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特表2023-504284疾患モデリング及び創薬を促進するためにヒトニューロンの老化を誘導するための化学カクテル
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-02
(54)【発明の名称】疾患モデリング及び創薬を促進するためにヒトニューロンの老化を誘導するための化学カクテル
(51)【国際特許分類】
C12N 5/079 20100101AFI20230126BHJP
C12N 5/02 20060101ALI20230126BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230126BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230126BHJP
【ＦＩ】
C12N5/079
C12N5/02
C12N5/10
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022534271
(86)(22)【出願日】2020-12-09
(85)【翻訳文提出日】2022-06-06
(86)【国際出願番号】 US2020064138
(87)【国際公開番号】W WO2021119217
(87)【国際公開日】2021-06-17
(31)【優先権主張番号】62/945,386
(32)【優先日】2019-12-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591013274
【氏名又は名称】ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100093300
【弁理士】
【氏名又は名称】浅井 賢治
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】チャン ス－チュン
(72)【発明者】
【氏名】ファティ アリ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ08
4B065AA90X
4B065BA24
4B065BA25
4B065BB04
4B065CA60
(57)【要約】
ニューロンにおいて化学的に老化を誘導するための方法及び組成物、並びに神経変性疾患のモデル化及び創薬のために化学的に誘導された老化ニューロンを使用する方法が本明細書で提供される。本方法は、ヒトニューロンを、ＤＮＡグリコシラーゼ１の阻害剤、オートファジー阻害剤、及びＨＩＶプロテアーゼ阻害剤を含む培養培地と接触させて、約４日以内に老化ニューロンのインビトロ集団を得ることを含む。ニューロンを、神経変性疾患を有する患者から得た場合、これらの方法によって得られた化学的に誘導された老化ニューロンは、神経変性疾患を有する個人で観察される細胞及び細胞内表現型を再現する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトニューロンにおける細胞老化を誘導するためのインビトロ方法であって、（ａ）細胞培養培地中で、ヒトニューロンを、ＤＮＡグリコシラーゼ１の阻害剤、オートファジー阻害剤、又はＨＩＶプロテアーゼ阻害剤のうちの１つ以上を含む組成物とインビトロで接触させる工程、
（ｂ）前記接触したニューロンを前記培地の存在下で約２～約４日間培養することであって、化学的に誘導された老化（ＣＩＳ）ニューロンの集団が生成され工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項2】
前記薬剤が、ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、及びＯ１５１である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記組成物が、酪酸ナトリウム及び任意選択でＳＣＲ－７を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＣＩＳニューロンが、老化に関連するバイオマーカーであるβ－ガラクトシダーゼを発現し、対照ニューロンと比較して、Ｈ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨＰ１γのうちの１つ以上の増加した発現を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ニューロンが、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来ニューロン、一次ニューロン、又は誘導ニューロン（ｉＮ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記ｈＰＳＣ由来のニューロンが、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）又はヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ヒトｉＰＳＣが、神経変性疾患を有する個人の体細胞を再プログラミングすることによって得られ、それにより、前記ＣＩＳニューロンが、前記神経変性疾患に特徴的な１つ以上の形態学的特徴を示す、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記神経変性疾患が、ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、又は加齢黄斑変性症である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であり、前記形態学的特徴には、対照ニューロンと比較して、軸索腫脹、軸索変性、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ９及びＬａｐ２βの低下した発現、リン酸化ニューロフィラメントの増大した発現、及び増加したタンパク質凝集が含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記組成物が、Ｎ２、Ｂ２７、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ジブチリルｃＡＭＰ、ドキシサイクリン、及びラミニンを含むニューロン成熟培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法に従って得られた化学的に誘導された老化ニューロンの実質的に純粋な集団。
【請求項12】
Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、及びロピナビルを含む組成物。
【請求項13】
Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、及び酪酸ナトリウムを含む組成物。
【請求項14】
細胞培養培地として調製される、請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項15】
試験物質のインビトロスクリーニング方法であって、（ａ）試験物質を、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法に従って得られた化学的に誘導された老化（ＣＩＳ）ニューロンと接触させる工程、
（ｂ）前記接触したＣＩＳニューロンに対する前記試験物質の影響を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項16】
前記検出が、接触したニューロンの形態、増殖、又は寿命に対する前記薬剤の少なくとも１つの影響を検出することを含み、それにより、対照と比較して、軸索腫脹、軸索変性を減少させ、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ９及びＬａｐ２βの発現を増加させ、リン酸化ニューロフィラメントの発現を低下させ、及びタンパク質凝集を減少させる薬剤が、神経変性疾患を処置するための治療活性を有するものと同定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
創薬スクリーニングにおける、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法に従って得られた化学的に誘導された老化（ＣＩＳ）ニューロンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１９年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／９４５，３８６号の優先権の利益を主張し、該米国仮特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府が後援する研究又は開発に関する陳述
該当しない。
本特許出願は、２０１９年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／９４５，３８６号の優先権の利益を主張し、該米国仮特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府が後援する研究又は開発に関する陳述
該当しない。
【背景技術】
【0002】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、疾患をモデル化し、薬物を試験するための潜在的なツールである。ｈＰＳＣプラットフォームの利点は、患者に特異的なｉＰＳＣを確立することよるか、又はナイーブｈＥＳ若しくはｈｉＰＳ細胞に疾患関連の変異を導入することにより、ヒトの遺伝的背景を捉える能力である。しかしながら、ｉＰＳＣ再プログラミングプロセスは、ドナー体細胞の年齢をリセットし、ｈＰＳＣ由来の体細胞は、転写及び機能プロファイリングに基づく胎児の発達段階と一致する。
年齢は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、及びアルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性疾患の主要な危険因子である。従って、ニューロンを含むｈＰＳＣ由来細胞を使用して変性疾患をモデル化することは非常に困難である。１つのアプローチは、プロジェリンの発現を導入してｈＰＳＣ由来のニューロンを得ることを誘導し、これにより、ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて加齢に関連する表現型を誘発することである。このような戦略は、遺伝的背景を変更し、表現型の解読を困難にすることにより、モデルシステムに複雑さを追加する。別の代替法は、線維芽細胞などの体細胞をニューロンに直接再プログラミングすることであり、これは小規模な取り組みでは可能であるが、大規模では実行可能ではない。更に、結果として得られるニューロンは、特定のグルタミン酸作動性ニューロンに限定される。従って、ニューロンにおいて「老化」を体系的かつ再現性よく誘導するための非遺伝的手段を作製する必要がある。
従って、疾患モデリング及び創薬のために、ｈＰＳＣ由来ニューロンにおいて体系的かつ再現可能に「老化」を誘導するための非遺伝的方法及び組成物に対する継続的な必要性が存在する。
年齢は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、及びアルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性疾患の主要な危険因子である。従って、ニューロンを含むｈＰＳＣ由来細胞を使用して変性疾患をモデル化することは非常に困難である。１つのアプローチは、プロジェリンの発現を導入してｈＰＳＣ由来のニューロンを得ることを誘導し、これにより、ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて加齢に関連する表現型を誘発することである。このような戦略は、遺伝的背景を変更し、表現型の解読を困難にすることにより、モデルシステムに複雑さを追加する。別の代替法は、線維芽細胞などの体細胞をニューロンに直接再プログラミングすることであり、これは小規模な取り組みでは可能であるが、大規模では実行可能ではない。更に、結果として得られるニューロンは、特定のグルタミン酸作動性ニューロンに限定される。従って、ニューロンにおいて「老化」を体系的かつ再現性よく誘導するための非遺伝的手段を作製する必要がある。
従って、疾患モデリング及び創薬のために、ｈＰＳＣ由来ニューロンにおいて体系的かつ再現可能に「老化」を誘導するための非遺伝的方法及び組成物に対する継続的な必要性が存在する。
【発明の概要】
【0003】
老化ニューロンにおいて神経変性疾患をモデル化するための従来の分化及び「老化」プロトコルの前述の欠点に対処する方法、組成物、及びキットが本明細書に記載される。
【0004】
第１の態様では、ヒトニューロンにおいて細胞老化を誘導するためのインビトロ方法が本明細書で提供される。本方法は、ヒトニューロンを、ＤＮＡグリコシラーゼ１の阻害剤、オートファジー阻害剤、及びＨＩＶプロテアーゼ阻害剤から選択される１つ以上の薬剤を含む培養培地とインビトロで接触させることと、接触したニューロンを培養培地の存在下で約２～約４日間培養して、化学的に誘導された老化（ＣＩＳ）ニューロンの集団を生成することと、を含むことができる。例示的であるが限定的ではない薬剤には、ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、及びＯ１５１が含まれる。培養培地は、酪酸ナトリウム及び任意選択でＳＣＲ－７を更に含むことができる。ＣＩＳニューロンは、β－ガラクトシダーゼを含む老化関連バイオマーカーを発現し、対照ニューロンと比較して、Ｈ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨＰ１γのうちの１つ以上の発現の増加を示すことができる。これらのニューロンは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来のニューロン、一次ニューロン、又は誘導ニューロン（ｉＮ）であり得る。ｈＰＳＣ由来のニューロンは、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）又はヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来し得る。ヒトｉＰＳＣは、神経変性疾患を有する個人の体細胞を再プログラミングすることによって得ることができ、これにより、ＣＩＳニューロンは、神経変性疾患に特徴的な１つ以上の形態的特徴を示す。神経変性疾患は、ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、及び加齢黄斑変性症であり得る。神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であり得、形態学的特徴には、対照ニューロンと比較した、軸索腫脹、軸索変性、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ９及びＬａｐ２βの発現の低下、リン酸化ニューロフィラメントの発現の増加、並びにタンパク質凝集の増加が含まれ得る。培養培地は、Ｎ２、Ｂ２７、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ジブチリルｃＡＭＰ、ドキシサイクリン、及びラミニンを含むニューロン成熟培地であり得る。
【0005】
別の態様では、本開示の方法に従って得られた化学的に誘導された老化ニューロンの実質的に純粋な集団が本明細書で提供される。
更なる態様では、Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、及びロピナビルを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞培養培地として調製される。
更なる態様では、Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、及び酪酸ナトリウムを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞培養培地として調製される。
更なる態様では、Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、及びロピナビルを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞培養培地として調製される。
更なる態様では、Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、及び酪酸ナトリウムを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞培養培地として調製される。
【0006】
別の態様では、試験物質のインビトロスクリーニングのための方法が本明細書で提供される。本方法は、試験物質を、本開示の方法に従って得られた化学的に誘導された老化（ＣＩＳ）ニューロンに接触させることと、接触したＣＩＳニューロンに対する試験物質の影響を検出することと、を含むことができる。本方法は、接触したニューロンの形態、増殖、又は寿命に対する薬剤の少なくとも１つの影響を検出することを含むことができ、それにより、対照と比較して、軸索腫脹、軸索変性を低減し、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ９及びＬａｐ２βの発現を増加させ、リン酸化ニューロフィラメントの発現を低下させ、タンパク質凝集を減少させる薬剤が、神経変性疾患を処置するための治療活性を有すると同定される。
別の態様では、創薬スクリーニングにおける、本開示の方法に従って得られた化学的に誘導された老化（ＣＩＳ）ニューロンの使用が本明細書で提供される。
本発明のこれら及び他の特徴、目的、及び利点は、以下の記載からより良く理解されることになるであろう。本記載では、本明細書の一部を形成し、かつ、本発明の実施形態が限定するものではなく例示として示されている、添付の図面を参照する。好ましい実施形態の記載は、本発明を限定すること、並びにすべての修正、同等物、及び代替物を網羅することを意図するものではない。従って、本発明の範囲を解釈するためには、本明細書に列挙する特許請求の範囲を参照する必要がある。
別の態様では、創薬スクリーニングにおける、本開示の方法に従って得られた化学的に誘導された老化（ＣＩＳ）ニューロンの使用が本明細書で提供される。
本発明のこれら及び他の特徴、目的、及び利点は、以下の記載からより良く理解されることになるであろう。本記載では、本明細書の一部を形成し、かつ、本発明の実施形態が限定するものではなく例示として示されている、添付の図面を参照する。好ましい実施形態の記載は、本発明を限定すること、並びにすべての修正、同等物、及び代替物を網羅することを意図するものではない。従って、本発明の範囲を解釈するためには、本明細書に列挙する特許請求の範囲を参照する必要がある。
【0007】
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、及び特許出願がそれぞれ参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
以下の詳細な説明を考慮した場合に、本発明はより良く理解され、上記以外の特徴、態様、及び利点が明らかになるであろう。そのような詳細な説明は、以下の図面を参照する。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、及び特許出願がそれぞれ参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
以下の詳細な説明を考慮した場合に、本発明はより良く理解され、上記以外の特徴、態様、及び利点が明らかになるであろう。そのような詳細な説明は、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1A】図１Ａ～１Ｄは、ヒトの新生児及び高齢者の線維芽細胞における老化マーカーを確立し、小分子を使用して新生児の線維芽細胞において老化を誘導することを示している。新生児及び高齢者の線維芽細胞の両方についてのＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質の免疫染色イメージング（図１Ａ）。男性新生児及び高齢者（７２歳）の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質のハイコンテンツイメージングにおけるシグナル強度の異なるビンの頻度分布分析（図１Ｂ）。異なる小分子で処理された男性新生児線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質発現の頻度分布分析であり、赤い破線は対照であり、各タンパク質の上位７つの分子がグラフに示されている（図１Ｃ）。ＤＭＳＯ対照群と比較した平均±９５％信頼区間として示される２５個のすべての小分子のシグナル強度の平均差。ゼロラインは対照と比較して差がないことを意味し、平均差が基準線に触れていない場合、発現の変化は有意である（図１Ｄ）。
【図1B】図１Ａ～１Ｄは、ヒトの新生児及び高齢者の線維芽細胞における老化マーカーを確立し、小分子を使用して新生児の線維芽細胞において老化を誘導することを示している。男性新生児及び高齢者（７２歳）の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質のハイコンテンツイメージングにおけるシグナル強度の異なるビンの頻度分布分析（図１Ｂ）。
【図1C】図１Ａ～１Ｄは、ヒトの新生児及び高齢者の線維芽細胞における老化マーカーを確立し、小分子を使用して新生児の線維芽細胞において老化を誘導することを示している。異なる小分子で処理された男性新生児線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質発現の頻度分布分析であり、赤い破線は対照であり、各タンパク質の上位７つの分子がグラフに示されている（図１Ｃ）。
【図1D】図１Ａ～１Ｄは、ヒトの新生児及び高齢者の線維芽細胞における老化マーカーを確立し、小分子を使用して新生児の線維芽細胞において老化を誘導することを示している。ＤＭＳＯ対照群と比較した平均±９５％信頼区間として示される２５個のすべての小分子のシグナル強度の平均差。ゼロラインは対照と比較して差がないことを意味し、平均差が基準線に触れていない場合、発現の変化は有意である（図１Ｄ）。
【図2A】図２Ａ～２Ｃは、線維芽細胞がニューロン（「誘導ニューロン」又は「ｉＮ」）に直接変換される間、細胞老化の特徴が保持されることを示している。新生児及び７２歳のドナー個人の両方からの線維芽細胞に由来する誘導ニューロン（ｉＮ）における、ＴＵＪ１（赤）と共染色されたＨ３ｋ９Ｍｅ３、ラミンＢ２、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γの免疫染色（図２Ａ）。ＴＵＪ１陽性ニューロンのパーセンテージの定量化結果（図２Ｂ）、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨｐ１γの平均シグナル強度（図２Ｃ）。若年者ｉＮ及び高齢者ｉＮの両方のヘキストシグナル強度（図２Ｄ）、核の真円度（Ｅ）、核の比率（Ｆ）、及び核の面積（Ｇ）の定量化結果（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ 対応のないｔ検定）。
【図2B】図２Ａ～２Ｃは、線維芽細胞がニューロン（「誘導ニューロン」又は「ｉＮ」）に直接変換される間、細胞老化の特徴が保持されることを示している。新生児及び７２歳のドナー個人の両方からの線維芽細胞に由来する誘導ニューロン（ｉＮ）における、ＴＵＪ１（赤）と共染色されたＨ３ｋ９Ｍｅ３、ラミンＢ２、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γの免疫染色（図２Ａ）。ＴＵＪ１陽性ニューロンのパーセンテージの定量化結果（図２Ｂ）、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨｐ１γの平均シグナル強度（図２Ｃ）。若年者ｉＮ及び高齢者ｉＮの両方のヘキストシグナル強度（図２Ｄ）、核の真円度（Ｅ）、核の比率（Ｆ）、及び核の面積（Ｇ）の定量化結果（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ 対応のないｔ検定）。
【図2C】図２Ａ～２Ｃは、線維芽細胞がニューロン（「誘導ニューロン」又は「ｉＮ」）に直接変換される間、細胞老化の特徴が保持されることを示している。新生児及び７２歳のドナー個人の両方からの線維芽細胞に由来する誘導ニューロン（ｉＮ）における、ＴＵＪ１（赤）と共染色されたＨ３ｋ９Ｍｅ３、ラミンＢ２、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γの免疫染色（図２Ａ）。ＴＵＪ１陽性ニューロンのパーセンテージの定量化結果（図２Ｂ）、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨｐ１γの平均シグナル強度（図２Ｃ）。若年者ｉＮ及び高齢者ｉＮの両方のヘキストシグナル強度（図２Ｄ）、核の真円度（Ｅ）、核の比率（Ｆ）、及び核の面積（Ｇ）の定量化結果（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ 対応のないｔ検定）。
【図2D】図２Ａ～２Ｃは、線維芽細胞がニューロン（「誘導ニューロン」又は「ｉＮ」）に直接変換される間、細胞老化の特徴が保持されることを示している。新生児及び７２歳のドナー個人の両方からの線維芽細胞に由来する誘導ニューロン（ｉＮ）における、ＴＵＪ１（赤）と共染色されたＨ３ｋ９Ｍｅ３、ラミンＢ２、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γの免疫染色（図２Ａ）。ＴＵＪ１陽性ニューロンのパーセンテージの定量化結果（図２Ｂ）、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨｐ１γの平均シグナル強度（図２Ｃ）。若年者ｉＮ及び高齢者ｉＮの両方のヘキストシグナル強度（図２Ｄ）、核の真円度（Ｅ）、核の比率（Ｆ）、及び核の面積（Ｇ）の定量化結果（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ 対応のないｔ検定）。
【図2E】図２Ａ～２Ｃは、線維芽細胞がニューロン（「誘導ニューロン」又は「ｉＮ」）に直接変換される間、細胞老化の特徴が保持されることを示している。新生児及び７２歳のドナー個人の両方からの線維芽細胞に由来する誘導ニューロン（ｉＮ）における、ＴＵＪ１（赤）と共染色されたＨ３ｋ９Ｍｅ３、ラミンＢ２、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γの免疫染色（図２Ａ）。ＴＵＪ１陽性ニューロンのパーセンテージの定量化結果（図２Ｂ）、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨｐ１γの平均シグナル強度（図２Ｃ）。若年者ｉＮ及び高齢者ｉＮの両方のヘキストシグナル強度（図２Ｄ）、核の真円度（Ｅ）、核の比率（Ｆ）、及び核の面積（Ｇ）の定量化結果（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ 対応のないｔ検定）。
【図2F】図２Ａ～２Ｃは、線維芽細胞がニューロン（「誘導ニューロン」又は「ｉＮ」）に直接変換される間、細胞老化の特徴が保持されることを示している。新生児及び７２歳のドナー個人の両方からの線維芽細胞に由来する誘導ニューロン（ｉＮ）における、ＴＵＪ１（赤）と共染色されたＨ３ｋ９Ｍｅ３、ラミンＢ２、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γの免疫染色（図２Ａ）。ＴＵＪ１陽性ニューロンのパーセンテージの定量化結果（図２Ｂ）、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨｐ１γの平均シグナル強度（図２Ｃ）。若年者ｉＮ及び高齢者ｉＮの両方のヘキストシグナル強度（図２Ｄ）、核の真円度（Ｅ）、核の比率（Ｆ）、及び核の面積（Ｇ）の定量化結果（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ 対応のないｔ検定）。
【図2G】図２Ａ～２Ｃは、線維芽細胞がニューロン（「誘導ニューロン」又は「ｉＮ」）に直接変換される間、細胞老化の特徴が保持されることを示している。新生児及び７２歳のドナー個人の両方からの線維芽細胞に由来する誘導ニューロン（ｉＮ）における、ＴＵＪ１（赤）と共染色されたＨ３ｋ９Ｍｅ３、ラミンＢ２、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γの免疫染色（図２Ａ）。ＴＵＪ１陽性ニューロンのパーセンテージの定量化結果（図２Ｂ）、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨｐ１γの平均シグナル強度（図２Ｃ）。若年者ｉＮ及び高齢者ｉＮの両方のヘキストシグナル強度（図２Ｄ）、核の真円度（Ｅ）、核の比率（Ｆ）、及び核の面積（Ｇ）の定量化結果（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ 対応のないｔ検定）。
【図3A】図３Ａ～３Ｄは、ｈＥＳＣに由来する皮質ニューロンにおいて化学的に誘導された老化を示している。皮質ニューロンのＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質のハイコンテンツイメージングデータの頻度分布分析、赤い破線は対照であり、各タンパク質の上位７つの分子がグラフに示されている（図３Ａ）。ＤＭＳＯ対照皮質ニューロンと比較した、平均±９５％信頼区間として示されている２５個のすべての小分子のシグナル強度の平均差。ゼロラインは、対照と比較して差がないことを意味し、平均の差が基準線に触れていない場合、発現の変化は有意である（図３Ｂ）。エトポシド、アクチノマイシンＤ、及び対照としてのＤＭＳＯで処理したＨ９－ＧＦＰ皮質ニューロンにおけるホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ（セリン１３９）の共焦点画像（図３Ｃ）。異なる小分子で処理した皮質ニューロンの核あたりのホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ（セリン１３９）の陽性の焦点の定量化結果（図３Ｄ）。
【図3B】図３Ａ～３Ｄは、ｈＥＳＣに由来する皮質ニューロンにおいて化学的に誘導された老化を示している。皮質ニューロンのＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質のハイコンテンツイメージングデータの頻度分布分析、赤い破線は対照であり、各タンパク質の上位７つの分子がグラフに示されている（図３Ａ）。ＤＭＳＯ対照皮質ニューロンと比較した、平均±９５％信頼区間として示されている２５個のすべての小分子のシグナル強度の平均差。ゼロラインは、対照と比較して差がないことを意味し、平均の差が基準線に触れていない場合、発現の変化は有意である（図３Ｂ）。エトポシド、アクチノマイシンＤ、及び対照としてのＤＭＳＯで処理したＨ９－ＧＦＰ皮質ニューロンにおけるホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ（セリン１３９）の共焦点画像（図３Ｃ）。異なる小分子で処理した皮質ニューロンの核あたりのホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ（セリン１３９）の陽性の焦点の定量化結果（図３Ｄ）。
【図3C】図３Ａ～３Ｄは、ｈＥＳＣに由来する皮質ニューロンにおいて化学的に誘導された老化を示している。皮質ニューロンのＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質のハイコンテンツイメージングデータの頻度分布分析、赤い破線は対照であり、各タンパク質の上位７つの分子がグラフに示されている（図３Ａ）。ＤＭＳＯ対照皮質ニューロンと比較した、平均±９５％信頼区間として示されている２５個のすべての小分子のシグナル強度の平均差。ゼロラインは、対照と比較して差がないことを意味し、平均の差が基準線に触れていない場合、発現の変化は有意である（図３Ｂ）。エトポシド、アクチノマイシンＤ、及び対照としてのＤＭＳＯで処理したＨ９－ＧＦＰ皮質ニューロンにおけるホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ（セリン１３９）の共焦点画像（図３Ｃ）。異なる小分子で処理した皮質ニューロンの核あたりのホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ（セリン１３９）の陽性の焦点の定量化結果（図３Ｄ）。
【図3D】図３Ａ～３Ｄは、ｈＥＳＣに由来する皮質ニューロンにおいて化学的に誘導された老化を示している。皮質ニューロンのＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質のハイコンテンツイメージングデータの頻度分布分析、赤い破線は対照であり、各タンパク質の上位７つの分子がグラフに示されている（図３Ａ）。ＤＭＳＯ対照皮質ニューロンと比較した、平均±９５％信頼区間として示されている２５個のすべての小分子のシグナル強度の平均差。ゼロラインは、対照と比較して差がないことを意味し、平均の差が基準線に触れていない場合、発現の変化は有意である（図３Ｂ）。エトポシド、アクチノマイシンＤ、及び対照としてのＤＭＳＯで処理したＨ９－ＧＦＰ皮質ニューロンにおけるホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ（セリン１３９）の共焦点画像（図３Ｃ）。異なる小分子で処理した皮質ニューロンの核あたりのホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ（セリン１３９）の陽性の焦点の定量化結果（図３Ｄ）。
【図4A】図４Ａ～４Ｅは、皮質ニューロンにおいて相乗的に増強された異なる老化表現型の提示の組み合わせ効果を示している。皮質ニューロンにおいて試験された５つの最も効果的な分子（Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、酪酸ナトリウム、ＳＣＲ－７）の異なる組み合わせ、及びＳＢＩ－０２０６９６５と比較した処理群でのＨ３ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βの平均発現（図４Ａ）。ニューロンを異なる期間にわたって処理することによって行われ、かつ、成熟後１４日目にＬａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３の発現についてアッセイされた、ＳＬＯの組み合わせの安定性試験。（図４Ｂ）。異なる小分子で処理された皮質ニューロンにおいて、Ｌａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３のシグナル強度の異なるビンの相対頻度分布分析。（図４Ｃ）。ＭＧ－１３２（プロテアソーム阻害剤）、ＳＬＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、及びＯ１５１）、及びＳＳＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、酪酸ナトリウム、及びＯ１５１）で処理され、かつ、タンパク質凝集を検出するためにＬａｍｐ２Ａ（リソソーム膜関連タンパク質）及びプロテオスタット色素で染色された、Ｈ９－ＧＦＰ皮質ニューロンの免疫染色画像（図４Ｄ）、並びにＬａｍｐ２Ａ及びプロテオスタットでのニューロンの陽性領域についての画像の定量化（図４Ｅ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図4B】図４Ａ～４Ｅは、皮質ニューロンにおいて相乗的に増強された異なる老化表現型の提示の組み合わせ効果を示している。皮質ニューロンにおいて試験された５つの最も効果的な分子（Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、酪酸ナトリウム、ＳＣＲ－７）の異なる組み合わせ、及びＳＢＩ－０２０６９６５と比較した処理群でのＨ３ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βの平均発現（図４Ａ）。ニューロンを異なる期間にわたって処理することによって行われ、かつ、成熟後１４日目にＬａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３の発現についてアッセイされた、ＳＬＯの組み合わせの安定性試験。（図４Ｂ）。異なる小分子で処理された皮質ニューロンにおいて、Ｌａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３のシグナル強度の異なるビンの相対頻度分布分析。（図４Ｃ）。ＭＧ－１３２（プロテアソーム阻害剤）、ＳＬＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、及びＯ１５１）、及びＳＳＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、酪酸ナトリウム、及びＯ１５１）で処理され、かつ、タンパク質凝集を検出するためにＬａｍｐ２Ａ（リソソーム膜関連タンパク質）及びプロテオスタット色素で染色された、Ｈ９－ＧＦＰ皮質ニューロンの免疫染色画像（図４Ｄ）、並びにＬａｍｐ２Ａ及びプロテオスタットでのニューロンの陽性領域についての画像の定量化（図４Ｅ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図4C】図４Ａ～４Ｅは、皮質ニューロンにおいて相乗的に増強された異なる老化表現型の提示の組み合わせ効果を示している。皮質ニューロンにおいて試験された５つの最も効果的な分子（Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、酪酸ナトリウム、ＳＣＲ－７）の異なる組み合わせ、及びＳＢＩ－０２０６９６５と比較した処理群でのＨ３ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βの平均発現（図４Ａ）。ニューロンを異なる期間にわたって処理することによって行われ、かつ、成熟後１４日目にＬａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３の発現についてアッセイされた、ＳＬＯの組み合わせの安定性試験。（図４Ｂ）。異なる小分子で処理された皮質ニューロンにおいて、Ｌａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３のシグナル強度の異なるビンの相対頻度分布分析。（図４Ｃ）。ＭＧ－１３２（プロテアソーム阻害剤）、ＳＬＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、及びＯ１５１）、及びＳＳＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、酪酸ナトリウム、及びＯ１５１）で処理され、かつ、タンパク質凝集を検出するためにＬａｍｐ２Ａ（リソソーム膜関連タンパク質）及びプロテオスタット色素で染色された、Ｈ９－ＧＦＰ皮質ニューロンの免疫染色画像（図４Ｄ）、並びにＬａｍｐ２Ａ及びプロテオスタットでのニューロンの陽性領域についての画像の定量化（図４Ｅ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図4D】図４Ａ～４Ｅは、皮質ニューロンにおいて相乗的に増強された異なる老化表現型の提示の組み合わせ効果を示している。皮質ニューロンにおいて試験された５つの最も効果的な分子（Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、酪酸ナトリウム、ＳＣＲ－７）の異なる組み合わせ、及びＳＢＩ－０２０６９６５と比較した処理群でのＨ３ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βの平均発現（図４Ａ）。ニューロンを異なる期間にわたって処理することによって行われ、かつ、成熟後１４日目にＬａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３の発現についてアッセイされた、ＳＬＯの組み合わせの安定性試験。（図４Ｂ）。異なる小分子で処理された皮質ニューロンにおいて、Ｌａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３のシグナル強度の異なるビンの相対頻度分布分析。（図４Ｃ）。ＭＧ－１３２（プロテアソーム阻害剤）、ＳＬＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、及びＯ１５１）、及びＳＳＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、酪酸ナトリウム、及びＯ１５１）で処理され、かつ、タンパク質凝集を検出するためにＬａｍｐ２Ａ（リソソーム膜関連タンパク質）及びプロテオスタット色素で染色された、Ｈ９－ＧＦＰ皮質ニューロンの免疫染色画像（図４Ｄ）、並びにＬａｍｐ２Ａ及びプロテオスタットでのニューロンの陽性領域についての画像の定量化（図４Ｅ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図4E】図４Ａ～４Ｅは、皮質ニューロンにおいて相乗的に増強された異なる老化表現型の提示の組み合わせ効果を示している。皮質ニューロンにおいて試験された５つの最も効果的な分子（Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、酪酸ナトリウム、ＳＣＲ－７）の異なる組み合わせ、及びＳＢＩ－０２０６９６５と比較した処理群でのＨ３ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βの平均発現（図４Ａ）。ニューロンを異なる期間にわたって処理することによって行われ、かつ、成熟後１４日目にＬａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３の発現についてアッセイされた、ＳＬＯの組み合わせの安定性試験。（図４Ｂ）。異なる小分子で処理された皮質ニューロンにおいて、Ｌａｐ２β、ラミンＢ２、及びＨ３ｋ９Ｍｅ３のシグナル強度の異なるビンの相対頻度分布分析。（図４Ｃ）。ＭＧ－１３２（プロテアソーム阻害剤）、ＳＬＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、及びＯ１５１）、及びＳＳＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、酪酸ナトリウム、及びＯ１５１）で処理され、かつ、タンパク質凝集を検出するためにＬａｍｐ２Ａ（リソソーム膜関連タンパク質）及びプロテオスタット色素で染色された、Ｈ９－ＧＦＰ皮質ニューロンの免疫染色画像（図４Ｄ）、並びにＬａｍｐ２Ａ及びプロテオスタットでのニューロンの陽性領域についての画像の定量化（図４Ｅ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図5A】ＳＬＯで処理された皮質ニューロンのＲＮＡ－ｓｅｑデータは、高齢者皮質及び早期老化経路との類似性を示した。対照及びＳＬＯ処理試料についての主成分分析の非管理多次元尺度法（ＭＤＳ）プロット（図５Ａ）。対照皮質ニューロンと比較してＳＬＯにおいて差次的に発現される転写物の数のベン図（図５Ｂ）、及びＳＬＯで処理した皮質ニューロンにおける２８６０個のＤＥＧと高齢者の皮質からのＤＥＧとの比較（若年者の皮質と比較）（図５Ｃ）。スメアプロット（Ｓｍｅａｒｐｌｏｔ）は、各遺伝子を灰色の・で表している。コントラスト方向に対して、赤色の・及び青色の・ドットは、０．０５のｐ調整値（ＦＤＲ）有意閾値におけるアップレギュレート及びダウンレギュレートされた発現をそれぞれ表す。灰色のドットはそれらの遺伝子を反映しており、統計的に有意な差次的発現の証拠はない。Ｘ軸（ｌｏｇ２倍数変化）は効果量であり、ＳＬＯ処理によってどのくらい発現が変化したかを示す（図５Ｄ）。０．０５未満のｐ値及び＋／－２より大きい又は小さいｌｏｇ｛２｝倍数変化を有する、最も差次的に発現された遺伝子の最大５０個のサブセットが選択される。次に、ユークリッド距離を使用して試料及び遺伝子の両方をクラスター化する。遺伝子については、追加のエルボー関数を適用して、存在する遺伝子クラスターの数を推定し、それらが高齢者の皮質においても差次的に発現される場合には赤色で着色される。計算された関係は、ヒートマップの上部（試料）及び左側（遺伝子）に描かれた樹状図で表される。色のグラデーションは、ＴＭＭによって正規化された遺伝子列にわたってコンピュータ計算され、スケーリングされたＺスコアによって決定される。所与の発現値のＺスコアは、その遺伝子のすべての発現値の平均から離れた標準偏差の数である（図５Ｅ）。０．０５未満のｐ値を有するすべてのＤＥＧを選択し、遺伝子リスト中の経路の過剰出現又は過小出現について試験する。任意の有意に富むＷｉｋｉＰａｔｈｗａｙ経路は、有意性が最も高いものから最も低いものへと順に並べられている（図５Ｆ）。
【図5B】ＳＬＯで処理された皮質ニューロンのＲＮＡ－ｓｅｑデータは、高齢者皮質及び早期老化経路との類似性を示した。対照及びＳＬＯ処理試料についての主成分分析の非管理多次元尺度法（ＭＤＳ）プロット（図５Ａ）。対照皮質ニューロンと比較してＳＬＯにおいて差次的に発現される転写物の数のベン図（図５Ｂ）、及びＳＬＯで処理した皮質ニューロンにおける２８６０個のＤＥＧと高齢者の皮質からのＤＥＧとの比較（若年者の皮質と比較）（図５Ｃ）。スメアプロット（Ｓｍｅａｒｐｌｏｔ）は、各遺伝子を灰色の・で表している。コントラスト方向に対して、赤色の・及び青色の・ドットは、０．０５のｐ調整値（ＦＤＲ）有意閾値におけるアップレギュレート及びダウンレギュレートされた発現をそれぞれ表す。灰色のドットはそれらの遺伝子を反映しており、統計的に有意な差次的発現の証拠はない。Ｘ軸（ｌｏｇ２倍数変化）は効果量であり、ＳＬＯ処理によってどのくらい発現が変化したかを示す（図５Ｄ）。０．０５未満のｐ値及び＋／－２より大きい又は小さいｌｏｇ｛２｝倍数変化を有する、最も差次的に発現された遺伝子の最大５０個のサブセットが選択される。次に、ユークリッド距離を使用して試料及び遺伝子の両方をクラスター化する。遺伝子については、追加のエルボー関数を適用して、存在する遺伝子クラスターの数を推定し、それらが高齢者の皮質においても差次的に発現される場合には赤色で着色される。計算された関係は、ヒートマップの上部（試料）及び左側（遺伝子）に描かれた樹状図で表される。色のグラデーションは、ＴＭＭによって正規化された遺伝子列にわたってコンピュータ計算され、スケーリングされたＺスコアによって決定される。所与の発現値のＺスコアは、その遺伝子のすべての発現値の平均から離れた標準偏差の数である（図５Ｅ）。０．０５未満のｐ値を有するすべてのＤＥＧを選択し、遺伝子リスト中の経路の過剰出現又は過小出現について試験する。任意の有意に富むＷｉｋｉＰａｔｈｗａｙ経路は、有意性が最も高いものから最も低いものへと順に並べられている（図５Ｆ）。
【図5C】ＳＬＯで処理された皮質ニューロンのＲＮＡ－ｓｅｑデータは、高齢者皮質及び早期老化経路との類似性を示した。対照及びＳＬＯ処理試料についての主成分分析の非管理多次元尺度法（ＭＤＳ）プロット（図５Ａ）。対照皮質ニューロンと比較してＳＬＯにおいて差次的に発現される転写物の数のベン図（図５Ｂ）、及びＳＬＯで処理した皮質ニューロンにおける２８６０個のＤＥＧと高齢者の皮質からのＤＥＧとの比較（若年者の皮質と比較）（図５Ｃ）。スメアプロット（Ｓｍｅａｒｐｌｏｔ）は、各遺伝子を灰色の・で表している。コントラスト方向に対して、赤色の・及び青色の・ドットは、０．０５のｐ調整値（ＦＤＲ）有意閾値におけるアップレギュレート及びダウンレギュレートされた発現をそれぞれ表す。灰色のドットはそれらの遺伝子を反映しており、統計的に有意な差次的発現の証拠はない。Ｘ軸（ｌｏｇ２倍数変化）は効果量であり、ＳＬＯ処理によってどのくらい発現が変化したかを示す（図５Ｄ）。０．０５未満のｐ値及び＋／－２より大きい又は小さいｌｏｇ｛２｝倍数変化を有する、最も差次的に発現された遺伝子の最大５０個のサブセットが選択される。次に、ユークリッド距離を使用して試料及び遺伝子の両方をクラスター化する。遺伝子については、追加のエルボー関数を適用して、存在する遺伝子クラスターの数を推定し、それらが高齢者の皮質においても差次的に発現される場合には赤色で着色される。計算された関係は、ヒートマップの上部（試料）及び左側（遺伝子）に描かれた樹状図で表される。色のグラデーションは、ＴＭＭによって正規化された遺伝子列にわたってコンピュータ計算され、スケーリングされたＺスコアによって決定される。所与の発現値のＺスコアは、その遺伝子のすべての発現値の平均から離れた標準偏差の数である（図５Ｅ）。０．０５未満のｐ値を有するすべてのＤＥＧを選択し、遺伝子リスト中の経路の過剰出現又は過小出現について試験する。任意の有意に富むＷｉｋｉＰａｔｈｗａｙ経路は、有意性が最も高いものから最も低いものへと順に並べられている（図５Ｆ）。
【図5D】ＳＬＯで処理された皮質ニューロンのＲＮＡ－ｓｅｑデータは、高齢者皮質及び早期老化経路との類似性を示した。対照及びＳＬＯ処理試料についての主成分分析の非管理多次元尺度法（ＭＤＳ）プロット（図５Ａ）。対照皮質ニューロンと比較してＳＬＯにおいて差次的に発現される転写物の数のベン図（図５Ｂ）、及びＳＬＯで処理した皮質ニューロンにおける２８６０個のＤＥＧと高齢者の皮質からのＤＥＧとの比較（若年者の皮質と比較）（図５Ｃ）。スメアプロット（Ｓｍｅａｒｐｌｏｔ）は、各遺伝子を灰色の・で表している。コントラスト方向に対して、赤色の・及び青色の・ドットは、０．０５のｐ調整値（ＦＤＲ）有意閾値におけるアップレギュレート及びダウンレギュレートされた発現をそれぞれ表す。灰色のドットはそれらの遺伝子を反映しており、統計的に有意な差次的発現の証拠はない。Ｘ軸（ｌｏｇ２倍数変化）は効果量であり、ＳＬＯ処理によってどのくらい発現が変化したかを示す（図５Ｄ）。０．０５未満のｐ値及び＋／－２より大きい又は小さいｌｏｇ｛２｝倍数変化を有する、最も差次的に発現された遺伝子の最大５０個のサブセットが選択される。次に、ユークリッド距離を使用して試料及び遺伝子の両方をクラスター化する。遺伝子については、追加のエルボー関数を適用して、存在する遺伝子クラスターの数を推定し、それらが高齢者の皮質においても差次的に発現される場合には赤色で着色される。計算された関係は、ヒートマップの上部（試料）及び左側（遺伝子）に描かれた樹状図で表される。色のグラデーションは、ＴＭＭによって正規化された遺伝子列にわたってコンピュータ計算され、スケーリングされたＺスコアによって決定される。所与の発現値のＺスコアは、その遺伝子のすべての発現値の平均から離れた標準偏差の数である（図５Ｅ）。０．０５未満のｐ値を有するすべてのＤＥＧを選択し、遺伝子リスト中の経路の過剰出現又は過小出現について試験する。任意の有意に富むＷｉｋｉＰａｔｈｗａｙ経路は、有意性が最も高いものから最も低いものへと順に並べられている（図５Ｆ）。
【図5E】ＳＬＯで処理された皮質ニューロンのＲＮＡ－ｓｅｑデータは、高齢者皮質及び早期老化経路との類似性を示した。対照及びＳＬＯ処理試料についての主成分分析の非管理多次元尺度法（ＭＤＳ）プロット（図５Ａ）。対照皮質ニューロンと比較してＳＬＯにおいて差次的に発現される転写物の数のベン図（図５Ｂ）、及びＳＬＯで処理した皮質ニューロンにおける２８６０個のＤＥＧと高齢者の皮質からのＤＥＧとの比較（若年者の皮質と比較）（図５Ｃ）。スメアプロット（Ｓｍｅａｒｐｌｏｔ）は、各遺伝子を灰色の・で表している。コントラスト方向に対して、赤色の・及び青色の・ドットは、０．０５のｐ調整値（ＦＤＲ）有意閾値におけるアップレギュレート及びダウンレギュレートされた発現をそれぞれ表す。灰色のドットはそれらの遺伝子を反映しており、統計的に有意な差次的発現の証拠はない。Ｘ軸（ｌｏｇ２倍数変化）は効果量であり、ＳＬＯ処理によってどのくらい発現が変化したかを示す（図５Ｄ）。０．０５未満のｐ値及び＋／－２より大きい又は小さいｌｏｇ｛２｝倍数変化を有する、最も差次的に発現された遺伝子の最大５０個のサブセットが選択される。次に、ユークリッド距離を使用して試料及び遺伝子の両方をクラスター化する。遺伝子については、追加のエルボー関数を適用して、存在する遺伝子クラスターの数を推定し、それらが高齢者の皮質においても差次的に発現される場合には赤色で着色される。計算された関係は、ヒートマップの上部（試料）及び左側（遺伝子）に描かれた樹状図で表される。色のグラデーションは、ＴＭＭによって正規化された遺伝子列にわたってコンピュータ計算され、スケーリングされたＺスコアによって決定される。所与の発現値のＺスコアは、その遺伝子のすべての発現値の平均から離れた標準偏差の数である（図５Ｅ）。０．０５未満のｐ値を有するすべてのＤＥＧを選択し、遺伝子リスト中の経路の過剰出現又は過小出現について試験する。任意の有意に富むＷｉｋｉＰａｔｈｗａｙ経路は、有意性が最も高いものから最も低いものへと順に並べられている（図５Ｆ）。
【図5F】ＳＬＯで処理された皮質ニューロンのＲＮＡ－ｓｅｑデータは、高齢者皮質及び早期老化経路との類似性を示した。対照及びＳＬＯ処理試料についての主成分分析の非管理多次元尺度法（ＭＤＳ）プロット（図５Ａ）。対照皮質ニューロンと比較してＳＬＯにおいて差次的に発現される転写物の数のベン図（図５Ｂ）、及びＳＬＯで処理した皮質ニューロンにおける２８６０個のＤＥＧと高齢者の皮質からのＤＥＧとの比較（若年者の皮質と比較）（図５Ｃ）。スメアプロット（Ｓｍｅａｒｐｌｏｔ）は、各遺伝子を灰色の・で表している。コントラスト方向に対して、赤色の・及び青色の・ドットは、０．０５のｐ調整値（ＦＤＲ）有意閾値におけるアップレギュレート及びダウンレギュレートされた発現をそれぞれ表す。灰色のドットはそれらの遺伝子を反映しており、統計的に有意な差次的発現の証拠はない。Ｘ軸（ｌｏｇ２倍数変化）は効果量であり、ＳＬＯ処理によってどのくらい発現が変化したかを示す（図５Ｄ）。０．０５未満のｐ値及び＋／－２より大きい又は小さいｌｏｇ｛２｝倍数変化を有する、最も差次的に発現された遺伝子の最大５０個のサブセットが選択される。次に、ユークリッド距離を使用して試料及び遺伝子の両方をクラスター化する。遺伝子については、追加のエルボー関数を適用して、存在する遺伝子クラスターの数を推定し、それらが高齢者の皮質においても差次的に発現される場合には赤色で着色される。計算された関係は、ヒートマップの上部（試料）及び左側（遺伝子）に描かれた樹状図で表される。色のグラデーションは、ＴＭＭによって正規化された遺伝子列にわたってコンピュータ計算され、スケーリングされたＺスコアによって決定される。所与の発現値のＺスコアは、その遺伝子のすべての発現値の平均から離れた標準偏差の数である（図５Ｅ）。０．０５未満のｐ値を有するすべてのＤＥＧを選択し、遺伝子リスト中の経路の過剰出現又は過小出現について試験する。任意の有意に富むＷｉｋｉＰａｔｈｗａｙ経路は、有意性が最も高いものから最も低いものへと順に並べられている（図５Ｆ）。
【図6A】図６Ａ～６Ｇでは、ＳＬＯで処理されたＴＡＲＤＢＰ変異体ｉＰＳＣ由来の運動ニューロン（ＭＮ）が疾患表現型の提示を示したことが示されている。分化に使用される分子を含むＴＤＰ－４３ Ｇ２９８Ｓ変異体及びＧ２９８Ｇ同質遺伝子ｉＰＳＣからＭＮを生成するために使用される分化プロトコル（図６Ａ）。誘導後３２日目における、ＳＬＯ、ＳＳＯ、及びＭＧ－１３２で処理された培養ＭＮにおける切断型カスパーゼ３及びαインターネキシンタンパク質の免疫染色（図６Ｂ）。ＳＬＯ処理後のＴＤＰ４３ Ｇ２９８Ｇ同質遺伝子対照及びＧ２９８Ｓ変異体の両方におけるＨ３Ｋ９Ｍ３及びＬＡＰ２βのハイコンテンツイメージングの発現の結果（ＤＭＳＯの対照群と比較したＳＬＯ処理の平均）（図６Ｃ）。対照及びＳＬＯで処理された変異体ＡＬＳニューロンの両方からのＭＮ培養物の代表的な位相差画像（図６Ｄ）。対照ＭＮ及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮにおけるαインターネキシン、プロテオスタット、リン酸化ニューロフィラメント重鎖タンパク質の免疫染色画像（右パネルは、対照及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮの高倍率の連結画像を示す）（図６Ｅ）、並びにすべての群にわたる、リン酸化ニューロフィラメント重鎖陽性凝集体の定量化結果（図６Ｆ）及びプロテオスタット陽性タンパク質凝集体の定量化結果（図６Ｇ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図6B】図６Ａ～６Ｇでは、ＳＬＯで処理されたＴＡＲＤＢＰ変異体ｉＰＳＣ由来の運動ニューロン（ＭＮ）が疾患表現型の提示を示したことが示されている。分化に使用される分子を含むＴＤＰ－４３ Ｇ２９８Ｓ変異体及びＧ２９８Ｇ同質遺伝子ｉＰＳＣからＭＮを生成するために使用される分化プロトコル（図６Ａ）。誘導後３２日目における、ＳＬＯ、ＳＳＯ、及びＭＧ－１３２で処理された培養ＭＮにおける切断型カスパーゼ３及びαインターネキシンタンパク質の免疫染色（図６Ｂ）。ＳＬＯ処理後のＴＤＰ４３ Ｇ２９８Ｇ同質遺伝子対照及びＧ２９８Ｓ変異体の両方におけるＨ３Ｋ９Ｍ３及びＬＡＰ２βのハイコンテンツイメージングの発現の結果（ＤＭＳＯの対照群と比較したＳＬＯ処理の平均）（図６Ｃ）。対照及びＳＬＯで処理された変異体ＡＬＳニューロンの両方からのＭＮ培養物の代表的な位相差画像（図６Ｄ）。対照ＭＮ及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮにおけるαインターネキシン、プロテオスタット、リン酸化ニューロフィラメント重鎖タンパク質の免疫染色画像（右パネルは、対照及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮの高倍率の連結画像を示す）（図６Ｅ）、並びにすべての群にわたる、リン酸化ニューロフィラメント重鎖陽性凝集体の定量化結果（図６Ｆ）及びプロテオスタット陽性タンパク質凝集体の定量化結果（図６Ｇ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図6C】図６Ａ～６Ｇでは、ＳＬＯで処理されたＴＡＲＤＢＰ変異体ｉＰＳＣ由来の運動ニューロン（ＭＮ）が疾患表現型の提示を示したことが示されている。分化に使用される分子を含むＴＤＰ－４３ Ｇ２９８Ｓ変異体及びＧ２９８Ｇ同質遺伝子ｉＰＳＣからＭＮを生成するために使用される分化プロトコル（図６Ａ）。誘導後３２日目における、ＳＬＯ、ＳＳＯ、及びＭＧ－１３２で処理された培養ＭＮにおける切断型カスパーゼ３及びαインターネキシンタンパク質の免疫染色（図６Ｂ）。ＳＬＯ処理後のＴＤＰ４３ Ｇ２９８Ｇ同質遺伝子対照及びＧ２９８Ｓ変異体の両方におけるＨ３Ｋ９Ｍ３及びＬＡＰ２βのハイコンテンツイメージングの発現の結果（ＤＭＳＯの対照群と比較したＳＬＯ処理の平均）（図６Ｃ）。対照及びＳＬＯで処理された変異体ＡＬＳニューロンの両方からのＭＮ培養物の代表的な位相差画像（図６Ｄ）。対照ＭＮ及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮにおけるαインターネキシン、プロテオスタット、リン酸化ニューロフィラメント重鎖タンパク質の免疫染色画像（右パネルは、対照及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮの高倍率の連結画像を示す）（図６Ｅ）、並びにすべての群にわたる、リン酸化ニューロフィラメント重鎖陽性凝集体の定量化結果（図６Ｆ）及びプロテオスタット陽性タンパク質凝集体の定量化結果（図６Ｇ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図6D】図６Ａ～６Ｇでは、ＳＬＯで処理されたＴＡＲＤＢＰ変異体ｉＰＳＣ由来の運動ニューロン（ＭＮ）が疾患表現型の提示を示したことが示されている。分化に使用される分子を含むＴＤＰ－４３ Ｇ２９８Ｓ変異体及びＧ２９８Ｇ同質遺伝子ｉＰＳＣからＭＮを生成するために使用される分化プロトコル（図６Ａ）。誘導後３２日目における、ＳＬＯ、ＳＳＯ、及びＭＧ－１３２で処理された培養ＭＮにおける切断型カスパーゼ３及びαインターネキシンタンパク質の免疫染色（図６Ｂ）。ＳＬＯ処理後のＴＤＰ４３ Ｇ２９８Ｇ同質遺伝子対照及びＧ２９８Ｓ変異体の両方におけるＨ３Ｋ９Ｍ３及びＬＡＰ２βのハイコンテンツイメージングの発現の結果（ＤＭＳＯの対照群と比較したＳＬＯ処理の平均）（図６Ｃ）。対照及びＳＬＯで処理された変異体ＡＬＳニューロンの両方からのＭＮ培養物の代表的な位相差画像（図６Ｄ）。対照ＭＮ及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮにおけるαインターネキシン、プロテオスタット、リン酸化ニューロフィラメント重鎖タンパク質の免疫染色画像（右パネルは、対照及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮの高倍率の連結画像を示す）（図６Ｅ）、並びにすべての群にわたる、リン酸化ニューロフィラメント重鎖陽性凝集体の定量化結果（図６Ｆ）及びプロテオスタット陽性タンパク質凝集体の定量化結果（図６Ｇ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図6E】図６Ａ～６Ｇでは、ＳＬＯで処理されたＴＡＲＤＢＰ変異体ｉＰＳＣ由来の運動ニューロン（ＭＮ）が疾患表現型の提示を示したことが示されている。分化に使用される分子を含むＴＤＰ－４３ Ｇ２９８Ｓ変異体及びＧ２９８Ｇ同質遺伝子ｉＰＳＣからＭＮを生成するために使用される分化プロトコル（図６Ａ）。誘導後３２日目における、ＳＬＯ、ＳＳＯ、及びＭＧ－１３２で処理された培養ＭＮにおける切断型カスパーゼ３及びαインターネキシンタンパク質の免疫染色（図６Ｂ）。ＳＬＯ処理後のＴＤＰ４３ Ｇ２９８Ｇ同質遺伝子対照及びＧ２９８Ｓ変異体の両方におけるＨ３Ｋ９Ｍ３及びＬＡＰ２βのハイコンテンツイメージングの発現の結果（ＤＭＳＯの対照群と比較したＳＬＯ処理の平均）（図６Ｃ）。対照及びＳＬＯで処理された変異体ＡＬＳニューロンの両方からのＭＮ培養物の代表的な位相差画像（図６Ｄ）。対照ＭＮ及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮにおけるαインターネキシン、プロテオスタット、リン酸化ニューロフィラメント重鎖タンパク質の免疫染色画像（右パネルは、対照及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮの高倍率の連結画像を示す）（図６Ｅ）、並びにすべての群にわたる、リン酸化ニューロフィラメント重鎖陽性凝集体の定量化結果（図６Ｆ）及びプロテオスタット陽性タンパク質凝集体の定量化結果（図６Ｇ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図6F】図６Ａ～６Ｇでは、ＳＬＯで処理されたＴＡＲＤＢＰ変異体ｉＰＳＣ由来の運動ニューロン（ＭＮ）が疾患表現型の提示を示したことが示されている。分化に使用される分子を含むＴＤＰ－４３ Ｇ２９８Ｓ変異体及びＧ２９８Ｇ同質遺伝子ｉＰＳＣからＭＮを生成するために使用される分化プロトコル（図６Ａ）。誘導後３２日目における、ＳＬＯ、ＳＳＯ、及びＭＧ－１３２で処理された培養ＭＮにおける切断型カスパーゼ３及びαインターネキシンタンパク質の免疫染色（図６Ｂ）。ＳＬＯ処理後のＴＤＰ４３ Ｇ２９８Ｇ同質遺伝子対照及びＧ２９８Ｓ変異体の両方におけるＨ３Ｋ９Ｍ３及びＬＡＰ２βのハイコンテンツイメージングの発現の結果（ＤＭＳＯの対照群と比較したＳＬＯ処理の平均）（図６Ｃ）。対照及びＳＬＯで処理された変異体ＡＬＳニューロンの両方からのＭＮ培養物の代表的な位相差画像（図６Ｄ）。対照ＭＮ及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮにおけるαインターネキシン、プロテオスタット、リン酸化ニューロフィラメント重鎖タンパク質の免疫染色画像（右パネルは、対照及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮの高倍率の連結画像を示す）（図６Ｅ）、並びにすべての群にわたる、リン酸化ニューロフィラメント重鎖陽性凝集体の定量化結果（図６Ｆ）及びプロテオスタット陽性タンパク質凝集体の定量化結果（図６Ｇ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図6G】図６Ａ～６Ｇでは、ＳＬＯで処理されたＴＡＲＤＢＰ変異体ｉＰＳＣ由来の運動ニューロン（ＭＮ）が疾患表現型の提示を示したことが示されている。分化に使用される分子を含むＴＤＰ－４３ Ｇ２９８Ｓ変異体及びＧ２９８Ｇ同質遺伝子ｉＰＳＣからＭＮを生成するために使用される分化プロトコル（図６Ａ）。誘導後３２日目における、ＳＬＯ、ＳＳＯ、及びＭＧ－１３２で処理された培養ＭＮにおける切断型カスパーゼ３及びαインターネキシンタンパク質の免疫染色（図６Ｂ）。ＳＬＯ処理後のＴＤＰ４３ Ｇ２９８Ｇ同質遺伝子対照及びＧ２９８Ｓ変異体の両方におけるＨ３Ｋ９Ｍ３及びＬＡＰ２βのハイコンテンツイメージングの発現の結果（ＤＭＳＯの対照群と比較したＳＬＯ処理の平均）（図６Ｃ）。対照及びＳＬＯで処理された変異体ＡＬＳニューロンの両方からのＭＮ培養物の代表的な位相差画像（図６Ｄ）。対照ＭＮ及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮにおけるαインターネキシン、プロテオスタット、リン酸化ニューロフィラメント重鎖タンパク質の免疫染色画像（右パネルは、対照及びＳＬＯで処理された変異体ＭＮの高倍率の連結画像を示す）（図６Ｅ）、並びにすべての群にわたる、リン酸化ニューロフィラメント重鎖陽性凝集体の定量化結果（図６Ｆ）及びプロテオスタット陽性タンパク質凝集体の定量化結果（図６Ｇ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図7A】図７Ａ～７Ｅ（図１Ａ～１Ｄに関連する）は、男性（上のパネル）及び女性（下のパネル）の両方の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γ発現の個々の値（図７Ａ）、並びに新生児及び高齢者（６２歳の女性）の両方の線維芽細胞についての老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色の位相差画像（図７Ｂ）を示す。女性新生児及び高齢者（６２歳）の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質のハイコンテントイメージングの結果の頻度分布分析（図７Ｃ）。ＤＭＳＯ対照新生児線維芽細胞と比較した、実際の実験における使用濃度での小分子の細胞毒性アッセイ（図７Ｄ）。新生児線維芽細胞で老化を誘導した上位７つの分子についての老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色の位相コントラスト画像（図７Ｅ）、並びに陽性細胞のパーセンテージ（プールされた複製にわたるすべての数）についての、かつ、染色の強度に基づいて高度の発現クラス及び中程度の発現クラスに分けられた定量結果（図７Ｆ）。（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図7B】図７Ａ～７Ｅ（図１Ａ～１Ｄに関連する）は、男性（上のパネル）及び女性（下のパネル）の両方の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γ発現の個々の値（図７Ａ）、並びに新生児及び高齢者（６２歳の女性）の両方の線維芽細胞についての老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色の位相差画像（図７Ｂ）を示す。女性新生児及び高齢者（６２歳）の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質のハイコンテントイメージングの結果の頻度分布分析（図７Ｃ）。ＤＭＳＯ対照新生児線維芽細胞と比較した、実際の実験における使用濃度での小分子の細胞毒性アッセイ（図７Ｄ）。新生児線維芽細胞で老化を誘導した上位７つの分子についての老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色の位相コントラスト画像（図７Ｅ）、並びに陽性細胞のパーセンテージ（プールされた複製にわたるすべての数）についての、かつ、染色の強度に基づいて高度の発現クラス及び中程度の発現クラスに分けられた定量結果（図７Ｆ）。（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図7C】図７Ａ～７Ｅ（図１Ａ～１Ｄに関連する）は、男性（上のパネル）及び女性（下のパネル）の両方の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γ発現の個々の値（図７Ａ）、並びに新生児及び高齢者（６２歳の女性）の両方の線維芽細胞についての老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色の位相差画像（図７Ｂ）を示す。女性新生児及び高齢者（６２歳）の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質のハイコンテントイメージングの結果の頻度分布分析（図７Ｃ）。ＤＭＳＯ対照新生児線維芽細胞と比較した、実際の実験における使用濃度での小分子の細胞毒性アッセイ（図７Ｄ）。新生児線維芽細胞で老化を誘導した上位７つの分子についての老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色の位相コントラスト画像（図７Ｅ）、並びに陽性細胞のパーセンテージ（プールされた複製にわたるすべての数）についての、かつ、染色の強度に基づいて高度の発現クラス及び中程度の発現クラスに分けられた定量結果（図７Ｆ）。（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図7D】図７Ａ～７Ｅ（図１Ａ～１Ｄに関連する）は、男性（上のパネル）及び女性（下のパネル）の両方の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γ発現の個々の値（図７Ａ）、並びに新生児及び高齢者（６２歳の女性）の両方の線維芽細胞についての老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色の位相差画像（図７Ｂ）を示す。女性新生児及び高齢者（６２歳）の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質のハイコンテントイメージングの結果の頻度分布分析（図７Ｃ）。ＤＭＳＯ対照新生児線維芽細胞と比較した、実際の実験における使用濃度での小分子の細胞毒性アッセイ（図７Ｄ）。新生児線維芽細胞で老化を誘導した上位７つの分子についての老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色の位相コントラスト画像（図７Ｅ）、並びに陽性細胞のパーセンテージ（プールされた複製にわたるすべての数）についての、かつ、染色の強度に基づいて高度の発現クラス及び中程度の発現クラスに分けられた定量結果（図７Ｆ）。（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図7E】図７Ａ～７Ｅ（図１Ａ～１Ｄに関連する）は、男性（上のパネル）及び女性（下のパネル）の両方の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γ発現の個々の値（図７Ａ）、並びに新生児及び高齢者（６２歳の女性）の両方の線維芽細胞についての老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色の位相差画像（図７Ｂ）を示す。女性新生児及び高齢者（６２歳）の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質のハイコンテントイメージングの結果の頻度分布分析（図７Ｃ）。ＤＭＳＯ対照新生児線維芽細胞と比較した、実際の実験における使用濃度での小分子の細胞毒性アッセイ（図７Ｄ）。新生児線維芽細胞で老化を誘導した上位７つの分子についての老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色の位相コントラスト画像（図７Ｅ）、並びに陽性細胞のパーセンテージ（プールされた複製にわたるすべての数）についての、かつ、染色の強度に基づいて高度の発現クラス及び中程度の発現クラスに分けられた定量結果（図７Ｆ）。（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図7F】図７Ａ～７Ｅ（図１Ａ～１Ｄに関連する）は、男性（上のパネル）及び女性（下のパネル）の両方の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γ発現の個々の値（図７Ａ）、並びに新生児及び高齢者（６２歳の女性）の両方の線維芽細胞についての老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色の位相差画像（図７Ｂ）を示す。女性新生児及び高齢者（６２歳）の線維芽細胞におけるＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨｐ１γタンパク質のハイコンテントイメージングの結果の頻度分布分析（図７Ｃ）。ＤＭＳＯ対照新生児線維芽細胞と比較した、実際の実験における使用濃度での小分子の細胞毒性アッセイ（図７Ｄ）。新生児線維芽細胞で老化を誘導した上位７つの分子についての老化に関連するβ－ガラクトシダーゼ染色の位相コントラスト画像（図７Ｅ）、並びに陽性細胞のパーセンテージ（プールされた複製にわたるすべての数）についての、かつ、染色の強度に基づいて高度の発現クラス及び中程度の発現クラスに分けられた定量結果（図７Ｆ）。（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図8A】図８Ａ～８Ｅ（図３Ａ～３Ｄに関連する）は、Ｈ９－ＧＦＰ ＥＳＣからの皮質ニューロンの分化及びニューロンマーカーの発現の特徴評価を示している。分化に使用される分子及び成長因子を含むＨ９－ＧＦＰ幹細胞から皮質ニューロンを生成するために使用される分化プロトコル（図８Ａ）。ＳＯＸ１及びＯＴＸ２タンパク質を発現する１４日目の皮質前駆細胞の免疫染色画像、並びに陽性細胞数の定量化（図８Ｂ）。ＴＵＪ１（ＴＵＢＢ３）及びＭＡＰ２タンパク質を発現する２１日目の皮質ニューロン（赤色）並びにヘキストで染色した核（青色）の代表的な免疫染色画像、並びに陽性ニューロンのパーセンテージの定量化（図８Ｃ）。Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βタンパク質を発現する２１日目のＧＦＰ標識皮質ニューロンの免疫染色画像（図８Ｄ）。２５個の小分子の異なる用量についての皮質ニューロンでの細胞毒性アッセイ（図８Ｅ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図8B】図８Ａ～８Ｅ（図３Ａ～３Ｄに関連する）は、Ｈ９－ＧＦＰ ＥＳＣからの皮質ニューロンの分化及びニューロンマーカーの発現の特徴評価を示している。分化に使用される分子及び成長因子を含むＨ９－ＧＦＰ幹細胞から皮質ニューロンを生成するために使用される分化プロトコル（図８Ａ）。ＳＯＸ１及びＯＴＸ２タンパク質を発現する１４日目の皮質前駆細胞の免疫染色画像、並びに陽性細胞数の定量化（図８Ｂ）。ＴＵＪ１（ＴＵＢＢ３）及びＭＡＰ２タンパク質を発現する２１日目の皮質ニューロン（赤色）並びにヘキストで染色した核（青色）の代表的な免疫染色画像、並びに陽性ニューロンのパーセンテージの定量化（図８Ｃ）。Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βタンパク質を発現する２１日目のＧＦＰ標識皮質ニューロンの免疫染色画像（図８Ｄ）。２５個の小分子の異なる用量についての皮質ニューロンでの細胞毒性アッセイ（図８Ｅ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図8C】図８Ａ～８Ｅ（図３Ａ～３Ｄに関連する）は、Ｈ９－ＧＦＰ ＥＳＣからの皮質ニューロンの分化及びニューロンマーカーの発現の特徴評価を示している。分化に使用される分子及び成長因子を含むＨ９－ＧＦＰ幹細胞から皮質ニューロンを生成するために使用される分化プロトコル（図８Ａ）。ＳＯＸ１及びＯＴＸ２タンパク質を発現する１４日目の皮質前駆細胞の免疫染色画像、並びに陽性細胞数の定量化（図８Ｂ）。ＴＵＪ１（ＴＵＢＢ３）及びＭＡＰ２タンパク質を発現する２１日目の皮質ニューロン（赤色）並びにヘキストで染色した核（青色）の代表的な免疫染色画像、並びに陽性ニューロンのパーセンテージの定量化（図８Ｃ）。Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βタンパク質を発現する２１日目のＧＦＰ標識皮質ニューロンの免疫染色画像（図８Ｄ）。２５個の小分子の異なる用量についての皮質ニューロンでの細胞毒性アッセイ（図８Ｅ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図8D】図８Ａ～８Ｅ（図３Ａ～３Ｄに関連する）は、Ｈ９－ＧＦＰ ＥＳＣからの皮質ニューロンの分化及びニューロンマーカーの発現の特徴評価を示している。分化に使用される分子及び成長因子を含むＨ９－ＧＦＰ幹細胞から皮質ニューロンを生成するために使用される分化プロトコル（図８Ａ）。ＳＯＸ１及びＯＴＸ２タンパク質を発現する１４日目の皮質前駆細胞の免疫染色画像、並びに陽性細胞数の定量化（図８Ｂ）。ＴＵＪ１（ＴＵＢＢ３）及びＭＡＰ２タンパク質を発現する２１日目の皮質ニューロン（赤色）並びにヘキストで染色した核（青色）の代表的な免疫染色画像、並びに陽性ニューロンのパーセンテージの定量化（図８Ｃ）。Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βタンパク質を発現する２１日目のＧＦＰ標識皮質ニューロンの免疫染色画像（図８Ｄ）。２５個の小分子の異なる用量についての皮質ニューロンでの細胞毒性アッセイ（図８Ｅ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図8E】図８Ａ～８Ｅ（図３Ａ～３Ｄに関連する）は、Ｈ９－ＧＦＰ ＥＳＣからの皮質ニューロンの分化及びニューロンマーカーの発現の特徴評価を示している。分化に使用される分子及び成長因子を含むＨ９－ＧＦＰ幹細胞から皮質ニューロンを生成するために使用される分化プロトコル（図８Ａ）。ＳＯＸ１及びＯＴＸ２タンパク質を発現する１４日目の皮質前駆細胞の免疫染色画像、並びに陽性細胞数の定量化（図８Ｂ）。ＴＵＪ１（ＴＵＢＢ３）及びＭＡＰ２タンパク質を発現する２１日目の皮質ニューロン（赤色）並びにヘキストで染色した核（青色）の代表的な免疫染色画像、並びに陽性ニューロンのパーセンテージの定量化（図８Ｃ）。Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βタンパク質を発現する２１日目のＧＦＰ標識皮質ニューロンの免疫染色画像（図８Ｄ）。２５個の小分子の異なる用量についての皮質ニューロンでの細胞毒性アッセイ（図８Ｅ）。（ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１ ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。
【図9A】図９Ａ～９Ｅ（図５Ａ～５Ｆに関連する）は、ＳＬＯで処理された線維芽細胞のＲＮＡ－ｓｅｑデータ及び高齢者線維芽細胞との比較を示す。若年者線維芽細胞（ＹＵＧＣ）及び高齢者線維芽細胞（ＯＬＤＣ）と比較したＳＬＯ処理（ＹＵＧＳＬＯ）において差次的に発現した転写物のベン図、並びに文献で報告されている老化遺伝子とのそれらの比較（図９Ａ）。対照及び高齢者線維芽細胞（図９Ｂ）並びにＳＬＯ処理試料（図９Ｃ）の主成分分析の非管理多次元尺度法（ＭＤＳ）プロット。０．０５未満のｐ値を有するすべてのＤＥＧを選択し、遺伝子リスト中の経路の過剰提示又は過小提示について試験する。任意の有意に富むＫＥＧＧ経路は、有意性が最も高いものから最も低いものへと順に並べられ、円のサイズは、高齢者線維芽細胞（図９Ｄ）及びＳＬＯで処理された若年者（新生児）線維芽細胞（図９Ｅ）のそのクラスターにおける転写物の数に関連する。
【図9B】図９Ａ～９Ｅ（図５Ａ～５Ｆに関連する）は、ＳＬＯで処理された線維芽細胞のＲＮＡ－ｓｅｑデータ及び高齢者線維芽細胞との比較を示す。若年者線維芽細胞（ＹＵＧＣ）及び高齢者線維芽細胞（ＯＬＤＣ）と比較したＳＬＯ処理（ＹＵＧＳＬＯ）において差次的に発現した転写物のベン図、並びに文献で報告されている老化遺伝子とのそれらの比較（図９Ａ）。対照及び高齢者線維芽細胞（図９Ｂ）並びにＳＬＯ処理試料（図９Ｃ）の主成分分析の非管理多次元尺度法（ＭＤＳ）プロット。０．０５未満のｐ値を有するすべてのＤＥＧを選択し、遺伝子リスト中の経路の過剰提示又は過小提示について試験する。任意の有意に富むＫＥＧＧ経路は、有意性が最も高いものから最も低いものへと順に並べられ、円のサイズは、高齢者線維芽細胞（図９Ｄ）及びＳＬＯで処理された若年者（新生児）線維芽細胞（図９Ｅ）のそのクラスターにおける転写物の数に関連する。
【図9C】図９Ａ～９Ｅ（図５Ａ～５Ｆに関連する）は、ＳＬＯで処理された線維芽細胞のＲＮＡ－ｓｅｑデータ及び高齢者線維芽細胞との比較を示す。若年者線維芽細胞（ＹＵＧＣ）及び高齢者線維芽細胞（ＯＬＤＣ）と比較したＳＬＯ処理（ＹＵＧＳＬＯ）において差次的に発現した転写物のベン図、並びに文献で報告されている老化遺伝子とのそれらの比較（図９Ａ）。対照及び高齢者線維芽細胞（図９Ｂ）並びにＳＬＯ処理試料（図９Ｃ）の主成分分析の非管理多次元尺度法（ＭＤＳ）プロット。０．０５未満のｐ値を有するすべてのＤＥＧを選択し、遺伝子リスト中の経路の過剰提示又は過小提示について試験する。任意の有意に富むＫＥＧＧ経路は、有意性が最も高いものから最も低いものへと順に並べられ、円のサイズは、高齢者線維芽細胞（図９Ｄ）及びＳＬＯで処理された若年者（新生児）線維芽細胞（図９Ｅ）のそのクラスターにおける転写物の数に関連する。
【図9D】図９Ａ～９Ｅ（図５Ａ～５Ｆに関連する）は、ＳＬＯで処理された線維芽細胞のＲＮＡ－ｓｅｑデータ及び高齢者線維芽細胞との比較を示す。若年者線維芽細胞（ＹＵＧＣ）及び高齢者線維芽細胞（ＯＬＤＣ）と比較したＳＬＯ処理（ＹＵＧＳＬＯ）において差次的に発現した転写物のベン図、並びに文献で報告されている老化遺伝子とのそれらの比較（図９Ａ）。対照及び高齢者線維芽細胞（図９Ｂ）並びにＳＬＯ処理試料（図９Ｃ）の主成分分析の非管理多次元尺度法（ＭＤＳ）プロット。０．０５未満のｐ値を有するすべてのＤＥＧを選択し、遺伝子リスト中の経路の過剰提示又は過小提示について試験する。任意の有意に富むＫＥＧＧ経路は、有意性が最も高いものから最も低いものへと順に並べられ、円のサイズは、高齢者線維芽細胞（図９Ｄ）及びＳＬＯで処理された若年者（新生児）線維芽細胞（図９Ｅ）のそのクラスターにおける転写物の数に関連する。
【図9E】図９Ａ～９Ｅ（図５Ａ～５Ｆに関連する）は、ＳＬＯで処理された線維芽細胞のＲＮＡ－ｓｅｑデータ及び高齢者線維芽細胞との比較を示す。若年者線維芽細胞（ＹＵＧＣ）及び高齢者線維芽細胞（ＯＬＤＣ）と比較したＳＬＯ処理（ＹＵＧＳＬＯ）において差次的に発現した転写物のベン図、並びに文献で報告されている老化遺伝子とのそれらの比較（図９Ａ）。対照及び高齢者線維芽細胞（図９Ｂ）並びにＳＬＯ処理試料（図９Ｃ）の主成分分析の非管理多次元尺度法（ＭＤＳ）プロット。０．０５未満のｐ値を有するすべてのＤＥＧを選択し、遺伝子リスト中の経路の過剰提示又は過小提示について試験する。任意の有意に富むＫＥＧＧ経路は、有意性が最も高いものから最も低いものへと順に並べられ、円のサイズは、高齢者線維芽細胞（図９Ｄ）及びＳＬＯで処理された若年者（新生児）線維芽細胞（図９Ｅ）のそのクラスターにおける転写物の数に関連する。
【図10A】図１０Ａ～１０Ｃ（図６Ａ～６Ｈに関連する）は、ＴＤＰ４３ Ｇ２９８Ｓ及びＴＤＰ４３ Ｇ２９８Ｇ ｉＰＳＣの特徴評価を示している。変異体（図１０Ａの上のパネル）及び補正された（図１０Ａの下のパネル）（同質遺伝子対照）細胞株の両方のサンガーシーケンシングの結果。両方の細胞株のＳＴＲ分析を図１０Ｂに示される選択された遺伝子座に対して行った、並びに変異体（左）及び補正された（右）細胞株の核型分析（図１０Ｃ）。
【図10B】図１０Ａ～１０Ｃ（図６Ａ～６Ｈに関連する）は、ＴＤＰ４３ Ｇ２９８Ｓ及びＴＤＰ４３ Ｇ２９８Ｇ ｉＰＳＣの特徴評価を示している。変異体（図１０Ａの上のパネル）及び補正された（図１０Ａの下のパネル）（同質遺伝子対照）細胞株の両方のサンガーシーケンシングの結果。両方の細胞株のＳＴＲ分析を図１０Ｂに示される選択された遺伝子座に対して行った、並びに変異体（左）及び補正された（右）細胞株の核型分析（図１０Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明は、様々な修正及び代替の形態を受けることが許容されるが、その例示的な実施形態は、図面に例示として示され、本明細書に詳細に記載されている。しかしながら、例示的な実施形態の記載は、本発明を開示された特定の形態に限定することを意図するものではなく、対照的に、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨及び範囲内にあるすべての修正、同等物、及び代替物を網羅することを意図することを理解されたい。
【0010】
本発明は、胚性線維芽細胞及び複数種のｈＰＳＣ由来ニューロンにおいて１週間未満で細胞老化を誘導する化学分子カクテルの開発に関する。本開示に示されるように、この老化カクテルは、体系的な化学スクリーニングによって開発され、細胞老化を誘導する能力について線維芽細胞及び異なるニューロン種で検証された。検証研究により、老化カクテルが皮質ニューロン（アルツハイマー病に罹患したもの）、中脳ドーパミンニューロン（パーキンソン病に罹患したもの）、及び運動ニューロン（ＡＬＳに罹患したもの）において化学的に誘導された老化（ＣＩＳ）をもたらすことが示された。ＡＬＳ患者由来のｉＰＳＣに由来する運動ニューロンを使用して、カクテルで処理されたニューロンが、より早く、より一貫して疾患に関連する表現型を示すことが示された。本明細書に記載の方法及び組成物は、神経疾患の前例のないモデリングを可能にし、例えば、変性疾患を有する個人からのｉＰＳＣを使用して、ヒト幹細胞ベースの薬物試験を可能にする。この開発は、現在の最先端の方法を大幅に上回る進歩を示している。特に、本方法により、細胞の遺伝的背景を変更することなく、分化したニューロンにおいて老化表現型を誘導することが可能になる。一次細胞、幹細胞由来細胞、及び線維芽細胞からの直接の変換により（すなわち、前駆細胞段階を経ることなく）生成されたニューロンを「老化」させるカクテルの能力は、本明細書に記載のように検証されている。従って、カクテルは、多くの細胞種においてその経歴及び多能性に関係なく広く使用することができる。本方法は、スケール調整可能であり、既存技術よりも予測可能な結果をもたらす。
【0011】
従って、第１の態様では、本開示は、ヒトニューロンにおいて細胞老化を誘導し、例えば、神経変性疾患、特に年齢に関連する神経変性疾患のモデル化を含む様々な用途のために年齢相応の化学的に誘導された老化ニューロンを生成するための方法を提供する。特に、本開示は、一次ニューロン、誘導ニューロン、及びｈＰＳＣ由来の皮質ニューロン、中脳ドーパミンニューロン、及び運動ニューロンを含むがこれらに限定されないニューロンにおいて、老化を化学的に誘導するためのインビトロ方法を提供する。本明細書で使用する場合、「化学的に誘導される老化」という用語は、１つ以上の小分子で処理される細胞を指し、処理の結果として、細胞が代謝的に活性であり、かつ、特徴的な表現型の変化を採択する細胞周期停止状態を細胞が維持する。表現型の変化には、形態学的変化、遺伝子発現の変化（老化バイオマーカーの発現を含む）、機能的活性の変化、及び老化に関連する成長因子、ケモカイン、及びサイトカインの分泌が含まれるが、これらに限定されない。細胞における老化は、参照細胞（例えば、本明細書に記載の化学組成物による処理／接触のない細胞）と比較して、細胞増殖の減少、リポフスチンの蓄積、β－ガラクトシダーゼ活性の増加、ミトコンドリア活性酸素種の増加、又はそれらの組み合わせを含むことができる細胞の変化によって示すことができる。
【0012】
例示的な実施形態では、これらの方法は、ヒトニューロンを、ＤＮＡグリコシラーゼ１の阻害剤、オートファジー阻害剤、及びＨＩＶプロテアーゼ阻害剤を含むことができる１つ以上の薬剤を含む化学カクテルにインビトロで接触させることと、接触したニューロンを、この化学カクテルの存在下にて培養培地中で約２～約４日間培養し、化学的に誘導された老化（ＣＩＳ）ニューロンの集団を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡグリコシラーゼ１の阻害剤、オートファジー阻害剤、及びＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は、小分子であり、特に図１１に列挙されたものである。有利なことに、薬剤は、ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、及びＯ１５１である（実施例では「ＳＬＯ」カクテルと称される）。いくつかの実施形態では、化学カクテルは、酪酸ナトリウムを更に含む。他の実施形態では、薬剤は、ＳＢＩ－０２０６９６５、酪酸ナトリウム、及びＯ１５１である（実施例では「ＳＳＯ」カクテルと称される）。
【0013】
これらの方法に従って使用するのに適切な８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧ１）の他の阻害剤には、ＳＵ０２６８、ＣＧＰ－７４５１４Ａ、ＮＣＧＣ０００１８８６１８、ＮＣＧＣ０００１８８６１６、ＮＣＧＣ０００１８８６１７、ＮＣＧＣ０００１８８６１９、３，４－ジクロロベンゾ［ｂ］チオフェン－２－カルボヒドラジド（Ｏ８）、Ｏ１、Ｏ４０、Ｏ１０５、Ｏ１５９、Ｏ１５４、Ｏ１６７、Ｏ１５１－Ｈｙ、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５８、Ｏ１７９、及びＯ１８１が含まれるが、これらに限定されない。Ｊａｃｏｂｓ ＡＣ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．８（１２）：ｅ８１６６７（２０１３）；Ｌｌｏｙｄ ＲＳ ｅｔ ａｌ．ＵＳ２０１７００３８３６５を参照のこと。
これらの方法に従って使用するのに適切な他のオートファジー阻害剤には、オートニフィブ（Ａｕｔｏｐｈｉｎｉｂ）、ニモジピン、ＳＢＩ－０２０６９６５、ＭＲＴ６８９２１、ＭＲＴ ６８９２１二塩酸塩、リエンシニン、ＬＹＮ－１６０４、ＰＨＹ３４、スパウチン－１、ＲＯＣ－３２５、ＰＩＫ－ＩＩＩ、ＵＬＫ－１０１、ＥＡＤ１、ＣＡ－５ｆ、ルカントン、ＩＩＴＺ－０１、ＭＨＹ１４８５、Ｌｙｓ０５、ＤＣ６６１、ヒドロキシクロロキン硫酸塩、クロロキン二リン酸塩、及び３－メチルアデニンが含まれるが、これらに限定されない。
これらの方法に従って使用するのに適切な他のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤には、ＧＧＴＩ２９８、ＧＧＴＩ２１４７、ホスホラミドン二ナトリウム塩、ＦＴＩ ２７７ ＨＣｌ、チピファルニブ（Ｒ１１５７７７）、ＬＢ４２７０８、ＡＧ１３４３（ネルフィナビルメシル酸塩）、ロナファルニブ、スタブジン、チプラナビル、ダルナビル、サキナビルメシル酸塩、リトナビル、及び遺伝子亜鉛メタロペプチダーゼＳＴＥ２４（ＺＭＰＳＴＥ２４）を標的とする他のエンドペプチダーゼ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
これらの方法に従って使用するのに適切な他のオートファジー阻害剤には、オートニフィブ（Ａｕｔｏｐｈｉｎｉｂ）、ニモジピン、ＳＢＩ－０２０６９６５、ＭＲＴ６８９２１、ＭＲＴ ６８９２１二塩酸塩、リエンシニン、ＬＹＮ－１６０４、ＰＨＹ３４、スパウチン－１、ＲＯＣ－３２５、ＰＩＫ－ＩＩＩ、ＵＬＫ－１０１、ＥＡＤ１、ＣＡ－５ｆ、ルカントン、ＩＩＴＺ－０１、ＭＨＹ１４８５、Ｌｙｓ０５、ＤＣ６６１、ヒドロキシクロロキン硫酸塩、クロロキン二リン酸塩、及び３－メチルアデニンが含まれるが、これらに限定されない。
これらの方法に従って使用するのに適切な他のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤には、ＧＧＴＩ２９８、ＧＧＴＩ２１４７、ホスホラミドン二ナトリウム塩、ＦＴＩ ２７７ ＨＣｌ、チピファルニブ（Ｒ１１５７７７）、ＬＢ４２７０８、ＡＧ１３４３（ネルフィナビルメシル酸塩）、ロナファルニブ、スタブジン、チプラナビル、ダルナビル、サキナビルメシル酸塩、リトナビル、及び遺伝子亜鉛メタロペプチダーゼＳＴＥ２４（ＺＭＰＳＴＥ２４）を標的とする他のエンドペプチダーゼ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
【0014】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬剤を培養培地中でニューロンに接触させる。ＤＮＡグリコシラーゼ１の阻害剤は、培養培地中で、約０．１μＭ～約１０μＭの濃度（例えば、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ）で存在することができる。有利には、ＤＮＡグリコシラーゼ１の阻害剤は、Ｏ１５１であり、約１μＭの濃度で存在する。
オートファジー阻害剤は、培養培地中で、約１μＭ～約２０μＭの濃度（例えば、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ）で存在することができる。有利には、オートファジー阻害剤は、ＳＢＩ－０２０６９６５であり、約１０μＭの濃度で存在する。
ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は、培養培地中で、約０．１μＭ～約１０μＭの濃度（例えば、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ）で存在することができる。有利には、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は、ロピナビルであり、約１μＭの濃度で存在する。
オートファジー阻害剤は、培養培地中で、約１μＭ～約２０μＭの濃度（例えば、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ）で存在することができる。有利には、オートファジー阻害剤は、ＳＢＩ－０２０６９６５であり、約１０μＭの濃度で存在する。
ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は、培養培地中で、約０．１μＭ～約１０μＭの濃度（例えば、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ）で存在することができる。有利には、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は、ロピナビルであり、約１μＭの濃度で存在する。
【0015】
本開示に記載されるように、ＣＩＳニューロンは、β－Ｇａｌなどの老化に関連するバイオマーカーを発現し、対照ニューロンと比較して、Ｈ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、及びＨＰ１γのうちの１つ以上の発現の増加を示す。ＣＩＳニューロンが神経変性疾患を有する患者に由来するニューロンから得られる場合、それらのＣＩＳニューロンはまた、神経変性疾患に特徴的な形態学的特徴を示す。例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の患者に由来するＣＩＳニューロン、又はＡＬＳに関連する遺伝子変異を有するニューロンは、対照ニューロンと比較して、軸索腫脹、軸索変性、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ９及びＬａｐ２βの発現の低下、リン酸化ニューロフィラメントの発現の増加、及びタンパク質凝集の増加などの形態学的特徴を示す。このようにして、これらの方法によって得られた化学的に誘導された老化ニューロンは、神経変性疾患を有する個人で観察された細胞表現型及び細胞内表現型を再現することができる。
本明細書に記載の方法及び組成物で使用するためのニューロンは、様々な供給源から入手することができる。いくつかの実施形態では、ニューロンは、一次ニューロンである。他の実施形態では、ニューロンは、誘導ニューロン又は「ｉＮ」である。誘導ニューロン（ｉＮ）は、分化した体細胞（線維芽細胞など）を前駆細胞段階に戻さずに、機能的なニューロンにインビトロで直接変換することによって得られるニューロンである。誘導ニューロンは、非増殖性であり、患者及び疾患に特異的なニューロンを取るための誘導多能性幹細胞の代替手段を提供し、それらが変換される線維芽細胞の老化表現型（又は「加齢」）を保持することが示されている。線維芽細胞を機能的なヒトニューロンに直接変換する方法は既知であり、一般に、線維芽細胞への神経変換因子のベクター系の送達を伴う。使用される神経変換因子の特定の組み合わせは、所望のニューロンサブタイプに依存する。いくつかの実施形態では、ｉＮは、例えば、ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、又は加齢黄斑変性症などの神経変性疾患を有するか又は有すると疑われる個人から得られた線維芽細胞などの分化細胞を使用して得られる。
本明細書に記載の方法及び組成物で使用するためのニューロンは、様々な供給源から入手することができる。いくつかの実施形態では、ニューロンは、一次ニューロンである。他の実施形態では、ニューロンは、誘導ニューロン又は「ｉＮ」である。誘導ニューロン（ｉＮ）は、分化した体細胞（線維芽細胞など）を前駆細胞段階に戻さずに、機能的なニューロンにインビトロで直接変換することによって得られるニューロンである。誘導ニューロンは、非増殖性であり、患者及び疾患に特異的なニューロンを取るための誘導多能性幹細胞の代替手段を提供し、それらが変換される線維芽細胞の老化表現型（又は「加齢」）を保持することが示されている。線維芽細胞を機能的なヒトニューロンに直接変換する方法は既知であり、一般に、線維芽細胞への神経変換因子のベクター系の送達を伴う。使用される神経変換因子の特定の組み合わせは、所望のニューロンサブタイプに依存する。いくつかの実施形態では、ｉＮは、例えば、ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、又は加齢黄斑変性症などの神経変性疾患を有するか又は有すると疑われる個人から得られた線維芽細胞などの分化細胞を使用して得られる。
【0016】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、任意の適切な分化プロトコルに従って、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、多分化能幹細胞、単能性幹細胞、又はそれらの組み合わせを含む幹細胞の分化によって生成される。例えば、いくつかの実施形態では、ニューロンは、ヒト多能性幹細胞由来のニューロンである。本明細書で使用する場合、本発明の方法に従った使用に適切な「多能性幹細胞」は、３つすべての胚葉の細胞に分化する能力を有する細胞である。本明細書での使用に好適な多能性細胞には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が含まれる。本明細書で使用する場合、「胚性幹細胞」又は「ＥＳＣ」は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞又は多能性細胞集団を意味する。Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５－１１４７（１９９８）を参照のこと。これらの細胞は、Ｏｃｔ－４、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、及びＴＲＡ－１－８１を発現し、高い核対細胞質比及び明瞭な核小体を有するコンパクトなコロニーとして現れる。ＥＳＣは、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ウィスコンシン州、マディソン）などの供給源から市販されている。本明細書で使用する場合、「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ細胞」は、それらの分化される起源の体細胞に関して様々であることができ、効力決定因子の特定のセットに関して様々であることができ、かつ、それらを単離するために使用される培養条件に関して様々であることができるが、それにもかかわらず、それらのそれぞれの分化される起源の体細胞と実質的に遺伝的に同一であり、本明細書に記載されるようにＥＳＣなどのより高い効力の細胞と同様の特徴を示す、多能性細胞又は多能性細胞集団を意味する。例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７－１９２０（２００７）を参照のこと。
【0017】
人工多能性幹細胞は、ＥＳＣと同様の形態学的特性（例えば、丸い形状、大きな核小体、及び僅かな細胞質）及び成長特性（例えば、約１７～１８時間の倍加時間）を示す。更に、ｉＰＳ細胞は、多能性細胞特異的マーカー（例えば、Ｏｃｔ－４、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、又はＴｒａ－１－８１であるが、ＳＳＥＡ－１ではない）を発現する。しかしながら、人工多能性幹細胞は、胚に直接由来しない。本明細書で使用する場合、「胚に直接由来しない」とは、ｉＰＳ細胞を生成するための開始細胞種が、多分化能細胞などの非多能性細胞又は出生後の個人から得られる体細胞などの最終分化細胞であることを意味する。
人工多能性幹細胞に再プログラミングするための対象特異的な体細胞は、生検又は他の組織サンプリング方法によって、目的の標的組織から取得又は単離することができる。例えば、対象特異的な細胞を増殖させ、分化させ、遺伝子改変し、ポリペプチド、核酸、若しくは他の因子と接触させ、凍結保存し、又はその他では人工多能性幹細胞に再プログラミングし、本開示の方法に従って老化させる前に改変することができる。
いくつかの実施形態では、細胞は、（処置される又は細胞を受け取ることができる対象に対して）自己細胞又は同種異系細胞であり得る。従って、体細胞又は成人幹細胞は、神経変性状態又は神経障害性疾患（例えば、ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、加齢黄斑変性症）を有するか又は発症している疑いのある哺乳動物から得ることができ、そのようにして得られた細胞は、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、化学的に誘導された老化のためにインビトロ由来のニューロンに再プログラムすることができる。
人工多能性幹細胞に再プログラミングするための対象特異的な体細胞は、生検又は他の組織サンプリング方法によって、目的の標的組織から取得又は単離することができる。例えば、対象特異的な細胞を増殖させ、分化させ、遺伝子改変し、ポリペプチド、核酸、若しくは他の因子と接触させ、凍結保存し、又はその他では人工多能性幹細胞に再プログラミングし、本開示の方法に従って老化させる前に改変することができる。
いくつかの実施形態では、細胞は、（処置される又は細胞を受け取ることができる対象に対して）自己細胞又は同種異系細胞であり得る。従って、体細胞又は成人幹細胞は、神経変性状態又は神経障害性疾患（例えば、ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、加齢黄斑変性症）を有するか又は発症している疑いのある哺乳動物から得ることができ、そのようにして得られた細胞は、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、化学的に誘導された老化のためにインビトロ由来のニューロンに再プログラムすることができる。
【0018】
ニューロンへの分化を促進する条件下でｈＰＳＣ（例えば、ｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣ）を培養する前に、支持細胞層（例えば、線維芽細胞層）の非存在下にて、ｈＰＳＣの増殖に好適な基質、例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、ビトロネクチン、ビトロネクチン断片、又はビトロネクチンペプチド、又はＳｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）上で、ｈＰＳＣを培養することができる。いくつかの実施形態では、ｈＰＳＣは、支持細胞層の非存在下にて、少なくとも１回から少なくとも約５回継代される。ｈＰＳＣの継代及び維持に好適な培地には、ｍＴｅＳＲ（登録商標）及びＥ８（商標）培地が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｈＰＳＣはゼノフリー条件下で維持及び継代され、細胞培養培地はＥ８又はｍＴｅＳＲなどの化学組成が明らかな培地であるが、細胞は、ヒト組換えビトロネクチンタンパク質などの完全に規定されたゼノフリー基質又はＳｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）（又は別の種類の自己コーティング基質）で維持される。一実施形態では、ｈＰＳＣは、ヒト組換えビトロネクチン若しくはその断片、ヒト組換えビトロネクチンペプチド、又はＳｙｎｔｈｅａｘ（登録商標）などの化学組成が明らかな自己コーティング基質でのＥ８培地で維持及び継代される。
任意の適切な方法を使用して、本明細書に記載の細胞種に特徴的な生物学的マーカーの発現を検出することができる。例えば、１つ以上の生物学的マーカー（例えば、神経マーカー）の存在又は非存在を、例えば、ＲＮＡシーケンシング、免疫組織化学、ポリメラーゼ連鎖反応、ｑＲＴ－ＰＣＲ、又は遺伝子発現を検出若しくは測定する他の技術を使用して検出することができる。上記のマーカーを評価するための好適な方法は当該技術分野で周知であり、例えば、ＲＮＡレベルで遺伝子発現を評価するためのｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡシーケンシングなどが含まれる。分化した細胞の同一性はまた、ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４などの多能性マーカーのダウンレギュレーション（ヒトＥＳ細胞又は人工多能性幹細胞と比較して）に関連している。細胞集団におけるタンパク質レベルでマーカーの発現を評価するための定量的方法もまた、当該技術分野で既知である。例えば、フローサイトメトリーは、典型的には、目的のタンパク質マーカー（例えば神経マーカー）を発現する（又は発現しない）所与の細胞集団内の細胞の割合を決定するために使用される。
任意の適切な方法を使用して、本明細書に記載の細胞種に特徴的な生物学的マーカーの発現を検出することができる。例えば、１つ以上の生物学的マーカー（例えば、神経マーカー）の存在又は非存在を、例えば、ＲＮＡシーケンシング、免疫組織化学、ポリメラーゼ連鎖反応、ｑＲＴ－ＰＣＲ、又は遺伝子発現を検出若しくは測定する他の技術を使用して検出することができる。上記のマーカーを評価するための好適な方法は当該技術分野で周知であり、例えば、ＲＮＡレベルで遺伝子発現を評価するためのｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡシーケンシングなどが含まれる。分化した細胞の同一性はまた、ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４などの多能性マーカーのダウンレギュレーション（ヒトＥＳ細胞又は人工多能性幹細胞と比較して）に関連している。細胞集団におけるタンパク質レベルでマーカーの発現を評価するための定量的方法もまた、当該技術分野で既知である。例えば、フローサイトメトリーは、典型的には、目的のタンパク質マーカー（例えば神経マーカー）を発現する（又は発現しない）所与の細胞集団内の細胞の割合を決定するために使用される。
【0019】
創薬方法
別の態様では、本発明は、候補試験物質のハイスループットスクリーニングのために化学的に誘導された老化ニューロンを生成及び使用し、かつ、神経変性疾患の進行を遅延させ、停止させ、及び／又は後退させる治療活性を有する薬剤を同定するための方法を提供する。そのような薬剤は、それを必要とする対象における神経変性疾患を処置するために使用することができる。
例示的な実施形態では、本方法は、医薬、小分子剤などをスクリーニングするための本開示の化学的に誘導された老化ニューロンを使用する。例えば、化学的に誘導された老化ニューロンを試験物質と接触させることができ、接触したＣＩＳニューロンを試験物質への曝露に応答するニューロンの生物学的特性の変化を検出するために研究することができる。
別の態様では、本発明は、候補試験物質のハイスループットスクリーニングのために化学的に誘導された老化ニューロンを生成及び使用し、かつ、神経変性疾患の進行を遅延させ、停止させ、及び／又は後退させる治療活性を有する薬剤を同定するための方法を提供する。そのような薬剤は、それを必要とする対象における神経変性疾患を処置するために使用することができる。
例示的な実施形態では、本方法は、医薬、小分子剤などをスクリーニングするための本開示の化学的に誘導された老化ニューロンを使用する。例えば、化学的に誘導された老化ニューロンを試験物質と接触させることができ、接触したＣＩＳニューロンを試験物質への曝露に応答するニューロンの生物学的特性の変化を検出するために研究することができる。
【0020】
本明細書に記載されるように、本開示の方法は、創薬スクリーニングのための従来のインビトロ及びインビボ方法論よりも有利である。特に、本明細書に記載の方法は、試験物質をスクリーニングするための、感度が高く、再現性があり、定量化可能な方法を提供する。これらの方法を使用して、神経変性疾患がヒト対象において現れるのを待たずに、かつ、非老化ニューロンを使用したスクリーニングよりも高い再現性及び予測可能性で、神経変性疾患に関連する細胞及び細胞内表現型を示すニューロンの治療活性について試験物質を迅速にスクリーニングすることが可能である。実際、これらのインビトロスクリーニング方法は、ヒト対象又は動物モデルを必要とせずに行うことができる。本方法は、経済的に行うことができ（例えば、最小限の量の試験物質を必要とするマルチウェルプレートを使用して）、ハイスループット方法に容易に（例えば、ロボット又は他の自動化された手順を使用して）適応される。本方法は、定量化可能なアッセイであるが、エラーが発生しやすく、多数の動物を必要とし、かつ、実験室間で容易に標準化されないか、又はハイスループットスクリーニング用にスケール調整可能でない、インビボ動物アッセイのより良い代替手段である。動物ベースのアッセイの欠点により、食品医薬品局（ＦＤＡ）及び米国農務省を含む規制当局は、より生理学的に関連するヒト細胞を含み、かつ、大規模で定量的なインビトロモデリング及びスクリーニング適用のための必要な感度及び均一性を備えた、細胞ベースのモデルの開発を促進している（国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ），２００８）。
試験物質への曝露後、次いで試験物質で処理した老化ニューロンの生物学的特性の変化を検出する。生物学的特性のそのような変化には、例えば、形態又は寿命の変化、タンパク質凝集の変化、リン酸化ニューロフィラメント及び神経変性疾患に関連する他の生物学的マーカー（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）の発現の変化が含まれる。
試験化合物が老化ニューロンにおいて細胞の特定の生物学的活性に影響を及ぼす方法は、試験化合物の性質及びアッセイされる特定の生物学的活性に依存するであろう。しかしながら、本発明の方法は、一般に、試験物質の存在下で本明細書に提供される老化ニューロンを培養するステップと、老化ニューロンの選択された生物学的特性又は活性をアッセイするステップと、アッセイで決定された値を、老化ニューロンを使用して行われるが試験物質の非存在下及び／又は適切な対照の存在下で培養された同じアッセイの値と比較するためのステップと、を含む。
試験物質への曝露後、次いで試験物質で処理した老化ニューロンの生物学的特性の変化を検出する。生物学的特性のそのような変化には、例えば、形態又は寿命の変化、タンパク質凝集の変化、リン酸化ニューロフィラメント及び神経変性疾患に関連する他の生物学的マーカー（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）の発現の変化が含まれる。
試験化合物が老化ニューロンにおいて細胞の特定の生物学的活性に影響を及ぼす方法は、試験化合物の性質及びアッセイされる特定の生物学的活性に依存するであろう。しかしながら、本発明の方法は、一般に、試験物質の存在下で本明細書に提供される老化ニューロンを培養するステップと、老化ニューロンの選択された生物学的特性又は活性をアッセイするステップと、アッセイで決定された値を、老化ニューロンを使用して行われるが試験物質の非存在下及び／又は適切な対照の存在下で培養された同じアッセイの値と比較するためのステップと、を含む。
【0021】
生物学的特性の変化は、例えば、以下の非限定的な方法によって検出することができる。ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及び非コードＲＮＡを含む）、タンパク質、ペプチド、及び代謝産物の発現は、従来の発現評価方法で評価することができる。いくつかの実施形態では、検出は、ＲＮＡシーケンシング、遺伝子発現プロファイリング、トランスクリプトーム分析、細胞増殖アッセイ、メタボローム分析、レポーター又はセンサーの検出、タンパク質発現プロファイリング、フェルスター共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）、代謝プロファイリング、及び微小透析法からなる群から選択される方法を行うことを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子発現に対する効果について薬剤をスクリーニングすることができ、そのような効果の検出は、非接触ニューロンと比較した差次的遺伝子発現についてアッセイすることを含むことができる。
例示的な実施形態では、老化ニューロンへの試験化合物の曝露（例えば、接触）後の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの正又は負の変化を検出及び／又は測定することは、例えばＲＮＡシーケンシングを使用した、全トランスクリプトーム分析を含む。そのような実施形態では、遺伝子発現は、例えば、ライトサイクル、ＲＳＥＭ（期待値最大化によるＲＮＡ－Ｓｅｑ）、Ｅｃｌｅｘ、及びＰｒｉｓｍなどのデータ処理ソフトウェアプログラムを使用して計算される。Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．９：ｅ１００２９３６（２０１３）を参照のこと。必要に応じて、ＡＮＯＶＡ分析、ボンフェローニ補正を用いた分散分析、又は両側スチューデントの検定を使用して統計的比較を行うことがすることができ、ここでは、値が、Ｐ＜０．０５で有意であると決定される。神経構築物からＲＮＡ又はタンパク質を単離するために、任意の適切な方法を使用することができる。例えば、トータルＲＮＡを単離して逆転写し、シーケンシング用のｃＤＮＡを得ることができる。
例示的な実施形態では、老化ニューロンへの試験化合物の曝露（例えば、接触）後の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの正又は負の変化を検出及び／又は測定することは、例えばＲＮＡシーケンシングを使用した、全トランスクリプトーム分析を含む。そのような実施形態では、遺伝子発現は、例えば、ライトサイクル、ＲＳＥＭ（期待値最大化によるＲＮＡ－Ｓｅｑ）、Ｅｃｌｅｘ、及びＰｒｉｓｍなどのデータ処理ソフトウェアプログラムを使用して計算される。Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．９：ｅ１００２９３６（２０１３）を参照のこと。必要に応じて、ＡＮＯＶＡ分析、ボンフェローニ補正を用いた分散分析、又は両側スチューデントの検定を使用して統計的比較を行うことがすることができ、ここでは、値が、Ｐ＜０．０５で有意であると決定される。神経構築物からＲＮＡ又はタンパク質を単離するために、任意の適切な方法を使用することができる。例えば、トータルＲＮＡを単離して逆転写し、シーケンシング用のｃＤＮＡを得ることができる。
【0022】
本明細書で使用する場合、「試験物質」には、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチド、及びアミノ酸などの単一の化合物、並びに化合物ライブラリ、遺伝子ライブラリの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、単細胞真核生物抽出物、及び動物細胞抽出物が含まれ得るが、これらに限定されない。これらは、精製された産物、又は植物、動物、微生物の抽出物などの粗製の精製物であり得る。試験化合物には、既知又は未知の毒性プロファイルを有するＦＤＡ承認薬及び非ＦＤＡ承認薬（後期動物試験又はヒト臨床試験で失敗したものを含む）が含まれ得る。試験物質は、天然物質から単離するか、化学的若しくは生化学的に合成するか、又は遺伝子工学によって調製することができる。「試験物質」には、上記の物質の混合物も包含される。
試験化合物は、本明細書に記載されるように、ＣＩＳニューロンに接触する前に、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの溶媒に溶解することができる。いくつかの実施形態では、薬剤の同定は、接触したＣＩＳニューロンを、遺伝子発現、タンパク質発現、細胞生存率、及び細胞増殖を含むがこれらに限定されない生物学的活性の正又は負の変化について分析することを含む。例えば、マイクロアレイ法を使用して、複数の試験化合物を増殖した集団に接触させる前、接触中、又は接触させた後に遺伝子発現プロファイルを分析することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、代謝アッセイ及びタンパク質発現プロファイリングなどの追加の分析を更に含む。
本開示のスクリーニング方法に従って神経変性疾患を処置するための治療活性を有するとして選択された医薬品は、追加の薬物有効性試験及び安全性試験を行い、更にヒト患者で臨床試験を行うことにより、必要に応じて更にスクリーニングすることができる。
試験化合物は、本明細書に記載されるように、ＣＩＳニューロンに接触する前に、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの溶媒に溶解することができる。いくつかの実施形態では、薬剤の同定は、接触したＣＩＳニューロンを、遺伝子発現、タンパク質発現、細胞生存率、及び細胞増殖を含むがこれらに限定されない生物学的活性の正又は負の変化について分析することを含む。例えば、マイクロアレイ法を使用して、複数の試験化合物を増殖した集団に接触させる前、接触中、又は接触させた後に遺伝子発現プロファイルを分析することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、代謝アッセイ及びタンパク質発現プロファイリングなどの追加の分析を更に含む。
本開示のスクリーニング方法に従って神経変性疾患を処置するための治療活性を有するとして選択された医薬品は、追加の薬物有効性試験及び安全性試験を行い、更にヒト患者で臨床試験を行うことにより、必要に応じて更にスクリーニングすることができる。
【0023】
製造品
別の態様では、本開示は、ヒトニューロンにおいて老化を化学的に誘導するためのキットを提供する。これらのキットの構成要素は、ＤＮＡグリコシラーゼ１の阻害剤、オートファジー阻害剤、及びＨＩＶプロテアーゼ阻害剤などの１つ以上の薬剤を含む組成物を含むことができる。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、及びＯ１５１である。いくつかの実施形態では、キットは、老化ニューロンに対して特定の効果を発揮する試験物質を同定するために試験物質をスクリーニングするための化学的に誘導された老化ニューロンの使用説明書を更に含む。
別の態様では、本開示は、ヒトニューロンにおいて老化を化学的に誘導するためのキットを提供する。これらのキットの構成要素は、ＤＮＡグリコシラーゼ１の阻害剤、オートファジー阻害剤、及びＨＩＶプロテアーゼ阻害剤などの１つ以上の薬剤を含む組成物を含むことができる。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、及びＯ１５１である。いくつかの実施形態では、キットは、老化ニューロンに対して特定の効果を発揮する試験物質を同定するために試験物質をスクリーニングするための化学的に誘導された老化ニューロンの使用説明書を更に含む。
【0024】
別段で定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されている方法及び材料と類似する又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載されている。
本明細書及び特許請求の範囲において、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、オープンエンドの用語であり、「・・・含むが、これらに限定されない」を意味すると解釈されるべきである。これらの用語は、より限定的な用語である「から本質的になる」及び「からなる」を包含する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段で明示していない限り、複数形の参照を含む。更に、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では交換可能に使用することができる。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を特徴とする」、及び「有する」という用語は、交換可能に使用することができることにも留意されたい。
本明細書で使用する場合、「から本質的になる培地」とは、特定の成分を含み、その基本的特性に実質的に影響を及ぼさない培地を意味する。
本明細書で使用する場合、「約」は、記載された濃度範囲、密度、温度、又は時間枠の５％以内を意味する。或いは及び特に生物学的システムにおいて、「約」及び「ほぼ」という用語は、所与の値の１桁以内、有利には５倍以内、より有利には２倍以内の値を意味することができる。本明細書で付与されている数値は、特段で明記しない限り、ほぼであり、「約」又は「ほぼ」という用語は、明示的に記載されていない場合には推定することができることを意味する。
以下の非限定的な実施例を検討した際に、本発明はより完全に理解されるであろう。
本明細書及び特許請求の範囲において、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、オープンエンドの用語であり、「・・・含むが、これらに限定されない」を意味すると解釈されるべきである。これらの用語は、より限定的な用語である「から本質的になる」及び「からなる」を包含する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段で明示していない限り、複数形の参照を含む。更に、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では交換可能に使用することができる。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を特徴とする」、及び「有する」という用語は、交換可能に使用することができることにも留意されたい。
本明細書で使用する場合、「から本質的になる培地」とは、特定の成分を含み、その基本的特性に実質的に影響を及ぼさない培地を意味する。
本明細書で使用する場合、「約」は、記載された濃度範囲、密度、温度、又は時間枠の５％以内を意味する。或いは及び特に生物学的システムにおいて、「約」及び「ほぼ」という用語は、所与の値の１桁以内、有利には５倍以内、より有利には２倍以内の値を意味することができる。本明細書で付与されている数値は、特段で明記しない限り、ほぼであり、「約」又は「ほぼ」という用語は、明示的に記載されていない場合には推定することができることを意味する。
以下の非限定的な実施例を検討した際に、本発明はより完全に理解されるであろう。
【実施例】
【0025】
実施例１－ニューロンにおいて化学的に誘導された老化は、神経変性の表現型の提示を促進する
本実施例では、多能性幹細胞由来のニューロンの老化を誘発するための化学カクテルの開発及び検証を記載する。小分子をスクリーニングして、胚性線維芽細胞が老化した線維芽細胞によって提示される加齢に関連した特徴を示すように誘導する小分子を同定した。次に、小分子のカクテルを、アポトーシスを引き起こすことなく線維芽細胞及び皮質ニューロンにおいて老化を誘導する能力について選択した。「老化カクテル」の有用性を、ＡＬＳ患者人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する運動ニューロンで検証した。「老化カクテル」の存在下で、ＡＬＳ患者ｉＰＳＣ由来の運動ニューロンは、カクテルで処置を行わなかった患者よりも実質的に早くタンパク質凝集及び軸索変性を示した。「老化カクテル」は、様々な神経障害のｉＰＳＣに由来するニューロンにおける疾患関連表現型の提示を一貫した方法で改善し、信頼性の高い創薬プラットフォームの生成を可能にする。
本実施例では、多能性幹細胞由来のニューロンの老化を誘発するための化学カクテルの開発及び検証を記載する。小分子をスクリーニングして、胚性線維芽細胞が老化した線維芽細胞によって提示される加齢に関連した特徴を示すように誘導する小分子を同定した。次に、小分子のカクテルを、アポトーシスを引き起こすことなく線維芽細胞及び皮質ニューロンにおいて老化を誘導する能力について選択した。「老化カクテル」の有用性を、ＡＬＳ患者人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する運動ニューロンで検証した。「老化カクテル」の存在下で、ＡＬＳ患者ｉＰＳＣ由来の運動ニューロンは、カクテルで処置を行わなかった患者よりも実質的に早くタンパク質凝集及び軸索変性を示した。「老化カクテル」は、様々な神経障害のｉＰＳＣに由来するニューロンにおける疾患関連表現型の提示を一貫した方法で改善し、信頼性の高い創薬プラットフォームの生成を可能にする。
【0026】
結果
新生児線維芽細胞において老化を誘導する小分子の同定：初代ヒト線維芽細胞は、細胞が単離された個人の年齢に応じて、年齢に関連した特徴を保持する（２２）。従って、これらの細胞は、細胞老化（ＣＳ）を研究するための適切な参照物である。年齢に関連するマーカーＨ３ｋ９Ｍｅ３（ヒストン３リジン９トリメチル化）、Ｌａｐ２β（ラミナ関連ポリペプチド２β）、及びＨＰ１γ（ヘテロクロマチンタンパク質１γ）の発現を調べることにより、新生児線維芽細胞を７２歳及び６２歳のドナーからの線維芽細胞と比較した。新生児線維芽細胞は、古い線維芽細胞（７２歳）よりも高いレベルのＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、ＨＰ１γを発現することが見出された。対照的に、古い線維芽細胞は、老化に関連するβ－Ｇａｌを発現した（図１Ａ～１Ｂ、図７Ａ）。これらの所見は、以前の観察（Ｍｉｌｌｅｒ ＪＤ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３（６）：６９１－７０５（２０１３））と一致しており、これらのマーカーがＣＳを評価するための信頼できる読み出しであることを示唆している。
次いで、オートファジーを誘発し、Ａｋｔシグナル伝達を活性化し、ｍＴＯＲ、ＨＤＡＣ、ＺＭＰＳＴＥ２４、及びサーチュインシグナル伝達を阻害する小分子を含むＣＳに関与する経路に影響を与えることが既知である２５個の小分子から、新生児線維芽細胞において老化表現型を誘導することができる分子を同定した（２３）（図１１）。生細胞と死細胞とを区別するためにカルセインＡＭ及びエチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ－１）蛍光色素を使用した以前の研究に基づいて、最小有効濃度でのこれらの分子の毒性を評価した。小分子のいずれも、ＤＭＳＯ対照を上回って細胞死を誘導しなかった（５～１０％の細胞死）（図７）。新生児線維芽細胞を小分子の存在下、有効用量で５日間連続して培養し、上記の老化マーカーの発現を調べることにより、分子の半分超（１３個の分子、ｐ≦０．００１、表１）が３つのすべて読み出しの発現を有意に減少することが見出された（図１Ｃ、１Ｄ）。１３個の分子のうち、７個はまた、ＣＳの別の一般的マーカーであるβ－Ｇａｌの発現を誘導した（図７Ｆ、７Ｇ）。従って、新生児線維芽細胞において老化表現型を誘導する小分子のセットが同定された。
新生児線維芽細胞において老化を誘導する小分子の同定：初代ヒト線維芽細胞は、細胞が単離された個人の年齢に応じて、年齢に関連した特徴を保持する（２２）。従って、これらの細胞は、細胞老化（ＣＳ）を研究するための適切な参照物である。年齢に関連するマーカーＨ３ｋ９Ｍｅ３（ヒストン３リジン９トリメチル化）、Ｌａｐ２β（ラミナ関連ポリペプチド２β）、及びＨＰ１γ（ヘテロクロマチンタンパク質１γ）の発現を調べることにより、新生児線維芽細胞を７２歳及び６２歳のドナーからの線維芽細胞と比較した。新生児線維芽細胞は、古い線維芽細胞（７２歳）よりも高いレベルのＨ３ｋ９Ｍｅ３、Ｌａｐ２β、ＨＰ１γを発現することが見出された。対照的に、古い線維芽細胞は、老化に関連するβ－Ｇａｌを発現した（図１Ａ～１Ｂ、図７Ａ）。これらの所見は、以前の観察（Ｍｉｌｌｅｒ ＪＤ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３（６）：６９１－７０５（２０１３））と一致しており、これらのマーカーがＣＳを評価するための信頼できる読み出しであることを示唆している。
次いで、オートファジーを誘発し、Ａｋｔシグナル伝達を活性化し、ｍＴＯＲ、ＨＤＡＣ、ＺＭＰＳＴＥ２４、及びサーチュインシグナル伝達を阻害する小分子を含むＣＳに関与する経路に影響を与えることが既知である２５個の小分子から、新生児線維芽細胞において老化表現型を誘導することができる分子を同定した（２３）（図１１）。生細胞と死細胞とを区別するためにカルセインＡＭ及びエチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ－１）蛍光色素を使用した以前の研究に基づいて、最小有効濃度でのこれらの分子の毒性を評価した。小分子のいずれも、ＤＭＳＯ対照を上回って細胞死を誘導しなかった（５～１０％の細胞死）（図７）。新生児線維芽細胞を小分子の存在下、有効用量で５日間連続して培養し、上記の老化マーカーの発現を調べることにより、分子の半分超（１３個の分子、ｐ≦０．００１、表１）が３つのすべて読み出しの発現を有意に減少することが見出された（図１Ｃ、１Ｄ）。１３個の分子のうち、７個はまた、ＣＳの別の一般的マーカーであるβ－Ｇａｌの発現を誘導した（図７Ｆ、７Ｇ）。従って、新生児線維芽細胞において老化表現型を誘導する小分子のセットが同定された。
【0027】
ニューロンの老化を増強する小分子カクテルの同定：老化に関連するものを含むエピジェネティックな特徴は、ｉＰＳＣへの再プログラミング中に大部分が消去される（６、２４）。その結果、ニューロンを含むｉＰＳＣから分化した細胞は、胚発生時の細胞と同じように振る舞う。対照的に、転写因子の強制された発現によって線維芽細胞から直接変換されたニューロンは、親の体細胞における年齢に関連する特徴の多くを保持している（１３）。この現象を検証し、ニューロンにおけるＣＳ読み出しを確立するために、遺伝子の過剰発現及び小分子の組み合わせを使用して、若い及び古いヒト線維芽細胞をニューロンに再プログラムした。Ｍｅｒｔｅｎｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １７（６）：７０５－１８（２０１５）。新生児及び加齢した線維芽細胞の両方に、Ｅｔｏ及びＸＴＰ－Ｎｇｎ２：２Ａ：Ａｓｃｌｌ（Ｎ２Ａ）のためのレンチウイルス粒子を形質導入し、Ｇ４１８及びピューロマイシンの存在下で少なくとも３継代増殖させた。ＤＯＸ処理の３週間後、細胞の約５０％が誘導ニューロン（ｉＮ）になり、これは分極した形態を示し、β－ＩＩＩチューブリンなどのニューロンタンパク質を発現した（図２Ａ）。重要なことに、古い線維芽細胞からのｉＮは、エピジェネティックな特徴であるＨ３Ｋ９Ｍｅ３の減少、核構造タンパク質ラミンＢ２であるＬａｐ２βの発現、及びヘテロクロマチンタンパク質であるＨＰ１γの減少を示した（図２Ｂ）。新生児ｉＮはまた、老化したｉＮと比較して、より低いヘキスト（核）強度及びより小さな核面積を有していた（図２Ｃ）。これらの結果により、加齢した線維芽細胞からのｉＮがその親細胞からの年齢に関連する特徴を保持していることが確認され、胚性ニューロンのＣＳに対する小分子の影響を調べるための基準を設定した。
【0028】
ＥＳＣ及びｉＰＳＣから分化したニューロンは、胚発生中のニューロンに類似していた。胚性ニューロンでＣＳを誘導する小分子を同定するために、ＧＦＰを発現するｈＥＳＣ（Ｈ９、ＷＡ０９）からの大脳皮質ニューロンを確立されたプロトコルに従って生成した（Ｑｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５（２）：１５４－６３（２０１７））（図８）。１４日目のＥＳＣ由来の皮質前駆細胞は、前脳前駆細胞のマーカーであるＳＯＸ１（８６．７％）及びＯＴＸ２（８７％）を発現した。化合物Ｅ（２１日目にノッチシグナル伝達及びＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１を阻害する）の存在下で成熟ニューロンに分化したとき、これらの細胞の大部分はニューロンマーカーを発現した（ＭＡＰ－２ｂ ９５％、ＴＵＢＢ３ ９５％）（図８）。次いで、ニューロン培養物をこれらの小分子で４日間連続して処理し、ＣＳの特徴についてアッセイした（図８）。陽性分子の基準は、明らかなＤＮＡ損傷及び細胞死を誘導することなく、ＣＳマーカーを発現させることであった。各小分子の５０％阻害濃度（ＩＣ50S）に基づく３つの異なる濃度を使用することにより、細胞死を引き起こさなかった濃度を同定した（図９）。ロミデプシン、Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、酪酸ナトリウム、ＳＣＲ－７、及びホスホラミドンは、Ｈ３ｋ９Ｍｅ３（平均±ＳＥＭ、対照における２１８３±１４と比較してそれぞれ、１９８０±２２、１９５７±１９、１６３２±１５、１８０６±２７、１９９０±１８、１９０８±２３、２０３７±２４）、Ｌａｐ２β（対照における７８９±４と比較してそれぞれ、７４２±６．４、６８８±６、７２６±５、７０９±８、７３４±５、６９３±７．７、８５５±７．５）、及びＨＰ１γ（対照における１０８±０．５と比較してそれぞれ、１２２±３．６、９８±０．５、９２±０．３、９６±０．６４、９８±０．５、９９±０．５、９５±０．５）の、３つの読み出しのすべての発現に有意な影響を有していた（図３Ａ、図１１）。対照群の平均発現と比較して、ロミデプシンはＨＰ１γのより大きな発現を誘導し、ホスホラミドンはより大きなＬａｐ２β発現を誘導し、これらを更なる実験から除外した（図１１）。残りの分子の中で、アクチノマイシンＤ、エトポシド、テモゾロミド、及びヒドロキシ尿素で処理されたニューロンは、対照群と比較して、より高いＨ２Ａ．ｘ発現を示したが（図３Ｂ）、これはこれらの分子が有意なＤＮＡ損傷を引き起こしたことを示唆しており、従って、これらの分子を更なるスクリーニングから除外した。更なる分析のために５つの分子を選択した（Ｏ１５１、ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、酪酸ナトリウム、ＳＣＲ－７）。
これらの５つの小分子の任意の組み合わせがニューロンにおいてＣＳを誘導したかどうかを決定するために、細胞を参照として単独でＳＢＩ－０２０６９６５（オートファジー阻害剤）で処理したが、それは、この分子が初期スクリーニング中に３つの読み出しのすべてを調節することにおいてより優れた性能を示したからである。この実験セットでは、対で使用される分子のための最初の実験セットに使用された濃度の５０％、及び細胞毒性を最小限に抑えるために３つの組み合わせで７０％の減少。結果は、ほとんどの組み合わせがＳＢＩよりも大きいか又は同様の効果を有することを示した（図４Ａ）。ＳＬＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、Ｏ１５１）及びＳＳＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、酪酸ナトリウム、Ｏ１５１）の２つの組み合わせは、ＤＭＳＯ（対照）及びＳＢＩ－０２０６９６５で処理した細胞と比較して、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βの発現においてより大きな平均差を有した（ｐ＜０．０１）。
これらの５つの小分子の任意の組み合わせがニューロンにおいてＣＳを誘導したかどうかを決定するために、細胞を参照として単独でＳＢＩ－０２０６９６５（オートファジー阻害剤）で処理したが、それは、この分子が初期スクリーニング中に３つの読み出しのすべてを調節することにおいてより優れた性能を示したからである。この実験セットでは、対で使用される分子のための最初の実験セットに使用された濃度の５０％、及び細胞毒性を最小限に抑えるために３つの組み合わせで７０％の減少。結果は、ほとんどの組み合わせがＳＢＩよりも大きいか又は同様の効果を有することを示した（図４Ａ）。ＳＬＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、ロピナビル、Ｏ１５１）及びＳＳＯ（ＳＢＩ－０２０６９６５、酪酸ナトリウム、Ｏ１５１）の２つの組み合わせは、ＤＭＳＯ（対照）及びＳＢＩ－０２０６９６５で処理した細胞と比較して、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βの発現においてより大きな平均差を有した（ｐ＜０．０１）。
【0029】
次に、安定したＣＳを誘導するために必要なＴＡの最小処理期間を決定した。７日目の皮質ニューロンをＳＬＯ小分子で様々な期間にわたって処理し（７日目、９日目、１０日目、１２日目、１３日目）、細胞を１４日目に分析した。Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３、ラミンＢ２、及びＬａｐ２βの発現は、ＳＬＯ分子での２～４日間の連続処理が小分子カクテルの最大の効果をもたらしたことを示した（図４Ｂ、４Ｃ）。この実験は、処理後５日目及び７日目においてＨ３ｋ９Ｍｅ３及びＬａｐ２βの発現がわずかに回復したが、正常な状態には回復しなかったことを示した。ラミンＢ２レベルの低下は、ＳＬＯ処理後に、より持続的であり、処理の５日後及び７日後でも対照細胞と比較して低いレベルにとどまった（図４Ｂ、４Ｃ）。
上記で分析されたＣＳ表現型に加えて、ニューロンの老化は、しばしば細胞内タンパク質凝集を伴う。陽性対照としてＭＧ－１３２処理細胞（プロテアソーム阻害剤）を用いて、タンパク質凝集に対する上位２つの小分子の組み合わせの効果を調べた。Ｐｒｏｔｅｏｓｔａｔ（商標）染色により、ＳＳＯ、ＳＬＯ、及びＭＧ－１３２条件で処理された細胞におけるタンパク質凝集が明らかになり、これらはＬａｍｐ２陽性オートファゴソームによって共局在化されていた（テューキーの多重比較 ＭＧ－１３２ ｐ＜０．０００１、ＳＬＯ ｐ＜０．００４、ＳＳＯ ｐ＜０．０３５）（図４Ｄ、４Ｅ）。
ＳＬＯ処理されたニューロンは、ＣＳに関連する転写物及び経路を発現する：ＳＬＯ処理されたニューロンのＣＳに関連する変化を定義するために、ＳＬＯで処理された又はＳＬＯ処理なしの皮質ニューロンにおいてＲＮＡ－ｓｅｑ分析を行った。全遺伝子発現に基づく主成分分析は、ＳＬＯで処理された独立して培養されたニューロン間又はＳＬＯ処理なしのニューロン（対照）間で高い類似性（クラスター化）を示したが、ＳＬＯ処理群と対照群との間では十分に分離された（図５Ａ）。ＳＬＯ処理ニューロンとＤＭＳＯ対照ニューロンとの比較により、２８６０個の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）（ＦＤＲ＜０．０５）が得られ、ＳＬＯで処理した場合には１３１５個の遺伝子がダウンレギュレートされ、１５４５個の遺伝子がアップレギュレートされたが、１１３９１個の転写物は変化がないままであった（図５Ｂ）。脳皮質試料から推測される１７７２個の老化に関連する遺伝子を伴うＳＬＯ処理皮質ニューロンからのＤＥＧを比較した（Ｃｈｅｎ ＣＹ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１３（１）：２０６－１１（２０１６））。ヒト皮質試料データを、３６個の若年者（＜２５歳）の脳試料と高齢の個人（＞６５歳）からの６２個の脳試料との比較から得た。ＳＬＯで処理された皮質ニューロンと老化した脳皮質試料との間で共有されている３７９個の老化に関連するＤＥＧ（２２％）があった（図５Ｃ）。これら共通するＤＥＧには、カルシウムシグナル伝達、ＧＡＢＡ作動性シナプス、神経活性リガンド－受容体相互作用、及びＰＩ３ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路に関与するものが含まれていた（表２、図５Ｅ、左側の灰色で強調表示）。ＤＥＧのリストにおいて、ＧＡＢＡ受容体はまた、最もダウンレギュレートされた遺伝子のうちの１つであったが、ヒストンバリアントはアップレギュレートされた（図５Ｄ、５Ｅ）。ＳＬＯ処理ニューロンにおけるＤＥＧの経路分析により、神経伝達物質受容体シグナル伝達及びカルシウム調節はダウンレギュレートされたが、タンパク質合成及びヒストン修飾（特にヒストンバリアント）の経路はアップレギュレートされたことが明らかになった（図５Ｆ）。
上記で分析されたＣＳ表現型に加えて、ニューロンの老化は、しばしば細胞内タンパク質凝集を伴う。陽性対照としてＭＧ－１３２処理細胞（プロテアソーム阻害剤）を用いて、タンパク質凝集に対する上位２つの小分子の組み合わせの効果を調べた。Ｐｒｏｔｅｏｓｔａｔ（商標）染色により、ＳＳＯ、ＳＬＯ、及びＭＧ－１３２条件で処理された細胞におけるタンパク質凝集が明らかになり、これらはＬａｍｐ２陽性オートファゴソームによって共局在化されていた（テューキーの多重比較 ＭＧ－１３２ ｐ＜０．０００１、ＳＬＯ ｐ＜０．００４、ＳＳＯ ｐ＜０．０３５）（図４Ｄ、４Ｅ）。
ＳＬＯ処理されたニューロンは、ＣＳに関連する転写物及び経路を発現する：ＳＬＯ処理されたニューロンのＣＳに関連する変化を定義するために、ＳＬＯで処理された又はＳＬＯ処理なしの皮質ニューロンにおいてＲＮＡ－ｓｅｑ分析を行った。全遺伝子発現に基づく主成分分析は、ＳＬＯで処理された独立して培養されたニューロン間又はＳＬＯ処理なしのニューロン（対照）間で高い類似性（クラスター化）を示したが、ＳＬＯ処理群と対照群との間では十分に分離された（図５Ａ）。ＳＬＯ処理ニューロンとＤＭＳＯ対照ニューロンとの比較により、２８６０個の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）（ＦＤＲ＜０．０５）が得られ、ＳＬＯで処理した場合には１３１５個の遺伝子がダウンレギュレートされ、１５４５個の遺伝子がアップレギュレートされたが、１１３９１個の転写物は変化がないままであった（図５Ｂ）。脳皮質試料から推測される１７７２個の老化に関連する遺伝子を伴うＳＬＯ処理皮質ニューロンからのＤＥＧを比較した（Ｃｈｅｎ ＣＹ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１３（１）：２０６－１１（２０１６））。ヒト皮質試料データを、３６個の若年者（＜２５歳）の脳試料と高齢の個人（＞６５歳）からの６２個の脳試料との比較から得た。ＳＬＯで処理された皮質ニューロンと老化した脳皮質試料との間で共有されている３７９個の老化に関連するＤＥＧ（２２％）があった（図５Ｃ）。これら共通するＤＥＧには、カルシウムシグナル伝達、ＧＡＢＡ作動性シナプス、神経活性リガンド－受容体相互作用、及びＰＩ３ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路に関与するものが含まれていた（表２、図５Ｅ、左側の灰色で強調表示）。ＤＥＧのリストにおいて、ＧＡＢＡ受容体はまた、最もダウンレギュレートされた遺伝子のうちの１つであったが、ヒストンバリアントはアップレギュレートされた（図５Ｄ、５Ｅ）。ＳＬＯ処理ニューロンにおけるＤＥＧの経路分析により、神経伝達物質受容体シグナル伝達及びカルシウム調節はダウンレギュレートされたが、タンパク質合成及びヒストン修飾（特にヒストンバリアント）の経路はアップレギュレートされたことが明らかになった（図５Ｆ）。
【0030】
ＬＭＮＡ遺伝子（ラミンＡ及びラミンＣをコードする）又はＷＲＮ遺伝子（ＷＲＮ ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ）の変異に関連する早期老化症候群は、遺伝子発現に関して正常な老化に類似している；Ｄｒｅｅｓｅｎ Ｏ ｅｔ ａｌ．Ａｇｉｎｇ（Ａｌｂａｎｙ，ＮＹ） ３（９）：８８９－９５（２０１１）；Ｋｙｎｇ ＫＪ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １００（２１）：１２２２５９－６４（２００３）。正常なニューロンにおける変異体ラミンＡ／Ｃ（プロジェリン）の過剰発現は、老化の表現型を引き起こした（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１３）。興味深いことに、ＳＬＯで処理されたニューロンは、ハッチンソン－ギルフォードプロジェリア症候群に関与する１２個の遺伝子（経路の全遺伝子の３０％）を共有するアップレギュレートされた経路（ＷＰ４３２０）を示した（図４Ｆ）。これらには、ＭＢＤ３、ＭＴＡ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｄ、及びＨＩＳＴ１Ｈ３Ｅが含まれ、これらのうちのいくつかはヒストン修飾経路（ＷＰ２３６９）に関与している。更に、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）経路のいくつかのメンバーは、ＲＮＡ－ｓｅｑデータでアップレギュレーション及びダウンレギュレーションの両方があった（図４Ｆ）。ＳＬＯ処理細胞におけるアップレギュレートされたＢＤＮＦ応答性転写物には、インスリン受容体基質１及び２（ＩＲＳ１及びＩＲＳ２）、アポトーシス促進遺伝子（ＦＯＸＯ３、ＢＡＤ、及びＢＣＬ２Ｌ１１）、栄養センシング転写物（ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＴＳＣ２、ＥＥＦ２）、及び下流のキナーゼ分子（ＰＩＫ３Ｒ２、ＥＬＫ１、ＰＴＰＲＦ、ＭＡＰＫ７、ＡＫＴ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＰＬＣＧ１、ＣＲＴＣ１、及びＪＵＮ）、並びに他の転写物（ＳＨＣ２、ＲＡＢ３Ａ、ＤＯＣＫ３、ＲＥＬＡ、ＮＣＫ２、ＲＡＣＫ１、ＳＨ２Ｂ１、ＬＩＮＧＯ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＥＧＲ１、ＳＱＳＴＭ１）が含まれた。ＳＬＯ処理細胞においてダウンレギュレートされたＢＤＮＦ経路関連転写物には、ＡＭＰＡ及びＮＭＤＡ受容体（ＧＲＩＡ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＮ２Ｂ）、ｔｒｋＢ及びｔｒｋＣ受容体の両方（ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３）及びそれらの下流カルシウムシグナル伝達分子（ＮＦＡＴＣ４、ＣＡＭＫ２Ａ、ＣＡＭＫ４）、ＭＡＰＫ応答性転写物（ＭＡＰ２Ｋ１、ＫＩＤＩＮＳ２２０、ＰＲＫＡＡ２、ＰＰＰ２ＣＡ）、並びに他の転写物（ＧＡＢＲＢ３、ＭＥＦ２Ｃ、ＳＨＣ３、ＲＡＳＧＲＦ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＤＣ４２、ＣＤＨ２、ＣＮＲ１、ＳＰＰ１、ＥＩＦ４Ｅ、ＮＳＦ、ＰＴＰＮ１１、ＤＬＧ１、ＡＰＣ）が含まれた。トランスクリプトームデータは更に、ＳＬＯで処理されたニューロンが老化したヒト皮質からのニューロンに類似していることを示唆した。
【0031】
ＣＳの誘導は、ＡＬＳ ＭＮにおける疾患表現型の発現を加速する：筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患は、通常、４０代以降に症状を表す。ＡＬＳ ｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるＣＳの誘導は、疾患の表現型の提示を加速し得、ＡＬＳ ＭＮはＣＳ因子に対して異なって反応し、老化の読み出しのより大きな変化を提供し得る。ＡＬＳ患者から生成されたＴＡＲＤＢＰ変異体（Ｇ２９８Ｓ）ｉＰＳＣ株及びＣＲＩＳＰＲ（図１０）を使用して変異を補正することによって生成されたその同質遺伝子細胞株（Ｇ２９８Ｇ）を使用して、この決定を行った。Ｃｈｅｎ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １４（６）：７９６－８０９（２０１４） ａｎｄ Ｄｕ ＺＷ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．６：６６２６（２０１５）に開示されたプロトコルを使用して、変異ｉＰＳＣ及び修正されたｉＰＳＣの両方を脊髄運動ニューロン（ＭＮ）に分化させ（図６Ａ）、ＭＮをＳＬＯカクテルで２８日目（成熟後７日目）に４日間処理した。予想した通り、小分子の添加により、切断型カスパーゼ３（ＣＣ３）を発現する細胞の割合はカクテルの除去から４週間後でも有意に変化せず（対照＝１２±３．３、ＳＬＯ＝１０±１．５、ＳＳＯ＝１０．７±２．４、ＭＧ１３２＝１６．４±３．７）（図６Ｂ）、これは明らかな細胞毒性がなかったことを示唆している。
次いで、ＳＬＯで処理されたＭＮが、線維芽細胞及び皮質ニューロンで観察されたようにＣＳ様の表現型を示すかどうかを決定した。２９８Ｇ及び２９８Ｓ ＭＮの両方が、ＳＬＯ処理後にＨ３Ｋ９Ｍｅ９及びＬａｐ２βの発現の低下を示し（図１６Ｃ）、これはＳＬＯ処理によってＣＳが誘導されることを示している。両方の細胞株はＳＬＯ化学物質に同じレベルで応答し、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３及びｌａｐ２βのシグナル強度の差は有意ではなかった（図６Ｃ）。次いで、ＣＳの誘導がニューロン変性を加速するかどうかを決定した。３２日目までに、ＳＬＯで処理された２９８Ｓ ＭＮは軸索腫脹、軸索変性の兆候を示したが、２９８Ｇ ＭＮは比較的無傷の神経突起を示した（図６Ｄ）。プロテオスタット染色は、ＳＬＯで処理した細胞、特に２９８Ｓ ＭＮで増加した。リン酸化ニューロフィラメント（これは軸索変性及び代謝回転のマーカーである）の染色は、ＳＬＯ処理されていない２９８Ｓ及びＳＬＯ処理された２９８Ｇ ＭＮよりもＳＬＯ処理された２９８Ｓで有意に増加した。より高い倍率の下で、プロテオスタット陽性の凝集体が軸索に沿って観察され、α－インターネキシン及びリン酸化ニューロフィラメントの両方に対して陽性であった（図６Ｅ）。凝集体の定量化は、ＳＬＯで処理されたＧ２９８Ｇ同質遺伝子対照ＭＮよりも、Ｇ２９８Ｓ ＡＬＳ変異体においてｐ－ＮＦＨ凝集体（Ｇ２９８Ｇの１．２２±０．３１対Ｇ２９８Ｓの４．２６±０．９２）及びプロテオスタット陽性凝集体（Ｇ２９８Ｇの４．４９±０．３８対Ｇ２９８Ｓの７．８６±１．０６）の有意な増加を示した（図６Ｆ、６Ｇ）。
次いで、ＳＬＯで処理されたＭＮが、線維芽細胞及び皮質ニューロンで観察されたようにＣＳ様の表現型を示すかどうかを決定した。２９８Ｇ及び２９８Ｓ ＭＮの両方が、ＳＬＯ処理後にＨ３Ｋ９Ｍｅ９及びＬａｐ２βの発現の低下を示し（図１６Ｃ）、これはＳＬＯ処理によってＣＳが誘導されることを示している。両方の細胞株はＳＬＯ化学物質に同じレベルで応答し、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３及びｌａｐ２βのシグナル強度の差は有意ではなかった（図６Ｃ）。次いで、ＣＳの誘導がニューロン変性を加速するかどうかを決定した。３２日目までに、ＳＬＯで処理された２９８Ｓ ＭＮは軸索腫脹、軸索変性の兆候を示したが、２９８Ｇ ＭＮは比較的無傷の神経突起を示した（図６Ｄ）。プロテオスタット染色は、ＳＬＯで処理した細胞、特に２９８Ｓ ＭＮで増加した。リン酸化ニューロフィラメント（これは軸索変性及び代謝回転のマーカーである）の染色は、ＳＬＯ処理されていない２９８Ｓ及びＳＬＯ処理された２９８Ｇ ＭＮよりもＳＬＯ処理された２９８Ｓで有意に増加した。より高い倍率の下で、プロテオスタット陽性の凝集体が軸索に沿って観察され、α－インターネキシン及びリン酸化ニューロフィラメントの両方に対して陽性であった（図６Ｅ）。凝集体の定量化は、ＳＬＯで処理されたＧ２９８Ｇ同質遺伝子対照ＭＮよりも、Ｇ２９８Ｓ ＡＬＳ変異体においてｐ－ＮＦＨ凝集体（Ｇ２９８Ｇの１．２２±０．３１対Ｇ２９８Ｓの４．２６±０．９２）及びプロテオスタット陽性凝集体（Ｇ２９８Ｇの４．４９±０．３８対Ｇ２９８Ｓの７．８６±１．０６）の有意な増加を示した（図６Ｆ、６Ｇ）。
【0032】
ＳＯＤ１変異におけるニューロフィラメントの不均衡は、ＡＬＳ疾患の兆候の１つである（３）。ＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＮＥＦＨ、ＮＥＦＭ、及びα－インターネキシンを含む３つのニューロフィラメント転写物が変異ニューロンにおいてより少ない発現を有し、ＮＥＦＬ遺伝子のみが同質遺伝子対照と比較してより高い発現を有していた。ＳＬＯで処理したときに、遺伝子型に関係なくすべてのニューロフィラメントの遺伝子発現の低下が観察されたが、ニューロフィラメントはＮＥＦＬを除く正常な遺伝子型においてより高い発現を有してした。これらの結果により、ＴＡＲＤＢＰ変異体ＭＮにおけるニューロフィラメントの誤調節が確認された。従って、ＣＳの誘導は、ＡＬＳ関連疾患の表現型の提示を容易にする。
【0033】
有意性
殆どの神経変性疾患は加齢と同時に起こる。従って、幹細胞由来のニューロンにおけるＣＳを再現することにより、疾患メカニズムを研究する能力が増加し得る。Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３、ＨＰ１γ、Ｌａｐ２βを読み出しとして使用し、新生児線維芽細胞及びｉＰＳＣ由来皮質ニューロンにおいてＣＳを誘導する化学物質／経路をスクリーニングすることにより、前脳ニューロンにおいてＣＳを誘導する小分子のカクテルを開発した。この化学物質誘導の老化（ＣＩＳ）をＡＬＳ患者のｉＰＳＣに由来する運動ニューロンで検証した。重要なことに、ＣＩＳは、疾患に関連する表現型の提示を増強した。このＣＩＳ戦略により加齢に関連する変性疾患のより効果的なｉＰＳＣベースのモデリングが可能になった。
殆どの神経変性疾患は加齢と同時に起こる。従って、幹細胞由来のニューロンにおけるＣＳを再現することにより、疾患メカニズムを研究する能力が増加し得る。Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３、ＨＰ１γ、Ｌａｐ２βを読み出しとして使用し、新生児線維芽細胞及びｉＰＳＣ由来皮質ニューロンにおいてＣＳを誘導する化学物質／経路をスクリーニングすることにより、前脳ニューロンにおいてＣＳを誘導する小分子のカクテルを開発した。この化学物質誘導の老化（ＣＩＳ）をＡＬＳ患者のｉＰＳＣに由来する運動ニューロンで検証した。重要なことに、ＣＩＳは、疾患に関連する表現型の提示を増強した。このＣＩＳ戦略により加齢に関連する変性疾患のより効果的なｉＰＳＣベースのモデリングが可能になった。
【0034】
インビトロニューロン老化システムは、ヒトの脳に通常存在する多くの他の細胞種を欠如しているにもかかわらず、高齢者皮質試料に類似している。これは、本明細書に開示されるように生成されたＣＩＳニューロンと高齢者ヒト脳組織との間の加齢に関連する転写物の実質的な重複（２２％）に反映されている。Ｃｈｅｎ ＣＹ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１３（１）：２０６－１１（２０１６）。これらの共通の転写物は、シナプス膜アセンブリでのニューレキシン／ニューロリギン複合体、並びにＧＡＢＡ、グルタミン酸、及びコリン作動系からの神経伝達物質放出関連転写物に関与している。ニューレキシンの発現は、年齢とともに低下することが既知である。Ｋｕｍａｒ Ｄ ａｎｄ Ｔｈａｋｕｒ ＭＫ，Ａｇｅ（Ｄｏｒｄｒ）．３７（２）：１７（２０１５）；Ｋｏｎａｒ Ａ ｅｔ ａｌ．Ａｇｉｎｇ Ｄｉｓ．７（２）：１２１－９（２０１６）。ＳＬＯで処理された皮質ニューロンにおいて有意な変化を示すＣＲＥＢ１（Ｐａｒａｍａｎｉｋ Ｖ ａｎｄ Ｔｈａｋｕｒ ＭＫ，Ａｒｃｈ Ｉｔａｌ Ｂｉｏｌ．１５１（１）：３３－４２（２０１３））及びＢＤＮＦシグナル伝達経路のＣＲＴＣ１転写コアクチベーターなどの他の転写物はまた、脳の老化及びニューロンの老化に寄与する（Ｂｏｇｅｒ ＨＡ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ．１０（２）：１８６－９８（２０１１）；Ｓｉｌｈｏｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１３２（３）：６１３－２４（２００５）；Ｔｏｎｇ ＣＷ ｅｔ ａｌ．Ｄｏｎｇｗｕｚｕｅ Ｙａｎｊｉｕ ３６（１）：４８－５３（２０１５）；ｖｏｎ Ｂｏｈｌｅｎ ｕｎｄ Ｈａｌｂａｃｈ Ｏ，Ｆｒｏｎｔ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２（２０１０））。ｐ６２（ＳＱＳＴＭ１）などのＢＤＮＦ経路のメンバーとして記載した分子のうちのいくつかは、複数の機能を有し、神経変性への寄与について周知である（Ｍａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０（５）：２０９４－１１４（２０１９））。更に、本明細書に開示されるように生成されたＣＩＳニューロンは、プロジェリア症候群においてプロジェリン効果を有するいくつかのヒストンバリアントを共有した。ヒストンバリアントは、皮質ニューロンにおけるＣＩＳ中に最も影響を受ける転写物の１つである。加齢に関連する遺伝子の発現（Ｇｅｖｒｙ Ｎ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２１（１５）：１８６９－８１（２００７））及び／又はクロマチン構成（Ｆｌｅｘ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．（２０１９））を調節することによるヒストンバリアント交換は、ＣＳ及び老化の背後にあるメカニズムのうちの１つである。従って、本明細書に開示されるように生成されたＣＩＳは、主にエピジェネティックなレベルでプロジェリン効果のいくつかの部分を再現した。
【0035】
細胞老化は、ミトコンドリア機能障害、ＤＮＡ損傷、及びＰ１６の発現の変化、並びに遺伝子サイレンシングのためのエピジェネティックな特徴などの特徴を共有する（Ｋｉｍ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２３（９）：２２５０－８（２０１８）；Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ．８３（２）：２６６－８２（２０１４）；Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ ＤＣ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １４６（５）：６８２－９５（２０１１）；Ｓａｔｏｈ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（６）：３６２－７４（２０１７））。これらの変化は、細胞のサイズ、形状及び代謝、増殖停止、並びにテロメア侵食の変化を含む、細胞レベルでの加齢に関連する変化を最終的にもたらす（Ｐｅｔｒｏｖａ ＮＶ ｅｔ ａｌ．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ １５（６）：９９９－１０１７（２０１６）；Ｌｏｐｅｚ－Ｏｔｉｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．１５３（６）：１１９４－２１７（２０１３）；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｓｅｇｕｒａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２８（６）：４３６－５３（２０１８））。線維芽細胞などの有糸分裂細胞では、Ｐ１６の発現は増殖停止を伴い、老化を誘導する。本明細書に開示されるパルボシクリブによるＰ１６の活性化は、ＣＤＫ４／６及び線維芽細胞の増殖を妨げて老化をもたらすことによるＣＳにおける最も効率的な経路の１つであった（Ｖｉｊａｙａｒａｇｈａｖａｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔ Ｏｎｃｏｌ．１３（１）：２１－３８（２０１８））。線維芽細胞の観察に関係する他の経路は、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ合成、及びＤＮＡアルキル化経路に関連し、これらはすべて細胞分裂及びテロメアの減少に関連している。驚くべきことに、サーチュイン阻害剤はいずれも、それらの老化に対する影響にもかかわらず、線維芽細胞又はニューロンにおいて老化を誘導しなかった。Ｓａｔｏｈ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（６）：３６２－７４（２０１７）；Ｂｏｎｄａ ＤＪ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．１０（３）：２７５－９（２０１１）；Ｍａｚｕｃａｎｔｉ ＣＨ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１５（２１）：２１１６－３８（２０１５）。これは、細胞種間の違い又は阻害剤による不十分な治療を反映している可能性がある。
【0036】
ニューロンなどの有糸分裂後細胞では、プロテアソーム及びオートファジープロセスを含むタンパク質品質管理がＣＳの進行においてより重要である。Ｉｈａｒａ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ．２（８）（２０１２）；Ｓｃｏｔｔｅｒ ＥＬ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１２７（６）：１２６３－７８（２０１４）；Ｐａｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ １３１（８）：１９６９－７８（２００８）；Ｚｈａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８（８）：８６１－８（２０１７）。これは、オートファジー阻害剤の強力なＣＳ誘導効果を示すことによって本明細書で反映される。欠陥のあるオートファゴソームは、損傷したミトコンドリア及び折りたたまれていないタンパク質破片を除去することができず、ミトコンドリアの代謝回転が欠如し、より多くの酸化ストレスが生成された。Ｈｅ ＬＱ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．３４（５）：６０５－１１（２０１３）；Ｗｙｓｓ－Ｃｏｒａｙ Ｔ，Ｎａｔｕｒｅ ５３９（７６２８）：１８０－６（２０１６）。酸化ストレスはＲＯＳを生成し、最終的にＣＳに関連するより高いＤＮＡ変異の原因となる。Ｌｏ Ｓａｒｄｏ Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５（１）：６９－７４（２０１７）；Ｃａｍｐｏｓ ＰＢ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：２９２（２０１４）。同様に、ゲノムＤＮＡにおける酸化ヌクレオチドの検出及び除去に重要なＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧＩ）の阻害は、線維芽細胞ではなくニューロンにおいてＣＳ表現型を悪化させることが見出された。ＳＬＯにおける３つの小分子のうちの２つであるＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧＩ）阻害剤（Ｏ１５１）及びＨＩＶプロテアーゼ阻害剤（ロピナビル）は、ニューロンにおいてＣＳ表現型を調節したが、これは、塩基除去修復（ＢＥＲ）経路 （Ｌｅａｎｄｒｏ ＧＳ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ．７７６：３１－９（２０１５）；Ｃａｎｎａｒｄ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ．５（１０）（２０１５）；Ｓｙｋｏｒａ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈ Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．１３４（１０）：４４０－８（２０１３））及びプロテアソーム活性が、ニューロンの健全性にとって重要な経路であることを示している（Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８（３３）：８１８９－９８（２００８）；Ｄａｎｔｕｍａ ＮＰ ａｎｄ Ｂｏｔｔ ＬＣ，Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：７０（２０１４）；ｖａｎ Ｔｉｊｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１２０（９）：１６１５－２３（２００７）；Ｚｈｅｎｇ Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ Ｄｉｓ．１４（４）：１６１－７５（２０１４））。
【0037】
ＣＩＳを開発することの１つの利点は、ヒト幹細胞を使用して加齢に関連する疾患の効果的かつ信頼できるモデリングを可能にすることである。ＡＬＳなどの神経変性変化のいくつかの態様は、ニューロンの分化プロセス、長期の成熟、及び受けるストレス（栄養因子及び培地変化のない基礎条件下での培養を含む）を厳密に制御することによって再現することができる。Ｃｈｅｎ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．１４（６）：７９６－８０９（２０１４）。長期にわたるそのような操作は、システムに変数を追加し、幹細胞ベースの疾患モデリングをより困難にする。ＴＡＲＤＢＰ変異を有する患者からのＭＮは、可溶性及び界面活性剤耐性ＴＤＰ－４３の増加したレベルを有し、かつ、細胞生存率の低下を示し、このモデルがＡＬＳの病理を表していることを示唆している（Ｂｉｌｉｃａｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０９（１５）：５８０３－８（２０１２）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２４（１０）：１５７９－８９（２０１８））。しかしながら、最近の研究では、不溶性ＴＤＰ４３の増加及びその誤局在表現型のいずれも繰り返されなかった（Ｋｌｉｍ ＪＲ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（２）：１６７－７９（２０１９））。同様に、パーキンソン病（ＰＤ）ｉＰＳＣからのドーパミンニューロンは、ミトコンドリア機能障害及び酸化ストレス、神経突起の成長及び形態の変化、シナプス接続、並びにリソソーム機能障害を示した（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｄａｎｅｓ Ａ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．４（５）：３８０－９５（２０１２）；Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２（３）：３５４－６７（２０１３）；Ｍｏｎｚｉｏ Ｃｏｍｐａｇｎｏｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １１（５）：１１８５－９８（２０１８）；Ｋｏｕｒｏｕｐｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１４（１８）：Ｅ３６７９－Ｅ８８（２０１７））が、タンパク質凝集及びルイス体などの特徴的な病理はほとんど観察されない（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｄａｎｅｓ，２０１２；Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，２０１３；Ｍｏｎｚｉｏ Ｃｏｍｐａｇｎｏｎｉ，２０１８；Ｋｏｕｒｏｕｐｉ，２０１７；Ｍｉｓｈｉｍａ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．１９（１２）（２０１８））。これらの不一致は、使用されるプロトコルの違い、及び幹細胞由来のニューロンを成熟させるために必要な長期培養に起因し得る。ＣＩＳを生成するための本明細書に記載の方法は、ＴＤＰ４３変異体ＭＮにおけるタンパク質凝集及び軸索変性を含む疾患に関連する表現型の早期かつ一貫した提示を可能にした。これらのカクテルは異なるニューロン種においてＣＳを誘導するので、本明細書に記載の方法及び細胞培養成分を使用して生成されたＣＩＳを使用して、ＰＤ、ＡＤ、及び加齢黄斑変性症などのｉＰＳＣを使用する他の加齢性疾患における表現型の提示を促進することができる。
【0038】
本明細書に記載のＣＩＳ方法は、遺伝子操作を必要とせずに、短期間（処置の２～４日後）にＣＳを誘導する。これは、疾患に関連する表現型の信頼できる一貫した提示を促進し、特定の疾患に特異的ではなかった。カクテルは、分子の比較的小さなプールをスクリーニングすることによって開発されたが、これは、他の分子、特に、類似した経路に影響を与える分子もＣＳを誘導することができることを示唆している。本方法はまた、ｉＰＳＣ由来ニューロンからの疾患表現型のより迅速で一貫した提示を可能にした。従って、これは薬物検査プラットフォームを確立するのに役立つ。
【0039】
方法
ｈＰＳＣからのニューロン分化：ヒト胚性幹細胞Ｈ９（ＷＡ０９、ＷｉＣｅｌｌ）、Ｈ９－ＧＦＰ（ＡＡＶＳ１－ＣＡＧ－ｅＧＦＰ）細胞、及びＴＡＲＤＢＰ変異体（Ｇ２９８Ｓ）、並びに同質遺伝子制御人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ－８培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むマトリゲル上で２５％のコンフルエンシーまで増殖させた。皮質分化のために、ｈＰＳＣの５日目の培養物をアキュターゼで処理し、解離した単一細胞を、２５ｃｍフラスコ中のＳＭＡＤ阻害剤ＳＢ４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＤＭＨ－１（Ｔｏｃｒｉｓ）（両方とも２μＭ）、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤（Ｔｏｃｒｉｓ）を含む神経分化培地（ＮＤＭ）（ＤＭＤＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ １：１＋１×Ｎ２サプリメント＋ｌｍＭ Ｌ－グルタマックス）で培養し（一晩）、７日間にわたって球体形成を促進した。８日目に、スムーズンドアンタゴニストであるシクロパミン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、２μＭ）及びＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ、１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、７日間にわたって球体を背側前脳（大脳皮質）前駆細胞にパターン化した。１４日目に、神経前駆細胞をアキュターゼで単一細胞に分離し、最終成熟のために、アッセイ時間まで化合物Ｅ（０．１μＭ、ＴＯＣＲＩＳ）を補充した成熟培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ５０％／５０％、ｌ×Ｂ２７サプリメント、ｌ×非必須アミノ酸、ｌ×グルタマックス）のラミニンコーティングプレート上でプレーティングした。運動ニューロンの分化のために、以前に公開されたプロトコル（Ｄｕ、２０１５）を何ら変更せずに使用した。
ｈＰＳＣからのニューロン分化：ヒト胚性幹細胞Ｈ９（ＷＡ０９、ＷｉＣｅｌｌ）、Ｈ９－ＧＦＰ（ＡＡＶＳ１－ＣＡＧ－ｅＧＦＰ）細胞、及びＴＡＲＤＢＰ変異体（Ｇ２９８Ｓ）、並びに同質遺伝子制御人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ－８培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むマトリゲル上で２５％のコンフルエンシーまで増殖させた。皮質分化のために、ｈＰＳＣの５日目の培養物をアキュターゼで処理し、解離した単一細胞を、２５ｃｍフラスコ中のＳＭＡＤ阻害剤ＳＢ４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＤＭＨ－１（Ｔｏｃｒｉｓ）（両方とも２μＭ）、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤（Ｔｏｃｒｉｓ）を含む神経分化培地（ＮＤＭ）（ＤＭＤＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ １：１＋１×Ｎ２サプリメント＋ｌｍＭ Ｌ－グルタマックス）で培養し（一晩）、７日間にわたって球体形成を促進した。８日目に、スムーズンドアンタゴニストであるシクロパミン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、２μＭ）及びＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ、１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、７日間にわたって球体を背側前脳（大脳皮質）前駆細胞にパターン化した。１４日目に、神経前駆細胞をアキュターゼで単一細胞に分離し、最終成熟のために、アッセイ時間まで化合物Ｅ（０．１μＭ、ＴＯＣＲＩＳ）を補充した成熟培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ５０％／５０％、ｌ×Ｂ２７サプリメント、ｌ×非必須アミノ酸、ｌ×グルタマックス）のラミニンコーティングプレート上でプレーティングした。運動ニューロンの分化のために、以前に公開されたプロトコル（Ｄｕ、２０１５）を何ら変更せずに使用した。
【0040】
ｉＮへの成人ヒト線維芽細胞の直接変換：初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＷＣ－０４－０５－ＣＯ－ＤＧ，７２歳の男性、ＷＣ－６０－０７－ＣＯ－ＣＭＮ，新生児男性、ＷＣ－０３－０６－ＣＯ－ＤＧ，６２歳の女性、及びＷＣ－５９－０７－ＣＯ－ＣＭＮ，新生児の女性、すべてＷｉＣｅｌｌから）を、ＥｔＯのためのレンチウイルス粒子（Ｌａｄｅｗｉｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．９（６）：５７５－８（２０１２））及びＸＴＰＮｇｎ２：２Ａ：Ａｓｃｌｌ（Ｎ２Ａ）で形質導入した１５％テトラサイクリン不含ウシ胎児血清及び０．１％ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭで培養し、Ｇ４１８（２００ｍｇ／ｍｌ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びピューロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で増殖させた。ｉＮ変換のために、以前に公開されたプロトコル（Ｍｅｒｔｅｎｓ、２０１５）を続けて行った。ＤＭＥＭ：Ｆ１２／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（１：１）ベースのニューロン変換（ＮＣ）培地を使用して、これらの細胞を３週間培養した。ＮＣは、次のサプリメントを含んだ：Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント（両方とも１３、ＧＩＢＣＯ）、ドキシサイクリン（２ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ラミニン１ｍｇ／ｍｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ジブチリルｃＡＭＰ（５００ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヒト組換えＮｏｇｇｉｎ（１５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）、ＬＤＮ－１９３１８９（０．５ｍＭ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及びＡ８３－１（０．５ｍＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３ｍＭ、ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、並びにＳＢ－４３１５４２（１０ｍＭ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。培地を３日ごとに交換した。更なる成熟のために、ｉＮをＮ２、Ｂ２７、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ（両方とも２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）、ジブチリルｃＡＭＰ（５００ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ドキシサイクリン（２ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びラミニン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌベースの神経成熟培地（ＮＭ）で培養した。９６ウェルプレート中の変換されたニューロンを更に精製することなく免疫染色に使用された。
【0041】
免疫蛍光染色及び顕微鏡検査：細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを使用して室温で２０分間固定した。試料を４％ロバ血清及び０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０で１時間ブロッキングした。一次抗体を４％ロバ血清及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０に希釈し、試料中に４℃で一晩適用した。試料をＰＢＳで洗浄し、フルオレセイン標識二次抗体とともに室温で１時間インキュベートし、ヘキストで２０分間対比染色した。試料をＮｉｋｏｎ Ａ１ｓ共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で画像化した。神経突起の長さ及び腫脹を測定するために、画像をＦｉｊｉソフトウェアで処理した。最初に、すべての細胞プロセスを選択するために画像に閾値を設定し、次に神経突起を骨格化し、パラメーターをプルーンサイクル（ｐｒｕｎｅ ｃｙｃｌｅ）法に設定して分岐を最も短くし、端点を取り除いてプルーン端とした。次に、標識付けされた骨格について分岐の全長を計算し（ピクセル／１０，０００での分岐の全長＝ｃｍでの分岐の長さ）、集合体の総数を分岐の長さで割った。
【0042】
以下の一次抗体を使用した：
【表1】
【0043】
ハイコンテントイメージング：細胞集団、蛍光強度、アポトーシス、並びにＨ３Ｋ９Ｍｅ３、ラミンＢ２、Ｌａｐ２β、及びＨＰ１γの強度を測定するため、細胞を９６ウェルイメージングプレート（１ウェルあたり１８０００個の細胞、細胞担体）でプレーティングし、異なる分子で処理した（図１１）。染色後、ハイコンテント細胞分析システムＯｐｅｒｅｔｔａ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して画像を分析した。４０倍の対物レンズを使用して６０視野のセットを各ウェルから収集し（１処理あたり合計３つのウェル）、１ウェルあたり１０，０００個を超える細胞をスコアリングした。この分析ワークフローでは、デフォルトプロトコルＢに基づいて核が最初に同定され、非常に明るい核（死細胞を示す）を除去するために０．７５未満の真円度及び１５００超の強度を有する核を排除することにより、各核について強度及び形態特性を計算した。シグナル強度を異なるチャネルにおける各タンパク質について別々に計算した。直接再プログラムされたニューロンにおけるＨ３Ｋ９Ｍｅ３、ラミンＢ２、Ｌａｐ２β強度の定量化のために、選択された各核を取り囲むβＩＩＩ－チューブリン染色に基づいて細胞質を同定し、βＩＩＩ－チューブリン陽性集団におけるマーカーの発現を定量化した。すべての生データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してエクスポート及び分析した。
【0044】
ＲＮＡ－ｓｅｑ手順：７日間分化させ、次いでＳＬＯで５日間処理した皮質ニューロンをＲＮＡ－ｓｅｑ分析のために収集した。７日間連続してＳＬＯで処理した高齢及び若年（新生児）の個人（すべて３継代）からの線維芽細胞をＲＮＡ抽出のために収集した。すべての実験を３回行い、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造元の説明書に従って使用して、ＲＮＡをすべての試料（３つの生物学的複製物及び３つの技術的複製物）から抽出した。ＲＮＡの品質をＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ＰｉｃｏＣｈｉｐを使用して評価し、すべての試料がＱＣに合格した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡｖ２キットを製造元の説明書に従って使用し、ｐｏｌｙ－Ａ選択を使用して、試料ライブラリを調製した。調製したライブラリを１０１ｂｐのシングルリードのためにシーケンングし、ウィスコンシン大学マディソンバイオテクノロジーセンターのＤＮＡシーケンング施設によって１試料あたり２５００万超のリードの深度までＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑで行った。ＦａｓｔＱＣをすべての試料で行い、すべての試料がすべての品質管理測定に合格した。
【0045】
ＲＮＡ－ｓｅｑ分析：ｅｄｇｅＲパッケージ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＭＤ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２６（１）：１３９－４０（２０１０））を使用して、差次的に発現された遺伝子をｇｌｍで同定した。０．０５未満のｐ値及び＋／－２より大きい又は小さい対数倍数変化を有する、最も差次的に発現された遺伝子の最大５０個のサブセットを選択した（２９）。次に、ユークリッド距離を使用して、試料及び遺伝子の両方をクラスター化した。遺伝子については、追加のエルボー関数を適用して、存在する遺伝子クラスターの数を推定した。計算された関係は、ヒートマップの上部（試料）及び左側（遺伝子）に描かれた樹形図によって表される。ＴＭＭによって正規化された遺伝子列にわたってコンピュータ計算され、スケーリングされたＺスコアにより、色のグラデーションが決定される。所与の発現値のＺスコアは、その遺伝子についてのすべての発現値の平均から離れた標準偏差の数である。
経験ベイズ階層モデリングアプローチＥＢＳｅｑを使用して、２つ以上の条件にわたって差次的に発現された遺伝子を同定した。シーケンシング深度の差異を説明するために、ＤＥＳｅｑの中央値正規化技法（Ａｎｄｅｒｓ Ｓ ａｎｄ Ｈｕｂｅｒ Ｗ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１１（１０）：Ｒ１０６（２０１０））を使用した。ＥＢＳｅｑは、各発現パターンにある遺伝子の事後確率（ＰＰ）を計算する。ＰＩ（ＥＥ）の事後確率が１－α未満の場合、遺伝子は、１００＊（１－α）％に制御された偽発見率で差次的に発現すると宣言された。このＤＥ遺伝子の列挙を考慮して、遺伝子は更に各パターンに分類され、ＰＰによって選別される。
経験ベイズ階層モデリングアプローチＥＢＳｅｑを使用して、２つ以上の条件にわたって差次的に発現された遺伝子を同定した。シーケンシング深度の差異を説明するために、ＤＥＳｅｑの中央値正規化技法（Ａｎｄｅｒｓ Ｓ ａｎｄ Ｈｕｂｅｒ Ｗ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１１（１０）：Ｒ１０６（２０１０））を使用した。ＥＢＳｅｑは、各発現パターンにある遺伝子の事後確率（ＰＰ）を計算する。ＰＩ（ＥＥ）の事後確率が１－α未満の場合、遺伝子は、１００＊（１－α）％に制御された偽発見率で差次的に発現すると宣言された。このＤＥ遺伝子の列挙を考慮して、遺伝子は更に各パターンに分類され、ＰＰによって選別される。
【0046】
経路分析：一般的な経路分析のためにいくつかの経路データベースを利用するＥＮＲＩＣＨＲ（ワールドワイドウェブ上のｅｎｒｉｃｈｒ．ｏｒｇで入手可能）を使用し、差次的に調節された経路について、各群からのＤＥＧを分析した。ＫＥＧＧデータベース及びＷｉｋｉｐａｔｈｗａｙデータベースを分析に使用した。１００超のＴＰＭ及び他の群の各々に対して２倍超の変化として、ＤＥＧを定義した。統計的に有意な経路は、潜在的に差次的に調節されているとして強調表示した。３つの分析のうち２つ以上で有意であることが見出された経路のみを更なる評価のために考慮した。
【0047】
ｑＲＴ－ＰＣＲ：ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造元の説明書に従って使用して、ＲＮＡ試料を得た。各試料からの５００ｎｇの精製ＲＮＡを入力として使用し、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を製造元の説明書に従って使用して、ｃＤＮＡライブラリを構築した。ｉＴａｑ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及び等量のｃＤＮＡ試料を使用して、ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ ｑＰＣＲ機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でｑＲＴ－ＰＣＲを行った。ΔΔＣｔ法を使用して、結果をＧＡＰＤＨ又は１８ｓ ｒＲＮＡレベルに正規化した。
【0048】
ＳＡ－βガラクトシダーゼアッセイ：試薬中で提供される１Ｘ固定緩衝液を使用して、線維芽細胞を固定し、製造元の説明書に従って手順を行った。Ｎｉｋｏｎ顕微鏡を使用して明視野像を得て、Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して陽性細胞数を計算した。ヒストグラム関数（染色の量）を使用し、β－Ｇａｌ染色後の外観に基づいて、陽性細胞を高度及び中程度にグループ化した。
【0049】
生細胞及び死細胞の染色：細胞毒性アッセイのために、細胞を９６ウェル光学プレート中で１ウェルあたり３０，０００個の細胞の密度でプレーティングし、各３ウェル（実験的複製）を異なる小分子で２４時間処理した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、１μＭ ＥｔｈＤ－１及び１ｍＭカルセインＡＭとともに室温で３０分間インキュベートし、Ｏｐｅｒｅｔｔａ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して画像化し、Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェアで分析した。
【0050】
ＴＡＤＢＰ遺伝子座における一塩基多型（ＳＮＰ）修飾：一塩基多型（ＳＮＰ）修飾を行うために、Ｙａｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５４：１３７０－７９（２０１３）で論じられる一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）方法を利用し、このアプローチは、Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｃａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １７（２）：２３３－４４（２０１５）で公開されているＣＲＩＳＰＲワークフローに適合するように以下のように変更された。ワールドワイドウェブ上のｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕで利用可能な設計ツールを使用して目的の部位のｓｇＲＮＡを同定した後、プラスミドで提供されるプロトコル（例えば、Ｓｈａｌｅｍ Ｏ，Ｓａｎｊａｎａ ＮＥ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３４３（６１６６）：８４－８７（２０１４）；Ｓａｎｊａｎａ ＮＥ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１（８）：７８３－４（２０１４））に従って、ｓｇＲＮＡ配列をＦｅｎｇ Ｚｈａｎｇの研究室からのｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－Ｖ１プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｖ２バージョン＃５２９６１）にクローニングした。細胞を培養し、Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｃａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２０１５に記載されているようにエレクトロポレートした。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を２５０Ｖ、５００μＦで０．４ｃｍキュベット（Ｐｈｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）において使用し、５００マイクロリットルのエレクトロポレーション緩衝液（ＫＣ１ ５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ １５ｍＭ、Ｎａ2ＨＰＯ4 １０２．９４ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4 ４７．０６ｍＭ、ＰＨ＝７．２）中で、プラスミドの適切な組み合わせでエレクトロポレートした。ＴＤＰ４３Ｇ２９８Ｓ変異遺伝子部位を標的化する１５マイクログラムのｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲＶ１－ＴＤＰ４３ ｓｇｌ４プラスミド及び１００マイクロリットルの１０マイクロモルｓｓＯＤＮのカクテル中で、細胞をエレクトロポレートした。このｓｓＯＤＮは、ｓｇＲＮＡ配列と非相補的であり、標的化されたインデル生成部位の上流７０ヌクレオチド及び下流７０ヌクレオチドを含む１４１ヌクレオチドを含んでいた（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。エレクトロポレーション後、細胞を１．０ｍＭ ＲＯＣＫ阻害剤中で、ＭＥＦフィーダー上でプレーティングした。エレクトロポレーションの２４時間後及び７２時間後に、細胞をピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ａｎｔ－ｐｒ－１）で処理して、ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲＶ１－ＴＤＰ４３ ｓｇｌ４プラスミドを含む細胞を選択した。９６時間でピューロマイシンを除去した後、コロニーが見えるまで、細胞をＭＥＦ馴化ｈＰＳＣ培地で培養した。
単一細胞をジェノタイピングするために、生成されたコロニーを手動で選択し、機械的に脱凝集させた。Ｑ５ポリメラーゼベースのＰＣＲ（ＮＥＢ）を使用してゲノムＤＮＡを増幅し、サンガーシーケンシングを使用して適切なコドンを決定した。非特異的なゲノム編集を同定するために、ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕアルゴリズムによって予測された５つの最も可能性の高いオフターゲット部位を使用して、ゲノム修飾について疑いのあるオフターゲット部位を分析した。
単一細胞をジェノタイピングするために、生成されたコロニーを手動で選択し、機械的に脱凝集させた。Ｑ５ポリメラーゼベースのＰＣＲ（ＮＥＢ）を使用してゲノムＤＮＡを増幅し、サンガーシーケンシングを使用して適切なコドンを決定した。非特異的なゲノム編集を同定するために、ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕアルゴリズムによって予測された５つの最も可能性の高いオフターゲット部位を使用して、ゲノム修飾について疑いのあるオフターゲット部位を分析した。
【0051】
電気生理学：培養した星状細胞を、９５％ Ｏ2／５％ ＣＯ2で飽和された人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）とともに継続的に灌流した。ＡＣＳＦの組成は、（ｍＭで）１２４ ＮａＣｌ、３．５ ＫＣｌ、１．５ ＣａＣｌ2、１．３ ＭｇＳＯ4、１．２４ ＫＨ2ＰＯ4、１８ ＮａＨＣＯ3、２０ ブドウ糖、ＰＨ７．４であった。電極は、（ｍＭで）１４０ Ｋ－グルコン酸塩、０．１ ＣａＣｌ2、２ ＭｇＣｌ2、１ ＥＧＴＡ、２ ＡＴＰ Ｋ２、０．１ ＧＴＰ Ｎａ３、及び１０ ＨＥＰＥＳ、ＰＨ７．２５（２９０ｍＯｓｍ）からなる溶液で満たされ、４～６ＭΩの抵抗を有していた。４０倍の微分干渉コントラスト光学を用いたＯｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ（東京、日本）ＢＸ５１ＷＩ顕微鏡を使用して、星状細胞を視覚化した。電圧及び電流固定の記録は、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して３０℃で得た。Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａアナログ－デジタル変換器（Ａｘｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、信号を４ｋＨｚでフィルター処理した。記録の前後でアクセス抵抗を監視し、いずれかの時点で２５ＭΩ超の抵抗を有する細胞を分析から除外した。
【0052】
本発明を現在最も実用的で好ましい実施形態であると考えられているものに関連して記載した。しかしながら、本発明は例示として提示されており、本開示の実施形態に限定されることを意図するものではない。従って、当業者は、本発明が、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の趣旨及び範囲内のすべての修正及び代替のアレンジメントを包含することを意図していることを理解するであろう。
【表2-1】
【表2-2】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【国際調査報告】