特表 2023-504735 ヒトＭＥＣＰ２遺伝子を発現するように設計されたトランスジーンカセット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-06

(54)【発明の名称】ヒトＭＥＣＰ２遺伝子を発現するように設計されたトランスジーンカセット

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20230130BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230130BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230130BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230130BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230130BHJP

   A61K 38/17 20060101ALN20230130BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALN20230130BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/12 ZNA

A61P25/00

A61K48/00

A61K35/76

A61K38/17

A61K31/7088

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022534148

(86)(22)【出願日】2020-12-04

(85)【翻訳文提出日】2022-08-02

(86)【国際出願番号】 US2020063300

(87)【国際公開番号】W WO2021113634

(87)【国際公開日】2021-06-10

(31)【優先権主張番号】63/047,596

(32)【優先日】2020-07-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/944,209

(32)【優先日】2019-12-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/008,159

(32)【優先日】2020-04-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/946,696

(32)【優先日】2019-12-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508152917

【氏名又は名称】ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(74)【代理人】

【識別番号】100204582

【弁理士】

【氏名又は名称】大栗 由美

(72)【発明者】

【氏名】グレイ，スティーヴン，ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】シネット，サラ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084CA18

4C084DC50

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA02

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA56

4C086MA58

4C086MA59

4C086MA60

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZA02

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA52

4C087MA55

4C087MA56

4C087MA58

4C087MA59

4C087MA60

4C087MA65

4C087MA66

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA02

(57)【要約】

本開示は、レット症候群を含むＭｅＣＰ２の喪失および／または機能不全に関連する疾患および遺伝障害の処置のための方法および組成物を提供する。本開示の方法および組成物は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子を含むｒＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶウイルスベクターを含む。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

５’から３’の方向に、
ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）プロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＭｅＣＰ２由来ポリペプチドがミニＭｅＣＰ２ポリペプチドである、トランスジーン核酸分子、
ｄ）制御配列、および
ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含むｒＡＡＶベクター。

【請求項2】

前記ミニＭｅＣＰ２ポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項3】

ＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする前記核酸配列が、配列番号３で表される核酸配列を含む、請求項１または２に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項4】

前記第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号１８で表される核酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項5】

前記第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号２０で表される核酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項6】

前記プロモーター配列がＭｅＰ４２６プロモーター配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項7】

前記ＭｅＰ４２６プロモーター配列が、配列番号２２で表される核酸配列を含む、請求項６に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項8】

前記制御配列が１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項9】

前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－９－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２１８－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－９８－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２１８－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項８に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項10】

前記制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のうち１つまたは複数を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項11】

前記制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項12】

前記制御配列が、配列番号１３で表される核酸配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項13】

前記制御配列が、配列番号１４で表される核酸配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項14】

前記制御配列が、配列番号１５で表される核酸配列を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項15】

前記制御配列が、配列番号１６で表される核酸配列を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項16】

前記制御配列が、５’から３’の方向に、
ｉ）配列番号１５で表される核酸配列、
ｉｉ）配列番号１３で表される核酸配列、および
ｉｉｉ）配列番号１６で表される核酸配列
を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項17】

前記制御配列が、配列番号１７で表される核酸配列を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項18】

５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。

【請求項19】

５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。

【請求項20】

ａ）請求項１から１９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、および
ｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質
を含む、ｒＡＡＶウイルスベクター。

【請求項21】

前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、請求項２０に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。

【請求項22】

前記ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ９カプシドタンパク質である、請求項２１に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。

【請求項23】

前記ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質である、請求項２１に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。

【請求項24】

ａ）請求項２０から２３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルスベクター、ならびに
ｂ）少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または添加物
を含む、医薬組成物。

【請求項25】

ＭＥＣＰ２遺伝子が関与する疾患および／または障害を有する対象を処置するための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の請求項２０から２３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルスベクターまたは請求項２４に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項26】

ＭＥＣＰ２遺伝子が関与する前記疾患および／または障害がレット症候群である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ｒＡＡＶウイルスベクターまたは前記医薬組成物が、約１０^５～約１０^２０ウイルスベクター粒子の範囲の用量で前記対象に投与される、請求項２５または２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ｒＡＡＶウイルスベクターまたは前記医薬組成物が、約１０^５～約１０^１５ウイルスベクター粒子の範囲の用量で前記対象に投与される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ｒＡＡＶウイルスベクターまたは前記医薬組成物が、静脈内、髄腔内、脳内、心室内、鼻内、気管内、耳内、眼内または眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内、胸膜内、局所、リンパ節内、脳槽内、または神経内で前記対象に投与される、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物が髄腔内投与される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物が頭蓋内投与される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

それを必要とする対象におけるＭＥＣＰ２遺伝子が関与する疾患および／または障害の処置における使用のための、請求項２０から２３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルスベクターまたは請求項２４に記載の医薬組成物。

【請求項33】

ＭＥＣＰ２遺伝子が関与する疾患および／または障害がレット症候群である、請求項３２に記載の使用。

【請求項34】

前記ｒＡＡＶウイルスベクターまたは前記医薬組成物が、約１０^１１～約１０^１８ウイルスベクター粒子の範囲の用量で前記対象に投与するためのものである、請求項３２または３３に記載の使用。

【請求項35】

前記ｒＡＡＶウイルスベクターまたは前記医薬組成物が、約１０^５～約１０^２０ウイルスベクター粒子の範囲の用量で前記対象に投与するためのものである、請求項３４に記載の使用。

【請求項36】

前記ｒＡＡＶウイルスベクターまたは前記医薬組成物が、静脈内、髄腔内、脳内、心室内、鼻内、気管内、耳内、眼内または眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内、胸膜内、局所、リンパ節内、脳槽内、または神経内で前記対象に投与するためのものである、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の使用。

【請求項37】

前記ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物が髄腔内投与のためのものである、請求項３６に記載の使用。

【請求項38】

前記ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物が頭蓋内投与のためのものである、請求項３６に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年１２月５日出願の米国仮特許出願第６２／９４４，２０９号、２０１９年１２月１１日出願の米国仮特許出願第６２／９４６，６９６号、２０２０年４月１０日出願の米国仮特許出願第６３／００８，１５９号、および２０２０年７月２日出願の米国仮特許出願第６３／０４７，５９６号の優先権を主張する。上述の特許出願のそれぞれの内容は、あらゆる目的のため参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の参照による組み込み
本出願はＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０２０年１２月４日に作成され、「ＴＡＹＳ－００３＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」と命名され、大きさ約１８．６ＫＢである。

【背景技術】

【0003】

レット症候群は、正常の脳機能、特にシナプスの維持に関与する多くの遺伝子の発現を制御するタンパク質（ＭｅＣＰ２）をコードする遺伝子であるＸ連鎖ＭＥＣＰ２の変異によって惹起される。レット症候群の罹患率は１２歳未満の女児において９０００分の１である一方、一般の集団における罹患率は３万分の１と推定されている。発症の月齢は約６～１８か月である。短期間は正常な発達が起こるが、続いて言語および意図的な手の使用の喪失、固定的な手の動作、ならびに歩行異常が起こる。さらなる特徴には、頭の成長の減速、発作、自閉症の兆候、および呼吸異常が含まれる。ＭＥＣＰ２遺伝子の導入が、Ｘ連鎖神経発達障害であるレット症候群（ＲＴＴ）をモデルするＭｅＣＰ２^－／ｙノックアウト（ＫＯ）マウスの生存を延長することが示されている。しかし、ＭｅＣＰ２の有害な過発現を制御することは、ＲＴＴの安全かつ有効な遺伝子療法アプローチに向かう重要で満たされていない障害として残っている。レット症候群の遺伝子療法処置のための当技術における組成物および方法が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本開示は、５’から３’の方向に、ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、ｂ）プロモーター配列、ｃ）トランスジーン核酸分子、ｄ）制御配列、およびｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

トランスジーン核酸分子はＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでよく、ここでＭｅＣＰ２由来ポリペプチドはミニＭｅＣＰ２ポリペプチドである。ミニＭｅＣＰ２ポリペプチドは配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み得る。ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３で表される核酸配列を含み得る。ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２８で表される核酸配列を含み得る。

【0006】

第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号１８で表される核酸配列を含み得る。第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２０で表される核酸配列を含み得る。

【0007】

プロモーター配列は、ＭｅＰ４２６プロモーター配列を含み得る。ＭｅＰ４２６プロモーター配列は、配列番号２２で表される核酸配列を含み得る。

【0008】

制御配列は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－９－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２１８－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－９８－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２１８－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、またはこれらの任意の組合せを含み得る。

【0009】

制御配列は、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のうち１つまたは複数を含み得る。制御配列は、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のそれぞれを含み得る。制御配列は、配列番号１３で表される核酸配列を含み得る。制御配列は、配列番号１４で表される核酸配列を含み得る。制御配列は、配列番号１５で表される核酸配列を含み得る。制御配列は、配列番号１６で表される核酸配列を含み得る。制御配列は、５’から３’の方向に、ｉ）配列番号１５で表される核酸配列、ｉｉ）配列番号１３で表される核酸配列、およびｉｉｉ）配列番号１６で表される核酸配列を含み得る。制御配列は、配列番号１７で表される核酸配列を含み得る。

【0010】

本開示は、５’から３’の方向に、ａ）配列番号１８で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、およびｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。

【0011】

本開示は、５’から３’の方向に、ａ）配列番号１８で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、およびｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。

【0012】

本開示は、ａ）本明細書に記載したｒＡＡＶベクターのいずれか１つおよびｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質であってよい。ＡＡＶカプシドタンパク質はＡＡＶ９カプシドタンパク質であってよい。ＡＡＶカプシドタンパク質はＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質であってよい。

【0013】

本開示は、本明細書に記載した任意のｒＡＡＶウイルスベクターならびに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または添加物を含む医薬組成物を提供する。

【0014】

本開示は、ＭＥＣＰ２遺伝子が関与する疾患および／または障害を有する対象を処置するための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本明細書に記載した任意のｒＡＡＶウイルスベクターまたは本明細書に記載した任意の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、約１０^５～約１０^２０ウイルスベクター粒子の範囲の用量で対象に投与することができる。ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、約１０^５～約１０^１５ウイルスベクター粒子の範囲の用量で対象に投与することができる。ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、静脈内、髄腔内、脳内、心室内、鼻内、気管内、耳内、眼内または眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌｌｙ）、神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖａｌｌｙ）、胸膜内、局所、リンパ節内、脳槽内、または神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖｅ）で、対象に投与することができる。ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、髄腔内に投与することができる。ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、頭蓋内に投与することができる。

【0015】

本開示は、それを必要とする対象におけるＭＥＣＰ２遺伝子が関与する疾患および／または障害の処置における使用のための、本明細書に記載した任意のｒＡＡＶウイルスベクターまたは本明細書に記載した任意の医薬組成物を提供する。ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、約１０^１１～約１０^１８ウイルスベクター粒子の範囲の用量で、対象に投与するためのものであってよい。ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、約１０^５～約１０^２０ウイルスベクター粒子の範囲の用量で、対象に投与するためのものであってよい。ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、静脈内、髄腔内、脳内、心室内、鼻内、気管内、耳内、眼内または眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内、胸膜内、局所、リンパ節内、脳槽内、または神経内で対象に投与するためであってよい。ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、髄腔内投与のためであってよい。ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、頭蓋内投与のためであってよい。

【0016】

ＭＥＣＰ２遺伝子が関与する疾患および／または障害は、レット症候群であってよい。

【0017】

上記の任意の態様、または本明細書に記載した他の任意の態様は、他の任意の態様と組み合わせることができる。

【0018】

他に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術における当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書では、単数形は文脈によって他が明確に指示されない限り、複数形を含み、たとえば用語「１つの」および「その」は単数または複数であると理解され、用語「または」は包括的であると理解される。例として、「１つの要素」は１つまたは複数の要素を意味する。明細書全体にわたって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓまたはｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記述した要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を意味するが、他の任意の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を排除しないことが理解されよう。「約」は、記述した値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解することができる。文脈から他が明確でない限り、本明細書で提供する全ての数値は、用語「約」によって修飾される。

【0019】

本明細書に記載した方法および材料と同様または等価の方法および材料は、本開示の実施または試験に用いることができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で述べる全ての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参照により全体として組み込まれる。本明細書で引用する参考文献は、特許を請求する発明の先行技術であると認めてはいない。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は説明のためのみであり、限定的であることを意図していない。本開示のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。

【0020】

上記のおよびさらなる特徴は、添付した図面と併せて取り上げた場合に、以下の詳細な説明からより明確に理解される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1A】ミニＭＥＣＰ２ベクターが野生型（ＷＴ）マウスにおいて副反応を惹起することを示す図である。図１Ａは、急性毒性研究におけるＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２処置の後のマウスの平均クラスピングスコアの増加を示す表である。ミニＭｅＣＰ２の過発現は、異常なクラスピングスコアの顕著な増大を惹起した。１群あたりｎ＝５～６匹のマウス。食塩水とウイルス処理；および注射前と注射後：＃ｐ＜０．０５。図１Ｂは、ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２（１×１０^１２ｖｇ／マウス、ＩＣＭ）による処置の３日後に観察された重篤な後肢のクラスピングを示す写真である。健康なマウスでは、後肢は外側に伸長する。図１Ｃは、ＡＡＶ９／およびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２による処置の後のマウスにおける総計表現型重症度スコアの変化を示すグラフである。ＡＡＶ９／とＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２の両方は、注射後２週以内で総計表現型重症度スコアを有意に増加させる（ｐ＜０．０５）。図１Ａ～図１Ｃは、ＵＮＣ－Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌで飼育し、処置したマウスについてのデータを示している。本出願における他の全てのマウスは、ＵＴＳＷで試験した。図１Ａおよび図１Ｃは、平均±ＳＥＭである。

【図1B】ミニＭＥＣＰ２ベクターが野生型（ＷＴ）マウスにおいて副反応を惹起することを示す図である。図１Ａは、急性毒性研究におけるＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２処置の後のマウスの平均クラスピングスコアの増加を示す表である。ミニＭｅＣＰ２の過発現は、異常なクラスピングスコアの顕著な増大を惹起した。１群あたりｎ＝５～６匹のマウス。食塩水とウイルス処理；および注射前と注射後：＃ｐ＜０．０５。図１Ｂは、ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２（１×１０^１２ｖｇ／マウス、ＩＣＭ）による処置の３日後に観察された重篤な後肢のクラスピングを示す写真である。健康なマウスでは、後肢は外側に伸長する。図１Ｃは、ＡＡＶ９／およびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２による処置の後のマウスにおける総計表現型重症度スコアの変化を示すグラフである。ＡＡＶ９／とＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２の両方は、注射後２週以内で総計表現型重症度スコアを有意に増加させる（ｐ＜０．０５）。図１Ａ～図１Ｃは、ＵＮＣ－Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌで飼育し、処置したマウスについてのデータを示している。本出願における他の全てのマウスは、ＵＴＳＷで試験した。図１Ａおよび図１Ｃは、平均±ＳＥＭである。

【図1C】ミニＭＥＣＰ２ベクターが野生型（ＷＴ）マウスにおいて副反応を惹起することを示す図である。図１Ａは、急性毒性研究におけるＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２処置の後のマウスの平均クラスピングスコアの増加を示す表である。ミニＭｅＣＰ２の過発現は、異常なクラスピングスコアの顕著な増大を惹起した。１群あたりｎ＝５～６匹のマウス。食塩水とウイルス処理；および注射前と注射後：＃ｐ＜０．０５。図１Ｂは、ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２（１×１０^１２ｖｇ／マウス、ＩＣＭ）による処置の３日後に観察された重篤な後肢のクラスピングを示す写真である。健康なマウスでは、後肢は外側に伸長する。図１Ｃは、ＡＡＶ９／およびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２による処置の後のマウスにおける総計表現型重症度スコアの変化を示すグラフである。ＡＡＶ９／とＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２の両方は、注射後２週以内で総計表現型重症度スコアを有意に増加させる（ｐ＜０．０５）。図１Ａ～図１Ｃは、ＵＮＣ－Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌで飼育し、処置したマウスについてのデータを示している。本出願における他の全てのマウスは、ＵＴＳＷで試験した。図１Ａおよび図１Ｃは、平均±ＳＥＭである。

【図2A】知的障害を媒介する遺伝子の３’ＵＴＲの精選されたリストにわたって頻繁に出現する標的をランク付けするために用いられるマイクロアレイ発現データを示す図である。図２Ａは、４５１個のｍｉＲＮＡ標的の出現率を示すグラフである。多くのｍｉＲＮＡ標的が、３’ＵＴＲの精選されたリストにわたって頻繁に出現する。図２Ｂは、２４９１個のヒト標的および１８３１個のマウス標的の中で、４５１個の標的がマウスとヒトの両方の３’ＵＴＲデータセットにわたって同一のアノテーションを有していたことを示すプロットである。散布図は、図２Ａに示したものと同じデータを示す。標的パネル設計のために、両方の種について検討した３’ＵＴＲ配列の半分以上においてアノテートした標的を優先した（影を付けた区域）。影を付けた区域の中で、黒いデータ点は、切除したＣＣ、小脳、および／または延髄の組織における中程度～高いレベルで発現したｍｉＲＮＡに対応する標的を示す（シグナル強度＞５００）。四角のデータ点は、想定されるＭｅＣＰ２応答性ｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ^＊、ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ）ならびにＭｅＣＰ２（－）およびＭｅＣＰ２（＋）処置群のデータを併せて統合した場合に頚髄で増加した（データは示していない）２つの追加的なｍｉＲＮＡ（＃で示すｍｉＲ－９－５ｐおよびｍｉＲ－２７ａ－３ｐ）の標的を示す。たとえばＭｅＣＰ２（－）群には、食塩水で処置したＫＯマウスおよびＡＡＶ９／ＥＧＦＰで処理したＫＯマウスの両方が含まれる。明確にするため、影を付けた区域のみにノーテーション（黒色および四角のデータ点）を限定した。ｍｉＲＡＲＥを多数の遺伝子治療用途により広く適用可能にする目的のため、ｍｉＲ－２１８－５ｐの標的を新たなパネル設計（「ｍｉＲＡＲＥ」、他の箇所では「Ｒｅｇ２」と注記）に含ませた^‡。ｍｉＲ－２１８－５ｐの発現は、本発明者らのＨＴＳデータではＭｅＣＰ２応答性であるようには思われなかった。図２Ｃは、ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥウイルスゲノムカセットの概略図である。黒の点線および白の実線は、ＲＤＨ１ｐＡの部分であるｍｉＲＮＡ標的を示す。灰色の実線は、ＲＤＨ１ｐＡに挿入されたｍｉＲＡＲＥ標的を示す。ＩＴＲは逆転ターミナルリピート、ｓｃは変異した自己相補性ＩＴＲ配列である。

【図2B】知的障害を媒介する遺伝子の３’ＵＴＲの精選されたリストにわたって頻繁に出現する標的をランク付けするために用いられるマイクロアレイ発現データを示す図である。図２Ａは、４５１個のｍｉＲＮＡ標的の出現率を示すグラフである。多くのｍｉＲＮＡ標的が、３’ＵＴＲの精選されたリストにわたって頻繁に出現する。図２Ｂは、２４９１個のヒト標的および１８３１個のマウス標的の中で、４５１個の標的がマウスとヒトの両方の３’ＵＴＲデータセットにわたって同一のアノテーションを有していたことを示すプロットである。散布図は、図２Ａに示したものと同じデータを示す。標的パネル設計のために、両方の種について検討した３’ＵＴＲ配列の半分以上においてアノテートした標的を優先した（影を付けた区域）。影を付けた区域の中で、黒いデータ点は、切除したＣＣ、小脳、および／または延髄の組織における中程度～高いレベルで発現したｍｉＲＮＡに対応する標的を示す（シグナル強度＞５００）。四角のデータ点は、想定されるＭｅＣＰ２応答性ｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ^＊、ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ）ならびにＭｅＣＰ２（－）およびＭｅＣＰ２（＋）処置群のデータを併せて統合した場合に頚髄で増加した（データは示していない）２つの追加的なｍｉＲＮＡ（＃で示すｍｉＲ－９－５ｐおよびｍｉＲ－２７ａ－３ｐ）の標的を示す。たとえばＭｅＣＰ２（－）群には、食塩水で処置したＫＯマウスおよびＡＡＶ９／ＥＧＦＰで処理したＫＯマウスの両方が含まれる。明確にするため、影を付けた区域のみにノーテーション（黒色および四角のデータ点）を限定した。ｍｉＲＡＲＥを多数の遺伝子治療用途により広く適用可能にする目的のため、ｍｉＲ－２１８－５ｐの標的を新たなパネル設計（「ｍｉＲＡＲＥ」、他の箇所では「Ｒｅｇ２」と注記）に含ませた^‡。ｍｉＲ－２１８－５ｐの発現は、本発明者らのＨＴＳデータではＭｅＣＰ２応答性であるようには思われなかった。図２Ｃは、ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥウイルスゲノムカセットの概略図である。黒の点線および白の実線は、ＲＤＨ１ｐＡの部分であるｍｉＲＮＡ標的を示す。灰色の実線は、ＲＤＨ１ｐＡに挿入されたｍｉＲＡＲＥ標的を示す。ＩＴＲは逆転ターミナルリピート、ｓｃは変異した自己相補性ＩＴＲ配列である。

【図2C】知的障害を媒介する遺伝子の３’ＵＴＲの精選されたリストにわたって頻繁に出現する標的をランク付けするために用いられるマイクロアレイ発現データを示す図である。図２Ａは、４５１個のｍｉＲＮＡ標的の出現率を示すグラフである。多くのｍｉＲＮＡ標的が、３’ＵＴＲの精選されたリストにわたって頻繁に出現する。図２Ｂは、２４９１個のヒト標的および１８３１個のマウス標的の中で、４５１個の標的がマウスとヒトの両方の３’ＵＴＲデータセットにわたって同一のアノテーションを有していたことを示すプロットである。散布図は、図２Ａに示したものと同じデータを示す。標的パネル設計のために、両方の種について検討した３’ＵＴＲ配列の半分以上においてアノテートした標的を優先した（影を付けた区域）。影を付けた区域の中で、黒いデータ点は、切除したＣＣ、小脳、および／または延髄の組織における中程度～高いレベルで発現したｍｉＲＮＡに対応する標的を示す（シグナル強度＞５００）。四角のデータ点は、想定されるＭｅＣＰ２応答性ｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ^＊、ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ）ならびにＭｅＣＰ２（－）およびＭｅＣＰ２（＋）処置群のデータを併せて統合した場合に頚髄で増加した（データは示していない）２つの追加的なｍｉＲＮＡ（＃で示すｍｉＲ－９－５ｐおよびｍｉＲ－２７ａ－３ｐ）の標的を示す。たとえばＭｅＣＰ２（－）群には、食塩水で処置したＫＯマウスおよびＡＡＶ９／ＥＧＦＰで処理したＫＯマウスの両方が含まれる。明確にするため、影を付けた区域のみにノーテーション（黒色および四角のデータ点）を限定した。ｍｉＲＡＲＥを多数の遺伝子治療用途により広く適用可能にする目的のため、ｍｉＲ－２１８－５ｐの標的を新たなパネル設計（「ｍｉＲＡＲＥ」、他の箇所では「Ｒｅｇ２」と注記）に含ませた^‡。ｍｉＲ－２１８－５ｐの発現は、本発明者らのＨＴＳデータではＭｅＣＰ２応答性であるようには思われなかった。図２Ｃは、ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥウイルスゲノムカセットの概略図である。黒の点線および白の実線は、ＲＤＨ１ｐＡの部分であるｍｉＲＮＡ標的を示す。灰色の実線は、ＲＤＨ１ｐＡに挿入されたｍｉＲＡＲＥ標的を示す。ＩＴＲは逆転ターミナルリピート、ｓｃは変異した自己相補性ＩＴＲ配列である。

【図3A】ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥが若年のＷＴにおけるＩＴ投与後によく忍容されることを示す図である。この原稿を通して、全ての処置は４～５週齢の間に投与した。図３Ａは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）が、１５週齢で開始して食塩水で処置したＷＴマウスより有意に低い体重を有していた（ｐ＜０．０５）ことを示すグラフである。食塩水とＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）の間では有意差は観察されなかった。同じ説明が図３Ｂにも適用される。図３Ｂは、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウスが、食塩水で処置したマウスで観察されたものに対して有意に高い平均総計行動重症度スコアを有していた（６～３０週齢および７～２７週齢のそれぞれでｐ＜０．０５）ことを示すグラフである。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスは、それぞれ１１～１９週齢および９～２０週齢の大部分の時点で、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したマウスに対して有意に低い平均総計重症度スコアを有していた。食塩水およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）の間では有意差は観察されなかった。図３Ｃは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置した大部分のＷＴマウスでは重篤なクラスピング異常が発現しなかった（ｎ＝２／９匹のマウス）ことを示すグラフである。図３Ｄは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスでは重篤な歩行異常が発現しなかった（ｎ＝０／９匹のマウス）ことを示すグラフである。図３Ｃおよび図３Ｄにおいて、重篤な異常歩行および重篤なクラスピングはそれぞれ、０～２のスケールで２とスコア付けている。全てのベクターは、１×１０^１２ｖｇ／マウスで投与した。歩行またはクラスピングの重篤なスコアが発現する前、早期に安楽死させたマウスは、図３Ｃおよび図３Ｄから除外した。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットについて有意性を評価するために用いることができるＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて、^＊ｐ＜０．０５。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスが重篤な歩行異常を発現する時点が存在しないので、図３Ｄについての平均発症週齢の一方向ＡＮＯＶＡは勧められない。図３Ｅは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスについて、早期の死亡が観察されなかったことを示している。明確にするため、ＭｉＲＡＲＥ群はオフセットしている。菱形は、虐待に関連する傷害（食塩水処置）および脱落（ｐｒｏｌａｐｓｅ）（ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２処置）についての獣医の要望による安楽死を示す。脱落は、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウス（それぞれ１×１０^１１～１×１０^１２ｖｇ）の８～１７％で観察された。ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２で処置した４匹のマウスは８週齢で解剖し、したがって生存プロットから除外した。図３Ａおよび図３Ｂのデータは平均±ＳＥＭである。単純にするため、食塩水処置と高用量処置のＷＴマウスの統計的差のみを解析した。^＊ｐ＜０．０５。

【図3B】ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥが若年のＷＴにおけるＩＴ投与後によく忍容されることを示す図である。この原稿を通して、全ての処置は４～５週齢の間に投与した。図３Ａは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）が、１５週齢で開始して食塩水で処置したＷＴマウスより有意に低い体重を有していた（ｐ＜０．０５）ことを示すグラフである。食塩水とＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）の間では有意差は観察されなかった。同じ説明が図３Ｂにも適用される。図３Ｂは、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウスが、食塩水で処置したマウスで観察されたものに対して有意に高い平均総計行動重症度スコアを有していた（６～３０週齢および７～２７週齢のそれぞれでｐ＜０．０５）ことを示すグラフである。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスは、それぞれ１１～１９週齢および９～２０週齢の大部分の時点で、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したマウスに対して有意に低い平均総計重症度スコアを有していた。食塩水およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）の間では有意差は観察されなかった。図３Ｃは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置した大部分のＷＴマウスでは重篤なクラスピング異常が発現しなかった（ｎ＝２／９匹のマウス）ことを示すグラフである。図３Ｄは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスでは重篤な歩行異常が発現しなかった（ｎ＝０／９匹のマウス）ことを示すグラフである。図３Ｃおよび図３Ｄにおいて、重篤な異常歩行および重篤なクラスピングはそれぞれ、０～２のスケールで２とスコア付けている。全てのベクターは、１×１０^１２ｖｇ／マウスで投与した。歩行またはクラスピングの重篤なスコアが発現する前、早期に安楽死させたマウスは、図３Ｃおよび図３Ｄから除外した。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットについて有意性を評価するために用いることができるＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて、^＊ｐ＜０．０５。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスが重篤な歩行異常を発現する時点が存在しないので、図３Ｄについての平均発症週齢の一方向ＡＮＯＶＡは勧められない。図３Ｅは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスについて、早期の死亡が観察されなかったことを示している。明確にするため、ＭｉＲＡＲＥ群はオフセットしている。菱形は、虐待に関連する傷害（食塩水処置）および脱落（ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２処置）についての獣医の要望による安楽死を示す。脱落は、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウス（それぞれ１×１０^１１～１×１０^１２ｖｇ）の８～１７％で観察された。ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２で処置した４匹のマウスは８週齢で解剖し、したがって生存プロットから除外した。図３Ａおよび図３Ｂのデータは平均±ＳＥＭである。単純にするため、食塩水処置と高用量処置のＷＴマウスの統計的差のみを解析した。^＊ｐ＜０．０５。

【図3C】ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥが若年のＷＴにおけるＩＴ投与後によく忍容されることを示す図である。この原稿を通して、全ての処置は４～５週齢の間に投与した。図３Ａは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）が、１５週齢で開始して食塩水で処置したＷＴマウスより有意に低い体重を有していた（ｐ＜０．０５）ことを示すグラフである。食塩水とＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）の間では有意差は観察されなかった。同じ説明が図３Ｂにも適用される。図３Ｂは、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウスが、食塩水で処置したマウスで観察されたものに対して有意に高い平均総計行動重症度スコアを有していた（６～３０週齢および７～２７週齢のそれぞれでｐ＜０．０５）ことを示すグラフである。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスは、それぞれ１１～１９週齢および９～２０週齢の大部分の時点で、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したマウスに対して有意に低い平均総計重症度スコアを有していた。食塩水およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）の間では有意差は観察されなかった。図３Ｃは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置した大部分のＷＴマウスでは重篤なクラスピング異常が発現しなかった（ｎ＝２／９匹のマウス）ことを示すグラフである。図３Ｄは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスでは重篤な歩行異常が発現しなかった（ｎ＝０／９匹のマウス）ことを示すグラフである。図３Ｃおよび図３Ｄにおいて、重篤な異常歩行および重篤なクラスピングはそれぞれ、０～２のスケールで２とスコア付けている。全てのベクターは、１×１０^１２ｖｇ／マウスで投与した。歩行またはクラスピングの重篤なスコアが発現する前、早期に安楽死させたマウスは、図３Ｃおよび図３Ｄから除外した。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットについて有意性を評価するために用いることができるＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて、^＊ｐ＜０．０５。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスが重篤な歩行異常を発現する時点が存在しないので、図３Ｄについての平均発症週齢の一方向ＡＮＯＶＡは勧められない。図３Ｅは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスについて、早期の死亡が観察されなかったことを示している。明確にするため、ＭｉＲＡＲＥ群はオフセットしている。菱形は、虐待に関連する傷害（食塩水処置）および脱落（ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２処置）についての獣医の要望による安楽死を示す。脱落は、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウス（それぞれ１×１０^１１～１×１０^１２ｖｇ）の８～１７％で観察された。ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２で処置した４匹のマウスは８週齢で解剖し、したがって生存プロットから除外した。図３Ａおよび図３Ｂのデータは平均±ＳＥＭである。単純にするため、食塩水処置と高用量処置のＷＴマウスの統計的差のみを解析した。^＊ｐ＜０．０５。

【図3D】ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥが若年のＷＴにおけるＩＴ投与後によく忍容されることを示す図である。この原稿を通して、全ての処置は４～５週齢の間に投与した。図３Ａは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）が、１５週齢で開始して食塩水で処置したＷＴマウスより有意に低い体重を有していた（ｐ＜０．０５）ことを示すグラフである。食塩水とＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）の間では有意差は観察されなかった。同じ説明が図３Ｂにも適用される。図３Ｂは、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウスが、食塩水で処置したマウスで観察されたものに対して有意に高い平均総計行動重症度スコアを有していた（６～３０週齢および７～２７週齢のそれぞれでｐ＜０．０５）ことを示すグラフである。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスは、それぞれ１１～１９週齢および９～２０週齢の大部分の時点で、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したマウスに対して有意に低い平均総計重症度スコアを有していた。食塩水およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）の間では有意差は観察されなかった。図３Ｃは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置した大部分のＷＴマウスでは重篤なクラスピング異常が発現しなかった（ｎ＝２／９匹のマウス）ことを示すグラフである。図３Ｄは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスでは重篤な歩行異常が発現しなかった（ｎ＝０／９匹のマウス）ことを示すグラフである。図３Ｃおよび図３Ｄにおいて、重篤な異常歩行および重篤なクラスピングはそれぞれ、０～２のスケールで２とスコア付けている。全てのベクターは、１×１０^１２ｖｇ／マウスで投与した。歩行またはクラスピングの重篤なスコアが発現する前、早期に安楽死させたマウスは、図３Ｃおよび図３Ｄから除外した。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットについて有意性を評価するために用いることができるＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて、^＊ｐ＜０．０５。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスが重篤な歩行異常を発現する時点が存在しないので、図３Ｄについての平均発症週齢の一方向ＡＮＯＶＡは勧められない。図３Ｅは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスについて、早期の死亡が観察されなかったことを示している。明確にするため、ＭｉＲＡＲＥ群はオフセットしている。菱形は、虐待に関連する傷害（食塩水処置）および脱落（ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２処置）についての獣医の要望による安楽死を示す。脱落は、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウス（それぞれ１×１０^１１～１×１０^１２ｖｇ）の８～１７％で観察された。ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２で処置した４匹のマウスは８週齢で解剖し、したがって生存プロットから除外した。図３Ａおよび図３Ｂのデータは平均±ＳＥＭである。単純にするため、食塩水処置と高用量処置のＷＴマウスの統計的差のみを解析した。^＊ｐ＜０．０５。

【図3E】ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥが若年のＷＴにおけるＩＴ投与後によく忍容されることを示す図である。この原稿を通して、全ての処置は４～５週齢の間に投与した。図３Ａは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）が、１５週齢で開始して食塩水で処置したＷＴマウスより有意に低い体重を有していた（ｐ＜０．０５）ことを示すグラフである。食塩水とＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）の間では有意差は観察されなかった。同じ説明が図３Ｂにも適用される。図３Ｂは、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウスが、食塩水で処置したマウスで観察されたものに対して有意に高い平均総計行動重症度スコアを有していた（６～３０週齢および７～２７週齢のそれぞれでｐ＜０．０５）ことを示すグラフである。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスは、それぞれ１１～１９週齢および９～２０週齢の大部分の時点で、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したマウスに対して有意に低い平均総計重症度スコアを有していた。食塩水およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウス（１×１０^１２ｖｇ／マウス）の間では有意差は観察されなかった。図３Ｃは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置した大部分のＷＴマウスでは重篤なクラスピング異常が発現しなかった（ｎ＝２／９匹のマウス）ことを示すグラフである。図３Ｄは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスでは重篤な歩行異常が発現しなかった（ｎ＝０／９匹のマウス）ことを示すグラフである。図３Ｃおよび図３Ｄにおいて、重篤な異常歩行および重篤なクラスピングはそれぞれ、０～２のスケールで２とスコア付けている。全てのベクターは、１×１０^１２ｖｇ／マウスで投与した。歩行またはクラスピングの重篤なスコアが発現する前、早期に安楽死させたマウスは、図３Ｃおよび図３Ｄから除外した。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットについて有意性を評価するために用いることができるＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて、^＊ｐ＜０．０５。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスが重篤な歩行異常を発現する時点が存在しないので、図３Ｄについての平均発症週齢の一方向ＡＮＯＶＡは勧められない。図３Ｅは、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスについて、早期の死亡が観察されなかったことを示している。明確にするため、ＭｉＲＡＲＥ群はオフセットしている。菱形は、虐待に関連する傷害（食塩水処置）および脱落（ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２処置）についての獣医の要望による安楽死を示す。脱落は、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウス（それぞれ１×１０^１１～１×１０^１２ｖｇ）の８～１７％で観察された。ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２で処置した４匹のマウスは８週齢で解剖し、したがって生存プロットから除外した。図３Ａおよび図３Ｂのデータは平均±ＳＥＭである。単純にするため、食塩水処置と高用量処置のＷＴマウスの統計的差のみを解析した。^＊ｐ＜０．０５。

【図4A】ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥがＫＯマウスの生存を延長することを示す図である。図４Ａは、本開示のＭＥＣＰ２組成物によって処置したマウスの生存のグラフである。菱形は、主として重篤な尾の病変または尾の自己切断のために獣医によって要望された安楽死を示す。食塩水処置およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置されたＫＯマウスのメディアン生存は９．６週および１５．０週である（Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定でｐ＜０．０２）。図９に示す低用量と比較されたい。図４Ｂは、いずれの処置もＫＯ体重に有意に影響しなかったことを示すグラフである。図４Ｂにおける１群あたりのｎは、ＷＴ，０ｖｇ（２０）；ＫＯ，０ｖｇ（１８）；ＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２（１２）；ＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２（１２）；およびＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ（１２）である。図４Ａおよび図４Ｂは、これらのマウスを並行して処置した際に、同じＷＴ対照データが図３に出現することを示す。図４Ｃは、食塩水、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２、およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したマウスの間で、重篤な歩行（スコア＝２）を達成する頻度が２８％、５０％、３３％、および１７％であったことを示すプロットである。マウスあたり１×１０^１２ｖｇを投与した。黒色のバーは、重篤なクラスピングの発症の平均週齢を示す。各データ点は１匹のマウスを表す。マウスの割合（サブセット対全体群）を、各処置群について列記している。重篤な歩行を発現したＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウス（１２匹中ｎ＝２）は、他の群の４～５週後にそうなった。この遅延は顕著に異なるが、確定的な結論を導くにはデータ点の数が少なすぎる。図３Ｄと図４Ｃは同じ種類のデータを示すが、図４Ｃは異なるフォーマットでプロットしている。一般に、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットは発症週齢のデータを視覚的に伝達するには最も明確な方法である（図３Ｄ参照）が、これらのプロットは、正常な歩行を保持した全てのマウスがＸ軸で特定した全期間、生存するという直感的な仮定に役立つ。この仮定はＷＴマウスについては真である（図３Ｄ）が、ＫＯマウスについてはそうではない（図４Ｃ）。重要なことに、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置ＫＯマウスは、生存が延長したにも関わらず、重篤な歩行が発現したのは僅かであった。図４Ｄは、高用量（１×１０^１２ｖｇ／マウス）のＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥがＫＯマウスで初期運動神経の改善の傾向（食塩水に対して、トライアル１、１日目）を生じることを示すグラフである。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはトライアルにわたって運動学習を改善しなかった。食塩水処置ＷＴ、食塩水処置ＫＯ、およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置ＫＯ群について、ｎ＝３０、２９、および９である。図４Ｅは、処置群にわたって病変が観察されたことを示すグラフである。群のサイズが小さいので、ｍｉＲＡＲＥがウイルス処置マウスの間で病変のリスクを低下させるか否かは明らかでない。（図４Ｂ～４Ｄ）データは平均±ＳＥＭである。

【図4B】ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥがＫＯマウスの生存を延長することを示す図である。図４Ａは、本開示のＭＥＣＰ２組成物によって処置したマウスの生存のグラフである。菱形は、主として重篤な尾の病変または尾の自己切断のために獣医によって要望された安楽死を示す。食塩水処置およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置されたＫＯマウスのメディアン生存は９．６週および１５．０週である（Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定でｐ＜０．０２）。図９に示す低用量と比較されたい。図４Ｂは、いずれの処置もＫＯ体重に有意に影響しなかったことを示すグラフである。図４Ｂにおける１群あたりのｎは、ＷＴ，０ｖｇ（２０）；ＫＯ，０ｖｇ（１８）；ＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２（１２）；ＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２（１２）；およびＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ（１２）である。図４Ａおよび図４Ｂは、これらのマウスを並行して処置した際に、同じＷＴ対照データが図３に出現することを示す。図４Ｃは、食塩水、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２、およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したマウスの間で、重篤な歩行（スコア＝２）を達成する頻度が２８％、５０％、３３％、および１７％であったことを示すプロットである。マウスあたり１×１０^１２ｖｇを投与した。黒色のバーは、重篤なクラスピングの発症の平均週齢を示す。各データ点は１匹のマウスを表す。マウスの割合（サブセット対全体群）を、各処置群について列記している。重篤な歩行を発現したＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウス（１２匹中ｎ＝２）は、他の群の４～５週後にそうなった。この遅延は顕著に異なるが、確定的な結論を導くにはデータ点の数が少なすぎる。図３Ｄと図４Ｃは同じ種類のデータを示すが、図４Ｃは異なるフォーマットでプロットしている。一般に、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットは発症週齢のデータを視覚的に伝達するには最も明確な方法である（図３Ｄ参照）が、これらのプロットは、正常な歩行を保持した全てのマウスがＸ軸で特定した全期間、生存するという直感的な仮定に役立つ。この仮定はＷＴマウスについては真である（図３Ｄ）が、ＫＯマウスについてはそうではない（図４Ｃ）。重要なことに、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置ＫＯマウスは、生存が延長したにも関わらず、重篤な歩行が発現したのは僅かであった。図４Ｄは、高用量（１×１０^１２ｖｇ／マウス）のＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥがＫＯマウスで初期運動神経の改善の傾向（食塩水に対して、トライアル１、１日目）を生じることを示すグラフである。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはトライアルにわたって運動学習を改善しなかった。食塩水処置ＷＴ、食塩水処置ＫＯ、およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置ＫＯ群について、ｎ＝３０、２９、および９である。図４Ｅは、処置群にわたって病変が観察されたことを示すグラフである。群のサイズが小さいので、ｍｉＲＡＲＥがウイルス処置マウスの間で病変のリスクを低下させるか否かは明らかでない。（図４Ｂ～４Ｄ）データは平均±ＳＥＭである。

【図4C】ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥがＫＯマウスの生存を延長することを示す図である。図４Ａは、本開示のＭＥＣＰ２組成物によって処置したマウスの生存のグラフである。菱形は、主として重篤な尾の病変または尾の自己切断のために獣医によって要望された安楽死を示す。食塩水処置およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置されたＫＯマウスのメディアン生存は９．６週および１５．０週である（Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定でｐ＜０．０２）。図９に示す低用量と比較されたい。図４Ｂは、いずれの処置もＫＯ体重に有意に影響しなかったことを示すグラフである。図４Ｂにおける１群あたりのｎは、ＷＴ，０ｖｇ（２０）；ＫＯ，０ｖｇ（１８）；ＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２（１２）；ＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２（１２）；およびＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ（１２）である。図４Ａおよび図４Ｂは、これらのマウスを並行して処置した際に、同じＷＴ対照データが図３に出現することを示す。図４Ｃは、食塩水、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２、およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したマウスの間で、重篤な歩行（スコア＝２）を達成する頻度が２８％、５０％、３３％、および１７％であったことを示すプロットである。マウスあたり１×１０^１２ｖｇを投与した。黒色のバーは、重篤なクラスピングの発症の平均週齢を示す。各データ点は１匹のマウスを表す。マウスの割合（サブセット対全体群）を、各処置群について列記している。重篤な歩行を発現したＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウス（１２匹中ｎ＝２）は、他の群の４～５週後にそうなった。この遅延は顕著に異なるが、確定的な結論を導くにはデータ点の数が少なすぎる。図３Ｄと図４Ｃは同じ種類のデータを示すが、図４Ｃは異なるフォーマットでプロットしている。一般に、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットは発症週齢のデータを視覚的に伝達するには最も明確な方法である（図３Ｄ参照）が、これらのプロットは、正常な歩行を保持した全てのマウスがＸ軸で特定した全期間、生存するという直感的な仮定に役立つ。この仮定はＷＴマウスについては真である（図３Ｄ）が、ＫＯマウスについてはそうではない（図４Ｃ）。重要なことに、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置ＫＯマウスは、生存が延長したにも関わらず、重篤な歩行が発現したのは僅かであった。図４Ｄは、高用量（１×１０^１２ｖｇ／マウス）のＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥがＫＯマウスで初期運動神経の改善の傾向（食塩水に対して、トライアル１、１日目）を生じることを示すグラフである。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはトライアルにわたって運動学習を改善しなかった。食塩水処置ＷＴ、食塩水処置ＫＯ、およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置ＫＯ群について、ｎ＝３０、２９、および９である。図４Ｅは、処置群にわたって病変が観察されたことを示すグラフである。群のサイズが小さいので、ｍｉＲＡＲＥがウイルス処置マウスの間で病変のリスクを低下させるか否かは明らかでない。（図４Ｂ～４Ｄ）データは平均±ＳＥＭである。

【図4D】ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥがＫＯマウスの生存を延長することを示す図である。図４Ａは、本開示のＭＥＣＰ２組成物によって処置したマウスの生存のグラフである。菱形は、主として重篤な尾の病変または尾の自己切断のために獣医によって要望された安楽死を示す。食塩水処置およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置されたＫＯマウスのメディアン生存は９．６週および１５．０週である（Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定でｐ＜０．０２）。図９に示す低用量と比較されたい。図４Ｂは、いずれの処置もＫＯ体重に有意に影響しなかったことを示すグラフである。図４Ｂにおける１群あたりのｎは、ＷＴ，０ｖｇ（２０）；ＫＯ，０ｖｇ（１８）；ＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２（１２）；ＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２（１２）；およびＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ（１２）である。図４Ａおよび図４Ｂは、これらのマウスを並行して処置した際に、同じＷＴ対照データが図３に出現することを示す。図４Ｃは、食塩水、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２、およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したマウスの間で、重篤な歩行（スコア＝２）を達成する頻度が２８％、５０％、３３％、および１７％であったことを示すプロットである。マウスあたり１×１０^１２ｖｇを投与した。黒色のバーは、重篤なクラスピングの発症の平均週齢を示す。各データ点は１匹のマウスを表す。マウスの割合（サブセット対全体群）を、各処置群について列記している。重篤な歩行を発現したＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウス（１２匹中ｎ＝２）は、他の群の４～５週後にそうなった。この遅延は顕著に異なるが、確定的な結論を導くにはデータ点の数が少なすぎる。図３Ｄと図４Ｃは同じ種類のデータを示すが、図４Ｃは異なるフォーマットでプロットしている。一般に、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットは発症週齢のデータを視覚的に伝達するには最も明確な方法である（図３Ｄ参照）が、これらのプロットは、正常な歩行を保持した全てのマウスがＸ軸で特定した全期間、生存するという直感的な仮定に役立つ。この仮定はＷＴマウスについては真である（図３Ｄ）が、ＫＯマウスについてはそうではない（図４Ｃ）。重要なことに、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置ＫＯマウスは、生存が延長したにも関わらず、重篤な歩行が発現したのは僅かであった。図４Ｄは、高用量（１×１０^１２ｖｇ／マウス）のＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥがＫＯマウスで初期運動神経の改善の傾向（食塩水に対して、トライアル１、１日目）を生じることを示すグラフである。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはトライアルにわたって運動学習を改善しなかった。食塩水処置ＷＴ、食塩水処置ＫＯ、およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置ＫＯ群について、ｎ＝３０、２９、および９である。図４Ｅは、処置群にわたって病変が観察されたことを示すグラフである。群のサイズが小さいので、ｍｉＲＡＲＥがウイルス処置マウスの間で病変のリスクを低下させるか否かは明らかでない。（図４Ｂ～４Ｄ）データは平均±ＳＥＭである。

【図4E】ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥがＫＯマウスの生存を延長することを示す図である。図４Ａは、本開示のＭＥＣＰ２組成物によって処置したマウスの生存のグラフである。菱形は、主として重篤な尾の病変または尾の自己切断のために獣医によって要望された安楽死を示す。食塩水処置およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置されたＫＯマウスのメディアン生存は９．６週および１５．０週である（Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定でｐ＜０．０２）。図９に示す低用量と比較されたい。図４Ｂは、いずれの処置もＫＯ体重に有意に影響しなかったことを示すグラフである。図４Ｂにおける１群あたりのｎは、ＷＴ，０ｖｇ（２０）；ＫＯ，０ｖｇ（１８）；ＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２（１２）；ＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２（１２）；およびＫＯ，１×１０^１２ｖｇ ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ（１２）である。図４Ａおよび図４Ｂは、これらのマウスを並行して処置した際に、同じＷＴ対照データが図３に出現することを示す。図４Ｃは、食塩水、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２、およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したマウスの間で、重篤な歩行（スコア＝２）を達成する頻度が２８％、５０％、３３％、および１７％であったことを示すプロットである。マウスあたり１×１０^１２ｖｇを投与した。黒色のバーは、重篤なクラスピングの発症の平均週齢を示す。各データ点は１匹のマウスを表す。マウスの割合（サブセット対全体群）を、各処置群について列記している。重篤な歩行を発現したＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウス（１２匹中ｎ＝２）は、他の群の４～５週後にそうなった。この遅延は顕著に異なるが、確定的な結論を導くにはデータ点の数が少なすぎる。図３Ｄと図４Ｃは同じ種類のデータを示すが、図４Ｃは異なるフォーマットでプロットしている。一般に、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットは発症週齢のデータを視覚的に伝達するには最も明確な方法である（図３Ｄ参照）が、これらのプロットは、正常な歩行を保持した全てのマウスがＸ軸で特定した全期間、生存するという直感的な仮定に役立つ。この仮定はＷＴマウスについては真である（図３Ｄ）が、ＫＯマウスについてはそうではない（図４Ｃ）。重要なことに、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置ＫＯマウスは、生存が延長したにも関わらず、重篤な歩行が発現したのは僅かであった。図４Ｄは、高用量（１×１０^１２ｖｇ／マウス）のＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥがＫＯマウスで初期運動神経の改善の傾向（食塩水に対して、トライアル１、１日目）を生じることを示すグラフである。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはトライアルにわたって運動学習を改善しなかった。食塩水処置ＷＴ、食塩水処置ＫＯ、およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置ＫＯ群について、ｎ＝３０、２９、および９である。図４Ｅは、処置群にわたって病変が観察されたことを示すグラフである。群のサイズが小さいので、ｍｉＲＡＲＥがウイルス処置マウスの間で病変のリスクを低下させるか否かは明らかでない。（図４Ｂ～４Ｄ）データは平均±ＳＥＭである。

【図5】ランダムに選択した１０個のヒト３’ＵＴＲが僅かのｍｉＲＮＡ標的しか共通に有しないことを示すグラフである。３’ＵＴＲを、ＡＣＴＢ（ベータ－アクチン）、ＡＴＦ１（活性化転写因子１）、ＤＡＤ１（細胞死に対するデフェンダー１）、ＤＡＲＳ（アスパルチル－ｔＲＮＡシンセターゼ）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ＨＳＰＡ４（ヒートショックタンパク質ファミリーＡ（Ｈｓｐ７０）メンバー４）、ＭＲＰＬ９（ミトコンドリアルリボソーマルプロテインＬ９）、ＰＯＬＲＩＣ（ＲＮＡポリメラーゼＩおよびＩＩＩサブユニットＣ）、ＰＲＫＡＧ１（プロテインキナーゼＡＭＰ活性化非触媒性サブユニットガンマ１）、ＲＰＬ５（リボソーマルプロテインＬ５）について検討した。

【図6A】３’ＵＴＲの対の間で共有される標的の数を示す図である。図６Ａおよび図６Ｂは、ランダムに選択したヒト遺伝子（図６Ａ）および精選したヒト遺伝子のリスト（図６Ｂ）について示された、共有された標的の数を示す表である。図６Ａにおいて、３’ＵＴＲアンサンブル転写長さは２２４ｂｐ～２３８２ｂｐの範囲である。図６Ｂにおいて、精選した遺伝子のリストについての３’ＵＴＲは、共通した多くのｍｉＲＮＡ標的を有している。３’ＵＴＲアンサンブル転写長さは１９６０ｂｐ～８７９４ｂｐの範囲である。

【図6B】３’ＵＴＲの対の間で共有される標的の数を示す図である。図６Ａおよび図６Ｂは、ランダムに選択したヒト遺伝子（図６Ａ）および精選したヒト遺伝子のリスト（図６Ｂ）について示された、共有された標的の数を示す表である。図６Ａにおいて、３’ＵＴＲアンサンブル転写長さは２２４ｂｐ～２３８２ｂｐの範囲である。図６Ｂにおいて、精選した遺伝子のリストについての３’ＵＴＲは、共通した多くのｍｉＲＮＡ標的を有している。３’ＵＴＲアンサンブル転写長さは１９６０ｂｐ～８７９４ｂｐの範囲である。

【図7A】共有されたアノテートされた標的が、知的障害を媒介する遺伝子の３’ＵＴＲの間でより密に充填されていることを示す表である。（図６Ａおよび図６Ｂ）共有された標的の数（図６Ａ～図６Ｂを参照）を、カラムのヘッダーに列挙した遺伝子についての３’ＵＴＲアンサンブル転写物の長さで割って１００倍することにより、ＵＴＲ配列の１００ｂｐ長さあたりの共有された標的の数を得た。個別のシードマッチによって多数の特有のｍｉＲＮＡを同様または同一のシード配列に結合することができれば、１００ｂｐの配列の中に２２個までの標的を収容することが可能である。ヒト配列のみを解析した。

【図7B】共有されたアノテートされた標的が、知的障害を媒介する遺伝子の３’ＵＴＲの間でより密に充填されていることを示す表である。（図６Ａおよび図６Ｂ）共有された標的の数（図６Ａ～図６Ｂを参照）を、カラムのヘッダーに列挙した遺伝子についての３’ＵＴＲアンサンブル転写物の長さで割って１００倍することにより、ＵＴＲ配列の１００ｂｐ長さあたりの共有された標的の数を得た。個別のシードマッチによって多数の特有のｍｉＲＮＡを同様または同一のシード配列に結合することができれば、１００ｂｐの配列の中に２２個までの標的を収容することが可能である。ヒト配列のみを解析した。

【図8A】ｍｉＲＡＲＥが処置されたＷＴマウスにおけるミニＭＥＣＰ２介在副反応に対して保護することを示す図である。図８Ａは、１×１０^１１ｖｇ／マウスのＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２が処置されたＷＴマウスにおいて体重減少を惹起することを示すグラフである（^＊ｐ≦０．０５）。対照的に、ＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰおよびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはよく忍容された。図８Ｂは、ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２が処置されたＷＴマウスにおいて重症度スコアを増加させることを示すグラフである（^＊ｐ≦０．０５）。対照的に、ＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰおよびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはよく忍容された。同じ説明が、図８Ａおよび図８Ｂに適用される。４匹のＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２処置マウスおよび３匹のＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウスを、注射後３～４週で免疫蛍光解析のために還流した。図８Ｃは、２３週齢（研究の終了）まで生存したＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰ処置マウスのいずれも、重篤な異常歩行（スコア＝２）を発現しなかったことを示すグラフである。比較のため、ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２処置マウスの７８％およびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウスの３３％が重篤な異常歩行を発現した。図８Ｄは、ＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰ処置マウスのいずれも、研究の終了までに重篤なクラスピング（スコア＝２）を発現しなかったことを示すグラフである。ｍｉＲＡＲＥは、ウイルス処置ＷＴマウスの中で重篤なクラスピングの発症の頻度を低下させ、発症の週齢を遅延させ得る。（図８Ａおよび図８Ｂ）データは平均±ＳＥＭである。同じ説明が図８Ａ～図８Ｄに適用される。しかし、注射後３～４週で還流したマウスは図８Ｃ～図８Ｄから除外した。図８Ｃおよび図８Ｄにおいて、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットについて有意性を評価するために用いることができるＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて、^＊ｐ＜０．０５。

【図8B】ｍｉＲＡＲＥが処置されたＷＴマウスにおけるミニＭＥＣＰ２介在副反応に対して保護することを示す図である。図８Ａは、１×１０^１１ｖｇ／マウスのＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２が処置されたＷＴマウスにおいて体重減少を惹起することを示すグラフである（^＊ｐ≦０．０５）。対照的に、ＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰおよびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはよく忍容された。図８Ｂは、ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２が処置されたＷＴマウスにおいて重症度スコアを増加させることを示すグラフである（^＊ｐ≦０．０５）。対照的に、ＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰおよびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはよく忍容された。同じ説明が、図８Ａおよび図８Ｂに適用される。４匹のＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２処置マウスおよび３匹のＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウスを、注射後３～４週で免疫蛍光解析のために還流した。図８Ｃは、２３週齢（研究の終了）まで生存したＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰ処置マウスのいずれも、重篤な異常歩行（スコア＝２）を発現しなかったことを示すグラフである。比較のため、ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２処置マウスの７８％およびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウスの３３％が重篤な異常歩行を発現した。図８Ｄは、ＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰ処置マウスのいずれも、研究の終了までに重篤なクラスピング（スコア＝２）を発現しなかったことを示すグラフである。ｍｉＲＡＲＥは、ウイルス処置ＷＴマウスの中で重篤なクラスピングの発症の頻度を低下させ、発症の週齢を遅延させ得る。（図８Ａおよび図８Ｂ）データは平均±ＳＥＭである。同じ説明が図８Ａ～図８Ｄに適用される。しかし、注射後３～４週で還流したマウスは図８Ｃ～図８Ｄから除外した。図８Ｃおよび図８Ｄにおいて、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットについて有意性を評価するために用いることができるＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて、^＊ｐ＜０．０５。

【図8C】ｍｉＲＡＲＥが処置されたＷＴマウスにおけるミニＭＥＣＰ２介在副反応に対して保護することを示す図である。図８Ａは、１×１０^１１ｖｇ／マウスのＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２が処置されたＷＴマウスにおいて体重減少を惹起することを示すグラフである（^＊ｐ≦０．０５）。対照的に、ＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰおよびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはよく忍容された。図８Ｂは、ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２が処置されたＷＴマウスにおいて重症度スコアを増加させることを示すグラフである（^＊ｐ≦０．０５）。対照的に、ＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰおよびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはよく忍容された。同じ説明が、図８Ａおよび図８Ｂに適用される。４匹のＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２処置マウスおよび３匹のＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウスを、注射後３～４週で免疫蛍光解析のために還流した。図８Ｃは、２３週齢（研究の終了）まで生存したＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰ処置マウスのいずれも、重篤な異常歩行（スコア＝２）を発現しなかったことを示すグラフである。比較のため、ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２処置マウスの７８％およびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウスの３３％が重篤な異常歩行を発現した。図８Ｄは、ＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰ処置マウスのいずれも、研究の終了までに重篤なクラスピング（スコア＝２）を発現しなかったことを示すグラフである。ｍｉＲＡＲＥは、ウイルス処置ＷＴマウスの中で重篤なクラスピングの発症の頻度を低下させ、発症の週齢を遅延させ得る。（図８Ａおよび図８Ｂ）データは平均±ＳＥＭである。同じ説明が図８Ａ～図８Ｄに適用される。しかし、注射後３～４週で還流したマウスは図８Ｃ～図８Ｄから除外した。図８Ｃおよび図８Ｄにおいて、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットについて有意性を評価するために用いることができるＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて、^＊ｐ＜０．０５。

【図8D】ｍｉＲＡＲＥが処置されたＷＴマウスにおけるミニＭＥＣＰ２介在副反応に対して保護することを示す図である。図８Ａは、１×１０^１１ｖｇ／マウスのＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２が処置されたＷＴマウスにおいて体重減少を惹起することを示すグラフである（^＊ｐ≦０．０５）。対照的に、ＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰおよびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはよく忍容された。図８Ｂは、ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２が処置されたＷＴマウスにおいて重症度スコアを増加させることを示すグラフである（^＊ｐ≦０．０５）。対照的に、ＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰおよびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥはよく忍容された。同じ説明が、図８Ａおよび図８Ｂに適用される。４匹のＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２処置マウスおよび３匹のＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウスを、注射後３～４週で免疫蛍光解析のために還流した。図８Ｃは、２３週齢（研究の終了）まで生存したＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰ処置マウスのいずれも、重篤な異常歩行（スコア＝２）を発現しなかったことを示すグラフである。比較のため、ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２処置マウスの７８％およびＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置マウスの３３％が重篤な異常歩行を発現した。図８Ｄは、ＰＨＰ．Ｂ／ＥＧＦＰ処置マウスのいずれも、研究の終了までに重篤なクラスピング（スコア＝２）を発現しなかったことを示すグラフである。ｍｉＲＡＲＥは、ウイルス処置ＷＴマウスの中で重篤なクラスピングの発症の頻度を低下させ、発症の週齢を遅延させ得る。（図８Ａおよび図８Ｂ）データは平均±ＳＥＭである。同じ説明が図８Ａ～図８Ｄに適用される。しかし、注射後３～４週で還流したマウスは図８Ｃ～図８Ｄから除外した。図８Ｃおよび図８Ｄにおいて、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットについて有意性を評価するために用いることができるＧｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて、^＊ｐ＜０．０５。

【図9】１×１０^１１ｖｇ／マウスでは、髄腔内処置のいずれも、ＫＯの生存の延長において有効でなかったことを示すグラフである。菱形は、獣医の要望による安楽死を示す。同じ食塩水処置対照群は、図３～図４に現れている。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本開示はとりわけ、ＭｅＣＰ２および／またはＭｅＣＰ２由来のポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子を含む単離されたポリヌクレオチド、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、ならびにｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。本開示はまた、これらの単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、およびｒＡＡＶウイルスベクターを製造する方法、ならびにＭＥＣＰ２遺伝子の喪失および／または機能不全に付随する疾患を含む疾患または障害を処置または防止するためにトランスジーンを送達するためのそれらの使用を提供する。

【0023】

ＲＴＴ遺伝子療法およびその他の用量感受性遺伝子療法に関連するトランスジーンの過発現の可能性を最小化するために、高スループットのプロファイリングおよびゲノムマイニングに根ざす、リスクによって推進されるウイルスゲノム設計戦略を用いて、コンパクトな合成ｍｉＲＮＡ標的パネル（ｍｉＲ－応答性自己制御性エレメント、「ｍｉＲＡＲＥ」）を合理的に開発した。ミニＭＥＣＰ２遺伝子発現カセットへのｍｉＲＡＲＥの挿入により、効率を犠牲にすることなく、ミニＭＥＣＰ２遺伝子の導入の安全性が大きく改善される。重要なことに、このビルトイン制御システムは追加の外因性薬物の適用を何ら必要とせず、ｍｉＲＮＡはトランスジーンカセットから発現しない。

【0024】

ＡＡＶ９媒介遺伝子導入の効率を改善する１つの戦略は、ＡＡＶ９カプシドと自己相補性（ｓｃ）ウイルスゲノムとを対にすることである。一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）と比較して、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）はより小さなウイルスゲノムのパッケージ容量（約２．２ｋｂ）を有しているが、宿主細胞中において速度を制限する第２鎖合成をバイパスする能力を有しているので、より効率的な形質導入が可能になる。約１．５ｋｂのＭＥＣＰ２遺伝子がウイルスゲノムカセット中に含まれる５’および３’の制御エレメントの大きさを制限するので、ｓｃＡＡＶのパッケージ容量の低減は、ＭＥＣＰ２ウイルスゲノムの設計を導くために重要である。治療用のミニＭＥＣＰ２遺伝子（約０．５ｋｂ）によって、新規な制御エレメントを挿入してＲＴＴ遺伝子療法の治療インデックスを改善するためのさらなるスペースがｓｃウイルスゲノムの中に解放される。

【0025】

ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびミニＭＥＣＰ２遺伝子療法は、ＫＯマウスの生存を延長することが示されている。新生児期に投与されたＫＯマウスでは、顕著な副反応は少なく、生存および行動における恩恵が実現されている。しかし、ヒトへの変換のためにより関連性が高い４～５週齢でマウスを処置した場合には、生存の恩恵には顕著な副反応（死亡を含む）および明確な行動の救済の欠如が伴っていた。さらに、この明確な行動の救済の欠如（ＡＡＶ９媒介遺伝子導入に関連する）は、若年期に処置されたＫＯマウスとＴ１５８Ｍ ＭｅＣＰ２発現ＲＴＴマウスの両方にわたって観察された。ＡＡＶ９／ＥＧＦＰ（ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２ではなく）の高いＣＳＦ内の用量はＷＴマウスでよく忍容されるので、これらの用量依存性副反応はＭｅＣＰ２の過発現に直接よっていることが最も考えられる。数年間の候補ＭＥＣＰ２ベクターの反復された完全な要因評価の後で、この分野は今でも、１６年前に遡るＭｅＣＰ２の過発現の研究から予測される同じジレンマと闘っている。ＭｅＣＰ２をコードする高用量のベクターは有害である可能性があり、低用量では効果がない可能性がある。明らかに、この持続するジレンマは、安全性を犠牲にすることなく効率を可能にする革新的なウイルスゲノム設計戦略を正当化する。

【0026】

本明細書では、ウイルスゲノムの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）にｍｉＲＮＡ標的を挿入することによって、遺伝子の過発現に関連する毒性を防止するための組成物および方法が提供される。内因性ｍｉＲＮＡはウイルスゲノムにコードされたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）中の標的と塩基対を形成し、究極的にはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってタンパク質の発現レベルを低下させることができる。ＣＮＳ等の系の中でＭＥＣＰ２等の外因性遺伝子を条件付きで制御するｍｉＲＮＡ標的パネルが提供される。これらの標的パネルは、遺伝子およびミニＭＥＣＰ２等の発現カセットの有害な過発現を和らげる一方、十分なトランスジーン発現を可能にして、ＭＥＣＰ２またはミニＭＥＣＰ２対照ベクター等の対照ベクターの治療効果と同様またはこれより大きい治療効果を発揮させることができる。遺伝子および発現カセットの発現（たとえばミニＭｅＣＰ２の発現）を制御するために、高スループットのプロファイリングおよびゲノムマイニングに根ざす、リスクによって推進されるウイルスゲノム設計戦略を用いて、新規なｍｉＲＮＡ標的パネル（ｍｉＲ－応答性自己制御エレメント、または「ｍｉＲＡＲＥ」と命名）を開発した。遺伝子の過発現（たとえばＭｅＣＰ２の過発現）に関与する負のトランスジーン制御のフィードバック機構。本明細書に記載したデータは、ｍｉＲＡＲＥが若年マウスの脳脊髄液内（ＣＳＦ内）注射の後の効率を犠牲にすることなく、ｓｃＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２遺伝子療法の安全性を改善することを示している。

【0027】

本明細書で使用される用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、この名称に付随し、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのデペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属に属するウイルスのクラスのメンバーを指す。アデノ随伴ウイルスは、細胞中で増殖する一本鎖ＤＮＡウイルスであり、その中である種の機能が共感染するヘルパーウイルスによって提供される。ＡＡＶに関する一般的な情報および総説は、たとえばＣａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，１巻，１６９～２２８頁およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７４３～１７６４頁，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出すことができる。種々の血清型が、遺伝子レベルであっても、構造的および機能的両方に極めて密接に関連していることがよく知られているので、これらの総説に記載された同じ原理が総説の発行日以後に特徴解析されたさらなるＡＡＶの血清型に適用可能であることが、完全に期待される（たとえばＢｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ編，１６５～１７４頁、およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１～６１頁（１９７４）を参照）。たとえば、全てのＡＡＶ血清型は同種ｒｅｐ遺伝子によって媒介される極めて類似した複製特性を明らかに呈し、全てが、ＡＡＶ２で発現されるもののような３つの関連するカプシドタンパク質を有している。ゲノムの長さに沿った血清型の間の広範な交叉ハイブリダイゼーションおよび「逆転ターミナルリピート配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニール性セグメントの存在を明らかにするヘテロデュプレックス解析によって、関連性の程度がさらに示唆されている。類似した感染性パターンも、各血清型における複製機能が同様の規制制御の下にあることを示唆している。このウイルスの多数の血清型が遺伝子送達に適していることが知られており、全ての既知の血清型が種々の組織型の細胞に感染することができる。連続的に番号付けされた少なくとも１１個のＡＡＶ血清型が当技術で知られている。本明細書で開示した方法において有用な非限定的な例示的血清型には、１１個の血清型、たとえばＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはバリアント血清型、たとえばＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂのいずれかが含まれる。ＡＡＶ粒子は、３つの主要なウイルスタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。一部の態様では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、またはＡＡＶｒｈ．１０を指す。

【0028】

例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスには、それだけに限らないが、全ての血清型（たとえばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、およびＡＡＶｒｈ．１０）が含まれる。例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスには、それだけに限らないが、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）および１つの血清型のゲノムと別の血清型のカプシドとを含むＡＡＶハイブリッド（たとえばＡＡＶ２／５、ＡＡＶ－ＤＪ、およびＡＡＶ－ＤＪ８）が含まれる。例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスには、それだけに限らないが、ｒＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＫＰ－１（Ｋｅｒｕｎら．ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ，２０１９；４（２２）：ｅ１３１６１０に詳細に記載）およびＡＡＶ－ＮＰ５９（Ｐａｕｌｋら．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１８；２６（１）：２８９～３０３頁に詳細に記載）が含まれる。

【0029】

ＡＡＶの構造および機能
ＡＡＶは複製欠損性のパルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは約４．７ｋｂの長さで、２つの１４５ヌクレオチド逆転ターミナルリピート（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには多数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。たとえば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５～５６４頁（１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿ｌ８２９で提供され、ＡＡＶ－４の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ－６の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２で提供され、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部はそれぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９で提供され、ＡＡＶ－９のゲノムはＧａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１～６３８８頁（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０のゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７～７６頁（２００６）で提供され、ＡＡＶ－１１のゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５～３８３頁（２００４）で提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は米国特許第９，４３４，９２８号で提供されている。米国特許第９，４３４，９２８号は、カプシドタンパク質および自己相補性ゲノムの配列も提供している。一態様では、ＡＡＶゲノムは自己相補性ゲノムである。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド封入／パッケージング、および宿主細胞染色体の一体化を指示するシス作用性配列は、ＡＡＶ ＩＴＲの中に含まれている。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ位置によってｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）差別的スプライシングと一体になった２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、究極的にはウイルスゲノムの複製に関与する多種の酵素特性を有している。

【0030】

ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的なスプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位が、この３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与している。より具体的には、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質のそれぞれがそれから翻訳される単一のｍＲＮＡが転写された後で、このｍＲＮＡは２つの異なる様式でスプライシングされ得る。長いイントロンまたは短いイントロンが切除され、ｍＲＮＡの２つのプール、即ち２．３ｋｂと２．６ｋｂの長さのｍＲＮＡプールの形成がもたらされる。長いイントロンが好ましいことが多く、したがって２．３ｋｂの長さのｍＲＮＡは主要なスプライスバリアントと称され得る。この形態はＶＰ１タンパク質の合成がそれから始まる第１のＡＵＧコドンを欠き、ＶＰ１タンパク質合成の全体のレベルの低下をもたらす。主要なスプライスバリアントに残る第１のＡＵＧコドンは、ＶＰ３タンパク質の開始コドンである。しかし、同じオープンリーディングフレーム中のそのコドンの上流には、最適のＫｏｚａｋ（翻訳開始）コンテクストによって囲まれたＡＣＧ配列（スレオニンをコードする）が存在する。これはＶＰ２タンパク質の合成の低いレベルに寄与する。ＶＰ２タンパク質は実際上、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるＢｅｃｅｒｒａ ＳＰら，（１９８５年１２月）．“Ｄｉｒｅｃｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂ ａｎｄ Ｃ： ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ＡＣＧ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．８２（２３）：７９１９～２３頁；Ｃａｓｓｉｎｏｔｔｉ Ｐら，（１９８８年１１月）．“Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｃａｐｓｉｄ ｇｅｎｅ： ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｉｎｏｒ ｓｐｌｉｃｅｄ ｍＲＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １”．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１６７（１）：１７６～８４頁；Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒ Ｓら，（１９９４年１月）．“Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６８（１）：１７０～６頁；およびＴｒｅｍｐｅ ＪＰ，Ｃａｒｔｅｒ ＢＪ（１９８８年９月）．“Ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ＶＰ１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６２（９）：３３５６～６３頁に記載されているように、ＶＰ１と同じく、ＶＰ３タンパク質にＮ末端残基が付加されたものである。単一のコンセンサスポリＡ部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置している。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝的特徴は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７～１２９頁（１９９２）に概説されている。

【0031】

それぞれのＶＰ１タンパク質は、ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、およびＶＰ３部分を含む。ＶＰ１部分は、ＶＰ１タンパク質に特有のＶＰ１タンパク質のＮ末端部分である。ＶＰ２部分は、ＶＰ２タンパク質のＮ末端部分にも見出される、ＶＰ１タンパク質の中に存在するアミノ酸配列である。ＶＰ３部分とＶＰ３タンパク質は同じ配列を有する。ＶＰ３部分は、ＶＰ１タンパク質とＶＰ２タンパク質に共有されるＶＰ１タンパク質のＣ末端部分である。

【0032】

ＶＰ３タンパク質は、不連続の可変表面領域Ｉ～ＩＸ（ＶＲ－Ｉ～ＩＸ）にさらに分割することができる。可変表面領域（ＶＲ）のそれぞれは、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＤｉＭａｔｔａら，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｕｎｉｑｕｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．８６（１２）：６９４７～６９５８頁，２０１２年６月に記載されているように、単独でまたは他のＶＲのそれぞれの特定のアミノ酸配列との組合せで、特有の感染表現型（たとえば低下した抗原性、改善された形質導入および／または他のＡＡＶ血清型と比較した組織特異的向性）を特定の血清型に付与することができる特定のアミノ酸配列を含み得る。

【0033】

ＡＡＶは、たとえば遺伝子療法において外来のＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてこれを魅力的なものにする固有の特徴を有している。培養における細胞のＡＡＶ感染は細胞変性を起こさず、ヒトおよびその他の動物の天然の感染は症状がなく無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染してｉｎ ｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的とすることを可能にする。さらに、ＡＡＶは分裂している細胞および分裂していない細胞にゆっくりと形質導入し、実質的にこれらの細胞の生涯にわたって転写活性の核エピソーム（染色体外エレメント）として持続することができる。ＡＡＶのプロウイルスゲノムはクローン化されたＤＮＡとしてプラスミド中に挿入され、それにより組み換えゲノムの構築が実行可能になる。さらに、ＡＡＶの複製とゲノムのカプシド封入を指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲの中に含まれているので、ゲノムの内部の約４．３ｋｂの一部または全部（複製および構造のカプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）を外来のＤＮＡで置き換えて、ＡＡＶベクターを生成することができる。ｒｅｐおよびｃａｐのタンパク質はトランスで提供され得る。ＡＡＶの別の顕著な特徴は、これが極めて安定で元気なウイルスであることである。これはアデノウイルスを不活化するために用いられる条件（５６～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の問題を重要でなくしている。ＡＡＶは凍結乾燥することさえできる。最後に、ＡＡＶに感染した細胞は重複感染に抵抗しない。

【0034】

多くの研究が筋肉における長期（１．５年超）の組み換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実証している。Ｃｌａｒｋら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９～６６９頁（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ． Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２～１４０８７頁（１９９６）；およびＸｉａｏら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８～８１０８頁（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９～６２３頁（２０００）およびＣｈａｏら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７～２２２頁（２００１）も参照されたい。さらに、筋肉は高度に血管新生しているので、Ｈｅｒｚｏｇら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４～５８０９頁（１９９７）およびＭｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１～１３９２６頁（１９９７）に記載されているように、組み換えＡＡＶ形質導入によって、筋肉内注射の後の全身循環におけるトランスジーン産生物の出現がもたらされた。さらに、Ｌｅｗｉｓら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９～８７７５頁（２００２）は、骨格筋筋線維が抗体の正しいグリコシル化、フォールディング、および分泌のために必要な細胞性因子を有していることを実証し、筋肉が分泌されたタンパク質治療剤を安定的に発現することができることを示した。本発明の組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、治療用タンパク質をコードする核酸分子（たとえばＧＡＴ１）および核酸分子の側にある１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれからなる。偽型ｒＡＡＶの産生は、たとえばＷＯ２００１０８３６９２に開示されている。その他の型のｒＡＡＶバリアント、たとえばカプシド変異を有するｒＡＡＶも意図されている。たとえばＭａｒｓｉｃら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００～１９０９頁（２０１４）を参照されたい。種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術で既知である。

【0035】

トランスジーン配列を含む単離されたポリヌクレオチド
本開示は、少なくとも１つのトランスジーン核酸分子を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0036】

一部の態様では、トランスジーン核酸分子は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／もしくはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列またはその少なくとも１つの断片を含み得る。一部の態様では、トランスジーン核酸分子は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドの生物学的等価物をコードする核酸配列を含み得る。ＭｅＣＰ２由来ポリペプチドは、機能に絶対的に必須のドメインのみを含むように、野生型ＭｅＣＰ２ポリペプチドに基づいて具体的に設計されたポリペプチドであってよい。このように、ＭｅＣＰ２由来ポリペプチドは内因性の野生型ＭｅＣＰ２ポリペプチドより小さなものにすることができ、とりわけ、ｉｎ ｖｉｖｏでの発現および固有の大きさの拘束のあるベクター（それだけに限らないがＡＡＶベクター等）に効率的にパッケージされる能力の増大がもたらされる。

【0037】

一部の態様では、ＭｅＣＰ２由来ポリペプチドは、これ以降「ミニＭｅＣＰ２」ポリペプチドと称するヒトＭｅＣＰ２アイソフォーム由来ミニＭｅＣＰ２ポリペプチドであってよい。

【0038】

一部の態様では、ミニＭｅＣＰ２ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列またはその断片を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。一部の態様では、ミニＭｅＣＰ２ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の少なくとも一部と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列またはその断片を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。

【0039】

一部の態様では、ミニＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３、配列番号４、または配列番号２８で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。一部の態様では、ミニＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。一部の態様では、ミニＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２８で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。

【0040】

一部の態様では、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列であってよい。ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（またはその間の任意のパーセンテージ）を超えず同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。本明細書で使用する場合、「ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列」は、ヒトゲノムにおけるＭＥＣＰ２ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。

【0041】

一部の態様では、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、ドナースプライス部位を含まなくてよい。一部の態様では、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、約１個、または約２個、または約３個、または約４個、または約５個、または約６個、または約７個、または約８個、または約９個、または約１０個を超えないドナースプライス部位を含んでよい。一部の態様では、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列と比較して、少なくとも１個、または少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個少ないドナースプライス部位を含む。理論に縛られることは望まないが、曖昧なスプライシングが防止されるので、コドン最適化された核酸配列におけるドナースプライス部位の除去によって、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドの発現を予想外かつ予測外に増加させることができる。さらに、曖昧なスプライシングは様々な対象の間で変動することがあり、ドナースプライス部位を含むＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドの発現レベルは様々な対象の間で予測外に変動することがあることを意味している。

【0042】

一部の態様では、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列のＧＣ含量と異なるＧＣ含量を有し得る。一部の態様では、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列のＧＣ含量は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列と比較して、核酸配列全体にわたってより均一に分布している。理論に縛られることは望まないが、核酸配列全体にわたってＧＣ含量をより均一に分布させることによって、コドン最適化された核酸配列は転写物の長さにわたってより均一な融解温度（「Ｔｍ」）を呈する。核酸配列の転写および／または翻訳はポリメラーゼおよび／またはリボソームの停滞をあまり伴わずに起こるので、融解温度の均一性は、予期しないことに、ヒト対象におけるコドン最適化された核酸の発現の増大をもたらす。

【0043】

一部の態様では、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードする野生型またはコドン最適化されていない核酸配列に対して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増大したヒト対象における発現を呈する。

【0044】

一部の態様では、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドは、タンパク質タグをさらに含み得る。理論に縛られることは望まないが、タンパク質タグを含ませることによって、外因性ＭｅＣＰ２ポリペプチドの検出および／または可視化が可能になる。当業者には認識されるように、タンパク質タグの非限定的な例には、Ｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ＳＢＰタグ、または当技術で既知の任意の他のタグが含まれる。非限定的な例では、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドは、Ｍｙｃタグをさらに含み得る。一部の態様では、Ｍｙｃタグは、配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。

【0045】

したがって、一部の態様では、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列は、ｍｙｃタグをコードする核酸配列をさらに含み得る。一部の態様では、ｍｙｃタグをコードする核酸配列は、配列番号６で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。

【0046】

制御配列をコードする単離されたポリヌクレオチド
本開示は、少なくとも１つの制御配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0047】

一部の態様では、制御配列は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。「ｍｉＲＮＡ結合部位」は、目的のｍｉＲＮＡのポリヌクレオチドへのアニーリングおよび引き続くトランスジーンの下方制御を確実にするために十分なｍｉＲＮＡの配列への相補性を有するポリヌクレオチド配列である。

【0048】

一部の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、表１に示す配列番号７、８、９、１０、１１、および１２のいずれか１つで表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。

【0049】

【表1】

【0050】

一部の態様では、制御配列は、少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個のｍｉＲＮＡ結合部位を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。一部の態様では、制御配列は、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表されるｍｉＲＮＡ結合部位のそれぞれを含むか、それらからなるか、または実質的にそれらからなり得る。したがって、一部の態様では、制御配列は、配列番号７、配列番号８，配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２のうち１つもしくは複数、またはそれらの任意の組合せを含み得る。一部の態様では、制御配列は、配列番号７、配列番号８，配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２のそれぞれを含み得る。

【0051】

一部の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、フランキング配列に隣接して位置してよい。フランキング配列は、ｍｉＲＮＡ結合部位の前（５’）、ｍｉＲＮＡ結合部位の後（３’）、またはｍｉＲＮＡ結合部位の前および後の両方で生じ得る。フランキング配列は約５～約３５ヌクレオチドまたは約９～約２９ヌクレオチドを含み得る。

【0052】

本明細書では、「Ｒｅｇ２配列」または「Ｒｅｇ２パネル」と称する制御配列が提供される。一部の態様では、Ｒｅｇ２配列は、ｌｅｔ－７－５ｐ ｍｉＲＮＡ（またはｍｉＲ－９８－５ｐ）、ｍｉＲ－２１８－５ｐ、ｍｉＲ－９－５ｐ、ｍｉＲ－２６－５ｐ、ｍｉＲ－２３－３ｐ、ｍｉＲ－２７－３ｐ、または本明細書に記載したｍｉＲＮＡと類似のシード配列を有するその他のｍｉＲＮＡに結合することが予測される６個の結合部位を含み得る。

【0053】

一部の態様では、Ｒｅｇ２配列は、配列番号１３で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。配列番号１３を以下に示し、配列番号７～１２のｍｉＲＮＡ結合部位に下線を付している。下線を付していない配列番号１３の部分はフランキング配列である。
CTGTTCTAGCCCCCAAAGAGTTTTCTGTGCTTGCTTTTGAAACTTGAAGTCTTGAAAACCAAAGACATAGATGTGAAAATTTTAGGCAGTGTAAGCTGATAGCACAAGTTCTGGCGACTCACAATTATGCTGTGAATTTTACAAAAAGAAGCAGTAATCTACCTCAGCCGATAAC（配列番号１３）

【0054】

一部の態様では、Ｒｅｇ２配列は、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２のうち１つもしくは複数またはそれらの任意の組合せを含む核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。一部の態様では、フランキング配列は配列番号８に示す配列に限定されず大きく変動してよく、特に制限されない。したがって、一実施形態では、Ｒｅｇ２配列は、その配列が特に限定されない約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、またはそれ以上の側面ヌクレオチドによって分離された（即ちそれぞれの結合部位の前（５’）および後（３’）で生じる）配列番号７～１２のうち１つまたは複数を有するポリペプチドを含む。一部の態様では、Ｒｅｇ２配列は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、および２０のうちいずれか１つで表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。一実施形態では、Ｒｅｇ２配列は、配列番号８で示されるフランキング配列（即ち、上に示す下線を付していないポリヌクレオチド）と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。

【0055】

一部の態様では、制御配列はＲＤＨ１ｐＡエレメントを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＲＤＨ１ｐＡエレメントは、高度に保存されたＭＥＣＰ２末梢ポリアデニル化シグナルの１１０ｂｐならびにＭＥＣＰ２の３’ＵＴＲに内因性であることが予測されまたは示された３つの追加的なｍｉＲＮＡ標的、即ちｍｉＲ－１９、ｍｉＲ－２２、およびｍｉＲ－１３２のための部位を含む上流のｍｉＲＮＡ結合パネルを含む合成の３’ＵＴＲである。一部の態様では、ＲＤＨ１ｐＡエレメント配列は、配列番号１４で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。

【0056】

一部の態様では、配列番号１４のＲＤＨ１ｐＡエレメントは、２つの構成成分、即ち以下「ＲＤＨ１ｐＡ ｍｉＲＮＡ結合部位配列」と称する第１の成分、および本明細書で「ＭＥＣＰ２下流ポリＡ（ｐＡ）配列」と称する第２の成分に分離することができる。

【0057】

一部の態様では、ＲＤＨ１ｐＡ ｍｉＲＮＡ結合部位配列は、配列番号１５で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。

【0058】

一部の態様では、ＭＥＣＰ２下流ポリＡ（ｐＡ）配列は、配列番号１６で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。

【0059】

一部の態様では、制御配列はＲｅｇ２配列とＲＤＨ１ｐＡエレメントの両方を含み得る。一部の態様では、Ｒｅｇ２配列は、ＲＤＨ１ｐＡエレメントの第１の成分（ＲＤＨ１ｐＡ ｍｉＲＮＡ結合部位配列）とＲＤＨ１ｐＡの第２の成分（ＭＥＣＰ２下流ポリＡ（ｐＡ）配列）との間に位置し得る。Ｒｅｇ２配列は、ＲＤＨ１ｐＡエレメントの成分の一方または両方に直接隣接してよく、またはＲＤＨ１ｐＡエレメントの成分の一方または両方から約２～１０ヌクレオチドだけ離れていてもよい。

【0060】

したがって、制御配列は、５’から３’の方向に、配列番号１５、続いて配列番号１３、続いて配列番号１６を含み得る。そのような制御配列は、配列番号１７で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0061】

ＡＡＶベクター
一部の態様では、本明細書に記載した少なくとも１つのトランスジーン核酸分子を含む単離されたポリヌクレオチドは、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであり得る。

【0062】

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、元のままのレプリコンを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる核酸であって、それによりベクターが、細胞内に入れられた場合に、たとえばトランスフェクション、感染、または形質転換のプロセスによって複製される、核酸を指す。いったん細胞内に入れば、ベクターは染色体外（エピソーマル）エレメントとして複製され、または宿主細胞の染色体内に統合され得ることが当技術で理解されている。ベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、改変されたバキュロウイルス、パポバウイルス、またはその他に改変された天然産生のウイルスから誘導される核酸が含まれ得る。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターには、裸のＤＮＡ、単独もしくはカチオン性ポリマーと組み合わせたカチオン性脂質とのＤＮＡの複合体、アニオン性およびカチオン性のリポソーム、ＤＮＡ－タンパク質複合体、ならびに不均一なポリリジン、定義された長さのオリゴペプチド、およびポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーと縮合し、ある場合にはリポソームに含まれるＤＮＡを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる粒子、ならびにウイルスおよびポリリジン－ＤＮＡを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる三元複合体の使用が含まれる。

【0063】

一般的な組み換え手法に関しては、プロモーターとその中にポリヌクレオチドを作動可能に連結することができるクローニング部位との両方を含むベクターは、当技術で周知である。そのようなベクターはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することができ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）等の供給元から市販されている。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を最適化するため、クローニングされたトランスジーンの５’および／または３’の翻訳されない部分を除去、付加、または変化させて、余分で潜在的で不適切な代替の翻訳開始コドンまたは転写もしくは翻訳のレベルにおいて発現に干渉しまたはこれを低減させ得る他の配列を排除することが必要であろう。あるいは、発現を増強するために、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンの５’のすぐ傍に挿入することができる。

【0064】

本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」は、１つまたは複数のトランスジーン核酸分子および１つまたは複数のＡＡＶ逆転ターミナルリピート配列（ＩＴＲ）を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなるベクターを指す。そのようなＡＡＶベクターは、宿主細胞中に存在する場合に、たとえば宿主細胞のトランスフェクションによってｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子産物の機能を提供する感染性ウイルス粒子の中に、複製しパッケージすることができる。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、プロモーター、少なくとも１つのタンパク質もしくはＲＮＡをコードし得る少なくとも１つの核酸、および／または感染性ＡＡＶ粒子の中にパッケージされた側面ＩＴＲの中のエンハンサーおよび／またはターミネーターを含む。カプシド封入された核酸部分は、ＡＡＶベクターゲノムと称し得る。ｒＡＡＶベクターを含むプラスミドは、製造目的のためのエレメント、たとえば抗生剤耐性遺伝子、複製起点の配列、その他を含んでもよいが、これらはカプシド封入されず、したがってＡＡＶ粒子の一部を形成しない。

【0065】

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのトランスジーン核酸分子を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つの制御配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ逆転ターミナル（ＩＴＲ）配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのプロモーター配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのエンハンサー配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのポリＡ配列を含み得る。

【0066】

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、制御配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、制御配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。

【0067】

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、２つ以上のトランスジーン核酸分子を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも２つのトランスジーン核酸分子を含み得て、それによりｒＡＡＶベクターは第１のトランスジーン核酸分子および少なくとも第２のトランスジーン核酸分子を含む。一部の態様では、第１および少なくとも第２のトランスジーン核酸分子は、同じ核酸配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のトランスジーン核酸分子は、異なる核酸配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のトランスジーン核酸配列は、互いに隣接し得る。

【0068】

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、２つ以上のプロモーター配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも２つのプロモーター配列を含み得て、それによりｒＡＡＶベクターは第１のプロモーター配列および少なくとも第２のプロモーター配列を含む。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、同じ配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、異なる配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、互いに隣接し得る。ｒＡＡＶベクターが第１のトランスジーン核酸分子および少なくとも第２のトランスジーン核酸分子も含む一部の態様では、第１のプロモーターは第１のトランスジーン核酸分子の上流（５’）に位置してよく、少なくとも第２のプロモーターは第１のトランスジーン核酸分子と少なくとも第２のトランスジーン核酸分子との間に位置してよく、それにより少なくとも第２のプロモーターは第１のトランスジーン核酸分子の下流（３’）かつ少なくとも第２のトランスジーン核酸分子の上流（５’）に位置する。

【0069】

先行するｒＡＡＶベクターのいずれも、少なくとも１つのエンハンサーをさらに含み得る。少なくとも１つのエンハンサーは、ｒＡＡＶベクターのいずれの場所に位置してもよい。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、プロモーターのすぐ上流（５’）に位置し得る。即ち、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、エンハンサー、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、制御配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、プロモーターのすぐ下流（３’）に位置し得る。即ち、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、エンハンサー、トランスジーン核酸分子、制御配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、トランスジーン核酸分子のすぐ下流に位置し得る。即ち、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、エンハンサー、制御配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。

【0070】

ＡＡＶ ＩＴＲ配列
一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、当技術で既知の任意のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、またはＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列であってよい。

【0071】

即ち、一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、またはＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0072】

一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号１８、１９、または３０で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0073】

一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲは、配列番号２０または２１で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0074】

一部の態様では、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号１８と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよく、第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２０と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0075】

一部の態様では、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号１９と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよく、第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0076】

一部の態様では、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号１８と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよく、第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0077】

一部の態様では、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号１９と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよく、第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２０と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0078】

一部の態様では、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号３０と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよく、第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２０と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0079】

一部の態様では、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号３０と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよく、第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0080】

プロモーター配列およびエンハンサー
本明細書で使用される用語「プロモーター」および「プロモーター配列」は、遺伝子またはトランスジーン等のコーディング配列の転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である調節配列を意味する。プロモーターは、たとえば構造的、誘起的、抑制的、または組織特異的であってよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子等の制御性のタンパク質および分子が結合し得る遺伝要素を含み得る。非限定的な例示的プロモーターには、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーととともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロフォレートリダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、遍在性ニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、小核ＲＮＡ（Ｕ１ａまたはＵ１ｂ）プロモーター、ＭＥＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーターのヒトバリアント、ミニマルＭＥＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、またはＥＦ１プロモーターが含まれる。

【0081】

本明細書で提供されるさらなる非限定的な例示的プロモーターには、それだけに限らないが、ＥＦｌａ、Ｕｂｃ、ヒトβ－アクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、Ａｃ５、ポリヘドリン、ＣａＭＫＩＩａ、Ｇａｌ１、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、Ｕｂｉ、およびα－１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）が含まれる。ｍＲＮＡ転写の効率を増大または低減させるために、そのようなプロモーターのヌクレオチド配列を改変し得ることは、当技術で既知である。たとえばＧａｏら．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １２：１３５～１４５頁を参照されたい（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写を無効にし、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ｍＲＮＡ転写を刺激するために、７ＳＫ、Ｕ６、およびＨ１プロモーターのＴＡＴＡボックスを改変する）。遍在性または組織特異的な発現のために、合成由来のプロモーターを用いてもよい。さらに、そのいくつかを上で言及したウイルス由来プロモーター、たとえばＣＭＶ、ＨＩＶ、アデノウイルス、およびＡＡＶのプロモーターは、本明細書に記載した方法において有用であり得る。一部の態様では、転写効率を増大させるために、プロモーターは少なくとも１つのエンハンサーとともに用いられる。エンハンサーの非限定的な例には、間質性レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）エンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサーが含まれる。

【0082】

一部の態様では、プロモーター配列は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター配列（任意選択でＲＳＶエンハンサーとともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ジヒドロフォレートリダクターゼプロモーター配列、β－アクチンプロモーター配列、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター配列、Ｕ６プロモーター配列、Ｈ１プロモーター配列、遍在性ニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター配列、小核ＲＮＡ（Ｕ１ａまたはＵ１ｂ）プロモーター配列、ＭＥＣＰ２プロモーター配列、ＭｅＰ４２６プロモーター配列、ミニマルＭＥＣＰ２プロモーター配列、ＶＭＤ２プロモーター配列、ｍＲｈｏプロモーター配列、ＥＦ１プロモーター配列、ＥＦ１ａプロモーター配列、Ｕｂｃプロモーター配列、ヒトβ－アクチンプロモーター配列、ＣＡＧプロモーター配列、ＴＲＥプロモーター配列、Ａｃ５プロモーター配列、ポリヘドリンプロモーター配列、ＣａＭＫＩＩａプロモーター配列、Ｇａｌ１プロモーター配列、ＴＥＦ１プロモーター配列、ＧＤＳプロモーター配列、ＡＤＨ１プロモーター配列、Ｕｂｉプロモーター配列、ＭｅＰ４２６プロモーター、またはα－１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。

【0083】

エンハンサーは、標的配列の発現を増大させる制御エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を提供することができる配列を含むポリヌクレオチドである。たとえば、レトロウイルスの長いターミナルリピートは、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を含んでいる。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種」であり得る。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム内の所与の遺伝子に天然に連結されたエンハンサー／プロモーターである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子操作（即ち分子生物学的手法）または合成手法の手段によって遺伝子に並置され、それによりその遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指示される、エンハンサー／プロモーターである。本明細書で提供される方法、組成物、および構築物における使用のための連結されたエンハンサー／プロモーターの非限定的な例には、ＰＤＥプロモータープラスＩＲＢＰエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサープラスＵ１ａプロモーターが含まれる。エンハンサーは遠方から、また内因性または異種のプロモーターの位置に対するそれらの配向とは関係なく、作動し得ることが当技術で理解されている。即ち、プロモーターから離れて作動するエンハンサーは、したがってベクター中のその位置またはプロモーターの位置に対するその配向とは関係なく、そのプロモーターに「作動可能に連結」されていることがさらに理解される。

【0084】

本開示を通して使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、遺伝子が空間的に連結されたプロモーターの制御下にある遺伝子（即ちトランスジーン）の発現を指す。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターとそのプロモーターがそれから誘導された遺伝子内でプロモーターが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであってよい。プロモーターと遺伝子との間の距離の変動は、プロモーター機能の損失なしに適応させることができる。

【0085】

一部の態様では、プロモーター配列は、ＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。ＭｅＰ４２６プロモーター配列は、配列番号２２と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0086】

一部の態様では、プロモーター配列は、ＪｅＴプロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。Ｊｅｔプロモーター配列は、配列番号２３と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0087】

一部の態様では、プロモーター配列は、ＭｅＰ２２９プロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。ＭｅＰ２２９プロモーター配列は、配列番号２４と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0088】

一部の態様では、プロモーター配列は、ＣＢｈプロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。ＣＢｈプロモーター配列は、配列番号２５と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0089】

トランスジーン核酸分子
トランスジーン核酸分子は、上の見出し「トランスジーン配列を含む単離されたポリヌクレオチド」の下に記載したトランスジーン核酸分子のいずれかを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。

【0090】

一部の態様では、ｒＡＡＶベクター中に存在するトランスジーン核酸分子は、同じｒＡＡＶベクター中にも存在するプロモーター配列の転写制御の下にあり得る。

【0091】

制御配列
制御は、上の見出し「制御配列をコードする単離されたポリヌクレオチド」の下に記載した配列のいずれかを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。

【0092】

ポリＡ配列
一部の態様では、ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、当技術で既知の任意のポリＡ配列を含み得る。ポリＡ配列の非限定的な例には、それだけに限らないが、ＭＥＣＰ２ポリＡ配列、レチノールデヒドロゲナーゼ１（ＲＤＨ１）ポリＡ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＳＰＡ４９ポリＡ配列、ｓＮＲＰ－ＴＫ６５ポリＡ配列、ｓＮＲＰポリＡ配列、またはＴＫ６５ポリＡ配列が含まれる。

【0093】

即ち、ポリＡ配列は、ＭｅＣＰ２ポリＡ配列、レチノールデヒドロゲナーゼ１（ＲＤＨ１）ポリＡ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＳＰＡ４９ポリＡ配列、ｓＮＲＰ－ＴＫ６５ポリＡ配列、ｓＮＲＰポリＡ配列、またはＴＫ６５ポリＡ配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0094】

一部の態様では、ＭＥＣＰ２ポリＡ配列は、配列番号１６で表される配列のいずれかと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0095】

一部の態様では、ポリＡ配列は、ＳＶ４０ｐＡ配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。一部の態様では、ＳＶ４０ｐＡ配列は、配列番号２６で表される配列のいずれかと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0096】

一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクターは、配列番号２７または配列番号２９で表される配列のいずれかと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0097】

細菌プラスミド
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｒＡＡＶベクターの増殖を可能にするために細菌プラスミドの中に含ませてよい。即ち、本開示は、本明細書に記載したｒＡＡＶベクターのいずれかを含む細菌プラスミドを提供する。細菌プラスミドはさらに、複製の起点の配列を含み得る。細菌プラスミドはさらに、抗生剤耐性遺伝子を含み得る。細菌プラスミドはさらに、原核生物プロモーターを含み得る。

【0098】

複製の起点の配列
一部の態様では、複製の起点の配列は、当技術で既知の任意の複製の起点の配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。複製の起点の配列は、細菌の複製の起点の配列であってよく、それにより前記細菌の複製の起点の配列を含むｒＡＡＶベクターが当技術で標準的な方法を用いることによって細菌内で産生され、増殖し、維持されることが可能になる。

【0099】

抗生剤耐性遺伝子
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターは、抗生剤耐性遺伝子を含み得る。

【0100】

一部の態様では、抗生剤耐性遺伝子は、当技術で既知の任意の抗生剤耐性遺伝子を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。当技術で既知の抗生剤耐性遺伝子の例には、それだけに限らないが、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ポリミキシンＢ耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれる。

【0101】

ＡＡＶウイルスベクター
「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞中に送達されるポリヌクレオチドを含む、組み換えで産生されたウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が含まれる。アルファウイルスベクター、たとえばＳｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス系ベクターおよびＳｉｎｄｂｉｓウイルス系ベクターも、遺伝子療法および免疫療法における使用のために開発されている。たとえばＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４～４３９頁およびＹｉｎｇら，（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３～８２７頁を参照されたい。

【0102】

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶウイルスベクター」または「ｒＡＡＶウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド封入されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。即ち、ｒＡＡＶウイルスベクターの産生には必然的にｒＡＡＶベクターの産生が含まれ、したがってベクターはｒＡＡＶベクターの中に含まれる。

【0103】

本明細書で使用される場合、用語「ウイルスカプシド」または「カプシド」は、ウイルス粒子のタンパク質性シェルまたはコートを指す。カプシドは、ウイルスゲノムをカプシド封入し、保護し、輸送し、また宿主細胞中に放出するように機能する。カプシドは一般に、タンパク質（「カプシドタンパク質」）のオリゴマー性構造サブユニットからなっている。本明細書で使用される場合、用語「カプシド封入」は、ウイルスカプシド中に封入されることを意味する。ＡＡＶのウイルスカプシドは３つのウイルスカプシドタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の混合物からなっている。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の混合物は、そのそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれるＳｏｎｎｔａｇ Ｆら，（２０１０年６月）“Ａ ｖｉｒａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＡＡＶ２ ｃａｐｓｉｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．１０７（２２）：１０２２０～５頁、およびＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ（２０００年１２月）．“Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒ： ｔｈｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｖｉｒｉｏｎｓ”．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２７８（２）：３０１～８頁に記載されているように、１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）または１：１：２０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比でＴ＝１の２０面体対称に配置された６０個のモノマーを含む。

【0104】

本開示は、ａ）本明細書に記載したｒＡＡＶベクターのいずれか、およびｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。

【0105】

ＡＡＶカプシドタンパク質は、当技術で既知の任意のＡＡＶカプシドタンパク質であってよい。ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質であってよい。

【0106】

代替のｒＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶウイルスベクターの実施形態
１．５’から３’の方向に、
ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）プロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子、
ｄ）制御配列、および
ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含むｒＡＡＶベクター。
２．トランスジーン核酸分子が、ＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、実施形態１に記載のｒＡＡＶベクター。
３．ＭｅＣＰ２由来ポリペプチドがミニＭＥＣＰ２ポリペプチドである、実施形態２に記載のベクター。
４．ミニＭｅＣＰ２ポリペプチドが、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載のベクター。
５．ミニＭｅＣＰ２ポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載のベクター。
６．ミニＭｅＣＰ２ポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載のベクター。
７．ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号３、配列番号４、または配列番号２８で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
８．ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号３で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
９．ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号４で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１０．ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号２８で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１１．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号１８で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１２．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号１９で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１３．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号３０で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１４．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号２０で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１５．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号２１で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１６．プロモーター配列がＭｅＰ４２６プロモーター配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１７．ＭｅＰ４２６プロモーター配列が、配列番号２２で表される核酸配列を含む、実施形態１５に記載のｒＡＡＶベクター。
１８．制御配列が１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１９．１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－９－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２１８－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－９８－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２１８－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１７に記載のｒＡＡＶベクター。
２０．制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のうち１つまたは複数を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２１．制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のうち２つ以上を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２２．制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のうち３つ以上を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２３．制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のうち４つ以上を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２４．制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のうち５つ以上を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２５．制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のそれぞれを含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２６．制御配列が、配列番号１３で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２７．制御配列が、配列番号１４で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２８．制御配列が、配列番号１５で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２９．制御配列が、配列番号１６で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３０．制御配列が、５’から３’の方向に、
ｉ）配列番号１５で表される核酸配列、
ｉｉ）配列番号１３で表される核酸配列、および
ｉｉｉ）配列番号１６で表される核酸配列
を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３１．制御配列が、配列番号１７で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３２．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８、配列番号１９、または配列番号３０で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０または配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
３３．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
３４．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
３５．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１９で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
３６．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１９で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
３７．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号３０で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
３８．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号３０で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
３９．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８、配列番号１９、または配列番号３０で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０または配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
４０．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
４１．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
４２．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１９で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
４３．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１９で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
４４．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号３０で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
４５．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号３０で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
４６．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８、配列番号１９、または配列番号３０で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３、配列番号４、または配列番号２８で表される核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０または配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
４７．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
４８．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
４９．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１９で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
５０．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１９で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
５１．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号３０で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
５２．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号３０で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
５３．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８、配列番号１９、または配列番号３０で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３、配列番号４、または配列番号２８で表される核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０または配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
５４．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
５５．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１８で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
５６．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１９で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
５７．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号１９で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
５８．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号３０で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２０で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
５９．５’から３’の方向に、
ａ）配列番号３０で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号２２で表される核酸配列を含むＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＭｅＣＰ２ポリペプチドおよび／またはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３の核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子、
ｄ）配列番号１３で表される核酸配列を含む制御配列、および
ｅ）配列番号２１で表される核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、ｒＡＡＶベクター。
６０．配列番号２７の核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
６１．配列番号２９の核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
６２．ａ）先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、および
ｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質
を含む、ｒＡＡＶウイルスベクター。
６３．ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６４．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６５．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ２カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６６．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ３カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６７．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ４カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６８．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ５カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６９．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ６カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７０．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ７カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７１．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ８カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７２．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ９カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７３．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１０カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７４．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１１カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７５．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１２カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７６．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１３カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７７．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７８．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７９．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、実施形態６２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
８０．１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含む制御配列を含む、ｒＡＡＶベクター。
８１．１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－９－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２１８－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－９８－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲ－２１８－５ｐ ｍｉＲＮＡ結合部位、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態７０に記載のｒＡＡＶベクター。
８２．制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のうち１つまたは複数を含む、実施形態８０または８１に記載のｒＡＡＶベクター。
８３．制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のうち２つ以上を含む、実施形態８０から８２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
８４．制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のうち３つ以上を含む、実施形態８０から８３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
８５．制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のうち４つ以上を含む、実施形態８０から８４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
８６．制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のうち５つ以上を含む、実施形態８０から８５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
８７．制御配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２で表される核酸配列のそれぞれを含む、実施形態８０から８６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
８８．制御配列が、配列番号１３で表される核酸配列を含む、実施形態８０から８７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
８９．制御配列が、配列番号１４で表される核酸配列を含む、実施形態８０から８８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
９０．制御配列が、配列番号１５で表される核酸配列を含む、実施形態８０から８９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
９１．制御配列が、配列番号１６で表される核酸配列を含む、実施形態８０から９０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
９２．制御配列が、５’から３’の方向に、
ｉ）配列番号１５で表される核酸配列、
ｉｉ）配列番号１３で表される核酸配列、および
ｉｉｉ）配列番号１６で表される核酸配列
を含む、実施形態８０から９１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
９３．制御配列が、配列番号１７で表される核酸配列を含む、実施形態８０から９２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
９４．ａ）実施形態８０から９３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、および
ｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質
を含む、ｒＡＡＶウイルスベクター。

【0107】

組成物および医薬組成物
本開示は、本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれかを含む組成物を提供する。一部の態様では、組成物は医薬組成物であってよい。したがって、本開示は、本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれかを含む医薬組成物を提供する。

【0108】

医薬組成物は、本明細書に記載したように、薬理学の技術において既知のまたは開発された任意の方法によって製剤化することができ、その方法には、それだけに限らないが、活性成分（たとえばウイルス粒子または組み換えベクター）を賦形剤および／または添加物および／またはその他の補助的成分と接触させ、産生物を用量単位に分割または包装することが含まれる。本開示のウイルス粒子は、望ましい特徴、たとえば増大した安定性、増大した細胞トランスフェクション、持続したまたは遅延した放出、生体分布もしくは向性、コードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの調節されたまたは増進された翻訳、およびコードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの放出プロファイルを有して製剤化され得る。

【0109】

したがって、医薬組成物は、食塩水、脂質類、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞（たとえば対象への移植のための）、ナノ粒子模倣体、またはそれらの組合せをさらに含んでよい。一部の態様では、医薬組成物はナノ粒子として製剤化される。一部の態様では、ナノ粒子は自己アセンブルした核酸ナノ粒子である。

【0110】

本開示による医薬組成物は、単一の単位用量として、および／または複数の単一単位用量として、バルクで調製され、包装され、および／または販売され得る。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投薬量に等しくおよび／またはそのような投薬量の都合の良い割合、たとえばそのような投薬量の半分または３分の１等である。本発明の製剤は、１つまたは複数の賦形剤および／または添加物を、それぞれともにウイルスベクターの安定性を増大し、ウイルスベクターによる細胞のトランスフェクションまたは形質導入を増大し、ウイルスベクターによってコードされたタンパク質の発現を増大し、および／またはウイルスベクターによってコードされたタンパク質の放出プロファイルを変更させる量で含み得る。一部の態様では、医薬組成物は、賦形剤および／または添加物を含む。賦形剤および／または添加物の非限定的な例には、溶媒、分散媒、希釈剤、またはその他の液体ビヒクル、分散または懸濁の助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、またはそれらの組合せが含まれる。

【0111】

一部の態様では、医薬組成物は凍結保護剤を含む。用語「凍結保護剤」は、凍結中の物質に対する損傷を低減または排除することができる薬剤を指す。凍結保護剤の非限定的な例には、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース、ラフィノース、および／またはマンニトールが含まれる。

【0112】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な薬学的担体のいずれか、たとえばリン酸塩緩衝食塩溶液、水、およびエマルジョン、たとえば水中油もしくは油中水エマルジョン、ならびに種々の種類の湿潤剤を包含する。組成物は安定剤および保存剤を含んでもよい。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ（１９７５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ）を参照されたい。

【0113】

一部の態様では、本開示の医薬組成物は、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｄ－ソルビトール、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。

【0114】

一部の態様では、医薬組成物はＰＢＳを含んでよく、ＰＢＳは約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、または約２００ｍＭ～約４００ｍＭ、または約３００ｍＭ～約４００ｍＭの濃度で存在する。一部の態様では、塩化ナトリウムが約３５０ｍＭの濃度で存在してよい。

【0115】

一部の態様では、医薬組成物はＤ－ソルビトールを含んでよく、Ｄ－ソルビトールは約１％～約１０％、または約２．５％～約７．５％の濃度で存在する。一部の態様では、Ｄ－ソルビトールは約５％の濃度で存在してよい。

【0116】

即ち、本開示は、５％の濃度でＤ－ソルビトールを含む３５０ｍＭのリン酸塩緩衝食塩溶液中に本開示のｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。

【0117】

本開示の組成物を使用する方法
本開示は、開示した組成物または医薬組成物を用いる、たとえば細胞、組織、器官、動物、または対象に治療有効量の組成物または医薬組成物を投与する、または接触させる、当技術で既知のまたは本明細書に記載した細胞、組織、器官、動物、または対象における疾患または障害の処置のための開示した組成物または医薬組成物の使用を提供する。一実施形態では、対象は哺乳動物である。好ましくは、対象はヒトである。用語「対象」および「患者」は、本明細書では相互交換可能に用いられる。

【0118】

本開示は、治療有効量の本明細書で開示したｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、および／または医薬組成物のいずれか１つを対象に投与することを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる、障害を防止または処置する方法を提供する。

【0119】

一部の態様では、疾患はＭＥＣＰ２遺伝子が関与する遺伝障害であり得る。ＭＥＣＰ２遺伝子が関与する遺伝障害は、ＭＥＣＰ２欠損症であり得る。

【0120】

ＭＥＣＰ２遺伝子が関与する遺伝障害は、レット症候群であり得る。

【0121】

一部の態様では、疾患は対象のゲノムにおけるＭＥＣＰ２遺伝子の少なくとも１つのコピーの機能喪失によって特徴付けられる疾患であり得る。一部の態様では、疾患は対象のゲノムにおけるＭＥＣＰ２遺伝子の少なくとも１つのコピーの機能の低下によって特徴付けられる疾患であり得る。一部の態様では、疾患は対象のゲノムにおけるＭＥＣＰ２遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける少なくとも１つの変異における少なくとも１つの変異によって特徴付けられる疾患であり得る。

【0122】

ＭＥＣＰ２遺伝子における変異は、当技術で既知の任意の型の変異であってよい。変異の非限定的な例には、体細胞変異、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）、ナンセンス変異、挿入、欠失、重複、フレームシフト変異、反復拡張、短い挿入および欠失（ＩＮＤＥＬ）、長いＩＮＤＥＬ、選択的スプライシング、選択的スプライシングの産物、改変された翻訳の開始、改変された翻訳の開始の産物、プロテオーム切断、プロテオーム切断の産物が含まれる。

【0123】

一部の態様では、疾患は、疾患を有しない対照の対象と比較した、対象におけるＭＥＣＰ２遺伝子の発現の低下によって特徴付けられる疾患であり得る。一部の態様では、発現の低下は、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％であってよい。

【0124】

一部の態様では、疾患は、疾患を有しない対照の対象と比較した、対象におけるＭｅＣＰ２の量の減少によって特徴付けられる疾患であり得る。一部の態様では、ＭｅＣＰ２の量の減少は、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％であってよい。

【0125】

一部の態様では、疾患は、疾患を有しない対照の対象と比較した、対象におけるＭｅＣＰ２の活性の低下によって特徴付けられる疾患であり得る。一部の態様では、ＭｅＣＰ２の活性の低下は、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％であってよい。

【0126】

処置の方法は、レット症候群の１つまたは複数の症状を緩和することができる。一実施形態では、本明細書に記載した組成物の送達によって、症状が検出可能になる前にＭＥＣＰ２遺伝子の変異を有している対象に投与されれば、検出可能な症状の進行を防止しまたは遅延させることができる。したがって、処置は治療的または予防的であり得る。治療は、確立した症状または表現型の阻害または逆転を指す。治療は、症状または表現型の発症の遅延も意味し得る。予防は、既に明白な症状を呈していない対象における症状の進行を阻止または防止することを意味する。明白な症状を呈していない対象は、月齢１８か月、１２か月、または６か月以前に実施される適切な遺伝子検査によって、ＭＥＣＰ２遺伝子の機能喪失変異を有すると若年期に特定することができる。

【0127】

レット症候群の症状には、たとえば脳の成長の遅延（小頭症）および身体の他の部分の成長の遅延、正常な動作および協調の喪失、コミュニケーション能力の喪失、異常な手の動作、通常でない眼の動き、呼吸困難（たとえば呼吸停止、異常に速い呼吸（過換気）、空気または唾液の強引な排出、および空気の飲み込み）、興奮性および号泣、認知障害、発作、脊柱側弯、不規則な拍動、睡眠障害、やせ、骨折しやすい脆い骨、通常冷たい小さな手足、咀嚼および嚥下の障害、腸機能の障害、ならびに歯ぎしりが含まれる。

【0128】

レット症候群のステージには、たとえば以下が含まれる。ステージＩは初期の発症である（通常、月齢６～１８か月で始まり、数か月または１年続くことがある）。ステージＩＩは急速な悪化である（年齢約１～４歳で始まる）。ステージＩＩＩはプラトーである（通常、年齢２～１０歳で始まり、何年も続くことがある）。ステージＩＶは後期の運動の悪化である（通常、１０歳以後に始まり、数年または数十年続くことがある）。小児の頭または身体の他の部分の成長の遅延。本明細書に記載した組成物および方法は、レット症候群のいかなるステージでも患者を処置するために用いることができる。

【0129】

本開示の方法、組成物、医薬組成物、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶウイルスベクターを用いて処置すべき対象は、本明細書に記載した疾患および／または症状のいずれをも有し得る。

【0130】

一部の態様では、対象は年齢０．５歳未満、または年齢１歳未満、または年齢１．５歳未満、または年齢２歳未満、または年齢２．５歳未満、または年齢３歳未満、または年齢３．５歳未満、または年齢３．５歳未満、または年齢４歳未満、または年齢４．５歳未満、または年齢５歳未満、または年齢５．５歳未満、または年齢６歳未満、または年齢６．５歳未満、または年齢７歳未満、または年齢７．５歳未満、または年齢８歳未満、または年齢８．５歳未満、または年齢９歳未満、または年齢９．５歳未満、または年齢１０歳未満であってよい。一部の態様では、対象は年齢１１歳未満、年齢１２歳未満、年齢１３歳未満、年齢１４歳未満、年齢１５歳未満、年齢２０歳未満、年齢３０歳未満、年齢４０歳未満、年齢５０歳未満、年齢６０歳未満、年齢７０歳未満、年齢８０歳未満、年齢９０歳未満、年齢１００歳未満、年齢１１０歳未満、または年齢１２０歳未満であってよい。一部の態様では、対象は年齢０．５歳未満であってよい。一部の態様では、対象は年齢４歳未満であってよい。一部の態様では、対象は年齢１０歳未満であってよい。

【0131】

本明細書で開示した処置および防止の方法は、治療または防止のための患者を特定および選択するために適切な診断手法と組み合わせてよい。

【0132】

本開示は、宿主細胞を本明細書で開示したｒＡＡＶウイルスベクターのいずれか１つと接触させることを含む、宿主細胞中のタンパク質のレベルを増加させる方法を提供し、ｒＡＡＶウイルスベクターは、タンパク質をコードするトランスジーン核酸分子を含む本明細書で開示したｒＡＡＶベクターのいずれか１つを含む。一部の態様では、タンパク質は治療用タンパク質である。一部の態様では、宿主細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏである。一部の態様では、宿主細胞は対象由来である。一部の態様では、対象は正常な対象におけるタンパク質のレベルおよび／または機能と比較して低下したタンパク質のレベルおよび／または機能をもたらす障害に罹患している。

【0133】

一部の態様では、タンパク質のレベルは、宿主細胞中で約１×１０^－７ｎｇ、約３×１０^－７ｎｇ、約５×１０^－７ｎｇ、約７×１０^－７ｎｇ、約９×１０^－７ｎｇ、約１×１０^－６ｎｇ、約２×１０^－６ｎｇ、約３×１０^－６ｎｇ、約４×１０^－６ｎｇ、約６×１０^－６ｎｇ、約７×１０^－６ｎｇ、約８×１０^－６ｎｇ、約９×１０^－６ｎｇ、約１０×１０^－６ｎｇ、約１２×１０^－６ｎｇ、約１４×１０^－６ｎｇ、約１６×１０^－６ｎｇ、約１８×１０^－６ｎｇ、約２０×１０^－６ｎｇ、約２５×１０^－６ｎｇ、約３０×１０^－６ｎｇ、約３５×１０^－６ｎｇ、約４０×１０^－６ｎｇ、約４５×１０^－６ｎｇ、約５０×１０^－６ｎｇ、約５５×１０^－６ｎｇ、約６０×１０^－６ｎｇ、約６５×１０^－６ｎｇ、約７０×１０^－６ｎｇ、約７５×１０^－６ｎｇ、約８０×１０^－６ｎｇ、約８５×１０^－６ｎｇ、約９０×１０^－６ｎｇ、約９５×１０^－６ｎｇ、約１０×１０^－５ｎｇ、約２０×１０^－５ｎｇ、約３０×１０^－５ｎｇ、約４０×１０^－５ｎｇ、約５０×１０^－５ｎｇ、約６０×１０^－５ｎｇ、約７０×１０^－５ｎｇ、約８０×１０^－５ｎｇ、または約９０×１０^－５ｎｇのレベルに増加している。

【0134】

本開示は、細胞を有効量の本明細書で開示したｒＡＡＶウイルスベクターのうちいずれか１つと接触させることを含む、対象における細胞に目的の遺伝子を導入する方法を提供し、ｒＡＡＶウイルスベクターは目的の遺伝子を含む本明細書で開示したｒＡＡＶベクターのうちいずれか１つを含む。

【0135】

本開示の方法の一部の態様では、対象には、本開示のｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶウイルスベクターを投与することに加えて、予防的免疫抑制処置レジメンを施行することもできる。一部の態様では、免疫抑制処置レジメンには、少なくとも１つの免疫抑制治療剤を投与することが含まれる。免疫抑制治療剤の非限定的な例には、それだけに限らないが、シロリムス（ラパマイシン）、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、ＩＶメチルプレドニソロン、プレドニソン、またはそれらの任意の組合せが含まれる。免疫抑制治療剤は、ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはｒＡＡＶウイルスベクターの投与の日に先立って、ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはｒＡＡＶウイルスベクターの投与と同じ日に、またはｒＡＡＶベクターおよび／もしくはｒＡＡＶウイルスベクターの投与の後の任意の日に、投与してよい。

【0136】

診断または処置の「対象」は、細胞または哺乳動物等の動物、またはヒトである。対象は特定の種に限定されず、限定なしに類人猿、ネズミ、ラット、イヌ、またはウサギ種を含む、診断または処置の対象となる非ヒト動物、および感染または動物のモデルの対象となるもの、ならびにその他の家畜、スポーツ動物、またはペットを含む。一部の態様では、対象はヒトである。

【0137】

本明細書で使用される場合、対象における疾患の「処置すること」または「処置」は、（１）疾患を阻止しまたはその進行を阻むこと、または（２）疾患もしくは疾患の症状を改善しまたはその退行を惹起することを指す。当技術で理解されているように、「処置」は、臨床的結果を含む有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチである。本技術の目的のため、有益なまたは望ましい結果には、検出可能であってもなくても、１つまたは複数の、それだけに限らないが、１つまたは複数の症状の緩和または改善、状態（疾患を含む）の程度の逓減、状態（疾患を含む）の状況の安定化（即ち、悪化しないこと）、状態（疾患を含む）の遅延または遅らせること、状態（疾患を含む）の進行、改善、または軽減、状況および寛解（部分的であっても全面的であっても）が含まれ得る。

【0138】

本明細書で使用される場合、「防止すること」または疾患の「防止」は、疾患に罹患しやすい、または疾患の症状がまだ表れていない対象における発生から症状または疾患を防止することを指す。

【0139】

本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、所望の効果を達成するために十分な量を意味することを意図している。治療または予防の用途に関しては、有効量は、問題の状態の種類および重症度、ならびに個別の対象の特徴、たとえば一般的健康状態、年齢、性別、体重、および医薬組成物に対する忍容性に依存することになる。遺伝子治療に関しては、有効量は、対象において欠如している遺伝子の部分的または完全な機能の回復をもたらすために十分な量であってよい。一部の態様では、ｒＡＡＶウイルスベクターの有効量は、ＭｅＣＰ２ポリペプチドまたはＭｅＣＰ２由来ポリペプチドが産生されるような対象における遺伝子の発現をもたらすために十分な量である。一部の態様では、有効量は、それを必要とする対象におけるガラクトースの代謝を増大させるために必要な量である。当業者であれば、これらのおよびその他の因子に応じて適切な量を決定することができよう。

【0140】

一部の態様では、有効量は、問題の用途の大きさおよび性質に依存することになる。これは標的の対象および使用する方法の性質および感受性に依存することにもなる。当業者であれば、これらのおよびその他の考慮に基づいて有効量を決定することができよう。有効量は、実施形態に応じた組成物の１つまたは複数の投与を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。

【0141】

本明細書で使用される場合、用語「投与する」または「投与」は、ヒトまたは動物等の対象への物質の送達を意味することを意図している。投与は、処置の経過を通して１つの用量で、連続的に、または間欠的に、達成することができる。最も有効な投与の手段および投薬量を決定する方法は当業者には既知であり、治療に用いる組成物、治療の目的、ならびに処置される対象の年齢、健康状態、または性別によって変動することになる。単一または多回の投与は、処置する臨床医またはペットおよびその他の動物の場合には処置する獣医によって選択される用量レベルおよびパターンで行なってよい。

【0142】

最も有効な投与の手段および投薬量を決定する方法は当業者には既知であり、治療に用いる組成物、治療の目的、ならびに処置される対象によって変動することになる。単一または多回の投与は、処置する臨床医によって選択される用量レベルおよびパターンで行なってよい。投薬量は投与の経路に影響され得ることが注意される。好適な投薬処方および薬剤を投与する方法は当技術で既知である。そのような好適な投薬量の非限定的な例は、投与あたり１０^９ベクターゲノムの低い量から１０^１７ベクターゲノムの高い量までであってよい。

【0143】

本明細書に記載した方法の一部の態様では、対象に投与されるウイルス粒子（たとえばｒＡＡＶウイルスベクター）の数は、約１０^９～約１０^１７の範囲である。一部の態様では、約１０^１０～約１０^１２、約１０^１１～約１０^１３、約１０^１１～約１０^１２、約１０^１１～約１０^１４、約１０^１２～約１０^１６、約１０^１３～約１０^１６、約１０^１４～約１０^１５、約５×１０^１１～約５×１０^１２、または約１０^１２～約１０^１３個のウイルス粒子が対象に投与される。

【0144】

本明細書に記載した方法の一部の態様では、対象に投与されるウイルス粒子（たとえばｒＡＡＶウイルスベクター）の数は、少なくとも約１０^１０、または少なくとも約１０^１１、または少なくとも約１０^１２、または少なくとも約１０^１３、または少なくとも約１０^１４、または少なくとも約１０^１５、または少なくとも約１０^１６、または少なくとも約１０^１７個のウイルス粒子である。

【0145】

本明細書に記載した方法の一部の態様では、対象に投与されるウイルス粒子（たとえばｒＡＡＶウイルスベクター）の数は対象の年齢に依存し得る。非限定的な例では、７歳またはそれ以上の年齢の対象には約１０×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよく、約４歳～約７歳の年齢の対象には約１０×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよく、約３歳～約４歳の年齢の対象には約９×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよく、約２歳～約３歳の年齢の対象には約８．２×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよく、約１歳～約２歳の年齢の対象には約７．３×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよく、約０．５歳～約１歳の年齢の対象には約４×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよく、約０．５歳未満の年齢の対象には３×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよい。

【0146】

一部の態様では、組成物、医薬組成物中のウイルス粒子の量、または患者に投与されるウイルス粒子の量は、ウイルスゲノムを含むと予測されるウイルス粒子のパーセンテージに基づいて計算することができる。

【0147】

一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、静脈内、髄腔内、脳内、心室内、鼻内、気管内、耳内、眼内または眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内、胸膜内、局所、リンパ内、脳槽内で対象に導入してよい。そのような導入は、動脈内、心臓内、脳室下、硬膜外、大脳内、脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、腹腔内、子宮内、神経内、またはそれらの任意の組合せであってもよい。一部の態様では、ウイルス粒子は所望の標的組織に、たとえば非限定的な例として、肺、眼、またはＣＮＳに送達される。一部の態様では、ウイルス粒子の送達は全身的である。脳槽内の投与経路には、脳室の脳脊髄液への薬物の直接投与が含まれる。これは、大槽への直接注射または永久的に位置したチューブによって実施し得る。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは髄腔内に投与される。

【0148】

一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象における遺伝子欠損を修復する。一部の態様では、成功裡に処理された細胞、組織、器官、または対象における修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの修復されていない標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの比は、少なくとも約１．５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１０００：１、約１０，０００：１、約１００，０００：１、または約１，０００，０００：１である。修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量または比は、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＰＣＲ、シーケンシング、マススペクトル、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、次世代シーケンシング、イムノブロット、およびＥＬＩＳＡを含むがそれらに限らない当技術で既知の任意の方法によって決定することができる。

【0149】

本開示のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、または医薬組成物の投与は、処置の経過を通して１つの用量で、連続的に、または間欠的に、達成することができる。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、または医薬組成物は、注射、注入、または移植によって非経口的に投与される。

【0150】

一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、脳および頸椎に増進された向性を示す。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。

【0151】

製造方法
本開示のｒＡＡＶウイルスベクターを産生するために種々のアプローチを用い得る。一部の態様では、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドおよび細胞株を用いることによって、パッケージングが達成される。ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドは、ウイルスベクターの産生を容易にするエレメントおよび配列を含んでいる。別の態様では、ヘルパープラスミドはパッケージング細胞株のゲノムの中に安定に組み込まれ、それによりパッケージング細胞株はヘルパープラスミドによるさらなるトランスフェクションを必要としない。

【0152】

一部の態様では、細胞はパッケージング細胞株またはヘルパー細胞株である。一部の態様では、ヘルパー細胞株は真核細胞、たとえばＨＥＫ２９３細胞または２９３Ｔ細胞である。一部の態様では、ヘルパー細胞は酵母細胞または昆虫細胞である。

【0153】

一部の態様では、細胞はテトラサイクリンアクチベータータンパク質をコードする核酸、およびテトラサイクリンアクチベータータンパク質の発現を制御するプロモーターを含む。一部の態様では、テトラサイクリンアクチベータータンパク質の発現を制御するプロモーターは、構成的プロモーターである。一部の態様では、プロモーターはホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）またはＣＭＶプロモーターである。

【0154】

ヘルパープラスミドはたとえば、複製能のあるＡＡＶを産生せず、複製能のないＡＡＶをパッケージングするためおよび複製能のないＡＡＶをパッケージングすることができるビリオンタンパク質を高いタイターで産生するために必要なトランスオールビリオンタンパク質をコードする複製能のないウイルスゲノムから誘導された少なくとも１つのウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含み得る。

【0155】

ＡＡＶをパッケージングするためのヘルパープラスミドは当技術で既知であり、たとえば参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４／０２３５１７４Ａ１号を参照されたい。そこで述べられているように、ＡＡＶヘルパープラスミドはヘルパーウイルスとしてＤＮＡ配列、非限定的な例としてそれぞれの元のプロモーターまたは異種プロモーターによって制御されるＡｄ５遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡを含み得る。ＡＡＶヘルパープラスミドは、所望の標的細胞のトランスフェクションの単純な検出を可能にするために、蛍光タンパク質等のマーカータンパク質の発現のための発現カセットをさらに含んでよい。

【0156】

本開示は、パッケージング細胞株を本明細書で開示したＡＡＶヘルパープラスミドのいずれか１つおよび本明細書で開示したｒＡＡＶベクターのいずれか１つでトランスフェクトすることを含む、ｒＡＡＶウイルスベクターを産生する方法を提供する。一部の態様では、ＡＡＶヘルパープラスミドとｒＡＡＶベクターはパッケージング細胞株に共トランスフェクトされる。一部の態様では、細胞株は哺乳動物細胞株、たとえばヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞株である。本開示は、本明細書で開示したｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれか１つを含む細胞を提供する。

【0157】

本明細書で使用される場合、ウイルスまたはプラスミドに関連する用語「ヘルパー」は、本明細書に記載したｒＡＡＶベクターのいずれか１つの複製およびパッケージングのために必要なさらなる成分を提供するために用いられるウイルスまたはプラスミドを指す。ヘルパーウイルスによってコードされる成分は、ビリオンのアセンブリー、カプシド封入、ゲノムの複製、および／またはパッケージングのために必要な任意の遺伝子を含み得る。たとえば、ヘルパーウイルスまたはプラスミドは、ウイルスゲノムの複製のための必要な酵素をコードし得る。ＡＡＶ構築物とともに用いるために好適なヘルパーウイルスおよびプラスミドの非限定的な例には、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）、またはヘルペスウイルス（ウイルス）が含まれる。一部の態様では、ｐＨＥＬＰプラスミドはｐＨＥＬＰＫプラスミドであってよく、この場合はアンピシリン発現カセットがカナマイシン発現カセットに交換される。

【0158】

本明細書で使用される場合、パッケージング細胞（またはヘルパー細胞）は、ウイルスベクターを産生するために用いられる細胞である。組み換えＡＡＶウイルスベクターの産生には、トランスで提供されるＲｅｐおよびＣａｐタンパク質、ならびにＡＡＶの複製を助けるアデノウイルス由来の遺伝子配列が必要である。一部の態様では、パッケージング／ヘルパー細胞が、細胞のゲノムの中に安定に組み込まれるプラスミドを含む。他の態様では、パッケージング細胞は一過的にトランスフェクトされ得る。典型的には、パッケージング細胞は真核細胞、たとえば哺乳動物細胞または昆虫細胞である。

【0159】

キット
本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、および／または医薬組成物は、治療、診断、または研究の用途におけるその使用を容易にするために、医薬用または診断用または研究用のキットにアセンブルしてよい。一部の態様では、本開示のキットは、本明細書に記載したように、単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、医薬組成物、宿主細胞、単離された組織のいずれか１つを含む。

【0160】

一部の態様では、キットは使用説明書をさらに含む。具体的には、そのようなキットは、本明細書に記載した１つまたは複数の薬剤を、これらの薬剤の意図された用途および正しい使用を記載した説明書とともに含んでよい。一部の態様では、キットは、キットの１つもしくは複数の成分を混合し、および／または試料を単離し混合して対象に適用するための説明書を含んでよい。一部の態様では、キット中の薬剤は医薬製剤中にあり、特定の用途および薬剤の投与の方法に適した投薬量である。研究目的用のキットは、種々の実験を行なうために適切な濃度または量で成分を含み得る。

【0161】

キットは、本明細書に記載した方法の使用を容易にするように設計され、多くの形態を取ることができる。キットの成分のそれぞれは、適用できる場合には、液体形態（たとえば溶液中）または固体形態（たとえば乾燥粉末）で提供され得る。ある特定の例では、組成物のいくつかは、たとえば、キットとともに提供されてもよく提供されなくてもよい好適な溶媒または他の種（たとえば、水または細胞培養培地）によって再構成または他の方法で処理（たとえば活性形に）することができる。一部の態様では、組成物は保存溶液（たとえば凍結保存溶液）中で提供され得る。保存溶液の非限定的な例には、ＤＭＳＯ、パラホルムアルデヒド、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）が含まれる。一部の態様では、保存溶液はある量のメタロプロテアーゼ阻害剤を含む。

【0162】

一部の態様では、キットは、本明細書に記載した成分のいずれか１つまたは複数を、１つまたは複数の容器中に含む。即ち、一部の態様では、キットは、本明細書に記載した薬剤を収容する容器を含み得る。薬剤は液体、ゲル、または固体（粉末）の形態であってもよい。薬剤は無菌的に調製され、シリンジに包装され、冷蔵で出荷され得る。あるいは、保存のために薬剤をバイアルまたはその他の容器中に収容してもよい。第２の容器が無菌的に調製された他の薬剤を有してもよい。あるいは、キットは、事前に混合され、シリンジ、バイアル、チューブ、またはその他の容器中で出荷された活性薬剤を含んでよい。キットは、対象に薬剤を投与するために必要な部品、たとえばシリンジ、局所適用デバイス、またはＩＶニードルチューブおよびバッグの１つもしくは複数または全てを有してよい。

【0163】

さらなる定義
文脈によって他が指示されない限り、本明細書に記載した本発明の種々の特徴は任意の組合せで用いることができることが特に意図されている。さらに、本開示は、一部の態様で、本明細書で説明した任意の特徴または特徴の組合せを除外または削除してよいことも意図している。説明のため、複合体が成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むと明細書で述べている場合には、Ａ、Ｂ、もしくはＣのいずれか、またはそれらの組合せを、単独でまたは任意の組合せで削除または放棄してよいことが特に意図されている。

【0164】

他に明示的に示さない限り、全ての特定した態様、実施形態、特徴、および用語は、引用した態様、実施形態、特徴、または用語と、その生物学的等価物の両方を含むことが意図されている。

【0165】

本技術の実施には、他に指示がない限り、当技術の技能の範囲内にある有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組み換えＤＮＡの従来の手法が採用されることになる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５）），ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，およびＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＲＩ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，（１９８７））を参照されたい。

【0166】

本明細書で使用される場合、用語「含む」は、組成物および方法が引用した要素を含むが、他を排除しないことを意味することを意図している。本明細書で使用される場合、移行句「実質的に～からなる」（および文法的変形）は、引用した材料またはステップ、および引用した実施形態の基礎的かつ新規な特徴に実質的に影響しない材料またはステップを包含すると解釈すべきである。即ち、本明細書で使用される用語「実質的に～からなる」は、「含む」と等価であると解釈するべきではない。「からなる」は、他の成分および本明細書で開示した組成物を投与するための実質的な方法ステップの微量を超える要素を排除することを意味する。これらの移行句のそれぞれによって定義される態様は、本開示の範囲内である。本明細書におけるそれぞれの例において、用語「含む」、「実質的に～からなる」、および「からなる」のいずれも、それらの元の意味を保持したままで他の２つの句によって置き換えることができる。本明細書に記載したいずれの単一の用語、単一の要素、単一の句、用語の群、または要素の群は、特許請求の範囲からそれぞれ具体的に除外され得る。

【0167】

全ての数値指定、たとえば範囲を含むｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、必要に応じて１．０または０．１の増分で、あるいは±１５％、１０％、５％、２％の変動で、（＋）または（－）に変動する近似である。常に明示的に述べてはいないが、全ての数値指定には、用語「約」が先行していることを理解されたい。常に明示的に述べてはいないが、本明細書に記載した試薬は単に例示的なものであり、その等価物が当技術で既知であることも理解されたい。量または濃度その他の測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される用語「約」は、特定した量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、または０．１％でさえもの変動を包含することを意味している。

【0168】

用語「許容される」、「有効な」、または「十分な」は、本明細書で開示した任意の成分、範囲、用量形態、その他の選択を記載するために使用される場合には、前記の成分、範囲、用量形態、その他が開示した目的に適していることを意図している。

【0169】

また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙した項目の１つまたは複数のあらゆる可能な組合せ、ならびに選択肢（「または」）で説明される場合には組合せの欠如を指し、包含する。

【0170】

具体的に引用しない限り、用語「宿主細胞」は、たとえば真菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主細胞を含む。真核生物宿主細胞の非限定的な例には、類人猿、ウシ、ブタ、ネズミ、ラット、鳥類、爬虫類、およびヒト、たとえばＨＥＫ２９３細胞および２９３Ｔ細胞が含まれる。

【0171】

本明細書で使用される用語「単離された」は、実質的に他の材料を含まない分子または生物製剤または細胞材料を指す。

【0172】

本明細書で使用される場合、用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は相互交換可能に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである任意の長さのヌクレオチドのポリマーの形態を指す。即ち、この用語には、それだけに限らないが、一本鎖、二本鎖、もしくは多数鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基またはその他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、または誘導されたヌクレオチド塩基を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなるポリマーが含まれる。

【0173】

「遺伝子」は、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを指す。「遺伝子産物」あるいは「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写され翻訳された際に生成するアミノ酸配列（たとえばペプチドまたはポリペプチド）を指す。

【0174】

本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される２ステップのプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが引き続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから誘導される場合には、発現は真核細胞内におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

【0175】

「転写の制御下」は当技術でよく理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常ＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に寄与するか、または転写を促進するエレメントに作動可能に連結されていることに依存していることを示す。「作動可能に連結されている」は、ポリヌクレオチドが細胞中において機能することを可能にする様式で配置されていることを意図している。一態様では、プロモーターは下流配列に作動可能に連結されていてよい。

【0176】

用語「コードする」は、それがポリヌクレオチドおよび／または核酸配列に適用される場合には、その天然の状態において、または当業者には公知の方法によって操作された場合に、転写されてポリペプチドおよび／またはその断片のためのｍＲＮＡを産生することができるならば、ポリペプチドを「コードしている」と称されるポリヌクレオチドおよび／または核酸配列を指す。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、コードする配列はそれから推測することができる。

【0177】

用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は相互交換可能に使用され、その最も広い意味においてアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチド模倣体の２つ以上のサブユニットの化合物を指す。サブユニットはペプチド結合で連結されていてよい。別の態様では、サブユニットは他の結合、たとえばエステル、エーテル、その他で連結されていてよい。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなるアミノ酸の最大の数には制限はない。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤとＬの両方の光学異性体、アミノ酸アナログ、およびペプチド模倣体を含む、天然および／または非天然、または合成のアミノ酸を指す。

【0178】

本明細書で使用される場合、用語「シグナルペプチド」または「シグナルポリペプチド」は、新たに合成された分泌性または膜のポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端に通常存在するアミノ酸配列を意図している。これはポリペプチドを特定の細胞位置に、たとえば細胞膜を横切って、細胞膜の中に、または核の中に、指向するように作用する。一部の態様では、シグナルペプチドは局在化の後で除去される。シグナルペプチドの例は当技術で周知である。非限定的な例としては、米国特許第８，８５３，３８１号、第５，９５８，７３６号、および第８，７９５，９６５号に記載されたものがある。一部の態様では、シグナルペプチドはＩＤＵＡシグナルペプチドであってよい。

【0179】

用語「等価」または「生物学的等価」は、特定の分子、生物学的材料、または細胞材料に言及する場合には、相互交換可能に使用され、最小の相同性を有しながらそれでも所望の構造または機能性を維持している特定の分子、生物学的材料、または細胞材料を意図している。等価のポリペプチドの非限定的な例には、参照ポリペプチド（たとえば野生型ポリペプチド）と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチド、または参照ポリヌクレオチド（たとえば野生型ポリヌクレオチド）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされるポリペプチドが含まれる。

【0180】

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチドの間、または２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。同一性パーセントは、比較の目的でアラインさせたそれぞれの配列において位置を比較することによって決定することができる。比較した配列中のある位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合には、それらの分子はその位置において同一である。配列の間の同一性の程度は、それらの配列によって共有される一致した位置の数の関数である。「無関係な」または「非相同性」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、２５％未満の同一性を共有している。アラインメントおよび配列同一性パーセントは、前記核酸またはアミノ酸の配列をＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ－ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可能）にインポートし、これを用いることによって、本明細書で提供した核酸またはアミノ酸の配列について決定することができる。たとえば、本明細書で見出したタンパク質配列アラインメントを実施するために用いたＣｌｕｓｔａｌＷパラメーターは、Ｇｏｎｎｅｔ（タンパク質について）重みマトリックスを用いて生成した。一部の態様では、本明細書で見出した核酸配列を用いて核酸配列アラインメントを実施するために用いたＣｌｕｓｔａｌＷパラメーターは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＤＮＡについて）重みマトリックスを用いて生成される。

【0181】

本明細書で使用される場合、アミノ酸の改変は、アミノ酸の置換、アミノ酸の欠失、またはアミノ酸の挿入であってよい。アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよい。保存的置き換え（保存的変異、保存的置換、または保存的変形とも呼ばれる）は、所与のアミノ酸を同様の生化学的特性（たとえば電荷、疎水性、または大きさ）を有する異なるアミノ酸に変更する、タンパク質中のアミノ酸の置き換えである。本明細書で使用される場合、「保存的変形」は、アミノ酸残基の、別の生物学的に同様の残基による置き換えを指す。保存的変形の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニン等の１つの疎水性残基の別の残基への置換、または１つの荷電したもしくは極性の残基の別の残基への置換、たとえばアルギニンのリジンへの、グルタミン酸のアスパラギン酸への、グルタミンのアスパラギンへの置換、その他が含まれる。保存的置換のその他の説明的な例には、アラニンからセリン、アスパラギンからグルタミンもしくはヒスチジン、アスパラギン酸からグルタミン酸、システインからセリン、グリシンからプロリン、ヒスチジンからアスパラギンもしくはグルタミン、リジンからアルギニン、グルタミン、もしくはグルタミン酸、フェニルアラニンからチロシン、セリンからスレオニン、スレオニンからセリン、トリプトファンからチロシン、チロシンからトリプトファンもしくはフェニルアラニン、その他の変更が含まれる。

【0182】

本明細書で開示したポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて細胞または組織に送達することができる。本明細書で使用される「遺伝子送達」、「遺伝子導入」、「形質導入」等は、導入のために用いられる方法に関わらず、外因性ポリヌクレオチド（時には「トランスジーン」と称される）の宿主細胞への導入を指す用語である。そのような方法には、種々の周知の手法、たとえばベクター媒介遺伝子導入（たとえばウイルス感染／トランスフェクション、またはその他の種々のタンパク質系もしくは脂質系の遺伝子送達複合体による）、ならびに「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする手法（たとえばエレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入のために用いられる他の種々の手法）が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、安定的または過渡的に宿主細胞中に維持され得る。安定的な維持には、典型的には導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞に適合する複製の起点を含むか、または宿主細胞のレプリコン、たとえば染色体外レプリコン（たとえばプラスミド）、または核もしくはミトコンドリアの染色体に統合されることが必要である。当技術において既知で本明細書に記載しているように、いくつかのベクターが遺伝子の哺乳動物細胞への導入を媒介することができることが知られている。

【0183】

「プラスミド」は、典型的には染色体ＤＮＡとは離れていて独立にこれを複製することができるＤＮＡ分子である。多くの例で、これは環状で二本鎖である。プラスミドは微生物の集団の中で水平的遺伝子導入のための機構を提供し、典型的には所与の環境状況の下で選択的な利点を提供する。プラスミドは競争的な環境的地位において天然産生の抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を運搬し、あるいは産生されたタンパク質が同様の状況の下で毒素として作用し得る。プラスミドベクターは染色体外環状ＤＮＡ分子として存在することが多い一方、プラスミドベクターはランダムにまたは標的とされた様式で宿主染色体中に安定的に統合されるようにも設計され、そのような統合は環状プラスミドまたは宿主細胞への導入の前に線状化されたプラスミドを用いて達成できることが当技術で知られている。

【0184】

遺伝子操作で用いられる「プラスミド」は「プラスミドベクター」と呼ばれる。そのような使用のために多くのプラスミドが市販されている。複製されるべき遺伝子は、細胞を特定の抗生物質に対して耐性にする遺伝子を含むプラスミドのコピー、およびいくつかの一般に用いられる制限部位を含み、この位置におけるＤＮＡ断片の挿入を容易にする短い領域である多重クローニング部位（ＭＣＳまたはポリリンカー）の中に挿入される。プラスミドの別の主要な用途は、大量のタンパク質を作成することである。この場合には、目的の遺伝子を有するプラスミドを含む細菌または真核細胞が研究者によって増殖され、これらは、挿入された遺伝子から大量のタンパク質が産生されるように誘起することができる。

【0185】

遺伝子導入がアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のＤＮＡウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその部分、およびトランスジーンを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなるポリヌクレオチドを指す。

【0186】

用語「組織」は、生きているもしくは死亡した生命体の組織または生きているもしくは死亡した生命体から誘導されもしくはこれを模倣するように設計された任意の組織を指すために本明細書において使用される。組織は健康であっても、疾患を有していても、および／または遺伝的変異を有していてもよい。生物学的組織は、任意の単一の組織（たとえば相互に連結されていてもよい細胞の集合）または生命体の身体の器官もしくは部分もしくは領域を構成する組織の群を含み得る。組織は、均一な細胞材料を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよく、またはたとえば肺組織、骨格組織、および／または筋肉組織を含み得る胸部を含む身体の領域において見出されるようなコンポジット構造であってもよい。例示的な組織には、それだけに限らないが、肝、肺、甲状腺、皮膚、膵、血管、膀胱、腎、脳、胆道系、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓、および腸から誘導された組織が含まれ、それらの任意の組合せが含まれ得る。
実施例

【0187】

実施例１～５の材料および方法
動物：マウスには飼料および水を自由に摂取させ、１２時間の明－暗サイクル下に飼育した。動物研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ（ＵＮＣ） ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ（図１Ａ～図１Ｃ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ（ＵＴＳＷ）Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（他の全ての図）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコルに従って実行した。全てのマウスはＰ２８で離乳させた（Ｓｉｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ，２０１７．５：１０６～１１５頁）。マウスは以下の例外を除き、バリア施設の中に収容し、そこで評価した。図４Ｄのマウスは従来の施設で飼育し、収容し、評価した。

【0188】

ベクター
ａ）ＡＡＶ９／ＣＢＨ－ＥＧＦＰ：ＡＡＶ９カプシドタンパク質ならびにニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーターおよびそれに続くｅＧＦＰポリペプチドをコードする核酸を含むｒＡＡＶベクターを含むウイルスベクター。
ｂ）ＡＡＶ９／ＭｅＰ４２６－ｈＭＥＣＰ２－ｍｙｃ－ＲＤＨ１ｐＡ（以後、「ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２」と称する）：ＡＡＶ９カプシドタンパク質ならびに５’から３’の方向にＭｅＰ４２６プロモーター配列、ヒトＭｅＣＰ２をコードする核酸配列、ｍｙｃタグをコードする核酸配列、および配列番号１４で表される核酸配列を含む制御配列を含むｒＡＡＶベクターを含むウイルスベクター。
ｃ）ＡＡＶ９－ＭｅＰ４２６－ミニＭＥＣＰ２－ｍｙｃ－ＲＤＨ１ｐＡ（今後、「ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２」と称する）：ＡＡＶ９カプシドタンパク質ならびに５’から３’の方向にＭｅＰ４２６プロモーター配列、配列番号１のアミノ酸配列を含むミニＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードする核酸配列、ｍｙｃタグをコードする核酸配列、および配列番号１４で表される核酸配列を含む制御配列を含むｒＡＡＶベクターを含むウイルスベクター。
ｄ）ＡＡＶ９－ＭｅＰ４２６－ミニＭＥＣＰ２－ｍｙｃ－ｍｉＲＡＲＥ－ＲＤＨ１ｐＡ（今後、「ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ」と称する）：ＡＡＶ９カプシドタンパク質ならびに５’から３’の方向にＭｅＰ４２６プロモーター配列、配列番号１のアミノ酸配列を含むミニＭｅＣＰ２ポリペプチドをコードする核酸配列、ｍｙｃタグをコードする核酸配列、および配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列を含むｒＡＡＶベクターを含むウイルスベクター。
ｅ）ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｙｃ：ＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質ならびに５’から３’の方向にＭｅＰ４２６プロモーター配列、配列番号１のアミノ酸配列を含むミニＭＥＣＰ２－ｍｙｃポリペプチドをコードする核酸配列、ｍｙｃタグをコードする核酸配列、および配列番号１４で表される核酸配列を含む制御配列を含むｒＡＡＶベクターを含むウイルスベクター。
ｆ）ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２－ｍｙｃ－ｍｉＲＡＲＥ：ＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質ならびに５’から３’の方向にＭｅＰ４２６プロモーター配列、配列番号１のアミノ酸配列を含むミニＭＥＣＰ２－ｍｙｃポリペプチドをコードする核酸配列、ｍｙｃタグをコードする核酸配列、および配列番号１７で表される核酸配列を含む制御配列を含むｒＡＡＶベクターを含むウイルスベクター。
ｇ）ＰＨＰ．Ｂ／ＣＢＨ－ＥＧＦＰベクター：ＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質ならびにニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーターおよびそれに続くｅＧＦＰポリペプチドをコードする核酸を含むｒＡＡＶベクターを含むウイルスベクター。

【0189】

全てのベクターはＵＮＣ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって産生された（Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｎ．およびＪ．Ｃ．Ｇｒｉｅｇｅｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ，２０１６．３：１６００２頁）。

【0190】

上記のベクターの全ては自己相補性ゲノムを有しており、全て５％のＤ－ソルビトールを含む３５０ｍＭのＰＢＳの製剤緩衝液中で調製された。

【0191】

６標的のｍｉＲＡＲＥパネルを、ＲＤＨ１ｐＡの２つのサブ成分の間に挿入した。これら２つのサブ成分は、ｍｉＲ－１９、ｍｉＲ－２２、およびｍｉＲ－１３２のための３標的のパネルならびに保存された末梢ポリアデニル化シグナルの１１０ｂｐの断片である。

【化1】

【0192】

下線を付した配列は、それぞれｍｉＲ－９－５ｐ、ｍｉＲ－２６－５ｐ、ｍｉＲ－２３－３ｐ、ｍｉＲ－２１８－５ｐ、ｍｉＲ－２７－３ｐ、およびｌｅｔ－７－５ｐのシードマッチを示す。下線を付していない部分はフランキング配列を表す。これらの標的および側面の配列は、いくつかの基準を満たす。（１）太字の変異はＴ１Ａアンカーを創成するために導入した（Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｎ．Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４．３４６（６２０９）：６０８～１３頁）。（２）それぞれの下線を付した配列の間のスペーサーは、共同抑制のための所望の範囲内である（Ｇｒｉｍｓｏｎ，Ａ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００７．２７（１）：９１～１０５頁；Ｓａｅｔｒｏｍ，Ｐ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００７．３５（７）：２３３３～４２頁）。（３）標的の大部分はＴ９ＡまたはＴ９Ｕを許容する（Ｌｅｗｉｓ，Ｂ．Ｐ．ら，Ｃｅｌｌ，２００５．１２０（１）：１５～２０頁）。

【0193】

処置：４～５週齢のマウスについて、外科的脳槽内または経皮のＩＴ注射（１０μＬ）を実施した。以下の例外を除いて、当業者には公知の注射法を用いた。イソフルランによる吸入麻酔に先立って（アベルチンの腹腔内投与の代わりに）カルプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）およびリドカイン（５μＬ、２％溶液）を皮下投与した（Ｓｉｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ，２０１７．５：１０６～１１５頁；Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１１．第４章：ユニット４ １７頁）。ＩＴ注射は、処置について知らされていない人員によって実施した。

【0194】

ＲＮＡの精製：１群あたり３匹のマウスを、食塩水、１×１０^１２ｖｇのＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２、または１×１０^１２ｖｇのＡＡＶ９／ＥＧＦＰで処置した。注射の２～３週後、致死量の腹腔内アベルチンでマウスを安楽死させ、頸部を切断した。頚髄、小脳、および髄質を迅速に切除し、ドライアイス上で凍結し、直ちに－８０℃に移した。解凍し、溶解した組織からＱｉａｇｅｎ ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを用いて全ＲＮＡを精製した。ＲＮＡ試料は、スクリーニングのためにドライアイス上で出荷するまで－８０で保存した。

【0195】

ｍｉＲＮＡのプロファイリング：ブラインドされたＲＮＡ試料からＬＣ ＳｃｉｅｎｃｅｓによってプロファイリングされたマウスｍｉＲＮＡをプロファイリングし（マイクロアレイパート番号ＭＲＡ－１００２、ｍｉＲＢａｓｅバージョン２１、１群１組織型あたりマウスｎ＝３匹、スクリーニング反復２回）、統計解析を行なった。強度５００未満を正規化シグナルと定義した。本明細書に記載した有意に増加したｍｉＲＮＡ発現レベルは、５００を超える平均シグナル強度を有するものに限定する。

【0196】

バイオインフォーマティクス：本明細書で論じる内因性標的は、ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇに列挙されたアノテーションに基づいており、ここでは２１個の３’ＵＴＲのエクセルファイルをダウンロードした（リリース７．２、２０１８年３月）（Ａｇａｒｗａｌ，Ｖ．ら、Ｅｌｉｆｅ，２０１５．４）。単一の遺伝子について２つの３’ＵＴＲ配列が利用可能な場合には、最も優勢な転写物を解析に選択した。たとえばＭＥＣＰ２について、ＲＤＨ１ｐＡの一部がそれから誘導される８ｋｂの転写物を解析に用いた。ダウンロードしたファイルから得た標的を、頻度表を創成するために用いた単一のマスターファイルに併合した。これらのスコアはウイルスゲノムのコンテクストを説明しないので、一意的にアノテートされた全ての標的をそれらのコンテクスト＋＋パーセンタイルスコアに関わらず考慮した。（Ａｇａｒｗａｌ，Ｖ．ら，Ｅｌｉｆｅ，２０１５．４）。単一の転写物の中で２回以上出現した標的は、３’ＵＴＲあたりただ１回とカウントした。ｍｉＲＡＲＥ由来の６個の標的がＭＥＣＰ２について内因性ヒト３’ＵＴＲと一致する（ｍｉＲ－９－５、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１８－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、およびｌｅｔ－７－５ｐ／９８－５ｐ）。ｍｉＲＡＲＥ由来の５個の標的がＭＥＣＰ２について内因性マウス３’ＵＴＲと一致する（ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１８－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、およびｌｅｔ－７－５ｐ／９８－５ｐ）。

【0197】

毎週の体重測定および総計行動スコアリング：総計表現型重症度スケールを用いて、処置されたマウスにおける行動を評価した。これは以前に公開されたスケールに基づいている（Ｇｕｙ，Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７．３１５（５８１５）：１１４３～７頁）。この総計スケールには、異常な動作、異常な歩行、後肢のクラスピング、振戦、異常な呼吸、および異常な一般的所見についての６つのサブスケールが含まれる。後肢のクラスピングは、マウスを尾で吊り上げて後肢が浮かんだ状態になるようにして評価した。スコアは処置および遺伝型についてブラインドとしたが、目視評価によって遺伝型を推測することは可能であろう。マウスは注射前およびその後毎週、体重測定およびスコア付けを行なった。

【0198】

ロタロッド：マウスをＣｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＲｏｔａｍａｘ－５によって試験した。ロタロッドは５分にわたって４～４０ｒｐｍで加速した。マウスは、試験の間の間隔を１５分として１日あたり４回、２日にわたって試験した。記録した潜在期間は、マウスがロタロッドから落ちた時間またはマウスが倒れずにロッドの周囲を１回旋回した時間のいずれかとした（マウスはその後でロタロッドから取り除いた）。これらの評価は、処置および遺伝型について知らされていないスコアラーによって行なわれた。

【0199】

生存：それぞれのマウスについて記録した死亡日は、以下の例外を除いて自然の死亡日であった。ピーク時の体重の少なくとも２０％を失ったマウスは、以前公開された方法（Ｇａｄａｌｌａ，Ｋ．Ｋ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ，２０１７．５：１８０～１９０頁）に従って、またはＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒの獣医スタッフの提言に従って安楽死させた。重篤な健康上の問題（合併症による脱落、壊死をもたらすか自己傷害に続く尾の病変）による早期の安楽死は、校閲前の生存曲線の中で指示している。

【0200】

免疫蛍光および共焦点解析：免疫蛍光解析技術は、以下の例外を除いて以前公開された方法に従って実施した（Ｓｉｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ，２０１７．５：１０６～１１５頁）。抗原賦活化は実施しなかった。抗原賦活化はブロッキングおよび抗ＭｅＣＰ２一次抗体とのインキュベーションの前には必要であるが、ブロッキングおよび抗ｍｙｃ抗体とのインキュベーションの前には必要でない。免疫標識した切片は、Ｚｅｉｓｓ８８０共焦点顕微鏡により、Ｚｅｎソフトウェアを用いて、ＵＴ ＳｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎのＬｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙでイメージングした。

【0201】

統計解析：有意性を判定するために用いたアルファレベルはｐ＜０．０５であった。ｍｉＲＮＡマイクロアレイからの変換したシグナル強度の統計解析は、技術資料に記載された方法に従って実施した。群間の解析（たとえば群Ａ対群Ｂ）を実施した。スクリーニング手法の制限のために、ｐ－値は注意深く解析し、ｍｉＲＡＲＥのために選択したｍｉＲＮＡ標的を正当化するために、スクリーニングとバイオインフォーマティクスの結果を併せた。Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって生成したＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットにおける群の対の間の統計的有意性を計算した。他に注記した場合を除き、体重および行動のデータについてＧｒａｐｈＰａｄを用いて二方向ＡＮＯＶＡおよびそれに続くＴｕｋｅｙのポストホック検定を行なった。

【実施例1】

【0202】

ミニＭＥＣＰ２ベクターはＷＴマウスにおいて副反応を惹起し得る。
ＡＡＶ９／ＭｅＰ４２６－ｈＭＥＣＰ２－ｍｙｃ－ＲＤＨ１ｐＡ（これ以降ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２と称する）は、若年マウスへの脳槽内（ＩＣＭ）投与の後、用量依存性の副反応（たとえば体重減少および四肢のクラスピングの異常）を惹起し得る。対照的に、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２の安全性に関してはあまり知られていない。ミニＭＥＣＰ２遺伝子導入による毒性を評価するため、ＷＴ若年マウスに１×１０^１２ｖｇのＡＡＶ９／またはＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２を注射し（ＩＣＭ）、行動を毎週スコア付けした。これらの用量は極めて高いが、目的は副反応を惹起せずにＣＮＳにおいて広範囲のＭｅＣＰ２タンパク質発現を可能にする処置を開発することであり、したがって高い用量が必要である。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２は、注射後２週以内に平均クラスピングスコアを増加させた（ｐ＜０．０５、図１Ａ）。ＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２は、注射後３日と早期に両側のクラスピングをもたらした（図１Ｂ）。ＡＡＶ９／とＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２の両方は、注射後２週以内に総計表現型重症度スコアを増加させた（ｐ＜０．０５、図１Ｃ）。内因性ミニＭｅＣＰ２－ＥＧＦＰを発現するトランスジェニックマウスは穏和なクラスピングを呈したが、急速に進行する重度の表現型が観察されたことは、毒性の過発現と一致し、したがってミニＭＥＣＰ２ウイルスゲノムのさらなる最適化が正当化された。

【実施例2】

【0203】

ｍｉＲＡＲＥ配列を設計するためのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現解析
毒性のあるＭＥＣＰ２遺伝子療法によって上方制御されるｍｉＲＮＡを同定するため、ＷＴおよびＫＯマウスに、食塩水、ＡＡＶ９／ＥＧＦＰ、またはＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２を４～５週齢で注射した（１×１０^１２ｖｇ／マウス、ＩＣＭ）。注射後２～３週で、注射部位近くで見出された３種の組織を切除した。組織型は頚髄（ＣＣ）、小脳、および髄質であった。これらの試料から全ＲＮＡを精製した。次いでマイクロアレイによって１９００のマウスｍｉＲＮＡの発現を定量した。このアプローチにより、より顆粒状の、細胞型に特異的なｍｉＲＮＡを特定する可能性を差し控えながら、ＣＮＳ中の関連性のあるＭｅＣＰ２応答性ｍｉＲＮＡの同定が可能になった。その発現レベルがＭｅＣＰ２と相関して組織レベルで有意に増加したｍｉＲＮＡを同定した。これらの変化がｑＲＴ－ＰＣＲによる二次的確認のためにはスケールにおいて小さすぎる（せいぜい１．５倍未満）ことに鑑みて、新規な制御パネルのためにｍｉＲＮＡ標的の選択を正当化する代替の二次的アプローチを用いた。

【0204】

二次的アプローチの必要性に鑑みて、マイクロアレイデータを新規なバイオインフォーマティクスアプローチと併せた。表現型において関連し、発達において同時に起こる神経発達障害を媒介する用量感受性のＣＮＳ遺伝子の３’ＵＴＲは、共通していくつかのｍｉＲＮＡ標的を有し得る（表２～表３）。そうであれば、一次的にはレット遺伝子療法を意図しているが、他の疾患にも関連し得る小型で多目的の標的パネルを設計することができる。アノテートされたｍｉＲＮＡ標的が１１種の３’ＵＴＲの間で出現した回数を、知的障害を媒介する遺伝子の精選されたリストについて定量した（表２～表３、図２Ａ～図２Ｂ）。本発明者らの３’ＵＴＲの精選されたリストにわたる見かけ上の標的の保存が極めて長いｍＲＮＡ配列による人工産物であるかもしれないという懸念に対処するため、ヒト遺伝子のランダムな選択について同じ解析を行なった。（１）ランダムに選択した遺伝子についての３’ＵＴＲは、共通のｍｉＲＮＡ標的をほとんど有しなかったこと（図５）、および（２）１００ｂｐの長さの３’ＵＴＲ配列あたりの共有された標的の数は、本発明者らの精選された遺伝子の組よりもランダムに選択した遺伝子の組について少なかったこと（図６Ａ～６Ｂおよび図７Ａ～７Ｂ）が観察された。

【0205】

【表2】

【0206】

表２に列挙した遺伝子における不活化変異は、知的障害ならびにその他の表現型、たとえば発作、常同症、異常発語、および／または異常な頭の大きさによって特徴付けられる神経発達障害を媒介することが示されている。発症の正確な年齢は機能喪失症候群にわたって変動するが、これらの症候群の多くは２歳までに明らかになる。逆進(reciprocal)（過発現に関連する）障害は全体としてまたは部分的に同じ遺伝子によって媒介され得る。ヒト染色体複製に伴う特定の表現型に対する特定の遺伝子の寄与は、常には知られていない。明らかにするため、必要以上のタンパク質発現を有する患者は、典型的にはこの表に示された遺伝子を包含するが、それらに限定されない、より大きな染色体領域にわたる複製を有している。したがって、表３にはこれらの遺伝子の可能な用量感受性を過小評価する単一遺伝子の複製マウスモデルが含まれている。遺伝子内の複製（これはタンパク質の切断を生じ得る）を記載する臨床的寸描は、この表では考慮していない。３’ＵＴＲ配列はｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇでアクセス可能である。ここで列挙したアンサンブル転写数を解析に用いた（Ａｇａｒｗａｌ，Ｖ．ら，Ｅｌｉｆｅ，２０１５．４）。

【0207】

【表3】

【0208】

１１種の３’ＵＴＲ（マウスおよびヒトのデータの組における）のうち大部分（６以上）にわたって出現するｍｉＲＮＡ標的を同定した後で、ＣＳＦ内注射部位付近の組織において発現したｍｉＲＮＡの標的を優先させるため、マイクロアレイデータを用いた（図２Ａ～２Ｂ）。次いでその発現レベルがＭｅＣＰ２と相関して増加しているように見えるｍｉＲＮＡについての標的を含むように、候補標的のリストを狭めた。最後に、多数の可能性のあるＭｅＣＰ２感受性ｌｅｔ－７－５ｐ ｍｉＲＮＡと塩基対を形成することが予測されるｌｅｔ－７－５ｐ結合部位を含ませることによって、ＤＮＡ配列の長さを最小化しつつ制御ポテンシャルを最大化した。究極的に、この二方面からのアプローチによって１７５塩基対の６標的パネル（ｍｉＲＡＲＥ）が得られ、これをミニＭＥＣＰ２ウイルスゲノムに挿入した（図２Ｃ）。自己相補性ＡＡＶ９／ＭｅＰ４２６－ミニＭＥＣＰ２－ｍｙｃ－ｍｉＲＡＲＥ－ＲＤＨ１ｐＡウイルスゲノムを今後ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥと称する。重要なことに、これらのｍｉＲＡＲＥ標的のそれぞれは、幼年期から若年期を通じてヒト脳組織で発現することが示されているｍｉＲＮＡに結合することが予測される。さらに、６種の女性ヒト小脳ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－９－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１８－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、およびｌｅｔ－７ｅ－５ｐ）の相対的発現レベルは、ｍｉＲＮＡプロファイルにおける相対的発現レベルを大まかに反映しており、ｍｉＲ－９－５ｐとｍｉＲ－２３ａ－３ｐがそれぞれ高レベルおよび低レベルで発現される。

【実施例3】

【0209】

ｍｉＲＡＲＥは処置されたＷＴマウスにおいてミニＭＥＣＰ２遺伝子導入の安全性を改善する。
若年マウスについて２つの処置パラダイム、即ち（１）ＩＣＭ ＰＨＰ．Ｂ媒介遺伝子導入（図８を参照）および（２）髄腔内（ＩＴ）ＡＡＶ９媒介遺伝子導入における制御されたミニＭＥＣＰ２遺伝子導入の安全性を解析した。

【0210】

ＰＨＰ．Ｂを用いるＩＣＭ実験は、高度に効率的な遺伝子導入についてのデータを提供し、ｍｉＲＡＲＥのデータを図１と結びつけ、これは制御されていないＡＡＶ９／とＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２ベクターとのＩＣＭ投与を比較する。ＰＨＰ．Ｂのデータの組を要約する。ｍｉＲＡＲＥは、ＷＴ脳におけるミニＭｅＣＰ２－ｍｙｃタンパク質発現の強固な制御を提供し（ｍｉＲＡＲＥは脳におけるミニＭｅＣＰ２－ｍｙｃタンパク質の発現を低下させる）、ウイルス処置ＷＴマウスの体重損失を防止し（非制御ベクターおよび食塩水に対してｐ＜０．０５、図８Ａ）、ウイルス処置ＷＴマウスの総計表現型スコアを正常化し（非制御ベクターに対してｐ＜０．０５、図８Ｂ）、重篤な歩行の発症を遅延させ（非制御ベクターに対してｐ＜０．０５、図８Ｃ）、ウイルス処置ＷＴマウスにおける重篤な後肢のクラスピングの発生をほぼ完全に除去した（非制御ベクターに対してｐ＜０．０５、図８Ｄ）。

【0211】

次に、ｍｉＲＡＲＥの評価をヒトへの変換に関連する方法と合わせるため、髄腔内投与したＡＡＶ９のコンテクストの中でｍｉＲＡＲＥを評価した。ｍｉＲＡＲＥはいくつかの安全性の恩恵を提供した。具体的には、ｍｉＲＡＲＥは、ＷＴマウスにおいて試験した最大の用量で急性のミニＭＥＣＰ２媒介体重損失を防止した（１×１０^１２ｖｇ／マウス、図３Ａ）。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２処置ＷＴマウスは、１５週齢で開始して食塩水処置ＷＴマウスより有意に低い体重を有していた（ｐ＜０．０５）。食塩水処置とＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置のＷＴマウスの間で有意差は観察されなかった（１×１０^１２ｖｇ／マウス）。

【0212】

ｍｉＲＡＲＥはＷＴ総計表現型重症度スコアにおいてミニＭＥＣＰ２媒介悪化を減衰させた（図３Ｂ）。ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置されたＷＴマウスは、食塩水処置されたマウスで観察されたスコアに対して有意に高い平均総計行動重症度スコアを有していた（それぞれ６～３０週齢および７～２７週齢においてｐ＜０．０５）。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスは、それぞれ１１～１９週齢および９～２０週齢のほとんどの時点で、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したマウスに対して有意に低い平均総計重症度スコアを有していた。食塩水とＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＷＴマウスとの間には、有意差は観察されなかった（１×１０^１２ｖｇ／マウス）。ｍｉＲＡＲＥは、ミニＭｅＣＰ２媒介重症後肢クラスピングの頻度を低減させることおよびミニＭｅＣＰ２媒介重症異常歩行を防止することによって、総計重症度スコアにおけるミニＭｅＣＰ２媒介悪化を減衰させた（図３Ｃ～３Ｄ）。対照的に、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２またはＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウスの少なくとも半分は、重症異常歩行または重症後肢異常が進行した。

【0213】

ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置したＷＴマウスの間では、早期の死亡は観察されなかった。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２処置したＷＴマウスの間の獣医の要望による早期の安楽死は、脱落による合併症のためであった（図３Ｅ）。最後に、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ処置ＷＴマウスの間では、尾の病変は観察されなかった（マウス２１匹中０％）。対照的に、制御していないＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２処置ＷＴマウスの８～１７％（１×１０^１１ｖｇで処置した１２匹のマウス中１匹、１×１０^１２ｖｇで処置したマウス１２匹中２匹）では病変が観察された。尾の病変は、１×１０^１１ｖｇのＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウス１２匹中１匹で観察された。これらの結果は、ｍｉＲＡＲＥ配列を用いて、ＭＥＣＰ２のＡＡＶ媒介送達の有害な副反応を効果的に防止できることを実証している。

【実施例4】

【0214】

ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥは、ＭＥＣＰ２ ＫＯマウスの生存を延長する。
若年マウスにおけるＡＡＶ９ベクターのＩＴ投与のコンテクストにおいて、制御していないミニＭＥＣＰ２遺伝子導入は、試験したいずれの用量においてもＭＥＣＰ２ ＫＯの生存を延長することができなかった。しかし、制御されたミニＭＥＣＰ２遺伝子導入は、ＫＯの生存を５６％延長した（１×１０^１２ｖｇ／マウス、図４Ａ～４Ｅおよび図９）。ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２で処置したＫＯマウスの生存の延長には見かけ上の傾向があるが、この延長は有意ではなかった（ｐ＝０．１）。ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２による生存の延長の強い傾向はあるが、ＷＴマウスにおける研究により、この用量のこのベクターデザインには許容できない毒性が示された（図３Ａ～３Ｅ）。処置はＫＯの体重には影響しなかった。これらの結果は、ｍｉＲＡＲＥ配列を用いて、ＭＥＣＰ２のＡＡＶ媒介送達の有害な副反応を効果的に防止できる一方、治療上の恩恵を提供し、かつＫＯマウスの生存を延長できることを実証している。

【実施例5】

【0215】

ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥは重度異常歩行の発症の週齢を遅延させる。
毎週の行動データを用いて、ＫＯマウスにおける重度歩行異常（０～２のスケールでスコア２）の発症のおよその週齢を表にした。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥは、重度歩行異常の発症のおよその週齢を４～５週、遅延させ（他の全ての群に対してｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡおよびそれに続くＴｕｋｅｙのポストホック検定）、発生の頻度は同様または低かった（他の全てのＫＯ群に対して、図４Ａ～４Ｅ）。

【0216】

加速ロタロッド試験において、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥ（１×１０^１２ｖｇ／マウス）は、食塩水処理マウスの運動神経に対して１５０％改善されたＫＯマウスの初期運動神経の傾向を生じた（ｐ＞０．０５）が、試験にわたる運動学習は改善しなかった。ロタロッド試験は、第２の動物施設に位置するマウスの別のコホートについて実施した。

【0217】

いくつかのＡＡＶ処置ＫＯマウスでは有害事象が注目された。

【0218】

食塩水処置ＫＯマウスを含めた全ての処置群にわたって、尾の病変が観察された（図４Ｅ）。食塩水で処置したＫＯマウスの間の病変の頻度は１１％（２／１８）であった。１×１０^１１ｖｇのＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２、およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したマウスの間の病変の頻度は、それぞれ２５％（３／１２）、４２％（５／１２）、および１７％（２／１２）であった。１×１０^１２ｖｇのＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２、ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２、およびＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２－ｍｉＲＡＲＥで処置したＫＯマウスの病変の頻度は、それぞれ３３％（４／１２）、２５％（３／１２）、および１７％（２／１２）であった。群のサイズが小さいので、ｍｉＲＡＲＥが病変のリスクを低下させるか否かを、自信をもって判定することはできない。ＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２処置ＫＯマウスについての病変の頻度と用量との逆相関関係は、群サイズが小さいことまたはおそらく早期の死亡による人為的影響かも知れない。１×１０^１１または１×１０^１２ｖｇのＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２で処置したＫＯマウスについてのそれぞれのメディアン生存は、それぞれ１０．４週および９．６週である（図４Ａおよび図９）。

【0219】

実施例１～５のまとめ
実施例１～５に提示した結果は、ＷＴマウスにおける制御されていないＡＡＶ９／ミニＭＥＣＰ２の用量依存性副反応を定量化した最初のものである。これらの副反応は、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２について以前観察された副反応を反復するものであり、したがってウイルスゲノムに対するさらなる改善が正当化された。

【0220】

「ｍｉＲＡＲＥ」ｍｉＲＮＡ標的パネルを特徴とする制御されたミニＭＥＣＰ２ウイルスゲノムを設計するために、新規な標的パネル設計戦略を創成した。理論に縛られることは望まないが、形質導入された任意の細胞においてトランスジーンの過発現を阻止する安全弁を創成するために、内因性ＭｅＣＰ２応答性ｍｉＲＮＡを利用して、ＭｅＣＰ２の過発現の事象においてミニＭＥＣＰ２トランスジーンを下方制御することが目的であった。ｍｉＲＡＲＥは以下の基準に合致する。（１）標的の大部分は想定されるＭｅＣＰ２応答性ｍｉＲＮＡに結合することが予測される。（２）それぞれの標的は、知能障害を媒介する用量感受性遺伝子の精選されたリストからの７～１１種の内因性ヒト３’ＵＴＲの中に出現する（したがって、他の用量感受性のＣＮＳ遺伝子療法用途にも有用である）。（３）標的は発達の段階にわたってヒトＣＮＳ組織中で発現するｍｉＲＮＡに結合することが予測される。究極的には、この戦略は、２つの異なる処置モデルにおいて（制御されていない対照ベクターの有効性に対して）有効性を犠牲にすることなく、安全性が改善された制御されたウイルスゲノムの設計をもたらした。

【0221】

ｍｉＲＡＲＥの設計戦略は、ＣＮＳ遺伝子療法のコンテクスト内においてトランスジーンの発現を制御するための従来のアプローチの限界に対処することを追求している。発現を制御するための以前のアプローチには、細胞型特異性（たとえば神経プロモーター）を付与し、末梢発現を排除し（たとえば肝における発現を構成的に阻害するためのｍｉＲ－１２２標的パネル）、ｍＲＮＡを不安定化し（全ＭｅＣＰ２レベルには応答しない様式で）、および外因性タンパク質を不安定化する（たとえば融合したデグロンドメイン）戦略が含まれている（Ｌｕｏｎｉ，Ｍ．ら，Ｅｌｉｆｅ，２０２０．９；Ｑｉａｏ，Ｃ．ら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１．１８（４）：４０３～１０頁；Ｇｅｉｓｌｅｒ，Ａ．ら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１．１８（２）：１９９～２０９頁；Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１．２２（９）：１１４３～５３頁；Ｑｕｉｎｔｉｎｏ，Ｌ．ら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ，２０１８．１１：２９～３９頁）。しかしこれらの先行するアプローチは、僅かなゲノムコピーを受容するＣＮＳ細胞の外因性タンパク質発現レベルに対して数百個のベクターゲノムコピーを受容するＣＮＳ細胞における外因性タンパク質発現レベルを制限することを意図したものではない。さらに、従来の制御アプローチは、形質導入された細胞がＷＴ内因性ＭｅＣＰ２またはミュータントＭｅＣＰ２のいずれかを発現するＭｅＣＰ２のモザイク現象に応じて発現を制御することを意図していない。形質導入された細胞にわたるベクターのコピー数および内因性ＷＴ ＭｅＣＰ２の発現におけるこの変動は、ＭｅＣＰ２の真にフィードバックを可能にする制御に対するニーズを創成している。生命体レベルでは、そのようなフィードバックループは、有効性を維持する一方で安全性を改善するはずである。究極的には、ｍｉＲＡＲＥはＫＯマウスにおける有効性を犠牲にすることなく、ＷＴマウスにおける過発現に関連する副反応を減衰させる。

【0222】

ｍｉＲＡＲＥは、二次的介入を必要とせずに、（それぞれＷＴおよびＫＯマウスにおいて）髄腔内ミニＭＥＣＰ２遺伝子導入の安全性と有効性の両方を改善する（図４Ａ～４Ｅ）。ｍｉＲＡＲＥベクターはＷＴマウスにおいてよく忍容されたので、このベクターは対立遺伝子特異的ＲＴＴモデルによく忍容されることが想定される。全体として、ｍｉＲＡＲＥは、本発明者らの腰部髄腔内処置モデルにおいてこれらのＷＴ行動副反応を大きく減衰させた一方、ＫＯ生存を改善した（図４Ａ～４Ｅ）。

【0223】

実施例１～５で提示した結果も、ｍｉＲＡＲＥがレット症候群を超える実用的な用途を有し得ることを実証している。ｍｉＲＡＲＥの配列はＭｅＣＰ２の過発現の研究から集められた実験データの組合せを用い、またいくつかの発達制御された用量感受性の遺伝子の解析から得られた統合された知識も用いて設計した。即ち、ｍｉＲＡＲＥを用いて、ＭｉＲＡＲＥの創成において解析した遺伝子を超える遺伝子を含む遺伝子導入のコンテクストにおけるその他の用量感受性遺伝子のフィードバック制御を提供することができる。本明細書に記載した標的パネル設計戦略は意図的な過剰摂取からの分子データの上に構築されているので、ｍｉＲＡＲＥの設計戦略にはさらなる意義がある。リスクによって推進されるウイルスゲノムの改変によって、用量依存性のトランスジーン関連副反応がコードされた治療用産生物の中で解決され得るというユニークな利点を有する遺伝子療法の分野が提供される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】

【配列表】

2023504735000001.app

【国際調査報告】