知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブールの特許一覧 ▶ サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シアンティフィクの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-06
(54)【発明の名称】発光性の双性イオンポリマーナノ粒子
(51)【国際特許分類】
G01N 33/545 20060101AFI20230130BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20230130BHJP
C08F 20/00 20060101ALI20230130BHJP
【ＦＩ】
G01N33/545 A
G01N33/543 575
C08F20/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022533554
(86)(22)【出願日】2020-12-02
(85)【翻訳文提出日】2022-08-02
(86)【国際出願番号】 EP2020084247
(87)【国際公開番号】W WO2021110735
(87)【国際公開日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】19306564.6
(32)【優先日】2019-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＭＡＴＬＡＢ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】500262120
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＳＴＲＡＳＢＯＵＲＧ
(71)【出願人】
【識別番号】509025832
【氏名又は名称】サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シアンティフィク
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】クリムチェンコ，アンドレイ
(72)【発明者】
【氏名】レイシュ，アンドレア
(72)【発明者】
【氏名】ランセル，アンヌ
(72)【発明者】
【氏名】デュジャルダン，ドニ
【テーマコード（参考）】
4J100
【Ｆターム（参考）】
4J100AJ02S
4J100AL03R
4J100AL08P
4J100AM21Q
4J100BA16Q
4J100BA27P
4J100BA27Q
4J100BA34Q
4J100BA56P
4J100GC35
4J100JA53
(57)【要約】
本発明は、双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子、その調製方法、並びに医療分野及び生物学的研究分野におけるこれらのナノ粒子の使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの発光性色素及び少なくとも１つのランダムコポリマーを含んでいる双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子であって、前記ランダムコポリマーは、― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化されるのに適した反応性基であるペンダント基を有する、０～５ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 疎水基であるペンダント基を有する、６０～９５ｍｏｌ％の繰返し単位
を含んでいる、双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子。
【請求項2】
前記ランダムコポリマーは、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキルメタクリラート系ポリマー、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキルアクリラート系ポリマー、アクリルアミド系ポリマー、ポリエステル系ポリマー、ポリアミド（ポリペチド（polypetide））系ポリマー、スチレン系ポリマー及びこれらのコポリマーから選択される、請求項１に記載の双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子。
【請求項3】
双性イオン基は、アンモニオホスフェート、アンモニオホスホネート、アンモニオホスフィネート、アンモニオスルホネート、アンモニオサルフェート、アンモニオカルボキシレート、アンモニオスルホンアミド、アンモニ－スルホン－イミド、グアニジニオカルボキシレート、ピリジニオカルボキシレート、ピリジニオスルホネート、アンモニオ（アルコキシ）ジシアノエテノレート、アンモニオボロネート、スルホニオカルボキシレート、ホスホニオスルホネート、ホスホニオカルボキシレートから選択される、請求項１又は２に記載の双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子。
【請求項4】
前記ランダムコポリマーは（Ｃ１‐Ｃ６）アルキルメタクリラート系ポリマーであり、かつ― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化されるのに適した反応性基であるペンダント基を有する、０～５ｍｏｌ％の繰返し単位、
― （Ｃ１‐Ｃ６）アルキルであるペンダント基を有する、６０～９５ｍｏｌ％の繰返し単位
を含んでいる、請求項１～３のいずれか１項に記載の双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子。
【請求項5】
ナノ粒子は蛍光性色素を場合によりその対イオンと共に含み、前記色素及び前記対イオンはナノ粒子の内部にカプセル化されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子。
【請求項6】
蛍光性色素はローダミン誘導体又はシアニン誘導体から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子。
【請求項7】
ナノ粒子の直径は、５ｎｍ～２００ｎｍ、特に５ｎｍ～１５０ｎｍ、より特定すれば５ｎｍ～１００ｎｍ、さらにより特定すれば５ｎｍ～５０ｎｍ、さらにより特定すれば７～３０ｎｍ、さらにより特定すれば７～２０ｎｍである、請求項１～６のいずれか１項に記載の双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子。
【請求項8】
少なくとも１つのランダムコポリマーを含んでいる機能化された双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子であって、前記ランダムコポリマーは、― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 前記ポリマー鎖に共有結合している、天然又は合成の生物学的に興味深い分子であるペンダント基を有する、０より多いが５ｍｏｌ％以下の繰返し単位
― 疎水基であるペンダント基を有する、６０～９５ｍｏｌ％の繰返し単位
を含んでいる、機能化された双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子。
【請求項9】
前記天然又は合成の生物学的に興味深い分子は、抗体、抗体のフラグメント、ペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、毒素又は化学薬品から選択される、請求項８に記載の機能化された双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子。
【請求項10】
コントラスト剤、診断用薬又は医用造影剤として使用するための、請求項８又は９に記載の機能化された双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子。
【請求項11】
請求項８又は９に記載の双性イオンの機能化された蛍光色素を搭載したポリマーナノ粒子によって、標的生体分子をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで検出又はトラッキングするための方法。
【請求項12】
試料中の標的生体分子、特に抗原を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで検出又はトラッキングするための、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、発光性の双性イオンポリマーナノ粒子、その調製方法、並びに医療分野及び生物学的研究分野におけるこれらのナノ粒子の使用に関する。
【0002】
単一分子かつ超解像の蛍光顕微鏡法の出現は、生細胞内において分子レベルで生体内作用を視覚化することが見込まれる、新しい画像化の分野を切りひらいてきた。細胞質中の単一の生体分子をトラッキング又は視覚化するためには、蛍光発光体は極めて明るい必要がある。確かに、時空間的解像度は収集された光子の数に直接結び付いている。近年、色素搭載型のポリマーナノ粒子が、ナノ粒子の中に大量の蛍光色素をカプセル化することにより極めて高い輝度を達成した（Reisch, A.; Klymchenko, A. S. “Fluorescent Polymer Nanoparticles Based on Dyes: Seeking Brighter Tools for Bioimaging.” Small, (独) , 2016, vol.12, no.15, p.1968-1992）。凝集誘起発光性を備えた蛍光性の有機ドット１、又はフルオロフォアと嵩高い疎水性対イオンとの塩の使用２のような、いくつかの新しい戦略が、極めて高い濃度でカプセル化されたフルオロフォアの凝集起因消光を克服するために使用されてきた。
【0003】
しかしながら生物学的環境で使用するためには、単一分子の画像化は、高輝度のナノ粒子のみならず、プローブの大きさが小さいこと、及び生物学的環境との非特異的相互作用が無いことも必要である３。第１に、局在化の精度を高めるために、粒子径はその粒子が標識するように意図される生体分子（例えばタンパク質）の大きさ程度である必要がある。第２に、ナノ粒子の大きさ及び表面コーティングは該ナノ粒子の細胞内での挙動を規定するのに重要な役割を果たすが、該ナノ粒子による標識生体分子の挙動に対する影響は限定されるべきである４、５。細胞内のような生物学的環境におけるナノ粒子の拡散は、構造上の制約及び細胞内部の巨大分子混み合い効果により制限される可能性がある６。Etocらは、≦５０ｎｍの粒子が細胞質ゾル内でブラウン拡散することができることを測定した４。本発明者らも過去に、ＮＰが細胞質ゾルのほぼ全ての領域に到達することができる限界のコアサイズが約２３ｎｍであることを示した５。同時に、表面化学も生体系におけるナノ粒子の挙動に対して大きな影響を及ぼし７、かつ細胞質ゾル中のＮＰの拡散及び運動に影響を与える可能性がある４。この理由の１つは、表面化学がタンパク質との相互作用を決定するであろうということである。特に、タンパク質コロナの形成をもたらすタンパク質の吸着は、細胞内取込みから分解までＮＰの挙動の全局面に影響を与え８、またタンパク質とＮＰ表面との間に強い相互作用がある限り、ナノ粒子は細胞質ゾルの中で自由に移動することはできない４。したがって、タンパク質の吸着を低減（抑制）するための表面特性の制御が不可欠である。
【0004】
これまでのところ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の導入が、ナノ粒子上へのタンパク質吸着を抑制するための最もよく知られた戦略である９。しかしながら、ＰＥＧ化は生体分子（例えばタンパク質）の大きさに似た大きさのナノ粒子を生産するのに十分には適していない、というのもタンパク質との相互作用を効果的に抑制するのに必要なＰＥＧ鎖は、粒子径も数ナノメートル及び多くの場合は約１０ｎｍ、増大させてしまうからである１０、１１。
【0005】
例えば、国際公開第２０１８／０４４６８８号には、１以上の両親媒性ポリマーの中にカプセル化された１以上の疎水性ポリマーの混合物を含んでいる水分散性の蛍光性粒子について記載されている。前記両親媒性ポリマーは、ＰＳ‐ｂ‐ＰＥＧのような、少なくとも１つの疎水性セグメント及び少なくとも１つの親水性セグメントを含んでいる「ブロック」コポリマーである。
【0006】
他の方法は、細胞膜の外側表面を模倣する双性イオン（ＺＩ）基の使用である１２。双性イオンの場合のタンパク質吸着の抑制メカニズムは、ＰＥＧの場合のような立体反発力ではなく、双性イオンの高い親水性及び双性イオンが自身の対イオンを内包しているという事実に関係している１１、１２。したがって、ＰＥＧコーティングとは異なり、双性イオンコーティングは、非常に薄くして粒子径の増大を制限することができる。ＮＰ表面上に双性イオン基、特にカルボキシベタイン、スルホベタイン及びホスホリルコリン基を実装するための、いくつかの手法が開発されている。しかしながら、過去に開発されたほとんどの双性イオンナノ粒子は、量子ドット（ＱＤ）１３、シリカＮＰ１１、又はＡｕのＮＰ１４のような無機ナノ粒子である。
【0007】
これまでのところ、ポリマーナノ粒子の場合には、双性イオンポリマー粒子は主に双性イオンブロック及び疎水性ブロックを有する「ブロック」コポリマーから得られている。
この手法の欠点は、これらのＮＰの直径が満足なものではなく、ｉｎ ｖｉｖｏ環境での該ＮＰの使用が制限されることである。なお、その合成方法は多くの場合非常に複雑である。
この手法の欠点は、これらのＮＰの直径が満足なものではなく、ｉｎ ｖｉｖｏ環境での該ＮＰの使用が制限されることである。なお、その合成方法は多くの場合非常に複雑である。
【0008】
よって、標的とする生体分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏでの検出又はトラッキングを改善するために、高輝度であり、大きさが制御可能で小型であり、かつタンパク質表面相互作用が限定的である、新たな双性イオンポリマーナノ粒子群を提供することが必要である。
【0009】
上記の要件を満たすために、本発明の発明者らは、無極性基、荷電基、双性イオン基及びバイオコンジュゲーション用の反応性基を有している特殊な設計のランダム疎水性ポリマーを基にした、新規な発光性の双性イオンナノ粒子を開発した。
【0010】
双性イオンブロック及び疎水性ブロックが分離されてポリマー鎖の両端に局在している先行技術において既知のブロック双性イオンコポリマーとは対照的に、本発明のナノ粒子を形成している双性イオンコポリマーは、負の荷電基及び双性イオン基の両方を、コポリマーの疎水性ペンダント基に混じってポリマー主鎖上に不規則に配置構成された状態で有している。
【0011】
あらゆる予想を覆して、この少量の双性イオン基及び負の荷電基のランダムな配置構成が、同時にナノ粒子の大きさをさらに縮小してナノ粒子表面へのタンパク質吸着を効果的に抑制しつつ高い発光輝度を維持することも可能である、ということは驚くべきことである。
【0012】
本発明のナノ粒子の直径はわずか７～２０ｎｍとすることが可能であるが、これは生きた細胞及び組織並びに固定された細胞及び組織の細胞質中において単一粒子レベルで直接モニタリングするのに特に適している。
【0013】
本発明の第１の態様は、双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子を提供することであり、前記ナノ粒子は少なくとも１つの発光性色素及び少なくとも１つのランダムコポリマーを含んでおり、前記ランダムコポリマーは、
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化されるのに適した反応性基であるペンダント基を有する、０～５ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 疎水基であるペンダント基を有する、６０～９５ｍｏｌ％の繰返し単位
を含んでいる。
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化されるのに適した反応性基であるペンダント基を有する、０～５ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 疎水基であるペンダント基を有する、６０～９５ｍｏｌ％の繰返し単位
を含んでいる。
【0014】
いかなる理論によっても拘束されるものではないが、本発明のナノ粒子は恐らく、主にコポリマーの疎水性部分及び色素塩から構成された疎水性コアを有する。他方、タンパク質吸着に対する優れた抵抗性、及び細胞質ゾルにおける粒子の高い移動性は、高密度の双性イオン基を備えた高親水性の表面を示唆している。よって、本発明のナノ粒子は、両親媒性ポリマーの疎水性部分がコアにおいて顕著に高濃度であって発光性色素のカプセル化を担い、荷電部分及び双性イオン部分がシェルにおいて豊富であって相互作用の制御を担う、コア‐シェル構造を有するものと予想される。
【0015】
所与の大きさの粒子コアについて、本発明のナノ粒子は、同一の主要モノマーを基にしたＰＥＧ化ナノ粒子に対してナノ粒子全体の大きさを２分の１に縮小することを可能にする。これは、双性イオンの粒子の場合の粒子シェルの大きさが対応するＰＥＧ化物と比較して小さいことによる。粒子の輝度は、該粒子のコア内にカプセル化された色素の数に依存し、かつその結果として、全体の大きさを所与とすれば、コア直径と粒子全体（コア及びシェル）の直径の比に依存する。従って、粒子全体の直径が同一である場合、シェルが非常に薄いためほぼ２倍の大きなコア径を有する本発明の粒子の輝度は、ほぼ８倍に高めることができる。本発明の粒子の高い搭載量（＞２０重量％）及び量子収率（＞３０％）が確認されている。このことは、本発明のナノ粒子が非双性イオンのナノ粒子と比較して極めて明るいことを意味している。
【0016】
よって、本発明のナノ粒子は、一方では粒子の高い輝度をもたらす効率的な色素のカプセル化及び高い量子収率と、他方では優れた安定性及びタンパク質吸着抵抗性とを、兼ね備えたものである。
【0017】
本明細書中で使用されるように、用語「ランダムコポリマー」は、特定の配列ではなく重合した２種類以上のモノマーを有するコポリマーを意味する。ランダムコポリマーにおいて、個々の繰返し単位はそのコポリマーの主鎖に沿って無作為に分布している。
【0018】
用語「繰返し単位」は、単位であって該単位を繰り返せばポリマー鎖に沿って繰返し単位を連続的に繋ぎ合わせることによる完全なポリマー鎖が生じることになる、単位を意味する。
本明細書中で使用されるように、ポリマーに関する用語「ペンダント基」は、ポリマーの主鎖に取り付けられた一群の分子を意味する。
本明細書中で使用されるように、ポリマーに関する用語「ペンダント基」は、ポリマーの主鎖に取り付けられた一群の分子を意味する。
【0019】
結果として、主要モノマーのペンダント基は、その主要モノマーを用いて重合されたランダムコポリマーの主要なペンダント基でもある。
ポリマーの「主鎖」という用語は、ポリマーの線状鎖であって、他の全ての長鎖若しくは短鎖又はその両方が該線状鎖に垂下していると考えることができるものを指す。
ポリマーの「主鎖」という用語は、ポリマーの線状鎖であって、他の全ての長鎖若しくは短鎖又はその両方が該線状鎖に垂下していると考えることができるものを指す。
【0020】
本明細書中で使用されるように、「天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基」という表現は、バイオコンジュゲーション用の任意の反応性基、すなわち、特に細胞、組織又は生体液の中で標的の生体分子を認識する分子、例えば抗体、抗体のフラグメント、リガンド、天然の生体分子のアゴニスト若しくはアンタゴニスト、ペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、毒素又は化学薬品などの分子の対応する反応性官能基と、例えば共有結合によって化学反応することができる任意の反応性基、を意味している。
【0021】
本発明によれば、前記ランダムコポリマーは、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキルメタクリラート系ポリマー、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキルアクリラート系ポリマー、アクリルアミド系ポリマー、ポリエステル系ポリマー、ポリアミド（ポリペチド（polypetide））系ポリマー、スチレン系ポリマー及びこれらのコポリマーであってよい。
【0022】
本発明との関連において用語「（Ｃ１‐Ｃ６）アルキルメタクリラート系ポリマー」は、主要モノマーとしての（Ｃ１‐Ｃ６）アルキルメタクリラートとその他の微量モノマーとによって形成されたコポリマーとして理解されることになる。
【0023】
本発明との関連において、用語「（Ｃ１‐Ｃ６）アルキルアクリラート系ポリマー」、「アクリルアミド系ポリマー」「ポリエステル系ポリマー」、「ポリアミド系ポリマー」、「スチレン系ポリマー」も同様に解釈されるべきである。
【0024】
（Ｃ１‐Ｃ６）アルキルメタクリラート系ポリマーの例は、メチルメタクリラート系コポリマー、エチルメタクリラート系コポリマー、プロピルメタクリラート系コポリマー、イソプロピルメタクリラート系コポリマー、又はブチルメタクリラート系コポリマーであってよい。
【0025】
ポリエステル系ポリマーの例には、限定するものではないが、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）系コポリマー、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）（ＰＬＧＡ）系コポリマー、ポリ乳酸（ＰＬＡ）系コポリマー、又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）系コポリマーを挙げることができる。
【0026】
本発明のナノ粒子に含まれるランダムコポリマーの実施形態は、以下の式Ｉ：
によって表わされ、上記式中、
― ｍは０又は１であり、
― ｎは１～６から選択された整数であり、
― Ｒ１は双性イオン基であり、
― Ｒ２は負の荷電基であり、
― Ｒ３は天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基であり、
― ｘは０．５～２０ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｙは３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｚは０～５ｍｏｌ％の範囲にある。
【化1】
― ｍは０又は１であり、
― ｎは１～６から選択された整数であり、
― Ｒ１は双性イオン基であり、
― Ｒ２は負の荷電基であり、
― Ｒ３は天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基であり、
― ｘは０．５～２０ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｙは３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｚは０～５ｍｏｌ％の範囲にある。
【0027】
本発明のナノ粒子に含まれるランダムコポリマーのより具体的な実施形態は、以下の式Ｉａ：
によって表わすことが可能であり、上記式中、
― ｍは０又は１であり、
― ｎは１～６から選択された整数であり、
― ｘは０．５～２０ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｙは３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｚは０～５ｍｏｌ％の範囲にあり、
― Ｒ２は負の荷電基、例えばＯ－又は‐（Ｏ‐（ＣＨ２）３‐ＳＯ３‐であり、
― Ｒ３は天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基である。
【化2】
― ｍは０又は１であり、
― ｎは１～６から選択された整数であり、
― ｘは０．５～２０ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｙは３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｚは０～５ｍｏｌ％の範囲にあり、
― Ｒ２は負の荷電基、例えばＯ－又は‐（Ｏ‐（ＣＨ２）３‐ＳＯ３‐であり、
― Ｒ３は天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基である。
【0028】
本発明のナノ粒子に含まれるランダムコポリマーの別の実施形態は、以下の式ＩＩ：
によって表わされ、上記式中、
― Ｒ１は双性イオン基であり、
― Ｒ２は負の荷電基であり、
― Ｒ３は天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基であり、
― ｘは０．５～２０ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｙは３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｚは０～５ｍｏｌ％の範囲にある。
【化3】
― Ｒ１は双性イオン基であり、
― Ｒ２は負の荷電基であり、
― Ｒ３は天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基であり、
― ｘは０．５～２０ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｙは３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｚは０～５ｍｏｌ％の範囲にある。
【0029】
特定の実施形態によれば、本発明の双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子は、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキルメタクリラート系ポリマーであるランダムコポリマーを含み、前記ランダムコポリマーは、
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より具体的には７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基であるペンダント基を有する、０～５ｍｏｌ％の繰返し単位、
― （Ｃ１‐Ｃ６）アルキルであるペンダント基を有する、７０～９５ｍｏｌ％の繰返し単位
を含んでいる。
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より具体的には７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基であるペンダント基を有する、０～５ｍｏｌ％の繰返し単位、
― （Ｃ１‐Ｃ６）アルキルであるペンダント基を有する、７０～９５ｍｏｌ％の繰返し単位
を含んでいる。
【0030】
本発明のランダムポリマーに含まれる微量のペンダント基のうち１つの種類は、ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基である。
本発明のナノ粒子に含まれるランダムコポリマーは、ペンダント基として負の荷電基を有する０．５～２０％の繰返し単位を有している。
本発明のナノ粒子に含まれるランダムコポリマーは、ペンダント基として負の荷電基を有する０．５～２０％の繰返し単位を有している。
【0031】
本発明のランダムポリマーに含まれる微量のペンダント基のうち別の種類は、双性イオン基である。
【0032】
「双性イオン基」という用語は、正電荷を有する部分と、負電荷を有する別の隣接していない部分とを同時に含有する化学基を指す。上記のランダムコポリマーに含まれることが可能な双性イオン基の例は、アンモニオホスフェート（ammoniophosphates）、アンモニオホスホネート（ammoniophosphonates）、アンモニオホスフィネート（ammoniophosphinates）、アンモニオスルホネート（ammoniosulfonates）、アンモニオサルフェート（ammoniosulfates）、アンモニオカルボキシレート（ammoniocarboxylates）、アンモニオスルホンアミド（ammoniosulfonamides）、アンモニ－スルホン－イミド（ammoni-sulfon-imides）、グアニジニオカルボキシレート（guanidiniocarboxylates）、ピリジニオカルボキシレート（pyridiniocarboxylates）、ピリジニオスルホネート（pyridiniosulfonates）、アンモニオ（アルコキシ）ジシアノエテノレート（ammonio(alkoxy)dicyanoethenolates）、アンモニオボロネート（ammonioboronates）、スルホニオカルボキシレート（sulfoniocarboxylates）、ホスホニオスルホネート（phophoniosulfonates）、ホスホニオカルボキシレート（phosphoniocarboxylates）から選択することができる。
【0033】
本発明のナノ粒子に含まれるランダムコポリマーは、ペンダント基として双性イオン基を有する繰返し単位を、３～３０％、特に５～２０％、より特定すれば７～１７％有している。
前記ランダムコポリマーに高親水性の双性イオン基が存在することにより、コポリマーの親水性は増大する。しかしながら、本発明のナノ粒子に含まれるランダムコポリマーは、疎水性ペンダント基が大半を占めることにより基本的には疎水性のままである。
前記ランダムコポリマーに高親水性の双性イオン基が存在することにより、コポリマーの親水性は増大する。しかしながら、本発明のナノ粒子に含まれるランダムコポリマーは、疎水性ペンダント基が大半を占めることにより基本的には疎水性のままである。
【0034】
双性イオン基及び負の荷電基が存在するおかげで、本発明のナノ粒子の大きさは際立って小さい。
【0035】
本発明のナノ粒子の直径は、５ｎｍ～２００ｎｍ、特に５ｎｍ～１５０ｎｍ、より特定すれば５ｎｍ～１００ｎｍ、さらにより特定すれば５ｎｍ～５０ｎｍ、さらにより特定すれば７～３０ｎｍ、さらにより特定すれば７～２０ｎｍである。
ナノ粒子の直径及び粒度分布は、電子顕微鏡検査又は動的光散乱によって従来の方法で計測することができる。
ナノ粒子の直径及び粒度分布は、電子顕微鏡検査又は動的光散乱によって従来の方法で計測することができる。
【0036】
本発明のナノ粒子はさらに発光性色素を含む。
本発明の範囲内で、前記発光性色素は蛍光性色素又はリン光性色素であってよい。
前記発光性色素はさらに、発光性金属錯体であってもよい。
本発明の範囲内で、前記発光性色素は蛍光性色素又はリン光性色素であってよい。
前記発光性色素はさらに、発光性金属錯体であってもよい。
【0037】
好ましい実施形態では、前記発光性色素は蛍光性色素であって場合によりその対イオンを備えたものであり、前記色素及び前記対イオンはナノ粒子の内部にカプセル化される。
【0038】
蛍光性色素の例には、限定するものではないが、ローダミン誘導体、シアニン誘導体、フルオレセイン誘導体、ＢＯＤＩＰＹ誘導体、アザＢＯＤＩＰＹ誘導体、クマリン、スクアライン、ポルフィリン又はフタロシアニンを挙げることができる。
イオン性色素に適した対イオンは、無機対イオン又は嵩高い有機対イオンであってよい。
無機対イオンの例には、限定するものではないが、クロリド、ペルクロレート、スルホネート、ニトレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェートが挙げられる。
イオン性色素に適した対イオンは、無機対イオン又は嵩高い有機対イオンであってよい。
無機対イオンの例には、限定するものではないが、クロリド、ペルクロレート、スルホネート、ニトレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェートが挙げられる。
【0039】
本明細書中で使用されるような用語「嵩高い有機対イオン」は、芳香族及び／又は脂肪族の残基を有している大きな有機陰イオンを意味する。嵩高い有機対イオンの例には、限定するものではないが、テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボラート、テトラキス（４‐フルオロフェニル）ボラート、テトラキス［３，５‐ビス（トリフルオロメチル）フェニル］ボラート、テトラキス［３，５‐ビス（１，１，１，３，３，３‐ヘキサフルオロ‐２‐メトキシ‐２‐プロピル）フェニル］ボラート、テトラキス［ペルフルオロｔｅｒｔ‐ブトキシ］アルミナート、又はテトラフェニルボラートを挙げることができる。
【0040】
いくつかの実施形態によれば、本発明のランダムコポリマーはさらに、天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基である第３の種類の微量のペンダント基を含むこともできる。
【0041】
例えば、前記反応性基は、アジド基、テトラジン基、アルケニル基、若しくは付加環化を行なうことができるその他の反応性基のような、「クリックケミストリー」に適した反応性基、又は、マレイミド基、若しくはペンタフルオロフェニルエステルやＮＨＳエステルのような活性エステルなどの反応性基であってよい。
【0042】
この第３の種類の微量のペンダント基により、天然又は合成の生物学的に興味深い分子を本発明の発光性の双性イオンナノ粒子と組み合わせることが可能となる。
【0043】
前記天然又は合成の生物学的に興味深い分子の例は、限定するものではないが、細胞、組織又は生体液の中で標的の生体分子を認識する分子、例えば抗体、抗体のフラグメント、リガンド、天然の生体分子のアゴニスト若しくはアンタゴニスト、ペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、毒素又は化学薬品であってよい。
【0044】
反応性基を有しているこの種の発光性の双性イオンナノ粒子は、該ナノ粒子の予定された用途に照らして簡単にさらなる機能化を行うことが可能であるので、特に興味深い。
いくつかの実施形態によれば、本発明の発光性の双性イオンポリマーナノ粒子は、前述のようなランダムコポリマーを唯一のポリマー材料として含むことができる。
いくつかの実施形態によれば、本発明の発光性の双性イオンポリマーナノ粒子は、前述のようなランダムコポリマーを唯一のポリマー材料として含むことができる。
【0045】
他のいくつかの実施形態によれば、本発明の発光性の双性イオンポリマーナノ粒子は、上述のようなランダムコポリマーを別のポリマーとともに含んでもよいし、上述のようなランダムコポリマーを少なくとも２種類含んでもよい。
【0046】
好ましい実施形態では、本発明の発光性の双性イオンポリマーナノ粒子は、
― 生物学的に興味深い分子を用いたナノ粒子の機能化に適している反応性基を備えた上述のような第１のランダムコポリマー、及び
― ナノ粒子の機能化のための反応性基を備えていない上述のような第２のランダムコポリマー
を含んでいる。
― 生物学的に興味深い分子を用いたナノ粒子の機能化に適している反応性基を備えた上述のような第１のランダムコポリマー、及び
― ナノ粒子の機能化のための反応性基を備えていない上述のような第２のランダムコポリマー
を含んでいる。
【0047】
反応性基を有するランダムコポリマーと反応性基を含まない別のランダムコポリマーとの混合物は、この反応性基を介してナノ粒子に結合され、かつ例えばナノ粒子の検出感度、標的分子の定量、又は単一分子のトラッキングにさらに影響を及ぼすであろう生物学的に興味深い分子の量を、より高い精度で制御することを可能にする。
【0048】
特定の実施形態において、本発明の双性イオンポリマーナノ粒子は第１のランダムコポリマー及び第２のランダムコポリマーを含み、
第１のランダムコポリマーは、
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基であるペンダント基を有する、０より多いが５ｍｏｌ％以下の繰返し単位
を含んでおり、
第２のランダムコポリマーは、天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基を含んでおらず、かつ
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位
を含んでいる。
第１のランダムコポリマーは、
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基であるペンダント基を有する、０より多いが５ｍｏｌ％以下の繰返し単位
を含んでおり、
第２のランダムコポリマーは、天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基を含んでおらず、かつ
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位
を含んでいる。
【0049】
別の特定の実施形態では、本発明の発光性の双性イオンポリマーナノ粒子は、
― 第１の種類の生物学的に興味深い分子を用いたナノ粒子の機能化に適している反応性基を備えた、上述のような第１のランダムコポリマー、及び
― 第２の種類の生物学的に興味深い分子を用いたナノ粒子の機能化に適している反応性基を備えた、上述のような第２のランダムコポリマー
を含んでいる。
― 第１の種類の生物学的に興味深い分子を用いたナノ粒子の機能化に適している反応性基を備えた、上述のような第１のランダムコポリマー、及び
― 第２の種類の生物学的に興味深い分子を用いたナノ粒子の機能化に適している反応性基を備えた、上述のような第２のランダムコポリマー
を含んでいる。
【0050】
したがってこの種のナノ粒子は、２種類の生物学的に興味深い分子を用いて機能化することができる。
発光性の双性イオンナノ粒子に反応性基が存在することにより、前記ポリマー鎖への共有結合を通じて前記ナノ粒子を天然又は合成の生物学的に興味深い分子により容易に機能化することが可能となる。
発光性の双性イオンナノ粒子に反応性基が存在することにより、前記ポリマー鎖への共有結合を通じて前記ナノ粒子を天然又は合成の生物学的に興味深い分子により容易に機能化することが可能となる。
【0051】
よって、本発明の別の態様は、新規な機能化された双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子を提供することである。
【0052】
前記機能化された双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子は、少なくとも１つのランダムコポリマーであって、
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 前記ポリマー鎖に共有結合している天然又は合成の生物学的に興味深い分子であるペンダント基を有する、０より多いが５ｍｏｌ％以下の繰返し単位、
― 疎水基であるペンダント基を有する、６０～９５ｍｏｌ％の繰返し単位
を含んでいるランダムコポリマーを含んでいる。
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 前記ポリマー鎖に共有結合している天然又は合成の生物学的に興味深い分子であるペンダント基を有する、０より多いが５ｍｏｌ％以下の繰返し単位、
― 疎水基であるペンダント基を有する、６０～９５ｍｏｌ％の繰返し単位
を含んでいるランダムコポリマーを含んでいる。
【0053】
特定の実施形態では、本発明の前記機能化された双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子は、以下の式ＩＩＩ
で表すことが可能であり、上記式中、
― ｍは０又は１であり、
― ｎは１～６から選択された整数であり、
― Ｒ１は双性イオン基であり、
― Ｒ２は負の荷電基であり、
― Ｒ４は天然又は合成の生物学的に興味深い分子とコンジュゲートした反応性基であり、
― ｘは０．５～２０ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｙは３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｚは０より多く５ｍｏｌ％以下の範囲にある。
【化4】
― ｍは０又は１であり、
― ｎは１～６から選択された整数であり、
― Ｒ１は双性イオン基であり、
― Ｒ２は負の荷電基であり、
― Ｒ４は天然又は合成の生物学的に興味深い分子とコンジュゲートした反応性基であり、
― ｘは０．５～２０ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｙは３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｚは０より多く５ｍｏｌ％以下の範囲にある。
【0054】
特定の実施形態では、本発明の前記機能化された双性イオンの発光性ポリマーナノ粒子は、以下の式ＩＶ
で表すことが可能であり、
― Ｒ１は双性イオン基であり、
― Ｒ２は負の荷電基であり、
― Ｒ４は天然又は合成の生物学的に興味深い分子とコンジュゲートした反応性基であり、
― ｘは０．５～２０ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｙは３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｚは０より多く５ｍｏｌ％以下の範囲にある。
【化5】
― Ｒ１は双性イオン基であり、
― Ｒ２は負の荷電基であり、
― Ｒ４は天然又は合成の生物学的に興味深い分子とコンジュゲートした反応性基であり、
― ｘは０．５～２０ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｙは３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の範囲にあり、
― ｚは０より多く５ｍｏｌ％以下の範囲にある。
【0055】
前記天然又は合成の生物学的に興味深い分子は、抗体、抗体のフラグメント、ペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、毒素又は化学薬品から選択される。
そのような天然又は合成の生物学的に興味深い分子がナノ粒子上に存在することにより、前記ナノ粒子に、対応する生体分子を検出する能力が付与される。
そのような天然又は合成の生物学的に興味深い分子がナノ粒子上に存在することにより、前記ナノ粒子に、対応する生体分子を検出する能力が付与される。
【0056】
検出されるべき標的の生体分子に応じて、反応性基を有する発光性の双性イオンナノ粒子を、対応する天然又は合成の生物学的に興味深い分子により機能化することができる。例えば、特定のタンパク質の発現を検出するためには、発光性の双性イオンナノ粒子を前記タンパク質に対する抗体で機能化することができる。
【0057】
小型であり、輝度が極めて高く、タンパク質吸着が低いことと標的特異性とを兼ね備えている、本発明の上記の機能化された発光性の双性イオンナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏでの疾患の診断、治療処置、又は生物学的研究における適用に特に有用である。
【0058】
本発明の機能化されたナノ粒子は例えば、標的の生体分子の検出、例えば特定のタンパク質、抗体又はペプチドの検出のための、バイオセンサとして使用することができる。
高輝度であることにより、本発明の機能化された発光性の双性イオンナノ粒子は、ＥＬＩＳＡ検査よりも高感度で、より使い易い。
高輝度であることにより、本発明の機能化された発光性の双性イオンナノ粒子は、ＥＬＩＳＡ検査よりも高感度で、より使い易い。
【0059】
特に、これらの機能化されたナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏでの医学的診断のための標的の分子又は細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの検出、トラッキングに使用可能なコントラスト剤又は医用造影剤として使用することもできるし、生体分子又は前記生体分子を発現している細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出又は同定に使用可能な診断用薬として使用することもできる。
【0060】
本発明はさらに、上述のような機能化された発光性の双性イオンポリマーナノ粒子を用いて標的生体分子をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで検出又はトラッキングするための方法に関する。
【0061】
前記標的生体分子の例は、限定するものではないが、タンパク質、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、毒素であってよい。
その極めて高い輝度により、本発明のナノ粒子は単一分子のトラッキングに使用することができる。
その極めて高い輝度により、本発明のナノ粒子は単一分子のトラッキングに使用することができる。
【0062】
特定の実施形態によれば、本発明は、試料中の標的生体分子、特に抗原の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出又はトラッキングのための方法に関する。
前記試料は、生体液から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物又は組織から、植物から、微生物から得られた生物学的試料、生体分子を含有する溶液、環境試料、食品試料、薬剤試料であってよい。
前記試料は、生体液から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物又は組織から、植物から、微生物から得られた生物学的試料、生体分子を含有する溶液、環境試料、食品試料、薬剤試料であってよい。
【0063】
「生体液」が意味するのは、生きている動物又は植物に含まれていたか、生きている動物又は植物から排泄又は分泌された液体、例えば、血液、血液の様々な画分、リンパ液、胆汁、唾液、滲出液である。本発明の好ましい実施形態では、生体液は、血清、不活化血清、血漿、又は血液から選択されたヒト又は動物由来の流体である。
【0064】
「組織」が意味するのは、ヒト、動物又は植物の組織である。本発明の特定の実施形態では、組織の試料は生検によって得られたか又は外科手術の際に得られた試料である。より具体的な実施形態では、組織は、がんに罹患しているか又はがんの発症が疑われる患者から、生検によって、又は外科手術の際に得られた腫瘍組織である。
【0065】
「環境試料」が意味するのは、土壌、汚泥、又は廃水のような、環境から収集された試料である。
【0066】
検出用に、本発明の機能化された発光性の双性イオンナノ粒子を、溶液中に懸濁させるか又はマイクロプレートの表面上に固定化することができる。
【0067】
本発明はさらに、コントラスト剤、診断用薬又は医用造影剤として使用するための、本発明の機能化された発光性の双性イオンナノ粒子を含んでいる医薬組成物に関する。
前記組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏの診断用薬として使用することができる。
前記組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏの診断用薬として使用することができる。
【0068】
前述のような発光性の双性イオン疎水性ポリマーナノ粒子に含まれるランダムコポリマーは、フリーラジカル重合、精密ラジカル重合、縮合、付加開環重合によって合成することができる。
発光性の双性イオン疎水性ポリマーナノ粒子は、ナノ沈殿法によって得ることができる。
発光性の双性イオン疎水性ポリマーナノ粒子は、ナノ沈殿法によって得ることができる。
【0069】
本発明はさらに、前述のような機能化された蛍光性の双性イオンポリマーナノ粒子を調製するための方法も提供し、前記方法は、
― 少なくとも１つのランダムコポリマーであって、
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 前記ポリマー鎖に共有結合している天然又は合成の生物学的に興味深い分子であるペンダント基を有する、０より多いが５ｍｏｌ％以下の繰返し単位
を含んでいるランダムコポリマーのナノ沈殿
を含んでいる。
― 少なくとも１つのランダムコポリマーであって、
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 前記ポリマー鎖に共有結合している天然又は合成の生物学的に興味深い分子であるペンダント基を有する、０より多いが５ｍｏｌ％以下の繰返し単位
を含んでいるランダムコポリマーのナノ沈殿
を含んでいる。
【0070】
前述のような機能化された発光性の双性イオンポリマーナノ粒子を調製するための別の方法は、
― 少なくとも１つのランダムコポリマーであって、
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基であるペンダント基を有する、０より多いが５ｍｏｌ％以下の繰返し単位
を含んでいるランダムコポリマーのナノ沈殿と、
― ナノ沈殿の後に得られた発光性の双性イオンポリマーナノ粒子と天然又は合成の生物学的に興味深い分子との反応と
を含んでいる。
― 少なくとも１つのランダムコポリマーであって、
― ホスホネート、スルホネート及びカルボキシレートから選択された負の荷電基であるペンダント基を有する、０．５～２０ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 双性イオン基であるペンダント基を有する、３～３０ｍｏｌ％、特に５～２０ｍｏｌ％、より特定すれば７～１７ｍｏｌ％の繰返し単位、
― 天然又は合成の生物学的に興味深い分子によって機能化するのに適した反応性基であるペンダント基を有する、０より多いが５ｍｏｌ％以下の繰返し単位
を含んでいるランダムコポリマーのナノ沈殿と、
― ナノ沈殿の後に得られた発光性の双性イオンポリマーナノ粒子と天然又は合成の生物学的に興味深い分子との反応と
を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【0071】
本発明については、以降の図面及び実施例においてより詳細に提示される。
【図1】ナノ沈殿による双性イオンの発光色素搭載ＮＰの調製に使用された、スルホネート及び双性イオン（ＺＩ）基を有するメタクリラート系コポリマー、色素（Ｒ１８）及びその対イオン（Ｆ５‐ＴＰＢ）の、簡略化した化学構造を示す図。疎水基、双性イオン基及びスルホネートが主鎖のポリマー鎖上に無作為に配置構成されていることに注目されることに注意すべきである。
【図2】（Ａ）双性イオンのスルホネートナノ粒子（ＰＭＭＡ‐ＺＩ １０％‐ＳＯ３Ｈ １％及び２％）並びに非双性イオンのスルホネートナノ粒子（ＰＭＭＡ‐ＳＯ３Ｈ １％、ＰＭＭＡ‐ＳＯ３Ｈ ２％）の大きさのＴＥＭ分析について示す図。１０重量％のＲ１８／Ｆ５‐ＴＰＢを搭載したナノ粒子はナノ沈殿によって調製された。（Ｂ）１０％の双性イオン基及び１％のＳＯ３Ｈ基を有する様々なメタクリラートポリマーの大きさのＴＥＭ分析について示す図。各画像の下に、対応するナノ粒子の粒度分布が示されている。スケールバーは５０ｎｍに相当する。１条件につき少なくとも１００個のナノ粒子が分析された。
【図3】ＦＣＳを使用して測定されたＮＰの安定性及び該ＮＰとタンパク質との相互作用を示す図。（Ａ）粒子が安定性を維持した最大塩濃度に対するＺＩ密度の影響。（Ｂ）様々な割合のＺＩを有するＰＭＭＡ‐ＳＯ３Ｈ ２％のＮＰ、及び（Ｃ）ＺＩ基を有するか又は有していない様々なメタクリラートモノマーから作製された１％スルホネートＮＰの、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下における大きさ。全てのＮＰに１％のＲ１８／Ｆ５‐ＴＰＢが搭載された。３回の独立な計測値から平均値が得られている。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図4】１０重量％のＲ１８／Ｆ５‐ＴＰＢが搭載された様々な種類のＮＰをマイクロインジェクションされたＨｅＬａ細胞を代表する落射蛍光顕微鏡写真。６０秒間の最大値投影が示されている。スケールバーは１０μｍに相当する。
【図5】単一粒子のトラッキングについて示す図。（Ａ）２０重量％のＲ１８／Ｆ５‐ＴＰＢが搭載されたＰＥＭＡ‐ＺＩ １０％‐ＳＯ３Ｈ １％のＮＰの、細胞質中における３０秒間の軌道。（Ｂ）ＰＥＭＡ‐ＺＩ １０％‐ＳＯ３Ｈ １％のＮＰの平均二乗変位（ＭＳＤ）。黒色の曲線は平均のＭＳＤ曲線に相当し、灰色の直線はプロットをフィッティングしたものである。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．に相当する。（Ｃ）ＰＥＭＡ‐ＺＩ １０％‐ＳＯ３Ｈ １％のＮＰの拡散係数の分布。（Ｄ）様々なポリマーＮＰの平均の拡散係数。エラーバーはＦＷＨＭを示す。１試料につき少なくとも５０例の軌道を分析した。
【図6】（Ａ）カルボキシレート（荷電）、スルホベタイン（双性イオン）基、及びアジド基を有しているエチルメタクリラート系ポリマーを色素塩Ｒ１８／Ｆ５‐ＴＰＢと共にナノ沈殿して構築された、アジドを有する蛍光性ＮＰの簡略化学スキームを示す図。（Ｂ）ＤＢＣＯを有する抗体は、ＤＢＣＯ‐ＥＧ４‐マレイミドを、ＴＣＥＰで処理した抗体と反応させることで得られる。
【図7】ＨＥＲ２受容体を発現しているＳＫＢＲ‐３細胞を、アジドを有する双性イオンＮＰ単独と共にインキュベートしたもの（上段）、又はＤＢＣＯ修飾された抗ＨＥＲ２受容体抗体、次いでアジドを有する双性イオンナノ粒子と共にインキュベートしたもの（下段）の顕微鏡写真を示す図。左から右に、蛍光及びＤＩＣの重ね合わせ画像、蛍光画像、並びにＤＩＣ画像である。
【実施例】
【0072】
＜実施例１＞
１．材料及び方法
１．１ 材料
メチルメタクリラート（９９％、Ｍ５５９０９）、メタクリル酸（９９％、１５５７２１）、３‐スルホプロピルメタクリラートカリウム塩（９９％、２５１６５８）及び２‐（Ｎ‐３‐スルホプロピル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウム）エチルメタクリラート（９９％、５３７２８４）は、シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich）から購入した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、分析用）はフィッシャーサイエンティフィック（Fisher-Scientific）から入手した。ミリＱ水（ミリポア（Millipore））、アセトニトリル（≧９９．９％、シグマアルドリッチ）及びメタノール（≧９９．９％、カルロエルバリエージェンツ（Carlo Erba reagents））は、ナノ粒子の調製に使用した。ジクロロメタン（≧９９．８％）はカルロエルバ製、及びメタノール（ＨＰＬＣ用）はＶＷＲ製である。６‐カルボキシ‐テトラメチルローダミン（ＴＭＲ、シグマアルドリッチ製）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、フィッシャーサイエンティフィック）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ロンザ（Lonza））は安定性研究に使用した。モノマーはカラムクロマトグラフィー又は再結晶を使用して精製した。アゾビスイソブチロニトリル（アルドリッチ、≧９８％）は、エタノールから２度再結晶を行った。他の化合物は、入手したものをそのまま使用した。Ｒ１８／Ｆ５‐ＴＰＢは、既述２のとおりにしてローダミンＢオクタデシルエステル過塩素酸塩（アルドリッチ、＞９８．０％）及びリチウムテトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボラートエチルエーテラート（アルファエイサー（AlfaAesar）、９７％）からイオン交換によって合成した後にカラムクロマトグラフィーにより精製した。
１．材料及び方法
１．１ 材料
メチルメタクリラート（９９％、Ｍ５５９０９）、メタクリル酸（９９％、１５５７２１）、３‐スルホプロピルメタクリラートカリウム塩（９９％、２５１６５８）及び２‐（Ｎ‐３‐スルホプロピル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウム）エチルメタクリラート（９９％、５３７２８４）は、シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich）から購入した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、分析用）はフィッシャーサイエンティフィック（Fisher-Scientific）から入手した。ミリＱ水（ミリポア（Millipore））、アセトニトリル（≧９９．９％、シグマアルドリッチ）及びメタノール（≧９９．９％、カルロエルバリエージェンツ（Carlo Erba reagents））は、ナノ粒子の調製に使用した。ジクロロメタン（≧９９．８％）はカルロエルバ製、及びメタノール（ＨＰＬＣ用）はＶＷＲ製である。６‐カルボキシ‐テトラメチルローダミン（ＴＭＲ、シグマアルドリッチ製）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、フィッシャーサイエンティフィック）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ロンザ（Lonza））は安定性研究に使用した。モノマーはカラムクロマトグラフィー又は再結晶を使用して精製した。アゾビスイソブチロニトリル（アルドリッチ、≧９８％）は、エタノールから２度再結晶を行った。他の化合物は、入手したものをそのまま使用した。Ｒ１８／Ｆ５‐ＴＰＢは、既述２のとおりにしてローダミンＢオクタデシルエステル過塩素酸塩（アルドリッチ、＞９８．０％）及びリチウムテトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボラートエチルエーテラート（アルファエイサー（AlfaAesar）、９７％）からイオン交換によって合成した後にカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【0073】
１．２ ポリマーの合成
本発明のポリマーの合成：様々なポリマーをフリーラジカル重合によって合成した。様々なモノマーを全て、脱気したＤＭＳＯに溶解し、所望の比率で混合した。０．０１等量のＡＩＢＮを添加し、丸底フラスコを７０℃に予熱したオイルバスに入れた。転化率が２５％に達したならば、反応を停止させ、ポリマーをメタノール及び／又は水の中で２回再沈殿させた。乾燥させた後、ポリマーをＮＭＲで、かつ可能な場合はサイズ排除クロマトグラフィーで特徴解析した。例として、ＰＭＭＡ‐ＳＯ３Ｈ‐ＺＩの合成について述べる：
本発明のポリマーの合成：様々なポリマーをフリーラジカル重合によって合成した。様々なモノマーを全て、脱気したＤＭＳＯに溶解し、所望の比率で混合した。０．０１等量のＡＩＢＮを添加し、丸底フラスコを７０℃に予熱したオイルバスに入れた。転化率が２５％に達したならば、反応を停止させ、ポリマーをメタノール及び／又は水の中で２回再沈殿させた。乾燥させた後、ポリマーをＮＭＲで、かつ可能な場合はサイズ排除クロマトグラフィーで特徴解析した。例として、ＰＭＭＡ‐ＳＯ３Ｈ‐ＺＩの合成について述べる：
【0074】
ポリ（メチルメタクリラート‐コ‐３‐スルホプロピルメタクリラート‐コ‐２‐（Ｎ‐３‐スルホプロピル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウム）エチルメタクリラート）（ＰＭＭＡ‐ＺＩ‐ＳＯ３Ｈ）：メチルメタクリラート、２‐（Ｎ‐３‐スルホプロピル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウム）エチルメタクリラート、及び３‐スルホプロピルメタクリラートカリウム塩を、２Ｍの濃度で（２‐（Ｎ‐３‐スルホプロピル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウム）エチルメタクリラートについては１Ｍとして少量のメタノールを追加）、脱気したＤＭＳＯに溶解した。次いでこの３つの溶液を、撹拌子を備えた５０ｍＬの二つ口丸底フラスコの中で所望の比率で混合し、全量２０ｍＬとした。該混合物を５分間のアルゴンバブリングにより脱気し、アルゴン雰囲気下に置いた。ＤＭＳＯ中のＡＩＢＮ（４０ｍｇ／ｍＬ）を０．０１等量添加し、丸底フラスコを７０℃に予熱したオイルバスに入れた。一定間隔で試料を抜き取り、ＤＭＳＯ‐ｄ６に溶解してＮＭＲで分析した。転化率が２５％に達したならば、ＲＴまで急冷することにより反応を停止させた。次に反応混合物をメタノール中に、又は荷電モノマー及び双性イオンモノマーの比率が高い場合は水中に、滴下した。濾過した後、沈殿物を少量のアセトニトリル（必要であれば少量のメタノールを含むもの）に再溶解し、メタノール（ＺＩの比率が最も高いものについては水）の中で２回再沈殿させた。得られたポリマーを真空下で乾燥させた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ): 4.36 (br, 0.04-0.2 H), 3.96 (br. s, 0.02-0.04 H), 3.55 (m, 3.4 H), 3.13 (br, 0.12-0.6 H), 2.45 (br, covered by the solvent peak), 2.04 (br, 0.04-0.2 H), 2.00-0.30 (m, 6 H). それぞれ４．３６ｐｐｍ及び３．９７ｐｐｍのピークに基づいて得られたＺＩ基及びＳＯ３Ｈ基の分率（供給：取得）は、ＺＩ １０％：１０．２％－ＳＯ３Ｈ １％：１．４％；ＺＩ １０％：１１％－ＳＯ３Ｈ ２％：２．８％である。ＧＰＣによる分子量：１％ＳＯ３Ｈ：
Ｍｗ＝５１２００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５８；１％ＺＩ：Ｍｗ＝４３１００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１４。より多くの双性イオンモノマーを有するポリマーについては、ＧＰＣに適した溶媒系を利用できなかった。
Ｍｗ＝５１２００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５８；１％ＺＩ：Ｍｗ＝４３１００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１４。より多くの双性イオンモノマーを有するポリマーについては、ＧＰＣに適した溶媒系を利用できなかった。
【0075】
ポリ（エチルメタクリラート‐コ‐３‐スルホプロピルメタクリラート‐コ‐２‐（Ｎ‐３‐スルホプロピル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウム）エチルメタクリラート）（ＰＥＭＡ‐ＺＩ‐ＳＯ３Ｈ）：1H NMR (400 MHz, MeOD-, δ): 4.50 (br, 0.2 H), 4.34-3.92 (m, 2.02 H), 3.81 (br, 0.2 H), 3.70 (br, 0.2 H), 3.29 (br, partial covered by the solvent peak), 2.92 (br, 0.2 H), 2.31 (br, 0.2 H), 2.23-0.5 (m, 9 H). ４．５０ｐｐｍのピークに基づいて得られたＺＩ基の分率：１０．３％。
【0076】
ポリ（プロピルメタクリラート‐コ‐３‐スルホプロピルメタクリラート‐コ‐２‐（Ｎ‐３‐スルホプロピル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウム）エチルメタクリラート）（ＰＰＭＡ‐ＺＩ‐ＳＯ３Ｈ）：1H NMR (400 MHz, MeOD, δ): 4.50 (br, 0.2 H), 4.29-3.54 (m, 2.42 H), 3.29 (br, partial covered by the solvent peak), 2.92 (br, 0.2 H), 2.31 (br, 0.2 H), 2.23-0.5 (m, 11 H).
４．５０ｐｐｍのピークに基づいて得られたＺＩ基の分率：９．４％。
４．５０ｐｐｍのピークに基づいて得られたＺＩ基の分率：９．４％。
【0077】
ポリ（ブチルメタクリラート‐コ‐３‐スルホプロピルメタクリラート‐コ‐２‐（Ｎ‐３‐スルホプロピル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウム）エチルメタクリラート）（ＰＢＭＡ‐ＺＩ‐ＳＯ３Ｈ）：1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 4.40 (br, 0.2H), 4.30-3.55 (m, 2.42 H), 3.33 (br, 0.6 H), 2.99 (br, 0.2 H), 2.36 (br, 0.2 H), 2.28-0.4 (m, 13 H). ４．４０ｐｐｍのピークに基づいて得られたＺＩ基の分率：８．３％。
【0078】
ポリ（メチルメタクリラート‐コ‐３‐スルホプロピルメタクリラート）（ＰＭＭＡ‐ＳＯ３Ｈ）：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ): 3.97 (br. s, 0.02-0.04 H), 3.57 (s, 3 H), 2.45 (m, partial covered by the solvent peak), 2.1 - 0.5 (m, 6 H). ３．９７ｐｐｍのピークに基づいたＳＯ３Ｈ基の分率（供給：取得）は、ＳＯ３Ｈ １％：１．１％；ＳＯ３Ｈ ２％：２．３％である。
【0079】
１．３ ナノ粒子の調製
コポリマーの保存溶液を、アセトニトリル（ＺＩポリマー用には２０体積％メタノール）中に１０ｇ／Ｌの濃度で調製した。これらの溶液を、１、１０又は２０重量％（ポリマーに対して）のＲ１８／Ｆ５‐ＴＰＢを含有する対応する溶媒で２ｇ／Ｌに希釈した。この溶液を直ちに１０倍過剰量の撹拌中（エッペンドルフ（Eppendorf）のＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ、２１℃で１０００ｒｐｍ）の水に加え、次いで水中で第２の希釈を行った。
コポリマーの保存溶液を、アセトニトリル（ＺＩポリマー用には２０体積％メタノール）中に１０ｇ／Ｌの濃度で調製した。これらの溶液を、１、１０又は２０重量％（ポリマーに対して）のＲ１８／Ｆ５‐ＴＰＢを含有する対応する溶媒で２ｇ／Ｌに希釈した。この溶液を直ちに１０倍過剰量の撹拌中（エッペンドルフ（Eppendorf）のＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ、２１℃で１０００ｒｐｍ）の水に加え、次いで水中で第２の希釈を行った。
【0080】
１．４ ナノ粒子の特徴解析
吸収及び発光スペクトルをそれぞれ、Ｃａｒｙ４０００スキャン紫外可視分光光度計（バリアン（Varian））及びＦＳ５蛍光分光光度計（エジンバラインスツルメンツ（Edinburgh Instruments））にサーモスタット付きセルコンパートメントを装備したものを用いて記録した。励起波長は５３０ｎｍに設定し、発光を５４０～７５０ｎｍで記録した。ＱＹは、参照基準としてエタノール中のローダミン１０１（ＱＹ＝０．９）を使用して計算した。
吸収及び発光スペクトルをそれぞれ、Ｃａｒｙ４０００スキャン紫外可視分光光度計（バリアン（Varian））及びＦＳ５蛍光分光光度計（エジンバラインスツルメンツ（Edinburgh Instruments））にサーモスタット付きセルコンパートメントを装備したものを用いて記録した。励起波長は５３０ｎｍに設定し、発光を５４０～７５０ｎｍで記録した。ＱＹは、参照基準としてエタノール中のローダミン１０１（ＱＹ＝０．９）を使用して計算した。
【0081】
透過型電子顕微鏡検査：５μｌのナノ粒子溶液を、カーボンコーティングした銅ロジウムの電子顕微鏡用グリッド上に載せ、次いでアミルアミンによるグロー放電を行った。次に染色用の２％酢酸ウラニル溶液で２０秒間処理した。得られたグリッドを、ＬａＢ６フィラメントを装備し１００ｋＶで作動するフィリップス（Philips）のＣＭ１２０透過型電子顕微鏡を使用して観察した。関心領域の取得を、ペルチェ式冷却型ＣＣＤカメラ（モデル７９４、米国カリフォルニア州プレザントンのガタン（Gatan））を用いて記録した。Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して画像を分析した。
【0082】
蛍光相関分光法：計測は、自作の共焦点光学系で励起を５３２ｎｍとして、参照基準として水中のＴＭＲを使用して実施した。１重量％の色素を含有するＮＰの溶液を２倍に希釈してから、２００μｌを９６ウェルの透明底の計測用プレートに載せた。塩及びタンパク質の存在下でのＮＰの安定性について、低吸着の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入ったＮＰ溶液に５０体積％の１０倍濃ＰＢＳ（１０×）、ＦＢＳ又は水を１滴ずつ添加して調査した。データを添加の５分後に記録し、次に、ＰｙＣｏｒｒＦｉｔソフトウェアを使用して分析した。
【0083】
１．５ 細胞実験：
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ロンザ）、Ｌ‐グルタミン、及び１％抗生物質溶液（ペニシリン‐ストレプトマイシン、ギブコ‐インビトロジェン（Gibco-Invitrogen））を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、フェノールレッド不含、ギブコ‐インビトロジェン）において、５％ＣＯ２を含有する加湿環境下にて３７℃で増殖させた。細胞を、マイクロインジェクションの２４時間前に、６ウェルプレートに載置された円形の顕微鏡用カバーグラス（直径１８ｍｍ）の上に１２５×１０３個／ウェルの密度で播種した。
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ロンザ）、Ｌ‐グルタミン、及び１％抗生物質溶液（ペニシリン‐ストレプトマイシン、ギブコ‐インビトロジェン（Gibco-Invitrogen））を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、フェノールレッド不含、ギブコ‐インビトロジェン）において、５％ＣＯ２を含有する加湿環境下にて３７℃で増殖させた。細胞を、マイクロインジェクションの２４時間前に、６ウェルプレートに載置された円形の顕微鏡用カバーグラス（直径１８ｍｍ）の上に１２５×１０３個／ウェルの密度で播種した。
【0084】
ＮＰのマイクロインジェクション及び細胞の画像化：マイクロインジェクション実験については、ガラスのカバーガラス上で平板培養されたサブコンフルエントなＨｅＬａ細胞を、Ｌｕｄｉｎ Ｃｈａｍｂｅｒ（スイス連邦バーゼルのライフ・イメージング・サービス（Life Imaging Services））に取り付けた。次いで細胞を、ライカ（Leica）のＤＭＩＲＥ２顕微鏡（３７℃、５％ＣＯ２、１００×対物レンズ、ｓＣＭＯＳカメラ、キセノンランプ）に載せ、粒子濃度０．５～２ｎＭの様々なナノ粒子溶液を、Ｆｅｍｔｏｊｅｔ／ＩｎｊｅｃｔＭａｎ ＮＩ２マイクロインジェクタ（エッペンドルフ）を使用して細胞の核周囲部にマイクロインジェクションした。次に、同じ装置上で、又は多波長ＬＥＤ光源ＳｐｅｃｔｒａＸ（ルメンコ（Lumencor））、オリンパスの６０×ＴＩＲＦＭ（１．４５ＮＡ）対物レンズ、及びＦｌａｓｈ４ Ｖ２＋カメラ（浜松）を装備したｉＭＩＣ顕微鏡（ティル・フォトニクス（Till Photonics））上で、試料を移した後に画像シーケンスを取得した。
【0085】
生細胞を、環境制御システム（ライフ・イメージング・サービス）を使用して５％ＣＯ２の加湿環境下で３７℃に維持した。タイムラプス動画を、フレームレートを５０ミリ秒及びビニングを２として６０秒間記録した。これを次にＩｍａｇｅＪ（米国国立衛生研究所）を使用して分析した。単一粒子のトラッキングについては、タイムラプス動画を、解像度を高めるためにフレームレートをＩｍｉｃ顕微鏡については４３ミリ秒又はライカのＤＭＩＲＥ２顕微鏡については５０ミリ秒及びビニングを１として、３０秒間記録した。Ｆｉｊｉソフトウェアを用いて、軌道をＴｒａｃｋＭａｔｅプラグインから復元した。次いでＭＳＤ曲線をプロットし、粒子トラッキング解析のためにＭＡＴＬＡＢスクリプトを用いてＭＳＤ曲線から傾きを求めた。
【0086】
２．実験結果
２．１ 負の荷電基及び双性イオン基が粒子径に及ぼす影響
スルホネート及び双性イオン（ＺＩ）基を有するメタクリラート系コポリマーを、「材料及び方法」に上述された方法に従って合成した。以降の本文ではポリマーをＰＸＭＡ‐ＺＩ‐ｘ％‐ＳＯ３Ｈ‐ｙ％と記し、前記式中、ＸＭＡは対応する主要モノマー（メチルメタクリラートはＭＭＡ、エチルメタクリラートはＥＭＡ、プロピルメタクリラートはＰＭＡ、ブチルメタクリラートはＢＭＡ）であり、ｘ及びｙは双性イオン基及びスルホネートのモル百分率に相当する。なお、スルホネートのみを有し双性イオン基は有していないポリマーも対照として調製した。
２．１ 負の荷電基及び双性イオン基が粒子径に及ぼす影響
スルホネート及び双性イオン（ＺＩ）基を有するメタクリラート系コポリマーを、「材料及び方法」に上述された方法に従って合成した。以降の本文ではポリマーをＰＸＭＡ‐ＺＩ‐ｘ％‐ＳＯ３Ｈ‐ｙ％と記し、前記式中、ＸＭＡは対応する主要モノマー（メチルメタクリラートはＭＭＡ、エチルメタクリラートはＥＭＡ、プロピルメタクリラートはＰＭＡ、ブチルメタクリラートはＢＭＡ）であり、ｘ及びｙは双性イオン基及びスルホネートのモル百分率に相当する。なお、スルホネートのみを有し双性イオン基は有していないポリマーも対照として調製した。
【0087】
次にこれらのポリマーを、ナノ沈殿により色素搭載ポリマーＮＰを構築するために使用した。これについては、様々な量のローダミンＢ誘導体（Ｒ１８）とペルフルオロホウ酸（Ｆ５‐ＴＰＢ）との塩を含有しているアセトニトリル（少量のメタノールを含む）中のポリマー溶液を、大過剰量の水に素早く加えた。形成されたＮＰの大きさを、透過型電子顕微鏡法により分析した（ＴＥＭ、図２、表１）。
【0088】
スルホネートのみを有し双性イオン基は有していないポリマーの場合には、非常に小さな粒子が観察され、ＰＭＭＡ‐ＳＯ３Ｈ １％では約１３ｎｍのＮＰが生じ、粒子径は２％のスルホネートで約９ｎｍまで低下した。ポリマー鎖に１０％のＺＩを導入してもＰＭＭＡ‐ＺＩ‐ＳＯ３Ｈ系ＮＰの粒子径への影響はごくわずかであった。１％及び２％スルホネートのＮＰについてはそれぞれ直径１１ｎｍ及び９ｎｍとなった。従ってＺＩ基の存在は粒子形成の過程に影響を及ぼさず、得られる「ＺＩシェル」は十分に薄くＮＰの大きさに影響しない。一方でアルキルメタクリラートモノマーの疎水性を高めると、粒子径（図２、表１）は、ＰＭＭＡ‐ＺＩ １０％‐ＳＯ３Ｈ １％＜ＰＥＭＡ‐ＺＩ １０％‐ＳＯ３Ｈ １％＜ＰＰＭＡ‐ＺＩ １０％‐ＳＯ３Ｈ １％＜ＰＢＭＡ‐ＺＩ １０％‐ＳＯ３Ｈ １％の順に、１１ｎｍから３５ｎｍまで大きくなった。
【0089】
表１．透過型電子顕微鏡法及び蛍光相関分光法から得られた、様々なポリマーから作製されたＮＰの大きさ。誤差は、ＴＥＭについては分布の半値幅、及びＦＣＳについては３回の計測値に関する変動に相当する。
【0090】
【表1】
【0091】
ナノ粒子は、大量の色素（ポリマーに対して１～２０重量％）のカプセル化によって蛍光性となった。ここで、カチオンのローダミンＲ１８は大型かつ非常に疎水性の高い対イオンＦ５‐ＴＰＢと会合しているが、これはこの会合が凝集によるクエンチングを回避し、かつ非常に疎水性の高い色素と対イオンの対を生じるからである。色素を搭載したＮＰを４８時間透析すると、使用した色素の放出は５％未満であることが判明し、この手法で粒子中への色素塩の非常に効率的なカプセル化がなされることが示されたが、これはＦ５‐ＴＰＢ対イオンを伴う色素の非常に効率的なカプセル化を示した以前の結果１５と一致している。更に、粒子の量子収率は双性イオンを有する全てのポリマーに関して１０重量％の場合で＞３０％が維持され、よって優れた粒子輝度が確保された。
【0092】
２．２ 双性イオンポリマーナノ粒子の安定性
得られた粒子の生体媒質中における安定性、特に双性イオン基が安定性を改善する可能性について、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によって調査した。ポリマー中のＺＩ基の割合（％）を、粒子上のＺＩの密度を変更するために０％から１０％まで変化させた。ＦＣＳデータから得られたＮＰの粒子径は、ＴＥＭから得られたものと非常に良く一致していた（図３、表１。大きさが小さいのはＦＣＳ実験で使用された色素塩の量が少ないことと関係している。）。第１のステップでは、ＮＰの安定性について、追加するＮａＣｌ溶液の濃度を高めることにより評価した（図３Ａ）。安定限界は、ＮＰの凝集が観察されない最大のＮａＣｌ濃度として定義した。ＺＩ基を有していないポリマーから作製された粒子は少量の塩が添加されるとすぐに凝集（及び沈殿）し始めた（図３Ａ）。ＺＩ基を加えることにより、ＺＩ基の量が増加するにつれて粒子の安定性が増大した。１０％の双性イオン基では、ＮＰの大きさに変化は見られず１Ｍ ＮａＣｌまでは沈殿の兆候もみられなかった。
得られた粒子の生体媒質中における安定性、特に双性イオン基が安定性を改善する可能性について、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によって調査した。ポリマー中のＺＩ基の割合（％）を、粒子上のＺＩの密度を変更するために０％から１０％まで変化させた。ＦＣＳデータから得られたＮＰの粒子径は、ＴＥＭから得られたものと非常に良く一致していた（図３、表１。大きさが小さいのはＦＣＳ実験で使用された色素塩の量が少ないことと関係している。）。第１のステップでは、ＮＰの安定性について、追加するＮａＣｌ溶液の濃度を高めることにより評価した（図３Ａ）。安定限界は、ＮＰの凝集が観察されない最大のＮａＣｌ濃度として定義した。ＺＩ基を有していないポリマーから作製された粒子は少量の塩が添加されるとすぐに凝集（及び沈殿）し始めた（図３Ａ）。ＺＩ基を加えることにより、ＺＩ基の量が増加するにつれて粒子の安定性が増大した。１０％の双性イオン基では、ＮＰの大きさに変化は見られず１Ｍ ＮａＣｌまでは沈殿の兆候もみられなかった。
【0093】
次にＮＰとタンパク質及び他の生体分子との相互作用に対する双性イオン基の影響について、塩及び生体分子の複雑な混合物であり著しく多数のタンパク質を含有しているウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えることにより試験した（図３Ｂ）。ＺＩ基を含まない粒子の場合、約１０ｎｍの大きさの増大が観察されたが、これは少なくとも単層のタンパク質の吸着とその結果である「ハードな」タンパク質コロナの形成に相当する（図３Ｂ）。５％のＺＩ基以降、タンパク質と相互作用したときのＮＰの大きさの増大は有意に縮小された。１０％のＺＩ基では粒子径の有意な増大は観察されず、これらの粒子の表面がタンパク質吸着に抵抗したことが示された（図３Ｃ）。
【0094】
２．３ 双性イオンポリマーナノ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏでのふるまい
その後、上記のＮＰを生きているＨｅＬａ細胞の細胞質ゾルの核周囲部に直接マイクロインジェクションし、その挙動について落射蛍光顕微鏡法を使用してモニタリングした（図４）。全例において、細胞質ゾル構造物の広範な染色はほとんど存在しなかった。これは、ＮＰ内への色素の効率的かつ安定したカプセル化、及び色素の浸出が無いことを確認するものである。６０秒間の蛍光強度の最大値投影により、細胞質ゾル全域の粒子の全体的分布についての概要がつかめた。すなわち、ＺＩ基が存在しない場合、ほとんどの粒子は注入地点に残されたままであり、かつ細胞質ゾル中にあるわずかな粒子の移動性は低く、粒子と細胞構成物質との強い相互作用が示された。これに対し、１０％のＺＩ基を有する粒子は概して細胞質ゾル全体にわたって分布した。ＰＭＭＡ系のＺＩを有するＮＰは、注入地点近くの核の上に「投影像」がある場合もあるが、細胞質ゾル全体への分布及び高い移動性を示した。ＰＥＭＡ‐ＺＩ粒子は、実際にすべてのＮＰについて均一な分布及び高い移動性を示した。これはＰＰＭＡ‐ＺＩ粒子についても観察され、ただしこの場合は粒子の一部が注入地点近くに残った。ＰＢＭＡ系の粒子の場合、これらは試験した他のポリマーを用いる粒子よりも強く注入地点に局在した。これらの結果から、１０％のＺＩ基は、粒子と細胞構成物質との相互作用を強力に低減して細胞質ゾル全体にわたって広がることを可能にするのに十分であることが確認された。しかしながら、上記の結果からさらに、粒子径も細胞内の粒子拡散に対して大きな影響を有すること、及び細胞構造物による立体障害６のためコアの臨界の大きさ約２３ｎｍより小さい粒子しか細胞質ゾル全体にわたって広がることができないことも確認される。ここでは、ＰＢＭＡ粒子はこの閾値を明らかに上回る大きさであり、該粒子の固定化が生じていた。ＰＰＭＡ粒子の一部もこの閾値を上回っており、その結果粒子の一部の固定化が生じた。
その後、上記のＮＰを生きているＨｅＬａ細胞の細胞質ゾルの核周囲部に直接マイクロインジェクションし、その挙動について落射蛍光顕微鏡法を使用してモニタリングした（図４）。全例において、細胞質ゾル構造物の広範な染色はほとんど存在しなかった。これは、ＮＰ内への色素の効率的かつ安定したカプセル化、及び色素の浸出が無いことを確認するものである。６０秒間の蛍光強度の最大値投影により、細胞質ゾル全域の粒子の全体的分布についての概要がつかめた。すなわち、ＺＩ基が存在しない場合、ほとんどの粒子は注入地点に残されたままであり、かつ細胞質ゾル中にあるわずかな粒子の移動性は低く、粒子と細胞構成物質との強い相互作用が示された。これに対し、１０％のＺＩ基を有する粒子は概して細胞質ゾル全体にわたって分布した。ＰＭＭＡ系のＺＩを有するＮＰは、注入地点近くの核の上に「投影像」がある場合もあるが、細胞質ゾル全体への分布及び高い移動性を示した。ＰＥＭＡ‐ＺＩ粒子は、実際にすべてのＮＰについて均一な分布及び高い移動性を示した。これはＰＰＭＡ‐ＺＩ粒子についても観察され、ただしこの場合は粒子の一部が注入地点近くに残った。ＰＢＭＡ系の粒子の場合、これらは試験した他のポリマーを用いる粒子よりも強く注入地点に局在した。これらの結果から、１０％のＺＩ基は、粒子と細胞構成物質との相互作用を強力に低減して細胞質ゾル全体にわたって広がることを可能にするのに十分であることが確認された。しかしながら、上記の結果からさらに、粒子径も細胞内の粒子拡散に対して大きな影響を有すること、及び細胞構造物による立体障害６のためコアの臨界の大きさ約２３ｎｍより小さい粒子しか細胞質ゾル全体にわたって広がることができないことも確認される。ここでは、ＰＢＭＡ粒子はこの閾値を明らかに上回る大きさであり、該粒子の固定化が生じていた。ＰＰＭＡ粒子の一部もこの閾値を上回っており、その結果粒子の一部の固定化が生じた。
【0095】
２．４ 単一粒子のトラッキング
本発明の粒子が高輝度であることにより、ＮＰの移動性及び拡散挙動を単一粒子レベルでモニタリングすることが可能となり、したがって本発明者らのＮＰの細胞内の挙動に対するＺＩ基及び使用したポリマーの種類の影響をよりよく理解することが可能となった。ＰＥＭＡ系のＺＩを有するＮＰの細胞質内軌道の一例を図５Ａに示す。上記ＮＰについて平均二乗変位（ＭＳＤ）を遅延時間に対してプロットすることにより、指数αを１とした約１０μｍ２までの直線的増加が示された（図５Ｂ）。これは、細胞質ゾル中における上記粒子の正常拡散又はブラウン拡散を示しており、二次元ではＭＳＤ＝４ＤΔｔαとして記述され、Ｄは拡散係数であり、α＝１である１６。次に個々のＮＰの拡散係数を対応するＭＳＤ曲線から求めた。図５Ｃは、ＰＥＭＡ‐ＺＩのＮＰについて拡散係数の分布がおよそ１μｍ２／ｓに集中していて平均のＤは０．８０μｍ２／ｓであり、同じような大きさのＱＤについて得られた値４と良く一致していることを示している。この分布は、０．２μｍ２／ｓを下回る拡散係数のＮＰを有する画分のみを示している。ＰＭＭＡ‐ＺＩのＮＰは同様の拡散係数の分布を有し、平均値はわずかに低く０．６５μｍ２／ｓであった（図５Ｄ）が、これは流体力学的な大きさがわずかに大きいことと合致している。他方、ＰＰＭＡ‐ＺＩのＮＰは０．２５μｍ２／ｓという明らかに低い平均拡散係数を示した。これは恐らく、このＮＰが注入地点の周りに強く集積していることによって既に示されていたように、該ＮＰがより大きいため細胞質内拡散が制限されることによる。ＺＩ基を含まないＰＭＭＡ‐ＳＯ３Ｈ １％のＮＰは注入地点の周りに集積したままであり、従ってこれらの拡散挙動を特徴解析することはできなかった。しかしながら本発明者らは、そのようなナノ粒子上へのＰＥＧ化界面活性剤Ｔｗｅｅｎ ８０（Ｔ８０）の単純な吸着が、該ナノ粒子のタンパク質との相互作用を強く低減し、かつ細胞質ゾル中における拡散を可能にすることを、かつて示すことができている５、１５。興味深いことに、これらのＮＰの平均拡散係数は、ＰＭＭＡ及びＰＥＭＡのＺＩのＮＰの平均拡散係数と比較すると、それらのコアの大きさが非常に近い（図２）にもかかわらず、３分の１～４分の１の０．２μｍ２／ｓであった。この１つの理由は確かに、ＰＥＧ化界面活性剤の添加によりＮＰの大きさが＞５ｎｍも増大するという事実である。拡散係数の大きな差はさらに、ＺＩ基が、吸着したＰＥＧシェルよりも、細胞内の生体分子及び構造物との非特異的相互作用を低減するのにより有効であることを示している。
本発明の粒子が高輝度であることにより、ＮＰの移動性及び拡散挙動を単一粒子レベルでモニタリングすることが可能となり、したがって本発明者らのＮＰの細胞内の挙動に対するＺＩ基及び使用したポリマーの種類の影響をよりよく理解することが可能となった。ＰＥＭＡ系のＺＩを有するＮＰの細胞質内軌道の一例を図５Ａに示す。上記ＮＰについて平均二乗変位（ＭＳＤ）を遅延時間に対してプロットすることにより、指数αを１とした約１０μｍ２までの直線的増加が示された（図５Ｂ）。これは、細胞質ゾル中における上記粒子の正常拡散又はブラウン拡散を示しており、二次元ではＭＳＤ＝４ＤΔｔαとして記述され、Ｄは拡散係数であり、α＝１である１６。次に個々のＮＰの拡散係数を対応するＭＳＤ曲線から求めた。図５Ｃは、ＰＥＭＡ‐ＺＩのＮＰについて拡散係数の分布がおよそ１μｍ２／ｓに集中していて平均のＤは０．８０μｍ２／ｓであり、同じような大きさのＱＤについて得られた値４と良く一致していることを示している。この分布は、０．２μｍ２／ｓを下回る拡散係数のＮＰを有する画分のみを示している。ＰＭＭＡ‐ＺＩのＮＰは同様の拡散係数の分布を有し、平均値はわずかに低く０．６５μｍ２／ｓであった（図５Ｄ）が、これは流体力学的な大きさがわずかに大きいことと合致している。他方、ＰＰＭＡ‐ＺＩのＮＰは０．２５μｍ２／ｓという明らかに低い平均拡散係数を示した。これは恐らく、このＮＰが注入地点の周りに強く集積していることによって既に示されていたように、該ＮＰがより大きいため細胞質内拡散が制限されることによる。ＺＩ基を含まないＰＭＭＡ‐ＳＯ３Ｈ １％のＮＰは注入地点の周りに集積したままであり、従ってこれらの拡散挙動を特徴解析することはできなかった。しかしながら本発明者らは、そのようなナノ粒子上へのＰＥＧ化界面活性剤Ｔｗｅｅｎ ８０（Ｔ８０）の単純な吸着が、該ナノ粒子のタンパク質との相互作用を強く低減し、かつ細胞質ゾル中における拡散を可能にすることを、かつて示すことができている５、１５。興味深いことに、これらのＮＰの平均拡散係数は、ＰＭＭＡ及びＰＥＭＡのＺＩのＮＰの平均拡散係数と比較すると、それらのコアの大きさが非常に近い（図２）にもかかわらず、３分の１～４分の１の０．２μｍ２／ｓであった。この１つの理由は確かに、ＰＥＧ化界面活性剤の添加によりＮＰの大きさが＞５ｎｍも増大するという事実である。拡散係数の大きな差はさらに、ＺＩ基が、吸着したＰＥＧシェルよりも、細胞内の生体分子及び構造物との非特異的相互作用を低減するのにより有効であることを示している。
【0096】
＜実施例２：生体分子との特異的相互作用のための双性イオン蛍光性ナノ粒子の調製＞
本実施例では、非特異的相互作用を防止するための双性イオン基を有し、かつ生体分子との特異的相互作用を導入するための標的指向基を有している、蛍光性ナノ粒子（ＮＰ）を設計した。特異的相互作用を導入するために、抗体、より具体的にはＨＥＲ２受容体に対する抗体であるセツキシマブを使用した。抗体とナノ粒子とのコンジュゲーションを達成するために、アジド基と歪んだアルキンであるジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）との間の、銅を用いない付加環化のクリックケミストリーを利用した。片方では、双性イオン基、荷電基、及びアジド基を有する疎水性コポリマーを疎水性の色素塩と共にナノ沈殿することにより、アジド基を表面に備えた双性イオンの高輝度蛍光性ナノ粒子を構築した。他方では、反応性のＤＢＣＯ基を導入するために抗体を修飾した。細胞アッセイから、抗体を用いて蛍光性ナノ粒子がＨＥＲ２を発現する細胞に特異的に結合することが示された。
本実施例では、非特異的相互作用を防止するための双性イオン基を有し、かつ生体分子との特異的相互作用を導入するための標的指向基を有している、蛍光性ナノ粒子（ＮＰ）を設計した。特異的相互作用を導入するために、抗体、より具体的にはＨＥＲ２受容体に対する抗体であるセツキシマブを使用した。抗体とナノ粒子とのコンジュゲーションを達成するために、アジド基と歪んだアルキンであるジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）との間の、銅を用いない付加環化のクリックケミストリーを利用した。片方では、双性イオン基、荷電基、及びアジド基を有する疎水性コポリマーを疎水性の色素塩と共にナノ沈殿することにより、アジド基を表面に備えた双性イオンの高輝度蛍光性ナノ粒子を構築した。他方では、反応性のＤＢＣＯ基を導入するために抗体を修飾した。細胞アッセイから、抗体を用いて蛍光性ナノ粒子がＨＥＲ２を発現する細胞に特異的に結合することが示された。
【0097】
１． 材料及び方法
１．１ ポリ（エチルメタクリラート‐コ‐メタクリル酸‐コ‐２‐（Ｎ‐３‐スルホプロピル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウム）エチルメタクリラート‐コ‐Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）‐Ｎ３）（ＰＥＭＡ‐ＺＩ‐ＭＡＡ‐Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）‐Ｎ３）の合成
このポリマーは、下式（Ｉａ‐１）
によって表わすことができる。
１．１ ポリ（エチルメタクリラート‐コ‐メタクリル酸‐コ‐２‐（Ｎ‐３‐スルホプロピル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウム）エチルメタクリラート‐コ‐Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）‐Ｎ３）（ＰＥＭＡ‐ＺＩ‐ＭＡＡ‐Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）‐Ｎ３）の合成
このポリマーは、下式（Ｉａ‐１）
【化6】
【0098】
ＰＥＭＡ‐ＺＩ‐ＭＡＡ‐Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）‐Ｎ３は、ポリ（エチルメタクリラート‐コ‐メタクリル酸‐コ‐２‐（Ｎ‐３‐スルホプロピル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウム）エチルメタクリラート）（ＰＥＭＡ‐ＺＩ‐ＭＡＡ）から３ステップで得た。ＰＥＭＡ‐ＺＩ‐ＭＡＡは、実施例１に上述したようにしてフリーラジカル重合によって得た。
【0099】
1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ, ppm: 4.35 (br, 0.33 H), 3.98 (m, 2.00 H), 3.66 (br, partial covered with solvent peak), 3.10 (m, 0.87 H), 1.82 (br, 1.78 H), 1.19 (m, 3.06 H), 0.94 (m, 1.12 H), 0.78 (m, 1.53).
【0100】
第１のステップでは、ＰＥＭＡ‐ＺＩ‐ＭＡＡを、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）‐Ｎ３（Ｔｅｒｔ‐ブチル３‐アミノ‐４‐（（３‐アジドプロピル）アミノ）‐４‐オキソブタノアート、Melnychuk, N.らが述べた手順（A.S. “DNA-Functionalized Dye-Loaded Polymeric Nanoparticles:Ultrabright FRET Platform for Amplified Detection of Nucleic Acids”, J. Am. Chem. Soc., (米), 2018, vol. 140, p. 10856）に従って合成）と共に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、シグマアルドリッチ）の中で、カップリング剤としてベンゾトリアゾール‐１‐イル‐オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ、東京化成工業）を使用して、塩基のＮ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、シグマアルドリッチ）の存在下で、反応させた。得られたポリマーを、メタノール‐水混合物中での沈殿により精製した。
【0101】
第２のステップでは、ｔｅｒｔ‐ブチル基を、トリフルオロ酢酸（シグマアルドリッチ）及びジクロロメタン（シグマアルドリッチ）の１対１混合物を用いた処理によって脱離させた。
【0102】
蒸発乾固の後、第３のステップにおいて、ポリマーを沈殿及びカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【0103】
1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ, ppm: 4.34 (br, 0.23 H), 3.96 (m, 2.00 H), 3.63 (m, 0.22 H), 3.51 (m, 0.23 H), 3.09 (m, 0.54 H), 1.78 (br, 1.97 H), 1.37 (s, 0.41 H), 1.17 (m, 3.55 H), 0.92 (m, 1.06 H), 0.76 (m, 1.65 H).
【0104】
このポリマーでは、主要モノマーは上記のようにエチルメタクリラートであり、ＣＯＯＨ基及び双性イオン基のモル量はそれぞれ５ｍｏｌ％及び１０ｍｏｌ％である。
【0105】
１．２ ナノ粒子の調製
上記１．１項において得られたＰＥＭＡ‐ＺＩ‐ＭＡＡ‐Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）‐Ｎ３の保存溶液を、２０体積％メタノールを含むアセトニトリル中に１０ｇ／Ｌの濃度で調製した。この溶液を、蛍光性の疎水性色素塩であるＲ１８／Ｆ５‐ＴＰＢを（ポリマーに対して）１０、２０、又は３０重量％含有する相応の溶媒で２ｇ／Ｌに希釈した。この溶液を直ちに９倍過剰量の撹拌中（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ、２１℃で１０００ｒｐｍ）のリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）に加え、続いて水性相を用いて第２の希釈を行った。
上記１．１項において得られたＰＥＭＡ‐ＺＩ‐ＭＡＡ‐Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）‐Ｎ３の保存溶液を、２０体積％メタノールを含むアセトニトリル中に１０ｇ／Ｌの濃度で調製した。この溶液を、蛍光性の疎水性色素塩であるＲ１８／Ｆ５‐ＴＰＢを（ポリマーに対して）１０、２０、又は３０重量％含有する相応の溶媒で２ｇ／Ｌに希釈した。この溶液を直ちに９倍過剰量の撹拌中（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ、２１℃で１０００ｒｐｍ）のリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）に加え、続いて水性相を用いて第２の希釈を行った。
【0106】
１．３ 抗体の修飾
セツキシマブ（メルク（Merck））は、ＨＥＲ２受容体に対するキメラ型のＩｇＧ１完全長抗体である。この抗体は臨床用調合物として入手した。抗体のバッファ交換を、限外濾過（ＭＷＣＯ ５０ｋＤａ、Ｖｉｖａｓｐｉｎ）によりホウ酸緩衝液ｐＨ８．１４について行った。抗体の濃度をＵＶ‐ｖｉｓ吸光度によって測定し（セツキシマブｍＡｂについてはε２８０＝２１０．０００Ｍ－１ｃｍ－１）、４８μＭ（１０．０ｍｇ／ｍＬ）に調整し、アリコートとして－２０℃で保管した。実験用には、アリコートを融解して直ぐに使用した。
セツキシマブ（メルク（Merck））は、ＨＥＲ２受容体に対するキメラ型のＩｇＧ１完全長抗体である。この抗体は臨床用調合物として入手した。抗体のバッファ交換を、限外濾過（ＭＷＣＯ ５０ｋＤａ、Ｖｉｖａｓｐｉｎ）によりホウ酸緩衝液ｐＨ８．１４について行った。抗体の濃度をＵＶ‐ｖｉｓ吸光度によって測定し（セツキシマブｍＡｂについてはε２８０＝２１０．０００Ｍ－１ｃｍ－１）、４８μＭ（１０．０ｍｇ／ｍＬ）に調整し、アリコートとして－２０℃で保管した。実験用には、アリコートを融解して直ぐに使用した。
【0107】
１．４ セツキシマブとマレイミド‐ＰＥＧ４‐ＤＢＣＯとのコンジュゲーション
報告されているプロトコール１の変法を使用してコンジュゲートを調製した。セツキシマブ（２３μＭ、３００μＬ、０．００６９μｍｏｌ）をホウ酸緩衝液ｐＨ８．４で調製した。次に、トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、シグマアルドリッチ）を加え（４５．８ｍＭ、１．２μＬ、４ｅｑ）、反応物を穏やかに撹拌（４５０ＲＰＭ）しながら３７℃で２時間インキュベートした。その後、ジベンゾシクロオクチン‐ＰＥＧ４‐マレイミド（ＤＢＣＯ‐ＰＥＧ４‐マレイミド、シグマアルドリッチ）の乾燥ＤＭＦ中の溶液（１０ｍＭ）を調製してセツキシマブ（８μＬ、８ ｅｑ）に添加した。続いて、温度を４℃に下げてインキュベーションを１８時間継続した。その後、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた限外濾過（５０ｋＤａ ＭＷＣＯ）により過剰な試薬を除去すると、ＰＢＳ緩衝液中の修飾型の抗体‐マレイミド‐ＰＥＧ４‐ＤＢＣＯが得られ、ＵＶ‐ｖｉｓによって決定されるように収率は６０～７０％であった。
報告されているプロトコール１の変法を使用してコンジュゲートを調製した。セツキシマブ（２３μＭ、３００μＬ、０．００６９μｍｏｌ）をホウ酸緩衝液ｐＨ８．４で調製した。次に、トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、シグマアルドリッチ）を加え（４５．８ｍＭ、１．２μＬ、４ｅｑ）、反応物を穏やかに撹拌（４５０ＲＰＭ）しながら３７℃で２時間インキュベートした。その後、ジベンゾシクロオクチン‐ＰＥＧ４‐マレイミド（ＤＢＣＯ‐ＰＥＧ４‐マレイミド、シグマアルドリッチ）の乾燥ＤＭＦ中の溶液（１０ｍＭ）を調製してセツキシマブ（８μＬ、８ ｅｑ）に添加した。続いて、温度を４℃に下げてインキュベーションを１８時間継続した。その後、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた限外濾過（５０ｋＤａ ＭＷＣＯ）により過剰な試薬を除去すると、ＰＢＳ緩衝液中の修飾型の抗体‐マレイミド‐ＰＥＧ４‐ＤＢＣＯが得られ、ＵＶ‐ｖｉｓによって決定されるように収率は６０～７０％であった。
【0108】
１．５ 細胞の維持及び蛍光の画像化
Ｈｅｒ２（Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ‐２）を過剰発現するヒト乳がん細胞株であるＳＫＢＲ‐３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ギブコ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ、ギブコ）が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ、ＤＭＥＭ）で培養した。ＳＫＢＲ‐３細胞を、８ウェルのＬａｂ‐Ｔｅｋチャンバーカバーガラス（サーモサイエンティフィック（Thermo Scientific））に２．０×１０４個の細胞密度で播種し、続いて３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。蛍光の画像化のために、培地を捨てて細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次に、２００μＬのＡｂ‐マレイミド‐ＰＥＧ４‐ＤＢＣＯ（ギブコのＯｐｔｉｍｅｍに含めて１０μｇ／ｍＬ）及び２００μＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地単独（対照）を細胞に加え、３７℃及び５％ＣＯ２で２０分間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで繰り返し洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて３７℃及び５％ＣＯ２で１２分間固定し、続いてＰＢＳ中に含めた３％ＢＳＡを添加し、３７℃及び５％ＣＯ２でさらに１５分間インキュベートした。次に、双性イオン基、荷電基及びアジド基を有する蛍光性ＮＰ（１．２項を参照、ＰＢＳ中に０．１％ＢＳＡの溶液中に１００ｐＭ）を添加し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳ中に０．１％ＢＳＡの溶液で洗浄し、６０×対物レンズ（Ａｐｏ ＴＩＲＦ、油浸、ＮＡ１．４９、ニコン）を備えたニコンのＴｉ‐Ｅ倒立顕微鏡を使用して落射蛍光顕微鏡法によって検査した。励起は発光ダイオード（ＳｐｅｃｔｒａＸ、ルメンコ）により５５０ｎｍで行った。
Ｈｅｒ２（Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ‐２）を過剰発現するヒト乳がん細胞株であるＳＫＢＲ‐３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ギブコ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ、ギブコ）が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ、ＤＭＥＭ）で培養した。ＳＫＢＲ‐３細胞を、８ウェルのＬａｂ‐Ｔｅｋチャンバーカバーガラス（サーモサイエンティフィック（Thermo Scientific））に２．０×１０４個の細胞密度で播種し、続いて３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。蛍光の画像化のために、培地を捨てて細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次に、２００μＬのＡｂ‐マレイミド‐ＰＥＧ４‐ＤＢＣＯ（ギブコのＯｐｔｉｍｅｍに含めて１０μｇ／ｍＬ）及び２００μＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地単独（対照）を細胞に加え、３７℃及び５％ＣＯ２で２０分間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで繰り返し洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて３７℃及び５％ＣＯ２で１２分間固定し、続いてＰＢＳ中に含めた３％ＢＳＡを添加し、３７℃及び５％ＣＯ２でさらに１５分間インキュベートした。次に、双性イオン基、荷電基及びアジド基を有する蛍光性ＮＰ（１．２項を参照、ＰＢＳ中に０．１％ＢＳＡの溶液中に１００ｐＭ）を添加し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳ中に０．１％ＢＳＡの溶液で洗浄し、６０×対物レンズ（Ａｐｏ ＴＩＲＦ、油浸、ＮＡ１．４９、ニコン）を備えたニコンのＴｉ‐Ｅ倒立顕微鏡を使用して落射蛍光顕微鏡法によって検査した。励起は発光ダイオード（ＳｐｅｃｔｒａＸ、ルメンコ）により５５０ｎｍで行った。
【0109】
２． 結果及び考察
本実施例では、生物学的に興味深い分子の導入を可能にする反応性基を備えた蛍光性の双性イオンナノ粒子を構築した。このために、カルボキシレート及びスルホベタイン基を有するエチルメタクリラート系ポリマーをラジカル重合によって合成した（図６Ａ）。このポリマーに、本発明者らは次に、アジド基、ポリマー上のＣＯＯＨ基と結合するためのアミノ基、及び保護されたカルボン酸を有する三官能分子（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）‐Ｎ３、アスパラギン酸由来）との反応によりアジド基を導入した。カルボキシレートの脱保護の後、ＺＩ基、ナノ沈殿の際のナノ粒子の大きさを制御するためのＣＯＯＨ基、及びアジド反応性基（例えば１０ｍｏｌ％の双性イオン基、５ｍｏｌ％のＣＯＯＨ、３～５ｍｏｌ％のＮ３）を兼ね備えた疎水性ポリマーが得られた（上記の式Ｉａ‐１）。
本実施例では、生物学的に興味深い分子の導入を可能にする反応性基を備えた蛍光性の双性イオンナノ粒子を構築した。このために、カルボキシレート及びスルホベタイン基を有するエチルメタクリラート系ポリマーをラジカル重合によって合成した（図６Ａ）。このポリマーに、本発明者らは次に、アジド基、ポリマー上のＣＯＯＨ基と結合するためのアミノ基、及び保護されたカルボン酸を有する三官能分子（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）‐Ｎ３、アスパラギン酸由来）との反応によりアジド基を導入した。カルボキシレートの脱保護の後、ＺＩ基、ナノ沈殿の際のナノ粒子の大きさを制御するためのＣＯＯＨ基、及びアジド反応性基（例えば１０ｍｏｌ％の双性イオン基、５ｍｏｌ％のＣＯＯＨ、３～５ｍｏｌ％のＮ３）を兼ね備えた疎水性ポリマーが得られた（上記の式Ｉａ‐１）。
【0110】
このポリマーを次に、ナノ沈殿により色素搭載ナノ粒子（ＮＰ）を構築するために使用した。ポリマー及び（ポリマーに対して）１０～３０重量％の色素塩Ｒ１８／Ｆ５‐ＴＰＢのアセトニトリル溶液（１０％のメタノールを含有）を、９倍過剰量のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に素早く加え、続いてさらに希釈した。これにより１５～１８ｎｍの大きさのＮＰが形成されたが、この大きさは以下の表２に詳述されるように色素の搭載に伴ってわずかに増大した。これらのＮＰは、蛍光量子収率およそ３２％の明るい蛍光を示した。粒子の大きさ及び搭載量に基づくと、発蛍光団の数を、搭載量１０、２０、及び３０重量％のナノ粒子につきそれぞれ１００、２５０及び５００個の発蛍光団であると見積もることができる。次に１粒子あたりの輝度は式ε×Ｎ×ＱＹを使用して計算することが可能であり、前記式中、εはローダミンの吸光係数（１２５０００Ｍ－１・ｃｍ－１）、Ｎは１粒子当たりの色素の数、及びＱＹは量子収率であり、×は乗算演算子である。これにより、搭載量３０重量％の場合、１粒子あたりの輝度は２．１×１０７Ｍ－１・ｃｍ－１となる。
【0111】
【表2】
【0112】
他方、ＤＢＣＯを有する抗体は、２ステップのワンポットプロセスで得た（図６Ｂ）。第１ステップでは、（トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン）（ＴＣＥＰ）を使用して抗体セツキシマブのジスルフィド結合を切断した。第２ステップでは、次に抗体を、一方の側にチオール基とのコンジュゲーション用のマレイミド、及び反対側にＤＢＣＯ基を有しておりこれらが短いオリゴ（エチレングリコール）リンカーによって接続されている二価性試薬と、反応させた。精製した後、アジド基を有する発蛍光団とのコンジュゲーションを経た反応性のＤＢＣＯ基の存在を、ＵＶ‐可視吸収測定によって確認した。
【0113】
この抗体／ＮＰシステムを次に、ＨＥＲ２受容体を発現する細胞へのＮＰの特異的結合に適用した。抗体‐ＮＰコンジュゲーションはｉｎ ｓｉｔｕで実施した。ＳＫＢＲ‐３細胞をガラス製のカバーガラス（Ｌａｂｔｅｋ）のウェル内で培養し、培養４８時間後に本発明のＤＢＣＯ修飾抗体で処理した。細胞を固定した後、アジドを有するＮＰを添加した。対照として、抗体を加えずに同じ実験を実施した。
【0114】
図７に示す蛍光顕微鏡法の結果から、抗体が存在しない場合はＳＫＢＲ‐３細胞にＮＰは事実上検出されないことが示された。しかしながら、ＨＥＲ２受容体に対するＤＢＣＯ修飾抗体を用いて処理した後は、ＮＰを添加すると、特に細胞の外縁部、恐らくは受容体を包含している原形質膜に、強い蛍光が生じた。
【0115】
これにより、ＤＢＣＯを有する抗体とアジドを有する蛍光性の双性イオンＮＰとのコンジュゲーションという本発明者らのシステムが、細胞上の生物学的な目的物（受容体）へのＮＰの特異的結合を可能にすることが示された。
(1) Li, K.; Qin, W.; Ding, D.; Tomczak, N.; Geng, J.; Liu, R.; Liu, J.; Zhang, X.; Liu, H.; Liu, B.; et al. Photostable Fluorescent Organic Dots with Aggregation-Induced Emission (AIE Dots) for Noninvasive Long-Term Cell Tracing. Sci. Rep. 2013, 3. https://doi.org/10.1038/srep01150.
(2) Reisch, A.; Didier, P.; Richert, L.; Oncul, S.; Arntz, Y.; Mely, Y.; Klymchenko, A. S. Collective Fluorescence Switching of Counterion-Assembled Dyes in Polymer Nanoparticles. Nat. Commun. 2014, 5. https://doi.org/10.1038/ncomms5089.
(3) Sahl, S. J.; Hell, S. W.; Jakobs, S. Fluorescence Nanoscopy in Cell Biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2017, 18 (11), 685-701. https://doi.org/10.1038/nrm.2017.71.
(4) Etoc, F.; Balloul, E.; Vicario, C.; Normanno, D.; Lise, D.; Sittner, A.; Piehler, J.; Dahan, M.; Coppey, M. Non-Specific Interactions Govern Cytosolic Diffusion of Nanosized Objects in Mammalian Cells. Nat. Mater. 2018, 17 (8), 740-746. https://doi.org/10.1038/s41563-018-0120-7.
(5) Reisch, A.; Heimburger, D.; Ernst, P.; Runser, A.; Didier, P.; Dujardin, D.; Klymchenko, A. S. Protein-Sized Dye-Loaded Polymer Nanoparticles for Free Particle Diffusion in Cytosol. Adv. Funct. Mater. 2018, 28 (48), 1805157. https://doi.org/10.1002/adfm.201805157.
(6) Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and Physical Properties of Cytoplasm: Volume, Viscosity, Diffusion, Intracellular Surface Area. Int. Rev. Cytol. 2000, 192, 189-221.
(7) Walkey, C. D.; Chan, W. C. W. Understanding and Controlling the Interaction of Nanomaterials with Proteins in a Physiological Environment. Chem. Soc. Rev. 2012, 41 (7), 2780-2799. https://doi.org/10.1039/C1CS15233E.
(8) Monopoli, M. P.; Aberg, C.; Salvati, A.; Dawson, K. A. Biomolecular Coronas Provide the Biological Identity of Nanosized Materials. Nat. Nanotechnol. 2012, 7 (12), 779-786. https://doi.org/10.1038/nnano.2012.207.
(9) Jokerst, J. V.; Lobovkina, T.; Zare, R. N.; Gambhir, S. S. Nanoparticle PEGylation for Imaging and Therapy. Nanomed. 2011, 6 (4), 715-728. https://doi.org/10.2217/nnm.11.19.
(10) Rabanel, J.-M.; Hildgen, P.; Banquy, X. Assessment of PEG on Polymeric Particles Surface, a Key Step in Drug Carrier Translation. J. Controlled Release 2014, 185, 71-87. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2014.04.017.
(11) Estephan, Z. G.; Schlenoff, P. S.; Schlenoff, J. B. Zwitteration As an Alternative to PEGylation. Langmuir 2011, 27 (11), 6794-6800. https://doi.org/10.1021/la200227b.
(12) Garcia, K. P.; Zarschler, K.; Barbaro, L.; Barreto, J. A.; O’Malley, W.; Spiccia, L.; Stephan, H.; Graham, B. Zwitterionic-Coated “Stealth” Nanoparticles for Biomedical Applications: Recent Advances in Countering Biomolecular Corona Formation and Uptake by the Mononuclear Phagocyte System. Small 2014, 10 (13), 2516-2529. https://doi.org/10.1002/smll.201303540.
(13) Muro, E.; Pons, T.; Lequeux, N.; Fragola, A.; Sanson, N.; Lenkei, Z.; Dubertret, B. Small and Stable Sulfobetaine Zwitterionic Quantum Dots for Functional Live-Cell Imaging. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132 (13), 4556-4557. https://doi.org/10.1021/ja1005493.
(14) Rouhana, L. L.; Jaber, J. A.; Schlenoff, J. B. Aggregation-Resistant Water-Soluble Gold Nanoparticles. Langmuir 2007, 23 (26), 12799-12801. https://doi.org/10.1021/la702151q.
(15) Reisch, A.; Runser, A.; Arntz, Y.; Mely, Y.; Klymchenko, A. S. Charge-Controlled Nanoprecipitation as a Modular Approach to Ultrasmall Polymer Nanocarriers: Making Bright and Stable Nanoparticles. ACS Nano 2015, 9 (5), 5104-5116. https://doi.org/10.1021/acsnano.5b00214.
(16) Ruthardt, N.; Lamb, D. C.; Brauchle, C. Single-Particle Tracking as a Quantitative Microscopy-Based Approach to Unravel Cell Entry Mechanisms of Viruses and Pharmaceutical Nanoparticles. Mol. Ther. 2011, 19 (7), 1199-1211. https://doi.org/10.1038/mt.2011.102.
(1) Li, K.; Qin, W.; Ding, D.; Tomczak, N.; Geng, J.; Liu, R.; Liu, J.; Zhang, X.; Liu, H.; Liu, B.; et al. Photostable Fluorescent Organic Dots with Aggregation-Induced Emission (AIE Dots) for Noninvasive Long-Term Cell Tracing. Sci. Rep. 2013, 3. https://doi.org/10.1038/srep01150.
(2) Reisch, A.; Didier, P.; Richert, L.; Oncul, S.; Arntz, Y.; Mely, Y.; Klymchenko, A. S. Collective Fluorescence Switching of Counterion-Assembled Dyes in Polymer Nanoparticles. Nat. Commun. 2014, 5. https://doi.org/10.1038/ncomms5089.
(3) Sahl, S. J.; Hell, S. W.; Jakobs, S. Fluorescence Nanoscopy in Cell Biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2017, 18 (11), 685-701. https://doi.org/10.1038/nrm.2017.71.
(4) Etoc, F.; Balloul, E.; Vicario, C.; Normanno, D.; Lise, D.; Sittner, A.; Piehler, J.; Dahan, M.; Coppey, M. Non-Specific Interactions Govern Cytosolic Diffusion of Nanosized Objects in Mammalian Cells. Nat. Mater. 2018, 17 (8), 740-746. https://doi.org/10.1038/s41563-018-0120-7.
(5) Reisch, A.; Heimburger, D.; Ernst, P.; Runser, A.; Didier, P.; Dujardin, D.; Klymchenko, A. S. Protein-Sized Dye-Loaded Polymer Nanoparticles for Free Particle Diffusion in Cytosol. Adv. Funct. Mater. 2018, 28 (48), 1805157. https://doi.org/10.1002/adfm.201805157.
(6) Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and Physical Properties of Cytoplasm: Volume, Viscosity, Diffusion, Intracellular Surface Area. Int. Rev. Cytol. 2000, 192, 189-221.
(7) Walkey, C. D.; Chan, W. C. W. Understanding and Controlling the Interaction of Nanomaterials with Proteins in a Physiological Environment. Chem. Soc. Rev. 2012, 41 (7), 2780-2799. https://doi.org/10.1039/C1CS15233E.
(8) Monopoli, M. P.; Aberg, C.; Salvati, A.; Dawson, K. A. Biomolecular Coronas Provide the Biological Identity of Nanosized Materials. Nat. Nanotechnol. 2012, 7 (12), 779-786. https://doi.org/10.1038/nnano.2012.207.
(9) Jokerst, J. V.; Lobovkina, T.; Zare, R. N.; Gambhir, S. S. Nanoparticle PEGylation for Imaging and Therapy. Nanomed. 2011, 6 (4), 715-728. https://doi.org/10.2217/nnm.11.19.
(10) Rabanel, J.-M.; Hildgen, P.; Banquy, X. Assessment of PEG on Polymeric Particles Surface, a Key Step in Drug Carrier Translation. J. Controlled Release 2014, 185, 71-87. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2014.04.017.
(11) Estephan, Z. G.; Schlenoff, P. S.; Schlenoff, J. B. Zwitteration As an Alternative to PEGylation. Langmuir 2011, 27 (11), 6794-6800. https://doi.org/10.1021/la200227b.
(12) Garcia, K. P.; Zarschler, K.; Barbaro, L.; Barreto, J. A.; O’Malley, W.; Spiccia, L.; Stephan, H.; Graham, B. Zwitterionic-Coated “Stealth” Nanoparticles for Biomedical Applications: Recent Advances in Countering Biomolecular Corona Formation and Uptake by the Mononuclear Phagocyte System. Small 2014, 10 (13), 2516-2529. https://doi.org/10.1002/smll.201303540.
(13) Muro, E.; Pons, T.; Lequeux, N.; Fragola, A.; Sanson, N.; Lenkei, Z.; Dubertret, B. Small and Stable Sulfobetaine Zwitterionic Quantum Dots for Functional Live-Cell Imaging. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132 (13), 4556-4557. https://doi.org/10.1021/ja1005493.
(14) Rouhana, L. L.; Jaber, J. A.; Schlenoff, J. B. Aggregation-Resistant Water-Soluble Gold Nanoparticles. Langmuir 2007, 23 (26), 12799-12801. https://doi.org/10.1021/la702151q.
(15) Reisch, A.; Runser, A.; Arntz, Y.; Mely, Y.; Klymchenko, A. S. Charge-Controlled Nanoprecipitation as a Modular Approach to Ultrasmall Polymer Nanocarriers: Making Bright and Stable Nanoparticles. ACS Nano 2015, 9 (5), 5104-5116. https://doi.org/10.1021/acsnano.5b00214.
(16) Ruthardt, N.; Lamb, D. C.; Brauchle, C. Single-Particle Tracking as a Quantitative Microscopy-Based Approach to Unravel Cell Entry Mechanisms of Viruses and Pharmaceutical Nanoparticles. Mol. Ther. 2011, 19 (7), 1199-1211. https://doi.org/10.1038/mt.2011.102.
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】