特表 2023-504241 悪性腫瘍の治療、診断および予防に使用するためのＵＫ１１４サケタンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-02

(54)【発明の名称】悪性腫瘍の治療、診断および予防に使用するためのＵＫ１１４サケタンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/705 20060101AFI20230126BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20230126BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230126BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20230126BHJP

【ＦＩ】

C07K14/705 ZNA

C12N9/22

A61P35/00

A61K38/17

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022530848

(86)(22)【出願日】2020-11-23

(85)【翻訳文提出日】2022-07-22

(86)【国際出願番号】 EP2020083069

(87)【国際公開番号】W WO2021105059

(87)【国際公開日】2021-06-03

(31)【優先権主張番号】102019000022203

(32)【優先日】2019-11-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519216057

【氏名又は名称】バートレリ クザーニ、 アルバート

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＲＴＯＲＥＬＬＩ ＣＵＳＡＮＩ， Ａｌｂｅｒｔｏ

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】バートレリ クザーニ、 アルバート

【テーマコード（参考）】

4B050

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD02

4B050FF14E

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA21

4C084BA23

4C084CA53

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA50

4H045DA50

4H045DA86

4H045DA89

4H045EA28

4H045EA31

4H045FA51

4H045FA52

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

悪性腫瘍の治療、診断および予防に使用されるサケタンパク質ＵＫ１１４を開示する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

固形および全身性悪性腫瘍の治療、診断および予防に使用するＵＫ１１４サケタンパク質。

【請求項2】

前記タンパク質のモノマー単位が配列番号１または配列番号２の配列を有する、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項3】

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉによって発現される請求項１に記載のタンパク質。

【請求項4】

腫瘍の治療を受けた個体の免疫化、アジュバント療法、および悪性腫瘍の発生または再発のリスクのある個体のワクチン接種のための、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項5】

腫瘍に罹患している、または治療された個人のモノクローナル抗体による受動免疫、アジュバント療法、および悪性腫瘍の発生または再発のリスクのある個人のための請求項１に記載のタンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、悪性腫瘍の治療、診断および予防に使用するためのＵＫ１１４サケタンパク質に関する。

【背景技術】

【0002】

様々な原生生物およびユーカリ生物において高度に保存されているＹｊｇＦ／ＹＥＲ０５７ｃ７／ＵＫｌ１４と呼ばれるタンパクのファミリーは、その構造的および機能的特性を研究するために設計された多くの研究の主題を形成している（非特許文献１～８）。これらのファミリーは、ＲｉＤ(反応性中間体／イミンデアミナーゼ）タンパク質を含む。特許文献１は、タンパク質ＵＫ１１４を含有する過塩素酸（ＵＫ１０１と呼ばれる）を用いたヤギ肝臓抽出物の抗腫瘍活性を記載している。前記タンパク質は１４．２ｋＤａの分子量を有し、１３７アミノ酸の配列が報告されている（非特許文献９）。種々の哺乳動物種の肝臓から単離された天然タンパク質ＵＫ１１４、および／またはそれと交差反応するタンパク質は、正常細胞の細胞質中にのみ存在するが、悪性腫瘍細胞の細胞膜上にも存在し(非特許文献１０～１１)、特に腺癌では８０％を超える割合で存在する。組換えE. coliにおけるＵＫ１１４ヤギタンパク質の発現は、特許文献２および非特許文献１２に記載されている。より最近では、特許文献３が腫瘍の治療に有用な増大した免疫原性特性を示す、ＵＫ１１４の多量体、特に三量体組換え形態を記載している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】ＷＯ９６０２５６７

【特許文献2】ＷＯ００６３３６８

【特許文献3】ＥＰ３５５４６３９

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Bartorelli et al, J. Tumor and Marker Oncology, 1994, 9, 37

【非特許文献2】Lambrecht JA et al, J.Biol. Chem., 285, 34401-34407

【非特許文献3】Lambrecht JA et al, J.Biol. Chem. 2012, 287, 3454-3461

【非特許文献4】Mistiniene E et al, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 1243-1252

【非特許文献5】Dhawan L et al, Mol. Cell. Biol., 2012, 32, 3768-3775

【非特許文献6】Flynn JM et al, Mol. Microbiol., 2013, 89(4)751-759

【非特許文献7】Ernst DC et al., J. Bacteriology, 2014, 196 (18), 3335-3342

【非特許文献8】Niehaus TD et al., BMC Genomics, 2015, 16, 382

【非特許文献9】Ceciliani F. et al.、FEBS Letters, 1996, 393, 147-150

【非特許文献10】Bartorelli A, et al, Int J Oncol. 1996 Mar; 8(3): 543-8.;

【非特許文献11】Bussolati G et al.、Int J Oncol. 1997年4月; 10(4):779-85

【非特許文献12】Colombo I et al., Biochim Biophys．Acta， 1998, 1442, 49-59．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

Ｒｉｄ／ＵＫ１１４サケ(Salmo sala)タンパク質は動物またはヒトに注射された場合、同じファミリーのヤギ(Capra hircus)タンパク質で今日まで見出されたよりも予想外に大きい程度まで腫瘍細胞に対して細胞毒性の抗体の産生を誘導することが、今回見出された。

【0006】

したがって、本発明の主題は、悪性腫瘍の治療、診断および予防、特に、腫瘍の治療、アジュバント治療、および悪性腫瘍の発症または再発のリスクがある個人のワクチン接種のための免疫付与のために使用されるＵＫ１１４のサケタンパク質を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

Ｒｉｄ／ＵＫ１１４サケタンパク質はまた、腫瘍に罹患しているかまたは腫瘍の治療、アジュバント治療、および悪性腫瘍の発症または再発のリスクがある個人の治療を受けた個人のモノクローナル抗体による受動免疫に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】末梢血サンプルを、示された濃度の種々のＰＲＰ１４タンパク質種（ヤギ［Ｇｏａｔ］、サケＡ型［Ｓａｌ Ａ］およびサケＢ型［Ｓａｌ Ｂ］）とインキュベートし、未処理サンプルを対照として維持し、またはリポ多糖（ＬＰＳ）で処理したサンプルを陽性対照として維持することによって得られたデータを示す図である。

【図2】末梢血サンプルを、示された濃度の種々のＰＲＰ１４タンパク質種（ヤギ［Ｇｏａｔ］、サケＡ型［Ｓａｌ Ａ］およびサケＢ型［Ｓａｌ Ｂ］）とインキュベートし、未処理サンプルを対照として維持し、またはリポ多糖（ＬＰＳ）で処理したサンプルを陽性対照として維持することによって得られたデータを示す図である。

【図3】末梢血単核細胞を、示された濃度の種々のＰＲＰ１４タンパク質種（ヤギ［Ｇｏａｔ］、サケＡ型［Ｓａｌ Ａ］およびサケＢ型［Ｓａｌ Ｂ］）と共にインキュベートし、未処理試料、またはホルボール１２－リステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で処理した試料を対照として維持することによって得られたデータを示す図である。

【図4】ＰＲＰ１４ヤギ／サケＡおよびＢの 細胞傷害活性の比較を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

Ｒｉｄ／ＵＫｌ１４サケタンパク質の配列は公知である。
アミノ酸配列を以下に示す。

【0010】

【表1】

【0011】

形態Ａ（ＵＫＡ）は、４３．５ｋＤａの分子量を有するホモトリマーである。モノマーは１３９ ａａからなり、１４．５ｋＤａの分子量を有する。三量体の流体力学的半径は２．９ｎｍである。ＵＫＡは５．２６の等電点を有する。ＵＫＡは高い立体配座安定性（Ｔｍ約１００℃）を示す。

【0012】

形態Ｂ（ＵＫＢ）はホモトリマーである。モノマーは１３８ ａａからなり、１４．７ｋＤａの分子量を有する。三量体は、４４．１ｋＤａの分子量および２．９ｎｍの流体力学的半径を有する。
ＵＫＢは、ＵＫＡよりも大きな立体配座安定性（Ｔｍ約６５℃）を示す。
アミノ酸配列に基づく予測等電点は８．０５である。

【0013】

ＵＫ １１４ ＲＩＤ ＡおよびＢサケ(Salmo sala)タンパク質は、ＵＫ １１４ Ｒｉｄヒト蛋白質との相同性がそれぞれ７１％および６１％、ウサギＲｉｄ蛋白質との相同性がそれぞれ７０％および６２％、マウスＲｉｄ蛋白質との相同性がそれぞれ７２％および６４％である。

【0014】

サケＲｉｄタンパク質は、公知の方法によって、細菌、酵母またはＣＨＯ細胞における組換えＤＮＡ技術によって得ることができる。本発明はまた、アミノ酸、例えば１～１０アミノ酸以上の保存的置換を示すタンパク質の突然変異体形態を含む。

【0015】

推奨される治療的または予防的使用のために、サケタンパク質は無菌水性キャリア中の溶液または懸濁液の形態で皮下または筋肉内に投与され、任意に、免疫応答を増強するためにアジュバントと結合体化される。

【0016】

しかし、このタンパク質はまた、他の経路（例えば、舌下または局所）によって投与され得る。治療的、予防的およびワクチン的適用のための用量は、投与当たり１～５０ｍｇの範囲であり得る。典型的なワクチン接種プロトコルでは、４回の投与を隔夜に１回行う。最終投与の２０／３０日後に、４倍の追加接種を行う。免疫療法は、抗体数および細胞毒性を評価するために臨床検査で監視される。免疫寛容のリスクにつながる過剰免疫を防ぐために、臨床検査でモニターした抗体数に応じて、追加免疫を間隔をあけて行うことにより、満足のいく臨床結果が得られるまで治療を継続できる（腫瘍量の減少または消失）。タンパク質投与の代替として、対応するＤＮＡは、ＤＮＡワクチン接種技術によって注射され得る。

【0017】

このタンパク質はまた、筋肉内または静脈内受動免疫療法、ならびに免疫抑制患者および／または特異的免疫療法に応答しない患者の受動血清予防に有用なモノクローナル抗体を調製するために使用され得る。

【0018】

例えば、ヒトモノクローナル抗体は、ヒトマウス骨髄腫Ｋ６Ｈ６／Ｂ５を、タンパク質で前処理された患者由来のエプスタイン－バーウイルスで形質転換されたリンパ球と融合させることによって得ることができる。補体の存在下で腫瘍細胞に対して細胞傷害性であるＩｇＭ分泌クローンが好ましい。あるいは、トランスジェニック動物において産生されたヒト化マウスＩｇＭモノクローナル抗体またはヒトＩｇＭ分泌モノクローナル抗体を使用することができる。

【0019】

本発明は、以下に記載される実施例において詳細に記載される。

【実施例1】

【0020】

組換えサケタンパク質（ＡおよびＢ）の生産
大腸菌におけるSalmo salar組換えタンパク質ＲｉｄＡ－ＡおよびＲｉｄＡ－Ｂの発現には、発現ベクターｐＥＴ－１５ｂを用いる。ＲｉｄＡ－ＡおよびＲｉｄＡ－Ｂをコードするヌクレオチド配列を化学合成により得、ベクターｐＥＴ－１５ｂに挿入した。得られたプラスミドは、ポリヒスチジンタグおよびＮ末端の特定のプロテアーゼによって認識される切断部位に融合したタンパク質配列を発現する。ｐＥＴ１５－Ｂ－ＲｉｄＡ－ＡおよびｐＥＴ１５Ｂ－ＲｉｄＡ－Ｂと呼ばれる作成されたプラスミドを用いて、Escherichia coli細胞（ＤＨ５α）を形質転換した。

【0021】

【表2】

【0022】

融合タンパク質Ｈｉｓ－Ｔａｇ－ＲｉｄＡ－ＡおよびＨｉｓ－Ｔａｇ－ＲｉｄＡ－Ｂのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ３およびＳＥＱ ＩＤ ４を以下に示す（トロンビン切断部位までのＨｉｓ－Ｔａｇを含むセグメントに下線を引く）：

【0023】

【表3】

【0024】

ＲｉｄＡ－ＡおよびＲｉｄＡ－Ｂタンパク質を発現させるために、プラスミドを株ＤＨ５Ａから発現株（Ｒｏｓｅｔｔａ ＤＥ３）に移す。形質転換された細胞を適切な培地（ＬＢ＋抗生物質）中で培養し、そしてタンパク質発現を、ＩＰＴＧを用いて３７℃で４時間誘導する。この誘導時間および３７℃の温度はＵＫ１１４ヤギタンパク質について既に実証されているように、ＲｉｄＡ－ＡおよびＲｉｄＡ－Ｂタンパク質の産生に理想的である。ＳＤＳ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を含有するポリアクリルアミドゲル上での電気泳動、およびクーマシーブルーでのタンパク質の染色を行って、目的のタンパク質の発現を確認する。試験したクローンは組換えタンパク質Ｈｉｓ－ｔａｇ－ＲｉｄＡ－ＡまたはＨｉｓ－ｔａｇ－ＲｉｄＡ－Ｂを高レベルで発現し、前記タンパク質は細胞抽出物の可溶性画分中に存在する。Ｈｉｓ－ｔａｇ－ＲｉｄＡ－ＡまたはＨｉｓ－ｔａｇ－ＲｉｄＡ－Ｂは、ニッケル樹脂に対するポリヒスチジンタグの親和性を利用することによって精製することができる。３７℃での誘導の４時間後に収集された細胞から得られた可溶性画分を、樹脂とインキュベートして、目的の組換えタンパク質のＨｉｓ－ｔａｇを、樹脂と結合したニッケルに結合させる。次いで、フロースルー（樹脂に結合していない全てのもの）を収集し、種々の洗浄後、タンパク質を、ニッケル結合についてヒスチジンと競合する高濃度のイミダゾールで溶出する。有意な濃度のＨｉｓ－ｔａｇ－ＲｉｄＡ－ＡまたはＨｉｓ－ｔａｇ－ＲｉｄＡ－Ｂタンパク質と共に溶出液をプールすることによって得られたサンプルを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で透析する。次いで、サンプルを、タンパク質配列とＨｉｓ－ｔａｇ配列との間のＮ末端で切断部位を特異的に認識するセリンプロテアーゼであるトロンビンと共にインキュベートし、ｔａｇを除去することを可能にする。次いで、ＲｉｄＡ－ＡまたはＲｉｄＡ－Ｂタンパク質を、ＦＰＬＣ（泳動緩衝液：生理食塩水）に連結したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでのゲル濾過によって溶出された画分をチェックした後、ＲｉｄＡ－ＡまたはＲｉｄＡ－Ｂタンパク質を含有する画分をプールし、その濃度をＵＶスペクトルおよびＢＣＡアッセイによってアッセイする。

【実施例2】

【0025】

自然免疫の活性化
ヤギＲｉｄ蛋白質と比較して、全血または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の異なる予想外の活性の明確な実証は、様々な濃度の精製組換え蛋白質のインキュベーションの分析、および全血および／またはＰＢＭＣ（単球、非古典的「ｎｃＭｏ」単球、樹状細胞、ＣＤ１４およびＣＤ３８マーカー発現細胞、ＣＤ４＋リンパ球、ＣＤ８＋リンパ球、γδリンパ球、Ｂリンパ球およびＮＫ細胞）において発明および分析された様々な細胞亜集団による表面マーカー発現およびサイトカイン産生（ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＮＦ－α、ＩＬ－ｌｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、パーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＣＤ１０７、インターフェロン－γ）のその後の分析に由来する。

【0026】

特に、図１は末梢血サンプルを、示された濃度の種々のＰＲＰ１４タンパク質種（ヤギ［Ｇｏａｔ］、サケＡ型［Ｓａｌ Ａ］およびサケＢ型［Ｓａｌ Ｂ］）とインキュベートし、未処理サンプルを対照として維持し、またはリポ多糖（ＬＰＳ）で処理したサンプルを陽性対照として維持することによって得られたデータを示す。３時間後、細胞はフローサイトメトリー分析を受け、単球亜集団は示されたように、様々なサイトカイン（インターロイキン１β［ＩＬｌｂ Ｍｏｎｏ］、ＴＮＦα［ＴＮＦａ Ｍｏｎｏ］、インターロイキン６［ＩＬ６ Ｍｏｎｏ］、インターロイキン１２［ＩＬ１２ Ｍｏｎｏ］）の細胞内発現について評価された。

【0027】

図２は末梢血サンプルを、示された濃度の種々のＰＲＰ１４タンパク質種（ヤギ［Ｇｏａｔ］、サケＡ型［Ｓａｌ Ａ］およびサケＢ型［Ｓａｌ Ｂ］）とインキュベートし、未処理サンプルを対照として維持し、またはリポ多糖（ＬＰＳ）で処理したサンプルを陽性対照として維持することによって得られたデータを示す。３時間後、細胞はフローサイトメトリー分析を受け、樹状細胞の亜集団を細胞内発現について評価した。）
図３は末梢血単核細胞を、示された濃度の種々のＰＲＰ１４タンパク質種（ヤギ［Ｇｏａｔ］、サケＡ型［Ｓａｌ Ａ］およびサケＢ型［Ｓａｌ Ｂ］）と共にインキュベートし、未処理試料、またはホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で処理した試料を対照として維持することによって得られたデータを示す。６時間後に、細胞はフローサイトメトリー分析を受け、ナチュラルキラー亜集団について、種々のサイトカイン（ＴＮＦα［ＮＫ細胞上のＴＮＦａ］、ＣＤ１０７［ＮＫ細胞上のＣＤ１０７］）の細胞内発現を評価した。

【0028】

図１～３に示した結果から、３時間のインキュベーションによって、ヤギタンパク質と比較して自然免疫の活性化に特徴的な表面マーカーの発現とサイトカイン産生が劇的に増加し、サケタンパク質Ａの方がサケタンパク質Ｂよりも大きく増加することが実証される。いずれの場合も、ヤギタンパク質は不活性または活性が低い一方で、サケタンパク質ＡおよびＢは自然免疫細胞（単球、”ｎｃＭｏ”単球およびＮＫ細胞）および他の細胞種（樹状細胞）の活性化を誘導し、適応免疫応答の異なる段階にも関与している。したがって、図１～３に示すデータは、末梢血から単離されたヒト細胞上で自然免疫を活性化するサケ形態のより大きな能力を示す。

【実施例3】

【0029】

ワクチン活性
１０マイクログラムのサケタンパク質Ａを週１回マウスに皮下注射した。４回目の注射の１０日後に、メラノーマＢ１６Ｆ１０の１００００細胞を注射した。腫瘍注射の１４日後、ワクチン効果は非常に有意であり、腫瘍の平均面積がワクチン未接種群の３９＋８ｍｍからワクチン接種マウスの７＋８ｍｍに減少した。

【実施例4】

【0030】

抗血清産生
ウサギおよびマウスに、それぞれ３ミリグラムおよび３マイクログラムのサケタンパク質ＡおよびＢを、完全フロイントアジュバントとともに、１晩に１回与えた。各動物に、３つの異なる点で皮下注射した。４回目の免疫化の１０日後に、ウサギの中心耳静脈およびマウスの尾静脈から血液サンプルを採取した。免疫応答を腫瘍細胞についてＷＢおよび免疫蛍光フローサイトメトリーにより検査し、過免疫血清について、様々な腫瘍細胞株および正常細胞株に対する細胞毒性を誘発する能力を検査した。以下に列挙される細胞株を、この目的のために使用した。

【0031】

【表4】

【0032】

細胞を、高グルコースＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）１０％ ＦＣＳ（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ）中の２４ウェルプレート（１０，０００細胞／ウェル）にプレーティングし、接着したらすぐに、低グルコースＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）中の１０％血清および１％補体（Ｓｉｇｍａ）で処理した。４８時間後、Ｍｕｓｅ（商標）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＆Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、製造者の指示に従って、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖアポトーシスアッセイを行った。

【0033】

抗サケＲｉｄ ＡおよびＢ高免疫血清の細胞毒性活性を、抗ＵＫ１１４組換えヤギ高免疫血清（ＰＲＰ１４ Ｇｏａｔ）の細胞毒性活性と比較した。

【実施例5】

【0034】

細胞傷害活性の比較：ＰＲＰ１４ヤギ／サケＡおよびＢ
本発明のタンパク質およびヤギＵＫ１１４で免疫したウサギの血清中の細胞傷害性抗体の存在を評価した。細胞生存率は、ＭＴＴアッセイ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラナトリウムブロミド）を用いて、製造者の指示に従って評価した。

【0035】

、マウス乳癌からクローニングした細胞株である３０００個のチューブ細胞を、９６ウェルプレートに３連でプレーティングし、試験血清で７２時間処理し、ＭＴＴ試薬と共に３７℃で６時間インキュベートした。１００μｌのイソプロパノール０．０４Ｎ ＨＣｌを添加して結晶を溶解し、５７０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を図４に示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2023504241000001.app

【国際調査報告】