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特表2023-504424代謝は内皮から造血への移行中の決定的系統指定を誘導する
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-03
(54)【発明の名称】代謝は内皮から造血への移行中の決定的系統指定を誘導する
(51)【国際特許分類】
C12N 5/078 20100101AFI20230127BHJP
C12N 5/02 20060101ALI20230127BHJP
【ＦＩ】
C12N5/078
C12N5/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022531555
(86)(22)【出願日】2020-11-27
(85)【翻訳文提出日】2022-07-04
(86)【国際出願番号】 SE2020051139
(87)【国際公開番号】W WO2021107855
(87)【国際公開日】2021-06-03
(31)【優先権主張番号】1930385-8
(32)【優先日】2019-11-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(31)【優先権主張番号】2030046-3
(32)【優先日】2020-02-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522154940
【氏名又は名称】アムニオティクス・アーベー
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ニルス－ビャルネ・ウッズ
(72)【発明者】
【氏名】レアル・オブログル
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BB00
4B065BB04
4B065BB08
(57)【要約】
分化するｉＰＳ細胞、造血細胞の前駆体に直接再プログラムされた細胞、決定的造血細胞に直接再プログラムされた細胞、および骨髄、臍帯血、胎盤、または動員された末梢血からの成人または新生児造血細胞のうちの少なくとも１つを含むソース細胞から決定的造血細胞を生成する方法であって、代謝調節因子を使用してソース細胞のトリカルボン酸サイクルを活性化することを含む、方法。他の方法は、分化するｉＰＳ細胞、造血細胞の前駆体に直接再プログラムされた細胞、決定的造血細胞に直接再プログラムされた細胞、および骨髄、臍帯血、胎盤、または動員された末梢血からの成人または新生児造血細胞のうちの少なくとも１つを含むソース細胞から原始的造血細胞を生成することに関し、方法は、代謝調節因子を使用してソース細胞のトリカルボン酸サイクルを阻害することを含む。いくつかの態様は、決定的または原始的造血細胞の産生のためのソース細胞のトリカルボン酸サイクルの活性化のための代謝調節因子に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
決定的造血細胞を生成する方法であって、分化するｉＰＳ細胞、造血細胞の前駆体に直接再プログラムされた細胞、決定的造血細胞に直接再プログラムされた細胞、および骨髄、臍帯血、胎盤、または動員された末梢血に由来する成人または新生児造血細胞からなる群から選択される複数のソース細胞を提供することと、
前記ソース細胞を代謝調節因子で処理することと、を含み、前記代謝調節因子が、前記ソース細胞のトリカルボン酸サイクルを活性化するように構成された、方法。
【請求項2】
前記代謝調節因子が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）を阻害するように構成された、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記代謝調節因子が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）を活性化するように構成された、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
前記代謝調節因子が、ピルビン酸塩のミトコンドリアへの取り込みを増加させるように構成された、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記代謝調節因子が、ピルビン酸塩のアセチル補酵素Ａ（Ａｃ－ＣｏＡ）への変換を加速するように構成された、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記代謝調節因子が、ジクロロ酢酸塩（ＤＣＡ）である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ジクロロ酢酸塩の濃度が、少なくとも約３０μＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＤＣＡが、リンパ球／骨髄バイアスがかかった決定的造血を誘導するように構成された、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記代謝調節因子が、ＬＳＤ１阻害剤である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＬＳＤ１阻害剤が、ＧＳＫ２８７９５５２またはＲＯ７０５１７９０のうちの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ＬＳＤ１阻害剤が、赤血球系統の決定的造血細胞を生成するように構成された、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記代謝調節因子が、α－ケトグルタル酸塩の産生を増加させるように構成された、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記代謝調節因子が、グルタミンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記代謝調節因子による処理に応答して造血内皮（ＨＥ）ソース細胞からＣＤ４３＋細胞を生成することをさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ソース細胞をヌクレオシド三リン酸で処理することをさらに含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記代謝調節因子が、α－ケトグルタル酸塩のより強力またはより安定な同等物である、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記代謝調節因子が、ジメチルα－ケトグルタル酸（ＤＭＫ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
ジメチルα－ケトグルタル酸の濃度が、少なくとも約１７．５μＭである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記代謝調節因子が、ヌクレオシドと組み合わせて使用される、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
ヌクレオシドの濃度が、少なくとも約０．７ｍｇ／Ｌである、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ヌクレオシドが、シチジン、グアノシン、ウリジン、アデノシン、およびチミジンからなる群から選択されるヌクレオシドを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項22】
前記決定的造血細胞が、決定的造血幹細胞を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記決定的造血幹細胞が、リンパ球および／または骨髄再増殖の可能性を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記決定的造血細胞が、決定的リンパ球および／または骨髄細胞を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記決定的リンパ球細胞が、Ｔ細胞、腫瘍細胞を標的とする修飾Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記決定的造血細胞が、肥満細胞を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記決定的造血細胞が、成人ヘモグロビンの産生に適した赤血球細胞を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
造血細胞の前駆体に直接再プログラムされた細胞が、中胚葉前駆細胞、造血内皮細胞、および内皮から造血への移行を経験する細胞からなる群から選択される細胞を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
成人または新生児造血細胞が、造血幹細胞または造血前駆細胞を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
決定的造血細胞を生成する方法であって、分化するｉＰＳ細胞、造血細胞の前駆体に直接再プログラムされた細胞、決定的造血細胞に直接再プログラムされた細胞、および骨髄、臍帯血、胎盤、または動員された末梢血に由来する成人または新生児造血細胞からなる群から選択される複数のソース細胞を提供することと、
前記ソース細胞を代謝調節因子で処理することと、を含み、前記代謝調節因子が、前記ソース細胞のトリカルボン酸サイクルを阻害するように構成された、方法。
【請求項31】
前記代謝調節因子が、ピルビン酸塩のミトコンドリアへの取り込みを阻害するように構成された、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記代謝調節因子が、ピルビン酸塩のＡｃ－ＣｏＡへの変換を阻害するように構成された、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項33】
前記代謝調節因子が、ＭＰＣを阻害するように構成された、請求項３０～３２のいずれかに記載の方法。
【請求項34】
前記代謝調節因子が、ＵＫ５０９９である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
ＵＫ５０９９の濃度が、少なくとも約１００ｎＭである、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記代謝調節因子が、ＰＤＨを阻害するように構成された、請求項３０に記載の方法。
【請求項37】
前記代謝調節因子が、１－アミノエチルホスフィン酸（１－ＡＡ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
１－アミノエチルホスフィン酸の濃度が、少なくとも約４μＭである、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
決定的造血細胞の産生のためのソース細胞のトリカルボン酸サイクルの活性化のための代謝調節因子。
【請求項40】
原始的造血細胞の産生のためのソース細胞のトリカルボン酸サイクルの阻害のための代謝調節因子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
任意の優先出願への参照による組み込み
外国または国内の優先権主張が本出願とともに提出されたものとして出願データシートにおいて特定される任意のすべての出願は、米国特許法施行規則第１．５７条下で参照によって本明細書に組み込まれる。
外国または国内の優先権主張が本出願とともに提出されたものとして出願データシートにおいて特定される任意のすべての出願は、米国特許法施行規則第１．５７条下で参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
技術分野
ソース細胞から決定的造血細胞を生成する方法であって、決定的造血細胞が、分化するｉＰＳ細胞、造血細胞の前駆体に直接再プログラムされた細胞、決定的造血細胞に直接再プログラムされた細胞、および骨髄、臍帯血、胎盤、または動員された末梢血からの成人または新生児造血細胞のうちの少なくとも１つを含み、方法が、代謝調節因子を使用してソース細胞のトリカルボン酸サイクルを活性化することを含む、方法。
ソース細胞から決定的造血細胞を生成する方法であって、決定的造血細胞が、分化するｉＰＳ細胞、造血細胞の前駆体に直接再プログラムされた細胞、決定的造血細胞に直接再プログラムされた細胞、および骨髄、臍帯血、胎盤、または動員された末梢血からの成人または新生児造血細胞のうちの少なくとも１つを含み、方法が、代謝調節因子を使用してソース細胞のトリカルボン酸サイクルを活性化することを含む、方法。
【0003】
関連技術の説明
発生する胚において、原始的造血は、卵黄嚢（ＹＳ）の血島において赤血球、巨核球、およびマクロファージを生じさせる（Ｐａｌｉｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６，５０７３－５０８４（１９９９））。次に、造血の決定的な波は、より成熟した赤血球－骨髄（Ｐａｌｉｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６，５０７３－５０８４（１９９９））およびリンパ球（Ｙｏｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７，３３５－３４４（１９９７）、およびＢｏｉｅｒｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３，５３５－５４８（２０１３））前駆体を産生する。カーネギー発生段階（ＣＳ）１２－１３当たりで、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、第２の決定的造血波を通して大動脈－性腺－中腎（ＡＧＭ）領域において出現する（Ｍｅｄｖｉｎｓｋｙ，Ａ．＆Ｄｚｉｅｒｚａｋ，Ｅ．Ｃｅｌｌ ８６，８９７－９０６（１９９６）、およびＩｖａｎｏｖｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０８，２４１７－２４２７（２０１１））。原始的赤血球、赤血球－骨髄前駆体（ＥＭＰ）、およびＨＳＣは、造血内皮（ＨＥ）細胞（Ｌａｎｃｒｉｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４５７，８９２－８９５（２００９）、Ｆｒａｍｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ３４，４３１－４４４（２０１６）、およびＳｔｅｆａｎｓｋａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，１－１０（２０１７））から、内皮から造血への移行（ＥＨＴ）として知られるプロセス（Ｂｏｉｓｓｅｔ，Ｊ．－Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，１１６－１２０（２０１０）、およびＫｉｓｓａ，Ｋ．＆Ｈｅｒｂｏｍｅｌ，Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，１１２－１１５（２０１０））によって誘導される。胚発生中の造血の出現に関する研究は、いくつかの動物モデルにおいて空間的および時間的文脈でＥＨＴを説明するだけでなく（Ｂｏｉｓｓｅｔ，Ｊ．－Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，１１６－１２０（２０１０）、およびＫｉｓｓａ，Ｋ．＆Ｈｅｒｂｏｍｅｌ，Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，１１２－１１５（２０１０））、このプロセスを調節する成長および転写因子の深い理解にもつながった（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４５７，８８７－８９１（２００９）、Ｚｈｏｕ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４８７－４９２（２０１６）、およびＳｗｉｅｒｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４，２９２４（２０１３））。しかしながら、造血細胞の出現における代謝物および代謝経路の役割は、発生中に評価されていない。
発生する胚において、原始的造血は、卵黄嚢（ＹＳ）の血島において赤血球、巨核球、およびマクロファージを生じさせる（Ｐａｌｉｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６，５０７３－５０８４（１９９９））。次に、造血の決定的な波は、より成熟した赤血球－骨髄（Ｐａｌｉｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６，５０７３－５０８４（１９９９））およびリンパ球（Ｙｏｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７，３３５－３４４（１９９７）、およびＢｏｉｅｒｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３，５３５－５４８（２０１３））前駆体を産生する。カーネギー発生段階（ＣＳ）１２－１３当たりで、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、第２の決定的造血波を通して大動脈－性腺－中腎（ＡＧＭ）領域において出現する（Ｍｅｄｖｉｎｓｋｙ，Ａ．＆Ｄｚｉｅｒｚａｋ，Ｅ．Ｃｅｌｌ ８６，８９７－９０６（１９９６）、およびＩｖａｎｏｖｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０８，２４１７－２４２７（２０１１））。原始的赤血球、赤血球－骨髄前駆体（ＥＭＰ）、およびＨＳＣは、造血内皮（ＨＥ）細胞（Ｌａｎｃｒｉｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４５７，８９２－８９５（２００９）、Ｆｒａｍｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ３４，４３１－４４４（２０１６）、およびＳｔｅｆａｎｓｋａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，１－１０（２０１７））から、内皮から造血への移行（ＥＨＴ）として知られるプロセス（Ｂｏｉｓｓｅｔ，Ｊ．－Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，１１６－１２０（２０１０）、およびＫｉｓｓａ，Ｋ．＆Ｈｅｒｂｏｍｅｌ，Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，１１２－１１５（２０１０））によって誘導される。胚発生中の造血の出現に関する研究は、いくつかの動物モデルにおいて空間的および時間的文脈でＥＨＴを説明するだけでなく（Ｂｏｉｓｓｅｔ，Ｊ．－Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，１１６－１２０（２０１０）、およびＫｉｓｓａ，Ｋ．＆Ｈｅｒｂｏｍｅｌ，Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，１１２－１１５（２０１０））、このプロセスを調節する成長および転写因子の深い理解にもつながった（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４５７，８８７－８９１（２００９）、Ｚｈｏｕ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４８７－４９２（２０１６）、およびＳｗｉｅｒｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４，２９２４（２０１３））。しかしながら、造血細胞の出現における代謝物および代謝経路の役割は、発生中に評価されていない。
【0004】
増大する証拠は、代謝経路が細胞運命を制御することができるという事実を示す（Ｏｂｕｒｏｇｌｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５，１６９－１８４（２０１４）、Ｍｏｕｓｓａｉｅｆｆ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２１，３９２－４０２（２０１５）、およびＦｏｌｍｅｓ，Ｃ．Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １４，２６４－２７１（２０１１））。具体的には、骨髄ＨＳＣの運命は、いくつかの代謝経路によって調節される。骨髄の低酸素ニッチは、ＨＳＣが最小限のエネルギー提供経路である嫌気的解糖を活性化することを推進し、それらの静止状態を確保する（Ｔａｋｕｂｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２，４９－６１（２０１３））。ＨＳＣ自己再生および維持は、脂肪酸酸化に依存し（Ｉｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １８，１３５０－１３５８（２０１２））、分化するＨＳＣは、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）に切り替わり、それらのエネルギー要件を満たす（Ｙｕ，Ｗ．－Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２，６２－７４（２０１３）、およびＳｉｍｓｅｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ７，３８０－３９０（２０１０））。
【0005】
ＥＨＴプロセスは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を使用してインビトロで広くモデル化されており、この文脈で発生するＨＥ中間体は、原始的および決定的造血細胞の両方を生じさせることができる（Ｇａｒｃｉａ－Ａｌｅｇｒｉａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １１，１０６１－１０７４（２０１８））。多くの研究は、治療的使用のための機能的で移植可能なＨＳＣを産生するための取り組みにおいて、インビトロで唯一決定的な可能性を有するＨＥを得ることに焦点を当てている（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２，１７２２－１７３５（２０１２）、Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５４５，４３２－４３８（２０１７）、Ｎｇ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４，１１６８－１１７９（２０１６）、およびＳｔｕｒｇｅｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２，５５４－５６１（２０１４））。
【0006】
ＥＨＴは、密着結合溶解、幹細胞様特性の獲得を意味し、移行する細胞における広範な転写および表現型の変化につながるため（Ｚｈｏｕ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４８７－４９２（２０１６）、Ｓｗｉｅｒｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４，２９２４（２０１３）、およびＧｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９，１０－１９（２０１７））、代謝は、これらのプロセスを調節することに寄与し得る。以前に、動物モデルにおいて、ＨＳＣの出現は、アデノシンシグナル伝達およびＰＫＡ－ＣＲＥＢ経路によって調節されることが示され（Ｊｉｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１２，６４９－６６３（２０１５）、およびＫｉｍ，Ｐ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１２，６３３－６４８（２０１５））、これはＡＴＰレベルおよび利用可能性によって厳密に制御され、ＥＨＴ中のエネルギー需要の変化を示す。また、グルコース代謝は、ゼブラフィッシュにおいてＨＳＣ出現を誘導することが示されている（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １２１，２４８３－２４９３（２０１３））。
【0007】
当業者によって理解されるように、現在、１００を超える血液疾患、悪性腫瘍、および他の生命を脅かす適応症の日常的な治療において必要な移植または輸血手順のための適切に適合した造血細胞の利用可能性には限界がある。造血細胞および造血幹細胞の現在の供給源は、それらが典型的には献血運動（例えば、赤十字）ならびに骨髄、臍帯血、および動員された末梢血のための幹細胞ドナー登録の一部として健康な個人による寄付に依存するため、限定的である。これらの適切なドナー血液産物の不足は、必要な療法を行う能力を制限し、したがって、悪性腫瘍の治療のために造血幹細胞移植を必要とする患者の最大３０％は、適切に適合したドナーを有さず、必要性は時間および地理的地域にかけて変動するため、輸血可能な血液細胞の輸送の複雑なインフラストラクチャーおよび善意のドナーの献血運動が供給不足に対処する。よって、造血幹細胞および輸血可能な血液細胞産物の両方を取得するための、より堅牢で信頼性の高いシステムの大きな必要性がある。
【0008】
レシピエント患者への感染症の伝播などの、ドナー由来産物を使用することに関連するリスク、および移植片対宿主病などの組織拒絶合併症もあり、これらの両方は生命を脅かす可能性がある。したがって、感染症の伝播のリスクなしに、レシピエントに完全に一致し得る、実質的に無制限の自己再生能力を有する、これらの造血細胞の代替供給源の開発が必要である。
【発明の概要】
【0009】
我々は、代謝調節がＨＥ細胞に決定的造血運命を優先的に採用するよう促すと決定している。我々は、グルコース、グルタミン、ピルビン酸塩によって燃料供給される、ヒトＥＨＴ中に代謝が徐々に全体的に増加することを示す。これらの栄養素の使用を分析することによって、我々は、造血系統指定におけるそれらの役割を解明した。
【0010】
いくつかの態様は、ソース細胞から決定的造血細胞を生成する方法に関し、ソース細胞は、
分化するｉＰＳ細胞、
造血細胞の前駆体に直接再プログラムされた細胞、
決定的造血細胞に直接再プログラムされた細胞、および
骨髄、臍帯血、胎盤、または動員された末梢血からの成人または新生児造血細胞、のうちの少なくとも１つを含み、
方法は、ソース細胞のトリカルボン酸サイクルを活性化するために代謝調節因子を使用することを含む。
分化するｉＰＳ細胞、
造血細胞の前駆体に直接再プログラムされた細胞、
決定的造血細胞に直接再プログラムされた細胞、および
骨髄、臍帯血、胎盤、または動員された末梢血からの成人または新生児造血細胞、のうちの少なくとも１つを含み、
方法は、ソース細胞のトリカルボン酸サイクルを活性化するために代謝調節因子を使用することを含む。
【0011】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）を阻害する。
【0012】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）を活性化する。
【0013】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ピルビン酸塩のミトコンドリアへの取り込みを増加させる。
【0014】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ピルビン酸塩のアセチル補酵素Ａ（Ａｃ－ＣｏＡ）への変換を加速する。
【0015】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ジクロロ酢酸塩（ＤＣＡ）である。
【0016】
いくつかの例では、ソース細胞のための培養培地中のジクロロ酢酸塩の濃度は、少なくとも３０μＭである。
【0017】
いくつかの例では、ＤＣＡは、リンパ球／骨髄に偏った決定的造血を誘導する。
【0018】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ＬＳＤ１阻害剤である。
【0019】
いくつかの例では、ＬＳＤ１阻害剤は、ＧＳＫ２８７９５５２またはＲＯ７０５１７９０のうちの少なくとも１つを含む。
【0020】
いくつかの例では、ＬＳＤ１阻害剤は、赤血球系統の決定的造血細胞を生成する。
【0021】
いくつかの例では、代謝調節因子は、α－ケトグルタル酸塩の産生を増加させる。
【0022】
いくつかの例では、代謝調節因子は、グルタミンである。
【0023】
いくつかの例では、代謝調節因子は、造血内皮（ＨＥ）ソース細胞からのＣＤ４３＋細胞の生成をもたらす。
【0024】
いくつかの例では、方法は、ヌクレオシド三リン酸を使用することをさらに含む。
【0025】
いくつかの例では、代謝調節因子は、α－ケトグルタル酸塩のより強力またはより安定な同等物である。
【0026】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ジメチルα－ケトグルタル酸（ＤＭＫ）である。
【0027】
いくつかの例では、分化するｉＰＳ細胞のための培養培地中のジメチルα－ケトグルタル酸塩の濃度は、少なくとも１７．５μＭである。
【0028】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ヌクレオシドと組み合わせて使用される。
【0029】
いくつかの例では、ヌクレオシドの濃度は、少なくとも０．７ｍｇ／Ｌである。
【0030】
いくつかの例では、ヌクレオシドは、シチジン、グアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジンのうちの少なくとも１つを含む。
【0031】
いくつかの例では、決定的造血細胞は、決定的造血幹細胞を含む。
【0032】
いくつかの例では、決定的造血幹細胞は、リンパ球および／または骨髄再増殖の可能性を有する。
【0033】
いくつかの例では、決定的造血細胞は、決定的リンパ球および／または骨髄細胞を含む。
【0034】
いくつかの例では、決定的リンパ球細胞は、Ｔ細胞、腫瘍細胞を標的とする修飾Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞のうちの少なくとも１つを含む。
【0035】
いくつかの例では、決定的造血細胞は、肥満細胞を含む。
【0036】
いくつかの例では、決定的造血細胞は、成人ヘモグロビンの産生に適した赤血球細胞を含む。
【0037】
いくつかの例では、造血細胞の前駆体に直接再プログラムされた細胞は、中胚葉前駆細胞、造血内皮細胞、および内皮から造血への移行を経験する細胞のうちの少なくとも１つを含む。
【0038】
いくつかの例では、成人または新生児造血細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞を含む。
【0039】
いくつかの態様は、ソース細胞から原始的造血細胞を生成する方法に関し、ソース細胞は、以下のうちの少なくとも１つを含み：
分化するｉＰＳ細胞、
造血細胞の前駆体に直接再プログラムされた細胞、
決定的造血細胞に直接再プログラムされた細胞、および
骨髄、臍帯血、胎盤、または動員された末梢血からの成人または新生児造血細胞、
方法は、ソース細胞のトリカルボン酸サイクルを阻害するために代謝調節因子を使用することを含む。
分化するｉＰＳ細胞、
造血細胞の前駆体に直接再プログラムされた細胞、
決定的造血細胞に直接再プログラムされた細胞、および
骨髄、臍帯血、胎盤、または動員された末梢血からの成人または新生児造血細胞、
方法は、ソース細胞のトリカルボン酸サイクルを阻害するために代謝調節因子を使用することを含む。
【0040】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ピルビン酸塩のミトコンドリアへの取り込みを阻害する。
【0041】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ピルビン酸塩のＡｃ－ＣｏＡへの変換を阻害する。
【0042】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ＭＰＣを阻害する。
【0043】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ＵＫ５０９９である。
【0044】
いくつかの例では、ソース細胞のための培養培地中のＵＫ５０９９の濃度は、少なくとも１００ｎＭである。
【0045】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ＰＤＨを阻害する。
【0046】
いくつかの例では、代謝調節因子は、１－アミノエチルホスフィン酸（１－ＡＡ）である。
【0047】
いくつかの例では、ソース細胞のための培養培地中の１アミノエチルホスフィン酸の濃度は、少なくとも４μＭである。
【0048】
いくつかの態様は、決定的造血細胞の産生のためのソース細胞のトリカルボン酸サイクルの活性化のための代謝調節因子に関する。
【0049】
いくつかの態様は、原始的造血細胞の産生のためのソース細胞のトリカルボン酸サイクルの活性化のための代謝調節因子に関する。
【図面の簡単な説明】
【0050】
当業者は、以下の図が、以下に記載される情報を示すデータおよび図の例を表すことを理解するであろう。
【0051】
【図1a】ｉＰＳＣ由来細胞が初代ヒトＥＨＴ集団と一致するデータの一例である。ｉＰＳＣ由来ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞を選別し、１日間培養し、ｓｃＲＮＡｓｅｑによって分析し、ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞からのｓｃＲＮＡｓｅｑデータのＵＭＡＰ可視化が示され、表現型を選別することによって色分けされる。
【図1b】ｉＰＳＣ由来細胞が初代ヒトＥＨＴ集団と一致するデータの一例である。図は、ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様集団における内皮遺伝子および造血遺伝子の発現レベルを示すヒートマップを含む。
【図1c】ｉＰＳＣ由来細胞が初代ヒトＥＨＴ集団と一致するデータの一例である。カーネギー発生段階（ＣＳ）１３３３のＡＥＣ／Ｈｅｍクラスター細胞を示すＵＭＡＰは、図１ａにおいてＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様集団と一致させる。
【図1d】ｉＰＳＣ由来細胞が初代ヒトＥＨＴ集団と一致するデータの一例である。ヒートマップは、図１ｃに示されるように、ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様集団にマッピングされたＡＥＣ／Ｈｅｍクラスター細胞における内皮および造血遺伝子の発現レベルを示す。
【図2】解糖、酸素消費、およびミトコンドリア活性がＥＨＴ中に増加するデータの一例である。（ａ）細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）は、ＨＥ（ｎ＝２４）、ＥＨＴ（ｎ＝１３）、およびＨＳＣ様（ｎ＝８）細胞において測定され、解糖フラックスは、細胞外フラックス分析によって評価された。棒グラフは、示されたプロセスの相対レベル±ｓ．ｅ．ｍ．を示す（７つ（ＨＥ、ＥＨＴ）または３つ（ＨＳＣ様）の独立した実験、対応のないｔ検定から）。（ｂ）ｓｃＲＮＡｓｅｑによって検出され、発現パーセント（ドットのサイズ）および平均発現レベル（色の強度）に基づく解糖酵素の遺伝子発現レベルを示すドットプロットである。（ｃ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、２－ＤＧ（１ｍＭ）ありまたはなしで継代培養された。継代培養３日目の代表的なＦＳＣ－Ａ／ＣＤ４３プロットが示される（ｎ＝７、棒グラフについては拡張データ図３ｄを参照されたい）。（ｄ）継代培養３日目の代表的なＧＰＡ／ＣＤ４３プロットおよび継代培養６日目のＣＤ４５／ＣＤ４３プロットが示される（ｎ＝６およびｎ＝５、棒グラフについては拡張データ図３ｅを参照されたい）。（ｅ）継代培養３日目のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）蛍光は、フローサイトメトリーによって評価された（ｎ＝４の代表）。（ｆ）２－ＮＢＤＧ取り込みは、ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞について１０日目にフローサイトメトリーによって測定され、平均ＭＦＩレベル±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ｎ＝４、対応のあるｔ検定）。（ｇ）酸素消費速度（ＯＣＲ）は、ＨＥおよびＥＨＴ細胞（ｎ＝７）で測定され、酸化的リン酸化は、細胞外フラックス分析によって評価された。棒グラフは、示されたプロセスの相対レベル±ｓ．ｅ．ｍ．を示す（３つの独立した実験、対応のないｔ検定から）。（ｈ）ＴＭＲＥ蛍光は、１００μＭのＦＣＣＰ処理ありまたはなしで、ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞について１０日目にフローサイトメトリーによって測定され、ＨＥと比較したＭＦＩ－ＭＦＩ ＦＭＯレベル±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ｎ＝５、対応のあるｔ検定）。（ｉ）基礎ＯＣＲは、１０日目のＨＥ（ｎ＝６）、ＥＨＴ（ｎ＝５）、およびＨＳＣ様（ｎ＝４）細胞において測定され、棒グラフは、ＨＥと比較した平均レベル±ｓ．ｅ．ｍ．を示す（対応のあるｔ検定）。（ｊ）継代培養の３日目にＴＭＲＥ（赤）で染色されたＨＥおよびＨＳＣ様細胞の生細胞イメージングである。代表的な統合された明視野／ＴＭＲＥおよびＴＭＲＥ画像が示される。スケールバー、１００μｍ。棒グラフは、すべての実験にわたるすべての複製ウェルからのＴＭＲＥ染色強度の平均を示す（ＨＥ紡錘、ｎ＝９、ＨＥ円、ｎ＝９、ＨＳＣ様、ｎ＝６、複数の比較を伴うクラスカル－ウォリス検定）。（ｋ）ｓｃＲＮＡｓｅｑによって検出されたＴＣＡサイクル酵素の遺伝子発現レベルを示し、発現パーセント（ドットのサイズ）および平均発現レベル（色の強度）に基づくドットプロットである。ｎｓ、有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図3】ＨＥの造血指定がグルタミン異化に依存するデータの一例である。ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、示された化合物を含むグルタミンを含まない培地において継代培養された。（ａ）ＦＳＣ－Ａ／ＣＤ４３およびＣＤ３４／ＣＤ４３の継代培養３日目の代表的なプロットが示される（ｎ＝３、棒グラフについては図１１、ｇを参照されたい）。（ｂ）継代培養３日目のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）蛍光は、フローサイトメトリーによって評価された（ｎ＝４、棒グラフについては図１１、ｈを参照されたい）。（ｃ）ＨＥ細胞に由来するＧＰＡ＋（オレンジ色）およびＣＤ４５＋（青色）集団についての代表的な３日目のＣＴＶプロットが示される（ｎ＝６、グラフについては図１１、ｉを参照されたい）。（ｄ）継代培養の６日目でのＣＤ４３＋集団±ｓ．ｅ．ｍ．中のＧＰＡまたはＣＤ４５を発現する細胞のパーセンテージが示される（対照、ｎ＝７、ＤＭＫ、ｎ＝６、ＤＭＫ＋ｎｕｃｌ、ｎ＝５、ＤＭＫ＋ｎｕｃｌ＋ＮＥＡＡ、ｎ＝３、対照との対応のあるｔ検定、プロットについては拡張データ図５ｊを参照されたい）。（ｅ）ＯＰ９－ＤＬ１ストロマとの３日継代培養されたＨＥ細胞の３５日の共培養後に得られたＣＤ４５＋ＣＤ５６＋±ｓ．ｅ．ｍ．細胞のパーセンテージである。３日の継代培養中、ＨＥ細胞は、示された化合物で処理された。（対照およびＤＭＫ、ｎ＝５、－ＧＬＮ、ｎ＝４、－ＧＬＮ＋ｎｕｃｌおよびＤＭＫ＋ｎｕｃｌ、ｎ＝３、プロットについては拡張データ図５ｋを参照されたい）。ｎｓ、有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図4】ＨＥ細胞におけるミトコンドリアへのピルビン酸塩フラックスを増加させることが決定的造血運命に有利に働くデータの一例である。（ａ）ピルビン酸塩は、ミトコンドリアピルビン酸担体（ＭＰＣ、阻害剤：ＵＫ５０９９）を介してミトコンドリアに輸送され、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ、阻害剤：１－ＡＡ）によってアセチル－ｃｏＡに変換される。ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ、阻害剤：ＤＣＡ）は、ＰＤＨ活性を負に調節する。（ｂ－ｅ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、ＵＫ５０９９（１０μＭ）またはＤＣＡ（３ｍＭ）ありまたはなしで継代培養された。継代培養３日目の代表的なＧＰＡ／ＣＤ４３プロット（ｂ、ｄ）および継代培養６日目の代表的なＣＤ４５／ＣＤ４３プロット（ｃ、ｅ）が示される（対応する棒グラフについては図１２、ａ、ｆ、ｋ、およびｍを参照されたい）。（ｆ）示された化合物で６日間継代培養されたＨＥ細胞から得られた対照条件に対するＣＦＵ－Ｅ～ＣＦＵ－Ｇ、Ｍ、ＧＭコロニーの比であり、パーセンテージについては拡張データ図６ｒを参照されたい（ｎ＝５、対応のあるｔ検定）。（ｇ）未処理細胞と比較したＵＫ５０９９（１０μＭ）またはＤＣＡ（３ｍＭ）で処理されたＨＥ細胞から得られたＣＦＵにおけるＫＬＦ１に正規化されたＨＢＥ１またはＨＢＧ１－２転写物の発現における倍率変化である。（ｈ）ＯＰ９－ＤＬ１ストロマとの３日継代培養されたＨＥ細胞の３５日の共培養後に得られたＣＤ４５＋ＣＤ５６＋±ｓ．ｅ．ｍ．細胞のパーセンテージである。３日の継代培養中、ＨＥ細胞は、示された化合物で処理された。（ｎ＝３、一元配置分散分析検定、プロットについては図１２、ｕを参照されたい）。（ｉ－ｋ）妊娠マウスにＥ９．５でＵＫ５０９９またはＤＣＡを注射し、胎児肝臓をフローサイトメトリーによってＥ１４．５で分析した。ＦＬ、胎児肝臓。胎児肝臓におけるパーセンテージとしてのＬＴ－ＨＳＣ（ｉ）、Ｔ、およびＢ細胞（ｊ）のレベルは、対照（ｎ＝１０）、ＵＫ５０９９処理（ｎ＝１４）、およびＤＣＡ処理（ｎ＝１６）条件について示される（一元配置分散分析検定）。（ｋ）選別されたＬＴ－ＨＳＣから得られたＣＦＵ－ＧＭコロニーに対するＢＦＵ－Ｅの比が示される（図１３、ｅにおけるデータも参照されたい）（一元配置分散分析）。ＣＦＵ、コロニー形成単位、ＢＦＵ、バースト形成単位、Ｅ、赤血球、Ｍ、マクロファージ、Ｇ、顆粒球。（ｌ－ｐ）ＯＰ９－ＤＬ１ストロマと共培養されたＨＥ細胞は、ＤＣＡで３日間処理され、照射されたＮＳＧマウスに移植された。骨髄（ＢＭ）および胸腺は、１２週目に採取された。（ｌ）胸腺からのｈｕＣＤ４５＋細胞におけるヒトＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性胸腺細胞のパーセンテージ±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（対照、ｎ＝６、ＤＣＡ、ｎ＝７、対応のないｔ検定）。ＢＭからのｈｕＣＤ４５＋細胞におけるヒトＢ細胞（ｍ）、ＣＬＰ（ｎ）、およびＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞（ｐ）のパーセンテージ±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（対照、ｎ＝６、ＤＣＡ、ｎ＝７、対応のないｔ検定）。（ｏ）８週目のＰＢからのｈｕＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞のパーセンテージ±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（対照、ｎ＝６、ＤＣＡ、ｎ＝６、対応のないｔ検定）。ｎｓ、有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図5】ピルビン酸塩異化の調節が単一細胞レベルでのＨＥコミットメントに影響を与えるデータの一例である。（ａ）対照、ＵＫ５０９９処理、およびＤＣＡ処理ＨＥ細胞は、ＵＭＡＰによって一緒に可視化され、７つのクラスターに分割された。（ｂ）７つのクラスターにおける発現された内皮または造血遺伝子のｓｃＲＮＡｓｅｑデータを示すヒートマップである。（ｃ）クラスター６（５５９細胞）および７（２８０細胞）は、個別に評価され、ドットプロットは、ｓｃＲＮＡｓｅｑによって検出され、発現パーセント（ドットのサイズ）および平均発現レベル（色強度）に基づく、示された遺伝子の発現レベルを示す。（ｄ）ドットプロットは、ｓｃＲＮＡｓｅｑによって検出され、発現パーセント（ドットのサイズ）および平均発現レベル（色強度）に基づく、ＨＥ ｃｔｒｌ、ＨＥ＋ＵＫ５０９９、およびＨＥ＋ＤＣＡ条件のクラスター６および７における示された造血転写因子の発現レベルを示す。
【図6】ピルビン酸塩異化が異なるメカニズムを介してＥＨＴに影響を与えるデータの一例である。（ａ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、示された化合物で継代培養され、対照と比較した３日目のＣＤ４３＋ＧＰＡ＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ｎ＝４、一元配置分散分析検定）。（ｂ）ＨＥ細胞は、選別の翌日にＵＫ５０９９（１０μＭ）ありまたはなしでｓｈＳｃｒａｍｂｌｅｄ（ｓｈＳｃｒ）またはｓｈＬＳＤ１で形質導入され、ｓｈＳｃｒと比較した３日目のＣＤ４３＋／ＧＰＡ＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ｎ＝３、一元配置分散分析検定）。（ｃ）アセチル－ｃｏＡは、ＡＣＣを介した脂質生合成（阻害剤：ＣＰ－６４０１８６またはＣＰ）のための、またはＨＭＧＣＲを介したメバロン酸経路／コレステロール生合成（阻害剤：アトルバスタチンまたはＡｔｏ）のための前駆体であり得る。（ｄ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、ＣＰ（５μＭ）、ＤＣＡ（３ｍＭ）、または両方で継代培養され、対照と比較した６日目のＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ｎ＝４、一元配置分散分析検定）。（ｅ）ＨＥ細胞中のコレステロール含有量は、フィリピンＩＩＩ染色による処理の２日目に測定された（ｎ＝３、対応のあるｔ検定）。（ｆ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、Ａｔｏ（０．５μＭ）、ＤＣＡ（３ｍＭ）、または両方で継代培養され、対照と比較した３日目のＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（対照／ＤＣＡについてｎ＝３、Ａｔｏ／Ａｔｏ＋ＤＣＡについて２つの技術的複製でｎ＝２、一元配置分散分析検定）。（ｇ）解糖は、ＨＥ細胞の造血分化に不可欠であり、（ＵＫ５０９９またはｓｈＭＰＣ１／２を介して）ピルビン酸塩がミトコンドリアに入ることを阻害することは、原始的赤血球運命に有利に働く。ＤＣＡを介したミトコンドリアへのピルビン酸塩フラックスを増加させることは、アセチル－ｃｏＡ産生を増幅させ、これはコレステロール生合成に燃料供給し、ＨＥ細胞の決定的造血分化を促進する。
【図7】目的のＥＨＴ集団の生成および特性を含むデータの一例である。（ａ）造血分化システムの概略図である。胚様体構成後、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＶＥＧＦ、および造血サイトカインが順次添加され、ＨＥ細胞形成およびＥＨＴが誘導された。プロトコルの８日目に目的の細胞が選別された。（ｂ）純粋なＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞集団を得るための選別戦略である。分化の８日目に、代表的なプロットは、磁気ビーズ濃縮、ＣＤ４３発現に基づく分離、ならびにＨＥおよびＥＨＴ細胞のＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－およびＣＤ９０＋ＶＥｃａｄ＋、ならびにＨＳＣ様細胞のＣＤ９０＋ＣＤ３８－に対するさらなるゲーティング後のＣＤ３４＋細胞のレベルを示す。（ｃ－ｄ）Ｇ０（ｃ）またはＳ／Ｇ２Ｍ（ｄ）経路を取るＥＨＴ集団の擬時間分析、および集団の存在量を示す対応する棒グラフである。（ｅ）臍帯血ＣＤ３４＋細胞（ＣＢ ＨＳＣ）のＥＨＴデータセットへのｓｃＣｏＧＡＰＳマッピング、およびパターン重量を示すバイオリン図である。（ｆ－ｇ）ＥＨＴデータセットのヒトＣＳ １３背側大動脈データセットへのｓｃＣｏＧＡＰＳマッピング（ｆ）およびその逆（ｇ）であり、プロットは集団の共局在化を示す。
【図8】ＨＥおよびＥＨＴ細胞の造血能の検証でのデータの一例である。（ａ－ｃ）選別されたＨＥおよびＥＨＴ細胞は、６日間継代培養された（ｎ＝５の代表）。ＣＤ４３およびＣＤ３４マーカーのレベル（ａ）ならびにＣＤ４３、ＧＰＡ、およびＣＤ４５マーカーのレベル（ｃ）は、継代培養３日目および６日目に評価された。（ｂ）ウェルの代表的な写真は、ＨＥおよびＥＨＴ継代培養中に毎日撮影された。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）ｓｃＲＮＡｓｅｑによって評価されるＨＳＣ様細胞におけるグロビン遺伝子の発現である。
【図9】解糖が造血指定において役割を果たすデータの一例である。（ａ）代表的なアッセイデータは、基礎条件下および示された化合物の添加後、ＨＥおよびＥＨＴ細胞において測定される細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を示す。棒グラフは、図２ａに示される。（ｂ）ヒトＣＳ １３ ＡＧＭ領域（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．からのデータ）において、それらのｓｃＲＮＡｓｅｑデータの我々のデータセット（図１ｃに示される）上へのマッピングによって検出され、発現パーセント（ドットのサイズ）および平均発現レベル（色強度）に基づく解糖酵素の遺伝子発現レベルを示すドットプロットである。（ｃ）グルコースは、解糖を通して分解され、得られるピルビン酸塩は、乳酸塩を生じさせるか、ＴＣＡサイクルへの統合のためにアセチル－ｃｏＡに変換される。２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）は、解糖フラックスを遮断する。（ｄ）対照と比較した継代培養３日目のＣＤ４３＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ｎ＝７、対応のあるｔ検定）。（ｅ）対照と比較した継代培養３日目のＣＤ４３＋ＧＰＡ＋および継代培養６日目のＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（それぞれ、ｎ＝６およびｎ＝５、対応のあるｔ検定）。（ｆ）継代培養３日目のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）蛍光は、フローサイトメトリーによって評価され、中央ＭＦＩ値が示される（ｎ＝４、対応のあるｔ検定）。
【図10a】グルコースの不在下でもＥＨＴ中にＯＸＰＨＯＳが増加するデータの一例である。代表的なアッセイデータは、基礎条件下および示された化合物の添加後、ＨＥおよびＥＨＴ細胞において測定される酸素消費速度（ＯＣＲ）を示す。棒グラフは、図２、ｇに示される。
【図10b】グルコースの不在下でもＥＨＴ中にＯＸＰＨＯＳが増加するデータの一例である。ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様集団において発現されるＯＸＰＨＯＳ関連遺伝子のｓｃＲＮＡｓｅｑデータを示すヒートマップである。
【図10c】グルコースの不在下でもＥＨＴ中にＯＸＰＨＯＳが増加するデータの一例である。ヒトＣＳ １３ ＡＧＭ領域において発現されるＯＸＰＨＯＳ関連遺伝子のｓｃＲＮＡｓｅｑデータ（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．からのデータ）を、それらのｓｃＲＮＡｓｅｑデータの我々のデータセット（図１ｃに示される）上へのマッピングによって示すヒートマップである。この初代細胞データセットでは、より多くのＯＸＰＨＯＳ関連遺伝子が検出可能であることに留意されたい。
【図10d】グルコースの不在下でもＥＨＴ中にＯＸＰＨＯＳが増加するデータの一例である。ヒトＣＳ １３ ＡＧＭ領域において発現されるＴＣＡサイクル酵素のｓｃＲＮＡｓｅｑデータ（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．からのデータ）を、それらのｓｃＲＮＡｓｅｑデータの我々のデータセット（図１ｃに示される）上へのマッピングによって示すドットプロットである。
【図10e】グルコースの不在下でもＥＨＴ中にＯＸＰＨＯＳが増加するデータの一例である。ＯＣＲは、グルコースの不在下および指定された化合物の添加後、ＨＥおよびＥＨＴ細胞（ｎ＝１１）において測定された。対応する棒グラフは、グルコースの不在下およびグルコース注射後のＯＣＲの平均レベル±ｓ．ｅ．ｍ．を示す（ｎ＝１１、３つの独立した実験、対応のないｔ検定から）。
【図11】グルタミンが初期赤血球および成熟造血系統を誘導するための異なるプロセスに寄与するデータの一例である。（ａ）ＴＣＡサイクルへのグルタミンの寄与を示す概略図である。グルタミンは、グルタミン酸塩（Ｇｌｕ）に脱アミド化され、これは次いでＴＣＡサイクルの中間体であるα－ケトグルタル酸塩（α－ＫＧ）に変換される。グルタミンからグルタミン酸塩への変換は、ＢＰＴＥＳによって特異的に阻害される、グルタミナーゼ（ＧＬＳ）酵素によって媒介される。（ｂ）ｓｃＲＮＡｓｅｑによって検出され、発現パーセント（ドットのサイズ）および平均発現レベル（色強度）に基づくグルタミン輸送体の遺伝子発現レベルを示すドットプロットである。（ｃおよびｄ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、ＢＰＴＥＳ（２５μＭ）ありまたはなしで継代培養された。継代培養３日目の代表的なプロットおよび棒グラフ（ｃ）は、ＣＤ４３＋ＧＰＡ＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。（ｎ＝６、対応のあるｔ検定）。継代培養６日目の代表的なプロットおよび棒グラフ（ｄ）は、ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。（ｎ＝４、対応のあるｔ検定）。（ｅおよびｆ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、示された化合物を含むグルタミンを含まない培地において継代培養された。ＦＳＣ－Ａ／ＣＤ４３（ｅ）の継代培養３日目の代表的なプロットが示される。継代培養の６日目にＣＤ４３±ｓ．ｅ．ｍ．を発現する細胞のパーセンテージの棒グラフが描かれる（ｆ）（ｎ＝３、対応のあるｔ検定）。（ｇ）図３、ａにおけるＣＤ３４－ＣＤ４３＋細胞±ｓ．ｅ．ｍ．のパーセンテージの棒グラフが示される（ｎ＝３、対応のあるｔ検定）。（ｈ）対照と比較したＣＴＶ中央ＭＦＩ±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ｎ＝５、対応のあるｔ検定、図３、ｂにおける対応するプロットを参照されたい）。（ｉ）図３、ｃに対応するＣＴＶ中央ＭＦＩ±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ｎ＝６、対応のあるｔ検定）。（ｊ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、示された化合物を含むグルタミンを含まない培地において継代培養された。ＦＳＣ－Ａ／ＧＰＡおよびＦＳＣ－Ａ／ＣＤ４５について継代培養３日目または６日目の代表的なプロットが示される（グラフについては図３、ｄを参照されたい）。（ｅ）ＯＰ９－ＤＬ１ストロマとの３日継代培養されたＨＥ細胞の３５日の共培養後に得られたＣＤ４５＋ＣＤ５６＋細胞のパーセンテージを示すプロットである。３日の継代培養中、ＨＥ細胞は、示された化合物で処理された。ｎｓ、有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図12】ピルビン酸塩異化が造血系統指定を誘導するデータの一例である。（ａ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ、ＥＨＴ、またはＨＳＣ様細胞は、ＵＫ５０９９（１０μＭ）ありまたはなしで継代培養された。すべての集団について対照と比較した継代培養３日目のＣＤ４３＋／ＧＰＡ＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ＨＥ、ｎ＝５、ＥＨＴ、ｎ＝６、ＨＳＣ様、ｎ＝４、対応のあるｔ検定）。（ｂ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、１－ＡＡ（４ｍＭ）ありまたはなしで継代培養された。対照と比較した継代培養３日目のＣＤ４３＋ＧＰＡ＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ｎ＝４、対応のあるｔ検定）。（ｃ）ｓｈＳｃｒａｍｂｌｅｄ（ｓｈＳｃｒ）と比較したｓｈＲＮＡ形質導入細胞におけるＨＰＲＴと比較したＭＰＣ１およびＭＰＣ２の発現の倍率変化が示される（ｎ＝３、対応のないｔ検定）。Ｕｎｔｒ、非形質導入。（ｄ）ＨＥ細胞は、選別の翌日にｓｈＳｃｒａｍｂｌｅｄ（ｓｈＳｃｒ）、ｓｈＭＰＣ１、ｓｈＭＰＣ２、または両方で形質導入され、ｓｈＳｃｒと比較した３日目のＣＤ４３＋／ＧＰＡ＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ｎ＝４、一元配置分散分析検定）。Ｕｎｔｒ、非形質導入。（ｅ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、ＣＴＶで染色され、蛍光は、ＵＫ５０９９（１０μＭ）ありまたはなしで継代培養の３日目にＧＰＡ＋細胞についてフローサイトメトリーによって評価された。ｎ＝３の代表。（ｆ－ｇ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ、ＥＨＴ、またはＨＳＣ様細胞は、ＵＫ５０９９（１０μＭ）ありまたはなしで継代培養された。すべての集団について対照と比較した継代培養６日目のＣＤ４３＋（ｆ）およびＣＤ４３＋ＣＤ４５＋（ｇ）細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ＨＥ、ｎ＝７、ＥＨＴ、ｎ＝７、ＨＳＣ様、ｎ＝４、対応のあるｔ検定）。（ｈ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、１－ＡＡ（４ｍＭ）ありまたはなしで継代培養された。対照と比較した継代培養６日目のＣＤ４３＋およびＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ｎ＝３、対応のあるｔ検定）。（ｉ－ｊ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、ＵＫ５０９９（１０μＭ）ありまたはなしで３日間継代培養された。ＨＥ由来のＣＤ４５＋細胞のＣＴＶ（ｉ）および対照と比較したＨＥ由来ＨＳＣ様細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝７、対応のあるｔ検定）（ｊ）が示される。（ｋ－ｐ）ＦＡＣＳ選別ＨＥおよびＥＨＴ細胞は、ＤＣＡ（３ｍＭ）ありまたはなしで継代培養された。対照と比較した継代培養３日目（ｋ、ｎ＝３）および６日目（ｌ、ＨＥ、ｎ＝５、ＥＨＴ、ｎ＝４）ＣＤ４３＋ＧＰＡ＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（対応のあるｔ検定）。（ｍ）継代培養３日目のＨＥ由来ＧＰＡ＋細胞のＣＴＶが示される。ｎ＝３の代表。（ｎ）両方の集団について対照と比較した継代培養６日目のＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（ＨＥ、ｎ＝５、ＥＨＴ、ｎ＝４、対応のあるｔ検定）。（ｏ）ＨＥ由来のＣＤ４５＋細胞のＣＴＶが示される。ｎ＝３の代表。（ｐ）対照と比較したＨＥ由来のＨＳＣ様細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４、対応のあるｔ検定）が示される。（ｑ）ＨＥ細胞へのＥｄＵの組み込みは、ＵＫ５０９９（１０μＭ）またはＤＣＡ（３ｍＭ）ありまたはなしでの継代培養の１日目および２日目に２４時間パルス後のフローサイトメトリーによって評価された（ｎ＝３）。（ｒ－ｓ）示された化合物で３日間（ｒ）（ｎ＝３、二元配置分散分析検定）または６日間（ｓ）（ｎ＝５、二元配置分散分析検定）継代培養されたＨＥ細胞から得られたＣＦＵアッセイコロニータイプのパーセンテージである。ＣＦＵ、コロニー形成単位、Ｅ、赤血球、Ｍ、マクロファージ、Ｇ、顆粒球、ＧＥＭＭ、混合。（ｔ）示された化合物で３日間継代培養されたＨＥ細胞から得られたＥｒｙＤおよびＥｒｙＰ ＣＦＵ－Ｅである。スケールバー、１００μｍ。（ｕ）未処理細胞と比較したＵＫ５０９９（１０μＭ）またはＤＣＡ（３ｍＭ）で処理されたＨＥ細胞から得られたＣＦＵにおけるＫＬＦ１に正規化されたＨＢＡ１－２転写物の発現における倍率変化である。（ｖ）ＯＰ９－ＤＬ１ストロマとの３日継代培養されたＨＥ細胞の３５日の共培養後に得られたＣＤ４５＋ＣＤ５６＋細胞のパーセンテージを示すプロットである。３日の継代培養中、ＨＥ細胞は、示された化合物で処理された。ｎｓ、有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図13】ピルビン酸塩代謝の調節がインビボでの系統指定に影響を与えるデータの一例である。（ａ－ｃ）妊娠マウスにＥ９．５でＵＫ５０９９またはＤＣＡを注射し、胎児肝臓をフローサイトメトリーによってＥ１４．５で分析した。ＦＬ、胎児肝臓。胎児肝臓におけるパーセンテージとしてのＨＰＣ－１、ＨＰＣ－２（ａ）、および赤血球前駆体（ｂ）のレベルは、対照（ｎ＝１０）、ＵＫ５０９９処理（ｎ＝１４）、およびＤＣＡ処理（ｎ＝１６）条件について示される（一元配置分散分析検定）。（ｃ）ＣＤ７１／Ｔｅｒ１１９染色による赤血球分化段階が対照プロット上に示される。各段階における細胞のパーセンテージを示す代表的なプロットは、対照、ＵＫ５０９９処理、またはＤＣＡ処理条件について示される。（ｄ）Ｅ１４．５胚においてＬＴ－ＨＳＣを選別するためのゲーティング戦略が示される。（ｅ）選別されたＬＴ－ＨＳＣから得られるコロニーのパーセンテージは、対照（ｎ＝４）、ＵＫ５０９９処理（ｎ＝８）、およびＤＣＡ処理（ｎ＝１０）条件について示される（一元配置分散分析検定）。（ｆ－ｉ）照射されたＮＳＧマウスに、ＯＰ９－ＤＬ１ストロマとの３日間の共培養に保持されるＤＣＡ処理ＨＥ細胞が移植され、末梢血（ＰＢ）中のヒト細胞は、４、８、および１２週目に評価された。（ｆ）ｈｕＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとしての末梢血（ＰＢ）における生着レベルが示される（対照、ｎ＝６、ＤＣＡ、ｎ＝７）。（ｇ）胸腺は、移植後１２週目に採取され、ＣＤ４／ＣＤ８発現細胞を示す代表的なプロットは、対照およびＤＣＡ処理条件について示される。（ｈ）８週目のＰＢからのｈｕＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）の代表的なプロットおよびパーセンテージ±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（対照、ｎ＝６、ＤＣＡ、ｎ＝６、対応のないｔ検定）。（ｉ）ＢＭからのｈｕＣＤ４５＋細胞におけるヒトＨＳＣのパーセンテージ±ｓ．ｅ．ｍ．が示される（対照、ｎ＝６、ＤＣＡ、ｎ＝７、対応のないｔ検定）。ｎｓ、有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図14】分化するＨＥ細胞における内皮および造血遺伝子の発現を示すデータの一例である。継代培養の２日目に、対照、ＵＫ５０９９処理、およびＤＣＡ処理ＨＥ細胞に対して単一細胞ＲＮＡｓｅｑを実施した。図５、ａにおけるＵＭＡＰ上での内皮（ａ）または造血（ｂ）遺伝子の発現を示す特徴プロットである。（ｃ）各条件においてクラスター６および７に属する細胞のパーセンテージを示す１０×１０ドットプロットである。（ｄ）ＯＰ９－ＤＬ１ストロマ上で共培養され、示された化合物で１４日間処理された単一ＨＥ細胞から得られたＧＰＡ＋クローンの数である（ｎ＝６の独立した実験、各条件について合計５５２ウェルがスクリーニングされた）。
【図15】ＥＨＴ中のピルビン酸塩異化の機構的分析を示すデータの一例である。（ａ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、ＴＳＡ（６０ｎＭ）ありまたはなしで継代培養された。継代培養３日目のＣＤ４３ ＭＦＩレベルおよび代表的なＣＤ４３ヒストグラムが示される（ｎ＝４、対応のあるｔ検定）。（ｂ）ｓｃＲＮＡｓｅｑによって検出され、発現パーセント（ドットのサイズ）および平均発現レベル（色の強度）に基づくＬＳＤ１、ＧＦＩ１、およびＧＦＩ１Ｂの遺伝子発現レベルを示すドットプロットである。（ｃ）ｓｈＳｃｒａｍｂｌｅｄ（ｓｈＳｃｒ）と比較したｓｈＲＮＡ形質導入細胞におけるＨＰＲＴと比較したＬＳＤ１の発現の倍率変化が示される（ｎ＝３、対応のないｔ検定）。Ｕｎｔｒ、非形質導入。（ｄ－ｅ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、ＴＣＰ（３００ｎＭ）、ＤＣＡ（３ｍＭ）、または両方で継代培養された。６日目ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．（ｄ）および６日目ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．（ｅ）対照との比較が示される（ｎ＝５、一元配置分散分析検定）。（ｆ）酢酸塩は、ＡＣＳＳ２（阻害剤：ＡＣＳＳ２ｉ）によってアセチル－ｃｏＡに直接変換することができる。アセチル－ｃｏＡは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ、阻害剤：Ｃ６４６）を介してヒストン上に移される、アセチル化マークの前駆体である。（ｇ－ｈ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、ＡＣＳＳ２ｉ（５μＭ）、ＤＣＡ（３ｍＭ）、もしくは両方（ｎ＝５、一元配置分散分析検定）で（ｇ）またはＣ６４６（１０μＭ）、ＤＣＡ（３ｍＭ）、もしくは両方（ｎ＝３、一元配置分散分析検定）で継代培養され、（ｈ）６日目のＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞頻度±ｓ．ｅ．ｍ．が示される。（ｉ）ＦＡＣＳ選別ＨＥ細胞は、ＤＣＡ（３ｍＭ）ありまたはなしで２日間カバーガラス上で継代培養された。Ｈ３Ｋ９アセチル化およびＨ４Ｋ５、８、１２、１６アセチル化の染色強度は、共焦点顕微鏡イメージングによって評価され、対照と比較した倍率変化が示される（ｎ＝３）。（ｊ）ｓｃＲＮＡｓｅｑによって検出され、発現パーセント（ドットのサイズ）および平均発現レベル（色強度）に基づくコレステロール流出経路遺伝子の遺伝子発現レベルを示すドットプロットである。
【発明を実施するための形態】
【0052】
胚発生中、造血はまず、主に卵黄嚢（ＹＳ）および大動脈－性腺－中腎（ＡＧＭ）領域において原始的および決定的波を通して発生し、異なる血液系統を生じさせる（Ｐａｌｉｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６，５０７３－５０８４（１９９９）、およびＭｅｄｖｉｎｓｋｙ，Ａ．＆Ｄｚｉｅｒｚａｋ，Ｅ．Ｃｅｌｌ ８６，８９７－９０６（１９９６））。第１の造血幹細胞（ＨＳＣ）は、内皮から造血への移行（ＥＨＴ）を通して、ＡＧＭにおける造血内皮（ＨＥ）細胞から出現する（Ｂｏｉｓｓｅｔ，Ｊ．－Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，１１６－１２０（２０１０）、およびＫｉｓｓａ，Ｋ．＆Ｈｅｒｂｏｍｅｌ，Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，１１２－１１５（２０１０））。成人では、ＨＳＣ静止、維持、および分化は、代謝における変化と密接に関連している（Ｔａｋｕｂｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２，４９－６１（２０１３）、およびＹｕ，Ｗ．－Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２，６２－７４（２０１３））。本明細書に開示される特定の例では、血液のデノボ出現は、ヒトＥＨＴ中の造血指定および系統コミットメントを直接誘導または調節する複数の代謝経路によって調節され得る。ＥＨＴは、解糖および酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）の増加を伴う、代謝スイッチが付随し得る。また、ＯＸＰＨＯＳ燃料グルタミンは、造血出現に不可欠であり得、その異なる経路中間体を通して、異なる系統回帰を誘導することができる。インビトロおよびインビボ設定の両方において、ピルビン酸塩使用を解糖またはＯＸＰＨＯＳに向けて操作することは、ＨＥ細胞のコミットメントを、それぞれ、原始的赤血球運命またはリンパ球／骨髄の可能性を有する決定的運命のいずれかに差次的に偏らせ得る。特定の例では、この文脈での原始的または決定的運命へのコミットメントは、異なるメカニズムによって制御され得る。ＥＨＴ中、代謝は、造血指定、系統コミットメント、および原始的対決定的の運命決定の主要な決定因子であり得る。本明細書で提供される開示は、代謝経路の調節を使用してインビトロで決定的ＨＳＣを生成するための基礎を提供し得、それによって、例において、血液学的障害および悪性腫瘍のための貴重な治療の源を提供する。
【0053】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、胚性幹細胞とのそれらの機能的同等性のため、無限の自己再生能を有し得、それらは患者自身の体細胞（例えば、皮膚細胞、または羊水ＭＳＣなど）から生成し、よって自己として認識することができるので、１つのそのような理想的な供給源であり、おそらく最も実現可能なものである。いくつかの例では、患者由来のｉＰＳ細胞から造血幹細胞を生成する能力は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合細胞の無制限の供給の生成を可能にし、血液学的障害を有する患者または造血およびいくつかの非造血固形腫瘍の悪性腫瘍のための化学療法を受けている患者の造血システムを再構成することができる。いくつかの例では、ｉＰＳ細胞を誘導するための体細胞の供給源に応じて、ｉＰＳ由来の造血幹細胞は、１）低減した後天性突然変異（例えば、ｉＰＳ細胞が新生児細胞源に由来する場合）、２）無制限の増殖能力、３）低減した拒絶の問題、４）存在する元の腫瘍からの汚染細胞がないこと、および５）Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓなどの既存の遺伝子編集技術を使用して患者からのｉＰＳ細胞株における先天性突然変異を修正する能力の観点で従来の採取された造血幹細胞よりも優れている場合がある。
【0054】
また、ｉＰＳ細胞からのそれらの分化後に悪性細胞を標的として破壊するように特異的に設計されたＴ細胞を生成する能力における最近の進歩は、移植が幹細胞および抗腫瘍Ｔ細胞の同時投与で行われ得ることを意味する（Ｔｒｏｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１６，Ｖｉｚｃａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１３）。そのようなものとして、いくつかの例では、ｉＰＳ由来の造血幹細胞を生成する能力は、多くの患者にドナー細胞の即時需要を提供し、周囲の技術が進歩するにつれて使用における指数関数的な増加を潜在的に提供する。よって、ｉＰＳ由来の造血細胞は、前述の生命を脅かす疾患を有する患者に信頼性が高く堅牢な新しい治療法を提供する。
【0055】
さらに、患者への輸血のためにｉＰＳから治療的に価値のある成熟細胞または分化された造血細胞を生成する能力は、公共の必要性に応えるという点でおそらくさらに大きな別の側面である。いくつかの例では、機能的な赤血球は、傷害の結果として失血に苦しんでいる患者、手術中に輸血を必要とする患者、または様々な形態の貧血に苦しむ患者のための輸血産物の不足に対処することができるように、すべての血液群についてまとめて生成することができる。加えて、ｉＰＳから分化された他の血液細胞も、抗腫瘍活性でプログラムされたＮＫまたはＴ細胞などの、がんの治療に有用であり得る。
【0056】
クレブスまたはクエン酸サイクルとしても知られる、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルは、細胞のためのエネルギーの主要な供給源であり、好気的呼吸の重要な部分である。サイクルは、アセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）の利用可能な化学エネルギーをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の還元力に利用する。ＴＣＡサイクルは、より大きなグルコース代謝の一部であり、それによってグルコースが酸化されてピルビン酸塩が形成され、次いで酸化されて、アセチル－ＣｏＡとしてＴＣＡサイクルに入る。
【0057】
分化するｉＰＳ細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞のように機能する。ＥＳ細胞とは異なり、ｉＰＳ細胞は、療法および研究のためにより容易に入手可能であり、それらの単離は、同じ倫理的懸念を有さない。ヒトｉＰＳ細胞は、患者自身に由来することができるため、患者特異的な療法のための理想的な供給源であり得る。加えて、ｉＰＳ細胞は、新薬をスクリーニングするため、または発症機序および毒物学を研究するために使用するヒト疾患のモデル、ならびに正常な発生のモデルを提供することによって、有用な研究ツールとして機能することができる。
【0058】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、未分化細胞であり、その子孫は、造血と呼ばれるプロセスを通して単球／マクロファージまたはＴおよびＢリンパ球などの血液細胞系統を再構成する。ＨＳＣは、血液細胞の持続的な再構成のための移植についてのこれらの細胞における目的を説明する無期限の自己再生能を有する。Ｂ細胞は、体液性免疫（抗体によって媒介される免疫）に関与するリンパ球の一種である。
【0059】
決定的造血幹細胞（ＨＳＣ）は、個体の全成人寿命間のすべての成熟した血液細胞の継続的な産生に関与している。それらは、血液関連疾患の療法に使用される移植プロトコルにおいて臨床的に重要な細胞である。実験的に、ＨＳＣは、照射された成人レシピエントの造血システム全体の長期的な再構成をもたらすことができる。
【0060】
特定の例では、解糖およびＴＣＡサイクル（細胞におけるエネルギー産生の主要な手段）の特定の代謝経路調節因子が、誘導された造血系統バイアスおよび決定的造血細胞の生成を可能にする造血細胞（内皮から造血への移行を受ける細胞）の前駆体において転写変化を直接活性化し得る。再プログラムされた細胞から決定的造血細胞を生成する能力は、決定的細胞のみがリンパ球血液系統（ＮＫ、Ｂ細胞、およびＴ細胞）、造血幹細胞、および成人ヘモグロビンを発現する赤血球細胞（赤血球）を生じさせるため、治療にとって重要である。これらは、患者が毎年世界中で受ける何百万もの赤血球輸血を含む、造血細胞ベース療法にすでに広く使用されているか、または使用のために開発されているドナーによって現在提供されている細胞型である。
【0061】
決定的造血細胞のｉＰＳ由来産生における上記の代謝経路の調節に加えて、代謝調節は、ｉＰＳ細胞以外の細胞源から決定的血液を生成するための重要な手段であり得る。例えば、決定的造血細胞のデノボ生成は、また直接再プログラムされた血液細胞に加えて、体細胞の中胚葉細胞および内皮から造血への移行が行われている細胞を含む血液の前駆細胞への直接再プログラミングによって達成され得る。代謝調節は、すべてのこれらの場合において決定的血液産生を誘導するための基礎を提供し得る。また、すでにコミットされた決定的血液細胞（すなわち、今日の世界中の造血幹細胞移植療法において現在使用されている、骨髄、臍帯血、動員された末梢血からの）の自己再生のための能力は、治療用造血幹細胞または他の決定的造血細胞の自己再生および増殖のための代謝経路操作の恩恵を受ける。
【0062】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼファミリーメンバー（ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、ＰＤＫ４）は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）のＥ１αサブユニットのリン酸化を触媒するセリンキナーゼである。ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼは、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ、およびアセチル－ＣｏＡによって活性化される。それは、ＡＤＰ、ＮＡＤ＋、ＣｏＡ－ＳＨ、およびピルビン酸塩によって阻害される。ＰＤＫを阻害する生化学物質は、造血系統バイアスを誘導し、決定的造血細胞を生成するために使用され得る。例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）の阻害剤には、リーラミンＨＣｌ、弱いＣＢ１受容体アゴニストおよびＰＤＫ阻害剤；ケルセチン二水和物、天然フラボノイド抗増殖性キナーゼ阻害剤；ジクロロ酢酸ナトリウム、ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼの阻害剤；ＳＢ ２０３５８０（塩酸塩）、ＭＡＰＫ阻害剤；ジクロロ酢酸、ミトコンドリアＰＤＫ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ）阻害剤；ＰＤＫ１／Ａｋｔ／Ｆｌｔ Ｄｕａｌ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、アポトーシスを選択的に誘導する細胞透過性化合物；ＢＸ ７９５、ＰＤＫ１、ＴＢＫ１、およびＩＫＫ＆イプシロンの阻害剤；ＳＢ ２０３５８０；ピリジニルイミダゾールおよびＭＫ２のｐ３８媒介活性化を抑制する特異的阻害剤；ＫＴ ５７２０、ＰＫＡの強力で特異的な細胞透過性阻害剤；ＢＸ－９１２、アポトーシスを誘導する強力で選択的なＰＤＫ－１阻害剤；ＧＳＫ ２３３４４７０、その後アポトーシス細胞死を誘導する強力で選択的なＰＤＫ１阻害剤；ならびにＯＳＵ ０３０１２、ＰＤＫ１阻害剤ならびにカスパーゼおよびｐ５３非依存性アポトーシスの誘導剤が含まれる。
【0063】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）の第１の成分酵素である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸脱炭酸（Ｓｗａｎｓｏｎ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）と呼ばれるプロセスによってピルビン酸塩をアセチル－ＣｏＡに変換することに寄与する。次いでアセチル－ＣｏＡは、細胞呼吸を行うためにクエン酸サイクルにおいて使用され得る。よって、ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、解糖代謝経路をクエン酸サイクルに結び付け、ＮＡＤＨを介してエネルギーを放出する。ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、フルクトース－１，６－ビスリン酸塩によってアロステリックに活性化され得、ＮＡＤＨおよびアセチル－ＣｏＡによって阻害される。ＰＤＨのリン酸化は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼによって媒介される。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）を活性化する代謝調節因子が使用され得る。
【0064】
ＰＤＨ阻害剤１－アミノエチルホスフィン酸（１－ＡＡ）は、ソース細胞のための培養培地において使用され得、１－ＡＡの濃度は、好ましくは、少なくとも４μＭであるが、約０．５μｍ～５０μｍの範囲、例えば、約：０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１．０μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、および５０μｍであり得る。
【0065】
いくつかの例では、代謝調節因子は、ピルビン酸塩のミトコンドリアへの取り込みを増加させるために使用され得る。ミトコンドリア外膜（ＯＭＭ）にわたるピルビン酸塩の輸送は、受動拡散を可能にする、電位依存性アニオンチャネル／ポリンなどの大きな非選択的チャネルを介して行われる（Ｂｅｎｚ Ｒ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９４；１１９７：１６７－１９６）。電位依存性アニオンチャネル（ＶＤＡＣ）は、ＯＭＭにおいて最も豊富なタンパク質であり、サイトゾルとミトコンドリアの膜間腔（ＩＭＳ）との間の代謝物／イオン輸送のための主要な経路として機能する。これらのチャネルにおける欠陥は、ピルビン酸塩代謝を遮断することが示されている（Ｈｕｉｚｉｎｇ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ．１９９６；３９：７６０－７６５）。電位依存性アニオンチャネル／ポリンの阻害剤は、ピルビン酸塩の取り込みを阻害するために使用され得る。タンパク質キナーゼ、ＧＳＫ３β、ＰＫＡ、およびタンパク質キナーゼＣイプシロン（ＰＫＣε）によるＶＤＡＣリン酸化は、ＢａｘおよびｔＢｉｄなどの他のタンパク質とのＶＤＡＣの結合を遮断または阻害し、またＶＤＡＣ開口を調節する。ＰＫＡ依存性ＶＤＡＣリン酸化およびＧＳＫ３β媒介性ＶＤＡＣ２リン酸化は、ＶＤＡＣコンダクタンスを増加させる。
【0066】
しかしながら、ピルビン酸塩などの代謝物のミトコンドリア内膜（ＩＭＭ）を通る動きは、ＯＭＭにわたるものよりも制限的であり得る。多くの代謝物は、同定され、研究された特定のミトコンドリア内膜輸送体を有する（Ｐａｌｍｉｅｒｉ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９６；１２７５：１２７－１３２）。
【0067】
ピルビン酸塩のアセチル補酵素Ａ（Ａｃ－ＣｏＡ）への変換を加速する代謝調節因子が使用され得る。ジクロロ酢酸塩（ＤＣＡ）は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）キナーゼを阻害し、それによってＰＤＨを活性な脱リン酸化状態に維持することによって、ピルビン酸塩がクレブスサイクルに入ることを促進する。代謝調節因子がジクロロ酢酸塩（ＤＣＡ）である事例では、ソース細胞のための培養培地中のジクロロ酢酸塩の濃度は、少なくとも約３０μＭであり得、１０μＭ～１００μＭで変動することができ、約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭの濃度を含む。
【0068】
本明細書における開示される方法で使用される代謝調節因子は、ピルビン酸塩のＡｃ－ＣｏＡへの変換を阻害し得る。例えば、ＵＫ－５０９９は、ミトコンドリアピルビン酸担体（ＭＰＣ）の強力な阻害剤である。ＵＫ－５０９９は、５０ｎＭのＩＣ５０でピルビン酸塩依存性Ｏ２消費を阻害する。ソース細胞のための培養培地中のＵＫ５０９９の濃度は、少なくとも１００ｎＭであり得るが、１０ｎＭ～１μｍの範囲であり得、約１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、および１μｍを含む。
【0069】
リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）は、ＥＨＴ、特に赤血球系統に使用され得る。ＴＣＰ、ＯＲＹ－１００１、ＧＳＫ－２８７９５５２、ＩＭＧ－７２８９、ＩＮＣＢ０５９８７２、ＣＣ－９００１１、ＯＲＹ－２００１、およびＲＯ７０５１７９０などの多数のＬＳＤ１阻害剤が報告されている。これらの阻害剤のうちの１つ以上は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上の組み合わせなど、組み合わせて使用され得る。
【0070】
α－ケトグルタル酸塩の産生を増加させる代謝調節因子が使用され得る。例えば、Ｌ－グルタミンは、ほとんどの細胞および組織における適切な成長のための栄養的に半必須のアミノ酸であり、細胞の正常な代謝プロセスの決定および保護において重要な役割を果たす。輸送システムの助けで、細胞外Ｌ－グルタミンは、原形質膜を通過し、２つの経路、すなわち、グルタミナーゼ（ＧＬＳ）ＩおよびＩＩ経路を通してα－ケトグルタル酸塩（ＡＫＧ）に変換され得る。グルタミン代謝の異なるステップ（グルタミン－ＡＫＧ軸）は、いくつかの因子によって調節され得（Ｘｉａｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．２０１６ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ４８：２０６７－２０８０）、グルタミン－ＡＫＧ軸を、ソース細胞のトリカルボン酸サイクルの活性化によるソース細胞からの決定的造血細胞の生成を調節するための潜在的な標的にする。α－ケトグルタル酸塩は、膜不透過性であり、通常、α－ケトグルタル酸ジメチル（ＤＭＫＧ）、α－ケトグルタル酸トリフルオロメチルベンジル（ＴＦＭＫＧ）、およびα－ケトグルタル酸オクチル（Ｏ－ＫＧ）などのエステルの形態で細胞に添加されることを意味する。これらの化合物が原形質膜を通過すると、エステラーゼによって加水分解されてα－ケトグルタル酸塩を生成し得、これは細胞内に閉じ込められたままである。すべての３つの化合物は、α－ケトグルタル酸塩の細胞内レベルを増加させる。よって、これらの化合物は、α－ケトグルタル酸塩の代謝調節因子である。いくつかの例では、分化ｉＰＳ細胞のための培養培地中のジメチルα－ケトグルタル酸塩の濃度は、少なくとも約１７．５μＭであり得るが、約１０μＭ～１００μＭであり得、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭの濃度を含む。
【0071】
本明細書に開示される様々な代謝調節因子は、ヌクレオシドと組み合わせて使用され得、ヌクレオシドの濃度は、少なくとも０．７ｍｇ／Ｌであり得るが、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌであり得、約０．１ｍｇ／Ｌ、０．２ｍｇ／Ｌ、０．３ｍｇ／Ｌ、０．４ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、０．６ｍｇ／Ｌ、０．７ｍｇ／Ｌ、０．８ｍｇ／Ｌ、０．９ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、３．５ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、４．５ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、５．５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、および６．５ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、７．５ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、８．５ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、９．５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、および１０．５ｍｇ／Ｌの濃度を含む。ヌクレオシドは、シチジン、グアノシン、ウリジン、アデノシン、およびチミジンのうちの少なくとも１つを含むが、２つ、３つ、４つ、または５つすべてのヌクレオシドなどの任意の潜在的な組み合わせを含み得る。
【0072】
実施例１
インビトロでのヒトＥＨＴおよび造血分化の反復発生
培養において原始的および決定的造血波の両方を得る一例では、２つの前述の小分子を、ヒトｉＰＳＣ分化中に組み合わせた（図７、ａ）：決定的造血を支持するＷＮＴ経路アゴニストであるＣＨＩＲ９９０２１（Ｎｇ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４，１１６８－１１７９（２０１６））および原始的造血を促進する、アクチビンＡ（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２，１７２２－１７３５（２０１２））。これらの修飾を前述の造血分化プロトコル（Ｄｉｔａｄｉ，Ａ．＆Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，Ｃ．Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０１，６５－７２（２０１６））に統合した後、造血内皮細胞（ＨＥ）、ＣＤ４３を中間レベルで発現する移行する細胞（ＥＨＴ）（Ｇｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９，１０－１９（２０１７））、および造血幹様細胞（ＨＳＣ様、免疫表現型ＨＳＣ）を得た（ゲーティング戦略については、図７．ｂを参照されたい）。これらの３つの集団は、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）を使用して転写的に特徴付けられた。ＵＭＡＰ可視化は、ＨＥ細胞をＨＳＣ様細胞から遠位に配置し、ＥＨＴ細胞がこれら２つの集団に架橋し、逐次ＥＨＴプロセスを確認した（図１ａ）。加えて、データセットの擬時間分析を行い、Ｇ０（図７、ｃ）およびＳ／Ｇ２Ｍ（図７、ｄ）の２つの細胞周期経路を取った。両方の事例では、軌跡の初めに豊富なＨＥ細胞、中程にＥＨＴ細胞、最後にＨＳＣ様細胞が観察された（図７、ｃおよびｄ、棒グラフ）。ＨＥ細胞は、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＣＤＨ５などの内皮マーカーを発現したが、造血マーカーを発現せず、対照的に、他のＥＨＴシステムにおいて以前に示されるように（Ｚｈｏｕ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４８７－４９２（２０１６）、Ｓｗｉｅｒｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４，２９２４（２０１３）、およびＧｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９，１０－１９（２０１７））、ＥＨＴ細胞は内皮および造血マーカーの両方を発現し、ＨＳＣ様細胞はＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＷＡＳ、およびＳＰＮなどの造血マーカーのみを発現した（図１ｂ）。単離された臍帯血ＣＤ３４＋細胞データセットを生成し、ｓｃＣｏＧＡＰＳパッケージを使用してＥＨＴプロセスデータセットに投影し、最も高いパターン重量がパターン１およびパターン３の一部であったことを観察し、両方は我々のＨＳＣ様クラスター（図７、ｅ）を包含し、臍帯血ＣＤ３４＋細胞が、本明細書の他の場所で記載されるｉＰＳＣ由来のＨＳＣ様細胞とほとんどの転写物を共有することを証明した。ＥＨＴプロセスデータを、カーネギー発生段階（ＣＳ）１３の初代ヒト胚性細胞の最近公開されたｓｃＲＮＡｓｅｑ分析と比較した（Ｚｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １－１４（２０１９））。動脈内皮および造血（ＡＥＣ／Ｈｅｍ）クラスターにおける９９個の細胞のうち、５０個、３６個、および１３個の細胞が、それぞれ、ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様集団にマッピングされ（図１ｃ）、それらが図１ａにおけるＥＨＴデータセットと同様にクラスター化された。さらに、ＥＨＴデータセットと同様に、ＨＥにマッピングされたＡＥＣ／Ｈｅｍクラスター細胞は、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＣＤＨ５などの内皮マーカーを発現し、ＨＳＣ様細胞にマッピングされた細胞は、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＷＡＳ、およびＳＰＮのような造血マーカーを発現した（図１ｄ）。データセットは、ｓｃＣｏＧＡＰＳパッケージを使用してＺｅｎｇ ｅｔ ａｌ．からのヒトＣＳ １３背側大動脈集団データセットにマッピングした。ＨＥ集団（パターン９）の大部分をＣＳ １３ ＡＥＣおよびＥＣ集団（灰色の矢印）と共局在化し、ＨＳＣ様集団（パターン７－８）のかなりの部分をＣＳ １３ Ｈｅｍクラスター（ピンク色の矢印）にマッピングした（図７、ｆ）。ＣＳ １３データの逆マッピングをデータセットに行った場合、ＣＳ １３ ＥＣ集団をＨＥ細胞の近くにマッピングし（パターン９、灰色の矢印）、ＣＳ １３ ＨｅｍクラスターをＥＨＴおよびＨＳＣ様細胞の両方の近くにマッピングした（パターン１０、緑色の矢印）（図７、ｇ）。よって、例において、システムは、ヒトＥＨＴプロセスをうまく捕捉し、得られるＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様集団は、ＣＳ１３でヒト胚において発生する細胞型と同等の血液－内皮転写シグネチャーを有する。
インビトロでのヒトＥＨＴおよび造血分化の反復発生
培養において原始的および決定的造血波の両方を得る一例では、２つの前述の小分子を、ヒトｉＰＳＣ分化中に組み合わせた（図７、ａ）：決定的造血を支持するＷＮＴ経路アゴニストであるＣＨＩＲ９９０２１（Ｎｇ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４，１１６８－１１７９（２０１６））および原始的造血を促進する、アクチビンＡ（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２，１７２２－１７３５（２０１２））。これらの修飾を前述の造血分化プロトコル（Ｄｉｔａｄｉ，Ａ．＆Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，Ｃ．Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０１，６５－７２（２０１６））に統合した後、造血内皮細胞（ＨＥ）、ＣＤ４３を中間レベルで発現する移行する細胞（ＥＨＴ）（Ｇｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９，１０－１９（２０１７））、および造血幹様細胞（ＨＳＣ様、免疫表現型ＨＳＣ）を得た（ゲーティング戦略については、図７．ｂを参照されたい）。これらの３つの集団は、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）を使用して転写的に特徴付けられた。ＵＭＡＰ可視化は、ＨＥ細胞をＨＳＣ様細胞から遠位に配置し、ＥＨＴ細胞がこれら２つの集団に架橋し、逐次ＥＨＴプロセスを確認した（図１ａ）。加えて、データセットの擬時間分析を行い、Ｇ０（図７、ｃ）およびＳ／Ｇ２Ｍ（図７、ｄ）の２つの細胞周期経路を取った。両方の事例では、軌跡の初めに豊富なＨＥ細胞、中程にＥＨＴ細胞、最後にＨＳＣ様細胞が観察された（図７、ｃおよびｄ、棒グラフ）。ＨＥ細胞は、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＣＤＨ５などの内皮マーカーを発現したが、造血マーカーを発現せず、対照的に、他のＥＨＴシステムにおいて以前に示されるように（Ｚｈｏｕ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４８７－４９２（２０１６）、Ｓｗｉｅｒｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４，２９２４（２０１３）、およびＧｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９，１０－１９（２０１７））、ＥＨＴ細胞は内皮および造血マーカーの両方を発現し、ＨＳＣ様細胞はＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＷＡＳ、およびＳＰＮなどの造血マーカーのみを発現した（図１ｂ）。単離された臍帯血ＣＤ３４＋細胞データセットを生成し、ｓｃＣｏＧＡＰＳパッケージを使用してＥＨＴプロセスデータセットに投影し、最も高いパターン重量がパターン１およびパターン３の一部であったことを観察し、両方は我々のＨＳＣ様クラスター（図７、ｅ）を包含し、臍帯血ＣＤ３４＋細胞が、本明細書の他の場所で記載されるｉＰＳＣ由来のＨＳＣ様細胞とほとんどの転写物を共有することを証明した。ＥＨＴプロセスデータを、カーネギー発生段階（ＣＳ）１３の初代ヒト胚性細胞の最近公開されたｓｃＲＮＡｓｅｑ分析と比較した（Ｚｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １－１４（２０１９））。動脈内皮および造血（ＡＥＣ／Ｈｅｍ）クラスターにおける９９個の細胞のうち、５０個、３６個、および１３個の細胞が、それぞれ、ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様集団にマッピングされ（図１ｃ）、それらが図１ａにおけるＥＨＴデータセットと同様にクラスター化された。さらに、ＥＨＴデータセットと同様に、ＨＥにマッピングされたＡＥＣ／Ｈｅｍクラスター細胞は、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＣＤＨ５などの内皮マーカーを発現し、ＨＳＣ様細胞にマッピングされた細胞は、ＲＵＮＸ１、ＴＡＬ１、ＷＡＳ、およびＳＰＮのような造血マーカーを発現した（図１ｄ）。データセットは、ｓｃＣｏＧＡＰＳパッケージを使用してＺｅｎｇ ｅｔ ａｌ．からのヒトＣＳ １３背側大動脈集団データセットにマッピングした。ＨＥ集団（パターン９）の大部分をＣＳ １３ ＡＥＣおよびＥＣ集団（灰色の矢印）と共局在化し、ＨＳＣ様集団（パターン７－８）のかなりの部分をＣＳ １３ Ｈｅｍクラスター（ピンク色の矢印）にマッピングした（図７、ｆ）。ＣＳ １３データの逆マッピングをデータセットに行った場合、ＣＳ １３ ＥＣ集団をＨＥ細胞の近くにマッピングし（パターン９、灰色の矢印）、ＣＳ １３ ＨｅｍクラスターをＥＨＴおよびＨＳＣ様細胞の両方の近くにマッピングした（パターン１０、緑色の矢印）（図７、ｇ）。よって、例において、システムは、ヒトＥＨＴプロセスをうまく捕捉し、得られるＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様集団は、ＣＳ１３でヒト胚において発生する細胞型と同等の血液－内皮転写シグネチャーを有する。
【0073】
次に、ＨＥおよびＥＨＴ集団の両方の造血の可能性を検証した。両方の細胞型が造血細胞（ＣＤ４３＋）を生じさせた（図８、ａ）。継代培養の６日目に、ＨＥまたはＥＨＴ細胞に由来するほとんどすべての細胞（＞９６％）はＣＤ４３＋であり、大部分はＣＤ３４発現を失い（＞８６％）、それらの成熟を示した。両方の細胞培養において、紡錘形の内皮細胞は、それらの形態を円形の造血細胞に変化させた（図８、ｂ）。ＨＥおよびＥＨＴ由来継代培養の両方において、赤血球（ＣＤ４３＋ＧＰＡ＋）細胞集団および非赤血球汎造血ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞集団は、それぞれ、３日目および６日目に明確に識別可能であった（図８、ｃ）。Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２，１７２２－１７３５（２０１２））によって記載されるモデルによると、ＣＤ４３＋ＧＰＡ＋およびＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞集団が生成される時間枠は、それぞれ、それらの原始的および決定的性質を示唆する。また、継代培養されたＨＳＣ様細胞における胚（ＨＢＺ、ＨＢＥ１）、胎児（ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）、および成人（ＨＢＤ、ＨＢＢ）グロビン上方調節の存在は、この設定において、我々が原始的および決定的造血細胞の両方を得ることをさらに支持する（図８、ｄ）。要するに、これらの結果は、この分化システムが、ヒトＥＨＴプロセスを正確にモデル化することを可能にし、得られたＨＥ細胞を効率的に継代培養することが、原始的および決定的造血集団を生じさせることを示す。
【0074】
解糖はＥＨＴ中に異なるプロセスに燃料供給し得る
例において、ＥＨＴ集団で発生する代謝プロセスを説明するために、解糖をＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞で評価した。分化に伴う解糖能および解糖の漸増が示された（図２、ａ、図９、ａ）。また、ｓｃＲＮＡｓｅｑによって評価される解糖酵素ＨＫ１、ＰＦＫＦＢ２、ＴＰＩ１、ＧＡＰＤＨ、ＰＫＬＲ、ＥＮＯ３、ＬＤＨＡ、およびＬＤＨＢの発現も、ＥＨＴ中に増加した（図２、ｂ）。いくつかの例では、ＣＳ １３からのヒト初代細胞におけるＥＨＴ中のこれらの解糖酵素の大部分の増加も示され（Ｚｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １－１４（２０１９））、インビトロの結果と一致する（図．９、ｂ）。
例において、ＥＨＴ集団で発生する代謝プロセスを説明するために、解糖をＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞で評価した。分化に伴う解糖能および解糖の漸増が示された（図２、ａ、図９、ａ）。また、ｓｃＲＮＡｓｅｑによって評価される解糖酵素ＨＫ１、ＰＦＫＦＢ２、ＴＰＩ１、ＧＡＰＤＨ、ＰＫＬＲ、ＥＮＯ３、ＬＤＨＡ、およびＬＤＨＢの発現も、ＥＨＴ中に増加した（図２、ｂ）。いくつかの例では、ＣＳ １３からのヒト初代細胞におけるＥＨＴ中のこれらの解糖酵素の大部分の増加も示され（Ｚｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １－１４（２０１９））、インビトロの結果と一致する（図．９、ｂ）。
【0075】
ＥＨＴ中に解糖活性が必要かを調べる例において、ＨＥ細胞を、解糖を遮断する、グルコース類似体、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）で処理した（図９、ｃ）。この処理は、継代培養の３日目にＨＥ細胞からのＣＤ４３＋細胞出力を有意に低減した（図２、ｃ、図９、ｄ）。また、２－ＤＧの存在下では、３日目のＣＤ４３＋ＧＰＡ＋細胞集団および６日目のＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞集団の生成が著しく損なわれ、対照の５０％未満に低下した（図２、ｄ、図９、ｅ）。興味深いことに、ＨＥではなく、ＥＨＴまたはＨＳＣ様細胞の増殖速度は、２－ＤＧの存在下で有意に低減した（図２、ｅ、図９、ｆ）。これらの結果は、解糖がＨＥ細胞が造血分化を誘導するために重要である一方で、ＥＨＴプロセス中の後期ステップでＥＨＴおよびＨＳＣ様細胞の増殖にも燃料供給し得ることを示す。
【0076】
ミトコンドリア呼吸はＥＨＴプロセス中に徐々に増加し得る
解糖および増殖の増加とともに、ＨＳＣ様細胞はまた、ＨＥおよびＥＨＴ細胞と比較して増加したグルコース取り込みを有した（図２、ｆ）。興味深いことに、解糖フラックスはＨＥ細胞と比較してＥＨＴ細胞においてより高かったにもかかわらず、グルコース取り込みはこれら２つの細胞型において同等であった。この結果は、我々に、ミトコンドリア呼吸がＨＥ対ＥＨＴ細胞においてより活性であったかを調査するように促した。予期せぬことに、ＥＨＴ細胞は、ＨＥ細胞と比較して、より高いレベルの基礎呼吸、ＡＴＰ産生、および最大呼吸を示した（図２、ｇ、図１０、ａ）。また、ＴＭＲＥ染色によって測定されるミトコンドリア活性は、ＨＥ細胞と比較して個別に分析されたＥＨＴ細胞において有意に増加し、我々は、ＨＳＣ様細胞の場合においてさらに高い速度を観察した（図２、ｈ）。ミトコンドリアを脱分極させるＦＣＣＰによる処理は、すべての細胞型においてＴＭＲＥシグナルを無効にし、ＯＸＰＨＯＳがこれらの集団において活性であったことを示す（図２、ｈ）。ＴＭＲＥ染色と一致して、我々が検出した最も高い基礎呼吸速度は、ＨＳＣ様細胞であった（図２、ｉ）。共焦点顕微鏡による生細胞イメージングを使用して、我々は、紡錘形のＨＥ細胞におけるミトコンドリア活性対同じウェルにおけるそれらの新しく形成された円形の造血子孫を比較した。ＴＭＲＥ染色強度測定は、ＨＥウェルにおける紡錘形細胞と比較して円形において２倍高いミトコンドリア活性を示し、この値は、ＨＳＣ様細胞において検出されたレベルと同様であった（図２、ｊ）。また、我々は、ｓｃＲＮＡｓｅｑによるＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様集団における複合体Ｉ（ＮＤＵＦと呼ばれる遺伝子）、ＩＩ（ＳＤＨＡ）、ＩＶ（ＣＯＸと呼ばれる遺伝子）、およびＶ（ＡＴＰ５と呼ばれる遺伝子）のサブユニットを含む、ＯＸＰＨＯＳに関与するいくつかの遺伝子の発現の漸増を観察した（図１０、ｂ）。この結果は、ＥＨＴ中のＴＣＡサイクル酵素の漸進的増加を伴った（図２、ｋ）。我々は、ＣＳ １３でヒト初代細胞においてＥＨＴ中にＯＸＰＨＯＳ関連遺伝子およびＴＣＡサイクル酵素の両方の漸増を観察し（Ｚｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １－１４（２０１９））、我々のインビトロでの所見を確認した（図１０、ｃおよびｄ）。まとめると、これらの結果は、ＴＣＡサイクル活性、ミトコンドリア呼吸、およびＯＸＰＨＯＳがＥＨＴプロセス中に徐々に増加することを示す。
解糖および増殖の増加とともに、ＨＳＣ様細胞はまた、ＨＥおよびＥＨＴ細胞と比較して増加したグルコース取り込みを有した（図２、ｆ）。興味深いことに、解糖フラックスはＨＥ細胞と比較してＥＨＴ細胞においてより高かったにもかかわらず、グルコース取り込みはこれら２つの細胞型において同等であった。この結果は、我々に、ミトコンドリア呼吸がＨＥ対ＥＨＴ細胞においてより活性であったかを調査するように促した。予期せぬことに、ＥＨＴ細胞は、ＨＥ細胞と比較して、より高いレベルの基礎呼吸、ＡＴＰ産生、および最大呼吸を示した（図２、ｇ、図１０、ａ）。また、ＴＭＲＥ染色によって測定されるミトコンドリア活性は、ＨＥ細胞と比較して個別に分析されたＥＨＴ細胞において有意に増加し、我々は、ＨＳＣ様細胞の場合においてさらに高い速度を観察した（図２、ｈ）。ミトコンドリアを脱分極させるＦＣＣＰによる処理は、すべての細胞型においてＴＭＲＥシグナルを無効にし、ＯＸＰＨＯＳがこれらの集団において活性であったことを示す（図２、ｈ）。ＴＭＲＥ染色と一致して、我々が検出した最も高い基礎呼吸速度は、ＨＳＣ様細胞であった（図２、ｉ）。共焦点顕微鏡による生細胞イメージングを使用して、我々は、紡錘形のＨＥ細胞におけるミトコンドリア活性対同じウェルにおけるそれらの新しく形成された円形の造血子孫を比較した。ＴＭＲＥ染色強度測定は、ＨＥウェルにおける紡錘形細胞と比較して円形において２倍高いミトコンドリア活性を示し、この値は、ＨＳＣ様細胞において検出されたレベルと同様であった（図２、ｊ）。また、我々は、ｓｃＲＮＡｓｅｑによるＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様集団における複合体Ｉ（ＮＤＵＦと呼ばれる遺伝子）、ＩＩ（ＳＤＨＡ）、ＩＶ（ＣＯＸと呼ばれる遺伝子）、およびＶ（ＡＴＰ５と呼ばれる遺伝子）のサブユニットを含む、ＯＸＰＨＯＳに関与するいくつかの遺伝子の発現の漸増を観察した（図１０、ｂ）。この結果は、ＥＨＴ中のＴＣＡサイクル酵素の漸進的増加を伴った（図２、ｋ）。我々は、ＣＳ １３でヒト初代細胞においてＥＨＴ中にＯＸＰＨＯＳ関連遺伝子およびＴＣＡサイクル酵素の両方の漸増を観察し（Ｚｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １－１４（２０１９））、我々のインビトロでの所見を確認した（図１０、ｃおよびｄ）。まとめると、これらの結果は、ＴＣＡサイクル活性、ミトコンドリア呼吸、およびＯＸＰＨＯＳがＥＨＴプロセス中に徐々に増加することを示す。
【0077】
グルタミンはＨＥの造血分化を開始する制限ステップであり得る
グルコースを含まない培地でも、ＨＥおよびＥＨＴ細胞は、高い基礎呼吸レベルを有した（図１０、ｅ）。よって、これらの細胞はまた、ミトコンドリア呼吸のために他のエネルギー源に依存し得る。グルタミンは、ＴＣＡサイクルの中間体であるα－ケトグルタル酸塩（α－ＫＧ）を生じさせることができ、結果としてＯＸＰＨＯＳに与える（図１１、ａ）。図に示されるように、ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞は、いくつかの異なるグルタミン輸送体を発現し（図１１、ｂ）、ＨＳＣ様細胞は、初代臍帯血ＨＳＣにおいて前述されるように、最高レベルのＳＬＣ１Ａ５輸送体を発現した（Ｏｂｕｒｏｇｌｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５，１６９－１８４（２０１４））。
グルコースを含まない培地でも、ＨＥおよびＥＨＴ細胞は、高い基礎呼吸レベルを有した（図１０、ｅ）。よって、これらの細胞はまた、ミトコンドリア呼吸のために他のエネルギー源に依存し得る。グルタミンは、ＴＣＡサイクルの中間体であるα－ケトグルタル酸塩（α－ＫＧ）を生じさせることができ、結果としてＯＸＰＨＯＳに与える（図１１、ａ）。図に示されるように、ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞は、いくつかの異なるグルタミン輸送体を発現し（図１１、ｂ）、ＨＳＣ様細胞は、初代臍帯血ＨＳＣにおいて前述されるように、最高レベルのＳＬＣ１Ａ５輸送体を発現した（Ｏｂｕｒｏｇｌｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５，１６９－１８４（２０１４））。
【0078】
グルタミンがＥＨＴに重要であるかを決定するために、グルタミナーゼ（ＧＬＳ）酵素を遮断し、これはＨＥ細胞をＢＰＴＥＳで処理することによって、グルタミンのグルタミン酸塩への脱アミド化を触媒する（図１１、ａ）。ＢＰＴＥＳの存在下での３日目のＨＥ由来ＣＤ４３＋ＧＰＡ＋赤血球集団および６日目のＣＤ４３＋ＣＤ４５＋集団の生成における急激な減少が図に示される（図１１、ｃおよびｄ）。この結果は、いくつかの例において、グルタミンがＴＣＡサイクルに入ることがＥＨＴ中の造血分化に必要であり得ることを示す。
【0079】
グルタミンはまた、ヌクレオチドおよび非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）合成を含むいくつかの代謝経路に関与する（ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓ，Ｒ．Ｊ．＆Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２９，３１３－３２４（２００９））。したがって、ＥＨＴ中のその役割をよりよく理解するために、ＨＥ細胞はその不在下にある。グルタミン欠乏は、継代培養の３日目にＨＥ細胞からのＣＤ４３＋細胞出力を無効にした（＞８０％減少）（図３、ａ）。この表現型をレスキューするために、グルタミンを含まない培養培地は、ヌクレオシド、ＮＥＡＡ、またはα－ＫＧの細胞透過性形態（ジメチル－ケトグルタル酸塩、ＤＭＫ）で補充し、これらはすべてグルタミンから誘導することができる基質である（ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓ，Ｒ．Ｊ．＆Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２９，３１３－３２４（２００９））。ヌクレオシド、ＮＥＡＡ、または両方の組み合わせは、グルタミン欠乏において見られる効果をレスキューすることができなかった（図１１、ｅ）。しかしながら、ＤＭＫ付加は、ＨＥ細胞からのＣＤ４３＋細胞出力を最大６０％レスキューした（図３、ａ、図１１、ｅ）。また、ＤＭＫ／ヌクレオシド、またはＤＭＫ／ヌクレオシド／ＮＥＡＡの組み合わせは、ＨＥ細胞に由来するＣＤ４３＋細胞のパーセンテージをさらに増加させ、対照条件のレベルに達した。
【0080】
ＴＣＡサイクルの別の燃料であるピルビン酸塩はグルタミンに取って代わり得るため、我々は、ＨＥ細胞をピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）阻害剤、ジクロロ酢酸塩（ＤＣＡ）で処理して、グルタミン欠乏中のピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）活性を増加させた。グルタミンなしでは、例において、ＤＣＡ処理単独では、対照において見られるＣＤ４３＋細胞レベルを回復することができなかった（図１１、ｆ）。
【0081】
特定の例では、ＣＤ３４＋発現を失ったより成熟したＣＤ４３＋細胞のパーセンテージは、対照と比較してグルタミンを含まないＤＭＫ処理条件において有意に減少した（図３、ａ、図１１、ｇ）。しかしながら、ヌクレオシド付加は、単独で、またはＮＥＡＡと一緒に、ＣＤ４３＋ＣＤ３４－細胞のパーセンテージを対照において観察されるレベルに回復した。ヌクレオチドは増殖する細胞において不可欠であるため、特定の例では、分化するＨＥ細胞の増殖はこの因子に依存した。いくつかの例では、ＤＭＫまたはヌクレオシ単独では、対照条件において見られる増殖プロファイルを回復することができず、実際、これら因子の両方の付加のみが、グルタミン欠乏中のＨＥ細胞の増殖を回復させた（図３、ｂ、図１１．ｈ）。これらの結果は、グルタミンがＨＥからのＣＤ４３＋細胞の生成に重要であり得、ＴＣＡサイクル燃料供給において、および増殖支援のためのヌクレオチド産生において役割を果たすことを示す。
【0082】
グルタミンは造血集団を差次的に維持する
以前に、赤血球分化は、グルタミン燃料供給されたヌクレオチド合成が必要であることが示されている（Ｏｂｕｒｏｇｌｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５，１６９－１８４（２０１４））。よって、ＨＥ細胞を増殖色素（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、ＣＴＶ）で染色し、新たに形成されたＧＰＡ＋またはＣＤ４５＋細胞の増殖状態を３日後に評価した。ＧＰＡ＋細胞は分裂した細胞にクラスター化した（低いＣＴＶ ＭＦＩ値）が、興味深いことに、ＨＥ細胞に由来するＣＤ４５＋細胞は、分裂をほとんどまたはまったく有さなかった（高いＣＴＶ ＭＦＩ値、図３、ｃ、図１１、ｉ）。グルタミンなしでのＨＥ継代培養の３日目および６日目に、ＤＭＫ単独は、ＣＤ４３＋ＧＰＡ＋集団を対照で見られるレベルまでレスキューすることができなかった（図１１、ｊ）。しかしながら、ＤＭＫ／ヌクレオシドまたはＤＭＫ／ヌクレオシド／ＮＥＡＡの組み合わせは、グルタミンの存在下で見られるものに相当するＣＤ４３＋ＧＰＡ＋集団を生じさせた（図３、ｄ、図１１、ｊ）。その結果、グルタミンは、炭素ドナーおよび窒素ドナーの両方として機能して、それらの増殖プロファイルに沿って、ともにＨＥ細胞からのＣＤ４３＋ＧＰＡ＋の産生に必要な、α－ＫＧおよびヌクレオチドを産生する（図３、ｃ）。
以前に、赤血球分化は、グルタミン燃料供給されたヌクレオチド合成が必要であることが示されている（Ｏｂｕｒｏｇｌｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５，１６９－１８４（２０１４））。よって、ＨＥ細胞を増殖色素（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、ＣＴＶ）で染色し、新たに形成されたＧＰＡ＋またはＣＤ４５＋細胞の増殖状態を３日後に評価した。ＧＰＡ＋細胞は分裂した細胞にクラスター化した（低いＣＴＶ ＭＦＩ値）が、興味深いことに、ＨＥ細胞に由来するＣＤ４５＋細胞は、分裂をほとんどまたはまったく有さなかった（高いＣＴＶ ＭＦＩ値、図３、ｃ、図１１、ｉ）。グルタミンなしでのＨＥ継代培養の３日目および６日目に、ＤＭＫ単独は、ＣＤ４３＋ＧＰＡ＋集団を対照で見られるレベルまでレスキューすることができなかった（図１１、ｊ）。しかしながら、ＤＭＫ／ヌクレオシドまたはＤＭＫ／ヌクレオシド／ＮＥＡＡの組み合わせは、グルタミンの存在下で見られるものに相当するＣＤ４３＋ＧＰＡ＋集団を生じさせた（図３、ｄ、図１１、ｊ）。その結果、グルタミンは、炭素ドナーおよび窒素ドナーの両方として機能して、それらの増殖プロファイルに沿って、ともにＨＥ細胞からのＣＤ４３＋ＧＰＡ＋の産生に必要な、α－ＫＧおよびヌクレオチドを産生する（図３、ｃ）。
【0083】
興味深いことに、条件におけるＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージの有意な増加は、対照と比較してＤＭＫまたはＤＭＫ／ヌクレオシド（図３、ｄ、図１１、ｊ）によって回復した。ＨＥ由来のＣＤ４５＋細胞は増殖を開始するのがより遅いという所見（図３、ｃ）と同様に、ＤＭＫは、ヌクレオシドの不在でもＨＥからのそれらの誘導には十分であった。よって、ＴＣＡサイクルにおける増加は、ＣＤ４５＋成熟造血細胞の形成に有利に働く。ＤＭＫ＋／ヌクレオシド＋条件において対照と同様のレベルのＣＤ４３＋ＧＰＡ＋で観察されるように（図４、ｄ）、これはＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞が他の集団を置き換えるために培養物を引き継ぐ可能性を排除する。ＤＭＫが決定的造血細胞の形成を誘導するかを理解するために、３日目のＨＥ細胞をＯＰ９－ＤＬ１ストロマと共培養し、リンパ球分化を誘導した。３日の継代培養中のグルタミン欠乏またはヌクレオシド補充単独は、ＨＥ細胞が共培養においてＮＫ細胞を生じさせるのを防止したが、ＤＭＫまたはＤＭＫ／ヌクレオシド補充は、効率的なＮＫ細胞分化を可能にした（図３、ｅおよび図１１、ｋ）。よって、グルタミンは、ＥＨＴ中に不可欠であり、ＨＥからの原始的ＧＰＡ＋および決定的ＣＤ４５＋集団の増殖を差次的に調節する。
【0084】
ピルビン酸塩の調節は、ＨＥからの造血出力を再形成し得る。
いくつかの例では、ＨＥ細胞は、それらの解糖速度はより低いものの、ＥＨＴ細胞と同様のレベルでグルコースを取り込み（図２ｆ）、したがって、ピルビン酸酸化がＨＥ細胞の造血コミットメントに重要であるかが調査された。ピルビン酸塩は、ミトコンドリアピルビン酸担体複合体（ＭＰＣ）を介してミトコンドリアによって取り込まれ、ＰＤＨ酵素によってアセチル－ＣｏＡに変換されて、ＴＣＡサイクルを補充することができる（図４、ａ）。ピルビン酸塩がミトコンドリアに入ることは、ＵＫ５０９９と呼ばれる特定のＭＰＣ阻害剤を使用して遮断した（図４、ａ）。ＨＥ細胞では、ＥＨＴまたはＨＳＣ様細胞とは異なり、ＭＰＣ阻害は、継代培養の３日目にＣＤ４３＋ＧＰＡ＋細胞出力における著しい増加をもたらした（図４、ｂおよび図１２、ａ）。この結果を確認するために、ＨＥ細胞を１－アミノエチルホスフィン酸（１－ＡＡ）、ＰＤＨ阻害剤（５）で処理し（図４、ａ）、対照と比較してＧＰＡ＋細胞出力における有意な増加が観察された（図１２、ｂ）。さらに、いくつかの例では、両方のＭＰＣサブユニット、ＭＰＣ１およびＭＰＣ２は、ｓｈＲＮＡを使用して下方調節され（図１２、ｃ）、継代培養の３日目にＣＤ４３＋ＧＰＡ＋細胞出力における２．７倍の増加が観察され（図１２、ｄ）、ＵＫ５０９９での結果を確認した。対照と比較して、ＵＫ５０９９の存在下でのＨＥに由来するＧＰＡ＋集団の増殖において差は観察されなかった（図１２、ｅ）。これらの結果は、解糖のためのグルコースの使用が赤血球細胞形成を駆動するのに十分であり得、ピルビン酸塩がミトコンドリアに入ることを阻害することが赤血球系統へのＨＥ細胞の分化の増加をもたらすことを示す。
いくつかの例では、ＨＥ細胞は、それらの解糖速度はより低いものの、ＥＨＴ細胞と同様のレベルでグルコースを取り込み（図２ｆ）、したがって、ピルビン酸酸化がＨＥ細胞の造血コミットメントに重要であるかが調査された。ピルビン酸塩は、ミトコンドリアピルビン酸担体複合体（ＭＰＣ）を介してミトコンドリアによって取り込まれ、ＰＤＨ酵素によってアセチル－ＣｏＡに変換されて、ＴＣＡサイクルを補充することができる（図４、ａ）。ピルビン酸塩がミトコンドリアに入ることは、ＵＫ５０９９と呼ばれる特定のＭＰＣ阻害剤を使用して遮断した（図４、ａ）。ＨＥ細胞では、ＥＨＴまたはＨＳＣ様細胞とは異なり、ＭＰＣ阻害は、継代培養の３日目にＣＤ４３＋ＧＰＡ＋細胞出力における著しい増加をもたらした（図４、ｂおよび図１２、ａ）。この結果を確認するために、ＨＥ細胞を１－アミノエチルホスフィン酸（１－ＡＡ）、ＰＤＨ阻害剤（５）で処理し（図４、ａ）、対照と比較してＧＰＡ＋細胞出力における有意な増加が観察された（図１２、ｂ）。さらに、いくつかの例では、両方のＭＰＣサブユニット、ＭＰＣ１およびＭＰＣ２は、ｓｈＲＮＡを使用して下方調節され（図１２、ｃ）、継代培養の３日目にＣＤ４３＋ＧＰＡ＋細胞出力における２．７倍の増加が観察され（図１２、ｄ）、ＵＫ５０９９での結果を確認した。対照と比較して、ＵＫ５０９９の存在下でのＨＥに由来するＧＰＡ＋集団の増殖において差は観察されなかった（図１２、ｅ）。これらの結果は、解糖のためのグルコースの使用が赤血球細胞形成を駆動するのに十分であり得、ピルビン酸塩がミトコンドリアに入ることを阻害することが赤血球系統へのＨＥ細胞の分化の増加をもたらすことを示す。
【0085】
総ＣＤ４３＋細胞のレベルが、６日目のＵＫ５０９９処理および未処理条件間で不変であったが（図１２、ｆ）、ＨＳＣ様細胞ではなく、ＨＥおよびＥＨＴ細胞の両方に由来するＣＤ４３＋ＣＤ４５＋集団において２倍の減少が観察された（図４、ｃ、図１２、ｇ）。同様に、１－ＡＡ処理は、総ＣＤ４３＋細胞レベルが不変であったとしても、ＨＥ由来ＣＤ４５＋細胞集団における有意な減少をもたらした（図１２、ｈ）。いくつかの例では、ＵＫ５０９９は、ともにＨＥに由来する、ＣＤ４５＋細胞の増殖またはＨＳＣ様細胞の頻度に対して効果を有さなかった（図１２、ｉおよびｊ）。これらの結果は、ピルビン酸塩がミトコンドリアに入ることを遮断することが、ＥＨＴ中のＣＤ４５＋造血運命への分化を損なうことを示し得る。
【0086】
特定の例では、ミトコンドリアへのピルビン酸塩フラックスを増加させることによって、反対の効果が誘導され得る。ＤＣＡを使用して、ＰＤＨ複合体を抑制するＰＤＫが遮断され、これはピルビン酸塩がアセチル－ｃｏＡに変換され、潜在的にＴＣＡサイクルに燃料供給することを可能にする（図４、ａ）。ＣＤ４３＋ＧＰＡ＋細胞の形成は、ＨＥ継代培養の３日目でＤＣＡによって有意に改変されなかったが（図１２、ｋ）、６日目でのこの集団における５０％減少が処理された条件で観察された（図４、ｄ、図１２、ｌ）。よって、ＤＣＡは解糖を直接遮断しないため、ＨＥ細胞からの原始的赤血球分化に影響を与えない場合がある。実際、ＨＥ継代培養に由来するＧＰＡ＋集団の増殖は、継代培養の３日目にＤＣＡによって影響されなかった（図１２、ｍ）。ＤＣＡでの継代培養の６日目に、ＥＨＴ細胞ではなく、ＨＥに由来するＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージにおいて８０％増加が観察された（図４、ｅ、図１２、ｎ）。ＣＤ４５＋細胞の増殖またはＨＥに由来するＨＳＣ様細胞の頻度は、ＤＣＡによって影響されなかった（図１２、ｏおよびｐ）。増殖に対するＵＫ５０９９およびＤＣＡのいかなる効果も完全に除外するために、ＥｄＵ組み込みを継代培養の初期の時点（１日目および２日目）で行い、ＵＫ５０９９またはＤＣＡ処理による増殖の差は見られなかった（図１２、ｑ）。まとめると、これらの結果は、ピルビン酸塩がＴＣＡサイクルに入ることが阻害される場合、ＨＥ細胞が優先的に赤血球細胞を生じさせ得ることを示し、一方、ピルビン酸塩がミトコンドリアにおける酸化に向かって推進される場合、増加したＴＣＡサイクル燃料供給は、ＨＥ細胞の決定的ＣＤ４５＋分化に有利に働く。
【0087】
例において、ＨＥ細胞におけるＵＫ５０９９でのＭＰＣ阻害の３日または６日後、赤血球コロニー（ＣＦＵ－Ｅ）形成は、未処理条件と比較して有意に増加したが、顆粒球およびマクロファージコロニーは減少した（ＣＦＵ－Ｇ、ＧＭ、およびＭ）（図１２、ｒおよびｓ）。対照的に、ＤＣＡでの３日のＰＤＫ阻害は、ＣＦＵに対する効果を有さなかったが（図１２、ｒ）、６日のＤＣＡ処理は、ＣＦＵ－Ｅの減少およびＣＦＵ－Ｍコロニーの有意な増加をもたらした（図１２、ｓ）。ＣＦＵ－Ｇ、ＣＦＵ－ＧＭ、およびＣＦＵ－Ｍコロニーの合計に対するＣＦＵ－Ｅコロニーの比は、対照と比較して、ＵＫ５０９９処理細胞において２０倍高く、ＤＣＡ処理細胞において３倍超低かった（図４、ｆ）。すべての条件において、明赤色の原始的赤血球（ＥｒｙＰ）および褐色がかった決定的赤血球（ＥｒｙＤ）コロニーの両方が観察された（図１２、ｔ）。しかしながら、ＵＫ５０９９またはＤＣＡは、ＨＢＡ１－２（成人グロビン）発現に対する効果を有さなかったが（図１２、ｕ）、ＵＫ５０９９処理されたＨＥ細胞から得られたコロニーにおけるＨＢＥ１（胚）およびＨＢＧ１－２（胎児）グロビン転写物の有意な増加（図４、ｇ）が観察され、ＭＰＣ阻害が原始的赤血球細胞の生成を増加させることを確認した。
【0088】
特定の例では、ＤＣＡが決定的造血細胞の形成を誘導するかを理解するために、ＯＰ９－ＤＬ１ストロマ共培養における３日目のＨＥ細胞においてリンパ球分化が誘導された。ＵＫ５０９９処理はＮＫ細胞形成を損なったが、ＤＣＡ処理は未処理ＨＥ細胞と比較してＮＫ細胞分化を有意に増加させた（図４、ｈ、図１２、ｖ）。全体として、例において、これらの結果は、フローサイトメトリーデータを確認し、ＵＫ５０９９が原始的赤血球形成を増加させ得る一方で、ＤＣＡが後期段階でＨＥからの骨髄／リンパ球分化に有利に働くことを示す。
【0089】
インビボ設定におけるこれらの所見を検証するために、妊娠マウスに、胎生期（Ｅ）９．５にＵＫ５０９９またはＤＣＡを注射して、Ｅ７－７．２５で行われる原始的造血ではなく、Ｅ９－９．５およびＥ１０．５で発生する決定的造血（両方の第２および第３波）を生じさせる造血内皮に影響を及ぼした（Ｐａｌｉｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６，５０７３－５０８４（１９９９）、およびＭｅｄｖｉｎｓｋｙ，Ａ．＆Ｄｚｉｅｒｚａｋ，Ｅ．Ｃｅｌｌ ８６，８９７－９０６（１９９６））。いくつかの例では、胚における血液系統出力は、胎児肝臓（ＦＬ）が造血の主要部位である場合、Ｅ１４．５でのＦＬの細胞組成を特徴付けることによって評価された。いくつかの例では、表現型長期ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）の頻度は、ＵＫ５０９９またはＤＣＡによって影響されず（図４、ｉ）、インビトロでの所見を確認した（図１２、ｊおよびｐ）。主に巨核球子孫を生じさせる、リンパ球／骨髄潜在性およびＨＰＣ－２を有する制限された前駆体である、造血前駆細胞（ＨＰＣ）－１は、対照およびＵＫ５０９９注射条件と比較して、ＤＣＡ注射マウスからの胚において有意に増加した（図１３、ａ）。これと一致して、ＴおよびＢ細胞レベルの両方は、ＤＣＡ対対照およびＵＫ５０９９注射胚において増加し（図４、ｊ）、ＤＣＡで増加したＣＤ４５＋決定的出力を示すインビトロの結果を支持した。また、例において、ＤＣＡ処理は、ＦＬにおける０、４、および５段階赤血球集団の有意な減少につながり得、対照およびＵＫ５０９９条件と比較して１、２、および３段階には有意差はない（図１３、ｂおよびｃ）。いくつかの例では、このプロファイルは、決定的赤血球細胞産生における機能障害（Ｓ０における減少）を示し、以前に記載されるように（Ｆｒａｓｅｒ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０９，３４３－３５２（２００７）、およびＩｓｅｒｎ，Ｊ．ＰＮＡＳ １０５，６６６２－６６６７（２００８））、注射前に形成された原始的赤血球は、ＦＬ（Ｓ１、２、および３）において後期成熟段階にあるか、またはＦＬから循環へと排出された（Ｓ４および５における減少）。
【0090】
さらに、例において、図１３、ｄに示されるゲーティング戦略に従って選別された、ＤＣＡ処理胚からのＬＴ－ＨＳＣは、対照およびＵＫ５０９９処理条件と比較して、有意により多くのＣＦＵ－ＧＭコロニーおよびより少ないＢＦＵ－Ｅコロニー（図１３、ｅ）、ＢＦＵ－Ｅ対ＣＦＵ－ＧＭの比の８０％減少（図４、ｋ）を生じさせた。ＵＫ５０９９によるインビボＥＨＴおよび造血に対する顕著な効果（図４、ｉ－ｋ）が観察されず、ＭＰＣ阻害が好ましくは原始的造血波に影響を与えることを確認した。よって、インビトロでの結果と類似して、ＤＣＡによるＰＤＫ阻害は、インビボでの成熟赤血球細胞を犠牲にしてリンパ系／骨髄細胞の頻度を増加させる。
【0091】
特定の例では、ｉＰＳ由来細胞の決定的造血能を評価するために、ＯＰ９－ＤＬ１ストロマと共培養された３日ＤＣＡ処理されたＨＥ細胞を、照射されたＮＳＧマウスに静脈内注射した。以前の研究に相当する生着レベルが得られ（Ｒａｈｍａｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８，１－１２（２０１７））、８週目に末梢血（ＰＢ）中に約１％のヒトＣＤ４５＋細胞が含まれた（図１３、ｆ）。８週目にＤＣＡ処理細胞が注射されたＮＳＧマウスのＰＢ中で有意により多くのヒトＢ細胞が検出されたが（図１３、ｇ）、骨髄細胞レベルは未処理条件と同様であった（図１２、ｈ）。１２週目に、両方の条件（図４、ｌ）で同様のレベルのヒトＨＳＣ（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ４５ＲＡ－として定義される）が見られたが、ＤＣＡ処理条件（図４、ｍ）においてリンパ球共通前駆体（ＣＬＰ）集団の有意な増加が検出された。この結果と一致して、ＤＣＡ処理ＨＥ細胞が注射されたＮＳＧマウスのＢＭにおいて有意により多くのヒトＢ細胞が観察され（図４、ｎ）、骨髄細胞のレベルに差はなかった（図４、ｏ）。さらに、ＤＣＡ処理ＨＥ細胞が注射されたＮＳＧマウスの胸腺において有意により多くのＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ胸腺細胞が検出された（図４、ｐ、図１３、ｉ）。まとめると、これらの結果は、ＤＣＡでミトコンドリアへのピルビン酸塩フラックスを増加させることが、ＨＥ細胞を決定的造血および優先的にリンパ球運命へインビボで推進することを示し得る。
【0092】
ピルビン酸塩運命は単一細胞レベルでのＨＥ細胞の造血系統コミットメントを指示し得る
特定の例では、ピルビン酸塩操作の分子効果を分析するために、ＨＥ細胞のトランスクリプトームプロファイルを、対照およびＵＫ５０９９またはＤＣＡ処理細胞において、処理の初期時点（２日目）に、単一細胞レベルで評価した。まず、すべての条件を一緒に群化し、細胞を７つのクラスターに分離した（図５、ａ）。ＨＥ細胞の大部分は、ＥＮＧ、ＣＤＨ５、ＰＲＯＣＲ、およびＡＮＧＰＴ２を含む内皮マーカーを発現し（図１４、ａ）、それらの発現は、主にクラスター１～５に限定された（図５、ｂ）。対照的に、クラスター６および７における細胞は、ＲＵＮＸ１、ＧＡＴＡ２、ＭＹＢ、およびＳＰＮを含む造血遺伝子を発現した（図５、ｂおよび図１４、ｂ）。よって、この時点は、クラスター６および７内で発生する造血細胞へのＨＥ細胞のコミットメントを捕捉し得る。
特定の例では、ピルビン酸塩操作の分子効果を分析するために、ＨＥ細胞のトランスクリプトームプロファイルを、対照およびＵＫ５０９９またはＤＣＡ処理細胞において、処理の初期時点（２日目）に、単一細胞レベルで評価した。まず、すべての条件を一緒に群化し、細胞を７つのクラスターに分離した（図５、ａ）。ＨＥ細胞の大部分は、ＥＮＧ、ＣＤＨ５、ＰＲＯＣＲ、およびＡＮＧＰＴ２を含む内皮マーカーを発現し（図１４、ａ）、それらの発現は、主にクラスター１～５に限定された（図５、ｂ）。対照的に、クラスター６および７における細胞は、ＲＵＮＸ１、ＧＡＴＡ２、ＭＹＢ、およびＳＰＮを含む造血遺伝子を発現した（図５、ｂおよび図１４、ｂ）。よって、この時点は、クラスター６および７内で発生する造血細胞へのＨＥ細胞のコミットメントを捕捉し得る。
【0093】
単離されたクラスター６および７に焦点を当てた例（図５、ｃ）では、早期赤血球形成調節因子であるＲＹＫ（Ｔｕｓｉ，Ｂ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５５５，５４－６０（２０１８））、および赤血球特異的ＫＬＦ３は、すでにクラスター６において高レベルで発現されたが、ＴＡＬ１、ＧＡＴＡ２、ＺＦＰＭ１、ＫＬＦ１、ＮＦＥ２、ＡＮＫ１、およびＨＢＱ１などの他の赤血球マーカーは、クラスター７においてより高度に発現された（赤血球マーカー、図５、ｃ）ことがわかった。早期リンパ球細胞運命調節因子ＰＯＵ２Ｆ２（Ｂ細胞）およびＧＡＴＡ３（Ｔ細胞）ならびに骨髄マーカーＳＷＡＰ７０およびＩＲＦ８は、クラスター６においてより高いレベルで発現したが、Ｔリンパ球ＢＣＬ１１Ｂ、骨髄単球ＣＳＦ１Ｒ、ＣＥＢＰＥ、および巨核球ＰＦ４は、クラスター７において最も高かった（リンパ球／骨髄マーカー、図５、ｃ）。よって、クラスター６細胞は、特定の系統の早期調節因子を発現したが、クラスター７細胞は、より成熟した造血細胞に特徴的な転写因子を発現し始めた。また、クラスター７では、赤血球転写因子を発現する細胞のパーセンテージは、７５％超であったが、リンパ球または骨髄マーカーを発現する細胞は、ＨＥからの、それぞれ、ＧＰＡ＋およびＣＤ４５＋細胞の早期および後期出現に応じて、合計の２０％未満を表した（図５、ｃ）。
【0094】
いくつかの例では、クラスター６における細胞のパーセンテージは、条件間で一定であったが、対照と比較してクラスター７ではＵＫ５０９９処理ＨＥ細胞が３８％多く、ＤＣＡ処理ＨＥ細胞が３５％少なかった（図１４、ｃ）。この結果は、ピルビン酸塩調節が初期造血コミットメントに影響しない場合があることを示す（クラスター６）。しかしながら、それは系統コミットメントに対して効果を有するようである（クラスター７）。
【0095】
特定の例では、クラスター６および７において、赤血球系統遺伝子ＲＹＫ、ＫＬＦ３、ＴＡＬ１、ＧＡＴＡ２、ＺＦＰＭ１、ＫＬＦ１、ＮＦＥ２、ＡＮＫ１、およびＨＢＱ１の平均発現レベルは、未処理ＨＥ細胞と比較してＵＫ５０９９処理ＨＥ細胞においてより高く、これらの因子は、ＤＣＡ処理ＨＥ細胞においてほぼ不在であった（左側ドットプロット、図５、ｄ）。対照的に、ＤＣＡ処理ＨＥ細胞は、対照およびＵＫ５０９９処理ＨＥ細胞と比較して、より高いレベルのリンパ球／骨髄転写因子ＳＷＡＰ７０、ＰＯＵ２Ｆ２、ＧＡＴＡ３、ＣＳＦ１Ｒ、ＰＦ４、ＢＣＬ１１Ｂ、ＣＥＢＰＥ、およびＩＲＦ８を発現した（右側ドットプロット、図５、ｄ）。
【0096】
単一細胞レベルに対するピルビン酸塩操作の効果をさらに評価するためのいくつかの例では、単一のＨＥ細胞をＯＰ９－ＤＬ１ストロマ上に選別し、ＧＰＡ＋クローンを１４日目にスコアリングした。条件当たり合計５５２個の単一細胞から、対照における９個のＧＰＡ＋クローンと比較してＵＫ５０９９処理条件において１２個のＧＰＡ＋クローン、ＤＣＡ処理条件において７個のＧＰＡ＋クローンが検出された（図１４、ｄ）。この結果は、ＵＫ５０９９の存在下で赤血球系統へのＨＥ細胞の優先的なコミットメントを確認し得る。まとめると、これらの結果は、ＨＥ分化の早期段階で、ピルビン酸塩使用の調節が系統特異的転写因子の発現に直接影響を及ぼし、ＨＥ細胞の系統コミットメントを誘導することを示し得る。
【0097】
ＭＰＣ阻害中の原始的赤血球コミットメントはＬＳＤ１に依存し得る
以前の研究は、リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）は、ＥＨＴおよび特に赤血球系統にとって重要であり得ることを示している（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１２，１３９２２－１３９２７（２０１５）、およびＴｈａｍｂｙｒａｊａｈ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８，２１－３２（２０１６））。ＥＨＴ中、ＬＳＤ１は、ＨＤＡＣ１／２（Ｔｈａｍｂｙｒａｊａｈ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０，１３６９－１３８３（２０１８））およびＧＦＩ１／ＧＦＩ１Ｂ（Ｔｈａｍｂｙｒａｊａｈ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８，２１－３２（２０１６））と協調して作用して、エピジェネティックな変化を誘導する。いくつかの例では、ＣＤ４３＋造血細胞の出現を損なうＨＤＡＣ１／２阻害剤（トリコスタチンＡ、ＴＳＡ）を使用したＥＨＴにとってＨＤＡＣが重要であり得ることが示された（図１５、ａ）。また、ＬＳＤ１、ＧＦＩ１、およびＧＦＩ１Ｂは、ＤＣＡ処理細胞と比較してＵＫ５０９９処理細胞においてより高いレベルで発現されることが観察され（図１５、ｂ）、ピルビン酸塩異化による系統指定がＬＳＤ１依存性であり得ることを示す。ＬＳＤ１がトラニルシプロミン（ＴＣＰ）で遮断されたか、またはｓｈＲＮＡによって下方調節された条件下（図１５、ｃ）、ＨＥ細胞のＵＫ５０９９処理後３日目でＣＤ４３＋ＧＰＡ＋細胞頻度の増加は検出されなかった（図６、ａおよびｂ）。一方、ＴＣＰ処理されたＨＥ細胞は、ＤＣＡ処理と同様に６日目により多くのＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞を生じさせたが（図１５、ｄ）、ＤＣＡとは異なり、ＴＣＰは、文献（Ｓｃｈｅｎｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １８，６０５－６１１（２０１２））において以前に記載されたように、骨髄分化を特異的に増加させた（図１５、ｅ）。よって、機構的には、ＭＰＣ阻害を通した原始的赤血球生成の誘導は、ＨＥ細胞におけるＬＳＤ１によるエピジェネティックな調節に依存し得る。
以前の研究は、リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）は、ＥＨＴおよび特に赤血球系統にとって重要であり得ることを示している（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１２，１３９２２－１３９２７（２０１５）、およびＴｈａｍｂｙｒａｊａｈ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８，２１－３２（２０１６））。ＥＨＴ中、ＬＳＤ１は、ＨＤＡＣ１／２（Ｔｈａｍｂｙｒａｊａｈ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０，１３６９－１３８３（２０１８））およびＧＦＩ１／ＧＦＩ１Ｂ（Ｔｈａｍｂｙｒａｊａｈ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８，２１－３２（２０１６））と協調して作用して、エピジェネティックな変化を誘導する。いくつかの例では、ＣＤ４３＋造血細胞の出現を損なうＨＤＡＣ１／２阻害剤（トリコスタチンＡ、ＴＳＡ）を使用したＥＨＴにとってＨＤＡＣが重要であり得ることが示された（図１５、ａ）。また、ＬＳＤ１、ＧＦＩ１、およびＧＦＩ１Ｂは、ＤＣＡ処理細胞と比較してＵＫ５０９９処理細胞においてより高いレベルで発現されることが観察され（図１５、ｂ）、ピルビン酸塩異化による系統指定がＬＳＤ１依存性であり得ることを示す。ＬＳＤ１がトラニルシプロミン（ＴＣＰ）で遮断されたか、またはｓｈＲＮＡによって下方調節された条件下（図１５、ｃ）、ＨＥ細胞のＵＫ５０９９処理後３日目でＣＤ４３＋ＧＰＡ＋細胞頻度の増加は検出されなかった（図６、ａおよびｂ）。一方、ＴＣＰ処理されたＨＥ細胞は、ＤＣＡ処理と同様に６日目により多くのＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞を生じさせたが（図１５、ｄ）、ＤＣＡとは異なり、ＴＣＰは、文献（Ｓｃｈｅｎｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １８，６０５－６１１（２０１２））において以前に記載されたように、骨髄分化を特異的に増加させた（図１５、ｅ）。よって、機構的には、ＭＰＣ阻害を通した原始的赤血球生成の誘導は、ＨＥ細胞におけるＬＳＤ１によるエピジェネティックな調節に依存し得る。
【0098】
ＤＣＡ依存性決定的造血はコレステロール代謝によって促進され得る
いくつかの例では、ジクロロ酢酸は、アセチル化マークの前駆体として直接使用され得、酢酸塩は、ＡＣＳＳ２によってアセチル－ｃｏＡに変換され、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）を介してヒストンに移される（図１５、ｆ）。ＡＣＳＳ２を阻害することは、ＨＥ継代培養の６日目にＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞に対するＤＣＡ効果を乱さず（図１５、ｇ）、ＤＣＡがアセチル－ｃｏＡに直接変換されないことを示す。また、Ｃ６４６単独でＨＡＴを遮断することは、ＨＥ細胞に対する効果を有さなかったが、Ｃ６４６＋ＤＣＡ処理は、ＤＣＡ単独と比較してＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞の増加を２倍に高めた（図１５、ｈ）。ＨＡＴを遮断することはＤＣＡ効果を阻害しなかったため、ＤＣＡによるＨ３Ｋ９またはＨ４の全体的なアセチル化の変化は見られなかった（図１５、ｉ）。よって、ＰＤＨ活性を増強することと一緒にＨＡＴを阻害することは、他の代謝プロセスのためのアセチル－ｃｏＡ利用可能性を促進し得、ＣＤ４５＋細胞の増加をもたらす。アセチル－ｃｏＡは、脂質生合成（ＡＣＣを介した）のため、およびコレステロールを産生するメバロン酸経路（ＨＭＧＣＲを介した）のため両方の前駆体である（図６、ｃ）。ＣＰ－６４０１８６（ＣＰ）でＡＣＣを遮断することは、ＤＣＡと同じ効果を有し、ＣＰおよびＤＣＡの両方での併用治療は、ＤＣＡ単独と比較して６日目のＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞の頻度をさらに増加させた（図６、ｄ）。よって、脂質生合成を防止することは、コレステロール産生のためのアセチル－ｃｏＡの利用可能性を高め得る。実際、ＤＣＡで処理されたＨＥ細胞では、コレステロール含有量の８％増加（図６、ｅ）が検出され、２日目にコレステロール流出遺伝子のレベルが高くなった（図１５、ｊ）。驚くべきことに、ＨＥ細胞をアトルバスタチン（Ａｔｏ）（メバロン酸経路の阻害剤）と組み合わせたＤＣＡで処理することは、ＤＣＡの効果を無効にした（図６、ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＤＣＡがコレステロール生合成を促進し、これがＨＥ細胞の決定的造血コミットメントに有利に働くことを示し得る（図６、ｇ）。
いくつかの例では、ジクロロ酢酸は、アセチル化マークの前駆体として直接使用され得、酢酸塩は、ＡＣＳＳ２によってアセチル－ｃｏＡに変換され、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）を介してヒストンに移される（図１５、ｆ）。ＡＣＳＳ２を阻害することは、ＨＥ継代培養の６日目にＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞に対するＤＣＡ効果を乱さず（図１５、ｇ）、ＤＣＡがアセチル－ｃｏＡに直接変換されないことを示す。また、Ｃ６４６単独でＨＡＴを遮断することは、ＨＥ細胞に対する効果を有さなかったが、Ｃ６４６＋ＤＣＡ処理は、ＤＣＡ単独と比較してＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞の増加を２倍に高めた（図１５、ｈ）。ＨＡＴを遮断することはＤＣＡ効果を阻害しなかったため、ＤＣＡによるＨ３Ｋ９またはＨ４の全体的なアセチル化の変化は見られなかった（図１５、ｉ）。よって、ＰＤＨ活性を増強することと一緒にＨＡＴを阻害することは、他の代謝プロセスのためのアセチル－ｃｏＡ利用可能性を促進し得、ＣＤ４５＋細胞の増加をもたらす。アセチル－ｃｏＡは、脂質生合成（ＡＣＣを介した）のため、およびコレステロールを産生するメバロン酸経路（ＨＭＧＣＲを介した）のため両方の前駆体である（図６、ｃ）。ＣＰ－６４０１８６（ＣＰ）でＡＣＣを遮断することは、ＤＣＡと同じ効果を有し、ＣＰおよびＤＣＡの両方での併用治療は、ＤＣＡ単独と比較して６日目のＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞の頻度をさらに増加させた（図６、ｄ）。よって、脂質生合成を防止することは、コレステロール産生のためのアセチル－ｃｏＡの利用可能性を高め得る。実際、ＤＣＡで処理されたＨＥ細胞では、コレステロール含有量の８％増加（図６、ｅ）が検出され、２日目にコレステロール流出遺伝子のレベルが高くなった（図１５、ｊ）。驚くべきことに、ＨＥ細胞をアトルバスタチン（Ａｔｏ）（メバロン酸経路の阻害剤）と組み合わせたＤＣＡで処理することは、ＤＣＡの効果を無効にした（図６、ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＤＣＡがコレステロール生合成を促進し、これがＨＥ細胞の決定的造血コミットメントに有利に働くことを示し得る（図６、ｇ）。
【0099】
上で説明されたように、ＥＨＴ中、移行する細胞は、解糖およびＴＣＡサイクル／ＯＸＰＨＯＳの同時増加とともに、エネルギー使用および代謝の根本的な変化を経験し得る。本明細書に提示される開示および結果は、グルタミンがＥＨＴプロセスにとって重要であり、原始的赤血球および決定的造血細胞の指定において異なる役割を果たすことを初めて示す。一方、例において、解糖およびＴＣＡサイクルの両方においてグルコースの役割があり得る。２－ＤＧでのその使用を遮断することは、ＨＥ細胞の造血分化を損ない得る。静止状態のＨＳＣでは、解糖は、低酸素誘導性因子－１α（ＨＩＦ－１α）の安定化を通して低酸素によって調節されることが示された（Ｔａｋｕｂｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ７，３９１－４０２（２０１０））。ＨＥからＨＳＣへの移行はまた、ＨＩＦ－１αによって調節されることが示された（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １２１，２４８３－２４９３（２０１３）、およびＩｍａｎｉｒａｄ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，２４－３５（２０１４））。よって、例において、ＨＩＦ－１α依存性解糖誘導は、ＥＨＴにとって重要であり得る。
【0100】
本明細書に示され、上記で説明されるように、解糖は、原始的造血のためのエネルギーを提供するのに十分である。実際に、早期胚形成段階では、酸素は、全身的に利用可能ではなく、解糖は、エネルギーを産生するための一般に好まれる経路である（Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｄ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍｉｎ Ｒｅｐｒｏｄ Ｍｅｄ １８，２０５－２１８（２０００））。胚の発生において、原始的赤血球細胞は、それらの急速な増殖に燃料供給するために高速の解糖を行うことが示された（Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１９，４８２８－４８３７（２０１２））。同様に、本明細書に記載される設定では、ＨＥに由来するＧＰＡ＋細胞は、ＣＤ４５＋細胞よりも速く増殖し、このプロセスにヌクレオチドを提供するためにグルタミンに依存する。同様に、赤血球分化のためのヌクレオチドの供給におけるグルタミンの重要な役割は、臍帯血から得られたＨＳＣの文脈で以前に記載されている（Ｏｂｕｒｏｇｌｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５，１６９－１８４（２０１４））。ＭＰＣを遮断することは、単一細胞レベルでのコミットされた細胞の増加した頻度、ならびにこの条件における赤血球因子および胚／胎児特異的グロビンのより高いレベルによって示されるように、ＥＨＴの非常に早期の段階でＨＥコミットメントを原始的赤血球形成へと向け直し得る。
【0101】
いくつかの例では、本明細書における、および上記に示される結果は、決定的造血同一性の特定におけるＴＣＡサイクルおよびＯＸＰＨＯＳの役割を解明し得る。グルタミン欠乏またはＤＣＡ処理中にＤＭＫでＴＣＡサイクルに燃料供給することは、ＨＥ細胞の決定的ＣＤ４５＋系統への増加した分化につながり得る。ＤＣＡでのＰＤＫ阻害は、原始的赤血球細胞形成に影響を与えないが、インビトロおよびインビボの両方で本明細書に示されるように、リンパ球／骨髄バイアスがかかった決定的造血を誘導し得る。ＨＥ細胞のＤＣＡ処理は、ＮＳＧマウスにおける増加したリンパ球再構成につながり得る。本明細書に提示される結果は、貧血であることが示されたが、Ｔ、Ｂ、および骨髄集団の正常な頻度を保持した、Ｐｄｋ２／Ｐｄｋ４ダブルノックアウトマウスにおける以前の所見と一致している（Ｔａｋｕｂｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２，４９－６１（２０１３））。例において、本明細書における結果は、ＤＣＡが、コレステロール生合成に燃料供給することによってＣＤ４５＋細胞形成を促進し得ることを示す。この結果は、コレステロール生合成のＳｒｅｂｐ２依存性調節がＨＳＣ出現に不可欠であることを示すゼブラフィッシュにおける洗練された研究によって裏付けられる（Ｇｕ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６３，１０８５－１０８８（２０１９））。ここに示されるように、ＨＥ細胞における直接的な代謝変化、すなわち増加したアセチル－ｃｏＡ含有量は、コレステロール代謝を促進し、決定的造血出力を制御することができる。
【0102】
異なるＥＨＴ細胞サブセットまたはｐｒｅ－ＨＳＣが異なる系統傾向を表すことが以前に報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４８７－４９２（２０１６）、およびＧｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９，１０－１９（２０１７））。本明細書に示されるような特定の例では、代謝は、ＨＥ細胞の運命を再構築することができ、系統傾向がＨＥレベルで決定され得ることを示す。本明細書における結果と一致して、ｓｃＲＮＡｓｅｑをレンチウイルス系統追跡と組み合わせる最近の研究は、細胞運命バイアスが、従来の方法で以前に記載されたよりも造血発生中のはるかに早期の段階で現れることを明らかにした（Ｗｅｉｎｒｅｂ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０２０ Ｆｅｂ １４；３６７（６４７９））。さらに、マウスＨＳＣは、それらの形成前に確立されるエピジェネティックなプライミングにより、リンパ球または骨髄造血系統バイアスを表すことが示された（Ｙｕ，Ｖ．Ｗ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６７，１３１０－１３２２．ｅ１７（２０１６））。実際には、エピジェネティックな変化を代謝に結び付けることは、代謝改変を細胞プロセスの転写調節と調和させる新たに出現した分野である。したがって、本明細書において例に示されるように、ＭＰＣ阻害による赤血球運命誘導は、エピジェネティックな因子であるＬＳＤ１に依存し得る。
【0103】
本明細書における例および結果は、原始的および決定的造血波の系統傾向が、ＹＳおよびＡＧＭニッチにおける栄養素利用可能性によって形成されることを示し得る。早期胚形成段階における酸素の不足のため、原始的造血波は、酸素について高い親和性を有する胚性グロビンを発現する赤血球細胞を形成する解糖に依存し得る（図６、ｇ）。これは、新たに形成される組織への酸素の効率的な分布を可能にし、ＯＸＰＨＯＳの使用を促進し得、これは決定的造血波の出現を開始し得る（図６、ｇ）。
【0104】
本明細書で説明されるように、例において、代謝決定因子を使用して、ＰＳＣからインビトロでの決定的ＨＳＣ発生を誘導することは、血液学的悪性腫瘍および障害を有する患者の造血システムを再構成することができる、移植可能な細胞を産生する方法を提供し得る。
【0105】
ｈｉＰＳＣ培養、造血分化、および細胞分離方法
当業者は、以下および本明細書の他の場所で記載される方法および材料が単なる例であり、そのような例は、方法および材料の異なる組み合わせを使用して行われ得ることを理解するであろう。さらに、本明細書に記載される方法および材料の要素は、任意であり得る。ＲＢ９－ＣＢ１ヒトｉＰＳＣ株は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共培養し、６日ごとに継代し、前述のように処理して胚様体（ＥＢ）を形成した（Ｇｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９，１０－１９（２０１７））。この研究において使用される分化プロトコルは、以前に記載されている（Ｄｉｔａｄｉ，Ａ．＆Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，Ｃ．Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０１，６５－７２（２０１６））が、以下および図７、ａに示されるように、原始的および決定的造血の両方を誘導するために小さな修飾が行われた。新たに形成されたＥＢを、まず１ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（０～２日目）および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（２日目のみ）で補足されたＳＦＤ培地に保存した。３日目に、培地を１ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（３日目のみ）および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（３日目のみ）で補足された「３日目－ＳＰ３４」培地に６日目までに切り替えた。６日目に、培地を、８日目までに、「６日目－ＳＰ３４」培地によって置き換えた。示されるいくつかの実験では、より高い収率のＨＳＣ様細胞を得るために、ＥＢを１０日目まで保持し、この場合では、ＥＢをマトリゲル（８μｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされた皿に８日目に播種し、１０日目まで保持した。培地を、５日目および７日目を除いて、毎日交換した。８日目または１０日目に（示されるように）、ＥＢをＴｒｙＰＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）との５～６ラウンドの５分のインキュベーションで単数化した。ＣＤ３４＋細胞を、ヒトＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して選択し、前述のマーカーに従って、ＣＤ３４－ＦＩＴＣ、ＣＤ７３－ＰＥ、ＶＥＣａｄ－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ３８－ＰＣ７、ＣＤ１８４－ＡＰＣ、ＣＤ４５－ＡＦ７００、ＣＤ４３－ＡＰＣＨ７、ＧＰＡ－ｅＦ４５０、ＣＤ９０－ＢＶ６０５、ならびにＨＥ（ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－ＣＤ９０＋ＶＥＣａｄ＋）、ＥＨＴ（ＣＤ３４＋ＣＤ４３ｉｎｔＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－ＣＤ９０＋ＶＥＣａｄ＋）、およびＨＳＣ様（ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ９０＋ＣＤ３８－）細胞を選別するための生存率マーカー７ＡＡＤで染色した（Ｇｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９，１０－１９（２０１７）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １２１，２４８３－２４９３（２０１３）、およびＳｃｈｅｎｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １８，６０５－６１１（２０１２））。
当業者は、以下および本明細書の他の場所で記載される方法および材料が単なる例であり、そのような例は、方法および材料の異なる組み合わせを使用して行われ得ることを理解するであろう。さらに、本明細書に記載される方法および材料の要素は、任意であり得る。ＲＢ９－ＣＢ１ヒトｉＰＳＣ株は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共培養し、６日ごとに継代し、前述のように処理して胚様体（ＥＢ）を形成した（Ｇｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９，１０－１９（２０１７））。この研究において使用される分化プロトコルは、以前に記載されている（Ｄｉｔａｄｉ，Ａ．＆Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，Ｃ．Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０１，６５－７２（２０１６））が、以下および図７、ａに示されるように、原始的および決定的造血の両方を誘導するために小さな修飾が行われた。新たに形成されたＥＢを、まず１ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（０～２日目）および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（２日目のみ）で補足されたＳＦＤ培地に保存した。３日目に、培地を１ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（３日目のみ）および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（３日目のみ）で補足された「３日目－ＳＰ３４」培地に６日目までに切り替えた。６日目に、培地を、８日目までに、「６日目－ＳＰ３４」培地によって置き換えた。示されるいくつかの実験では、より高い収率のＨＳＣ様細胞を得るために、ＥＢを１０日目まで保持し、この場合では、ＥＢをマトリゲル（８μｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされた皿に８日目に播種し、１０日目まで保持した。培地を、５日目および７日目を除いて、毎日交換した。８日目または１０日目に（示されるように）、ＥＢをＴｒｙＰＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）との５～６ラウンドの５分のインキュベーションで単数化した。ＣＤ３４＋細胞を、ヒトＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して選択し、前述のマーカーに従って、ＣＤ３４－ＦＩＴＣ、ＣＤ７３－ＰＥ、ＶＥＣａｄ－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ３８－ＰＣ７、ＣＤ１８４－ＡＰＣ、ＣＤ４５－ＡＦ７００、ＣＤ４３－ＡＰＣＨ７、ＧＰＡ－ｅＦ４５０、ＣＤ９０－ＢＶ６０５、ならびにＨＥ（ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－ＣＤ９０＋ＶＥＣａｄ＋）、ＥＨＴ（ＣＤ３４＋ＣＤ４３ｉｎｔＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－ＣＤ９０＋ＶＥＣａｄ＋）、およびＨＳＣ様（ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ９０＋ＣＤ３８－）細胞を選別するための生存率マーカー７ＡＡＤで染色した（Ｇｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９，１０－１９（２０１７）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １２１，２４８３－２４９３（２０１３）、およびＳｃｈｅｎｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １８，６０５－６１１（２０１２））。
【0106】
ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様継代培養
選別されたＨＥ（４０，０００）、ＥＨＴ（３０，０００）、およびＨＳＣ様（５－２０，０００）細胞を、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを有するＨＥ培地（３０）においてマトリゲル（１６μｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされた９６ウェル平底プレート上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２、４％Ｏ２で加湿インキュベーターに一晩保持した。翌日（０日目）、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、新鮮なＨＥ培地を、示される場合、２－ＤＧ（１ｍＭ）、ＵＫ５０９９（１０μＭ）、ＤＣＡ（３ｍＭ）、ＢＰＴＥＳ（２５μＭ）、ＴＳＡ（６０ｎＭ）、ＴＣＰ（３００ｎＭ）、ＡＣＳＳ２ｉ（５μＭ）、Ｃ６４６（１０μＭ）、ＣＰ－６４０１８６（５μＭ）、アトルバスタチン（０．５μＭ）、またはＤＭＫ（１．７５ｍＭ）、ヌクレオシド（１Ｘ）、もしくはＮＥＡＡ（１Ｘ）を含むグルタミンフリー培地と一緒に添加した。培地を交換し、薬物を２日ごとに添加し、細胞を加湿インキュベーターに３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で６～７日間保持した。写真は、ＣｅｌｌＳｅｎｓ ＤＰ７２カメラおよびＣｅｌｌＳｅｎｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ １．６ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０顕微鏡を使用して撮影した。
選別されたＨＥ（４０，０００）、ＥＨＴ（３０，０００）、およびＨＳＣ様（５－２０，０００）細胞を、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを有するＨＥ培地（３０）においてマトリゲル（１６μｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされた９６ウェル平底プレート上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２、４％Ｏ２で加湿インキュベーターに一晩保持した。翌日（０日目）、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、新鮮なＨＥ培地を、示される場合、２－ＤＧ（１ｍＭ）、ＵＫ５０９９（１０μＭ）、ＤＣＡ（３ｍＭ）、ＢＰＴＥＳ（２５μＭ）、ＴＳＡ（６０ｎＭ）、ＴＣＰ（３００ｎＭ）、ＡＣＳＳ２ｉ（５μＭ）、Ｃ６４６（１０μＭ）、ＣＰ－６４０１８６（５μＭ）、アトルバスタチン（０．５μＭ）、またはＤＭＫ（１．７５ｍＭ）、ヌクレオシド（１Ｘ）、もしくはＮＥＡＡ（１Ｘ）を含むグルタミンフリー培地と一緒に添加した。培地を交換し、薬物を２日ごとに添加し、細胞を加湿インキュベーターに３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で６～７日間保持した。写真は、ＣｅｌｌＳｅｎｓ ＤＰ７２カメラおよびＣｅｌｌＳｅｎｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ １．６ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０顕微鏡を使用して撮影した。
【0107】
細胞外フラックス分析
ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞間の比較のために、１０日目のＦＡＣＳ選別細胞（≧４０，０００）を、２～４つの複製においてＣｅｌｌＴａｋ（０．５６μｇ／ウェル）でコーティングされたＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６細胞培養マイクロプレートウェル上に直接播種し、細胞外フラックスをＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６アナライザーですぐに評価した。ＨＥおよびＥＨＴ細胞間の比較のために、８日目のＦＡＣＳ選別細胞（≧４０，０００）を、３～４つの複製においてマトリゲル（１６μｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされたＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６細胞培養マイクロプレートウェル上に播種し、細胞外フラックスを、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６アナライザーで、播種の２日後に評価した。解糖フラックスを評価するために、ＥＣＡＲを、２ｍＭグルタミンを含むＸＦ培地において、基礎条件下（製造元の指示に従って１時間のグルコース飢餓後）ならびに２５ｍＭのグルコース、４μＭのオリゴマイシン、および５０ｍＭの２－ＤＧの添加後に測定し、データを細胞数に対して正規化した。解糖能力（ＥＣＡＲオリゴマイシン－ＥＣＡＲ２－ＤＧ）および解糖（ＥＣＡＲグルコース－ＥＣＡＲ２－ＤＧ）のレベルを計算した。酸化的リン酸化を評価するために、１０ｍＭのグルコース、２ｍＭのグルタミン、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＸＦ培地において、基礎条件下、および４μＭのオリゴマイシン、２μＭのシアン化カルボニル４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、および１μＭのロテノン／４０μＭのアンチマイシンＡの添加後に、ＯＣＲを測定し、データを細胞数に対して正規化した。基礎呼吸（ＯＣＲ基礎－ＯＣＲロテノン／アンチマイシンＡ）、ＡＴＰ産生（ＯＣＲ基礎－ＯＣＲオリゴマイシン）、および最大呼吸（ＯＣＲＦＣＣＰ－ＯＣＲロテノン／アンチマイシンＡ）のレベルを計算した。
ＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞間の比較のために、１０日目のＦＡＣＳ選別細胞（≧４０，０００）を、２～４つの複製においてＣｅｌｌＴａｋ（０．５６μｇ／ウェル）でコーティングされたＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６細胞培養マイクロプレートウェル上に直接播種し、細胞外フラックスをＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６アナライザーですぐに評価した。ＨＥおよびＥＨＴ細胞間の比較のために、８日目のＦＡＣＳ選別細胞（≧４０，０００）を、３～４つの複製においてマトリゲル（１６μｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされたＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６細胞培養マイクロプレートウェル上に播種し、細胞外フラックスを、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６アナライザーで、播種の２日後に評価した。解糖フラックスを評価するために、ＥＣＡＲを、２ｍＭグルタミンを含むＸＦ培地において、基礎条件下（製造元の指示に従って１時間のグルコース飢餓後）ならびに２５ｍＭのグルコース、４μＭのオリゴマイシン、および５０ｍＭの２－ＤＧの添加後に測定し、データを細胞数に対して正規化した。解糖能力（ＥＣＡＲオリゴマイシン－ＥＣＡＲ２－ＤＧ）および解糖（ＥＣＡＲグルコース－ＥＣＡＲ２－ＤＧ）のレベルを計算した。酸化的リン酸化を評価するために、１０ｍＭのグルコース、２ｍＭのグルタミン、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＸＦ培地において、基礎条件下、および４μＭのオリゴマイシン、２μＭのシアン化カルボニル４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、および１μＭのロテノン／４０μＭのアンチマイシンＡの添加後に、ＯＣＲを測定し、データを細胞数に対して正規化した。基礎呼吸（ＯＣＲ基礎－ＯＣＲロテノン／アンチマイシンＡ）、ＡＴＰ産生（ＯＣＲ基礎－ＯＣＲオリゴマイシン）、および最大呼吸（ＯＣＲＦＣＣＰ－ＯＣＲロテノン／アンチマイシンＡ）のレベルを計算した。
【0108】
フローサイトメトリー分析
継代培養の３日目および６日目に、細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いた３７℃での２分のインキュベーション後に回収し、ＣＤ３４－ＦＩＴＣ、ＣＤ１４－ＰＥ、ＣＤ３３－ＰＣ７、ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣ、ＣＤ４５－ＡＦ７００、ＣＤ４３－ＡＰＣＨ７、ＧＰＡ－ｅＦ４５０、ＣＤ９０－ＢＶ６０５、および生存率マーカー７ＡＡＤで染色し、蛍光をＢＤ ＬＳＲＩＩで測定した。ミトコンドリア活性を測定するために、細胞をテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ、２０ｎＭ）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。ＴＭＲＥ染色の前に、陰性対照を１００μＭのＦＣＣＰとともに３７℃で３０分間インキュベートした。蛍光をＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩＩで測定し、ＭＦＩレベル－ＭＦＩ ＦＭＯを計算した。グルコース取り込みを測定するために、細胞を２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（２－ＮＢＤＧ）とともに３７℃で３０分間インキュベートし、蛍光をＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩＩで測定した。増殖を測定するために、細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）キットで製造元の指示に従って処理し（１０分のインキュベーション）、蛍光をＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで測定した。ＥｄＵ組み込みを測定するために、２４時間のＥｄＵパルス後の継代培養の１日目または２日目に、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵフローサイトメトリー細胞増殖アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ１０４２４）を製造元の指示に従って使用して、ＨＥ細胞を評価した。フローサイトメトリー出力を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで、すべての実験においてダブレットおよび死細胞を除外するＳＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ａ、ＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ｈ／ＳＳＣ－Ａ、および７－ＡＡＤに対する初期ゲーティングを用いて分析した。
継代培養の３日目および６日目に、細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いた３７℃での２分のインキュベーション後に回収し、ＣＤ３４－ＦＩＴＣ、ＣＤ１４－ＰＥ、ＣＤ３３－ＰＣ７、ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣ、ＣＤ４５－ＡＦ７００、ＣＤ４３－ＡＰＣＨ７、ＧＰＡ－ｅＦ４５０、ＣＤ９０－ＢＶ６０５、および生存率マーカー７ＡＡＤで染色し、蛍光をＢＤ ＬＳＲＩＩで測定した。ミトコンドリア活性を測定するために、細胞をテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ、２０ｎＭ）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。ＴＭＲＥ染色の前に、陰性対照を１００μＭのＦＣＣＰとともに３７℃で３０分間インキュベートした。蛍光をＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩＩで測定し、ＭＦＩレベル－ＭＦＩ ＦＭＯを計算した。グルコース取り込みを測定するために、細胞を２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（２－ＮＢＤＧ）とともに３７℃で３０分間インキュベートし、蛍光をＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩＩで測定した。増殖を測定するために、細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）キットで製造元の指示に従って処理し（１０分のインキュベーション）、蛍光をＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで測定した。ＥｄＵ組み込みを測定するために、２４時間のＥｄＵパルス後の継代培養の１日目または２日目に、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵフローサイトメトリー細胞増殖アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ１０４２４）を製造元の指示に従って使用して、ＨＥ細胞を評価した。フローサイトメトリー出力を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで、すべての実験においてダブレットおよび死細胞を除外するＳＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ａ、ＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ｈ／ＳＳＣ－Ａ、および７－ＡＡＤに対する初期ゲーティングを用いて分析した。
【0109】
コロニー形成単位アッセイ
継代培養されたＨＥ細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて３７℃で２分間処理し、解離された細胞を、３ｍｌのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４２３０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）（製造元の指示に従って、２．５μｇのｈＳＣＦ、５μｇのＧＭ－ＣＳＦ、２．５μｇのＩＬ－３、および５００ Ｕ ＥＰＯを含有する２０ｍＬのＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍで調製）に再懸濁した。各混合物を、組織培養処理されていない６ウェルプレートの２ウェルに分けた。３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２の加湿インキュベーターにおける１２日のインキュベーション後、コロニーを形態学的に識別し、スコア付けした。グロビン分析のために、ＭｅｔｈｏｃｕｌｔウェルにおけるコロニーをＰＢＳで採取し、完全に洗浄し、β－メルカプトエタノールを含むＲＬＴバッファーで凍結した。ＲＮＡ抽出およびＲＴ（Ｑｉａｇｅｎ）後、遺伝子発現をｑ－ＰＣＲによるｔａｑｍａｎプローブで評価した。この研究で使用されるｔａｑｍａｎプローブは、ＨＢＡ１／２（Ｈｓ００３６１１９１＿ｇ１）、ＨＢＥ１（Ｈｓ００３６２２１６＿ｍ１）、ＨＢＧ２／１（Ｈｓ００３６１１３１＿ｇ１）、およびＫＬＦ１（Ｈｓ００６１０５９２＿ｍ１）である。
継代培養されたＨＥ細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて３７℃で２分間処理し、解離された細胞を、３ｍｌのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４２３０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）（製造元の指示に従って、２．５μｇのｈＳＣＦ、５μｇのＧＭ－ＣＳＦ、２．５μｇのＩＬ－３、および５００ Ｕ ＥＰＯを含有する２０ｍＬのＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍで調製）に再懸濁した。各混合物を、組織培養処理されていない６ウェルプレートの２ウェルに分けた。３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２の加湿インキュベーターにおける１２日のインキュベーション後、コロニーを形態学的に識別し、スコア付けした。グロビン分析のために、ＭｅｔｈｏｃｕｌｔウェルにおけるコロニーをＰＢＳで採取し、完全に洗浄し、β－メルカプトエタノールを含むＲＬＴバッファーで凍結した。ＲＮＡ抽出およびＲＴ（Ｑｉａｇｅｎ）後、遺伝子発現をｑ－ＰＣＲによるｔａｑｍａｎプローブで評価した。この研究で使用されるｔａｑｍａｎプローブは、ＨＢＡ１／２（Ｈｓ００３６１１９１＿ｇ１）、ＨＢＥ１（Ｈｓ００３６２２１６＿ｍ１）、ＨＢＧ２／１（Ｈｓ００３６１１３１＿ｇ１）、およびＫＬＦ１（Ｈｓ００６１０５９２＿ｍ１）である。
【0110】
ＯＰ９－ＤＬ１ストロマに対するリンパ球分化アッセイ
示されるように、ＵＫ５０９９（１０μＭ）、ＤＣＡ（３ｍＭ）の存在下、またはＤＭＫ（１．７５ｍＭ）、ヌクレオシド（１Ｘ）、もしくはＮＥＡＡ（１Ｘ）を含むグルタミンを含まない培地において培養された継代培養３日目ＨＥ細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔとともに３７℃で２分のインキュベーション後に収集し、８０％コンフルエントなＯＰ９－ＤＬ１ストロマ上に播種した。細胞は、以前に記載されるように（Ｒｅｎｏｕｘ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４３，３９４－４０７（２０１５））、ＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬＴ３－Ｌ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－２（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍｌ、最初の１５日のみ）、およびＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むＯＰ９培地において培養し、毎週新しいＯＰ９－ＤＬ１ストロマ上に継代した。共培養の３５日目に、細胞をＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで分析した。
示されるように、ＵＫ５０９９（１０μＭ）、ＤＣＡ（３ｍＭ）の存在下、またはＤＭＫ（１．７５ｍＭ）、ヌクレオシド（１Ｘ）、もしくはＮＥＡＡ（１Ｘ）を含むグルタミンを含まない培地において培養された継代培養３日目ＨＥ細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔとともに３７℃で２分のインキュベーション後に収集し、８０％コンフルエントなＯＰ９－ＤＬ１ストロマ上に播種した。細胞は、以前に記載されるように（Ｒｅｎｏｕｘ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４３，３９４－４０７（２０１５））、ＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬＴ３－Ｌ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－２（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍｌ、最初の１５日のみ）、およびＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むＯＰ９培地において培養し、毎週新しいＯＰ９－ＤＬ１ストロマ上に継代した。共培養の３５日目に、細胞をＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで分析した。
【0111】
単一細胞ＲＮＡｓｅｑライブラリー調製および配列決定
選別されたＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞、ならびに磁気的に選択された（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）臍帯血ＣＤ３４＋細胞を、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを有するＨＥ培地（Ｄｉｔａｄｉ，Ａ．＆Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，Ｃ．Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０１，６５－７２（２０１６））においてマトリゲル（１６μｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされた９６ウェル平底プレート上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２、４％Ｏ２の加湿インキュベーターに一晩保持した。翌日（０日目）、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、新鮮なＨＥ培地を、示される場合、ＵＫ５０９９（１０μＭ）またはＤＣＡ（３ｍＭ）と一緒に添加した。１日目および２日目に（示されるように）、細胞を、ＰＢＳ ０．０４％ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＢＳＡで２回洗浄し、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔとの３７℃で２分のインキュベーション後に収集した。細胞を、スピンダウンし、ＰＢＳ ０．０４％ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＢＳＡに再懸濁し、計数し（８，０００～１８，０００細胞の収率）、ライブラリー調製をＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’Ｒｅａｇｅｎｔキットｖ３指示（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）に従って行った。配列決定は、ＩｌｌｕｍｉｎａからのＮＯＶＡＳｅｑ ６０００で、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって推奨されるランパラメータ（２８－８－０－９１）で、３００ｐＭのプールされたライブラリーの最終ローディング濃度で行った。ヒト臍帯血試料は、地方倫理委員会によって承認されたガイドラインに従ってインフォームドコンセントを得てＳｋａｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｌｕｎｄ ａｎｄ Ｍａｌｍｏ）およびＨｅｌｓｉｎｇｂｏｒｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌから収集した。
選別されたＨＥ、ＥＨＴ、およびＨＳＣ様細胞、ならびに磁気的に選択された（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）臍帯血ＣＤ３４＋細胞を、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを有するＨＥ培地（Ｄｉｔａｄｉ，Ａ．＆Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，Ｃ．Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０１，６５－７２（２０１６））においてマトリゲル（１６μｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされた９６ウェル平底プレート上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２、４％Ｏ２の加湿インキュベーターに一晩保持した。翌日（０日目）、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、新鮮なＨＥ培地を、示される場合、ＵＫ５０９９（１０μＭ）またはＤＣＡ（３ｍＭ）と一緒に添加した。１日目および２日目に（示されるように）、細胞を、ＰＢＳ ０．０４％ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＢＳＡで２回洗浄し、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔとの３７℃で２分のインキュベーション後に収集した。細胞を、スピンダウンし、ＰＢＳ ０．０４％ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＢＳＡに再懸濁し、計数し（８，０００～１８，０００細胞の収率）、ライブラリー調製をＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’Ｒｅａｇｅｎｔキットｖ３指示（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）に従って行った。配列決定は、ＩｌｌｕｍｉｎａからのＮＯＶＡＳｅｑ ６０００で、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって推奨されるランパラメータ（２８－８－０－９１）で、３００ｐＭのプールされたライブラリーの最終ローディング濃度で行った。ヒト臍帯血試料は、地方倫理委員会によって承認されたガイドラインに従ってインフォームドコンセントを得てＳｋａｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｌｕｎｄ ａｎｄ Ｍａｌｍｏ）およびＨｅｌｓｉｎｇｂｏｒｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌから収集した。
【0112】
単一細胞ＲＮＡｓｅｑ分析
データを、Ｓｅｕｒａｔ ｖ３．１．０を使用して処理および分析し、細胞がログ正規化前に最大２０％のミトコンドリアリードを有することを可能にし、「ｖｓｔ」方法を使用して上位５００の可変遺伝子を見出した。細胞周期スコアを計算し、データをミトコンドリア含有量ならびにＳスコアおよびＧ２Ｍスコアの差に回帰してスケーリングした。主成分は、ＵＭＡＰを計算する前に計算した。２つの発生経路を説明する擬時間軌跡は、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔ（Ｓｔｒｅｅｔ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９，４７７（２０１８））を使用して我々のＥＨＴデータセットにおいて特定され、それに沿って細胞を順序付けた。次いで、細胞を各軌道に沿ってビニングし、各ビンの細胞型組成をパーセンテージとして計算した。臍帯血ＣＤ３４＋細胞を我々のデータにマッピングし、ｓｃＣｏＧＡＰＳを使用して標識した（Ｓｔｅｉｎ－Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ ８，３９５－４１１．ｅ８（２０１９））。Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｚｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １－１４（２０１９））からのＣＳ１３データを読み取り、処理してＵＭＡＰを作製し、そこから「ＡＥＣ」および「Ｈｅｍ」と名付けた細胞を特定した。これらの９９個の細胞を、我々のデータにマッピングし、ＳＣＭＡＰを使用して標識した（Ｋｉｓｅｌｅｖ，Ｖ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５，３５９－３６２（２０１８））。我々のＥＨＴデータを、ｓｃＣｏＧＡＰＳを使用してＺｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｚｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １－１４（２０１９））からのデータにマッピングし、その逆も同様であり、各データセットにおいて１０パターンが特定され、次いでｐｒｏｊｅｃｔＲを使用して互いに投影された。各細胞を、最も高い重量を達成した群に割り当てた。細胞型とパターンとの間の関係を示す概説は、分割表を形成することによって行い、このコレスポンデンス分析は、Ｒについてｃａパッケージを使用して行った。ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ関数を使用して、差次的に発現する遺伝子を見出した。１日目試料の細胞数は、次のとおりである：ＨＥ＝１４５１、ＥＨＴ＝１５２３、ＨＳＣ様＝７３２。２日目試料の細胞数は、次のとおりである：ＨＥ ｃｔｒｌ＝１１９５、ＨＥ＋ＵＫ５０９９＝７１８、ＨＥ＋ＤＣＡ＝２３０９。すべての評価された内皮および造血遺伝子は、ＥＨＴプロセスを検証するために以前にいくつかの刊行物で使用された（Ｚｈｏｕ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４８７－４９２（２０１６）、Ｓｗｉｅｒｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４，２９２４（２０１３）、Ｎｇ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４，１１６８－１１７９（２０１６）、およびＧｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９，１０－１９（２０１７））。遺伝子発現分析のために、解糖、酸化的リン酸化、グルタミン輸送、およびコレステロール流出の遺伝子セットをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）からダウンロードした。
データを、Ｓｅｕｒａｔ ｖ３．１．０を使用して処理および分析し、細胞がログ正規化前に最大２０％のミトコンドリアリードを有することを可能にし、「ｖｓｔ」方法を使用して上位５００の可変遺伝子を見出した。細胞周期スコアを計算し、データをミトコンドリア含有量ならびにＳスコアおよびＧ２Ｍスコアの差に回帰してスケーリングした。主成分は、ＵＭＡＰを計算する前に計算した。２つの発生経路を説明する擬時間軌跡は、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔ（Ｓｔｒｅｅｔ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９，４７７（２０１８））を使用して我々のＥＨＴデータセットにおいて特定され、それに沿って細胞を順序付けた。次いで、細胞を各軌道に沿ってビニングし、各ビンの細胞型組成をパーセンテージとして計算した。臍帯血ＣＤ３４＋細胞を我々のデータにマッピングし、ｓｃＣｏＧＡＰＳを使用して標識した（Ｓｔｅｉｎ－Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ ８，３９５－４１１．ｅ８（２０１９））。Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｚｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １－１４（２０１９））からのＣＳ１３データを読み取り、処理してＵＭＡＰを作製し、そこから「ＡＥＣ」および「Ｈｅｍ」と名付けた細胞を特定した。これらの９９個の細胞を、我々のデータにマッピングし、ＳＣＭＡＰを使用して標識した（Ｋｉｓｅｌｅｖ，Ｖ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５，３５９－３６２（２０１８））。我々のＥＨＴデータを、ｓｃＣｏＧＡＰＳを使用してＺｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｚｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １－１４（２０１９））からのデータにマッピングし、その逆も同様であり、各データセットにおいて１０パターンが特定され、次いでｐｒｏｊｅｃｔＲを使用して互いに投影された。各細胞を、最も高い重量を達成した群に割り当てた。細胞型とパターンとの間の関係を示す概説は、分割表を形成することによって行い、このコレスポンデンス分析は、Ｒについてｃａパッケージを使用して行った。ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ関数を使用して、差次的に発現する遺伝子を見出した。１日目試料の細胞数は、次のとおりである：ＨＥ＝１４５１、ＥＨＴ＝１５２３、ＨＳＣ様＝７３２。２日目試料の細胞数は、次のとおりである：ＨＥ ｃｔｒｌ＝１１９５、ＨＥ＋ＵＫ５０９９＝７１８、ＨＥ＋ＤＣＡ＝２３０９。すべての評価された内皮および造血遺伝子は、ＥＨＴプロセスを検証するために以前にいくつかの刊行物で使用された（Ｚｈｏｕ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４８７－４９２（２０１６）、Ｓｗｉｅｒｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４，２９２４（２０１３）、Ｎｇ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４，１１６８－１１７９（２０１６）、およびＧｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９，１０－１９（２０１７））。遺伝子発現分析のために、解糖、酸化的リン酸化、グルタミン輸送、およびコレステロール流出の遺伝子セットをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）からダウンロードした。
【0113】
ｓｈＲＮＡを介した下方調節
目的の遺伝子を認識する短ヘアピン配列は、前述のように、最小限の毒性のためにマイクロＲＮＡコンテキストに埋め込まれた、ＧＦＰ発現ｐＲＲＬ－ＳＦＦＶベクターにクローン化した（Ｆｅｌｌｍａｎｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５，１７０４－１７１３（２０１３））。各レンチウイルスバッチは、２２μｇのｐＭＤ２．Ｇ、１５μｇのｐＲＳＶ－Ｒｅｖ、３０μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、および７５μｇのｓｈＲＮＡベクターを、２．５ＭのＣａＣｌ２を使用してコトランスフェクトすることによって、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の２つのＴ１７５フラスコにおいて産生した。トランスフェクションの１６時間後に培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後にウイルスを採取し、２０，０００×ｇで２時間４℃でペレット化し、１００μｌのＤＭＥＭに再懸濁し、アリコートし、－８０℃で保持した。各ｓｈＲＮＡの下方調節効率は、臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣのレンチウイルス形質導入の３日後、選別されたＧＦＰ＋細胞においてｑＰＣＲによって対応する遺伝子発現を評価することによって測定した。選別の翌日にレンチウイルス粒子の培養培地への直接添加によって、ＨＥ細胞を形質導入した。
目的の遺伝子を認識する短ヘアピン配列は、前述のように、最小限の毒性のためにマイクロＲＮＡコンテキストに埋め込まれた、ＧＦＰ発現ｐＲＲＬ－ＳＦＦＶベクターにクローン化した（Ｆｅｌｌｍａｎｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５，１７０４－１７１３（２０１３））。各レンチウイルスバッチは、２２μｇのｐＭＤ２．Ｇ、１５μｇのｐＲＳＶ－Ｒｅｖ、３０μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、および７５μｇのｓｈＲＮＡベクターを、２．５ＭのＣａＣｌ２を使用してコトランスフェクトすることによって、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の２つのＴ１７５フラスコにおいて産生した。トランスフェクションの１６時間後に培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後にウイルスを採取し、２０，０００×ｇで２時間４℃でペレット化し、１００μｌのＤＭＥＭに再懸濁し、アリコートし、－８０℃で保持した。各ｓｈＲＮＡの下方調節効率は、臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣのレンチウイルス形質導入の３日後、選別されたＧＦＰ＋細胞においてｑＰＣＲによって対応する遺伝子発現を評価することによって測定した。選別の翌日にレンチウイルス粒子の培養培地への直接添加によって、ＨＥ細胞を形質導入した。
【0114】
インビボ化合物注射およびマウス造血評価
妊娠雌Ｃ５７Ｂｌ／６ｘＢ６．ＳＪＬマウスに、Ｅ９．５でＵＫ５０９９（４ｍｇ／ｋｇ）またはＤＣＡ（２００ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（対照）を腹腔内注射した。胚をＥ１４．５で採取し、個別に計量し、処理した。胎児肝臓を解剖し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補足された８００μＬの氷冷ＰＢＳ中でホモジナイズし、ＦＬ細胞を、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した。分化した系統パネルについて、細胞をＢ２２０およびＣＤ１９（Ｂ細胞マーカー）－ＰＥ、ＣＤ３ｅ－ＡＰＣ、Ｔｅｒ１１９－ＰｅＣｙ７、およびＣＤ７１－ＦＩＴＣで染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩＩで分析した。ＨＳＣパネルについて、試料をまず塩化アンモニウム溶液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）で処理して赤血球を溶解し、２％ＦＢＳを含む氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＣＤ３ｅ、Ｂ２２０、Ｔｅｒ１１９、Ｇｒ１（系統）－ＰｅＣｙ５、ｃ－Ｋｉｔ－Ｅｆｌｕｏｒ７８０、Ｓｃａ１－ＢＶ４２１、ＣＤ４８－ＦＩＴＣ、ＣＤ１５０－ＢＶ６０５、および７－ＡＡＤ（死細胞除外のため）で染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩＩで分析した。フローサイトメトリー出力を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで、ダブレットを除外するＳＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａに対する初期ゲーティングを用いて分析した。ＣＦＵアッセイの播種について、１００個のＬＴ－ＨＳＣを選別し（図１３、ｄに示されるゲーティング戦略）、３．０ｍＬのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｍ３４３４（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）に再懸濁した。各混合物を、組織培養処理されていない６ウェルプレートの２ウェルに分けた。３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２の加湿インキュベーターにおける１４日のインキュベーション後、コロニーを形態学的に識別し、スコア付けした。
妊娠雌Ｃ５７Ｂｌ／６ｘＢ６．ＳＪＬマウスに、Ｅ９．５でＵＫ５０９９（４ｍｇ／ｋｇ）またはＤＣＡ（２００ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（対照）を腹腔内注射した。胚をＥ１４．５で採取し、個別に計量し、処理した。胎児肝臓を解剖し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補足された８００μＬの氷冷ＰＢＳ中でホモジナイズし、ＦＬ細胞を、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した。分化した系統パネルについて、細胞をＢ２２０およびＣＤ１９（Ｂ細胞マーカー）－ＰＥ、ＣＤ３ｅ－ＡＰＣ、Ｔｅｒ１１９－ＰｅＣｙ７、およびＣＤ７１－ＦＩＴＣで染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩＩで分析した。ＨＳＣパネルについて、試料をまず塩化アンモニウム溶液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）で処理して赤血球を溶解し、２％ＦＢＳを含む氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＣＤ３ｅ、Ｂ２２０、Ｔｅｒ１１９、Ｇｒ１（系統）－ＰｅＣｙ５、ｃ－Ｋｉｔ－Ｅｆｌｕｏｒ７８０、Ｓｃａ１－ＢＶ４２１、ＣＤ４８－ＦＩＴＣ、ＣＤ１５０－ＢＶ６０５、および７－ＡＡＤ（死細胞除外のため）で染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩＩで分析した。フローサイトメトリー出力を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで、ダブレットを除外するＳＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａに対する初期ゲーティングを用いて分析した。ＣＦＵアッセイの播種について、１００個のＬＴ－ＨＳＣを選別し（図１３、ｄに示されるゲーティング戦略）、３．０ｍＬのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｍ３４３４（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）に再懸濁した。各混合物を、組織培養処理されていない６ウェルプレートの２ウェルに分けた。３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２の加湿インキュベーターにおける１４日のインキュベーション後、コロニーを形態学的に識別し、スコア付けした。
【0115】
ＮＳＧマウス移植
選別されたヒトＨＥ細胞（３５０，０００）を、ＯＰ９－ＤＬ１ストロマ（６０，０００）と混合し、ＨＥ培地においてマトリゲル（１６μｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされた１２ウェルプレート上でＤＣＡ（３ｍＭ）ありまたはなしで３日間継代培養した３０。対照またはＤＣＡ試料からの１００，０００～１５０，０００個の細胞を、亜致死的に照射された（３００ｃＧｙ）８週齢の雌ＮＯＤ／Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス（ＮＳＧ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、Ｃ５７Ｂｌ／６．ＳＪＬマウス（ＣＤ４５．１＋／ＣＤ４５．２＋、インハウス繁殖）からの２０，０００個の全骨髄支持細胞と一緒に移植した。細胞を、静脈内尾静脈注射を通して、２％ＦＢＳを含む２５０μμＬのＰＢＳ中の単一細胞溶液に移植した。移植されたＮＳＧマウスの飲料水は、感染を予防するために移植後３週間シプロフロキサシン（１２５ｍｇ／Ｌ、ＨＥＸＡＬ）で補足した。マウスを、制御された環境において、１２時間の明暗サイクルで、餌および水を自由に与えて飼育した。実験および動物の世話は、Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従って行った。
選別されたヒトＨＥ細胞（３５０，０００）を、ＯＰ９－ＤＬ１ストロマ（６０，０００）と混合し、ＨＥ培地においてマトリゲル（１６μｇ／ｃｍ２、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされた１２ウェルプレート上でＤＣＡ（３ｍＭ）ありまたはなしで３日間継代培養した３０。対照またはＤＣＡ試料からの１００，０００～１５０，０００個の細胞を、亜致死的に照射された（３００ｃＧｙ）８週齢の雌ＮＯＤ／Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス（ＮＳＧ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、Ｃ５７Ｂｌ／６．ＳＪＬマウス（ＣＤ４５．１＋／ＣＤ４５．２＋、インハウス繁殖）からの２０，０００個の全骨髄支持細胞と一緒に移植した。細胞を、静脈内尾静脈注射を通して、２％ＦＢＳを含む２５０μμＬのＰＢＳ中の単一細胞溶液に移植した。移植されたＮＳＧマウスの飲料水は、感染を予防するために移植後３週間シプロフロキサシン（１２５ｍｇ／Ｌ、ＨＥＸＡＬ）で補足した。マウスを、制御された環境において、１２時間の明暗サイクルで、餌および水を自由に与えて飼育した。実験および動物の世話は、Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従って行った。
【0116】
ＮＳＧマウス移植後の末梢血分析
末梢血（ＰＢ）を尾静脈からＥＤＴＡコーティングされたｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、カタログ番号２０．１３４１．１００）に収集した。末梢血を、塩化アンモニウム溶液中の成熟赤血球（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）について室温で１０分間溶解し、細胞表面抗体について４℃で４５分間洗浄および染色し、洗浄および濾過した後、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）でのフローサイトメトリー分析を行った。フローサイトメトリー出力は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで、ダブレット除外のためのＳＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａに対する、死細胞除外のためのＤＡＰＩに対する、ならびにマウス細胞除外のためのｈｕＣＤ４５／ｍｕＣＤ４５．１に対する初期ゲーティングを用いて分析した。
末梢血（ＰＢ）を尾静脈からＥＤＴＡコーティングされたｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、カタログ番号２０．１３４１．１００）に収集した。末梢血を、塩化アンモニウム溶液中の成熟赤血球（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）について室温で１０分間溶解し、細胞表面抗体について４℃で４５分間洗浄および染色し、洗浄および濾過した後、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）でのフローサイトメトリー分析を行った。フローサイトメトリー出力は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで、ダブレット除外のためのＳＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａに対する、死細胞除外のためのＤＡＰＩに対する、ならびにマウス細胞除外のためのｈｕＣＤ４５／ｍｕＣＤ４５．１に対する初期ゲーティングを用いて分析した。
【0117】
ＮＳＧマウス移植後の骨髄分析
骨髄は、１２週間の移植エンドポイントで分析した。マウスを脊椎脱臼によって安楽死させ、続いて左右両方の大腿骨、脛骨、および腸骨の解剖を行った。骨髄を、乳棒および乳鉢での粉砕を通して採取し、細胞を、２％ＦＢＳを含む２０ｍＬの氷冷ＰＢＳ中に収集し、濾過し、洗浄した（３５０ｘｇ、５分）。骨髄細胞を、赤血球（塩化アンモニウム溶液、ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）について室温で１０分間溶解し、細胞表面抗体について４℃で４５分間洗浄および染色し、洗浄および濾過した後、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）でのＦＡＣＳ分析を行った。フローサイトメトリー出力は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで、ダブレット除外のためのＳＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａに対する、死細胞除外のためのＤＡＰＩまたは７ＡＡＤに対する、ならびにマウス細胞除外のためのｈｕＣＤ４５／ｍｕＣＤ４５．１に対する初期ゲーティングを用いて分析した。
骨髄は、１２週間の移植エンドポイントで分析した。マウスを脊椎脱臼によって安楽死させ、続いて左右両方の大腿骨、脛骨、および腸骨の解剖を行った。骨髄を、乳棒および乳鉢での粉砕を通して採取し、細胞を、２％ＦＢＳを含む２０ｍＬの氷冷ＰＢＳ中に収集し、濾過し、洗浄した（３５０ｘｇ、５分）。骨髄細胞を、赤血球（塩化アンモニウム溶液、ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）について室温で１０分間溶解し、細胞表面抗体について４℃で４５分間洗浄および染色し、洗浄および濾過した後、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）でのＦＡＣＳ分析を行った。フローサイトメトリー出力は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで、ダブレット除外のためのＳＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａに対する、死細胞除外のためのＤＡＰＩまたは７ＡＡＤに対する、ならびにマウス細胞除外のためのｈｕＣＤ４５／ｍｕＣＤ４５．１に対する初期ゲーティングを用いて分析した。
【0118】
ＮＳＧマウス移植後の胸腺分析
胸腺全体は、１２週間の移植エンドポイントで採取した。胸腺細胞は、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で上下にピペッティング、続いて５０μμｍの滅菌フィルターを通した濾過によって、胸腺において結合組織から機械的に解離した。試料を塩化アンモニウム溶液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ技術）中で室温で１０分間溶解することによって、赤血球汚染を除去した。試料を洗浄し、その後スピンダウンし、胸腺細胞のペレットをＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）でのＦＡＣＳ分析の前に細胞表面抗体を４℃で４５分間染色し、洗浄し、濾過した。フローサイトメトリー出力は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで、ダブレット除外のためのＳＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａに対する、死細胞除外のためのＤＡＰＩに対する、ならびにマウス細胞除外のためのｈｕＣＤ４５／ｍｕＣＤ４５．１に対する初期ゲーティングを用いて分析した。
胸腺全体は、１２週間の移植エンドポイントで採取した。胸腺細胞は、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で上下にピペッティング、続いて５０μμｍの滅菌フィルターを通した濾過によって、胸腺において結合組織から機械的に解離した。試料を塩化アンモニウム溶液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ技術）中で室温で１０分間溶解することによって、赤血球汚染を除去した。試料を洗浄し、その後スピンダウンし、胸腺細胞のペレットをＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）でのＦＡＣＳ分析の前に細胞表面抗体を４℃で４５分間染色し、洗浄し、濾過した。フローサイトメトリー出力は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで、ダブレット除外のためのＳＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａに対する、死細胞除外のためのＤＡＰＩに対する、ならびにマウス細胞除外のためのｈｕＣＤ４５／ｍｕＣＤ４５．１に対する初期ゲーティングを用いて分析した。
【0119】
共焦点顕微鏡イメージングおよび定量化
ＴＭＲＥ染色について、継代培養の３日目に、培養培地の半分を除去し、２倍濃縮溶液の培養培地への直接添加によって細胞を２０ｎＭのＴＭＲＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔ６６９）で染色した。３７℃で２０分のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳで注意深く洗浄し、新鮮なＨＥ培地を加えた。取得中、細胞は、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２の加湿インキュベーターに保持した。免疫細胞化学について、継代培養２日目のＨＥ細胞（カバーガラスに播種される）をＰＢＳで２回洗浄し、ＲＴで１５分間４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。フィリピン染色について、固定細胞を１００μｇ／ｍｌのフィリピンＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ４７６７）で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、蒸留水ですすいだ後、ＰＶＡ／ＤＡＢＣＯでマウントした。Ｈ３Ｋ９およびＨ４アセチル化染色について、固定細胞を透過処理し、ＰＢＳ＋０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００＋５％正常ロバ血清（ブロッキング溶液）でＲＴで１時間遮断し、続いてブロッキング溶液で希釈された一次抗体と４℃で一晩インキュベーションを行った。次いで、細胞をＰＢＳ＋０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＴＰＢＳ）で２×５分、ブロッキング溶液で５分洗浄した後、ブロッキング溶液で希釈された二次抗体とＲＴで２時間のインキュベーションを行った。その後、細胞を１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔを含有するＴＰＢＳで５分、ＰＢＳで２回洗浄した後、蒸留水ですすぎ、ＰＶＡ：ＤＡＢＣＯでマウントした。画像は、Ｚｅｎソフトウェアおよび１．５倍ズーム（ＴＭＲＥ）または０．６倍ズーム（フィリピンおよびアセチル化）を使用して、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡の１０倍（ＴＭＲＥ）または２０倍（フィリピンおよびアセチル化）対物レンズで得た。取得設定は、各実験のすべての画像について同じであり、同じ数のスタックを取った。強度定量化は、Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して次のように行った。ＴＭＲＥについて、明視野チャネルを使用して、ＲＯＩを５つの紡錘形および５つの円形細胞（ランダムに選択される）について選択し、各ＲＯＩの平均強度をＴＭＲＥチャネルの合計Ｚスタックで計算した。フィリピンおよびアセチル化について、フィリピンチャネルの合計Ｚスタックが得られ、平均強度が計算された。２～３つの複製ウェルを用いた合計２～３回の独立した実験を定量化した。各複製ウェルについて、４～６つの画像を取得した。
ＴＭＲＥ染色について、継代培養の３日目に、培養培地の半分を除去し、２倍濃縮溶液の培養培地への直接添加によって細胞を２０ｎＭのＴＭＲＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔ６６９）で染色した。３７℃で２０分のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳで注意深く洗浄し、新鮮なＨＥ培地を加えた。取得中、細胞は、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２の加湿インキュベーターに保持した。免疫細胞化学について、継代培養２日目のＨＥ細胞（カバーガラスに播種される）をＰＢＳで２回洗浄し、ＲＴで１５分間４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。フィリピン染色について、固定細胞を１００μｇ／ｍｌのフィリピンＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ４７６７）で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、蒸留水ですすいだ後、ＰＶＡ／ＤＡＢＣＯでマウントした。Ｈ３Ｋ９およびＨ４アセチル化染色について、固定細胞を透過処理し、ＰＢＳ＋０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００＋５％正常ロバ血清（ブロッキング溶液）でＲＴで１時間遮断し、続いてブロッキング溶液で希釈された一次抗体と４℃で一晩インキュベーションを行った。次いで、細胞をＰＢＳ＋０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＴＰＢＳ）で２×５分、ブロッキング溶液で５分洗浄した後、ブロッキング溶液で希釈された二次抗体とＲＴで２時間のインキュベーションを行った。その後、細胞を１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔを含有するＴＰＢＳで５分、ＰＢＳで２回洗浄した後、蒸留水ですすぎ、ＰＶＡ：ＤＡＢＣＯでマウントした。画像は、Ｚｅｎソフトウェアおよび１．５倍ズーム（ＴＭＲＥ）または０．６倍ズーム（フィリピンおよびアセチル化）を使用して、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡の１０倍（ＴＭＲＥ）または２０倍（フィリピンおよびアセチル化）対物レンズで得た。取得設定は、各実験のすべての画像について同じであり、同じ数のスタックを取った。強度定量化は、Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して次のように行った。ＴＭＲＥについて、明視野チャネルを使用して、ＲＯＩを５つの紡錘形および５つの円形細胞（ランダムに選択される）について選択し、各ＲＯＩの平均強度をＴＭＲＥチャネルの合計Ｚスタックで計算した。フィリピンおよびアセチル化について、フィリピンチャネルの合計Ｚスタックが得られ、平均強度が計算された。２～３つの複製ウェルを用いた合計２～３回の独立した実験を定量化した。各複製ウェルについて、４～６つの画像を取得した。
【0120】
統計分析
条件間の差の有意性は、示されるように、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアにおける複数の比較で対応のある／対応のないｔ検定、一元／二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定、またはクラスカル－ウォリス検定を使用して計算した。ｐ値は、以下の略語で図に示される：ｎｓ、有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
条件間の差の有意性は、示されるように、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアにおける複数の比較で対応のある／対応のないｔ検定、一元／二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定、またはクラスカル－ウォリス検定を使用して計算した。ｐ値は、以下の略語で図に示される：ｎｓ、有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【0121】
本説明は様々な実施形態の具体的詳細を記載するが、説明は例示にすぎず、決して限定として解釈されるべきではないことが理解されるであろう。さらに、当業者に起こり得る、そのような実施形態およびそれらへの修飾の様々な適用もまた、本明細書に記載される一般的な概念によって包含される。本明細書に記載される各々およびすべての特徴、ならびにそのような特徴の２つ以上の各々およびすべての組み合わせは、そのような組み合わせに含まれる特徴が相互に矛盾しないという条件で、本発明の範囲内に含まれる。上記で参照される、すべての図、表、および付録、ならびに特許、出願、および刊行物は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0122】
いくつかの実施形態は、添付の図面に関連して説明されている。しかしながら、図は縮尺通りに描かれていないことが理解されるべきである。距離、角度などは、単なる例示であり、例示されるデバイスの実際の寸法およびレイアウトとの正確な関係を必ずしも有するわけではない。成分は、追加、削除、および／または再配置することができる。さらに、様々な実施形態に関連する任意の特定の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、態様、方法、特性、特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、品質、属性、要素などの本明細書における開示は、本明細書に記載されるすべての他の実施形態において使用することができる。加えて、本明細書に記載される任意の方法は、列挙されたステップを行うのに適した任意の装置を使用して実施され得ることが認識されるであろう。
【0123】
本開示の目的のために、特定の態様、利点、および新規特徴が本明細書に記載される。任意の特定の実施形態によれば、必ずしもすべてのそのような利点が達成され得るわけではないことを理解されたい。よって、例えば、当業者は、本明細書において教示または示唆され得る他の利点を必ずしも達成することなく、本明細書において教示される１つの利点または一群の利点を達成する方法で本開示が具体化または実施され得ることを認識するであろう。
【0124】
これらの発明は、特定の好ましい実施形態および例の文脈で開示されているが、本発明は、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替の実施形態ならびに／または本発明ならびにその明らかな修飾および同等物の使用にまで及ぶことが当業者によって理解されるであろう。加えて、本発明のいくつかの変形が示され、詳細に説明されているが、これらの発明の範囲内にある、他の修飾は、本開示に基づいて当業者には容易に明らかになるであろう。実施形態の特定の特徴および態様の様々な組み合わせまたは部分的組み合わせが行われ得、依然として本発明の範囲内に入ることも企図される。開示された発明の様々なモードを形成するために、開示された実施形態の様々な特徴および態様は、互いに組み合わせるか、または置き換えることができることを理解されたい。さらに、開示されたプロセスおよび方法のアクションは、アクションの並べ替えおよび／または追加のアクションの挿入および／またはアクションの削除を含む、任意の方法で修飾され得る。よって、本明細書に開示される本発明の少なくともいくつかの範囲は、上記の特定の開示された実施形態によって限定されるべきではないことが意図されている。特許請求の範囲における制限は、特許請求の範囲において使用される文言に基づいて広く解釈されるべきであり、本明細書においてまたは出願の審査中に記載される例に限定されず、これらの例は、非排他的であると解釈されるべきである。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8】
【図9】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図10d】
【図10e】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図15-1】
【図15-2】
【国際調査報告】