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特表2023-504461化粧品および医薬品に使用するためのペプチドおよび組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-03

(54)【発明の名称】化粧品および医薬品に使用するためのペプチドおよび組成物

(51)【国際特許分類】

C07K 7/06 20060101AFI20230127BHJP

A61K 8/64 20060101ALI20230127BHJP

A61Q 19/00 20060101ALI20230127BHJP

A61K 38/08 20190101ALI20230127BHJP

A61P 17/00 20060101ALI20230127BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20230127BHJP

【ＦＩ】

C07K7/06

A61K8/64 ZNA

A61Q19/00

A61K38/08

A61P17/00

A61P29/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022532114

(86)(22)【出願日】2020-11-30

(85)【翻訳文提出日】2022-07-28

(86)【国際出願番号】 EP2020083983

(87)【国際公開番号】W WO2021110608

(87)【国際公開日】2021-06-10

(31)【優先権主張番号】19383075.9

(32)【優先日】2019-12-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519271311

【氏名又は名称】リポトゥルー，エセ．エレ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯＷＯＲＬＤＰＡＴＥＮＴ＆ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】グラウ－カンピスタニー，アリアドナ

(72)【発明者】

【氏名】パストル，シルヴィア

(72)【発明者】

【氏名】カルラ，パトリシア

(72)【発明者】

【氏名】エスクデロ，フアンカルロス

【テーマコード（参考）】

4C083

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C083AA082

4C083AB362

4C083AC112

4C083AC122

4C083AC292

4C083AC302

4C083AC312

4C083AC352

4C083AC372

4C083AC422

4C083AC532

4C083AD152

4C083AD162

4C083AD411

4C083AD412

4C083CC02

4C083CC14

4C083EE12

4C083EE13

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA17

4C084BA23

4C084CA59

4C084NA14

4C084ZA89

4C084ZB11

4C084ZC52

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA14

4H045BA50

4H045EA15

4H045FA33

(57)【要約】

本発明は、ＩＬ－３３の発現を調節することができ、したがって、皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥の低減、予防および／または排除に役立つペプチドおよびその組成物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

６個のアミノ酸を含むペプチド、その異性体、塩、溶媒和物および／または塩の溶媒和物および／またはそれらの混合物であって、該ペプチドが少なくとも３個のアルギニンを含むことを特徴とする、ペプチド。

【請求項2】

前記６個のアミノ酸が、３個のアルギニン、１個のグルタミン、１個のメチオニンおよび１個のグルタミン酸であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

以下の式（Ｉ）：
Ｒ_１－ＡＡ_１－ＡＡ_２－ＡＡ_３－ＡＡ_４－ＡＡ_５－ＡＡ_６－Ｒ_２
に従う配列を有し、
Ｒ_１は、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアラルキルおよびＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここでＲ_５は、置換または非置換のＣ_１－Ｃ_２４アルキルラジカル、置換または非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルケニル、置換または非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルキニル、置換または非置換のＣ_３－Ｃ_２４シクロアルキル、置換または非置換のＣ_５－Ｃ_２４シクロアルケニル、置換または非置換のＣ_８－Ｃ_２４シクロアルキニル、置換または非置換のＣ_６－Ｃ_３０アリール、置換または非置換のＣ_７－Ｃ_２４アラルキル、３～１０員からなる置換または非置換のヘテロシクリル環および、炭素原子の数２～２４、炭素以外の原子の数１～３、および炭素原子の数１～６のアルキル鎖からなる置換または非置換のヘテロアリールアルキルから選択され、
Ｒ_２は、Ｈ、－ＮＲ_３Ｒ_４－、－ＯＲ_３および－ＳＲ_３から選択され、Ｒ_３およびＲ_４は、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族基、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキルから独立して選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチド。

【請求項4】

Ａｒｇ－Ａｒｇをその配列内に含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項5】

Ａｒｇ－Ｇｌｕをその配列内に含むことを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項6】

Ｍｅｔ－Ａｒｇをその配列内に含むことを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項7】

ペプチドの配列が、
Ｒ_１－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｒ_２
Ｒ_１－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ｒ_２
Ｒ_１－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｒ_２
であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項8】

ペプチドの配列が、
Ａｃ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－ＮＨ_２
Ａｃ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－ＮＨ_２
Ａｃ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＮＨ_２
であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物。

【請求項10】

化粧品としての使用であって、
請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項９に記載の組成物の、それを必要とする対象における、化粧品としての使用。

【請求項11】

化粧品としての使用が、皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥の治療のためであることを特徴とする、請求項１０に記載の化粧品としての使用。

【請求項12】

皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥が、眼袋、瞼の欠陥、眼の周囲の皺、眼窩骨膜血色素増加症、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１１に記載の化粧品としての使用。

【請求項13】

皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥が、睡眠遮断に関連することを特徴とする、請求項１２に記載の化粧品としての使用。

【請求項14】

薬剤として使用するための、請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項９に記載の組成物。

【請求項15】

炎症に基づく瞼のたるみの治療に使用するための、請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項９に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は分子生物学の分野に関し、より正確には化粧品および／または医薬に適用される分子生物学に関し、さらに正確には、皮膚の若返りのために皮膚老化徴候を低減、予防および／または排除することができ、および／または、皮膚の欠陥、より正確には眼における皮膚の欠陥を低減、予防および／または排除することができる、ペプチドおよび前記ペプチドを含む組成物に関する。より好ましくは、本発明は眼のケアおよび／または眼に関連する状態の治療に有効なペプチドおよびそれらを含む組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

過去数十年間、個人の美観に関する人々の関心が高まっており、皮膚老化徴候の出現を遅らせ、または最小限に抑えようとする試みがなされている。

【0003】

皮膚はヒトにおいて最大の臓器であり、身体界面におけるその位置のために、内因性（慢性）加齢および外因性加齢を受け、後者は環境要因（例えば、紫外線、喫煙、汚染または睡眠遮断など）によって引き起こされる。

【0004】

この意味で、最も一般的な皮膚老化徴候のいくつかは顔面に位置し（顔面皮膚老化徴候）、より正確には眼の周囲に位置し、例えば、眼袋、瞼の欠陥、眼の周囲の皺、および暗円（眼窩骨膜血色素増加症）に位置する。これらはまた、それらの存在および／または増加がより老化した外観を提供するので、社会においてより多くの懸念を引き起こす皮膚老化徴候の中にある。したがって、これら全ての徴候の予防および／または治療に対する関心がある。

【0005】

最も重要な瞼の欠陥は、瞼の垂れ下がりおよび／または瞼のたるみに関連するものである。これは、通常、加齢とともに眼の周囲の皮膚や筋肉が弱くなり、瞼がたるむためである。太陽への曝露および老化の自然な影響は、目の周りの皮膚をよりたるませる可能性がある。老化に関し、皮膚は老化に伴って弾性が低下し、顔面は膨らみが少なく硬くなるので、その結果、しばしば、眼の周りの皮膚が緩くなるか、または過剰になる。瞼のたるみは、さまざまな理由や、内科的疾患や美容上の異常が原因で起こる。通常、瞼のたるみは、皮膚弛緩症、下垂症（例えば、腱膜性下垂症および腱膜性眼瞼下垂症）、外反および内反による（ＷｅｎｄｅｌｌＤａｍａｓｃｅｎｏ，Ｒ．ｅｔａｌ．Ｅｙｅｌｉｄａｇｉｎｇ：ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｍａｇｅｍｅｎｔ，ＡｒｑＢｒａｓＯｆｔａｌｍｏｌ．２０１５；７８（５）：３２８－３１）。瞼の欠陥（好ましくは瞼のたるみ）が通常、非炎症に基づく瞼のたるみと呼ばれる場合、美容上の状態と考えられるが、炎症に基づく瞼のたるみの欠陥（例えば、広範な瞼のたるみ）の場合、それらは視野喪失、眼または瞼の刺激および頭痛をもたらし得、したがって、医学的状態である。

【0006】

技術水準で周知のように、皮膚老化徴候の大部分は酸化ストレスおよび／または炎症によって生成されるかまたは由来し、酸化ストレスおよび／または炎症は、時系列老化によってまたは環境因子（例えば紫外線または睡眠遮断）によって引き起こされる。

【0007】

インターロイキン－３３（以下、ＩＬ－３３）は、ＩＬ－１ファミリーのメンバーである。これは、細胞外アラームメディエーターと同様に、遺伝子発現の細胞内調節因子としての役割を発揮するデュアル機能を有する炎症誘導因子である。これは、オーファンＩＬ－１ファミリー受容体のヘテロ二量体膜結合受容体であるＳＴ２のリガンドである。

【0008】

ＩＬ－３３は線維芽細胞、マスト細胞、樹状細胞、マクロファージ、骨芽細胞、内皮細胞、および上皮細胞（ケラチノサイトなど）を含む多種多様な細胞型によって発現される（Ｍａｒｔｉｎ，Ｎ．Ｔ．ａｎｄＭａｒｔｉｎ，Ｍ．Ｕ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３３ｉｓａｇｕａｒｄｉａｎｏｆｂａｒｒｉｅｒｓａｎｄａｌｏｃａｌａｌａｒｍｉｎ，ＮａｔｕｒｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１６）１７，１２２－１３１）。

【0009】

ホメオスタシスの間、核ＩＬ－３３は、肺、皮膚および胃などの上皮障壁組織において構成的に高レベルに発現される。全長の生物活性ＩＬ－３３は、アレルゲンへの曝露またはウイルスまたは寄生虫への感染に続いて、組織損傷および細胞死（または細胞ストレス）に際して核から細胞外に放出される。放出後、ＩＬ－３３は肥満細胞を含む様々な種類の免疫細胞、および最も重要なことには大量のＩＬ－５およびＩＬ－１３を分泌するＩＬＣ２を活性化することによって、免疫系における「アラーム」を上昇させる。プログラムされた細胞死（アポトーシス）の後、ＩＬ－３３はカスパーゼによって不活性化され、不必要に免疫系に警告することを避ける。全長ＩＬ－３３は活性であるが、炎症性プロテアーゼ（カテプシンＧ、エラスターゼ）によって、より短い「過剰活性」成熟形態にプロセシングされ得、これはインビボでの重要な生物活性形態であり得る。

【0010】

ＩＬ－３３の作用の範囲および持続時間は、ＳＴ２へのその結合を阻害するその急速な酸化によって調節される。

【0011】

近年、ＩＬ－３３はそれが参加することを明らかにした多数のシグナル伝達過程、したがってそれが多数の美容上の特徴および医学的特徴において有するように思われる重要な役割のために、注意を集めており、例えば以下の通りである：
皮膚炎症：ＵＶ放射線への曝露はケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞においてＩＬ－３３発現を誘導する（ＮａｐｉｅｒＢｙｒｎｅ，Ｓ．，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｉｍｍｕｎｅ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇｃｙｔｏｋｉｎｅａｎｄｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓａｌａｒｍｉｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３ｉｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｓｋｉｎｅｘｐｏｓｅｄｔｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＵＶＢＲａｄｉａｔｉｏｎ．ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１７９（２０１１），２１１－２２２）。
皮膚障壁：ＩＬ－３３は、皮膚障壁調節効果を有する。ＩＬ－３３の増加は、フィラグリンの発現の低下を生じ、アレルゲン、細菌およびウイルスの入口を促進する皮膚障壁を妨害する（Ｓｅｌｔｍａｎｎ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．ＩＬ３３ｉｍｐａｃｔｓｏｎｔｈｅｓｋｉｎｂａｒｒｉｅｒｂｙｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｉｌａｇｇｒｉｎ．ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌｕｍｅ１３５，Ｎｕｍｂｅｒ６，ｐａｇｅｓ１６５９－１６６１）。
血管分布：ＩＬ－３３は血管新生および血管透過性を促進する（Ｃｈｏｉ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３ｉｎｄｕｃｅｓａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｔｈｒｏｕｇｈＳＴ２／ＴＲＡＦ６－ｍｅｄｉａｔｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ，１Ｏｃｔｏｂｅｒ２００９，ｖｏｌｕｍｅ１１４，ｎｕｍｂｅｒ１４，ｐａｇｅｓ３１１７－３１２６）。
色素沈着：ＩＬ－３３はメラノサイトにおけるメラニン生合成を改善することにより、プロメラニン形成活性を有する（Ｚｈｏｕ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｐ３８ＭＡＰＫａｎｄＰＫＡｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏ－ｍｅｌａｎｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３３ｉｎｐｒｉｍａｒｙｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，７３（２０１４），１１０－１１６）。

【0012】

したがって、ＩＬ－３３は、ケラチノサイトの凝集性の減少、色素沈着の増加および炎症および血管透過性の増加を生じ、したがって、上記の全ての皮膚徴候と関係する。

【0013】

睡眠遮断（これは、最適な睡眠時間より短い、睡眠期間の完全な欠如、または概日パターンの変化である）もまた、皮膚において重要な影響を有し、皮膚老化および／または皮膚の欠陥の促進因子である。睡眠遮断に関連するいくつかの皮膚属性には、粗い、鈍い、および乾燥した皮膚、ならびに瞼の垂れ下がりおよび暗い眼球が含まれる。この効果は視覚的特性に限定されないが、睡眠遮断は皮膚障害の悪化、皮膚障壁の完全性の障害、炎症性サイトカイン、グルココルチコイドの生成の増加、ならびにグルコースおよびコルチゾールレベルの増加およびメラトニンレベルの低下などの皮膚の健康および生理に影響を及ぼし得る（Ｋｉｍ，Ｍ．Ａ．ｅｔａｌ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｌｅｅｐｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｆａｃｉａｌｓｋｉｎ，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（２０１７）７，３４－４７；およびＧｕａｎＬ．，ＭｅｈｒａＲ．，ＢａｒｏｎＥ．（２０１７）ＳｌｅｅｐａｎｄＡｇｉｎｇＳｋｉｎ．Ｉｎ：ＦａｒａｇｅＭ．，ＭｉｌｌｅｒＫ．，ＭａｉｂａｃｈＨ．（ｅｄｓ）ＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＡｇｉｎｇＳｋｉｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）。

【0014】

グルコース濃度の上昇は皮膚の線維芽細胞と同様にケラチノサイトの増殖に負の影響を与える（Ｋｒｕｓｅ，Ｃ．Ｒ．ｅｔａｌ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｌｏｃａｌｈｙｐｅｒｇｌｕｃｅｍｉａｏｎｓｋｉｎｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｏｎｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇｉｎｅｕｇｌｙｃｅｍｉｃｒａｔｓ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｕｒｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ（２０１６）２０６，４１８－４２６）。皮膚線維芽細胞の増殖障害は、高齢者の皮膚で認められる創傷治癒の遅延と同様に、創傷治癒の遅延をもたらす（Ｂｕｒａｎａｓｉｎ，Ｐ．，Ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｍｐａｉｒｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｇｉｎｇｉｖａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＰＬｏＳＯＮＥ（２０１８）１３）。

【0015】

グルコース濃度の増加がこれらのケラチノサイトの最終分化および形態の変化をもたらすという証拠もある（Ｓｐｒａｖｃｈｉｋｏｖ，Ｎ．ｅｔａｌ．Ｇｌｕｃｏｓｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｓｋｉｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００１）５０，１６２７－１６３５）。これらの最終分化した細胞は、新しい細胞を生み出す能力を失い、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤のアップレギュレーションと細胞周期の陽性のメディエーターのダウンレギュレーションを介して終末状態で停止する。

【0016】

高血糖はしばしばインスリン欠乏またはインスリン抵抗性を伴い、自己調節障害および微小血管の透過性亢進も引き起こす。

【0017】

コルチゾールに関して、皮膚では、グルココルチコイド濃度の上昇が透過性障壁恒常性の低下、角層凝集の低下、創傷治癒の低下、表皮の先天性免疫の低下に変換され（Ａｌｔｅｍｕｓ，Ｍ．，Ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄｃｈａｎｇｅｓｉｎｓｋｉｎｂａｒｒｉｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｈｅａｌｔｈｙｗｏｍｅｎ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２００１）１１７，３０９－３１７）、これらはすべて、ひいては皮膚の内因性老化につながる可能性がある。さらに、睡眠遮断は過剰なグルココルチコイド分泌を誘導し、したがって皮膚老化を増強する生理的ストレスを引き起こす可能性がある。過剰のグルココルチコイドはまた、脂質の合成を阻害し、層状体のより低い生成および分泌を引き起こし、これは、表皮障壁へのさらなる損傷をもたらし得る。

【0018】

皮膚細胞は、メラトニンが発毛サイクル、毛髪色素沈着、黒色腫制御、抗酸化活性、皮膚細胞への紫外線誘発損傷の抑制などの複数の生命機能において役割を果たすことを可能にする膜結合型および核メラトニン受容体の両方を発現する（Ｓｌｏｍｉｎｓｋｉ，Ａ．，Ｏｎｔｈｅｒｏｌｅｏｆｍｅｌａｔｏｎｉｎｉｎｓｋｉｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ（２００５）２７，１３７－１４８）。メラトニンは、酸化ストレスからの老化関連皮膚変化を低下させ、ＵＶ誘発性皮膚老化に対する保護を通して皮膚の外因性老化を防止することが示されている。メラトニンの調節異常は最終的に皮膚の完全性に悪影響を及ぼし、メラトニンの皮膚に対する天然アンチエイジング効果を妨げる。これは、ＵＶ損傷による皮膚の外因性老化の増加と、酸化ストレスによる皮膚の内因性老化の両方につながる。

【0019】

さらに、メラトニンは抗酸化性とスカベンジャー特性を有している（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｅｌａｔｏｎｉｎａｓａｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｈｕｍａｎｓ，ＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍＰｏｌ（２００３）５０，１１２９－１１４６）。

【0020】

メラトニンはまた、ケラチノサイト上の高血糖損傷を減少させ、炎症誘発性サイトカインレベルを低下させる（Ｓｏｎｇ，Ｒ．，Ｍｅｌａｔｏｎｉｎｐｒｏｍｏｔｅｓｄｉａｂｅｔｉｃｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ＡｍＪＴｒａｎｓｌＲｅｓ（２０１６）８，４６８２－４６９３）。

【0021】

近年、皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を改善するための活性成分の数が著しく増加している。そのような活性成分の例は、レチノイド、ビタミンまたは植物抽出物である（ＢｒａｄｌｅｙＥ．Ｊ．，ＧｒｉｆｆｉｔｈｓＣ．Ｅ．Ｍ．，ＳｈｅｒｒａｔｔＭ．Ｊ．，ＢｅｌｌＭ．ａｎｄＷａｔｓｏｎＲ．Ｅ．Ｂ．（２０１５），Ｏｖｅｒ－ｔｈｅ－ｃｏｕｎｔｅｒａｎｔｉ－ａｇｅｉｎｇｔｏｐｉｃａｌａｇｅｎｔｓａｎｄｔｈｅｉｒａｂｉｌｉｔｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｄｒｅｐａｉｒｐｈｏｔｏａｇｅｄｓｋｉｎ．Ｍａｔｕｒｉｔａｓ，８０，２６５－２７２）。

【0022】

レチノイドの場合、注目すべきはレチノイン酸であり、このレチノイン酸は現在、数分子のＥＣＭ（例えば、コラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニン）の合成誘導のための「ゴールドスタンダード」である（ＶａｒａｎｉＪ．，ＭｉｔｒａＲ．Ｓ．，ＧｉｂｂｓＤ．，ＰｈａｎＳ．Ｈ．，ＤｉｘｉｔＶ．Ｍ．，ＭｉｔｒａＲ．，ＷａｎｇＴ．，ＳｉｅｂｅｒｔＫ．Ｊ．，ＮｉｃｋｏｌｏｆｆＢ．Ｊ．，ＶｏｏｒｈｅｅｓＪ．Ｊ．（１９９０），Ａｌｌ－ＴｒａｎｓＲｅｔｉｎｏｉｃＡｃｉｄＳｔｉｍｕｌａｔｅｓＧｒｏｗｔｈａｎｄＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭａｔｒｉｘＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＧｒｏｗｔｈ－ＩｎｈｉｂｉｔｅｄＣｕｌｔｕｒｅｄＨｕｍａｎＳｋｉｎＦｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，９４，７１７－７２３）。したがって、レチノイン酸はコラーゲンおよびフィブロネクチンなどのＥＣＭのタンパク質の転写および合成とマトリックスメタロプロテイナーゼ（以下、ＭＭＰ）の阻害をアップレギュレートすることにより、顔の皺の臨床的外観を顕著に改善することができるので、老化の徴候を治療する最も強力な化合物の１つと考えられている（ＶａｒａｎｉＪ．，ＭｉｔｒａＲ．Ｓ．，ＧｉｂｂｓＤ．，ＰｈａｎＳ．Ｈ．，ＤｉｘｉｔＶ．Ｍ．，ＭｉｔｒａＲ．，ＷａｎｇＴ．，ＳｉｅｂｅｒｔＫ．Ｊ．，ＮｉｃｋｏｌｏｆｆＢ．Ｊ．，ＶｏｏｒｈｅｅｓＪ．Ｊ．（１９９０），Ａｌｌ－ＴｒａｎｓＲｅｔｉｎｏｉｃＡｃｉｄＳｔｉｍｕｌａｔｅｓＧｒｏｗｔｈａｎｄＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭａｔｒｉｘＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＧｒｏｗｔｈ－ＩｎｈｉｂｉｔｅｄＣｕｌｔｕｒｅｄＨｕｍａｎＳｋｉｎＦｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，９４，７１７－７２３）。しかしながら、レチノイン酸の使用にはいくつかの欠点があり、その理由は例えば、レチノイン酸は皮膚刺激を容易に生じさせ得るので慎重に使用されなければならず、レチノイン酸と日光曝露とを組み合わせることは推奨されないからである。レチノイドを使用する場合の別の主要な問題は、特に酸素および光の存在下でのそれらの不安定性である（ＳｏｒｇＯ．，ＡｎｔｉｌｌｅＣ．，ＫａｙａＧ．ａｎｄＳａｕｒａｔＪ－Ｈ．（２００６），Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓｉｎｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ．ＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｈｅｒａｐｙ，１９，２８９－２９６）。

【0023】

抗酸化剤はまた、皮膚中のフリーラジカルの濃度を減少させ、したがってコラーゲン分解を妨げるために使用される。前記酸化防止剤の例はアスコルビン酸（ビタミンＣとしても知られる）である。アスコルビン酸はその酸化防止作用に加えて、とりわけ、表皮分化を促進し、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１（ＭＭＰ１）を阻害しながら、ＥＣＭ（コラーゲンＩおよびＩＩＩならびにエラスチン）からのタンパク質の合成を誘導する。残念ながら、アスコルビン酸は極めて不安定であり、特に高い温度、好気性条件、高いｐＨにおいて、および／または光に曝露された場合に酸化を受ける（Ｍａｎｅｌａ－ＡｚｕｌａｙＭ．，ＡｚｕｌａｙＶ．，ＡｇｕｉｎａｇａＦ．，ＩｓｓａＭ．Ｃ．（２０１７），ＶｉｔａｍｉｎｓａｎｄｏｔｈｅｒＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ．ＤａｉｌｙＲｏｕｔｉｎｅｉｎＣｏｓｍｅｔｉｃＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１－１３）。

【0024】

化学的に合成された化合物に加えて、例えば、レスベラトロール（抗酸化剤）を含むブドウ抽出物；ポリフェノールを含む緑茶；またはイソフラボンを含む大豆など、広範囲の植物抽出物および植物由来化合物が多数の用途で市販されている。しかしながら、これらの組成物のインビボ効力および組成は、十分に科学的に検証されていない。

【0025】

ヒアルロン酸はその粘弾性特性および水を保持するその能力のために、皮膚を水和状態に保ち、弾性を維持し、粗さを改善することによって皺を処置するために化粧品産業においても使用されているか、または皮膚充填剤としても使用されている。しかし、現在、ヒアルロン酸はいくつかの供給源（例えば、ロスターコームまたは細菌抽出物）から得られ、そしてその結果、これらの製品は、不純物を含み得、そして徹底的に特徴付けられる必要がある（ＫｏｇａｎＧ．，ＳｏｌｔｅｓＬ．，ＳｔｅｒｎＲ．ａｎｄＧｅｍｅｉｎｅｒＰ．（２００７），Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ：ａｎａｔｕｒａｌｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｗｉｔｈａｂｒｏａｄｒａｎｇｅｏｆｂｉｏｍｅｄｉｃａｌａｎｄｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌＬｅｔｔｅｒｓ２９，１７－２５）。

【0026】

他方、ペプチドは、皮膚老化徴候を改善するために化粧用処方に組み込むこともできる。生体活性ペプチドは体自身の分子を模倣し、コラーゲン合成などの処理に影響を及ぼすことができ、耐容性および安定性がはるかに良好であるという利点を有する。さらに、広範囲の活性、成分および適応症をそれらのために開発することができる（ＺｈａｎｇＬ．ａｎｄＦａｌｌａＴ．Ｊ．（２００９），Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓａｎｄｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃｓｉｎｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２７，４８５－４９４）。

【0027】

技術水準における広範囲にわたる種々の化合物および／または抽出物にもかかわらず、皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を低減、予防および／または排除することを可能にする新規な作用機構を有する改善された活性薬剤および組成物が依然として必要とされており、より正確には、ＩＬ－３３を標的とし、所望されかつ必要とされる美容上の効果および医学的効果を提供する新規な分子（好ましくは生体分子）を見出す必要がある。

【発明の概要】

【0028】

本発明の発明者らは広範囲にわたる徹底的な調査の後、驚くべきことに、ＩＬ－３３の発現を調節する（ダウンレギュレートする）ことができ、したがって、化粧品および医薬品において有益であるペプチドを見出した。本発明のペプチドは、皮膚の老化徴候および／または皮膚の欠陥、より好ましくは顔の皮膚の老化、より好ましくは眼またはその周囲の皮膚の老化徴候および／または皮膚の欠陥、さらにより好ましくは眼袋、瞼の欠陥、眼の周囲の皺および暗円（眼窩骨膜血色素増加症）を低減、予防および／または排除することができる。さらに、本発明のペプチドはまた、驚くべきことに、睡眠遮断によって生じる皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を低減、予防および／または排除することができる。上記のように、本発明のペプチドはそれらの活性のために、医学においても有効である。

【0029】

第１の態様において、本発明は、ＩＬ－３３の発現を調節する（ダウンレギュレートする）ことができるペプチドを指す。上記のように、本発明のペプチドは、皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥の予防、減少および／または治療のための化粧品および医薬品において有効である。

【0030】

さらに、第２の態様において、本発明は、本発明の少なくとも１つのペプチドを含む組成物を指す。

【0031】

第３の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは化粧組成物の化粧品としての使用を指す。

【0032】

第４の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは化粧組成物の美容使用を指す。

【0033】

第５の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは化粧組成物の使用を含む、それを必要とする対象の化粧治療のための方法を指す。

【0034】

第６の態様において、本発明は、薬剤として使用するための本発明のペプチドまたは薬学的組成物を指す。

【0035】

第７の態様において、本発明は、薬剤の製造のための本発明のペプチドまたは薬学的組成物の使用を指す。

【0036】

最後の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは薬学的組成物の使用を含む、それを必要とする対象の医学的治療のための方法を指す。

【0037】

用語「非環状脂肪族基」およびその複数形は、本明細書で使用される場合、当該用語に対する技術水準で与えられる共通の意味を有する。したがって、これらの用語は例えば、直鎖または分岐アルキル、アルケニルおよびアルキニル基を指すが、これらに限定されない。

【0038】

用語「アルキル基」およびその複数形は、本明細書で使用される場合、１～２４個、好ましくは１～１６個、より好ましくは１～１４個、さらにより好ましくは１～１２個、さらにより好ましくは１、２、３、４、５、または６個の炭素原子を有し、単結合によって残りの分子に結合される、飽和した、直鎖または分岐鎖基を指し、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、ラウリル、ヘキサデシル、オクタデシル、アミル、２－エチルヘキシル、２－メチルブチル、５－メチルヘキシルなどを含むが、これらに限定されない。アルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。

【0039】

用語「アルケニル基」およびその複数形は、本明細書中で使用される場合、２～２４個、好ましくは２～１６個、より好ましくは２～１４個、さらにより好ましくは２～１２個、さらにより好ましくは２、３、４、５または６個の炭素原子を有し、好ましくは１、２または３個の炭素－炭素二重結合（共役または非共役）を有し、単結合を介して残りの分子に結合される直鎖または分岐鎖基を指し、例えば、ビニル、オレイル、リノレイルおよび類似の基を含むが、これらに限定されない。アルケニル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。

【0040】

用語「アルキニル基」およびその複数形は、本明細書中で使用される場合、２～２４個、好ましくは２～１６個、より好ましくは２～１４個、さらにより好ましくは２～１２個、さらにより好ましくは２、３、４、５または６個の炭素原子を有し、好ましくは１、２または３個の炭素－炭素三重結合（共役または非共役）を有し、単結合を介して残りの分子に結合される直鎖または分枝鎖基を指し、例えば、エチニル基、１－プロピニル、２－プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、３－ブチニル、１－ペンチニルなどのペンチニルおよび類似の基を含むが、これらに限定されない。アルキニル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。

【0041】

用語「脂環式基」およびその複数形は、本明細書中で使用される場合、当該用語に対して技術水準で与えられる共通の意味を有する。したがって、これらの用語は例えば、シクロアルキルまたはシクロアルケニルまたはシクロアルキニル基を指すために使用されるが、これらに限定されない。

【0042】

用語「シクロアルキル」およびその複数形は、本明細書で使用される場合、３～２４個、好ましくは３～１６個、より好ましくは３～１４個、さらにより好ましくは３～１２個、さらにより好ましくは３、４、５または６個の炭素原子を有し、単結合を介して分子の残りに結合される飽和単環または多環脂肪族基を指し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、メチルシクロヘキシル、ジメチルシクロヘキシル、オクタヒドロインデン、デカヒドロナフタレン、ドデカヒドロフェナレン、アダマンチルなどを含むが、これらに限定されず、場合によってはアルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の基によって置換することができる。

【0043】

用語「シクロアルケニル」およびその複数形は、本明細書で使用される場合、５～２４個、好ましくは５～１６個、より好ましくは５～１４個、さらにより好ましくは５～１２個、さらにより好ましくは５または６個の炭素原子を有し、好ましくは１、２または３個の炭素－炭素二重結合（共役または非共役）を有し、単結合を介して分子の残りに結合される非芳香族単環または多環脂肪族基を指し、例えば、シクロペント－１－エン－１－イル基および同様の基を含むがこれらに限定されず、場合によってはアルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の基によって置換することができる。

【0044】

用語「シクロアルキニル」およびその複数形は、本明細書で使用される場合、８～２４個、好ましくは８～１６個、より好ましくは８～１４個、さらにより好ましくは８～１２個、さらにより好ましくは８～９個の炭素原子を有し、好ましくは１、２または３個の炭素－炭素三重結合（共役または非共役）を有し、単結合を介して分子の残りに結合される非芳香族単環または多環脂肪族基を指し、例えば、シクロオクト－２－ｙｎ－１－イル基などを含むがこれに限定されず、場合によってはアルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の基によって置換することができる。

【0045】

用語「アリール基」およびその複数形は、本明細書中で使用される場合、６～３０個、好ましくは６～１８個、より好ましくは６～１０個、さらにより好ましくは６または１０個の炭素原子を有し、炭素－炭素結合または縮合によって結合された１、２、３または４個の芳香環を含み、単結合を介して残りの分子に結合される芳香族基を指し、例えば、フェニル、ナフチル、ジフェニル、インデニル、フェナントリルまたはアントラニルを含むがこれらに限定されない。アリール基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。

【0046】

用語「アラルキル基」およびその複数形は、本明細書で使用される場合、７～２４個の炭素原子を有する、芳香族基によって置換されたアルキル基を指し、例えば、－（ＣＨ_２）１－６－フェニル、－（ＣＨ_２）１－６－（１－ナフチル）、－（ＣＨ_２）１－６－（２－ナフチル）、－（ＣＨ_２）１－６－ＣＨ（フェニル）_２などを含むが、これらに限定されない。アラルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。

【0047】

用語「複素環基」およびその複数形は、本明細書中で使用される場合、３～１０員のヘテロシクイル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｙｌ）または炭化水素環を指し、ここで、環原子の１つ以上、好ましくは環原子の１、２または３は炭素とは異なる元素（例えば、窒素、酸素または硫黄）であり、そして飽和または不飽和であり得る。本発明の目的のために、ヘテロ環状は、融合環系を含み得る環状、単環状、二環状または三環系であり得、窒素、炭素または硫黄原子は、任意に、ヘテロ環状ラジカル中で酸化され得；窒素原子は任意に、四元化され得；ヘテロ環状ラジカルは部分的または完全に飽和され得るか、または芳香族であり得る。好ましくは、複素環との用語は、５または６員環に関する。複素環基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。

【0048】

用語「ヘテロアリールアルキル基」およびその複数形は、本明細書で使用される場合、置換または非置換芳香族ヘテロシクリル基で置換されたアルキル基を指し、アルキル基は１～６個の炭素原子を有し、芳香族ヘテロシクリル基は２～２４個の炭素原子および炭素以外の１～３個の原子を有し、例えば、－（ＣＨ_２）１－６－イミダゾリル、－（ＣＨ_２）１－６－トリアゾリル、－（ＣＨ_２）１－６－チエニル、－（ＣＨ_２）１－６－フリル、－（ＣＨ_２）１－６－ピロリジニルなどを含むが、これらに限定されない。ヘテロアリールアルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。

【0049】

本明細書で使用される「ハロ」または「ハロゲン」という用語はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指し、そのアニオンはハロゲン化物と呼ばれる。

【0050】

本明細書中で使用される場合、用語「誘導体」およびその複数形は、化粧品または薬剤の調製において使用され得る目的の化合物に由来する化粧用および／または薬学的に許容される化合物と、化粧用および／または薬学的に許容されない化合物との両方を指し、なぜなら、後者は、化粧用および／または薬学的に許容される誘導体の調製において有用であり得るからである。

【0051】

本明細書で使用される「塩」およびその複数形は、技術水準で知られているもの中からの任意の種類の塩、例えば、ハロゲン化物塩、ヒドロキシ酸塩（オキシ酸塩、酸性塩、塩基性塩、および二重塩など）、ヒドロキソ塩、混合塩、オキシ塩、または他の水和塩を指す。この用語は化粧用および／または薬学的に許容される塩；ならびに化粧用および／または薬学的に許容されない塩の両方を含み、なぜなら、後者は、化粧用および／または薬学的に許容される塩の調製に有用であり得るからである。

【0052】

本明細書で使用される場合、用語「異性体」およびその複数形は、光学異性体、エナンチオマー、立体異性体またはジアステレオマーを指す。個々のエナンチオマーまたはジアステレオマー、ならびにそれらの混合物は、技術水準で知られている従来の技術によって分離することができる。

【0053】

本明細書中で使用される場合、「溶媒和物」という語およびその複数形は、極性、無極性または両親媒性溶媒和物のような、技術水準で公知の任意の溶媒和物をいい、そして目的の対象に投与または適用される場合に（直接的または間接的に）目的の化合物（本発明のペプチド）を提供する、任意の化粧用に許容される溶媒和物を含む。好ましくは溶媒和物は、水和物、メタノール、エタノール、プロパノールまたはイソプロパノールなどのアルコールとの溶媒和物、酢酸エチルなどのエステルとの溶媒和物、メチルエーテル、エチルエーテルまたはＴＨＦ（テトラヒドロフラン）などのエーテルとの溶媒和物、またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）との溶媒和物であり、より好ましくはエタノールなどのアルコールとの水和物または溶媒和物である。

【0054】

さらに、本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」およびその複数形は、それらが天然であるか否かにかかわらず、そしてそれらがＤ－およびＬ－アミノ酸であるかどうかにかかわらず、コドンによってコード化されたアミノ酸ならびにコード化されていないアミノ酸を含む。コード化されていないアミノ酸の例は特に限定されないが、シトルリン、オルニチン、サルコシン、デスモシン、ノルバリン、４－アミノ酪酸、２－アミノ酪酸、２－アミノイソ酪酸、６－アミノヘキサン酸、１－ナフチルアラニン、２－ナフチルアラニン、２－アミノ安息香酸、４－アミノ安息香酸、４－アミノフェニルアラニン、２，３－ジアミノプロピオン酸、２，４－ジアミノ酪酸、シクロセリン、カルニチン、システイン、ペニシラミン、ピログルタミン酸、チエニルアラニン、ヒドロキシプロリン、アロ－イソロイシン、アロ－トレオニン、イソニペコチン酸、イソセリン、フェニルグリシン、スタチン、β－アラニン、ノルロイシン、Ｎ－メチルアミノ酸、α－アミノ酸およびβ－アミノ酸およびそれらの誘導体である。それにもかかわらず、さらなる非天然アミノ酸は、技術水準で公知である（例えば、“Ｕｎｕｓｕａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” ｂｙＤ．Ｃ．ＲｏｂｅｒｔｓａｎｄＦ．Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ，ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．５（１９８３），ＣｈａｐｔｅｒＶＩ，ＧｒｏｓｓＥ．ａｎｄＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒＪ．，Ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＵＳＡを参照のこと）。

【0055】

ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に関する「同一性の率」は、本明細書中で使用される場合、技術水準において一般に帰する意味を有し、したがって、これらの配列の最適なアラインメント後に比較される２つのアミノ酸配列間で同一であるアミノ酸の率に関連し、ここで、前記率は単に統計的であり、２つのアミノ酸配列間の差異は、配列全体にわたってランダムに分布する。「最適アラインメント」は、より大きな同一性割合を生じるアミノ酸配列のアラインメントとして理解される。同一性の割合はアミノ酸が２つの比較された配列において同一である同一位置の数を決定し、同一位置の数を比較された位置の数で割り、そして２つの配列間の同一性の割合を得るために１００によって得られた結果を掛けることによって計算される。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、手動で、またはＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）アルゴリズムなどの技術水準で知られているコンピュータプログラムによって行うことができる。

【0056】

本明細書中で使用される場合、「暗円」および「眼窩骨膜血色素増加症」は、互換的に使用され、そしてそれらが技術水準において一般的に有する意味を獲得する。手短に言えば、暗円または眼窩骨膜血色素増加症は、通常、眼窩周囲のメラニン沈着、青みがかった色および眼の周りの真皮毛細血管網の可視性、ならびに皮膚および頬の下降の薄化を提供する皮下脂肪の損失を特徴とする。

【0057】

本明細書中で使用される場合、ＩＬ３３は、タンパク質インターロイキン－３３をコードする遺伝子を指す。

【0058】

本明細書中で使用される場合、ＩＬ－３３は、タンパク質インターロイキン－３３を指す。

【0059】

上記のように、第１の態様において、本発明は、少なくとも３個のアルギニンを含むことを特徴とする、６個のアミノ酸を含むペプチドを指す。

【0060】

上記のように、本発明のペプチドは遺伝子ＩＬ３３および／またはタンパク質インターロイキン－３３の発現を調節し、より好ましくは、遺伝子ＩＬ３３および／またはタンパク質インターロイキン－３３の発現をダウンレギュレートする。

【0061】

本発明のペプチドの異性体、塩、溶媒和物および／または誘導体ならびに混合物；より好ましくは、本発明のペプチドの化粧用および／または薬学的に許容される異性体、塩、溶媒和物および／または誘導体ならびに混合物もまた、本発明に含まれる。

【0062】

本発明のペプチドに使用または存在するアミノ酸は、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸またはそれらの組み合わせであることが意図される。好ましい実施形態では、本発明のペプチドにおいて使用されるかまたは存在するアミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。

【0063】

好ましくは、上記の異性体は立体異性体である。前記立体異性体は、エナンチオマーまたはジアステレオマーであることが意図される。したがって、本発明の好ましい実施形態では、ペプチドは、ラセミ混合物、ジアステレオマー混合物、純粋なエナンチオマーまたは純粋なジアステレオマーである。

【0064】

好ましい実施形態では本発明のペプチドにおいて、前記６つのアミノ酸は３つのアルギニン、１つのグルタミン、１つのメチオニンおよび１つのグルタミン酸である。

【0065】

また好ましくは、本発明のペプチドが式（Ｉ）：
Ｒ_１－ＡＡ_１－ＡＡ_２－ＡＡ_３－ＡＡ_４－ＡＡ_５－ＡＡ_６－Ｒ_２
に従う配列を有し、
Ｒ_１は、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアラルキルおよびＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここでＲ_５は、置換または非置換のＣ_１－Ｃ_２４アルキルラジカル、置換または非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルケニル、置換または非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルキニル、置換または非置換のＣ_３－Ｃ_２４シクロアルキル、置換または非置換のＣ_５－Ｃ_２４シクロアルケニル、置換または非置換のＣ_８－Ｃ_２４シクロアルキニル、置換または非置換のＣ_６－Ｃ_３０アリール、置換または非置換のＣ_７－Ｃ_２４アラルキル、３～１０員からなる置換または非置換のヘテロシクリル環および、炭素原子の数２～２４、炭素以外の原子の数１～３、および炭素原子の数１～６のアルキル鎖からなる置換または非置換のヘテロアリールアルキルから選択され、
Ｒ_２は、Ｈ、－ＮＲ_３Ｒ_４－、－ＯＲ_３および－ＳＲ_３から独立に選択され、Ｒ_３およびＲ_４は、Ｈ、置換または非置換の非環状脂肪族基、置換または非置換のアリシクリル、置換または非置換のヘテロシクリル、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキルから独立して選択される。

【0066】

Ｒ_１は好ましくはＨまたはＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここでＲ_５は、置換または非置換のＣ_１－Ｃ_２４アルキルラジカル、置換または非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルケニル、置換または非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルキニル、置換または非置換のＣ_３－Ｃ_２４シクロアルキル、置換または非置換のＣ_５－Ｃ_２４シクロアルケニル、置換または非置換のＣ_８－Ｃ_２４シクロアルキニル、置換または非置換のＣ_６－Ｃ_３０アリール、置換または非置換のＣ_７－Ｃ_２４アラルキル、３～１０員からなる置換または非置換のヘテロシクリル環および炭素原子の数２～２４、炭素以外の原子の数１～３、炭素原子の数１～６のアルキル鎖の置換または非置換のヘテロアリールアルキルから選択される。さらにより好ましくは、Ｒ_１は、Ｈ、アセチル（以下、Ａｃ）、ｔｅｒｔ－ブタノイル、ヘキサノイル、２－メチルヘキサノイル、シクロヘキサンカルボキシル、オクタノイル、デカノイル、ラウロイルミリストイル、パルミトイル（以下、Ｐａｌ）、ステアロイル、オレオイルおよびリノレオイルから選択される。さらにより好ましくは、Ｒ_１はＡｃである。

【0067】

好ましくは、Ｒ_２は－ＮＨ_２である。

【0068】

したがって、より好ましくは、Ｒ_１はＡｃであり、Ｒ_２は－ＮＨ_２である。

【0069】

好ましくは、本発明のペプチドは、その配列内にＡｒｇ－Ａｒｇ、Ａｒｇ－Ｇｌｕ、Ｍｅｔ－Ａｒｇまたはそれらの組み合わせを含む。最も好ましい態様において、本発明のペプチドは、その配列内にＡｒｇ－Ａｒｇ、Ａｒｇ－ＧｌｕおよびＭｅｔ－Ａｒｇを含む。

【0070】

最も好ましい実施形態の１つにおいて、本発明のペプチドの配列は：
Ｒ_１－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｒ_２（Ｒ_１－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－Ｒ_２）；
Ｒ_１－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ｒ_２（Ｒ_１－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－Ｒ_２）；または
Ｒ_１－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｒ_２（Ｒ_１－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－Ｒ_２）
である。

【0071】

上記のように、Ｒ_１は好ましくはＨまたはＲ_５－ＣＯ－から選択され、ここでＲ_５は、置換または非置換のＣ_１－Ｃ_２４アルキルラジカル、置換または非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルケニル、置換または非置換のＣ_２－Ｃ_２４アルキニル、置換または非置換のＣ_３－Ｃ_２４シクロアルキル、置換または非置換のＣ_５－Ｃ_２４シクロアルケニル、置換または非置換のＣ_８－Ｃ_２４シクロアルキニル、置換または非置換のＣ_６－Ｃ_３０アリール、置換または非置換のＣ_７－Ｃ_２４アラルキル、３～１０員からなる置換または非置換のヘテロシクリル環および炭素原子の数２～２４、炭素以外の原子の数１～３、炭素原子の数１～６のアルキル鎖の置換または非置換のヘテロアリールアルキルから選択される。さらにより好ましくは、Ｒ_１は、Ｈ、アセチル（以下、Ａｃ）、ｔｅｒｔ－ブタノイル、ヘキサノイル、２－メチルヘキサノイル、シクロヘキサンカルボキシル、オクタノイル、デカノイル、ラウロイルミリストイル、パルミトイル（以下、Ｐａｌ）、ステアロイル、オレオイルおよびリノレオイルから選択され、さらにより好ましくはＲ_１はＡｃである。

【0072】

また、上述のように、Ｒ_２は、好ましくは－ＮＨ_２である。

【0073】

したがって、最も好ましい実施態様では、本発明のペプチドの配列は：
Ａｃ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－ＮＨ_２（Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２）；
Ａｃ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－ＮＨ_２（Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２）；または
Ａｃ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＮＨ_２（Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２）
である。

【0074】

以下に含まれる実施例から直接的に導き出すことができるように、本発明のペプチドは、遺伝子ＩＬ３３およびタンパク質ＩＬ－３３の発現をダウンレギュレートすることができる。また、本発明のペプチドは、細胞外マトリックス関連遺伝子の好ましい調節、チロシナーゼ活性の抑制、およびタンパク質糖化および脂質過酸化に対する防御を提供する。したがって、本発明のペプチドは、皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥の治療のための化粧品および医薬品において有効であり、より正確には以下の通りである：
化粧品において、上記の活性および以下に含まれる実施例に示される活性を考慮すると、本発明のペプチドは少なくとも、眼袋、瞼の欠陥、皺（好ましくは眼の周囲の皺）および血色素増加症（好ましくは眼窩骨膜血色素増加症）の治療に有効である。また、本発明のペプチドは睡眠遮断の皮膚における効果を予防、減少および／または回復させることができ、これは、睡眠遮断に関連する皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を治療することができる。
医薬品において、上記の活性および以下に含まれる実施例において実証される活性を考慮すると、本発明のペプチドは、炎症、血管新生および／または色素過剰に関連する医学的状態、脂質過酸化に関連する疾患、タンパク質糖化に関連する疾患、またはそれらの組み合わせの処置に有効である。最も好ましくは、本発明のペプチドは、少なくとも瞼の欠陥、より好ましくは皮膚軟化症、下垂症（例えば、腱膜性下垂症および腱膜性眼瞼下垂症に対して）、外反および内反の治療に役立つ。

【0075】

したがって、本発明のペプチドは、技術水準に存在して上述した必要性および技術的課題を解決する。

【0076】

さらに、上記の特異的配列のいずれかに対して７０％の同一性、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９９％の同一性を有するペプチドが本発明の範囲に含まれ、（これは、Ｒ_１－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｒ_２；Ｒ_１－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ｒ_２；またはＲ_１－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｒ_２であり、好ましくは、Ａｃ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－ＮＨ_２；Ａｃ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－ＮＨ_２；またはＡｃ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＮＨ_２であり、）これは、なおも、本発明のペプチドに対してここで記載された活性を示す。

【0077】

本発明のペプチドは、技術水準で公知の任意の方法によって合成および生成することができる。例えば、それらは、化学合成によって（好ましくは固相ペプチド合成によって）、細胞培養において前記ペプチドを発現させることによって、または植物もしくは動物におけるペプチドのトランスジェニック生成によって、合成および生成され得る。さらに、本発明のペプチドは、技術水準で公知の任意の方法によって精製することができる。

【0078】

好ましい実施形態では、本発明のペプチドは環状ペプチドである。

【0079】

好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、イオントフォレーシスによって、より好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面に、より好ましくは眼の中および／または周囲に適用されるのに適しているか、または適用されるように適合される。

【0080】

さらなる好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、皮下に、より好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面に、より好ましくは眼の中および／または周囲に適用されるのに適しているか、または適用されるように適合される。

【0081】

別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、局所的に（好ましくはクリームの形態で）、より好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面に、より好ましくは眼の中および／または周囲に適用されるのに適しているか、または適用されるように適合される。

【0082】

第２の態様において、本発明は、本発明に従う少なくとも１つのペプチドを含む組成物を指す。

【0083】

本発明の組成物は、本発明の１つのタイプのペプチド、または本発明の異なるペプチドの組み合わせまたは混合物、好ましくは本発明の１つのタイプのペプチドを含むことが意図される。

【0084】

好ましい実施形態では、本発明の組成物は化粧組成物である。したがって、本実施形態では、本発明の化粧組成物は、化粧用に有効な量の本発明の少なくとも１つのペプチドを含み、より好ましくは、本発明の化粧組成物は、０．０００１％（重量／体積ｇ／１００ｍＬ、以下、ｗ／ｖ）～０．０５％（ｗ／ｖ）の本発明の少なくとも１つのペプチドを含む。最も好ましい実施形態では、本発明の化粧組成物は、０．０００１％（ｗ／ｖ）～０．００１％（ｗ／ｖ）の本発明の少なくとも１つのペプチド、より好ましくは０．０００５％（ｗ／ｖ）を含む。別の最も好ましい実施形態では、本発明の化粧組成物は、０．０５％（ｗ／ｖ）～０．００１％（ｗ／ｖ）の少なくとも１つの本発明のペプチドを含む。

【0085】

本発明の化粧組成物はまた、少なくとも１つの追加の化粧成分を含むことが意図される。前記追加の化粧成分は、少なくとも１つの賦形剤および／または少なくとも１つの追加の化粧活性成分であり得る。

【0086】

追加の化粧成分は例えば、安定剤、可溶化剤、ビタミン、着色剤および香料などの補助剤；担体；および／または他の化粧活性成分として、技術水準で通常使用されるものを含む。

【0087】

前記の追加の化粧成分は、組成物の他の成分と、とりわけ本発明の組成物に含まれる本発明のペプチドと、物理的および化学的に適合性でなければならない。同様に、前記追加の化粧成分の性質は、本発明のペプチドおよび組成物の利点を容認できないほど変えてはならない。前記追加の化粧成分は例えば、例えば、植物抽出物のような合成または天然起源のものであってもよく、またはそれらは、生物発酵処理から誘導されてもよい（例えば、ＣＴＦＡ化粧成分ハンドブック、第１１版（２００６）を参照のこと）。

【0088】

上述の追加の化粧成分は、とりわけ、皮膚および／または毛髪を手入れし、それらを洗浄するための組成物に一般に使用される成分、および／または過汗を防止するためのデオドラントおよび／またはクリーム、例えば、メラニン合成抑制剤、白化または脱色剤、抗老化剤、ＮＯシンターゼ抑制剤、抗酸化剤、抗大気汚染および／またはフリーラジカル捕捉剤、抗糖化剤、乳化剤、皮膚軟化薬、有機溶剤、液体噴射剤、湿潤剤などのスキンコンディショナー、水分保持物質、アルファヒドロキシ酸、保湿剤、ビタミン、顔料または着色剤、染料、ゲル化ポリマー、増粘剤、界面活性剤、軟化剤、他の皺防止剤、眼の下の袋を低減または排除することができる薬剤、剥脱剤、抗菌剤、抗真菌剤、殺菌剤、真皮または表皮の高分子合成を刺激する薬剤および／またはそれらの分解を防止または抑制することができる薬剤、例えば、コラーゲン合成刺激剤、エラスチン合成刺激剤、ラミニン合成刺激剤、コラーゲン分解抑制剤、エラスチン分解抑制剤、線維芽細胞増殖刺激剤、ケラチノサイト増殖刺激剤、ケラチノサイト分化刺激剤、脂質合成刺激剤および角質層の成分（セラミド、脂肪酸等）の合成刺激剤、皮膚弛緩剤、グリコサミノグリカン合成刺激剤、ＤＮＡ修復剤、ＤＮＡ保護剤、プロテオソーム活性刺激剤、抗掻痒剤、感受性皮膚治療剤、再確認剤、収斂剤、皮脂生成調節剤、脂肪分解刺激剤、抗セリュライト剤、鎮静剤、抗炎症剤、毛細血管循環および／または微小循環に作用する薬剤、細胞ミトコンドリアに作用する薬剤、真皮－表皮接合部を改善することを目的とした薬剤、防腐剤、香水、キレート剤、植物抽出物、海洋抽出物、バイオ発酵プロセス由来の薬剤、ミネラル塩、細胞抽出物および／または、太陽フィルター（紫外線ＡおよびＢに対して活性な有機または無機光保護剤）を含むことが意図される。

【0089】

一実施形態では、追加の化粧成分の少なくとも１つは、本発明のペプチドについて上記に開示されたものと同じ、類似の、相補的または異なった化粧活性を発揮し得る化粧活性成分または物質である。本発明の組成物は、他の抗皺剤または抗老化剤、例えば、コラーゲン、エラスチン、成長因子、ヒアルロン酸ブースター、障壁機能促進剤、啓発剤、コラーゲンＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよび／またはＶＩおよび／またはラミニンの発現および／または合成を刺激する薬剤；グリコサミノグリカンまたはヒアルロン酸の合成を刺激する薬剤、エラスチンおよび／または他の弾性線維関連タンパク質の発現および／または合成を刺激する薬剤；コラーゲンおよび／または弾性線維の分解を抑制する薬剤；ミトコンドリア関連タンパク質（例えば、サーチュインおよびアコニターゼ）の発現および／または合成を刺激する薬剤；局所接着タンパク質の発現および／または合成を刺激する薬剤；ケラチノサイトおよび／または線維芽細胞の増殖および／または分化を刺激する薬剤；抗酸化剤、抗大気汚染剤および／またはフリーラジカル捕捉剤；抗糖化剤、解毒剤；経時的老化、環境老化および炎症老化を減少させる薬剤；およびメラニン生成を減少させるおよび／またはチロシナーゼを抑制する薬剤および／または脂質合成および表皮の成分（ケラチン）、より具体的には角質層（ケラチン、セラミド、フィラグリン、ロリクリンおよびＳＰＲＲ_１Ｂ）の合成を刺激する薬剤を含むことが意図される。より好ましくは、追加の化粧成分の少なくとも１つは、Ａｒｇｉｒｅｌｉｎｅ（登録商標）（アセチルヘキサペプチド－８）、Ｌｅｕｐｈａｓｙｌ（登録商標）（ペンタペプチド－３）、Ｉｎｙｌｉｎｅ（登録商標）（アセチルヘキサペプチド－３０）、Ｓｙｎ－Ａｋｅ（登録商標）（トリペプチド－３）またはそれらの組み合わせである。

【0090】

さらに、本発明の化粧組成物（または本発明のペプチド）は例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、ペースト、ゲル、クリーム、粉末、噴霧、ローション、油、リニメント、血清、ムース、軟膏、棒または鉛筆のような、当該技術分野で通常使用される任意の形態で製剤化することができ、「リーブオン」および「リンスオフ」製剤を含む。本発明の化粧組成物は技術水準で知られている技術によって、ぬれナプキン、ヒドロゲル、接着剤（または非接着剤）パッチまたはフェースマスクなどの様々なタイプの固形アクセサリに組み込むこともでき、あるいは、とりわけ、コンシーラー、メーキャップファンデーション、ローションまたはメーキャップ除去ローションなどの様々なメーキャップライン製品に組み込むこともできる。

【0091】

また、本明細書に開示される本発明の化粧組成物または本発明のペプチドは両方とも、活性成分のより大きな浸透を得るために、リポソーム、ミリ粒子、マイクロ粒子およびナノ粒子などの化粧徐放系および／または担体、ならびにスポンジ、小胞、ミセル、ミリスフェア、マイクロ球、ナノスフェア、リポスフェア、ミリカプセル、マイクロカプセルおよびナノカプセル、ならびにマイクロエマルジョンおよびナノエマルジョンに組み込むことができることも意図される。

【0092】

好ましい実施形態では、本発明の化粧組成物は、イオントフォレーシスによって、より好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面に、より好ましくは眼の中および／または周囲に適用されるのに適しているか、または適用されるように適合される。

【0093】

さらなる好ましい実施形態では、本発明の化粧組成物は、皮下に、より好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面に、より好ましくは眼の中および／または周囲に適用されるのに適しているか、または適用されるように適合される。

【0094】

別の好ましい実施形態では、本発明の化粧組成物は、局所的に（好ましくはクリームの形態で）、より好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面に、より好ましくは眼の中および／または周囲に適用されるのに適しているか、または適用されるように適合される。

【0095】

別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は薬学的組成物である。したがって、この実施形態では本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量の本発明の少なくとも１つのペプチドを含み、より好ましくは、本発明の薬学的組成物は、０．０００１％（ｗ／ｖ）～０．０５％（ｗ／ｖ）の本発明の少なくとも１つのペプチドを含む。最も好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、０．０００１％（ｗ／ｖ）～０．００１％（ｗ／ｖ）の本発明の少なくとも１つのペプチド、より好ましくは０．０００５％（ｗ／ｖ）を含む。別の最も好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、０．０５％（ｗ／ｖ）～０．００１％（ｗ／ｖ）の本発明の少なくとも１つのペプチドを含む。

【0096】

薬学的組成物は、選択された経路に適した、技術水準で公知の任意の形態であり得る。本発明の薬学的組成物は、技術水準で知られている任意の方法および任意の経路（例えば皮下、筋肉内、静脈内、局所または経口；後者のケースでは例えば生理食塩水および／または生分解性物質、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）ポリ乳酸－グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトンおよび／またはコレステロールのポリマー）の形態での投与に適しているか、または投与されるように適合されることが意図される。より好ましくは、本発明の薬学的組成物は、局所的に、さらにより好ましくはクリームの形態で投与されるのに適しているか、または投与されるように適応している。

【0097】

本発明の薬学的組成物はまた、少なくとも１つの追加の薬学的成分を含むことが意図される。前記追加の薬学的成分は、少なくとも１つの賦形剤および／または少なくとも１つの追加の薬学的活性成分であり得る。

【0098】

以下に含まれる実施例から直接的に導き出すことができるように、本発明のペプチドは、遺伝子ＩＬ３３およびタンパク質ＩＬ－３３の発現をダウンレギュレートすることができる。また、本発明のペプチドは、細胞外マトリックス関連遺伝子の好ましい調節、チロシナーゼ活性の抑制、およびタンパク質糖化および脂質過酸化に対する防御を提供する。したがって、本発明の組成物は、皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥の治療のための化粧品および医薬において有効であり、より正確には以下の通りである：
化粧品において、上記の活性および以下に含まれる実施例に示される活性を考慮すると、本発明のペプチドは少なくとも、眼袋、瞼の欠陥、皺（好ましくは眼の周囲の皺）および血色素増加症（好ましくは眼窩骨膜血色素増加症）の治療に有効である。また、本発明のペプチドは睡眠遮断の皮膚における効果を予防、減少および／または回復させることができ、これは、睡眠遮断に関連する皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を治療することができる。
医薬品において、上記の活性および以下に含まれる実施例において実証される活性を考慮すると、本発明のペプチドは、炎症、血管新生および／または色素過剰に関連する医学的状態、脂質過酸化に関連する疾患、タンパク質糖化に関連する疾患、またはそれらの組み合わせの処置に有効である。最も好ましくは、本発明のペプチドは、少なくとも瞼の欠陥、より好ましくは皮膚軟化症、下垂症（例えば、腱膜性下垂症および腱膜性眼瞼下垂症に対して）、外反および内反の治療に役立つ。

【0099】

したがって、本発明の組成物は、技術水準に存在して上述した必要性および技術的課題を解決する。

【0100】

すでに上述したように、第３の態様において、本発明は、本発明によるペプチドのまたは化粧組成物の、化粧品としての使用を指す。

【0101】

本発明によるペプチドおよび化粧組成物は、上記の通りである。

【0102】

好ましくは、化粧品としての使用は、炎症、血管新生、細胞外マトリックス障害、酸化ストレス、真皮細胞接合部における改変、アポトーシスおよび／または色素過剰、好ましくは美容炎症に関連する美容状態、美容血管新生、美容細胞外マトリックス障害、美容酸化ストレス、真皮細胞接合部における美容改変、美容アポトーシスおよび／または美容色素過剰に関連する美容状態の治療のためである。

【0103】

より好ましくは、化粧品としての使用は、皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥の治療のためであり、より好ましくは皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥の低減、予防および／または排除のためである。

【0104】

明らかなように、上記の皮膚老化徴候は、美容上の皮膚老化徴候および／または美容上の皮膚の欠陥である。

【0105】

皮膚老化は、時系列および／または環境老化による。

【0106】

より好ましくは、前記皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥は、ＩＬ－３３の調節不全によって生成される。上記のように、本発明のペプチドおよび化粧組成物は、ＩＬ－３３をダウンレギュレートする（それらはＩＬ３３遺伝子の発現および／またはインターロイキン３３の発現をダウンレギュレートする）。

【0107】

最も好ましい実施形態では、前記皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥は、眼袋、瞼の欠陥、皺（好ましくは眼の周囲の皺）、血色素増加症（好ましくは眼窩骨膜血色素増加症）、またはそれらの組み合わせである。

【0108】

瞼の欠陥は、好ましくは瞼のたるみ、より好ましくは美容上の皮膚弛緩症、美容上の下垂症、美容上の外反および美容上の内反、より好ましくは美容上の皮膚弛緩症、美容上の腱膜性下垂症、美容上の腱膜性眼瞼下垂症、美容上の退行性外反および美容上の退行性内反である。

【0109】

したがって、好ましくは前記皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥は、眼袋、眼の周囲の皺、眼窩骨膜血色素増加症、瞼のたるみ、またはそれらの組み合わせ、より好ましくは眼袋、眼の周囲の皺、眼窩骨膜血色素増加症、美容上の皮膚弛緩症、美容上の腱膜性下垂症、美容上の腱膜性眼瞼下垂症、美容上の退行性外反、および美容上の退行性内反、またはそれらの組み合わせである。

【0110】

最も好ましい実施形態では、前記皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥は、眼袋、眼の周囲の皺、眼窩骨膜血色素増加症、またはそれらの組み合わせである。

【0111】

別の最も好ましい実施形態では、化粧品としての使用は、睡眠遮断の皮膚における効果の治療のためであり、より好ましくは、睡眠遮断に関連する皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を低減、予防および／または排除するためである。

【0112】

睡眠遮断に関連する皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥は、好ましくは（上記で説明したように）瞼のたるみ、眼窩骨膜血色素増加症、障壁機能障害に関連する徴候、またはそれらの組み合わせである。

【0113】

好ましい実施形態では、睡眠遮断に関連する皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥は、眼窩骨膜血色素増加症である。

【0114】

別の好ましい実施形態では、睡眠遮断に関連する皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥は、障害された障壁機能、より好ましくは、変化した皮膚透過性、皮膚炎症、皮膚における細胞凝集の欠如、またはそれらの組み合わせ、さらにより好ましくは眼袋、皺（好ましくは眼の周囲の皺）、またはそれらの組み合わせに関連する徴候である。

【0115】

また、好ましい実施形態では、化粧品としての使用は、対象におけるものである。好ましくは、対象は哺乳動物、さらにより好ましくはヒトである。

【0116】

本発明のペプチドまたは化粧組成物は、イオントフォレーシスによって、より好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面に、さらにより好ましくは眼の中および／または周囲に適用されることが意図される。

【0117】

本発明のペプチドまたは化粧組成物は、皮下に、より好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面に、さらにより好ましくは眼の中および／または周囲に適用されることも意図される。

【0118】

最も好ましい実施形態では、本発明のペプチドまたは化粧組成物は、局所的に（好ましくはクリームの形態で）、より好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面に、さらにより好ましくは眼の中および／または周囲に適用される。

【0119】

また、本発明の化粧品としての使用では、本発明のペプチドまたは化粧組成物は、化粧用に有効な量で使用される。より好ましくは、本発明のペプチドは、０．０００１％（ｗ／ｖ）～０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。最も好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、０．０００１％（ｗ／ｖ）～０．００１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０００５％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。別の最も好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、０．０５％（ｗ／ｖ）～０．００１％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。

【0120】

第４の態様において、本発明は、本発明によるペプチドまたは化粧組成物の美容使用を指す。

【0121】

本発明によるペプチドおよび化粧組成物は、上記の通りである。

【0122】

好ましくは、美容使用は、炎症、血管新生、細胞外マトリックス障害、酸化ストレス、真皮細胞接合部における改変、アポトーシスおよび／または色素過剰、好ましくは美容炎症に関連する美容状態、美容血管新生、美容細胞外マトリックス障害、美容酸化ストレス、真皮細胞接合部における美容改変、美容アポトーシスおよび／または美容色素過剰に関連する美容状態の治療のためである。

【0123】

より好ましくは、美容使用は、皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥の治療のためであり、より好ましくは皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥の低減、予防および／または排除のためである。

【0124】

明らかなように、上記の皮膚老化徴候は、美容上の皮膚老化徴候および／または美容上の皮膚の欠陥である。

【0125】

皮膚老化は、時系列および／または環境老化による。

【0126】

【0127】

【0128】

【0129】

【0130】

【0131】

別の最も好ましい実施形態では、美容使用は、睡眠遮断の皮膚における効果の治療のためであり、より好ましくは、睡眠遮断に関連する皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を低減、予防および／または排除するためである。

【0132】

【0133】

好ましい実施形態では、睡眠遮断に関連する皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥は、眼窩骨膜血色素増加症である。

【0134】

【0135】

また、好ましい実施形態では、本発明の美容使用は、対象におけるものである。好ましくは、対象は哺乳動物、さらにより好ましくはヒトである。

【0136】

【0137】

【0138】

【0139】

また、本発明の美容使用では、本発明のペプチドまたは化粧組成物は、化粧用に有効な量で使用される。より好ましくは、本発明のペプチドは、０．０００１％（ｗ／ｖ）～０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。最も好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、０．０００１％（ｗ／ｖ）～０．００１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０００５％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。別の最も好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、０．０５％（ｗ／ｖ）～０．００１％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。

【0140】

第５の態様において、本発明は、それを必要な対象における本発明のペプチドまたは化粧組成物の使用を含む、それを必要な対象の美容治療のための方法を指す。

【0141】

本発明によるペプチドおよび化粧組成物は、上記の通りである。

【0142】

好ましくは、この方法は、炎症、血管新生、細胞外マトリックス障害、酸化ストレス、真皮細胞接合部における改変、アポトーシスおよび／または色素過剰、好ましくは美容炎症に関連する美容状態、美容血管新生、美容細胞外マトリックス障害、美容酸化ストレス、真皮細胞接合部における美容改変、美容アポトーシスおよび／または美容色素過剰に関連する美容状態の美容治療のためである。

【0143】

より好ましくは、この方法は、皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥の美容治療のためであり、より好ましくは皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥の低減、予防および／または排除のためである。

【0144】

明らかなように、上記の皮膚老化徴候は、美容上の皮膚老化徴候および／または美容上の皮膚の欠陥である。

【0145】

皮膚老化は、時系列および／または環境老化による。

【0146】

【0147】

【0148】

【0149】

【0150】

【0151】

別の最も好ましい実施形態では、本方法は、睡眠遮断の皮膚における効果の美容治療のためであり、より好ましくは、睡眠遮断に関連する皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥の美容治療のためであり、さらにより好ましくは、睡眠遮断に関連する皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を美容的に低減、予防および／または排除するためである。

【0152】

【0153】

好ましい実施形態では、睡眠遮断に関連する皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥は、眼窩骨膜血色素増加症である。

【0154】

【0155】

また、好ましい態様において、それを必要な対象は、哺乳動物、さらにより好ましくはヒトである。

【0156】

好ましくは、本発明の美容治療のための方法において、それを必要な対象における本発明のペプチドまたは化粧組成物の使用は、それを必要な対象における本発明の前記ペプチドまたは化粧組成物の適用による。

【0157】

【0158】

【0159】

【0160】

また、本発明の美容方法では、本発明のペプチドまたは組成物は、化粧用に有効な量で使用される。より好ましくは、本発明のペプチドは、０．０００１％（ｗ／ｖ）～０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。最も好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、０．０００１％（ｗ／ｖ）～０．００１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０００５％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。別の最も好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、０．０５％（ｗ／ｖ）～０．００１％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。

【0161】

第６の態様において、本発明は、薬剤として使用するための本発明のペプチドまたは薬学的組成物を指す。

【0162】

本発明によるペプチドおよび薬学的組成物は、上記の通りである。

【0163】

好ましくは、本発明のペプチドまたは組成物は、治療的に有効な量で使用される。

【0164】

好ましい態様において、本発明のペプチドおよび組成物は、哺乳動物において、より好ましくはヒトにおいて使用するためのものである。

【0165】

好ましくは、本発明のペプチドまたは薬学的組成物は、炎症、血管新生、細胞外マトリックス障害、酸化ストレス、真皮細胞接合部の改変、アポトーシスおよび／または色素過剰、脂質過酸化に関連する疾患、タンパク質糖化に関連する疾患、またはそれらの組み合わせに関連する医学的状態の治療に使用するためのものである。

【0166】

好ましくは、脂質過酸化に関連する疾患は、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、未熟児網膜症、境界性人格障害、喘息、パーキンソン病および腎障害である。

【0167】

好ましくは、タンパク質糖化に関連する疾患は、糖尿病（より好ましくは糖尿病性血管障害）、腎不全および加齢性変性疾患である。

【0168】

最も好ましい実施形態では、本発明のペプチドまたは薬学的組成物は、瞼の欠陥、好ましくは瞼のたるみ、より好ましくは皮膚弛緩症、下垂症、外反および内反、さらにより好ましくは皮膚弛緩症、腱膜性下垂症、腱膜性眼瞼下垂症、退行性外反および退行性内反の治療に使用するためのものである。

【0169】

本発明のペプチドまたは薬学的組成物は、イオントフォレーシスによって、より好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面に、さらにより好ましくは眼の中および／または周囲に適用されることが意図される。

【0170】

本発明のペプチドまたは薬学的組成物は、皮下、より好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面に、さらにより好ましくは眼の中および／または周囲に適用されることも意図される。

【0171】

最も好ましい実施形態では、本発明のペプチドまたは薬学的組成物は、局所的に（好ましくはクリームの形態で）、より好ましくは対象（好ましくはヒト）の顔面に、さらにより好ましくは眼の中および／または周囲に適用される。

【0172】

第７の態様において、本発明は、薬剤の製造のための本発明のペプチドまたは薬学的組成物の使用を指す。

【0173】

本発明によるペプチドおよび薬学的組成物は、上記の通りである。

【0174】

好ましくは、本発明のペプチドまたは組成物は、治療的に有効な量で使用される。

【0175】

好ましい態様において、本発明のペプチドおよび組成物は、哺乳動物において、より好ましくはヒトにおいて使用するためのものである。

【0176】

好ましくは、この使用は、炎症、血管新生、細胞外マトリックス障害、酸化ストレス、真皮細胞接合部の改変、アポトーシスおよび／または色素過剰、脂質過酸化に関連する疾患、タンパク質糖化に関連する疾患、またはそれらの組み合わせに関連する医学的状態の治療のための薬剤の製造のためである。

【0177】

【0178】

好ましくは、タンパク質糖化に関連する疾患は、糖尿病（より好ましくは糖尿病性血管障害）、腎不全および加齢性変性疾患である。

【0179】

最も好ましい実施態様において、使用は、瞼の欠陥、好ましくは瞼のたるみ、より好ましくは皮膚弛緩症、下垂症、外反および内反、さらにより好ましくは皮膚弛緩症、腱膜性下垂症、腱膜性眼瞼下垂症、退行性外反および退行性内反の治療のための薬剤の製造のためである。

【0180】

【0181】

【0182】

【0183】

最後の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは薬学的組成物の使用を含む、それを必要とする対象の医学的治療のための方法を指す。

【0184】

本発明によるペプチドおよび薬学的組成物は、上記の通りである。

【0185】

好ましくは、本発明のペプチドまたは組成物は、治療的に有効な量で使用される。

【0186】

好ましい態様において、医学的治療を必要とする対象は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。

【0187】

【0188】

好ましくは、本発明の医学的治療のための方法は、炎症、血管新生、細胞外マトリックス障害、酸化ストレス、真皮細胞接合部の改変、アポトーシスおよび／または色素過剰、脂質過酸化に関連する疾患、タンパク質糖化に関連する疾患、またはそれらの組み合わせに関連する医学的状態の治療のためである。

【0189】

【0190】

好ましくは、タンパク質糖化に関連する疾患は、糖尿病（より好ましくは糖尿病性血管障害）、腎不全および加齢性変性疾患である。

【0191】

最も好ましい実施形態では、本発明の医学的治療のための方法は、瞼の欠陥、好ましくは瞼のたるみ、より好ましくは皮膚弛緩症、下垂症、外反および内反、さらにより好ましくは皮膚弛緩症、腱膜性下垂症、腱膜性眼瞼下垂症、退行性外反および退行性内反の治療のためである。

【0192】

【0193】

【0194】

【0195】

より良い理解を可能にするために、本発明は、実施例として提示される添付の図面を参照し、例示的かつ非限定的な実施例を参照して、以下でより詳細に説明される。

【図面の簡単な説明】

【0196】

【図1】ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ（配列番号）：１－ＮＨ_２で処理した成人ヒト真皮線維芽細胞におけるＩＬ－３３タンパク質レベルを示す。陽性対照（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ ３００Ｕ／ｍＬでの治療）との比較では、百分率で結果を示し、１００％と安定している。ｘ軸の列は左から右に、それぞれ、細胞、陽性対照、および０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、または０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２で処理された細胞の基底状態を指す。本発明のペプチドで処理した試料もまた、３００Ｕ／ｍＬのインターフェロン－γで処理した。ｙ軸は、１００％と安定している陽性対照に関して、ｐｇ／ｍＬ中のＩＬ－３３の％を意味する。＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。

【図2】実施例１１で得られたキノコチロシナーゼ活性の抑制の結果を示す。対照（ペプチドなし）に対するチロシナーゼ活性を測定し、これは１００％として確立される。図２ＡはＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を用いて得られたチロシナーゼ活性の結果を示し、したがって、ｘ軸の列は左から右に、それぞれ、対照ウェルおよび４００μＭおよび８００μＭのコウジ酸を含むウェル、ならびに０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬおよび２．５ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を含むウェルを示す。図２ＢはＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２を用いて得られたチロシナーゼ活性の結果を示し、したがって、ｘ軸の列は左側から右側に、それぞれ、対照ウェル、４００μＭおよび８００μＭのコウジ酸を含むウェル、ならびに０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬおよび２．５ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２を含むウェルを示す。図２ＣはＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２で得られたチロシナーゼ活性の結果を示し、したがって、ｘ軸のカラムは左から右に、それぞれ、対照ウェル、４００μＭおよび８００μＭのコウジ酸を含むウェル、ならびに０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬおよび２．５ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２を含むウェルを示す。図２ＤはＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２で得られた結果を示し、したがって、ｘ軸の列は左から右に、それぞれ、対照ウェルおよび０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬおよび２．５ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２で処理されたウェルを示す。図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄにおいて、ｙ軸はチロシナーゼ活性の割合を示し、対照のチロシナーゼ活性を１００％として確立する。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。

【図3】実施例１２中のＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２で処理したＨＵＶＥＣにおける管形成（血管新生）を示す。より正確には、黒色の列は基底状態（基底状態を１００％とする）との比較における百分率としてのメッシュの数を示し、白色の列は基底状態（基底状態を１００％とする）との比較における百分率としてのメッシュの総面積を示す。さらに、この図のｘ軸において左から右への２つのカラム（１つの黒色および１つの白色）のそれぞれのグループは、以下に対応する：基底；陰性対照（２０μＭのスラミンでの治療）；陽性対照（１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３での治療）；０．０１ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３での治療；０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３での治療；ならびに０．１ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３での治療。ｙ軸は、基底状態（１００％として確立された）と比較した、メッシュの数（黒色カラムについて）またはメッシュの総面積（白色カラムについて）（考慮されるカラムに依存する）のパーセンテージを示す。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。

【図4】実施例１３の結果を示し、これは、陰性対照と比較した脂質の過酸化であり、１００％として確立される。ｘ軸において、左から右への列はそれぞれ、陰性対照（抗酸化化合物を含まない脂質基質）、陽性対照（２５０μｇ／ｍＬのトロロックス（安定なビタミンＥ類似体）で処理したが、本発明のペプチドでは処理しなかった脂質基質）、および０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬまたは０．５ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２で処理したものに対応する。全ての試料は脂質基質を有し、陰性対照を除く全ての試料は脂質過酸化剤（チオバルビツール酸）も含んでいた。３７℃で２時間のインキュベーションを行った後、５００ｎｍでの励起；５３０ｎｍでの発光で平板を読み取った。ｙ軸は、陰性対照と比較した脂質過酸化の割合を示し、これは１００％として確立される。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。

【図5】実施例１４の結果を示し、これは陰性対照と比較したタンパク質の糖化であり、これは１００％として確立される。ｘ軸において、左から右への列は、それぞれ、陰性対照（糖基質）、陽性対照（アミノグアニジン（ＡＧ、代表的な抗糖化化合物）６９０μｇ／ｍＬで処理された糖基質）、および０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬまたは０．５ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２で処理したものに対応する。全ての試料は糖基質を有し、陰性対照を除く全ての試料も糖化剤を含んでいた。３７℃で７２時間のインキュベーションを行った後、３７０ｎｍでの励起；４４０ｎｍでの発光で平板を読み取った。ｙ軸は、陰性対照と比較したタンパク質糖化の割合を示し、これは１００％として確立される。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。

【図6】実施例１４のエクスビボの結果を示し、これは、陰性対照（未処理外植片）と比較した、メチルグリオキサール（ＭＧ）誘導糖化に先立つＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２の保護作用であり、これは１００％として確立される。ｘ軸において、左側から右側への列は、それぞれ、陰性対照（未処理外植片）、陽性対照（ＭＧ、いかなるクリームでも処理されていない）、およびプラセボクリームまたは１％（ｗ／ｖ）のＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を含むクリームを用いたＭＧに対応する。ｙ軸は陰性対照と比較したＣＭＬ染色（Ｎ（ε）－カルボキシメチル－リジン）の割合を示し、これは１００％として確立される。

【図7】実施例１５のエクスビボの結果を示し、これは、陰性対照（未処理外植片）と比較した、メチルグリオキサール（ＭＧ）誘導フィブリリン－１分解に先立つＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２の保護作用であり、これは１００％として確立される。ｘ軸において、左側から右側への列は、それぞれ、陰性対照（未処理外植片）、陽性対照（ＭＧ、いかなるクリームでも処理されていない）、およびプラセボクリームまたは１％（ｗ／ｖ）のＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を含むクリームを用いたＭＧに対応する。ｙ軸は陰性対照と比較したフィブリリン－１染色の割合を示し、これは１００％として確立される。

【図8】メラトニン０．１ｍｇ／ｍＬおよび０．５ｍｇ／ｍＬと比較して、抗過酸化活性について得られたデータのグラフ表示を示す。ｘ軸において、左から右への列は、陰性対照（抗酸化化合物を含まない脂質基質）、陽性対照（２５０μｇ／ｍＬのトロロックス（安定なビタミンＥ類似体）で処理したが、本発明のペプチドでは処理しなかった脂質基質）、０．１ｍｇ／ｍＬのメラトニン、０．５ｍｇ／ｍＬのメラトニンに対応する。

【図9】メラトニン０．１ｍｇ／ｍＬおよび０．５ｍｇ／ｍＬに対する抗糖化活性について得られたデータのグラフ表示を示す。ｘ軸において、左から右への列は、陰性対照（糖基質）、陽性対照（アミノグアニジン（ＡＧ、代表的な抗糖化化合物）６９０μｇ／ｍＬで処理した糖基質）、０．１ｍｇ／ｍＬメラトニン、０．５ｍｇ／ｍＬメラトニンに対応する。

【図10】基底細胞（Ａ）および、Ｄ１８ＣｈＡＨで２４時間処理した後のＨＤＬＭＶＥＣ上のエミリン－１発現（Ｂ）について蛍光顕微鏡で得られた免疫蛍光画像を示す（緑色：エミリン－１、赤色：ファロイジン、青色：核）。

【図11】基底細胞（Ａ）および、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２で２４時間処理した後のＨＤＬＭＶＥＣ上のインテグリンα９β１発現（Ｂ）（緑色：インテグリンα９β１、赤色：ファロイジン、青色：核）についての蛍光顕微鏡で得られた免疫蛍光画像を示す。

【図12】処理の６時間後のＨＥＫａ細胞中の０．０１ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２または０．０１ｍｇ／ｍＬのメラトニンによる、抗菌性先天性免疫反応に関連する遺伝子の調節を示す。ｘ軸は、基底に対する倍率変化を示す。

【図13】ペプチドおよびプラセボ組成物を含む組成物による眼袋容量の減少のグラフ表示を示す。ｘ軸において、左から右への列は、Ｔ７日およびＴ１４日に対応する。

【実施例】

【0197】

〔略語：〕
アミノ酸に使用される略語は、１９８３ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢＪｏｉｎｔＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓｏｕｔｌｉｎｅｄｉｎＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）１３８：９３７に従う。

【0198】

Ａｃ、アセチル；Ａｒｇ、アルギニン；Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ-ブチルオキシカルボニル；Ｃ末端、カルボキシル末端；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＤＩＥＡ、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン；ＤＩＰＣＤＩ、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；ｅｑｕｉｖ、当量；ＥＳＩ－ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化質量分析；Ｆｍｏｃ、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル；Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｇｌｎ、グルタミン；ｈｉＰＳＣ、ヒト誘導多能性幹細胞；ＨＯＢｔ、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＨＲＰ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ；ＩＮＣＩ、化粧成分の国際命名法；ＭＢＨＡ、ｐ－メチルベンズヒドリルアミン；Ｍｅ、メチル；ＭｅＣＮ、アセトニトリル；ＭｅＯＨ、メタノール；Ｍｅｔ、メチオニン；Ｎ末端、アミノ末端；Ｐａｌｍ、パルミトイル；Ｐｂｆ、２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル；ＰＦＡ、パラホルムアルデヒド；ＰＭＡ、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート；ＰＭＳＦ、フェニルメタンスルホニル；ＲＴ、室温；ｔＢｕ、ｔｅｒｔ－ブチル；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＩＳ、トリイソプロピルシラン；ＴＭＢ、テトラメチルベンジジン；Ｔｒｔ、トリフェニルメチルまたはトリチル。

【0199】

本実施例に含まれる化学合成手順に関して、全ての合成プロセスは、多孔質ポリエチレンディスクを取り付けたポリプロピレンシリンジまたは多孔質プレートを取り付けたＰｙｒｅｘ（登録商標）反応器中で実施したことに留意されたい。全ての試薬および溶媒は合成品質であり、いかなる追加の処理も行わずに使用した。溶媒および可溶性試薬を吸引により除去した。Ｆｍｏｃ基をピペリジン－ＤＭＦ（２：８、ｖ／ｖ）（少なくとも１×１分、２×１０分、５ｍＬ／ｇ樹脂）で除去した（ＬｌｏｙｄＷｉｌｌｉａｍｓＰ．ｅｔａｌ．，ＣｈｅｍｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｔｈｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ，１９９７，ＢｏｃａＲａｔｏｎ（Ｆｌａ．，ＵＳＡ））。脱保護、カップリング、および再度脱保護の段階の間の洗浄は、１０ｍｌ溶媒／ｇ樹脂を使用して、毎回ＤＭＦ（３×１分）およびＤＣＭ（３×１分）で行った。カップリング反応は、３ｍｌ溶媒／ｇ樹脂で行った。カップリングの制御は、ニンヒドリン試験を実施することによって行った（ＫａｉｓｅｒＥ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７０，３４：５９５５９８）。全ての合成反応および洗浄を室温で行った。

【0200】

〔実施例１．ペプチドの合成および調製〕
〔Ｆｍｏｃ－ＡＡ_１－ＡＡ_２－ＡＡ_３－ＡＡ_４－ＡＡ_５－ＡＡ_６－Ｒｉｎｋ－ＭＢＨＡ－樹脂の取得。ＡＡ_１はＬ－Ａｒｇ、ＡＡ_２はＬ－Ａｒｇ、ＡＡ_３はＬ－Ｇｌｎ、ＡＡ_４はＬ－Ｍｅｔ、ＡＡ_５はＬ－Ａｒｇ、ＡＡ_６はＬ－Ｇｌｕである。〕
重量を正規化した。０．５２ｍｍｏｌ／ｇの官能基化を有する４．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ＭＢＨＡ樹脂を、Ｆｍｏｃ基を除去するために、技術水準で公知の記載された一般的なプロトコルに従ってピペリジン－ＤＭＦで処理した。３．１９ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、ＤＩＰＣＤＩ（１．１７ｍＬ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）およびＨＯＢｔ（１．０１ｇ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で、ＤＭＦを溶媒として１時間使用して、脱保護された樹脂上に組み込んだ。

【0201】

次いで、樹脂を、技術水準において公知の一般的な方法に記載されているように洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を繰り返して、次のアミノ酸をカップリングした。以前に記載されたプロトコルに従って、４．８６ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて２．７８ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｍｅｔ－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて４．５８ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて４．８６ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）および続いて４．８６ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、それぞれ１．０１ｇのＨＯＢｔ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）および１．１７ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で連続してカップリングした。既に上述したように、各アミノ酸付加工程の間に、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を行った。

【0202】

合成後、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し（それぞれ３分間、５回）、真空下で乾燥させた。

【0203】

〔Ｆｍｏｃ－ＡＡ_１－ＡＡ_２－ＡＡ_３－ＡＡ_４－ＡＡ_５－ＡＡ_６－Ｒｉｎｋ－ＭＢＨＡ－樹脂の取得。ＡＡ_１はＬ－Ｍｅｔ、ＡＡ_２はＬ－Ａｒｇ、ＡＡ_３はＬ－Ａｒｇ、ＡＡ_４はＬ－Ｇｌｕ、ＡＡ_５はＬ－Ｇｌｎ、ＡＡ_６はＬ－Ａｒｇである。〕
重量を正規化した。０．５２ｍｍｏｌ／ｇの官能基化を有する４．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ＭＢＨＡ樹脂を、Ｆｍｏｃ基を除去するために、技術水準で公知の記載された一般的なプロトコルに従ってピペリジン－ＤＭＦで処理した。４．８６ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、ＤＩＰＣＤＩ（１．１７ｍＬ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）およびＨＯＢｔ（１．０１ｇ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で、ＤＭＦを溶媒として１時間使用して、脱保護された樹脂上に組み込んだ。

【0204】

次いで、樹脂を、技術水準において公知の一般的な方法に記載されているように洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を繰り返して、次のアミノ酸をカップリングした。以前に記載されたプロトコルにしたがって、４．５８ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて３．１９ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて４．８６ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて４．８６ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）および続いて２．７８ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｍｅｔ－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、それぞれ１．０１ｇのＨＯＢｔ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）および１．１７ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で連続してカップリングした。既に上述したように、各アミノ酸付加工程の間に、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を行った。

【0205】

合成後、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し（それぞれ３分間、５回）、真空下で乾燥させた。

【0206】

〔Ｆｍｏｃ－ＡＡ_１－ＡＡ_２－ＡＡ_３－ＡＡ_４－ＡＡ_５－ＡＡ_６－Ｒｉｎｋ－ＭＢＨＡ－樹脂の取得。ＡＡ_１はＬ－Ａｒｇ、ＡＡ_２はＬ－Ｇｌｕ、ＡＡ_３はＬ－Ｇｌｎ、ＡＡ_４はＬ－Ｍｅｔ、ＡＡ_５はＬ－Ａｒｇ、ＡＡ_６はＬ－Ａｒｇである。〕
重量を正規化した。０．５２ｍｍｏｌ／ｇの官能基化を有する４．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－ＭＢＨＡ樹脂を、Ｆｍｏｃ基を除去するために、技術水準で公知の記載された一般的なプロトコルに従ってピペリジン－ＤＭＦで処理した。４．８６ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、ＤＩＰＣＤＩ（１．１７ｍＬ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）およびＨＯＢｔ（１．０１ｇ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で、ＤＭＦを溶媒として１時間使用して、脱保護された樹脂上に組み込んだ。

【0207】

次いで、樹脂を、技術水準において公知の一般的な方法に記載されているように洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を繰り返して、次のアミノ酸をカップリングした。以前に記載されたプロトコルにしたがって、４．８６ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて２．７８ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｍｅｔ－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて４．５８ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて３．１９ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）および続いて４．８６ｇのＦｍｏｃ－Ｌ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、それぞれ１．０１ｇのＨＯＢｔ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）および１．１７ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で連続してカップリングした。既に上述したように、各アミノ酸付加工程の間に、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を行った。

【0208】

合成後、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し（それぞれ３分間、５回）、真空下で乾燥させた。

【0209】

〔実施例２．実施例１に従って合成されたペプチドのＦｍｏｃＮ末端保護基の除去〕
実施例１中で得られたペプチジル樹脂のＮ末端Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ（１×１分＋２×１０分）中の２０％（容量／容量、以下ｖ／ｖ）ピペリジンで脱保護した（ＬｌｏｙｄＷｉｌｌｉａｍｓＰ．ｅｔａｌ．（１９９７）ＣｈｅｍｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｔｈｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ．ＣＲＣ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ（Ｆｌａ．，ＵＳＡ））。ペプチジル樹脂をＤＭＦ（５×１分）、ＤＣＭ（４×１分）で洗浄し、真空下で乾燥させた。

【0210】

〔実施例３．実施例２により得られたペプチジル樹脂上にＲ_１アセチル基を導入する方法〕
実施例２に従って得られたペプチジル樹脂１ミリモル（１当量）を、５ｍＬのＤＭＦを溶媒として使用して、２５当量のＤＩＥＡの存在下、２５当量の無水酢酸で処理した。それらを３０分間反応させた後、ペプチジル樹脂をＤＭＦ（５×１分）、ＤＣＭ（４×１分）で洗浄し、真空下で乾燥した。

【0211】

〔実施例４．実施例２および３に従って得られたペプチジル樹脂のポリマー支持体からの切断方法〕
重量を正規化した。実施例２または３のいずれかで得られた乾燥ペプチジル樹脂２００ｍｇを、撹拌しながら室温で２時間、５ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ（９０：５：５）で処理した。濾液を集め、５０ｍＬ（８～１０倍）の冷ジエチルエーテルを用いて沈殿させた。エーテル溶液を減圧および室温で蒸発乾固し、沈殿物をＨ_２Ｏ中の５０％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮに再溶解し、凍結乾燥した。

【0212】

〔実施例５．実施例４に従って合成および調製されたペプチドの特徴付け〕
実施例４により得られたペプチドの高速液体クロマトグラフィー分析は、逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ、ＸＢｒｉｄｇｅＰｅｐｔｉｄｅＢＥＣ１８、３．５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ、米国）を用いて、Ｈ_２Ｏ（＋０．０４５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）中のＭｅＣＮ（＋０．０３６％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）の勾配で、１．２５ｍＬ／分の流量で島津装置（京都、日本）を用いて行い、２２０ｎｍで検出を行った。全てのペプチドは、８０％を超える純度を示した。得られたペプチドの同一性は、移動相としてＭｅＯＨを使用し、流速０．２ｍＬ／分のＷａｔｅｒＺＱ４０００検出器中のＥＳＩ－ＭＳによって確認した。得られた結果は、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２およびＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２が正確かつ効果的に合成されたことを実証した。

【0213】

〔実施例６．Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を含む顔用化粧組成物の調製〕
以下の表１による顔用化粧組成物を調製した。この目的のために、相Ａからの成分を適当な容器に溶解し、該混合物を７０－７５℃に加熱した。別の容器において、相Ｂの成分を一緒に混合し、混合物を７０－７５℃に加熱した。次に、相Ｃ（ＴＥＧＯＬＯＮ１２－１０（ＩＮＣＩ：ナイロン－１２））を、それが完全に溶解するまで、撹拌しながら相Ｂにゆっくりと添加した。該混合物を７０－７５℃に加熱した。次に、相Ａの溶液を、タービン撹拌下で相ＢおよびＣの混合物に添加して、エマルジョンを形成した。次に、Ｄ相を混合物にゆっくり加え、均一なエマルジョンが得られるまで撹拌を維持した。最後に、約３０℃で、混合物に、化合物Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２（ＩＮＣＩ：水（アクア）、グリセリン、カプリルグリコール、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２）を含む市販の製剤を撹拌しながらゆっくりと添加した。

【0214】

【表1】

【0215】

〔実施例７．ＨＥＫａ（ヒト真皮線維芽細胞、成人）細胞およびＨＤＦａ（ＨｕｍａｎＤｅｒｍａｌＦｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ａｄｕｌｔ）細胞におけるＩＬ３３発現調節の分析〕
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２およびＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２を、ＨＥＫａ細胞（３つのペプチド全て）およびＨＤＦａにおけるＩＬ３３の発現を調節するその能力について分析した（ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２についてのみ分析した）。

【0216】

本実施例で使用したペプチドは、実施例１～５に従って調製した。

【0217】

ペプチドのストック溶液を、１ｍｇ／ｍＬの水中で調製した。作業溶液は、対応する補充培地中のストック溶液から特定の濃度で新たに調製した。

【0218】

未処理細胞を基底または陰性対照試料として使用した。

【0219】

ＲＮＡ（リボ核酸）抽出およびＲＴ－ｑＰＣＲ（逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応）を実施した。簡単に述べると、ＨＤＦａおよびＨＥＫａ細胞を、２つ組で（ｎ＝２）、４×１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート中に播種し、標準培養条件（ＨＤＦａ細胞については１％（ｖ／ｖ）ＬＳＧＳを補充した１０６培地；ＨＥＫａ細胞については１％（ｖ／ｖ）ＥＤＧＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した培地Ｅｐｉｌｉｆｅ；３７℃、９５％室内湿度、５％ＣＯ_２）で２４時間維持した。次いで、細胞をペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２またはＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２で０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度で２４時間処理した。未処理細胞を基底または陰性対照として使用した。

【0220】

細胞を最終的に溶解し、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキットを用いたＲＮＡ抽出のために、製造業者の説明書に従って複製物を一緒にプールした。精製したＲＮＡを用いて、市販のキットの高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた逆転写により、増幅のための鋳型として働く対応するｃＤＮＡ（相補的デオキシリボ核酸）を生成した。ＲＴ－ｑＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅｐｌｕｓＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ機器を使用して、ＩＬ３３についての適切なＴａｑＭａｎアッセイプローブ（ハウスキーピング遺伝子として使用したＧＡＰＤＨ－グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼを加えている）および２ｘ遺伝子発現マスターミックスを用いて行った。増幅は、９５℃で１５秒（変性）および６０℃で１分（アニーリングおよび伸長）の４０サイクルを含んだ（Ａｒｙａ，Ｍ．，Ｓｈｅｒｇｉｌｌ，Ｉ．Ｓ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｍ．，Ｇｏｍｍｅｒｓａｌｌ，Ｌ．，Ａｒｙａ，Ｎ．，Ｐａｔｅｌ，Ｈ．Ｒ．（２００５）Ｂａｓｉｃｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．；５（２）：２０９－１９；ａｎｄＪｏｚｅｆｃｚｕｋ，Ｊ．ａｎｄＡｄｊａｙｅ，Ｊ．（２０１１）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ－ｂａｓｅｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．５００；９９－１０９）。

【0221】

得られたデータを、ΔΔＣｔ方法を用いて分析し、これは、未処理の基底試料と比較した処理試料における倍率変化として標的遺伝子発現値を提供した。両方の試料を、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）の相対発現で正規化した。

【0222】

分析の手順は以下の通りである：
１．各条件の平均Ｃｔを算出する
２． ΔＣＴ試験試料およびΔＣＴ未処理試料を算出する
３． ΔΔＣＴを算出する：ΔΔＣＴ＝ ΔＣＴ試験試料－ΔＣＴ未処理試料
４．２^{－ΔΔＣＴ}で比率を得る。

【0223】

このアッセイにおいて、ＩＬ３３遺伝子の発現の明らかなダウンレギュレーションが、試験した全てのペプチドについてＨＥＫａ細胞において観察された：
Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２：基底対照に関して、処理細胞における－４．５８倍の変化。
Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２：基底対照に関して、処理細胞における－３．７７倍の変化。
Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：：３－ＮＨ_２：基底対照に関して、処理細胞における－３．９３倍の変化。

【0224】

さらに、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２について、ＩＬ３３の発現のダウンレギュレーションもまた、ＨＤＦａ細胞において観察された（基底対照に関して、処理細胞における－１．２２倍の変化）。

【0225】

本実施例の結果はＩＬ３３の発現をダウンレギュレートするための本発明のペプチドの有用性を実証し、したがって、上記で説明したように、主に炎症の改善、さらには皮膚障壁の改善、血管新生の減少、および色素沈着の減少を提供する。したがって、本実施例の結果は、皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥、より好ましくは眼袋、瞼の欠陥、眼の周囲の皺、および暗円（眼窩骨膜血色素増加症）を低減、予防および／または排除するための本発明のペプチドの有用性を実証する。

【0226】

〔実施例８．ＨＤＦａ細胞におけるタンパク質ＩＬ－３３の生成の分析〕
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を、成人ヒト真皮線維芽細胞におけるＩＬ－３３生成を調節するその能力について分析した。

【0227】

ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を実施例１～５に従って調製した。

【0228】

成人ヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦａ）を、それらの対応する増殖培地中で１×１０^５細胞／ｍＬの濃度で２４ウェルプレート上に播種し、そして２４時間、通常の培養条件下でインキュベートした；その時点で、３つの異なった濃度（０．００５、０．０１および０．０５ｍｇ／ｍＬ）のＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を、ＩＬ－３３誘導刺激（ＩＦＮγ、３００Ｕ／ｍＬ）の存在下で添加した。刺激のない細胞も基底群として含めた。陽性対照群は、３００Ｕ／ｍＬのＩＦＮγで処理したが、本発明のペプチドで処理しなかった細胞であった。２４時間後、ならし培地を回収し、細胞をタンパク質抽出のために処理した。

【0229】

細胞溶解物中のＩＬ－３３のレベルを市販のＥＬＩＳＡキット（ＤｕｏＳｅｔＥＬＩＳＡＲ＆Ｄ）で分析した。吸光度を自動分光光度計プレートリーダーで測定した。

【0230】

この実施例で得られた結果は図１に要約されており、ＩＦＮγ（３００Ｕ／ｍＬ）がＨＤＦａ細胞におけるタンパク質ＩＬ－３３の生成の増大を誘導し、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２が、ＩＦＮγ（３００Ｕ／ｍＬ）に曝露されたＨＤＦａ細胞によって生成されるＩＬ－３３タンパク質レベルを用量依存的に減少させることが分かる（これは、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２の濃度が増加することにつれて、ＩＬ－３３タンパク質レベルのより大きな減少が観察されることである）。

【0231】

本実施例の結果はＩＬ－３３の発現のダウンレギュレーションを通して炎症を低下させるための本発明のペプチドの有用性を実証し、したがって、上記に説明したように、皮膚障壁の改善、血管新生の低下および色素沈着の低下を提供する。したがって、本実施例の結果は、皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥、より好ましくは眼袋、瞼の欠陥、眼の周囲の皺、および暗円（眼窩骨膜血色素増加症）を低減、予防および／または排除するための本発明のペプチドの有用性を実証する。

【0232】

〔実施例９．ヒト表皮ケラチノサイト、成人（以下、「ＨＥＫａ」）、における遺伝子発現調節の分析〕
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２およびＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２を、表皮細胞凝集に関連する遺伝子の発現を調節するその能力について分析した（分析した遺伝子については表２を参照のこと）。

【0233】

本実施例で使用したペプチドは、実施例１～５に従って調製した。

【0234】

ペプチドのストック溶液を、１ｍｇ／ｍＬの水中で調製した。作業溶液は、対応する補充培地中のストック溶液から特定の濃度で新たに調製した。

【0235】

未処理細胞を基底または陰性対照試料として使用した。

【0236】

ＲＮＡ（リボ核酸）抽出およびＲＴ－ｑＰＣＲ（逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応）を実施した。簡単に述べると、ＨＥＫａ細胞を、２つ組で（ｎ＝２）、４×１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート中に播種し、標準培養条件（１％（ｖ／ｖ）ＥＤＧＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した培地Ｅｐｉｌｉｆｅ；３７℃、９５％室内湿度、５％ＣＯ_２）で２４時間維持した。

【0237】

次いで、細胞をペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２またはＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２で０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度で２４時間処理した。未処理細胞を基底または陰性対照として使用した。

【0238】

細胞を最終的に溶解し、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキットを用いたＲＮＡ抽出のために、製造業者の説明書に従って複製物を一緒にプールした。精製したＲＮＡを用いて、市販のキットの高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた逆転写により、増幅のための鋳型として働く対応するｃＤＮＡ（相補的デオキシリボ核酸）を生成した。ＲＴ－ｑＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅｐｌｕｓＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ機器を使用して、表１に示す遺伝子についての適切なＴａｑＭａｎアッセイプローブのパネル（ハウスキーピング遺伝子として使用したＧＡＰＤＨ－グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼを加えている）および２ｘ遺伝子発現マスターミックスを用いて行った。増幅は、９５℃で１５秒（変性）および６０℃で１分（アニーリングおよび伸長）の４０サイクルを含んだ（Ａｒｙａ，Ｍ．，Ｓｈｅｒｇｉｌｌ，Ｉ．Ｓ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｍ．，Ｇｏｍｍｅｒｓａｌｌ，Ｌ．，Ａｒｙａ，Ｎ．，Ｐａｔｅｌ，Ｈ．Ｒ．（２００５）Ｂａｓｉｃｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．；５（２）：２０９－１９；ａｎｄＪｏｚｅｆｃｚｕｋ，Ｊ．ａｎｄＡｄｊａｙｅ，Ｊ．（２０１１）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ－ｂａｓｅｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．５００；９９－１０９）。

【0239】

【表2】

【0240】

【0241】

【0242】

このアッセイの結果は、表３～表５にもまとめられている。

【0243】

【表3】

【0244】

【表4】

【0245】

【表5】

【0246】

表３～表５から、以下のことを容易に導き出すことができる：
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２は、密着結合および障壁機能に関連する重要な遺伝子：ＪＵＰ、ＯＣＬＮ、ＤＳＰ、ＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ４、ＤＳＣ２、ＣＤＳＮ、ＰＣＤＨ１、ＴＪＰ１、ＰＫＰ２およびＰＰＬを明らかにアップレギュレートした。
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２は、密着結合および障壁機能に関連する重要な遺伝子：ＯＣＬＮ、ＣＬＤＮ４、ＰＣＤＨ１、ＴＪＰ１およびＰＫＰ２を明らかにアップレギュレートした。
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２は、密着結合および障壁機能に関連する重要な遺伝子：ＪＵＰ、ＯＣＬＮ、ＤＳＰ、ＣＬＤＮ１、ＤＳＣ１、ＣＬＤＮ４、ＤＳＣ２、ＰＣＤＨ１、ＴＪＰ１、ＰＫＰ２およびＰＰＬを明らかにアップレギュレートした。

【0247】

したがって、本発明のペプチドは、（Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２およびＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２によって例示されるように）皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を低減、予防および／または排除し、より正確には、本実施例の結果は、ケラチノサイト間の密着結合を改善し、それらの間の凝集を改善し、したがって皮膚の硬さを改善し、皺を低減するための本発明のペプチドの有用性を実証する。

【0248】

〔実施例１０．初代ヒト真皮線維芽細胞、成人、における遺伝子発現調節の分析〕
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２およびＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２を、コラーゲンおよび細胞外マトリックスの生成に関連する遺伝子の発現を調節するその能力について分析した（分析した遺伝子については表６を参照のこと）。

【0249】

本実施例で使用したペプチドは、実施例１～５に従って調製した。

【0250】

ペプチドのストック溶液を、１ｍｇ／ｍＬの水中で調製した。作業溶液は、対応する補充培地中のストック溶液から特定の濃度で新たに調製した。

【0251】

未処理細胞を基底または陰性対照試料として使用した。

【0252】

ＲＮＡ（リボ核酸）抽出およびＲＴ－ｑＰＣＲ（逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応）を実施した。簡単に述べると、ＨＤＦａ細胞を、２つ組で（ｎ＝２）、４×１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート中に播種し、標準培養条件（１％（ｖ／ｖ）ＬＳＧＳを補充した１０６培地；３７℃、９５％室内湿度、５％ＣＯ_２）で２４時間維持した。次いで、細胞をペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２で０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度で２４時間および４８時間処理した。未処理細胞を基底または陰性対照として使用した。

【0253】

細胞を最終的に溶解し、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキットを用いたＲＮＡ抽出のために、製造業者の説明書に従って複製物を一緒にプールした。精製したＲＮＡを用いて、市販のキットの高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた逆転写により、増幅のための鋳型として働く対応するｃＤＮＡ（相補的デオキシリボ核酸）を生成した。ＲＴ－ｑＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅｐｌｕｓＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ機器を使用して、表５に示す遺伝子についての適切なＴａｑＭａｎアッセイプローブのパネル（ハウスキーピング遺伝子として使用したＧＡＰＤＨ－グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼを加えている）および２ｘ遺伝子発現マスターミックスを用いて行った。増幅は、９５℃で１５秒（変性）および６０℃で１分（アニーリングおよび伸長）の４０サイクルを含んだ（Ａｒｙａ，Ｍ．，Ｓｈｅｒｇｉｌｌ，Ｉ．Ｓ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｍ．，Ｇｏｍｍｅｒｓａｌｌ，Ｌ．，Ａｒｙａ，Ｎ．，Ｐａｔｅｌ，Ｈ．Ｒ．（２００５）Ｂａｓｉｃｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．；５（２）：２０９－１９；ａｎｄＪｏｚｅｆｃｚｕｋ，Ｊ．ａｎｄＡｄｊａｙｅ，Ｊ．（２０１１）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ－ｂａｓｅｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．５００；９９－１０９）。

【0254】

【表6】

【0255】

【0256】

【0257】

このアッセイの結果は、表７～表１０にまとめられている。

【0258】

【表7】

【0259】

【表8】

【0260】

【表9】

【0261】

【表10】

【0262】

表７および表８から、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２について、以下のことを容易に導き出すことができる：
２４時間では、ＬＡＭＡ１、ＣＯＬ３Ａ１およびＴＩＭＰ２のアップレギュレーションが観察された。
４８時間では、ＭＭＰ１およびＭＭＰ３のダウンレギュレーションが観察された。

【0263】

表９から、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２について、以下のことを容易に導き出すことができる：
２４時間では、ＦＢＮ１のアップレギュレーションとＭＭＰ１のダウンレギュレーションが観察された。

【0264】

表１０から、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２について、以下のことを容易に導き出すことができる：
２４時間では、ＦＢＮ１のアップレギュレーションとＭＭＰ１およびＭＭＰ３のダウンレギュレーションが観察された。

【0265】

したがって、本発明のペプチドは、（Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２およびＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２によって例示されるように）ＥＣＭ合成およびメンテナンスに関して遺伝子の好ましい調節を示した。したがって、本発明のペプチドは皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を低減、予防および／または排除することができ、より正確には、本実施例の結果は、皮膚の硬度を改善し、皺を低減する本発明のペプチドの有用性を実証する。

【0266】

〔実施例１１．チロシナーゼ活性の分析〕
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２およびＡｃ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－－ＮＨ_２（Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２）を、チロシナーゼ活性を調節するそれらの能力について分析した。

【0267】

本実施例で使用したペプチドは、実施例１～５に従って調製した。

【0268】

簡単に述べると、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２（０．０５、０．２５、０．５および２．５ｍｇ／ｍＬ）、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２（０．０５、０．２５、０．５および２．５ｍｇ／ｍＬ）、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２（０．０５、０．２５、０．５および２．５ｍｇ／ｍＬ）およびＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２（０．００５、０．０２５、０．０５、０．２５、０．５および２．５ｍｇ／ｍＬ）、および陽性対照コウジ酸（４００および８００μＭ）を、Ｌ－ＤＯＰＡ（Ｌ－３，４ジヒドロキシフェニルアラニン、ＰＢＳ中２．５ｍｇ／ｍＬ）の添加前に、組換えマッシュルームチロシナーゼと３０分間インキュベートした。室温で２時間反応させた後、マイクロプレートリーダーＭｕｌｔｉｓｋａｎＦＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、反応混合物中のドーパクロムの量に正比例する各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定した。

【0269】

吸光度値を、１００％として確立された非処理ウェル（対照）に関して正規化し、それにより、試験した各状態についての活性のパーセンテージを得た。

【0270】

この実施例で得られた結果を図２（２Ａ～２Ｄ）に要約する。

【0271】

この図から直接的に導き出すことができるように、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２（図２Ａ）は試験した全ての濃度においてチロシナーゼを抑制したが、この作用は０．２５ｍｇ／ｍＬ以降に用量依存的に増加した。

【0272】

一方、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２（図２Ｂ）は、０．０５ｍｇ／ｍＬ以降、用量依存的にチロシナーゼ活性の抑制を示した。

【0273】

ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２（図２Ｃ）は、０．２５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度でチロシナーゼ活性の用量依存的抑制を示した。

【0274】

一方、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２（図２Ｄ）（本発明のペプチドではない）は、試験した濃度のいずれにおいてもチロシナーゼ活性を抑制しなかった。一方、これは、濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ以降では、チロシナーゼ活性を用量依存的に増加させた。

【0275】

技術水準では、とりわけ、メラニンの堆積により暗円が引き起こされることが知られており、チロシナーゼ活性の抑制がメラニン堆積を減少させることも確立されている（ＭＩＲｙｕｎｇＲｏｈ，ＫｅｅＹａｎｇＣｈｕｎｇ：ＩｎｆｒａｏｒｂｉｔａｌＤａｒｋＣｉｒｃｌｅｓ：Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ，Ｃａｕｓｅｓ，ａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔＯｐｔｉｏｎｓ，ＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌＳｕｒｇｅｒｙ，３５：８：Ａｕｇｕｓｔ２００９）。

【0276】

これらの結果は、チロシナーゼ活性を抑制するのではなく前記活性を維持または増加させる類似のペプチド（Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２）ではなく、眼における色素過剰症、好ましくは眼窩骨膜血色素増加症の治療および／または予防のための、（Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：２－ＮＨ_２およびＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：３－ＮＨ_２によって例示されるような）本発明のペプチドの有用性を実証する。

【0277】

〔実施例１２．ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２の血管新生に対する効果〕
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を、インビトロで血管形成を調節するその能力について分析した。

【0278】

ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２は、実施例１～５に従って調製した。

【0279】

本症例では、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて管形成アッセイを行った。簡単に述べると、４０μＬのｇｅｌｔｒｅｘを９６ウェルプレートのウェルに添加し、３０分間固化させた。その後、８０００細胞を各ウェルに一緒に適用した：
完全培地（基底対照）。
完全培地＋２０μＭスラミン（管形成の抑制剤）。
完全培地＋１０ｎｇ／ｍＬＩＬ－３３。
完全培地＋１０ｎｇ／ｍＬＩＬ－３３＋種々の濃度のペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２（より正確には、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬまたは０．１ｍｇ／ｍＬ）。

【0280】

１６時間のインキュベーション後、細胞を顕微鏡により可視化し、各ウェルの１０×で写真を撮った。ウェルの各々について、メッシュの数およびメッシュの総面積を、血管形成の指標（これは、血管新生の指標である）として分析した。

【0281】

結果を図３に要約する。

【0282】

前記図から容易に導き出すことができるように、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２は、メッシュの個数およびメッシュの総面積の両方に関して、試験したすべての濃度で、ＩＬ－３３によって誘導される血管形成または血管新生を覆すことができた。

【0283】

したがって、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２によって例示されるように、本発明のペプチドは血管新生を抑制および／または予防することができ、したがって、それらは血管新生または過剰な血管形成、好ましくは眼袋および眼窩骨膜血色素増加症に関連する美容上の特性の治療に有効である。

【0284】

〔実施例１３．本発明のペプチドの脂質過酸化に対する保護能の分析〕
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を、チオバルビツール酸反応性物質（以下、ＴＢＡＲ）アッセイによって、脂質過酸化から保護するその能力について分析した。

【0285】

ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２は、実施例１～５に従って調製した。

【0286】

簡単に述べると、Ｔｒｏｌｏｘ（陽性対照）、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＹＰＣ）の小さな単層小胞の存在下の０．０１、０．０５、０．１および０．５ｍｇ／ｍＬのペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２、脂質過酸化のための基質を、チオバルビツール酸（ＴＢＡ）の存在下、３７℃で２時間インキュベートした。蛍光測定法を用いて、陰性対照（卵黄ホスファチジルコリンの小さな単層小胞のみを有する試料）と比較した脂質過酸化の％を評価した。

【0287】

この実施例で得られた結果を図４にまとめて示す。

【0288】

この図から直接的に導き得るように、本発明のペプチドは、試験された全ての濃度で抗酸化活性を示す。

【0289】

したがって、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２によって例示されるように、本発明のペプチドは、脂質過酸化から保護することができた。

【0290】

メラトニンも強力な抗酸化剤であるので、過酸化から保護するペプチド能力の分析をメラトニンとも比較した。

【0291】

試験、対照、手順、材料およびデータ分析は、上記で説明したものと同じであった。

【0292】

図８は、メラトニン０．１ｍｇ／ｍＬおよび０．５ｍｇ／ｍＬと比較して、抗過酸化活性について得られたデータのグラフ表示を示す。

【0293】

このデータは、本発明のペプチドが脂質過酸化に対してメラトニン様保護作用を有することを示している。

【0294】

技術水準で知られているように、脂質過酸化は、細胞膜の変化による細胞障害および死に関連する。

【0295】

したがって、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２によって例示されるような本発明のペプチドは、老化の予防および／または治療のための化粧品において、ならびに、脂質過酸化に関連する疾患、好ましくはアテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、早産の網膜症、境界人格障害、喘息、パーキンソン病および腎障害の予防および／または治療のための医薬品において、有効である。

【0296】

〔実施例１４．本発明のペプチドの糖化に対する保護能の分析〕
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を、高度な糖化最終産物（ＡＧＥ）の生成を減少させるその能力について分析した。

【0297】

ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２は、実施例１～５に従って調製した。

【0298】

簡単に述べると、０．０１、０．０５、０．１および０．５ｍｇ／ｍＬのペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を、糖化剤およびその対応する基質と一緒に混合した。試料を３７℃で７２時間インキュベートした。蛍光測定法を用いて、陰性対照（糖基質のみを有する試料）と比較したタンパク質糖化の％を評価した。

【0299】

この実施例で得られた結果を図５にまとめて示す。

【0300】

この図から直接的に導き得るように、本発明のペプチドは、試験したすべての濃度で、糖化剤によって生成された糖化をほぼ完全に逆転させることができた。

【0301】

したがって、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２によって例示されるように、本発明のペプチドは、タンパク質糖化から保護することができた。

【0302】

さらに、タンパク質糖化から保護する本発明のペプチドの性能をエクスビボでも試験した。

【0303】

簡単に述べると、４０歳の女性からのヒト皮膚外植片を、湿った５％ＣＯ_２大気中、３７℃のＢＥＭ培養培地中で生存させた。１％（ｗ／ｖ）のＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を含んだ実施例６による化粧組成物を調製し、また、ペプチドを含まないもの（プラセボ）も調製した。これらのクリームを、外植片あたり２μＬ（２ｍｇ／ｃｍ^２）に基づいて局所的に適用し、０日目（Ｄ０）、１日目、４日目、６日目および８日目に小スパチュラを用いて広げた。対照外植片は、培養培地の更新を除いて、いかなる治療も受けなかった。糖化を誘導するために、メチルグリオキサール（ＭＧ）の溶液を、関連するバッチ「ＭＧ」（対照未処理外植片を除くすべての試料）の４日目、６日目および８日目にＢＥＭ培養培地中に５００μＭの最終濃度で組み込んだ。移植片を各時点で収集し、２つの部分に切断した。半分を緩衝ホルマリン溶液中で固定し、半分を－８０℃で凍結した。

【0304】

緩衝ホルマリン中で２４時間固定した後、試料を脱水し、パラフィンに含浸させた。ＬｅｉｃａＲＭ２１２５Ｍｉｎｏｔ型ミクロトームを用いて５μｍ厚のセクションを作製し、セクションをＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）組織学的ガラススライド上に載せた。カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）免疫染色（ＣＭＬは、酸化ストレスおよび化学品糖化の結果としてタンパク質および脂質上に見出される高度な糖化最終産物（ＡＧＥ）であり、高度な糖化のマーカーとして使用される。）は、ＰＢＳ－ＢＳＡ０．３％（ｗ／ｖ）中で１：２５に希釈されたモノクローナル抗ＣＭＬ抗体を用いて室温で１晩実施され、ペルオキシダーゼの基質であるＶＥＣＴＯＲ（登録商標）ＶＩＰ（ベクターラボラトリーズ）によって示された。

【0305】

図６に見られるように、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２は、９日間の培養後にＭＧ誘導糖化から保護され、ＭＧに曝露した未処理外植片と比較した場合、ＣＭＬシグナルの有意な低下（－７３％）を示した。プラセボ処理外植片はＣＭＬ染色の有意な減少を示さなかった。

【0306】

メラトニンも糖化から保護することができる強力な抗酸化剤であるので、高度な糖化最終産物（ＡＧＥ）の形成を減少させるペプチド能力の分析（糖化に対する保護）をメラトニンとも比較した。

【0307】

試験、対照、手順、材料およびデータ分析は、上記で説明したものと同じであった。

【0308】

図９は、メラトニン０．１ｍｇ／ｍＬおよび０．５ｍｇ／ｍＬと比較して、抗糖化活性について得られたデータのグラフ表示を示す。

【0309】

このデータは、本発明のペプチドが糖化に対してメラトニン様保護作用を有することを示している。

【0310】

技術水準で知られているように、糖化は、時間とともに自然に起こるが、糖尿病、腎不全、炎症の際にも病理学的に起こる内因性老化機構の一つである。ＡＧＥは、多くの加齢性変性疾患において組織および器官に高度に蓄積される。これらの毒性付加物（グリコトキシン）は、特に糖尿病患者や古い生物において、細胞機能不全に関係している。糖尿病患者におけるＡＧＥ形成および蓄積は、糖尿病性血管障害をもたらす血管変化をもたらす。

【0311】

糖化はまた、細胞外マトリックス障害（コラーゲンおよび弾性線維への障害）、炎症、酸化ストレスおよびアポトーシスと関係し、したがって、それは老化と関係する。

【0312】

したがって、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２によって例示されるような本発明のペプチドは、タンパク質糖化から保護することができ、したがって、老化の予防および／または治療のための化粧品において、ならびに、糖化に関連する疾患、好ましくは糖尿病（より好ましくは糖尿病性血管障害）、腎不全、炎症および加齢に関連する変性疾患の予防および／または治療のための医薬品において、有効である。

【0313】

〔実施例１５．エクスビボ試料におけるフィブリリン－１の分析〕
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を、真皮細胞外マトリックスを糖化から保護するその能力について分析した。

【0314】

ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２は、実施例１～５に従って調製した。

【0315】

簡単に述べると、４０歳の女性からのヒト皮膚外植片を、湿った５％ＣＯ_２大気中、３７℃のＢＥＭ培養培地中で生存させた。プラセボクリームおよび実施例６に従って調製した１％Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を含むクリームを、外植片あたり２μＬ（２ｍｇ／ｃｍ^２）に基づいて局所的に適用し、０日目（Ｄ０）、１日目、４日目、６日目および８日目に小スパチュラを用いて広げた。対照外植片は、培養培地の更新を除いて、いかなる治療も受けなかった。糖化を誘導するために、メチルグリオキサール（ＭＧ）の溶液を、関連するバッチ「ＭＧ」（制御未処理試料を除くすべての試料）の４日目、６日目および８日目にＢＥＭ培養培地中に５００μＭの最終濃度で組み込んだ。移植片を各時点で収集し、２つの部分に切断した。半分を緩衝ホルマリン溶液中で固定し、半分を－８０℃で凍結した。

【0316】

フィブリリン１免疫染色は、ＰＢＳ、ＢＳＡ０．３％（ｗ／ｖ）中で１：５００に希釈されたモノクローナル抗フィブリリン１抗体および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を用いて凍結切片上にて室温で１時間実施され、ビオチン／ストレプトアビジン増幅系を用いて示された。核をヨウ化プロピジウムで対比染色した。

【0317】

図７からのデータは、ＭＧへの曝露が９日目の非曝露対照と比較した場合、どのようにして真皮におけるフィブリリン１染色の有意な減少を誘導するかを示す。ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２はこの障害から保護することができ、ＭＧに曝露した未処理対照と比較した場合、９日目にフィブリリン１染色の有意な増大（８６％）を示した。

【0318】

技術水準で知られているように、フィブリリン－１は、皮膚の完全性および機械的性質を維持する際に必須の機能を示す真皮－表皮接合部に沿って見出されるオキシタラン繊維の主要成分である（Ｏｘｌｕｎｄｅｔａｌ．，１９８０．ＪＡｎａｔ．１３１：６１１－６２０）。皮膚美容研究において、フィブリリン－１は、通常、真皮の細胞外マトリックスの構造状態のバイオマーカーとして使用される。

【0319】

したがって、本発明のペプチドは、（Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２によって例示されるように）皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を低減、予防および／または排除し、より正確には、本実施例の結果は、本発明のペプチドの有用性が皮膚の完全性および機械的性質を維持し、したがって、皮膚の堅さを改善し、皺を減少させることを実証する。

【0320】

〔実施例１６．睡眠遮断に関連する遺伝子の発現の分析〕
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を、ＨＤＦａ細胞、ＨＥＫａ細胞およびＨＵＶＥＣにおける睡眠遮断の結果に関連する遺伝子の発現を調節するその能力について分析した（分析した遺伝子について表１１を参照のこと）。

【0321】

本実施例で使用したペプチドは、実施例１～５に従って調製した。

【0322】

ペプチドのストック溶液を、１ｍｇ／ｍＬの水中で調製した。作業溶液は、対応する補充培地中のストック溶液から特定の濃度で新たに調製した。

【0323】

未処理細胞を基底または陰性対照試料として使用した。

【0324】

ＲＮＡ（リボ核酸）抽出およびＲＴ－ｑＰＣＲ（逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応）を実施した。簡単に述べると、ＨＥＫａ、ＨＤＦａまたはＨＵＶＥＣ細胞を、２つ組で（ｎ＝２）、４×１０^５細胞／ウェル（ＨＵＶＥＣ細胞については２×１０^５細胞／ウェル）の密度で６ウェルプレート中に播種し、標準培養条件（ＨＤＦａ細胞については１％（ｖ／ｖ）ＬＳＧＳを補充した１０６培地；ＨＥＫａ細胞については１％（ｖ／ｖ）ＥＤＧＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した培地Ｅｐｉｌｉｆｅ；ＨＵＶＥＣ細胞については内皮細胞増殖培地；３７℃、９５％室内湿度、５％ＣＯ_２）で２４時間維持した。

【0325】

次いで、細胞をペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２で０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度で２４時間処理した。未処理細胞を基底または陰性対照試料として使用した。

【0326】

細胞を最終的に溶解し、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキットを用いたＲＮＡ抽出のために、製造業者の説明書に従って複製物を一緒にプールした。精製したＲＮＡを用いて、市販のキットの高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた逆転写により、増幅のための鋳型として働く対応するｃＤＮＡ（相補的デオキシリボ核酸）を生成した。ＲＴ－ｑＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅｐｌｕｓＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ機器を使用して、表１０に示す遺伝子についての適切なＴａｑＭａｎアッセイプローブのパネル（ハウスキーピング遺伝子として使用したＧＡＰＤＨ－グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼを加えている）および２ｘ遺伝子発現マスターミックスを用いて行った。増幅は、９５℃で１５秒（変性）および６０℃で１分（アニーリングおよび伸長）の４０サイクルを含んだ（Ａｒｙａ，Ｍ．，Ｓｈｅｒｇｉｌｌ，Ｉ．Ｓ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｍ．，Ｇｏｍｍｅｒｓａｌｌ，Ｌ．，Ａｒｙａ，Ｎ．，Ｐａｔｅｌ，Ｈ．Ｒ．（２００５）Ｂａｓｉｃｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．；５（２）：２０９－１９；ａｎｄＪｏｚｅｆｃｚｕｋ，Ｊ．ａｎｄＡｄｊａｙｅ，Ｊ．（２０１１）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ－ｂａｓｅｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．５００；９９－１０９）。

【0327】

【表11】

【0328】

【0329】

【0330】

このアッセイの結果は、表１２～表１４にもまとめられている。

【0331】

【表12】

【0332】

【表13】

【0333】

【表14】

【0334】

したがって、本発明のペプチドは、（Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２によって例示されるように）睡眠遮断に関連する皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を低減、予防および／または排除する。これは、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２が、ＩＬ－３３レベル（ＥＬＩＳＡ）に対するその効果に加えて、ＩＬ３３受容体（ＩＬ１ＲＬ１）およびＩＬ３３関連阻害剤（ＳＩＧＩＲＲ）のダウンレギュレーションを誘導することによって、その信号を調節することができるためである。他の炎症関連遺伝子（ＣＸＣＬ８およびＮＦＫＢ１）の調節も観察されている。

【0335】

炎症に対するこの作用とは別に、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２はまた、グルコーストランスポーターＳＬＣ２Ａ１の発現をダウンレギュレートし、メラトニン受容体ＭＮＴＲ１の発現をアップレギュレートすることができ、両方とも、睡眠遮断に対する生理学的反応に関与する。

【0336】

〔実施例１７．Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２での処理によって誘導された遺伝子の発現の分析〕
ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２の遺伝子調節を、ＨＤＦａ細胞およびＨＥＫａ細胞においてこの実施例で分析した（分析した遺伝子については表１５を参照のこと）。

【0337】

本実施例で使用したペプチドは、実施例１～５に従って調製し、必要な適合を行った。

【0338】

ペプチドのストック溶液を、１ｍｇ／ｍＬの水中で調製した。作業溶液は、対応する補充培地中のストック溶液から特定の濃度で新たに調製した。

【0339】

未処理細胞を基底または陰性対照試料として使用した。

【0340】

ＲＮＡ（リボ核酸）抽出およびＲＴ－ｑＰＣＲ（逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応）を実施した。簡単に述べると、ＨＥＫａ細胞またはＨＤＦａ細胞を、２つ組で（ｎ＝２）、４×１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート中に播種し、標準培養条件（ＨＤＦａ細胞については１％（ｖ／ｖ）ＬＳＧＳを添加した１０６培地；ＨＥＫａ細胞については１％（ｖ／ｖ）ＥＤＧＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地；３７℃、９５％室内湿度、５％ＣＯ_２）で２４時間維持した。

【0341】

次いで、細胞をペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２で０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度で２４時間処理した。未処理細胞を基底または陰性対照試料として使用した。

【0342】

細胞を最終的に溶解し、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキットを用いたＲＮＡ抽出のために、製造業者の説明書に従って複製物を一緒にプールした。精製したＲＮＡを用いて、市販のキットの高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた逆転写により、増幅のための鋳型として働く対応するｃＤＮＡ（相補的デオキシリボ核酸）を生成した。ＲＴ－ｑＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅｐｌｕｓＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ機器を使用して、表１０に示す遺伝子についての適切なＴａｑＭａｎアッセイプローブのパネル（ハウスキーピング遺伝子として使用したＧＡＰＤＨ－グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼを加えている）および２ｘ遺伝子発現マスターミックスを用いて行った。増幅は、９５℃で１５秒（変性）および６０℃で１分（アニーリングおよび伸長）の４０サイクルを含んだ（Ａｒｙａ，Ｍ．，Ｓｈｅｒｇｉｌｌ，Ｉ．Ｓ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｍ．，Ｇｏｍｍｅｒｓａｌｌ，Ｌ．，Ａｒｙａ，Ｎ．，Ｐａｔｅｌ，Ｈ．Ｒ．（２００５）Ｂａｓｉｃｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．；５（２）：２０９－１９；ａｎｄＪｏｚｅｆｃｚｕｋ，Ｊ．ａｎｄＡｄｊａｙｅ，Ｊ．（２０１１）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ－ｂａｓｅｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．５００；９９－１０９）。

【0343】

【表15】

【0344】

【0345】

【0346】

このアッセイの結果は、表１６および表１７にもまとめられている。

【0347】

【表16】

【0348】

【表17】

【0349】

したがって、表１６および１７に含まれる結果から直接的に得られるように、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２（これは上記のように、本発明のペプチドではないが、非常に類似している）は本発明のペプチドについて見られる好ましい遺伝子調節を示さず、反対に、これは遺伝子のあるグループにおいて逆の遺伝子調節を示し、そして遺伝子の別のグループにおける発現において影響の欠乏を示す。

【0350】

したがって、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２は、本発明のペプチドについて上記で実証されたものとは対照的である：
Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２は、ＣＯＬ３Ａ１およびＴＩＭＰ２のダウンレギュレーションを示した。したがって、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２は、ＥＣＭ合成および維持に関して遺伝子の好ましくない調節を示した。したがって、本発明のペプチドとは対照的に、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２は皮膚老化徴候および／または皮膚の欠陥を低減、予防および／または排除することができず、より正確には、本実施例の結果は、前記ペプチドが、皮膚の硬さを改善して皺を低減することができないことを実証する。
Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２は、遺伝子ＯＣＬＮ、ＣＤＳＮおよびＴＪＰ１、つまり、密着結合および障壁機能に関連する重要な遺伝子のわずかなダウンレギュレーションまたは調節の欠如を示す。したがって、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２は、本発明のためのペプチドについて実証されたものとは対照的に、ケラチノサイト間の密着結合を改善することができず、したがって、それらの間の凝集を改善することができず、したがって、皮膚の硬さを改善することができず、皺を低減することができない。
また、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２は、ＳＩＧＩＲＲのダウンレギュレーション、およびＳＬＣ２Ａ１のわずかなダウンレギュレーションまたはレギュレーションの欠如を示した。したがって、ペプチドは、睡眠遮断に対する反応を回復させることができなかった。
最後に、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：４－ＮＨ_２は、遺伝子ＩＬ３３およびＩＬ１ＲＬ１の発現を調節または変化させることができず、したがって、ＩＬ３３に関連していて上記で説明したすべての反応を調節することができなかった。

【0351】

〔実施例１８．ヒトリンパ性真皮微小血管内皮細胞（ＨＤＬＭＶＥＣ）に対するエミリン－１タンパク質の発現に対するＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２の効果の分析〕
エミリン－１タンパク質の発現は、より良好なリンパ管構造および組織からの流体クリアランスと関連し得るので、この実施例においてはエミリン－１タンパク質について免疫蛍光アッセイを実施した。

【0352】

ＨＤＬＭＶＥＣを、５％ＣＯ_２を含む加湿大気中で、１６，０００細胞／ｃｍ^２の密度および３７℃で、微小血管内皮細胞増殖（ＭＥＣＧ）培地中でカバースリップ上で培養した。細胞コンフルエンスが約７０～８０％であった場合、細胞を、ＭＥＣＧ培地中の０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２で２４時間処理した。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％ホルムアルデヒドで固定し、Ｔｒｉｔｏｎ０．２％で透過処理した。次に、非特異的抗体結合を避けるために、試料をＰＢＳ／ＢＳＡ５％で１時間ブロックした。

【0353】

エミリン－１を、ＰＢＳ／ＢＳＡ１％中の１：５０エミリン－１抗体で、室温で１．５時間染色した。ＰＢＳで適切に洗浄した後、アクチンを５０μｇ／ｍＬファロイジンで室温で１時間染色した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、５μｇ／ｍＬの二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧと共に室温で１時間インキュベートした。最後に、カバースリップを、核を染色するＤＡＰＩと共にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いてマウントし、顕微鏡画像が取得されるまで、試料を４℃で光から保護した。

【0354】

顕微鏡画像は、１０×対物レンズを用いて取得した。２つの反復を各状態について染色し、同じ設定を用いて各カバースリップの１０の異なる視野の画像を取得した。

【0355】

図１０は、基底細胞（Ａ）および０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２で処理した細胞（Ｂ）について蛍光顕微鏡で得られた画像を示す（緑色：エミリン－１、赤色：ファロイジン、青色：核）。

【0356】

画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析した。手短に言えば、閾値を調整してエミリン－１染色を選択し、平均蛍光を測定した。ＤＡＰＩ染色を用いて細胞数を計数した。エミリン－１平均蛍光強度を細胞数で割った。最後に、全てのデータを以下のように正規化して、未処理細胞と比較したエミリン－１の％を得た：
％対基底＝（処理ウェル中の細胞あたりの蛍光）／（未処理ウェル中の細胞あたりの蛍光）×１００。

【0357】

統計学的データ分析は、処理細胞と非処理細胞の蛍光の比較、＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１および＊＊＊、ｐ＜０．００１によりスチューデントｔ検定を用いて行った。

【0358】

【表18】

【0359】

結果は、未処理細胞と比較した場合、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２が、処理の２４時間後にエミリン－１の発現を７０％よりも有意に増加させたことを示す。エミリン－１がリンパ機能において重大な役割を果たすことを考えると、これらの結果は、化粧品への適用が考えられる、組織からの液体クリアランスにおけるＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２の潜在的な役割を示唆する。

【0360】

〔実施例１９．ヒトリンパ性真皮微小血管内皮細胞（ＨＤＬＭＶＥＣ）におけるインテグリンα９β１タンパク質の発現に対するペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２の効果の分析〕
インテグリンα９β１（Ｉｔｇ９）タンパク質の発現は、より良好なリンパ管構造および組織からの流体クリアランスと関連しているので、この実施例においてはインテグリンα９β１（Ｉｔｇ９）タンパク質について免疫蛍光アッセイを実施した。

【0361】

ＨＤＬＭＶＥＣを、５％ＣＯ_２を含む加湿大気中で、１６，０００細胞／ｃｍ^２の密度および３７℃で、微小血管内皮細胞増殖（ＭＥＣＧ）培地中でカバースリップ上で培養した。

【0362】

細胞コンフルエンスが約７０～８０％であった場合、細胞を、ＭＥＣＧ培地中の０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２で２４時間処理した。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％ホルムアルデヒドで固定し、Ｔｒｉｔｏｎ０．２％で透過処理した。次に、非特異的抗体結合を避けるために、試料をＰＢＳ／ＢＳＡ５％で１時間ブロックした。

【0363】

Ｉｔｇ９を、ＰＢＳ／ＢＳＡ１％中の１：５０抗Ｉｔｇ９抗体で、室温で１．５時間染色した。ＰＢＳで適切に洗浄した後、アクチンを５０μｇ／ｍＬファロイジンで室温で１時間染色した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、５μｇ／ｍＬの二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧと共に室温で１時間インキュベートした。最後に、カバースリップを、核を染色するＤＡＰＩと共にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いてマウントし、顕微鏡画像が取得されるまで、試料を４℃で光から保護した。

【0364】

顕微鏡画像は、１０×対物レンズを用いて取得した。２つの独立した実験を各条件について行い、同じ設定を用いて各カバースリップの少なくとも１３の異なる視野の画像を取得した。

【0365】

図１１は、基底細胞（Ａ）および、０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２で２４時間処理した後のＨＤＬＭＶＥＣ上のインテグリンα９β１発現についての蛍光顕微鏡で得られた画像を示す（緑色：インテグリンα９β１、赤色：ファロイジン、青色：核）。

【0366】

画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析した。手短に言えば、閾値を調整してＩｔｇ９染色を選択し、平均蛍光を測定した。ＤＡＰＩ染色を用いて細胞数を計数した。Ｉｔｇ９平均蛍光強度を細胞数で割った。

【0367】

データの正規化および統計は、先に説明したように行った。

【0368】

【表19】

【0369】

結果は、未処理細胞と比較した場合、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２が、処理の２４時間後に初代ヒトリンパ管真皮微小血管内皮細胞上のＩｔｇ９の発現を５０％よりも有意に増加させることを示す。Ｉｔｇ９がリンパ機能において重大な役割を果たすことを考えると、これらの結果は、化粧品における適用が考えられる、組織からの流体クリアランスにおけるＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２の潜在的な役割を示唆する。

【0370】

〔実施例２０．ヒト皮膚から単離した初代ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫａ）における先天性抗菌免疫関連遺伝子の発現に対するペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：：１－ＮＨ_２およびメラトニンの効果の分析〕
試験、制御、手順、材料およびデータ分析は、実施例１６－１７で説明したものと同じであった。

【0371】

ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２およびメラトニンがヒト表皮ケラチノサイトにおけるウイルス免疫反応に関与する遺伝子の発現を調節する可能性を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した。結果は、ＨＥＫａ細胞について、０．０１ｍｇ／ｍＬのＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２ペプチドでの６時間処理が、ＨＥＫａ中の重要な遺伝子ＩＲＦ３、ＤＥＦＢ４Ａ、Ｓ１００Ａ７およびＭＸ１／ＭＸＡの強力なアップレギュレーションを誘導することができることを示す。ＩＲＦ１、ＤＥＦＢ１、ＯＡＳ２、ＩＳＧ１５などの他の遺伝子も、Ｄ１８ＣｈＡＨによる処理でアップレギュレートされた。ＨＥＫａ細胞におけるメラトニンの効果に関して、０．０１ｍｇ／ｍＬで６時間処理した後、遺伝子ＤＥＦＢ１、ＤＥＦＢ４Ａ、Ｓ１００Ａ７、ＯＡＳ２、ＭＸ１はアップレギュレートされたが、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２の効果と比較して、より少なかった（図１２、表２０）。

【0372】

図１２は、６時間の処理後の、ＨＥＫａ細胞中の０．０１ｍｇ／ｍＬのペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２または０．０１ｍｇ／ｍＬのメラトニンによる、抗菌性先天性免疫反応に関連する遺伝子の調節を示す。

【0373】

【表20】

【0374】

【表21】

【0375】

ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２は０．０１ｍｇ／ｍＬで６時間処理した後、ＨＥＫａにおける遺伝子発現を調節し、表皮ケラチノサイトにおける抗菌性先天性免疫反応に関与する遺伝子の調節をもたらす。具体的には、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２がＩＲＦ３、ＤＥＦＢ４Ａ、Ｓ１００Ａ７およびＭＸ１の強力なアップレギュレーションを誘導した。さらに、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２での治療は、重要な遺伝子ＩＲＦ１、ＤＥＦＢ１、ＯＡＳ２およびＩＳＧ１６もアップレギュレートした。メラトニンによるＨＥＫａの治療は遺伝子ＤＥＦＢ１、ＤＥＦＢ４Ａ、Ｓ１００Ａ７、ＯＡＳ２およびＭＸ１をアップレギュレートしたが、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２の作用と比較して、より少ない程度であった。

【0376】

これらの全ての結果は、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２が、宿主の抗菌性先天性免疫反応および抗ウイルス性先天性免疫反応に関与する遺伝子のモジュレーターであり得、したがって、侵入および感染に対する表皮障壁の免疫防御を増加させることができることを強く示唆する。さらに、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２は、遺伝子発現調節に関してメラトニン様作用を示すようである。結果として、これの全ては、Ａｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２を化粧品産業において関心のある化合物にする。

【0377】

〔実施例２１．眼袋容量のインビボ結果〕
ペプチドを含む顔用化粧組成物を、眼袋容量のインビボ減少においてプラセボ組成物と比較した。この実施例には実施例６と同じ組成物を用いたが、ペプチドＡｃ－ＳＥＱＩＤＮＯ：１－ＮＨ_２の市販製剤の重量は３％（ｇ／１００ｇ）であった。プラセボ組成物はペプチドを含まない。

【0378】

図１３は、ペプチドを含む組成物およびプラセボ組成物による眼袋容量の減少のグラフ表示を示す。

【0379】

結果は、プラセボ組成物で観察された体積の減少と比較して、ペプチドを含む組成物で７日後に５％の眼袋容量の減少および１４日後に７％の減少を示す。

【図1】