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特表2023-504765ＣＢ１受容体アゴニストの副作用を軽減するペプチド化合物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-07
(54)【発明の名称】ＣＢ１受容体アゴニストの副作用を軽減するペプチド化合物
(51)【国際特許分類】
C07K 7/08 20060101AFI20230131BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230131BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230131BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20230131BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20230131BHJP
A61P 25/06 20060101ALI20230131BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230131BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230131BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20230131BHJP
A61P 1/14 20060101ALI20230131BHJP
A61P 1/08 20060101ALI20230131BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20230131BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230131BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230131BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230131BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20230131BHJP
A61P 25/22 20060101ALI20230131BHJP
A61K 31/352 20060101ALI20230131BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230131BHJP
【ＦＩ】
C07K7/08
A61K45/00
A61P43/00 121
A61K38/10
A61P25/04
A61P25/06
A61P29/00
A61P19/02
A61P15/00
A61P29/00 101
A61P1/14
A61P1/08
A61P27/06
A61P25/00
A61P25/16
A61P25/28
A61P25/14
A61P25/22
A61K31/352
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520668
(86)(22)【出願日】2020-10-02
(85)【翻訳文提出日】2022-05-31
(86)【国際出願番号】 EP2020077642
(87)【国際公開番号】W WO2021064165
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】19382856.3
(32)【優先日】2019-10-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514267962
【氏名又は名称】ウニベルシタ デ バルセローナ
(71)【出願人】
【識別番号】513317482
【氏名又は名称】ユニベルシタート ポンペウ ファブラ
(71)【出願人】
【識別番号】521440507
【氏名又は名称】ウニベルシタ アウトノマ デ バルセロナ
(71)【出願人】
【識別番号】522132373
【氏名又は名称】インシュティトュート デ メディシナ モレキュラー ジョアン ロボ アントゥネス
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＯ ＤＥ ＭＥＤＩＣＩＮＡ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＪＯＡＯ ＬＯＢＯ ＡＮＴＵＮＥＳ
(71)【出願人】
【識別番号】522132395
【氏名又は名称】ファクルダーヂ ヂ メディシナ ダ ウニベルシダーヂ ヂ リスボン
【氏名又は名称原語表記】ＦＡＣＵＬＤＡＤＥ ＤＥ ＭＥＤＩＣＩＮＡ ＤＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤＥ ＤＥ ＬＩＳＢＯＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100094640
【弁理士】
【氏名又は名称】紺野 昭男
(74)【代理人】
【識別番号】100103447
【弁理士】
【氏名又は名称】井波 実
(74)【代理人】
【識別番号】100111730
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 武泰
(74)【代理人】
【識別番号】100180873
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 慶政
(72)【発明者】
【氏名】カサド ブリリョ、ビセン
(72)【発明者】
【氏名】モレノ ギリェン、エステファニア
(72)【発明者】
【氏名】モルドナド ロペス、ラファエル
(72)【発明者】
【氏名】アンドレウ マルティネス、ダビド
(72)【発明者】
【氏名】ガリョ、マリア
(72)【発明者】
【氏名】パルド カラスコ、レオナルド
(72)【発明者】
【氏名】カスターニョ、ミゲル
(72)【発明者】
【氏名】ネベス、ベラ
(72)【発明者】
【氏名】カバコ、マルコ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA09
4C084BA18
4C084BA23
4C084CA59
4C084MA02
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA081
4C084ZA082
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZA691
4C084ZA692
4C084ZA711
4C084ZA712
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZA961
4C084ZA962
4C084ZB151
4C084ZB152
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZC412
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZA02
4C086ZA08
4C086ZA15
4C086ZA33
4C086ZA69
4C086ZA71
4C086ZA81
4C086ZA96
4C086ZB15
4C086ZB21
4C086ZC75
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA01
4H045BA17
4H045CA40
4H045CA45
4H045DA50
4H045EA20
4H045EA21
4H045FA33
(57)【要約】
本発明は、式（Ｉ）の化合物：
ＡＡ１－ＡＡ２－Ｄ－Ｉｌｅ－ＡＡ３－Ｄ－Ｍｅｔ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２
（Ｉ）、
またはその薬学的に許容される塩に関し、またそれらを得る方法およびそれらの治療用途（適応症）に関する。
ＡＡ１－ＡＡ２－Ｄ－Ｉｌｅ－ＡＡ３－Ｄ－Ｍｅｔ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２
（Ｉ）、
またはその薬学的に許容される塩に関し、またそれらを得る方法およびそれらの治療用途（適応症）に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）の化合物：ＡＡ１－ＡＡ２－Ｄ－Ｉｌｅ－ＡＡ３－Ｄ－Ｍｅｔ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２ （Ｉ）
（式中、
ＡＡ１は、Ｄ－トリプトファン（Ｄ－Ｔｒｐ）、１－ナフチルアラニン（Ｄ－１－Ｎａｌ）および２－ナフチルアラニン（Ｄ－２－Ｎａｌ）からなる群から選択されるアミノ酸を表し；
ＡＡ２は、Ｄ－ロイシン（Ｄ－Ｌｅｕ）、Ｄ－ノルロイシン（Ｄ－Ｎｌｅ）およびＤ－フェニルアラニン（Ｄ－Ｐｈｅ）からなる群から選択されるアミノ酸を表し；
ＡＡ３は、Ｄ－メチオニン（Ｄ－Ｍｅｔ）およびＤ－ノルロイシン（Ｄ－Ｎｌｅ）からなる群から選択されるアミノ酸を表す）、
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項2】
ＡＡ１がＤ－トリプトファン（Ｄ－Ｔｒｐ）を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
ＡＡ２がＤ－ロイシン（Ｄ－Ｌｅｕ）を表す、請求項１～２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項4】
ＡＡ３がＤ－Ｔｙｒを表す、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項5】
Ｄ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｍｅｔ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐまたはその薬学的に許容される塩
からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項6】
治療有効量の請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物を含む、医薬組成物または獣医用組成物。
【請求項7】
２－アラキドノイルグリセロール（２－ＡＧ）、２－アラキドニルグリセリルエーテル（２－ＡＧＥ、ノラジンエーテル）、アナンダミド（Ｎ－アラキドノイルエタノールアミンまたはＡＥＡ）、Ｎ－アラキドノイルドーパミン、パルミトイルエタノールアミド（ＰＥＡ）；１１－ヒドロキシ－Δ８－テトラヒドロカンナビノール、１１－ヒドロキシ－Δ９－テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール、Δ８－テトラヒドロカンナビノール、Δ９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＴＨＣまたはΔ９－ＴＨＣ）、ＡＭ－２２０１（１－（５－フルオロペンチル）－３－（１－ナフトイル）インドール）、ＡＭ－６７８（１－ペンチル－３－（１－ナフトイル）インドール）、アラキドニル－２’－クロロエチルアミド（ＡＣＥＡ）、ＣＰ５５，９４０（［（－）－シス－３－［２－ヒドロキシ－４－（１，１－ジメチルヘプチル）フェニル］－トランス－４－（３－ヒドロキシプロピル）－シクロヘキサノール］）、ＨＵ－２１０、ＪＷＨ－０１８（１－ペンチル－３－（１－ナフトイル）インドール）、ＪＷＨ－０７３、リノレイルエタノールアミド、レボナントラドール（ＣＰ５０，５５６－１）、ナビロン、ナビキシモルスおよびＷＩＮ５５，２１２－２、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＣＢ１受容体アゴニストと組み合わせて、医薬として使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項8】
２－アラキドノイルグリセロール（２－ＡＧ）、２－アラキドニルグリセリルエーテル（２－ＡＧＥ、ノラジンエーテル）、アナンダミド（Ｎ－アラキドノイルエタノールアミンまたはＡＥＡ）、Ｎ－アラキドノイルドーパミン、パルミトイルエタノールアミド（ＰＥＡ）；１１－ヒドロキシ－Δ８－テトラヒドロカンナビノール、１１－ヒドロキシ－Δ９－テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール、Δ８－テトラヒドロカンナビノール、Δ９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＴＨＣまたはΔ９－ＴＨＣ）、ＡＭ－２２０１（１－（５－フルオロペンチル）－３－（１－ナフトイル）インドール）、ＡＭ－６７８（１－ペンチル－３－（１－ナフトイル）インドール）、アラキドニル－２’－クロロエチルアミド（ＡＣＥＡ）、ＣＰ５５，９４０（［（－）－シス－３－［２－ヒドロキシ－４－（１，１－ジメチルヘプチル）フェニル］－トランス－４－（３－ヒドロキシプロピル）－シクロヘキサノール］）、ＨＵ－２１０、ＪＷＨ－０１８（１－ペンチル－３－（１－ナフトイル）インドール）、ＪＷＨ－０７３、リノレイルエタノールアミド、レボナントラドール（ＣＰ５０，５５６－１）、ナビロン、ナビキシモルスおよびＷＩＮ５５，２１２－２、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＣＢ１受容体アゴニストと組み合わせて、ヒトを含む動物におけるＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患または状態の治療または予防に使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項9】
前記ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患または状態が、重度の片頭痛、変形性関節症、子宮内膜症、関節リウマチ、線維筋痛症、背痛、膝痛、末梢性または中枢性の神経障害性疼痛に関連する疼痛からなる群から選択されるものであり、食欲促進治療、化学療法時の制吐薬としての、緑内障の治療のための、多発性硬化症患者における痙縮の治療における、および運動障害（特に、ジスキネジアおよびパーキンソン病など）の治療における、請求項８に記載の使用のための組み合わせ。
【請求項10】
２－アラキドノイルグリセロール（２－ＡＧ）、２－アラキドニルグリセリルエーテル（２－ＡＧＥ、ノラジンエーテル）、アナンダミド（Ｎ－アラキドノイルエタノールアミンまたはＡＥＡ）、Ｎ－アラキドノイルドーパミン、パルミトイルエタノールアミド（ＰＥＡ）；１１－ヒドロキシ－Δ８－テトラヒドロカンナビノール、１１－ヒドロキシ－Δ９－テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール、Δ８－テトラヒドロカンナビノール、Δ９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＴＨＣまたはΔ９－ＴＨＣ）、ＡＭ－２２０１（１－（５－フルオロペンチル）－３－（１－ナフトイル）インドール）、ＡＭ－６７８（１－ペンチル－３－（１－ナフトイル）インドール）、アラキドニル－２’－クロロエチルアミド（ＡＣＥＡ）、ＣＰ５５，９４０（［（－）－シス－３－［２－ヒドロキシ－４－（１，１－ジメチルヘプチル）フェニル］－トランス－４－（３－ヒドロキシプロピル）－シクロヘキサノール］）、ＨＵ－２１０、ＪＷＨ－０１８（１－ペンチル－３－（１－ナフトイル）インドール）、ＪＷＨ－０７３、リノレイルエタノールアミド、レボナントラドール（ＣＰ５０，５５６－１）、ナビロン、ナビキシモルスおよびＷＩＮ５５，２１２－２、およびこれらの混合物からなる群から選択されるＣＢ１受容体アゴニストと組み合わせて、ＣＢ１受容体アゴニストによって引き起こされる記憶障害および／または不安変化の軽減に使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項11】
前記ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患または状態が疼痛である、請求項８～９のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項12】
疼痛が慢性疼痛である、請求項１１に記載の使用のための化合物。
【請求項13】
疼痛が、重度の片頭痛、変形性関節症、子宮内膜症、関節リウマチ、線維筋痛症、背痛、膝痛、および末梢性または中枢性の神経障害性疼痛に関連するものである、請求項９、１１～１２のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項14】
前記ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患または状態の治療が、食欲不振、癌の治療における化学療法によって引き起こされる嘔吐、緑内障、多発性硬化症患者における痙縮、および運動障害（特に、ハンチントン病、ジスキネジアおよびパーキンソン病など）からなる群から選択される疾患または状態の治療である、請求項８に記載の使用のための化合物。
【請求項15】
ヒトを含む動物におけるＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患の治療または予防のための医薬の製造のための、ＣＢ１受容体アゴニストと組み合わせた、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項16】
前記ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患または状態が、重度の片頭痛、変形性関節症、子宮内膜症、関節リウマチ、線維筋痛症、背痛、膝痛、末梢性または中枢性の神経障害性疼痛に関連する疼痛からなる群から選択されるものであり、食欲促進治療、化学療法時の制吐薬としての、緑内障の治療のための、多発性硬化症患者における痙縮の治療における、および運動障害（特に、ジスキネジアおよびパーキンソン病など）の治療における、請求項１５に記載の使用。
【請求項17】
ＣＢ１受容体アゴニストによって引き起こされる記憶障害および／または不安変化を軽減するための医薬の製造のための、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項18】
前記ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患または状態が疼痛である、請求項１５～１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項19】
疼痛が慢性疼痛である、請求項１８に記載の使用。
【請求項20】
疼痛が、重度の片頭痛、変形性関節症、子宮内膜症、関節リウマチ、線維筋痛症、背痛、膝痛、および末梢性または中枢性の神経障害性疼痛に関連するものである、請求項１５、１８～１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項21】
前記ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患または状態の治療が、食欲不振、癌の治療における化学療法によって引き起こされる嘔吐、緑内障、多発性硬化症患者における痙縮、および運動障害（特に、ハンチントン病、ジスキネジアおよびパーキンソン病など）からなる群から選択される疾患または状態の治療である、請求項１５に記載の使用。
【請求項22】
前記治療または予防が、ＣＢ１受容体アゴニストによって引き起こされる記憶障害および／または不安変化を軽減することも可能である、請求項１５～１６、１８～２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項23】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩をＣＢ１受容体アゴニストと組み合わせてヒトを含む動物に投与することにより、当該動物において、ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患を治療または予防する方法。
【請求項24】
前記ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患または状態が、重度の片頭痛、変形性関節症、子宮内膜症、関節リウマチ、線維筋痛症、背痛、膝痛、末梢性または中枢性の神経障害性疼痛に関連する疼痛からなる群から選択されるものであり、食欲促進治療、化学療法時の制吐薬としての、緑内障の治療のための、多発性硬化症患者における痙縮の治療における、および運動障害（特に、ジスキネジアおよびパーキンソン病など）の治療における、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩をＣＢ１受容体アゴニストと組み合わせて前記動物に投与することにより、ＣＢ１受容体アゴニストによって引き起こされる記憶障害および／または不安変化を軽減するための方法。
【請求項26】
前記ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患または状態が疼痛である、請求項２３～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
疼痛が慢性疼痛である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
疼痛が、重度の片頭痛、変形性関節症、子宮内膜症、関節リウマチ、線維筋痛症、背痛、膝痛、および末梢性または中枢性の神経障害性疼痛に関連するものである、請求項２４、２６～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患または状態の治療が、食欲不振、癌の前記治療における化学療法によって引き起こされる嘔吐、緑内障、多発性硬化症患者における痙縮、および運動障害（特に、ハンチントン病、ジスキネジアおよびパーキンソン病など）からなる群から選択される疾患または状態の治療である、請求項２３に記載の方法。
【請求項30】
前記治療または予防が、ＣＢ１受容体アゴニストによって引き起こされる記憶障害および／または不安変化を軽減することも可能である、請求項２３～２４、２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＢ１受容体アゴニストによる薬理学的治療の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
ヨーロッパ人のほぼ５人に１人が慢性疼痛に罹患しており、仕事、社会生活および家庭生活に影響を及ぼし、毎年５億日近くの労働損失が発生し、ヨーロッパ経済に少なくとも３４０億ユーロの損失を与えている。鎮痛薬市場は、２０１９年までに１，０００億ユーロに拡大すると予想されており、望ましくない副作用を回避しながら慢性患者の疼痛を効率的に軽減することができる新規補完薬の必要性が強調されている。
【0003】
大麻の主要な精神活性成分であるΔ９－テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）などのＣＢ１受容体アゴニストまたは部分アゴニストによる、カンナビノイドＣＢ１受容体（ＣＢ１Ｒ）の活性化は、重度の片頭痛、変形性関節症、子宮内膜症、関節リウマチ、線維筋痛症、背痛、膝痛、末梢性または中枢性の神経障害性疼痛に関連する疼痛などの疼痛の治療および／または予防、食欲促進治療、癌治療における化学療法時の制吐薬、緑内障の治療、多発性硬化症患者における痙縮の治療、および運動障害（特に、ジスキネジア、ハンチントン病およびパーキンソン病など）の治療を含む治療目的で、非常に興味深い薬理反応を生じる（Ｋａｎｄａｓａｍｙ Ｒ他、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１８年１月５日；８１８：２７１～２７７；Ｂａｒｏｎ ＥＰ他、Ｈｅａｄａｃｈｅ Ｐａｉｎ．２０１８年５月２４日；１９（１）：３７；Ｒｕｓｓｏ ＥＢ他、Ｃａｎｎａｂｉｓ Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ Ｒｅｓ．２０１６年７月１日；１（１）：１５４～１６５；Ｍｉｌｌｅｒ Ｓ他、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１８年１２月３日；５９（１５）：５９０４～５９１１；Ｅｓｃｕｄｅｒｏ－Ｌａｒａ Ａ他、国際疼痛学会（ＩＡＳＰ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐａｉｎ）第７回世界疼痛学会（７ｔｈ Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｐａｉｎ）、ボストン、米国、１２～１６ ２０１８年９月、要約ＩＤ：４７１１００；Ｌａ Ｐｏｒｔａ Ｃ他、Ｐａｉｎ．２０１５年１０月；１５６（１０）：２００１～１２；Ｍａｌｄｏｎａｄｏ Ｒ．他、Ｐａｉｎ．２０１６年２月；１５７補遺１：Ｓ２３～３２；Ｅｎｇｅｌｉ Ｓ．，Ｈａｎｄｂ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２；（２０９）：３５７～８１；Ａｌ－Ｇｈｅｚｉ ＺＺ他、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９年８月２１日；１０：１９２１；Ａｌｌｅｎ Ｄ他，Ｃｌｉｎ Ｊ Ｏｎｃｏｌ Ｎｕｒｓ．２０１９年２月１日；２３（１）：２３～２６；Ｂｕｈｍａｎｎ Ｃ他、Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ（ウイーン）２０１９年７月；１２６（７）：９１３～９２４；Ｖａｌｄｅｏｌｉｖａｓ Ｓ他、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１７年３月２３日；１８（４）；Ｄｏｎｏｖａｎ ＫＡ他、Ｊ Ａｄｏｌｅｓｃ Ｙｏｕｎｇ Ａｄｕｌｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１９年８月２２日［印刷前の電子出版］を参照）。
【0004】
しかしながら、このＣＢ１Ｒ活性化は、記憶障害、および不安変化（ａｎｘｉｅｔｙ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）などの他の精神活性反応、および、治療薬としてのカンナビノイドの使用にとって重大な欠点となる、大麻使用者に深刻な結果を招く社会的相互作用の障害などの様々な負の作用に関連している。
【0005】
このため、ＴＨＣおよび他のＣＢ１受容体アゴニストの有益な作用を利用することに、医学的に大きな関心が寄せられている。
【0006】
５－ＨＴ２Ａ受容体（５－ＨＴ２ＡＲ）欠損マウスを用いて行われた行動学的研究により、ＴＨＣの有益な抗侵害受容作用とその有害な健忘特性における顕著な５－ＨＴ２ＡＲ依存性解離が明らかになった。記憶障害、不安変化、および社会的相互作用などのＴＨＣの特定の作用は５－ＨＴ２ＡＲの制御下にあるが、ＴＨＣの急性自発運動抑制作用、体温低下作用、不安惹起作用、および抗侵害受容作用は５－ＨＴ２ＡＲの制御下にないことが報告されている（Ｖｉｎａｌｓ Ｘ．他；ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２０１５年７月９日；１３（７）：ｅ１００２１９４）。
【0007】
ＣＢ１Ｒと５－ＨＴ２ＡＲが、記憶障害に関与する特定の脳領域で発現され機能的に活性であるヘテロマーを形成すること、および、そのヘテロマー形成を妨害することが、ＴＨＣなどのＣＢ１Ｒアゴニストへの曝露によって引き起こされる記憶障害および他の望ましくない副作用の選択的な抑止につながる貴重な戦略であることが示されている（Ｖｉｎａｌｓ Ｘ．他；ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２０１５年７月９日；１３（７）：ｅ１００２１９４）。
【0008】
また、ＣＢ１受容体の膜貫通ヘリックス５および６の配列を有する合成ペプチドを細胞透過性ペプチドと融合させたものが、インビボで５－ＨＴ２ＡＲとの受容体ヘテロマー化（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を妨害できることも開示されている。
【0009】
この度、本発明者らは、以前から知られているペプチドよりも効率的に、カンナビノイド受容体ＣＢ１Ｒとセロトニン受容体５ＨＴ２ＡＲによって形成されるヘテロマーを妨害することができるだけでなく、より高い加水分解安定性を有し、血液脳関門を効率的に通過することができる新規合成ペプチドを発見した。
【発明の概要】
【0010】
第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物
ＡＡ１－ＡＡ２－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｔｙｒ－ＡＡ３－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２
（Ｉ）
（式中、
ＡＡ１は、Ｄ－トリプトファン（Ｄ－Ｔｒｐ）、１－ナフチルアラニン（Ｄ－１－Ｎａｌ）および２－ナフチルアラニン（Ｄ－２－Ｎａｌ）からなる群から選択されるアミノ酸を表し；
ＡＡ２は、Ｄ－ロイシン（Ｄ－Ｌｅｕ）、Ｄ－ノルロイシン（Ｄ－Ｎｌｅ）およびＤ－フェニルアラニン（Ｄ－Ｐｈｅ）からなる群から選択されるアミノ酸を表し；
ＡＡ３は、Ｄ－メチオニン（Ｄ－Ｍｅｔ）およびＤ－ノルロイシン（Ｄ－Ｎｌｅ）からなる群から選択されるアミノ酸を表す）、
またはその薬学的に許容される塩の提供に関する。
ＡＡ１－ＡＡ２－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｔｙｒ－ＡＡ３－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２
（Ｉ）
（式中、
ＡＡ１は、Ｄ－トリプトファン（Ｄ－Ｔｒｐ）、１－ナフチルアラニン（Ｄ－１－Ｎａｌ）および２－ナフチルアラニン（Ｄ－２－Ｎａｌ）からなる群から選択されるアミノ酸を表し；
ＡＡ２は、Ｄ－ロイシン（Ｄ－Ｌｅｕ）、Ｄ－ノルロイシン（Ｄ－Ｎｌｅ）およびＤ－フェニルアラニン（Ｄ－Ｐｈｅ）からなる群から選択されるアミノ酸を表し；
ＡＡ３は、Ｄ－メチオニン（Ｄ－Ｍｅｔ）およびＤ－ノルロイシン（Ｄ－Ｎｌｅ）からなる群から選択されるアミノ酸を表す）、
またはその薬学的に許容される塩の提供に関する。
【0011】
特定の実施形態において、ＡＡ１はＤ－トリプトファン（Ｄ－Ｔｒｐ）を表す。
【0012】
特定の実施形態において、ＡＡ２はＤ－ロイシン（Ｄ－Ｌｅｕ）を表す。
【0013】
特定の実施形態において、ＡＡ３はＤ－チロシン（Ｄ－Ｔｙｒ）を表す。
【0014】
特定の実施形態において、化合物は、
Ｄ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｍｅｔ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ
またはその薬学的に許容される塩
からなる群から選択される。
Ｄ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｍｅｔ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ
またはその薬学的に許容される塩
からなる群から選択される。
【0015】
第２の態様において、本発明は、治療有効量の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物または獣医用組成物に関する。本発明の文脈における薬学は、ヒト医学および獣医学の両方に関する。
【0016】
第３の態様において、本発明は、ＣＢ１受容体アゴニストと組み合わせて、医薬として使用するための、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩に関する。
【0017】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＢ１受容体のアゴニストと組み合わせて、ヒトを含む動物におけるＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患の治療または予防に使用するための、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩に関する。
【0018】
特定の実施形態において、ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患は、重度の片頭痛、変形性関節症、子宮内膜症、関節リウマチ、線維筋痛症、背痛、膝痛、末梢性または中枢性の神経障害性疼痛、食欲促進治療、化学療法時の制吐薬、緑内障の治療、多発性硬化症患者における痙縮の治療、および運動障害（特に、ジスキネジアおよびパーキンソン病など）の治療に関連する疼痛からなる群から選択される。
【0019】
特定の実施形態において、治療および／または予防は、ＣＢ１受容体アゴニストによって引き起こされる記憶障害および／または不安変化を軽減することができる。
【0020】
第４の態様において、本発明は、ＣＢ１受容体アゴニストで治療される患者において、ＣＢ１受容体アゴニストの副作用、例えば、記憶障害、不安変化などの他の精神活性反応、および社会的相互作用の障害などを軽減するのに用いるための、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩に関する。患者とは、ＣＢ１受容体アゴニストの投与によって改善されやすい疾患、特に疼痛、重度の片頭痛、変形性関節症、子宮内膜症、関節リウマチ、線維筋痛症、腰痛、膝痛、末梢性または中枢性の神経障害性疼痛、食欲促進治療、化学療法時の制吐薬、緑内障の治療、多発性硬化症患者における痙縮の治療、および運動障害（特に、ジスキネジアおよびパーキンソン病など）の治療に関連する疼痛に罹患している哺乳動物、特に、ヒトとみなされる。
【0021】
本発明の第３、第４、第５および第６の態様の特定の実施形態において、ＣＢ１受容体アゴニストは、完全アゴニストまたは部分アゴニストのいずれかである。
【0022】
本発明の第３、第４、第５および第６の態様のより特定の実施形態において、ＣＢ１受容体アゴニストは、２－アラキドノイルグリセロール（２－ＡＧ）、２－アラキドニルグリセリルエーテル（２－ＡＧＥ、ノラジンエーテル）、アナンダミド（Ｎ－アラキドノイルエタノールアミンまたはＡＥＡ）、Ｎ－アラキドノイルドーパミン、パルミトイルエタノールアミド（ＰＥＡ）などの哺乳動物体内で産生される内在性カンナビノイド；１１－ヒドロキシ－Δ８－テトラヒドロカンナビノール、１１－ヒドロキシ－Δ９－テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール、Δ８－テトラヒドロカンナビノール、Δ９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＴＨＣまたはΔ９－ＴＨＣ）などの植物カンナビノイド、およびＡＭ－２２０１（１－（５－フルオロペンチル）－３－（１－ナフトイル）インドール）、ＡＭ－６７８（１－ペンチル－３－（１－ナフトイル）インドール）、アラキドニル－２’－クロロエチルアミド（ＡＣＥＡ）、ＣＰ５５，９４０（［（－）－シス－３－［２－ヒドロキシ－４－（１，１－ジメチルヘプチル）フェニル］－トランス－４－（３－ヒドロキシプロピル）－シクロヘキサノール］）、ＨＵ－２１０、ＪＷＨ－０１８（１－ペンチル－３－（１－ナフトイル）インドール）、ＪＷＨ－０７３、リノレイルエタノールアミド、レボナントラドール（ＣＰ５０，５５６－１）、ナビロン、ナビキシモルスおよびＷＩＮ５５，２１２－２などの合成カンナビノイドからなる群から選択され、特に、植物由来カンナビノイドＴＨＣである。
【0023】
すなわち、本発明は、式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物または獣医用組成物をヒトを含む動物に投与することにより、当該動物において、ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患を治療または予防する方法に関する。前述の特定の疾患および障害の治療のための方法は、本発明の特定の実施形態である。
【0024】
第５の態様において、本発明は、ヒトを含む動物におけるＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患の治療または予防のための医薬を製造するために、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩をＣＢ１受容体アゴニストと組み合わせて使用することに関する。
【0025】
特定の実施形態において、治療および／または予防は、ＣＢ１受容体アゴニストによって引き起こされる記憶障害および／または不安変化を軽減することができる。
【0026】
第６の態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩をＣＢ１受容体アゴニストと組み合わせてヒトを含む動物に投与することにより、当該動物において、ＣＢ１受容体のアゴニズムによって改善されやすい疾患を治療または予防する方法に関する。
【0027】
特定の実施形態において、治療および／または予防は、ＣＢ１受容体アゴニストによって引き起こされる記憶障害および／または不安変化を軽減することができる。
【0028】
本発明の第５の態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、以下の工程：
ａ）ペプチドの一部を形成するアミノ酸（Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｄ－Ｉｌｅ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｍｅｔ、Ｄ－１－Ｎａｌ、Ｄ－２－Ｎａｌ、Ｄ－Ｎｌｅ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｔｒｐ、Ｄ－Ｔｙｒ、Ｄ－Ｖａｌ）を供給する工程、
ｂ）アミノ酸Ｄ－ＬｙｓおよびＤ－ＴｒｐをＢｏｃで保護する工程、
ｃ）アミノ酸Ｄ－Ａｒｇを２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニルで保護する工程、
ｄ）アミノ酸Ｄ－Ｔｈｒをｔ－ブチルで保護する工程、
ｅ）ＤＭＦを溶剤として、過剰の２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）および過剰のＤＩＥＡの存在下で過剰のＦｍｏｃ－アミノ酸とのカップリングを行うＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－アミド樹脂において、アミノ酸および保護アミノ酸を組み立てる工程、
ｆ）好ましくはＣＦ３ＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）／トリイソプロピルシランを用いて、ペプチドの保護された側鎖およびペプチドを樹脂（ｒｅｓｉｎｇ）から切断する工程
を含む方法によって調製され得る。
ａ）ペプチドの一部を形成するアミノ酸（Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｄ－Ｉｌｅ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｍｅｔ、Ｄ－１－Ｎａｌ、Ｄ－２－Ｎａｌ、Ｄ－Ｎｌｅ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｔｒｐ、Ｄ－Ｔｙｒ、Ｄ－Ｖａｌ）を供給する工程、
ｂ）アミノ酸Ｄ－ＬｙｓおよびＤ－ＴｒｐをＢｏｃで保護する工程、
ｃ）アミノ酸Ｄ－Ａｒｇを２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニルで保護する工程、
ｄ）アミノ酸Ｄ－Ｔｈｒをｔ－ブチルで保護する工程、
ｅ）ＤＭＦを溶剤として、過剰の２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）および過剰のＤＩＥＡの存在下で過剰のＦｍｏｃ－アミノ酸とのカップリングを行うＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－アミド樹脂において、アミノ酸および保護アミノ酸を組み立てる工程、
ｆ）好ましくはＣＦ３ＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）／トリイソプロピルシランを用いて、ペプチドの保護された側鎖およびペプチドを樹脂（ｒｅｓｉｎｇ）から切断する工程
を含む方法によって調製され得る。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【発明を実施するための形態】
【0030】
本明細書で用いられる場合、「ＣＢ１受容体アゴニストと組み合わせた式（Ｉ）の化合物」とは、１つの投与単位形態中の式（Ｉ）の化合物とＣＢ１受容体アゴニストとの固定された組み合わせか、または組み合わせ投与（ここで、式（Ｉ）の化合物とＣＢ１受容体アゴニストは、同時に独立して投与されてもよく、またはＣＢ１受容体アゴニストの有害作用の軽減を特に可能にする時間間隔内で別々に投与されてもよい）のための式（Ｉ）の化合物を含む第１の組成物およびＣＢ１受容体アゴニストを含む第２の組成物を含むキットオブパーツのいずれか、あるいはそれらの任意の組み合わせを意味する。
【0031】
本明細書で用いられる場合、「ＣＢ１受容体アゴニスト」という表現は、ＣＢ１カンナビノイド受容体を活性化することができる化合物を指し、リガンド、例えば２－アラキドノイルグリセロール（２－ＡＧ）、２－アラキドニルグリセリルエーテル（２－ＡＧＥ、ノラジンエーテル）、アナンダミド（Ｎ－アラキドノイルエタノールアミンまたはＡＥＡ）、Ｎ－アラキドノイルドーパミン、パルミトイルエタノールアミド（ＰＥＡ）などの哺乳動物体内で産生される内在性カンナビノイド；１１－ヒドロキシ－Δ８－テトラヒドロカンナビノール、１１－ヒドロキシ－Δ９－テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール、Δ８－テトラヒドロカンナビノール、Δ９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＴＨＣまたはΔ９－ＴＨＣ）などの植物カンナビノイド、およびＡＭ－２２０１（１－（５－フルオロペンチル）－３－（１－ナフトイル）インドール）、ＡＭ－６７８（１－ペンチル－３－（１－ナフトイル）インドール）、アラキドニル－２’－クロロエチルアミド（ＡＣＥＡ）、ＣＰ５５，９４０（［（－）－シス－３－［２－ヒドロキシ－４－（１，１－ジメチルヘプチル）フェニル］－トランス－４－（３－ヒドロキシプロピル）－シクロヘキサノール］）、ＨＵ－２１０、ＪＷＨ－０１８（１－ペンチル－３－（１－ナフトイル）インドール）、ＪＷＨ－０７３、リノレイルエタノールアミド、レボナントラドール（ＣＰ５０，５５６－１）、ナビロン、ナビキシモルスおよびＷＩＮ５５，２１２－２などの合成カンナビノイドが含まれる。
【0032】
好ましい実施形態において、ＣＢ１カンナビノイド受容体アゴニストは、Δ９－テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）である。
【0033】
本明細書で用いられる場合、本明細書で用いられる「薬学的に許容される」という表現は、健全な医学的判断の範囲内で、著しい毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を伴うことなく対象（例えば、ヒト）の組織と接触させて使用するのに適しており、合理的な利益／リスク比に見合う化合物、材料、組成物、および／または剤形に関する。各担体、賦形剤などもまた、医薬組成物の他の成分と適合性であるという意味で「許容される」ものでなければならない。また、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題または合併症を伴うことなくヒトおよび動物の組織または器官と接触させて使用するのに適しており、合理的な利益／リスク比に見合うものでなければならない。適切な担体、賦形剤などは、標準的な医薬テキストに記載されており、例えば、防腐剤、凝着剤、湿潤剤、皮膚軟化剤、および抗酸化剤が挙げられる。
【0034】
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される塩」という表現は、患者への投与に際して、本明細書中に記載される化合物を（直接的または間接的に）提供することができる任意の塩を指す。例えば、本明細書で提供される化合物の薬学的に許容される塩は、塩基性部分または酸性部分を含む親化合物から、従来の化学的方法によって合成される。一般に、そのような塩は、例えば、これらの化合物の遊離酸形態または塩基形態を、水中または有機溶媒中または両方の混合物中で、化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製される。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、２－プロパノールまたはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。酸付加塩の例としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの鉱酸付加塩、および、例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩およびｐ－トルエンスルホン酸塩などの有機酸付加塩が挙げられる。アルカリ付加塩の例としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩およびアンモニウム塩などの無機塩、および、例えば、エチレンジアミン塩、エタノールアミン塩、Ｎ，Ｎ－ジアルキレンエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩および塩基性アミノ酸塩などの有機アルカリ塩が挙げられる。
【0035】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの単語の変化形は、他の技術的特徴、付加物、構成要素、または工程を除外することを意図するものではない。さらに、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の場合を包含する。
【0036】
ペプチド合成
本発明によるペプチドおよび参考例のペプチドの合成は、従来のペプチド合成方法によって実施され得る。
本発明によるペプチドおよび参考例のペプチドの合成は、従来のペプチド合成方法によって実施され得る。
【0037】
次の段落に記載されているプロセスは、実施例に記載されているペプチドの調製に実際に使用されたものであり、本発明による任意のペプチドを調製するために使用され得る。
【0038】
ペプチドは、最適化されたＦｍｏｃ合成プロトコルを実行するＰｒｅｌｕｄｅ装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）中の５０μｍｏｌ（０．１０６ｇ；０．４７ｍｍｏｌ／ｇ）のＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋ－アミドＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂上で組み立てた。側鎖保護は、Ｂｏｃ（Ｄ－Ｌｙｓ、ＴｒｐおよびＤ－Ｔｒｐの保護に使用）、２，２，４，６，７ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル（Ｄ－Ａｒｇの保護に使用）、およびｔ－ブチル（Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒおよびＤ－Ｔｙｒの保護に使用）であった。ＤＭＦを溶媒として用い、５＋５分間、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ、５倍過剰）およびＤＩＥＡ（１０倍過剰）の存在下、５倍過剰のＦｍｏｃ－アミノ酸でダブルカップリングを系統的に行った。
【0039】
脱保護および開裂カクテルは、ＣＦ３ＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）／トリイソプロピルシラン（９４：２．５：２．５：１ｖ／ｖ、９０分）であった。合成生成物を、冷却したジエチルエーテルで沈殿させることによって単離し、４℃で３×１０分間遠心分離し、Ｈ２Ｏ中に溶解し、凍結乾燥させた。
【0040】
ペプチド分析および精製
以下のプロトコルを用いて、本願に記載されたペプチドを精製および分析した。
以下のプロトコルを用いて、本願に記載されたペプチドを精製および分析した。
【0041】
凍結乾燥した粗ペプチドを、直接的な方法（ＨＯＡｃで酸性化したＨ２Ｏ）で再構成した。粗ペプチドを、ＬＣ－２０ＡＤシステム（島津製作所、京都、日本）中のＬｕｎａ Ｃ１８カラム（４．６×５０ｍｍ、３μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、カリフォリニア州、米国）でのＨＰＬＣにより分析した。１５分間にわたる溶剤Ａ（Ｈ２Ｏ中０．０４５ｖ／ｖ％のＴＦＡ）中への溶剤Ｂ（ＣＨ３ＣＮ中０．０３６ｖ／ｖ％のＴＦＡ）の直線勾配で溶出した。ペプチドを、３０分間にわたる溶剤Ａ（Ｈ２Ｏ中０．１ｖ／ｖ％のＴＦＡ）中への溶剤Ｂ（ＣＨ３ＣＮ中０．１ｖ／ｖ％のＴＦＡ）の直線勾配を用い、７ｍＬ／分の流速で、２２０ｎｍでのＵＶ検出を行いながら、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－８Ａ装置中のＬｕｎａ Ｃ１８（１０×２５０ｍｍ、１０μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）カラムでの分取ＨＰＬＣにより精製した。分析用ＨＰＬＣによる十分な純度（＞９５％）の画分をプールし、凍結乾燥し、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－ＭＳ２０１０ＥＶ装置中のＣ１８（４．６×１５０ｍｍカラム、３．５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で、流速１ｍＬ／分で１５分間にわたる溶剤Ａ（Ｈ２Ｏ中０．１ｖ／ｖ％のＴＦＡ）中への溶剤Ｂ（ＣＨ３ＣＮ中０．０８ｖ／ｖ％のＨＣＯＯＨ）の直線勾配で溶出を行うＨＰＬＣ－ＭＳによって同一性を再分析した。
【0042】
略語：
本願では、以下の略語を使用している：
Ａｌａ：Ｌ－アラニン
Ｄ－Ａｌａ：Ｄ－アラニン
Ｄ－Ａｒｇ：Ｄ－アルギニン
Ｇｌｕ：Ｌ－グルタミン酸
Ｇｌｙ：グリシン
Ｉｌｅ：Ｌ－イソロイシン
Ｄ－Ｉｌｅ：Ｄ－イソロイシン
Ｌｅｕ：Ｌ－ロイシン
Ｄ－Ｌｅｕ：Ｄ－ロイシン
Ｄ－Ｌｙｓ：Ｄ－リジン
Ｍｅｔ：Ｌ－メチオニン
Ｄ－Ｍｅｔ：Ｄ－メチオニン
Ｄ－１－Ｎａｌ：１－ナフチルアラニン（（２Ｒ）－２－アミノ－３－ナフタレン－１－イルプロパン酸）
Ｄ－２－Ｎａｌ：２－ナフチルアラニン（（２Ｒ）－２－アミノ－３－ナフタレン－２－イルプロパン酸）
Ｄ－Ｎｌｅ：Ｄ－ノルロイシン
Ｐｈｅ：Ｌ－フェニルアラニン
Ｄ－Ｐｈｅ：Ｄ－フェニルアラニン
Ｓｅｒ：Ｌ－セリン
Ｔｈｒ：Ｌ－スレオニン
Ｔｒｐ：Ｌ－トリプトファン
Ｄ－Ｔｒｐ：Ｄ－トリプトファン
Ｔｙｒ：Ｌ－チロシン
Ｄ－Ｔｙｒ：Ｄ－チロシン
Ｖａｌ：Ｌ－バリン
Ｄ－Ｖａｌ：Ｄ－バリン
ＣＦ：下記式の５（６）－カルボキシフルオレセインの残基：
－Ｌｙｓ（ＣＦ）－ＮＨ２：下記式の残基：
－Ｄ－Ｌｙｓ（ＣＦ）－ＮＨ２：下記式の残基：
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ
本願では、以下の略語を使用している：
Ａｌａ：Ｌ－アラニン
Ｄ－Ａｌａ：Ｄ－アラニン
Ｄ－Ａｒｇ：Ｄ－アルギニン
Ｇｌｕ：Ｌ－グルタミン酸
Ｇｌｙ：グリシン
Ｉｌｅ：Ｌ－イソロイシン
Ｄ－Ｉｌｅ：Ｄ－イソロイシン
Ｌｅｕ：Ｌ－ロイシン
Ｄ－Ｌｅｕ：Ｄ－ロイシン
Ｄ－Ｌｙｓ：Ｄ－リジン
Ｍｅｔ：Ｌ－メチオニン
Ｄ－Ｍｅｔ：Ｄ－メチオニン
Ｄ－１－Ｎａｌ：１－ナフチルアラニン（（２Ｒ）－２－アミノ－３－ナフタレン－１－イルプロパン酸）
Ｄ－２－Ｎａｌ：２－ナフチルアラニン（（２Ｒ）－２－アミノ－３－ナフタレン－２－イルプロパン酸）
Ｄ－Ｎｌｅ：Ｄ－ノルロイシン
Ｐｈｅ：Ｌ－フェニルアラニン
Ｄ－Ｐｈｅ：Ｄ－フェニルアラニン
Ｓｅｒ：Ｌ－セリン
Ｔｈｒ：Ｌ－スレオニン
Ｔｒｐ：Ｌ－トリプトファン
Ｄ－Ｔｒｐ：Ｄ－トリプトファン
Ｔｙｒ：Ｌ－チロシン
Ｄ－Ｔｙｒ：Ｄ－チロシン
Ｖａｌ：Ｌ－バリン
Ｄ－Ｖａｌ：Ｄ－バリン
ＣＦ：下記式の５（６）－カルボキシフルオレセインの残基：
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【実施例】
【0043】
参考例１：
式Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｍｅｔ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＮＨ２（配列番号１－ＮＨ２）のペプチドを、上記で説明した一般的な合成方法を用いて調製した。
式Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｍｅｔ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＮＨ２（配列番号１－ＮＨ２）のペプチドを、上記で説明した一般的な合成方法を用いて調製した。
【0044】
このペプチドは、カンナビノイド受容体１の膜貫通領域５（ＴＭ５）が細胞透過性ペプチド配列Ｔａｔ（Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ）（配列番号２）と結合したものに相当する。
【0045】
ＨＰＬＣ：ｔＲ８．１０分（１５分間にわたるＡ中へのＢの４０～９０％直線勾配）。ＥＳＩ－ＭＳ；ｍ／ｚ１５７６．４５［Ｍ＋３Ｈ］＋３、１１８２．６５［Ｍ＋４Ｈ］＋４、９４６．３０［Ｍ＋５Ｈ］＋５、７８８．７０［Ｍ＋６Ｈ］＋６、６７６．２０［Ｍ＋７Ｈ］＋７、５９１．７５［Ｍ＋８Ｈ］＋８（ＭＷ計算値：４７２７．７６）。
【0046】
参考例２：
式Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｍｅｔ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２のペプチドを、上記で説明した一般的な合成方法を用いて調製した。
式Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｍｅｔ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２のペプチドを、上記で説明した一般的な合成方法を用いて調製した。
【0047】
このペプチドは、ＴＭ５の１９～２７番目のアミノ酸の部分配列が細胞透過性ペプチド配列Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２と結合したものに由来する。
【0048】
ＨＰＬＣ：ｔＲ５．２４分（１５分間にわたるＡ中へのＢの３０～６０％直線勾配）。ＥＳＩ－ＭＳ；ｍ／ｚ：１０２３．６０［Ｍ＋２Ｈ］＋２、６８２．７５［Ｍ＋３Ｈ］＋３、５１１．２０［Ｍ＋４Ｈ］＋４、４１１．９０［Ｍ＋５Ｈ］＋５、３４０．９０［Ｍ＋６Ｈ］＋６、２９２．００［Ｍ＋７Ｈ］＋７（ＭＷ計算値：２０４５．５２）。
【0049】
参考例３：
上記で説明した一般的な合成方法を用いた、式Ｄ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｍｅｔ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２のペプチド。
上記で説明した一般的な合成方法を用いた、式Ｄ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｍｅｔ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２のペプチド。
【0050】
このペプチドは、ＴＭ５の２３～２７番目のアミノ酸の部分配列のレトロエナンチオ型（ｒｅｔｒｏｅｎａｎｔｉｏ ｖｅｒｓｉｏｎ）（Ｄ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｍｅｔ）が細胞透過性ペプチド配列Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２と結合したものに由来する。ペプチド配列のレトロエナンチオ型とは、すべてのアミノ酸がそのＤ－エナンチオマーで置換され、配列中のアミノ酸の順序が逆転している新しいペプチド配列と理解される。
【0051】
ＨＰＬＣ：ｔＲ６．３３分（１５分間にわたるＡ中へのＢの２０～６０％直線勾配）。ＥＳＩ－ＭＳ；ｍ／ｚ：１５４９．７０［Ｍ＋１Ｈ］＋１、７７５．４５［Ｍ＋２Ｈ］＋２、５１７．３５［Ｍ＋３Ｈ］＋３、３８９．９５［Ｍ＋４Ｈ］＋４（ＭＷ計算値：１５４８．９６）。
【0052】
実施例１：
上記で説明した一般的な合成方法を用いた、式Ｄ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｍｅｔ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２のペプチド。
上記で説明した一般的な合成方法を用いた、式Ｄ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｍｅｔ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２のペプチド。
【0053】
このペプチドは、ＴＭ５の１９～２７番目のアミノ酸の部分配列のレトロエナンチオ型（Ｄ－Ｔｒｐ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｍｅｔ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｄ－Ｖａｌ）が細胞透過性ペプチド配列Ｄ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｄ－Ｉｌｅ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｔｒｐ－ＮＨ２と結合したものに由来する。ペプチド配列のレトロエナンチオ型とは、すべてのアミノ酸がそのＤ－エナンチオマーで置換され、配列中のアミノ酸の順序が逆転している新しいペプチド配列と理解される。
【0054】
ＨＰＬＣ：ｔＲ７．１０分（１５分間にわたるＡ中へのＢの３０～６０％直線勾配）。ＥＳＩ－ＭＳ；ｍ／ｚ：１０２３．９０［Ｍ＋２Ｈ］＋２、６８２．７０［Ｍ＋３Ｈ］＋３、５１２．８５［Ｍ＋４Ｈ］＋４、４０９．９０［Ｍ＋５Ｈ］＋５、３４０．９５［Ｍ＋６Ｈ］＋６、２９３．００［Ｍ＋７Ｈ］＋７（ＭＷ計算値：２０４５．５２）。
【0055】
実施例２：
実施例１のペプチドは、そのカルボキシ末端に－Ｌｙｓ（ＣＦ）－ＮＨ２残基を結合することにより標識されている。
実施例１のペプチドは、そのカルボキシ末端に－Ｌｙｓ（ＣＦ）－ＮＨ２残基を結合することにより標識されている。
【0056】
ペプチドのカルボキシ末端への標識（５（６）－カルボキシフルオレセインの組み込み）は、ペプチド配列にさらなる標識リジンを付加することによって行った。そのために、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨを使用した。
【0057】
上記化合物では、リジンの側鎖はメチルトリチル（Ｍｔｔ）保護基で保護されており、これは樹脂中において１％ＴＦＡの存在下で選択的に脱保護することができる（この条件下では、他のすべての側鎖保護基は安定である）。
【0058】
上記化合物を標識対象ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸と縮合させた後、メチルトリチルを除去し、「余分な」リジン側鎖のε－ＮＨ２基を５（６）－カルボキシフルオレセインの－ＣＯＯＨ基と反応させて、標識ペプチドを得る。最後にカルボキシ末端基をアミド化する。
【0059】
このわずかに修飾を加えたペプチドを用いて、このペプチドのインビトロＢＢＢトランスロケーションおよび細胞内移行を評価した。
【0060】
試験方法
Ａ．トリプシン消化
トリプシンの作用に対するペプチドの安定性は、以下に記載する方法で試験した。
Ａ．トリプシン消化
トリプシンの作用に対するペプチドの安定性は、以下に記載する方法で試験した。
【0061】
１０００μｇ／１０００μＬのトリプシン溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、凍結乾燥酵素を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁して調製した。同じ緩衝液に溶解したペプチド（１μｇ／μＬ）を、トリプシンと共に（ペプチド：トリプシン比＝１００：１）、３７℃で２４時間インキュベートした。試料を様々な時点で採取し、Ｈ２Ｏ中０．５％ギ酸を２０％（ｖ／ｖ）添加することによって消化を停止させた。試料は逆相ＨＰＬＣ－ＭＳで分析するまで－２０℃で保存した。実験は２連で行い、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍに適合させた。
【0062】
Ｂ．ｂＥｎｄ．３細胞培養
ｂＥｎｄ．３脳内皮腫細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２９９（商標））は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質溶液を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（商標）、米国）中で７５ｃｍ２Ｔフラスコ上の単層として増殖させた。細胞は、９５％大気と５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で培養し（ＭＣＯ－１８ＡＩＣ（ＵＶ）、三洋電機、日本）、１日おきに培地を交換した。細胞は、コンフルエントになった時点でトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（商標）、米国）を用いて細胞培養用Ｔフラスコから収集し、種々のアッセイ（細胞増殖、インビトロＢＢＢトランスロケーション、およびインビトロ二分子蛍光相補性）に使用した。
ｂＥｎｄ．３脳内皮腫細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２９９（商標））は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質溶液を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（商標）、米国）中で７５ｃｍ２Ｔフラスコ上の単層として増殖させた。細胞は、９５％大気と５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で培養し（ＭＣＯ－１８ＡＩＣ（ＵＶ）、三洋電機、日本）、１日おきに培地を交換した。細胞は、コンフルエントになった時点でトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（商標）、米国）を用いて細胞培養用Ｔフラスコから収集し、種々のアッセイ（細胞増殖、インビトロＢＢＢトランスロケーション、およびインビトロ二分子蛍光相補性）に使用した。
【0063】
Ｃ．細胞生存率アッセイ
評価対象化合物のインビトロ細胞毒性を、インビトロＢＢＢモデルと同じ細胞株、すなわちｂＥｎｄ．３細胞を用いて調べ、毒性の可能性を評価する。ｂＥｎｄ．３細胞株は、漸増濃度の化合物に２４時間曝露した。
評価対象化合物のインビトロ細胞毒性を、インビトロＢＢＢモデルと同じ細胞株、すなわちｂＥｎｄ．３細胞を用いて調べ、毒性の可能性を評価する。ｂＥｎｄ．３細胞株は、漸増濃度の化合物に２４時間曝露した。
【0064】
ｂＥｎｄ．３細胞に対するペプチドの細胞毒性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存率アッセイにより、下記のように製造業者の指示に従って試験した。
【0065】
このアッセイは、生存細胞がレサズリンを還元して高蛍光性代謝物であるレゾルフィンにする能力に基づいている。非生存細胞はレゾルフィンを生成することができない。したがって、このアプローチを用いることで、代謝細胞と非代謝細胞を区別し、種々の化合物の細胞毒性を間接的に判定することが可能である。ｂＥｎｄ．３細胞を、１０，０００細胞／１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）上に播種し、２４時間インキュベートした。培地除去後、ＤＭＥＭ培地で予め希釈したペプチド（０．０１～５０μＭの範囲）１００μＬをウェルに添加した。２４時間のインキュベーション後、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で３時間インキュベートした。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ ＴＥＣＡＮプレートリーダーを用いて、λｅｘｃ＝５６０ｎｍおよびλｅｍ＝５９０ｎｍで蛍光強度を測定した。培地および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有培地を、それぞれ陽性対照（細胞生存率１００％）および陰性対照（細胞生存率０％）として使用した。細胞生存率（％）は、以下の方程式で求めた：
（式中、Ｆｐはペプチド処理した細胞の蛍光強度、ＦＮＣは陰性対照の蛍光強度、ＦＰＣは陽性対照の蛍光強度である。）
【数1】
【0066】
実験は、独立に増殖させた細胞培養物を用いて、異なる日に行った。
【0067】
Ｄ．インビトロＢＢＢトランスロケーションアッセイ
ｂＥｎｄ．３細胞を、培養用Ｔフラスコ中でコンフルエンスまで増殖させた。細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（商標）、米国）を用いて注意深く収集し、２４ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、米国）用の１％フィブロネクチンコートした組織培養インサート（１．０μｍ孔の透明ポリエステル（ＰＥＴ）膜）に５，０００細胞／ウェルで播種した。１０日間を通して、２日ごとに培地を交換した。１０日後、細胞を１×ＰＢＳで２回、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）で１回洗浄した。次いで、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭで最終濃度１μＭに希釈したペプチドを、インビトロＢＢＢモデルの頂端側に添加した。実験は、独立に増殖させた細胞培養物を用いて、異なる日に行った。
ｂＥｎｄ．３細胞を、培養用Ｔフラスコ中でコンフルエンスまで増殖させた。細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（商標）、米国）を用いて注意深く収集し、２４ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、米国）用の１％フィブロネクチンコートした組織培養インサート（１．０μｍ孔の透明ポリエステル（ＰＥＴ）膜）に５，０００細胞／ウェルで播種した。１０日間を通して、２日ごとに培地を交換した。１０日後、細胞を１×ＰＢＳで２回、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）で１回洗浄した。次いで、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭで最終濃度１μＭに希釈したペプチドを、インビトロＢＢＢモデルの頂端側に添加した。実験は、独立に増殖させた細胞培養物を用いて、異なる日に行った。
【0068】
５（６）－カルボキシフルオレセイン標識ペプチドのトランスロケーションは、蛍光発光によって判定する。
【0069】
インビトロＢＢＢモデルは、ｂＥｎｄ．３細胞が２つのチャンバーに分かれて増殖するインサート付きのトランスウェルシステムからなる（図１参照）。インサート、すなわち頂端側は血液脳関門の血液側に相当し、側底側（下部チャンバー）は血液脳関門の脳側に相当する。
【0070】
ペプチドのトランスロケーション能力を調べるために、評価対象の５（６）－カルボキシフルオレセイン標識ペプチド１μＭを上述のインビトロＢＢＢモデルの頂端側に添加した。２４時間のインキュベーション後に頂端側容量および側底容量を収集し、これらの試料中の蛍光をプレートリーダーで別々に測定した。細胞内移行パーセンテージは、全蛍光と、頂端側と側底側の蛍光の合計との差として得た。
【0071】
２４時間のインキュベーション後、頂端側および側底側から試料を採取し、分析する。蛍光をｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ ＴＥＣＡＮプレートリーダーを用いて測定した。トランスロケーションのパーセンテージ（％）は、以下の方程式を用いて算出した：
【数2】
【0072】
Ｆｉは回収した蛍光強度であり、Ｆ細胞はペプチドインキュベーションを行わない細胞から回収した蛍光強度であり、Ｆペプチドはトランスウェル頂端側に最初に添加した全ペプチドの蛍光強度である。
【0073】
内皮関門の完全性は、分子量４ｋＤａの蛍光標識デキストラン（ＦＤ）（ＦＤ４）の透過性によって評価する。標識ペプチドの存在下または非存在下での頂端側からの蛍光プローブのクリアランスにより、ＢＢＢの完全性に関する情報が得られる。
【0074】
Ｅ．二分子蛍光相補性によるＣＢ
１
Ｒと５－ＨＴ
２Ａ
Ｒとのヘテロマーを破壊する能力のインビトロ判定
「Ｖｉｎａｌｓ＊ Ｘ，Ｍｏｒｅｎｏ＊ Ｅ，Ｌａｎｆｕｍｅｙ Ｌ，Ｃｏｒｄｏｍｉ Ａ，Ｐａｓｔｏｒ Ａ，ｄｅ Ｌａ Ｔｏｒｒｅ Ｒ，Ｇａｓｐｅｒｉｎｉ Ｐ，Ｎａｖａｒｒｏ Ｇ，Ｈｏｗｅｌｌ ＬＡ，Ｐａｒｄｏ Ｌ，Ｌｌｕｉｓ Ｃ，Ｃａｎｅｌａ ＥＩ，ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ＊ ＰＪ，Ｍａｌｄｏｎａｄｏ＊ Ｒ，Ｒｏｂｌｅｄｏ＊ Ｐ．「Δ９－テトラヒドロカンナビノールにより誘導される認知障害は、カンナビノイドＣＢ１受容体とセロトニン５－ＨＴ２Ａ受容体とのヘテロマーを介して生じる。（Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｄｅｌｔａ９－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎａｂｉｎｏｌ Ｏｃｃｕｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ＣＢ１ ａｎｄ Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ５－ＨＴ２Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）」ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３（７）：ｅ１００２１９４（２０１５）」に記載の方法を、本明細書に記載の若干の修正を加えて使用し、ＣＢ１Ｒと５－ＨＴ２ＡＲとのヘテロマーを破壊するペプチドのインビトロ能力を判定した。
「Ｖｉｎａｌｓ＊ Ｘ，Ｍｏｒｅｎｏ＊ Ｅ，Ｌａｎｆｕｍｅｙ Ｌ，Ｃｏｒｄｏｍｉ Ａ，Ｐａｓｔｏｒ Ａ，ｄｅ Ｌａ Ｔｏｒｒｅ Ｒ，Ｇａｓｐｅｒｉｎｉ Ｐ，Ｎａｖａｒｒｏ Ｇ，Ｈｏｗｅｌｌ ＬＡ，Ｐａｒｄｏ Ｌ，Ｌｌｕｉｓ Ｃ，Ｃａｎｅｌａ ＥＩ，ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ＊ ＰＪ，Ｍａｌｄｏｎａｄｏ＊ Ｒ，Ｒｏｂｌｅｄｏ＊ Ｐ．「Δ９－テトラヒドロカンナビノールにより誘導される認知障害は、カンナビノイドＣＢ１受容体とセロトニン５－ＨＴ２Ａ受容体とのヘテロマーを介して生じる。（Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｄｅｌｔａ９－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎａｂｉｎｏｌ Ｏｃｃｕｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ＣＢ１ ａｎｄ Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ５－ＨＴ２Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）」ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３（７）：ｅ１００２１９４（２０１５）」に記載の方法を、本明細書に記載の若干の修正を加えて使用し、ＣＢ１Ｒと５－ＨＴ２ＡＲとのヘテロマーを破壊するペプチドのインビトロ能力を判定した。
【0075】
発現ベクター
目的の受容体と融合したＹＦＰ Ｖｅｎｕｓ半短縮型タンパク質（５－ＨＴ２ＡＲ－ｃＹＦＰ、ＣＢ１Ｒ－ｎＹＦＰ）を得るために、５－ＨＴ２ＡＲを、ＹＦＰ Ｖｅｎｕｓタンパク質の１５６～２３８番目のアミノ酸残基をコードする配列を含むｐｃＤＮＡ３．１－ｃＶｅｎｕｓの制限酵素部位にインフレームとなるようにサブクローニングした。さらに、ＣＢ１Ｒを、ＹＦＰ Ｖｅｎｕｓタンパク質の１～１５５番目のアミノ酸残基をコードする配列を含むｐｃＤＮＡ３．１－ｎＶｅｎｕｓの制限酵素部位にインフレームとなるようにサブクローニングした。
目的の受容体と融合したＹＦＰ Ｖｅｎｕｓ半短縮型タンパク質（５－ＨＴ２ＡＲ－ｃＹＦＰ、ＣＢ１Ｒ－ｎＹＦＰ）を得るために、５－ＨＴ２ＡＲを、ＹＦＰ Ｖｅｎｕｓタンパク質の１５６～２３８番目のアミノ酸残基をコードする配列を含むｐｃＤＮＡ３．１－ｃＶｅｎｕｓの制限酵素部位にインフレームとなるようにサブクローニングした。さらに、ＣＢ１Ｒを、ＹＦＰ Ｖｅｎｕｓタンパク質の１～１５５番目のアミノ酸残基をコードする配列を含むｐｃＤＮＡ３．１－ｎＶｅｎｕｓの制限酵素部位にインフレームとなるようにサブクローニングした。
【0076】
構築物の発現は共焦点顕微鏡により、受容体融合タンパク質の機能性はＥＲＫ１／２リン酸化により試験した。
【0077】
細胞培養および一過性トランスフェクション
ＡＴＣＣから入手したヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３Ｔ）細胞を、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１／１００）、および５％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた（すべての補充物は、英国、スコットランド、ペイズリーのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製であった）。細胞を５％ＣＯ２の雰囲気中、３７℃で維持した。
ＡＴＣＣから入手したヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３Ｔ）細胞を、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１／１００）、および５％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた（すべての補充物は、英国、スコットランド、ペイズリーのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製であった）。細胞を５％ＣＯ２の雰囲気中、３７℃で維持した。
【0078】
蛍光相補性アッセイ
６ウェルディッシュで増殖中の細胞に、ＹＦＰ Ｖｅｎｕｓ Ｎ末端フラグメント（ｎ－ＹＦＰ）と融合したＣＢ１ＲおよびＹＦＰ Ｖｅｎｕｓ Ｃ末端フラグメント（ｃ－ＹＦＰ）と融合した５－ＨＴ２ＡＲをコードするｃＤＮＡを、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｓｉｇｍａ）法により一過性にトランスフェクトした。細胞を、血清飢餓培地中でＰＥＩおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌと共に、対応するｃＤＮＡと４時間インキュベートした。４時間後、培地を新鮮な完全培地に交換した。
６ウェルディッシュで増殖中の細胞に、ＹＦＰ Ｖｅｎｕｓ Ｎ末端フラグメント（ｎ－ＹＦＰ）と融合したＣＢ１ＲおよびＹＦＰ Ｖｅｎｕｓ Ｃ末端フラグメント（ｃ－ＹＦＰ）と融合した５－ＨＴ２ＡＲをコードするｃＤＮＡを、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｓｉｇｍａ）法により一過性にトランスフェクトした。細胞を、血清飢餓培地中でＰＥＩおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌと共に、対応するｃＤＮＡと４時間インキュベートした。４時間後、培地を新鮮な完全培地に交換した。
【0079】
４８時間後、細胞を３７℃で４時間、示されたＴＡＴ－ペプチド（４μＭ）で処理したか、または処理しなかった。相補されたＹＦＰ Ｖｅｎｕｓ発現を定量するために、細胞を、１０ｍＭグルコースを含むＨＢＳＳで素早く２回連続して洗浄し、剥離し、そして同じバッファーに再懸濁させた。細胞数を管理するために、ウシ血清アルブミン希釈液を標準として用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ミュンヘン、ドイツ）を用いて試料タンパク質濃度を測定した。２０μｇのタンパク質を９６ウェルマイクロプレート（底が透明な黒いプレート、Ｐｏｒｖａｉｒ、キングズ・リン、英国）に分配し、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バート・ヴィルトバート、ドイツ）を用いて５００ｎｍでの励起後に５３０ｎｍでの蛍光発光を記録した。タンパク質の蛍光は、試料の蛍光からトランスフェクトされていない細胞の蛍光（基底）を差し引いた値として求めた。５－ＨＴ２ＡＲ－ｃＶｅｎｕｓおよびｎＶｅｎｕｓを発現する細胞またはＣＢ１Ｒ－ｎＶｅｎｕｓおよびｃＶｅｎｕｓを発現する細胞は、非トランスフェクト細胞と同様の蛍光レベルを示した。
【0080】
実施例３（実施例１の化合物のトリプシン安定性）
実施例１の化合物のＨＰＬＣ分析から、上述の方法Ａに記載されているように提供されるトリプシンとのインキュベーションの際に、表１に要約した結果がもたらされ、
実施例１の化合物のＨＰＬＣ分析から、上述の方法Ａに記載されているように提供されるトリプシンとのインキュベーションの際に、表１に要約した結果がもたらされ、
【0081】
【表1】
【0082】
実施例４（実施例１の化合物の細胞毒性）
実施例１の化合物の細胞毒性を、上述の方法Ｂ．で提供されているように評価し、その結果を以下の表２に要約する。
実施例１の化合物の細胞毒性を、上述の方法Ｂ．で提供されているように評価し、その結果を以下の表２に要約する。
【0083】
【表2】
【0084】
上記の結果から、ＥＣ５０値は５０μＭより高いことが分かる。この実験から、実施例１の化合物には顕著な毒性はないことが分かる。
【0085】
実施例５（実施例２の化合物のトランスロケーション）
実施例２の化合物（実施例１の５（６）－カルボキシフルオレセイン標識ペプチド）のトランスロケーションを、上述の方法Ｄ．で提供されるように評価した。
実施例２の化合物（実施例１の５（６）－カルボキシフルオレセイン標識ペプチド）のトランスロケーションを、上述の方法Ｄ．で提供されるように評価した。
【0086】
実施例２のペプチド（実施例１の５（６）－カルボキシフルオレセイン標識ペプチド）を合計１μＭ、最初に頂端側に添加した。２４時間インキュベーション後、頂端側、細胞内移行、および側底側におけるペプチドの相対量を定量した。頂端側および側底側の量を、頂部に添加した標識ペプチドの初期総量で正規化し、回収した蛍光線量のパーセンテージで表した。細胞内移行したペプチドは、初期添加量と、頂端側および側底側との差である。その結果を以下の表３に示す：
【0087】
【表3】
【0088】
得られたデータは、実施例２のペプチド（５（６）－カルボキシフルオレセインで標識された実施例１のペプチド）が、細胞内移行保持率１９．９８±７．３２４％で、２４時間で最大４３．３９±２．７０３％までＢＢＢをトランスロケートさせることができることを実証している。
【0089】
内皮バリアの完全性を、方法Ｄに記載されているように評価した。頂端側からの蛍光プローブ（分子量４ｋＤａの蛍光標識デキストラン（ＦＤ）（ＦＤ４））のクリアランスは、標識ペプチドの存在下でも非存在下でも無視できる程度であり、細胞バリアの開窓と傍細胞漏出の両方がないことが立証された。
【0090】
実施例６（二分子蛍光相補性によるＣＢ
１
Ｒと５－ＨＴ
２Ａ
Ｒとのヘテロマーを破壊する能力のインビトロ判定）
ＣＢ１Ｒと５－ＨＴ２ＡＲとのヘテロマーを破壊する実施例１の化合物の能力を、上述の方法Ｅ．に基づく二分子蛍光相補性により評価し、得られた結果を表４に要約する。
ＣＢ１Ｒと５－ＨＴ２ＡＲとのヘテロマーを破壊する実施例１の化合物の能力を、上述の方法Ｅ．に基づく二分子蛍光相補性により評価し、得られた結果を表４に要約する。
【0091】
【表4】
【0092】
実施例７ 共焦点顕微鏡によるペプチドの細胞内移行評価
ｂＥｎｄ．３細胞を、ｉｂｉＴｒｅａｔコートした８ウェルμ－スライド（Ｉｂｉｄｉ、ドイツ）に５０，０００細胞／２００μＬで２４時間播種した。次いで、細胞を１×ＰＢＳで２回、培地で１回、注意深く洗浄し、最終濃度１０μＭの標識ペプチドと共に２時間インキュベートした。２時間後、細胞を再度１×ＰＢＳで２回、培地で１回洗浄し、核および膜をそれぞれＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）およびＣｅｌｌｓＭａｓｋ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）で染色した。核染料および膜染料は、最終濃度５μｇ／ｍＬ、０．５×の作業溶液で、３７℃で１０分間細胞に添加した。最後に、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、画像化した。
ｂＥｎｄ．３細胞を、ｉｂｉＴｒｅａｔコートした８ウェルμ－スライド（Ｉｂｉｄｉ、ドイツ）に５０，０００細胞／２００μＬで２４時間播種した。次いで、細胞を１×ＰＢＳで２回、培地で１回、注意深く洗浄し、最終濃度１０μＭの標識ペプチドと共に２時間インキュベートした。２時間後、細胞を再度１×ＰＢＳで２回、培地で１回洗浄し、核および膜をそれぞれＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）およびＣｅｌｌｓＭａｓｋ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）で染色した。核染料および膜染料は、最終濃度５μｇ／ｍＬ、０．５×の作業溶液で、３７℃で１０分間細胞に添加した。最後に、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、画像化した。
【0093】
αＰｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ×１００油浸対物レンズ（開口数１．４６）を装備した共焦点走査型Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８８０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）で取得した。ダイオード４０５－３０およびＨｅＮｅ６３３レーザーを使用して、Ｈｏｅｓｃｈ３３３４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、スペイン）およびＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ形質膜染料（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）を励起した。アルゴンレーザーからの４８８ｎｍ線を用いて、実施例２のペプチド（５（６）－カルボフルオレセイン－Ｌｙｓで標識された実施例１のペプチド）を励起した。通常の共焦点モードでは、０．６倍ズーム画像を１０２４×１０２４の解像度で記録した。画像取得にはＺＥＮソフトウェアを使用した。画像処理にはＦｉｊｉソフトウェアを使用した。少なくとも合計１２の画像を、３回別個に繰り返して取得した。実施例２のペプチド（すなわち、５（６）－カルボフルオレセイン－Ｌｙｓで標識された実施例１のペプチド）の細胞内移行を確認するために、ｂＥｎｄ．３細胞を１０μＭの上記ペプチドと共に３７℃で２時間インキュベートし、共焦点顕微鏡を用いて調べた。
【0094】
ペプチド蛍光の点状パターンが観察され、細胞内移行後に小胞画分中にペプチドが存在することが示された。これを図２に示す。
【0095】
実施例８：記憶に対するペプチドの作用のインビボ判定（新規物体認識試験）
「Ｐｕｉｇｈｅｒｍａｎａｌ Ｅ，Ｍａｒｓｉｃａｎｏ Ｇ，Ｂｕｓｑｕｅｔｓ－Ｇａｒｃｉａ Ａ、Ｌｕｔｚ Ｂ，Ｍａｌｄｏｎａｄｏ Ｒ，Ｏｚａｉｔａ Ａ．「海馬長期記憶のカンナビノイド調節はｍＴＯＲシグナル伝達により媒介される（Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｍｅｍｏｒｙ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．）」Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２（９）：１１５２～８（２００９）」に記載された方法を、本明細書に記載した若干の修正を加えて使用し、記憶に対するペプチドの作用を評価した。結果を以下の表５に要約する。
「Ｐｕｉｇｈｅｒｍａｎａｌ Ｅ，Ｍａｒｓｉｃａｎｏ Ｇ，Ｂｕｓｑｕｅｔｓ－Ｇａｒｃｉａ Ａ、Ｌｕｔｚ Ｂ，Ｍａｌｄｏｎａｄｏ Ｒ，Ｏｚａｉｔａ Ａ．「海馬長期記憶のカンナビノイド調節はｍＴＯＲシグナル伝達により媒介される（Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｍｅｍｏｒｙ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．）」Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２（９）：１１５２～８（２００９）」に記載された方法を、本明細書に記載した若干の修正を加えて使用し、記憶に対するペプチドの作用を評価した。結果を以下の表５に要約する。
【0096】
１日目（馴化）に、マウスを、課題を行うＶ迷路に９分間馴化させた。２日目（訓練）に、マウスをＶ迷路に９分間戻し、２つの同一の物体を提示し、マウスがそれぞれの物体を探索するのに費やした時間を記録した。２４時間後にマウスを再びＶ迷路に９分間入れ（試験）、馴染みのある物体の１つを新規物体に置き換え、２つの物体（新規および馴染みのある）のそれぞれを探索するのに費やした時間の合計を算出した。物体探索は、物体に対する鼻の向きが２ｃｍ未満になることと定義した。識別指数は、新規物体または馴染みのある物体の探索に費やした時間の差を、２つの物体の探索時間の合計で割って算出した。正常なマウスは馴染みのある物体よりも新規物体を探索することにより多くの時間を費やすので、識別指数が高いほど馴染みのある物体に対する記憶保持力が高いことを示すと考えられる。
【0097】
マウスの体重１ｋｇ当たり２０ｍｇのペプチドの用量でのビヒクル（生理食塩水＋２％ＤＭＳＯ）中の試験対象ペプチドによる処置、または上記ビヒクル単独による処置を、訓練直後に静脈内投与（ＩＶ）で行い、一方、ＩＰビヒクル（５ｖ／ｖ％のエタノール、５ｖ／ｖ％のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ－ＥＬおよび９０ｖ／ｖ％生理食塩水）またはＩＰビヒクルに溶解したマウス１ｋｇ当たり３ｍｇのＴＨＣを、ペプチドの３０分後に腹腔内注射（ＩＰ）で投与した。
【0098】
【表5】
【0099】
上記の表に要約した結果から、実施例１の化合物の共投与により、記憶に対するＴＨＣの有害作用が覆されることが示される。
【0100】
実施例９：ペプチドの鎮痛効果のインビボ判定（ホットプレート試験）
「Ｍｏｎｏｒｙ Ｋ，Ｂｌａｕｄｚｕｎ Ｈ，Ｍａｓｓａ Ｆ，Ｋａｉｓｅｒ Ｎ，Ｌｅｍｂｅｒｇｅｒ Ｔ，Ｓｃｈｕｔｚ Ｇ，Ｗｏｔｊａｋ ＣＴ，Ｌｕｔｚ Ｂ＊，Ｍａｒｓｉｃａｎｏ Ｇ＊．「マウスにおけるＤ９－テトラヒドロカンナビノールの行動的および自律神経的作用の遺伝学的解析（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ａｎｄ Ａｕｔｏｎｏｍｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｄ９－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎａｂｉｎｏｌ ｉｎ Ｍｉｃｅ．）」ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５（１０）：ｅ２６９，２００７」に記載された方法を、本明細書に記載した若干の修正を加えて使用し、ペプチドの鎮痛効果を評価した。結果を以下の表６に要約する。
「Ｍｏｎｏｒｙ Ｋ，Ｂｌａｕｄｚｕｎ Ｈ，Ｍａｓｓａ Ｆ，Ｋａｉｓｅｒ Ｎ，Ｌｅｍｂｅｒｇｅｒ Ｔ，Ｓｃｈｕｔｚ Ｇ，Ｗｏｔｊａｋ ＣＴ，Ｌｕｔｚ Ｂ＊，Ｍａｒｓｉｃａｎｏ Ｇ＊．「マウスにおけるＤ９－テトラヒドロカンナビノールの行動的および自律神経的作用の遺伝学的解析（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ａｎｄ Ａｕｔｏｎｏｍｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｄ９－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎａｂｉｎｏｌ ｉｎ Ｍｉｃｅ．）」ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５（１０）：ｅ２６９，２００７」に記載された方法を、本明細書に記載した若干の修正を加えて使用し、ペプチドの鎮痛効果を評価した。結果を以下の表６に要約する。
【0101】
【表6】
【0102】
ＴＨＣ誘発鎮痛を、ＩＰビヒクル（５ｖ／ｖ％のエタノール、５ｖ／ｖ％のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ－ＥＬおよび９０ｖ／ｖ％生理食塩水）中に溶解したＴＨＣの腹腔内注射（ＩＰ）またはビヒクル（生理食塩水＋２％ＤＭＳＯ）単独注射の６０分後に、および、ＩＶビヒクル中の試験対象ペプチドまたはビヒクル単独の最初の注射から９０分後の静脈内注射により、ホットプレート鎮痛計（Ｈｏｔ／Ｃｏｌｄ Ｐｌａｔｅ Ｔｅｓｔ、Ｂｉｏｓｅｂ、米国）を用いて測定した。プレートを５２±０．５℃に加熱し、マウスがプレート上で足舐めおよび跳躍反応を示すまでの時間（秒）を記録した（足舐めおよび跳躍潜時）。組織損傷を防ぐため、２４０秒をカットオフタイムとした。
【0103】
実施例１の化合物とＴＨＣとの共投与により、実質的な鎮痛効果の達成が可能になる。
【0104】
参考文献一覧
明細書に引用した非特許文献
1. Vinals X. et al; PLoS Biol. 2015 Jul 9;13(7):e1002194
2. Kandasamy R, Dawson CT, Craft RM, Morgan MM. Anti-migraine effect of Δ9-tetrahydrocannabinol in the female rat. Eur J Pharmacol. 2018 Jan 5;818:271-277. doi: 10.1016/j.ejphar.2017.10.054. Epub 2017 Oct 28.
3. Baron EP, Lucas P, Eades J, Hogue O. Patterns of medicinal cannabis use, strain analysis, and substitution effect among patients with migraine, headache, arthritis, and chronic pain in a medicinal cannabis cohort. Headache Pain. 2018 May 24;19(1):37. doi: 10.1186/s10194-018-0862-2.
4. Russo EB. Clinical Endocannabinoid Deficiency Reconsidered: Current Research Supports the Theory in Migraine, Fibromyalgia, Irritable Bowel, and Other Treatment-Resistant Syndromes. Cannabis Cannabinoid Res. 2016 Jul 1;1(1):154-165. doi: 10.1089/can.2016.0009. eCollection 2016.
5. Miller S, Daily L, Leishman E, Bradshaw H, Straiker A. Δ9-Tetrahydrocannabinol and Cannabidiol Differentially Regulate Intraocular Pressure. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018 Dec 3;59(15):5904-5911. doi: 10.1167/iovs.18-24838.
6. Escudero-Lara A, Argerich J, Cabanero D, Maldonado R. Δ9-tetrahydrocannabinol (THC) alleviates pelvic hypersensitivity in a mouse model of endometriosis. IASP (International Association for the Study of Pain) 7th World Congress on Pain. Boston, USA. 12-16 September 2018, Abstract ID: 471100.
7. La Porta C, Bura SA, Llorente-Onaindia J, Pastor A, Navarrete F, Garcia-Gutierrez MS, De la Torre R, Manzanares J, Monfort J, Maldonado R. Role of the endocannabinoid system in the emotional manifestations of osteoarthritis pain. Pain. 2015 Oct;156(10):2001-12.
8. Maldonado R, Banos JE, Cabanero D. The endocannabinoid system and neuropathic pain. Pain. 2016 Feb;157 Suppl 1:S23-32.
9. Engeli S. Central and peripheral cannabinoid receptors as therapeutic targets in the control of food intake and body weight. Handb Exp Pharmacol. 2012;(209):357-81. doi: 10.1007/978-3-642-24716-3_17.
10. Al-Ghezi ZZ, Miranda K, Nagarkatti M, Nagarkatti PS . Combination of Cannabinoids, Δ9- Tetrahydrocannabinol and Cannabidiol, Ameliorates Experimental Multiple Sclerosis by Suppressing Neuroinflammation Through Regulation of miRNA-Mediated Signaling Pathways. Front Immunol. 2019 Aug 21;10:1921.
11. Allen D. Dronabinol Therapy: Central Nervous System Adverse Events in Adults With Primary Brain Tumors. Clin J Oncol Nurs. 2019 Feb 1;23(1):23-26.
12. Buhmann C, Mainka T, Ebersbach G, Gandor F. Evidence for the use of cannabinoids in Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 2019 Jul;126(7):913-924.
13. Valdeolivas S, Sagredo O, Delgado M, Pozo MA, Fernandez-Ruiz J. Effects of a Sativex-Like Combination of Phytocannabinoids on Disease Progression in R6/2 Mice, an Experimental Model of Huntington's Disease. Int J Mol Sci. 2017 Mar 23;18(4).
14. Donovan KA, Oberoi-Jassal R, Chang YD, Rajasekhara S, Haas MF, Randich AL, Portman DG. Cannabis Use in Young Adult Cancer Patients. J Adolesc Young Adult Oncol. 2019 Aug 22. doi: 10.1089/jayao.2019.0039. [Epub ahead of print]
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【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】