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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-02
(54)【発明の名称】タンパク質を搭載したＰＬＧＡナノスフィア
(51)【国際特許分類】
A61K 9/51 20060101AFI20230126BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20230126BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20230126BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20230126BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230126BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20230126BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20230126BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20230126BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230126BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230126BHJP
【ＦＩ】
A61K9/51
A61K47/34
A61K47/02
A61K47/22
A61K47/26
A61K47/10
A61K47/42
A61K38/20
A61P35/00
A61P37/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022534255
(86)(22)【出願日】2020-12-04
(85)【翻訳文提出日】2022-07-29
(86)【国際出願番号】 US2020063314
(87)【国際公開番号】W WO2021113638
(87)【国際公開日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】62/944,191
(32)【優先日】2019-12-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】502347102
【氏名又は名称】ウエストバージニア ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＷＥＳＴ ＶＩＲＧＩＮＩＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(71)【出願人】
【識別番号】522222744
【氏名又は名称】ウエスト バージニア ユニバーシティー ボード オブ ガバナーズ オン ビハーフ オブ ウエスト バージニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】リンジー， ブロック エー．
(72)【発明者】
【氏名】マーケル， ジャスティン イー．
(72)【発明者】
【氏名】ラチンスキ， ライアン エー．
(72)【発明者】
【氏名】ノーア， ジャビーン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076AA94
4C076CC07
4C076CC27
4C076DD01F
4C076DD26Z
4C076DD61Z
4C076DD67Z
4C076EE23F
4C076EE24A
4C076EE41
4C076GG50
4C084AA02
4C084BA44
4C084DA12
4C084MA05
4C084MA38
4C084NA12
4C084ZB07
4C084ZB26
(57)【要約】
本開示は、タンパク質をカプセル封入したナノ粒子を含む組成物、および前記組成物を作製する方法を提供する。一態様では、組成物は、薬物送達ベクターおよび治療物質を含むことができ、組成物は、薬物送達ベクター放出緩衝液の条件下で、一定期間にわたり、１００，０００個の粒子の薬物送達ベクターあたり少なくとも１．０ｐｇの治療物質を溶出し、治療物質、薬物送達ベクターおよび薬物送達ベクター放出緩衝液が溶液を構成し、溶液が遠心分離され、一部が約１～１０℃で保管され、治療物質の溶出量が、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。本開示は、免疫系に影響を及ぼす疾患に罹患している患者における、免疫表現型を制御する方法をさらに記載する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノスフィアおよび治療物質を含む組成物であって、溶液中に前記組成物を入れてから７２時間より後に、前記治療物質の少なくとも一部が前記組成物から溶出する、
組成物。
【請求項2】
前記治療物質の少なくとも一部が、溶液に前記組成物を入れてから９６時間より後に前記組成物から溶出する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記治療物質の少なくとも一部が、溶液に前記組成物を入れてから１２０時間より後に前記組成物から溶出する、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記治療物質の少なくとも一部が、溶液に前記組成物を入れた後７２～２８８時間の間で前記組成物から溶出する、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記治療物質がＩＬ－１２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記溶液が、リン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）中の哺乳動物の血清および約１００単位／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノスフィアおよびＩＬ－１２を含む組成物であって、ＩＬ－１２が、少なくとも２％のカプセル封入効率で前記ＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれている、
組成物。
【請求項8】
ＩＬ－１２が、少なくとも１０％のカプセル封入効率で前記ＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれている、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
ＩＬ－１２が、少なくとも２０％のカプセル封入効率で前記ＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれている、請求項７に記載の組成物。
【請求項10】
ＩＬ－１２が、少なくとも４０％のカプセル封入効率で前記ＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれている、請求項７に記載の組成物。
【請求項11】
ＩＬ－１２が、約２％～約４０％のカプセル封入効率で前記ＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれている、請求項７に記載の組成物。
【請求項12】
前記ＩＬ－１２が、生物活性ＩＬ－１２である、請求項７に記載の組成物。
【請求項13】
薬物送達ベクターおよび治療物質を含む組成物であって、前記組成物が、薬物送達ベクター放出緩衝液の条件下で、１００，０００個の粒子の前記薬物送達ベクターあたり少なくとも１．０ｐｇの前記治療物質を溶出し、
前記組成物が、３日間を超えて治療物質を溶出し続け、
前記治療物質、薬物送達ベクターおよび薬物送達ベクター放出緩衝液が溶液を構成し、
前記溶液が遠心分離されて、一部が約１～１０℃で保管され、
前記治療物質の溶出が、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される、
組成物。
【請求項14】
前記薬物送達ベクターが、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記治療物質がタンパク質である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項16】
タンパク質がサイトカインである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項17】
前記サイトカインがＩＬ－１２である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記薬物送達ベクター放出緩衝液が、リン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）中に約１０％のＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｈｅａｔ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ（ＨＩ－ＦＢＳ）および約１００単位／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項19】
界面活性剤をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項20】
前記界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＳｐａｎ（登録商標）６０を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
種特異的な全血清、種特異的な操作された血清アルブミン、または種特異的な全胎児血清をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項22】
約１００～１０００ｎｍの直径を含む、タンパク質を搭載したポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノスフィア、界面活性剤、および
種特異的な全血清、操作されたまたは天然の血清アルブミン
を含む、組成物。
【請求項23】
前記タンパク質が、ＩＬ－１２を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
前記界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＳｐａｎ（登録商標）６０を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項25】
タンパク質をカプセル封入したナノスフィアを作製する方法であって、時間の増加および／または超音波処理のワット数の増加に伴う前記タンパク質の解離速度を決定するステップと、
前記タンパク質の解離速度と、時間および／または超音波処理のワット数の増加に伴う前記ナノスフィアの形成速度とを比較するステップと、
前記タンパク質の解離速度と前記ナノスフィアの形成速度との交点における、時間および超音波処理のワット数を決定するステップと、
第１の界面活性剤を含む溶媒にＰＬＧＡを溶解させることによって第１の相を調製するステップと、
第２の界面活性剤および哺乳動物の血清を含む水にアルコールを溶解させることによって第２の相を調製するステップと、
水性媒体に構成成分を懸濁するステップと、
前記水性媒体および前記第１の相を含む第１のエマルションを形成するステップと、
前記第１のエマルションおよび前記第２の相を含む第２のエマルションを形成して、前記交点において決定した前記時間および超音波処理出力で前記第２のエマルションを超音波処理するステップと、
前記第２のエマルションから前記溶媒を蒸発させて水溶液を形成するステップと、
前記水溶液から前記構成成分を含有するＰＬＧＡナノスフィアを回収するステップと
を含む、方法。
【請求項26】
ナノスフィアに構成成分をカプセル封入する方法であって、溶媒にポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を溶解させることによって第１の相を調製するステップと、
水にアルコールを溶解させることによって第２の相を調製するステップと、
水性媒体に前記構成成分を懸濁させるステップと、
前記水性媒体および前記第１の相を含む第１のエマルションを形成するステップと、
前記第１のエマルションおよび前記第２の相を含む第２のエマルションを形成するステップと、
前記第２のエマルションから前記溶媒を蒸発させて水溶液を形成するステップと、
前記水溶液から前記構成成分を含むＰＬＧＡナノスフィアを回収するステップと
を含む、方法。
【請求項27】
前記構成成分がタンパク質を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記タンパク質がＩＬ－１２を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記構成成分が、界面活性剤および哺乳動物の血清をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記ＰＬＧＡが、５０％～９０％のラクチドを含み、前記溶媒が、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ３有機溶媒、Ｃ２～Ｃ３ニトリル溶媒、Ｃ２～Ｃ５アルキルエステル溶媒、Ｃ３～Ｃ５ケトン溶媒、およびそれらの混合物からなる群から選択される、
請求項２６に記載の方法。
【請求項31】
前記溶媒が、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチルまたはジクロロメタンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記ＰＬＧＡが７５％～９０％のラクチドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項33】
前記ＰＬＧＡが、５０％～７５％のラクチドを含み、前記溶媒が、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ３有機溶媒、アセトニトリル、Ｃ３～Ｃ４ケトン溶媒およびそれらの混合物からなる群から選択される、
請求項２６に記載の方法。
【請求項34】
前記第１の相に前記水性媒体を添加して、前記第１のエマルションを形成するステップ、および組織ホモジナイザーを用いて、１３，０００ＲＰＭ～２０，０００ＲＰＭの速度で前記第１のエマルションを撹拌するステップ、ならびに前記第１のエマルションを前記第２の相に添加して、前記第２のエマルションを形成するステップ、および組織ホモジナイザーを用いて、１３，０００ＲＰＭ～２０，０００ＲＰＭの速度で前記第２のエマルションを撹拌するステップ
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項35】
前記第１の相に前記水性媒体を添加して、前記第１のエマルションを形成するステップ、および超音波処理によって前記第１のエマルションを撹拌するステップ、ならびに前記第１のエマルションを前記第２の相に添加して、前記第２のエマルションを形成するステップ、および超音波処理によって前記第２のエマルションを撹拌するステップ
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項36】
前記第１のエマルションを撹拌するステップが、５秒～３０秒の一定期間、３０Ｗ～５０Ｗの電力レベルでの超音波処理を含み、前記第２のエマルションを撹拌するステップが、５秒～３０秒の一定期間、３０Ｗ～５０Ｗの電力レベルでの超音波処理を含む、
請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記第１のエマルションを撹拌するステップが、１０秒～２０秒の一定期間の超音波処理を含み、前記第２のエマルションを撹拌するステップが、１０秒～２０秒の一定期間の超音波処理を含む、
請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記タンパク質が、サイトカインまたは球状タンパク質である、請求項２７に記載の方法。
【請求項39】
前記タンパク質が、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子およびケモカインからなる群から選択されるサイトカインである、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記サイトカインが、インターロイキンおよび非免疫学的サイトカインからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記タンパク質が、Ｎ末端シグナル配列、Ａ～Ｄと標識した４本のヘリックスを含む４ヘリックスバンドルを有し、前記Ｄヘリックスの後にＣ末端伸長部を有さないサイトカインである、請求項３８に記載の方法。
【請求項42】
前記サイトカインが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンアルファ－１、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンカッパ、インターフェロンタウ－１、インターフェロンオメガ－１、またはＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２からなる群から選択されるインターロイキン、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６およびＩＬ－２７のアルファ鎖である、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記タンパク質が、ａ）細胞性免疫応答、または
ｂ）抗体応答
のどちらか一方を増強する免疫学的サイトカインである、請求項３８に記載の方法。
【請求項44】
前記サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＦＮ－γおよびインターロイキン－１２からなる群から選択される、細胞性免疫応答を増強する免疫学的サイトカインである、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記サイトカインがＩＬ－１２である、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記サイトカインが、ＴＧＦ－β、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３からなる群から選択される、抗体応答を増強する免疫学的サイトカインである、請求項４３に記載の方法。
【請求項47】
前記第１および第２のエマルションがそれぞれ、組織ホモジナイザーを用いて、１３，０００ＲＰＭ～２０，０００ＲＰＭの速度で撹拌され、ＩＬ－１２が、約０．５％～約２．１％のカプセル封入効率で前記ＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれる
請求項４５に記載の方法。
【請求項48】
前記第１および第２のエマルションがそれぞれ、５秒～３０秒の一定期間、３０Ｗ～５０Ｗの電力レベルの超音波処理により撹拌され、ＩＬ－１２が、約４．５％～約１０％のカプセル封入効率で前記ＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれる、
請求項４５に記載の方法。
【請求項49】
ＰＬＧＡマトリックスおよびタンパク質を含む、請求項２６に記載の方法により生成される、ナノスフィアであって、前記タンパク質の第１の部分が、前記ナノスフィアの表面に吸着されており、
前記タンパク質の第２の部分が、前記ナノスフィアのコアにおいて前記ＰＬＧＡマトリックスに取り込まれている、
ナノスフィア。
【請求項50】
前記タンパク質が、ＩＬ－１２であり前記ＩＬ－１２が、約０．５％～約１０％のカプセル封入効率で前記ナノスフィアに取り込まれている、
請求項４９に記載のナノスフィア。
【請求項51】
前記第２の相が、ポリビニルアルコールおよび哺乳動物の血清を含有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項52】
前記第１の相が、第１の界面活性剤を含有する、および／または前記第２の相が、第２の界面活性剤を含有する、
請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記第１の界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステルである、および／または前記第２の界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、
請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記第２の相が、ポリビニルアルコールおよび胎児血清を含有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項55】
ＰＬＧＡマトリックスおよびタンパク質を含む、請求項５３に記載の方法により生成される、ナノスフィアであって、前記タンパク質の第１の部分が、前記ナノスフィアの表面に吸着されており、
前記タンパク質の第２の部分が、前記ナノスフィアのコアにおいて前記ＰＬＧＡマトリックスに取り込まれており、
前記ナノスフィアが、哺乳動物の血清アルブミン、トレハロース、前記第１および前記第２の界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の添加剤を含む、
ナノスフィア。
【請求項56】
前記ナノスフィアが、哺乳動物の血清アルブミンおよび界面活性剤を含む、請求項５５に記載のナノスフィア。
【請求項57】
請求項２６に記載の方法により生成される複数のナノスフィアを含む剤形であって、各ナノスフィアがＰＬＧＡマトリックスおよびタンパク質を含み、前記タンパク質の第１の部分が、前記ナノスフィアの表面に吸着されており、
前記タンパク質の第２の部分が、前記ナノスフィアのコアにおいて前記ＰＬＧＡマトリックスに取り込まれている、
剤形。
【請求項58】
前記タンパク質が、ＩＬ－１２であり前記ＩＬ－１２が、少なくとも２％のカプセル封入効率で前記ナノスフィアに取り込まれている、
請求項５７に記載の剤形。
【請求項59】
ナノスフィアにタンパク質をカプセル封入する方法であって、第１の界面活性剤を必要に応じて含有する有機溶媒に２．５％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖのポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を溶解させることによって油相を調製するステップと、
ポリビニルアルコール、ならびに哺乳動物の血清、トレハロースおよび第２の界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の添加剤を含有する水性相を調製し、水性媒体に前記タンパク質を懸濁させるステップと、
前記水性媒体を前記油相に添加して第１のエマルションを形成し、前記第１のエマルションを撹拌するステップと、
前記第１のエマルションを前記水性相に添加して第２のエマルションを形成し、前記第２のエマルションを撹拌するステップと、
前記第２のエマルションから前記有機溶媒を蒸発させて、水溶液を形成するステップと、
前記水溶液から前記タンパク質を含有するポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）ナノスフィアを回収するステップと
を含む、方法。
【請求項60】
免疫系に影響を及ぼす疾患に罹患している患者における、免疫表現型を制御する方法であって、ａ） 患者の初期免疫表現型を決定するステップ、
ｂ） 前記初期免疫表現型が免疫抑制を示す場合、免疫系を刺激する第１の薬物を投与するステップ、または
前記初期免疫表現型が免疫系の過剰刺激を示す場合、免疫系を抑制する第２の薬物を投与するステップ、
ｃ） ステップ（ｂ）の後に、時間の関数として前記患者の免疫表現型をモニタリングするステップ、ならびに
ｄ） 前記患者の免疫表現型が、所望の範囲外である場合、前記第１および／もしくは第２の薬物の投与を調節するステップ
を含む、方法。
【請求項61】
免疫系に影響を及ぼす疾患に罹患している患者における、免疫表現型を制御する方法であって、ａ） 患者の疾患状態を判定するステップであり、前記疾患状態が診断および初期免疫表現型を含む、ステップと、
ｂ） 前記患者の前記疾患状態とデータベース内の複数の疾患状態とを比較するステップであり、前記データベースにおける各疾患状態が、診断、初期免疫表現型および処置プロトコルを含む、ステップと、
ｃ） 前記比較するステップ（ｂ）に基づいて、前記データベースから処置プロトコルを選択するステップであり、前記処置プロトコルが免疫モジュレート薬を投与することを含む、ステップと
を含む、方法。
【請求項62】
ｄ） 前記患者に前記免疫モジュレート薬を投与するステップと、ｅ） ステップ（ｄ）の後に、前記患者の免疫表現型を時間の関数としてモニタリングするステップと、
ｆ） 前記患者の免疫表現型が所望の範囲の外側に収まる場合、前記免疫モジュレート薬の投与を調節するステップと
をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１９年１２月５日出願の米国仮出願第６２／９４４，１９１号に基づく利益を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１９年１２月５日出願の米国仮出願第６２／９４４，１９１号に基づく利益を主張する。
【0002】
政府により支援された研究に関する記載
本出願は、国立衛生研究所／国立総合医科研究所によって助成された助成金番号２Ｕ５４ＧＭ１０４９４２－０２、Ｓ１０ＯＤ０１６１６５、Ｐ３０ＧＭ１０３４８８およびＰ２０ＧＭ１０３４３４の下、政府支援により行われた。連邦政府は、本発明において、ある程度の権利を有する。
本出願は、国立衛生研究所／国立総合医科研究所によって助成された助成金番号２Ｕ５４ＧＭ１０４９４２－０２、Ｓ１０ＯＤ０１６１６５、Ｐ３０ＧＭ１０３４８８およびＰ２０ＧＭ１０３４３４の下、政府支援により行われた。連邦政府は、本発明において、ある程度の権利を有する。
【0003】
分野
本明細書に開示されている様々な実施形態は、概して、タンパク質含有ナノスフィアの調製に関する。
本明細書に開示されている様々な実施形態は、概して、タンパク質含有ナノスフィアの調製に関する。
【0004】
本明細書に開示されている様々な実施形態は、免疫分析のための免疫表現型解析に関する。
【背景技術】
【0005】
背景
免疫刺激は、１）悪性細胞の増殖および／または腫瘍転移の形成を阻害することができる、ならびに２）ウイルスおよび細菌感染を排除することができる重要な機構である。免疫療法がん処置は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の軸を含めた、特異的免疫調節性チェックポイントのモノクローナル抗体の遮断を含むことができる。
免疫刺激は、１）悪性細胞の増殖および／または腫瘍転移の形成を阻害することができる、ならびに２）ウイルスおよび細菌感染を排除することができる重要な機構である。免疫療法がん処置は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の軸を含めた、特異的免疫調節性チェックポイントのモノクローナル抗体の遮断を含むことができる。
【0006】
歴史的には、腫瘍微小環境および免疫応答に焦点が置かれてきた。しかし、全身性応答は、持続的な免疫学的応答をもたらして、疾患を治癒することができる。多数のグループが、患者に免疫学的に発生していることをリアルタイムに説明する一助となるため、処置の免疫表現型解析に着目してきた。多数の疾患に対する免疫療法剤が一層主流となり、これらの応答の生きたデータベースを開発することが、この過程を著しく前に推し進めることになるので、上記の情報は、重要な役割を果たすことになろう。
【0007】
前臨床検討により、インターロイキンは、多数の悪性腫瘍に対する抗腫瘍応答を誘発することができることが示されてきた。全身に投与されると最大化される抗腫瘍活性を有する免疫刺激性サイトカインであるインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）は、このような抗腫瘍応答を誘発することができる。ＩＬ－１２の高用量投与は、毒性副作用を有するおそれがあるが、低用量のＩＬ－１２は、安全と考えることができる。
【0008】
ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）薬物送達ベクターが、ＦＤＡによって承認されており、ポリマーが分解する際に、幅広い物質を溶出することができる。治療目的の場合、ＰＬＧＡナノスフィア内に免疫刺激性インターロイキンタンパク質を潜在的に含むペプチドをカプセル封入すると、有毒な搭載用量を必要とすることなく、全身送達および組織沈着が可能となり得る。全身的状況で使用されるため、ナノスフィアは、血液による、安全かつ効果的な生物の大血管および微小血管の移動を実現することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
要旨
サイトカイン投与法の改善が、現在必要とされていることに照らし合わせて、様々な例示的な実施形態の簡単な要旨を提示する。以下の要旨において、一部の単純化および省略が行われ得、この要旨は、本明細書において開示されているある特定の実施形態の態様を強調して導入することが意図されているが、本開示の範囲を制限するものではない。当業者が、本明細書において開示されている概念の実施および使用を可能にするのに適切な様々な実施形態の詳細説明が、これ以降の項目に続く。
サイトカイン投与法の改善が、現在必要とされていることに照らし合わせて、様々な例示的な実施形態の簡単な要旨を提示する。以下の要旨において、一部の単純化および省略が行われ得、この要旨は、本明細書において開示されているある特定の実施形態の態様を強調して導入することが意図されているが、本開示の範囲を制限するものではない。当業者が、本明細書において開示されている概念の実施および使用を可能にするのに適切な様々な実施形態の詳細説明が、これ以降の項目に続く。
【0010】
本明細書に開示されている様々な実施形態によれば、タンパク質は、ナノスフィアにカプセル封入され得る。このカプセル封入法は、二重エマルションを作製することによって行うことができ、第１の水相が油相中に乳化され得、この油相は、第２の水相中に乳化されている。タンパク質はサイトカインであることができ、これは、細胞シグナル伝達においてある役割を果たす、小さなタンパク質（約５～２０ｋＤａ）であることができる。好適なサイトカインは、以下：
Ｔヘルパー細胞によって産生されるインターロイキン
リンパ球によって産生されるリンホカイン
単球によって専ら産生されるモノカイン
抗ウイルス応答に含まれるインターフェロン
半固体培地中での細胞の成長を支持するコロニー刺激因子、および
細胞間での化学誘引を媒介するケモカイン
を含む。
Ｔヘルパー細胞によって産生されるインターロイキン
リンパ球によって産生されるリンホカイン
単球によって専ら産生されるモノカイン
抗ウイルス応答に含まれるインターフェロン
半固体培地中での細胞の成長を支持するコロニー刺激因子、および
細胞間での化学誘引を媒介するケモカイン
を含む。
【0011】
様々な実施形態では、ナノスフィアにカプセル封入したタンパク質は、４ａｃヘリックスのバンドルを有する三次元構造を有するサイトカインであることができ、このサイトカインは、インターフェロン、インターロイキン、例えばインターロイキン－２またはインターロイキン－１２、またはエリスロポエチンおよびトロンボポエチンを含めた非免疫学的サイトカインであることができる。ナノスフィアにカプセル封入されたタンパク質は、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）であることができる。
【0012】
油相は、有機溶媒に、２．５％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖのポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を溶解させることによって調製することができる。第１の水性相は、水性媒体にタンパク質を懸濁させることによって作製することができる。最後に、第２の水性相は、水にポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を溶解させることによって作製することができる。
【0013】
ＰＬＧＡは、５０％～９０％のラクチドを含むことができ、有機溶媒は、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ３有機溶媒、Ｃ２～Ｃ３ニトリル溶媒、Ｃ２～Ｃ５アルキルエステル溶媒、Ｃ３～Ｃ５ケトン溶媒またはそれらの混合物であることができる。ＰＬＧＡは、７５％～９０％のラクチドを含むことができる。ＰＬＧＡは、５０％～７５％のラクチドを含むことができ、有機溶媒は、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ３有機溶媒、アセトニトリル、Ｃ３～Ｃ４ケトン溶媒またはそれらの混合物であることができる。様々な実施形態では、ＰＬＧＡは、５０％～９０％ラクチドを含み、有機溶媒は、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチルまたはジクロロメタンであることができる。
【0014】
撹拌しながら、タンパク質含有水性媒体を油相に添加し、第１のエマルションを形成することができる。撹拌しながら、第１のエマルションをＰＶＡ含有水性相に加えて、第２のエマルションを形成することができる。次に、有機溶媒を第２のエマルションから蒸発させて、水溶液を形成することができる。第２の水性相に由来するタンパク質を含有するＰＬＧＡナノスフィアを水溶液から回収することができる。
【0015】
一態様では、本開示は、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノスフィアおよび治療物質を含む組成物であって、溶液中に組成物を入れてから７２時間より後に、治療物質の少なくとも一部が組成物から溶出することができる、組成物を記載する。
【0016】
様々な実施形態では、治療物質の少なくとも一部は、溶液に組成物を入れてから９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０、２６４、２８８、３１２、３３６時間より後に組成物から溶出することができる。治療物質の少なくとも一部は、溶液に組成物を入れた後７２～２８８時間の間で組成物から溶出することができる。治療物質は、ＩＬ－１２であることができる。溶液は、リン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）中の哺乳動物の血清および約１００単位／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）であることができる。
【0017】
一態様では、本開示は、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノスフィアおよびＩＬ－１２を含む組成物であって、ＩＬ－１２が、少なくとも２％のカプセル封入効率でＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれ得る、組成物を記載する。
【0018】
様々な実施形態では、ＩＬ－１２は、少なくとも１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％のカプセル封入効率でＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれ得る。ＩＬ－１２は、約２％～約４０％のカプセル封入効率でＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれ得る。ＩＬ－１２は、生物活性なＩＬ－１２であることができる。
【0019】
一態様では、本開示は、薬物送達ベクターおよび治療物質を含む組成物であって、該組成物が、薬物送達ベクター放出緩衝液の条件下で、１００，０００個の粒子の薬物送達ベクターあたり少なくとも１．０ｐｇの治療物質を溶出することができ、該組成物が、３日を超えて治療物質を溶出し続け、治療物質、薬物送達ベクターおよび薬物送達ベクター放出緩衝液が溶液を構成し、該溶液が遠心分離されて、一部が約１～１０℃で保管され、治療物質の溶出量が、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される、組成物を記載する。本組成物は、界面活性剤を含むことができる。界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＳｐａｎ（登録商標）６０であることができる。本組成物は、含むことができる
【0020】
様々な実施形態では、薬物送達ベクターは、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含むことができる。治療物質は、タンパク質であることができる。タンパク質は、サイトカインであることができる。サイトカインは、ＩＬ－１２であることができる。薬物送達ベクター放出緩衝液は、リン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）中の約１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｈｅａｔ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ（ＨＩ－ＦＢＳ）および約１００単位／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）を含むことができる。上記組成物は、種特異的な全血清、種特異的な、操作された血清アルブミン、または種特異的な全胎児血清をさらに含み得る。
【0021】
一態様では、本開示は、タンパク質を搭載したポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノスフィアを含む組成物であって、ナノスフィアが、約１００～１０００ｎｍの直径、界面活性剤、および種特異的な、全血清、操作されたまたは天然の血清アルブミンを含むことができる、組成物を記載する。
【0022】
様々な実施形態では、タンパク質は、ＩＬ－１２を含むことができる。界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＳｐａｎ（登録商標）６０を含むことができる。
【0023】
一態様では、本開示は、タンパク質をカプセル封入したナノスフィアを作製する方法であって、時間の増加および／または超音波処理のワット数の増加に伴うタンパク質の解離速度を決定するステップと、タンパク質の解離速度と、時間および／または超音波処理のワット数の増加に伴うナノスフィアの形成速度とを比較するステップと、タンパク質の解離速度とナノスフィアの形成速度との交点における、時間および超音波処理のワット数を決定するステップと、第１の界面活性剤を含む溶媒にＰＬＧＡを溶解させることによって第１の相を調製するステップと、第２の界面活性剤および哺乳動物の血清を含む水にアルコールを溶解させることによって第２の相を調製するステップと、水性媒体に構成成分を懸濁するステップと、水性媒体および第１の相を含む第１のエマルションを形成するステップと、第１のエマルションおよび第２の相を含む第２のエマルションを形成して、交点において決定した時間および超音波処理出力で第２のエマルションを超音波処理するステップと、第２のエマルションから溶媒を蒸発させて水溶液を形成するステップと、水溶液から構成成分を含有するＰＬＧＡナノスフィアを回収するステップとを含む、方法を記載する。
【0024】
一態様では、本開示は、ナノスフィアに構成成分をカプセル封入する方法であって、溶媒にポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を溶解させることによって第１の相を調製するステップと、水にアルコールを溶解させることによって第２の相を調製するステップと、水性媒体に構成成分を懸濁するステップと、水性媒体および第１の相を含む第１のエマルションを形成するステップと、第１のエマルションおよび第２の相を含む第２のエマルションを形成するステップと、第２のエマルションから溶媒を蒸発させて水溶液を形成するステップと、水溶液から構成成分を含有するＰＬＧＡナノスフィアを回収するステップとを含む、方法を記載する。
【0025】
様々な実施形態では、構成成分は、タンパク質を含むことができる。タンパク質は、ＩＬ－１２を含むことができる。構成成分は、界面活性剤および哺乳動物の血清を含むことができる。ＰＬＧＡは、５０％～９０％のラクチドを含むことができ、溶媒は、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ３有機溶媒、Ｃ２～Ｃ３ニトリル溶媒、Ｃ２～Ｃ５アルキルエステル溶媒、Ｃ３～Ｃ５ケトン溶媒、およびそれらの混合物からなる群から選択することができる。溶媒は、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチルまたはジクロロメタンであることができる。ＰＬＧＡは、７５％～９０％のラクチドを含むことができる。ＰＬＧＡは、５０％～７５％のラクチドを含むことができ、溶媒は、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ３有機溶媒、アセトニトリル、Ｃ３～Ｃ４ケトン溶媒およびそれらの混合物からなる群から選択することができる。本方法は、第１の相に水性媒体を添加して、第１のエマルションを形成するステップ、および組織ホモジナイザーを用いて、１３，０００ＲＰＭ～２０，０００ＲＰＭの速度で第１のエマルションを撹拌するステップ、ならびに第１のエマルションを第２の相に添加して、第２のエマルションを形成するステップ、および組織ホモジナイザーを用いて、１３，０００ＲＰＭ～２０，０００ＲＰＭの速度で第２のエマルションを撹拌するステップを含むことができる。本方法は、第１の相に水性媒体を添加して、第１のエマルションを形成するステップ、および超音波処理によって第１のエマルションを撹拌するステップ、ならびに第１のエマルションを第２の相に添加して、第２のエマルションを形成するステップ、および超音波処理によって第２のエマルションを撹拌するステップを含むことができる。本方法は、第１のエマルションを撹拌するステップが、５秒～３０秒の一定期間、３０Ｗ～５０Ｗの電力レベルでの超音波処理を含み、第２のエマルションを撹拌するステップが、５秒～３０秒の一定期間、３０Ｗ～５０Ｗの電力レベルでの超音波処理を含むことを含むことができる。タンパク質は、サイトカインまたは球状タンパク質とすることができる。タンパク質は、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子およびケモカインからなる群から選択されるサイトカインであることができる。サイトカインは、インターロイキンおよび非免疫学的サイトカインからなる群から選択することができる。タンパク質は、Ｎ末端シグナル配列、Ａ～Ｄと標識した４本のヘリックスを含む４ヘリックスバンドルを有し、Ｄヘリックスの後にＣ末端伸長部を有さないサイトカインであることができる。サイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンアルファ－１、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンカッパ、インターフェロンタウ－１、インターフェロンオメガ－１、またはＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２からなる群から選択されるインターロイキン、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６およびＩＬ－２７のアルファ鎖であることができる。タンパク質は、ａ）細胞性免疫応答を増強するか、またはｂ）抗体応答を増強するかのどちらか一方を行う、免疫学的サイトカインであることができる。サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＦＮ－γおよびインターロイキン－１２からなる群から選択される、細胞性免疫応答を増強する免疫学的サイトカインであることができる。サイトカインは、ＩＬ－１２であることができる。サイトカインは、ＴＧＦ－β、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３からなる群から選択される、抗体応答を増強する免疫学的サイトカインであることができる。第１および第２のエマルションはそれぞれ、組織ホモジナイザーを用いて、１３，０００ＲＰＭ～２０，０００ＲＰＭの速度で撹拌することができ、ＩＬ－１２は、約０．５％～約２．１％のカプセル封入効率でＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれる。第１および第２のエマルションはそれぞれ、５秒～３０秒の一定期間、３０Ｗ～５０Ｗの電力レベルの超音波処理により撹拌することができ、ＩＬ－１２は、約４．５％～約１０％のカプセル封入効率でＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれる。第２の相は、ポリビニルアルコールおよび哺乳動物の血清を含むことができる。第１の相は、第１の界面活性剤を含むことができる、および／または第２の相は、第２の界面活性剤を含有することができる。第１の界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステルであることができる、および／または第２の界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであることができる。第２の相は、ポリビニルアルコールおよび胎児血清を含有することができる。
【0026】
様々な実施形態では、タンパク質の第１の部分は、ナノスフィアの表面に吸着されることができ、タンパク質の第２の部分は、ナノスフィアのコアにおいてＰＬＧＡマトリックスに取り込まれ得、ナノスフィアは、哺乳動物の血清アルブミン、トレハロース、第１および第２の界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の添加剤を含むことができる。ナノスフィアは、哺乳動物の血清アルブミンおよび界面活性剤を含むことができる。
【0027】
様々な実施形態では、本開示は、記載されている方法によって生成される複数のナノスフィアを含む剤形であって、各ナノスフィアが、ＰＬＧＡマトリックスおよびタンパク質を含み、タンパク質の第１の部分が、ナノスフィアの表面に吸着されることができ、タンパク質の第２の部分が、ナノスフィアのコアにおいてＰＬＧＡマトリックスに取り込まれている、剤形を記載する。タンパク質は、ＩＬ－１２であることができ、ＩＬ－１２は、少なくとも２％のカプセル封入効率でナノスフィアに取り込まれ得る。
【0028】
一態様では、本開示は、ナノスフィアにタンパク質をカプセル封入する方法であって、第１の界面活性剤を必要に応じて含有する有機溶媒に２．５％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖのポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を溶解させることによって油相を調製するステップと、ポリビニルアルコール、ならびに哺乳動物の血清、トレハロースおよび第２の界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の添加剤を含有する水性相を調製し、水性媒体にタンパク質を懸濁させるステップと、水性媒体を油相に添加して第１のエマルションを形成し、第１のエマルションを撹拌するステップと、第１のエマルションを水性相に添加して第２のエマルションを形成し、第２のエマルションを撹拌するステップと、第２のエマルションから有機溶媒を蒸発させて、水溶液を形成するステップと、水溶液からタンパク質を含有するポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）ナノスフィアを回収するステップとを含む、方法を記載する。
【0029】
一態様では、本開示は、免疫系に影響を及ぼす疾患に罹患している患者における免疫表現型を制御する方法であって、（ａ）患者の疾患状態を判定するステップであり、疾患状態が診断および初期免疫表現型を含む、ステップと、（ｂ）患者の疾患状態とデータベース内の複数の疾患状態とを比較するステップであり、データベースにおける各疾患状態が、診断、初期免疫表現型および処置プロトコルを含む、ステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の比較に基づいて、データベースから処置プロトコルを選択するステップであり、処置プロトコルが免疫モジュレート薬を投与する、ステップとを含む、方法を記載する。
【0030】
様々な実施形態では、本方法は、（ｄ）患者に免疫モジュレート薬を投与するステップ、（ｅ）ステップ（ｄ）の後に、患者の免疫表現型を時間の関数としてモニタリングするステップ、および患者の免疫表現型が所望の範囲の外側に収まる場合、免疫モジュレート薬の投与を調節するステップを含むことができる。
【0031】
様々な実施形態では、組織ホモジナイザーによって、１３，０００ＲＰＭ～２０，０００ＲＰＭの速度で撹拌しながら、タンパク質含有水性媒体を油相に加えて、第１のエマルションを形成することができる。組織ホモジナイザーによって、１３，０００ＲＰＭ～２０，０００ＲＰＭの速度で撹拌しながら、第１のエマルションをＰＶＡ含有水性相に加えて、第２のエマルションを形成することができる。次に、有機溶媒を第２のエマルションから蒸発させて、水溶液を形成することができる。第２の水性相に由来するタンパク質を含有するＰＬＧＡナノスフィアを水溶液から回収することができる。
【0032】
様々な実施形態では、タンパク質含有水性媒体中のタンパク質は、サイトカインであることができる。好適なサイトカインは、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子およびケモカインを含む。タンパク質は、４ａｃヘリックスのバンドルを有する三次元構造を有するサイトカイン、例えば、インターロイキン、例えば、インターロイキン－２またはインターロイキン－１２、またはエリスロポエチンおよびトロンボポエチンを含めた非免疫学的サイトカインであることができる。
【0033】
様々な実施形態では、タンパク質含有水性媒体中のタンパク質は、ＩＬ－１２であることができる。組織ホモジナイザーを用いて、１３，０００ＲＰＭ～２０，０００ＲＰＭの速度で第１および第２のエマルションを撹拌することによって、ＩＬ－１２はＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれ得る。ＩＬ－１２は、得られたＰＬＧＡナノスフィアに、約０．５％～約２．１％のカプセル封入効率で取り込まれ得る。
【0034】
様々な実施形態では、超音波処理によって撹拌しながら、タンパク質含有水性媒体を油相に添加し、第１のエマルションを形成することができる。超音波処理によって撹拌しながら、第１のエマルションをＰＶＡ含有水性相に加えて、第２のエマルションを形成することができる。第１および第２のエマルションの一方または両方が形成している間の撹拌は、５秒～３０秒、１０秒～３０秒、１０秒～２０秒または１０秒～１５秒という一定期間、３０Ｗ～５０Ｗ、３０Ｗ～４０Ｗまたは４０Ｗ～５０Ｗの電力レベルでの超音波処理を含むことができる。次に、有機溶媒を第２のエマルションから蒸発させて、水溶液を形成することができる。次に、第２の水性相に由来するタンパク質を含有するＰＬＧＡナノスフィアを水溶液から回収することができる。
【0035】
様々な実施形態では、組織ホモジナイザーによって、１３，０００ＲＰＭ～２０，０００ＲＰＭの速度で撹拌しながら、タンパク質含有水性媒体を油相に加えて、第１のエマルションを形成することができる。５秒～３０秒の一定期間の間、３０Ｗ～５０Ｗ、３０Ｗ～４０Ｗまたは４０Ｗ～５０Ｗの電力レベルの超音波処理による撹拌をしながら、ＰＶＡ含有水性相に第１のエマルションを添加して、第２のエマルションを形成することができる。次に、有機溶媒を第２のエマルションから蒸発させて、水溶液を形成することができる。第２の水性相に由来するタンパク質を含有するＰＬＧＡナノスフィアを水溶液から回収することができる。
【0036】
様々な実施形態では、タンパク質含有水性媒体中のタンパク質は、ＩＬ－１２であることができる。ＩＬ－１２は、１０秒～２０秒の一定期間、３０Ｗ～５０Ｗの電力レベルの超音波処理によってＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれ得る。約２％～約８５％、約４．５％～約７０％、約５％～６０％、約７％～約５０％、約８％～約４０％、約１０％～３０％または約５％～１０％のカプセル封入効率で、ＩＬ－１２は得られたＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれ得る。
【0037】
本明細書に開示されている様々な実施形態は、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）マトリックスおよびタンパク質を含むナノスフィアであって、タンパク質の第１の部分が、ナノスフィアの表面に吸着されることができ、タンパク質の第２の部分が、ナノスフィアのコアにおいてポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）マトリックスに取り込まれ得る、ナノスフィアを対象とする。ナノスフィアは、二重エマルションを作製することによって生成することができ、第１のタンパク質含有水相が油相中で乳化され得、この油相は、次に、第２の水相中に乳化され得る。タンパク質は、ＩＬ－１２などのサイトカインであることができる。約０．５％～約８５％、約１％～約７０％、約２％～６０％、約３％～約５０％、約４％～約４０％、約５％～３０％、約０．５％～１０％、約１％～８％または約２％～５％のカプセル封入効率で、ＩＬ－１２をナノスフィアに取り込ませることができる。少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または１００％のカプセル封入効率で、ＩＬ－１２をＰＬＧＡナノスフィアに取り込まれ得る。
【0038】
本明細書に開示されている様々な実施形態は、第１の界面活性剤を必要に応じて含有する有機溶媒に２．５％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖのポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を溶解させることにより油相を調製することによる、ナノスフィアにタンパク質をカプセル封入する方法であって、ポリビニルアルコール、ならびに哺乳動物の全血清、組換え／天然哺乳動物アルブミン、トレハロースおよび第２の界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の添加剤を含有する水性相を調製するステップと、水性媒体にタンパク質を懸濁させるステップとを含む、方法に関する。第１の界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステルであることができる。水性媒体を油相に添加し、第１のエマルションを形成することができる。第１のエマルションを撹拌することができ、第１のエマルションを水性相に加えて、第２のエマルションを形成することができ、これを次に、撹拌することができる。有機溶媒を第２のエマルションから蒸発させて、水溶液を形成することができる。タンパク質を含有するポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）ナノスフィアを、水溶液から回収することができる。水性相は、ポリビニルアルコールおよび哺乳動物の血清、例えば胎児血清を含有することができる。水性相は、ポリビニルアルコールおよび第２の界面活性剤を含有することができ、第１の界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステルであることができ、第２の界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであることができる。
【0039】
本明細書に開示されている様々な実施形態は、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）マトリックスおよびタンパク質を含むナノスフィアであって、タンパク質の第１の部分が、ナノスフィアの表面に吸着されることができ、タンパク質の第２の部分が、ナノスフィアのコアにおいてポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）マトリックスに取り込まれ得る、ナノスフィアに関する。ナノスフィアは、哺乳動物の血清アルブミン、トレハロースおよび界面活性剤からなる群から選択される、少なくとも１種の添加剤をさらに含むことができる。ナノスフィアは、哺乳動物の血清アルブミン、哺乳動物の組換え／天然アルブミンおよび界面活性剤を含むことができる。ナノスフィアは、哺乳動物の全血清、哺乳動物の組換え／天然アルブミン、第１の界面活性剤および第２の界面活性剤を含むことができる。
【0040】
多数の疾患状態、例えば、がんおよび自己免疫性障害において、ヒト免疫系は常に変化している状態にあり得る。このような疾患を処置するため、医師が、患者の免疫系をリアルタイムに評価して、免疫系状態を経時的に追跡することが有益となり得る。がん、感染および／または自己免疫性障害が、免疫モジュレート剤を用いて処置されている場合、免疫モジュレート剤が免疫抑制性または免疫賦活性であるかどうかに関わらず、医師が免疫系に及ぼすこのような薬剤の影響を追跡することが可能であることが有益となり得る。
【0041】
本明細書に開示されている様々な実施形態は、検査施設において分析され得る採血またはフィンガースティック採血から免疫系の全身性分析を可能にする方法に関する。疾患状態、例えば、がんまたは自己免疫疾患への免疫系の応答は、選択した時間に分析することができ、処置プロトコルへの免疫応答を、疾患または処置の経過にわたり追跡することができる。
【0042】
この診断方法は、がん、自己免疫疾患および感染を含めた、多数の疾患の処置、監視および診断に有用となり得る。免疫モジュレート剤は、一層、一般的になっているので、本方法は、医師に、疾患の病因において、特定の時間における免疫系の状態を評価する能力を提供することができ、免疫モジュレート処置は、疾患の対処に最も有効となり得るかに関する予測を可能にすることができる。これは、処置の総合的な有効性を高めることができ、疾患過程における患者の免疫状態の評価の改善を可能にすることができる。この情報はまた、以前の経験に基づいて医師が施す処置に関するより多くの情報を医師に提供することが可能な疾患特異的分類にわたる免疫プロファイルの生きたデータベースに体系化され得る。
【0043】
本明細書に開示されている様々な実施形態は、免疫系に影響を及ぼす疾患に罹患している患者において、免疫表現型を制御する方法であって、
患者の初期免疫表現型もしくは免疫状態を判定するステップ、および
初期免疫表現型が免疫抑制を示す場合、免疫系を刺激する第１の薬物を投与するステップ、または
初期免疫表現型が免疫系の過剰刺激を示す場合、免疫系を抑制する第２の薬物を投与するステップ
のうちのいずれか一方のステップ
を含む、方法に関する。
患者の初期免疫表現型もしくは免疫状態を判定するステップ、および
初期免疫表現型が免疫抑制を示す場合、免疫系を刺激する第１の薬物を投与するステップ、または
初期免疫表現型が免疫系の過剰刺激を示す場合、免疫系を抑制する第２の薬物を投与するステップ
のうちのいずれか一方のステップ
を含む、方法に関する。
【0044】
選択した薬物を投与した後、患者の免疫表現型を時間の関数としてモニタリングすることができる。患者の免疫表現型が所望の範囲の外側に収まる場合、第１および／または第２の薬物の投与を調節することができる。
【0045】
本明細書に開示されている様々な実施形態は、免疫系に影響を及ぼす疾患に罹患している患者における免疫表現型を制御する方法であって、患者の疾患状態を判定するステップであり、疾患状態が診断および初期免疫表現型を含むステップと、患者の疾患状態とデータベース内の複数の疾患状態とを比較するステップであり、データベースにおける各疾患状態が、診断、初期免疫表現型および処置プロトコルを含む、ステップとによる、方法に関する。患者の疾患状態（単数または複数）とデータベースからの処置プロトコルとの間の比較に基づいて、処置プロトコルは、データベースから選択することができ、この場合、処置プロトコルは、免疫モジュレート薬を投与するステップを含む。本方法は、患者に免疫モジュレート薬を投与するステップと、薬物の投与後に、患者の免疫表現型を時間の関数としてモニタリングするステップと、患者の免疫表現型が所望の範囲の外側に収まる場合、免疫モジュレート薬の投与を調節するステップとを含むことができる。
【0046】
患者の血液試料の免疫表現型解析は、適切にデータを解析および評価する能力を含むことができる。このシステムによって、いくつかの疾患状態全体に行われる、適切な投与、処置および修正が可能となり得る。データの収集量が増加するにつれて、増えたデータベースはまた、最も広い意味において、直接の医療専門家が診断、処置および免疫治療剤の投与を行う一助にすることを可能にし得る。
【0047】
参照による組込み
本明細書において明記されている、刊行物、特許および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、具体的かつ個々に、参照により組み込まれるように示されているかのごとく同じ程度に参照により本明細書に組み込まれている。参照により組み込まれている刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲について、本明細書は、このような矛盾する資料のいずれよりも優先すること、および／または上位にあることが意図されている。
本明細書において明記されている、刊行物、特許および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、具体的かつ個々に、参照により組み込まれるように示されているかのごとく同じ程度に参照により本明細書に組み込まれている。参照により組み込まれている刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲について、本明細書は、このような矛盾する資料のいずれよりも優先すること、および／または上位にあることが意図されている。
【0048】
本開示の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本開示の特徴および利点の一層良好な理解は、本開示の原理を利用する例示的な実施形態を説明する以下の詳細説明、および添付の図面（同様に、本明細書における「図（Ｆｉｇｕｒｅ）」および「図（ＦＩＧ．）」）を参照することにより得られる。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【0050】
【0051】
【0052】
【0053】
【0054】
【0055】
【0056】
【0057】
【0058】
【0059】
【0060】
【0061】
【0062】
【0063】
【0064】
【0065】
【0066】
【0067】
【0068】
【0069】
【0070】
【0071】
【0072】
【0073】
【0074】
【発明を実施するための形態】
【0075】
詳細な説明
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明白に示さない限り、複数の参照物を含む。例えば、用語「試料」は、それらの混合物を含めた、複数の試料を含む。
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明白に示さない限り、複数の参照物を含む。例えば、用語「試料」は、それらの混合物を含めた、複数の試料を含む。
【0076】
「ナノスフィア」または「ナノ粒子」は、超微粒子であることができる。このような粒子は、以下に限定されないが、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含めた、様々な物質から作製することができる。
【0077】
ＰＬＧＡ薬物送達ベクターは、ＦＤＡ承認を受けており、ポリマーコーティングがＫｒｅｂｓ回路の中間体に分解されると、幅広い物質を溶出することができる。薬物溶解度、生体利用率および安定性はすべて、有機コーティングによって改変することができ、カプセル封入した基質の薬物動態および薬力学特性の大きなシフトが可能となる。腫瘍および感染の治療目的の場合、ＰＬＧＡナノスフィア内にＩＬ－１２をカプセル封入すると、有毒な搭載用量を必要とすることなく、全身送達および組織沈着が可能となり得る。負に荷電した表面は、グリコカリックスによって撃退され、そのサイズが一層小さいことに連動して、グリコカリックスがその中身を乱すことなく溶出することができる間質空間において沈着を増加させることが可能となる。しかし、現在まで、サブミクロンスケールのＰＬＧＡ粒子内にＩＬ－１２をカプセル封入することに成功していない。ナノスフィアは、塞栓を形成するリスクを最小限にしながら、血液による、安全かつ効果的な生物の微小血管（毛細血管は、約４～９ミクロンの直径となり得る）の移動を実現することができる。
【0078】
カプセル封入したタンパク質を有するＰＬＧＡナノスフィアは、以下：
有機溶媒に、２．５％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖのＰＬＧＡを溶解させることによって油相を調製する
水性溶媒に、１％ｗ／ｖ～３％ｗ／ｖのポリビニルアルコールを溶解させることによって水性相を調製する
水性媒体にタンパク質を懸濁させる
水性媒体を油相に添加して第１のエマルションを形成して、第１のエマルションを均質化する
第１のエマルションを水性相に添加して、第２のエマルションを形成して、第２のエマルションを均質化する
第２のエマルションから有機溶媒を蒸発させて、水溶液を形成する、および
水溶液からタンパク質を含有するＰＬＧＡナノスフィアを回収する
ことによって生成することができる。
有機溶媒に、２．５％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖのＰＬＧＡを溶解させることによって油相を調製する
水性溶媒に、１％ｗ／ｖ～３％ｗ／ｖのポリビニルアルコールを溶解させることによって水性相を調製する
水性媒体にタンパク質を懸濁させる
水性媒体を油相に添加して第１のエマルションを形成して、第１のエマルションを均質化する
第１のエマルションを水性相に添加して、第２のエマルションを形成して、第２のエマルションを均質化する
第２のエマルションから有機溶媒を蒸発させて、水溶液を形成する、および
水溶液からタンパク質を含有するＰＬＧＡナノスフィアを回収する
ことによって生成することができる。
【0079】
タンパク質
様々な実施形態では、タンパク質は、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子およびケモカインからなる群から選択されるサイトカインであることができる。サイトカインは、インターロイキンまたは非免疫学的サイトカインであることができる。
様々な実施形態では、タンパク質は、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子およびケモカインからなる群から選択されるサイトカインであることができる。サイトカインは、インターロイキンまたは非免疫学的サイトカインであることができる。
【0080】
サイトカインは、Ｎ末端シグナル配列、Ａ～Ｄと標識した４本のヘリックスを含む４ヘリックスバンドル、およびＤヘリックスの後に必要に応じたＣ末端伸長部を有することができる。サイトカインは、実質的なＣ末端伸長部を欠如することができ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンアルファ－１、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンカッパ、インターフェロンタウ－１、インターフェロンオメガ－１、またはＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１からなる群から選択されるインターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６およびＩＬ－２７のアルファ鎖であることができる。
【0081】
様々な実施形態では、サイトカインは、細胞性免疫応答を増強するか、または抗体応答を増強するかのどちらか一方を行う、免疫学的サイトカインであることができる。サイトカインが、細胞性免疫応答を増強する免疫学的サイトカインである場合、サイトカインは、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦｏｃ）、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－’）およびインターロイキン－１２（これは、ＩＦＮ－’およびＴＮＦｏｃの産生を刺激することができる）からなる群から選択することができる。サイトカインが、抗体応答を増強する免疫学的サイトカインである場合、サイトカインは、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－ｆ３）、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３からなる群から選択することができる。
【0082】
様々な実施形態では、ナノスフィアにカプセル封入されるタンパク質は、球状タンパク質であることができる。好適な球状タンパク質は、血清アルブミンタンパク質；酵素、例えば、エステラーゼ；ホルモン、例えば、インスリン；および輸送体タンパク質を含むことができる。
【0083】
様々な実施形態では、ＰＬＧＡナノスフィアは、医薬品活性成分；ビタミン；栄養補給食品活性成分、例えば、フィトケミカル；および有機色素または造影剤をカプセル封入するために使用することができる。ＰＬＧＡナノスフィアは、可溶性に乏しいクラスＩＩＩおよびクラスＩＶの薬物を含めた、様々な薬物の制御放出に使用することができる。
【0084】
ナノ粒子の製作方法
油相を生成するため、２．５％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖのＰＬＧＡは、有機溶媒に溶解させることができる。ＰＬＧＡは、５０％～９０％のラクチド、６５％～９０％のラクチドまたは７５％～９０％のラクチドを含有することができる。有機溶媒は、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ３有機溶媒、例えば、ジクロロメタン、クロロホルムまたは１，１，１－トリクロロエタン；Ｃ２～Ｃ３ニトリル溶媒、例えば、アセトニトリルもしくはプロピオニトリル；またはＣ２～Ｃ５アルキルエステル溶媒、例えば酢酸エチルもしくは酢酸ブチル；またはＣ３～Ｃ５ケトン溶媒、例えば、アセトンまたはペンタノンであることができる。有機溶媒は、１．１～３．５の間の双極子モーメントを有する半極性溶媒であることができる。油相は、撹拌しながら、室温（ＲＴ）において有機溶媒にＰＬＧＡを溶解させることによって作製することができ、この場合、撹拌は、３００～６００ＲＰＭ、３５０～５５０ＲＰＭまたは４２５～５００ＲＰＭであることができる。
油相を生成するため、２．５％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖのＰＬＧＡは、有機溶媒に溶解させることができる。ＰＬＧＡは、５０％～９０％のラクチド、６５％～９０％のラクチドまたは７５％～９０％のラクチドを含有することができる。有機溶媒は、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ３有機溶媒、例えば、ジクロロメタン、クロロホルムまたは１，１，１－トリクロロエタン；Ｃ２～Ｃ３ニトリル溶媒、例えば、アセトニトリルもしくはプロピオニトリル；またはＣ２～Ｃ５アルキルエステル溶媒、例えば酢酸エチルもしくは酢酸ブチル；またはＣ３～Ｃ５ケトン溶媒、例えば、アセトンまたはペンタノンであることができる。有機溶媒は、１．１～３．５の間の双極子モーメントを有する半極性溶媒であることができる。油相は、撹拌しながら、室温（ＲＴ）において有機溶媒にＰＬＧＡを溶解させることによって作製することができ、この場合、撹拌は、３００～６００ＲＰＭ、３５０～５５０ＲＰＭまたは４２５～５００ＲＰＭであることができる。
【0085】
様々な実施形態では、溶媒選択は、ＰＬＧＡ中のラクチド含有量に基づいて行うことができる。ＰＬＧＡが、７５％～９０％のラクチドを含有する場合、有機溶媒は、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ３有機溶媒、Ｃ２～Ｃ３ニトリル溶媒、またはＣ２～Ｃ５アルキルエステル溶媒またはＣ３～Ｃ５ケトン溶媒であることができる。ＰＬＧＡが、７５％未満のラクチドを含有する場合、有機溶媒は、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ３有機溶媒、アセトニトリルまたはＣ３～Ｃ４ケトン溶媒であることができる。
【0086】
エマルションの水性相を生成するため、１％ｗ／ｖ～３％ｗ／ｖのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を、水または緩衝食塩水溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であることができる水性溶媒に溶解させることができる。
【0087】
次に、タンパク質、例えば、ＩＬ－１２またはウシ血清アルブミンは、緩衝食塩水溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であることができる水性媒体に懸濁することができ、得られたタンパク質懸濁液をＰＬＧＡ含有油相に添加することができ、この油相に、急速撹拌、例えば、１０，０００～２０，０００ＲＰＭ；１２，０００～１９，５００ＲＰＭ；１３，０００～１９，０００ＲＰＭ；１５，０００～１８，０００ＲＰＭまたは１６，０００～１７，５００ＲＰＭを施して、第１のエマルションを生成することができる。代替的に、超音波処理をしながら、タンパク質懸濁液をＰＬＧＡ含有油相に加えて、第１のエマルションを生成することができる。
【0088】
次に、急速撹拌（例えば、１０，０００～２０，０００ＲＰＭ；１２，０００～１９，５００ＲＰＭ；１３，０００～１９，０００ＲＰＭ；１５，０００～１８，０００ＲＰＭまたは１６，０００～１７，５００ＲＰＭ）しながら、均質化しながら、または超音波処理しながら第１のエマルションをＰＶＡ水性相に加えて、第２のエマルションを生成することができる。次に、第２のエマルションから有機溶媒を蒸発させることができる。水性媒体に由来するタンパク質を含有するＰＬＧＡナノ粒子は、遠心分離によって回収されて、液体窒素中で急速凍結することができる、および／または凍結乾燥することができる。
【0089】
いかなる理論によっても拘泥されないが、経時的に超音波処理を使用すると、ナノ粒子の数を増加させて、前記ナノ粒子のサイズを低下させて、ナノ粒子の均質性を向上することによって、ナノ粒子の形成を増加せることができる。さらに一層高い超音波処理のワット数によっても、ナノ粒子の形成を増加させることができる。しかし、タンパク質は、特に、一層長い期間にわたり、より高い超音波処理のワット数で経時的に超音波処理に曝露されると、解離することができる。したがって、ここで開示されている通り、タンパク質を搭載したナノ粒子の生成において、超音波処理のワット数および時間のパラメータを個々のタンパク質の種類に最適化することができる。
【0090】
第２のエマルションが形成され得ると、タンパク質は、ＰＬＧＡマトリックスポリマーの鎖に巻かれた状態になることができ、有機溶媒が除去され得ると、融合して球体に沈殿することができる。このプロセスの間に、タンパク質は、ポリマーマトリックス内部に捕捉された状態（図１Ａ、この場合、タンパク質は、フルオレセインイソチオシアネート標識ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ－ＦＩＴＣ］であることができる）、および外側表面に吸着（図１Ｂ）された状態の両方になって、図１Ｃに示されている特徴的な二相溶出曲線を生成することができる。ベースラインと２日間の間で発生し得るバースト相は、水性媒体中での再懸濁時に、ナノスフィアの表面に吸着したタンパク質が放出されることに起因し得る（図１Ｄ）。制御放出期は、捕捉されたタンパク質に起因することができ（図１Ｄ）、タンパク質は、ＰＬＧＡが加水分解すると、経時的にゆっくりと放出され得る。
【0091】
比較の目的のため、上記のプロセスは、タンパク質懸濁液の代わりに、緩衝食塩水溶液を使用し、この生理食塩水溶液をＰＬＧＡ含有油相に添加して、第１のエマルションを生成して行うことができる。この第１のエマルションをＰＶＡ水性相に添加すると、タンパク質不含ブランクのナノ粒子を生成することができる。
【0092】
ブランクのナノスフィアおよびＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィアは、上記の技法を使用して合成することができる。ブランクおよびタンパク質を搭載したＰＬＧＡナノスフィアの幾何形状は、走査型電子顕微鏡により、５０ｎｍ～５００ｎｍ、１００～２５０ｎｍ、１００～１５０ｎｍまたは１７５～２２５ｎｍの平均粒子径を有する球体の形状であると求めることができる。様々な実施形態では、ＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィアは、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｎｍの直径を有することができる。ブランク、すなわちタンパク質不含ナノスフィアは、１７５～２２５ｎｍの直径を有することができる。
【0093】
ゼータ電位
ブランクとＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィアの両方のゼータ電位もまた、脱イオン水媒体中で決定した。ゼータ電位は、分散媒体と、分散粒子に結合した流体の固定層との間の電位差であることができ、合成の間にタンパク質を搭載した場合、１２．５～２５ｕｇの組換えマウスＩＬ－１２（ｒｍＩＬ－１２）の導入後、それぞれ、－１５～－２５ｍＶの範囲であることができる。ゼータ電位の大きさが増加するにつれて、ナノスフィア分散液の安定性が増加し得る。
ブランクとＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィアの両方のゼータ電位もまた、脱イオン水媒体中で決定した。ゼータ電位は、分散媒体と、分散粒子に結合した流体の固定層との間の電位差であることができ、合成の間にタンパク質を搭載した場合、１２．５～２５ｕｇの組換えマウスＩＬ－１２（ｒｍＩＬ－１２）の導入後、それぞれ、－１５～－２５ｍＶの範囲であることができる。ゼータ電位の大きさが増加するにつれて、ナノスフィア分散液の安定性が増加し得る。
【0094】
カプセル封入効率
タンパク質は、ナノスフィア放出緩衝液中のナノスフィアから溶出することができる。ナノスフィアによってカプセル封入されて放出された（カプセル封入効率、ＥＥ）ＩＬ－１２の量（パーセント）は、各溶出プロファイルの曲線下面積（ＡＵＣ）、粒子濃度（ＰＣ；粒子／ｍＬ）、合成した粒子の全量（Ｖ、ｍＬ）、および合成中に添加したＩＬ－１２の全重量（ｍｇ）を使用して、以下の式：
によって推定することができる。
タンパク質は、ナノスフィア放出緩衝液中のナノスフィアから溶出することができる。ナノスフィアによってカプセル封入されて放出された（カプセル封入効率、ＥＥ）ＩＬ－１２の量（パーセント）は、各溶出プロファイルの曲線下面積（ＡＵＣ）、粒子濃度（ＰＣ；粒子／ｍＬ）、合成した粒子の全量（Ｖ、ｍＬ）、および合成中に添加したＩＬ－１２の全重量（ｍｇ）を使用して、以下の式：
【数1】
【0095】
溶出は、ナノスフィア放出緩衝液中に、２億個の粒子／ｍＬ～１０００億個の粒子／ｍＬ、３億個の粒子／ｍＬ～５００億個の粒子／ｍＬ、４億個の粒子／ｍＬ～２００億個の粒子／ｍＬ、または５億個の粒子／ｍＬ～１０億個の粒子／ｍＬのタンパク質を搭載したＰＬＧＡナノスフィアを分散させて、得られた分散液の経時的に放出されたタンパク質濃度を分析することによって測定することができる。タンパク質濃度は、生物活性であってもよい。ＩＬ－１２の場合、上記の粒子濃度から溶出したｒｍＩＬ－１２の総量は、曲線下面積（ＡＵＣ）分析によって、１５００～４，０００ｐｇと求めることができる。１００，０００個のナノスフィアあたりに溶出されるＩＬ－１２の量は、それぞれ、０．３～０．４５ｐｇ／１００，０００個のナノスフィアと求めることができ、均質化法により作製された粒子の場合、最も効率的な溶出速度は、７．５億個の粒子／ｍＬの濃度において得られ、最も効率が低い溶出速度は、１０億個の粒子／ｍＬの濃度において得られる。式（１）に基づくと、平均カプセル封入効率（ＥＥ）は、０．４％～０．５％の範囲と求まった。最高のＥＥは、７．５億個の粒子／ｍＬの濃度において得られた。
【0096】
合成されたナノスフィアが、実際に、タンパク質をカプセル封入することができ、単に外壁にタンパク質を吸着させたのではないかどうかを判定するため、フルオレセインイソチオシアネート標識ウシ血清アルブミンを含有するＰＬＧＡナノスフィアを合成した。得られたナノスフィアは、内部構造を視覚化するため、共焦点顕微鏡によって画像化した。分析によって、標識したＢＳＡは、ナノスフィア内部に首尾よく取り込まれたことが確認された。
【0097】
全身への分布
様々な投与経路の後に傷害を引き起こすことなく、ＰＬＧＡナノスフィアの含有物が全身に分布するかどうかを判定するため、蛍光色素であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を搭載したＰＬＧＡナノスフィアを尾部静脈から静脈内、または腹腔内のどちらか一方で、雌マウスに注射し、ｉｎ ｖｉｖｏでの画像化システムによりモニタリングすることができる。どちらの投与経路も、図２に図示されている通り、罹患または致死の何ら兆候なしに、ナノスフィア内容物の全身への分布をもたらすことができる。
様々な投与経路の後に傷害を引き起こすことなく、ＰＬＧＡナノスフィアの含有物が全身に分布するかどうかを判定するため、蛍光色素であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を搭載したＰＬＧＡナノスフィアを尾部静脈から静脈内、または腹腔内のどちらか一方で、雌マウスに注射し、ｉｎ ｖｉｖｏでの画像化システムによりモニタリングすることができる。どちらの投与経路も、図２に図示されている通り、罹患または致死の何ら兆候なしに、ナノスフィア内容物の全身への分布をもたらすことができる。
【0098】
水不溶性ペイロード
同様の技法を使用して、ＰＬＧＡナノスフィア中に、薬物の水不溶性遊離塩基もしくは塩、または水不溶性色素、または造影剤をカプセル封入することができ、この場合、「水不溶性」という用語は、薬物または塩が、ＰＬＧＡポリマーを溶解させる有機溶媒よりも水への可溶性の方が低いことを意味する。同様の技法を使用して、可溶性薬物、色素または造影剤をカプセル封入することができ、この場合、ＰＬＧＡポリマーによる制御放出は、急速初期放出に起因する毒性副作用を回避すると同時に、治療的に安全かつ有効な用量をもたらすことが望ましい。
同様の技法を使用して、ＰＬＧＡナノスフィア中に、薬物の水不溶性遊離塩基もしくは塩、または水不溶性色素、または造影剤をカプセル封入することができ、この場合、「水不溶性」という用語は、薬物または塩が、ＰＬＧＡポリマーを溶解させる有機溶媒よりも水への可溶性の方が低いことを意味する。同様の技法を使用して、可溶性薬物、色素または造影剤をカプセル封入することができ、この場合、ＰＬＧＡポリマーによる制御放出は、急速初期放出に起因する毒性副作用を回避すると同時に、治療的に安全かつ有効な用量をもたらすことが望ましい。
【0099】
油相を生成するため、２．５％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖのＰＬＧＡを有機溶媒、例えば、ハロゲン化Ｃ１～Ｃ３有機溶媒；Ｃ２～Ｃ３ニトリル溶媒；Ｃ２～Ｃ５アルキルエステル溶媒；またはＣ３～Ｃ５ケトン溶媒に溶解させることができる。エマルションの水性相を生成するため、１％ｗ／ｖ～３％ｗ／ｖのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を、水または緩衝食塩水溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であることができる水性溶媒に溶解させることができる。
【0100】
次に、薬物の水不溶性遊離塩基もしくは塩、水不溶性色素、または造影剤を、水性媒体に懸濁することができ、ＰＬＧＡを含有する油相に得られたタンパク質懸濁液を添加することができ、この油相に急速撹拌または超音波処理を施して、第１のエマルションを生成することができる。
【0101】
次に、急速撹拌または超音波処理しながら、第１のエマルションをＰＶＡ水性相に添加し、第２のエマルションを生成することができる。次に、有機溶媒を第２のエマルションから蒸発させることができる。水性媒体に由来する薬物、色素または造影剤を含有するＰＬＧＡナノ粒子を遠心分離によって回収することができ、凍結乾燥することができる。
【0102】
添加剤
ナノスフィア調製のためのプロセスへの様々なさらなる改変により、カプセル封入効率を増加させて、ナノスフィアの溶出プロファイルを変えることができる。１．５％ｗ／ｖのトレハロースを含有する１．２ｍＬのＤＰＢＳ中に、ＩＬ－１２を１２．５マイクログラム懸濁させることによって作製したタンパク質溶液を使用するナノスフィアの調製によって、遅延放出溶出プロファイルを有するナノスフィアを生成することができる。初期バースト相は、溶出検討を開始して２日後まで遅延させることができるが、カプセル封入効率が低下するおそれがある。
ナノスフィア調製のためのプロセスへの様々なさらなる改変により、カプセル封入効率を増加させて、ナノスフィアの溶出プロファイルを変えることができる。１．５％ｗ／ｖのトレハロースを含有する１．２ｍＬのＤＰＢＳ中に、ＩＬ－１２を１２．５マイクログラム懸濁させることによって作製したタンパク質溶液を使用するナノスフィアの調製によって、遅延放出溶出プロファイルを有するナノスフィアを生成することができる。初期バースト相は、溶出検討を開始して２日後まで遅延させることができるが、カプセル封入効率が低下するおそれがある。
【0103】
２％ｗ／ｖのＭｇ（ＯＨ）２を含有する１．２ｍＬのＤＰＢＳ中に、ＩＬ－１２を１２．５マイクログラム懸濁させることによって作製したタンパク質溶液を使用するナノスフィアの調製によって、カプセル封入効率の低下したナノスフィアを生成することができる。
【0104】
患者に種特異的である、３％～１５％、５％～１２％、８％～１２％または約１０％の全血清、血清アルブミン、胎児血清または胎児血清アルブミンを含有する１．２ｍＬのＤＰＢＳ中にＩＬ－１２を１２．５マイクログラム懸濁させることによって作製したタンパク質溶液を使用するナノスフィアの調製により、遅延放出を有するナノスフィアを生成することができる。初期バースト相は、溶出検討を開始して２日後まで遅延させることができ、カプセル封入効率を増加させることができる。ナノスフィア調製の前に、２４時間、ＩＬ－１２懸濁液を胎児血清と共にインキュベートした場合、バースト相は、溶出検討を開始して３日後まで遅延させることができる。４８時間、全血清、血清アルブミンまたは胎児血清と共にさらにインキュベートすると、バースト相の溶出が延長もし、カプセル封入効率が増加する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ検討の場合、任意のタイプの血清、血清アルブミン（合成により製造した血清アルブミンを含む）、胎児血清または胎児血清アルブミン、例えばウシ胎児血清または胎児マウス血清を使用することができる。代替的に、ヒト血清を使用することができる。ナノスフィアをヒトまたは非ヒト患者に投与することができるｉｎ ｖｉｖｏ検討の場合、血清または血清アルブミンの選択は、処置される種に特異的となり得る。ウシの処置の場合、ウシ胎児血清を含有するＤＰＢＳにＩＬ－１２を懸濁することによって作製されるナノスフィアを使用することができる。マウスの処置の場合、ナノスフィアは、胎児マウス血清を含有するＤＰＢＳを用いて作製されるべきである。ヒトの処置の場合、ナノスフィアは、ヒト血清を含有するＤＰＢＳを用いて作製することができる。１種の種から異なる種までの血清または胎児血清と共に処理したナノスフィアを投与すると、移植片対宿主病が引き起こされるおそれがある。同様に、全血清または採集した天然ヒトアルブミンを使用する場合、いずれの血液生成物の場合にもあり得るように、これらの生成物の投与を受ける各患者の交差適合法を行うことができる。一部の場合、治療物質（例えば、ＩＬ－１２）の少なくとも一部は、溶液に組成物を入れてから２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０、２６４、２８８、３１２、３３６時間より後に組成物（例えば、ナノスフィア）から溶出することができる。一部の場合、治療物質（例えば、ＩＬ－１２）の少なくとも一部は、溶液に組成物を入れた後約２４時間～約４８時間、約４８時間～約７２時間、約７２時間～約１９２時間、約７２時間～約１６８時間、約９６時間～約１６８時間、約１２０時間～約１６８時間、約１４４時間～約１９２時間で、組成物（例えば、ナノスフィア）から溶出することができる。
【0105】
ナノスフィア調製の間に界面活性剤が存在すると、カプセル封入効率を増加させることができる。界面活性剤は、ＰＬＧＡ含有油相、またはＰＶＡ／水相に取り込まれ得る。好適な界面活性剤には、油溶性ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０およびＳｐａｎ（登録商標）８０）、および／または水溶性ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）が含まれる。様々な実施形態では、ナノスフィアは、４％～２０％ｗ／ｗのＳｐａｎ（登録商標）界面活性剤を含有するＰＬＧＡ含有油相、２％～１０％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤を含有するＰＶＡ／水相、またはそれらの両方を用いて調製することができる。例えば、
油相は、４％～２０％ｗ／ｗのＳｐａｎ（登録商標）６０、１０％～１６％ｗ／ｗのＳｐａｎ（登録商標）６０または約１４％ｗ／ｗのＳｐａｎ（登録商標）６０を含有することができる、
ＰＶＡ／水相は、２％～１０％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、３％～８％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０または４％～６％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有することができる、または
油相は、４％～２０％ｗ／ｗのＳｐａｎ（登録商標）６０を含有することができ、ＰＶＡ／水相は、２％～１０％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有することができる。
油相は、４％～２０％ｗ／ｗのＳｐａｎ（登録商標）６０、１０％～１６％ｗ／ｗのＳｐａｎ（登録商標）６０または約１４％ｗ／ｗのＳｐａｎ（登録商標）６０を含有することができる、
ＰＶＡ／水相は、２％～１０％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、３％～８％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０または４％～６％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有することができる、または
油相は、４％～２０％ｗ／ｗのＳｐａｎ（登録商標）６０を含有することができ、ＰＶＡ／水相は、２％～１０％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有することができる。
【0106】
界面活性剤および胎児血清の両方が存在すると、カプセル封入効率を増加させることができる。１０％胎児血清を含有する１．２ｍＬのＤＰＢＳに１２．５マイクログラムのＩＬ－１２を懸濁することによって作製されるタンパク質溶液を使用してナノスフィアを調製すると、２％～１０％の間、４％～８％の間または５％～７％の間のカプセル封入効率でＩＬ－１２を含むナノスフィアを生成することができる。２４時間、ＤＰＢＳ中でインキュベートした、１０％胎児血清を含有する１．２ｍＬのＤＰＢＳに１２．５マイクログラムのＩＬ－１２を懸濁することによって作製されるタンパク質溶液を使用してナノスフィアを調製すると、１０％～５０％の間、２０％～４５％の間または３０％～４０％の間のカプセル封入効率でＩＬ－１２を含むナノスフィアを生成することができる。１０％胎児血清と界面活性剤の両方を含有する１．２ｍＬのＤＰＢＳに１２．５マイクログラムのＩＬ－１２を懸濁することによって作製されるタンパク質溶液を使用してナノスフィアを調製すると、５０％～９５％の間、６０％～８５％の間または７０％～８０％の間のカプセル封入効率でＩＬ－１２を含むナノスフィアを生成することができる。様々な実施形態では、サイトカイン、胎児血清および界面活性剤を含有するタンパク質溶液を使用すると、ＰＬＧＡナノスフィアへのサイトカインのカプセル封入効率が相乗的に増加する。
【0107】
免疫表現型解析
本明細書に開示されている様々な実施形態は、採血から、またはランセットおよびＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）を使用して得られたフィンガースティック採血を使用して得られた血液２～３滴から、患者の免疫系を医療専門家が全身的に分析することを可能にする技法に関する。採血は、家庭で、医療専門家のオフィスで、クリニックで、または病院で行うことができる。
本明細書に開示されている様々な実施形態は、採血から、またはランセットおよびＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）を使用して得られたフィンガースティック採血を使用して得られた血液２～３滴から、患者の免疫系を医療専門家が全身的に分析することを可能にする技法に関する。採血は、家庭で、医療専門家のオフィスで、クリニックで、または病院で行うことができる。
【0108】
様々な実施形態では、採血は、家庭で、医療専門家のオフィスで、クリニックで、または病院で行うことができる。採血は、検査施設または医療施設で分析することができる。
【0109】
血液試料は、患者の身体に元々存在する免疫化学のレベル、および／または患者に投与された免疫モジュレート薬のレベルに関して分析され得る。血液試料は、時間の関数として、患者の身体に元々存在する免疫化学のレベルに関して分析され得、これによって、医療専門家は、免疫化学レベルに及ぼす処置レジメンの効果を観察することが可能となる。採血は、定期的な間隔で採取して分析することができ、これによって、医療専門家は、処置の経過期間にわたり、免疫状態または免疫表現型の変化を評価することが可能となる。
【0110】
図１１を参照すると、４つの主要な免疫表現型が考慮される：
抑制、例えば、がん、自己免疫疾患または感染によって誘発される免疫抑制
ベースライン、例えば、疾患のない対象の免疫状態
ベースラインレベルより上の免疫系の刺激、および
疲弊、すなわちリンパ球アネルギー、全身性炎症応答症候群および／または器官不全を特徴とする、免疫細胞疲弊（ＴＣＥ）として知られている免疫系の過活性化の生命を脅かす状態。
抑制、例えば、がん、自己免疫疾患または感染によって誘発される免疫抑制
ベースライン、例えば、疾患のない対象の免疫状態
ベースラインレベルより上の免疫系の刺激、および
疲弊、すなわちリンパ球アネルギー、全身性炎症応答症候群および／または器官不全を特徴とする、免疫細胞疲弊（ＴＣＥ）として知られている免疫系の過活性化の生命を脅かす状態。
【0111】
図１１は、様々な免疫モジュレート治療により処置している間の、骨肉腫がん患者の免疫表現型の変化を示す。患者の初期免疫表現型は、がん誘発性免疫抑制のために抑制となる。プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、骨肉腫の間に発現されることが多く、したがって、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体（抗ＰＤ－Ｌ１）が投与され得る。図１１の線Ａを参照されたい。インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）は、骨肉腫の腫瘍成長を阻害することが示されており、したがって、遊離ＩＬ－１２は、免疫モジュレーターとして投与することができる。図１１の線Ｃを参照されたい。
【0112】
時間Ｔ１では、抗ＰＤ－Ｌ１は、患者の免疫表現型の変化には無効であるように思われる一方、ＩＬ－１２は、免疫表現型を刺激に変化させたように見える。しかし、時間Ｔ２では、処置が進行するにつれて、ＩＬ－１２は、毒性副作用を引き起こし、患者の免疫表現型を疲弊に変化させる。時間Ｔ２では、抗ＰＤ－Ｌ１は患者の免疫表現型をベースラインに変化させ、がんと戦うために免疫系を刺激することなく、がん誘発性免疫抑制と戦う。
【0113】
図１１の線Ｂにおいて分かる通り、抗ＰＤ－Ｌ１と、ＰＧＬＡナノスフィアで投与された低用量のＩＬ－１２とを組み合わせると、免疫系の過活性化を引き起こすことなく、免疫系を刺激してがんと戦うことができる。したがって、免疫表現型を経時的にモニタリングすることにより、医師は免疫モジュレート治療を調節して、Ｔ細胞疲弊を伴わずに免疫刺激をもたらすことが可能となる。
【0114】
がん治療法への免疫応答に関するデータは、データベースに登録することができる。例えば、図１１を参照すると、免疫系を抑制するまたは過剰刺激する第１の疾患を有する任意の所与の患者に関するデータベースに、以下の情報を登録することができる：
ａ） 疾患のタイプ
ｂ） 処置前の免疫表現型
ｃ） 第１の疾患のために行った処置
ｄ） 時間の関数としての免疫表現型の変化
ｅ） 臨床的転帰
ｆ） 第２の疾患のために患者によって服用された医薬
ｇ） 疾患ステージまたは疾患レベル
ｈ） 医療的併存症、および
ｉ） 患者の年齢。
ａ） 疾患のタイプ
ｂ） 処置前の免疫表現型
ｃ） 第１の疾患のために行った処置
ｄ） 時間の関数としての免疫表現型の変化
ｅ） 臨床的転帰
ｆ） 第２の疾患のために患者によって服用された医薬
ｇ） 疾患ステージまたは疾患レベル
ｈ） 医療的併存症、および
ｉ） 患者の年齢。
【0115】
それらのパラメータのうちのいずれか１つの変化が、他のパラメータに影響し得る。例えば、免疫系に影響を及ぼす第１の疾患のための処置を受けている患者が、処置の開始後に、第２の疾患、すなわち医療的併存症と診断された場合、第２の疾患の原因因子または第２の疾患の症状のどちらか一方は、以下：
第１の疾患の処置の臨床的転帰
経時的な患者の免疫表現型の変化
第１の疾患のステージもしくはレベル、および／または
第１の疾患のために行われた処置の有効性
に影響を及ぼし得る。
第１の疾患の処置の臨床的転帰
経時的な患者の免疫表現型の変化
第１の疾患のステージもしくはレベル、および／または
第１の疾患のために行われた処置の有効性
に影響を及ぼし得る。
【0116】
同様に、第１の疾患の疾患ステージまたは疾患レベルの変化、例えば、ステージ２からステージ３へのがんの進行は、時間の関数としての患者の免疫表現型、第１の疾患の処置のプロトコル、および第１の疾患の処置の臨床的転帰に影響を及ぼし得る。
【0117】
したがって、データベースは、免疫モジュレート薬を用いた様々な疾患の処置に関する情報を含み、その疾患を呈する特定の患者がどのように所与の免疫モジュレート治療に応答するかに関する予測を可能にする。
【0118】
このようなデータベースの使用により、医療専門家は所与の疾患状態に対する患者の免疫系の応答を予測すること、および疾患または処置の経過期間にわたる患者の免疫表現型の変化を予測することが可能となる。データベースは、がん、自己免疫疾患および感染を含めた、多数の疾患の処置、監視および診断に有用となろう。免疫モジュレート剤は、一層一般的になっているので、このようなデータベースは、疾患の病因において、特定の時間における免疫系の状態を評価する能力、およびどの免疫モジュレート処置がその疾患を処置するのに最も有効であると思われるかを予測する能力を提供する。
【0119】
患者の採血またはフィンガースティック採血から得た血液試料はそれぞれ、採血の時に患者の免疫表現型について分析することができる。患者の疾患状態および現行の処置に関する情報と一緒にした上記の分析の結果は、存在する場合、データベースに存在するデータを比較して、患者の免疫表現型を効果的にモジュレートする可能性が最も高い処置計画を展開することができる。採血は、定期的な間隔で採取して分析することができ、これによって、医療専門家は、処置の経過期間にわたり、免疫状態または免疫表現型の変化を評価することが可能となる。現在の患者からのデータをデータベースに追加して、他の患者の評価を改善することができる可能性があり得る。これは、この分析が、がん、感染または自己免疫疾患のためのものであるかに関わりなく、複雑な免疫表現型解析を含めた、患者の血液の分析に関する膨大な商業的可能性を有する。免疫表現型解析を含む疾患の相互参照により生成することができるデータベースは、将来に患者を処置する強力な手段になろう。データベースは、免疫表現型解析および処置の状態に関して常に更新した情報を生成する生きたデータベースとなろう。患者の血液試料の免疫表現型解析は、適切にデータを解析および評価する能力を含む。このシステムによって、いくつかの疾患状態全体に行われる、適切な投与、処置および修正が可能となろう。データの収集量が増加につれて、増えたデータベースはまた、最も広い意味において、直接の医療専門家が診断、処置および免疫治療剤の投与を行う一助になり得るであろう。
【0120】
様々な例示的な実施形態は、ある特定の例示的なその態様に対する特定の参照物と共に詳細に記載されているが、本開示は、他の実施形態を可能にし得ること、およびその詳細は、様々な明白な点における修正を可能にし得ることを理解すべきである。当業者に容易に明白な通り、本開示の趣旨および範囲内に依然として留まりながら、変形および修正を行うことができる。したがって、上述の開示、記載および図は、例示目的に過ぎず、本開示を決して限定するものではなく、本開示は、特許請求の範囲によってのみ規定される。
【0121】
項目Ｆにおいて議論されている通り、骨肉腫の免疫適格性Ｋ７Ｍ２同所性マウスモデルにおける、転移に及ぼすＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィアの効果を探索する。ｎＩＬ－１２処置マウスの方が、用量に関係なく、未処置マウスよりもかなり良好な転帰を示したことが観察された。さらに、転移率の低下が、切断時の末梢血液中のＮＫ細胞百分率の増加とリンクした。血液免疫表現型（ＮＫ細胞百分率＞８．２１％）の特定の構成成分は、このような早期の臨床的な時間点（切断）における完全応答者と非応答者とを潜在的に区別することができるという観察は、明白な臨床的関連性を有する。これは、十分に情報が提供された仮説の生成に対する強固な基盤を提供する。実際に、遊離ｒｍＩＬ－１２の毒性検討は、ｎＩＬ－１２処置、すなわちＴＣＥ状態、ＰＭＮ－ＭＤＳＣ骨髄球増加症およびＮＫ細胞の枯渇と共に調査することができる、ＢＡＬＢ／ｃマウスに特異的なＩＬ－１２誘導毒性に着目したものであった。これにより、遊離ｒｍＩＬ－１２が、ＢＡＬＢ／ｃ全身性免疫表現型の識別可能な変化を誘発することが確立された。さらに、ｎＩＬ－１２治療は、転移性ＯＳ腫瘍に有効となり得、疾患再発の機会を低減することが示され得る。さらに、末梢血液中のＮＫ細胞百分率のモニタリングにより、ｎＩＬ－１２に対する応答および転帰に関する情報を提供することができる。このデータは、全身性免疫表現型解析および実験的な免疫療法を連携して使用し、転移性ＯＳに対する有効な免疫治療レジメンを生成することができることを支持する。
【0122】
本開示の様々な実施形態が、本明細書に示されて、記載されているが、このような実施形態が単なる例として提示されていることは、当業者に明白である。本発明から逸脱することなく、多数の変形形態、変更形態および置換形態を当業者が思いつくことができる。本明細書に記載されている本開示の実施形態の様々な代替形態を使用することができることを理解すべきである。
【実施例】
【0123】
以下の実施例では、ジクロロメタン（ＤＣＭ、＃３２０２６９）、ＰＬＧＡ（Ｒｅｓｏｍｅｒ ＲＧ７５６Ｓ、７５％ラクチド、＃７１９９２７）、ＮａＣｌ（＃７６４７－１４－５）およびポリ（ビニルアルコール）（＃３４１５８４）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。フルオレセインイソチオシアネート標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ－ＦＩＴＣ、＃Ａ２３０１５）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、１０，０００Ｕ／ｍｌ、＃１５１４０１２２）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸、トリス（トリエチルアンモニウム）塩は、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。組換えマウスＩＬ－１２（ｐ７０、ｒｍＩＬ－１２、＃５７７００８）およびマウスＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ ｄｅｌｕｘｅ ＥＬＩＳＡキット（＃４３３６０６）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。
【0124】
Ｇｉｂｃｏ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｈｅａｔ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＵＳ Ｏｒｉｇｉｎ（ＨＩ－ＦＢＳ、＃ＭＴ３５０１１ＣＶ）およびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １Ｘ（ＤＰＢＳ、＃２１０３１ＣＶ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から購入した。
【0125】
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）（＃０００６５１）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。
【0126】
項目Ａ． ＩＬ－１２安定性検討。
（実施例１）
酸性溶液および塩基性溶液中のＩＬ－１２の安定性。
ＩＬ－１２が、ＰＬＧＡナノスフィアの酸性ナノ環境で取り扱うことができるかどうかを判定するため、３時間の様々なｐＨの溶液への曝露後の生物活性な組換えマウスＩＬ－１２の回収を試験した。具体的には、ＩＬ－１２をｐＨ１の溶液、ｐＨ３の溶液、ｐＨ７．４の溶液、ｐＨ１１の溶液およびｐＨ１３の溶液中で３時間、インキュベートした。これらの結果が、表１に示されている。酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、初期濃度に対する、回収した活性なＩＬ－１２の百分率を求め、その天然でのタンパク質の量、およびしたがって、生物活性な立体構造を決定した。
（実施例１）
酸性溶液および塩基性溶液中のＩＬ－１２の安定性。
ＩＬ－１２が、ＰＬＧＡナノスフィアの酸性ナノ環境で取り扱うことができるかどうかを判定するため、３時間の様々なｐＨの溶液への曝露後の生物活性な組換えマウスＩＬ－１２の回収を試験した。具体的には、ＩＬ－１２をｐＨ１の溶液、ｐＨ３の溶液、ｐＨ７．４の溶液、ｐＨ１１の溶液およびｐＨ１３の溶液中で３時間、インキュベートした。これらの結果が、表１に示されている。酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、初期濃度に対する、回収した活性なＩＬ－１２の百分率を求め、その天然でのタンパク質の量、およびしたがって、生物活性な立体構造を決定した。
【表1】
【0127】
表１において分かる通り、ＩＬ－１２は、７．４～１１のｐＨの値において良好な安定性を有しており、この範囲の外側になる変性を受け得る。
【0128】
（実施例２）
有機溶媒中のＩＬ－１２の安定性。
ＰＬＧＡナノスフィアを合成する二重エマルション法は、有機溶媒にＰＬＧＡを溶解させることを含むことができる。したがって、ＩＬ－１２の安定性を様々な極性のいくつかの非プロトン性溶媒中で試験した。試験した有機溶媒は、親水性が増加する順序で、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、酢酸エチル（ＥＡ）およびアセトン（ＡＣ）であった。ＤＣＭは、ＰＬＧＡを十分に溶解させるが、ＤＣＭは、最も疎水性でもあり、したがって、ＩＬ－１２の生物活性に最大の効果を及ぼすことができる。ＰＬＧＡは、アセトンへの溶解度は乏しいものとなり得るが、この溶媒は最も極性であり、したがって、ＩＬ－１２の生物活性への影響は最も低くなり得る。
有機溶媒中のＩＬ－１２の安定性。
ＰＬＧＡナノスフィアを合成する二重エマルション法は、有機溶媒にＰＬＧＡを溶解させることを含むことができる。したがって、ＩＬ－１２の安定性を様々な極性のいくつかの非プロトン性溶媒中で試験した。試験した有機溶媒は、親水性が増加する順序で、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、酢酸エチル（ＥＡ）およびアセトン（ＡＣ）であった。ＤＣＭは、ＰＬＧＡを十分に溶解させるが、ＤＣＭは、最も疎水性でもあり、したがって、ＩＬ－１２の生物活性に最大の効果を及ぼすことができる。ＰＬＧＡは、アセトンへの溶解度は乏しいものとなり得るが、この溶媒は最も極性であり、したがって、ＩＬ－１２の生物活性への影響は最も低くなり得る。
【0129】
溶媒とリン酸緩衝塩溶液とが１：１の溶液にＩＬ－１２を加え、撹拌して有機溶媒を完全に除去し、残留した生物活性なＩＬ－１２濃縮物を次に、ＥＬＩＳＡを使用して決定し、初期濃度に対する百分率として表した。これらの結果が、表２に示されている。興味深いことに、ＡＣは、タンパク質に対して最も有害な作用を有し、わずか４３％（ＳＥ＝１．０６％）が回収された一方、ＥＡは、６３％（ＳＥ＝０．７７％）という最高の回収率を示した。ＤＣＭは、タンパク質の約半分がその元々の形態で残った（４９％、ＳＥ＝０．５５）。
【表2】
【0130】
特に示さない限り、ＤＣＭをさらなる例において、ナノスフィアバッチを生成するために使用した。ＤＣＭを溶媒として使用すると、酢酸エチルと比較して、タンパク質回収率の低下がもたらされたが、ＤＣＭは、ＰＬＧＡをより良く溶解させ、良好なナノスフィア幾何形状をもたらす。
【0131】
（実施例３）
超音波処理時のＩＬ－１２の安定性。
エマルションを形成するため、ＰＬＧＡナノスフィアを合成する際には、ＩＬ－１２に超音波処理を２回、施すことができる。ナノスフィアを調製している間の超音波処理により、一様かつより小さなナノスフィアをもたらすことができる。しかし、ＩＬ－１２のような感受性の高いタンパク質は、強力な撹拌に曝露されると、変性状態になる。
超音波処理時のＩＬ－１２の安定性。
エマルションを形成するため、ＰＬＧＡナノスフィアを合成する際には、ＩＬ－１２に超音波処理を２回、施すことができる。ナノスフィアを調製している間の超音波処理により、一様かつより小さなナノスフィアをもたらすことができる。しかし、ＩＬ－１２のような感受性の高いタンパク質は、強力な撹拌に曝露されると、変性状態になる。
【0132】
したがって、様々な超音波処理のワット数および時間を試験して、ＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィア合成のための好適な条件を求めた。ＩＬ－１２をリン酸緩衝塩溶液に懸濁させて、３０ワット、４０ワットまたは５０ワットで超音波処理した。超音波処理の時間は、１０、２０、３０、４０または６０秒とし、ベースラインを比較した。次に、超音波処理後に残留した生物活性なＩＬ－１２濃縮物をＥＬＩＳＡを使用して求め、初期濃度に対する百分率として表した。図３において分かる通り、ＩＬ－１２は、３０秒を過ぎた場合のタンパク質の回収率が、すべてのワット数の場合で１０％未満であったので、ワット数よりも時間の方に感受性が高いことが判明した。様々なＩＬ－１２を搭載したバッチの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を図４Ａ～４Ｃに示す。図３における、四角形の囲みは、大部分のタンパク質を回収した時間／ワット数、すなわち、３０ワット～５０ワットで５～３０秒間の超音波処理の組合せを表示している。
【0133】
特に示さない限り、後の実施例において超音波処理によって作製したナノスフィアは、以下を使用して調製した：
１０～２０秒間で３０ワットの超音波処理
１０～１５秒間で４０ワットの超音波処理、または
１０～１５秒間で５０ワットの超音波処理。
１０～２０秒間で３０ワットの超音波処理
１０～１５秒間で４０ワットの超音波処理、または
１０～１５秒間で５０ワットの超音波処理。
【0134】
項目Ｂ． ＰＬＧＡナノスフィアに関する検討。
（実施例４）
ＰＬＧＡナノスフィアの合成
油相を生成するため、８００ｍｇのＰＬＧＡを、５００ＲＰＭの磁気撹拌子を使用して、２時間、室温で３２ｍｌのＤＣＭに溶解させた。
（実施例４）
ＰＬＧＡナノスフィアの合成
油相を生成するため、８００ｍｇのＰＬＧＡを、５００ＲＰＭの磁気撹拌子を使用して、２時間、室温で３２ｍｌのＤＣＭに溶解させた。
【0135】
エマルションの水性相を生成するため、２４００ｍｇのＰＶＡおよび９６ｍｇのＮａＣｌを１２０ｍｌの脱イオン水に溶解させ、濁りが無くなるまで、標準的な調理用マイクロ波において、ＨＩＧＨという設定で１０秒間のバーストでマイクロ波処理した。次に、水性相を氷上で冷却した。
【0136】
第１のエマルション（ｗ１）は、カプセル封入した物質を１．２ｍＬのＤＰＢＳに懸濁させることによって作製し、得られた懸濁液を油相に加え、組織ホモジナイザーを使用してこれを６分間、１７，５００ＲＰＭで撹拌した。撹拌を氷上で行った。対照として、ブランク粒子は、ＤＰＢＳ中で懸濁した非カプセル封入物質を用いて作製した。
【0137】
第２のエマルション（ｗ２）は、第１のエマルションを１２０ｍｌの水性相にゆっくりと注ぎ入れることによって形成した。第１のエマルションの添加中、組織ホモジナイザーを用いて、水性相を１７，５００ＲＰＭで撹拌した。第１のエマルションの添加後、撹拌を合計で８分間、継続した。次に、得られた懸濁液を７５０ＲＰＭの磁気撹拌子を用いて１６時間、撹拌し、有機溶媒を蒸発させた。
【0138】
溶媒が一旦蒸発すると、得られた溶液を３回、３５００ＲＰＭで遠心分離した。各遠心分離工程後、ナノスフィアのペレットを回収して再懸濁させた一方、遠心分離中に生成した上清を収集して、氷上に保管した。次に、ナノスフィアを２０，０００ＲＰＭで４０分間、摂氏４度で超遠心分離することにより２回、洗浄し、液体窒素中で急速凍結して、摂氏－２０度で保管した。
【0139】
次に、ナノスフィアを真空下で凍結乾燥し、ナノスフィアから水を除去することができる。
【0140】
得られたナノスフィアの特性を表３に要約する。表３に記載されている、ＦＩＴＣ標識ＢＳＡを含有するナノスフィアを共焦点顕微鏡により画像化し、内部構造を可視化した。図５Ａに示されている通り、Ｚスタック分析によって、ＦＩＴＣ標識したＢＳＡは、ナノスフィア内部に首尾よく取り込まれたことが確認された。
【0141】
ブランク（図４Ａ～４Ｃ）とＩＬ－１２を搭載した（図５Ｂおよび５Ｃ）ＰＬＧＡナノスフィアの両方の幾何形状を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により、形状が球体であると求まり、平均粒子直径は、それぞれ、２０１．７±６．７ｎｍ（図６Ａ）および１３８．１±１０．８ｎｍ（図６Ｂ）であった。ブランクと搭載したＰＬＧＡナノスフィアの両方のゼータ電位もまた決定し、電圧の大きさは、それぞれ、－２１．３±０．８０８ｍＶ（図６Ｃ）から－１５．１±１．２４９ｍＶ（図６Ｄ）に低下した。
【0142】
Ａｌｅｘａ６４７色素およびフルオレセインイソチオシアネート標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ－ＦＩＴＣ）を含有するナノスフィアもまた、上記の手順を使用して、首尾よく調製した。
【表3】
【0143】
（実施例５）
ナノスフィアＩＬ－１２溶出プロファイル。
ＩＬ－１２をカプセル封入するＰＬＧＡナノスフィアは、実施例４の方法によって得た。３種の異なる濃度（５億個の粒子／ｍＬ、７．５億個の粒子／ｍＬおよび１０億個の粒子／ｍＬ）のＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィアを５００μｌのナノスフィア放出緩衝液（ＮＲＢ、ＤＰＢＳ中の１０％ ＨＩ－ＦＢＳおよび１００単位／ｍｌのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中で調製した。次に、この懸濁液を４℃で１５分間、遠心分離し、ナノスフィアをペレット化し、この後、一定分量の上清２５０ｕｌを抜き取り、４℃で保管した。次に、氷上で、２５０μｌのＮＲＢをペレットに加え、全量を５００μｌに戻し、これを再懸濁させて、一定撹拌（７５０ＲＰＭ）しながら２４時間、３７℃でインキュベートした。このプロセスを１２日間にわたり、合計で１２個の試料に繰り返した（１時間点の試料／２４時間）。各一定分量を少なくとも２４時間、摂氏４度で保管して放出緩衝液と平衡にした後、ＩＬ－１２濃度をＥＬＩＳＡで決定した。経時的な放出された生物活性なＩＬ－１２濃度について、一定分量をＥＬＩＳＡにより分析した。
ナノスフィアＩＬ－１２溶出プロファイル。
ＩＬ－１２をカプセル封入するＰＬＧＡナノスフィアは、実施例４の方法によって得た。３種の異なる濃度（５億個の粒子／ｍＬ、７．５億個の粒子／ｍＬおよび１０億個の粒子／ｍＬ）のＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィアを５００μｌのナノスフィア放出緩衝液（ＮＲＢ、ＤＰＢＳ中の１０％ ＨＩ－ＦＢＳおよび１００単位／ｍｌのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）中で調製した。次に、この懸濁液を４℃で１５分間、遠心分離し、ナノスフィアをペレット化し、この後、一定分量の上清２５０ｕｌを抜き取り、４℃で保管した。次に、氷上で、２５０μｌのＮＲＢをペレットに加え、全量を５００μｌに戻し、これを再懸濁させて、一定撹拌（７５０ＲＰＭ）しながら２４時間、３７℃でインキュベートした。このプロセスを１２日間にわたり、合計で１２個の試料に繰り返した（１時間点の試料／２４時間）。各一定分量を少なくとも２４時間、摂氏４度で保管して放出緩衝液と平衡にした後、ＩＬ－１２濃度をＥＬＩＳＡで決定した。経時的な放出された生物活性なＩＬ－１２濃度について、一定分量をＥＬＩＳＡにより分析した。
【0144】
溶出したＩＬ－１２の総量をＥＬＩＳＡおよび続いて曲線下面積（ＡＵＣ）分析によって、以下の通り求まった：
５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、１９０７．６６±１６２．００ｐｇ
７．５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、３３２９．７７±１６２．６７ｐｇ、および
１０億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、３４１５．６４±８４８．９４ｐｇ。
５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、１９０７．６６±１６２．００ｐｇ
７．５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、３３２９．７７±１６２．６７ｐｇ、および
１０億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、３４１５．６４±８４８．９４ｐｇ。
【0145】
１００，０００個のナノスフィアあたり溶出されたＩＬ－１２の量は、以下と求まった：
５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、０．３８１５±０．０３２４０ｐｇ／１００，０００個の粒子
７．５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、０．４４４０±０．０２１６９ｐｇ／１００，０００個の粒子および
１０億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、０．３４１６±０．０８４８９ｐｇ／１００，０００個の粒子。
５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、０．３８１５±０．０３２４０ｐｇ／１００，０００個の粒子
７．５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、０．４４４０±０．０２１６９ｐｇ／１００，０００個の粒子および
１０億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、０．３４１６±０．０８４８９ｐｇ／１００，０００個の粒子。
【0146】
７．５億個の粒子／ｍＬ試料が、試験した３種の濃度の最も有効な溶出速度であると報告した。
【0147】
図７Ａにおいて分かる通り、７．５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度における、時間の関数として溶出されたＩＬ－１２濃度の方が、５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度における、時間の関数として溶出されたＩＬ－１２濃度よりもかなり高い。しかし、７．５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度における、時間の関数としてのＩＬ－１２溶出量と、１０億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度における、時間の関数としてのＩＬ－１２溶出量との間に差はほとんどあり得なかった。図７Ａにおいてやはり分かる通り、ＩＬ－１２ナノ粒子は、二相溶出プロファイルを示し、バースト相は、約２日間、続き、持続放出相は、ほぼ、約３日目～１１日目まで続いた。さらに、７．５億個の粒子／ｍＬのナノスフィアの濃度における、経時的に溶出したＩＬ－１２の総量は、５億個の粒子／ｍＬのナノスフィアの濃度において溶出したＩＬ－１２の総量よりも約７５％高くなり得る。しかし、１０億個の粒子／ｍＬのナノスフィアの濃度において溶出したＩＬ－１２の総量は、７．５億個の粒子／ｍＬの濃度において溶出したＩＬ－１２の総量よりも約２．６％しか高くなり得ない。図７Ｂで分かる通り、１００，０００個の粒子あたりの時間の関数として溶出したＩＬ－１２濃度は、５００，０００個の粒子／ｍＬまたは１０億個の粒子／ｍＬのどちらか一方の濃度における場合よりも、７．５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度の場合の方が高くなり得る。
【0148】
図７Ｃに示されている通り、組換えマウスＩＬ－１２（ｒｍＩＬ－１２）を搭載したナノスフィアのカプセル封入効率（ＥＥ）は、式１を使用し、検討した３種の異なる粒子濃度に関して、各溶出プロファイルの曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して計算した。１００，０００個のナノスフィアあたり溶出されたＩＬ－１２の量は、５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、０．４４％、７．５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、０．５０％、および１０億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度では、０．３９％と求まった。平均カプセル封入効率（ＥＥ）は、０．４４３％±０．０５５１％となり得る。試験濃度からの溶出速度が様々となるため、ＥＥを３種の濃度のすべてに関して報告し、続いて、平均して全ＥＥに反映させた。
【0149】
上記のデータに基づくと、ナノスフィア濃度を７．５億個の粒子／ｍＬより高く増加させると、薬物の溶出プロファイルの有意な増加はもたらすことができない。これは、高い粒子濃度ではカプセル封入効率が低下するためである可能性がある。しかし、これは、少量（５００μＬ）の溶出溶媒において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの粒子の溶出が制限されたことに起因し得る。ナノスフィア濃度が７．５億個の粒子／ｍＬを超えて増加すると、より多い量での溶出、例えば、より多い量のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶出溶媒またはｉｎ ｖｉｖｏでの血液供給により、溶出プロファイルが増加する可能性がある。
【0150】
（実施例６）
ｉｎ ｖｉｖｏでのＡｌｅｘａ６４７を搭載したＰＬＧＡナノスフィア基質の生体分布。
表１に記載されている蛍光色素であるＡｌｅｘａ６４７を搭載したＰＬＧＡナノスフィアを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。第１のマウスの群では、色素を搭載したＰＬＧＡナノスフィアを尾部静脈から静脈内に注射した。第２のマウスの群では、色素を搭載したＰＬＧＡナノスフィアを腹腔内に注射した。色素分布を、７６分間の期間にわたり、ＩＶＩＳ画像化によりモニタリングした。注射して３５分後に、図２に図示されている通り、両方の投与経路により、ナノスフィア内容物が全身に分布した。静脈内注射により、対象マウスの身体から標識色素の一般的な分布がもたらされた。腹腔内注射により、対象マウスの腹腔（abdominal cavity）内に標識色素が局所分布し、腹膜腔（peritoneal cavity）内に色素が最も集中して分布した。分布は、罹患または致死の何ら兆候なしに起こった。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＡｌｅｘａ６４７を搭載したＰＬＧＡナノスフィア基質の生体分布。
表１に記載されている蛍光色素であるＡｌｅｘａ６４７を搭載したＰＬＧＡナノスフィアを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。第１のマウスの群では、色素を搭載したＰＬＧＡナノスフィアを尾部静脈から静脈内に注射した。第２のマウスの群では、色素を搭載したＰＬＧＡナノスフィアを腹腔内に注射した。色素分布を、７６分間の期間にわたり、ＩＶＩＳ画像化によりモニタリングした。注射して３５分後に、図２に図示されている通り、両方の投与経路により、ナノスフィア内容物が全身に分布した。静脈内注射により、対象マウスの身体から標識色素の一般的な分布がもたらされた。腹腔内注射により、対象マウスの腹腔（abdominal cavity）内に標識色素が局所分布し、腹膜腔（peritoneal cavity）内に色素が最も集中して分布した。分布は、罹患または致死の何ら兆候なしに起こった。
【0151】
項目Ｃ． 超音波処理によるＰＬＧＡナノスフィアに関する検討。
（実施例７）
超音波処理によるＰＬＧＡナノスフィアの合成。
油相を生成するため、２５０ｍｇのＰＬＧＡを、室温で１．５１ｍｌのＤＣＭに溶解させた。１ｇのＰＶＡを１００ｍｌの脱イオン水に溶解させ、水性相を生成した。次に、この水性相を氷上で冷却した。第１のエマルション（ｗ１）は、約２０±６マイクロリットルのＤＰＢＳ中に１２．５マイクログラムのＩＬ－１２を懸濁し、得られた懸濁液を、３０～５０ワットで１０～２０秒間、超音波処理しながら油相に添加することによって作製した。
（実施例７）
超音波処理によるＰＬＧＡナノスフィアの合成。
油相を生成するため、２５０ｍｇのＰＬＧＡを、室温で１．５１ｍｌのＤＣＭに溶解させた。１ｇのＰＶＡを１００ｍｌの脱イオン水に溶解させ、水性相を生成した。次に、この水性相を氷上で冷却した。第１のエマルション（ｗ１）は、約２０±６マイクロリットルのＤＰＢＳ中に１２．５マイクログラムのＩＬ－１２を懸濁し、得られた懸濁液を、３０～５０ワットで１０～２０秒間、超音波処理しながら油相に添加することによって作製した。
【0152】
第２のエマルション（ｗ２）は、第１のエマルションを５ｍｌの水性相にゆっくりと添加することによって形成した。第１のエマルションを添加している間、水性相に１０～３０秒間、３０～５０ワットの超音波処理を施した。次に、磁気撹拌子を用いて、得られた懸濁液を１，０００ＲＰＭで３時間、撹拌し、有機溶媒を蒸発させた。
【0153】
溶媒が一旦、蒸発すると、摂氏４度で１５分間、１０，０００ｇでの３回の超遠心分離処理によって、得られた溶液からナノスフィアを回収し、液体窒素中で急速凍結させて、摂氏－２０度で保管した。
【0154】
次に、ナノスフィアを真空下で凍結乾燥し、ナノスフィアから水を除去することができる。
【0155】
図８Ａは、３０ワットの超音波処理出力および１０秒～２０秒の範囲の超音波処理時間で、超音波処理を使用して調製したＩＬ－１２を搭載したナノスフィアを示している（表２のバッチ３０Ｗ１０Ｓ、３０Ｗ１５Ｓおよび３０Ｗ２０Ｓ）。
【0156】
図８Ｂは、４０ワットの超音波処理出力および１０～１５秒の範囲の超音波処理時間での超音波処理を使用して調製した、ＩＬ－１２を搭載したナノスフィアを示している（表２のバッチ４０Ｗ１０Ｓおよび４０Ｗ１５Ｓ）。
【0157】
図８Ｃは、５０ワットの超音波処理出力および１０秒～１５秒の範囲の超音波処理時間での超音波処理を使用して調製した、ＩＬ－１２を搭載したナノスフィアを示している（表２の回分５０Ｗ１０Ｓおよび５０Ｗ１５Ｓ）。
【0158】
表４において分かる通り、１０～２０秒間、３０ワット～５０ワットの出力での超音波処理によって、約５％～約１０％のカプセル封入効率および－３０～－４０ｍＶの間のゼータ電位で、ＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィアが一般に生成する。
【表4】
【0159】
（実施例８）
超音波処理により調製したＰＬＧＡナノスフィアの溶出。
実施例５の手順によって、表２に示されているＩＬ－１２を搭載したナノスフィアの溶出特性を試験した。１日あたりのタンパク質濃度をＥＬＩＳＡによって求め、放出されたタンパク質の総量を未加工の溶出曲線下面積を使用して求めた。
超音波処理により調製したＰＬＧＡナノスフィアの溶出。
実施例５の手順によって、表２に示されているＩＬ－１２を搭載したナノスフィアの溶出特性を試験した。１日あたりのタンパク質濃度をＥＬＩＳＡによって求め、放出されたタンパク質の総量を未加工の溶出曲線下面積を使用して求めた。
【0160】
上記の手順によって得られた溶出曲線が、図９に示されている。表２の各バッチに関する溶出曲線は、初期バースト相、および持続放出相を伴う二相曲線を示す。バースト相は、水性媒体中での再懸濁時に、ナノスフィアの表面に吸着したタンパク質が放出されることに起因し得る一方、制御放出相は、ＰＬＧＡマトリックス内に捕捉されたタンパク質によるものであることができる。図８において分かる通り、一定の超音波処理期間、例えば１０秒の場合、バースト相の間の薬物放出の初期速度は、超音波処理出力の増加に伴って低下した。３０Ｗの出力で１０秒間（３０Ｗ１０Ｓ）、超音波処理したバッチでは、６０％～６５％の間のＩＬ－１２が１日以内に溶出され得る。５０Ｗの出力で１０秒間（５０Ｗ１０Ｓ）、超音波処理したバッチでは、５０％未満のＩＬ－１２が１日以内に溶出され得る。これは、ナノスフィアコア中のＰＬＧＡマトリックス内のタンパク質の百分率は、超音波処理出力が増加するにつれて増加することを示唆している。
【0161】
項目Ｄ． ＰＬＧＡナノスフィアに及ぼす撹拌速度の影響。
（実施例９）
油相を生成するため、磁気撹拌子を使用して、５００ＲＰＭで８００ｍｇのＰＬＧＡを室温で２時間、３２ｍｌのＤＣＭに溶解させた。
（実施例９）
油相を生成するため、磁気撹拌子を使用して、５００ＲＰＭで８００ｍｇのＰＬＧＡを室温で２時間、３２ｍｌのＤＣＭに溶解させた。
【0162】
エマルションの水性相を生成するため、２４００ｍｇのＰＶＡおよび９６ｍｇのＮａＣｌを１２０ｍｌの脱イオン水に溶解させ、濁りが無くなるまで、標準的な調理用マイクロ波において、ＨＩＧＨという設定で１０秒間のバーストでマイクロ波処理した。次に、水性相を氷上で冷却した。
【0163】
１．２ｍＬのＤＰＢＳ中に２５マイクログラムのＩＬ－１２を懸濁することによって、ＩＬ－１２懸濁液を調製した。
【0164】
ナノスフィアは、実施例４に記載されている通りに調製した。
【0165】
ＰＬＧＡナノスフィアにおけるＩＬ－１２のカプセル封入効率、およびＰＬＧＡナノスフィアからのＩＬ－１２の溶出プロファイルに及ぼす撹拌速度の影響を観察するため、第１および第２のエマルションを調製している間の撹拌を、１３，１２５ＲＰＭ；１５，３１２ＲＰＭ；１７，５００ＲＰＭ；１９，６８８ＲＰＭ；２１，８７５ＲＰＭ；２４，０６３ＲＰＭ；および２６，２５０ＲＰＭの速度で行った。撹拌速度の関数としてのカプセル封入効率を表５に示す。
【表5】
【0166】
図１０で分かる通り、７．５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度において、超音波処理よりもむしろ高速撹拌を使用して調製したＰＬＧＡナノスフィアからのＩＬ－１２の溶出プロファイルが、撹拌速度に高度に依存し得る。１７，５００ＲＰＭでの撹拌により、高いカプセル封入効率、および１２日間の期間にわたり、約４５００ｐｇとなるＩＬ－１２の全薬物放出量をもたらす。約１３，０００～約２０，０００ＲＰＭで撹拌すると、１２日間の期間にわたり、約３５００ｐｇまたはそれより多いＩＬ－１２の許容される薬物放出量をもたらす。約２２，０００ＲＰＭより高い撹拌により、低いカプセル封入効率、および１２日間の期間にわたり、３，０００ｐｇ未満のＩＬ－１２の全薬物放出量をもたらす。ＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィアを生成するための最適撹拌速度は、約１７，５００ＲＰＭであることができる。
【0167】
項目Ｅ． 可溶性サイトカインの放出に及ぼすナノスフィアの効果。
（実施例１０）
遊離ＩＬ－１２対ナノスフィアにカプセル封入したＩＬ－１２の放出。
骨肉腫（ＯＳ）は、マウスにおいて、図１１に示されている通り、チェックポイント遮断剤である抗ＰＤ－Ｌ１によって反転し得る、全身性免疫抑制を誘発する。抗ＰＤ－Ｌ１を使用すると、全身性免疫表現型はベースライン状態に戻り、ＯＳから免疫抑制を緩和する。しかし、ベースライン状態は、進行したＯＳを有するマウスでは、腫瘍負荷を効果的に軽減するほど十分な免疫刺激をもたらさない。図１１の線Ａを参照されたい。しかし、再発性および難治性の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対する、ＩＬ－１２が遊離ペプチドとして投与される、リツキシマブ／ＩＬ－１２併用療法の第ＩＩ相検討において、患者は、用量規定毒性（ＤＬＴ）の兆候を示した。それらの免疫状態または免疫表現型は、刺激のレベルを超えて、免疫細胞疲弊として知られている免疫系の過活性化の生命を脅かす状態の領域にまで押しのけられた。図１１の線Ｃを参照されたい。この目的は、過剰刺激または免疫細胞疲弊なしに、免疫系をベースラインレベルより上に刺激させることである。
（実施例１０）
遊離ＩＬ－１２対ナノスフィアにカプセル封入したＩＬ－１２の放出。
骨肉腫（ＯＳ）は、マウスにおいて、図１１に示されている通り、チェックポイント遮断剤である抗ＰＤ－Ｌ１によって反転し得る、全身性免疫抑制を誘発する。抗ＰＤ－Ｌ１を使用すると、全身性免疫表現型はベースライン状態に戻り、ＯＳから免疫抑制を緩和する。しかし、ベースライン状態は、進行したＯＳを有するマウスでは、腫瘍負荷を効果的に軽減するほど十分な免疫刺激をもたらさない。図１１の線Ａを参照されたい。しかし、再発性および難治性の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対する、ＩＬ－１２が遊離ペプチドとして投与される、リツキシマブ／ＩＬ－１２併用療法の第ＩＩ相検討において、患者は、用量規定毒性（ＤＬＴ）の兆候を示した。それらの免疫状態または免疫表現型は、刺激のレベルを超えて、免疫細胞疲弊として知られている免疫系の過活性化の生命を脅かす状態の領域にまで押しのけられた。図１１の線Ｃを参照されたい。この目的は、過剰刺激または免疫細胞疲弊なしに、免疫系をベースラインレベルより上に刺激させることである。
【0168】
しかし、活性化Ｔ細胞の脱抑制をもたらす抗ＰＤ－Ｌ１チェックポイント遮断の背景では、ＰＬＧＡナノスフィア（ＩＬ－１２－ＮＳ）の加水分解からの全身性腫瘍のマクロ環境への低用量ＩＬ－１２（一般に安全と考えられている）のゆっくりとした持続的な送達は、図１１の線Ｂに示されている通り、依然として疲弊閾値を下回った状態を維持しながらも、全身刺激をもたらして、腫瘍負荷を効果的に軽減することができる。リアルタイム免疫表現型のモニタリングプラットフォームは、本明細書に記載されているもののように、この用途に対して大きな価値があると思われる。
【0169】
したがって、可溶性薬物のための送達用ビヒクルとしての生分解性ＰＬＧＡナノスフィアの使用は、治療的に有効な程の低い用量の投与を可能にすることができる。これは、薬物の有効投与量と毒性用量との間の差が小さい場合に有用となり得る。
【0170】
項目Ｅ． 可溶性サイトカインの放出に及ぼすナノスフィア添加剤の効果。
（実施例１１）
薬物ＩＬ－１２を含有する７つのバッチのナノスフィアを調製した。これらのバッチの溶出プロファイルは、１０秒間、５０ワット出力での超音波処理により、実施例５の手順に従うことによって得た。
（実施例１１）
薬物ＩＬ－１２を含有する７つのバッチのナノスフィアを調製した。これらのバッチの溶出プロファイルは、１０秒間、５０ワット出力での超音波処理により、実施例５の手順に従うことによって得た。
【0171】
第１のバッチは、約２０±６マイクロリットルのＤＰＢＳおよびＰＶＡ／水相に１２．５マイクログラムのＩＬ－１２を懸濁させることによって作製したタンパク質溶液を使用し、実施例７の手順に従うことによって作製した。実施例７に列挙されていない添加剤を含めなかった。図１２に示されている通り、実施例５の方法による第１のバッチの溶出時に、初期バースト相が１～２日間続く、薬物の放出があり、２日目に、－Ｐ６５，０００ｐｇ／ｍＬのピークＩＬ－１２濃度に到達した。
【0172】
第２のバッチは、１．５％ｗ／ｖのトレハロースを含有する約２０±６マイクロリットルのＤＰＢＳに１２．５マイクログラムのＩＬ－１２を懸濁させることによって作製したタンパク質溶液を使用したことを除き、実施例７の手順に従うことによって作製した。第２のバッチの場合、初期バースト相が３日間続く、薬物の放出があり、３日目に、－Ｐ７５，０００ｐｇ／ｍＬのピークＩＬ－１２濃度に到達した。図１２で分かる通り、ナノスフィアを作製するために使用したタンパク質溶液中にトレハロースが存在すると、追加の添加剤なしに作製したナノスフィアからの薬物放出量に比べて、全薬物放出量（曲線下面積として測定される）が顕著に増加した。
【0173】
第３のバッチは、２％ｗ／ｖのＭｇ（ＯＨ）２を含有する約２０±６マイクロリットルのＤＰＢＳに１２．５マイクログラムのＩＬ－１２を懸濁させることによって作製したタンパク質溶液を使用したことを除き、実施例７の手順に従うことによって作製した。実施例５の方法による第３のバッチの溶出時に、初期バースト相が１日間続き、－Ｐ１０，０００ｐｇ／ｍＬのピークＩＬ－１２濃度となる薬物の放出があった。図１２で分かる通り、ナノスフィアを作製するために使用したタンパク質溶液中にＭｇ（ＯＨ）２が存在すると、追加の添加剤なしに作製したナノスフィアからの薬物放出量に比べて、全薬物放出量が低下した。
【0174】
第４のバッチの場合、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する約２０±６マイクロリットルのＤＰＢＳに１２．５マイクログラムのＩＬ－１２を懸濁させることによって作製したタンパク質溶液を使用し、実施例７の手順に従うことによってナノスフィアを作製した。実施例５の方法による溶出時に、初期バースト相が３日間続く、薬物の放出があり、２日目に、－Ｐ１１５，０００ｐｇ／ｍＬのピークＩＬ－１２濃度に到達した。図１３で分かる通り、タンパク質溶液中に１０％ＦＢＳが存在すると、追加の添加剤なしに作製したナノスフィアからの薬物放出量に比べて、全薬物放出量（曲線下面積として測定される）が顕著に増加した。
【0175】
第５のバッチの場合、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する約２０±６マイクロリットルのＤＰＢＳに１２．５マイクログラムのＩＬ－１２を懸濁させることによって作製したタンパク質溶液であって、ナノスフィアの生成前に２４時間、インキュベートしたタンパク質溶液を使用し、実施例７の手順に従うことによってナノスフィアを作製した。実施例５の方法による溶出時に、初期バースト相が３日間続く、薬物の放出があり、３日目に、－Ｐ１０５，０００ｐｇ／ｍＬ～－Ｐ１１０，０００ｐｇ／ｍＬのピークＩＬ－１２濃度に到達した。図１３Ａで分かる通り、タンパク質溶液中に１０％のインキュベートしたＦＢＳが存在すると、追加の添加剤なしに作製したナノスフィア、またはインキュベート工程の非存在下でＦＢＳを使用して作製したナノスフィアのどちらか一方からの薬物放出量と比べて、ナノスフィアからの全薬物放出量（曲線下面積として測定される）が顕著に増加した。図１３Ｂのゲル溶出に見られる通り、ナノスフィアの生成前の４８時間、タンパク質溶液をインキュベートすると、ＩＬ－１２の全放出量の低下がもたらされ、カプセル封入効率が低下した。
【0176】
第６のバッチの場合、ナノスフィアは、以下：
４％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有するＰＶＡ／水相、および
１４％ｗ／ｖのＳｐａｎ（登録商標）６０を含有する油相
を使用して実施例７の手順に従うことによって作製した。
実施例５の方法による溶出時に、初期バースト相が１日間続き、－Ｐ１２０，０００ｐｇ／ｍＬ～－Ｐ１２５，０００ｐｇ／ｍＬとなるピークＩＬ－１２濃度で、薬物の放出があった。図１４において分かる通り、タンパク質溶液中に界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＳｐａｎ（登録商標）６０が存在すると、追加の添加剤なしに作製されたナノスフィアからのピーク薬物放出量に比べて、ナノスフィアからのピーク薬物放出量が約２倍、増加した。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０が存在しても、全薬物放出量が実質的に増加した。
４％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有するＰＶＡ／水相、および
１４％ｗ／ｖのＳｐａｎ（登録商標）６０を含有する油相
を使用して実施例７の手順に従うことによって作製した。
実施例５の方法による溶出時に、初期バースト相が１日間続き、－Ｐ１２０，０００ｐｇ／ｍＬ～－Ｐ１２５，０００ｐｇ／ｍＬとなるピークＩＬ－１２濃度で、薬物の放出があった。図１４において分かる通り、タンパク質溶液中に界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＳｐａｎ（登録商標）６０が存在すると、追加の添加剤なしに作製されたナノスフィアからのピーク薬物放出量に比べて、ナノスフィアからのピーク薬物放出量が約２倍、増加した。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０が存在しても、全薬物放出量が実質的に増加した。
【0177】
第７のバッチの場合、ナノスフィアは、以下：
１０％ｗ／ｖのＦＢＳおよび４％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有するＰＶＡ／水相；および１４％ｗ／ｖのＳｐａｎ（登録商標）６０を含有する油相
を使用して実施例７の手順に従うことによって作製した。
実施例５の方法による溶出時に、初期バースト相が１日間続き、約－５８０，０００ｐｇ／ｍＬのピークＩＬ－１２濃度で、薬物の放出があった。図１４において分かる通り、タンパク質溶液中にＦＢＳと界面活性剤の両方が存在すると、追加の添加剤なしに作製されたナノスフィアからの－６５，０００ｐｇ／ｍＬとなるピーク薬物放出量に比べて、ナノスフィアからのピーク薬物放出量がほぼ、約９倍、増加した。ＦＢＳおよびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０の両方が存在するとやはり、
ＦＢＳ単独で作製されたナノスフィアからの－１１５，０００ｐｇ／ｍＬとなるピーク薬物放出量に比べて、ナノスフィアからのピーク薬物放出量がほぼ、約４．５倍、増加し、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０単独で作製されたナノスフィアからの－１２０，０００ｐｇ／ｍＬとなるピーク薬物放出量に比べて、ナノスフィアからのピーク薬物放出量が、ほぼ、約４．５倍、増加した。
１０％ｗ／ｖのＦＢＳおよび４％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有するＰＶＡ／水相；および１４％ｗ／ｖのＳｐａｎ（登録商標）６０を含有する油相
を使用して実施例７の手順に従うことによって作製した。
実施例５の方法による溶出時に、初期バースト相が１日間続き、約－５８０，０００ｐｇ／ｍＬのピークＩＬ－１２濃度で、薬物の放出があった。図１４において分かる通り、タンパク質溶液中にＦＢＳと界面活性剤の両方が存在すると、追加の添加剤なしに作製されたナノスフィアからの－６５，０００ｐｇ／ｍＬとなるピーク薬物放出量に比べて、ナノスフィアからのピーク薬物放出量がほぼ、約９倍、増加した。ＦＢＳおよびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０の両方が存在するとやはり、
ＦＢＳ単独で作製されたナノスフィアからの－１１５，０００ｐｇ／ｍＬとなるピーク薬物放出量に比べて、ナノスフィアからのピーク薬物放出量がほぼ、約４．５倍、増加し、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０単独で作製されたナノスフィアからの－１２０，０００ｐｇ／ｍＬとなるピーク薬物放出量に比べて、ナノスフィアからのピーク薬物放出量が、ほぼ、約４．５倍、増加した。
【表6】
【0178】
これらの改変したナノスフィアバッチに関するピーク薬物放出量、全薬物放出量、薬物放出量／１００，０００個の粒子、カプセル封入効率（ＥＥ）およびゼータ電位が、表６に記録されている。この表に示されている通り、ナノスフィアからの薬物ＩＬ－１２の溶出時のピーク薬物放出量および全薬物放出量は、トレハロース、ＦＢＳ、２４時間のインキュベートを伴うＦＢＳ、界面活性剤、またはそれらの混合物からなる群から選択される添加剤の存在下でナノスフィアを作製することによって増加させることができる。同様に、２４時間のインキュベートを伴うＦＢＳ、界面活性剤、またはＦＢＳと界面活性剤との混合物は、カプセル封入効率の劇的な増加をもたらす。溶出時のピーク薬物放出量および全薬物放出量は、ＦＢＳと界面活性剤の両方の存在下で、ナノスフィアを作製することによって相乗的に増加させることができる。
【0179】
図１５Ａおよび１５Ｂにおいて分かる通り、溶液を１０秒間、５０Ｗで超音波処理した（５０Ｗ１０Ｓ）ナノスフィアのバッチ、インキュベートのないＦＢＳ（「ベースライン」）（Ｂ）、２４時間のインキュベートを伴うＦＢＳ（２４Ｈ）、および４８時間のインキュベートを伴うＦＢＳ（４８Ｈ）を、溶出率（図１５Ａ）および全溶出量のパーセント（図１５Ｂ）として比較した。全量のパーセントにより、改変したバッチに対する溶出プロファイルの正確な比較が可能となる。これらの図に関する値が、表７に見られる。５０Ｗ１０Ｓの溶出とベースラインおよびインキュベートしたバッチとの比較が、表８に示されている。
【表7】
【表8】
【0180】
項目Ｆ． 骨肉腫の免疫適格性Ｋ７Ｍ２同所性マウスモデルにおける、転移および治癒速度に及ぼす、ＩＬ－１２を搭載したポリ（乳酸－ＣＯ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノスフィアの効果
マウス
４～５週齢の雄および雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（ストック番号：０００６５１）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得て、１２時間の明／暗サイクルで、自動でｌｉｘｉｔ水を、および食物を自由摂取させて、トウモロコシ穂軸の寝床で特定の病原体不含施設内の換気されたＡｌｌｅｎｔｏｗｎケージで個別に収容した。実験はすべて、施設内動物管理委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認を受けた。
マウス
４～５週齢の雄および雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（ストック番号：０００６５１）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得て、１２時間の明／暗サイクルで、自動でｌｉｘｉｔ水を、および食物を自由摂取させて、トウモロコシ穂軸の寝床で特定の病原体不含施設内の換気されたＡｌｌｅｎｔｏｗｎケージで個別に収容した。実験はすべて、施設内動物管理委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認を受けた。
【0181】
ＯＳ腫瘍を有するマウスのｉｎ ｖｉｖｏ画像化システム（ＩＶＩＳ）による画像化
疾病負荷をモニタリングするためのＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅバージョン４．５ソフトウェアを用い、ＩＶＩＳスペクトルＣＴ画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、動物を触診可能な原発腫瘍の最初の兆候から、およびその後は毎週の間隔で、ＩＶＩＳで画像化した。各セッションにおいて、マウスは、１５０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．のＤ－ルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）の投与を受け、肺における転移性疾患を可視化し、マウスは、さらに１５ｍｇ／ｋｇの鼻内へのＤ－ルシフェリン（ほぼ、３０μＬ）の投与を受けた。画像は、最大生物発光の所定の間隔内で、自動露出を使用してキャプチャした。
疾病負荷をモニタリングするためのＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅバージョン４．５ソフトウェアを用い、ＩＶＩＳスペクトルＣＴ画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、動物を触診可能な原発腫瘍の最初の兆候から、およびその後は毎週の間隔で、ＩＶＩＳで画像化した。各セッションにおいて、マウスは、１５０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．のＤ－ルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）の投与を受け、肺における転移性疾患を可視化し、マウスは、さらに１５ｍｇ／ｋｇの鼻内へのＤ－ルシフェリン（ほぼ、３０μＬ）の投与を受けた。画像は、最大生物発光の所定の間隔内で、自動露出を使用してキャプチャした。
【0182】
フローサイトメトリー（ＦＣ）
赤血球をＲｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ（ＲＢＣ）Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いて溶解させた。単一細胞懸濁液を分けて、製造業者の使用説明書に準拠して、最適化リンパ球（Ｌ）および骨髄（Ｍ）抗体パネルと共にインキュベートした。１×１０４の事象の最小値を各試料について分析した。
赤血球をＲｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ（ＲＢＣ）Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いて溶解させた。単一細胞懸濁液を分けて、製造業者の使用説明書に準拠して、最適化リンパ球（Ｌ）および骨髄（Ｍ）抗体パネルと共にインキュベートした。１×１０４の事象の最小値を各試料について分析した。
【0183】
組織学
安楽死の際にＩＶＩＳで陽性な肺腫瘍転移を有していなかったすべてのｎＩＬ－１２処置マウスの肺に対して組織学を行った。未処置対照群の転移率は、組織学とＩＶＩＳ陽性との組合せにより評価した。安楽死後、ｎＩＬ－１２処置マウスの肺をまとめて直ちに採取し、中性の緩衝ホルマリンに入れて、ミクロトームにマウントした。５０μｍの切片を２５０μｍ毎に取得し、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色して、認定病理学者によって、試験体の腫瘍転移の有無について分析した。
安楽死の際にＩＶＩＳで陽性な肺腫瘍転移を有していなかったすべてのｎＩＬ－１２処置マウスの肺に対して組織学を行った。未処置対照群の転移率は、組織学とＩＶＩＳ陽性との組合せにより評価した。安楽死後、ｎＩＬ－１２処置マウスの肺をまとめて直ちに採取し、中性の緩衝ホルマリンに入れて、ミクロトームにマウントした。５０μｍの切片を２５０μｍ毎に取得し、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色して、認定病理学者によって、試験体の腫瘍転移の有無について分析した。
【0184】
統計解析
分類した臨床データ（転移率および無病率）間の有意性を判定するため、両側カイ二乗検定を使用した。健常なマウスおよび疾患のあるｎＩＬ－１２処置マウス間の末梢血液中のＮＫ集団率を比較するため、両群の平均値を各時間点で求め、標準偏差（ＳＤ）を計算した。統計学的有意性は、対応のない両側ｔ検定によって求めた。
分類した臨床データ（転移率および無病率）間の有意性を判定するため、両側カイ二乗検定を使用した。健常なマウスおよび疾患のあるｎＩＬ－１２処置マウス間の末梢血液中のＮＫ集団率を比較するため、両群の平均値を各時間点で求め、標準偏差（ＳＤ）を計算した。統計学的有意性は、対応のない両側ｔ検定によって求めた。
【0185】
実験設計
３０匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの頬から１００μＬの全血を出血させた後（赤い矢印）、１×１０６個のｌｕｃ－Ｋ７Ｍ２ ＯＳ腫瘍細胞を脛骨内接種した。原発腫瘍を定着させた第１の１２匹のマウスの頬を再度、出血させて、続いて、３つのｎ＝４のｎＩＬ－１２投与群（低用量：０．１ｍｇ、中用量１ｍｇまたは高用量１０ｍｇ）に無作為化した。原発腫瘍のＩＶＩＳによる確認後、ｎＩＬ－１２の第１の用量（青色矢印）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。マウスをＩＶＩＳにより画像化し、これ以降、毎週の間隔で投与し、頬からの出血を連続して５、６、８、１０および１２週目に行った。１２週目の頬の出血直後、マウスを安楽死させた。５週間目に、腫瘍を有する四肢を切断した。
３０匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの頬から１００μＬの全血を出血させた後（赤い矢印）、１×１０６個のｌｕｃ－Ｋ７Ｍ２ ＯＳ腫瘍細胞を脛骨内接種した。原発腫瘍を定着させた第１の１２匹のマウスの頬を再度、出血させて、続いて、３つのｎ＝４のｎＩＬ－１２投与群（低用量：０．１ｍｇ、中用量１ｍｇまたは高用量１０ｍｇ）に無作為化した。原発腫瘍のＩＶＩＳによる確認後、ｎＩＬ－１２の第１の用量（青色矢印）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。マウスをＩＶＩＳにより画像化し、これ以降、毎週の間隔で投与し、頬からの出血を連続して５、６、８、１０および１２週目に行った。１２週目の頬の出血直後、マウスを安楽死させた。５週間目に、腫瘍を有する四肢を切断した。
【0186】
健常なマウスにおける遊離ＩＬ－１２毒性のｉｎ ｖｉｖｏ誘発
４匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたり２匹の雌および２匹の雄）の２つの群の頬から、４ｍｍの滅菌Ｇｏｌｄｅｎｒｏｄ Ａｎｉｍａｌ Ｌａｎｃｅｔ（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＭＡ）を使用して、顔面の静脈叢を刺すことによって頬を出血させて、ベースライン免疫表現型解析のために１００μＬの全血を集めた。頬を出血させた直後に、１５０μＬのＤＰＢＳ中に０．１％のマウス血清アルブミン（ＭＳＡ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む、低（１００ｎｇ）用量または高（１００μｇ）用量の遊離組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ－１２（ｅＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の一方を、眼窩後（ｒ．ｏ．）注射して各群に投与した。ｒ．ｏ．注射後、２４時間および４８時間時に、免疫表現型解析を行うために、マウスの頬をさらに出血させた。
ｎＩＬ－１２合成
ｎＩＬ－１２ナノスフィアは、二重エマルション溶媒蒸発技法を使用して調製した（３３）。手短に述べると、ＤＰＢＳ中に１０％のマウス血清アルブミン（ＭＳＡ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む、１５０μＬの８３．３ｍｇ／ｍＬ組換えマウスのＩＬ－１２（ｒｍＩＬ－１２、ｅＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、１４％ｗ／ｗのＳｐａｎ（登録商標）６０（Ｓｉｇｍａ）を含む１．５１ｍＬのジクロロメタン（dicholoromethane）（Ｓｉｇｍａ）に溶解された２５０ｍｇのＰＬＧＡ ｒｅｓｏｍｅｒ ＲＧ ５０３Ｈ（Ｓｉｇｍａ）に加えた。得られたエマルションを、氷上で１０秒間、５０Ｗで超音波処理した後、４％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（Ｓｉｇｍａ）を含む１％ｗ／ｖのポリビニルアルコール（ＰＶＡ、Ｓｉｇｍａ）５ｍＬに加え、氷上で再度、同じパラメータで超音波処理した。得られた混合物を室温で３時間、撹拌し、４回、洗浄した。使用するまで、粒子を－８０℃で保管した。
４匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたり２匹の雌および２匹の雄）の２つの群の頬から、４ｍｍの滅菌Ｇｏｌｄｅｎｒｏｄ Ａｎｉｍａｌ Ｌａｎｃｅｔ（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＭＡ）を使用して、顔面の静脈叢を刺すことによって頬を出血させて、ベースライン免疫表現型解析のために１００μＬの全血を集めた。頬を出血させた直後に、１５０μＬのＤＰＢＳ中に０．１％のマウス血清アルブミン（ＭＳＡ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む、低（１００ｎｇ）用量または高（１００μｇ）用量の遊離組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ－１２（ｅＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の一方を、眼窩後（ｒ．ｏ．）注射して各群に投与した。ｒ．ｏ．注射後、２４時間および４８時間時に、免疫表現型解析を行うために、マウスの頬をさらに出血させた。
ｎＩＬ－１２合成
ｎＩＬ－１２ナノスフィアは、二重エマルション溶媒蒸発技法を使用して調製した（３３）。手短に述べると、ＤＰＢＳ中に１０％のマウス血清アルブミン（ＭＳＡ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む、１５０μＬの８３．３ｍｇ／ｍＬ組換えマウスのＩＬ－１２（ｒｍＩＬ－１２、ｅＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、１４％ｗ／ｗのＳｐａｎ（登録商標）６０（Ｓｉｇｍａ）を含む１．５１ｍＬのジクロロメタン（dicholoromethane）（Ｓｉｇｍａ）に溶解された２５０ｍｇのＰＬＧＡ ｒｅｓｏｍｅｒ ＲＧ ５０３Ｈ（Ｓｉｇｍａ）に加えた。得られたエマルションを、氷上で１０秒間、５０Ｗで超音波処理した後、４％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（Ｓｉｇｍａ）を含む１％ｗ／ｖのポリビニルアルコール（ＰＶＡ、Ｓｉｇｍａ）５ｍＬに加え、氷上で再度、同じパラメータで超音波処理した。得られた混合物を室温で３時間、撹拌し、４回、洗浄した。使用するまで、粒子を－８０℃で保管した。
【0187】
転移性ＯＳのＫ７Ｍ２同系同所性ＢＡＬＢ／ｃマウスモデル
Ｋ７Ｍ２マウスＯＳ腫瘍細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２８３６、ＡＴＣＣ）は、２０１４年４月に、Ｋｕｒｔ Ｗｅｉｓｓ博士、ＭＤ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）によって親切なことに寄贈され、既に記載したＰｒｏｍｅｇａ ｌｕｃ２リポーターベクター（ｌｕｃ－Ｋ７Ｍ２）を非ウイルス的にトランスフェクトした（３４）。Ｌｕｃ－Ｋ７Ｍ２細胞は、マイコプラズマ不含であり、その同一性は、２０１８年にＩＤＥＸＸ ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｓｅ ＃６９２６－２０１８（ＩＤ３）により確認された。同所性接種の場合、ＤＭＥＭ培地に懸濁したｌｕｃ－Ｋ７Ｍ２細胞（１×１０６）を既に記載した通り、３０匹のマウスに脛骨内注射した（３４）。４週間後、最小の原発腫瘍、および大部分が同様のサイズであることをＩＶＩＳにより確認した原発腫瘍を有する１２匹のマウスを３つの対数スケールの用量処置群１）低用量（０．１ｍｇのｎＩＬ－１２）、２）中用量（１ｍｇのｎＩＬ－１２）および３）高用量（１０ｍｇのｎＩＬ－１２）に無作為化した。原発腫瘍をＩＶＩＳにより確認して１週間後、マウスは、既に記載した通り、その腫瘍を有する肢の切断を受けた（３４）。接種して１２週間後に、マウスを安楽死させた。実験設計の全体の概略図を図１６に見ることができる。
Ｋ７Ｍ２マウスＯＳ腫瘍細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２８３６、ＡＴＣＣ）は、２０１４年４月に、Ｋｕｒｔ Ｗｅｉｓｓ博士、ＭＤ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）によって親切なことに寄贈され、既に記載したＰｒｏｍｅｇａ ｌｕｃ２リポーターベクター（ｌｕｃ－Ｋ７Ｍ２）を非ウイルス的にトランスフェクトした（３４）。Ｌｕｃ－Ｋ７Ｍ２細胞は、マイコプラズマ不含であり、その同一性は、２０１８年にＩＤＥＸＸ ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｓｅ ＃６９２６－２０１８（ＩＤ３）により確認された。同所性接種の場合、ＤＭＥＭ培地に懸濁したｌｕｃ－Ｋ７Ｍ２細胞（１×１０６）を既に記載した通り、３０匹のマウスに脛骨内注射した（３４）。４週間後、最小の原発腫瘍、および大部分が同様のサイズであることをＩＶＩＳにより確認した原発腫瘍を有する１２匹のマウスを３つの対数スケールの用量処置群１）低用量（０．１ｍｇのｎＩＬ－１２）、２）中用量（１ｍｇのｎＩＬ－１２）および３）高用量（１０ｍｇのｎＩＬ－１２）に無作為化した。原発腫瘍をＩＶＩＳにより確認して１週間後、マウスは、既に記載した通り、その腫瘍を有する肢の切断を受けた（３４）。接種して１２週間後に、マウスを安楽死させた。実験設計の全体の概略図を図１６に見ることができる。
【0188】
ＯＳ腫瘍を有するマウスにおける頬出血の時間点
腫瘍細胞の接種前（０週目）に、ベースライン免疫表現型解析用に３０匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスのすべての頬を出血させて、１００μＬの全血を収集した。図１６に示されている通り、触診可能な原発腫瘍の最初の兆候時（４週目）、その後の罹患した肢の切断前（５週目）、ならびに６（Ｔ１）、８（Ｔ２）、１０（Ｔ３）および１２（安楽死／ＥＵＴＨ）週目に再度、頬出血を繰り返した。
腫瘍細胞の接種前（０週目）に、ベースライン免疫表現型解析用に３０匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスのすべての頬を出血させて、１００μＬの全血を収集した。図１６に示されている通り、触診可能な原発腫瘍の最初の兆候時（４週目）、その後の罹患した肢の切断前（５週目）、ならびに６（Ｔ１）、８（Ｔ２）、１０（Ｔ３）および１２（安楽死／ＥＵＴＨ）週目に再度、頬出血を繰り返した。
【0189】
ＯＳ腫瘍を有するマウスのｎＩＬ－１２処置
腫瘍を有する１２匹のマウスを３つのｎ＝４の用量群に無作為化した；０．１ｍｇ（低）、１ｍｇ（中）または１０ｍｇ（高）のｎＩＬ－１２を滅菌ＤＰＢＳ中の０．１％ＭＳＡに懸濁させた。図１６に示されている通り、触診可能な原発腫瘍をＩＶＩＳにより確認した後、および次に、これ以降、合計で８回の用量について、１週間毎の時間点において、マウスに第１の用量のｎＩＬ－１２を投与した。ｎＩＬ－１２用量をそれぞれ、全量５００μＬで腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。
腫瘍を有する１２匹のマウスを３つのｎ＝４の用量群に無作為化した；０．１ｍｇ（低）、１ｍｇ（中）または１０ｍｇ（高）のｎＩＬ－１２を滅菌ＤＰＢＳ中の０．１％ＭＳＡに懸濁させた。図１６に示されている通り、触診可能な原発腫瘍をＩＶＩＳにより確認した後、および次に、これ以降、合計で８回の用量について、１週間毎の時間点において、マウスに第１の用量のｎＩＬ－１２を投与した。ｎＩＬ－１２用量をそれぞれ、全量５００μＬで腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。
【0190】
実験１２．末梢血液中のヘルパーＴリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球および調節性Ｔリンパ球のサブセットのｒｍＩＬ－１２誘発性Ｔ細胞疲弊
１００μＬの全血（ベースライン）のために、１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの頬を出血させた後に、１００ｎｇ（Ｌ：低用量）または１００μｇ（Ｈ：高用量）の組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ－１２を眼窩後（ｒ．ｏ．）注射により投与した。２４時間および４８時間（４８ｈ）時にマウスの頬から再度出血させて、血液試料をフローサイトメトリーにより免疫表現型解析した。ＣＤ８－ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（左、白色）、ＣＤ４－ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（中央、灰色）およびＣＤ８－ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋／－調節性Ｔ細胞（右、黒色）のＰＤ１＋ＴＩＭ－３＋が陽性になる程度を評価し、これを疲弊の指標とすることができる。ベースラインおよび４８時間の時間点からのＴ細胞データが図１７に示されている。個々の棒（上半分）は、平均値＋標準偏差の群を表す。表（下半分）は、各処置群およびＴ細胞のサブセットに関する平均値±標準偏差の群を示す。対応のない両側ｔ検定を使用して、ベースライン血液試料（ｎ＝４；群あたり雄２匹および雌２匹）を４８時間時の試料と比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
１００μＬの全血（ベースライン）のために、１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの頬を出血させた後に、１００ｎｇ（Ｌ：低用量）または１００μｇ（Ｈ：高用量）の組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ－１２を眼窩後（ｒ．ｏ．）注射により投与した。２４時間および４８時間（４８ｈ）時にマウスの頬から再度出血させて、血液試料をフローサイトメトリーにより免疫表現型解析した。ＣＤ８－ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（左、白色）、ＣＤ４－ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（中央、灰色）およびＣＤ８－ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋／－調節性Ｔ細胞（右、黒色）のＰＤ１＋ＴＩＭ－３＋が陽性になる程度を評価し、これを疲弊の指標とすることができる。ベースラインおよび４８時間の時間点からのＴ細胞データが図１７に示されている。個々の棒（上半分）は、平均値＋標準偏差の群を表す。表（下半分）は、各処置群およびＴ細胞のサブセットに関する平均値±標準偏差の群を示す。対応のない両側ｔ検定を使用して、ベースライン血液試料（ｎ＝４；群あたり雄２匹および雌２匹）を４８時間時の試料と比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【0191】
実験１３．末梢血液におけるｒｍＩＬ－１２誘発性多形核骨髄由来抑制因子細胞（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）骨髄球増加症
１００μＬの全血（ベースライン）のために、１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの頬を出血させた後に、１００ｎｇ（Ｌ：低用量）または１００μｇ（Ｈ：高用量）の組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ－１２を眼窩後（ｒ．ｏ．）注射により投与した。２４時間および４８時間（４８ｈ）時にマウスの頬から再度出血させて、血液試料をフローサイトメトリーにより免疫表現型解析した。ベースラインおよび４８時間の時間点からのＰＭＮ－ＭＤＳＣデータが図１８に示されている。個々の棒（上半分）は、平均値＋標準偏差の群を表す。表（下半分）は、各処置群に関する平均値±標準偏差の群を示す。対応のない両側ｔ検定を使用して、ベースライン血液試料（ｎ＝４；群あたり雄２匹および雌２匹）を４８時間時の試料と比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
１００μＬの全血（ベースライン）のために、１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの頬を出血させた後に、１００ｎｇ（Ｌ：低用量）または１００μｇ（Ｈ：高用量）の組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ－１２を眼窩後（ｒ．ｏ．）注射により投与した。２４時間および４８時間（４８ｈ）時にマウスの頬から再度出血させて、血液試料をフローサイトメトリーにより免疫表現型解析した。ベースラインおよび４８時間の時間点からのＰＭＮ－ＭＤＳＣデータが図１８に示されている。個々の棒（上半分）は、平均値＋標準偏差の群を表す。表（下半分）は、各処置群に関する平均値±標準偏差の群を示す。対応のない両側ｔ検定を使用して、ベースライン血液試料（ｎ＝４；群あたり雄２匹および雌２匹）を４８時間時の試料と比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【0192】
実験１４．循環ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＩＬ－１２誘発性低下
１００μＬの全血（ベースライン）のために、１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの頬を出血させた後に、１００ｎｇ（Ｌ：低用量）または１００μｇ（Ｈ：高用量）の組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ－１２を眼窩後（ｒ．ｏ．）注射により投与した。２４時間および４８時間（４８ｈ）時にマウスの頬から再度出血させて、血液試料をフローサイトメトリーにより免疫表現型解析した。図１９は、個々の棒（上半分）が平均値＋標準偏差の群を表すことを示している。表（下半分）は、各処置群に関する平均値±標準偏差の群を示す。対応のない両側ｔ検定を使用して、ベースライン血液試料（ｎ＝４；群あたり雄２匹および雌２匹）を４８時間時の試料と比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
１００μＬの全血（ベースライン）のために、１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの頬を出血させた後に、１００ｎｇ（Ｌ：低用量）または１００μｇ（Ｈ：高用量）の組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ－１２を眼窩後（ｒ．ｏ．）注射により投与した。２４時間および４８時間（４８ｈ）時にマウスの頬から再度出血させて、血液試料をフローサイトメトリーにより免疫表現型解析した。図１９は、個々の棒（上半分）が平均値＋標準偏差の群を表すことを示している。表（下半分）は、各処置群に関する平均値±標準偏差の群を示す。対応のない両側ｔ検定を使用して、ベースライン血液試料（ｎ＝４；群あたり雄２匹および雌２匹）を４８時間時の試料と比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【0193】
実験１５．切断時に８．２１％を超える血液ＮＫ細胞の百分率により、１２週時に非転移性マウスと転移性マウスとに分かれる。
ｎ＝８の疾患（転移および／または局所再発陽性）マウスおよびｎ＝４の健常（転移陰性と局所再発陰性の両方）マウスを含めた、ｎＩＬ－１２処置したＯＳ腫瘍を有するマウスを１２週目に疾患状態に基づいて２つの群に分けた。図２０は、以下を示す：（Ａ）１２週間、７つの時間点にわたり比較した、健常（１２週目に腫瘍負荷が陰性、緑色の丸）対罹患（１２週目に腫瘍負荷が陽性、赤色三角）マウスの末梢血液における、ＮＫｐ４６＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の平均（±標準偏差）百分率（＊ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１、対応のない両側ｔ検定を使用）、および（Ｂ）マウスを、切断時の末梢血液におけるそのＮＫ細胞の百分率に基づいて階層化した。各棒は、その個々のマウスのＮＫ細胞の百分率がメジアン値（８．２１％）から逸脱した程度を表す。片側カイ二乗検定を使用して、メジアンより高いマウスの転移率をメジアンより下のマウスの転移率と比較した；ｐｍｅｔ＝切断時のメジアンより高いおよび低いＮＫ細胞百分率を有する群間の転移率に関するＰ値。
ｎ＝８の疾患（転移および／または局所再発陽性）マウスおよびｎ＝４の健常（転移陰性と局所再発陰性の両方）マウスを含めた、ｎＩＬ－１２処置したＯＳ腫瘍を有するマウスを１２週目に疾患状態に基づいて２つの群に分けた。図２０は、以下を示す：（Ａ）１２週間、７つの時間点にわたり比較した、健常（１２週目に腫瘍負荷が陰性、緑色の丸）対罹患（１２週目に腫瘍負荷が陽性、赤色三角）マウスの末梢血液における、ＮＫｐ４６＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の平均（±標準偏差）百分率（＊ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１、対応のない両側ｔ検定を使用）、および（Ｂ）マウスを、切断時の末梢血液におけるそのＮＫ細胞の百分率に基づいて階層化した。各棒は、その個々のマウスのＮＫ細胞の百分率がメジアン値（８．２１％）から逸脱した程度を表す。片側カイ二乗検定を使用して、メジアンより高いマウスの転移率をメジアンより下のマウスの転移率と比較した；ｐｍｅｔ＝切断時のメジアンより高いおよび低いＮＫ細胞百分率を有する群間の転移率に関するＰ値。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A-6B】
【図6C-6D】
【図7A-7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【国際調査報告】