特表 2023-504593 産生系

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-06

(54)【発明の名称】産生系

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20230130BHJP

   C12N 15/115 20100101ALI20230130BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230130BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20230130BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230130BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20230130BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230130BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20230130BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20230130BHJP

   A61K 48/00 20060101ALN20230130BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z

C12N15/115 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/86 Z

C12N5/10

A61K35/761

A61K35/76

A61K35/763

C12N7/01

A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022526764

(86)(22)【出願日】2020-11-11

(85)【翻訳文提出日】2022-07-07

(86)【国際出願番号】 GB2020052873

(87)【国際公開番号】W WO2021094752

(87)【国際公開日】2021-05-20

(31)【優先権主張番号】1916452.4

(32)【優先日】2019-11-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2001998.0

(32)【優先日】2020-02-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】306034996

【氏名又は名称】オックスフォード バイオメディカ（ユーケー）リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100182132

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100172683

【弁理士】

【氏名又は名称】綾 聡平

(74)【代理人】

【識別番号】100219265

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 崇大

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】ファーリー，ダニエル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA20

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA20

(57)【要約】

本発明は、関心対象のヌクレオチドとトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位とを含み、コザック配列を含んでもよい核酸配列に関し、前記ＴＲＡＰ結合部位は、コザック配列および／または関心対象のヌクレオチドのＡＴＧ開始コドンと重複する。本発明はさらに、関心対象のヌクレオチドとコザック配列とを含む核酸配列であって、前記コザック配列は、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位の一部を含む核酸配列に関する。本発明はさらに、関心対象のヌクレオチドとＴＲＡＰ結合部位を含む核酸配列であって、ＴＲＡＰ結合部位が前記関心対象のヌクレオチドの開始コドンＡＴＧの一部を含み、またはＡＴＧ開始コドンがＴＲＡＰ結合部位の一部を含む、核酸配列に関する。本発明はさらに、関心対象のヌクレオチドと、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）に対する結合部位と、多重クローニング部位と、コザック配列とを含む核酸配列であって、前記多重クローニング部位は、ＴＲＡＰ結合部位の３’ＫＡＧＮ２－３反復と重複しているか、またはＴＲＡＰ結合部位の３’ＫＡＧＮ２－３反復に対して下流かつコザック配列の上流に位置する、核酸配列に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

関心対象のヌクレオチドとトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位とを含む核酸配列であって、
（ｉ）前記ＴＲＡＰ結合部位は前記関心対象のヌクレオチドの開始コドンＡＴＧと重複する；および／または
（ｉｉ）前記核酸配列はコザック配列も含み、前記ＴＲＡＰ結合部位は前記コザック配列と重複する、
核酸配列。

【請求項2】

関心対象のヌクレオチドとＴＲＡＰ結合部位とを含む核酸配列であって、
（ｉ）前記ＴＲＡＰ結合部位は前記関心対象のヌクレオチドの前記開始コドンＡＴＧの一部を含み、もしくはＡＴＧ開始コドンは前記ＴＲＡＰ結合部位の一部を含む；および／または
（ｉｉ）前記核酸配列はコザック配列も含み、前記コザック配列は前記ＴＲＡＰ結合部位の一部を含む、
核酸配列。

【請求項3】

前記関心対象のヌクレオチドが前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部に機能的に連結されている、請求項１または２に記載の核酸配列。

【請求項4】

前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部が、前記関心対象のヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質と相互作用することができる、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項5】

前記関心対象のヌクレオチドが、前記トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質を欠如する標的細胞中で翻訳される、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項6】

前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部が配列ＫＡＧＮ２－３の複数の反復を含む、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項7】

前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部が配列ＫＡＧＮ２の複数の反復を含む、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項8】

前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部が配列ＫＡＧＮ２の少なくとも６つの反復を含む、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項9】

前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部が配列ＫＡＧＮ２－３の少なくとも８つの反復を含む、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項10】

ＫＡＧＮＮＮ反復の数が１またはそれ未満である、請求項９に記載の核酸配列。

【請求項11】

前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部が配列ＫＡＧＮ２の少なくとも８～１１の反復を含む、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項12】

前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部が配列ＫＡＧＮ２－３の１１の反復を含み、ＫＡＧＮＮＮ反復の数が３またはそれ未満である、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項13】

前記コザック配列および／または開始コドンが前記ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端と重複する、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項14】

前記コザック配列および／または開始コドンが前記ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復と重複する、請求項１３に記載の核酸配列。

【請求項15】

前記コザック配列が配列ＲＮＮＡＴＧ（配列番号１２５）またはＲＶＶＡＴＧ（配列番号２８）を含む、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項16】

前記重複するコザック配列および／または開始コドンおよびＴＲＡＰ結合部位またはその一部が、配列番号２９～３３のいずれか１つを含む、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項17】

前記核酸配列が、配列番号３４～３７、６９～９２または１０８～１１２の任意の１つ、好ましくは配列番号１１４）を含む、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項18】

前記核酸配列が配列番号３４または配列番号３５の１つを含む、請求項１７に記載の核酸配列。

【請求項19】

転写開始部位／プロモーターの末端からＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の開始までの距離が１～３３ヌクレオチド長である、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項20】

転写開始部位／プロモーターの末端からＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の開始までの距離が１～１２ヌクレオチド長である、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項21】

前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部が、ＩＩ型制限酵素部位、好ましくはＳａｐＩ制限酵素部位を欠如する、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項22】

前記核酸配列が、前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部の上流に５’リーダー配列を含む、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項23】

前記リーダー配列が、非コードＥＦ１αエクソン１領域に由来する配列を含む、請求項２２に記載の核酸配列。

【請求項24】

前記リーダー配列が、配列番号２５または配列番号２６で定義される配列を含む、請求項２３に記載の核酸配列。

【請求項25】

前記配列が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項26】

前記配列が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）とＴＲＡＰ結合部位またはその一部との間にスペーサー配列を含む、請求項２５に記載の核酸配列。

【請求項27】

前記スペーサーが０から３０ヌクレオチド長である、請求項２６に記載の核酸配列。

【請求項28】

前記スペーサーが１５ヌクレオチド長である、請求項２７に記載の核酸配列。

【請求項29】

前記スペーサーが、前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部の３’末端および前記関心対象のヌクレオチドの下流開始コドンから３または９ヌクレオチドである、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項30】

前記スペーサーが配列番号３８～４４の任意の１つで定義される配列を含み、好ましくは前記スペーサーが配列番号３９で定義される配列を含む、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項31】

前記関心対象のヌクレオチドが治療効果を生じさせる、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項32】

前記核酸配列がＲＲＥ配列またはその機能的代替物をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項33】

前記核酸配列がベクター導入遺伝子発現カセットである、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項34】

前記ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の前記３’末端ＫＡＧＮＮ反復が、少なくとも前記開始コドンＡＴＧの最初のヌクレオチドと重複する、先行する請求項のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項35】

前記ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の前記３’末端ＫＡＧＮＮ反復が、前記開始コドンＡＴＧの最初の２つのヌクレオチドと重複する、請求項３４に記載の核酸配列。

【請求項36】

前記ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の前記３’末端ＫＡＧＮＮ反復が、コアコザック配列内の前記開始コドンＡＴＧの最初のヌクレオチドと重複する、請求項３４に記載の核酸配列。

【請求項37】

前記核酸配列が、配列番号１１４または配列番号１１６で定義される配列を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項38】

請求項１～３７または６７～９２のいずれか一項に記載の核酸配列を含むウイルスベクター。

【請求項39】

前記ウイルスベクターが、１より多くの関心対象のヌクレオチドを含み、少なくとも１つの関心対象のヌクレオチドが、請求項１～１２のいずれかに定義されるＴＲＡＰ結合部位またはその一部に機能的に連結されている、請求項３８に記載のウイルスベクター。

【請求項40】

前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスに由来する、請求項３８または請求項３９に記載のウイルスベクター。

【請求項41】

前記ウイルスベクターがレンチウイルスに由来し、好ましくは前記ウイルスベクターがＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する、請求項４０に記載のウイルスベクター。

【請求項42】

ウイルスベクターの産生のために必要とされる成分をコードする核酸配列の組を含むウイルスベクター産生系であって、前記ウイルスベクターのＲＮＡゲノムが、請求項１～３７または６７～９２のいずれかに記載の核酸配列を含む、ウイルスベクター産生系。

【請求項43】

前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来し、好ましくは、前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターであり、前記ウイルスベクター産生系が、ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質、前記トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質、およびＥｎｖタンパク質、またはこれらの機能的代替物をコードする核酸配列を含む、請求項４２に記載のウイルスベクター産生系。

【請求項44】

前記ウイルスベクター産生系が、ｒｅｖまたはその機能的代替物をコードする核酸配列をさらに含む、請求項４３に記載のウイルスベクター産生系。

【請求項45】

前記ウイルスベクターがレンチウイルスに由来する、好ましくは前記ウイルスベクターがＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する、請求項４２～４４のいずれかに記載のウイルスベクター産生系。

【請求項46】

請求項１～３７または６７～９２のいずれかに記載の核酸配列を含む、請求項４２～４５のいずれかに記載のウイルスベクター産生系において使用するためのＤＮＡ構築物。

【請求項47】

前記トリプトファン－ＲＮＡ結合減衰タンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項４２～４５のいずれかに記載のウイルスベクター産生系において使用するためのＤＮＡ構築物。

【請求項48】

請求項４６または請求項４７に記載のＤＮＡ構築物と、ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をコードするＤＮＡ構築物と、Ｅｎｖタンパク質またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物とを含む、請求項４２～４５のいずれかに記載のウイルスベクター産生系において使用するためのＤＮＡ構築物の組であって、好ましくは、前記ＤＮＡ構築物の組が、ｒｅｖ配列またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物をさらに含む、ＤＮＡ構築物の組。

【請求項49】

請求項１～３７または６７～９２のいずれかに記載の核酸配列、請求項４２～４５のいずれかに記載のウイルスベクター産生系または請求項４４６～４８のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を含むウイルスベクター産生細胞。

【請求項50】

前記細胞が、トリプトファン－ＲＮＡ結合減衰タンパク質をコードするベクターで一過性に形質移入される、請求項４９に記載のウイルスベクター産生細胞。

【請求項51】

前記細胞が、トリプトファン－ＲＮＡ結合減衰タンパク質を安定に発現する、請求項４９に記載のウイルスベクター産生細胞。

【請求項52】

請求項１～３７または６７～９２のいずれかに記載の核酸配列、請求項４２～４５のいずれかに記載のウイルスベクター産生系または請求項４６～４８のいずれかに記載のＤＮＡ構築物をウイルスベクター産生細胞中に導入することと、前記ウイルスベクターの産生に適した条件下で前記産生細胞を培養することと、を含む、ウイルスベクターを産生するための方法。

【請求項53】

請求項４９～５１のいずれかに記載のウイルスベクター産生細胞を使用して、または請求項５２に記載の方法によって、請求項４２～４５のいずれかに記載のウイルスベクター産生系によって産生されるウイルスベクター。

【請求項54】

請求項１～３７または６７～９２のいずれかに記載の核酸配列を含む、請求項５３に記載のウイルスベクター。

【請求項55】

レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来する、請求項５３または請求項５４に記載のウイルスベクター。

【請求項56】

レンチウイルスに由来する、請求項５５に記載のウイルスベクター。

【請求項57】

ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する、請求項５６に記載のウイルスベクター。

【請求項58】

請求項３８～４１または５３～５７のいずれか一項に記載のウイルスベクターによって形質導入された細胞。

【請求項59】

医学における使用のための、請求項３８～４１もしくは５３～５７のいずれかに記載のウイルスベクターまたは請求項５８に記載の細胞。

【請求項60】

関心対象のヌクレオチドを必要とする標的部位に前記関心対象のヌクレオチドを送達するための医薬の調製のための、請求項３８～４１もしくは５３～５７のいずれかに記載のウイルスベクターまたは請求項５８に記載の細胞の使用。

【請求項61】

請求項３８～４１もしくは５３～５７のいずれかに記載のウイルスベクターまたは請求項５８に記載の細胞を、これを必要とする対象に投与することを含む処置の方法。

【請求項62】

薬学的に許容され得る、担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、請求項３８～４１もしくは５３～５７のいずれかに記載のウイルスベクターまたは請求項５８に記載の細胞を含む薬学的組成物。

【請求項63】

核酸結合部位に機能的に連結されたときに関心対象のヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように相互作用することができる核酸結合部位および／または核酸結合タンパク質を同定する方法であって、レポーター遺伝子に機能的に連結された前記核酸結合部位および前記核酸結合タンパク質の両方を含む細胞におけるレポーター遺伝子の発現を分析することを含む、方法。

【請求項64】

前記レポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードする、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

ウイルスベクター産生細胞において関心対象のヌクレオチド（ＮＯＩ）の翻訳を抑制する方法であって、請求項１～３７または６７～９２のいずれか一項に定義される核酸配列、およびトリプトファン－ＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）をコードする核酸配列を前記ウイルスベクター産生細胞中に導入することを含み、前記ＴＲＡＰは前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部に結合し、それにより前記ＮＯＩの翻訳を抑制する、方法。

【請求項66】

真核生物のベクター産生細胞におけるウイルスベクター力価を増加させる方法であって、前記真核生物のベクター産生細胞中に請求項４２～４５のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系およびトリプトファン－ＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）をコードする核酸配列を導入することを含み、前記ＴＲＡＰは前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部に結合し、前記ＮＯＩの翻訳を抑制し、それにより、ＴＲＡＰ結合部位を有しないウイルスベクターと比較してウイルスベクター力価を増加させる、方法。

【請求項67】

関心対象のヌクレオチドと、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）に対する結合部位と、多重クローニング部位と、コザック配列とを含む核酸配列であって、前記多重クローニング部位は、前記ＴＲＡＰ結合部位の３’ＫＡＧＮ_２～３反復と重複しているか、または前記ＴＲＡＰ結合部位の３’ＫＡＧＮ_２～３反復に対して下流かつ前記コザック配列の上流に位置する、核酸配列。

【請求項68】

前記核酸配列が配列番号４５～５８の任意の１つを含む、請求項６７に記載の核酸配列。

【請求項69】

前記核酸配列が配列番号５２～５８の任意の１つを含む、請求項６８に記載の核酸配列。

【請求項70】

前記核酸配列が、配列番号５２、配列番号５５または配列番号５８の任意の１つを含む、請求項６９に記載の核酸配列。

【請求項71】

前記核酸配列がプロモーター－５’ＵＴＲ領域をさらに含む、請求項１～３７または６７～７０のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項72】

前記ＴＲＡＰ結合部位もしくはその一部およびコザック配列または前記ＴＲＡＰ結合部位、多重クローニング部位およびコザック配列が、前記プロモーター－５’ＵＴＲ領域の５’ＵＴＲ内に位置する、請求項７１に記載の核酸配列。

【請求項73】

前記プロモーター－５’ＵＴＲ領域がイントロンをさらに含み、好ましくは前記イントロンが前記ＴＲＡＰ結合部位またはその一部の上流にある、請求項７１または請求項７２に記載の核酸配列。

【請求項74】

前記プロモーター－５’ＵＴＲ領域が、前記５’ＵＴＲ内に異種イントロンを含む操作されたプロモーターである、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項75】

ウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードする核酸配列であって、前記ウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムが、請求項１～３７または６７～７４のいずれか一項に記載の核酸配列を含む、核酸配列。

【請求項76】

前記核酸配列がウイルスベクターのＲＮＡゲノム内に含まれる、請求項１～３７または６７～７４のいずれかに記載の核酸配列。

【請求項77】

前記核酸配列がウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている、請求項１～３７または６７～７４のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項78】

前記ウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位が不活性化されている、請求項７５～７７のいずれか一項に記載の核酸配列または請求項４３～４５のいずれか一項に記載のウイルスベクター産生系。

【請求項79】

前記ウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノム中の、前記主要スプライスドナー部位と前記主要スプライスドナー部位に対して３’の潜在的スプライスドナー部位とが不活性化されており、好ましくは前記潜在的スプライスドナー部位が前記主要スプライスドナー部位に対して３’の第１の潜在的スプライスドナー部位である、請求項７８に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項80】

前記潜在的スプライスドナー部位が前記主要スプライスドナー部位の６ヌクレオチド以内にある、請求項７５に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項81】

前記主要スプライスドナー部位および潜在的スプライスドナー部位が変異または欠失されている、請求項７８～８０のいずれか一項に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項82】

前記スプライス部位の不活性化前の前記ウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号９４、９６、９７、１０２、１０３および／または１０６のいずれかに示される配列を含む、請求項７８～８１のいずれか一項に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項83】

前記ウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号９４、９６、９７、１０２、１０３および／または１０６のいずれかに示される配列に対して変異または欠失を有する配列を含む、請求項７８～８２のいずれか一項に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項84】

前記ウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムをコードする前記ヌクレオチド配列が、不活性化されなければ配列番号９４のヌクレオチド１３および１４に対応するヌクレオチドの間に切断部位を有する不活性化された主要スプライスドナー部位を含む、請求項７８～８３のいずれか一項に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項85】

不活性化前の前記主要スプライスドナー部位の前記ヌクレオチド配列が、配列番号９７に示される配列を含む、請求項７８～８４のいずれか一項に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項86】

不活性化前の前記潜在的スプライスドナー部位の前記ヌクレオチド配列が、配列番号１０３に示される配列を含む、請求項７９～８５のいずれか一項に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項87】

前記ウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムをコードする前記ヌクレオチド配列が、不活性化されなければ配列番号９４のヌクレオチド１７および１８に対応するヌクレオチドの間に切断部位を有する不活性化された潜在的スプライスドナー部位を含む、請求項７９～８６のいずれか一項に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項88】

前記ウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号９５、９８、９９、１００、１０１、１０４、１０５および／または１０７のいずれかに示される配列を含む、請求項７８～８７のいずれか一項に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項89】

前記ウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１０２に示される配列を含まない、請求項７８～８８のいずれか一項に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項90】

前記ウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムの前記主要スプライスドナー部位および潜在的スプライスドナー部位からのスプライシング活性が抑制または除去される、請求項７８～８９のいずれか一項に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項91】

前記ウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムの前記主要スプライスドナー部位および潜在的スプライスドナー部位からのスプライシング活性が、形質移入された細胞においてまたは形質導入された細胞において抑制または除去される、請求項７８～９０のいずれか一項に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【請求項92】

前記ウイルスベクターがレンチウイルスに由来する、請求項６７～９１のいずれか一項に記載の核酸配列またはウイルスベクター産生系。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ウイルスベクターの産生に関する。より具体的には、本発明は、ウイルスベクター産生細胞における、ウイルスベクターによってコードされる関心対象のヌクレオチドの翻訳の改変に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子治療は、疾患を処置するための遺伝物質の使用を広く含む。遺伝子治療には、欠陥遺伝子（例えば、変異を有する遺伝子）を有する細胞における欠陥遺伝子の機能的コピーの補充、不適切に機能する遺伝子の不活性化および新しい治療用遺伝子の導入が含まれる。

【0003】

治療用遺伝物質は、核酸の導入を可能にするためにベクターを使用して宿主の標的細胞中に組み込まれ得る。このようなベクターは、一般に、ウイルスおよび非ウイルスカテゴリーに分けることができる。

【0004】

ウイルスは、ウイルスの複製サイクルの一環としてウイルスの遺伝物質を宿主の標的細胞中に自然に導入する。操作されたウイルスベクターは、関心対象のヌクレオチド（ＮＯＩ）または導入遺伝子の標的細胞への送達を可能にするために、この能力を利用する。今日まで、多くのウイルスが遺伝子治療のためのベクターとして操作されてきた。これらには、レトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびワクシニアウイルスが含まれる。

【0005】

ＮＯＩを運搬するための改変に加えて、ウイルスベクターは、典型的には、複製欠損であるようにさらに操作される。したがって、組換えベクターは標的細胞に直接感染することができるが、さらなる世代の感染性ビリオンを産生することはできない。他の種類のウイルスベクターは、癌細胞内でのみ条件的に複製能を有し得、毒性導入遺伝子またはプロ酵素をさらにコードし得る。

【0006】

レトロウイルスベクターは、様々な遺伝性障害に対する治療法として開発されており、現在、臨床試験において有望性が高まっている（例えば、Ｇａｌｙ，Ａ．ａｎｄ Ａ．Ｊ．Ｔｈｒａｓｈｅｒ（２０１０）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１（６）：５４５－５５０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｂ．Ｌ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｋａｌｏｓ，Ａ．Ｂａｇｇ ａｎｄ Ｃ．Ｈ．Ｊｕｎｅ（２０１１）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５（８）：７２５－７３３；Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ，Ｐ．Ａ．（２０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９（２）：１２１－１２６；Ｃａｒｔｉｅｒ，Ｎ．，Ｓ．Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａ，Ｃ．Ｃ．Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａｅ，Ｐ．Ｂｏｕｇｎｅｒｅｓ，Ｍ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．Ｖ．Ｋａｌｌｅ，Ａ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｃａｖａｚｚａｎａ－Ｃａｌｖｏ ａｎｄ Ｐ．Ａｕｂｏｕｒｇ（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ５０７：１８７－１９８；Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，Ｉ．Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｆ．Ｂｏｕｌａｄ，Ｓ．Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｐ．Ｇｉａｒｄｉｎａ，Ａ．Ｍａｇｇｉｏ，Ｒ．Ｇａｌａｎｅｌｌｏ，Ｆ．Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ ａｎｄ Ｅ．Ｙａｎｎａｋｉ（２０１０）Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １２０２：５２－５８；ＤｉＧｉｕｓｔｏ，Ｄ．Ｌ．，Ａ．Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｌ．Ｌｉ，Ｈ．Ｌｉ，Ｓ．Ｌｉ，Ａ．Ｒａｏ，Ｓ．Ｍｉ，Ｐ．Ｙａｍ，Ｓ．Ｓｔｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋａｌｏｓ，Ｊ．Ａｌｖａｒｎａｓ，Ｓ．Ｆ．Ｌａｃｅｙ，Ｊ．Ｋ．Ｙｅｅ，Ｍ．Ｌｉ，Ｌ．Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ｄ．Ｈｓｕ，Ｓ．Ｊ．Ｆｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｓｉ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｚａｉａ（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２（３６）：３６ｒａ４３およびＳｅｇｕｒａ ＭＭ，Ｍ．Ｍ．，Ｇａｉｌｌｅｔ Ｂ，Ｇａｒｎｉｅｒ Ａ．（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）。

【0007】

このようなベクターの重要な例としては、ガンマ－レトロウイルスベクター系（ＭＭＬＶに基づく）、霊長類レンチウイルスベクター系（ＨＩＶ－１に基づく）および非霊長類レンチウイルスベクター系（ＥＩＡＶに基づく）が挙げられる。

【0008】

逆遺伝学によって、大きな異種配列（約１０ｋｂ）をコードするベクターが適切なＤＮＡ配列での哺乳動物細胞の形質移入によって産生され得るように、これらのウイルスをベースとするベクターを大幅に操作することが可能になった（Ｂａｎｎｅｒｔ，Ｋ．（２０１０）Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：３４７－３７０に概説されている。）。

【0009】

研究段階におけるレトロウイルスベクターの操作および使用は、典型的には、例えばＧＦＰまたはｌａｃＺをコードするレポーター遺伝子ベクターの産生を含む。これらの臨床に無関係なベクターの力価は、通常、未精製採集材料１ｍＬ当たり１×１０^６～１×１０^７形質導入単位（ＴＵ／ｍＬ）の領域にある。この材料のさらなる濃縮および精製は、１×１０^１０ＴＵ／ｍＬを超えるワーキングストックを達成することができる。しかしながら、治療に関連するＮＯＩをコードするベクターの産生は、これらのレポーターベクターと比較して、実質的に低下した力価をもたらすことが多い。

【0010】

この影響に関与している可能性があるいくつかの要因が存在する。

【0011】

１．治療用ゲノムのサイズ。レトロウイルスによって極めて大きなゲノムをパッケージングすることができるが、逆転写および／または組み込み工程はサイズが増大するにつれて効率がより低くなると考えられている。

【0012】

２．ベクターゲノムＲＮＡの安定性。これは、ＮＯＩ中の予測されない不安定要素の存在によって低減され得る。

【0013】

３．ベクターゲノムＲＮＡ内での最適を下回るヌクレオチド使用。野生型ウイルスゲノムは、しばしば、ある種のヌクレオチドの偏りを有する（例えば、ＨＩＶ－１はＡＴに富む）。ベクターゲノムはＡＴの豊富さがより低い傾向があり、これはパッケージングおよび／または成熟後工程に影響を及ぼし得る。

【0014】

４．ウイルスベクター産生細胞におけるＮＯＩの発現。（過剰）発現されたタンパク質は、ベクタービリオンの集合および／または感染性に対して間接的または直接的な効果を有し得る。

【0015】

ウイルスベクター産生細胞内での、ＮＯＩによってコードされるタンパク質の発現は、治療用ベクターの力価に悪影響を及ぼし得ることが経験的に示されている（国際公開第２０１５／０９２４４０号に記載）。

【0016】

ＮＯＩによってコードされるタンパク質（関心対象のタンパク質、ＰＯＩ）のベクタービリオン中への組み込みも、ベクター粒子の下流プロセシングに影響を及ぼし得、例えば、膜貫通ＰＯＩをコードするＮＯＩは、ウイルスベクタービリオン中の膜貫通タンパク質の高い表面発現をもたらし、ビリオンの物理的特性を潜在的に変化させ得る。さらに、この組み込みは、送達部位で患者の免疫系にＰＯＩを提示し得、これはインビボでの治療遺伝子の形質導入および／または長期発現に悪影響を及ぼし得る。ＮＯＩは、産生、精製、回収および免疫原性に影響を及ぼし得る望ましくない二次タンパク質または代謝産物の産生も誘導し得るので、これを最小限に抑えることが望ましい。

【0017】

標的細胞中でのＮＯＩの効果的な発現を維持しながら、ウイルスベクター産生細胞中でのＮＯＩの発現を抑制する能力も望ましい。どのような機構が用いられるとしても、ウイルスベクター粒子の集合の「自然の」経路とその結果生じる機能性は妨げられてはならない。ビリオン中にパッケージングされるウイルスベクターゲノム分子は必然的にＮＯＩ発現カセットをコードしなければならないので、これは簡単ではない。換言すれば、ベクターゲノム分子およびＮＯＩ発現カセットは機能的に連結されているので、ＮＯＩ発現カセットの改変は、細胞内でベクターゲノム分子を産生する能力に対して悪影響を及ぼし得る。例えば、ＮＯＩ発現カセットを抑制するために物理的転写ブロック（例えば、ＴｅｔＲリプレッサー系）を使用すると、立体障害によってベクターゲノム分子の産生も阻害される可能性が高い。さらに、制御機構の改変はまた、ビリオンの成熟および放出後のベクターゲノム分子の機能性に（すなわち、標的細胞の形質導入の誘導に関して）悪影響を与えてはならない。例えば、レトロウイルスベクターゲノムＲＮＡ分子は、逆転写および組み込みの過程が可能でなければならず、ＮＯＩ発現カセットに対するいかなる改変も、形質導入過程におけるこれらの工程を妨げてはならない。

【0018】

ウイルスベクター産生細胞内でのＮＯＩ発現の抑制は、さらなる利点を提示し得る。ＮＯＩ発現がベクター産生細胞の生存率の低下をもたらす場合、その抑制は、大きな細胞数を必要とする大規模での製造に利益をもたらし得る。細胞死による細胞残屑の低減は、未精製ベクター採集材料内の不純物も低減させる。ベクタープラットフォーム（すなわち、同じベクター系内にコードされた異なる治療遺伝子）の処理、精製および濃縮を標準化することができる可能性がある、すなわち、ウイルスベクター産生細胞内で発現される唯一の異種遺伝子がベクター産生のために必要とされる遺伝子であれば、治療用ベクターのプラットフォーム全体に対して下流処理をより容易に最適化することができ、ベクター調製物の極めて類似した物理的仕様がもたらされるであろう。インビボでの得られたベクターに対する免疫応答の変動性および得られたベクターの毒性を最小化し得、これは標的細胞中でのより持続的な治療的ＮＯＩ発現をもたらし得る。

【0019】

産生細胞中でのＮＯＩの発現を制限する組織特異的プロモーターは、この問題に対する可能な解決策であるが、これらのプロモーターの漏出性（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）は、有害なレベルの導入遺伝子タンパク質をもたらし得る。しかしながら、構成的プロモーターを使用して、標的細胞中でのＮＯＩのより大きく、より強固な発現を達成することができる。実際、このような強固な発現は、インビボでの有効性のために必要とされ得る。さらに、組織特異的プロモーターは、前臨床および臨床開発中に動物モデルを通じて、およびヒトへと治療用ベクター産物を観察した場合、予測可能性がより低いことがあり得る。

【0020】

国際公開第２０１５／０９２４４０号（参照により本明細書に組み入れられる）は、ウイルスベクター産生中にＮＯＩの翻訳を抑制（導入遺伝子発現を抑制）し、これにより、ＮＯＩによってコードされるタンパク質の発現を抑制または防止するための、真核細胞培養物における異種翻訳制御系の使用を開示している。この系は、ベクター産生細胞系における導入遺伝子抑制（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ）またはＴＲＩＰ系と呼ばれる。１つの形態において、ＴＲＩＰ系は、導入遺伝子抑制を媒介するために、細菌ｔｒｐオペロン調節タンパク質、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）およびＴＲＡＰ結合部位／配列（ｔｂｓ）を利用する。驚くべきことに、この系の使用は、パッケージング可能なベクターゲノム分子の産生もベクタービリオンの活性も妨げず、標的細胞中でのＮＯＩの長期発現を妨害しない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0021】

【特許文献1】国際公開第２０１５／０９２４４０号

【非特許文献】

【0022】

【非特許文献1】Ｇａｌｙ，Ａ．ａｎｄ Ａ．Ｊ．Ｔｈｒａｓｈｅｒ（２０１０）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１（６）：５４５－５５０

【非特許文献2】Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｂ．Ｌ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｋａｌｏｓ，Ａ．Ｂａｇｇ ａｎｄ Ｃ．Ｈ．Ｊｕｎｅ（２０１１）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５（８）：７２５－７３３

【非特許文献3】Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ，Ｐ．Ａ．（２０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９（２）：１２１－１２６

【非特許文献4】Ｃａｒｔｉｅｒ，Ｎ．，Ｓ．Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａ，Ｃ．Ｃ．Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａｅ，Ｐ．Ｂｏｕｇｈｅｒｅｓ，Ｍ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．Ｖ．Ｋａｌｌｅ，Ａ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｃａｖａｚｚａｎａ－Ｃａｌｖｏ ａｎｄ Ｐ．Ａｕｂｏｕｒｇ（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ５０７：１８７－１９８

【非特許文献5】Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，Ｉ．Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｆ．Ｂｏｕｌａｄ，Ｓ．Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｐ．Ｇｉａｒｄｉｎａ，Ａ．Ｍａｇｇｉｏ，Ｒ．Ｇａｌａｎｅｌｌｏ，Ｆ．Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ ａｎｄ Ｅ．Ｙａｎｎａｋｉ（２０１０）Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １２０２：５２－５８

【非特許文献6】ＤｉＧｉｕｓｔｏ，Ｄ．Ｌ．，Ａ．Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｌ．Ｌｉ，Ｈ．Ｌｉ，Ｓ．Ｌｉ，Ａ．Ｒａｏ，Ｓ．Ｍｉ，Ｐ．Ｙａｍ，Ｓ．Ｓｔｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋａｌｏｓ，Ｊ．Ａｌｖａｒｎａｓ，Ｓ．Ｆ．Ｌａｃｅｙ，Ｊ．Ｋ．Ｙｅｅ，Ｍ．Ｌｉ，Ｌ．Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ｄ．Ｈｓｕ，Ｓ．Ｊ．Ｆｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｓｉ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｚａｉａ（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２（３６）：３６ｒａ４３

【非特許文献7】Ｓｅｇｕｒａ ＭＭ，Ｍ．Ｍ．，Ｇａｉｌｌｅｔ Ｂ，Ｇａｒｎｉｅｒ Ａ．（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ

【非特許文献8】Ｂａｎｎｅｒｔ，Ｋ．（２０１０）Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：３４７－３７０

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0023】

本発明は、ＴＲＩＰ系を改善するために使用され得る、ＴＲＡＰによる翻訳抑制のレベルの改善を可能にする、導入遺伝子ｍＲＮＡに対して施される修飾に関する。本発明の改善された核酸配列は、例えば、以下の特徴を有し得る。

【0024】

１．ＥＦ１α遺伝子の第１の（非コード）エクソンに由来するヌクレオチドから構成される改善された５’ＵＴＲリーダー配列（ｔｂｓの上流）は、驚くべきことに、様々な構成的プロモーターからの５’ＵＴＲリーダー配列と比較して、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体によって媒介される導入遺伝子発現の一貫してより低い「抑制された」レベルを可能にすることができることが示される。

【0025】

２．配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）とｔｂｓの間に挿入された改善されたＵＴＲまたは「スペーサー」配列は、驚くべきことに、倍数抑制および非抑制レベル（すなわち、ＴＲＡＰなし）の両方を改善することが示される。

【0026】

３．ｔｂｓの３’末端と重複する変異型コザック配列は、驚くべきことに、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体による導入遺伝子開始コドンの改善された閉塞をもたらすことが示される。

【0027】

４．ｔｂｓと導入遺伝子コザック配列（導入遺伝子開始コドン（ＡＴＧ））との間の圧縮された、重複する多重クローニング部位を含む配列は、驚くべきことに、ＴＲＡＰによって抑制された場合の低レベルの導入遺伝子発現を保持しながらクローニングを容易にすることができることが示される。

【0028】

５．ｔｂｓの３’末端の導入遺伝子開始コドンＡＴＧとの重複は、驚くべきことに、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体による導入遺伝子開始コドンの改善された閉塞をもたらすことが示される。

【0029】

一局面において、本発明は、関心対象のヌクレオチドと、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位と、コザック配列とを含む核酸配列であって、前記ＴＲＡＰ結合部位はコザック配列と重複する、核酸配列を提供する。

【0030】

別の局面において、本発明は、関心対象のヌクレオチドとコザック配列とを含む核酸配列であって、前記コザック配列は、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位の一部を含む核酸配列を提供する。

【0031】

一局面において、本発明は、関心対象のヌクレオチド（導入遺伝子）とＴＲＡＰ結合部位とを含む核酸配列であって、ＴＲＡＰ結合部位は導入遺伝子開始コドンＡＴＧの一部を含む、またはその逆である核酸配列を提供する。

【0032】

いくつかの態様において、関心対象のヌクレオチドは、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部に機能的に連結されている。

【0033】

いくつかの態様において、関心対象のヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質と相互作用することができる。

【0034】

いくつかの態様において、関心対象のヌクレオチドは、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質を欠如する標的細胞中で翻訳される。

【0035】

いくつかの態様において、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、配列ＫＡＧＮ２－３の複数の反復を含む。

【0036】

いくつかの態様において、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、配列ＫＡＧＮ２の複数の反復を含む。

【0037】

いくつかの態様において、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、配列ＫＡＧＮ２の少なくとも６つの反復を含む。

【0038】

いくつかの態様において、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、配列ＫＡＧＮ２－３の少なくとも８つの反復を含む。ＫＡＧＮＮＮ反復の数は、１またはそれ未満であり得る。

【0039】

いくつかの態様において、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、配列ＫＡＧＮ２の少なくとも８～１１の反復を含む。

【0040】

いくつかの態様において、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は配列ＫＡＧＮ２－３の１１の反復を含み、ＫＡＧＮＮＮ反復の数は３またはそれ未満である。

【0041】

いくつかの態様において、コザック配列は、ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端と重複する。コザック配列は、ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復と重複し得る。

【0042】

いくつかの態様において、前記コザック配列は、配列ＲＮＮＡＴＧを含む。

【0043】

いくつかの態様において、前記コザック配列は、配列ＲＶＶＡＴＧを含む。

【0044】

いくつかの態様において、前記重複するコザック配列およびＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、以下の配列：
（ａ）ＧＡＧＡＴＧ；
（ｂ）ＫＡＧＶＡＴＧ；
（ｃ）ＫＡＧＶＶＡＴＧ；
（ｄ）ＫＡＧＲＶＶＡＴＧ；または
（ｅ）ＫＡＧＮＲＶＶＡＴＧ
の１つを含む。

【0045】

いくつかの態様において、前記核酸配列は、以下の配列：
（ａ）ＫＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ；
（ｂ）ＫＡＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧ；
（ｃ）ＫＡＧＮＧＧＡＧＣＣＡＴＧ；または
（ｄ）ＫＡＧＮＮＧＡＧＡＣＣＡＴＧ
の１つを含む。

【0046】

いくつかの態様において、前記核酸配列は、以下の配列：
（ａ）ＫＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ；または
（ｂ）ＫＡＧＮＧＧＡＧＣＣＡＴＧ
の１つを含む。

【0047】

いくつかの態様において、前記核酸配列は、配列番号６９～９２または１０８～１１２に示される配列を含む。

【0048】

いくつかの態様において、転写開始部位／プロモーターの末端からＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の開始までの距離は３４ヌクレオチド未満である。

【0049】

いくつかの態様において、転写開始部位／プロモーターの末端からＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の開始までの距離は１３ヌクレオチド未満である。

【0050】

いくつかの態様において、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、ＩＩ型制限酵素部位、好ましくはＳａｐＩ制限酵素部位を欠如する。

【0051】

いくつかの態様において、前記核酸配列は、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部の上流に５’リーダー配列を含む。リーダー配列は、非コードＥＦ１αエクソン１領域に由来する配列を含み得る。リーダー配列は、配列番号２５または配列番号２６で定義される配列を含み得る。

【0052】

いくつかの態様において、前記核酸配列は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。前記核酸配列は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）とＴＲＡＰ結合部位またはその一部との間にスペーサー配列を含み得る。スペーサーは、０～３０ヌクレオチド長であり得る。スペーサーは、１５ヌクレオチド長であり得る。

【0053】

いくつかの態様において、スペーサーは、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部の３’末端および関心対象のヌクレオチドの下流開始コドンから３または９ヌクレオチドである。

【0054】

いくつかの態様において、スペーサーは配列番号３８～４４の任意の１つで定義される配列を含み、好ましくはスペーサーは配列番号３８で定義される配列を含む。

【0055】

いくつかの態様において、関心対象のヌクレオチドは、治療効果を生じさせる。

【0056】

いくつかの態様において、核酸配列は、ＲＲＥ配列またはその機能的代替物をさらに含む。

【0057】

いくつかの態様において、前記核酸配列はベクター導入遺伝子発現カセットである。

【0058】

いくつかの態様において、ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復は、少なくともＡＴＧ開始コドンの最初のヌクレオチドと重複する。

【0059】

いくつかの態様において、ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復は、ＡＴＧ開始コドンの最初の２つのヌクレオチドと重複する。

【0060】

いくつかの態様において、ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復は、本明細書において定義されるコアコザック配列内のＡＴＧ開始コドンの最初のヌクレオチドと重複する。

【0061】

いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号１１４または配列番号１１６で定義される配列を含む。

【0062】

さらなる局面において、本発明は、本発明の核酸配列を含むウイルスベクターを提供する。

【0063】

いくつかの態様において、ウイルスベクターは、１より多くの関心対象のヌクレオチドを含み、少なくとも１つの関心対象のヌクレオチドは、本明細書において定義されるＴＲＡＰ結合部位またはその一部に機能的に連結されている。

【0064】

いくつかの態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスに由来する。ウイルスベクターは、レンチウイルスに由来し得る。ウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来し得る。

【0065】

さらなる局面において、本発明は、ウイルスベクターの産生のために必要とされる成分をコードする核酸配列の組を含むウイルスベクター産生系であって、ベクターゲノムは本発明の核酸配列を含む、ウイルスベクター産生系を提供する。ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来し得る。

【0066】

いくつかの態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり、ウイルスベクター産生系は、ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質、およびＥｎｖタンパク質、またはこれらの機能的代替物をコードする核酸配列をさらに含む。

【0067】

いくつかの態様において、ウイルスベクター産生系は、ｒｅｖまたはその機能的代替物をコードする核酸配列をさらに含む。

【0068】

いくつかの態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスに由来する。ウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来し得る。

【0069】

さらなる局面において、本発明は、本発明の核酸配列を含む本発明のウイルスベクター産生系において使用するためのＤＮＡ構築物を提供する。

【0070】

さらなる局面において、本発明は、トリプトファン－ＲＮＡ結合減衰タンパク質をコードする核酸配列を含む本発明のウイルスベクター産生系において使用するためのＤＮＡ構築物を提供する。

【0071】

さらなる局面において、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物と、ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をコードするＤＮＡ構築物と、Ｅｎｖタンパク質またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物とを含む、本発明のウイルスベクター産生系において使用するためのＤＮＡ構築物の組を提供する。

【0072】

いくつかの態様において、ＤＮＡ構築物の組は、ｒｅｖ配列またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物をさらに含む。

【0073】

さらなる局面において、本発明は、本発明の核酸配列と、本発明のウイルスベクター産生系または本発明のＤＮＡ構築物とを含むウイルスベクター産生細胞を提供する。

【0074】

いくつかの態様において、細胞は、トリプトファン－ＲＮＡ結合減衰タンパク質をコードするベクターで一過性に形質移入される。細胞は、トリプトファン－ＲＮＡ結合減衰タンパク質を安定に発現し得る。

【0075】

さらなる局面において、本発明は、本発明の核酸配列、本発明のウイルスベクター産生系または本発明のＤＮＡ構築物をウイルスベクター産生細胞中に導入することと、ウイルスベクターの産生に適した条件下で産生細胞を培養することとを含む、ウイルスベクターを産生するための方法を提供する。

【0076】

さらなる局面において、本発明は、本発明のウイルスベクター産生細胞を使用して、または本発明の方法によって、本発明のウイルスベクター産生系によって産生されたウイルスベクターを提供する。

【0077】

いくつかの態様において、ウイルスベクターは本発明の核酸配列を含む。

【0078】

いくつかの態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来する。ウイルスベクターは、レンチウイルスに由来し得る。ウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来し得る。

【0079】

さらなる局面において、本発明は、本発明のウイルスベクターによって形質導入された細胞を提供する。

【0080】

さらなる局面において、本発明は、医学において使用するための本発明のウイルスベクターまたは本発明の細胞を提供する。

【0081】

さらなる局面において、本発明は、関心対象のヌクレオチドを必要とする標的部位に関心対象のヌクレオチドを送達するための医薬の調製ための、本発明のウイルスベクターまたは本発明の細胞の使用を提供する。

【0082】

さらなる局面において、本発明は、本発明のウイルスベクターまたは本発明の細胞を、これを必要とする対象に投与することを含む処置の方法を提供する。

【0083】

さらなる局面において、本発明は、本発明のウイルスベクターまたは本発明の細胞を薬学的に許容され得る、担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含む薬学的組成物を提供する。

【0084】

さらなる局面において、本発明は、核酸結合部位に機能的に連結されたときに関心対象のヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように相互作用することができる核酸結合部位および／または核酸結合タンパク質を同定する方法であって、レポーター遺伝子に機能的に連結された核酸結合部位および核酸結合タンパク質の両方を含む細胞におけるレポーター遺伝子の発現を分析することを含む、方法を提供する。

【0085】

いくつかの態様において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質をコードする。

【0086】

さらなる局面において、本発明は、ウイルスベクター産生細胞において関心対象のヌクレオチド（ＮＯＩ）の翻訳を抑制する方法であって、本発明の核酸配列、およびトリプトファン－ＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）をコードする核酸配列をウイルスベクター産生細胞中に導入することを含み、ＴＲＡＰはＴＲＡＰ結合部位またはその一部に結合し、それによりＮＯＩの翻訳を抑制する、方法を提供する。

【0087】

さらなる局面において、本発明は、真核生物のベクター産生細胞におけるウイルスベクター力価を増加させる方法であって、真核生物のベクター産生細胞中に本発明のウイルスベクター産生系およびトリプトファン－ＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）をコードする核酸配列を導入することを含み、ＴＲＡＰはＴＲＡＰ結合部位またはその一部に結合し、ＮＯＩの翻訳を抑制し、それにより、ＴＲＡＰ結合部位を有しないウイルスベクターと比較してウイルスベクター力価を増加させる、方法を提供する。

【0088】

さらなる局面において、本発明は、関心対象のヌクレオチドと、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）に対する結合部位と、多重クローニング部位と、コザック配列とを含む核酸配列であって、前記多重クローニング部位は、ＴＲＡＰ結合部位の下流およびコザック配列の上流に位置する、核酸配列を提供する。

【0089】

いくつかの態様において、本発明の核酸配列は、プロモーターをさらに含む。ＴＲＡＰ結合部位もしくはその一部およびコザック配列またはＴＲＡＰ結合部位、多重クローニング部位およびコザック配列は、プロモーターの５’ＵＴＲ内に位置し得る。

【0090】

いくつかの態様において、プロモーターはイントロンをさらに含み、好ましくはイントロンはＴＲＡＰ結合部位またはその一部の上流にある。プロモーターは、５’ＵＴＲ内に異種イントロンを含む操作されたプロモーターであり得る。

【0091】

いくつかの態様において、本発明の核酸配列は、配列番号１１７、１１８または１２０～１２４のいずれかに示される配列を含む。

【0092】

さらなる局面において、本発明は、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードする核酸配列であって、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムは、本明細書に記載の核酸配列を含む、核酸配列を提供する。

【0093】

いくつかの態様において、本明細書に記載される本発明の核酸配列は、ウイルスベクターのＲＮＡゲノム内に含まれる。

【0094】

いくつかの態様において、本明細書に記載の本発明の核酸配列は、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている。

【0095】

本明細書に記載の本発明の核酸配列または本明細書に記載の本発明のウイルスベクター産生系のいくつかの態様において、ウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位が不活性化されている。

【0096】

いくつかの態様において、ウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の、主要スプライスドナー部位と主要スプライスドナー部位に対して３’の潜在的スプライスドナー部位とが不活性化されている。

【0097】

いくつかの態様において、潜在的スプライスドナー部位は、主要スプライスドナー部位に対して３’の第１の潜在的スプライスドナー部位である。

【0098】

いくつかの態様において、前記潜在的スプライスドナー部位または配列は、主要スプライスドナー部位または配列の６ヌクレオチド以内にある。

【0099】

いくつかの態様において、主要スプライスドナー部位および潜在的スプライスドナー部位は、変異または欠失されている。

【0100】

いくつかの態様において、スプライス部位の不活性化前のウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９４、９６、９７、１０２、１０３および／または１０６のいずれかに示される配列を含む。

【0101】

いくつかの態様において、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９４、９６、９７、１０２、１０３および／または１０６のいずれかに示される配列に対して変異または欠失を有する配列を含む。

【0102】

いくつかの態様において、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列は、不活性化されなければ配列番号９４のヌクレオチド１３および１４に対応するヌクレオチドの間に切断部位を有する不活性化された主要スプライスドナー部位を含む。

【0103】

いくつかの態様において、不活化前の主要スプライスドナー部位のヌクレオチド配列は、配列番号９７に示される配列を含む。

【0104】

いくつかの態様において、不活化前の潜在的スプライスドナー部位のヌクレオチド配列は、配列番号１０３に示される配列を含む。

【0105】

いくつかの態様において、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列は、不活性化されなければ配列番号９４のヌクレオチド１７および１８に対応するヌクレオチドの間に切断部位を有する不活性化された潜在的スプライスドナー部位を含む。

【0106】

いくつかの態様において、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９５、９８、９９、１００、１０１、１０４、１０５および／または１０７のいずれかに示される配列を含む。

【0107】

いくつかの態様において、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０２に示される配列を含まない。

【0108】

いくつかの態様において、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムの主要スプライスドナー部位および潜在的スプライスドナー部位からのスプライシング活性は抑制または除去される。

【0109】

いくつかの態様において、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムの主要スプライスドナー部位および潜在的スプライスドナー部位からのスプライシング活性は、形質移入された細胞においてまたは形質導入された細胞において抑制または除去される。

【0110】

いくつかの態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスに由来する。

【図面の簡単な説明】

【0111】

【図1】ｔｂｓの上流の５’ＵＴＲ配列に対する改善の概要。導入遺伝子５’ＵＴＲ内のｔｂｓ配列（［ＫＡＧＮＮ］ｘ１１）の上流に配置されたＥＦ１α遺伝子エクソン１由来の５’リーダー配列の位置を示すための概略図。驚くべきことに、他のプロモーターからのリーダー配列と比較した場合、このようなリーダー配列の使用は、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ（ドーナツ形状によって表されているＴＲＡＰ）による導入遺伝子の抑制の改善されたレベルをもたらすことが見出される。理論に拘束されることを望むものではないが、このようなリーダー配列は、リボソームスキャニングの阻害が最大化されるように、より安定なＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体を可能にすると推定される。

【図2】ｔｂｓの下流の５’ＵＴＲ配列に対する改善の概要。 Ａ．多重クローニング部位（ＭＣＳ）がｔｂｓと導入遺伝子の開始コドンの間に挿入されているＴＲＡＰ－ｔｂｓ抑制性導入遺伝子カセットの５’ＵＴＲコード領域のＤＮＡ発現カセットを示すための概略図（ＴＲＡＰはドーナツ形状によって表されている）。本発明は、ｔｂｓの末端ＫＡＧＮＮ反復において／ｔｂｓの末端ＫＡＧＮＮ反復上で始まり、導入遺伝子開始コドンの上流に最大５つのクローニング部位を含有する、好ましい重複する制限酵素部位を記載する。 Ｂ．ｔｂｓの３’ＫＡＧＮＮ反復と大部分または部分的に重複するように、導入遺伝子のコザック配列をどのように配置することができるかを示すための概略図；そのようにすることにより、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体内の主要な開始コドンを効果的に「隠す」ことができ、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体内の主要な開始コドンを翻訳機構によりアクセスしにくいようにして、導入遺伝子発現のさらに低い「抑制された」レベルがもたらされる。 Ｃ．好ましい重複するｔｂｓおよびコザックコンセンサス配列を要約する表。ｔｂｓの３’ＫＡＧＮＮ反復が四角の枠で示されており、コアコザック配列が太字で示されている。

【図3】天然のＵＴＲ配列を含有する様々な構成的プロモーターと比較した、Ｌ３３改善型リーダー配列を使用した場合のＴＲＡＰ－ｔｂｓによる増強された抑制。 Ａ．ＧＦＰ試験レポータープラスミドの構成を示す概略図。５’ＵＴＲは、異なるプロモーターが利用されたことを除いて同一のｔｂｓ配列およびその他の要素、ならびにｔｂｓの上流の異なるリーダー配列を含んだ（これらは表ＩのパネルＩに示されている）。ｍＲＮＡ中にはイントロン配列が存在しないので、イントロン含有ＥＦ１α（ＥＦ１ａ）およびＵＢＣプロモーターは、それぞれ、それらの「短い」無イントロン対応物であるＥＦＳおよびＵＢＣと直接比較可能と考えられることに留意されたい（表Ｉのとおり）。３４ｎｔリーダーは、対照としてＣＭＶプロモーター含有レポーター内に存在した（これは、ＴＲＡＰ－ｔｂｓによる１００倍超の抑制を可能にすることが以前に示された）。他の構成的プロモーターは、天然のリーダー配列の他にいくつかの合成配列を含むリーダーを含有し、またはＥＦ１αプロモーターのエクソン１に由来するＬ３３改善型リーダー配列を有するように本研究において操作された。 Ｂ．それぞれ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）またはｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかとのレポータープラスミドの同時形質移入によって、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについてレポーターを試験した。形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（懸濁液、無血清）を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×蛍光強度中央値）を得て、ｌｏｇ－１０変換した。チャート内のデータは、左から右へ一般的プロモーター強度（ＴＲＡＰレベルなし）によって表示されており、偽形質移入された細胞（ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔのみ）または非形質移入細胞（ＵＮＴ）と比較される。天然のリーダーがＬ３３改善型リーダーと比較される各事例において、Ｌ３３改善型リーダーは、ＴＲＡＰの存在下で実質的により低いレベルのＧＦＰ発現を可能にし、ＴＲＡＰ－ｔｂｓによる抑制の１０倍を超える改善を可能にする。多くの事例において、Ｌ３３改善型リーダーを使用した場合、発現されたＧＦＰの抑制されていないレベルもわずかに改善された。（標準偏差バー、ｎ＝３）。

【図4】ｔｂｓとＡＡＶベクターゲノム内の導入遺伝子カセットのコザック配列との間に挿入された多重クローニング部位（ＭＣＳ）の設計および評価、ならびにＴＲＡＰ－ｔｂｓによる導入遺伝子抑制に対する影響。 Ａ．５’ＵＴＲ－ｔｂｓ配列とともに試験されたＭＣＳ変異型を示す概略図；７つの変異型は、ＮｃｏＩ部位を含まない２～４個のクローニング部位を含有し、ある特定のコザック配列の存在および導入遺伝子の第２のコドンの第１のヌクレオチドに依存する（したがって、必ずしもすべての導入遺伝子カセット中に存在しないことがあり得る）。ＭＣＳ変異型レポーター構築物は、ＥＦＳプロモーターによって駆動され、Ｌ３３改善型リーダーを含有したのに対して、「ＭＣＳなし」対照レポーター構築物は、ＣＭＶプロモーターによって駆動され、元の３４ｎｔリーダーを有した（Ｌ３３改善型リーダーと同様に機能することが図４に示されている）。ｓｃＡＡＶ２ベクターゲノムプラスミド（ＩＴＲは示さず）中に導入遺伝子カセットをクローニングした。 Ｂ．それぞれ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）またはｐＥＦ１ａ－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかとのレポータープラスミドの同時形質移入によって、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについてレポーターＡＡＶゲノムプラスミドを試験した。形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（懸濁液、無血清）を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×蛍光強度中央値）を得て、ｌｏｇ－１０変換した。すべてのＭＣＳ変異型レポーターがＴＲＡＰ－ｔｂｓによって約１０００倍またはそれを超えて抑制され、導入遺伝子レベルを低下させることにおいて、７つの変異型のうちの６つが少なくとも１０倍優れていた。さらに、変異型ＭＣＳ２．１、ＭＣＳ４．１およびＭＣＳ４．４は、ＴＲＡＰ－ｔｂｓが（非形質移入［ＵＮＴ］と比較して）ＧＦＰレベルを検出の限界まで抑制することを可能にした。（標準偏差バー、ｎ＝３）。

【図5】Ｌ３３改善型リーダー、ｔｂｓおよび最適化された多重クローニング部位を有する５’ＵＴＲを有する異なる構成的プロモーターによって駆動される導入遺伝子カセットを使用した、ＴＲＡＰ－ｔｂｓによる一貫して強力な導入遺伝子抑制の実証。Ｌ３３－ｔｂｓ配列を含有するＭＣＳ２．１－ＧＦＰおよびＭＣＳ４．１－ＧＦＰｓｃＡＡＶ２レポーターゲノムプラスミド中に種々の構成的プロモーターをクローニングした。それぞれ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）またはｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかとのレポータープラスミドの同時形質移入によって、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについてレポーターを試験した。形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（懸濁液、無血清）を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×蛍光強度中央値）を得て、ｌｏｇ－１０変換した。データは、Ｌ３３改善型リーダーおよび最適化されたＭＣＳ部位を同一のカセット中に組み込むことができ、広範囲の構成的プロモーターに関してＴＲＡＰ－ｔｂｓによる高度の導入遺伝子抑制を可能にすることを実証している。実験全体にわたっての平均抑制レベルは約５０００倍であった。（標準偏差バー、ｎ＝３）。

【図6】ｔｂｓをＡＴＧ開始コドンにより近接して配置するための、導入遺伝子５’ＵＴＲ内でｔｂｓの３’末端と重複する最適なコザック配列の同定。 Ａ．（１または複数の）ＫＡＧＮＮ反復が維持されるようにコザックがｔｂｓの３’末端と重複するように配置されたコアコンセンサス「ＲＶＶＡＴＧ」およびより広いコンセンサス「ＧＮＮＲＶＶＡＴＧ」に合致する、操作された変異型中のコザック配列の位置および配列を示す概略図。これにより、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体内のＡＴＧ開始コドンを「隠す」ことによって改善された導入遺伝子抑制レベル（＋ＴＲＡＰ）を可能にするｔｂｓ－コザック接合変異型を同定するために、ｔｂｓをＡＴＧ開始コドンにより近接して配置することが可能になる。コンセンサスコザック配列の維持は、導入遺伝子の非抑制レベル（ＴＲＡＰなし）を高いレベルで保持することを可能にする（すなわち、ベクターを形質導入された細胞における発現のモデル化）。 Ｂ．それぞれ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）またはｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかとのレポータープラスミドのＨＥＫ２９３Ｔ細胞中への同時形質移入によって、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについてレポーターを試験した。形質移入された細胞を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×蛍光強度中央値）を得て、ｌｏｇ－１０変換した。すべてのｔｂｓ－コザック接合変異型レポーターは、元の構成と比較して同一の、抑制されていないＧＦＰレベルを維持した。変異型「０」、「２」および「３」は、元の構成と比較して、改善された抑制されたレベルを示した（標準偏差バー、ｎ＝３）。

【図7-1】ＴＲＡＰ－ｔｂｓによりＩＲＥＳ依存性導入遺伝子のより良好な抑制を付与するための、ＩＲＥＳとｔｂｓ配列の間の改善されたスペーサー配列の特定。 Ａ．スペーサー配列を試験する際の導入遺伝子カセットの構成を示す概略図。ｐＣＭＶ－ルシフェラーゼ－ＩＲＥＳ－（スペーサー）－ｔｂｓ－ＧＦＰレポーター構築物を設計し（表ＩＩＩを参照）、試験した。 Ｂ．元の［２６ｎｔ］スペーサーまたは変異型［２６ｎｔ］または２つのスペーサーの切断物を含有するレポーターを試験した。それぞれ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）またはｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかとのレポータープラスミドのＨＥＫ２９３Ｔ細胞中への同時形質移入によって、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについてレポーターを試験した。形質移入された細胞を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×蛍光強度中央値）を得て、ｌｏｇ－１０変換した。本研究は、元のスペーサーと比較して改善された「ＯＮ」レベルおよび低減された「ＯＦＦ」レベルを有する変異型として「元の［ｔｒｕｎｃ－１５ｎｔ］」スペーサーを明らかにした。 Ｃ．次いで、１１ｘＫＡＧＮＮ反復ｔｂｓまたは８ｘＫＡＧＮＮ反復ｔｂｓのいずれかを有するレポーターとともに、ｔｂｓの３’末端および下流の導入遺伝子ＡＴＧ開始コドンから９ｎｔまたは３ｎｔのいずれかの距離で「元の［ｔｒｕｎｃ－１５ｎｔ］」スペーサーを組み込んだ。ＧＦＰ発現は、前述のように測定した。データは、改善された「元の［ｔｒｕｎｃ－１５ｎｔ］」スペーサーが、異なるｔｂｓ構成および主導入遺伝子ＡＴＧ開始コドンへの近接性で使用され得ることを示している（標準偏差バー、ｎ＝３）。

【図7-2】ＴＲＡＰ－ｔｂｓによりＩＲＥＳ依存性導入遺伝子のより良好な抑制を付与するための、ＩＲＥＳとｔｂｓ配列の間の改善されたスペーサー配列の特定。 Ａ．スペーサー配列を試験する際の導入遺伝子カセットの構成を示す概略図。ｐＣＭＶ－ルシフェラーゼ－ＩＲＥＳ－（スペーサー）－ｔｂｓ－ＧＦＰレポーター構築物を設計し（表ＩＩＩを参照）、試験した。 Ｂ．元の［２６ｎｔ］スペーサーまたは変異型［２６ｎｔ］または２つのスペーサーの切断物を含有するレポーターを試験した。それぞれ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）またはｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかとのレポータープラスミドのＨＥＫ２９３Ｔ細胞中への同時形質移入によって、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについてレポーターを試験した。形質移入された細胞を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×蛍光強度中央値）を得て、ｌｏｇ－１０変換した。本研究は、元のスペーサーと比較して改善された「ＯＮ」レベルおよび低減された「ＯＦＦ」レベルを有する変異型として「元の［ｔｒｕｎｃ－１５ｎｔ］」スペーサーを明らかにした。 Ｃ．次いで、１１ｘＫＡＧＮＮ反復ｔｂｓまたは８ｘＫＡＧＮＮ反復ｔｂｓのいずれかを有するレポーターとともに、ｔｂｓの３’末端および下流の導入遺伝子ＡＴＧ開始コドンから９ｎｔまたは３ｎｔのいずれかの距離で「元の［ｔｒｕｎｃ－１５ｎｔ］」スペーサーを組み込んだ。ＧＦＰ発現は、前述のように測定した。データは、改善された「元の［ｔｒｕｎｃ－１５ｎｔ］」スペーサーが、異なるｔｂｓ構成および主導入遺伝子ＡＴＧ開始コドンへの近接性で使用され得ることを示している（標準偏差バー、ｎ＝３）。

【図8】ＥＦ１αエクソン１配列に由来する２つの改善型リーダーの比較。切断型リーダー「Ｌ１２」は、ヒトＥＦ１α遺伝子由来のエクソン１を含むＬ３３改善型リーダー配列に由来した（表Ｉ参照）。ｔｂｓとコザック配列の間にＭＣＳ２．１またはＭＣＳ４．１配列のいずれかを有する、ｓｃＡＡＶ２ベクターゲノムプラスミド内の６つの構成的プロモーター含有ＧＦＰレポーターカセット中に、Ｌ１２改善型リーダーをクローニングした。それぞれ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）またはｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかとのレポータープラスミドの同時形質移入によって、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについてレポーターを試験した。形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（懸濁液、無血清）を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×蛍光強度中央値）を得て、ｌｏｇ－１０変換した。データは、Ｌ１２およびＬ３３改善型リーダーが、ＴＲＡＰ－ｔｂｓによる完全な抑制を可能にし、ＧＦＰレベルをバックグラウンドレベルに抑制することを実証する。興味深いことに、ＧＦＰの「ＯＮ」（抑制されていない）レベルは、異なるプロモーターにおいてＬ１２またはＬ３３についてわずかに高く、これは、異なるプロモーターを有するＴＲＩＰ系の利用を検討する場合に、Ｌ１２またはＬ３３のいずれかを選択することができるという点で柔軟性を許容し、その結果、ベクター産生中にＴＲＡＰ－ｔｂｓによって達成される実質的なレベルの抑制を喪失せずに、ＴＲＡＰの非存在下での（すなわちベクターを形質導入された細胞での）遺伝子発現レベルを最大化することができる。（標準偏差バー、ｎ＝３）。

【図9】重複するｔｂｓ－コザック変異型を使用することによるＡＡＶベクターゲノムプラスミドにおける導入遺伝子抑制の改善。Ｌ３３またはＬ１２改善型リーダー配列のいずれかをさらに含有するＥＦＳまたはｈｕＰＧＫプロモーターＧＦＰレポーターカセットのいずれかに２つの「ｔｂｓ－コザック」変異型（０および３）をクローニングした。重複していないｔｂｓ／コザック変異型も、ＥＦＳ／ｈｕＰＧＫ－Ｌ３３カセット中にクローニングした；これらはｔｂｓ－コザック領域においてのみ異なっていた（原型＝［ｔｂｓ］－ＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ；ＨｐａＩ変異型＝［ｔｂｓ－ＧＡＧＴＴ］ＡＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ）。それぞれ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）またはｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかとのレポータープラスミドの同時形質移入によって、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについてレポーターを試験した。形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（懸濁液、無血清）を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×蛍光強度中央値）を得て、ｌｏｇ－１０変換した。データは、ｔｂｓをコザック配列と重複させることにより、重複していないｔｂｓ／コザック変異型と比較して、ＴＲＡＰによる導入遺伝子発現の改善された抑制が可能になることを実証している。（標準偏差バー、ｎ＝３）。

【図10-1】完全長ＥＦ１ａプロモーターの状況でのＴＲＡＰ媒介性導入遺伝子抑制の改善。 Ａ．３つの「ｔｂｓ－コザック」変異型（０，２，３）をＥＦ１ａプロモーターＧＦＰレポーターカセット中にクローニングした。スプライシング後、リーダー配列は、Ｌ３３配列（エクソン１）およびｔｂｓのすぐ上流のエクソン２からの短い１２ｎｔ配列を含む。 Ｂ．それぞれ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）またはｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかとのレポータープラスミドの同時形質移入によって、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについてレポーターを試験した。形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（懸濁液、無血清）を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×蛍光強度中央値）を得て、ｌｏｇ－１０変換した。 Ｃ．ＧＦＰ導入遺伝子カセットをＨＩＶ－１レンチウイルスベクターゲノム中にクローニングし、Ｂに記載されるように、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについて試験した。データは、ｔｂｓをコザック配列と重複させることにより、ＴＲＡＰによる導入遺伝子発現の改善された抑制が可能になることを実証する。（標準偏差バー、ｎ＝３）。

【図10-2】完全長ＥＦ１ａプロモーターの状況でのＴＲＡＰ媒介性導入遺伝子抑制の改善。 Ａ．３つの「ｔｂｓ－コザック」変異型（０，２，３）をＥＦ１ａプロモーターＧＦＰレポーターカセット中にクローニングした。スプライシング後、リーダー配列は、Ｌ３３配列（エクソン１）およびｔｂｓのすぐ上流のエクソン２からの短い１２ｎｔ配列を含む。 Ｂ．それぞれ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）またはｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかとのレポータープラスミドの同時形質移入によって、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについてレポーターを試験した。形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（懸濁液、無血清）を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×蛍光強度中央値）を得て、ｌｏｇ－１０変換した。 Ｃ．ＧＦＰ導入遺伝子カセットをＨＩＶ－１レンチウイルスベクターゲノム中にクローニングし、Ｂに記載されるように、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについて試験した。データは、ｔｂｓをコザック配列と重複させることにより、ＴＲＡＰによる導入遺伝子発現の改善された抑制が可能になることを実証する。（標準偏差バー、ｎ＝３）。

【図11】レンチウイルスベクター産生中に導入遺伝子を発現する異常にスプライシングされたｍＲＮＡは、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターにおいては消失し、ＴＲｉＰ系を利用する場合にＴＲＡＰによって標的とされることが必要な導入遺伝子ｍＲＮＡの量を低下させる。Ａ ＥＦ１ａ－ＧＦＰ導入遺伝子カセットをコードする「ＴＲｉＰ」レンチウイルスベクターゲノムの概略図であり、ＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）がカセットの５’ＵＴＲ内に配置されている（ベクター産生中のＴＲＡＰの供給は導入遺伝子発現レベルを低下させる）。ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターの産生中、完全長のスプライシングされていないパッケージング可能なｖＲＮＡおよび導入遺伝子ｍＲＮＡが、レンチウイルスベクターカセット（ｉ）から産生される細胞質ＲＮＡの主な形態である（導入遺伝子プロモーターが産生中に活性である場合）。しかしながら、標準的なレンチウイルスベクターゲノムにおけるＭＳＤの雑多な活性は、導入遺伝子をコードし得るさらなる「異常な」スプライス生成物をもたらし（ｉｉ）、これは、内部導入遺伝子プロモーター、すなわち組織特異的プロモーターとは独立して起こり得る。（キー：Ｐｒｏ、プロモーター）；５’Ｒからｇａｇまでの領域は、パッケージング要素｛Ψ｝を含有する；ｍｓｄ、主要スプライスドナー；ｃｐｐｔ、中央ポリプリン鎖；Ｉｎｔ、イントロン；ｓｄ／ｓａ、スプライスドナー／アクセプタ；ＧＯＩ、関心対象の遺伝子；灰色の矢印は、第３世代レンチウイルスベクター産生中に産生された非スプライシングｖＲＮＡの割合を評価するためのフォワード｛ｆ｝およびリバース｛ｒ｝プライマーの位置を示す。転写後調節エレメント｛ＰＲＥ｝は、明確にするために示されていない）。Ｂ ＥＦ１ａ－ＧＦＰカセットを含有する標準的なまたはＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でレンチウイルスベクターを産生し、ＧＦＰ発現スコアを生成した（％ＧＦＰ×ＭＦＩ）。標準的なレンチウイルスベクター産生中に培養物中で産生されたＧＦＰの総量と比較して、ＭＳＤ－２ＫＯ改変は、ＴＲＡＰの非存在下でさえ産生されたＧＦＰの量を低下させるという実質的な効果（約５倍）を有した。したがって、ＴＲＡＰの抑制効果は、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムの使用によって増強され、培養物中のはるかにより低いレベルのＧＦＰをもたらした。Ｃ 「野生型」ＨＩＶ－１のステムループ２（ＳＬ２）領域の配列（ＮＬ４－３；現レンチウイルスベクターゲノム内の「標準」配列）が上に示されている。配列は、主要スプライスドナー部位（ＭＳＤ：コンセンサス＝ＣＴＧＧＴ）および潜在的スプライスドナー部位（ＭＳＤ部位自体が変異されているときに使用される（ｃｒＳＤ：コンセンサス＝ＴＧＡＧＴ）を含む。スプライスドナー部位が使用される場合のスプライシングの位置のヌクレオチドは、太字および矢印によって特定されている。ＭＳＤおよびｃｒＳＤ部位スプライシング活性の両方を消失させる４つの機能的ＭＳＤ変異が記載されている：ＭＳＤ－２ＫＯ、ＭＳＤおよびｃｒＳＤ部位からの２つの「ＧＴ」モチーフを変異させる（およびほとんどの実施例で広く使用されている）；ＭＳＤ－２ＫＯｖ２、ＭＳＤおよびｃｒＳＤ部位の両方を消失させる変異も含む；ＭＳＤ－２ＫＯｍ５、一切のスプライスドナー部位を欠く完全に新しいステムループ構造を導入する；ならびにΔＳＬ２、ＳＬ２配列を完全に欠失する。ＭＳＤ－２ＫＯ、ＭＳＤ－２ＫＯｖ２およびＭＳＤ－２ＫＯｍ５変異においてＳＬ２配列に導入された置換は、小文字の斜字体で示されている。

【図12】ＨＩＶ－１ベースのレンチウイルスベクター内の主要スプライスドナー部位（ＭＳＤ）からの異常なスプライシングの影響。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中において＋／－ｒｅｖで標準的な第３世代レンチウイルスベクターの産生を行い、産生後の細胞から全ＲＮＡを抽出した。２つのプライマーセットを使用して、全ＲＮＡをｑＰＣＲ（ＳＹＢＲグリーン）に供した：ｆ＋ｒＴは、レンチウイルスベクター発現カセットから生成された総転写物を増幅し、ｆ＋ｒＵＳは非スプライシング転写物を増幅した；したがって、非スプライシングｖＲＮＡ転写物対総ｖＲＮＡ転写物の割合を計算し、プロットした。データは、標準的な第３世代レンチウイルスベクター産生中の総ｖＲＮＡに対する非スプライシングｖＲＮＡの割合が低く、内部導入遺伝子カセット（本事例では、異なるプロモーターおよびＧＦＰ遺伝子を含有する）に従って変動することを示し、さらに、この割合はｒｅｖの作用によって最小限に増加されるに過ぎない。

【図13-1】懸濁（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における重複するｔｂｓ－コザック変異型のＴＲＡＰ媒介性導入遺伝子抑制を試験する。表ＩＶ中の重複するｔｂｓ－コザック変異型をｐＥＦ１ａ－ＧＦＰレポータープラスミド中にクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ｐＴＲＡＰ中に形質移入し、形質移入の２日後にフローサイトメトリを行った。Ａ．＋／－ＴＲＡＰでＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性×ＭＦＩ）を求め、および倍数抑制値を求めて、プロットした。変異型がｘ軸に沿って示されており、３’ｔｂｓ ＫＡＧＮＮ反復とコアコザック配列の相対的重複に従ってグループ分けされている（「重複群」－ＫＡＧａｔｇ、ＫＡＧＮａｔｇ）、ＫＡＧＮＮａｔｇ）；ＫＡＧＮＮは黒い括弧によって表され、コアコザックヌクレオチドは灰色の線によって表されている。以下の重複群を比較する統計解析を実施した（重複群内の等分散はＦ検定によって確認された）：両側Ｔ検定を用いると、倍数抑制は、ＫＡＧＮａｔｇに対してＫＡＧａｔｇが（＊ｐ＝０．０２９３）、ＫＡＧＮＮａｔｇに対してＫＡＧＮａｔｇが（＊＊ｐ＝０．０００００４８２）、重複していないｔｂｓに対してＫＡＧＮＮａｔｇが（＊＊＊ｐ＝０．０００２５９）、統計学的により大きかった。Ｂ．抑制されていないＧＦＰ発現スコアを最高から最低へ（左から右へ）プロットし、「Ｇ」変異型はより優れた「ＯＮ」（抑制されていない）レベルを有するので「Ｇ」変異型が「Ｔ」変異型より好ましいことを示すために、２つのＫＡＧａｔｇ重複群変異型ｔｂｓｋｚｋＶ０．ＧおよびｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｔ（Ａにおいてすべての変異型のなかで最大の抑制を示す）を強調表示した。

【図13-2】懸濁（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における重複するｔｂｓ－コザック変異型のＴＲＡＰ媒介性導入遺伝子抑制を試験する。表ＩＶ中の重複するｔｂｓ－コザック変異型をｐＥＦ１ａ－ＧＦＰレポータープラスミド中にクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ｐＴＲＡＰ中に形質移入し、形質移入の２日後にフローサイトメトリを行った。Ａ．＋／－ＴＲＡＰでＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性×ＭＦＩ）を求め、および倍数抑制値を求めて、プロットした。変異型がｘ軸に沿って示されており、３’ｔｂｓ ＫＡＧＮＮ反復とコアコザック配列の相対的重複に従ってグループ分けされている（「重複群」－ＫＡＧａｔｇ、ＫＡＧＮａｔｇ）、ＫＡＧＮＮａｔｇ）；ＫＡＧＮＮは黒い括弧によって表され、コアコザックヌクレオチドは灰色の線によって表されている。以下の重複群を比較する統計解析を実施した（重複群内の等分散はＦ検定によって確認された）：両側Ｔ検定を用いると、倍数抑制は、ＫＡＧＮａｔｇに対してＫＡＧａｔｇが（＊ｐ＝０．０２９３）、ＫＡＧＮＮａｔｇに対してＫＡＧＮａｔｇが（＊＊ｐ＝０．０００００４８２）、重複していないｔｂｓに対してＫＡＧＮＮａｔｇが（＊＊＊ｐ＝０．０００２５９）、統計学的により大きかった。Ｂ．抑制されていないＧＦＰ発現スコアを最高から最低へ（左から右へ）プロットし、「Ｇ」変異型はより優れた「ＯＮ」（抑制されていない）レベルを有するので「Ｇ」変異型が「Ｔ」変異型より好ましいことを示すために、２つのＫＡＧａｔｇ重複群変異型ｔｂｓｋｚｋＶ０．ＧおよびｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｔ（Ａにおいてすべての変異型のなかで最大の抑制を示す）を強調表示した。

【図14-1】最適な重複するｔｂｓ－コザック変異型を用いたイントロン含有プロモーターの改善された抑制。Ａ．重複していないｔｂｓ－コザック変異型と比較して重複するｔｂｓ－コザック変異型の使用を例示するために使用される発現カセットの概略図。広く使用されているＥＦ１ａプロモーター配列は、広く使用されているＣＡＧプロモーターと同様に、それ自体のイントロンを含有する（図１０および実施例５参照）。ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー、コアプロモーターおよびニワトリβ－アクチン遺伝子由来のエクソン１／イントロン配列およびウサギβ－グロビン遺伝子由来のスプライスアクセプタ／エクソン配列を含有する極めて強力な人工プロモーターである。本研究では、（エクソン１［Ｌ３３］を含有する）ＥＦ１ａプロモーター由来の「ＥＦ１ａ－ＩＮＴ」配列、ＥＦ１ａイントロンおよびスプライスアクセプタのすべて、ならびにＥＦ１ａエクソン２由来の１２ヌクレオチドをＣＡＧプロモーター中にクローニングし、ＣＡＧエクソン／イントロン配列を置き換えた。「ＥＦ１ａ－ＩＮＴ」配列もＣＭＶプロモーター構築物中にクローニングした。Ｂ．ウイルスベクター産生中の導入遺伝子発現をモデル化するために、懸濁（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現およびＴＲＡＰによる抑制について、構築物を評価した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×ＭＦＩ）を求めて、プロットし、ＴＲＡＰの存在下で倍数抑制スコアも表記した。

【図14-2】最適な重複するｔｂｓ－コザック変異型を用いたイントロン含有プロモーターの改善された抑制。Ａ．重複していないｔｂｓ－コザック変異型と比較して重複するｔｂｓ－コザック変異型の使用を例示するために使用される発現カセットの概略図。広く使用されているＥＦ１ａプロモーター配列は、広く使用されているＣＡＧプロモーターと同様に、それ自体のイントロンを含有する（図１０および実施例５参照）。ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー、コアプロモーターおよびニワトリβ－アクチン遺伝子由来のエクソン１／イントロン配列およびウサギβ－グロビン遺伝子由来のスプライスアクセプタ／エクソン配列を含有する極めて強力な人工プロモーターである。本研究では、（エクソン１［Ｌ３３］を含有する）ＥＦ１ａプロモーター由来の「ＥＦ１ａ－ＩＮＴ」配列、ＥＦ１ａイントロンおよびスプライスアクセプタのすべて、ならびにＥＦ１ａエクソン２由来の１２ヌクレオチドをＣＡＧプロモーター中にクローニングし、ＣＡＧエクソン／イントロン配列を置き換えた。「ＥＦ１ａ－ＩＮＴ」配列もＣＭＶプロモーター構築物中にクローニングした。Ｂ．ウイルスベクター産生中の導入遺伝子発現をモデル化するために、懸濁（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現およびＴＲＡＰによる抑制について、構築物を評価した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×ＭＦＩ）を求めて、プロットし、ＴＲＡＰの存在下で倍数抑制スコアも表記した。

【発明を実施するための形態】

【0112】

ここで、本発明の様々な好ましい特徴および態様を非限定的な例として記載する。

【0113】

本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の能力の範囲内である化学、分子生物学、微生物学および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は文献で説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３，ａｎｄ １６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｈｎ（１９９６）ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ（１９９０）Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。これらの一般的なテキストの各々は、参照により本明細書に組み入れられる。

【0114】

本開示は、本明細書に開示される例示的な方法および材料によって限定されず、本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を、本開示の態様の実施または試験において使用することができる。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。別段示されない限り、それぞれ、任意の核酸配列は５’から３’方向で左から右に書かれており、アミノ酸配列はアミノからカルボキシ方向で左から右に書かれている。

【0115】

値の範囲が与えられている場合、その範囲の上限と下限の間にある、文脈上明確に別段の指示がない限り下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内の任意の記載された値または介在する値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在する値との間のより小さい各範囲は、本開示内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、その範囲に含まれてもよく、または除外されてもよく、より小さい範囲に一方の限界が含まれる、両方の限界が含まれない、または両方の限界が含まれる各範囲も、示された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従うものとして、本開示内に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合には、含まれる限界の一方または両方を除外した範囲も本開示に含まれる。

【0116】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。

【0117】

本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的または非限定的であって、追加の列挙されていないメンバー、要素または方法工程を排除しない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含む。

【0118】

本明細書において論述される刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいかなる記載も、このような刊行物が本明細書に添付されている特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの承認として解釈されるべきではない。

【0119】

核酸配列
一局面において、本発明は、関心対象のヌクレオチドと、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位と、コザック配列とを含む核酸配列であって、前記ＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）はコザック配列と重複する、核酸配列を提供する。

【0120】

一局面において、本発明は、関心対象のヌクレオチド（導入遺伝子）と、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位（ｔｂｓ）とを含む核酸配列であって、ＴＲＡＰ結合部位は導入遺伝子開始コドンＡＴＧと重複する、核酸配列を提供する。

【0121】

別の局面において、本発明は、関心対象のヌクレオチドとコザック配列とを含む核酸配列であって、コザック配列は、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位（ｔｂｓ）の一部を含む核酸配列を提供する。

【0122】

一局面において、本発明は、関心対象のヌクレオチド（導入遺伝子）とＴＲＡＰ結合部位とを含む核酸配列であって、ＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）は導入遺伝子開始コドンＡＴＧの一部を含む、またはその逆である核酸配列を提供する。

【0123】

本発明のいくつかの態様において、関心対象のヌクレオチドは、ｔｂｓまたはその一部に機能的に連結されている。いくつかの態様において、関心対象のヌクレオチドは、ＴＲＡＰを欠如する標的細胞において翻訳される。

【0124】

ｔｂｓまたはその一部は、関心対象のヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または防止されるように、ＴＲＡＰと相互作用することが可能であり得る。

【0125】

したがって、別の局面において、本発明は、ウイルスベクター産生細胞においてＮＯＩの翻訳を抑制する方法であって、本発明の核酸配列、およびＴＲＡＰをコードする核酸配列をウイルスベクター産生細胞中に導入することを含み、ＴＲＡＰはＴＲＡＰ結合部位またはその一部に結合し、それによりＮＯＩの翻訳を抑制する、方法を提供する。

【0126】

トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）
トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において広く性質決定されている細菌タンパク質である。トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）は、転写減衰または翻訳制御機構のいずれかに関与することによって、ｔｒｐＥＤＣＦＢＡオペロンから指示されるトリプトファン生合成を調節する（Ｇｏｌｌｎｉｃｋ，Ｂ．，Ａｎｔｓｏｎ，ａｎｄ Ｙａｎｏｆｓｋｙ（２００５）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：４７－６８に概説されている）。

【0127】

その天然の状況において、ＴＲＡＰは、３つの異なる機構によってトリプトファン生合成および輸送を調節する。

【0128】

１．ｔｒｐＥＤＣＦＢＡオペロンの転写の減衰（Ｓｈｉｍｏｔｓｕ Ｈ，Ｋ．Ｍ．，Ｙａｎｏｆｓｋｙ Ｃ，Ｈｅｎｎｅｒ ＤＪ．（１９８６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６６：４６１－４７１）。

【0129】

２．ｔｒｐＥおよびｔｒｐＤシャイン－ダルガーノ封鎖ヘアピンの形成の促進（Ｙａｋｈｎｉｎ Ｈ，Ｂ．Ｊ．，Ｙａｋｈｎｉｎ ＡＶ，Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（２０）：５９１８－５９２６）。

【0130】

３．ｔｒｐＧおよびｙｈａＧリボソーム結合部位へのリボソームアクセスを遮断する（Ｙａｎｇ Ｍ，ｄ．Ｓ．Ａ．，ｖａｎ Ｌｏｏｎ ＡＰＧＭ，Ｇｏｌｌｎｉｃｋ Ｐ．（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：４２７２－４２７８）。

【0131】

バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）では、ＴＲＡＰは単一の遺伝子（ｍｔｒＢ）によってコードされ、機能性タンパク質は、トロイド環として配置された１１個の同一のサブユニットから構成される（Ａｎｔｓｏｎ ＡＡ，Ｄ．Ｅ．，Ｄｏｄｓｏｎ Ｇ，Ｇｒｅａｖｅｓ ＲＢ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｇｏｌｌｎｉｃｋ Ｐ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４０１（６７５０）：２３５－２４２）。ＴＲＡＰは活性化されて、隣接するサブユニット間のポケット内の最大１１分子のトリプトファンを結合することによってＲＮＡと相互作用する。標的ＲＮＡは、この四級環構造の外側に巻き付けられる（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｈｉｒｅ ＳＪ，Ｙａｎｏｆｓｋｙ Ｃ．（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９：１６５９７－１６６０４）。

【0132】

理論に拘束されることを望むものではないが、トリプトファン合成を感知および制御する天然の機構において、ＴＲＡＰは、新たに合成されたＲＮＡリーダー中の結合部位に結合することによって転写終結のレベルで作用すると理解される。これは、下流のｒｈｏ非依存性ターミネーターが活性であるように、重複する抗ターミネーター配列を不安定化し、短いＲＮＡのみの産生をもたらす。細菌内でトリプトファンが制限されている場合には、ＴＲＡＰ環はもはやそのＲＮＡ結合部位に結合することができない。したがって、抗ターミネーターが活性化され、転写がトリプトファン合成遺伝子オペロンに続く。ＴＲＡＰは、翻訳レベルで作用することもできる：ＲＮＡ転写物の５’－ＵＴＲ中のＴＲＡＰの結合部位へのＴＲＡＰのトリプトファン依存的結合は、抗シャイン－ダルガーノ配列を開放し、これはシャイン－ダルガーノ配列と安定なステムを形成し、その結果、リボソームによる翻訳の開始が抑制される。最後に、ＴＲＡＰがそのｔｂｓに結合されている他の状況においては、４０Ｓスキャニングリボソーム複合体が開始コドンに到達することができ、本来であればより安定で、より高い親和性の翻訳機構が直ちに形成するより前に４０Ｓスキャニングリボソーム複合体を物理的に封鎖することによって翻訳開始を抑制することができる。

【0133】

細菌の遺伝子配列は哺乳動物細胞中での発現に最適でない可能性が高いので、ＴＲＡＰオープンリーディングフレームは哺乳動物（例えば、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））細胞中での発現のためにコドン最適化され得る。配列は、潜在的な不安定な配列およびスプライシング部位を除去することによっても最適化され得る。ＴＲＡＰタンパク質上にＣ末端に発現されたＨＩＳタグの使用は、翻訳抑制に関して利益をもたらすようであり、使用されてもよい。このＣ末端ＨＩＳタグは、真核細胞内でのＴＲＡＰの溶解性または安定性を改善し得るが、改善された機能的利益を排除することはできない。それにもかかわらず、ＨＩＳタグ付きおよび非タグ付きＴＲＡＰはいずれも、導入遺伝子発現の堅固な抑制を可能にした。ＴＲＡＰ転写ユニット内のある特定のシス作用性配列も最適化され得る；例えば、ＥＦ１αプロモーターによって駆動される構築物は、一過性形質移入の状況において、ＣＭＶプロモーターによって駆動される構築物と比較して、ＴＲＡＰプラスミドの低投入量でより良好な抑制を可能にする。

【0134】

一態様において、ＴＲＡＰは細菌に由来する。

【0135】

本発明の一態様において、ＴＲＡＰは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、例えばバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは、以下の配列を含み得る。

【0136】

ＭＮＱＫＨＳＳＤＦＶＶＩＫＡＶＥＤＧＶＮＶＩＧＬＴＲＧＴＤＴＫＦＨＨＳＥＫＬＤＫＧＥＶＩＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＶＲＧＥＡＬＩＱＴＡＹＧＥＭＫＳＥＫＫ（配列番号１）
本発明の好ましい態様において、配列番号１は、６個のヒスチジンアミノ酸でＣ末端にタグ付けされている（ＨＩＳ×６タグ）。

【0137】

代替の態様において、ＴＲＡＰは、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは、以下の配列を含み得る。

【0138】

ＭＫＥＧＥＥＡＫＴＳＶＬＳＤＹＶＶＶＫＡＬＥＮＧＶＴＶＩＧＬＴＲＧＱＥＴＫＦＡＨＴＥＫＬＤＤＧＥＶＷＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＶＲＧＡＳＥＩＨＴＫＨＧＭＬＦＳＧＲＧＲＮＥＫＧ（配列番号２）
代替の態様において、ＴＲＡＰは、デスルホトマキュラム・ヒドロサーマル（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｅ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは、以下の配列を含み得る。

【0139】

ＭＮＰＭＴＤＲＳＤＩＴＧＤＹＶＶＶＫＡＬＥＮＧＶＴＩＩＧＬＴＲＧＧＶＴＫＦＨＨＴＥＫＬＤＫＧＥＩＭＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＩＲＧＲＡＥＬＬＴＫＨＧＫＩＲＴＥＶＤＳ（配列番号３）
代替の態様において、ＴＲＡＰは、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは、以下の配列を含み得る。

【0140】

ＭＹＴＮＳＤＦＶＶＩＫＡＬＥＤＧＶＮＶＩＧＬＴＲＧＡＤＴＲＦＨＨＳＥＫＬＤＫＧＥＶＬＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＶＲＧＫＡＹＩＱＴＲＨＧＶＩＥＳＥＧＫＫ（配列番号４）
代替の態様において、ＴＲＡＰは、バチルス・ステアロサーモフィルスＳ７２Ｎ（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ７２Ｎ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは、以下の配列を含み得る。

【0141】

ＭＹＴＮＳＤＦＶＶＩＫＡＬＥＤＧＶＮＶＩＧＬＴＲＧＡＤＴＲＦＨＨＳＥＫＬＤＫＧＥＶＬＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＶＲＧＫＡＹＩＱＴＲＨＧＶＩＥＮＥＧＫＫ（配列番号５）
代替の態様において、ＴＲＡＰは、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは、以下の配列を含み得る。

【0142】

ＭＮＶＧＤＮＳＮＦＦＶＩＫＡＫＥＮＧＶＮＶＦＧＭＴＲＧＴＤＴＲＦＨＨＳＥＫＬＤＫＧＥＶＭＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＶＫＩＲＧＫＡＩＩＱＴＳＹＧＴＬＤＴＥＫＤＥ（配列番号６）
代替の態様において、ＴＲＡＰは、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは、以下の配列を含み得る。

【0143】

ＭＶＣＤＮＦＡＦＳＳＡＩＮＡＥＹＩＶＶＫＡＬＥＮＧＶＴＩＭＧＬＴＲＧＫＤＴＫＦＨＨＴＥＫＬＤＫＧＥＶＭＶＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＩＲＧＫＡＥＩＹＴＫＨＧＶＩＫＮＥ（配列番号７）
一態様において、ＴＲＡＰは、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質遺伝子ファミリーｍｔｒＢ（例えば、ＮＣＢＩに保存されたドメインデータベース＃ｃｌ０３４３７を有するＴｒｐＢＰスーパーファミリー）によってコードされる。

【0144】

好ましい態様において、ＴＲＡＰは、６個のヒスチジンアミノ酸でＣ末端にタグ付けされている（ＨＩＳ×６タグ）。

【0145】

好ましい態様において、ＴＲＡＰは、配列番号１～７のいずれかと５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有し、機能的に連結されたＮＯＩの発現がウイルスベクター産生細胞において改変されるように、例えば抑制または防止されるようにＲＮＡ結合部位と相互作用することができるアミノ酸配列を含む。

【0146】

好ましい態様において、ＴＲＡＰは、配列番号１～７のいずれかと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の同一性を有し、機能的に連結されたＮＯＩの発現がウイルスベクター産生細胞において改変されるように、例えば抑制または防止されるようにＲＮＡ結合部位と相互作用することができるアミノ酸配列を含む。

【0147】

別の態様において、ＴＲＡＰは、機能的に連結されたＮＯＩの発現がウイルスベクター産生細胞において改変されるように、例えば抑制または防止されるように、ＲＮＡ結合部位と相互作用することができるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、ＴＲＡＰは、配列番号１～７のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ得る。

【0148】

本発明において使用するためのＴＲＡＰのすべての変異型、断片または相同体は、ＮＯＩ（マーカー遺伝子であり得る）の翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または防止されるように、本明細書に記載のＴＲＡＰ結合部位に結合する能力を保持する。

【0149】

ＴＲＡＰ結合部位
「結合部位」という用語は、ある特定のタンパク質と相互作用することができる核酸配列として理解されるべきである。

【0150】

ＴＲＡＰを結合することができるコンセンサスＴＲＡＰ結合部位配列は、複数回（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２回またはそれより多く）繰り返される［ＫＡＧＮＮ］であり、このような配列は天然のｔｒｐオペロン中に見出される。天然の状況では、時折、ＡＡＧＮＮが許容され、時折、さらなる「スペーシング」Ｎヌクレオチドが機能的配列をもたらす。インビトロ実験は、ＴＲＡＰ－ＲＮＡ結合のために少なくとも６またはそれより多くのコンセンサス反復が必要とされることを実証している（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９－５１６３）。したがって、好ましくは、一態様において、ｔｂｓ内に６またはそれより多くの連続した［ＫＡＧＮ_≧２］配列が存在し、ＫはＤＮＡ中のＴまたはＧおよびＲＮＡ中のＵまたはＧであり得る。

【0151】

ＲＮＡ結合タンパク質としてのＴＲＡＰの場合、好ましくは、ＴＲＩＰ系は、少なくとも８つのＫＡＧＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列と最大限に機能するが、７つの反復を使用して、依然として強固な導入遺伝子抑制を得ることができ、６つの反復を使用して、ベクター力価を救済することができるレベルまで導入遺伝子を十分に抑制することができる。ＫＡＧＮＮコンセンサス配列は、ＴＲＡＰ媒介性抑制を維持するために変更され得るが、好ましくは、選択された正確な配列は、非抑制状態において高レベルの翻訳を確実にするために最適化され得る。例えば、ｔｂｓ配列は、ＴＲＡＰの非存在下で（すなわち、標的細胞中で）ｍＲＮＡの翻訳効率を妨害し得るスプライシング部位、不安定な配列またはステムループを除去することによって最適化され得る。所与のｔｂｓのＫＡＧＮＮ反復の構成に関して、ＫＡＧ反復間のＮ「スペーシング」ヌクレオチドの数は、好ましくは２である。しかしながら、少なくとも２つのＫＡＧ反復の間に２つより多くのＮスペーサーを含有するｔｂｓは許容され得る（インビトロ結合研究によって判断されたところ、３つのＮを含有する反復の５０％も機能的ｔｂｓをもたらし得る；Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９－５１６３）。実際、１１×ＫＡＧＮＮｔｂｓ配列は、ＫＡＧＮＮＮ反復との最大３つの置き換えを許容し、ＴＲＡＰ結合と連携していくつかの潜在的に有用な翻訳遮断活性をなお保持することができることが示されている。

【0152】

本発明の一態様において、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、配列ＫＡＧＮ_≧２（例えば、ＫＡＧＮ_２～３）を含む。したがって、疑義を避けるために、このｔｂｓまたはその一部は、例えば、以下の反復配列：ＵＡＧＮＮ、ＧＡＧＮＮ、ＴＡＧＮＮ、ＵＡＧＮＮＮ、ＧＡＧＮＮＮまたはＴＡＧＮＮＮのいずれをも含む。

【0153】

「Ｎ」は配列中のその位置に任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。例えば、これはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵであり得る。このようなヌクレオチドの数は、好ましくは２であるが、最大３個、例えば１、２または３個であり、１１×反復ｔｂｓまたはその一部のＫＡＧ反復は、３つのスペーシングヌクレオチドによって隔てられ得、翻訳抑制をもたらすいくらかのＴＲＡＰ結合活性をなお保持し得る。好ましくは、翻訳抑制をもたらす最大のＴＲＡＰ結合活性を保持するために、１１×反復ｔｂｓまたはその一部において１つ以下のＮ_３スペーサーが使用されるであろう。

【0154】

別の態様において、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ_≧２の複数の反復（例えば、ＫＡＧＮ_２～３の複数の反復）を含む。

【0155】

別の態様において、ｔｂｓまたはその一部は、配列ＫＡＧＮ_２の複数の反復を含む。

【0156】

別の態様において、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ_≧２の少なくとも６つの反復（例えば、ＫＡＧＮ_２～３の少なくとも６つの反復）を含む。

【0157】

別の態様において、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ_２の少なくとも６つの反復を含む。例えば、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ_２の６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれより多くの反復を含み得る。例えば、ｔｂｓまたはその一部は、配列番号８～１９または２２の任意の１つを含み得る。

【0158】

別の態様において、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ_≧２の少なくとも８つの反復（例えば、ＫＡＧＮ_２～３の少なくとも８つの反復）を含む。例えば、ｔｂｓまたはその一部は、配列番号８、９、１４～１７、２０～２４の任意の１つを含み得る。

【0159】

好ましくは、ｔｂｓまたはその一部の中に存在するＫＡＧＮＮＮ反復の数は、１またはそれより少ない。例えば、ｔｂｓまたはその一部は、配列番号８、９、１４～１７、１９～２４の任意の１つを含み得る。

【0160】

別の態様において、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ_≧２の１１の反復（例えば、ＫＡＧＮ_２～３の１１の反復）を含む。好ましくは、このｔｂｓまたはその一部の中に存在するＫＡＧＮＮＮ反復の数は、３またはそれより少ない。例えば、ｔｂｓまたはその一部は、配列番号８、９、１４、２０～２２の任意の１つを含み得る。

【0161】

別の態様において、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ_≧２の１２の反復（例えば、ＫＡＧＮ_２～３の１２の反復）を含む。

【0162】

好ましい態様において、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ_２の８～１１の反復（例えば、ＫＡＧＮ_２の８、９、１０または１１の反復）を含む。例えば、ｔｂｓまたはその一部は、配列番号８、９、１４～１７、２０～２４の任意の１つを含み得る。

【0163】

一態様において、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、配列番号８～２４のいずれをも含み得る。

【0164】

例えば、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、以下の配列のいずれかを含み得る。

【0165】

ＧＡＧＵＵＵＡＧＣＧＧＡＧＵＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＵＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＵＧＧＡＧＣＵ（配列番号８）；または
ＧＡＧＵＵＵＡＧＣＧＧＡＧＵＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＵＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＣＵ（配列番号９）
「ＫＡＧＮ_≧２の反復」とは、一般的なＫＡＧＮ_≧２（例えば、ＫＡＧＮ_２～３）モチーフが繰り返されることを理解されたい。このモチーフの基準を満たす異なるＫＡＧＮ_≧２配列は、ｔｂｓまたはその一部を構成するために連結され得る。得られたｔｂｓまたはその一部が、このモチーフの要件を満たすただ１つの配列の反復に限定されることは意図されていないが、この可能性は定義に含まれる。例えば、「ＫＡＧＮ_≧２の６つの反復」には、以下の配列が含まれるが、これらに限定されない：
ＵＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ（配列番号１０）；
ＵＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ（配列番号１１）；
ＧＡＧＵＵＵ－ＧＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵＵ－ＧＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵ（配列番号１２）
および
ＵＡＧＵＵＵ－ＧＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵ（配列番号１３）
（ダッシュ記号は、ここでは、明確にするためのみに、反復の間に含まれている）。

【0166】

１つのＫＡＧＮＮＮ反復と７つのＫＡＧＮＮ反復を含有する８反復ｔｂｓまたはその一部は、ＴＲＡＰ媒介性抑制活性を保持する。１つまたはそれより多くのＫＡＧＮＮＮ反復を含有する８未満反復ｔｂｓ配列またはその一部（例えば、７または６反復ｔｂｓ配列またはその一部）は、より低いＴＲＡＰ媒介性抑制活性を有し得る。したがって、８より少ない反復が存在する場合、ｔｂｓまたはその一部がＫＡＧＮＮ反復のみを含むことが好ましい。

【0167】

ＫＡＧＮＮ反復コンセンサスにおいて使用するための好ましいヌクレオチドは以下のとおりである。

【0168】

・ＮＮスペーサー位置の少なくとも１つにおけるピリミジン；
・ＮＮスペーサー位置の第１におけるピリミジン；
・ＮＮスペーサー位置の両方におけるピリミジン；
・Ｋ位置におけるＧ。

【0169】

ＮＮスペーサー位置がＡＡである場合には、ＧはＫ位置で用いられることも好ましい（すなわち、ＴＡＧＡＡは、コンセンサス配列中の反復として使用されないことが好ましい）。

【0170】

「相互作用することができる」とは、核酸結合部位（例えば、ｔｂｓまたはその一部）が、細胞、例えば真核生物ウイルスベクター産生細胞において遭遇する条件下で、タンパク質、例えばＴＲＡＰに結合することができることと理解されるべきである。ＴＲＡＰなどのＲＮＡ結合タンパク質とのこのような相互作用は、核酸結合部位（例えば、ｔｂｓまたはその一部）が機能的に連結されているＮＯＩの翻訳の抑制または防止をもたらす。

【0171】

「機能的に連結された」とは、記載された成分が、その意図された様式で記載された成分が機能することを可能にする関係にあることと理解されるべきである。したがって、ＮＯＩに機能的に連結された本発明において使用するためのｔｂｓまたはその一部は、ＴＲＡＰがｔｂｓまたはその一部に結合したときにＮＯＩの翻訳が修飾されるように配置されている。

【0172】

所与のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮＯＩ翻訳開始コドンの上流にＴＲＡＰと相互作用することができるｔｂｓまたはその一部を配置することによって、そのＯＲＦに由来するｍＲＮＡの特異的な翻訳抑制が可能になる。ｔｂｓまたはその一部と翻訳開始コドンを隔てるヌクレオチドの数は、抑制の程度に影響を及ぼすことなく、例えば０～３４個のヌクレオチドまで変動し得る。さらなる例として、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部と翻訳開始コドンを隔てるために、０～１３個のヌクレオチドが使用され得る。

【0173】

ｔｂｓまたはその一部は、マルチシストロニックｍＲＮＡ中のＮＯＩの翻訳を抑制するために、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の下流に配置され得る。実際、これは、ｔｂｓに結合したＴＲＡＰが４０Ｓリボソームの通過を阻止し得るというさらなる証拠を提供する；ＩＲＥＳエレメントは、完全な翻訳複合体が形成される前に、ＣＡＰ非依存的様式で４０ＳリボソームサブユニットをｍＲＮＡに囲い込むように機能する（ＩＲＥＳ翻訳開始に関する総説については、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．（２０１２）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０（１１）：５５８－５６６を参照）。したがって、ＴＲＩＰ系は、ウイルスベクターゲノムから発現された単一のｍＲＮＡからの複数のオープンリーディングフレームを抑制することが可能である。これは、複数の治療遺伝子をコードするベクターを作製する場合に、特にすべての導入遺伝子産物がベクターの力価にある程度悪影響を及ぼし得る場合に、ＴＲＩＰ系の有用な特徴である。

【0174】

一態様において、核酸配列は、ＩＲＥＳとｔｂｓまたはその一部との間にスペーサー配列を含む。ＩＲＥＳは、「配列内リボソーム進入部位」という小見出しの下で本明細書に記載されるＩＲＥＳであり得る。スペーサー配列は、０～３０ヌクレオチド長、好ましくは１５ヌクレオチド長であり得る。スペーサーは、配列番号３８～４４の任意の１つで定義された配列を含み得、好ましくは、スペーサーは、配列番号３８で定義された配列を含む。

【0175】

一態様において、ＩＲＥＳとｔｂｓまたはその一部との間のスペーサー配列は、ｔｂｓまたはその一部の３’末端およびＮＯＩの下流開始コドンから３または９ヌクレオチドである。

【0176】

一態様において、ｔｂｓまたはその一部は、ＩＩ型制限酵素部位を欠如する。好ましい態様において、ｔｂｓまたはその一部は、ＳａｐＩ制限酵素部位を欠如する。

【0177】

いくつかの態様において、核酸配列は、ＲＲＥ配列またはその機能的代替物をさらに含む。

【0178】

いくつかの態様において、核酸配列はベクター導入遺伝子発現カセットである。

【0179】

重複するコザック配列およびＴＲＡＰ結合部位
本発明者らは、驚くべきことに、重複しないｔｂｓおよびコザック配列の使用と比較して、（重複するｔｂｓおよびコザック配列を使用して；図２Ｂおよび図２Ｃを参照）ｔｂｓまたはその一部の３’末端内にコザック配列を「隠す」ことによって、抑制の改善されたレベルが達成され得ることを見出した。さらに、予想外に、試験した重複するコザックおよびｔｂｓ配列のすべてが効率的なレベルの翻訳開始を誘導した、すなわち、試験した重複配列は、ＴＲＡＰの非存在下で非重複コザックおよびｔｂｓ配列と同様のレベルの導入遺伝子発現を提供した。理論に拘束されることを望むものではないが、抑制の改善されたレベルは、ｔｂｓまたはその一部がコザック配列と重複するときのＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体による導入遺伝子開始コドンの改善された閉塞を原因とし得る。

【0180】

「コザック配列」という用語は、翻訳開始部位としてリボソームによって認識される真核生物ｍＲＮＡ中のコンセンサス配列として理解されるべきである。コザック配列は、ＤＮＡ中のＡＴＧ開始（スタート）コドン（ｍＲＮＡではＡＵＧ）を含む。真核生物ｍＲＮＡ中に存在する正確なコザック配列が翻訳開始の効率を決定する、すなわちある種のコザック配列は効率的な翻訳開始をもたらさない。

【0181】

完全なコザック配列は、典型的には、ＤＮＡについてはコンセンサス配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＴＧＧおよびＲＮＡについてはコンセンサス配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧを有すると理解されており、ここで：小文字は、塩基が変化し得るこの位置で最も一般的な塩基を表し、大文字は、この位置における高度に保存された塩基を表し、「Ｒ」は、典型的にはプリン（すなわち、ＡまたはＧ）がこの位置で最適であることを表し、括弧内の配列（ｇｃｃ）は重要性が不確かである。Ｔ／Ｕは、一般に、開始コドンの上流にあるコザック配列コンセンサスのすべての位置で最も好ましくないヌクレオチドである。

【0182】

完全なコザック配列の最初の３つの塩基の重要性は不確かであるので、コザック配列は、本明細書において「拡張コザック配列」と呼ばれるコンセンサス配列、すなわち、ＤＮＡについてはＧＮＮＲＶＶＡＴＧＧ（配列番号２７）およびＲＮＡについてはＧＮＮＲＶＶＡＵＧＧを有すると理解することもでき、「Ｒ」は配列中のその位置にプリン（すなわち、ＡまたはＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｖ」はＧ、Ａ、またはＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきであり、「Ｎ」は配列中のその位置に任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。例えば、「Ｎ」は、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵであり得る。位置－１の「Ｒ」および位置＋３の「Ｇ」（ＡＴＧの「Ａ」が位置０である）は、コザック強度の観点から最も重要な位置と考えられることに留意されたい。しかしながら、導入遺伝子配列中での位置＋３の「Ｇ」の存在は、コードされているＯＲＦに依存するため、本明細書においては、＋３位置は「コア」コザック配列の一部として考えられていない。

【0183】

完全なコザック配列の最初の６つの位置に見出される塩基は、それらの位置に任意の塩基を見出すことができるように変化する（上で（ｇｃｃ）ｇｃｃと表記）。したがって、完全なコザックコンセンサス配列は、上でＲｃｃＡＵＧと表記される、低下した変動性を有する完全なコザック配列の一部からなる「コア」コザック配列を含有すると考えることができる。「コア」コザックコンセンサス配列は、本明細書では、ｍＲＮＡについてはＲＶＶＡＵＧおよびＤＮＡについてはＲＶＶＡＴＧとして定義され、ここで「Ｒ」は配列中のその位置にプリン（すなわち、ＡまたはＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｖ」はＧ、Ａ、またはＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。

【0184】

本発明の１つの好ましい態様において、コザック配列は、配列ＲＶＶＡＴＧ（配列番号２８）を含む；ここで、「Ｒ」は配列中のその位置にプリン（すなわち、ＡまたはＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｖ」はＧ、Ａ、またはＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。

【0185】

本発明の一態様において、コザック配列は、配列ＲＮＮＡＴＧ（配列番号１２５）を含む；ここで、「Ｒ」は配列中のその位置にプリン（すなわち、ＡまたはＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｎ」は、Ｇ、Ａ、Ｔ／ＵまたはＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきであり、「Ｔ／Ｕ」の使用はＴＲＡＰの非存在下での発現の低下したレベルをもたらし得ることが認識される。

【0186】

いくつかの態様において、コザック配列は、ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復と重複する。したがって、コアコザック配列は、ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復と重複し得る。

【0187】

好ましい重複するｔｂｓおよびコザックコンセンサス配列の要約を図２Ｃに提供する。

【0188】

好ましい態様において、ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復は、コアコザック配列内のＡＴＧトリプレットの少なくとも最初の、または最初の２つのヌクレオチドと重複する。

【0189】

本明細書に記載されているように、本発明の一局面において、ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復は、関心対象のヌクレオチド（導入遺伝子ＯＲＦ）のＡＴＧ開始コドンと重複する。一局面において、ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復は、関心対象のヌクレオチド（導入遺伝子ＯＲＦ）のＡＴＧ開始コドンの最初の１つまたは２つと重複する。

【0190】

一局面において、重複するｔｂｓ－コザック配列は、コンセンサス配列ＫＡＧＮＮＧ（配列番号１１３）を有し得、ここで、「ＮＮ」は、コザック配列のＡＴＧトリプレット内の最初の２つのヌクレオチドである。

【0191】

コンセンサス配列は、ＫＡＧＡＴＧ（配列番号１１４）であり得る；ここで、「Ｋ」は、ＧまたはＴ／Ｕのいずれかである。

【0192】

一局面において、重複するｔｂｓ－コザック配列は、図２Ｃに示されるようにＧＡＧＡＴＧ（配列番号２９）であり得る。

【0193】

一態様において、ＴＲＡＰ結合部位のまたはその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復は、関心対象のヌクレオチド内のＡＴＧトリプレットの第１のヌクレオチドと重複する。

【0194】

一局面において、配列は配列ＫＡＧＮＮＴＧ（配列番号１１５）を含み得、ここで、第２の「Ｎ」はＡＴＧトリプレット内の第１のヌクレオチドである。コンセンサス配列は、ＫＡＧＮＡＴＧ（配列番号１１６）であり得る；ここで、「Ｋ」は、配列中のその位置でＧまたはＴ／Ｕを指定すると理解されるべきであり、「Ｎ」は、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＵまたはＣから、但し、好ましくは「Ｖ」、すなわちＧ、ＡまたはＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。例えば、重複する配列は、図２Ｃに示されるようにＫＡＧＶＡＴＧ（配列番号３０）であり得る。

【0195】

一態様において、本発明の核酸において使用するための重複するコザック配列およびＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、以下の配列：
（ａ）ＧＡＧＡＴＧ（配列番号２９）；
（ｂ）ＫＡＧＶＡＴＧ（配列番号３０）；
（ｃ）ＫＡＧＶＶＡＴＧ（配列番号３１）；
（ｄ）ＫＡＧＲＶＶＡＴＧ（配列番号３２）；または
（ｅ）ＫＡＧＮＲＶＶＡＴＧ（配列番号３３）；
の１つを含み、
ここで、「Ｋ」はＴまたはＧであり得、「Ｒ」は配列中のその位置にプリン（すなわち、ＡまたはＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｖ」はＧ、Ａ、またはＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきであり、「Ｎ」は配列中のその位置に任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。例えば、「Ｎ」は、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＵであり得る。

【0196】

一態様において、本発明の核酸配列は、以下の配列：
（ａ）ＧＡＧＡＴＧ（配列番号２９）もしくはＫＡＧＡＴＧ（配列番号１１４）；
（ｂ）ＫＡＧＶＡＴＧ（配列番号３０）；
（ｃ）ＫＡＧＶＶＡＴＧ（配列番号３１）；
（ｄ）ＫＡＧＲＶＶＡＴＧ（配列番号３２）；または
（ｅ）ＫＡＧＮＲＶＶＡＴＧ（配列番号３３）；
の１つを含み、
ここで、「Ｋ」はＴまたはＧであり得、「Ｒ」は配列中のその位置にプリン（すなわち、ＡまたはＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｖ」はＧ、Ａ、またはＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきであり、「Ｎ」は配列中のその位置に任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。例えば、「Ｎ」は、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＵであり得る。

【0197】

本発明の核酸において使用するための好ましい重複するｔｂｓまたはその一部ならびにコンセンサス配列ＧＡＧＡＴＧ（配列番号２９）、ＫＡＧＶＡＴＧ（配列番号３０）およびＫＡＧＶＶＡＴＧ（配列番号３１）に対応するコアコザック配列（本明細書で定義されるＫＡＧＮＮのコンセンサスｔｂｓ反復配列および本明細書で定義されるコンセンサス「コア」コザック配列ＲＶＶＡＴＧに基づく）は、以下を包含する。

【0198】

（ａ）ＧＡＧＡＴＧ（配列番号２９）；
（ｂ）ＧＡＧＡＡＴＧ（配列番号６９）；
（ｃ）ＧＡＧＣＡＴＧ（配列番号７０）；
（ｄ）ＧＡＧＧＡＴＧ（配列番号７１）；
（ｅ）ＴＡＧＡＡＴＧ（配列番号７２）；
（ｆ）ＴＡＧＣＡＴＧ（配列番号７３）；
（ｇ）ＴＡＧＧＡＴＧ（配列番号７４）；
（ｈ）ＧＡＧＡＡＡＴＧ（配列番号７５）；
（ｉ）ＧＡＧＡＣＡＴＧ（配列番号７６）；
（ｊ）ＧＡＧＡＧＡＴＧ（配列番号７７）；
（ｋ）ＧＡＧＣＡＡＴＧ（配列番号７８）；
（ｌ）ＧＡＧＣＣＡＴＧ（配列番号７９）；
（ｍ）ＧＡＧＣＧＡＴＧ（配列番号８０）；
（ｎ）ＧＡＧＧＡＡＴＧ（配列番号８１）；
（ｏ）ＧＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号８２）；
（ｐ）ＧＡＧＧＧＡＴＧ（配列番号８３）；
（ｑ）ＴＡＧＡＡＡＴＧ（配列番号８４）；
（ｒ）ＴＡＧＡＣＡＴＧ（配列番号８５）；
（ｓ）ＴＡＧＡＧＡＴＧ（配列番号８６）；
（ｔ）ＴＡＧＣＡＡＴＧ（配列番号８７）；
（ｕ）ＴＡＧＣＣＡＴＧ（配列番号８８）；
（ｖ）ＴＡＧＣＧＡＴＧ（配列番号８９）；
（ｗ）ＴＡＧＧＡＡＴＧ（配列番号９０）；
（ｘ）ＴＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号９１）；
（ｙ）ＴＡＧＧＧＡＴＧ（配列番号９２）。

【0199】

いくつかの態様において、核酸配列は、以下の配列：
（ａ）ＫＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ（配列番号３４）；
（ｂ）ＫＡＧＮＧＧＡＧＣＣＡＴＧ（配列番号３５）；または
（ｃ）ＫＡＧＮＮＧＡＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号３６）；
（ｄ）ＫＡＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧ（配列番号３７）；
の１つを含み、
ここで、「Ｋ」はＴまたはＧであり得、「Ｎ」は配列中のその位置に任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。例えば、これは、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＵであり得る。

【0200】

好ましくは、核酸配列は、以下の配列：
（ａ）ＫＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ（配列番号３４）；または
（ｂ）ＫＡＧＮＧＧＡＧＣＣＡＴＧ（配列番号３５）；
の１つを含み、
ここで、「Ｋ」はＴまたはＧであり得、「Ｎ」は配列中のその位置に任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。例えば、これは、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＵであり得る。

【0201】

好ましい態様において、本発明の核酸配列は、重複するｔｂｓおよびコザック配列：
ＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ（配列番号６０）。

【0202】

ＮＯＩの翻訳の抑制または防止は、同等の時点で本発明の核酸配列の非存在下において発現される量と比較して、ウイルスベクター産生中に翻訳されるＮＯＩの産物（例えばタンパク質）の量の変化として理解されるべきである。このような翻訳の変化は、ＮＯＩによってコードされるタンパク質の発現の抑制または防止を結果としてもたらす。

【0203】

一態様において、本発明の核酸配列は、関心対象のヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または防止されるように、ＴＲＡＰと相互作用することができる。

【0204】

ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩの翻訳は、ベクター作製中の同じ時点で本発明の核酸配列の非存在下において翻訳される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％に低減され得る。

【0205】

ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩの翻訳は、ベクター作製中の同じ時点で本発明の核酸配列の非存在下において翻訳される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満に低減され得る。

【0206】

本発明の文脈において、ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩの翻訳は、ベクター作製中の同じ時点で（本発明の核酸配列とは異なって）重複していないコザックおよびｔｂｓ配列を含む核酸配列の存在下において翻訳される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％に低減され得る。

【0207】

本発明の文脈において、ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩの翻訳は、ベクター作製中の同じ時点で（本発明の核酸配列とは異なって）重複していないコザックおよびｔｂｓ配列を含む核酸配列の存在下において翻訳される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満に低減され得る。

【0208】

ＮＯＩの翻訳を防止することは、翻訳の量を実質的に０に低減させることとして理解されるべきである。

【0209】

ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩからのタンパク質の発現は、ベクター作製中の同じ時点で本発明の核酸配列の非存在下において発現される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％に低減され得る。

【0210】

ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩからのタンパク質の発現は、ベクター作製中の同じ時点で本発明の核酸配列の非存在下において発現される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満に低減され得る。

【0211】

本発明の文脈において、ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩからのタンパク質の発現は、ベクター作製中の同じ時点で（本発明の核酸配列とは異なって）重複していないコザックおよびｔｂｓ配列を含む核酸配列の存在下において発現される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％に低減され得る。

【0212】

本発明の文脈において、ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩからのタンパク質の発現は、ベクター作製中の同じ時点で（本発明の核酸配列とは異なって）重複していないコザックおよびｔｂｓ配列を含む核酸配列の存在下において発現される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満に低減され得る。

【0213】

ＮＯＩからのタンパク質の発現を防止することは、発現されるタンパク質の量を実質的に０に低減させることとして理解されるべきである。

【0214】

ＮＯＩの翻訳の分析および／または定量のための方法は、当技術分野において周知である。

【0215】

溶解された細胞からのタンパク質産物は、クーマシーまたは銀染色による可視化を伴うＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析などの方法を使用して分析され得る。あるいは、タンパク質産物は、該タンパク質産物を結合する抗体プローブを用いるウエスタンブロッティングまたは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して分析され得る。無処置の細胞中のタンパク質産物は、免疫蛍光によって分析され得る。

【0216】

改善型リーダー配列
ＴＲＩＰ系を（異なる長さおよび組成の異なる天然の５’ＵＴＲを含有する）異なるプロモーターに適用する場合には、ＴＲＡＰなしでの良好なレベルの発現も維持しながら、ＴＲＡＰによる効率的な抑制を与えるために、プロモーター－ＵＴＲ状況内にｔｂｓ配列を単に適用することが可能であることが望ましい。本研究の開始から、ｔｂｓが様々な構成的プロモーターの天然のＵＴＲ中に挿入されるときに、ＴＲＡＰ－ｔｂｓによって媒介される抑制の達成可能なレベルがどの程度であるかは公知でなかった。理想的には、天然の５’ＵＴＲ配列によって誘導され得る抑制レベルの潜在的な変動性のいずれをも回避するために、選択されたプロモーターを改変する場合には、ｔｂｓとともに単一の保存された５’ＵＴＲリーダー配列を供給することができることが有利であろう。驚くべきことに、ＥＦ１αプロモーターの第１のエクソン（配列番号２５）は、天然のリーダー配列を含む５’ＵＴＲリーダーと比較して、ＴＲＡＰによる一貫して良好なレベルの導入遺伝子抑制を提供し、このリーダーは、ＴＲＡＰの非存在下で良好なレベルの導入遺伝子発現も提供することが見出された。

【0217】

いくつかの態様において、核酸配列は、ｔｂｓまたはその一部の上流に５’リーダー配列を含む。リーダー配列は、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部のすぐ上流にあり得る、すなわち、リーダー配列とＴＲＡＰ結合部位またはその一部を隔てるさらなる配列は存在し得ない。５’リーダーがスプライシング事象に由来する場合には、エクソン／エクソン接合部からｔｂｓまでの配列は最小の長さ（好ましくは≦１２ｎｔ）に保たれるべきである。リーダー配列は、非コードＥＦ１αエクソン１領域に由来する配列を含み得る。好ましい態様において、リーダー配列は、配列番号２５、配列番号２６または配列番号９３で定義される配列を含む。

【0218】

多重クローニング部位
ＴＲＩＰ系の取り扱いやすさを改善するために、いくつかの異なる制限酵素（ＲＥ）の選択肢を介して、プロモーター－５’ＵＴＲ－ｔｂｓ配列を含有する発現カセット中にＮＯＩを直接クローニングする能力、すなわち、ｔｂｓとコザック配列の間に多重クローニング部位（ＭＣＳ）を組み込む能力を有することができることが望ましい（図２Ａを参照）。本発明者らは、いくつかの異なるＭＣＳがＴＲＩＰ系によって許容され得ること、すなわちＭＣＳが使用されるときに導入遺伝子抑制が依然として得られることを実証した。５’ＵＴＲリーダー配列がＴＲＡＰ媒介性抑制の程度を調節することができること、ｔｂｓのＡＴＧ開始コドンへの近接が重要であること、および効率的な翻訳開始を確実にするために効率的なコザック配列がＭＣＳおよびＮＯＩの開始コドンとともにまたはそれらの間に維持されなければならないことを考えると、これは予想外であった。加えて、ＴＲＡＰ媒介性抑制を維持しながら使用され得るＲＥ部位の数および／または組み合わせは予測することができなかった。

【0219】

このため、ＲＶＶＡＴＧの効率的なコアコザック配列も維持しながら、（ｔｂｓのＡＴＧへの近接性を保持するために）いくつかの（重複する）ＲＥ部位をｔｂｓからＡＴＧ開始コドンまで可能な限り短い距離で組み込むことができるように配列の「圧縮」が必要とされた。

【0220】

さらなる局面において、本発明は、関心対象のヌクレオチドと、本明細書に記載のｔｂｓまたはその一部と、多重クローニング部位（ＭＣＳ）と、本明細書に記載のコザック配列とを含む核酸配列であって、前記ＭＣＳは、ｔｂｓまたはその一部の下流かつコザック配列の上流に位置する、核酸配列を提供する。適切には、ｔｂｓまたはその一部およびコザック配列は重複しない。

【0221】

本明細書で使用される場合、「多重クローニング部位」は、互いに非常に近接したいくつかの制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含有するＤＮＡ領域として理解されるべきである。一態様において、ＲＥ部位は、本発明で使用するためのＭＣＳにおいて重複し得る。

【0222】

本明細書で使用される場合、「制限酵素部位」または「制限酵素認識部位」は、制限酵素によって認識される、４～８ヌクレオチド長のヌクレオチドの特定の配列を含有するＤＮＡ分子上の位置である。制限酵素は、特定のＲＥ部位（すなわち、特定の配列）を認識し、ＲＥ部位内またはＲＥ部位近傍のＤＮＡ分子を切断する。

【0223】

ＴＲＡＰを結合することができるコンセンサスＴＲＡＰ結合部位配列は、複数回（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２回またはそれより多く）繰り返される［ＫＡＧＮＮ］であり、ここで、Ｋは、ＤＮＡにおいてはＴまたはＧであり得、ＲＮＡにおいてはＵまたはＧであり得る。本発明の一態様において、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は、配列ＫＡＧＮ_≧２（例えば、ＫＡＧＮ_２～３）を含む。したがって、疑義を避けるために、このｔｂｓまたはその一部は、例えば、以下の反復配列：ＵＡＧＮＮ、ＧＡＧＮＮ、ＴＡＧＮＮ、ＵＡＧＮＮＮ、ＧＡＧＮＮＮまたはＴＡＧＮＮＮのいずれをも含む。「Ｎ」は配列中のその位置に任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。例えば、これはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵであり得る。このようなヌクレオチドの数は、好ましくは２であるが、最大３個、例えば１、２または３個であり、１１×反復ｔｂｓまたはその一部のＫＡＧ反復は、３つのスペーシングヌクレオチドによって隔てられ得、翻訳抑制をもたらすいくらかのＴＲＡＰ結合活性をなお保持し得る。好ましくは、翻訳抑制をもたらす最大のＴＲＡＰ結合活性を保持するために、１１×反復ｔｂｓまたはその一部において１つ以下のＮ_３スペーサーが使用されるであろう。

【0224】

一態様において、核酸配列は、以下の配列：
（ａ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＶＶＡＴＧ（配列番号４５）；
（ｂ）ＧＡＧＣＴＣＧＴＣＧＡＣＶＡＴＧ（配列番号４６）；
（ｃ）ＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＶＶＡＴＧ（配列番号４７）；
（ｄ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＶＡＴＧ（配列番号４８）；
（ｅ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＶＶＡＴＧ（配列番号４９）；
（ｆ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＲＶＶＡＴＧ（配列番号５０）；
（ｇ）ＫＡＧＡＣＴＡＧＴＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＲＶＶＡＴＧ（配列番号５１）；
（ｈ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号５２）；
（ｉ）ＧＡＧＣＴＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号５３）；
（ｊ）ＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＣＡＴＧ（配列番号５４）；
（ｋ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号５５）；
（ｌ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＣＡＴＧ（配列番号５６）；
（ｍ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＡＣＣＡＴＧ（配列番号５７）；または
（ｎ）ＫＡＧＡＣＴＡＧＴＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧ（配列番号５８）；
の１つを含み、
ここで、「Ｋ」はＴまたはＧであり得、「Ｒ」は配列中のその位置にプリン（すなわち、ＡまたはＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｖ」はＧ、Ａ、またはＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。

【0225】

一態様において、核酸配列は、以下の配列：
（ａ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号５２）；
（ｂ）ＧＡＧＣＴＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号５３）；
（ｃ）ＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＣＡＴＧ（配列番号５４）；
（ｄ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号５５）；
（ｅ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＣＡＴＧ（配列番号５６）；
（ｆ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＡＣＣＡＴＧ（配列番号５７）；または
（ｇ）ＫＡＧＡＣＴＡＧＴＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧ（配列番号５８）；
の１つを含み、
ここで、「Ｋ」はＴまたはＧであり得る。

【0226】

一態様において、核酸配列は、以下の配列：
（ａ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号５２）；
（ｂ）ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号５５）；または
（ｃ）ＫＡＧＡＣＴＡＧＴＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧ（配列番号５８）；
の１つを含み、
ここで、「Ｋ」はＴまたはＧであり得る。

【0227】

好ましい態様において、本発明の核酸配列は、重複するｔｂｓ－ＭＣＳ－コザック配列：
ＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号６１）
を含む。

【0228】

一態様において、ＮＯＩは、ｔｂｓまたはその一部に機能的に連結されている。

【0229】

一態様において、ｔｂｓまたはその一部は、ＮＯＩの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように、ＴＲＡＰと相互作用することができる。

【0230】

一態様において、ＮＯＩは、ＴＲＡＰを欠如する標的細胞において翻訳される。

【0231】

一態様において、ｔｂｓまたはその一部は、配列ＫＡＧＮ_２～３の複数の反復を含む。

【0232】

一態様において、ｔｂｓまたはその一部は、配列ＫＡＧＮ_２の複数の反復を含む。

【0233】

一態様において、ｔｂｓまたはその一部は、配列ＫＡＧＮ_２の少なくとも６つの反復を含む。例えば、ｔｂｓまたはその一部は、配列番号８～１９または２２の任意の１つを含み得る。

【0234】

一態様において、ｔｂｓまたはその一部は、配列ＫＡＧＮ_２～３の少なくとも８つの反復を含む。例えば、ｔｂｓまたはその一部は、配列番号８、９、１４～１７、２０～２４の任意の１つを含み得る。好ましくは、ＫＡＧＮＮＮ反復の数は、１またはそれ未満であり得る。例えば、ｔｂｓまたはその一部は、配列番号８、９、１４～１７、１９～２４の任意の１つを含み得る。

【0235】

一態様において、ｔｂｓまたはその一部は、配列ＫＡＧＮ_２の少なくとも８～１１の反復を含む。

【0236】

一態様において、ｔｂｓまたはその一部は、配列ＫＡＧＮ_２～３の１１の反復を含む。適切には、ＫＡＧＮＮＮ反復の数は３またはそれより少ない。例えば、ｔｂｓまたはその一部は、配列番号８、９、１４、２０～２２の任意の１つを含み得る。

【0237】

一態様において、コザック配列は、配列ＲＶＶＡＴＧ（配列番号２８）を含む；ここで、「Ｒ」は配列中のその位置にプリン（すなわち、ＡまたはＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｖ」はＧ、Ａ、またはＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。

【0238】

一態様において、コザック配列は、配列ＲＮＮＡＴＧ（配列番号１２５）を含む；ここで、「Ｒ」は配列中のその位置にプリン（すなわち、ＡまたはＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｎ」はＧ、Ａ、Ｔ／ＵまたはＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。

【0239】

一態様において、転写開始部位／プロモーターの末端からｔｂｓのまたはその一部の開始までの距離は、３４ヌクレオチド未満である。

【0240】

一態様において、転写開始部位／プロモーターの末端からｔｂｓのまたはその一部の開始までの距離は、１３ヌクレオチド未満である。

【0241】

一態様において、ｔｂｓまたはその一部は、ＩＩ型制限酵素部位、好ましくはＳａｐＩ制限酵素部位を欠如する。

【0242】

一態様において、核酸配列は、ｔｂｓまたはその一部の上流に５’リーダー配列を含む。リーダー配列は、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部のすぐ上流にあり得る、すなわち、リーダー配列とＴＲＡＰ結合部位またはその一部を隔てるさらなる配列は存在し得ない。

【0243】

一態様において、リーダー配列は、非コードＥＦ１αエクソン１領域に由来する配列を含む。

【0244】

一態様において、リーダー配列は、配列番号２５または配列番号２６で定義される配列を含む。

【0245】

一態様において、核酸配列はＩＲＥＳを含む。

【0246】

一態様において、核酸配列は、ＩＲＥＳとｔｂｓまたはその一部との間にスペーサー配列を含む。

【0247】

一態様において、スペーサーは、０～３０ヌクレオチド長である。

【0248】

一態様において、スペーサーは１５ヌクレオチド長である。

【0249】

一態様において、スペーサーは、ｔｂｓまたはその一部の３’末端およびＮＯＩの下流開始コドンから３または９ヌクレオチドである。

【0250】

一態様において、スペーサーは配列番号３８～４４の任意の１つで定義される配列を含み、好ましくはスペーサーは配列番号３８で定義される配列を含む。

【0251】

一態様において、ＮＯＩは治療効果を生じさせる。

【0252】

一態様において、核酸配列は、ＲＲＥ配列またはその機能的代替物をさらに含む。

【0253】

一態様において、核酸配列はベクター導入遺伝子発現カセットである。

【0254】

一態様において、本発明の核酸配列は、プロモーターをさらに含む。典型的には、プロモーターの転写は、得られたｍＲＮＡ転写物中にコードされる５’ＵＴＲをもたらす。プロモーターは、当技術分野において公知であり、関心対象のヌクレオチドの発現を制御するのに適した任意のプロモーターであり得る。例えば、プロモーターは、ＥＦ１α、ＥＦＳ、ＣＭＶまたはＣＡＧであり得る。

【0255】

好ましい態様において、本明細書に記載の重複するｔｂｓおよびコザック配列は、プロモーターの５’ＵＴＲ内に位置し、５’ＵＴＲは、関連するプロモーター由来の天然配列を含み得、またはより好ましくは、５’ＵＴＲは、本明細書に記載の５’ＵＴＲ配列から構成される。

【0256】

好ましい態様において、本明細書に記載のｔｂｓとコザック配列の間に圧縮された／重複するＭＣＳを含む配列は、前記５’ＵＴＲ内に位置する。

【0257】

本明細書に記載の重複するｔｂｓおよびコザック配列または本明細書に記載のｔｂｓとコザック配列との間に圧縮された／重複するＭＣＳを含む配列は、前記５’ＵＴＲの３’末端に位置し得る。

【0258】

好ましくは、５’ＵＴＲは、以下の配列：配列番号２９～３７、４５～５８、６９～９２および１０８～１１６のうちの１つを含む。より好ましくは、５’ＵＴＲは、配列番号２９または配列番号１０８を含む。さらにより好ましくは、５’ＵＴＲは配列番号２９を含む。

【0259】

プロモーター－５’ＵＴＲ領域はイントロンを含み得る。イントロンは、天然のイントロンまたは異種イントロンであり得る。例えば、プロモーターは、ＥＦ１αまたはＣＡＧであり得る。

【0260】

プロモーターは、イントロンを含まないウイルスベクターゲノム、例えばＣＭＶにおいて典型的に使用されるプロモーターであり得る。

【0261】

好ましい態様において、プロモーター－５’ＵＴＲ領域は、異種イントロンを含む人工の５’ＵＴＲを含むように操作されている。したがって、プロモーター－５’ＵＴＲ領域は、異種エクソン－イントロン－エクソン配列を含有するように操作されており、ｍＲＮＡ転写物内にコードされる成熟５’ＵＴＲは、イントロンのスプライシングによる切り出しから生じる。プロモーター－５’ＵＴＲ配列は、当技術分野において公知の方法を使用して操作され得る。例えば、プロモーターは、本明細書中に記載されているように操作され得る（実施例８を参照）。

【0262】

好ましくは、イントロンまたは異種イントロンのスプライシングによる切り出しから生じるその成熟ｍＲＮＡからの導入遺伝子タンパク質の発現は、ＴＲＡＰによって効率的に抑制される。適切には、イントロンまたは異種イントロンは、配列番号１２２のとおりのＥＦ１αイントロン配列であり得る。

【0263】

イントロンまたは異種イントロンは、本明細書に記載の重複するｔｂｓおよびコザック配列のまたは本明細書に記載のｔｂｓとコザック配列との間にＭＣＳを含む配列の上流、すなわち５’に位置し得る。

【0264】

５’ＵＴＲは、以下の配列（ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンキメラ５’ＵＴＲ－イントロン、太字のエクソン配列（スプライシングされて一緒になり、５’ＵＴＲリーダーになる））：
ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＡＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡ（配列番号１２１）
を含み得る。

【0265】

５’ＵＴＲは、以下の配列（ＥＦ１ａ５’ＵＴＲ－イントロン、太字のエクソン配列（スプライシングされて一緒になり、５’ＵＴＲリーダーになる））：
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＴＴＧＣＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＡＡＴＣＧＧＡＣＧＧＧＧＧＴＡＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＧＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＴＴＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＡＡＡ（配列番号１２２）
を含み得る。

【0266】

一態様において、プロモーターは、配列（太字のエクソン配列（スプライシングされて一緒になり、５’ＵＴＲリーダーになる）、斜字体のｔｂｓコンセンサス）：
ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＡＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡ［ＫＡＧＮ_２－３］_{１０－１１}（配列番号１２３）
を含む。

【0267】

一態様において、プロモーターは、配列（太字のエクソン配列（スプライシングされて一緒になり、５’ＵＴＲリーダーになる）、斜字体のｔｂｓコンセンサス）：
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＴＴＧＣＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＡＡＴＣＧＧＡＣＧＧＧＧＧＴＡＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＧＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＴＴＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＡＡＡ［ＫＡＧＮ_２－３］_{１０－１１}（配列番号１２４）
を含む。

【0268】

一態様において、プロモーターは、配列（ｔｂｓ－ｋｚｋＶ０．Ｇ変異型を有するニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンキメラ５’ＵＴＲ－イントロン、太字のエクソン配列（スプライシングされて一緒になり、５’ＵＴＲリーダーになる）、斜字体のｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ）：
ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＡＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ（配列番号１１７）
を含む。

【0269】

一態様において、プロモーターは、配列（重複するｔｂｓおよびコザック配列を有するＥＦ１ａ５’ＵＴＲ－イントロン（ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ変異型）、太字のエクソン配列（スプライシングされて一緒になり、５’ＵＴＲリーダーになる）、斜字体のｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ）：
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＴＴＧＣＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＡＡＴＣＧＧＡＣＧＧＧＧＧＴＡＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＧＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＴＴＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ（配列番号１１８）
を含む。

【0270】

配列番号１１７に対応するスプライシングされた配列；太字の５’ＵＴＲリーダー配列、斜字体のｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ：
ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＡＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ（配列番号１１９）
配列番号１１８に対応するスプライシングされた配列；太字の５’ＵＴＲリーダー配列、斜字体のｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ：
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ（配列番号１２０）
例示的な核酸配列
本発明の例示的な核酸配列を以下に示す。

【0271】

配列番号６２－Ｌ３３改善型リーダー、最適な（重複する）ｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］_８）－コザック接合を含有する例示的な核酸配列１
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ
配列番号６３－Ｌ３３改善型リーダー、最適な（重複する）ｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］_１１）－コザック接合を含有する例示的な核酸配列２
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ
配列番号６４－Ｌ１２改善型リーダー、最適な（重複する）ｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］_１１）－コザックを含有する例示的な核酸配列３
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ
配列番号６５－イントロン含有５’ＵＴＲに対する例示的な核酸配列４、Ｌ３３を含むスプライシングされたリーダー、最適な（重複する）ｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］_１１）－コザック接合をもたらす
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ
配列番号６６－改善型スペーサー、最適な（重複する）ｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］_８）－コザック接合を含有する例示的な核酸配列５
ＡＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＧＣＴＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ
配列番号６７－Ｌ３３改善型リーダーｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］_１１）－ＭＣＳ－コザックを含有する例示的な核酸配列６
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧ
配列番号６８－改善型スペーサー、ｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］_１１）－ＭＣＳ－コザックを含有する例示的な核酸配列７
ＡＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＧＣＴＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧ
一態様において、核酸配列は、配列番号６２～６８の任意の１つを含む。

【0272】

一態様において、核酸配列は、
（ａ）（ｉ）配列番号２５もしくは２６；および／または
（ｉｉ）配列番号３８～４４の任意の１つ；
（ｂ）配列番号１０～１３、１５～１９、２３、２４の任意の１つ；ならびに
（ｃ）（ｉ）配列番号２９～３６の任意の１つ、好ましくは配列番号３４～３６の任意の１つ；または
（ｉｉ）配列番号４５～５８の任意の１つ、好ましくは配列番号５２～５８の任意の１つ
を含む。

【0273】

一態様において、核酸配列は、
（ａ）配列番号２５または２６；
（ｂ）配列番号１０～１３、１６～１９、２３、２４の任意の１つ；および
（ｃ）配列番号２９～３６の任意の１つ、好ましくは配列番号３４～３６の任意の１つ
を含む。

【0274】

一態様において、核酸配列は、
（ａ）配列番号３８～４４の任意の１つ；
（ｂ）配列番号１０～１３、１６～１９、２３、２４の任意の１つ；および
（ｃ）配列番号２９～３６の任意の１つ、好ましくは配列番号３４～３６の任意の１つ
を含む。

【0275】

一態様において、核酸配列は、
（ａ）配列番号２５または２６；
（ｂ）配列番号１０～１３、１５～１９、２３、２４の任意の１つ；および
（ｃ）配列番号４５～５８の任意の１つ、好ましくは配列番号５２～５８の任意の１つ
を含む。

【0276】

一態様において、核酸配列は、
（ａ）配列番号３８～４４の任意の１つ；
（ｂ）配列番号１０～１３、１５～１９、２３、２４の任意の１つ；および
（ｃ）配列番号４５～５８の任意の１つ、好ましくは配列番号５２～５８の任意の１つ
を含む。

【0277】

関心対象のヌクレオチド
本発明の一態様において、関心対象のヌクレオチドは、ＴＲＡＰを欠如する標的細胞において翻訳される。

【0278】

「標的細胞」は、その中でＮＯＩを発現することが望ましい細胞として理解されるべきである。ＮＯＩは、本発明のウイルスベクターを用いて標的細胞中に導入され得る。標的細胞への送達は、インビボ、エクスビボまたはインビトロで行われ得る。

【0279】

好ましい態様において、関心対象のヌクレオチドは、治療効果を生じさせる。

【0280】

ＮＯＩは、治療的または診断的用途を有し得る。適切なＮＯＩには、酵素、補助因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、キメラ抗原受容体、標的タンパク質のトランスドメインネガティブ変異体、毒素、条件的毒素、抗原、転写因子、構造タンパク質、レポータータンパク質、細胞内局在化シグナル、腫瘍抑制タンパク質、成長因子、膜タンパク質、受容体、血管作動性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、ならびにこれらの誘導体（関連レポーター基を有する誘導体など）をコードする配列が含まれるが、これらに限定されない。ＮＯＩは、マイクロＲＮＡもコードし得る。理論に拘束されることを望むものではないが、マイクロＲＮＡのプロセシングはＴＲＡＰによって阻害されると考えられる。

【0281】

一態様において、ＮＯＩは、神経変性障害の処置において有用であり得る。

【0282】

別の態様において、ＮＯＩは、パーキンソン病の処置において有用であり得る。

【0283】

別の態様において、ＮＯＩは、ドーパミン合成に関与する１つの酵素または複数の酵素をコードし得る。例えば、酵素は、以下のうちの１つまたは複数であり得る：チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩおよび／または芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ。３つすべての遺伝子の配列が入手可能である（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｘ０５２９０、Ｕ１９５２３およびＭ７６１８０）。

【0284】

別の態様において、ＮＯＩは、小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）をコードし得る。代替の態様において、ウイルスゲノムは、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするＮＯＩおよびＶＭＡＴ２をコードするＮＯＩを含み得る。このようなゲノムは、パーキンソン病の処置において、特にＬ－ＤＯＰＡの末梢投与と併せて使用され得る。

【0285】

別の態様において、ＮＯＩは、治療用タンパク質または治療用タンパク質の組み合わせをコードし得る。

【0286】

別の態様において、ＮＯＩは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インスリン増殖因子－２、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ／ＶＥＧＦ－２、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰＤＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＦＧ－ＡおよびＰＤＦＧ－Ｂのヘテロ二量体およびホモ二量体からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質をコードし得る。

【0287】

別の態様において、ＮＯＩは、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子４、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、胎盤増殖因子、レスチン、インターフェロン－α、インターフェロン誘導性タンパク質、グロベータおよびチューブダウン－１、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－１２、レチノイン酸、抗ＶＥＧＦ抗体またはその断片／変異型、例えばアフリベルセプト、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦ受容体タンパク質、例えば米国特許第５，９５２，１９９号および米国特許第６，１００，０７１号に記載されているもの、ならびに抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群から選択される１つの抗血管新生タンパク質または複数の抗血管新生タンパク質をコードし得る。

【0288】

別の態様において、ＮＯＩは、ＮＦ－ｋＢ阻害剤、ＩＬ１β阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ＩＬ－６阻害剤、ＩＬ－２３阻害剤、ＩＬ－１８阻害剤、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β、リンホトキシンαおよびリンホトキシンβ、ＬＩＧＨＴ阻害剤、αシヌクレイン阻害剤、タウ阻害剤、βアミロイド阻害剤、ＩＬ－１７阻害剤、からなる群から選択される抗炎症性タンパク質、抗体またはタンパク質もしくは抗体の断片／変異型をコードし得る。

【0289】

別の態様において、ＮＯＩは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードし得る。

【0290】

別の態様において、ＮＯＩは、眼細胞内で通常発現されるタンパク質をコードし得る。

【0291】

別の態様において、ＮＯＩは、視細胞および／または網膜色素上皮細胞において通常発現されるタンパク質をコードし得る。

【0292】

別の態様において、ＮＯＩは、ＲＰＥ６５、アリール炭化水素相互作用受容体タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、ＣＲＢ１、レシチンレチナールアセチルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）、視細胞特異的ホメオボックス（ＣＲＸ）、レチナールグアニル酸シクラーゼ（ｃｙｃｌｉｓｅ）（ＧＵＣＹ２Ｄ）、ＲＰＧＲ相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰ１）、ＬＣＡ２、ＬＣＡ３、ＬＣＡ５、ジストロフィン、ＰＲＰＨ２、ＣＮＴＦ、ＡＢＣＲ／ＡＢＣＡ４、ＥＭＰ１、ＴＩＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＥＬＯＶＬ４、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ２Ａ、ＶＭＤ２、ＲＬＢＰ１、ＣＯＸ－２、ＦＰＲ、ハーモニン、Ｒａｂエスコートタンパク質１、ＣＮＧＢ２、ＣＮＧＡ３、ＣＥＰ２９０、ＲＰＧＲ、ＲＳ１、ＲＰ１、ＰＲＥＬＰ、グルタチオン経路酵素およびオプチシンを含む群から選択されるタンパク質をコードし得る。

【0293】

他の態様において、ＮＯＩは、ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子をコードし得る。

【0294】

他の態様において、ＮＯＩは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、３メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、カルバモイル－リン酸シンターゼアンモニア、オルニチントランスカルバミラーゼ、グルコシルセラミダーゼβ、αガラクトシダーゼＡ、グルコシルセラミダーゼβ、シスチノシン、グルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ、Ｎ－アセチル－α－グルコサミニダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ガラクトサミン－６スルファターゼ、アリールスルファターゼＡ、シトクロムＢ－２４５β、ＡＢＣＤ１、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）、アルギナーゼ１、アラニングリオキシル酸（ｇｌｙｃｏｘｈｙｌａｔｅ）アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢメンバーを含む群から選択される、代謝に関与する１つのタンパク質または複数のタンパク質をコードし得る。

【0295】

他の態様において、ＮＯＩは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし得る。一態様において、ＣＡＲは抗５Ｔ４ＣＡＲである。他の態様において、ＮＯＩは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ１３８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ルイスＹ抗原（ＬｅＹ）、チロシン－プロテインキナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）、ムチン１、細胞表面結合（Ｍｕｃ１）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、内皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン、タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体タイプ２２、インターロイキン２受容体、α、ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されるインターフェロン、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ２）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、メシオテリン（ｍｅｓｉｏｔｈｅｌｉｎ）、小胞内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）をコードし得る。

【0296】

他の態様において、ＮＯＩは、ＵＬＢＰ１、２および３、Ｈ６０、Ｒａｅ－１ａ、ｂ、ｇ、ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢを含む群から選択されるＮＫＧ２Ｄリガンドに対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし得る。

【0297】

さらなる態様において、ＮＯＩは、ＳＧＳＨ、ＳＵＭＦ１、ＧＡＡ、共通γ鎖（ＣＤ１３２）、アデノシンデアミナーゼ、ＷＡＳタンパク質、グロビン、αガラクトシダーゼＡ、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）シンターゼ、δ－アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＡＤ）、ヒドロキシメチルビラン（ＨＭＢ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）デカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲン（ＣＯＰＲＯ）オキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン（ＰＲＯＴＯ）オキシダーゼ、フェロケラターゼ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラン－α－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、３Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼおよびヒアルロニダーゼをコードし得る。

【0298】

ＮＯＩに加えて、ベクターはまた、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは調節されたｓｈＲＮＡを含み得る、またはコードし得る。（Ｄｉｃｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８９－１２９５，Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８１－１２８８）
適応症
本発明によるレトロウイルスベクターおよびＡＡＶベクターを含むベクターは、国際公開第１９９８／０５６３５号、国際公開第１９９８／０７８５９号、国際公開第１９９８／０９９８５号に列挙されている障害の処置において有用な１つまたはそれより多くのＮＯＩを送達するために使用され得る。関心対象のヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。このような疾患の例を以下に示す：
サイトカインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制または免疫刺激活性（例えば、ヒト免疫不全ウイルスによる感染を含む免疫不全を処置するため、リンパ球増殖の調節；癌および多くの自己免疫疾患を処置すること、ならびに移植拒絶を防止すること、または腫瘍免疫を誘導すること）；造血の調節（例えば、骨髄性またはリンパ性疾患の処置）；骨、軟骨、腱、靭帯および神経組織の成長を促進させること（例えば、創傷の治癒、熱傷、潰瘍および歯周疾患および神経変性の処置のため）；卵胞刺激ホルモンの阻害または活性化（妊孕性の調節）；走化性／ケモキネシス活性（例えば、特定の細胞型を損傷または感染の部位に動員するため）；止血および血栓溶解活性（例えば、血友病および脳卒中を処置するために）；抗炎症活性（例えば、敗血症性ショックまたはクローン病を処置するため）；マクロファージ阻害活性および／またはＴ細胞阻害活性、したがって抗炎症活性；抗免疫活性（すなわち、炎症に関連しない応答を含む、細胞性および／または体液性免疫応答に対する阻害効果）；マクロファージおよびＴ細胞が細胞外マトリックス成分およびフィブロネクチンに接着する能力の阻害、ならびにＴ細胞における上方制御されたｆａｓ受容体発現に応答する障害。

【0299】

癌、白血病、良性および悪性腫瘍の増殖、浸潤および拡散、血管新生、転移、腹水および悪性胸水貯留を含む悪性障害。

【0300】

関節リウマチを含む関節炎、過敏症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患および他の疾患を含む自己免疫疾患。

【0301】

動脈硬化症、アテローム硬化性心疾患、再灌流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群、心血管作用、末梢血管疾患、片頭痛およびアスピリン依存性抗血栓症、脳卒中、脳虚血、虚血性心疾患または他の疾患を含む血管疾患。

【0302】

消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病および他の疾患を含む胃腸管の疾患。

【0303】

肝線維症、肝硬変を含む肝疾患。

【0304】

フェニルケトン尿症ＰＫＵ、ウィルソン病、有機酸血症、尿素サイクル障害、胆汁うっ滞、および他の疾患を含む遺伝性代謝障害。

【0305】

甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の疾患を含む腎臓および泌尿器の疾患。

【0306】

耳炎または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患を含む耳、鼻および喉の障害。

【0307】

歯周疾患、歯周炎、歯肉炎または他の歯／口腔疾患を含む歯および口腔障害。

【0308】

精巣炎または精巣上体－精巣炎、不妊症、精巣外傷または他の精巣疾患を含む精巣疾患。

【0309】

胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣性流産、子癇、子癇前症、子宮内膜症および他の婦人科疾患を含む婦人科疾患。

【0310】

ＬＣＡ１０を含むレーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、網膜ブドウ膜炎、視神経炎、開放隅角緑内障および若年性先天緑内障を含む緑内障、眼内炎症、例えば網膜炎または嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）およびベスト病、ベスト卵黄様黄斑変性を含む若年性黄斑変性を含む黄斑変性、シュタルガルト病、アッシャー症候群、ドイン蜂巣状網膜ジストロフィー、ソービー（Ｓｏｒｂｙ’ｓ）黄斑ジストロフィー、若年性網膜分離症、錐体桿体ジストロフィー、角膜ジストロフィー、フックスジストロフィー、レーバー先天黒内障、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、アディー症候群、小口病、変性眼底（ｆｏｎｄｕｓ）疾患、眼外傷、感染によって引き起こされる眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、例えば緑内障濾過手術後の過剰瘢痕、眼移植片に対する反応、角膜移植片拒絶、ならびに糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞、ＲＬＢＰ１関連網膜ジストロフィー、全脈絡膜萎縮および色覚異常などの他の眼疾患などの眼科学的障害。

【0311】

パーキンソン病、パーキンソン病の処置による合併症および／または副作用、ＡＩＤＳ関連認知症複合ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病およびＣＮＳの他の変性疾患、症状または障害、脳卒中、ポリオ後症候群、精神障害、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ファブリー病、ゴーシェ病、シスチン症、ポンペ病、異染性白質ジストロフィー、ウィスコット（Ｗｉｓｃｏｔｔ）アルドリッチ症候群、副腎白質ジストロフィー、ベータサラセミア、鎌状赤血球症、ギラン（Ｇｕｉｌｌａｉｍ）・バレー症候群、シデナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、ＣＮＳ圧迫またはＣＮＳ外傷またはＣＮＳの感染症、筋萎縮症およびジストロフィー、中枢および末梢神経系の疾患、症状または障害、筋萎縮性側索硬化症、脊髄筋萎縮症、脊髄および剥離損傷を含む運動ニューロン疾患を含む神経および神経変性障害。

【0312】

嚢胞性線維症、サンフィリポ（Ｓａｎｆｉｌｉｐｏ）症候群Ａ、サンフィリポ症候群Ｂ、サンフィリポ症候群Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄ、ハンター症候群、ハーラー・シャイエ症候群、モルキオ症候群を含むムコ多糖症、アデノシンデアミナーゼ重症複合免疫不全（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、Ｘ連鎖慢性肉芽腫性疾患、ポルフィリン症、血友病Ａ、血友病Ｂ、外傷後炎症、出血、凝固および急性期反応、悪液質、食欲不振、急性感染症、敗血症性ショック、感染性疾患、糖尿病、手術の合併症または副作用、骨髄移植または他の移植合併症および／または副作用、角膜、骨髄、器官、レンズ、ペースメーカー、天然または人工の皮膚組織などの天然または人工の細胞、組織および器官の移植の場合における移植片拒絶の予防および／または処置のために体液性および／または細胞性免疫応答を抑制または阻害するための、例えばウイルスキャリアによる感染またはＡＩＤＳを原因とする遺伝子治療の合併症および副作用などのその他の疾患および症状。

【0313】

ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある特定の他の態様において、ＮＯＩはマイクロＲＮＡを含む。マイクロＲＮＡは、生物中で天然に産生される小さなＲＮＡの非常に大きな群であり、その少なくとも一部は標的遺伝子の発現を調節する。マイクロＲＮＡファミリーの創始メンバー（ｆｏｕｎｄｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒ）は、ｌｅｔ－７およびｌｉｎ－４である。ｌｅｔ－７遺伝子は、虫の発育中に内因性のタンパク質コード遺伝子の発現を調節する、小さな、高度に保存されたＲＮＡ種をコードする。活性なＲＮＡ種は最初に約７０ｎｔの前駆体として転写され、これは転写後に成熟した約２１ｎｔ形態へとプロセシングされる。ｌｅｔ－７およびｌｉｎ－４はいずれも、ダイサー酵素によってそれらの成熟形態へとプロセシングされるヘアピンＲＮＡ前駆体として転写される。

【0314】

ＮＯＩに加えて、ベクターはまた、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは調節されたｓｈＲＮＡを含み得る、またはコードし得る（Ｄｉｃｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８９－１２９５，Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８１－１２８８）。

【0315】

二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、外来遺伝子の発現を制御するための保存された細胞防御機構である。トランスポゾンまたはウイルスなどの要素のランダムな組み込みは、相同な一本鎖ｍＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡの配列特異的分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こすと考えられる。このサイレンシング効果は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている（Ｒａｌｐｈ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１：４２９－４３３）。ＲＮＡｉの機構は、長いｄｓＲＮＡの、約２１～２５ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡの二重鎖へのプロセシングを含む。これらの産物は、ｍＲＮＡ分解の配列特異的媒介因子である低分子干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。分化した哺乳動物細胞では、３０ｂｐ超のｄｓＲＮＡがインターフェロン応答を活性化し、タンパク質合成および非特異的ｍＲＮＡ分解の停止をもたらすことが見出されている（Ｓｔａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７：２２７－６４（１９９８））。しかしながら、この応答は、２１ｎｔのｓｉＲＮＡ二重鎖を使用することによって回避することができ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．Ｄｅｃ ３；２０（２３）：６８７７－８８（２００１），Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｕｇ ３，２９３（５５３１）：８３４－８．Ｅｕｐｕｂ Ｊｕｌ １２（２００１））、培養された哺乳動物細胞において遺伝子機能を分析することを可能にする。

【0316】

ＮＯＩおよびポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードすることができることが当業者によって理解されるであろう。さらに、日常的な技術を使用して、本発明のポリペプチドがその中において発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するために、当業者は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行い得ることを理解されたい。

【0317】

ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得る。このような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのインビボでの活性または寿命を増強するために行われ得る。

【0318】

ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、組換え的に、合成的に、または当業者に利用可能な任意の手段によって作製され得る。ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドはまた、標準的な技術によってクローニングされ得る。

【0319】

組換え手段を使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を使用して、一般に、より長いポリヌクレオチドが作製されるであろう。これは、クローニングすることが望まれる標的配列に隣接する（例えば、約１５～３０ヌクレオチドの）プライマーの対を作製すること、プライマーを動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させること、所望の領域の増幅をもたらす条件下でＰＣＲを行うこと、増幅された断片を（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することによって）単離すること、および増幅されたＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡを適切なベクター中にクローニングすることができるように、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計され得る。

【0320】

主要スプライスドナー
ＲＮＡスプライシングは、５つの小さな核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）から構成されるスプライソソームと呼ばれる大きなＲＮＡ－タンパク質複合体によって触媒される。イントロンとエクソンの間の境界は、プレｍＲＮＡ内の特定のヌクレオチド配列によって印が付けられており、スプライシングが起こる場所を表す。このような境界は、「スプライス部位」と呼ばれる。「スプライス部位」という用語は、切断されるのにおよび／または別のスプライス部位に連結されるのに適していると真核細胞のスプライシング機構によって認識されることができるポリヌクレオチドを指す。

【0321】

スプライス部位は、プレｍＲＮＡ転写物中に存在するイントロンの切除を可能にする。典型的には、５’スプライス境界は、「スプライスドナー部位」または「５’スプライス部位」と呼ばれ、３’スプライス境界は、「スプライスアクセプタ部位」または「３’スプライス部位」と呼ばれる。スプライス部位としては、例えば、天然に存在するスプライス部位、操作されたもしくは合成スプライス部位、カノニカルもしくはコンセンサススプライス部位、および／または非カノニカルスプライス部位、例えば潜在的スプライス部位が挙げられる。

【0322】

スプライスアクセプタ部位は、一般に、３つの別個の配列要素：分岐点または分岐部位、ポリピリミジン鎖およびアクセプタコンセンサス配列からなる。真核生物における分岐点コンセンサス配列は、ＹＮＹＴＲＡＣ（ここで、Ｙはピリミジンであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）である。３’アクセプタスプライス部位コンセンサス配列は、ＹＡＧ（Ｙはピリミジンである）である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｏｄｅｒｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００２）を参照）。３’スプライスアクセプタ部位は、典型的にはイントロンの３’末端に位置する。

【0323】

したがって、主要スプライスドナー部位は、本発明において使用するためのレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列において不活性化され得る。

【0324】

一局面において、本発明は、本明細書に記載されている本発明による核酸配列であって、該核酸配列はレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム内に含まれ、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム内の主要スプライスドナー部位は不活性化されている、例えば変異または欠失されている、核酸配列も提供する。

【0325】

一局面において、本発明は、本明細書に記載されている本発明による核酸配列であって、該核酸配列はレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムに機能的に連結されており、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム内の主要スプライスドナー部位は不活性化されている、例えば変異または欠失されている、核酸配列も提供する。

【0326】

一局面において、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、前記レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位は不活性化されている、例えば変異または欠失されている、ヌクレオチド配列が提供される。

【0327】

「カノニカルスプライス部位」または「コンセンサススプライス部位」という用語は互換的に使用され得、種間で保存されているスプライス部位を指す。

【0328】

真核生物ＲＮＡスプライシングにおいて使用される５’ドナースプライス部位および３’アクセプタスプライス部位のコンセンサス配列は、当技術分野において周知である。これらのコンセンサス配列は、イントロンの各末端にほぼ不変のジヌクレオチド：イントロンの５’末端にＧＴおよびイントロンの３’末端にＡＧを含む。

【0329】

カノニカルスプライスドナー部位コンセンサス配列は、（ＤＮＡの場合）ＡＧ／ＧＴＲＡＧＴ（ここで、Ａはアデノシンであり、Ｔはチミンであり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｒはプリンであり、「／」は切断部位を示す。）であり得る。特に、例えばｖＲＮＡパッケージング領域内の二次構造などの他の制約が同じ配列に課されるウイルスゲノムにおいて、スプライスドナーが、このコンセンサスから逸脱し得ることは当技術分野において周知である。非カノニカルスプライス部位も当技術分野において周知であるが、カノニカルスプライスドナーコンセンサス配列と比較してまれに生じる。

【0330】

「主要スプライスドナー部位」とは、典型的にはウイルスベクターヌクレオチド配列の５’領域中に位置する天然のウイルスＲＮＡパッケージング配列内にコードされ、組み込まれた、ウイルスベクターゲノム中の第１の（優位な（ｄｏｍｉｎａｎｔ））スプライスドナー部位を意味する。

【0331】

一局面において、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列は、活性な主要スプライスドナー部位を含有しない、すなわち、スプライシングは、前記ヌクレオチド配列中の主要スプライスドナー部位から生じず、主要スプライスドナー部位からのスプライシング活性は除去されている。

【0332】

主要スプライスドナー部位は、レンチウイルスゲノムの５’パッケージング領域中に位置する。

【0333】

ＨＩＶ－１ウイルスの場合には、主要スプライスドナーコンセンサス配列は（ＤＮＡの場合）ＴＧ／ＧＴＲＡＧＴである（ここで、Ａはアデノシンであり、Ｔはチミンであり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｒはプリンであり、「／」は切断部位を示す。）。

【0334】

本発明の一局面において、スプライスドナー領域、すなわち変異前に主要スプライスドナー部位を含むベクターゲノムの領域は、以下の配列：
ＧＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ（配列番号９４）
を有し得る。

【0335】

本発明の一局面において、変異されたスプライスドナー領域は、配列：
ＧＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ（配列番号９５－ＭＳＤ－２ＫＯ）
を含み得る。

【0336】

本発明の一局面において、変異されたスプライスドナー領域は、配列：
ＧＧＧＧＣＧＧＣＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ（配列番号１０４－ＭＳＤ－２ＫＯｖ２）
を含み得る。

【0337】

本発明の一局面において、変異されたスプライスドナー領域は、配列：
ＧＧＧＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＡＴ（配列番号１０５－ＭＳＤ－２ＫＯｍ５）
を含み得る。

【0338】

本発明の一局面において、修飾の前に、スプライスドナー領域は、以下の配列：
ＧＧＣＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣ（配列番号１０２）
を含み得る。

【0339】

この配列は、本明細書では「ステムループ２」領域（ＳＬ２）とも呼ばれる。この配列は、ベクターゲノムのスプライスドナー領域中にステムループ構造を形成し得る。本発明の一局面において、この配列（ＳＬ２）は、本明細書に記載の本発明によるヌクレオチド配列から欠失され得る。

【0340】

したがって、本発明は、ＳＬ２を含まないヌクレオチド配列を包含する。本発明は、配列番号１０２による配列を含まないヌクレオチド配列を包含する。

【0341】

本発明の一局面において、主要スプライスドナー部位は、以下のコンセンサス配列を有し得、ここで、Ｒはプリンであり、「／」は切断部位である：
ＴＧ／ＧＴＲＡＧＴ（配列番号９６）
一局面において、Ｒはグアニン（Ｇ）であり得る。

【0342】

本発明の一局面において、主要スプライスドナーおよび潜在的スプライスドナー領域は、以下のコア配列を有し得、「／」は、主要スプライスドナーおよび潜在的スプライスドナー部位における切断部位である：
／ＧＴＧＡ／ＧＴＡ（配列番号１０６）。

【0343】

本発明の一局面において、ＭＳＤを変異されたベクターゲノムは、主要スプライスドナーおよび潜在的スプライスドナー「領域」（配列番号１０６）中に少なくとも２つの変異を有し得、第１および第２の「ＧＴ」ヌクレオチドは、それぞれ主要スプライスドナーおよび潜在的スプライスドナーヌクレオチドのすぐ３’にある。

【0344】

本発明の一局面において、主要スプライスドナーコンセンサス配列はＣＴＧＧＴ（配列番号９７）である。主要スプライスドナー部位は、配列ＣＴＧＧＴを含有し得る。

【0345】

一局面において、ヌクレオチド配列は、スプライス部位の不活性化の前に、配列番号９４、９６、９７、１０２、１０３および／または１０６のいずれかに記載の配列を含む。

【0346】

一局面において、ヌクレオチド配列は、不活性化されなければ配列番号９４のヌクレオチド１３および１４に対応するヌクレオチドの間に切断部位を有する不活性化された主要スプライスドナー部位を含む。

【0347】

本明細書に記載の本発明によれば、ヌクレオチド配列は、不活性な潜在的スプライスドナー部位も含有する。一局面において、ヌクレオチド配列は、主要スプライスドナー部位（の３’）に隣接する活性な潜在的スプライスドナー部位を含有しない、すなわち、隣接する潜在的スプライスドナー部位からスプライシングが生じず、潜在的スプライスドナー部位からのスプライシングが除去されている。

【0348】

「潜在的スプライスドナー部位」という用語は、通常はスプライスドナー部位として機能しない、または隣接配列の状況（例えば、近くの「好ましい」スプライスドナーの存在）のためにスプライスドナー部位としてより低い効率で利用されるが、隣接配列の変異（例えば、近くの「好ましい」スプライスドナーの変異）によってより効率的に機能するスプライスドナー部位になるように活性化され得る核酸配列を指す。

【0349】

一局面において、潜在的スプライスドナー部位は、主要スプライスドナーの３’の第１の潜在的スプライスドナー部位である。

【0350】

一局面において、潜在的スプライスドナー部位は、主要スプライスドナー部位の３’側に、主要スプライスドナー部位の６ヌクレオチド以内にある。好ましくは、潜在的スプライスドナー部位は、主要スプライスドナー切断部位の４または５、好ましくは４ヌクレオチド以内にある。

【0351】

本発明の一局面において、潜在的スプライスドナー部位は、コンセンサス配列ＴＧＡＧＴ（配列番号１０３）を有する。

【0352】

一局面において、ヌクレオチド配列は、不活性化されなければ配列番号９４のヌクレオチド１７および１８に対応するヌクレオチドの間に切断部位を有する不活性化された潜在的スプライスドナー部位を含む。

【0353】

本発明の一局面において、主要スプライスドナー部位および／または隣接する潜在的スプライスドナー部位は、「ＧＴ」モチーフを含有する。本発明の一局面において、主要スプライスドナー部位および隣接する潜在的スプライスドナー部位の両方が、変異されている「ＧＴ」モチーフを含有する。変異されたＧＴモチーフは、主要スプライスドナー部位および隣接する潜在的スプライスドナー部位の両方からのスプライス活性を不活性化し得る。このような変異の例は、本明細書では「ＭＳＤ－２ＫＯ」と呼ばれる。

【0354】

一局面において、スプライスドナー領域は、以下の配列：
ＣＡＧＡＣＡ（配列番号９８）
を含み得る。

【0355】

例えば、一局面において、変異されたスプライスドナー領域は、以下の配列：
ＧＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号９９）
を含み得る。

【0356】

不活性化変異のさらなる例は、本明細書では「ＭＳＤ－２ＫＯｖ２」と呼ばれる。

【0357】

一局面において、変異されたスプライスドナー領域は、以下の配列：
ＧＴＧＧＡＧＡＣＴ（配列番号１００）
を含み得る。

【0358】

例えば、一局面において、変異されたスプライスドナー領域は、以下の配列：
ＧＧＣＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＴＡＣＧＣＣ（配列番号１０１）
を含み得る。

【0359】

例えば、一局面において、変異されたスプライスドナー領域は、以下の配列：
ＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＣＣＴＴ（配列番号１０７）
を含み得る。

【0360】

一局面において、上記のステムループ２領域は、スプライスドナー領域から欠失され得、主要スプライスドナー部位および隣接する潜在的スプライスドナー部位の両方の不活性化をもたらす。このような欠失は、本明細書では「ΔＳＬ２」と呼ばれる。

【0361】

主要スプライスドナー部位および隣接する潜在的スプライスドナー部位を不活性化するために、様々な異なるタイプの変異を核酸配列中に導入することができる。

【0362】

一局面において、変異は、スプライス領域中のスプライシング活性を消失または抑制するための機能的変異である。本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号９４、９６、９７、１０２、１０３および／または１０６のいずれか中のヌクレオチドのいずれかに変異または欠失を含有し得る。

【0363】

適切な変異は当業者に公知であり、本明細書に記載されている。

【0364】

例えば、核酸配列中に点変異を導入することができる。本明細書で使用される「点変異」という用語は、単一のヌクレオチドへの任意の変化を指す。点変異には、例えば、欠失、トランジションおよびトランスバージョンが含まれ、タンパク質コード配列内に存在する場合、これらは、ナンセンス変異、ミスセンス変異、またはサイレント変異として分類することができる。「ナンセンス」変異は終止コドンを生成する。「ミスセンス」変異は、異なるアミノ酸をコードするコドンを生成する。「サイレント」変異は、タンパク質の機能を変化させない同一のアミノ酸または異なるアミノ酸のいずれかをコードするコドンを生成する。潜在的スプライスドナー部位を含む核酸配列中には、１つまたはそれより多くの点変異を導入することができる。例えば、潜在的スプライス部位を含む核酸配列は、その中に２つまたはそれより多くの点変異を導入することによって変異させることができる。

【0365】

スプライスドナー領域からのスプライシングの減衰を達成するために、主要スプライスドナーおよび潜在的スプライスドナー部位を含む核酸配列内のいくつかの位置に少なくとも２つの点変異を導入することができる。一局面において、変異は、スプライスドナー切断部位における４つのヌクレオチド内にあり得、カノニカルスプライスドナーコンセンサス配列では、これはＡ^１Ｇ^２／Ｇ^３Ｔ^４であり、「／」は切断部位である。特に、例えばｖＲＮＡパッケージング領域内の二次構造などの他の制約が同じ配列に課されるウイルスゲノムにおいて、スプライスドナー切断部位が、このコンセンサスから逸脱し得ることは当技術分野において周知である。Ｇ^３Ｔ^４ジヌクレオチドは、一般に、カノニカルスプライスドナーコンセンサス配列内の最も可変性が少ない配列であり、Ｇ^３およびまたはＴ^４への変異が最大の減衰効果を達成する可能性が最も高いことは周知である。例えば、ＨＩＶ－１ウイルスベクターゲノム中の主要スプライスドナー部位については、これはＴ^１Ｇ^２／Ｇ^３Ｔ^４であり得、「／」は切断部位である。例えば、ＨＩＶ－１ウイルスベクターゲノム中の潜在的スプライスドナー部位については、これはＧ^１Ａ^２／Ｇ^３Ｔ^４であり得、「／」は切断部位である。さらに、（１または複数の）点変異は、スプライスドナー部位に隣接して導入することができる。例えば、点変異は、スプライスドナー部位の上流または下流に導入することができる。主要スプライスドナー部位および／または潜在的スプライスドナー部位を含む核酸配列が、その中に複数の点変異を導入することによって変異される態様において、点変異は、潜在的スプライスドナー部位の上流および／または下流に導入することができる。

【0366】

スプライス部位変異体の構築
本発明において使用するためのスプライス部位変異体は、様々な技術を使用して構築され得る。例えば、天然配列の断片への連結を可能にする制限部位に隣接する、変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、変異は特定の遺伝子座に導入され得る。連結後、得られた再構築された配列は、所望のヌクレオチド挿入、置換または欠失を有する誘導体を含む。

【0367】

ＤＮＡ配列の変更を可能にする他の公知の技術には、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ、Ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅクローニングおよびＩｎ－ｆｕｓｉｏｎなどの組換えアプローチが含まれる。

【0368】

あるいは、必要とされる置換、欠失または挿入に従って変更された特定のコドンを有する変更された配列を提供するために、オリゴヌクレオチド指向部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発手順が使用され得る。スプライス部位変異体の欠失または切断誘導体は、所望の欠失に隣接する便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによっても構築され得る。

【0369】

制限に続いて、突出が埋められ、ＤＮＡが再連結され得る。

【0370】

上記の変更を行う例示的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）によって開示されている。

【0371】

スプライス部位変異体は、ＰＣＲ変異誘発、化学的変異誘発、強制的ヌクレオチド誤組み込みによる（例えば、Ｌｉａｏ ａｎｄ Ｗｉｓｅ，１９９０）、またはランダムに変異誘発されたオリゴヌクレオチドの使用による（Ｈｏｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８９）化学的変異誘発（Ｄｒｉｎｋｗａｔｅｒ ａｎｄ Ｋｌｉｎｅｄｉｎｓｔ，１９８６）の技術を利用しても構築され得る。

【0372】

本発明は、レンチウイルスベクターヌクレオチド配列を産生するための方法であって、
（ｉ）本明細書に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列を提供する工程；および
前記ヌクレオチド配列中の本明細書に記載の主要スプライスドナー部位および潜在的スプライスドナー部位を変異させる工程
を含む、方法も提供する。

【0373】

改変されたＵ１との組み合わせ
ＬＶ産生中および標的細胞中の両方で異常なスプライシング事象に関与する能力が低下しているため、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターは、遺伝子治療ベクターとして使用するために現在の標準的なレンチウイルスベクターよりも好ましい。しかしながら、本発明まで、ＭＳＤを変異されたベクターの産生は、ＨＩＶ－１ｔａｔタンパク質（第１および第２世代レンチウイルスベクター）の供給に依存してきた、または（第３世代ベクターでは）ＭＳＤを変異させることのベクターＲＮＡレベルに対する非安定化効果のために効率がより低かった。安全上の理由から、現在の第３世代ＬＶ系中にｔａｔを「再導入」することは望まれず、または正当化されず、その結果、現在のところ、臨床使用が意図されるＭＳＤを変異されたベクターの産生力価の低下に対する解決策は存在しない。

【0374】

本発明者らは、産生中にベクターゲノムＲＮＡの５’パッケージング領域に結合するように指示される改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの共発現によって、ＭＳＤを変異された第３世代（すなわち、ｔａｔ非依存性）ＬＶが高力価に産生され得ることを示す。驚くべきことに、これらの改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、５’Ｒ領域内の５’ポリＡシグナルの存在とは独立した様式で、ＭＳＤを変異されたＬＶの産生力価を増強できることが示され、ポリアデニル化を抑制するための改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの他者の使用（いわゆるＵ１干渉、［Ｕｉ］）を超える新規な機序を示している。驚くべきことに、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡをパッケージング領域の重要な配列に標的化すると、ＭＳＤを変異されたＬＶの力価の最大の増強が生じることが示される。本発明者らは、ＭＳＤを変異されたＬＶの力価の低下がより顕著でないような、および改変されたＵ１ｓｎＲＮＡによるこのようなＭＳＤを変異されたＬＶ変異型の力価の増強が最大であるような、主要スプライスドナー領域内の新規配列変異も開示する。

【0375】

本発明者らは、驚くべきことに、内在性配列（スプライスドナー部位）をもはや標的とせず、ｖＲＮＡ分子内の配列を現在標的とするように改変された、Ｕ１ｓｎＲＮＡをベースとする非コードＲＮＡを共発現させることによって、レンチウイルスベクターの出力力価を増強できることを見出した。実施例において実証されているように、本発明者らは、前記改変されたＵ１ｓｎＲＮＡによる、（主要スプライスドナーおよび潜在的スプライスドナー部位を含有する）主要スプライスドナー領域内に減衰変異を保有するレンチウイルスベクターの出力力価の相対的増強が、変異されていない主要スプライスドナー領域を含有する標準レンチウイルスベクターより大きいことを示す。

【0376】

実施例において実証されているように、主要スプライスドナー領域内の低下した力価をもたらす幅広い範囲の変異型（点変異、領域欠失および配列置き換え）を有するベクターゲノムが、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡと組み合わせて使用され得る。このアプローチは、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡをベクター産生中に他のベクター成分とともに共発現させることを含み得る。改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、ベクターゲノムｖＲＮＡ内の標的配列に相補的な異種配列で置き換えることによって、コンセンサススプライスドナー部位への結合が除去されるように設計される。本発明は、標的配列および相補性長、設計および発現の様式を含む、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの様々な適用の様式および最適な特徴を記載する。

【0377】

本明細書に記載されている本発明の一局面において、ベクターは改変されたＵ１ｓｎＲＮＡと組み合わせて使用され得る。これは、以下でさらに論述されている。

【0378】

スプライシングおよびポリアデニル化は、特に大部分のタンパク質をコードする転写物が複数のイントロンを含有する高等真核生物において、ｍＲＮＡ成熟のための重要な過程である。スプライシングのために必要とされるプレｍＲＮＡ内の要素には、５’スプライスドナーシグナル、分岐点を取り囲む配列および３’スプライスアクセプタシグナルが含まれる。これらの３つの要素と相互作用するのはスプライソソームであり、Ｕ１ｓｎＲＮＡを含む５つの核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）および関連する核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）によって形成される。Ｕ１ｓｎＲＮＡはポリメラーゼＩＩプロモーターによって発現され、ほとんどの真核細胞中に存在する（Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：２０１３－２０２１）。ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）は１６４ｎｔ長であり、４つのステムループからなる明確に定義された構造を有する（Ｗｅｓｔ，Ｓ．，２０１２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，４０：８４６－８４９）。Ｕ１ｓｎＲＮＡは、その５’末端に、エクソン－イントロン接合部の５’スプライスドナー部位に広く相補的な短い配列を含有する。Ｕ１ｓｎＲＮＡは、５’スプライスドナー部位への塩基対形成によって、スプライス部位選択およびスプライソソームアセンブリに関与する。スプライシング以外のＵ１ｓｎＲＮＡの公知の機能は、３’末端ｍＲＮＡプロセシングの調節にあり、初期ポリＡシグナルでの未熟なポリアデニル化（ポリＡ）を抑制する。

【0379】

ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）は１６４ｎｔ長であり、４つのステムループからなる明確に定義された構造を有する（図１参照）。内因性非コードＲＮＡであるＵ１ｓｎＲＮＡは、イントロンスプライシングの初期段階中に、天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば、５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）を介してコンセンサス５’スプライスドナー部位（例えば、５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’、ここで、ＭはＡまたはＣであり、ＲはＡまたはＧである）に結合する。ステムループＩは、ポリＡ抑制のために重要であることが示されているＵ１Ａ－７０Ｋタンパク質に結合する。ステムループＩＩはＵ１Ａタンパク質に結合し、５’－ＡＵＵＵＧＵＧＧ－３’配列は、ステムループＩＶとともにＵ１ｓｎＲＮＡプロセシングのために重要であるＳｍタンパク質に結合する。本明細書で定義されるように、本発明に従って使用するための改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、天然のスプライスドナー標的化／アニーリング配列の部位においてベクターゲノムｖＲＮＡ分子内の標的配列に相補的な異種配列を導入するように改変されている（図１参照）。

【0380】

本明細書で使用される場合、「改変されたＵ１ｓｎＲＮＡ」、「再指示されたＵ１ｓｎＲＮＡ」、「再標的化されたＵ１ｓｎＲＮＡ」、「再目的化されたＵ１ｓｎＲＮＡ」および「変異体Ｕ１ｓｎＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子のスプライシング過程を開始するために使用されるコンセンサス５’スプライスドナー部位配列（例えば、５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’）にもはや相補的でないように改変されたＵ１ｓｎＲＮＡを意味する。したがって、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、スプライスドナー部位配列（例えば、５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’）にもはや相補的でないように改変されたＵ１ｓｎＲＮＡである。代わりに、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域内に固有のＲＮＡ配列（標的部位）を有するヌクレオチド配列、すなわちｖＲＮＡのスプライシングと無関係な配列を標的とするまたはこれに相補的であるように設計される。ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、予め選択することができる。したがって、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、その５’末端がＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的であるように改変されたＵ１ｓｎＲＮＡである。その結果、理論に拘束されることを望むものではないが、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの５’末端の短い配列との標的部位配列の相補性に基づいて標的部位配列に結合し、これにより、ｖＲＮＡを安定化させてＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターの増加した出力ベクター力価をもたらすと考えられる。

【0381】

本明細書で使用される場合、「天然スプライスドナーアニーリング配列」および「天然スプライスドナーターゲティング配列」という用語は、イントロンのコンセンサス５’スプライスドナー部位に広く相補的である内因性Ｕ１ｓｎＲＮＡの５’末端の短い配列を意味する。天然スプライスドナーアニーリング配列は、５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’であり得る。

【0382】

本明細書で使用される場合、「コンセンサス５’スプライスドナー部位」という用語は、例えば配列５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’を有する、スプライス部位選択において使用されるイントロンの５’末端のコンセンサスＲＮＡ配列を意味する。

【0383】

本明細書で使用される場合、「ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列」、「標的配列」および「標的部位」という用語は、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡを結合／アニーリングするための標的部位として予め選択された、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域内に特定のＲＮＡ配列を有する部位を意味する。

【0384】

本明細書で使用される場合、「ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域」および「ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域」という用語は、５’Ｕ５ドメインの先頭からｇａｇ遺伝子に由来する配列の末端までのＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムの５’末端の領域を意味する。したがって、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域は、５’Ｕ５ドメイン、ＰＢＳエレメント、ステムループ（ＳＬ）１エレメント、ＳＬ２エレメント、ＳＬ３ψエレメント、ＳＬ４エレメントおよびｇａｇ遺伝子に由来する配列を含む。複製欠損ウイルスベクター粒子の産生を可能にするために、レンチウイルスベクター産生中に完全なｇａｇ遺伝子をゲノムにトランスで与えることは当技術分野において一般的である。トランスで与えられるｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列は、野生型ヌクレオチドによってコードされる必要はなく、コドン最適化され得る；重要なことは、トランスで与えられるｇａｇ遺伝子の主な属性は、ｇａｇおよびｇａｇｐｏｌタンパク質をコードし、その発現を指示することである。したがって、レンチウイルスベクター産生中に完全なｇａｇ遺伝子がトランスで与えられる場合、「レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域」という用語は、５’Ｕ５ドメインの先頭からＳＬ３ψエレメントの「コア」パッケージングシグナルまでのＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノム分子の５’末端の領域、およびＡＴＧコドン（ＳＬ４内に存在する）からベクターゲノム上に存在する残りのｇａｇヌクレオチド配列の末端までの天然のｇａｇヌクレオチド配列を意味し得ることが当業者によって理解されよう。

【0385】

本明細書で使用される場合、「ｇａｇ遺伝子に由来する配列」という用語は、ベクターゲノム中に存在し得る、例えば残存し得る、ＡＴＧコドンからヌクレオチド６８８に由来するｇａｇ遺伝子の任意の天然の配列を意味する（Ｋｈａｒｙｔｏｎｃｈｙｋ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，２０１８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４３０：２０６６－７９）。

【0386】

本明細書で使用される場合、「天然スプライスドナーアニーリング配列を包含するＵ１ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチド内に異種配列を導入すること」、「３～１１位の９つのヌクレオチド内に前記異種配列を導入すること」および「Ｕ１ｓｎＲＮＡの５’末端の最初の１１ヌクレオチド内に異種配列を導入すること」という用語は、Ｕ１ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチドもしくは３～１１位の９つのヌクレオチドの全部もしくは一部を前記異種配列で置き換えること、または前記異種配列と同じ配列を有するようにＵ１ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチドもしくは３～１１位の９つのヌクレオチドを改変することを含む。

【0387】

本明細書で使用される場合、「天然スプライスドナーアニーリング配列内に異種配列を導入すること」および「Ｕ１ｓｎＲＮＡの５’末端の天然スプライスドナーアニーリング配列内に異種配列を導入すること」という用語は、天然スプライスドナーアニーリング配列の全部もしくは一部を前記異種配列で置き換えること、または前記異種配列と同じ配列を有するように天然スプライスドナーアニーリング配列を改変することを含む。

【0388】

本明細書で使用される場合、「レンチウイルスベクター力価を増強する」という用語は、「レンチウイルスベクター力価を増加させる」、「レンチウイルスベクター力価を回復させる」および「レンチウイルスベクター力価を改善する」を含む。

【0389】

したがって、一態様において、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に結合するように改変されている。

【0390】

いくつかの態様において、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列を導入するために、内因性Ｕ１ｓｎＲＮＡと比較して５’末端において改変される。

【0391】

いくつかの態様において、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列を天然スプライスドナーアニーリング配列内に導入するために、内因性Ｕ１ｓｎＲＮＡと比較して５’末端において改変される。

【0392】

改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、天然スプライスドナーアニーリング配列を包含する配列を前記ヌクレオチド配列に相補的な異種配列で置き換えるために、内因性Ｕ１ｓｎＲＮＡと比較して５’末端において改変され得る。

【0393】

改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡ変異型であり得る。本発明に従って改変されるＵ１ｓｎＲＮＡ変異型は、天然に存在するＵ１ｓｎＲＮＡ変異型、Ｕ１－７０Ｋタンパク質結合を除去するステムループＩ領域内の変異を含有するＵ１ｓｎＲＮＡ変異型、またはＵ１Ａタンパク質結合を除去するステムループＩＩ領域内の変異を含有するＵ１ｓｎＲＮＡ変異型であり得る。Ｕ１－７０Ｋタンパク質結合を除去するステムループＩ領域内の変異を含有するＵ１ｓｎＲＮＡ変異型は、Ｕ１＿ｍ１またはＵ１＿ｍ２、好ましくはＵ１Ａ＿ｍ１またはＵ１Ａ＿ｍ２であり得る。

【0394】

いくつかの態様において、本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、本明細書に記載のＵ１＿２５６配列の主要なＵ１ｓｎＲＮＡ配列［クローバー葉］（ｎｔ４１０～５６２）と少なくとも７０％の同一性（適切な少なくとも７５％、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本発明の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、本明細書に記載のＵ１＿２５６配列の主要なＵ１ｓｎＲＮＡ配列［クローバー葉］（ｎｔ４１０～５６２）を含む。Ｕ１＿２５６配列の主要なＵ１ｓｎＲＮＡ配列［クローバー葉］（ｎｔ４１０～５６２）は以下のとおりである。

【0395】

ＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＴＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＧＣＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＣＴＧＣＧＴＴＣＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＴＧ．（配列番号１３１）
いくつかの好ましい態様において、天然スプライスドナーアニーリング配列を包含するＵ１ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチドは、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列で全部または一部置き換えられ得る。適切には、Ｕ１ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチドの１～１１（適切には、２～１１、３～１１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１）核酸が、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列で置き換えられる。

【0396】

いくつかの態様において、天然スプライスドナーアニーリング配列は、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列で全部または一部置き換えられ得る。適切には、天然スプライスドナーアニーリング配列の１～１１（適切には、２～１１、３～１１、５～１１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１）核酸が、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列で置き換えられる。好ましい態様において、天然スプライスドナーアニーリング配列全体が、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列で置き換えられる、すなわち、天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）は、本明細書に記載の異種配列で完全に置き換えられる。

【0397】

いくつかの態様において、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列は、前記ヌクレオチド配列に対して相補性の少なくとも７つのヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列は、前記ヌクレオチド配列に対して相補性の少なくとも９つのヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明で使用するための異種配列は、前記ヌクレオチド配列に対して相補性の１５のヌクレオチドを含む。

【0398】

適切には、本発明において使用するための異種配列は、７～２５（適切には、７～２０、７～１５、９～１５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５）のヌクレオチドを含み得る。

【0399】

適切には、本発明において使用するための異種配列は、２５のヌクレオチドを含み得る。

【0400】

いくつかの態様において、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、５’Ｕ５ドメイン、ＰＢＳエレメント、ＳＬ１エレメント、ＳＬ２エレメント、ＳＬ３ψエレメント、ＳＬ４エレメントおよび／またはｇａｇ遺伝子に由来する配列内に位置する。適切には、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、ＳＬ１、ＳＬ２および／またはＳＬ３ψエレメント内に位置する。いくつかの好ましい態様において、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、ＳＬ１および／またはＳＬ２エレメント内に位置する。いくつかの特に好ましい態様において、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、ＳＬ１エレメント内に位置する。

【0401】

いくつかの態様において、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、少なくとも７つのヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、少なくとも９つのヌクレオチドを含む。適切には、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、７～２５（適切には、７～２０、７～１５、９～１５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５）ヌクレオチドを含む。

【0402】

好ましくは、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１５のヌクレオチドを含む。

【0403】

ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列への本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの結合は、本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの非存在下でのレンチウイルスベクター産生と比較して、レンチウイルスベクター産生中のレンチウイルスベクター力価を増強し得る。したがって、本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの存在下でのレンチウイルスベクターの産生は、本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの非存在下でのレンチウイルスベクター産生と比較してレンチウイルスベクター力価を増強する。レンチウイルスベクター力価の測定のための適切なアッセイは、本明細書に記載のとおりである。適切には、レンチウイルスベクターの産生は、前記改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖおよびレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを含むベクター成分との同時発現を含む。レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムは、ＭＳＤ－２ＫＯＲＮＡゲノムであり得る。いくつかの態様において、レンチウイルスベクター力価の増強は、機能的５’ＬＴＲポリＡ部位の存在下または非存在下において起こる。いくつかの態様において、本発明の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡによって媒介されるレンチウイルスベクター力価の増強は、ベクターゲノムの５’ＬＴＲにおけるポリＡ部位抑制から独立している。

【0404】

いくつかの態様において、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列への本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの結合は、本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの非存在下でのレンチウイルスベクター産生と比較して、レンチウイルスベクター産生中のレンチウイルスベクター力価を少なくとも３０％増加し得る。適切には、ＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列への本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの結合は、本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡの非存在下でのＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクター産生と比較して、産生中のＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクター力価を少なくとも３５％（適切には、少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、１，０００％、２，０００％、５，０００％、または１０，０００％）増加させ得る。

【0405】

本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、（ａ）改変されたＵ１ｓｎＲＮＡを結合するためのＭＳＤを変異されたレンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内の標的部位（予め選択されたヌクレオチド部位）を選択すること、および（ｂ）Ｕ１ｓｎＲＮＡの５’末端の天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）内に、工程（ａ）において選択された予め選択されたヌクレオチド部位に相補的な異種配列を導入することによって設計され得る。

【0406】

分子生物学における従来の技術を使用して、内因性Ｕ１ｓｎＲＮＡの５’末端の天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）内にまたはそれに代えて標的部位に相補的な異種配列を導入することは、当業者の能力の範囲内である。一般的に言えば、適切な日常的方法には、特異的変異誘発または相同組換えによる置換が含まれる。

【0407】

分子生物学における従来の技術を使用して、標的部位に相補的な異種配列と同じ配列を有するように内因性Ｕ１ｓｎＲＮＡの５’末端の天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）を改変することは、当業者の能力の範囲内である。例えば、適切な方法には、特異的変異誘発またはランダム変異誘発とそれに続く本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡを与える変異の選択が含まれる。

【0408】

本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、当技術分野で一般的に公知の方法に従って製造することができる。例えば、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡは、化学合成または組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術によって製造することができる。

【0409】

一局面において、改変されたＵ１ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、異なるヌクレオチド配列上、例えば異なるプラスミド上に存在し得る。

【0410】

従来の分子および細胞生物学技術を使用して、本明細書に記載の改変されたＵ１ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を細胞中に導入することは、当業者の能力の範囲内である。

【0411】

ベクター
本発明の別の局面は、本発明の核酸配列を含むウイルスベクターに関する。

【0412】

ベクターは、ある環境から別の環境への実体の移動を可能にする、または容易にするツールである。本発明によれば、例として、組換え核酸技術において使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（例えば、異種ｃＤＮＡセグメントなどの異種ＤＮＡセグメント）などの実体を標的細胞中に導入することを可能にする。ベクターは、細胞内で異種核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を維持するという目的、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのセグメントを含むベクターの複製もしくは核酸のセグメントによってコードされるタンパク質の発現を促進するという目的を果たし得る。

【0413】

本発明のベクターは、例えば、複製起点とともに提供され、前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよびプロモーターの調節因子とともに提供されてもよいウイルスベクターであり得る。ベクターは、１つまたはそれより多くの選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）および／または追跡可能なマーカー遺伝子（例えば、ＧＦＰをコードする遺伝子）を含有し得る。ベクターは、例えば、標的細胞を感染および／または形質導入するために使用され得る。

【0414】

本発明のベクターは、インビトロで適合性のある標的細胞中でＮＯＩを複製するために使用され得る。したがって、本発明は、本発明のベクターを適合性のある標的細胞中にインビトロで導入すること、およびＮＯＩの発現をもたらす条件下で標的細胞を増殖させることによってインビトロでタンパク質を作製する方法を提供する。タンパク質は、当技術分野において周知の方法によって標的細胞から回収され得る。適切な標的細胞には、哺乳動物細胞株および他の真核細胞株が含まれる。

【0415】

ベクターは発現ベクターであり得る。本明細書に記載の発現ベクターは、転写され得る配列を含有する核酸の領域を含む。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡをコードする配列は、この定義内に含まれる。好ましくは、発現ベクターは、標的細胞によるコード配列の発現を提供することができる制御配列に機能的に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む。

【0416】

ウイルスベクター
本発明の一態様において、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、ベクター、ベクタービリオンまたはベクター粒子とも呼ばれ得る。

【0417】

一態様において、ウイルスベクターは、本明細書に記載のウイルスベクター産生系によって産生される。

【0418】

一態様において、ウイルスベクターは、１つより多くのＮＯＩを含み、少なくとも１つのＮＯＩは、本明細書に記載のｔｂｓまたはその一部に機能的に連結されている。

【0419】

別の態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスに由来する。

【0420】

本発明の抑制系は、任意のウイルスベクター系に対して有益であることが予想される。この系は、関心対象のヌクレオチドが、例えばウイルスベクター産生細胞に対してまたはビリオン集合の間に有害な作用を引き起こす特定の用途を見出すであろう。

【0421】

別の態様において、レトロウイルスは泡沫状ウイルスに由来する。

【0422】

別の態様において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスに由来する。

【0423】

別の態様において、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する。

【0424】

ベクター力価
当業者は、ウイルスベクターの力価を決定するいくつかの異なる方法が存在することを理解するであろう。力価は、しばしば、形質導入単位／ｍＬ（ＴＵ／ｍＬ）として記載される。力価は、感染性粒子の数を増加させることによって、およびベクター調製物の比活性を増加させることによって増加させ得る。

【0425】

レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター
本発明のレトロウイルスベクターは、任意の適切なレトロウイルスに由来し得る、または任意の適切なレトロウイルスから誘導可能であり得る。多数の異なるレトロウイルスが同定されている。例としては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤浪肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ－ＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭＬＶ）、トリ骨髄細胞腫症ウイルス－２９（ＭＣ２９）およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）が挙げられる。レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）’’Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ’’，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８－７６３に見出すことができる。

【0426】

レトロウイルスは、２つのカテゴリー、すなわち「単純」および「複合」に大別され得る。レトロウイルスはさらに７つの群に分けられ得る。これらの群のうちの５つは、発癌能を有するレトロウイルスに相当する。残りの２つの群は、レンチウイルスおよびスプーマウイルスである。これらのレトロウイルスの総説は、Ｃｏｆｆｉｎら（１９９７）同書に提示されている。

【0427】

レトロウイルスおよびレンチウイルスのゲノムの基本構造は、ゲノムをパッケージングすることを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、標的細胞ゲノム中への組み込みを可能にする組み込み部位、ならびにパッケージング成分をコードするｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子－これらはウイルス粒子の集合に必要とされるポリペプチドである、がその間またはその中に位置する５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲなどの多くの共通の特徴を共有する。レンチウイルスは、ＨＩＶにおけるｒｅｖ遺伝子およびＲＲＥ配列など、感染した標的細胞の核から細胞質への組み込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写物の効率的な搬出を可能にするさらなる特徴を有する。

【0428】

プロウイルスでは、これらの遺伝子は、両端において、末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域によって隣接されている。ＬＴＲは、プロウイルスの組み込みおよび転写を担う。ＬＴＲはエンハンサー－プロモーター配列としても機能し、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。

【0429】

ＬＴＲ自体は、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる３つの要素に分けることができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。ＲはＲＮＡの両端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。３つの要素のサイズは、異なるレトロウイルス間でかなり異なり得る。

【0430】

本発明の典型的なレトロウイルスベクターでは、複製のために必須の１つまたはそれより多くのタンパク質コード領域の少なくとも一部がウイルスから除去され得る。例えば、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖは存在しなくてもよく、または機能しなくてもよい。これにより、ウイルスベクターが複製欠損となる。

【0431】

標的非分裂細胞を形質導入することができる、および／またはそのゲノムを宿主ゲノム中に組み込むことができる本明細書に記載の候補核酸結合配列を含むベクターを作製するために、ウイルスゲノムの一部はまた、ベクターゲノム内の調節制御領域およびレポーター遺伝子に機能的に連結された本明細書に記載の候補核酸結合配列をコードするライブラリーによって置き換えられ得る。

【0432】

レンチウイルスは、レトロウイルスというより大きな群の一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）’’Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ’’，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８－７６３）に見出すことができる。手短に言えば、レンチウイルスは、霊長類群と非霊長類群に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例には、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらに限定されない。非霊長類レンチウイルス群には、原型「遅発性ウイルス」であるビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）の他に、関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。

【0433】

レンチウイルス科は、レンチウイルスが分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力を有するという点でレトロウイルスとは異なる（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ１１（８）：３０５３－３０５８およびＬｅｗｉｓ ａｎｄ Ｅｍｅｒｍａｎ（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（１）：５１０－５１６）。対照的に、ＭＬＶなどの他のレトロウイルスは、例えば筋肉、脳、肺および肝臓組織を構成する細胞などの非分裂細胞またはゆっくりと分裂する細胞に感染することができない。

【0434】

レンチウイルスベクターは、本明細書で使用される場合、レンチウイルスから誘導可能な少なくとも１つの成分部分を含むベクターである。好ましくは、その成分部分は、ベクターが細胞に感染する、遺伝子を発現する、または複製される生物学的機構に関与する。

【0435】

レンチウイルスベクターは、霊長類レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１）または非霊長類レンチウイルスのいずれかに由来し得る。

【0436】

非霊長類レンチウイルスの例は、霊長類に自然に感染しないレンチウイルス科の任意のメンバーであり得、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を含み得る。

【0437】

一般的に言えば、典型的なレトロウイルスベクター産生系は、必須のウイルスパッケージング機能からのウイルスゲノムの分離を含む。これらの成分は、典型的には、別個のＤＮＡ発現カセット（あるいは、プラスミド、発現プラスミド、ＤＮＡ構築物または発現構築物として知られる）上で産生細胞に提供される。

【0438】

ベクターゲノムは、ＮＯＩを含む。ベクターゲノムは、典型的には、パッケージングシグナル（ψ）、中央ポリプリン鎖（ｃｐｐｔ）、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）ＮＯＩを有する内部発現カセットを必要とし、転写後エレメント（ＰＲＥ）、典型的には中央ポリプリン鎖（ｃｐｐｔ）、３’－ｐｐｕおよび自己不活型（ＳＩＮ）ＬＴＲを必要とすることがある。Ｒ－Ｕ５領域は、ベクターゲノムＲＮＡおよびＮＯＩｍＲＮＡの両方の正しいポリアデニル化、ならびに逆転写の過程に必要とされる。ベクターゲノムは、国際公開第２００３／０６４６６５号に記載されているように、オープンリーディングフレームを含んでもよい。

【0439】

一局面において、ヌクレオチド配列は、ベクター産生のためのｔａｔ非依存性の系におけるレンチウイルスベクターでの使用に適し得る。本明細書に記載されるように、第３世代レンチウイルスベクターは、ｔａｔ非依存性であり、本発明によるヌクレオチド配列は、第３世代レンチウイルスベクターの状況において使用され得る。本発明の一局面において、ｔａｔはレンチウイルスベクター産生系に提供されず、例えば、ｔａｔはトランスで提供されない。一局面において、本明細書に記載の細胞またはベクターまたはベクター産生系は、ｔａｔタンパク質を含まない。

【0440】

パッケージング機能には、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子が含まれる。これらは、産生細胞によるベクター粒子の産生のために必要とされる。これらの機能をゲノムにトランスで提供することにより、複製欠損ウイルスの産生が容易になる。

【0441】

ガンマレトロウイルスベクターのための産生系は、典型的には、ゲノム、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ発現構築物を必要とする３成分系である。ＨＩＶ－１をベースとするレンチウイルスベクターのための産生系は、さらに、アクセサリー遺伝子ｒｅｖがトランスで提供されること、ベクターゲノムがｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）を含むことを必要とする。ＥＩＡＶをベースとするレンチウイルスベクターは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する場合、ｒｅｖを必要としない（国際公開第２００３／０６４６６５号参照）。

【0442】

通常、ベクターゲノムカセット内にコードされる「外部」プロモーター（ベクターゲノムカセットを駆動する）および「内部」プロモーター（ＮＯＩカセットを駆動する）はいずれも、他のベクター系成分を駆動するプロモーターと同様に、強力な真核生物またはウイルスプロモーターである。このようなプロモーターの例としては、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０およびユビキチンプロモーターが挙げられる。ＤＮＡライブラリーによって生成されるもの（例えば、ＪｅＴプロモーター）などの強力な「合成」プロモーターも、転写を駆動するために使用され得る。あるいは、転写を駆動するために、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、錐体桿体ホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、神経特異的神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、星状膠細胞特異的グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、エンドグリンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、デスミンプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ１４プロモーターおよびＢ２９プロモーターなどの組織特異的プロモーターが使用され得る。

【0443】

レトロウイルスベクターの産生は、これらのＤＮＡ成分による産生細胞の一過性形質移入、または成分が産生細胞ゲノム内に組み込まれている安定なプロデューサ細胞株（ＰＣＬ）の使用のいずれかを含む（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｈ．Ｊ．，Ｍ．Ａ．Ｌｅｒｏｕｘ－Ｃａｒｌｕｃｃｉ，Ｃ．Ｊ．Ｓｉｏｎ，Ｋ．Ａ．ＭｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓおよびＰ．Ａ．Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６（６）：８０５－８１４ Ｅｐｕｂ ２００９ Ｍａｒ ２００５）。別のアプローチは、（その中にパッケージング成分が安定に組み込まれている）安定なパッケージング細胞を使用し、次いで必要に応じてベクターゲノムプラスミドに一過性に形質移入することである。本発明のウイルスベクターを作製するために、産生細胞はＴＲＡＰを発現することができなければならない。したがって、本発明の一態様において、産生細胞はＴＲＡＰ構築物を安定に発現するであろう。本発明の別の態様において、産生細胞はＴＲＡＰ構築物を一過性に発現する。本発明の別の態様において、産生細胞は、ＴＲＡＰ構築物を安定に発現し、また、ＴＲＡＰ構築物を一過性に発現する。

【0444】

ＴＲＩＰ系は主にレトロウイルスベクターを産生することに関して記載されているが、類似の戦略を他のウイルスベクターに適用することができることに留意されたい。

【0445】

本発明の一態様において、ウイルスベクターはＥＩＡＶに由来する。ＥＩＡＶは、レンチウイルスの最も単純なゲノム構造を有し、本発明での使用に特に好ましい。ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子に加えて、ＥＩＡＶは３つの他の遺伝子：ｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２をコードする。ｔａｔはウイルスＬＴＲの転写活性化因子として作用し（Ｄｅｒｓｅ ａｎｄ Ｎｅｗｂｏｌｄ（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４（２）：５３０－５３６およびＭａｕｒｙ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００（２）：６３２－６４２）、ｒｅｖはｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を介してウイルス遺伝子の発現を調節し、調和させる（Ｍａｒｔａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２－３１１１）。これらの２つのタンパク質の作用機序は、霊長類ウイルスにおける類似の機序と広く類似していると考えられている（Ｍａｒｔａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２－３１１１）。Ｓ２の機能は未知である。さらに、膜貫通タンパク質の初めにｅｎｖコード配列へとスプライシングされるｔａｔの第１のエクソンによってコードされるＥＩＡＶタンパク質、Ｔｔｍが同定されている。本発明の代替の態様において、ウイルスベクターはＨＩＶに由来する：ＨＩＶは、Ｓ２をコードしない点でＥＩＡＶとは異なるが、ＥＩＡＶとは異なって、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆをコードする。

【0446】

「組換えレトロウイルスまたはレンチウイルスベクター」（ＲＲＶ）という用語は、パッケージング成分の存在下で、標的細胞に感染することができるウイルス粒子中へのＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なレトロウイルス遺伝情報を有するベクターを指す。標的細胞の感染には、逆転写および標的細胞ゲノム中への組み込みが含まれ得る。ＲＲＶは、ベクターによって標的細胞に送達されるべき非ウイルスコード配列を担持する。ＲＲＶは、標的細胞内で感染性レトロウイルス粒子を産生するために独立した複製をすることができない。通常、ＲＲＶは、機能的ｇａｇ／ｐｏｌおよび／もしくはｅｎｖ遺伝子、ならびに／または複製のために必須の他の遺伝子を欠如する。

【0447】

好ましくは、本発明のＲＲＶベクターは、最小ウイルスゲノムを有する。

【0448】

本明細書で使用される場合、「最小ウイルスゲノム」という用語は、関心対象のヌクレオチド配列を標的細胞に感染させ、形質導入し、送達するために必要とされる機能を付与するのに必須の要素を保持しながら、非必須要素を除去するようにウイルスベクターが操作されていることを意味する。この戦略のさらなる詳細は、国際公開第１９９８／１７８１５号および国際公開第９９／３２６４６号に見出すことができる。最小のＥＩＡＶベクターは、ｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２遺伝子を欠き、これらの遺伝子のいずれもが、産生系においてトランスで提供されない。最小ＨＩＶベクターは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔおよびｎｅｆを欠く。

【0449】

しかしながら、産生細胞内でベクターゲノムを産生するために使用される発現プラスミドは、産生細胞／パッケージング細胞中でのゲノムの転写を指示するためにレトロウイルスゲノムに機能的に連結された転写調節制御配列を含むであろう。これらの調節配列は、転写されるレトロウイルス配列に付随する天然の配列、すなわち５’Ｕ３領域であり得、または後述するように、別のウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターなどの異種プロモーターであり得る。いくつかのレンチウイルスベクターゲノムは、効率的なウイルス産生のために追加の配列を必要とする。例えば、特にＨＩＶの場合、ＲＲＥ配列が含まれ得る。しかしながら、ＲＲＥの必要性（およびトランスで提供されるｒｅｖへの依存性）は、コドン最適化によって低減または除去され得る。この戦略のさらなる詳細は、国際公開第２００１／７９５１８号に見出すことができる。ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同じ機能を果たす別の配列も公知である。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的類似体は、マソン・ファイザー・サルウイルス中に見出される。これは恒常的輸送エレメント（ＣＴＥ）として知られており、感染した細胞中の因子と相互作用すると考えられるゲノム中のＲＲＥ型配列を含む。細胞因子は、ｒｅｖ類似体と考えることができる。したがって、ＣＴＥは、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の代替として使用され得る。公知であるまたは利用可能になる任意の他の機能的等価物が本発明に適切であり得る。例えば、ＨＴＬＶ－ＩのＲｅｘタンパク質がＨＩＶ－１のＲｅｖタンパク質を機能的に置き換えることができることも公知である。ｒｅｖおよびＲＲＥは、本発明の方法において使用するためのベクター中に存在しなくてもよく、または非機能的であってもよく、代替的なｒｅｖおよびＲＲＥ、または機能的に等価な系が存在し得る。

【0450】

ＳＩＮベクター
本発明の方法において使用するためのベクターは、好ましくは、ウイルスエンハンサーおよびプロモーター配列が欠失されている自己不活型（ＳＩＮ）構成において使用される。ＳＩＮベクターを作製し、野生型ベクターと同様の有効性で、インビボ、エクスビボまたはインビトロで非分裂標的細胞に形質導入することができる。ＳＩＮプロウイルス中の末端反復配列（ＬＴＲ）の転写の不活性化は、ｖＲＮＡの動員を防止するはずであり、複製能を有するウイルスの形成の可能性をさらに低下させる特徴である。これは、ＬＴＲの一切のシス作用効果を排除することによって、内部プロモーターからの遺伝子の調節された発現も可能にするはずである。

【0451】

例として、自己不活型レトロウイルスベクター系は、３’ＬＴＲのＵ３領域内の転写エンハンサーまたはエンハンサーおよびプロモーターを欠失させることによって構築されてきた。一連のベクター逆転写および組み込みの後、これらの変化は、５’および３’ＬＴＲの両方中に複製され、転写的に不活性な「プロウイルス」を産生する。しかしながら、このようなベクター中のＬＴＲの内部の（１つまたは複数の）任意のプロモーターは依然として転写的に活性である。この戦略は、内部に配置された遺伝子からの転写に対するウイルスＬＴＲ中のエンハンサーおよびプロモーターの影響を排除するために使用されてきた。このような効果には、増加された転写または転写の抑制が含まれる。この戦略は、３’ＬＴＲからゲノムＤＮＡ中への下流転写を排除するためにも使用され得る。これは、一切の内因性癌遺伝子の偶発的活性化を防ぐことが重要であるヒト遺伝子治療において特に懸念される。Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：３１９４－９８；Ｍａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７２：８８５－７；Ｎａｖｉａｕｘ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１－５；Ｉｗａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｖｉｒｏｌ．２６１：１２０－３２；Ｄｅｇｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１７９－９０。ＳＩＮレンチウイルスベクターは、米国特許第６，９２４，１２３号および米国特許第７，０５６，６９９号に記載されている。

【0452】

非複製レンチウイルスベクター
複製欠損レンチウイルスベクターのゲノムにおいて、ｇａｇ／ｐｏｌおよび／またはｅｎｖの配列は、変異され得、非存在であり得、および／または非機能的であり得る。

【0453】

本発明の典型的なレンチウイルスベクターにおいては、ウイルス複製のために必須のタンパク質の１つまたはそれより多くのコード領域の少なくとも一部がベクターから除去され得る。これにより、ウイルスベクターが複製欠損となる。非分裂標的細胞を形質導入することができる、および／またはそのゲノムを標的細胞ゲノム中に組み込むことができるＮＯＩを含むベクターを作製するために、ウイルスゲノムの一部は関心対象のヌクレオチド（ＮＯＩ）によって置き換えることもできる。

【0454】

一態様において、レンチウイルスベクターは、国際公開第２００６／０１０８３４号および国際公開第２００７／０７１９９４号に記載されているような非組込み型ベクターである。

【0455】

さらなる態様において、ベクターは、ウイルスＲＮＡを欠くまたは欠如する配列を送達する能力を有する。さらなる態様において、送達されるべきＲＮＡのパッケージングを確実にするために、送達されるべきＲＮＡ上に位置する異種結合ドメイン（ｇａｇに対して異種）およびＧａｇまたはＧａｇＰｏｌ上の同族結合ドメインを使用することができる。これらのベクターはいずれも、国際公開第２００７／０７２０５６号に記載されている。

【0456】

アデノウイルスベクター
本発明の別の態様において、ベクターはアデノウイルスベクターであり得る。アデノウイルスは、ＲＮＡ中間体を介して複製しない二本鎖の直鎖ＤＮＡウイルスである。それらの遺伝子配列に基づいて６つのサブグループに分けられる、アデノウイルスの５０を超える異なるヒト血清型が存在する。

【0457】

アデノウイルスは、ヒトおよび非ヒト起源の幅広い範囲の細胞型のインビボ、エクスビボおよびインビトロでの形質導入が可能な、エンベロープを有さない二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらの細胞には、気道上皮細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、滑膜細胞、初代乳腺上皮細胞および神経細胞などの有糸分裂後に最終分化した細胞が含まれる。

【0458】

アデノウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入することもできる。これは、肺上皮内の罹患した細胞が遅い回転速度を有する嚢胞性線維症などの疾患にとって極めて重要である。実際に、罹患した成人嚢胞性線維症患者の肺内への嚢胞性線維症輸送体（ＣＦＴＲ）のアデノウイルス媒介性導入を利用したいくつかの試験が進行中である。

【0459】

アデノウイルスは、遺伝子治療および異種遺伝子の発現のためのベクターとして使用されてきた。大きな（３６ｋｂ）ゲノムは、最大８ｋｂの外来挿入ＤＮＡを収容することができ、相補細胞株中で効率的に複製して、最大１０^１２形質導入単位／ｍｌの非常に高い力価を生成することができる。したがって、アデノウイルスは、初代非複製細胞における遺伝子の発現を研究するための最良の系の１つである。

【0460】

アデノウイルスゲノムからのウイルスの遺伝子または外来遺伝子の発現は、複製する細胞を必要としない。アデノウイルスベクターは、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスによって細胞に侵入する。細胞内に入ると、アデノウイルスベクターが宿主染色体内に組み込まれることは稀である。代わりに、アデノウイルスベクターは、宿主核内で直鎖ゲノムとしてエピソーム的に（宿主ゲノムとは独立して）機能する。

【0461】

アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、高い組み込み頻度を有し、非分裂細胞に感染することができるので、本発明において使用するための魅力的なベクター系である。このため、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、哺乳動物細胞中への遺伝子の送達に有用である。ＡＡＶは、感染性について広い宿主域を有する。ｒＡＡＶベクターの生成および使用に関する詳細は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３９，９４１号および米国特許第４，７９７，３６８号に記載されている。

【0462】

組換えＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子およびヒト疾患に関与する遺伝子のインビトロ、エクスビボおよびインビボでの形質導入のために首尾よく使用されてきた。

【0463】

大きな搭載物（最大８～９ｋｂ）を効率的に組み込むことができる特定のＡＡＶベクターが開発されている。１つのこのようなベクターは、ＡＡＶ５キャプシドおよびＡＡＶ２ ＩＴＲ（Ａｌｌｏｃｃａ Ｍ，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００８）１１８：１９５５－１９６４）を有する。

【0464】

単純ヘルペスウイルスベクター
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、神経細胞に自然に感染する、エンベロープを有する二本鎖ＤＮＡウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、外来ＤＮＡの大きな区画を収容することができ、このため、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）はベクター系として魅力的であり、神経細胞への遺伝子送達のためのベクターとして使用されてきた（Ｍａｎｓｅｒｖｉｇｉｅｔ ｅｔ ａｌ Ｏｐｅｎ Ｖｉｒｏｌ Ｊ．（２０１０）４：１２３－１５６）。

【0465】

治療手順におけるＨＳＶの使用は、株が溶菌サイクルを確立することができないように株を弱毒化することを必要とする。特に、ＨＳＶベクターがヒトにおける遺伝子治療のために使用される場合、ポリヌクレオチドは、好ましくは必須遺伝子中に挿入されるべきである。これは、ウイルスベクターが野生型ウイルスに遭遇すると、組換えによって野生型ウイルスへの異種遺伝子の導入が起こり得るためである。しかしながら、ポリヌクレオチドが必須遺伝子中に挿入されている限り、この組換え導入は、レシピエントウイルス中の必須遺伝子も欠失させ、複製能を有する野生型ウイルス集団内への異種遺伝子の「逸出」を防止するであろう。

【0466】

ワクシニアウイルスベクター
本発明のベクターは、ＭＶＡまたはＮＹＶＡＣなどのワクシニアウイルスベクターであり得る。ワクシニアベクターに対する代替物としては、ＡＬＶＡＣとして知られる鶏痘またはカナリアポックスなどのトリポックスベクターおよびヒト細胞において感染し、組換えタンパク質を発現することができるが複製することができないこれらに由来する株が挙げられる。

【0467】

バキュロウイルスベクター
本発明のベクターは、バキュロウイルスベクターでもあり得る。哺乳動物細胞内でのコードされたＮＯＩの発現を可能にするためのバキュロウイルスの改変は、当技術分野で周知である。これは、例えば、ＮＯＩの上流の哺乳動物プロモーターの使用によって達成することができる。

【0468】

複数のＮＯＩをコードするベクター
一態様において、ベクターは、１つより多くのＮＯＩを含み、１つまたはそれより多くのＮＯＩは、本明細書に記載のｔｂｓまたはその一部に機能的に連結されている。

【0469】

配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
上述のように、本発明のベクターは、１つより多くのＮＯＩを含み得る。これらのＮＯＩを発現させるために、ベクターゲノム内に２つまたはそれより多くの転写単位、各ＮＯＩに対して１つが存在し得る。しかしながら、レトロウイルスベクターが遺伝的に単純に保たれていれば、レトロウイルスベクターは最も高い力価および最も強力な遺伝子発現特性を達成することは文献から明らかであり（国際公開第９６／３７６２３号；Ｂｏｗｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，２４６４；Ｃｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｂｌｏｏｄ ８４，１８１２；Ｅｍｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎ １９８４ Ｃｅｌｌ ３９，４５９；Ｇｈａｔｔａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，５８４８；Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９ ＰＮＡＳ ８６，３５１９；Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６６，８４１６；Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３，１７７９８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３，３８１；ＭｃＬａｃｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｖｉｒｏｌ．１９５，１；Ｏｖｅｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，１８０３；Ｓｃｈａｒｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ ＰＮＡＳ ８８，４６２６；Ｖｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １，３０７；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｖｉｒｏｌ．１７１，３３１；Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ＰＮＡＳ ８４，５１９７）、したがって、ポリシストロン性メッセージ中の第２の（および後続の）コード配列の翻訳を開始するために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用することが好ましい（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ １９９１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，４９８５）。

【0470】

レトロウイルスベクター中へのＩＲＥＳエレメントの挿入は、レトロウイルス複製サイクルと適合的であり、単一のプロモーターからの複数のコード領域の発現を可能にする（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ（上記）；Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６：６６９－６７５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ １９９３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６７：２１４２－２１４８）。ＩＲＥＳエレメントは、ピコルナウイルスの非翻訳５’末端中に最初に見出され、ＩＲＥＳエレメントは、ここでウイルスタンパク質のキャップ非依存性翻訳を促進する（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｅｎｚｙｍｅ ４４：２９２－３０９）。ＲＮＡ中のオープンリーディングフレームの間に位置する場合、ＩＲＥＳエレメントは、ＩＲＥＳエレメントにおけるリボソームの進入を促進し、続いて下流の翻訳の開始を促進することによって、下流のオープンリーディングフレームの効率的な翻訳を可能にする。

【0471】

ＩＲＥＳに関する総説は、ＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ（ＴＩＧ Ｍａｙ １９９５ ｖｏｌ １１，Ｎｏ ５：１７９－１８４）によって提示されている。脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：５８４８－５８５９（１９９１）；ＢｉＰタンパク質［Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９１（１９９１）］；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのアンテナペディア遺伝子（エクソンｄおよびｅ）［Ｏｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：１６４３－１６５３（１９９２）］からのものの他、ポリオウイルス（ＰＶ）中のもの［Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３２０－３２５（１９８８）；Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，ＴＩＧ １１，１７９－１８４（１９８５）も参照］を含む多数の異なるＩＲＥＳ配列が公知である。

【0472】

ＰＶ、ＥＭＣＶおよび豚水疱病ウイルス由来のＩＲＥＳエレメントは、レトロウイルスベクターにおいて以前から使用されている（上記のＣｏｆｆｉｎら）。

【0473】

「ＩＲＥＳ」という用語は、ＩＲＥＳとして機能する、またはＩＲＥＳの機能を改善する任意の配列または配列の組み合わせを含む。

【0474】

（１つまたは複数の）ＩＲＥＳは、ウイルス起源（ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（配列番号５９）、ＰＶ ＩＲＥＳまたはＦＭＤＶ ２Ａ様配列など）または細胞起源（ＦＧＦ ２ ＩＲＥＳ、ＮＲＦ ＩＲＥＳ、Ｎｏｔｃｈ ２ ＩＲＥＳまたはＥＩＦ４ ＩＲＥＳなど）であり得る。

【0475】

ＩＲＥＳが各ポリヌクレオチドの翻訳を開始することができるようにするために、ＩＲＥＳは、ベクターゲノム中のポリヌクレオチド間またはポリヌクレオチドより前に位置するべきである。

【0476】

プロモーター
ＮＯＩの発現は、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを含む制御配列を使用して制御され得る。原核生物プロモーターおよび真核細胞において機能的なプロモーターが使用され得る。組織特異的プロモーターまたは刺激特異的プロモーターが使用され得る。２つまたはそれより多くの異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターも使用され得る。

【0477】

適切な促進配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムに由来するもの、またはアクチンプロモーター、ＥＦ１α、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０、ユビキチン、ＰＧＫもしくはリボソームタンパク質プロモーターなどの異種哺乳動物プロモーターに由来するものを含む強力なプロモーターである。あるいは、転写を駆動するために、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、錐体桿体ホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、神経特異的神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、星状膠細胞特異的グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、エンドグリンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、デスミンプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ１４プロモーターおよびＢ２９プロモーターなどの組織特異的プロモーターが使用され得る。

【0478】

遺伝子の転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することによってさらに増加させ得る。エンハンサーは、相対的に配向および位置に非依存的である。しかしながら、複製起点の後期側（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）（ｂｐ１００～２７０）のＳＶ４０エンハンサーおよびＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーなどの真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用し得る。エンハンサーは、プロモーターに対して５’または３’の位置でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’の部位に位置する。

【0479】

プロモーターは、適切な標的細胞における発現を確実にするためのまたは増加させるための特徴をさらに含むことができる。例えば、特徴は、保存された領域、例えば、ＰｒｉｂｎｏｗボックスまたはＴＡＴＡボックスであり得る。プロモーターは、ヌクレオチド配列の発現のレベルに影響を及ぼすための（維持する、増強する、または減少させるためなど）他の配列を含有し得る。適切な他の配列には、Ｓｈ１－イントロンまたはＡＤＨイントロンが含まれる。他の配列は、温度、化学的、光またはストレス誘導性要素などの誘導性要素を含む。また、転写または翻訳を増強するための適切な要素が存在し得る。

【0480】

組織特異的プロモーターを含む、導入遺伝子を駆動する構成的および／または強力なプロモーターが望ましい場合、特に、産生細胞における導入遺伝子タンパク質の発現がベクター力価の低下をもたらし、および／または導入遺伝子由来のタンパク質のウイルスベクター送達に起因してインビボで免疫応答を誘発する場合に、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ相互作用は、レトロウイルスベクターの産生のための導入遺伝子タンパク質抑制系に対する基礎を形成する上で有用であり得る。

【0481】

ＮＯＩの調節因子
レトロウイルスパッケージング／プロデューサ細胞株の生成およびレトロウイルスベクター産生を複雑にしている要因は、ある特定のレトロウイルスベクター成分およびＮＯＩの恒常的発現は細胞傷害性であり、これらの成分を発現する細胞の死をもたらすので、ベクターを産生することができないことである。したがって、これらの成分（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌおよびＶＳＶ－Ｇなどのエンベロープタンパク質）の発現を調節することができる。他の非細胞傷害性ベクター成分、例えばｒｅｖの発現も、細胞に対する代謝的負荷を最小化するように調節することができる。したがって、本明細書に記載のベクター成分をコードするモジュール式構築物もしくはヌクレオチド配列および／または細胞は、少なくとも１つの調節エレメントを伴う細胞傷害性および／または非細胞傷害性ベクター成分を含み得る。本明細書で使用される場合、「調節エレメント」という用語は、関連する遺伝子またはタンパク質の発現に影響を及ぼす、増加または減少させることができる任意のエレメントを指す。調節エレメントには、遺伝子スイッチ系、転写調節エレメントおよび翻訳抑制エレメントが含まれる。

【0482】

哺乳動物細胞において遺伝子スイッチを生成するために、多くの原核生物調節因子系が改良されてきた。多くのレトロウイルスパッケージングおよびプロデューサ細胞株が、遺伝子スイッチ系（例えば、テトラサイクリンおよびクメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性スイッチ系）を使用して制御されており、これにより、ベクター産生時にレトロウイルスベクター成分の１つまたはそれより多くの発現をオンに切り替えることができる。遺伝子スイッチ系には、転写調節因子の（ＴｅｔＲ）タンパク質群（例えば、Ｔ－Ｒｅｘ、Ｔｅｔ－ＯｎおよびＴｅｔ－Ｏｆｆ）の遺伝子スイッチ系、転写調節因子のクメート誘導性スイッチ系群（例えば、ＣｙｍＲタンパク質）の遺伝子スイッチ系、およびＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）を伴う遺伝子スイッチ系が含まれる。

【0483】

１つのこのようなテトラサイクリン誘導性の系は、Ｔ－ＲＥｘ（商標）系をベースとするテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）系である。例として、このような系では、テトラサイクリンオペレータ（ＴｅｔＯ_２）は、最初のヌクレオチドがヒトサイトメガロウイルス主要前初期プロモーター（ｈＣＭＶｐ）のＴＡＴＡＴＡＡエレメントの最後のヌクレオチドの３’末端から１０ｂｐであり、次いでＴｅｔＲ単独でリプレッサーとして作用することができるような位置に配置されている（Ｙａｏ Ｆ，Ｓｖｅｎｓｊｏ Ｔ，Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｔ，Ｌｕ Ｍ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｃ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｅ．，１９９８，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ；９：１９３９－１９５０）。このような系では、ＮＯＩの発現は、２コピーのＴｅｔＯ_２配列がタンデムに挿入されたＣＭＶプロモーターによって制御することができる。ＴｅｔＲホモ二量体は、誘導剤（テトラサイクリンまたはその類似体ドキシサイクリン［ｄｏｘ］）の非存在下では、ＴｅｔＯ_２配列に結合し、上流ＣＭＶプロモーターからの転写を物理的に遮断する。存在する場合、誘導剤はＴｅｔＲホモ二量体に結合し、ＴｅｔＲホモ二量体がもはやＴｅｔＯ_２配列に結合できないようなアロステリック変化を引き起こし、遺伝子発現をもたらす。コドン最適化は翻訳効率を改善して、ＴｅｔＯ_２によって制御される遺伝子発現のより厳密な制御をもたらすことが見出されたので、ＴｅｔＲ遺伝子はコドン最適化され得る。

【0484】

ＴＲｉＰ系は、国際公開第２０１５／０９２４４０号に記載されており、ベクター産生中に産生細胞におけるＮＯＩの発現を抑制する別の方法を提供する。組織特異的プロモーターを含む、導入遺伝子を駆動する構成的および／または強力なプロモーターが望ましい場合、特に、産生細胞における導入遺伝子タンパク質の発現がベクター力価の低下をもたらし、および／または導入遺伝子由来のタンパク質のウイルスベクター送達に起因してインビボで免疫応答を誘発する場合に、ＴＲＡＰ結合配列（例えば、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ）相互作用は、レトロウイルスベクターの産生のための導入遺伝子タンパク質抑制系に対する基礎を形成する（Ｍａｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１７）Ｍａｒ ２７；８）。

【0485】

簡潔には、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ相互作用は翻訳ブロックを形成し、導入遺伝子タンパク質の翻訳を抑制する（Ｍａｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１７）Ｍａｒ ２７；８）。翻訳ブロックは、産生細胞においてのみ有効であり、したがって、ＤＮＡまたはＲＮＡをベースとするベクター系を妨げない。ＴＲｉＰ系は、導入遺伝子タンパク質が、単また複シストロン性ｍＲＮＡ由来の組織特異的プロモーターを含む構成的および／または強力なプロモーターから発現される場合、翻訳を抑制することができる。導入遺伝子タンパク質の調節されない発現は、ベクター力価を低下させ、ベクター生成物の品質に影響を及ぼし得ることが実証されている。毒性または分子的負荷（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｕｒｄｅｎ）の問題が細胞ストレスをもたらし得る場合；導入遺伝子由来のタンパク質のウイルスベクター送達に起因して、導入遺伝子タンパク質がインビボで免疫応答を誘発する場合；遺伝子編集導入遺伝子の使用が、オンターゲット／オフターゲット作用（ａｆｆｅｃｔｓ）をもたらし得る場合；導入遺伝子タンパク質が、ベクターおよび／またはエンベロープ糖タンパク質の排除に影響を及ぼし得る場合には、一過性および安定なＰａＣＬ／ＰＣＬベクター産生系の両方に対する導入遺伝子タンパク質の抑制は、産生細胞がベクター力価の低下を防ぐために有益である。

【0486】

パッケージング配列
本発明の文脈内で利用される場合、「パッケージング配列」または「ｐｓｉ」と互換的に呼称される「パッケージングシグナル」という用語は、ウイルス粒子形成中にレトロウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド形成のために必要とされる非コードシス作用配列に関して使用される。ＨＩＶ－１では、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンまで伸長する遺伝子座にマッピングされている。ＥＩＡＶでは、パッケージングシグナルは、Ｇａｇの５’コーディング領域中にＲ領域を含む。

【0487】

本明細書で使用される場合、「伸長パッケージングシグナル」または「伸長パッケージング配列」という用語は、ｇａｇ遺伝子中にさらなる伸長を有するｐｓｉ配列周囲の配列の使用を指す。これらの追加のパッケージング配列を含めることにより、ウイルス粒子中へのベクターＲＮＡの挿入の効率を増加させ得る。

【0488】

ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＲＮＡキャプシド形成決定因子は、分離し、非連続的であり、ゲノムｍＲＮＡの５’末端の一方の領域（Ｒ－Ｕ５）およびｇａｇの近位３１１ｎｔ内にマッピングされたもう一方の領域を含むことが示されている（Ｋａｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．Ｏｃｔ；６９（１０）：６５８８－９２（１９９５）。

【0489】

偽型化
１つの好ましい局面において、本発明のウイルスベクターは偽型化されている。これに関して、偽型化は１つまたはそれより多くの利点を与えることができる。例えば、ＨＩＶベースのベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、ＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞のみに感染するようにこれらのベクターを制限する。しかし、これらのベクター中のｅｎｖ遺伝子が他のエンベロープを有するウイルス由来のｅｎｖ配列で置換されていれば、これらのベクターはより広い感染スペクトルを有し得る（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。例として、研究者らは、ＶＳＶ由来の糖タンパク質でＨＩＶをベースとするベクターを偽型化した（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。

【0490】

別の代替において、Ｅｎｖタンパク質は、変異体または操作されたＥｎｖタンパク質などの改変されたＥｎｖタンパク質であり得る。改変は、標的化能力を導入するために、または毒性を低減するために、または別の目的のために施されまたは選択され得る（Ｖａｌｓｅｓｉａ－Ｗｉｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ １９９６ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：２０５６－６４；Ｎｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３（４）：２８０－２８６；およびＦｉｅｌｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１（５）：１８０２－１８０９およびこれらに引用されている参考文献）。

【0491】

ベクターは、選択された任意の分子で偽型化され得る。

【0492】

ＶＳＶ－Ｇ
ラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、ある特定のエンベロープを有するウイルスおよびウイルスベクタービリオンを偽型化することができることが示されているエンベロープタンパク質である。

【0493】

一切のレトロウイルスエンベロープタンパク質の非存在下でＭｏＭＬＶベースのレトロウイルスベクターを偽型化するその能力は、Ｅｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：１２０２－１２０７）によって最初に示された。国際公開第１９９４／２９４４４０号は、レトロウイルスベクターがＶＳＶ－Ｇで首尾よく偽型化され得ることを教示している。これらの偽型化されたＶＳＶ－Ｇベクターは、広範囲の哺乳動物細胞を形質導入するために使用され得る。より最近では、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（８）６３５６－６３６１は、ＶＳＶ－Ｇの添加によって非感染性レトロウイルス粒子を感染性にすることができることを教示している。

【0494】

Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３－７）は、ＶＳＶ－Ｇで首尾よくレトロウイルスＭＬＶを偽型化し、これにより、その天然型のＭＬＶと比較して変化した宿主域を有するベクターが得られた。ＶＳＶ－Ｇで偽型化されたベクターは、哺乳動物細胞だけでなく、魚、爬虫類および昆虫に由来する細胞株にも感染することが示されている（Ｂｕｒｎｓら（１９９３）同上）。ＶＳＶ－Ｇで偽型化されたベクターは、様々な細胞株に対して従来の両種指向性エンベロープよりさらに効率的であることも示されている（Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９５６４－９５６８，Ｅｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：１２０２－１２０７）。ＶＳＶ－Ｇタンパク質は、その細胞質尾部がレトロウイルスのコアと相互作用することができるので、特定のレトロウイルスを偽型化するために使用することができる。

【0495】

ＶＳＶ－Ｇタンパク質などの非レトロウイルスの偽型化エンベロープを与えることは、感染性を失うことなくベクター粒子を高力価に濃縮できるという利点をもたらす（Ａｋｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２５８１－５）。おそらくは２つの非共有結合的に連結されたサブユニットからなるために、レトロウイルスエンベロープタンパク質は、明らかに超遠心分離中の剪断力に耐えることができない。サブユニット間の相互作用は、遠心分離によって破壊され得る。比較すると、ＶＳＶ糖タンパク質は単一の単位から構成されている。したがって、ＶＳＶ－Ｇタンパク質偽型化は潜在的な利点を提供することができる。

【0496】

国際公開第２０００／５２１８８号は、膜結合型ウイルスエンベロープタンパク質として水疱性口内炎ウイルス－Ｇタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）を有する、安定したプロデューサ細胞株からの偽型化レトロウイルスベクターの作製を記載しており、ＶＳＶ－Ｇタンパク質の遺伝子配列を提供している。

【0497】

ロスリバーウイルス
ロスリバーウイルスのエンベロープは、非霊長類レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）を偽型化するために使用されており、全身投与後に主に肝臓を形質導入した（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６（１８）：９３７８－９３８８）。効率は、ＶＳＶ－Ｇで偽型化されたベクターで得られたものより２０倍大きく、肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによって測定されたところ、より少ない細胞傷害性を引き起こしたことが報告された。

【0498】

バキュロウイルスＧＰ６４
バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質は、臨床用途および商業用途のために必要とされる高力価ウイルスの大規模生産に使用されるウイルスベクターに関して、ＶＳＶ－Ｇの代替物であることが示されている（Ｋｕｍａｒ Ｍ，Ｂｒａｄｏｗ ＢＰ，Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇ Ｊ（２００３）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１）：６７－７７）。ＶＳＶ－Ｇで偽型化されたベクターと比較して、ＧＰ６４で偽型化されたベクターは、類似の広い指向性および類似の天然の力価を有する。ＧＰ６４発現は細胞を死滅させないので、ＧＰ６４を構成的に発現する２９３Ｔベースの細胞株を作製することができる。

【0499】

代替エンベロープ
偽型ＥＩＡＶに使用した場合に妥当な力価を与える他のエンベロープとしては、モコラ、狂犬病、エボラおよびＬＣＭＶ（リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス）が挙げられる。４０７０Ａで偽型化されたレンチウイルスのマウスへの静脈内注入は、肝臓において最大の遺伝子発現をもたらした。

【0500】

ウイルスベクター産生系および細胞
本発明の別の局面は、ウイルスベクターの産生のために必要とされる成分をコードする核酸配列の組を含むウイルスベクター産生系であって、ベクターゲノム配列が本発明の核酸配列を含む、ウイルスベクター産生系に関する。

【0501】

「ウイルスベクター産生系」または「ベクター産生系」または「産生系」は、ウイルスベクター産生のために必要な成分を含む系として理解されるべきである。

【0502】

したがって、ベクター産生系は、ウイルスベクター粒子を作製するのに必要な成分をコードする核酸配列の組を含む。１つのこのような核酸配列は、ＴＲＡＰをコードする遺伝子を含み得る。好ましい態様において、ＲＮＡ結合タンパク質は細菌のＴＲＡＰである。

【0503】

本発明の一態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり、ウイルスベクター産生系は、ＧａｇおよびＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質ならびにＥｎｖタンパク質またはこれらの機能的代替物をコードする核酸配列と、本発明の核酸配列を含むベクターゲノム配列とをさらに含む。産生系は、Ｒｅｖタンパク質をコードする核酸配列および／またはＴＲＡＰをコードする核酸配列を含んでもよい。

【0504】

本発明のウイルスベクター産生系の別の態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来する。

【0505】

別の態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスに由来する。別の態様において、ウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する。

【0506】

本発明の別の局面は、真核生物のベクター産生細胞におけるウイルスベクター力価を増加させる方法であって、真核生物のベクター産生細胞中に本発明のウイルスベクター産生系およびＴＲＡＰをコードする核酸配列を導入することを含み、ＴＲＡＰはＴＲＡＰ結合部位またはその一部に結合し、ＮＯＩの翻訳を抑制し、それにより、ＴＲＡＰ結合部位を有しないウイルスベクターと比較してウイルスベクター力価を増加させる、方法に関する。

【0507】

本発明の別の局面は、本発明のウイルスベクター産生系において使用するためのＤＮＡ構築物に関する。このようなＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）は、本発明の核酸配列を含むベクターゲノム構築物を含み得る。

【0508】

本発明のさらなる局面は、ＴＲＡＰをコードする核酸配列を含む本発明のウイルスベクター産生系において使用するためのＤＮＡ構築物に関する。

【0509】

本発明の別の局面は、本発明のＤＮＡ構築物と、ＧａｇおよびＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質およびＥｎｖタンパク質またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物とを含む、本発明のウイルスベクター産生系において使用するためのＤＮＡ構築物の組に関する。

【0510】

本発明の一態様において、ＤＮＡ構築物の組は、ＴＲＡＰをコードするＤＮＡ構築物をさらに含む。

【0511】

本発明の一態様において、ＤＮＡ構築物の組は、Ｒｅｖタンパク質またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物をさらに含む。

【0512】

一態様において、ウイルスベクター産生系は、モジュール式核酸構築物（モジュール式構築物）を含む。モジュール式構築物は、レンチウイルスベクターの産生において使用される２つまたはそれより多くの核酸を含むＤＮＡ発現構築物である。モジュール式構築物は、レンチウイルスベクターの産生において使用される２つまたはそれより多くの核酸を含むＤＮＡプラスミドであり得る。プラスミドは細菌プラスミドであり得る。核酸は、例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、ベクターゲノムをコードすることができる。さらに、パッケージングおよびプロデューサ細胞株の作製のために設計されたモジュール式構築物は、転写調節タンパク質（例えば、ＴｅｔＲ、ＣｙｍＲ）および／または翻訳抑制タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）および選択可能なマーカー（例えば、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ネオマイシン耐性遺伝子）をコードすることをさらに必要とし得る。本発明において使用するための適切なモジュール式構築物は、欧州特許第３５０２２６０号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0513】

本発明に従って使用するためのモジュール式構築物は、１つの構築物上にレトロウイルス成分の２つまたはそれより多くをコードする核酸配列を含有するので、これらのモジュール式構築物の安全性プロファイルが検討されており、追加の安全性の特徴が構築物中に直接操作されている。これらの特徴には、レトロウイルスベクター成分の複数のオープンリーディングフレームに対するインスレーターの使用および／またはモジュール式構築物におけるレトロウイルス遺伝子の特異的な配向および配置が含まれる。これらの特徴を使用することにより、複製能を有するウイルス粒子を生成する直接的なリードスルーが防止されると考えられる。

【0514】

ウイルスベクター成分をコードする核酸配列は、モジュール式構築物中で逆および／または交互の転写配向であり得る。このため、ウイルスベクター成分をコードする核酸配列は、同じ５’から３’配向で提示されず、その結果、ウイルスベクター成分は、同じｍＲＮＡ分子から産生されることができない。逆の配向とは、異なるベクター成分に対する少なくとも２つのコード配列が、「ヘッドトゥーヘッド」および「テールトゥーテール」転写配向で提示されることを意味し得る。これは、モジュール式構築物の一方の鎖上の１つのベクター成分、例えばｅｎｖに対するコード配列および反対側の鎖上の別のベクター成分、例えばｒｅｖに対するコード配列を提供することによって達成され得る。好ましくは、２つより多くのベクター成分に対するコード配列がモジュール式構築物中に存在する場合、コード配列の少なくとも２つは逆の転写配向で存在する。したがって、２つより多くのベクター成分に対するコード配列がモジュール式構築物中に存在する場合、各成分は、それが隣接する他のベクター成分に対する（１つまたは複数の）隣接コード配列のすべてに対して反対の５’から３’配向で存在するように配向され得る、すなわち、各コード配列に対して交互の５’から３’（または転写）配向が使用され得る。

【0515】

本発明に従って使用するためのモジュール式構築物は、以下のベクター成分：ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、ベクターゲノムのうちの２つまたはそれより多くをコードする核酸配列を含み得る。モジュール式構築物は、ベクター成分の任意の組み合わせをコードする核酸配列を含み得る。一態様において、モジュール式構築物は、
ｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムおよびｒｅｖまたはその機能的代替物；
ｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムおよびｇａｇ－ｐｏｌ；
ｉｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムおよびｅｎｖ；
ｉｖ）ｇａｇ－ｐｏｌおよびｒｅｖまたはその機能的代替物；
ｖ）ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖ；
ｖｉ）ｅｎｖおよびｒｅｖまたはその機能的代替物；
ｖｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｒｅｖまたはその機能的代替物、およびｇａｇ－ｐｏｌ；
ｖｉｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｒｅｖまたはその機能的代替物およびｅｎｖ；
ｉｘ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖ；または
ｘ）ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖもしくはその機能的代替物、およびｅｎｖ、
をコードする核酸配列を含み得、
核酸配列は、逆のおよび／または交互の配向である。

【0516】

一態様において、レトロウイルスベクターを産生するための細胞は、上記ｉ）～ｘ）の組み合わせの任意の１つをコードする核酸配列を含み得、核酸配列は、同じ遺伝子座に位置しており、逆のおよび／または交互の配向にある。同じ遺伝子座は、細胞内の単一の染色体外遺伝子座、例えば単一のプラスミド、または細胞のゲノム内の単一の遺伝子座（すなわち、単一の挿入部位）を指し得る。細胞は、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを産生するための安定なまたは一過性の細胞であり得る。

【0517】

本発明の別の局面は、本発明の核酸配列、ウイルスベクター産生系またはＤＮＡ構築物の一部もしくは全部を含むウイルスベクター産生細胞に関する。

【0518】

「ウイルスベクター産生細胞」は、ウイルスベクターまたはウイルスベクター粒子を産生することができる細胞として理解されるべきである。ウイルスベクター産生細胞は、「プロデューサ細胞」または「パッケージング細胞」であり得る。ウイルスベクター系の１つまたはそれより多くのＤＮＡ構築物は、ウイルスベクター産生細胞内に安定に組み込まれ得る、またはエピソーム的に維持され得る。あるいは、ウイルスベクター系のすべてのＤＮＡ成分は、ウイルスベクター産生細胞中に一過性に形質移入され得る。さらに別の代替手段では、成分のいくつかを安定に発現する産生細胞が、残りの成分で一過性に形質移入され得る。

【0519】

ＴＲＡＰをコードするＤＮＡ発現カセットは、ウイルスベクター産生細胞内に安定に組み込まれ得る、またはエピソーム的に維持され得る。あるいは、ＴＲＡＰをコードするＤＮＡ発現カセットは、ウイルスベクター産生細胞中に一過性に形質移入され得る。

【0520】

したがって、本発明の一態様において、産生細胞はＴＲＡＰ構築物を安定に発現するであろう。本発明の別の態様において、産生細胞はＴＲＡＰ構築物を一過性に発現する。

【0521】

必要とされる抑制のレベルは、ＮＯＩに応じて変化し得るので、産生細胞において必要とされるＴＲＡＰのレベルも、ＮＯＩに依存し得る。したがって、いくつかの状況では、安定なおよび一過性のＴＲＡＰ発現との組み合わせが所望され得る。安定な発現は、産生細胞中で継続的なレベルのＴＲＡＰ発現を提供し得るのに対して、一過性発現は、より短期間の増大したレベルのＴＲＡＰ発現を提供し得る。例えば、より問題のある／毒性の導入遺伝子の抑制には、ベクター産生時の既存のＴＲＡＰ（例えば、安定な発現によって提供される）および高レベルのＴＲＡＰのいずれもが有益である可能性がある。

【0522】

このため、本発明の別の態様において、産生細胞は、ＴＲＡＰ構築物を安定に発現し、ＴＲＡＰ構築物を一過性にも発現する。一過性発現は、安定な発現によって提供されるより高いレベルのＴＲＡＰ発現を短期間提供し得る。

【0523】

「安定な発現」とは、安定な発現を与える構築物からのＴＲＡＰの発現が長期間にわたって実質的に変化しないことを理解されたい。

【0524】

「一過性発現」とは、一過性発現を与える構築物からのＴＲＡＰの発現が長期間にわたって安定でないことを理解されたい。好ましくは、一過性発現を与えるＴＲＡＰをコードするポリヌクレオチドは、産生細胞ゲノム中に組み込まれず、産生細胞中でエピソーム的に維持されない。

【0525】

本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞」という用語は、感染性ベクター粒子の産生のために必要な要素を含有するが、ベクターゲノムを欠く細胞を指す。典型的には、このようなパッケージング細胞は、ウイルスの構造タンパク質（ｇａｇ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖなど）を発現することができる１つまたはそれより多くの発現カセットを含有する。

【0526】

プロデューサ細胞／パッケージング細胞は、任意の適切な細胞型であり得る。プロデューサ細胞は一般に哺乳動物細胞であるが、例えば昆虫細胞であることができる。

【0527】

本明細書で使用される場合、「プロデューサ／産生細胞」または「ベクターを産生する／ベクター産生細胞」という用語は、レトロウイルスベクター粒子の産生およびＴＲＡＰの発現のために必要なすべての要素を含有する細胞を指す。

【0528】

プロデューサ細胞は、安定なプロデューサ細胞株または一過性に誘導されたプロデューサ細胞株のいずれかであり得る。

【0529】

本発明の一態様において、エンベロープおよびヌクレオキャプシド、ＴＲＡＰ、ならびに存在する場合にはｒｅｖヌクレオチド配列はすべて、プロデューサ細胞および／またはパッケージング細胞中に安定に組み込まれる。しかしながら、これらの配列の任意の１つまたはそれより多くはエピソーム形態で存在することもでき、遺伝子発現はエピソームから起こり得るか、または産生細胞中に一過性に形質移入され得る。

【0530】

ベクター産生細胞は、組織培養細胞株などのインビトロで培養された細胞であり得る。適切な細胞株には、マウス線維芽細胞由来細胞株またはヒト細胞株などの哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ベクター産生細胞はヒト細胞株に由来する。

【0531】

一態様において、本発明のベクターは、その産生系として、ＮＯＩに機能的に連結された本発明の核酸配列を含むベクターゲノム、ｇａｇ－ｐｏｌ成分、エンベロープおよびＴＲＡＰを発現する４つの転写単位を使用する。エンベロープ発現カセットは、ＶＳＶ－Ｇなどの多数の異種エンベロープの１つを含み得る。ｒｅｖ成分も含まれてもよい。

【0532】

ウイルスベクター産生過程
本発明の別の局面は、本発明の核酸配列、ウイルスベクター産生系またはＤＮＡ構築物の一部もしくは全部をウイルスベクター産生細胞中に導入することと、ウイルスベクターの産生に適した条件下で産生細胞を培養することとを含む、ウイルスベクターを産生するための方法に関する。

【0533】

適切な「産生細胞」は、適切な条件下で培養された場合にウイルスベクターまたはウイルスベクター粒子を産生することができる細胞である。適切な「産生細胞」は、一般に、哺乳動物またはヒトの細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＡＰ、ＣＡＰ－ＴまたはＣＨＯ細胞であるが、例えばＳＦ９細胞などの昆虫細胞であり得る。

【0534】

産生細胞は、鳥類細胞、例えばＥＢ６６（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）細胞でもあり得る。鳥類細胞は、ヒトおよび獣医学のウイルスベースのワクチン、例えばインフルエンザおよびニューカッスル病ウイルスワクチンの産生のために特に有用であり得る。

【0535】

核酸を産生細胞中に導入するための方法は、当技術分野において周知であり、以前に記載されている。

【0536】

一態様において、産生細胞はＴＲＡＰを含む。

【0537】

本発明の別の局面は、本発明のウイルスベクター産生系によって、本発明のウイルスベクター産生細胞を使用して、または本発明の方法によって産生されたウイルスベクターに関する。

【0538】

一態様において、ウイルスベクター粒子は、本発明の核酸配列を含む。ウイルスベクター粒子は、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来し得る。レトロウイルスベクター粒子は、レンチウイルスに由来し得る。レンチウイルスベクター粒子は、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来し得る。

【0539】

レンチウイルスベクターを作製するための方法、特にレンチウイルスベクターの処理は、国際公開第２００９／１５３５６３号に記載されている。

【0540】

本発明の別の局面は、本発明のウイルスベクターによって形質導入された細胞に関する。

【0541】

「ウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞」は、ウイルスベクター粒子によって運ばれる核酸がその中に導入された細胞、特に標的細胞として理解されるべきである。

【0542】

使用
本発明の別の局面は、医学において使用するための本発明のウイルスベクターまたは本発明のウイルスベクターで形質導入された細胞もしくは組織に関する。

【0543】

本発明の別の局面は、医学における本発明のウイルスベクターまたは本発明のウイルスベクターで形質導入された細胞もしくは組織の使用に関する。

【0544】

本発明の別の局面は、関心対象のヌクレオチドを必要とする標的部位に関心対象のヌクレオチドを送達するための医薬を調製するための、本発明のウイルスベクター、本発明の産生細胞または本発明のウイルスベクターで形質導入された細胞もしくは組織の使用に関する。

【0545】

本発明のウイルスベクターまたは形質導入された細胞のこのような使用は、本明細書に記載されるように、治療目的または診断目的のためであり得る。

【0546】

治療用ベクター
レトロウイルス治療用ベクター
一態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、パーキンソン病を処置するためにドーパミン合成経路の３つの酵素をコードする３つの遺伝子を導入するために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、切断型のヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ＊）遺伝子（ＴＨのフィードバック調節に関与するＮ末端の１６０アミノ酸を欠く）、ヒト芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）、およびヒトＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１）遺伝子を含み得る。３つの酵素は、３つの別々のオープンリーディングフレームでレトロウイルスベクターによってコードされ得る。あるいは、レトロウイルスベクターは、第１のオープンリーディングフレーム中のＴＨおよびＣＨ１酵素と、第２のオープンリーディングフレーム中のＡＡＤＣ酵素との融合物をコードし得る。遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターによって駆動され得、発現カセットは１つまたはそれより多くのＩＲＥＳエレメントを含み得る。レトロウイルスベクターは、脳の線条体中への直接注射によって投与され得る。

【0547】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、視細胞およびこれを支える網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に矯正のためのＭＹＯ７Ａ遺伝子を導入し、それにより、アッシャー１Ｂ症候群に伴う視力の低下を減弱または逆転させるように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、ＭＹＯ７Ａタンパク質をコードするＭＹＯ７ＡｃＤＮＡ（長さが１００ｍｂを超える大きな遺伝子）である。大きなＭＹＯ７Ａ遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ／ＭＹＯ７Ａキメラプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0548】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正のためのＡＴＰ結合カセット遺伝子ＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲとしても知られる）を視細胞に導入し、それによってシュタルガルト病をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、ＡＢＣＡ４タンパク質をコードするＡＢＣＡ４ｃＤＮＡである。ＡＢＣＡ４遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーター、視細胞特異的プロモーター、例えばロドプシンキナーゼまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0549】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫または網膜静脈閉塞を有する患者の眼における異常な血管成長および／もしくは血管漏出の再発を予防するように、ならびに／または萎縮型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有する患者の眼における異常な血管成長を予防するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このレトロウイルスベクターは、アンジオスタチンおよび／またはエンドスタチンなどの１つまたは複数の抗血管新生タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を送達する。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。一態様において、レトロウイルスベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してバイシストロン構成のヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する（１つまたは複数の）抗血管新生遺伝子の発現は、ＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）によって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0550】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）患者の眼の浮腫における異常な血管成長の再発を予防するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このレトロウイルスベクターは、アンジオスタチンおよび／またはエンドスタチンなどの１つまたは複数の抗血管新生タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を送達する。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。一態様において、レトロウイルスベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してバイシストロン構成のヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する（１つまたは複数の）抗血管新生遺伝子の発現は、ＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）によって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0551】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、移植前のドナー角膜への（１つまたは複数の）抗血管新生遺伝子の送達による血管新生の結果としての角膜移植片拒絶を予防するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇ、エボラまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。一態様において、レトロウイルスベクターは、角膜移植片へのエクスビボ送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してバイシストロン構成のヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子などの（１つまたは複数の）抗血管新生遺伝子を発現する。レトロウイルスベクターはエクスビボで角膜移植片組織に適用され得、形質導入されたドナー組織も移植前に保存され得る。（１つまたは複数の）抗血管新生遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーターによって駆動され得る。しかしながら、代替のプロモーターが使用され得ることも可能である。

【0552】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫または網膜静脈閉塞を有する患者の眼における異常な血管成長および／もしくは血管漏出の再発を予防するように、ならびに／または萎縮型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有する患者の眼における異常な血管成長を予防するように設計された遺伝子治療として使用され得る。このレトロウイルスベクターは、可溶性形態のｆｍｓ様チロシンキナーゼをコードする遺伝子を送達する。（可溶性Ｆｌｔ－１）レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。可溶性Ｆｌｔ－１遺伝子の発現は、ＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）によって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0553】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫または網膜静脈閉塞を有する患者の眼における異常な血管成長および／もしくは血管漏出の再発を予防するように、ならびに／または萎縮型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有する患者の眼における異常な血管成長を予防するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このレトロウイルスベクターは、色素上皮由来因子タンパク質（ＰＥＤＦ）をコードする１つまたは複数の遺伝子を送達する。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。ＰＥＤＦ遺伝子の発現は、ＣＭＶ、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）などのＲＰＥ特異的プロモーターによって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0554】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫または網膜静脈閉塞を有する患者の眼における異常な血管成長および／もしくは血管漏出の再発を予防するように、ならびに／または萎縮型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有する患者の眼における異常な血管成長を予防するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このレトロウイルスベクターは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤、例えば抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその結合断片（例えばアフリベルセプト）、ＶＥＧＦ特異的アプタマー、もしくはＶＥＧＦ受容体の可溶性形態を含むがこれに限定されないＶＥＧＦ遮断ペプチドもしくはポリペプチドおよび／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の阻害剤、例えば抗ＰＤＧＦ抗体もしくはその結合断片、ＰＤＧＦ特異的アプタマー、もしくはＰＤＧＦ受容体の可溶性形態を含むがこれに限定されないＰＤＧＦ遮断ペプチドもしくはポリペプチドをコードする１つの遺伝子または複数の遺伝子を送達する。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。一態様において、レトロウイルスベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してバイシストロン構成のＶＥＧＦの阻害剤およびＰＤＧＦの阻害剤を発現する。（１つまたは複数の）遺伝子の発現は、ＣＭＶ、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）などのＲＰＥ特異的プロモーターによって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0555】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正遺伝子卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）およびＶＭＤ２の疾患関連形態に対して特異的なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードするカセット、またはペリフェリン２をコードする矯正ＲＤＳ遺伝子およびＲＤＳの疾患関連形態に対して特異的なｍｉＲＮＡをコードするカセットを網膜色素上皮細胞に導入し、それにより、ベスト病またはベスト卵黄様黄斑変性（ＢＶＭＤ）をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。遺伝子の発現は、ＣＭＶ、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）などのＲＰＥ特異的プロモーターによって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0556】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正レチンアルデヒド結合タンパク質１遺伝子、ＲＬＢＰ１を網膜色素上皮細胞に導入し、それにより、ＲＬＢＰ１関連網膜ジストロフィーをもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、ＲＬＢＰ１タンパク質をコードするＲＬＢＰ１ｃＤＮＡである。ＲＬＢＰ１遺伝子の発現は、ＣＭＶ、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）などのＲＰＥ特異的プロモーターによって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0557】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、緑内障を処置するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このレトロウイルスベクターは、眼内圧を低下させるように作用するＣＯＸ－２および／またはプロスタグランジンＦ２α受容体（ＦＰＲ）をコードする１つまたは複数の遺伝子を送達する。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。一態様において、レトロウイルスベクターは、眼の前房への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してバイシストロン構成のＣＯＸ－２およびプロスタグランジンＦ２α受容体（ＦＰＲ）遺伝子を発現する。（１つまたは複数の）遺伝子の発現は、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、経角膜注射によって投与され得る。

【0558】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正ハーモニン遺伝子を導入して、アッシャー症候群１ｃをもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、ハーモニンタンパク質をコードするハーモニンｃＤＮＡである。ハーモニン遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0559】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）遺伝子を導入して、全脈絡膜萎縮をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、ＲＥＰ１タンパク質をコードするＲＥＰ１ｃＤＮＡである。ＲＥＰ１遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0560】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、（１つまたは複数の）矯正環状ヌクレオチド感受性チャネルベータ２（ＣＮＧＢ２）および／または環状ヌクレオチド感受性チャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）遺伝子を眼の中に導入して、色覚異常をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる（１つまたは複数の）遺伝子は、ＣＮＧＢ２および／またはＣＮＧＡ３タンパク質をコードする（１つまたは複数の）ＣＮＧＢ２および／またはＣＮＧＡ３遺伝子である。（１つまたは複数の）遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0561】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正ＣＥＰ２９０遺伝子を眼の中に導入して、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、２９０ｋＤａの中心体タンパク質をコードするＣＥＰ２９０遺伝子である。ＣＥＰ２９０遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0562】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正網膜色素変性症ＧＴＰ加水分解酵素調節因子（ＲＰＧＲ）遺伝子を眼の中に導入して、ｘ連鎖網膜色素変性症をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、ＲＰＧＲタンパク質をコードするＲＰＧＲ ｃＤＮＡである。ＲＰＧＲ遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0563】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正レチノスキシン１（ＲＳ１）遺伝子を眼の中に導入して、ｘ連鎖網膜分離症（ｒｅｔｉｎｏｃｈｉｓｉｓ）をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、ＲＳ１タンパク質をコードするＲＳ１ｃＤＮＡである。ＲＳ１遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0564】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正網膜色素変性症１（ＲＰ１）遺伝子を眼の中に導入して、網膜色素変性症をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、ＲＰ１タンパク質をコードするＲＰ１ｃＤＮＡである。ＲＰ１遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーター、視細胞特異的プロモーター、例えばロドプシンキナーゼまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0565】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）遺伝子を導入して、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）２型をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、ＲＰＥ６５タンパク質をコードするＲＰＥ６５ｃＤＮＡである。ＲＰＥ６５遺伝子の発現は、ＣＭＶ、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）などのＲＰＥ特異的プロモーターによって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0566】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正ヒトプロリン／アルギニンリッチ末端ロイシンリッチリピートタンパク質（ＰＲＥＬＰ）遺伝子を導入して、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、萎縮型ＡＭＤ、糖尿病性黄斑浮腫または網膜静脈閉塞をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、ＰＲＥＬＰタンパク質をコードするＰＲＥＬＰｃＤＮＡである。ＰＲＥＬＰ遺伝子の発現は、ＣＭＶ、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）などのＲＰＥ特異的プロモーターによって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0567】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、合成ミオシリン特異的ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を眼の中に導入して、ミオシリンの発現をノックダウンすることによって若年性開放隅角緑内障をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。合成ミオシリン特異的ｍｉＲＮＡの発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0568】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、グルタチオン生合成経路からの（１つまたは複数の）律速酵素であるグルタミン酸－システインリガーゼ（ＧＣＬ）および／もしくはグルタチオンシンセターゼ（ＧＳＳ）、ならびに／または合成γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）特異的ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を眼の中に導入して、遺伝子増強および／またはノックダウンによって、網膜色素変性症をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、例えば、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。（１つまたは複数の）ＧＣＬおよび／もしくはＧＳＳ遺伝子ならびに／または合成ＧＧＴ特異的ｍｉＲＮＡの発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。一態様において、レトロウイルスベクターは、１つまたは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してマルチシストロン構成の（１つまたは複数の）遺伝子および／または合成ｍｉＲＮＡを発現し得る。レトロウイルスベクターは、眼の前房への直接送達によって投与され得る。

【0569】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、前頭側頭葉認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性障害、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの運動ニューロン障害を処置するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このレトロウイルスベクターは、ＶＥＧＦ_１４５、ＶＥＧＦ_１６５もしくはＶＥＧＦ_１８９などのＶＥＧＦ－Ａアイソフォームであり得るまたはＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－ＣもしくはＶＥＧＦ－Ｄであり得るＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子を送達し、このような遺伝子は神経保護効果を有する。レトロウイルスベクターは、狂犬病ＧまたはＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。遺伝子の発現は、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、大きな筋肉群への直接注射によって、または髄腔内もしくは脳室内注射による脳脊髄液中への直接注射によって投与され得る。

【0570】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、嚢胞性線維症を処置するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このレトロウイルスベクターは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子を送達する。レトロウイルスベクターは、インフルエンザ赤血球凝集素、センダイウイルスエンベロープＦもしくはＨＮ、エボラ、バキュロウイルスＧＰ６４または代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。遺伝子の発現は、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、鼻腔内に、ネブライザーの使用によって、または気管支肺胞洗浄液を介した肺内への直接送達によって投与され得る。

【0571】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）および／またはスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）遺伝子（１つまたは複数）を脳内に導入して、サンフィリポ症候群Ａをもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる（１つまたは複数の）遺伝子は、ＳＧＳＨタンパク質をコードするＳＧＳＨｃＤＮＡおよび／またはＳＵＭＦ１タンパク質をコードするＳＵＭＦ１遺伝子である。（１つまたは複数の）遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。一態様において、レトロウイルスベクターは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してバイシストロン構成のＳＧＳＨおよびＳＵＭＦ１遺伝子を発現し得る。レトロウイルスベクターは、直接脳内注射によって投与され得る。

【0572】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正酸性αグリコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子を大きな筋肉群および／または肺内に導入して、ポンペ病をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。このレトロウイルスベクターは、ＧＡＡタンパク質をコードする遺伝子を送達する。レトロウイルスベクターは、インフルエンザ赤血球凝集素、センダイウイルスエンベロープＦもしくはＨＮ、エボラ、バキュロウイルスＧＰ６４、狂犬病Ｇ、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。遺伝子の発現は、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。レトロウイルスベクターは、（ｉ）大きな筋肉群中への直接注射および／または（ｉｉ）鼻腔内に、ネブライザーの使用によって、もしくは気管支肺胞洗浄液を介した肺内への直接送達によって投与され得る。

【0573】

別の態様において、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ１９）をコードする核酸配列で自己または同種Ｔ細胞を形質導入するために、本発明のレトロウイルスベクターがエクスビボで使用され得る。次いで、これらの形質導入されたＴ細胞は、ＣＤ１９を発現する癌および白血病を処置するために対象中に注入される。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。ＣＡＲをコードする核酸配列の発現は、ＥＦ１α、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。

【0574】

別の態様において、５Ｔ４特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列で自己または同種Ｔ細胞を形質導入するために、本発明のレトロウイルスベクターがエクスビボで使用され得る。次いで、これらの形質導入されたＴ細胞は、５Ｔ４を発現する癌および白血病を処置するために対象中に注入される。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。５Ｔ４ ＣＡＲをコードする核酸配列の発現は、ＥＦ１α、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。

【0575】

当業者に公知であるように、ある範囲の癌または白血病関連ポリペプチドに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生産することができる。任意の癌または白血病関連ポリペプチドに対して特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列で自己または同種Ｔ細胞を形質導入するために、本発明のレトロウイルスベクターがエクスビボで使用され得る。次いで、これらの形質導入されたＴ細胞は、ＣＡＲが結合する癌または白血病関連ポリペプチドを発現する癌および白血病を処置するために対象中に注入される。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。ＣＡＲをコードする核酸配列の発現は、ＥＦ１α、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。前記ＣＡＲによって標的とされ得る適切な癌または白血病関連ポリペプチドには、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：メソテリン、葉酸受容体α、免疫グロブリンのκ軽鎖、ＣＤ３０、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３８、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＥＧＦＲＶＩＩＩなどの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＩＬ－１３Ｒα２、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２などのＥｒｂＢ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ルイスＹ抗原および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＢ）。

【0576】

別の態様において、疾患細胞、白血病細胞または癌性細胞上に発現されるペプチド－ＭＨＣに対して特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列で自己または同種Ｔ細胞を形質導入するために、本発明のレトロウイルスベクターがエクスビボで使用され得る。次いで、ＴＣＲが結合するペプチド－ＭＨＣの発現に関連する疾患、癌または白血病を処置するために、これらの形質移入されたＴ細胞は対象中に注入される。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。ＴＣＲをコードする核酸配列の発現は、ＥＦ１α、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。本発明のベクターによってコードされるＴＣＲは、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）または二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）であり得る。当業者に公知であるように、適切なｄＴＣＲとしては、国際公開第２００３／０２０７６３号に記載されているものが挙げられ、適切なｓｃＴＣＲとしては、国際公開第１９９９／０１８１２９号に記載されているものが挙げられる。この態様の特定の局面では、ＡＩＤｓ、白血病、ならびに骨髄腫および肉腫を含む癌を処置するために、ＴＣＲで形質移入されたＴ細胞が使用され得る。

【0577】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、共通γ鎖（ＣＤ１３２）をコードする遺伝子を導入して、ｘ連鎖重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を処置するために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。本発明のレトロウイルスベクターは、骨髄幹細胞を形質導入するためにエクスビボで使用され得る。次いで、これらの形質導入された骨髄幹細胞は、疾患を処置するために対象中に注入することができる。

【0578】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、アデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子を導入して、ＡＤＡ重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を処置するために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。本発明のレトロウイルスベクターは、骨髄幹細胞を形質導入するためにエクスビボで使用され得る。次いで、これらの形質導入された骨髄幹細胞は、疾患を処置するために対象中に注入することができる。

【0579】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、ＷＡＳタンパク質をコードする遺伝子を導入してウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）を処置するために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。本発明のレトロウイルスベクターは、骨髄幹細胞を形質導入するためにエクスビボで使用され得る。次いで、これらの形質導入された骨髄幹細胞は、疾患を処置するために対象中に注入することができる。

【0580】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、野生型β－グロビン、野生型胎児グロビンおよび変異した「抗鎌状化」グロビンを含むいくつかのグロビンのうちの１つをコードする遺伝子を導入して鎌状赤血球症またはサラセミアを処置するために使用され得る。当業者に公知であるように、抗鎌状化グロビンの例には、国際公開第２０１４／０４３１３１号および国際公開第１９９６／００９３８５号に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。本発明のレトロウイルスベクターは、骨髄幹細胞を形質導入するためにエクスビボで使用され得る。次いで、これらの形質導入された骨髄幹細胞は、疾患を処置するために対象中に注入することができる。

【0581】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正遺伝子、第ＶＩＩＩ因子を肝臓、筋肉または脂肪細胞に導入して血友病Ａを処置するために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は第ＶＩＩＩ因子である。第ＶＩＩＩ因子遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。

【0582】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正遺伝子、第ＩＸ因子を肝臓、筋肉または脂肪細胞に導入して血友病Ｂを処置するために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は第ＩＸ因子である。第ＩＸ因子遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。

【0583】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、αガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ Ａ）をコードする遺伝子を導入してファブリー病を処置するために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、α－ＧＡＬ Ａタンパク質をコードするＧＬＡ ｃＤＮＡである。該遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。本発明のレトロウイルスベクターは、造血ＣＤ３４^＋幹細胞を形質導入するためにエクスビボで使用され得る。次いで、これらの形質導入された造血ＣＤ３４^＋幹細胞は、疾患を処置するために対象中に注入することができる。

【0584】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、欠損した酵素をコードする遺伝子を導入してポルフィリン症の一形態を処置するために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、以下の表から選択される処置されるべきポルフィリン症のタイプに関連する欠損酵素をコードする遺伝子である。遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。

【0585】

【表1】

【0586】

別の態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、欠損した酵素をコードする遺伝子を導入してムコ多糖症の一形態を処置するために使用され得る。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替のウイルスエンベロープタンパク質で偽型化され得るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性の自己不活型最小レンチウイルスベクターである。レトロウイルスベクターによって運ばれる遺伝子は、以下の表から選択される処置されるべきムコ多糖症のタイプに関連する欠損酵素をコードする遺伝子である。遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。

【0587】

【表2】

【0588】

レトロウイルス治療用ベクターの作製
本発明のレトロウイルスベクターは、４つのプラスミド：
（１）（１つまたは複数の）必要とされる導入遺伝子および本発明の核酸配列をコードする組換えレトロウイルスベクターゲノムプラスミド、
（２）合成レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ発現プラスミド、
（３）例えばＶＳＶ－Ｇを発現し得るエンベロープ（ｅｎｖ）発現プラスミド、および
（４）ＲＮＡ結合タンパク質発現プラスミド
でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性形質移入によって作製され得る。

【0589】

あるいは、ＨＩＶなどの本発明のレトロウイルスベクターは、５つのプラスミド：
（１）（１つまたは複数の）必要とされる導入遺伝子、本発明の核酸配列およびＲＲＥ配列をコードする組換えＨＩＶベクターゲノムプラスミド、
（２）合成ｇａｇ／ｐｏｌ発現プラスミド、
（３）例えばＶＳＶ－Ｇを発現し得るエンベロープ（ｅｎｖ）発現プラスミド、
（４）ＲＮＡ結合タンパク質発現プラスミド、ならびに
（５）ＲＥＶ発現プラスミド
でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性形質移入によって作製され得る。

【0590】

あるいは、ＨＩＶなどの本発明のレトロウイルスベクターは、ウイルスベクターおよびＴＲＡＰの産生のために必要とされる成分をコードする少なくとも１つのモジュール式構築物によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性形質移入によって作製され得、ウイルスゲノムは、本発明の核酸配列を含む。適切なモジュール式構築物には、欧州特許第３５０２２６０号明細書に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。

【0591】

あるいは、一過性形質移入系は、ＴＲＡＰを安定に発現する細胞株を利用し得る。

【0592】

あるいは、本発明のレトロウイルスベクターは、（１）ｇａｇ／ｐｏｌ、（２）ｅｎｖおよび（３）ＴＲＡＰ、ならびにＨＩＶベクターの場合、Ｒｅｖを安定に発現するパッケージング細胞を使用することによって作製され得、必要とされる（１つまたは複数の）導入遺伝子および本発明の核酸配列をコードする組換えレトロウイルスベクターゲノムをコードするプラスミドは、ＨＩＶベクターの場合、ＲＲＥ配列を含み、一過性形質移入によってこのような細胞中に導入される。

【0593】

あるいは、本発明のレトロウイルスベクターは、（１）ｇａｇ／ｐｏｌ、（２）ｅｎｖ、（３）ＴＲＡＰ、（４）必要とされる（１つまたは複数の）導入遺伝子および本発明の核酸配列をコードする組換えＥＩＡＶベクターゲノムを安定に発現するプロデューサ細胞中において産生され得る。

【0594】

あるいは、本発明のＨＩＶベクターは、（１）ｇａｇ／ｐｏｌ、（２）ｅｎｖ、（３）ＴＲＡＰ、（４）必要とされる（１つまたは複数の）導入遺伝子、本発明の核酸配列およびＲＲＥ配列をコードする組換えＨＩＶベクターゲノム、ならびに（５）ＲＥＶを安定に発現するプロデューサ細胞中において産生され得る。

【0595】

ＡＡＶ治療用ベクター
別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、パーキンソン病を処置するためにドーパミン合成経路の３つの酵素をコードする３つの遺伝子を導入するために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、切断型のヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ＊）遺伝子（ＴＨのフィードバック調節に関与するＮ末端の１６０アミノ酸を欠く）、ヒト芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）、およびヒトＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１）遺伝子を含み得る。３つの酵素は、３つの別々のオープンリーディングフレームでＡＡＶベクターによってコードされ得る。あるいは、ＡＡＶベクターは、第１のオープンリーディングフレーム中のＴＨおよびＣＨ１酵素と、第２のオープンリーディングフレーム中のＡＡＤＣ酵素との融合物をコードし得る。遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターによって駆動され得、発現カセットは１つまたはそれより多くのＩＲＥＳエレメントを含み得る。ＡＡＶベクターは、脳の線条体中への直接注射によって投与され得る。

【0596】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、視細胞およびこれを支える網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に矯正ＭＹＯ７Ａ遺伝子を導入し、それにより、アッシャー１Ｂ症候群に伴う視力の低下を減弱または逆転させるように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、ＭＹＯ７Ａタンパク質をコードするＭＹＯ７ＡｃＤＮＡ（長さが１００ｍｂを超える大きな遺伝子）である。大きなＭＹＯ７Ａ遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ／ＭＹＯ７Ａキメラプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0597】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、矯正のためのＡＴＰ結合カセット遺伝子ＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲとしても知られる）を視細胞に導入し、それによってシュタルガルト病をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、ＡＢＣＡ４タンパク質をコードするＡＢＣＡ４ｃＤＮＡである。ＡＢＣＡ４遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーター、視細胞特異的プロモーター、例えばロドプシンキナーゼまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0598】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫または網膜静脈閉塞を有する患者の眼における異常な血管成長および／もしくは血管漏出の再発を予防するように、ならびに／または萎縮型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有する患者の眼における異常な血管成長を予防するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このＡＡＶベクターは、アンジオスタチンおよび／またはエンドスタチンなどの１つまたは複数の抗血管新生タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を送達する。一態様において、ＡＡＶベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してバイシストロン構成のヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する（１つまたは複数の）抗血管新生遺伝子の発現は、ＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）によって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0599】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、移植前のドナー角膜への（１つまたは複数の）抗血管新生遺伝子の送達による血管新生の結果としての角膜移植片拒絶を予防するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。一態様において、ＡＡＶベクターは、角膜移植片へのエクスビボ送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してバイシストロン構成のヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子などの（１つまたは複数の）抗血管新生遺伝子を発現する。ＡＡＶベクターはエクスビボで角膜移植片組織に適用され得、形質導入されたドナー組織も移植前に保存され得る。（１つまたは複数の）抗血管新生遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーターによって駆動され得る。しかしながら、代替のプロモーターが使用され得ることも可能である。

【0600】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫または網膜静脈閉塞を有する患者の眼における異常な血管成長および／もしくは血管漏出の再発を予防するように、ならびに／または萎縮型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有する患者の眼における異常な血管成長を予防するように設計された遺伝子療法として使用され得る。このＡＡＶベクターは、可溶性形態のｆｍｓ様チロシンキナーゼをコードする遺伝子を送達する。（可溶性Ｆｌｔ－１）。可溶性Ｆｌｔ－１遺伝子の発現は、ＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）によって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0601】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫または網膜静脈閉塞を有する患者の眼における異常な血管成長および／もしくは血管漏出の再発を予防するように、ならびに／または萎縮型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有する患者の眼における異常な血管成長を予防するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このＡＡＶベクターは、色素上皮由来因子タンパク質（ＰＥＤＦ）をコードする１つまたは複数の遺伝子を送達する。ＰＥＤＦ遺伝子の発現は、ＣＭＶ、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）などのＲＰＥ特異的プロモーターによって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0602】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫または網膜静脈閉塞を有する患者の眼における異常な血管成長および／もしくは血管漏出の再発を予防するように、ならびに／または萎縮型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有する患者の眼における異常な血管成長を予防するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このＡＡＶベクターは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤、例えば抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその結合断片（例えばアフリベルセプト）、ＶＥＧＦ特異的アプタマー、もしくはＶＥＧＦ受容体の可溶性形態を含むがこれに限定されないＶＥＧＦ遮断ペプチドもしくはポリペプチドおよび／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の阻害剤、例えば抗ＰＤＧＦ抗体もしくはその結合断片、ＰＤＧＦ特異的アプタマー、もしくはＰＤＧＦ受容体の可溶性形態を含むがこれに限定されないＰＤＧＦ遮断ペプチドもしくはポリペプチドをコードする１つの遺伝子または複数の遺伝子を送達する。一態様において、ＡＡＶベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してバイシストロン構成のＶＥＧＦの阻害剤およびＰＤＧＦの阻害剤を発現する。（１つまたは複数の）遺伝子の発現は、ＣＭＶ、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）などのＲＰＥ特異的プロモーターによって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0603】

別の態様において、矯正遺伝子卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）およびＶＭＤ２の疾患関連形態に対して特異的なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードするカセット、またはペリフェリン２をコードする矯正ＲＤＳ遺伝子およびＲＤＳの疾患関連形態に対して特異的なｍｉＲＮＡをコードするカセットを網膜色素上皮細胞に導入し、それにより、ベスト病またはベスト卵黄様黄斑変性（ＢＶＭＤ）をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために、本発明のＡＡＶベクターが使用される。遺伝子の発現は、ＣＭＶ、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）などのＲＰＥ特異的プロモーターによって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0604】

別の態様において、矯正レチンアルデヒド結合タンパク質１遺伝子、ＲＬＢＰ１を網膜色素上皮細胞に導入し、それにより、ＲＬＢＰ１関連網膜ジストロフィーをもたらす病態生理を減弱または逆転させるために、本発明のＡＡＶベクターが使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、ＲＬＢＰ１タンパク質をコードするＲＬＢＰ１ｃＤＮＡである。ＲＬＢＰ１遺伝子の発現は、ＣＭＶ、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）などのＲＰＥ特異的プロモーターによって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0605】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、緑内障を処置するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このＡＡＶベクターは、ＣＯＸ－２および／またはプロスタグランジンＦ２α受容体（ＦＰＲ）をコードする１つまたは複数の遺伝子を送達する。一態様において、ＡＡＶベクターは、眼の前房への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してバイシストロン構成のＣＯＸ－２およびプロスタグランジンＦ２α受容体（ＦＰＲ）遺伝子を発現する。（１つまたは複数の）遺伝子の発現は、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、経角膜注射によって投与され得る。

【0606】

別の態様において、矯正ハーモニン遺伝子を導入して、アッシャー症候群１ｃをもたらす病態生理を減弱または逆転させるために、本発明のＡＡＶベクターが使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、ハーモニンタンパク質をコードするハーモニンｃＤＮＡである。ハーモニン遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0607】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、矯正Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）遺伝子を導入して、全脈絡膜萎縮をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、ＲＥＰ１タンパク質をコードするＲＥＰ１ｃＤＮＡである。ＲＥＰ１遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0608】

別の態様において、（１つまたは複数の）矯正環状ヌクレオチド感受性チャネルベータ２（ＣＮＧＢ２）および／または環状ヌクレオチド感受性チャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）遺伝子を眼の中に導入して、色覚異常をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために、本発明のＡＡＶベクターが使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる（１つまたは複数の）遺伝子は、ＣＮＧＢ２および／またはＣＮＧＡ３タンパク質をコードする（１つまたは複数の）ＣＮＧＢ２および／またはＣＮＧＡ３遺伝子である。（１つまたは複数の）遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0609】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、矯正ＣＥＰ２９０遺伝子を眼の中に導入して、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、２９０ｋＤａの中心体タンパク質をコードするＣＥＰ２９０遺伝子である。ＣＥＰ２９０遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0610】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、矯正網膜色素変性症ＧＴＰ加水分解酵素調節因子（ＲＰＧＲ）遺伝子を眼の中に導入して、ｘ連鎖網膜色素変性症をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、ＲＰＧＲタンパク質をコードするＲＰＧＲ ｃＤＮＡである。ＲＰＧＲ遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0611】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、矯正レチノスキシン１（ＲＳ１）遺伝子を眼の中に導入して、ｘ連鎖網膜分離症（ｒｅｔｉｎｏｃｈｉｓｉｓ）をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、ＲＳ１タンパク質をコードするＲＳ１ｃＤＮＡである。ＲＳ１遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0612】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、矯正網膜色素変性症１（ＲＰ１）遺伝子を眼の中に導入して、網膜色素変性症をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、ＲＰ１タンパク質をコードするＲＰ１ｃＤＮＡである。ＲＰ１遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーター、視細胞特異的プロモーター、例えばロドプシンキナーゼまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0613】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、矯正網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）遺伝子を導入して、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）２型をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、ＲＰＥ６５タンパク質をコードするＲＰＥ６５ｃＤＮＡである。ＲＰＥ６５遺伝子の発現は、ＣＭＶ、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）などのＲＰＥ特異的プロモーターによって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0614】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは矯正ヒトプロリン／アルギニンリッチ末端ロイシン、リッチリピートタンパク質（ＰＲＥＬＰ）遺伝子を導入して、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、萎縮型ＡＭＤ、糖尿病性黄斑浮腫または網膜静脈閉塞をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、ＰＲＥＬＰタンパク質をコードするＰＲＥＬＰｃＤＮＡである。ＰＲＥＬＰ遺伝子の発現は、ＣＭＶ、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）などのＲＰＥ特異的プロモーターによって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0615】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、合成ミオシリン特異的ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を眼の中に導入して、ミオシリンの発現をノックダウンすることによって若年性開放隅角緑内障をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。合成ミオシリン特異的ｍｉＲＮＡの発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0616】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、グルタチオン生合成経路からの（１つまたは複数の）律速酵素であるグルタミン酸－システインリガーゼ（ＧＣＬ）および／もしくはグルタチオンシンセターゼ（ＧＳＳ）、ならびに／または合成γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）特異的ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を眼の中に導入して、遺伝子増強および／またはノックダウンによって、網膜色素変性症をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。（１つまたは複数の）ＧＣＬおよび／もしくはＧＳＳ遺伝子ならびに／または合成ＧＧＴ特異的ｍｉＲＮＡの発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。一態様において、ＡＡＶベクターは、１つまたは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してマルチシストロン構成の（１つまたは複数の）遺伝子および／または合成ｍｉＲＮＡを発現し得る。ＡＡＶベクターは、眼の前房への直接送達によって投与され得る。

【0617】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、前頭側頭葉認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性障害、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの運動ニューロン障害を処置するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このＡＡＶベクターは、ＶＥＧＦ_１４５、ＶＥＧＦ_１６５もしくはＶＥＧＦ_１８９などのＶＥＧＦ－Ａアイソフォームであり得るまたはＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－ＣもしくはＶＥＧＦ－Ｄであり得るＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子を送達し、このような遺伝子は神経保護効果を有する。遺伝子の発現は、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、大きな筋肉群への直接注射によって、または髄腔内もしくは脳室内注射による脳脊髄液中への直接注射によって投与され得る。

【0618】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症を処置するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子を送達する。遺伝子の発現は、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、鼻腔内に、ネブライザーの使用によって、または気管支肺胞洗浄液を介した肺内への直接送達によって投与され得る。

【0619】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、矯正Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）および／またはスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）遺伝子（１つまたは複数）を脳内に導入して、サンフィリポ症候群Ａをもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる（１つまたは複数の）遺伝子は、ＳＧＳＨタンパク質をコードするＳＧＳＨ ｃＤＮＡおよび／またはＳＵＭＦ１タンパク質をコードするＳＵＭＦ１遺伝子である。（１つまたは複数の）遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。一態様において、ＡＡＶベクターは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してバイシストロン構成のＳＧＳＨおよびＳＵＭＦ１遺伝子を発現し得る。ＡＡＶベクターは、直接脳内注射によって投与され得る。

【0620】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、矯正酸性αグリコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子を大きな筋肉群および／または肺内に導入して、ポンペ病をもたらす病態生理を減弱または逆転させるために使用され得る。このＡＡＶベクターは、ＧＡＡタンパク質をコードする遺伝子を送達する。遺伝子の発現は、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、（ｉ）大きな筋肉群中への直接注射によって、および／または（ｉｉ）鼻腔内に、ネブライザーの使用によって、もしくは気管支肺胞洗浄液を介した肺内への直接送達によって投与され得る。

【0621】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、矯正遺伝子、第ＶＩＩＩ因子を肝臓、筋肉または脂肪細胞に導入して血友病Ａを処置するために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は第ＶＩＩＩ因子である。第ＶＩＩＩ因子遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。

【0622】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、矯正遺伝子、第ＩＸ因子を肝臓、筋肉または脂肪細胞に導入して血友病Ｂを処置するために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は第ＩＸ因子である。第ＩＸ因子遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。

【0623】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、欠損した酵素をコードする遺伝子を導入してポルフィリン症の一形態を処置するために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、以下の表から選択される処置されるべきポルフィリン症のタイプに関連する欠損酵素をコードする遺伝子である。遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。

【0624】

【表3】

【0625】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、欠損した酵素をコードする遺伝子を導入してムコ多糖症の一形態を処置するために使用され得る。ＡＡＶベクターによって運ばれる遺伝子は、以下の表から選択される処置されるべきムコ多糖症のタイプに関連する欠損酵素をコードする遺伝子である。遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。

【0626】

【表4】

【0627】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）患者の眼の浮腫における異常な血管成長の再発を予防するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このＡＡＶベクターは、アンジオスタチンおよび／またはエンドスタチンなどの１つまたは複数の抗血管新生タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を送達する。一態様において、ＡＡＶベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してバイシストロン構成のヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する（１つまたは複数の）抗血管新生遺伝子の発現は、ＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（より最近ではベストロフィンプロモーターとして知られている）によって、または代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、眼の硝子体切除後の直接網膜下注射によって投与され得る。

【0628】

別の態様において、本発明のＡＡＶベクターは、前頭側頭葉認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性障害、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの運動ニューロン障害を処置するように設計された遺伝子治療製品として使用され得る。このＡＡＶベクターは、ＶＥＧＦ_１４５、ＶＥＧＦ_１６５もしくはＶＥＧＦ_１８９などのＶＥＧＦ－Ａアイソフォームであり得るまたはＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－ＣもしくはＶＥＧＦ－Ｄであり得るＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子を送達し、このような遺伝子は神経保護効果を有する。遺伝子の発現は、ＣＭＶまたは代替のプロモーターによって駆動され得る。ＡＡＶベクターは、脳室内注射または髄腔内注射を介して脊髄を浸す脳脊髄液中への直接注射によって投与され得る。

【0629】

処置の方法
本発明の別の局面は、本発明のウイルスベクターまたは本発明のウイルスベクターで形質導入された細胞を、該細胞を必要とする対象に投与することを含む処置の方法に関する。

【0630】

本明細書における処置という参照はすべて、治癒的、緩和的および予防的処置を含むが、本発明の文脈においては、予防するという参照が、より一般的に予防的処置に関連することを理解されたい。処置には、疾患進行の予防または遅延も含まれ得る。哺乳動物の処置が特に好ましい。ヒトおよび獣医学的処置の両方が本発明の範囲内である。

【0631】

一態様において、本発明のウイルスベクターまたはウイルスベクター粒子は、ワクチンとして使用するためのものであり得る。ワクチンは、例えば、ヒトまたは獣医用のウイルスをベースとするワクチン（例えば、インフルエンザおよびニューカッスル病ウイルスワクチン）であり得る。

【0632】

本発明は、ワクチンが導入遺伝子を保有する改変されたコンピテントウイルスをベースとする場合に特に有用であり得る。

【0633】

上述のように、鳥類の産生細胞は、ワクチンとして使用するためのウイルスベクターおよびウイルスベクター粒子の作製において使用され得る。

【0634】

薬学的組成物
本発明の別の局面は、本発明のウイルスベクターまたは本発明のウイルスベクターで形質導入された細胞もしくは組織を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含む薬学的組成物に関する。

【0635】

本発明は、遺伝子療法によって個体を処置するための薬学的組成物であって、治療有効量のベクターを含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、ヒトまたは動物の使用のためのものであり得る。

【0636】

組成物は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を含み得る。薬学的担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図された投与経路および標準的な薬学の実務に関して行うことができる。薬学的組成物は、任意の適切な（１種または複数種の）結合剤、（１種または複数種の）潤滑剤、（１種または複数種の）懸濁化剤、（１種または複数種の）コーティング剤、（１種または複数種の）可溶化剤および標的部位へのベクターの進入を補助もしくは増加させ得る他の担体因子（例えば、脂質送達系など）を含み得る、または担体、希釈剤もしくは賦形剤に加えて含み得る。

【0637】

適切な場合、組成物は、吸入の任意の１つもしくは複数によって；坐剤もしくはペッサリーの形態で；ローション、溶液、クリーム、軟膏もしくは粉剤の形態で局所的に；皮膚用パッチ剤の使用によって；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤の形態で経口的に、もしくは単独でもしくは賦形剤と混合したカプセルもしくは膣座薬で、もしくは香味料もしくは着色剤を含有するエリキシル剤、溶液もしくは懸濁液の形態で投与することができ、またはそれらは、非経口的に、例えば、陰茎海綿体内に、静脈内に、筋肉内に、頭蓋内に、眼内にもしくは皮下に注射することができる。非経口投与の場合、組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩または単糖類を含有し得る無菌水溶液の形態で最も適切に使用され得る。頬側または舌下投与の場合、組成物は、従来の様式で製剤化することができる錠剤または甘味入り錠剤の形態で投与され得る。

【0638】

本発明のベクターはまた、標的細胞または標的組織を必要とする患者に前記標的細胞または標的組織を導入する前に、エクスビボで標的細胞または標的組織を形質導入するために使用され得る。このような細胞の例は自己Ｔ細胞であり得、このような組織の例はドナー角膜であり得る。

【0639】

スクリーニングの方法
本発明の別の局面は、核酸結合部位に機能的に連結されたときに関心対象のヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または防止されるように相互作用することができる核酸結合部位および／または同族の核酸結合タンパク質を同定する方法であって、レポーター遺伝子に機能的に連結された核酸結合部位および核酸結合タンパク質の両方を含む細胞におけるレポーター遺伝子の発現を分析することを含む、方法に関する。

【0640】

この方法は、本発明において有用な新規ＲＮＡ結合タンパク質およびそれらの対応する結合部位の同定を可能にし得る。この方法はまた、公知のＲＮＡ結合タンパク質または結合部位の変異型の同定を可能にし得る。

【0641】

一態様において、本方法は、ＴＲＡＰと相互作用する結合部位の同定を可能にする。

【0642】

別の態様において、本方法は、ＴＲＡＰに結合することができる結合部位と相互作用する核酸結合タンパク質の同定を可能にする。

【0643】

一態様において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質をコードする。

【0644】

別の態様において、レポーター遺伝子は、陽性細胞増殖選択マーカー、例えばＺｅｏｃｉｎ（商標）に対する細胞耐性を可能にするｓｈ ｂｌｅ遺伝子産物をコードする。

【0645】

別の態様において、レポーター遺伝子は、陰性細胞増殖選択マーカー、例えばガンシクロビルの存在下で細胞死を引き起こすＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子産物をコードする。

【0646】

改良された機能性についてＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）をスクリーニングする例は以下の通りであり得る。

【0647】

・配列ＫＡＧＮＮの８～１１リピートまたはＫＡＧＮＮおよびＫＡＧＮＮＮの合計８～１１リピートを含む縮重ＤＮＡライブラリーを合成する。

【0648】

・ＧＦＰなどのレポーター遺伝子カセットの５’ＵＴＲ内（好ましくはＯＲＦの１２ヌクレオチド以内）でライブラリーをクローニングする。ライブラリーに連結されたレポーター遺伝子は、必要に応じて、レトロウイルスベクターゲノムおよび作製されたレトロウイルスベクターライブラリー中にクローニングされ得る。

【0649】

・ライブラリーに連結されたレポーター遺伝子カセットを細胞株中に安定に導入し（これは形質移入またはレトロウイルスベクター送達によって達成され得る）、単一クローンを単離する。

【0650】

・対照ＤＮＡ（例えば、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）またはＴＲＡＰ発現プラスミドＤＮＡを使用する並行した形質移入によってクローンをスクリーニングする。両シナリオにおけるレポーター遺伝子発現を測定し、高い非抑制レポーター遺伝子レベル（対照）および低い抑制されたレポーター遺伝子レベル（ＴＲＡＰ）を有するクローンを同定する。

【0651】

・候補クローンからの標的細胞ゲノムＤＮＡからのｔｂｓ配列のＰＣＲ増幅および配列決定によってｔｂｓ配列を同定する。

【0652】

ここで、実施例によって本発明をさらに説明するが、実施例は当業者が本発明を実施するのを助ける役割を果たすことを意図しており、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。

【0653】

ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードすることができることが当業者によって理解されるであろう。さらに、日常的な技術を使用して、本発明において使用するためのポリペプチドがその中において発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するために、当業者は、本発明において使用するためのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行い得ることを理解されたい。

【0654】

ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得る。このような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのインビボでの活性または寿命を増強するために行われ得る。

【0655】

ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、組換え的に、合成的に、または当業者に利用可能な任意の手段によって作製され得る。ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドはまた、標準的な技術によってクローニングされ得る。

【0656】

組換え手段を使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を使用して、一般に、より長いポリヌクレオチドが作製されるであろう。これは、クローニングすることが望まれる標的配列に隣接する（例えば、約１５～３０ヌクレオチドの）プライマーの対を作製すること、プライマーを動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させること、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、増幅された断片を（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することによって）単離すること、および増幅されたＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡを適切なベクター中にクローニングすることができるように、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計され得る。

【0657】

タンパク質
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、単鎖ポリペプチド分子の他、個々の構成ポリペプチドが共有結合または非共有結合手段によって連結されている複数ポリペプチド複合体を含む。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、モノマーがアミノ酸であり、ペプチドまたはジスルフィド結合を介して互いに結合されているポリマーを指す。

【0658】

変異型、誘導体、類似体、相同体および断片
本明細書で言及される特定のタンパク質およびヌクレオチドに加えて、本発明はまた、その変異型、誘導体、類似体、相同体および断片の使用も包含する。

【0659】

本発明の文脈において、任意の所与の配列の変異型は、残基の特定の配列（アミノ酸残基であるかまたは核酸残基であるかを問わない）が、問題のポリペプチドまたはポリヌクレオチドがその内因性機能の少なくとも１つを保持するように改変されている配列である。変異型配列は、天然に存在するタンパク質中に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、修飾、置き換えおよび／または変異によって得ることができる。

【0660】

本発明のタンパク質またはポリペプチドに関して本明細書で使用される「誘導体」という用語は、得られるタンパク質またはポリペプチドがその内因性機能の少なくとも１つを保持することを条件として、配列からのまたは配列への１つ（または複数）のアミノ酸残基の任意の置換、変異、修飾、置き換え、欠失および／または付加を含む。

【0661】

ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される「類似体」という用語は、任意の模倣物、すなわち、その化学的化合物が模倣するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの内因性機能の少なくとも１つを有する化学的化合物を含む。

【0662】

典型的には、改変された配列が必要とされる活性または能力を保持する限り、アミノ酸置換、例えば１、２または３から１０または２０個の置換が行われ得る。アミノ酸置換は、天然に存在しない類似体の使用を含み得る。

【0663】

本発明で使用されるタンパク質はまた、サイレント変化を生成し、機能的に等価なタンパク質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得る。意図的なアミノ酸置換は、内因性機能が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行われ得る。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電されたアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンが挙げられる。

【0664】

保存的置換は、例えば以下の表に従って行われ得る。第２列内の同じブロック内の、好ましくは第３列内の同じ行内のアミノ酸は、互いに置換され得る：

【0665】

【表5】

【0666】

「相同体」という用語は、野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列と一定の相同性を有する実体を意味する。「相同性」という用語は、「同一性」と同じであると見ることができる。

【0667】

本文脈において、相同な配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９７％または９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むと解釈される。典型的には、相同体は、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点で考えることができるが、本発明の文脈においては、配列同一性の観点で相同性を表すことが好ましい。

【0668】

本文脈において、相同な配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９７％または９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。相同性は類似性の観点で考えることができるが、本発明の文脈においては、配列同一性の観点で相同性を表すことが好ましい。

【0669】

相同性比較は、眼によって、またはより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間でのパーセンテージ相同性または同一性を計算することができる。

【0670】

パーセンテージ相同性は、連続する配列にわたって計算され得る、すなわち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このようなギャップなしアラインメントは、比較的少数の残基にわたってのみ行われる。

【0671】

これは極めて単純で一貫した方法であるが、例えば、挿入または欠失がなければ同一であった配列の対において、ヌクレオチド配列中の１つの挿入または欠失が、後続のコドンをアラインメントから除外させ得ることを考慮に入れることができず、したがって、全体的なアラインメントが行われるときに、パーセント相同性の大きな低下をもたらす可能性がある。その結果、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアを過度に引き下げずに、起こり得る挿入および欠失を考慮に入れた最適なアラインメントを生成するように設計されている。これは、局所的な相同性を最大化しようとするために配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。

【0672】

しかしながら、これらのより複雑な方法は、アライメントにおいて生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当て、それにより、同じ数の同一のアミノ酸については、２つの比較される配列間でのより高い関連性を反映する、可能な限り少ないギャップを有する配列アライメントが、多くのギャップを有する配列アラインメントより高いスコアを達成する。ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ内の各後続の残基に対してはより小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が典型的に使用されている。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然ながら、より少ないギャップを有する最適化されたアラインメントを生じる。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティを修正することができる。しかしながら、配列比較のためにこのようなソフトウェアを使用する場合、初期設定値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に対する初期設定のギャップペナルティは、ギャップに対して－１２、各伸長に対して－４である。

【0673】

したがって、最大パーセンテージ相同性の計算は、まず、ギャップペナルティを考慮に入れて、最適なアラインメントを生成することを必要とする。このようなアラインメントを実施するための適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列比較を実施することができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）同書－Ｃｈ．１８）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３－４１０）および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはいずれも、オフラインおよびオンライン検索のために利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）同書，ｐａｇｅｓ ７－５８～７－６０を参照）。しかしながら、いくつかの用途では、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる別のツールもまた、タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するために利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ（１９９９）１７４（２）：２４７－５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ（１９９９）１７７（１）：１８７－８を参照）。

【0674】

最終的なパーセンテージ相同性は、同一性に関して測定することができるが、アラインメントプロセス自体は、典型的には、全か無かの対比較に基づいていない。代わりに、化学的類似性または進化的距離に基づいて各対比較にスコアを割り当てるスケール化された類似性スコア行列が一般に使用される。一般的に使用されるこのような行列の例は、プログラムのＢＬＡＳＴ一式の初期設定の行列であるＢＬＯＳＵＭ６２行列である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、公開の初期設定値または提供される場合には特別の記号比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細についてはユーザマニュアルを参照）。いくつかの用途では、ＧＣＧパッケージの公開の初期設定値、または他のソフトウェアの場合にはＢＬＯＳＵＭ６２などの初期設定行列を使用することが好ましい。

【0675】

ソフトウェアが最適なアラインメントを生成したら、パーセンテージ相同性、好ましくはパーセンテージ配列同一性を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生成する。

【0676】

「断片」もまた変異型であり、この用語は、典型的には、機能的にまたは例えばアッセイにおいて関心のあるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの選択された領域を指す。したがって、「断片」は、完全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸または核酸配列を指す。

【0677】

このような変異型は、部位特異的突然変異誘発などの標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。挿入が行われる場合、挿入部位の両側の天然に存在する配列に対応する５’および３’隣接領域と共に挿入をコードする合成ＤＮＡが作製され得る。隣接領域は、配列が（１つまたは複数の）適切な酵素で切断され、合成ＤＮＡが切断物に連結され得るように、天然に存在する配列中の部位に対応する都合のよい制限部位を含有する。次いで、本発明に従ってＤＮＡを発現させて、コードされたタンパク質を作製する。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作のための当技術分野で公知の多数の標準的な技術の例示にすぎず、他の公知の技術も使用され得る。

【0678】

本発明のＲＮＡ結合タンパク質のすべての変異型、断片または相同体は、ＮＯＩの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または防止されるように、本発明の同族結合部位を結合する能力を保持する。

【0679】

本発明の結合部位のすべての変異型、断片または相同体は、ＮＯＩの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または防止されるように、同族ＲＮＡ結合タンパク質を結合する能力を保持する。

【0680】

コドン最適化
本発明において使用されるポリヌクレオチド（ベクター産生系のＮＯＩおよび／または成分を含む）は、コドン最適化され得る。コドン最適化は、国際公開第１９９９／４１３９７号および国際公開第２００１／７９５１８号に以前に記載されている。異なる細胞では、特定のコドンの使用が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量におけるバイアスに対応する。配列中のコドンが対応するｔＲＮＡの相対的存在量と合致するように調整されるように配列中のコドンを変化させることによって、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において稀であることが知られているコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることが可能である。したがって、さらなる程度の翻訳の制御が利用可能である。

【0681】

ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは多数の稀なコドンを使用しており、これらを一般的に使用される哺乳動物コドンに対応するように変更することによって、関心対象の遺伝子、例えばＮＯＩまたは哺乳動物プロデューサ細胞中のパッケージング成分の増加した発現を達成することができる。コドン使用表は、哺乳動物細胞の他、様々な他の生物について当技術分野で公知である。

【0682】

ウイルスベクター成分のコドン最適化には、いくつかの他の利点がある。ウイルスベクター成分の配列の変化により、プロデューサ細胞／パッケージング細胞中でのウイルス粒子の集合のために必要とされるウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列からは、ＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）が除外される。同時に、パッケージング成分のアミノ酸配列コード配列は、これらの配列によってコードされるウイルス成分が同一性を保つか、またはパッケージング成分の機能が損なわれないように少なくとも十分に類似するように保持される。レンチウイルスベクターにおいては、コドン最適化はまた、搬出のためのＲｅｖ／ＲＲＥの必要性も克服し、最適化された配列をＲｅｖ非依存性にする。コドン最適化はまた、ベクター系内の異なる構築物間（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖオープンリーディングフレームにおける重複領域間）での相同組換えを低減させる。したがって、コドン最適化の全体的な効果は、ウイルス力価の顕著な増加および改善された安全性である。

【0683】

一態様において、ＩＮＳに関連するコドンのみがコドン最適化される。しかしながら、はるかに好ましい実用的な態様においては、配列は、いくつかの例外、例えば、ｇａｇ－ｐｏｌのフレームシフト部位を包含する配列（下記参照）を除いて、配列の全体がコドン最適化される。

【0684】

ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複するリーディングフレームを含む。両タンパク質の発現は、翻訳中のフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳中でのリボソーム「翻訳スリップ」の結果として起こる。この翻訳スリップは、少なくとも部分的にはリボソームを失速させるＲＮＡ二次構造によって引き起こされると考えられる。このような二次構造は、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子中のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、重複領域は、ｇａｇの始まりの下流のヌクレオチド１２２２（ヌクレオチド１はｇａｇＡＴＧのＡである）からｇａｇの終わり（ｎｔ１５０３）まで伸びる。その結果、フレームシフト部位と２つのリーディングフレームの重複領域にまたがる２８１ｂｐ断片は、好ましくはコドン最適化されない。この断片を保持することにより、Ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現が可能になる。

【0685】

ＥＩＡＶの場合、重複の開始はｎｔ１２６２であると解されている（ヌクレオチド１はｇａｇＡＴＧのＡである）。重複の末端は１４６１ｂｐにある。フレームシフト部位およびｇａｇ－ｐｏｌ重複が確実に保存されるようにするために、野生型配列がｎｔ１１５６から１４６５まで保持されている。

【0686】

例えば、都合のよい制限部位を収容するために、最適なコドン使用からの誘導が行われ得、Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質中に保存的なアミノ酸変化が導入され得る。

【0687】

一態様において、コドン最適化は、低度に発現される哺乳動物遺伝子に基づく。第３の塩基、場合によっては第２の塩基および第３の塩基が変更され得る。

【0688】

遺伝暗号の縮重性のために、数多くのｇａｇ－ｐｏｌ配列が当業者によって達成され得ることが理解されるであろう。また、コドン最適化されたｇａｇ－ｐｏｌ配列を生成するための出発点として使用することができる記載された多くのレトロウイルス変異型が存在する。レンチウイルスのゲノムは極めて可変的であり得る。例えば、依然として機能的であるＨＩＶ－１の多くの準種が存在する。これはＥＩＡＶにも当てはまる。これらの変異型は、形質導入過程の特定の部分を強化するために使用され得る。ＨＩＶ－１変異型の例は、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ，ＬＬＣによって運営されているＨＩＶ Ｄａｔａｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ－ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖに見出すことができる。ＥＩＡＶクローンの詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖに位置するＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースに見出すことができる。

【0689】

コドン最適化されたｇａｇ－ｐｏｌ配列に対する戦略は、任意のレトロウイルスに関して使用することができる。コドン最適化されたｇａｇ－ｐｏｌ配列に対する戦略は、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２を含むすべてのレンチウイルスに適用される。さらに、この方法は、ＨＴＬＶ－１、ＨＴＬＶ－２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶおよびヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶおよび他のレトロウイルス由来の遺伝子の発現を増加させるために使用することができる。

【0690】

コドン最適化は、ｇａｇ－ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存性にすることができる。しかしながら、レンチウイルスベクターにおける抗ｒｅｖまたはＲＲＥ因子の使用を可能にするためには、ウイルスベクター生成系を完全にＲｅｖ／ＲＲＥ非依存性にすることが必要であろう。したがって、ゲノムも改変される必要がある。これは、ベクターゲノム成分を最適化することによって達成される。有利には、これらの改変はまた、プロデューサ細胞および形質導入された細胞の両方にすべての追加のタンパク質が存在しないより安全な系の産生をもたらす。

【0691】

表１は、ＫはＴまたはＧであり得、「Ｒ」は配列中のその位置にプリン（すなわち、ＡまたはＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｖ」はＧ、Ａ、またはＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきであり、「Ｎ」は配列中のその位置に任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである配列を示す。例えば、これはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵであり得る。ＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）配列または３’ｔｂｓ配列は斜字体で示され、多重クローニング部位（ＭＣＳ）は下線で示され、コザック配列は太字で示される。

【0692】

【表6】

【実施例】

【0693】

実験の手順
ＤＮＡクローニング
標準的な分子クローニング技術によって発現構築物を作製した。典型的には、再合成（ＧｅｎｅＡｒｔ）によってまたは短いオリゴアダプタによって挿入断片を作製し、制限酵素消化によってレポーター（ＧＦＰ）プラスミド中に挿入して、表記構築物を作製した。弱毒化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の標準的な形質転換および増殖によってプラスミドＤＮＡを作製した。

【0694】

接着性細胞の培養および形質移入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接着様式での形質移入のために使用した－ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ウイルスベクター製造において典型的に使用され、したがって、それらの使用は、関連する文脈での導入遺伝子発現／抑制のモデルとなった。１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭＬ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ）および１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｓｉｇｍａ）を補充した完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ））中、５％ＣＯ_２中、３７℃で細胞を維持した。

【0695】

０．１７５ｃｍ^２容器面積あたりｍＬ完全培地あたり３．５×１０^５細胞でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、およそ２４時間後に、以下の質量比のプラスミドを使用して細胞を形質移入した：「＋ＴＲＡＰ」＝３４．２５ｎｇ／ｃｍ^２のレポータープラスミド、３４．２５ｎｇ／ｃｍ^２のｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ^１および６８．５ｎｇ／ｃｍ^２のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ；「ＴＲＡＰなし」＝３４．２５ｎｇ／ｃｍ^２のレポータープラスミドおよび１０２．８ｎｇ／ｃｍ^２のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ。形質移入は、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ無血清培地中でＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤと混合することによって媒介された。１０ｍｌの新鮮な無血清培地が形質移入培地を置き換える前に、約１８時間後に酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を１０ｍＭの最終濃度まで５～６時間添加した。形質移入の約２日後に、ＧＦＰ発現の分析のために細胞を採取した（またはルシフェラーゼ発現が示され、対照が含まれていた）。

【0696】

懸濁細胞培養および形質移入
ＨＥＫ２９３Ｔ懸濁細胞を懸濁様式での形質移入のために使用した－ＨＥＫ２９３Ｔ懸濁細胞は、ウイルスベクター製造において典型的に使用され、したがって、それらの使用は、関連する文脈での導入遺伝子発現／抑制のモデルとなった。振盪インキュベーター（１９０ＲＰＭに設定された２５ｍｍ軌道）内で、５％ＣＯ^２中、３７℃で、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ＋０．１％ＣＬＣ（Ｇｉｂｃｏ）中において細胞を増殖させた。無血清培地中に８×１０^５細胞／ｍＬで細胞を播種し、２４時間後に、以下の質量／ｍＬ（最終培養体積（ｃｖｏｌ））比のプラスミドを用いて細胞を形質移入した：「＋ＴＲＡＰ」＝３００ｎｇ／ｍＬのレポータープラスミド、３００ｎｇ／ｍＬのｐＥＦ１ａ－ＴＲＡＰ^１および６００ｎｇ／ｍＬのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ；「ＴＲＡＰなし」＝３００ｎｇ／ｍＬのレポータープラスミドおよび９００ｎｇ／ｍＬのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ。形質移入は、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ中でＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤと混合することによって媒介された。酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を約１８時間後に１０ｍＭの最終濃度まで添加した。形質移入の約２日後に、ＧＦＰ発現の分析のために細胞を採取した（またはルシフェラーゼ発現が示され、対照が含まれていた）。

【0697】

ＧＦＰ発現アッセイ
Ａｔｔｕｎｅ－ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いてフローサイトメトリのために形質移入された細胞を調製し、ＧＦＰ発現のパーセンテージおよび蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を測定した。各実験について、％ＧＦＰとＭＦＩ値を乗じて、相対ＧＦＰ発現スコアを得た。ＧＦＰ抑制のレベルを評価するために、このスコアをＴＲＡＰ同時形質移入ありまたはなしの条件と比較した。

【0698】

ルシフェラーゼアッセイ
反復培養では、ウェルあたり添加された室温の１００ｕｌの１×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ中で細胞をインキュベートした。細胞を室温で４５分間インキュベートし、次いで、可溶化液を３×約３０ｕｌの一定分量に分割し、－８０℃で凍結した。ルシフェラーゼアッセイのために、細胞可溶化液（ＰＬＢ中）およびルシフェラーゼアッセイ試薬（ＬＡＲ）を放置して解凍し、室温に平衡させた後、１０ｕｌの可溶化液を白色９６ウェルプレートに形質移入した。ＭＬＸリーダーを使用して、１２秒間の読み取り中に８０ｕｌのＬＡＲ／反応を使用してルシフェラーゼ活性をアッセイした。ルシフェラーゼ活性は、（合計蛍光単位／読み取り時間）を使用することによって算出した。

【0699】

［実施例１］
天然のプロモーター５’ＵＴＲリーダー配列と比較して、改善型リーダーを使用してＴＲＡＰ－ｔｂｓによる普遍的に増強された抑制の実証。

【0700】

（異なる長さおよび組成の異なる天然の５’ＵＴＲを含有する）異なるプロモーターにＴＲＩＰ系を適用する場合には、（ＴＲＡＰなしでの）良好な「ＯＮ」レベルの発現も維持しながら、ＴＲＡＰによる効率的な抑制を与えるために、プロモーター－ＵＴＲ状況内にｔｂｓ配列を単に適用することが可能であることが望ましい。

【0701】

本研究の開始から、ｔｂｓが様々な構成的プロモーターの天然のＵＴＲ中に挿入されるときに、ＴＲＡＰ－ｔｂｓによって媒介される抑制の達成可能なレベルがどの程度であるかは公知でなかった。理想的には、天然の５’ＵＴＲ配列によって誘導され得る抑制レベルの潜在的な変動性のいずれをも回避するために、選択されたプロモーターを改変する場合には、ｔｂｓとともに単一の保存された５’ＵＴＲリーダー配列を供給することができることが有利であろう。驚くべきことに、ＥＦ１αプロモーターの第１のエクソン（配列番号２５）は、天然のリーダー配列を含む５’ＵＴＲリーダーと比較して、ＴＲＡＰによる一貫して良好なレベルの導入遺伝子抑制を提供し、このリーダーは、ＴＲＡＰの非存在下で良好な「ＯＮ」レベルの導入遺伝子発現も提供することが見出された（図３）。

【0702】

本明細書で「Ｌ３３改善型リーダー」と呼ばれるＥＦ１αエクソンの最初の３３ヌクレオチドは、ｔｂｓのすぐ上流に位置し、この配列は、以下のプロモーター：ＲＳＶ、ＥＦ１α／ＥＦＳ、ユビキチン／ＵＢＣ、ＳＶ４０、ヒトＰＧＫおよびＨＳＶ ＴＫの天然のリーダーの５’ＵＴＲ全体を置き換えるために使用された（図３Ａ）。ＣＭＶについては、Ｌ３３改善型リーダーは、本明細書において「原型リーダー」と呼ばれる、国際公開第２０１５／０９２４４０号で使用された原型の３４ｎｔリーダーと比較した。また、異種ＮｏｔＩ部位でこれらのプロモーターの天然の５’ＵＴＲ中にｔｂｓを直接クローニングした（配列の詳細については表Ｉ－パネルＩ／ＩＩを参照）。これらのＧＦＰをコードする構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ＴＲＡＰ発現プラスミド中に個々に同時形質移入し、ＧＦＰ発現を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって測定した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性細胞×ＭＦＩ）をフローサイトメトリデータから求めて、プロットした（図３Ｂ）。

【0703】

データは、試験したすべての構成的プロモーターについて、Ｌ３３改善型リーダーが天然の５’ＵＴＲリーダーを優れていたことを示す。ＴＲＡＰの存在はすべてのｔｂｓ含有構築物に対して測定可能な抑制を媒介したが、達成された抑制のレベルは、Ｌ３３改善型リーダーを含有するものと比較して、天然の５’ＵＴＲ－ｔｂｓ構築物についてはさほど良好ではなかった。さらに、Ｌ３３改善型リーダーを含有する構築物についての（ＴＲＡＰなしでの）発現の「ＯＮ」レベルは、一般に、天然の５’ＵＴＲ－ｔｂｓ構築物より高かった。Ｌ３３改善型リーダーはＣＭＶプロモーター中の原型リーダーと同等に機能し、原型リーダーおよびＬ３３改善型リーダー構成の両方でＴＲＡＰによるより高いレベルの抑制が達成されることを示している。

【0704】

Ｌ３３改善型リーダーを１２ヌクレオチド（すなわち、ＥＦ１αエクソン１の最初の１２ヌクレオチド）に短縮することによって本明細書において「Ｌ１２改善型リーダー」と呼ばれる第２の改善型リーダーを作製し、ｔｂｓとコザック配列の間にＭＣＳ２．１またはＭＣＳ４．１配列（下記参照）のいずれかを有する６つの構成的プロモーター含有ＧＦＰレポーターカセットにクローニングした。それぞれ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）またはｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかとのレポータープラスミドの同時形質移入によって、ＧＦＰ発現の抑制されていないレベルまたは抑制されたレベルについてレポーターを試験した。形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（懸濁液、無血清）を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×蛍光強度中央値）を得て、ｌｏｇ－１０変換した（図８）。

【0705】

データは、Ｌ１２改善型リーダーが、Ｌ３３改善型リーダーと同様に機能して、ＴＲＡＰ－ｔｂｓによる完全な抑制を可能にし、ＧＦＰレベルをバックグラウンドレベルに抑制することを実証する。興味深いことに、ＧＦＰの「ＯＮ」（抑制されていない／ＴＲＡＰなし）レベルは、用いられるプロモーターに応じて、Ｌ１２またはＬ３３についてわずかにより高かった。例えば、「ＯＮ」レベルは、ＥＦＳ構築物ではＬ１２についてより高かったが、ｈｕＰＧＫではＬ３３改善型リーダーが大きな「ＯＮ」レベルを与えた。

【0706】

これは、異なるプロモーターを有するＴＲＩＰ系の利用を検討する場合に、Ｌ１２またはＬ３３のいずれかを選択することができるという点で柔軟性を許容し、その結果、ベクター産生中にＴＲＡＰ－ｔｂｓによって達成される絶対的抑制がＬ１２またはＬ３３改善型リーダーのいずれかについて極めて良好であることを認識しながら、ＴＲＡＰの非存在下での（すなわちベクターを形質導入された細胞中での）遺伝子発現レベルを最大化することができる。

【0707】

【表7】

【0708】

表I:UTR-リーダー、tbsおよびMSC変異型配列
［パネルＩ］異なるプロモーターの５’ＵＴＲ－ｔｂｓ領域においてリーダーを試験し、改善型リーダーと比較した。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターは、国際公開第２０１５／０９２４４０号（原型リーダー）に概説されている合成リーダー配列と共に以前に使用され、該合成リーダー配列は典型的にはＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体が導入遺伝子発現を１００倍超抑制することを可能にする。試験したプロモーターは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、伸長因子１α（ＥＦ１ａ）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、（ヒト）ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈｕＰＧＫ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ｈｓｖＴＫ）であった。ＥＦ１ａおよびＵＢＣ天然５’ＵＴＲはイントロンのスプライシングによる切り出しから生じ、これはスプライシングされた接合をもたらし、配列中では２つの太字のＧＧジヌクレオチドによって示されていることに留意されたい。本研究は翻訳レベル（ＴＲＡＰ－ｔｂｓによって調節される）での導入遺伝子の発現／抑制に焦点を当てているため、ＥＦ１ａおよびＵＢＣの「長い」プレｍＲＮＡ内のイントロンはスプライシングされたｍＲＮＡ中に存在しないので、ＥＦ１ａおよびＵＢＣの「長い」プレｍＲＮＡ内のイントロンの存在は考慮されていないことにも留意すべきである。したがって、ＥＦ１ａプロモーターはイントロンを欠く「短い」変異型（ＥＦＳ）と直接比較可能であり、同様にＵＢＣは「短い」ＵＢＣプロモーターと比較可能である。ＥＦ１ａプロモーター（イントロン含有）との関連における本発明のさらなる変異型は、実施例５に記載されている。本研究において評価された構成的プロモーターは、天然のリーダー配列（下線）に続いてＮｏｔＩ部位を含むまでの合成配列を含む５’ＵＴＲリーダーを有し、ＮｏｔＩ部位の直後にｔｂｓ配列が続いた。改善型リーダーＬ３３およびＬ１２は、ＥＦ１ａプロモーターの第１のエクソンに由来する配列を含む。［パネルＩＩ］ＴＲＡＰ－ｔｂｓおよび半縮重ｔｂｓコンセンサス配列による導入遺伝子（ＧＦＰ）抑制レベルに対するＵＴＲリーダー配列の影響を比較するために本研究において主に使用されたｔｂｓ配列。［パネルＩＩＩ］国際公開第２０１５／０９２４４０号において使用されたＭＣＳなしと比較して、本研究において評価された多重クローニング部位配列を含む配列。下線が引かれた配列はｔｂｓの３’末端を含み、斜字体で表示された配列は制限酵素（ＲＥ）部位を含み（ｔｂｓとコアコザック配列間の配列を最小限に抑えるために配列圧縮を可能にするため、いくつかはｔｂｓおよび／または互いと重複する）、コアコザック配列は太字である。

【0709】

［実施例２］
最適なｔｂｓ－ＭＣＳ－導入遺伝子構成の同定。

【0710】

ＴＲＩＰ系の取り扱いやすさ－特に商業化のために「キット」内での－を改善するために、いくつかの異なる制限酵素（ＲＥ）の選択肢、すなわち、多重クローニング部位（ＭＣＳ）を介して、プロモーター－５’ＵＴＲ－ｔｂｓ配列を含有する発現カセット中に関心対象の導入遺伝子を直接クローニングする能力を有することができることが望ましい（図２Ａを参照）。しかしながら、５’ＵＴＲリーダー配列はＴＲＡＰによって媒介される抑制の程度を調節することができること、およびｔｂｓのＡＴＧ開始コドンへの近接が重要であることを考えると、ＴＲＡＰによって媒介される抑制を維持しながらいくつのおよび／またはどのＲＥ部位の組み合わせを使用することができるかについては、本研究の開始時には明らかではなかった。

【0711】

さらに、さらなる要件は、導入遺伝子の「ＯＮ」レベル（ＴＲＡＰなし）が高いこと、すなわち効率的なコアコザック配列がＭＣＳとＡＴＧの中または間に維持されなければならないことを確実にすることであった。これには、コンセンサスＲＶＶＡＴＧの効率的なコアコザック配列も維持しながら、（ｔｂｓのＡＴＧへの近接性を保持するために）いくつかの（重複する）ＲＥ部位をｔｂｓからＡＴＧまで可能な限り短い距離で組み込むことができるように配列の「圧縮」が必要であった。ｔｂｓと導入遺伝子（本事例ではＧＦＰ）のＡＴＧコドンとの間にクローニングされた７つのＭＣＳ変異型の設計を表Ｉ－パネルＩＩＩ（配列；配列番号５２～５８）および図４Ａに報告する。変異型ＭＣＳ２．１～ＭＣＳ４．４は、ｔｂｓとＡＴＧコドンの間に比較的短い距離（＜１５ｎｔ）を確保しながら、ｔｂｓとコアコザック配列の間に徐々により多くの（重複する）ＲＥ部位を組み込む。すべての事例で、最後の１～２のリピート（ＫＡＧＮＮ）のコンセンサスを乱すことなく、ｔｂｓの３’末端と重複するＳａｃＩまたはＳｐｅＩ部位のいずれかを配置することが可能であった。ＮｃｏＩ部位が導入遺伝子コアコザック配列（ＡＴＧの下流のＧに依存する）中に保持されている場合、ＭＣＳ変異型は、２～４個のＲＥ部位または３～５個のＲＥ部位を導入した；観察されたいずれの差もｔｂｓの上流の配列の影響によるものでないことを保証するために、この状況でＭＣＳの一部として、また実施例１に記載のＬ３３改善型リーダーを使用するＥＦＳプロモーターという状況においても、すべてのＭＣＳ変異型にわたって、合計１５のＲＥ部位（ＮｃｏＩを含めて１６）を試験した。これらのＧＦＰをコードするＭＣＳ変異型（ｓｃＡＡＶ２ベクターゲノムカセット内にクローニングされた）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ＴＲＡＰ発現プラスミド中に個々に同時形質移入し、ＧＦＰ発現を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって測定した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性細胞×ＭＦＩ）をフローサイトメトリデータから求めて、プロットした（図４Ｂ）。

【0712】

データは、ｔｂｓとＡＴＧコドンの間に（元のレポーターでは、ｔｂｓとＡＴＧは９ヌクレオチドによって隔てられている）ＭＣＳを含有しなかった（より強力なＣＭＶプロモーターによって駆動される）元のレポーター構築物と同様のレベルまで、７つすべてのＭＣＳ変異型が抑制され得ることを特定する。重要なことに、７つの変異型のうち６つは、元のレポーター構築物と比較して、ＴＲＡＰによるより良好な抑制を示し、変異型ＭＣＳ２．１、ＭＣＳ４．１およびＭＣＳ４．４は検出不能なレベルに抑制され、「ＯＮ」レベル（ＴＲＡＰなし）には実質的に影響しなかった。

【0713】

ＭＣＳ２．１およびＭＣＳ４．１変異型をさらに検証するために、Ｌ３３改善型リーダーと共に構成的プロモーター（ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＦＳ、ＵＢＣ、ＳＶ４０、ｈｕＰＧＫおよびＨＳＶＴＫ）をコードするｓｃＡＡＶ２ベクターゲノムレポーター構築物にこれらの配列をクローニングした。これらのＧＦＰをコードするレポーター構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ＴＲＡＰ発現プラスミド中に個々に同時形質移入し、ＧＦＰ発現を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって測定した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性細胞×ＭＦＩ）をフローサイトメトリデータから求めて、プロットした（図５）。

【0714】

データは、ＭＣＳ２．１およびＭＣＳ４．１変異型が、利用されているプロモーターに関係なく、優れたＴＲＩＰ抑制プロファイルを示すことを実証している。２つのＭＣＳ変異型のいずれかを含有する構築物の組にわたる平均抑制倍数は約５０００倍であり、多くの構築物について、アッセイにおけるＧＦＰ検出の限界に近かった。

【0715】

［実施例３］
ｔｂｓ－コザック接合の最適化。

【0716】

実施例２におけるＭＣＳ変異型の試験は、ｔｂｓの末端とＡＴＧコドンの間の配列状況もまた、ＴＲＡＰによって達成される抑制の程度において役割を果たし得ることを実証した。また、（国際公開第２０１５／０９２４４０号における元の構成と比較して）抑制の改善されたレベルは、ｔｂｓの３’末端内にコザック配列を「隠す」ことによって達成され得ると仮定された（図２Ｂを参照）。これを達成することができるためには、ｔｂｓの末端の１～２反復コンセンサス（ＫＡＧＮＮ）がコザック配列と部分的に重複することが必ず必要であろう。

【0717】

４つのｔｂｓ－コザック変異型を設計し（表ＩＩ－パネルＩ参照）、図６Ａに示すようにＧＦＰレポーター構築物にクローニングした。変異型０、１および２は、（コンセンサスＧＮＮＲＶＶＡＴＧに一致する）拡張コザック配列は最後の２つのｔｂｓ反復配列と重複するのに対して、変異型３は最後のｔｂｓ反復配列のみと重複するように設計した。コザック配列が最終ｔｂｓ反復配列の３ヌクレオチド下流にある（すなわち、重複なし）元のレポーターと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ＴＲＡＰ発現プラスミド中にこれらの変異型を個々に同時形質移入し、形質移入の２日後にフローサイトメトリによってＧＦＰ発現を測定した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性細胞×ＭＦＩ）をフローサイトメトリデータから求めて、プロットした（図６Ｂ）。

【0718】

ｓｃＡＡＶ２ベクターゲノム発現カセット内の２つの異なるプロモーター（ＥＦＳおよびｈｕＰＧＫ）と併せてこれらのｔｂｓ－コザック変異型のうちの２つを試験し、重複するｔｂｓ／コザック配列を有しないｔｂｓ含有カセットと比較した。これらのＧＦＰレポーターベクターゲノムプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ＴＲＡＰ発現プラスミド中に個々に同時形質移入し、ＧＦＰ発現を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって測定した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性細胞×ＭＦＩ）をフローサイトメトリデータから求めて、プロットした（図９）。非重複ｔｂｓ／コザック変異型（元の変異型およびｔｂｓとコザックとの間にＨｐａＩ部位を含有する第２の変異型）は、５０倍～１００倍抑制することができたのに対して、新しいｔｂｓ－コザック変異型（ｔｂｓ＿Ｖ０およびｔｂｓ＿Ｖ３）は、これの少なくとも１０倍（５００倍～３５００倍）抑制された。これらのｔｂｓ－コザック変異型は、Ｌ３３またはＬ１２改善型リーダーをＥＦＳまたはｈｕＰＧＫプロモーターカセットのいずれかに使用した場合にも同様に機能した。重要なことに、新規変異型の「ＯＮ」レベル（ＴＲＡＰなし）は、非重複ｔｂｓ／コザック変異型と同様であり、新規変異型内のコザック配列が効率的な翻訳を指示するのに効果的であることを示した。

【0719】

データは、ｔｂｓ－コザック変異型のすべてが同様のレベルの「ＯＮ」導入遺伝子発現が可能であったことを示しており、これらのコザック配列が効率的なレベルの翻訳開始を指示したことを示している。変異型１は、元のレポーター構成と比較すると、ＴＲＡＰによる抑制が不十分であった（ＴＲＡＰの存在下で、ＧＦＰ発現のレベルが１０倍高かった）。しかしながら、驚くべきことに、変異型０、２および３は、元の構成と比較してより低いレベルに抑制された。

【0720】

【表8】

【0721】

表II:最適な3’tbs-コザック接合配列
［パネルＩ］上流のｔｂｓ配列の３’末端と重複するように設計された変異型コザック配列。主たる導入遺伝子ＡＴＧ開始コドンがｔｂｓの３’末端のＫＡＧＮＮ反復の９ヌクレオチド下流に配置されるように、すなわち重複が存在しないように、拡張コザック配列を配置した。主たる導入遺伝子ＡＴＧ開始コドンを上流ｔｂｓにより近接して配置するために、効率的な拡張コザックコンセンサス配列（本明細書ではＧＮＮＲＶＶＡＴＧと定義される）も維持しながら、３’末端ｔｂｓ反復のコンセンサスＫＡＧＮＮ反復が維持されるように４つの変異型を設計した。ＫＡＧＮＮ反復配列は括弧内にあり、コザック配列は太字の大文字である。

【0722】

［実施例４］
バイシストロン性カセット中の導入遺伝子のより大きな倍数抑制を可能にするためのＩＲＥＳとｔｂｓの間の改善されたスペーサー配列の同定。

【0723】

国際公開第２０１５／０９２４４０号に報告された元のＴＲＩＰ系では、ＩＲＥＳとＯＲＦの間にｔｂｓを挿入することによって、ＴＲＡＰ－ｔｂｓパラダイムをＩＲＥＳ依存性導入遺伝子の抑制に適用できることが初めて実証された。この構成では、ＩＲＥＳの３’末端とｔｂｓの間に２６ヌクレオチドのスペーサーが含まれていた。

【0724】

本研究では、より良好なレベルの抑制を可能にするためにスペーサー配列が最適化され得ると仮定したため、多数のＩＲＥＳ－スペーサー－ｔｂｓ－ＧＦＰ変異型を構築した（表ＩＩＩ－パネルＩおよび図７Ａを参照）。これらの構築物はすべて、上流発現カセットを含む同一の５’ＵＴＲ－ルシフェラーゼ配列も含有し、これは実験における形質移入効率をモニターするために使用した。スペーサー変異型は、元の２６ヌクレオチドスペーサーまたはこのスペーサーの変異型のいずれかの切断物から構成され、１５または１０または５ヌクレオチド長に切断された。スペーサーを含まない最終的な変異型を作製した。レポーターを含有する元の２６ヌクレオチドスペーサーと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ＴＲＡＰ発現プラスミド中にこれらの変異型を個々に同時形質移入し、ＧＦＰ発現を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって測定した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性細胞×ＭＦＩ）をフローサイトメトリデータから求めて、プロットした（図７Ｂ）。形質移入効率を評価するために、ルシフェラーゼ活性も測定した。

【0725】

データは、１５、１０および５ヌクレオチド長の元のスペーサーのスペーサー切断変異型が、「ＯＮ」レベル（ＴＲＡＰなし）に影響を及ぼすことなく、元のスペーサーと比較してより低い抑制レベルを与えたことを示す。同じことは、変異型スペーサーに基づく１０ヌクレオチドスペーサーについても当てはまった。したがって、改善されたスペーサー配列が同定された。

【0726】

下流のＡＴＧコドンにより近づけて（９ヌクレオチドから３ヌクレオチドに移動した）ｔｂｓを配置するという状況およびｔｂｓ配列中の１１または８反復という状況において、最良のスペーサーの１つ（原型、１５ヌクレオチドに切断）のさらなる検証を行った。これらのさらなる変異型の４つすべてが、原型スペーサーを含有する構成と比較して、ＴＲＡＰによる改善された抑制プロファイルを与え（図７Ｃ）、機能的であるが異なるｔｂｓ状況において他のスペーサーが利用され得ることを実証した。

【0727】

【表9】

【0728】

表III:IRES-スペーサー-コザック配列
［パネルＩ］本研究で使用したＩＲＥＳとｔｂｓ配列の間に使用した変異型スペーサー。国際公開第２０１５／０９２４４０号に概説されている「元の」スペーサー配列は、２６ヌクレオチド長のものである。このスペーサー配列の変異型を作製した（変異型［２６ヌクレオチド］）。これらのスペーサーの両方の切断物を作製し、またスペーサーのない変異型も作製した。Ｏｒｉｇｉｎａｌ－［Ｔｒｕｎｃ－１５ｎｔ］スペーサーは、良好な「オン」レベル（すなわち、ＴＲＡＰの非存在下）を維持しながら、最良のレベルの抑制を与えることが見出された。次いで、１１ｘＫＡＧＮＮ反復または８ｘｔｂｓＫＡＧＮＮ反復ｔｂｓ配列のいずれかと、またｔｂｓの３’末端から下流の導入遺伝子ＡＴＧ開始コドンまでの距離が９ヌクレオチドから３ヌクレオチドに減少された変異型と組み合わせて、Ｏｒｉｇｉｎａｌ－［Ｔｒｕｎｃ－１５ｎｔ］スペーサーを使用した。斜字体の配列はＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素の３’末端を示し、変異型スペーサー配列は太字であり、ｔｂｓコンセンサスは通常の文字で示され、下流の導入遺伝子拡張コザック配列には下線が引かれている。

【0729】

［実施例５］
改善された重複するｔｂｓ－コザック変異型を完全長の、イントロン含有ＥＦ１ａプロモーター中に組み込むこと。

【0730】

前記実施例は、重複するｔｂｓ－コザック変異型が、非重複ｔｂｓ／コザック変異型と比較して抑制を改善することを示し、これは、ＥＦＳプロモーター（その組み込まれたイントロンを除去することによって切断されたＥＦ１ａプロモーター）の状況において実証された。ｔｂｓ－コザック変異型が完全長ＥＦ１ａプロモーター（すなわち、イントロンのスプライシングによる切り出し後）内で同様に「機能する」かどうかを評価するために、３つのｔｂｓ－コザック変異型（０、２、３）を、ＥＦ１ａプロモーターを含有するＧＦＰレポーターカセットにクローニングした（図１０Ａ）。スプライシング後に、５’ＵＴＲは、エクソン１（すなわち、Ｌ３３改善型リーダー）、エクソン２の最初のヌクレオチドを含む短い１２ヌクレオチド配列、次いでｔｂｓ－コザック変異型配列（配列番号６０）を含有する。ｔｂｓを含有しないレポーターと共に、懸濁液、無血清ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ＴＲＡＰ発現プラスミド中にこれらのＧＦＰレポータープラスミドを個々に同時形質移入し、ＧＦＰ発現を形質移入の２日後にフローサイトメトリによって測定した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性細胞×ＭＦＩ）をフローサイトメトリデータから求めて、プロットした（図１０Ｂ）。さらに、（ＭＳＤおよびｃｒＳＤが不活化された、下記参照）ＨＩＶ－１ベースのレンチウイルスベクターゲノムプラスミド中にこれらのｔｂｓ含有ＧＦＰ発現カセットをクローニングし、懸濁液、無血清ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で同様の実験を実施して、ＧＦＰ発現スコアを得た（図１０Ｃ）。データは、実際に、重複するｔｂｓ－コザック変異型は、使用した非重複ｔｂｓ／コザック変異型と比較して改善された導入遺伝子抑制をすることができたことを示す。

【0731】

［実施例６］
ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターは、異常なスプライシングの消失のために、産生中により少ない導入遺伝子タンパク質を産生する
レンチウイルスベクター産生中に異常なスプライシングを消失させることのさらなる利点は、導入遺伝子タンパク質産生をもたらす導入遺伝子をコードするｍＲＮＡの量を低下させることである。

【0732】

この研究の過程で、本発明者らは、予想外にも、ＳＬ２のスプライシング領域（パッケージングシグナルの一部）から内部スプライスアクセプタ部位までのスプライシングによる切り出しに起因して、ベクターゲノムカセットを駆動する「外部」（ＣＭＶ）プロモーターから導入遺伝子をコードするｍＲＮＡが効果的に産生されることを見出した（図１１Ａ）。これが起こる程度は、ｃｐｐｔと導入遺伝子ＯＲＦ間の内部配列（すなわち、プロモーター－５’ＵＴＲ配列）に依存する。導入遺伝子カセットにおけるＥＦ１ａプロモーター（極めて強力なスプライスアクセプタを含有する）の使用は、外部プロモーターに由来する全転写物の９５％超においてＭＳＤからの異常なスプライシングをもたらす（図１２）。標準またはＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクター産生培養物における総ＧＦＰ発現を比較することにより（図１１Ｂ）、本発明者らは、産生中に発現される導入遺伝子タンパク質の最大８０％が異常なスプライス産物に由来することを示す。本発明者らは、ＭＳＤ－２ＫＯ遺伝子型をＴＲｉＰ系と組み合わせると、産生される導入遺伝子タンパク質の低下が増大することを見出した。

【0733】

図１１Ｃは、ＭＳＤおよび下流に位置する潜在的スプライスドナーの両方を変異させる、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムパッケージング領域の「ＭＳＤ２ＫＯ」変異型のＳＬ２ループに対する遺伝子改変を示している（該ＭＳＤ２ＫＯ変異型は、図１１Ｂに示されるデータを作成するために利用された）。本発明者らはまた、３つの他のスプライスドナー領域変異体：［１］同じくＭＳＤおよび潜在的ドナー配列内に２つの特異的変化を導入した「ＭＳＤ２ＫＯｖ２」、［２］ＳＬ２ループ全体を人工ステムループで置き換える「ＭＳＤ２ＫＯｍ５」、ならびに［３］完全なＳＬ２欠失、したがってスプライスドナー領域全体（スプライシング領域とも呼ばれる）を除去する、を作製した。これらは独立して、異常なスプライシング活性を消失させることが示された。

【0734】

［実施例７］
ｔｂｓの３’末端ＫＡＧＮＮ反復によってコアコザック配列を徐々により多く閉鎖することにより、ＴＲＡＰによる導入遺伝子抑制は徐々に増大する。

【0735】

実施例３では、限定された数の重複するｔｂｓ－コザック変異型を作製し、非イントロン含有プロモーターであるＥＦＳおよびｈｕＰＧＫという状況で試験した。次いで、実施例５でのイントロンを含有する完全なＥＦ１ａプロモーターにおいてもこれらの変異型を試験し、この抑制困難なプロモーターが、重複するｔｂｓ－コザック変異型を使用することによって抑制され得ることを示した。

【0736】

ｔｂｓの３’末端ＫＡＧＮＮ反復内にコアコザック配列を「隠す」ことによる改善されたＴＲＡＰ抑制の原理をさらに例示するために、新しい変異型のパネルを設計した（表ＩＶ参照）。これらは、３つの「重複群」ＫＡＧａｔｇ（ＫＡＧＮＮコンセンサスは、コアコザックのＡＴＧと可能な限り重複する、すなわちコアコザックのＡＴＧの最初の２ヌクレオチドと重複する）、ＫＡＧＮａｔｇ（ＫＡＧＮＮコンセンサスがコアコザックのＡＴＧの第１のヌクレオチドと重複する場合）およびＫＡＧＮＮａｔｇ（ＫＡＧＮＮコンセンサスがコアコザックのＡＴＧと重複しない場合）によってコードされるすべての可能な変異型に基づいていた。（実施例３および５における最初の変異型ｔｂｓ－ｋｚｋＶ０、ｔｂｓ－ｋｚｋＶ１およびｔｂｓ－ｋｚｋＶ２は、これらの定義された群に含まれる）。「ＧＴ」ジヌクレオチドを生成したこれらの群内の任意の変異型は、これらが潜在的スプライスドナー部位を生成し得るという望ましくない可能性のために生成／評価されなかった。

【0737】

表ＩＶ：さらなる例示のために作製された重複するｔｂｓ－コザック変異型
望ましくない（潜在的な）スプライスドナー部位を生成し得る「ＧＴ」ジヌクレオチドを生じるものを除いて、ＫＡＧａｔｇまたはＫＡＧＮａｔｇまたはＫＡＧＮＮａｔｇのコンセンサスに関連する「重複群」に相当するすべての可能な変異型を作製した。明確にするためにここでは、最初の１０個のＫＡＧＮＮ反復がコンセンサスとして提示されているが、主に配列番号８の最初の４８ヌクレオチドであった。３’末端ｔｂｓＫＡＧＮＮが、各変異型においてコードされるものとして提示されている（斜字体かつ括弧内）。コアコザックコンセンサスは太字であり、より広い拡張コザックコンセンサスの一部であるとして示される任意のヌクレオチドに下線が引かれている。

【0738】

【表10】

【0739】

一般に、ほとんどの変異型は、ＲＶＶＡＴＧの好ましいコアコザックコンセンサスに一致したが、同時に、表記されたＫＡＧＮＮｔｂｓコンセンサスを含有することに制限される。これらの変異型はｐＥＦ１ａ－ＧＦＰレポータープラスミドにクローニングされたので、５’ＵＴＲはＬ３３リーダー（エクソン１）に加えてエクソン２からの短い１２ヌクレオチド配列を（そのイントロンのスプライシング後に）含有し、これは重複するｔｂｓ－コザック変異型を使用しなければ、ＴＲＡＰによってより抑制されないことが実施例５で以前に示された。典型的にはレンチウイルスベクター（ＬＶ）の形質移入／産生を反映する条件下（例えば、酪酸ナトリウム誘導を含める）で、ＴＲＡＰ発現プラスミドありまたはなしで、これらの変異型で懸濁（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を個別に形質移入し、典型的なＬＶ回収時間（形質移入の２日後）にフローサイトメトリを行った。＋／－ＴＲＡＰ条件に対して全体的なＧＦＰ発現スコアを求め（％ＧＦＰ×ＭＦＩ；ＡｒｂＵ）、次いで、倍数抑制値を求めて、図１３Ａにプロットした。結果は、コアコザックコンセンサス配列が３’末端ＫＡＧＮＮｔｂｓ反復とより多く重複するほど、ＴＲＡＰ抑制のレベルがより向上することを実証している。各重複群の倍数差の統計解析（Ｔ検定）は、コアコザックが３’末端ＫＡＧＮＮｔｂｓ反復とより多く重複するほど抑制が有意に増加することを実証し、最高の抑制スコアは、開始コドンの２／３がＫＡＧＮＮ反復の一部を形成するＫＡＧａｔｇ群から得られる。すべての重複変異型は、非重複ｔｂｓ変異型と比較して、ＴＲＡＰによる統計的により大きな導入遺伝子抑制をもたらした。

【0740】

図１３Ｂでは、データをさらに層別化し、非抑制「オン」導入遺伝子レベルを最高から最低まで表示した。ＫＡＧａｔｇ重複群からの２つの変異型は、ＴＲＡＰ抑制に関してこれらの２つの最高の成績を示した変異型について、ＧＡＧａｔｇ変異型（ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ）が最高の「オン」レベルを与えたことを示すために強調表示されており、おそらくＧＡＧａｔｇ変異型（ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ）はＲＶＶＡＴＧのコアコザックコンセンサスに一致するのに対して、ＴＡＧａｔｇ（ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｔ）は一致しないからである。

【0741】

これらのデータはすべて、重複するｔｂｓ－コザック変異型は、重複していないｔｂｓ変異型と比較して、ＴＲＡＰ抑制を媒介することにおいてより効果的であり、好ましくは、ｔｂｓ－コザック重複は、ベクターを形質導入された標的細胞における良好な「ＯＮ」導入遺伝子発現を確実にするために、ＲＶＶＡＴＧのコアコザックコンセンサスに一致するという一般原理を裏付けている。したがって、これらの新規ｔｂｓ－コザック変異型の使用は、ウイルスベクター産生中のより効率的な導入遺伝子抑制を可能にし、前記導入遺伝子タンパク質活性がウイルスベクターの力価および／または活性に対して有害であれば、ウイルスベクター力価の増加を潜在的にもたらす。

【0742】

［実施例８］
イントロンを有する一般的なプロモーターのＴＲＡＰ媒介性抑制を改善するための最適な重複するｔｂｓ－コザック変異型のさらなる使用。

【0743】

実施例５では、重複するｔｂｓ－コザック変異型の使用は、イントロンを含有する完全長ＥＦ１ａプロモーターを使用した場合にＴＲＡＰ媒介抑制を改善することが示された。遺伝子治療のためにウイルスベクターゲノムにおいて広く使用されている類似のプロモーター、例えばＣＡＧプロモーターの場合、組み込まれたエクソン／イントロン配列の存在は、ＴＲＡＰ媒介性抑制の程度が「天然の」エクソン配列内の配列によって影響され得ることを意味する。ＴＲＡＰ媒介性抑制を改善するという観点からは、特にエクソン配列がスプライシング増強に関与している場合には（例えば、スプライスドナー部位に近接するスプライスエンハンサーエレメント）、エクソン配列を変化させることが自明でないこと、または実施可能でないことがあり得る。広く使用されているＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶエンハンサーエレメント、コアニワトリβ－アクチン遺伝子プロモーター－エクソン１－イントロン配列、およびウサギβ－グロビン遺伝子由来のスプライスアクセプタ－エクソン配列を含む。他の箇所において、本発明では、驚くべきことに、ＥＦ１ａプロモーター（Ｌ３３）由来のエクソン１は、ＴＲＡＰ媒介性抑制を改善するために、すべてのタイプのｔｂｓ変異型の上流で使用することができ、おそらく、安定なＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体の形成を補助する良好な配列状況を与えて、効率的な翻訳阻害を可能にすることができることが見出された。重複するｔｂｓ－コザック変異型は、ＥＦ１ａ（イントロン含有）およびイントロンを欠くいくつかの他のプロモーターの両方においてＴＲＡＰ媒介性抑制を補助することが示された。

【0744】

本実施例では（図１４Ａ参照）、［ａ］ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ変異型（他の実施例では変異型「０」とも呼ばれる）をＣＡＧプロモーター（配列番号１１７）の「自然の」５’ＵＴＲ領域内に配置し、［ｂ］「自然の」イントロン含有５’ＵＴＲ領域全体を、ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ変異型を有するＥＦ１ａ５’ＵＴＲ－イントロン領域（配列番号１１８）と交換することによって、ＣＡＧプロモーターからのＴＲＡＰ媒介性抑制を改善することに、両方の特徴を適用した。対応するスプライシングされた配列を、それぞれ配列番号１１９および配列番号１２０として示す加えて、ウイルスベクターゲノムにおいてイントロンなしで通例使用されるプロモーター（本事例ではＣＭＶ）には、異種イントロンを含有する人工の５’ＵＴＲを付加することができ、その発現はＴＲＡＰによって効率的に抑制されることが例証によって以前に示されていた。具体的には、ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ変異型を有するＥＦ１ａ５’ＵＴＲ－イントロン領域（配列番号１１８）を有する５’ＵＴＲをＣＭＶプロモーター状況で使用した。

【0745】

ウイルスベクター産生シナリオをモデル化して、懸濁（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中での「ＯＮ」発現レベルおよびＴＲＡＰ媒介性抑制の両方について、（ＧＦＰをコードする）これらのレポーター構築物を評価した。細胞をＧＦＰレポータープラスミド＋／－ｐＴＲＡＰで形質移入し、（典型的なウイルスベクター産生のとおりに）形質移入後に酪酸ナトリウムで培養物を誘導し、形質移入の約２日後に（すなわち、典型的なウイルスベクター採取点で）ＧＦＰ発現について細胞を分析した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性×ＭＦＩ；ＡｒｂＵ）を作成し、プロットし（図１４Ｂ）、ＴＲＡＰ抑制スコアを表示した。これらのデータは、典型的なウイルスベクター産生細胞におけるＴＲＡＰ媒介性発現が、ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ変異型を使用してＣＡＧプロモーターから３倍～３０倍改善され得ることを示す。さらに、データは、異なるプロモーター由来の「天然の」５’ＵＴＲ領域配列を、ｔｂｓＫｚｋＶ０．Ｇ変異型を有するイントロン含有ＥＦ１ａ５’ＵＴＲで置き換えることができ、実質的に改善されたＴＲＡＰ媒介性抑制（３０～４０倍から１００倍超）およびＴＲＡＰの非存在下での高遺伝子発現の維持（すなわち、ウイルスベクターを形質導入された標的細胞における発現をモデル化）の両方をもたらすことを示す。したがって、新規ＥＦ１ａ－５’ＵＴＲ－イントロン－ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ配列は、標的細胞においてイントロンによって与えられる既知の利点（すなわち、増加した遺伝子発現）を異種プロモーターに付与するのに有用であり得、同時に、ウイルスベクター産生中の導入遺伝子タンパク質の効率的な抑制も可能にし、前記導入遺伝子タンパク質活性がウイルスベクター力価に対して有害である場合に、ウイルスベクター力価の増加をもたらす可能性がある。これは、他の重複するｔｂｓ－コザック配列とのＥＦ１ａ－５’ＵＴＲ－イントロン配列の使用にも当てはまる。

【0746】

上記明細書中で言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された局面の様々な修正および変形が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。特定の好ましい態様に関連して本発明を説明してきたが、特許請求される発明はそのような特定の態様に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された態様の様々な改変が、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14-1】

【図14-2】

【配列表】

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【国際調査報告】