(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-03
(54)【発明の名称】神経変性障害に対する遺伝子療法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230127BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20230127BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230127BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20230127BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20230127BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230127BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230127BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230127BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230127BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230127BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230127BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
C12N15/86 Z
C12N15/861 Z
C12P21/02 C
A61P25/00
A61P25/28
A61K35/761
A61K35/76
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022532043
(86)(22)【出願日】2020-11-25
(85)【翻訳文提出日】2022-07-20
(86)【国際出願番号】 US2020062394
(87)【国際公開番号】W WO2021108686
(87)【国際公開日】2021-06-03
(31)【優先権主張番号】62/942,059
(32)【優先日】2019-11-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/004,422
(32)【優先日】2020-04-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
２．ＷＩＮＤＯＷＳ
(71)【出願人】
【識別番号】522211531
【氏名又は名称】パロス バイオ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】ギャノン キンバリー エス．
(72)【発明者】
【氏名】グーレ マーティン
(72)【発明者】
【氏名】ハケット ニール アール．
【テーマコード（参考）】
4B064
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA15
4C087ZA16
4C087ZC41
4C087ZC54
(57)【要約】
本開示は、神経変性障害の治療のための核酸発現カセットに関する。アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、ピック病、レヴィ小体認知症、記憶喪失、認知障害、及び軽度の認知障害などの神経変性障害を治療する方法も提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に示す、または、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有しかつ前記のそれぞれによってコードされる同じポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチドであって、天然に存在しない、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項2】
配列番号３７に示すヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項3】
配列番号３９に示すヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項4】
（Ｉ）プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドであって、（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に示すポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に対して、少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド
のいずれか１つを含む、前記ポリヌクレオチドと；
（ＩＩ）プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された１つ以上の調節要素と
を含む、核酸発現カセット。
【請求項5】
前記調節要素のうち１つがコザック翻訳開始シグナルである、請求項４に記載の核酸発現カセット。
【請求項6】
前記コザック翻訳開始シグナルが、配列番号５に示すポリヌクレオチドを含む、請求項５に記載の核酸発現カセット。
【請求項7】
前記調節要素のうち１つがクロマチンインスレーター配列である、請求項４～６のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項8】
前記クロマチンインスレーター配列が、配列番号４に示すポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載の核酸発現カセット。
【請求項9】
前記調節要素のうち１つがニューロン特異的プロモーターである、請求項４～８のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項10】
前記ニューロン特異的プロモーターが、（ｉ）配列番号２に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）配列番号３に示すポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）配列番号２もしくは配列番号３の機能的断片；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項９に記載の核酸発現カセット。
【請求項11】
前記調節要素のうち１つ以上が、ｍＲＮＡ安定性要素から独立して選択される、請求項４～１０のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項12】
前記ｍＲＮＡ安定性要素が、（ｉ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の核酸発現カセット。
【請求項13】
前記ｍＲＮＡ安定性要素が、プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの３’またはポリアデニル化シグナルの５’に位置する、請求項１１に記載の核酸発現カセット。
【請求項14】
第１及び第２のｍＲＮＡ安定性要素を含む、請求項１３に記載の核酸発現カセットであって、前記第１のｍＲＮＡ安定性要素が、プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの３’に位置し、前記第２のｍＲＮＡ安定性要素が、ポリアデニル化シグナルの５’に位置する、前記核酸発現カセット。
【請求項15】
プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３７に示すポリヌクレオチドである、請求項４～１４のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項16】
プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３９に示すポリヌクレオチドである、請求項４～１４のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項17】
請求項４～１６のいずれか１項に記載の核酸発現カセットを含むベクター。
【請求項18】
ウイルスベクターである、請求項１７に記載のベクター。
【請求項19】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項20】
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／ｒｈ１０、ＡＡＶ２／１１、またはＡＡＶ２／１２である、請求項１９に記載のベクター。
【請求項21】
ａ．ＣＡＧプロモーター、プレセニリン－１プロモーター、ユビキチンＣプロモーター、ＣＢＡプロモーター、シナプシン－１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＥＦ１αプロモーターから選択されるプロモーターであって、以下と機能的に連結される、プロモーター；ｂ．配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９から選択されるプレセニリン－１コード配列、または前記ＰＳＥＮ－１コード配列のいずれかに対して少なくとも９５％の同一性を有し、野生型ＰＳＥＮ－１アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；ならびに
ｃ．ヒト成長ホルモンポリアデニル化配列及びウサギβ－グロビンポリアデニル化配列から選択されるポリアデニル化配列
を含む、請求項１９または２０に記載のベクター。
【請求項22】
ヒトベータグロビンイントロン（野生型または合成のいずれか）またはマウス微小ウイルスのイントロンから選択されるイントロンをさらに含み、前記イントロンが前記プロモーターと前記ＰＳＥＮ－１コード配列との間に位置する、請求項２１に記載のベクター。
【請求項23】
ａ．配列番号４１のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド２３７～１２００もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド１２２１～１７８６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド１８９９～３２９９もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド３３３０～３８０６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、及び配列番号４１のヌクレオチド４５５３～４６９３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；ｂ．配列番号４２のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド２３７～１３２３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド１３４４～１９０９もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド１９８３～３４１６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド３４４７～３９２３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、及び配列番号４２のヌクレオチド４５５４～４６９４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｃ．配列番号４３のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド２３７～８９０もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド９１１～１４７６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド１５５０～２９８３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド３０１４～３４９０もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、及び配列番号４３のヌクレオチド４５５３～４６９４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｄ．配列番号４４の、ヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド２３７～１４１５もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド１４３６～２００１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド２０７５～３５０８もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド３５３９～４０１５もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、及びヌクレオチド４５００～４６４０もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｅ．配列番号４５のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド２３７～６６４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド６８４～１２４９もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド１３２３～２７５６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド２７８７～３２６３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、及び配列番号４５のヌクレオチド４５３３～４６７３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｆ．配列番号４６のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド２３７～６８４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド７０５～１２７０もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド１３４４～２７７７もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド２８０８～３２８４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、及び配列番号４６のヌクレオチド４５５４～４６９５もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；または
ｇ．配列番号４７のヌクレオチド１～１０５もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド１１３～７６６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド７７６～８６７もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド８８１～２３１１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド２３１９～２３６７もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、及び配列番号４７のヌクレオチド２３８６～２５２６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列
を含む、請求項２２に記載のベクター。
【請求項24】
配列番号４１～４７のいずれか１つのヌクレオチド配列、または配列番号４１～４７のいずれか１つに対して９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載のベクター。
【請求項25】
プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された前記調節要素が、（ｉ）コザック翻訳開始シグナル；
（ｉｉ）ニューロン特異的プロモーター；
（ｉｉｉ）クロマチンインスレーター配列；
（ｉｖ）プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの３’に位置するｍＲＮＡ安定性要素；及び
（ｖ）ポリアデニル化シグナルの５’に位置するｍＲＮＡ安定性要素
を含む、請求項４～１６のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項26】
コザック翻訳開始シグナルが、配列番号５に示すポリヌクレオチドを含み、クロマチンインスレーター配列が、配列番号４に示すポリヌクレオチドを含み、
プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの３’に位置するｍＲＮＡ安定性要素が、配列番号９または配列番号１０に示すポリヌクレオチドを含み、
ポリアデニル化シグナルの５’に位置する、少なくとも１つのｍＲＮＡ安定性要素が、配列番号１１に示すポリヌクレオチドを含み、
ニューロン特異的プロモーターが、配列番号２または配列番号３に示すポリヌクレオチドを含む、
請求項２５に記載の核酸発現カセット。
【請求項27】
プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターが、遍在性プロモーターである、請求項４～６のいずれか１項に記載の核酸発現カセット。
【請求項28】
請求項１７～２４のいずれか１項に記載のベクターを、その必要のある対象に投与することを含む、神経変性疾患、障害、または病態を治療する方法。
【請求項29】
神経変性疾患、障害、または病態が、アルツハイマー病、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）、プレセニリン１（ＰＳＥＮ－１）媒介ＦＡＤ、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、ピック病、レヴィ小体認知症、記憶喪失、認知障害、または軽度の認知障害である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
請求項１７～２４のいずれか１項に記載のベクターを、その必要のある対象に投与することを含む、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）またはプレセニリン１（ＰＳＥＮ－１）媒介ＦＡＤを治療する方法。
【請求項31】
プレセニリン１タンパク質を生成する方法であって、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に示す最適化ポリヌクレオチドを含むベクターで、または配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に対して、少なくとも９５％の同一性を有し、前記のそれぞれによってコードされる同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターによって、宿主細胞を形質転換すること；ならびに
プレセニリン１タンパク質の発現を可能にする条件下及び時間で前記細胞を培養することであって、宿主細胞における、前記最適化ポリヌクレオチドによってコードされるプレセニリン１タンパク質の発現が、宿主細胞における、野生型ポリヌクレオチドによってコードされるプレセニリン１タンパク質の発現レベルよりも高く、それにより、プレセニリン１タンパク質を生成する、前記培養すること
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもと、２０１９年１１月２９日に出願された米国特許出願第６２／９４２，０５９号及び２０２０年４月２日に出願された米国特許出願第６３／００４，４２２号の優先権の利益を主張するものであり、いずれもその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもと、２０１９年１１月２９日に出願された米国特許出願第６２／９４２，０５９号及び２０２０年４月２日に出願された米国特許出願第６３／００４，４２２号の優先権の利益を主張するものであり、いずれもその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表の組み込み
添付の配列表の資料は、本明細書において参照により本出願に組み込まれる。添付の配列表のテキストファイル、名称「ＡＰＲＥＳ１１１０＿２ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」（１０５ｋｂ）は、２０２０年１１月２４日に作成された。このファイルには、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＯＳを使用するコンピューターでＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄを使用してアクセスすることができる。
添付の配列表の資料は、本明細書において参照により本出願に組み込まれる。添付の配列表のテキストファイル、名称「ＡＰＲＥＳ１１１０＿２ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」（１０５ｋｂ）は、２０２０年１１月２４日に作成された。このファイルには、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＯＳを使用するコンピューターでＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄを使用してアクセスすることができる。
【0003】
技術分野
本開示は、概して神経変性障害に対する遺伝子療法に関し、より具体的には、治療遺伝子の送達のためのポリヌクレオチド及び発現カセットに関する。特定の実施形態では、治療遺伝子はプレセニリン－１である。
本開示は、概して神経変性障害に対する遺伝子療法に関し、より具体的には、治療遺伝子の送達のためのポリヌクレオチド及び発現カセットに関する。特定の実施形態では、治療遺伝子はプレセニリン－１である。
【背景技術】
【0004】
背景情報
アルツハイマー病（ＡＤ）はアルツハイマーとも呼ばれ、神経変性認知症の主因である慢性神経変性疾患である。症状として、記憶障害、言語障害、失見当識、気分変動、意欲減退、ならびに家族及び社会からの逃避のような他の行動障害が挙げられる。身体機能が徐々に失われ、最終的には死に至る。この疾患は１０年超にわたり持続する可能性があるものの、診断後３～９年が平均余命である。
アルツハイマー病（ＡＤ）はアルツハイマーとも呼ばれ、神経変性認知症の主因である慢性神経変性疾患である。症状として、記憶障害、言語障害、失見当識、気分変動、意欲減退、ならびに家族及び社会からの逃避のような他の行動障害が挙げられる。身体機能が徐々に失われ、最終的には死に至る。この疾患は１０年超にわたり持続する可能性があるものの、診断後３～９年が平均余命である。
【0005】
この疾患は、主に脳内でのアミロイド斑の局在及びニューロンの神経原線維変性といった多様な神経病理学的特徴に付随して発生する。この疾患の病因は複雑だが、ＡＤ症例の約１０％に、常染色体優性形質として遺伝する家族性のものが現れる。このような遺伝型ＡＤには、少なくとも４種の異なる遺伝子が存在しており、その変異体のいくつかは、この疾患に対する遺伝的感受性を付与する。アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子のσ４（Ｃｙｓ１１２Ａｒｇ）対立遺伝子多型は、晩年に発症した症例の相当数においてＡＤと関連していた。６５歳以前に発症した家族性症例のごく一部は、２１番染色体上のβ－アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の突然変異に関連していた。近年、染色体１４ｑ２４．３上に、早発型ＡＤ症例の多数に関連する第３の遺伝子座が同定された。遺伝性の早発型ＡＤの大部分（７０～８０％）は、１４番染色体と対応し、タンパク質プレセニリン－１（ＰＳ１）内の２０超の異なるアミノ酸置換の１つに起因するとみられる。頻度は低いものの、１番染色体上の同様のＡＤリスク遺伝子座は、タンパク質プレセニリン－２（ＰＳ－２、ＰＳ－１と高相同性）をコードしている。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、神経変性障害の治療のための、プレセニリン－１（ＰＳＥＮ－１）をコードするポリヌクレオチド及び核酸発現カセットに関する。
【0007】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１２（アイソフォームＸ１）または配列番号１４（アイソフォームＸ２）のいずれかに示す天然に存在するヒトプレセニリン－１アミノ酸配列をコードする、単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡを提供し、当該単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、天然に存在するＰＳＥＮ－１ Ｘ１アイソフォームのコード配列（配列番号１５）またはＰＳＥＮ－１ Ｘ２アイソフォームのコード配列（配列番号１３）に対応するｃＤＮＡと比較して、少なくとも２５％の許容コドンにコドン最適化変更を含む。本実施形態のいくつかの態様では、単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡのＰＳＥＮ－１コード配列において、どの非許容コドンも改変されない。本実施形態のいくつかの態様では、単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、ＰＳＥＮ－１コード配列の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはすべての許容コドンにコドン最適化変更を含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１２（アイソフォームＸ１）または配列番号１４（アイソフォームＸ２）のいずれかに示す天然に存在するヒトプレセニリン－１アミノ酸配列をコードする、単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡを提供し、当該単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、２０個以下のＣｐＧジヌクレオチドを含む。これは、それぞれがＰＳＥＮ１オープンリーディングフレームに２３個のＣｐＧジヌクレオチドを有する配列番号１または配列番号１３と比較して減少している。これらの実施形態において、配列番号１または配列番号１３に存在する任意のＣｐＧジヌクレオチドの置換は、シトシンまたはグアニンのいずれか（または両方）を、遺伝暗号の冗長性により、置換されたヌクレオチドを含有するコドンによってコードされるアミノ酸を改変しない別のヌクレオチドに置換することにより行われる必要がある。換言すれば、ＣｐＧジヌクレオチドの除去に利用されるどのヌクレオチド置換も、配列番号１または配列番号１３によってコードされるアミノ酸配列を保存している必要がある。これらの実施形態のいくつかの態様では、単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、配列番号１または配列番号１３に存在するＣｐＧジヌクレオチドを、１５個未満、１２個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、１個含むか、またはまったく含まない。これらの実施形態のいくつかの態様では、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少している単離ｃＤＮＡまたは人工遺伝子において、配列番号１または配列番号１３に存在するすべての非許容コドンが保存されている。
【0009】
いくつかの実施形態では、単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、配列番号１または配列番号１３に存在する少なくとも２５％の許容コドンにコドン最適化変更を含み、２０個以下のＣｐＧジヌクレオチドを含む。これらの実施形態のいくつかの態様では、単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、ＰＳＥＮ－１コード配列の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはすべての許容コドンにコドン最適化変更を含む。これらの実施形態のいくつかの態様では、単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、ＣｐＧジヌクレオチドを、１５個未満、１２個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、１個含むか、またはまったく含まない。これらの実施形態のいくつかの態様では、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少している単離ｃＤＮＡまたは人工遺伝子において、配列番号１または配列番号１３に存在するすべての非許容コドンが保存されている。
【0010】
いくつかの実施形態では、本開示は、１）配列番号１及び配列番号１３のｃＤＮＡの生成に使用される、２つの選択的スプライスドナー部位を有する天然に存在するＰＳＥＮ－１エキソン３の少なくとも一部または全部；２）イントロン３の部分が、スプライスアクセプター部位を含む、天然に存在するＰＳＥＮ－１イントロン３の少なくとも一部；ならびに３）選択的スプライスドナー部位の使用により、配列番号１２（アイソフォームＸ１）及び配列番号１４（アイソフォームＸ２）両方の発現についてコードできるヌクレオチド配列を含む、ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡを提供し、当該ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、ａ）７０％未満の天然に存在するＰＳＥＮ－１イントロン３を含み、ｂ）７０％未満の天然に存在するＰＳＥＮ－１イントロン４を含み、ｃ）天然に存在するＰＳＥＮ－１イントロン５、６、７、８、または９の少なくとも１つを欠失し、及び／またはｄ）４．４ｋｂ長未満である。これらの実施形態のいくつかの態様では、配列番号１２（アイソフォームＸ１）または配列番号１４（アイソフォームＸ２）のいずれかに示す天然に存在するヒトプレセニリン－１アミノ酸配列をコードする、ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡの一部は、天然に存在するＰＳＥＮ－１ Ｘ１アイソフォームのコード配列（配列番号１５）またはＰＳＥＮ－１ Ｘ２アイソフォームのコード配列（配列番号１３）に対応するｃＤＮＡと比較して、少なくとも２５％の許容コドンにコドン最適化変更を含む。これらの実施形態のいくつかの態様では、配列番号１２（アイソフォームＸ１）または配列番号１４（アイソフォームＸ２）のいずれかに示す天然に存在するヒトプレセニリン－１アミノ酸配列をコードする、ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、ヌクレオチド配列全体で５０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、ＰＳＥＮ－１コード配列に２０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、配列番号１５または配列番号１３において、少なくとも３０％の許容コドンにコドン最適化変更、ヌクレオチド配列全体で５０個未満のＣｐＧジヌクレオチド、ＰＳＥＮ－１コード配列に２０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含み、配列番号１または配列番号１３のどの非許容コドンにも変更がない。本段落に示すいずれかの態様のいくつかのさらに具体的な変形例では、ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、ヌクレオチド配列全体で、ＣｐＧジヌクレオチドを、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１５個未満、１２個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、１個含むか、またはまったく含まない。本段落に示すいずれかの態様のいくつかのさらに具体的な変形例では、ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、ＰＳＥＮ－１コード領域に、ＣｐＧジヌクレオチドを、１５個未満、１２個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、１個含むか、またはまったく含まない。本段落に示すいずれかの態様のいくつかのさらに具体的な変形例では、ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、配列番号１５または配列番号１３のＰＳＥＮ－１コード配列の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはすべての許容コドンにコドン最適化変更を含む。
【0011】
本明細書に記載されるのは、いくつかの実施形態では、配列番号６、配列番号７、もしくは配列番号８に示す単離ポリヌクレオチド、または配列番号６、配列番号７、もしくは配列番号８に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡは、配列番号６（ｃＤＮＡ）、配列番号７（ｃＤＮＡ）、または配列番号８（ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡ）であるか、あるいは配列番号６、配列番号７、または配列番号８に対して少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号６、配列番号７、または配列番号８それぞれと同じアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に対して少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号６、配列番号７、または配列番号８それぞれと同じアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、そこに存在する非許容コドンを維持し、（１）そこに存在するすべての最適化コドンを維持するか、または（２）その中の１つ以上の最適化コドンが、同じアミノ酸をコードしかつ最適化されている他のコドンで置換されている。
【0012】
本明細書に記載されるのは、いくつかの実施形態では、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に示す単離ポリヌクレオチド、または配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９のそれぞれによってコードされる同じアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。これらの実施形態のいくつかの態様では、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドは、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９と同じアミノ酸配列をコードし、そこに存在する非許容コドンを維持し、（１）そこに存在するすべての最適化コドンを維持するか、または（２）その中の１つ以上の最適化コドンが、同じアミノ酸をコードしかつ最適化されている他のコドンで置換されている。これらの実施形態のいくつかの態様では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号３６である。これらの実施形態のいくつかの態様では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号３７である。これらの実施形態の別の態様では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号３８である。これらの実施形態の別の態様では、単離ポリヌクレオチドは、配列番号３９である。
【0013】
ある特定の実施形態では、本開示は、上記に示すプレセニリン１をコードするｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡポリヌクレオチドのいずれかを含む核酸発現カセットを提供する。
【0014】
ある特定の実施形態では、核酸発現カセットは、５’ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）をコードする配列、任意のエンハンサーを有するプロモーター、プレセニリン１をコードするポリヌクレオチド、及び３’ＡＡＶ ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、核酸発現カセットは、全長ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び全長３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、核酸発現カセットは、Ｄ配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している５’ＩＴＲの短縮型（ΔＩＴＲと称される）を含む（Ｘ．Ｓ．Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５０：５７３－５８０，１９９５；Ｘ．Ｓ．Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：１６６８－１６７７，１９９６）；Ｃ．Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．Ｊａｎ ２０１５，８９（２）９５２－９６１；ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２５８１－１４）。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、カプシドのＡＡＶ起源とは異なる起源から選択される。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、選択された細胞受容体、標的組織、またはウイルス標的に対して特定の有効性を有するＡＡＶカプシドでの使用に合わせて選択することができる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９に由来する。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、またはその欠失型（ΔＩＴＲ）であるが、他のＡＡＶ源由来のＩＴＲを選択することができる。ＩＴＲの起源が、あるＡＡＶ血清型由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ血清型由来である場合、得られたベクターを偽型と称する場合がある。ある特定の実施形態では、ＩＴＲ及びカプシドは、ＡＡＶ９由来である。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、一本鎖または自己相補的ＡＡＶベクター由来である。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、発現カセットの一部であり得るが、別の実施形態では、ＩＴＲは、発現カセットをクローニングするベクターの一部であり得る。
【0015】
いくつかの実施形態では、１つ以上の調節要素は、配列番号５に示すポリヌクレオチド、または配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列などのコザック翻訳開始シグナルを含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、１つ以上の調節要素が、配列番号４に示すポリヌクレオチド、または配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列などのクロマチンインスレーター配列を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、１つ以上の調節要素が、プロモーターを含む。これらの実施形態のいくつかの態様では、プロモーターはニューロン特異的プロモーターである。ニューロン特異的プロモーターは、（ｉ）配列番号２に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）配列番号３に示すポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）配列番号２もしくは配列番号３の機能的断片；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドを含み得る。これらの実施形態の別の態様では、プロモーターは、ＣＡＧ（配列番号２３）、ＣＢＡ（配列番号２４）、ＵＢＣ（配列番号２５）、ＰＧＫ（配列番号２６）、ＰＫＣ、ＥＦ１ａ（配列番号２７）、ＧＵＳＢ、ＣＭＶ（配列番号２８）、ＮＳＥ（配列番号２９）、ＰＤＧＦ、デスミン、ＭＣＫ、ＭｅＣＰ２（配列番号３０）、ＧＦＡＰ（配列番号３１）、ＣａＭＫＩＩ、またはＭＢＰから選択される。
【0018】
いくつかの実施形態では、１つ以上の調節要素は、少なくとも１つのｍＲＮＡ安定性要素を含む。少なくとも１つのｍＲＮＡ安定性要素は、（ｉ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１の機能的バリアント；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み得る。これらの実施形態のいくつかの態様では、核酸発現カセットは、ＰＳＥＮ１をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの５’に位置するｍＲＮＡ安定性要素；及びポリアデニル化シグナルの３’に位置するｍＲＮＡ安定性要素を含む。ある特定の実施形態では、核酸発現カセットは、１つ以上のポリアデニル化エンハンサー要素、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列、ウサギベータ－グロビン（ｒＢＧ）ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列などを含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、１つ以上の調節要素は、後根神経節でのコードされるＰＳＥＮ－１の発現を抑制するためのマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」または「ｍｉＲ」）結合部位を１つ、２つ、または３つ含む。マイクロＲＮＡは１９～２５ヌクレオチドの非コードＲＮＡであり、ｍｉＲＮＡ結合部位に結合して、核酸分子の安定性を低下させるか、または翻訳を阻害することにより、遺伝子発現を下方制御する。これらの実施形態のいくつかの態様では、各ｍｉＲＮＡ結合部位は、以下のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ－１９１４、ｍｉＲ１１８１、ｍｉＲ３９１８、ｍｉＲ９３９、ｍｉＲ３２４、ｍｉＲ６５０、ＭｉＲ２９Ｃ、またはｍｉＲ２２７７のいずれかの結合部位から独立して選択される。これらの実施形態のいくつかの態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）は、ウイルスゲノムのコード配列に対して３’側に位置する。
【0020】
他の実施形態は、本明細書で提供される核酸発現カセットを含むベクターを提供する。ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／ｒｈ１０、ＡＡＶ２／１１、またはＡＡＶ２／１２であり得る。
【0021】
本明細書に記載されるベクターは、偽型ベクターであり得る。偽型化は、ベクターの標的細胞集団を調整するメカニズムを提供する。偽型ベクターは、あるベクターのゲノム、例えば、あるＡＡＶ血清型のゲノムを、第２のベクター、例えば、第２のＡＡＶ血清型のカプシド内に含む。レンチウイルスベクターは、ラブドウイルス小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）血清型（インディアナ株及びチャンディプラ株）、狂犬病ウイルス（例えば、様々なＥｖｅｌｙｎ－Ｒｏｋｉｔｎｉｃｋｉ－Ａｂｅｌｓｅｔｈ（ＥＲＡ）株及び攻撃ウイルス標準（ＣＶＳ））、リッサウイルスモコラウイルス、狂犬病関連ウイルス、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、モコラウイルス（ＭＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶ－Ｇ）、糖タンパク質Ｂ型（ＦｕＧ－Ｂ）、ＦｕＧ－Ｂのバリアント（ＦｕＧ－Ｂ２）、またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）に由来するエンベロープ糖タンパク質をもつ偽型であり得る。ウイルスは、１つ以上のニューロンまたは細胞群の形質導入のために偽型化される場合がある。
【0022】
他の実施形態では、（ｉ）上記に示すプレセニリン１をコードするｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡポリヌクレオチドのいずれか；（ｉｉ）コザック翻訳開始シグナル；（ｉｉｉ）ニューロン特異的プロモーター；（ｉｖ）クロマチンインスレーター配列；（ｖ）少なくとも１つのｍＲＮＡ安定性要素；または（ｖ）それらの任意の組み合わせを含む、核酸発現カセットを提供する。これらの実施形態のいくつかの態様では、核酸発現カセットは、（ｉ）上記に示すプレセニリン１をコードするｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡポリヌクレオチドのいずれか；（ｉｉ）コザック翻訳開始シグナル；（ｉｉｉ）ニューロン特異的プロモーター；（ｉｖ）クロマチンインスレーター配列；及び（ｖ）少なくとも１つのｍＲＮＡ安定性要素をそれぞれ含む。これらの実施形態のより具体的な態様では、コザック翻訳開始シグナルは、配列番号５に示すポリヌクレオチドを含み、クロマチンインスレーター配列は、配列番号４に示すポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つのｍＲＮＡ安定性要素は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１に示すポリヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを含み、ニューロン特異的プロモーターは、配列番号２または配列番号３に示すポリヌクレオチドを含む。
【0023】
本明細書に記載されるのは、核酸発現カセットまたはベクターを、その必要のある対象に投与することを含む、神経変性疾患、障害、または病態を治療する方法である。いくつかの実施形態では、神経変性疾患、障害、または病態は、アルツハイマー病、後部皮質萎縮症（ＰＣＡ）、ロゴペニック型進行性失語症（ｌｖＰＰＡ）、海馬温存ＡＤ、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、ピック病、レヴィ小体認知症、失語型ＡＤ、行動障害（「前頭」）型ＡＤ、遂行機能障害型、記憶喪失、認知障害、または軽度の認知障害である。
【0024】
本明細書に記載されるのは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に示す最適化ポリヌクレオチド、または配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有し、前述のそれぞれによってコードされる同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはプレセニリン１最適化ポリヌクレオチドをコードするベクターで宿主細胞を形質転換し、プレセニリン１タンパク質の発現を可能にする条件下及び時間で細胞を培養することを含む、プレセニリン１タンパク質を生成する方法である。いくつかの態様では、宿主細胞における、最適化ポリヌクレオチドによってコードされるプレセニリン１タンパク質の発現レベルが、宿主細胞における、野生型ポリヌクレオチドによってコードされるプレセニリン１タンパク質の発現レベルよりも高く、それによりプレセニリン１タンパク質を生成する。
【0025】
本明細書に記載の様々な実施形態の特性の１つ、一部、または全部を組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成できるものと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】ＣＭＶプロモーターの制御下で、様々なコドン最適化型のプレセニリン－１コード配列を含む構築物を有するＨＥＫ２９３細胞から発現するプレセニリン－１タンパク質の量、ならびに野生型プレセニリン－１コード配列からの量を示す棒グラフである。アスタリスク「＊」は、統計的有意差を示す（ｐ＜０．０５、一元配置分散分析後、テューキーの多重比較検定）。
【図2】ＣＡＧプロモーター（配列番号３７のＰＳＥＮ１コード配列を含有するＣＡＧ－ｖ１．５；配列番号３９のＰＳＥＮ１コード配列を含有するＣＡＧｖ３．０）によって発現が誘導される、様々なコドン最適化型のプレセニリン－１コード配列を含む構築物を有するＨＥＫ２９３細胞から発現するプレセニリン－１タンパク質の量、ならびにＣＡＧプロモーターによって誘導される野生型プレセニリン－１コード配列（配列番号１５）からの量を示す棒グラフである。アスタリスク「＊」は、野生型プレセニリン１と比較した統計的有意差を示す（ｐ＜０．０５、一元配置分散分析後、テューキーの多重比較検定）。
【図3】ＰＳＥＮ１にＣ４１０ＹまたはＧ２０６Ａ突然変異のいずれかを有する、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）患者由来の線維芽細胞において、ＮｏｔｃｈΔＥのＮＩＣＤへの切断により測定されるガンマセクレターゼ活性を示す棒グラフである。空のベクター（「ＮｏｔｃｈΔＥ＋空」）、またはガンマセクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴの存在下もしくは非存在下での、ＰＳＥＮ１をコードする配列番号３７を含有するベクター（「ＮｏｔｃｈΔＥ＋ｈＰＳＥＮｖｌ．５」）を線維芽細胞に形質転換し、ＮＩＣＤのレベルを測定した。アスタリスク「＊＊」は、空のベクターと比較した統計的有意差を示す（ｐ＜０．０１、一元配置分散分析後、テューキーの多重比較検定）。
【図4】ＰＳＥＮ１にＣ４１０Ｙ突然変異を有する、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）患者由来の線維芽細胞における、空のベクター（「空」）またはＰＳＥＮ１をコードする配列番号３７を含有するベクター（「ｐＡＴ０２８」）のいずれかによる形質転換後のＡβ４０生成のレベルを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0027】
詳細な説明
本発明は、プレセニリン－１などの最適化治療遺伝子をコードする最適化ポリヌクレオチド及び発現カセットを使用すると、野生型配列と比較して治療遺伝子の発現レベルを増加させ、神経変性障害の治療に用いるための遺伝子療法を提供できるという独創的な発見に基づく。
本発明は、プレセニリン－１などの最適化治療遺伝子をコードする最適化ポリヌクレオチド及び発現カセットを使用すると、野生型配列と比較して治療遺伝子の発現レベルを増加させ、神経変性障害の治療に用いるための遺伝子療法を提供できるという独創的な発見に基づく。
【0028】
本発明の組成物及び方法を記載するにあたり、記載される特定の組成物、方法、及び条件は変更することができるため、本発明は、そのような組成物、方法、及び実験条件に限定されないものと理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は特定の実施形態の記載のみを目的としており、限定を意図しないものと理解されるべきである。
【0029】
本明細書で言及される刊行物、特許、及び特許出願はすべて、個別の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれた場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【0030】
定義
特に具体的な定義のない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、及び生化学）に共通して理解されているものと同じ意味を有すると解釈されるものとする。本明細書に記載するものと同様または同等であるいかなる方法及び材料も本発明の実施または試験に使用することができるが、この改変例及び変形例は本開示の趣旨及び範囲内に包含されると理解されることになる。ここでは好ましい方法及び材料について記載する。
特に具体的な定義のない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、及び生化学）に共通して理解されているものと同じ意味を有すると解釈されるものとする。本明細書に記載するものと同様または同等であるいかなる方法及び材料も本発明の実施または試験に使用することができるが、この改変例及び変形例は本開示の趣旨及び範囲内に包含されると理解されることになる。ここでは好ましい方法及び材料について記載する。
【0031】
本明細書で使用される場合、数値または範囲の文脈における「約」という用語は、文脈がより限定された範囲を必要としない限り、列挙または特許請求される数値または範囲の±１０％を意味する。さらに、「約」という用語は、１つ以上の数または数範囲に関連して使用される場合、範囲内の数すべてを包含する当該数すべてを指し、示された数値の上下の境界を拡張することによってその範囲が変更されることを理解する必要がある。端点による数値範囲の列挙には、その範囲内及びその範囲内の任意の範囲に包含される数すべて、例えば、その小数部を含む整数が含まれる（例えば、１～５という列挙には、１、２、３、４、及び５に加え、その小数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１などが含まれる）。
【0032】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈によって特に明示されない限り、複数形も包含することを意図する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、またはそれらの変形は、詳細な説明及び／または特許請求の範囲のいずれかで使用される場合に限り、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という用語と類似する方法で包括的であることを意図する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈によって特に明示されない限り、複数の指示対象物を包含することに留意されたい。したがって、例えば「タンパク質」に関する言及は、１つ以上のタンパク質への言及であり、当業者などに公知であるその同等物を含む。
【0033】
本明細書で使用される場合、定義または記載される、品目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの構成要素を参照する、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含まれた（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」という用語、及びそれらの変形は、包括的または非限定的であることを意図し、追加の要素を許容することにより、定義または記載される、品目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどが、指定されるその構成要素、または必要に応じてその同等物を包含すること、また他の構成要素を含むことができ、かつ定義される品目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの範囲／定義の範囲内であることを示す。
【0034】
「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ６などを含むがこれらに限定されない、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、１種以上のＡＡＶ野生型遺伝子の全体または一部、好ましくはｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子を欠失していてもよいが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持する。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、及びパッケージングに必要である。したがって、本明細書でＡＡＶベクターは、ウイルスの複製及びパッケージングの際にｃｉｓに要求されるそれらの配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を少なくとも含むものと定義される。機能的なレスキュー、複製、及びパッケージングのために配列が提供される限り、ＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換により改変されていてもよい。
【0035】
制御要素は、哺乳動物細胞において機能するように選択される。得られる構築物は、機能的に連結された構成要素を含有しており、機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列と結合されている（５’及び３’）。「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの両端に存在することが当技術分野で認められている領域を意味し、ＤＮＡ複製の起点として、及びウイルスのパッケージングシグナルとしてｃｉｓで共に機能する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と共に、２つの隣接ＩＴＲ間に挿入されたヌクレオチド配列からの効率的な削除及びレスキュー、ならびに哺乳動物細胞ゲノムへの組み込みを提供する。ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、必ずしも野生型ヌクレオチド配列を含むとは限らず、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換により改変されていてもよい。加えて、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ６などを含むがこれらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれに由来してもよい。さらに、ＡＡＶベクター内の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’のＩＴＲは、意図される通りに機能する、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの対象となる配列の削除及びレスキューを可能にし、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在する場合に、レシピエント細胞ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にする限り、同じＡＡＶ血清型または分離株と必ずしも同一である必要も、それに由来する必要もない。加えて、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６などを含むがこれらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれに由来してもよい。さらに、ＡＡＶ発現ベクター内の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’のＩＴＲは、意図される通りに機能する、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの対象となる配列の削除及びレスキューを可能にし、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在する場合に、レシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡ分子の組み込みを可能にする限り、同じＡＡＶ血清型または分離株と必ずしも同一である必要も、それに由来する必要もない。
【0036】
「野生型」及び「天然」という用語は、本明細書で同義に使用され、自然界に存在する形態の物質（例えば、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を指す。本明細書で使用される「野生型プレセニリン－１コード配列」という用語は、配列番号１５に示すポリヌクレオチド配列を意味する。
【0037】
本明細書で使用される「ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡ」という用語は、タンパク質（例えば、ヒトプレセニリン－１）をコードする天然に存在しないヌクレオチド配列を意味し、タンパク質のコード配列が、１つ以上の非コードイントロン配列によって中断される。
【0038】
本明細書で使用される「非許容コドン」という用語は、同じアミノ酸配列をコードする、対応する対象ヌクレオチド配列において変更されない、参照ヌクレオチド配列に存在するコドンを意味する。配列番号１５の非許容コドンを下線で示す。
【0039】
本明細書で使用される「許容コドン」という用語は、非許容コドンではない、参照ヌクレオチド配列に存在するコドンを意味する。許容コドンは、同じアミノ酸配列をコードする、対応する対象ヌクレオチド配列において、同じアミノ酸をコードする異なるコドンに変更される場合がある。
【0040】
「最適化コドン」という用語は、表２または表３に示すコドンを意味する。対象ヌクレオチド配列中のコドンは、参照配列中の対応するコドンが、同じアミノ酸をコードする異なるコドンに置換される場合に「最適化された」と呼ばれ、表１または表２に示すコドンから選択される。
【0041】
「コドン最適化変更」という用語は、参照配列中の許容コドンを、表２から選択される、同じアミノ酸をコードするコドンで置換することを意味する。いくつかのアミノ酸については、複数の最適化コドンが存在する（表２を参照）。明確性を目的として、「コドン最適化変更」という用語は、参照配列に存在する最適化コドンを、表１に示す同じアミノ酸をコードする異なる最適化コドンで置換することを含む。
【0042】
ＰＳＥＮ１遺伝子のエキソン及びイントロンは、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列番号ＮＧ＿００７３８６を参照して、以下のように同定することができる。エキソン１はヌクレオチド５０３７～５１１３からなり；イントロン１はヌクレオチド５，１１４～１６，３２４からなり；エキソン２はヌクレオチド１６，３２５～１６，４０６からなり；イントロン２はヌクレオチド１６，４０７～１６，４９６からなり；エキソン３はヌクレオチド１６，４９７～１６，６３６からなり；イントロン３はヌクレオチド１６，６３７～３９，３２６からなり；エキソン４はヌクレオチド３９，３２７～３９，５７７からなり；イントロン４はヌクレオチド３９，５７８～４２，０９５からなり；エキソン５はヌクレオチド４２，０９６～４２，２３７からなり；イントロン５はヌクレオチド４２，２３８～５５，３８２からなり；エキソン６はヌクレオチド５５，３８３～５５，４５０からなり；イントロン６はヌクレオチド５５，４５１～６１，１７３からなり；エキソン７はヌクレオチド６１，１７４～６１，３９４からなり；イントロン７はヌクレオチド６１，３９５～６６，５６０からなり；エキソン８はヌクレオチド６６，５６１～６６，６５９からなり；イントロン８はヌクレオチド６６，６６０～７４，９１５からなり；エキソン９はヌクレオチド７４，９１６～７５，００２からなり；イントロン９はヌクレオチド７５，００３～８０，２９８からなり；エキソン１０はヌクレオチド８０，２９９～８０，４７２からなり；イントロン１０はヌクレオチド８０，４７３～８５，６５５からなり；エキソン１１はヌクレオチド８５，６５６～８５，７７６からなり；イントロン１１はヌクレオチド８５，７７５～８７，６６３からなり；エキソン１２はヌクレオチド８７，６６４～９２，２２２からなる。
【0043】
「ＣｐＧジヌクレオチド」という用語は、参照ヌクレオチド配列中でのヌクレオチド配列ＣＧの任意の出現を意味する。
【0044】
「自己相補的ＡＡＶ」とは、組換えＡＡＶ核酸配列が保持するコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計された構築物を指す。感染時に、第２の鎖の細胞媒介性の合成を待機するのではなく、ｓｃＡＡＶの２つに分かれた相補的な部分が会合して、即座に複製及び転写されるように準備された１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照のこと。自己相補的ＡＡＶについては、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号：及び同第７，４５６，６８３号に記載されており、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0045】
本明細書で使用される場合、「機能的に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」、「機能的な連結」、「機能的に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」、またはそれらの文法上の等価表現は、遺伝子要素、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはＲＮＡ、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの要素が、意図された方法で機能することを可能にするような関係にある並置を指す。例えば、プロモーター配列及び／またはエンハンサー配列を含み得る調節要素は、調節要素がコード配列の転写開始を補助する場合、コード領域に機能的に連結されている。この機能的関係が維持されている限り、調節要素とコード領域との間に介在する残基が存在していてもよい。
【0046】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、「または」という用語は、特に内容が明示されない限り、概して、「及び／または」を含む意味で用いられる。
【0047】
参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する「同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後に、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列中の核酸またはアミノ酸と同一である候補配列中の核酸またはアミノ酸の比率であると定義される。核酸またはアミノ酸の配列同一性パーセントの決定を目的としたアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、またはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアなどの公共のコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の能力の範囲内である様々な方法で行うことができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、配列のアラインメントに適するパラメーターを決定することができる。例えば、配列同一性パーセント値は、配列比較コンピュータープログラムＢＬＡＳＴを使用して生成することができる。例示として、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと比較して（ｔｏ，ｗｉｔｈ，ｏｒ ａｇａｉｎｓｔ）、所与の核酸またはアミノ酸配列Ａの配列同一性パーセント（あるいは、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと比較してある特定の配列同一性パーセントを有する所与の核酸またはアミノ酸配列Ａと表現することができる）は、以下のように計算される：
１００×（分率Ｘ／Ｙ）
ここでのＸは、配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）のＡとＢとのアラインメントにおいて、そのプログラムによって、完全一致として採点されたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂの総核酸数である。核酸またはアミノ酸配列Ａの長さが核酸またはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの配列同一性パーセントは、Ａに対するＢの配列同一性パーセントと等しくならないことが理解されよう。
１００×（分率Ｘ／Ｙ）
ここでのＸは、配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）のＡとＢとのアラインメントにおいて、そのプログラムによって、完全一致として採点されたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂの総核酸数である。核酸またはアミノ酸配列Ａの長さが核酸またはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの配列同一性パーセントは、Ａに対するＢの配列同一性パーセントと等しくならないことが理解されよう。
【0048】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドまたは遺伝子発現」という用語は、核酸配列またはポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物などへ）転写されるプロセス、及び／または転写されたｍＲＮＡが、それに続いて、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、「ポリヌクレオチドまたは遺伝子産物」と総称される場合がある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。「ポリヌクレオチドまたは遺伝子発現」及び「発現」という用語は、文脈によって特に明示されない限り、同義に使用することができる。
【0049】
本明細書で使用される場合、「プレセニリン－１」という用語は、ＰＳＥＮ１遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。プレセニリン１は、プレセニリン複合体の４つのコアタンパク質の１つであり、ガンマセクレターゼを含め、細胞内のいくつかのタンパク質の制御性タンパク質分解事象を媒介する。ガンマセクレターゼは、ベータ－アミロイド前駆体タンパク質からのベータアミロイドの生成に強く関与すると考えられており、ベータアミロイドの蓄積はアルツハイマー病の発症に関連している。選択的スプライシングに基づいて、ＰＳＥＮ１遺伝子によってコードされるプレセニリン－１には２つの形態がある。ヒトの優勢形態は、４６７アミノ酸のアイソフォームＸ１である。別の形態は、４６３アミノ酸のアイソフォームＸ２である。プレセニリン－１、プレセニリン２（ＰＳＥＮ２）、及びアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は主として、常染色体優性型の早発型アルツハイマー病に関連している。
【0050】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるために必要である、細胞の合成機構または誘導される合成機構によって認識されるＤＮＡ配列であると定義される。「構成的」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理的条件下で、その遺伝子産物を細胞内で生成させるヌクレオチド配列である。「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、そのプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在する場合のみ、実質的にその遺伝子産物を細胞内で生成させるヌクレオチド配列である。「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、細胞がそのプロモーターに対応する組織型の細胞である場合のみ、実質的にその遺伝子産物を細胞内で生成させるヌクレオチド配列である。代わりに、異種制御配列を用いてもよい。有用な異種制御配列として、概ね、哺乳動物遺伝子またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものが挙げられる。例として、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＣＡＧ、神経細胞プロモーター、ドーパミン－１受容体及びドーパミン－２受容体のプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、マウスのメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子に由来する配列もまた、本明細書で使用される。そのようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。本発明の目的として、異種プロモーター及び他の制御要素の両方、例えば、ＣＮＳ特異的プロモーター及び誘導性プロモーター、エンハンサーなどが特に有用である。異種プロモーターの例として、ＣＭＶプロモーターが挙げられる。ＣＮＳ特異的プロモーターの例として、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、及びニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）の遺伝子から単離されたものが挙げられる。
【0051】
本明細書で使用される場合、「調節要素」という用語は、単独で、または１つ以上の追加の調節要素と共に、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現に影響を及ぼすかまたは調整する遺伝子要素またはポリヌクレオチドを指す。調節要素は、ポリヌクレオチドもしくは遺伝子の発現を促進すること、ポリヌクレオチドもしくは遺伝子の発現を増加させること、ポリヌクレオチドもしくは遺伝子の発現を減少させること、及び／または特定の細胞型もしくは組織において選択的なポリヌクレオチドもしくは遺伝子の発現を与えることができる。調節要素は、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現に時間的及び／または空間的に影響を及ぼすか、または調整することができる。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現を調節する」、「ポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現に影響を及ぼす」、または「ポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現を調整する」という用語は、ポリヌクレオチドもしくは遺伝子の発現を増加させること、ポリヌクレオチドもしくは遺伝子の発現を減少させること、及び／または選択的なポリヌクレオチドもしくは遺伝子の発現を与えることを指す。「ポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現を調節すること」、「ポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現に影響を及ぼすこと」、または「ポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現を調整すること」は、時間的及び／または空間的な調節を指すことがある。
【0052】
本明細書で「導入遺伝子」は、細胞または生物への導入を意図するかまたは導入されたポリヌクレオチドまたは核酸を指して利便に使用される。導入遺伝子として、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子などの任意の核酸が挙げられる。
【0053】
ポリヌクレオチド配列の文脈で使用される場合、「バリアント」という用語は、野生型遺伝子に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義には、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」、または「多型」のバリアントも含まれ得る。スプライスバリアントは、参照分子と顕著な同一性を有する場合があるが、ｍＲＮＡのプロセシング中のエキソンの選択的スプライシングに起因して、ポリヌクレオチド数が増減するのが一般的である。対応するポリペプチドは、追加の機能的ドメインまたはドメインの欠失を有し得る。種バリアントは、種ごとに異なるポリヌクレオチド配列である。本発明において特に有用なものは、野生型遺伝子産物のバリアントである。バリアントは、核酸配列の少なくとも１つの突然変異により生じる可能性があり、改変ｍＲＮＡ、または構造もしくは機能が改変される場合と改変されない場合があるポリペプチドをもたらし得る。所与の天然遺伝子または組換え遺伝子は、対立遺伝子型をもたないか、１つまたは多数もつ場合がある。バリアントを生じさせる一般的な突然変異的変更は、概してヌクレオチドの自然な欠失、付加、または置換に起因する。この種の変更はそれぞれ、単独で、または他のものと組み合わせて、所与の配列に１回以上発生する場合がある。
【0054】
範囲：本開示の全体を通じて、本発明の様々な態様を、範囲形式で提示することができる。範囲形式による記載は、単に便宜上かつ簡潔性のためであって、本発明の範囲に対する不変の限定と解釈されるべきではないと理解すべきである。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内におけるすべての可能な部分範囲のほか、個々の数値も明確に開示されているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲のほか、その範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．１、２．２、２．７、３、４、５、５．５、５．７５、５．８、５．８５、５．９、５．９５、５．９９及び６も、明確に開示されているとみなされるべきである。これは範囲の幅とは関係なく適用される。
【0055】
本開示は、アルツハイマー病、ならびに他の神経変性の疾患、障害、及び病態を有する対象を治療するための組成物及び方法を提供する。特定の態様では、本開示は、治療を必要とする対象にプレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）遺伝子をコードするポリヌクレオチドを提供することによる遺伝子療法を企図する。アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳の神経変性疾患の最も一般的な形態である。ＡＤの病理学的特徴として、異常なタウタンパク質からなる、対らせん状細線維の神経細胞内蓄積と、神経突起斑におけるβ－アミロイドペプチド（Ａβ）の細胞外沈着が挙げられる。臨床上、ＡＤは発症年齢に基づいて、早発型ＡＤ（ＥＯＡＤ；６５歳未満）と遅発型ＡＤ（ＬＯＡＤ；６５歳超）という２つの表現型に分類することができる。そのうち、ＬＯＡＤは、全世界でよくみられる形態である。全ＡＤ症例のうちＥＯＡＤの割合は５％～１０％である。プレセニリン１（ＰＳＥＮ１）、プレセニリン２（ＰＳＥＮ２）、及びアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は主として、常染色体優性型のＥＯＡＤに関連している。遺伝的要因以外に、突然変異は環境に関連している。遺伝的環境的相互作用は、発症年齢、神経病理学的パターン、及び疾患期間の変動によって起こり得る。
【0056】
ＰＳＥＮ１及びＰＳＥＮ２は、γ－セクレターゼの触媒中心を構成する膜貫通タンパク質ＰＳ１及びＰＳ２をそれぞれコードしており、新興のクラスである非従来型の膜内切断プロテアーゼ（Ｉ－ＣＬｉＰ）を構成する、初期に発見されたメンバーである。活性型γ－セクレターゼは、ＰＳ１またはＰＳ２と、ニカストリン（ＮＣＴ）、前咽頭欠損タンパク質１（ＡＰＨ１）、及びプレセニリンエンハンサー２（ＰＥＮ２）で構成される多タンパク質複合体である。遷移状態類似体γ－セクレターゼ阻害剤がＰＳ１に結合すること、ならびにタンパク質分解にとって重要なアスパラギン酸残基をＰＳ１が欠失するとγ－セクレターゼ活性が消失することなどの実験的証拠により、プレセニリンが酵素複合体の活性部位を保持することが確認された。
【0057】
ＰＳ１及びＰＳ２はγ－セクレターゼ複合体の一部として、細胞シグナル伝達に必須の役割を果たす。ＰＳ２は、膜貫通ドメイン中の多数のＩ型膜タンパク質を切断して、対応する細胞内ドメインを放出させ、遺伝子発現に影響を及ぼすことができる。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、β－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）とγ－セクレターゼの連続作用によって処理され、３７～４６アミノ酸を範囲とする長さの異なるアミロイド－ベータペプチド（Ａβ）を生成する。γ－セクレターゼによるＡＰＰ Ｃ末端断片（ＡＰＰ－ＣＴＦ）の切断はまた、ＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）を放出させる。これは、ＡＤの主要な遺伝的決定因子である脳のＡｐｏＥ発現の調節、及びコレステロール代謝に関与することが近年発見された。加えて、ＰＳ１は、γ－セクレターゼ活性を調整するタンパク質と相互作用することが示されており、その対象は増えつつある。
【0058】
核酸組成物
したがって、本開示は、天然に存在するヒトプレセニリン－１をコードし、一部またはすべての許容コドンのみのコドン最適化、ＣｐＧジヌクレオチドの減少、または両方のＰＳＥＮ－１アイソフォームの発現を可能にするドナー／アクセプタースプライス部位の存在のうち１つ以上を特徴とする、単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡ；前述及び追加の調節要素を含む核酸発現カセット；そのような発現カセットを含むベクター；このようなベクターを含む組成物；ならびに前述のいずれかを利用する、アルツハイマー病などの神経変性障害の遺伝子療法のための方法を提供する。理論に束縛されるものではないが、本明細書に開示される核酸発現カセットは、それを必要とする患者、例えばアルツハイマー病患者において、天然型または変異型のＰＳＥＮ－１と比較して、ＰＳＥＮ－１発現の増加及び改善をもたらすと考えられる。したがって、低用量の発現カセットまたはその発現カセットを含むベクターでＰＳＥＮ－１タンパク質の発現を増加させることができる。
したがって、本開示は、天然に存在するヒトプレセニリン－１をコードし、一部またはすべての許容コドンのみのコドン最適化、ＣｐＧジヌクレオチドの減少、または両方のＰＳＥＮ－１アイソフォームの発現を可能にするドナー／アクセプタースプライス部位の存在のうち１つ以上を特徴とする、単離ｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡ；前述及び追加の調節要素を含む核酸発現カセット；そのような発現カセットを含むベクター；このようなベクターを含む組成物；ならびに前述のいずれかを利用する、アルツハイマー病などの神経変性障害の遺伝子療法のための方法を提供する。理論に束縛されるものではないが、本明細書に開示される核酸発現カセットは、それを必要とする患者、例えばアルツハイマー病患者において、天然型または変異型のＰＳＥＮ－１と比較して、ＰＳＥＮ－１発現の増加及び改善をもたらすと考えられる。したがって、低用量の発現カセットまたはその発現カセットを含むベクターでＰＳＥＮ－１タンパク質の発現を増加させることができる。
【0059】
一実施形態では、上記に示すプレセニリン１をコードするｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡポリヌクレオチドのいずれか、及びプレセニリン１をコードするポリヌクレオチドと機能的に連結される１つ以上の調節要素を含む、核酸発現カセットを提供する。
【0060】
ポリヌクレオチドまたは遺伝子発現を調整する、またはそれに影響を及ぼす任意の遺伝子要素は、調節要素であってよく、例えば、これには、プロモーター、エンハンサー、クロマチンインスレーター、強弱のコザックシグナル配列及び内部リボソーム侵入部位などの翻訳開始配列、ｍＲＮＡ安定性配列、スプライシング及び切断などのｍＲＮＡプロセシングに影響を及ぼす配列、ｍＲＮＡの核外輸送及び／またはｍＲＮＡ保持に影響を及ぼす配列、翻訳後応答要素、イントロンなどの非コード配列、ポリＡ配列、リプレッサー、サイレンサー、ターミネーターなどが挙げられる。調節要素は、転写レベル、転写後レベル、翻訳レベル、またはそれらの任意の組み合わせでポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現を調整するように機能することができる。調節要素は、例えば、ＲＮＡ転写物の生成速度を増加させること、生成されるＲＮＡの安定性を増加させること、ＲＮＡ転写物からのタンパク質の合成速度を増加させること、ＲＮＡ分解を防止すること、及び／またはＲＮＡ安定性を増加させてタンパク質合成を促進することができる。
【0061】
本明細書で使用される発現カセットは、プロモーター及びポリＡ配列を適切に含み得る。特定の好ましい実施形態では、発現カセットは、プロモーター、ポリＡ配列、及びｍＲＮＡ安定性要素を含み得る。特に好ましい発現カセットは、ＣＡＧプロモーター、コザック、コドン最適化ＰＳＥＮ１（許容のみ）、ｍＲＮＡ安定性要素、及びポリＡを含み得る。特に好ましい発現カセットは、配列番号２３、配列番号５、配列番号６、配列番号９、及び配列番号３４を含み得る。ある特定の実施形態では、好ましいベクターは、ＩＴＲに囲まれ、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０カプシドにパッケージングされたＡＡＶを含み得る。
【0062】
本明細書に記載の核酸発現カセットは、例えば、転写レベル、転写後レベル、及び翻訳レベルを含め、任意の段階でポリヌクレオチドまたは遺伝子発現を調節または調整する調節要素を含み得る。調節要素は、ポリヌクレオチドもしくは遺伝子の発現を複数のレベルで調節もしくは調整するか、またはポリヌクレオチドもしくは遺伝子の発現を調節または調整するために複数の方法で機能することができる。したがって、調節要素は、任意の機能、または上記に記載する機能の任意の組み合わせを有し得る。例えば、調節要素は、ｍＲＮＡを安定化する要素として機能し、翻訳を調整、すなわち増加または減少させることができる。さらに別の例として、調節要素は、転写開始を調整し、ｍＲＮＡの安定性を調整することができる。調節要素はまた、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現を調整する優勢な機能を有し、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現を増加または減少させる１つ以上の追加機能を有し得る。調節要素は、他の調節要素内に位置するか、またはそれと重複する配列を含んでもよく、この他の調節要素とは、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現の調整に際して、同じかもしくは異なる機能を有するか、または同じかもしくは異なる段階でポリヌクレオチドもしくは遺伝子の発現を調整するものである。
【0063】
調節要素は、コードまたは非コードのＤＮＡ配列に由来することができる。非コードＤＮＡに由来する調節要素は、遺伝子と関連付けることができ、例えば、上流配列、イントロン、３’及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、及び／または下流領域などの遺伝子に存在し得る。本明細書で使用される場合、核酸を指すときの「上流」という用語は、別の配列に対して５’側を意味し、「下流」という用語は、別の配列に対して３’側を意味する。「上流」という用語は、文脈によって特に明示されない限り、相互に相対的な配列の位置を指すときの「５’」という用語と同義に使用することができる。「下流」という用語は、文脈によって特に明示されない限り、相互に相対的な配列の位置を指すときの「３’」という用語と同義に使用することができる。
【0064】
いくつかの実施形態では、非コードＤＮＡ配列に由来する調節要素は、遺伝子と関連付けされず、例えば、遺伝子中に存在しない場合がある。調節要素が由来するゲノム領域は、機能的に連結されるポリヌクレオチドが由来するゲノム領域とは異なる可能性がある。いくつかの実施形態では、調節要素は、機能的に連結されるポリヌクレオチド（例えば、内因性遺伝子または内因型の異種遺伝子に由来するｃＤＮＡなど）のゲノム領域または位置に対して、遠位のゲノム領域または位置に由来する。いくつかの実施形態では、調節要素は、イントロン配列を含む。イントロン配列は、任意の遺伝子に由来する配列を含み得る。いくつかの実施形態では、イントロン配列は、機能的に連結されるポリヌクレオチドが由来するゲノム領域に由来する。例えば、本明細書に記載の核酸発現カセットは、ポリヌクレオチドに対応する内因性遺伝子か、またはｃＤＮＡの形態でポリヌクレオチドを生じさせた内因性遺伝子からのイントロンを含み得る。別の例として、本明細書に記載の核酸発現カセットは、ポリヌクレオチドに対応しないか、またはポリヌクレオチドを生じさせない内因性遺伝子からのイントロンを含み得る。
【0065】
いくつかの実施形態では、１つ以上の調節要素が、配列番号５に示すポリヌクレオチドなどのコザック翻訳開始シグナルを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の調節要素が、配列番号４に示すポリヌクレオチドなどのクロマチンインスレーター配列を含む。
【0066】
コザック配列：５’ＵＴＲには、概して、リボソームによって認識され、リボソームが結合して翻訳を開始できるような配列が含まれる。翻訳開始の例示的な配列として、コザック開始シグナル配列が挙げられる。本明細書で使用される場合、「コザック開始シグナル配列」、「コザックコンセンサス配列」、及び「コザック配列」という用語は、文脈によって特に明示されない限り、同義に使用することができる。下記に記載されるように、コザック開始シグナル配列は部分的に５’ＵＴＲに位置し、ＡＵＧ翻訳開始コドン自体及びＡＵＧ開始コドンの直後または下流のヌクレオチドを含み得ることを当業者は理解されよう。
【0067】
ｍＲＮＡの翻訳開始は通常、リボソームによって認識されるＡＴＧコドンで発生する。翻訳が開始されるＡＴＧコドンは、ｍＲＮＡ配列に存在する最初のＡＴＧ開始コドンではない場合がある。コザック配列と呼ばれるモチーフは、翻訳開始をＡＴＧコドンに誘導することができる。コザックコンセンサス配列は、５’－（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ－３として定義され、式中、下線のあるＡＵＧは翻訳開始コドンを示し、大文字は保存された塩基を示し、「Ｒ」は、アデニンの頻度が高いプリンの存在を示し、小文字は、変更できる位置の最も一般的な塩基を示し、配列（ｇｃｃ）は、意義不明のものである。これらの特徴に加えて、他の位置及び特徴が翻訳の開始に寄与する可能性がある。強弱のコザック配列が記載されており、強いコザックコンセンサス配列は、翻訳開始に最適であると考えられる上記の特徴を含み、弱いコザックコンセンサス配列は、強いコザックコンセンサス配列から逸脱するまたはそれとは異なる特徴を含む。ｍＲＮＡから合成されるタンパク質の量は、コザック配列の強度に依存し得る。例えば、ＡＵＧ翻訳開始コドンのすぐ上流のＣＣＡＣＣ（配列番号５）配列は、ＣＣＡＣＣとは異なる配列と比較して、翻訳開始の速度を増加させることができる。
【0068】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸発現カセットは、コザック翻訳開始シグナルを含む。コザック翻訳開始シグナルは、翻訳開始ＡＵＧコドンのすぐ上流または５’に位置し得る。強いコザック配列である任意のコザックコンセンサス配列を使用することができる。いくつかの実施形態では、コザック翻訳開始シグナルは、配列番号５に示す配列を含む。
【0069】
プロモーター：プロモーターは、ベクターゲノム設計内の主要なｃｉｓ作用要素であり、発現の全体的な強度に加え、細胞特異性を規定することができる。したがって、ある特定の実施形態では、プロモーターはニューロン特異的プロモーターである。ニューロン特異的プロモーターは、神経細胞におけるポリヌクレオチドまたは治療遺伝子の選択的発現を提供することができる。特定の細胞型に制限または限定された選択的発現は、例えば、望ましくない場合が多く、副作用をもたらす可能性があるオフターゲット効果を防止または低減することができる。本明細書で使用される場合、「選択的発現」とは、非神経細胞と比較して、ニューロン中、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びその間の任意の数または範囲で高い発現を指す。いくつかの実施形態では、非神経細胞では発現がない。
【0070】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸発現カセットのニューロン特異的プロモーターは、任意の細胞型で発現を誘導できるプロモーターによって提供される発現と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びその間の任意の数または範囲で高い発現を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸発現カセットのニューロン特異的プロモーターは、１種以上の非神経細胞型で発現を誘導できるプロモーターによって提供される発現と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びその間の任意の数または範囲で高い発現を提供する。
【0071】
任意のニューロン特異的プロモーターを、本明細書で提供される核酸発現カセットで使用することができる。例示的なプロモーターとして、ソマトスタチン（ＳＳＴ；配列番号２）遺伝子プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ；配列番号３）プロモーター、アルファ－カルシウム／カルモジュリンキナーゼ２Ａプロモーター、シナプシンＩプロモーター（例えば、配列番号４６のヌクレオチド２７３～６８４）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）（例えば、配列番号２９）、ドーパミン作動性受容体１（Ｄｒｄ１ａ）プロモーター、チューブリンアルファＩプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター（例えば、配列番号３１）、及びその公知のバリエーション（例えば、ｇｆａＡＢＣ（１）Ｄ）などが挙げられる。また、ハイブリッドプロモーターを使用することもできる。ハイブリッドプロモーターは、複数の遺伝子に由来するプロモーター配列を含むプロモーターである。プロモーターは、例えば、ヒト、アカゲザル、マウス、ラット、及びニワトリを含む、あらゆる種に由来し得る。ニューロン特異的プロモーターは、（ｉ）配列番号２に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）配列番号３に示すポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）配列番号２もしくは配列番号３の機能的断片；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドを含み得る。これらの実施形態の別の態様では、プロモーターは、ＣＡＧ、ＣＢＡ、ＵＢＣ、ＰＫＣ、ＥＦ１ａ、ＧＵＳＢ、ＣＭＶ、ＮＳＥ、ＰＤＧＦ、デスミン、ＭＣＫ、ＭｅＣＰ２、ＧＦＡＰ、ＣａＭＫＩＩ、またはＭＢＰを含む。
【0072】
ヒト伸長因子１αサブユニット（ＥＦ１α）（例えば、配列番号２７、または配列番号４４のヌクレオチド２３７～１４１５）、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、配列番号２８）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）（例えば、配列番号２４、または配列番号４３のヌクレオチド２３７～８９０）及びその誘導体ＣＡＧ（配列番号２３または配列番号４０）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）（例えば、配列番号２５、または配列番号４２のヌクレオチド２３７～１３２３）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）（例えば、配列番号２６）、さらには天然のＰＳＥＮ－１プロモーター（例えば、配列番号４１のヌクレオチド２３７～１２００）などの構成的プロモーターをほとんどの組織での発現を促進するために使用することができる。概して、ＣＢＡ及びＣＡＧは構成的プロモーターの中でも強く発現を促進するが、約１．７ｋｂという大きさは、ＣＭＶ（約０．８ｋｂ）またはＥＦ１α（約１．２ｋｂ）と比較して、ＡＡＶなどのパッケージング制約のあるベクターでの使用が制限される。ＧＵＳＢまたはＵＢＣプロモーターは、それぞれ３７８ｂｐ及び４０３ｂｐという小さいサイズで遍在性の遺伝子発現を提供できるが、ＣＭＶまたはＣＢＡプロモーターよりもかなり弱い。したがって、その発現に影響を及ぼすことなくサイズを縮小するための構成的プロモーターの改変が追求されており、ＣＢｈ（約８００ｂｐ）及びｍｉｎｉＣＢＡ（約８００ｂｐ）などの例は、選択された組織において同等か、さらに高い発現を促進することができる。
【0073】
器官内、例えば脳、中枢神経系などの特定の細胞型に発現を制限する場合、プロモーターは、この特異性を媒介するために使用することができる。例えば、神経系内で、ニューロン、アストロサイト、またはオリゴデンドロサイトに発現を制限するためにプロモーターが使用されてきた。ニューロンにおいて、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターは、遍在性プロモーターよりも強度の発現を誘導するが、サイズが２．２ｋｂであるため、小型ベクターでの使用に限定される。加えて、血小板由来成長因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ－β）、シナプシン（Ｓｙｎ）、及びメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）（例えば、配列番号３０）プロモーターは、ＮＳＥよりも低レベルでニューロン特異的発現を誘導できるが、それぞれサイズが１．４ｋｂ、４７０ｂｐ、及び２２９ｂｐであるため、サイズが限定されるベクターに適している。アストロサイトにおいて、６８０ｂｐ長の短縮型［ｇｆａＡＢＣ（ｌ）Ｄ］グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、２．２ｋｂ）プロモーターは、ＧＦＡＰプロモーターと同じアストロサイト特異性で高レベルの発現を付与することができる。このグリア細胞に発現が制限されるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターの選択によって、オリゴデンドロサイトの標的化も達成することができる（Ｇｒａｙ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１；２２：１１４３－１１５３）。
【0074】
組織特異的プロモーターは、目的とする細胞または組織に発現を限定するという利点をもたらす。しかしながら、低レベルの発現及び／またはサイズの大きさにより、その使用が限定される場合がある。強度の弱さを補うために、ＣＭＶ由来などのエンハンサー要素を追加することにより発現レベルを高めることができる。
【0075】
マイクロＲＮＡ結合部位：いくつかの実施形態では、１つ以上の調節要素は、後根神経節におけるコードされたＰＳＥＮ－１の発現を抑制するためのマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」または「ｍｉＲ」）結合部位を１つ、２つ、または３つ含む。マイクロＲＮＡは１９～２５ヌクレオチドの非コードＲＮＡであり、ｍｉＲＮＡ結合部位に結合して、核酸分子の安定性を低下させるか、または翻訳を阻害することにより、遺伝子発現を下方制御する。これらの実施形態のいくつかの態様では、各ｍｉＲＮＡ結合部位は、以下のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ－１９１４、ｍｉＲ１１８１、ｍｉＲ３９１８、ｍｉＲ９３９、ｍｉＲ３２４、ｍｉＲ６５０、ＭｉＲ２９Ｃ、またはｍｉＲ２２７７のいずれかの結合部位から独立して選択される。これらの実施形態のいくつかの態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）は、ｍＲＮＡ安定性要素に対して３’側に位置する。
【0076】
内因性ｍｉＲＮＡは、それらの正確な相補的標的配列が発現カセットに組み込まれている場合、導入遺伝子の発現を標的外にするか、または阻害することができる。抑制のレベルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、発現カセット内の標的配列の数と相関する。ｉｎ ｖｉｖｏ試験では、神経細胞特異的ｍｉＲ－１２４標的配列の４つのコピーを含む操作されたレンチウイルスベクターをマウスの脳に注入すると、ＰＧＫ誘導性導入遺伝子の発現標的からニューロンが外れ、アストロサイトのみになった（Ｃｏｌｉｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｇｌｉａ．２００９ Ａｐｒ １５；５７（６）：６６７－７９）。内因性ｍｉＲＮＡは、それぞれの結合部位が小さく、組み合わせることができ、発現を制限する能力が強固であるため、導入遺伝子細胞の特異性を得るのに有益な手段である。
【0077】
ｍＲＮＡ安定性要素：例示的なｍＲＮＡ安定性要素として、ＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡ安定性要素、ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、リポキシゲナーゼ、アルファ（Ｉ）コラーゲン、及びチロシンヒドロキシラーゼ３’ＵＴＲのＣリッチ安定性要素、例えば、３’ＵＴＲのＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）などが挙げられる。ｍＲＮＡ安定性要素は、例えば、発現及び核保持要素であり得る。ｍＲＮＡ安定性要素は、ｍＲＮＡの分解を防止するか、または減少させることができる。例えば、ｍＲＮＡ安定性要素が含まれる場合、ｍＲＮＡ安定性要素を含まない核酸発現カセットと比較して、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、及びその間の任意の数または範囲で、ｍＲＮＡの分解を減少させることができる。一実施形態では、ｍＲＮＡの分解がない。ｍＲＮＡの分解を防止するか、または減少させる任意の配列は、ｍＲＮＡ安定性要素であり得る。ｍＲＮＡ安定性要素は、核酸発現カセットの任意の位置に配置することができる。例えば、ｍＲＮＡ安定性要素は、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームに対して３’側、及びポリアデニル化部位の前または５’側に配置することができる。別の例として、ｍＲＮＡ安定性要素は、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームに対して３’側、及びポリアデニル化部位に対して３’側に配置することができる。さらに別の例として、ｍＲＮＡ安定性要素は、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームに対して５’側に配置することができる。
【0078】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ安定性要素は、（ｉ）配列番号９に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）その機能的バリアント；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ安定性要素は、配列番号９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、及びその間の任意の数または範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【0079】
したがって、ある特定の実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡ安定性要素は、（ｉ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１の機能的バリアント；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【0080】
いくつかの実施形態では、本明細書に包含される核酸発現カセットは、（ｉ）配列番号１０に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）その機能的バリアント；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むｍＲＮＡ安定性要素を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ安定性要素は、配列番号１０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、及びその間の任意の数または範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）配列番号１０に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）その機能的バリアント；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むｍＲＮＡ安定性要素は、ＰＳＥＮ１または他の治療遺伝子をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの５’に位置する。
【0081】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸発現カセットは、（ｉ）配列番号１１に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）その機能的バリアント；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むｍＲＮＡ安定性要素を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ安定性要素は、配列番号１１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、及びその間の任意の数または範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ安定性要素は、配列番号１０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、及びその間の任意の数または範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）配列番号１０に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）その機能的バリアント；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むｍＲＮＡ安定性要素は、ＰＳＥＮ１または他の治療遺伝子をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの５’に位置する。
【0083】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸発現カセットは、（ｉ）配列番号１１に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）その機能的バリアント；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むｍＲＮＡ安定性要素を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ安定性要素は、配列番号１１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、及びその間の任意の数または範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）配列番号１１に示すポリヌクレオチド；（ｉｉ）その機能的バリアント；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むｍＲＮＡ安定性要素は、ＰＳＥＮ１ヌクレオチド配列のオープンリーディングフレームの５’に位置する。
【0084】
これらの実施形態のいくつかの態様では、核酸発現カセットは、ＰＳＥＮ１をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの５’に位置するｍＲＮＡ安定性要素；及びポリアデニル化シグナルの３’に位置するｍＲＮＡ安定性要素を含む。
【0085】
ポリアデニル化シグナル：ある特定の実施形態では、核酸発現カセットは、１つ以上のポリアデニル化エンハンサー要素、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；配列番号３３；配列番号４１のヌクレオチド３３３０～３８０６）ポリアデニル化シグナル配列、ウサギベータ－グロビン（ｒＢＧ；配列番号３４または３５；配列番号４７のヌクレオチド２１３９～２３６７）ポリアデニル化シグナル配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列などを含む。転写物のポリアデニル化は、核外輸送、翻訳、及びｍＲＮＡの安定性にとって重要である。したがって、転写物のポリアデニル化効率は、導入遺伝子の発現にとって重要である。ポリ（Ａ）テールには、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）の結合部位が含まれる。このタンパク質は他の因子と協働して、ｍＲＮＡの輸送、安定性、分解、及び翻訳に影響を及ぼす。ポリ（Ａ）テールに結合したＰＡＢＰは、ｍＲＮＡの５’キャップに結合した翻訳開始因子などのタンパク質とも相互作用する場合がある。この相互作用により、転写物の環状化が引き起こされ、続いて翻訳の開始が進行する。さらに、リボソームの再生を引き起こすことにより、効率的な翻訳を可能にする。ポリ（Ａ）テールの存在は通常、翻訳の誘発を助ける一方、その不在または除去は、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ媒介性の分解に至ることが多い。ポリアデニル化自体は、転写物の３’－ＵＴＲ内の配列によって制御される。このような配列は、細胞質ポリアデニル化要素（ＣＰＥ）を含み、これは、ポリアデニル化の活性化と抑制の両方に寄与するウリジンリッチ配列である。ＣＰＥ結合タンパク質（ＣＰＥＢ）は、様々な応答を誘発するために、多様な他のタンパク質と組み合わされてＣＰＥに結合する。
【0086】
クロマチンインスレーター配列：ある特定の実施形態では、核酸発現カセットは、クロマチンインスレーター配列をさらに含み得る。遺伝子をクロマチンにパッケージングすると、遺伝子は細胞の転写機構に接近できなくなり、遺伝子発現がほとんどまたは全く生じなくなる可能性がある。クロマチンインスレーターは、配列が凝集して転写不活性なクロマチンになることを防止することができる。核酸発現カセットにクロマチンインスレーター配列を組み入れると、ポリヌクレオチドを接近可能な状態に維持し、転写を可能にすることができる。任意のクロマチンインスレーターを、本明細書で提供される核酸発現カセットに使用することができる。例示的なクロマチンインスレーター配列として、ＣＴＣＦインスレーター、ジプシーインスレーター、及びβ－グロビン遺伝子座が挙げられる。あらゆる種のクロマチンインスレーター配列を使用でき、種には、哺乳動物及び非哺乳動物ならびに脊椎動物及び非脊椎動物が含まれる。一例として、ヒトベータグロビン遺伝子座ＨＳ４由来のクロマチンインスレーター配列を使用することができる。クロマチンインスレーター配列の他の例として、ニワトリ及びショウジョウバエ由来の配列が挙げられる。クロマチンインスレーター配列は、配列番号４に示すポリヌクレオチド、配列番号４の機能的バリアント、または配列番号４に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドを含み得る。クロマチンインスレーター配列は、参照配列の機能、及びそれが関連する配列の転写不活性なクロマチンへの凝集を防止する能力が維持されている限り、配列番号４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、及びその間の任意の数または範囲の同一性を含み得る。
【0087】
転写終結領域：組換え構築物または発現カセットの転写終結領域は、終止コドン及び転写ターミネーター配列を含む下流の調節領域である。使用することができる転写終結領域は、転写開始領域と相同であり得るか、対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相同であり得るか、または異種であり得る（すなわち、別の起源に由来する）。転写終結領域は、天然に存在するものでも、全体的または部分的に合成されたものでもよい。転写終結領域をコードする３’非コード配列は、組換え構築物または発現構築物に提供されてもよく、開始領域を得た遺伝子の３’領域に由来するか、または異なる遺伝子に由来してもよい。多数の終結領域が公知であり、由来する同じ属及び種、ならびに異なる属及び種の両方に利用すると、多様な宿主において十分に機能する。終結領域はまた、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子に由来し得る。終結領域は通常、特定の特性のためではなく、利便性のために選択される。
【0088】
本明細書で提供される核酸発現カセットの調節要素及びポリヌクレオチドは、任意の方法で組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、核酸発現カセットは、プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドを含み、当該ポリヌクレオチドは、（Ｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に示すポリヌクレオチド；または（ＩＩＩ）（Ｉ）もしくは（ＩＩ）に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドのうちいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、及びその間の任意の数または範囲の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸発現カセットは、プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された１つ以上の調節要素をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の調節要素が、ニューロン特異的プロモーターを含む。
【0089】
いくつかの実施形態では、核酸発現カセットは、（ｉ）コザック翻訳開始シグナル；（ｉｉ）クロマチンインスレーター配列；（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍＲＮＡ安定性要素；または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせをさらに含み、１つ以上の調節要素が、ニューロン特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、コザック翻訳開始シグナルは、配列番号５に示すポリヌクレオチドを含み、クロマチンインスレーター配列は、配列番号４に示すポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つのｍＲＮＡ安定性要素は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、またはそれらの任意の組み合わせに示すポリヌクレオチドを含み、ニューロン特異的プロモーターは、配列番号２または配列番号３に示すポリヌクレオチドを含む。
【0090】
いくつかの実施形態では、配列番号９を含むｍＲＮＡ安定性要素は、ＰＳＥＮ１をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの３’及びポリアデニル化シグナルの５’に位置し、配列番号１０を含むｍＲＮＡ安定性要素は、ＰＳＥＮ１をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの５’に位置し、配列番号１１を含むｍＲＮＡ安定性要素は、ＰＳＥＮ１をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの３’に位置する。
【0091】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸発現カセットは、（ａ）プレセニリン１をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された１つ以上の調節要素であって、当該ポリヌクレオチドが、（Ｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９に示すポリヌクレオチド；（ＩＩ）（Ｉ）に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドのうちいずれか１つを含み、１つ以上の調節要素が、配列番号２または配列番号３に示すポリヌクレオチドを含むニューロン特異的プロモーターを含む、調節要素；（ｂ）配列番号５に示すポリヌクレオチドを含むコザック翻訳開始シグナル；（ｃ）配列番号４に示すポリヌクレオチドを含むクロマチンインスレーター配列；及び（ｄ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、またはそれらの任意の組み合わせに示すポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのｍＲＮＡ安定性要素を含む。
【0092】
他の実施形態は、（ｉ）上記に示すプレセニリン１をコードするｃＤＮＡまたはハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡポリヌクレオチドのいずれか；（ｉｉ）コザック翻訳開始シグナル；（ｉｉｉ）ニューロン特異的プロモーター；（ｉｖ）クロマチンインスレーター配列；（ｖ）少なくとも１つのｍＲＮＡ安定性要素；またはそれらの組み合わせを含む核酸発現カセットを提供する。コザック翻訳開始シグナルは、配列番号５に示すポリヌクレオチドを含み、クロマチンインスレーター配列は、配列番号４に示すポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つのｍＲＮＡ安定性要素は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、またはそれらの任意の組み合わせに示すポリヌクレオチドを含み、ニューロン特異的プロモーターは、配列番号２または配列番号３に示すポリヌクレオチドを含み得る。
【0093】
コドン最適化
コドン最適化を利用して、異種遺伝子発現のためのタンパク質発現を増強することができる。コドン最適化は遺伝子最適化の方法であり、合成遺伝子配列において、特定の生物の「コドン使用パターン」に一致するように配列を変更する。例えば、特定の生物の特定のアミノ酸配列の発現を最適化するために、その生物により「最も使用頻度の高いコドン」を（アミノ酸の縮重コドンの一覧から）選択する。使用される優先コドンのリストについては、表２を参照のこと。コドン最適化時、コードされたアミノ酸配列は同じままであるが、アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は異なり、その生物に最適化されている。したがって、本開示は、本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適した、コドン最適化プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）をコードするポリヌクレオチドを提供する。コドン最適化ＰＳＥＮ１は、表２に示す１つ以上の最適化コドンを含む、全長ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡ（例えば、配列番号８）を含み得る。ある特定の実施形態では、配列番号１を含むＰＳＥＮ－１ポリヌクレオチドは、表２に示す１つ以上の最適化コドンを含む。ある特定の実施形態では、コドン最適化プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６として示される。ある特定の実施形態では、コドン最適化プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６として示される。ある特定の実施形態では、コドン最適化プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３７として示される。ある特定の実施形態では、コドン最適化プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３８として示される。ある特定の実施形態では、コドン最適化プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３９として示される。
コドン最適化を利用して、異種遺伝子発現のためのタンパク質発現を増強することができる。コドン最適化は遺伝子最適化の方法であり、合成遺伝子配列において、特定の生物の「コドン使用パターン」に一致するように配列を変更する。例えば、特定の生物の特定のアミノ酸配列の発現を最適化するために、その生物により「最も使用頻度の高いコドン」を（アミノ酸の縮重コドンの一覧から）選択する。使用される優先コドンのリストについては、表２を参照のこと。コドン最適化時、コードされたアミノ酸配列は同じままであるが、アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は異なり、その生物に最適化されている。したがって、本開示は、本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適した、コドン最適化プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）をコードするポリヌクレオチドを提供する。コドン最適化ＰＳＥＮ１は、表２に示す１つ以上の最適化コドンを含む、全長ハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡ（例えば、配列番号８）を含み得る。ある特定の実施形態では、配列番号１を含むＰＳＥＮ－１ポリヌクレオチドは、表２に示す１つ以上の最適化コドンを含む。ある特定の実施形態では、コドン最適化プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６として示される。ある特定の実施形態では、コドン最適化プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６として示される。ある特定の実施形態では、コドン最適化プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３７として示される。ある特定の実施形態では、コドン最適化プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３８として示される。ある特定の実施形態では、コドン最適化プレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３９として示される。
【0094】
ベクター
「ベクター」とは、ポリヌクレオチドを含むかまたはポリヌクレオチドと会合する、高分子または高分子の会合であり、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用することができる。ベクターの例として、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、及び他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。ベクターは、ベクター複製のための１つ以上の要素を含み得る。ベクターは、ベクター複製のための１つ以上の要素を欠失するように操作することができる。
「ベクター」とは、ポリヌクレオチドを含むかまたはポリヌクレオチドと会合する、高分子または高分子の会合であり、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用することができる。ベクターの例として、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、及び他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。ベクターは、ベクター複製のための１つ以上の要素を含み得る。ベクターは、ベクター複製のための１つ以上の要素を欠失するように操作することができる。
【0095】
核酸発現カセット及び／またはポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組み込むベクターの能力に関して、ベクターは、組み込みベクターでも非組み込みベクターでもあり得る。組み込みベクターまたは非組み込みベクターのいずれかを使用して、ポリヌクレオチドが含まれた核酸発現カセットを送達することができる。ベクターの例として、（ａ）線状オリゴヌクレオチド及び環状プラスミド；ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及び細菌人工染色体（ＢＡＣまたはＰＡＣ）などの人工染色体；エピソームベクター；トランスポゾン（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ）を含む、核酸ベクターなどの非ウイルスベクター；ならびに（ｂ）レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びＡＡＶベクターなどのウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスは、核酸の送達に関していくつかの優位性があり、それには、特定の標的細胞または組織に対する高い感染性及び／または指向性が含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む核酸分子または核酸発現カセットを送達するために使用される。
【0096】
いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターである。本明細書で提供される核酸発現カセットを含むベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。
【0097】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／ｒｈ１０、ＡＡＶ２／１１、もしくはＡＡＶ２／１２、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクター、または自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ハイブリッドまたはキメラＡＡＶ血清型である。
【0098】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ａ）ＣＡＧプロモーター、プレセニリン－１プロモーター、ユビキチンＣプロモーター、ＣＢＡプロモーター、シナプシン－１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＥＦ１αプロモーターから選択されるプロモーターであって、以下と機能的に連結される、プロモーター、ｂ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９から選択されるプレセニリン－１コード配列、または前述のＰＳＥＮ－１コード配列のいずれかに対して少なくとも９５％の同一性を有し、野生型ＰＳＥＮ－１アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；ならびにｃ）ヒト成長ホルモンポリアデニル化配列及びウサギβ－グロビンポリアデニル化配列から選択されるポリアデニル化配列を含む。これらの実施形態のいくつかの態様では、ＡＡＶベクターは、プロモーターとＰＳＥＮ－１コード配列との間に、ヒトベータグロビンイントロン（野生型または合成のいずれか）またはマウス微小ウイルスのイントロンから選択されるイントロンをさらに含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、以下を含む：
ａ．配列番号４１のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド２３７～１２００もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド１２２１～１７８６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド１８９９～３２９９もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド３３３０～３８０６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド４５５３～４６９３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｂ．配列番号４２のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド２３７～１３２３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド１３４４～１９０９もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド１９８３～３４１６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド３４４７～３９２３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド４５５４～４６９４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｃ．配列番号４３のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド２３７～８９０もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド９１１～１４７６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド１５５０～２９８３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド３０１４～３４９０もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド４５５３～４６９４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｄ．配列番号４４の、ヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド２３７～１４１５もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド１４３６～２００１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド２０７５～３５０８もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド３５３９～４０１５もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド４５００～４６４０もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｅ．配列番号４５のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド２３７～６６４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド６８４～１２４９もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド１３２３～２７５６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド２７８７～３２６３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド４５３３～４６７３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｆ．配列番号４６のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド２３７～６８４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド７０５～１２７０もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド１３４４～２７７７もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド２８０８～３２８４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド４５５４～４６９５もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；または
ｇ．配列番号４７のヌクレオチド１～１０５もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド１１３～７６６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド７７６～８６７もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド８８１～２３１１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド２３１９～２３６７もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド２３８６～２５２６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列。
ａ．配列番号４１のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド２３７～１２００もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド１２２１～１７８６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド１８９９～３２９９もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド３３３０～３８０６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４１のヌクレオチド４５５３～４６９３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｂ．配列番号４２のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド２３７～１３２３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド１３４４～１９０９もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド１９８３～３４１６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド３４４７～３９２３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４２のヌクレオチド４５５４～４６９４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｃ．配列番号４３のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド２３７～８９０もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド９１１～１４７６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド１５５０～２９８３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド３０１４～３４９０もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４３のヌクレオチド４５５３～４６９４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｄ．配列番号４４の、ヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド２３７～１４１５もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド１４３６～２００１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド２０７５～３５０８もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド３５３９～４０１５もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、ヌクレオチド４５００～４６４０もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｅ．配列番号４５のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド２３７～６６４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド６８４～１２４９もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド１３２３～２７５６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド２７８７～３２６３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４５のヌクレオチド４５３３～４６７３もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；
ｆ．配列番号４６のヌクレオチド１～１４１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド２３７～６８４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド７０５～１２７０もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド１３４４～２７７７もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド２８０８～３２８４もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４６のヌクレオチド４５５４～４６９５もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列；または
ｇ．配列番号４７のヌクレオチド１～１０５もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド１１３～７６６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド７７６～８６７もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド８８１～２３１１もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド２３１９～２３６７もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列、配列番号４７のヌクレオチド２３８６～２５２６もしくはそれに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列。
【0100】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ａ）配列番号４１のヌクレオチド１～１４１、２３７～１２００、１２２１～１７８６、１８９９～３２９９、３３３０～３８０６、及び４５５３～４６９３；ｂ）配列番号４２のヌクレオチド１～１４１、２３７～１３２３、１３４４～１９０９、１９８３～３４１６、３４４７～３９２３、及び４５５４～４６９４；ｃ）配列番号４３のヌクレオチド１～１４１、２３７～８９０、９１１～１４７６、１５５０～２９８３、３０１４～３４９０、及び４５５３～４６９４；ｄ）配列番号４４のヌクレオチド１～１４１、２３７～１４１５、１４３６～２００１、２０７５～３５０８、３５３９～４０１５、及び４５００～４６４０；ｅ）配列番号４５のヌクレオチド１～１４１、２３７～６６４、６８４～１２４９、１３２３～２７５６、２７８７～３２６３、及び４５３３～４６７３；ｅ）配列番号４６のヌクレオチド１～１４１、２３７～６８４、７０５～１２７０、１３４４～２７７７、２８０８～３２８４、及び４５５４～４６９５；またはｆ）配列番号４７のヌクレオチド１～１０５、１１３～７６６、７７６～８６７、８８１～２３１１、２３１９～２３６７、及び２３８６～２５２６を含む。
【0101】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号４１～４７のいずれか１つのヌクレオチド配列、または配列番号４１～４７のいずれか１つに対して９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0102】
ＡＡＶベクターに関する上記の実施形態において、指定された範囲のヌクレオチドに対する配列の同一性が１００％未満である場合、当該配列は同様の機能を提供する（例えば、機能的ＩＴＲ対である；ＰＳＥＮ－１コード配列の発現を誘導できる機能的プロモーターである；機能的イントロンである；野生型ＰＳＥＮ－１と同じアミノ酸配列をコードする；または機能的ポリアデニル化配列である）はずであることを当業者は理解されよう。
【0103】
本明細書で企図される、体細胞の遺伝子療法のための技術として、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルパー依存性アデノウイルス系、ハイブリッドアデノウイルス系、単純ヘルペス、ポックスウイルス、レンチウイルス、及びエプスタインバーウイルス）、ならびに非ウイルス系、例えば、物理的系（裸のＤＮＡ、ＤＮＡ撃ち込み、エレクトロポレーション、流体力学、超音波、及びマグネトフェクション）及び化学的系（カチオン性脂質、異なるカチオン性ポリマー、及び脂質ポリマー）を介した送達が挙げられる。
【0104】
ウイルス遺伝子療法ベクターまたは遺伝子送達ベクターは、再現可能に及び／または安定して増殖され、高力価に精製される能力；標的化送達を媒介する（例えば、別の箇所への広範なベクターの伝搬、すなわちオフターゲット送達のない、対象となる組織または器官へ特異的にポリヌクレオチドを送達する）能力；有害な副作用またはオフターゲット効果を誘発せずに、遺伝子送達及び／またはポリヌクレオチド発現を媒介する能力を有し得る。
【0105】
「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、ウイルス自体またはその誘導体を指して使用される場合がある。この用語は、特に規定のない限り、すべての血清型、亜型、及び天然型と組換え型の両方を包含する。「ｒＡＡＶ」という略語は、組換えアデノ随伴ウイルスを指し、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）のように称することもある。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びそれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。様々な血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびに天然の末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。このような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースで閲覧することができる。本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源のものではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶと異種のポリヌクレオチド）、通常は細胞の遺伝子形質転換の対象となる配列を含むＡＡＶベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つ、概して２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が両側にある。「ｒＡＡＶベクター」という用語は、ｒＡＡＶベクター粒子とｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、カプシド封入されるポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達しようとするポリヌクレオチドまたは核酸発現カセットなどの、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、通常それは、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶベクター」と称される。したがって、そのようなベクターはｒＡＡＶ粒子内に含有されるので、ｒＡＡＶ粒子の生成には、必然的にｒＡＡＶベクターの生成が含まれる。
【0106】
大型ポリヌクレオチドの発現にとっては、ベクターまたはウイルス発現ベクターのクローニング能力が特に課題となる可能性がある。例えば、ＡＡＶベクターのパッケージング容量は通常約４．８ｋｂ、レンチウイルスの容量は通常約８ｋｂ、アデノウイルスの容量は通常約７．５ｋｂ、アルファウイルスの容量は通常約７．５ｋｂである。ウイルスによっては、パッケージング容量がそれより大きい可能性があり、例えば、ヘルペスウイルスの容量は３０ｋｂを超え、ワクシニアの容量は約２５ｋｂであり得る。遺伝子療法にＡＡＶを使用する優位性として、病原性が低いこと、宿主ゲノムへの組み込み頻度が極めて少ないこと、及び分裂細胞と非分裂細胞に感染できることが挙げられる。
【0107】
非病原性パルボウイルスである、いくつかの血清型のＡＡＶが、遺伝子送達を目的として操作されており、そのいくつかは、ある特定の組織または細胞型に対して指向性を有することが公知である。様々な遺伝子療法用途に使用されるウイルスは、複製欠損性であるか、または対象もしくは宿主において低毒性及び低病原性であるように操作することができる。このようなウイルス系ベクターは、ウイルスゲノムからコード領域の全部または一部を削除し、ベクターゲノムのウイルスカプシドへのパッケージングまたはベクター核酸（例えば、ＤＮＡ）の宿主クロマチンへの組み込みなどの機能に必要とされるインタクトな配列（例えば、逆方向末端反復配列）を残すことにより得ることができる。例えば、ポリヌクレオチドを含む核酸発現カセットを、ウイルス骨格（ウイルス遺伝子を欠失する改変または操作されたウイルス骨格など）にクローニングすることができ、追加ベクター（例えば、パッケージングベクター）と組み合わせて使用して、例えば、同時トランスフェクトすると、組換えウイルスベクター粒子を生成することができる。
【0108】
場合によっては、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、核酸発現カセットを細胞、細胞型、または組織に送達するために使用されるＡＡＶベクターまたはＡＡＶウイルス粒子、すなわちビリオンは、複製欠損性である。場合によっては、ＡＡＶウイルスは、ヘルパー因子の存在下でのみビリオンを複製及び生成できるように操作または遺伝子改変されている。
【0109】
いくつかの実施形態では、核酸発現カセットは、ＡＡＶまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）による送達に合わせて設計される。いくつかの実施形態では、核酸発現カセットは、レンチウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して送達される。いくつかの実施形態では、大型のポリヌクレオチド、すなわち、ＡＡＶのクローニング能力を超える遺伝子は、好ましくは、レンチウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して送達される。
【0110】
核酸発現カセットは、最適化された治療用レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターによる送達に合わせて設計することができる。レトロウイルスベクターは、左側（５’）ＬＴＲ；ウイルスのパッケージング及び／または核内輸送を支援する配列、すなわち少なくとも１つの調節要素、任意選択でレンチウイルスＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）；任意選択でプロモーターまたはその活性部分；１つ以上の調節要素に機能的に連結されたポリヌクレオチド；任意選択でインスレーター；ならびに右側（３’）レトロウイルスＬＴＲを含むレンチウイルスベクターであり得る。レンチウイルスベクターはまた、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）などの転写後調節要素を含み得る。レンチウイルスベクターは、自己不活化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターであり得る。例えば、第２世代、第３世代、及び第４世代のパッケージング系を含め、任意の好適なパッケージング系をレンチウイルスベクターとともに使用することができる。レンチウイルスベクターは偽型化することができる。例えば、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、リッサウイルス、モコラウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ラッサ熱ウイルス（ＬＦＶ）、レトロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、フィロウイルス、パラミクソウイルス、麻疹ウイルス、ニパウイルス、オルトミクソウイルスなどからの糖タンパク質を含め、任意のエンベロープ糖タンパク質を偽型化に使用することができる。レンチウイルスベクターを偽型化して、指向性を改変することができる。例えば、偽型化により、神経細胞を含め、任意の細胞型を標的にすることができる。
【0111】
治療方法
神経変性疾患、障害、または病態を治療する方法は、その必要のある対象に本明細書に記載の核酸発現カセットを投与することを含む。本明細書で提供される核酸発現カセットを用いて、任意の神経変性疾患、障害、または病態を治療することができる。いくつかの実施形態では、神経変性疾患、障害、または病態は、アルツハイマー病、家族性アルツハイマー病、散発性アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、ピック病、レヴィ小体認知症、記憶喪失、認知障害、または軽度の認知障害である。他の例示的な神経変性疾患、障害、または病態として、タウオパチー、原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、１７番染色体に連鎖する前頭側頭型認知症パーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム認知症複合（ＡＬＳ－ＰＤＣ、リティコ・ボディグ病）、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）、鉛脳症、結核性硬化症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、シヌクレイノパチー、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、神経軸索ジストロフィー、パーキンソン様疾患、パーキンソニズム、プリオン病、運動ニューロン疾患、認知症、伝染性海綿状脳症、主に中枢神経系を障害する全身性萎縮症、トリヌクレオチドリピート障害、タンパク質異常、アミロイドーシス、神経セロイドリポフスチン症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、外傷性脳損傷、脳卒中、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、うつ病、不安、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、統合失調症、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、双極性障害、強迫性障害（ＯＣＤ）、人格障害、疼痛などが挙げられる。
神経変性疾患、障害、または病態を治療する方法は、その必要のある対象に本明細書に記載の核酸発現カセットを投与することを含む。本明細書で提供される核酸発現カセットを用いて、任意の神経変性疾患、障害、または病態を治療することができる。いくつかの実施形態では、神経変性疾患、障害、または病態は、アルツハイマー病、家族性アルツハイマー病、散発性アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、ピック病、レヴィ小体認知症、記憶喪失、認知障害、または軽度の認知障害である。他の例示的な神経変性疾患、障害、または病態として、タウオパチー、原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、１７番染色体に連鎖する前頭側頭型認知症パーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム認知症複合（ＡＬＳ－ＰＤＣ、リティコ・ボディグ病）、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）、鉛脳症、結核性硬化症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、シヌクレイノパチー、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、神経軸索ジストロフィー、パーキンソン様疾患、パーキンソニズム、プリオン病、運動ニューロン疾患、認知症、伝染性海綿状脳症、主に中枢神経系を障害する全身性萎縮症、トリヌクレオチドリピート障害、タンパク質異常、アミロイドーシス、神経セロイドリポフスチン症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、外傷性脳損傷、脳卒中、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、うつ病、不安、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、統合失調症、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、双極性障害、強迫性障害（ＯＣＤ）、人格障害、疼痛などが挙げられる。
【0112】
家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）または早発型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）は、通常、６５歳以前（通常は５０～６５歳）と定義される早期に発症する希少形態のアルツハイマー病である。ＦＡＤは常染色体優性突然変異により遺伝する。ＦＡＤの発症に関与するとして、３種の遺伝子の突然変異が確認されているほか、他の遺伝子について研究されている。本明細書で使用される場合、「ＦＡＤ」とは、プレセニリン１（ＰＳＥＮ－１）、プレセニリン２（ＰＳＥＮ－２）、及びアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードする、これら３つの遺伝子のいずれかの突然変異によって引き起こされるアルツハイマー病を指す。「ＰＳＥＮ－１媒介ＦＡＤ」は、ＰＳＥＮ－１遺伝子の突然変異によって引き起こされるＦＡＤのみを指すことを意図する。
【0113】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、「療法」、「治療的」などの用語は、望ましい薬理学的効果及び／または生理学的効果を得ることを指し、これには、進行を緩和、遅延、または緩徐化すること、影響または症状を軽減すること、疾患または障害の発症を阻害、改善すること、疾患、障害、または病状に関して有益または望ましい結果（治療上の利益及び／または予防上の利益など）を得ることが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療を包含し、それには、（ａ）疾患を阻害する、すなわち、その発症を阻止すること、及び（ｂ）疾患を緩和する、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことが挙げられる。治療上の利益には、治療されている基礎疾患の根絶または改善が含まれる。また、治療上の利益は、対象が依然として基礎疾患を患っている場合があるものの、対象に改善が見られるような、基礎疾患に関連する１種以上の生理学的症状の根絶または改善をもって達成される。本開示の方法は、任意の哺乳動物または他の動物で使用することができる。場合によって、治療は症状を軽減または停止することができる。予防的効果として、疾患もしくは病態の出現を遅延もしくは解消すること、疾患もしくは病態の症状の発症を遅延もしくは解消すること、疾患もしくは病態の進行を緩徐化する、停止する、もしくは逆転させること、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0114】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本明細書に開示される方法を実施する任意の個体または患者を指す。「対象」という用語は、「個体」または「患者」という用語と同義に使用することができる。対象はヒトであり得るが、当業者には理解されているように、対象は動物であってもよい。したがって、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、及びモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む）、及び霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、及びゴリラを含む）などの哺乳動物を含め、他の動物も対象の定義に包含される。
【0115】
本明細書で提供されるベクターは、神経変性疾患、障害、または病態の治療に有効な量で投与することができる。「有効量」または「治療有効量」という用語は、本明細書で定義される疾患治療を含むがこれに限定されない意図される用途に十分に作用する、本明細書に記載の組成物の量を指す。治療有効量は、意図される治療用途（ｉｎ ｖｉｖｏ）、または治療される対象及び病状、例えば、対象の体重及び年齢、病状の重症度、投与方法などに応じて変更でき、当業者が容易に決定することができる。この用語はまた、標的細胞に特定の反応を誘発する用量に対しても適用される。具体的な用量は、選択された特定の組成物、準拠すべき投与レジメン（他の化合物との併用投与かを問わない）、投与のタイミング、投与される組織、及び搭載される物理的送達系に応じて異なることになる。投与できる例示的なＡＡＶベクター用量として、約１０３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ、１０４ＧＣ／ｋｇ、１０５ＧＣ／ｋｇ、１０６ＧＣ／ｋｇ、１０７ＧＣ／ｋｇ、１０８ＧＣ／ｋｇ、１０９ＧＣ／ｋｇ、１０１０ＧＣ／ｋｇ、１０１１ＧＣ／ｋｇ、１０１２ＧＣ／ｋｇ、１０１３ＧＣ／ｋｇ、１０１４ＧＣ／ｋｇ。及びその間の任意の数または範囲が挙げられるが、それより多いまたは少ない用量を使用することができる。
【0116】
核酸発現カセットは、任意の好適な方法またはベクターによって送達することができる。例示的な方法として、頭蓋内注射、定位注射、及び静脈内注射が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸発現カセットは、ウイルスベクターとして送達される。
【0117】
本明細書に記載の手順には、特に記載のない限り、当技術分野の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養、及びトランスジェニック生物学の従来技術を用いる。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）（１９９２）；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）；Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５，Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．（１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８８）；Ｆｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｆｒｏｍ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（２００５）；Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２００５）；Ｅｎｇｅｌｋｅ，ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）：Ｔｈｅ Ｎｕｔｓ ＆ Ｂｏｌｔｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｇｏｔｔ，ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｅｄｉｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（２００４）；及びＳｏｈａｉｌ，Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ（２００４）を参照）。
【0118】
組成物及び方法をさらに以下で詳細に記載する。本明細書に示す実施例は、そこでの多数の改変及び変形が当業者にとって明らかであるため、例示目的のみであると意図される。
【0119】
本明細書で使用される用語は、概して、本明細書に記載の組成物及び方法の文脈内、ならびに各用語が使用される特定の文脈において、当技術分野における通常の意味を有する。組成物及び方法の記載に関して、追加のガイダンスを医師に提供するために、いくつかの用語を以下で具体的に定義した。
【0120】
本明細書内で言及される特許、特許出願、及び他の科学文書または技術文書はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に例示的に記載される実施形態は、本明細書に具体的に開示されるまたは具体的に開示されない、任意の１つの要素または複数の要素、１つの限定または複数の限定がない状態で適切に実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各事例において、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という用語はいずれも、通常の意味を保持しつつ、他の２つの用語のいずれとも置き換え可能である。本明細書で用いられる用語及び表現は、限定ではなく説明に関する用語として使用され、そのような用語及び表現の使用にあたり、提示及び記載される特徴またはその一部のいかなる等価物も排除することを意図しないが、本発明が特許請求する範囲内で、種々の改変が可能であるものと理解される。したがって、実施形態によって本発明を具体的に開示してきたが、本明細書で開示される任意の特徴、概念の改変及び変形を当業者は用いることができ、そのような改変及び変形は、本明細書及び添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であるとみなされるものと理解されるべきである。
【0121】
本明細書で、範囲、例えば、温度範囲、時間範囲、または組成もしくは濃度の範囲が示されるときはいつでも、中間範囲及び部分範囲のすべて、ならびに所与の範囲に包含される個別値のすべてが本開示に包含される。本明細書の記載に包含される任意の部分範囲、または範囲内もしくは部分範囲内の個別値を、本明細書の態様から除外できるものと理解されよう。本明細書の記載に包含される任意の要素または工程を、特許請求される組成物または方法から除外できるものと理解されよう。
【0122】
加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群または他の代替となる群に関して記載されている場合、それによってマーカッシュ群または他の群の任意の個々の構成要素または構成要素の部分群に関しても本発明が記載されているものと当業者は理解されよう。
【0123】
以下に提示するのは、考察した用途に企図されるプレセニリン１をコードする治療用ポリヌクレオチドについて記載する実施例である。以下は、本発明の実施形態をさらに例示するため、例証目的のみで提供され、上記の広義の用語に記載された本発明の範囲を限定する意図はない。それらは、使用される可能性のある一般的なものであるが、当業者に公知である他の手順、方法論、または技術を代わりに使用してもよい。
【実施例】
【0124】
実施例１
本実施例は、コドン最適化によるヒトプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）ｃＤＮＡの改変について記載する。
本実施例は、コドン最適化によるヒトプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）ｃＤＮＡの改変について記載する。
【0125】
ヒトプレセニリン１遺伝子の天然のｃＤＮＡ配列（ＰＳＥＮ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００２１．４、配列番号１）は以下（配列の項）に示す。このコード配列は配列番号１において下線で示されている。配列番号１に存在するコード配列をコドンに分割し、非許容コドンを下線で示し、配列番号１５に再掲する。タンパク質自体をコードするオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド（ｎｔ）２１３～１６１６に対応する。このｍＲＮＡの注目すべき要素は、長鎖５’非翻訳配列（２１２ｎｔ）と長鎖３’非翻訳配列（４０１２ｎｔ）である。ｎｔ２１３の開始コドンの前には、ＣＴＣＣＡという弱いコザック翻訳開始シグナルがあり、＋１と定義されるＡＵＧ開始コドンのＡ残基と比較して、－３位のＡ残基が欠失している。
【0126】
天然のＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡ（配列番号１）をコドン最適化によって改変した。タンパク質をコードするＤＮＡ配列をタンパク質配列に影響を及ぼさない方法で変更する、いくつかのコドン最適化方法を使用することができる。コドン最適化では、細胞内のコドン使用頻度または同種ｔＲＮＡレベルの存在量の統計的調査に基づいて優先コドンを特定する。
【0127】
配列番号６は、許容される同義コドンの変更のみを可能にするという追加の制約をもつ改変コドン最適化によって生成された、コドン最適化ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡである。許容性は、関連する種の同じタンパク質をコードするＤＮＡ配列の比較によって決定した。例えば、関連する種すべてにおいてコドン選択が同じであれば、このコドン変更が許容されないことを意味する。したがって、変更を許容するコドンのみを、優先同義コドンに改変する。
【0128】
配列番号６は、ｎ＝１１の霊長類ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（表１）に基づいて生成した。このｃＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋから入手し、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡファシリティ（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）を使用してアラインメントした。ＰＳＥＮ１のヒトｃＤＮＡにある４６７のコドンのうち、２６７は１１種すべての間で一定であった。これらを、変更を許容できないコドンとして指定し、配列番号６において保存した。
【0129】
（表１）霊長類ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム
【0130】
変更が許容される残りのコドンについては、ヒト遺伝子においてコドン選択の偏りがある位置に同義コドンを選択した。
【0131】
工程１：ヒトｃＤＮＡを採取した。１１種の霊長類にわたり保存されている２６７のコドンすべてを許可する。表２の規則に従って許容コドンを変更した。
【0132】
（表２）優先最適化コドン
【0133】
実施例２
本実施例は、ＣｐＧジヌクレオチドの除去によるヒトプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）ｃＤＮＡの改変について記載する。
本実施例は、ＣｐＧジヌクレオチドの除去によるヒトプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）ｃＤＮＡの改変について記載する。
【0134】
哺乳動物のＤＮＡには、ＣｐＧジヌクレオチドの選択的メチル化が存在する。これはクロマチンタンパク質の動員に影響を及ぼし、さらにはそれが遺伝子発現に影響を及ぼす。加えて、ウイルス感染の除外を目的とした、新たに導入されたＤＮＡに対する自然免疫応答がある。この自然免疫応答は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを認識するｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）により媒介される。
【0135】
配列番号７では、遺伝暗号の冗長性を利用して、ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドが完全に除去されている。天然ｃＤＮＡでは２４個あるＣｐＧジヌクレオチドの数がゼロに減少した。ＣｐＧジヌクレオチドを除去すると、例えば、ＡＡＶなどのウイルスベクターの認識、及び抗原提示細胞によるポリヌクレオチドの認識を抑制し、遺伝子療法に対する免疫応答を減少させ、それによりポリヌクレオチド発現を延長し、免疫抑制療法の必要性を低減することができる。しかしながら、非許容コドンすべてを維持しながら、同時にＣｐＧジヌクレオチドすべてを除去することは不可能であった。したがって、配列番号７には、その配列に下線で示す６つの非許容コドンへの変更が含まれる。
【0136】
配列番号３６では、遺伝暗号の冗長性を利用して、いずれの非許容コドンも変更せずに、ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドが可能な限り除去されている。この構築物では、天然ｃＤＮＡでは２４個あるＣｐＧジヌクレオチドの数が５に減少した。
【0137】
実施例３
本実施例は、ゲノム配列の組み入れによるヒトプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）ｃＤＮＡの改変について記載する。
本実施例は、ゲノム配列の組み入れによるヒトプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）ｃＤＮＡの改変について記載する。
【0138】
以前の遺伝子療法構築物は、外因性または人工のイントロンを発現カセットに導入していた。例えば、臨床試験に使用される多数のＡＡＶベクターは、ニワトリベータアクチン遺伝子とウサギベータグロビン遺伝子との人工ハイブリッドイントロンを含むＣＡＧプロモーターを使用している。
【0139】
配列番号８は、ｍＲＮＡ前駆体をスプライシング機構に誘導し、それによって核外輸送及び全体的なｍＲＮＡレベルを増強することを意図したハイブリッドゲノム／ｃＤＮＡ ＰＳＥＮ１遺伝子配列である。配列番号８は、エキソン２、イントロン２、エキソン３、イントロン３、エキソン４、イントロン４と、それに続くｃＤＮＡ形態のタンパク質コード遺伝子の残部を含む、短縮ゲノム型ＰＳＥＮ１を表す。イントロン３と４は、例えば、ＡＡＶ遺伝子導入ベクターに挿入するには大きすぎるため、内側で短縮される。理論に束縛されるものではないが、概してスプライシング因子はイントロンの末端付近に結合するため、内側の欠失はスプライシングを妨害しない。
【0140】
重要な点として、ＰＳＥＮ１ ｍＲＮＡには２つの形態が存在し、１つは４６７アミノ酸長の最も豊富なタンパク質をコードし、別の形態（Ｘ２）は４６３アミノ酸型のプレセニリン１をコードする。１２ｎｔ隔てたイントロン３の起点に２つのスプライスドナーが存在する。この位置での選択的スプライシングにより、４つのアミノ酸の欠失が異なるタンパク質をコードする異なるｍＲＮＡになる。この選択的スプライシングの意義は未知だが、アイソフォームＸ２は広範囲の霊長類にわたって発見されている（例えば、マーモット：Ｇｅｎ Ｂａｎｋ参照番号ＸＰ＿０２７７８７３０９．１プレセニリン－１アイソフォーム及びＸＰ＿０２７７８７３１０．１プレセニリン－１アイソフォームＸ２）。これは、いくつかの生理学的意義を示唆している。
【0141】
配列番号８は、選択的スプライシングによるアイソフォームＸ１及びＸ２の生成を可能にするイントロン４の重要な特徴を用いて設計された。理論に束縛されるものではないが、配列番号８は両方のアイソフォームを発現するため、天然ＰＳＥＮ１遺伝子によって得られる全範囲の生理学的効果を提供する。
【0142】
実施例４
本実施例は、ニューロン特異的プロモーター配列の同定について記載する。
本実施例は、ニューロン特異的プロモーター配列の同定について記載する。
【0143】
ニューロンでのＡβ蓄積を防止するには、ＰＳＥＮ１の発現がニューロンに特異的に限定されるべきである。以前に報告されたニューロン特異的発現を伴うＡＡＶ遺伝子療法ベクターには、ニューロン特異的エラスターゼ及びシナプシン１プロモーターが含まれていた。
【0144】
複数の細胞型からＲＮＡ－Ｓｅｑデータを利用可能であり、高度に発現したニューロン特異的遺伝子に関して、偏りのない検索が可能となった（ｗｅｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｂａｒｒｅｓ＿ｌａｂ／ｂｒａｉｎ＿ｒｎａｓｅｑ．ｈｔｍｌを参照）。内皮細胞に対する神経細胞の発現比が高い遺伝子を同定し、ニューロンの発現レベルの低下により分類した。次に、遺伝子を手動で検査して、有用性を制限する可能性のある交絡因子（例えば、母体発現／複数の転写開始部位）をもつ候補を除外した。この方法によって、新規の高度発現したニューロン特異的プロモーター配列を２つ（配列番号２及び配列番号３）同定した。
【0145】
配列番号２は、転写開始部位を基準として－４０７から＋７３までの４８０塩基対（ｂｐ）断片のヒトソマトスタチン遺伝子（ＳＳＴ）を含む。アカゲザル由来のＳＳＴプロモーターの使用については、レンチウイルス遺伝子導入に関連してレポーターポリヌクレオチドのニューロン特異的発現を誘導する約３００ｂｐの断片が以前に報告されている。
【0146】
配列番号３は、ヒト神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーターのｍＲＮＡ開始部を基準として－９５２から＋４８までの１０００ｂｐセグメントを含む。この配列は、脳内で極めて特異的な発現パターンをもたらす。
【0147】
実施例５
本実施例は、ポリヌクレオチド発現を増加させるための調節要素について記載する。
本実施例は、ポリヌクレオチド発現を増加させるための調節要素について記載する。
【0148】
ＨＳ４と呼ばれるヒトベータグロビン遺伝子座由来の配列番号４は、クロマチンインスレーター配列として機能することができる。これは、レンチウイルス遺伝子導入ベクターに関連して、導入されたポリヌクレオチドの継続的な発現を確実にするために使用されてきた。
【0149】
配列番号５は、コザック翻訳開始シグナルである。これを使用して、ＰＳＥＮ１遺伝子の天然ｍＲＮＡの弱い非コンセンサスコザックシグナルを置換することができる。
【0150】
配列番号４及び／または配列番号５は、本明細書に記載の要素及び特徴のいずれかと組み合わせて核酸発現カセットに使用することができる。例えば、配列番号４及び／または配列番号５は、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に示す合成ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡ配列のいずれか１つを含む核酸発現カセットに使用することができる。核酸発現カセットは、配列番号２または配列番号３のニューロン特異的プロモーターのいずれか１つをさらに含み得る。加えて、核酸発現カセットは、ｍＲＮＡの安定性を与えること、またはｍＲＮＡの転写及びプロセシングを増強することにより、ｍＲＮＡ発現を増強する、以下（実施例６）に記載の配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１に示す配列のいずれか１つ、または配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１のいずれかの組み合わせを含み得る。
【0151】
実施例６
本実施例は、ｍＲＮＡに安定性を付与すること、またはｍＲＮＡの転写及びプロセシングを増強することにより、ポリヌクレオチド発現を増強する調節配列について記載する。
本実施例は、ｍＲＮＡに安定性を付与すること、またはｍＲＮＡの転写及びプロセシングを増強することにより、ポリヌクレオチド発現を増強する調節配列について記載する。
【0152】
配列番号９は、ｍＲＮＡの安定性を付与する発現及び核保持要素である。発現及び核保持要素は、ｍＲＮＡの末端ポリアデニル化配列と複合的な二次構造を作り、それによって３’から５’への分解を阻害することによりｍＲＮＡを安定化する。理論に束縛されるものではないが、オープンリーディングフレームの後ろでポリアデニル化部位の前にこの配列を挿入すると、プロモーターｍＲＮＡの安定性が得られることになる。
【0153】
配列番号１０は、天然ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡの３’非コード配列に対応する。理論に束縛されるものではないが、３’非翻訳配列は、ｍＲＮＡの転写及びプロセシングを増強し、それによりポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現を増強する重要な要素を含む場合がある。配列番号１０の一部または全体を、任意のプレセニリンコード配列の５’末端に付加して、発現レベルを増強することができる。
【0154】
配列番号１１は、天然ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡの５’非コード配列に対応する。理論に束縛されるものではないが、５’非翻訳配列は、ｍＲＮＡの安定性を増強し、それによりポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現を増強する重要な要素を含み得る。配列番号１１の一部または全体を、任意のプレセニリンをコードする配列の３’末端に付加して、発現レベルを増強することができる。
【0155】
配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１は、任意の組み合わせで、本明細書に記載の核酸発現カセットに使用することができる。配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１の任意の組み合わせを含む核酸発現カセットは、本明細書に記載の要素及び特徴の組み合わせのいずれかを有し得る。例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１の任意の組み合わせを含む発現カセットは、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に示す合成ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡ配列のいずれか１つを含み得る。核酸発現カセットは、配列番号２または配列番号３のニューロン特異的プロモーターのいずれか１つをさらに含み得る。核酸発現カセットはまた、配列番号４、配列番号５、またはその両方など、ポリヌクレオチド発現を増加させる、さらなる調節要素を含み得る。
【0156】
実施例７
本実施例は、プレセニリン１（ＰＳＥＮ１）発現カセットの設計について記載する。
本実施例は、プレセニリン１（ＰＳＥＮ１）発現カセットの設計について記載する。
【0157】
配列番号２～１１に示す配列を含め、本明細書に記載の任意の要素及び特徴を組み合わせて、プレセニリン１発現カセットに組み込むことができる。例えば、核酸発現カセットは、ＰＳＥＮ１をコードする配列番号６、配列番号７、または配列番号８に示す合成ｃＤＮＡ配列のいずれか１つを含み得る。合成ｃＤＮＡのいずれか１つの発現を、ヒトソマトスタチン（ＳＳＴ）遺伝子に由来する配列番号２またはヒト神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーターに由来する配列番号３のニューロン特異的プロモーターによって誘導することができる。
【0158】
上記に記載する合成ｃＤＮＡ配列及びプロモーター配列のいずれかを有する核酸発現カセットは、ポリヌクレオチド発現を増加させる要素のいずれかをさらに含んでもよく、例えば、これには、配列番号４のクロマチンインスレーター配列、配列番号５のコザックコンセンサス配列、配列番号９のｍＲＮＡ安定性要素、天然ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡに由来する配列番号１０の３’非コード配列、天然ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡに由来する配列番号１１の５’非コード配列、またはこれらの要素の任意の組み合わせが挙げられる。要素の選択は、例えば、目的とする発現レベルに基づいたものであり得る。例えば、発現レベルは、細胞型またはニューロンが存在する脳の領域によって異なる可能性があり、これを、例えば、ｍＲＮＡの転写、プロセシング、安定性、及び／または翻訳など、遺伝子発現の任意の段階に影響を及ぼす調節要素の組み入れまたは除外についての指針または基準として使用することができる。
【0159】
核酸発現カセットを、例えば、ウイルスベクターに組み込むことができる。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターを含め、任意のウイルスベクターを使用することができる。
【0160】
実施例８
本実施例は、２つの異なるコドン最適化ＰＳＥＮ－１構築物の合成、及び各構築物からのプレセニリン１タンパク質の発現、ならびに野生型ＰＳＥＮ－１コード配列を含む構築物からの発現について記載する。
本実施例は、２つの異なるコドン最適化ＰＳＥＮ－１構築物の合成、及び各構築物からのプレセニリン１タンパク質の発現、ならびに野生型ＰＳＥＮ－１コード配列を含む構築物からの発現について記載する。
【0161】
コドン最適化ヒトプレセニリン１をコードする構築物は、霊長類配列にわたって可変であるコドンでのみ、野生型ＰＳＥＮ－１をコードするｃＤＮＡ配列に変更を加えることにより設計した。野生型ＰＳＥＮ－１ ｃＤＮＡ配列には、１１種の霊長類配列にわたって保存される２６７のコドンが含まれている（配列番号１５に下線で示すコドンを参照）。これらの非許容コドンは、変更せず残した。野生型ｃＤＮＡの残り２００の許容コドンを、最適化の対象とみなした。
【0162】
１つの構築物（ｖ２．０）について、保存的コドン変更（小文字の３４コドン）を実施し、配列番号３８を構築した。フェニルアラニン、チロシン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸に翻訳されるコドンの場合、霊長類で同等に使用される２つの異なるコドンのみがこれらのアミノ酸をコードしているため、天然の野生型ＰＳＥＮ－１ ｃＤＮＡコドンを保存した。グルタミンをコードするコドンについては、ＣＡＧを優先した。イソロイシンをコードするコドンについては、ＡＴＡコドンをＡＴＣに変更し、天然配列に存在する場合はＡＴＣまたはＡＴＴのいずれかを維持した。メチオニン（ＡＴＧ）及びトリプトファン（ＴＧＧ）をコードするコドンは変更しなかった。プロリン、トレオニン、及びアラニンをコードするコドンについては、グアニン（Ｇ）で終わるすべてのコドンを、シトシン（Ｃ）で終わる冗長なコドンに変更した。バリン及びグリシンをコードするコドンについては、チミン（Ｔ）またはアデニン（Ａ）で終わるすべてのコドンを、それぞれシトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）で終わる冗長なコドンに変更した。ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＴＣＣ、ＴＣＴ、ＴＣＡ、ＴＴＧ、ＣＴＣ、及びＣＴＧのコドンは変更せず残した。ＣＧＴコドンはＣＧＣに変更した；ＣＧＡコドンはＣＧＧに変更した；ＴＣＧコドンはＴＣＣに変更した；ＴＴＡコドンはＴＴＧに変更した；ＣＴＴコドンはＣＴＣに変更した；ＣＴＡコドンはＣＴＧに変更した。
【0163】
別の構築物（ｖ１．５）について、天然配列と比較して、より多くのコドン変更（小文字の１３８コドン）を実施し、配列番号３７を構築した。この構築物では、トリプトファン、システイン、及びメチオニンに翻訳されるコドンで天然コドンを保存した。グルタミンをコードするコドンについては、ＣＡＡ選択コドンをＣＡＧに変更した。イソロイシンをコードするコドンについては、ＡＴＡ及びＡＴＴ選択コドンをＡＴＣに変更した。プロリンをコードするコドンについては、選択コドンをＣＣＣまたはＣＣＴに変更した。トレオニンをコードするコドンについては、選択コドンをＡＣＣまたはＡＣＡに変更した。アラニンをコードするコドンについては、選択コドンをＧＣＣまたはＧＣＴに変更した。シトシン（Ｃ）で終わらないグリシンをコードするコドンを、シトシン（Ｃ）で終わる冗長なコドンに変更した。バリンをコードするコドンについては、ＧＴＧを優先した。ＡＧＣコドンは、変更せず残した。アスパラギン酸をコードするコドンについては、選択コドンをＧＡＴまたはＧＡＣに変更した。グルタミン酸をコードするコドンについては、ＧＡＡまたはＧＡＧを優先した。フェニルアラニンをコードするコドンについては、ＴＴＴコドンをＴＴＣに変更した。ヒスチジンをコードするコドンについては、ＣＡＴコドンをＣＡＣに変更した。リジンをコードするコドンについては、ＡＡＡ選択コドンをＡＡＧに変更した。ロイシンをコードするコドンについては、ほとんどの選択コドンをＣＴＧに変更した。アスパラギンをコードするコドンについては、ＡＡＴコドンをＡＡＣに変更した。アルギニンをコードするコドンについては、ＡＧＡを優先したが、ＡＧＧ及びＣＧＧコドンも使用した。セリンをコードするコドンについては、ＡＧＣを優先したが、選択コドンでＴＣＣ及びＴＣＴも使用した。チロシンをコードするコドンについては、ＴＡＴコドンをＴＡＣに変更した。
【0164】
ＰＳＥＮ－２．０、ＰＳＥＮ－１．５、及び野生型ＰＳＥＮ－１コード配列のそれぞれを、個別にクローニングベクターｐＣＭＶ６－ＸＬ５（Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）にクローニングした。得られた構築物（ＷＴ（ｐＡＴ００１）、ｖ１．５（ｐＡＴ０１０）、及びｖ２．０（ｐＡＴ０１２））をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、プレセニリン１発現に対するコドン最適化の効果を決定した。トランスフェクション後４８時間で２９３細胞を採取し、３００μＬのＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ塩基／Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０代替品に、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標），Ｍｉｎｉ，ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害カクテル，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈを添加）を使用して溶解し、上清を回収した。ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標）ＰＩＥＲＣＥ（商標）ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイを製造元の指示に従って使用して、各試料の総タンパク質濃度を測定した。
【0165】
細胞溶解物中のヒトプレセニリン１（ＰＳ１）タンパク質を検出するＥＬＩＳＡを、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）ヒトプレセニリン１ ＥＬＩＳＡキットを使用して実施した。非トランスフェクト２９３細胞を使用して、希釈直線性（ＤＬ）及び添加回収（ＳＲ）を評価し、細胞溶解物とこのＥＬＩＳＡキットとの適合性を試験した。表３は、細胞溶解物が、許容される希釈直線性（１：２５０～１：１０００）及び添加回収を呈することを示している。
【0166】
（表３）希釈直線性及び添加回収
【0167】
トランスフェクトした２９３細胞溶解物中のヒトプレセニリン１（ＰＳ１）タンパク質を検出するＥＬＩＳＡを、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）ヒトプレセニリン１ ＥＬＩＳＡキットを使用して実施した。技術的な複製を、製造元の指示に従って１：１０００希釈で実行した。表４及び図１は、プラスミドｐＡＴ０１０をトランスフェクトすると、ＰＳ１発現が天然配列と比較した場合に２．５倍増加したことを示している。
【0168】
（表４）トランスフェクトした２９３細胞溶解物におけるＰＳ１発現
【0169】
実施例９
本実施例は、別のコドン最適化ＰＳＥＮ－１コード配列について記載する。
本実施例は、別のコドン最適化ＰＳＥＮ－１コード配列について記載する。
【0170】
構築物ｖ３．０（配列番号３９）では、野生型ＰＳＥＮ－１コード配列に存在するコドンと比較して、終止コドンと同様に、１４０の許容コドン（小文字で示す）を変更した。メチオニン（ＡＴＧ）及びトリプトファン（ＴＧＧ）をコードするコドンは変更しなかった。グルタミン（Ｑ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＣＡＧに変更した。イソロイシン（Ｉ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＡＴＣに変更した。プロリン（Ｐ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＣＣＣに変更した。トレオニン（Ｔ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＡＣＣに変更した。アラニン（Ａ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＧＣＣに変更した。グリシン（Ｇ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＧＧＣに変更した。バリン（Ｖ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＧＴＧに変更した。アスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＧＡＣに変更した。グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＧＧＣに変更した。フェニルアラニン（Ｆ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＴＴＣに変更した。ヒスチジン（Ｈ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＣＡＣに変更した。リジン（Ｋ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＡＡＧに変更した。ロイシン（Ｌ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＣＴＧに変更した。アスパラギン（Ｎ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＡＣＣに変更した。アルギニン（Ｒ）をコードするコドンについては、ＡＧＧからＣＧＧに変更したコドン３０７を除いて、許容コドンをすべてＡＧＡに変更した。セリン（Ｓ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＡＧＣに変更した。チロシン（Ｙ）をコードするコドンについては、許容コドンをすべてＴＡＣに変更した。
【0171】
実施例１０
本実施例は、２つの異なるコドン最適化ＰＳＥＮ－１コード配列からＣＡＧプロモーターによって誘導されるＰＳＥＮ１の、野生型ＰＳＥＮ１コード配列と比較した相対的発現レベルについて記載する。
本実施例は、２つの異なるコドン最適化ＰＳＥＮ－１コード配列からＣＡＧプロモーターによって誘導されるＰＳＥＮ１の、野生型ＰＳＥＮ１コード配列と比較した相対的発現レベルについて記載する。
【0172】
アンピシリン抗生物質耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に置き換えることによって、プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＭＣＳ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）を改変した。その中のＣＡＧプロモーターの配列は配列番号４０に示されており、配列番号２３に対して９８％の配列同一性を有する。次に、配列番号３９（「ＣＡＧ－ｖ３．０」；ｐＡＴ０２９）、配列番号３７（「ＣＡＧ－ｖ１．５」；ｐＡＴ０２４）いずれかのＰＳＥＮ－１コード配列、または野生型ＰＳＥＮ－１コード配列（配列番号１５；「ＣＡＧ天然型」；ｐＡＴ０２２）を改変プラスミドに挿入し、それらのプラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、プレセニリン１発現に対するコドン最適化の効果を決定した。トランスフェクション後４８時間で２９３細胞を採取し、３００μＬのＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ塩基／Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０代替品に、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標），Ｍｉｎｉ，ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害カクテル，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈを添加）を使用して溶解し、上清を回収した。ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標）ＰＩＥＲＣＥ（商標）ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイを製造元の指示に従って使用して、各試料の総タンパク質濃度を測定した。
【0173】
細胞溶解物中のヒトプレセニリン１（ＰＳ１）タンパク質を検出するＥＬＩＳＡを、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）ヒトプレセニリン１ ＥＬＩＳＡキットを使用して実施した。技術的な複製を、製造元の指示に従って１：４０希釈で実行した。データは両側ｔ検定を使用して分析した。図２は、コドン最適化された配列番号３７または３９を含むプラスミドを用いてトランスフェクトすると、野生型コード配列と比較した場合にＰＳ１発現の増加がもたらされたこと、及び配列番号３７含有プラスミドからのＰＳＥＮ－１発現のレベルが、野生型コード配列からの発現よりも統計的有意な増加を示したこと（アスタリスクｐ＜０．０５で示す）を表す。配列番号３９含有プラスミドからのＰＳＥＮ－１発現は、野生型コード配列と比較して、発現が増加する傾向を示した（ｐ＝０．１００）。
【0174】
要約すると、ニューロンでの目的とする発現レベルに応じて、コドン最適化、ＣｐＧジヌクレオチドの除外、ならびにゲノム配列、ニューロン特異的プロモーター配列、及び遺伝子発現の任意の段階、例えば、ｍＲＮＡ転写、プロセシング、安定性、及び／または翻訳などを増強する他の調節要素の組み入れに基づき、合成ｃＤＮＡ配列を組み合わせることができる。上記に記載の要素のうち、タンパク質生成に対して相対的に小さい影響を及ぼし得る一部または全部を細胞型、神経細胞の位置、及び他の要因に応じて組み合わせることにより、ポリヌクレオチド発現を増強する複数のモードを組み合わせると、核酸発現カセットまたはベクター分子からの発現を相対的に大きく増加させることができる。
【0175】
実施例１１
本実施例は、ＦＡＤ患者の線維芽細胞のガンマセクレターゼ活性に対する、コドン最適化ＰＳＥＮ－１ヌクレオチド配列の効果について記載する。
本実施例は、ＦＡＤ患者の線維芽細胞のガンマセクレターゼ活性に対する、コドン最適化ＰＳＥＮ－１ヌクレオチド配列の効果について記載する。
【0176】
ＰＳＥＮ１のＣ４１０ＹまたはＧ２０６Ａ突然変異を有する家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）患者からの初代皮膚線維芽細胞に、空の非コードプラスミド（ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＭＣＳ－ＫａｎＲ）または配列番号３７のヒトコドン最適化プレセニリン－１（ｈＰＳＥＮ１ｖ１．５）のいずれかを含む、Ｎｏｔｃｈ１断片（Ｎｏｔｃｈ１ΔＥ）をコードするプラスミドをエレクトロポレーションした。
【0177】
実施例１０に記載されるように、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に置き換えて、ｃＤＮＡプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＭＣＳ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）を改変し、得られるプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＭＣＳ－ＫａｎＲを作成した。得られるプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＭＣＳ－ＫａｎＲは、対照として使用するか、またはさらに改変して、コドン最適化ヒトプレセニリン１コード配列（配列番号３７）を組み入れ、機能的ガンマ－セクレターゼ活性を評価した。Ｎｏｔｃｈ１ΔＥプラスミドは、ヒトＮｏｔｃｈ１の膜貫通ドメイン及び一部の細胞内ドメインをコードするが、Ｎｏｔｃｈ１の細胞外ドメイン全体を欠失している。細胞内部で、Ｎｏｔｃｈ１ΔＥはガンマ－セクレターゼによって切断される。これを切断断片ＮＩＣＤに対する抗体特異性により検出することができる（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４１４７）。ガンマ－セクレターゼ活性は、公知のガンマ－セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ５９４２）で阻害することができる。
【0178】
コドン最適化構築物が機能的であるかどうかを決定するために、ＮＩＣＤをｈＰＳＥＮ１ｖ１．５（３μｇ）での処理後に測定し、２つのＰＳＥＮ１病原性突然変異（Ｃ４１０ＹまたはＧ２０６Ａ）のうち１つを含有するＦＡＤ患者線維芽細胞における非コードプラスミドと比較した。エレクトロポレーションの２４時間後に線維芽細胞の一部をＤＡＰＴ阻害剤に曝露し、トランスフェクション後４８時間で採取し、１００μＬのＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ塩基／Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０代替品に、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標），Ｍｉｎｉ，ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害カクテル，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈを添加）を使用して溶解し、上清を回収した。ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標）ＰＩＥＲＣＥ（商標）ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイを製造元の指示に従って使用して、各試料の総タンパク質濃度を測定した。
【0179】
技術的複製からの総タンパク質溶解物を、製造元の指示に従ってニトロセルロース膜に電気転写した。細胞溶解物中の切断されたＮｏｔｃｈ（ＮＩＣＤ）を検出するためのウエスタンブロットは、推奨条件を使用して実施した。図３は、配列番号３７を含有するプラスミドのトランスフェクションにより、Ｃ４１０Ｙ及びＧ２０６Ａ両方のＰＳＥＮ１変異型線維芽細胞において、非コード構築物（空）と比較した場合にＮＩＣＤが増加したことを示している。
【0180】
実施例１２
本実施例は、ＦＡＤ患者の線維芽細胞のＡβ４０レベルに対する、コドン最適化ＰＳＥＮ－１ヌクレオチド配列の効果について記載する。
本実施例は、ＦＡＤ患者の線維芽細胞のＡβ４０レベルに対する、コドン最適化ＰＳＥＮ－１ヌクレオチド配列の効果について記載する。
【0181】
機能的ガンマ－セクレターゼ活性を評価するために、ＰＳＥＮ１にＣ４１０Ｙ突然変異を有する家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）患者からの初代皮膚線維芽細胞に、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）Ｃ９９断片をコードするプラスミド、及びそれぞれ上記に記載する、非コード空プラスミド（ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＭＣＳ－ＫａｎＲ）またはコドン最適化ヒトプレセニリン１コード配列ｐＡＴ０２８（配列番号３７）を含有する同様のプラスミドのいずれかをエレクトロポレーションした。細胞内部で、Ｃ９９がガンマ－セクレターゼによって順次切断され、さまざまな長さのＡβペプチドが生成された後、これを細胞培養培地に放出する。
【0182】
コドン最適化構築物の機能性を決定するために、上記のプラスミドを用いた細胞のエレクトロポレーションに続いて、細胞培養培地中のＡβ４０を測定した。トランスフェクション後４８時間で細胞培養培地を回収し、ＭＳＤ ＥＬＩＳＡを用いてＡβ４０について分析した。データは両側ｔ検定を使用して分析した。図４は、配列番号３７を含有するプラスミドのトランスフェクションにより、Ｃ４１０Ｙ ＦＡＤ線維芽細胞において、非コード構築物（空）と比較した場合に、Ａβ４０生成が増加し、統計的有意となる傾向（ｐ＝０．２３）を表すことを示している。
【0183】
実施例１３
本実施例は、本発明の部分的にコドン最適化されたＰＳＥＮ－１コード配列を含む種々のＡＡＶベクターの合成について記載する。
本実施例は、本発明の部分的にコドン最適化されたＰＳＥＮ－１コード配列を含む種々のＡＡＶベクターの合成について記載する。
【0184】
本発明のＰＳＥＮ－１コード配列を含有するＡＡＶウイルスベクターを調製するために、本発明者らは、上記に記載するｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＭＣＳ－ＫａｎＲプラスミドからＣＡＧプロモーターを除去し、様々な発現カセットでそれを置き換えた。各発現カセットには、配列番号３７のＰＳＥＮ－１コード配列及びポリアデニル化配列に機能的に連結された異なるプロモーターを組み込んだ。加えて、これらのカセットにはさらに、プロモーターとＰＳＥＮ－１コード配列との間にヒトベータグロビンイントロン；ヒトベータグロビンイントロンとＰＳＥＮ－１コード配列との間にあるＨＡタグ（対象での使用前に除去することができる）；ポリアデニル化配列に続く、ヒト成長ホルモンまたはアルブミンのいずれかのゲノムのスタッファー配列を組み込んだ。これらの発現カセットのそれぞれの配列及びそれらに隣接するＡＡＶ２ ＩＴＲ（改変ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＭＣＳ－ＫａｎＲプラスミドにすでに存在する）を配列番号４１～４６に示す。
【0185】
自己相補的ＡＡＶベクターの生成では、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＭＣＳ－ＫａｎＲの５’ＡＡＶ２ ＩＴＲを、発現カセットの挿入前に改変する。この構築物の発現カセットには、ＣＢＡプロモーター、マウス微小ウイルスのイントロン、対象での使用前に除去できるＨＡタグ、配列番号３７、及びウサギβ－グロビンポリアデニル化配列を組み込んだ。挿入される改変ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＭＣＳ－ＫａｎＲプラスミドからの改変５’及び天然３’ＡＡＶ２ ＩＴＲを含むこの発現カセットの配列を配列番号４７に示す。
【0186】
発現カセットを含有する、得られるベクターゲノムプラスミドのそれぞれを、トリプルプラスミドトランスフェクション法（Ｘｉａｏ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：２２２４－２２３２，１９９８）を使用した組換えＡＡＶベクターの作成に使用した。この方法では、対象となる血清型に特異的なＡＡＶ血清型特異的ｒｅｐ及びｃａｐプラスミド、ならびにベクターゲノムＤＮＡプラスミドを使用したが、第３のプラスミドで必須Ａｄ遺伝子を供給することによりＡｄ感染の使用を除外した。付着性ＨＥＫ２９３細胞のマルチプラスミド一過性トランスフェクションは、ｒＡＡＶ生成に広く使用されている方法であり（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：２７４５－２７６０，１９９８；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：９３８－９４５，１９９８）、組換えＡＡＶベクターの作成に使用することができる。ＡＡＶ粒子は、ｐＨ約７．４の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、または０．００１％プルロニック酸（Ｆ－６８）を添加した、１０ｍＭリン酸ナトリウムと１８０ｍＭ ＮａＣｌ中で調製することができる。
【0187】
配列
配列番号１
＞ＮＭ＿００００２１．４ホモサピエンスプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ。下線はコード配列
配列番号２
＞ヒトＳＳＴプロモーター
配列番号３
＞ヒトＮＰＹプロモーター
配列番号４
＞ＨＳ４クロマチンインスレーター
配列番号５
＞コザックコンセンサス配列
ｃｃａｃｃ
配列番号６
＞許容される非優先コドンをすべて高優先同義コドンに変更したヒトＰＳＥＮ１。小文字は変更したコドン：
配列番号７
＞ＣｐＧジヌクレオチドをすべて除去し、許容コドンをすべて高優先同義コドンに変更し、ＣｐＧジヌクレオチドを除去した結果、非許容コドンの一部が変更された、合成ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡ。小文字は変更したコドン；小文字かつ下線は、変更された非許容コドン。
配列番号８
＞ゲノム／ｃＤＮＡハイブリッドＰＳＥＮ１遺伝子
配列番号９
＞ＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡ安定性要素
配列番号１０
＞天然ＰＳＥＮ１ ＲＮＡ由来の３’隣接配列
配列番号１１
＞天然ＰＳＥＮ１ ｍＲＮＡ由来の５’隣接配列
配列番号１２
＞ＸＰ＿０１１５３５２７４．１ヒトプレセニリン－１アイソフォームＸ１［４６７アミノ酸］
配列番号１３
＞ヒトＰＳＥＮ１ ４６３アミノ酸アイソフォームＸ２の遺伝子（ｃＤＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００７３１８．３）
配列番号１４
＞プレセニリン－１アイソフォームＸ２［４６３アミノ酸］
配列番号１５
＞プレセニリン－１アイソフォームＸ１コード配列。下線は非許容コドン
一本鎖ＡＡＶ２の逆方向末端反復（ＩＴＲ）
配列番号１６
ｎｃ＿００１４０１．２、ｎｔ１～１４５及び４５３５～４６７９
＞左側ＩＴＲ
配列番号１７
＞右側ＩＴＲ
自己相補的ＡＡＶ２の逆方向末端反復
配列番号１８
＞左側ＩＴＲ
配列番号１９
＞右側ＩＴＲ
イントロン
配列番号２０
＞ＭＶＭ ＮＣ＿００１５１０．１、マウス微小ウイルスのイントロンｎｔ２３１２～２４０３
配列番号２１
＞ハイブリッドアデノウイルスＳＤ／ＩｇＧ ＳＡ；ａｃ＿０００００８．１アデノウイルス５型トリプレットリーダー、ｎｔ５７３～７５８、及びｎｃ＿００００７８．６ハツカネズミ株ｃ５７ｂｌ／６ｊ ｎｔ１１５１５８７３６～１１５１５８６９５
配列番号２２
＞ｈＢＧイントロン、キメラｃｍｖプロモーター６０１～７３４、ｃｍｖイントロン１ １２６３～１２９４、続いてベータ－グロビン遺伝子のイントロンｉｉ。イントロンの３’末端は、ベータグロビン遺伝子のエキソン３の最初の２０ヌクレオチドと融合される。
プロモーター
配列番号２３
＞ＣＡＧ ｌｔ７２７５１８．１、ｎｔ３０７４～４７５０
配列番号２４
＞ＣＢＡ ｎｃ＿００６２７３．２、ｎｔ１７５６２５～１７５２９４、及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｘ００１８２．１、ｎｔ２８０～５４０。
配列番号２５
＞ＵＢＣ ｄ６３７９１ ｎｔ３５５３～４７２９
配列番号２６
＞ＰＧＫ ｎｃ＿００００８６．７ １０６１８６７２５～１０６１８７２３５
配列番号２７
＞Ｅｆ１ａ ｊ０４６１７．１ ｎｔ３７９～１５６０
配列番号２８
＞ＣＭＶ
配列番号２９
＞ドブネズミニューロン特異的エノラーゼ遺伝子ａｂ０３８９９３．１、ｎｔ１０２３～２７１５に類似するＮＳＥ
配列番号３０
＞ＭｅＣＰ２ ｎｃ＿００００８６．７ ｎｔ－６７７～＋５６、マウスｍｅｃｐ２メチルｃｐｇ結合タンパク質２
配列番号３１
＞ＧＦＡＰ ｎｃ＿００００１７．１１ ｎｔ－１９９１－０、ホモサピエンスグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）
配列番号３２
タグ
＞ＨＡ
ポリアデニル化シグナル
配列番号３３
＞ｈＧＨ ｎｇ＿０１１６７６．１ ｎｔ６５３７～７０１３
配列番号３４
＞ｒＢＧ ａｈ００１２２２．２、ｎｔ１６２３～１７４９
配列番号３５
＞ｒＢＧ ａｈ００１２２２．２、ｎｔ１６９０～１７４５
配列番号３６
許容コドンのみを改変することにより、最大数のＣｐＧジヌクレオチドを除去した合成ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡ。変更したコドンを小文字で示す。
配列番号３７
ｈＰＳＥＮ１ｖ１．５。ある特定の許容コドンを高優先同義コドンに変更したＰＳＥＮ１。変更したコドンを小文字で示す。
配列番号３８
ｈＰＳＥＮ１ｖ２．０。ある特定の許容コドンを高優先同義コドンに変更したＰＳＥＮ１。変更したコドンは小文字である。
配列番号３９
ｈＰＳＥＮ１ｖ３．０。許容コドンを高優先同義コドンに変更したＰＳＥＮ１。変更したコドンは小文字である。
配列番号４０
ｐＡＴ０２９、ｐＡＴ０２４、及びｐＡＴ０２２に使用されるＣＡＧプロモーター
配列番号４１
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１４１、４５５３～４６９３）、プレセニリン１プロモーター（下線２３７～１２００）、合成ヒトベータ－グロビンイントロン（１２２１～１７８６）、ＨＡタグ（１８６６～１８９８）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、１８９９～３２９９）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化配列（３３３０～３８０６）、及びアルブミンゲノム配列（３８１０～４５２２）を含有する、ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号４２
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１４１、４５５４～４６９４）、ユビキチンＣプロモーター（下線２３７～１３２３）、合成ヒトベータ－グロビンイントロン（１３４４～１９０９）、ＨＡタグ（１９８９～２０１５）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、１９８３～３４１６）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化（３４４７～３９２３）、及びヒト成長ホルモンゲノム配列（３９２４～４５２３）を含有する、ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号４３
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１４１、４５５４～４６９４）、ＣＢＡプロモーター（下線２３７～８９０）、合成ヒトベータ－グロビンイントロン（９１１～１４７６）、ＨＡタグ（１５５６～１５８２）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、１５５０～２９８３）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化（３０１４～３４９０）、及びヒト成長ホルモンゲノム配列（３０１４～３４９１）を含有する、ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号４４
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１４１、４５００～４６４０）、ＥＦ－１アルファプロモーター（下線２３７～１４１５）、合成ヒトベータ－グロビンイントロン（１４３６～２００１）、ＨＡタグ（２０８１～２１０７）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、２０７５～３５０８）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化（３５３９～４０１５）、及びヒト成長ホルモンゲノム配列（４０１６～４４６９）を含有する、ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号４５
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１４１、４５３３～４６７３）、ＰＧＫプロモーター（下線２３７～６６３）、合成ヒトベータ－グロビンイントロン（６８４～１２４９）、ＨＡタグ（１３２９～１３５５）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、１３２３～２７５６）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化（２７８７～３２６３）、及びヒト成長ホルモンゲノム配列（３２６４～４５０２）を含有する、ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号４６
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１４１、４５５４～４６９４）、シナプシン１プロモーター（下線２３７～６８４）、合成ヒトベータ－グロビンイントロン（７０５～１２７０）、ＨＡタグ（１３５０～１３７６）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、１３４４～２７７７）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化（２８０８～３２８４）、及びヒト成長ホルモンゲノム配列（３２８５～４５２３）を含有する、ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号４７
天然及び改変ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１０５、２３８６～２５２６）、ＣＢＡプロモーター（下線１１３～７６６）、マウス微小ウイルスのイントロン（７７６～８６７）、ＨＡタグ（８８４～９１０）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、８８１～２３１１）、ウサギベータ－グロビンポリアデニル化配列（２３１９～２３６７）を含有する、自己相補的ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号１
＞ＮＭ＿００００２１．４ホモサピエンスプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ。下線はコード配列
配列番号２
＞ヒトＳＳＴプロモーター
配列番号３
＞ヒトＮＰＹプロモーター
配列番号４
＞ＨＳ４クロマチンインスレーター
配列番号５
＞コザックコンセンサス配列
ｃｃａｃｃ
配列番号６
＞許容される非優先コドンをすべて高優先同義コドンに変更したヒトＰＳＥＮ１。小文字は変更したコドン：
配列番号７
＞ＣｐＧジヌクレオチドをすべて除去し、許容コドンをすべて高優先同義コドンに変更し、ＣｐＧジヌクレオチドを除去した結果、非許容コドンの一部が変更された、合成ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡ。小文字は変更したコドン；小文字かつ下線は、変更された非許容コドン。
配列番号８
＞ゲノム／ｃＤＮＡハイブリッドＰＳＥＮ１遺伝子
配列番号９
＞ＭＡＬＡＴ１ ｍＲＮＡ安定性要素
配列番号１０
＞天然ＰＳＥＮ１ ＲＮＡ由来の３’隣接配列
配列番号１１
＞天然ＰＳＥＮ１ ｍＲＮＡ由来の５’隣接配列
配列番号１２
＞ＸＰ＿０１１５３５２７４．１ヒトプレセニリン－１アイソフォームＸ１［４６７アミノ酸］
配列番号１３
＞ヒトＰＳＥＮ１ ４６３アミノ酸アイソフォームＸ２の遺伝子（ｃＤＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００７３１８．３）
配列番号１４
＞プレセニリン－１アイソフォームＸ２［４６３アミノ酸］
配列番号１５
＞プレセニリン－１アイソフォームＸ１コード配列。下線は非許容コドン
一本鎖ＡＡＶ２の逆方向末端反復（ＩＴＲ）
配列番号１６
ｎｃ＿００１４０１．２、ｎｔ１～１４５及び４５３５～４６７９
＞左側ＩＴＲ
配列番号１７
＞右側ＩＴＲ
自己相補的ＡＡＶ２の逆方向末端反復
配列番号１８
＞左側ＩＴＲ
配列番号１９
＞右側ＩＴＲ
イントロン
配列番号２０
＞ＭＶＭ ＮＣ＿００１５１０．１、マウス微小ウイルスのイントロンｎｔ２３１２～２４０３
配列番号２１
＞ハイブリッドアデノウイルスＳＤ／ＩｇＧ ＳＡ；ａｃ＿０００００８．１アデノウイルス５型トリプレットリーダー、ｎｔ５７３～７５８、及びｎｃ＿００００７８．６ハツカネズミ株ｃ５７ｂｌ／６ｊ ｎｔ１１５１５８７３６～１１５１５８６９５
配列番号２２
＞ｈＢＧイントロン、キメラｃｍｖプロモーター６０１～７３４、ｃｍｖイントロン１ １２６３～１２９４、続いてベータ－グロビン遺伝子のイントロンｉｉ。イントロンの３’末端は、ベータグロビン遺伝子のエキソン３の最初の２０ヌクレオチドと融合される。
プロモーター
配列番号２３
＞ＣＡＧ ｌｔ７２７５１８．１、ｎｔ３０７４～４７５０
配列番号２４
＞ＣＢＡ ｎｃ＿００６２７３．２、ｎｔ１７５６２５～１７５２９４、及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｘ００１８２．１、ｎｔ２８０～５４０。
配列番号２５
＞ＵＢＣ ｄ６３７９１ ｎｔ３５５３～４７２９
配列番号２６
＞ＰＧＫ ｎｃ＿００００８６．７ １０６１８６７２５～１０６１８７２３５
配列番号２７
＞Ｅｆ１ａ ｊ０４６１７．１ ｎｔ３７９～１５６０
配列番号２８
＞ＣＭＶ
配列番号２９
＞ドブネズミニューロン特異的エノラーゼ遺伝子ａｂ０３８９９３．１、ｎｔ１０２３～２７１５に類似するＮＳＥ
配列番号３０
＞ＭｅＣＰ２ ｎｃ＿００００８６．７ ｎｔ－６７７～＋５６、マウスｍｅｃｐ２メチルｃｐｇ結合タンパク質２
配列番号３１
＞ＧＦＡＰ ｎｃ＿００００１７．１１ ｎｔ－１９９１－０、ホモサピエンスグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）
配列番号３２
タグ
＞ＨＡ
ポリアデニル化シグナル
配列番号３３
＞ｈＧＨ ｎｇ＿０１１６７６．１ ｎｔ６５３７～７０１３
配列番号３４
＞ｒＢＧ ａｈ００１２２２．２、ｎｔ１６２３～１７４９
配列番号３５
＞ｒＢＧ ａｈ００１２２２．２、ｎｔ１６９０～１７４５
配列番号３６
許容コドンのみを改変することにより、最大数のＣｐＧジヌクレオチドを除去した合成ＰＳＥＮ１ ｃＤＮＡ。変更したコドンを小文字で示す。
配列番号３７
ｈＰＳＥＮ１ｖ１．５。ある特定の許容コドンを高優先同義コドンに変更したＰＳＥＮ１。変更したコドンを小文字で示す。
配列番号３８
ｈＰＳＥＮ１ｖ２．０。ある特定の許容コドンを高優先同義コドンに変更したＰＳＥＮ１。変更したコドンは小文字である。
配列番号３９
ｈＰＳＥＮ１ｖ３．０。許容コドンを高優先同義コドンに変更したＰＳＥＮ１。変更したコドンは小文字である。
配列番号４０
ｐＡＴ０２９、ｐＡＴ０２４、及びｐＡＴ０２２に使用されるＣＡＧプロモーター
配列番号４１
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１４１、４５５３～４６９３）、プレセニリン１プロモーター（下線２３７～１２００）、合成ヒトベータ－グロビンイントロン（１２２１～１７８６）、ＨＡタグ（１８６６～１８９８）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、１８９９～３２９９）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化配列（３３３０～３８０６）、及びアルブミンゲノム配列（３８１０～４５２２）を含有する、ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号４２
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１４１、４５５４～４６９４）、ユビキチンＣプロモーター（下線２３７～１３２３）、合成ヒトベータ－グロビンイントロン（１３４４～１９０９）、ＨＡタグ（１９８９～２０１５）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、１９８３～３４１６）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化（３４４７～３９２３）、及びヒト成長ホルモンゲノム配列（３９２４～４５２３）を含有する、ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号４３
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１４１、４５５４～４６９４）、ＣＢＡプロモーター（下線２３７～８９０）、合成ヒトベータ－グロビンイントロン（９１１～１４７６）、ＨＡタグ（１５５６～１５８２）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、１５５０～２９８３）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化（３０１４～３４９０）、及びヒト成長ホルモンゲノム配列（３０１４～３４９１）を含有する、ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号４４
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１４１、４５００～４６４０）、ＥＦ－１アルファプロモーター（下線２３７～１４１５）、合成ヒトベータ－グロビンイントロン（１４３６～２００１）、ＨＡタグ（２０８１～２１０７）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、２０７５～３５０８）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化（３５３９～４０１５）、及びヒト成長ホルモンゲノム配列（４０１６～４４６９）を含有する、ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号４５
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１４１、４５３３～４６７３）、ＰＧＫプロモーター（下線２３７～６６３）、合成ヒトベータ－グロビンイントロン（６８４～１２４９）、ＨＡタグ（１３２９～１３５５）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、１３２３～２７５６）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化（２７８７～３２６３）、及びヒト成長ホルモンゲノム配列（３２６４～４５０２）を含有する、ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号４６
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１４１、４５５４～４６９４）、シナプシン１プロモーター（下線２３７～６８４）、合成ヒトベータ－グロビンイントロン（７０５～１２７０）、ＨＡタグ（１３５０～１３７６）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、１３４４～２７７７）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化（２８０８～３２８４）、及びヒト成長ホルモンゲノム配列（３２８５～４５２３）を含有する、ＡＡＶ生成用発現カセット。
配列番号４７
天然及び改変ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１～１０５、２３８６～２５２６）、ＣＢＡプロモーター（下線１１３～７６６）、マウス微小ウイルスのイントロン（７７６～８６７）、ＨＡタグ（８８４～９１０）、コドン最適化ヒトプレセニリン１ｖ１．５（大文字、配列番号３７、８８１～２３１１）、ウサギベータ－グロビンポリアデニル化配列（２３１９～２３６７）を含有する、自己相補的ＡＡＶ生成用発現カセット。
【0188】
本開示を通じてなされた、特許、特許出願、特許刊行物、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書に対する参照及び引用はすべて、目的を問わず、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【0189】
上記の実施例において、本発明の特定の実施形態に関する具体的な詳細を参照して本発明を説明してきたが、改変例及び変形例は本発明の趣旨及び範囲内に包含されるものと理解されよう。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【手続補正書】
【提出日】2023-01-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】