▶ フーナン リアー バイオテック カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-07
(54)【発明の名称】改変ＤＡＡＯ及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20230131BHJP
C12N 9/08 20060101ALI20230131BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230131BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230131BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230131BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230131BHJP
C12P 13/04 20060101ALI20230131BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20230131BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53 ZNA
C12N9/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P13/04
C12N15/63 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022534287
(86)(22)【出願日】2020-12-08
(85)【翻訳文提出日】2022-07-20
(86)【国際出願番号】 CN2020134540
(87)【国際公開番号】W WO2021115256
(87)【国際公開日】2021-06-17
(31)【優先権主張番号】201911249924.4
(32)【優先日】2019-12-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522223132
【氏名又は名称】フーナン リアー バイオテック カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｈｕｎａｎ Ｌｉｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】シエ， シンカイ
(72)【発明者】
【氏名】シュー， ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ファン， ジュンイン
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050LL05
4B050LL10
4B064AE03
4B064AE63
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA12
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA28
4B065CA47
(57)【要約】
本発明は、改変Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）に関する。特に、本発明の改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。さらに、本発明の改変ＤＡＡＯは、Ｄ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性の増大、及び／又は配列番号４と比較して安定性の増大を有する。本発明はまた、本発明の改変ＤＡＡＯをコードするポリヌクレオチド、本発明の改変ＤＡＡＯを発現するベクター及び宿主細胞、並びに本発明の改変ＤＡＡＯ及び宿主細胞を用いてＬ－グルホシネートを産生する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
野生型Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）と比較して、５４位、５６位、５８位及び２１３位にアミノ酸置換を含む改変ＤＡＡＯであって、前記位置が配列番号２を参照して番号付けされており、５４位におけるアミノ酸が、Ｉ、Ｖ、Ｔ又はＬによって置換されており、５６位におけるアミノ酸がＮによって置換されており、５８位におけるアミノ酸がＨ又はＱによって置換されており、２１３位におけるアミノ酸がＳ又はＴによって置換されており、改変ＤＡＡＯがＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する、改変ＤＡＡＯ。
【請求項2】
５４位におけるアミノ酸がＩ又はＶによって置換されており、５８位におけるアミノ酸がＨによって置換されており、２１３位におけるアミノ酸がＳによって置換されている、請求項１に記載の改変ＤＡＡＯ。
【請求項3】
２１０及び／又は２２１位におけるアミノ酸置換（複数可）をさらに含み、２１０位におけるアミノ酸が、Ａ、Ｇ又はＰによって置換されており、２２１位におけるアミノ酸がＲによって置換されている、請求項１又は２に記載の改変ＤＡＡＯ。
【請求項4】
２１０位におけるアミノ酸がＡによって置換されている、請求項３に記載の改変ＤＡＡＯ。
【請求項5】
野生型ＤＡＡＯと比較して、５４位、５８位、２１３位及び２２１位にアミノ酸置換を含む改変ＤＡＡＯであって、前記位置が配列番号２を参照して番号付けされており、５４位におけるアミノ酸がＶによって置換されており、５８位におけるアミノ酸がＱによって置換されており、２１３位におけるアミノ酸がＳによって置換されており、２２１位におけるアミノ酸がＲによって置換されており、改変ＤＡＡＯがＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する、改変ＤＡＡＯ。
【請求項6】
２１０位及び／又は５６位におけるアミノ酸置換（複数可）をさらに含み、５６位におけるアミノ酸がＮによって置換されており、２１０位におけるアミノ酸がＡによって置換されている、請求項５に記載の改変ＤＡＡＯ。
【請求項7】
２位、８１位、９７位、１９３位、１９４位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位、３１９位、３３７位及び３４２位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含み、２位におけるアミノ酸がＣ又はＳによって置換されており、８１位におけるアミノ酸がＹによって置換されており、９７位におけるアミノ酸がＶによって置換されており、１９３位におけるアミノ酸がＴによって置換されており、１９４位におけるアミノ酸がＶ又はＣによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸がＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸がＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸がＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸がＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸がＳ又はＴによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸がＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸がＫによって置換されており、３３７位におけるアミノ酸がＳによって置換されており、３４２位におけるアミノ酸がＳ又はＨによって置換されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変ＤＡＡＯ。
【請求項8】
１９４位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位及び３１９位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含み、１９４位におけるアミノ酸がＶ又はＣによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸がＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸がＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸がＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸がＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸がＳによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸がＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸がＫによって置換されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変ＤＡＡＯ。
【請求項9】
２位、８１位、９７位、１９３位、３００位、３３７位及び３４２位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含み、２位におけるアミノ酸がＣ又はＳによって置換されており、８１位におけるアミノ酸がＹによって置換されており、９７位におけるアミノ酸がＶによって置換されており、１９３位におけるアミノ酸がＴによって置換されており、３００位におけるアミノ酸がＴによって置換されており、３３７位におけるアミノ酸がＳによって置換されており、３４２位におけるアミノ酸がＳ又はＨによって置換されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変ＤＡＡＯ。
【請求項10】
配列番号１と比較して、５４位、５８位、１９４位及び２１３位にアミノ酸置換を含む改変ＤＡＡＯであって、５４位におけるアミノ酸が、Ｉ、Ｖ、Ｔ又はＬによって置換されており、５８位におけるアミノ酸がＨ又はＱによって置換されており、１９４位におけるアミノ酸がＶ又はＣによって置換されており、２１３位におけるアミノ酸がＳ又はＴによって置換されており、改変ＤＡＡＯがＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する、改変ＤＡＡＯ。
【請求項11】
５６位、２１０位、２２１位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位及び３１９位からなる群から選択される位置における１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含み、５６位におけるアミノ酸がＮによって置換されており、２１０位におけるアミノ酸が、Ａ、Ｇ又はＰによって置換されており、２２１位におけるアミノ酸がＲによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸がＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸がＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸がＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸がＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸がＳによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸がＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸がＫによって置換されている、請求項１０に記載の改変ＤＡＡＯ。
【請求項12】
配列番号５～８６のうちの１つのアミノ酸配列、又は配列番号５～３０及び６６～７６のうちの１つと比較して、５４位、５６位、５８位、１９４位、２１０位、２１３位、２２１位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位、及び３１９位以外の位置に１～１０のアミノ酸置換を含むか、
配列番号３１～５７及び７７～８６のうちの１つと比較して、２位、５４位、５６位、５８位、８１位、９７位、１９３位、２１０位、２１３位、２２１位、３００位、３３７位及び３４２位以外の位置に１～１０のアミノ酸置換を含むか、若しくは
配列番号５８～６５のうちの１つと比較して、５４位、５６位、５８位、２１０位、２１３位及び２２１位以外の位置に１～１０のアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列
を含むか、又はこれからなる改変ＤＡＡＯであって、
Ｄ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する、改変ＤＡＡＯ。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変ＤＡＡＯをコードするポリヌクレオチド。
【請求項14】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項15】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変ＤＡＡＯ、請求項１３に記載のポリヌクレオチド又は請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項16】
Ｌ－グルホシネートを産生する方法であって、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変ＤＡＡＯ又は請求項１５に記載の宿主細胞をＤ－グルホシネートと接触させるステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酵素工学の分野に関する。特に、本発明は、改変Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）及びグルホシネートの産生におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
グルホシネート（４－［ヒドロキシ（メチル）ホスホノ］－Ｄ，Ｌ－ホモアラニンとも称する）は、遺伝子組換え作物が耐性を持つ、世界売上ランキング２位の除草剤である。グルホシネートは、Ｌ－グルタミン合成酵素の活性を阻害することにより、植物の窒素代謝に妨害をもたらし、最終的に植物を死滅させる広範囲の接触死滅除草剤である。グルホシネートは、グリホサートと比較して、広い適用範囲、迅速な効果、長い持続期間、低毒性、安全性等の大きな利点を有する。そのため、グルホシネートの売上は急速に増大しており、来期も大きなニーズがあり、優れた見込みがある。
【0003】
しかし、グルホシネートの産生プロセスは複雑であり、そのために産生の難易度が高くなっている。また、価格が高いために、グリホサートからの急速な置き換えが妨げられている。現在、市販されているグルホシネートは、等量の２つの光学異性体（Ｄ，Ｌ－グルホシネート）を含むラセミ混合物であり、Ｌ－グルホシネートのみが生物学的に活性である。したがって、Ｄ，Ｌ－グルホシネートの脱ラセミ化によりキラル純粋Ｌ－グルホシネートを調製することは、近年のＬ－グルホシネート合成において実質的に重要であり、一般的になっている。
【0004】
近年、Ｄ，Ｌ－グルホシネートからＬ－グルホシネートを調製する方法が多く報告されている。化学的改変による従来の分解方法は、コストが高く、またＤ－グルホシネートを使用できないため、競争力がない。現在、報告されているＤ－グルホシネート－アンモニウムをＬ－グルホシネートに変換する主要且つ代表的な技術的経路は、以下の通りである。
【0005】
１． Ｄ，Ｌ－グルホシネートはＮ－アセチルグルホシネートに変換され、次いでＬ－Ｎ－アセチルグルホシネートの選択的加水分解によってＬ－グルホシネートが得られ、これはカルボキシペプチダーゼによって触媒されるが、Ｄ－Ｎ－アセチルグルホネートは加水分解できず、化学的又は酵素的ラセミ化後に加水分解ステップにリサイクルされ得る（例えば、中国特許出願公開第１０８６９０８５４号を参照）。この方法の欠点としては、反応のステップが複数であること、及び加水分解で得られるＬ－グルホシネートのＮ－アセチル化基質からの分離が必要なことが挙げられる。
【0006】
２． Ｄ－グルホシネートは、２－カルボニル－４－（ヒドロキシメチルホスホノ）酪酸（ＰＰＯ）に酸化され、次いで、ＰＰＯが還元又はアミノ基転移されてＬ－グルホシネート－アンモニウムが生成される。殆どの文献において、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）を使用してＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒し、ここで、生成した過酸化水素を除去するためにカタラーゼ（ＣＡＴ）が通常添加される。ＰＰＯは炭素上のパラジウムの触媒作用によりギ酸で還元されて、Ｄ，Ｌ－グルホシネートを生成し得るため、Ｄ，Ｌ－グルホシネートは、ＤＡＡＯの立体選択性により、徐々にＬ－グルホシネートに変換され得る（例えば、中国特許出願公開第１０５５６７７８０号を参照）。この解決法の欠点としては、パラジウム－炭素触媒が多量に必要であり、反応の原料（例えば、酸素及びギ酸アンモニウム）が浪費されることが挙げられる。
【0007】
ＰＰＯはまた、Ｌ－アミノ酸トランスアミナーゼ（Ｌ－ＴＡ）によって触媒される立体選択的なトランスアミノ化反応によって、Ｌ－グルホシネートに変換され得る（例えば、米国特許出願公開第２０１８００３０４８７号を参照）。この解決方法は、アミノ基転移ステップが平衡反応であるため、高い変換率（例えば、３当量のアミノドナーを供給する場合の変換率９０％）を達成するために過剰量のアミノドナー（アミノ酸又は有機アミン）を供給する必要があり、過剰量のアミノドナー及び対応する副産物がその後の分離及び精製ステップに深刻な影響を与えるという欠点を有する。
【0008】
さらに、ＰＰＯは、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ－ＡＡＤＨ）によって触媒される立体選択的還元反応により、Ｌ－グルホシネートに変換され得る（例えば、中国特許出願公開第１０７５０２６４７号、中国特許出願公開第１０９５７６２３６号及び中国特許出願公開第１０９６０９５８２号を参照）。この解決方法では、変換された基質の濃度が低いか、又は損失が大きい。
【0009】
Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ及びＬ－アミノ酸デヒドロゲナーゼを用いる解決方法は、上記の解決方法と比較して、コスト面で利点を有する可能性がある。しかし、現在報告されている方法では、一般的に、変換され得る基質の濃度は高くないか、又は損失が大き過ぎるため、産生コストが過剰になっている。高濃度のＤ，Ｌ－グルホシネートの脱ラセミ化を達成することが、現在のプロセスのチョークポイントである。
【0010】
より高濃度の基質の変換を阻害する主な要因としては：組換えＤＡＡＯ酵素の安定性が悪く、反応器の条件下で不安定であること、及び反応中に酵素が不活性化されることが挙げられる。
【0011】
他の制限要因は、Ｄ－グルホシネートに対する酵素の選択的な触媒活性である。先行技術において、Ｄ－グルホシネートに対する活性を付与するために、ＤＡＡＯにおけるいくつかの改変が行われてきた。
【0012】
米国特許第７，９３９，７０９号では、Ｄ－グルホシネートからＰＰＯを合成する目的で、ロドトルラ・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）（ロドトルラ・グラシリス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）としても知られている、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｌｌ／１０７８８．ａｓｐｘを参照）由来のＤＡＡＯの変異体が使用された。前記特許に記載のロドトルラ・トルロイデス由来ＤＡＡＯの変異体は、変異Ｆ５８Ｋ、Ｍ２１３位におけるＨ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｎ、及びＡで置換されている変異、並びに２２３位及び２３８位における変異を含む。Ｔｉｍ Ｈａｗｋｓら、２０１１（Ｄ－ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ ａｓ ａ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｈｙｂｒｉｄ ｓｅｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ、（２０１１）９、ｐｐ．３０１～３１４）は、ＤＡＡＯがロドトルラ・トルロイデス由来であり、５８位及び２１３位における変異を含む上記特許と同様の内容を報告している。
【0013】
米国特許第９，８３４，８０２号では、ロドトルラ・トルロイデス由来のＤＡＡＯの変異体及びトランスアミナーゼ（ＴＡ）を使用して、Ｄ，Ｌ－グルホシネートからＬ－グルホシネートが合成された。また、ＤＡＡＯは５４位、５６位、５８位、２１３位、及び２３８位における１つ又は複数の変異を含むことが記載されており、いくつかの詳細な組合せが例示されている。
【0014】
中国特許出願公開第１０９５７６２３６号では、ロドトルラ・トルロイデス由来のＤＡＡＯに基づいて、Ｄ－グルホシネートを酸化することができる変異体も構築された。この変異体は、アミノ酸５２位、５４位、５８位、２１３位、及び３３５位に１つ又は複数の変異を有する。
【0015】
中国特許出願公開第１０５５６７７８０号、中国特許出願公開第１０９６０９５８２号等の他の特許出願においても、Ｄ－グルホシネートをＤＡＡＯで酸化することが関与していたが、使用した酵素の配列は示されていない。
【0016】
しかしながら、より高い安定性及び／又はＤ－グルホシネートに対するより高い活性を有するＤＡＡＯが未だに必要とされている。
【発明の概要】
【0017】
第１の態様において、本発明は、その野生型Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）と比較して、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の位置にアミノ酸置換を含む、改変ＤＡＡＯを提供し、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。
【0018】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、５４位、５６位、５８位及び２１３位にアミノ酸置換を含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされている。好ましくは、５４位におけるアミノ酸は、Ｉ、Ｖ、Ｔ又はＬ、より好ましくはＩ又はＶによって置換されている。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されている。好ましくは、５８位におけるアミノ酸は、Ｈ又はＱ、より好ましくはＨによって置換されている。好ましくは、２１３位におけるアミノ酸はＳ又はＴ、より好ましくはＳによって置換されている。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、２１０位及び／又は２２１位におけるアミノ酸置換（複数可）をさらに含む。好ましくは、２１０位におけるアミノ酸はＡ、Ｇ又はＰ、より好ましくはＡによって置換されている。好ましくは、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されている。
【0019】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは５４位、５８位、２１３位及び２２１位にアミノ酸置換を含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされている。好ましくは、５４位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、５８位におけるアミノ酸はＱによって置換されており、２１３位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されている。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、２１０位及び／又は５６位におけるアミノ酸置換（複数可）をさらに含む。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されており、２１０位におけるアミノ酸はＡによって置換されている。
【0020】
いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、２位、８１位、９７位、１９３位、１９４位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位、３１９位、３３７位、及び３４２位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、２位におけるアミノ酸はＣ又はＳによって置換されており、８１位におけるアミノ酸はＹによって置換されており、９７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、１９３位におけるアミノ酸はＴによって置換されており、１９４位におけるアミノ酸はＶ又はＣによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸はＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸はＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸はＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＳ又はＴによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸はＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸はＫによって置換されており、３３７位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３４２位におけるアミノ酸はＳ又はＨによって置換されている。
【0021】
或いは、いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、１９４位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位及び３１９位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、１９４位におけるアミノ酸はＶ又はＣによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸はＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸はＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸はＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸はＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸はＫによって置換されている。
【0022】
或いは、いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、２位、８１位、９７位、１９３位、３００位、３３７位及び３４２位からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含み、ここで、２位におけるアミノ酸はＣ又はＳによって置換されており、８１位におけるアミノ酸はＹによって置換されており、９７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、１９３位におけるアミノ酸はＴによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＴによって置換されており、３３７位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３４２位におけるアミノ酸はＳによって置換されている。
【0023】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、配列番号１と比較して、５４位、５８位、１９４位及び２１３位にアミノ酸置換を含み、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。好ましくは、５４位におけるアミノ酸は、Ｉ、Ｖ、Ｔ又はＬによって置換されており、５８位におけるアミノ酸はＨ又はＱによって置換されており、１９４位におけるアミノ酸はＶ又はＣによって置換されており、２１３位におけるアミノ酸はＳ又はＴによって置換されている。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、５６位、２１０位、２２１位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位及び３１９位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されており、２１０位におけるアミノ酸は、Ａ、Ｇ又はＰによって置換されており、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸はＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸はＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸はＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸はＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸はＫによって置換されている。
【0024】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、配列番号５～８６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、若しくはこれからなるか、又は改変ＤＡＡＯは、配列番号５～３０及び６６～７６のうちの１つと比較して、５４位、５６位、５８位、１９４位、２１０位、２１３位、２２１位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位、及び３１９位以外の位置に１～１０のアミノ酸置換を含むか、配列番号３１～５７及び７７～８６のうちの１つと比較して、２位、５４位、５６位、５８位、８１位、９７位、１９３位、２１０位、２１３位、２２１位、３００位、３３７位及び３４２位以外の位置に１～１０のアミノ酸置換を含むか、若しくは配列番号５８～６５のうちの１つと比較して、５４位、５６位、５８位、２１０位、２１３位及び２２１位以外の位置に１～１０のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。
【0025】
第２の態様において、本発明は、本発明の改変ＤＡＡＯをコードするポリヌクレオチド及び本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0026】
第３の態様において、本発明は、本発明の改変ＤＡＡＯ、それをコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0027】
第４の態様において、本発明は、Ｌ－グルホシネートを産生する方法であって、本発明の改変ＤＡＡＯ又は本発明の宿主細胞をＤ－グルホシネートと接触させるステップを含む、方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本発明は、Ｄ－グルホシネートの酸化を触媒して、Ｌ－グルホシネートを産生するための改変ＤＡＡＯに主に関する。特に明記しない限り、本明細書で使用される用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【0029】
Ｉ．改変Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ
本明細書中で使用する、用語「Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ」及び「ＤＡＡＯ」は、Ｄ－アミノ酸の酸化を触媒してケト酸を生成する酵素（ＥＣ１．４．３．３）を指す。一般的に、天然に存在するＤＡＡＯは、Ｄ－グルホシネートの酸化を触媒することができない。したがって、本発明は、Ｄ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒することができる改変ＤＡＡＯを提供する。好ましくは、改変ＤＡＡＯポリペプチドは、安定性の増大及び／又はＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性の増大を有する。
本明細書中で使用する、用語「Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ」及び「ＤＡＡＯ」は、Ｄ－アミノ酸の酸化を触媒してケト酸を生成する酵素（ＥＣ１．４．３．３）を指す。一般的に、天然に存在するＤＡＡＯは、Ｄ－グルホシネートの酸化を触媒することができない。したがって、本発明は、Ｄ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒することができる改変ＤＡＡＯを提供する。好ましくは、改変ＤＡＡＯポリペプチドは、安定性の増大及び／又はＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性の増大を有する。
【0030】
本明細書中で使用する、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結した少なくとも２つのアミノ酸を含む鎖を意味する。用語「ポリペプチド」は、「タンパク質」と互換してもよく、１０以上のアミノ酸残基を含む鎖を意味する。本明細書における全てのペプチド及びポリペプチドの化学式又は配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への方向を示し、左から右の順に記載されている。
【0031】
用語「アミノ酸」は、タンパク質中に天然に存在するアミノ酸及び非天然アミノ酸を含む。タンパク質中に天然に存在するアミノ酸の従来の命名法（１文字及び３文字）が用いられており、これは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）に見ることができる。
【0032】
【化1】
【0033】
本明細書中で使用する、用語「改変」は、ポリペプチドに対する化学的改変、例えば、アミノ酸（複数可）の置換、欠失、挿入及び／又は付加を指す。
【0034】
いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、その野生型ＤＡＡＯと比較して、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上のアミノ酸置換を含み、ここで、改変ＤＡＡＯは、Ｄ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、その野生型ＤＡＡＯと比較して、５４位、５６位、５８位及び２１３位にアミノ酸置換を含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされている。好ましくは、５４位におけるアミノ酸は、Ｉ、Ｖ、Ｔ又はＬ、より好ましくはＩ又はＶによって置換されている。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されている。好ましくは、５８位におけるアミノ酸は、Ｈ又はＱ、より好ましくはＨによって置換されている。好ましくは、２１３位におけるアミノ酸はＳ又はＴ、より好ましくはＳによって置換されている。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、その野生型ＤＡＡＯと比較して、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ及び２１３Ｓ、又は５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ及び２１３Ｓの置換の組合せを含む。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、２１０位及び／又は２２１位におけるアミノ酸置換（複数可）をさらに含む。好ましくは、２１０位におけるアミノ酸は、Ａ、Ｇ又はＰ、より好ましくはＡによって置換されている。好ましくは、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されている。
【0035】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、５４位、５８位、２１３位及び２２１位にアミノ酸置換を含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされている。好ましくは、５４位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、５８位におけるアミノ酸はＱによって置換されており、２１３位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されている。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、２１０位及び／又は５６位におけるアミノ酸置換（複数可）をさらに含む。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されており、２１０位におけるアミノ酸はＡによって置換されている。
【0036】
いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、２位、８１位、９７位、１９３位、１９４位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位、３１９位、３３７位、及び３４２位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされており、ここで、改変ＤＡＡＯは、Ｄ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。好ましくは、２位におけるアミノ酸はＣ又はＳによって置換されており、８１位におけるアミノ酸置換はＹによって置換されており、９７位におけるアミノ酸置換はＶによって置換されており、１９３位におけるアミノ酸置換はＴによって置換されており、１９４位におけるアミノ酸はＶ又はＣによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸はＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸はＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸はＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＳ又はＴによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸はＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸はＫによって置換されており、３３７位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３４２位におけるアミノ酸はＳ又はＨによって置換されている。
【0037】
或いは、本発明の改変ＤＡＡＯは、１９４位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位及び３１９位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされており、ここで、改変ＤＡＡＯは、Ｄ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。好ましくは、１９４位におけるアミノ酸はＶ又はＣによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸はＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸はＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸はＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸はＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸はＫによって置換されている。
【0038】
或いは、本発明の改変ＤＡＡＯは、２位、８１位、９７位、１９３位、３００位、３３７位及び３４２位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされており、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。好ましくは、２位におけるアミノ酸はＣ又はＳによって置換されており、８１位におけるアミノ酸はＹによって置換されており、９７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、１９３位におけるアミノ酸はＴによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＴによって置換されており、３３７位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３４２位におけるアミノ酸はＳによって置換されている。
【0039】
いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、配列番号１と比較して、５４位、５８位、１９４位及び２１３位にアミノ酸置換を含み、ここで、改変ＤＡＡＯは、Ｄ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。好ましくは、５４位におけるアミノ酸はＩ、Ｖ、Ｔ又はＬによって置換されており、５８位におけるアミノ酸はＨ又はＱによって置換されており、１９４位におけるアミノ酸はＶ又はＣによって置換されており、２１３位におけるアミノ酸はＳ又はＴによって置換されている。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、５６位、２１０位、２２１位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位及び３１９位からなる群から選択される位置における１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されており、２１０位におけるアミノ酸は、Ａ、Ｇ又はＰによって置換されており、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸はＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸はＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸はＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸はＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸はＫによって置換されている。いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、配列番号１と比較して、１つ若しくは複数のアミノ酸の保存された置換、又は１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入若しくは欠失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）をさらに含む。
【0040】
いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、その野生型と比較して、以下からなる群から選択されるアミノ酸置換の組合せを含む（位置は配列番号２を参照して番号付けされている）：
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｖ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ、２７３Ｄ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ、３１７Ｗ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ、２７４Ｅ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ、３１９Ｋ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｔ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２１０Ｇ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２１０Ｐ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２１０Ａ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２２１Ｒ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２３７Ａ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２３７Ｖ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｔ、５６Ｎ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｌ、５６Ｎ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２３７Ｖ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２１０Ａ、２３７Ｖ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２１０Ａ、２２１Ｒ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｌ、５６Ｎ、５８Ｑ；
５４Ｔ、５６Ｎ、５８Ｑ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ；
５４Ｌ、５６Ｎ、５８Ｑ、２１３Ｓ；
５４Ｔ、５６Ｎ、５８Ｑ、２１３Ｓ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ；
２Ｃ、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ；
２Ｓ、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、８１Ｙ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、１９３Ｔ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ、３００Ｔ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ、３３７Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ、３４２Ｓ；
２Ｓ、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、８１Ｙ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１３Ｓ、３３７Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、１９３Ａ、２１３Ｓ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
２Ｃ、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、８１Ｙ、９７Ｖ、２１３Ｓ、３３７Ｓ；
２Ｃ、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、８１Ｙ、９７Ｖ、１９３Ａ、２１３Ｓ、３４２Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１３Ｓ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、８１Ｙ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１３Ｓ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１３Ｓ、３００Ｔ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、８１Ｙ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１３Ｓ、３００Ｔ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１０Ａ、２１３Ｓ、３００Ｔ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１３Ｓ、２２１Ｒ、３００Ｔ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１０Ａ、２１３Ｓ、２２１Ｒ、３００Ｔ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５８Ｋ、２１３Ｔ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１０Ａ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ、２２１Ｒ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１０Ａ、２１３Ｓ、２２１Ｒ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１０Ａ、２１３Ｓ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ、２２１Ｒ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１０Ａ、２１３Ｓ、２２１Ｒ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１０Ａ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ、２２１Ｒ；及び
５４Ｖ、５８Ｑ、２１０Ａ、２１３Ｓ、２２１Ｒ
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｖ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ、２７３Ｄ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ、３１７Ｗ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ、２７４Ｅ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ、３１９Ｋ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｔ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２１０Ｇ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２１０Ｐ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２１０Ａ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２２１Ｒ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２３７Ａ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２３７Ｖ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｔ、５６Ｎ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｌ、５６Ｎ、５８Ｑ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２３７Ｖ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２１０Ａ、２３７Ｖ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ、１９４Ｃ、２１３Ｓ、２１０Ａ、２２１Ｒ、２６５Ｃ、３００Ｓ、３１７Ｙ；
５４Ｌ、５６Ｎ、５８Ｑ；
５４Ｔ、５６Ｎ、５８Ｑ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ；
５４Ｌ、５６Ｎ、５８Ｑ、２１３Ｓ；
５４Ｔ、５６Ｎ、５８Ｑ、２１３Ｓ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ；
２Ｃ、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ；
２Ｓ、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、８１Ｙ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、１９３Ｔ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ、３００Ｔ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ、３３７Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ、３４２Ｓ；
２Ｓ、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、８１Ｙ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１３Ｓ、３３７Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、１９３Ａ、２１３Ｓ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
２Ｃ、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、８１Ｙ、９７Ｖ、２１３Ｓ、３３７Ｓ；
２Ｃ、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、８１Ｙ、９７Ｖ、１９３Ａ、２１３Ｓ、３４２Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１３Ｓ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、８１Ｙ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１３Ｓ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１３Ｓ、３００Ｔ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、８１Ｙ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１３Ｓ、３００Ｔ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１０Ａ、２１３Ｓ、３００Ｔ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１３Ｓ、２２１Ｒ、３００Ｔ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、９７Ｖ、１９３Ｔ、２１０Ａ、２１３Ｓ、２２１Ｒ、３００Ｔ、３３７Ｓ、３４２Ｈ；
５８Ｋ、２１３Ｔ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１０Ａ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ、２２１Ｒ；
５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１０Ａ、２１３Ｓ、２２１Ｒ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１０Ａ、２１３Ｓ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１３Ｓ、２２１Ｒ；
５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ、２１０Ａ、２１３Ｓ、２２１Ｒ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１０Ａ、２１３Ｓ；
５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ、２２１Ｒ；及び
５４Ｖ、５８Ｑ、２１０Ａ、２１３Ｓ、２２１Ｒ
【0041】
本明細書において、アミノ酸の改変を行う基礎となるＤＡＡＯポリペプチドを、開始ＤＡＡＯと称する。開始ＤＡＡＯは、野生型ＤＡＡＯであってもよく、また、野生型ＤＡＡＯのバリアントであってもよい。例えば、改変が配列番号１のポリペプチドに基づいて開始される場合、配列番号１のポリペプチドは、改変ＤＡＡＯに関して「開始ＤＡＡＯ」であり、改変が配列番号１のバリアントポリペプチド（例えば、配列番号４～３０）に基づいて開始される場合、このバリアントポリペプチドは、改変ＤＡＡＯに関して「開始ＤＡＡＯ」である。
【0042】
本明細書中で使用する、用語「野生型ＤＡＡＯ」は天然に存在するＤＡＡＯを指す。いくつかの実施形態において、野生型ＤＡＡＯは、ロドトルラ属由来のＤＡＡＯである。いくつかの実施形態において、野生型ＤＡＡＯは、配列番号１～３のうちの１つである。配列番号１はロドトルラ・トルロイデス由来のＤＡＡＯのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託（Ａｓｓｅｓｉｏｎ）番号ＣＡＪ８７４２５．１）、配列番号２はロドトルラ種ＪＧ－１ｂのＤＡＡＯ由来のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＷＵ４５７００．１）、及び配列番号３はロドトルラ・タイワネンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＰＯＹ７０７１９．１）由来の推定ＤＡＡＯのアミノ酸配列である。
【0043】
本発明では、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の間のパーセンテージ同一性を決定するために、最適な比較を目的として配列をアライメントする（例えば、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適なアライメントのために第１のアミノ酸配列又は核酸配列にギャップを導入し得る）。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置が、第２の配列の対応する位置の同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、これらの分子はこの位置において同一である。２つの配列間のパーセンテージ同一性は、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、パーセンテージ同一性＝同一位置の数／位置の総数（すなわち、重複する位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は長さが同じである。
【0044】
当業者は、種々のコンピュータプログラムを使用して、２つの配列間の同一性を決定し得ることを知っている。
【0045】
「アミノ酸同一性パーセンテージ」又は「アミノ酸配列同一性パーセンテージ」は、２つのポリペプチドのアミノ酸間の比較を指し、最適にアライメントした場合、２つのポリペプチドは、およそ指定されたパーセンテージの同一のアミノ酸を有する。例えば、「９５％アミノ酸同一性」は、２つのポリペプチドのアミノ酸間の比較を指し、最適にアライメントされた場合、２つのポリペプチドのアミノ酸の９５％が同一である。
【0046】
いくつかの実施形態において、野生型ＤＡＡＯは、配列番号１～３のうちの１つと、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％又は９５％、特に９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。
【0047】
いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、その野生型と比較して、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上のアミノ酸置換を含み、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、５４位、５６位、５８位及び２１３位にアミノ酸置換を含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされている。好ましくは、５４位におけるアミノ酸は、Ｉ、Ｖ、Ｔ又はＬ、より好ましくはＩ又はＶによって置換されている。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されている。好ましくは、５８位におけるアミノ酸は、Ｈ又はＱ、より好ましくはＨによって置換されている。好ましくは、２１３位におけるアミノ酸はＳ又はＴ、より好ましくはＳによって置換されている。いくつかの好ましい実施形態において、改変ＤＡＡＯは、その野生型と比較して、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ及び２１３Ｓの置換、又は５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ及び２１３Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、２１０位及び／又は２２１位におけるアミノ酸置換（複数可）をさらに含む。好ましくは、２１０位におけるアミノ酸はＡ、Ｇ又はＰ、より好ましくはＡによって置換されている。好ましくは、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されている。好ましくは、本発明の改変ＤＡＡＯは、１９４位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位及び３１９位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、１９４位におけるアミノ酸はＶ又はＣによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸はＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸はＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸はＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸はＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸はＫによって置換されている。好ましくは、野生型ＤＡＡＯは、配列番号１と、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％又は９５％、特に、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。
【0048】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは５４位、５８位、２１３位及び２２１位にアミノ酸置換を含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされている。好ましくは、５４位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、５８位におけるアミノ酸はＱによって置換されており、２１３位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されている。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、２１０位及び／又は５６位におけるアミノ酸置換（複数可）をさらに含む。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されており、２１０位におけるアミノ酸はＡによって置換されている。好ましくは、本発明の改変ＤＡＡＯは、１９４位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位及び３１９位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含み、ここで、１９４位におけるアミノ酸はＶ又はＣによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸はＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸はＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸はＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸はＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸はＫによって置換されている。好ましくは、野生型ＤＡＡＯは、配列番号１と、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％又は９５％、特に９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。
【0049】
いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、その野生型と比較して、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上のアミノ酸置換を含み、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、５４位、５６位、５８位及び２１３位にアミノ酸置換を含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされている。好ましくは、５４位におけるアミノ酸は、Ｉ、Ｖ、Ｔ又はＬ、より好ましくはＩ又はＶによって置換されている。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されている。好ましくは、５８位におけるアミノ酸は、Ｈ又はＱ、より好ましくはＨによって置換されている。好ましくは、２１３位におけるアミノ酸はＳ又はＴ、より好ましくはＳによって置換されている。いくつかの好ましい実施形態において、改変ＤＡＡＯは、その野生型と比較して、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ及び２１３Ｓの置換、又は５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ及び２１３Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、２１０位及び／又は２２１位におけるアミノ酸置換（複数可）をさらに含む。好ましくは、２１０位におけるアミノ酸はＡ、Ｇ又はＰ、より好ましくはＡによって置換されている。好ましくは、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されている。好ましくは、本発明の改変ＤＡＡＯは、２位、８１位、９７位、１９３位、３００位、３３７位及び３４２位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含み、ここで、２位におけるアミノ酸はＣ又はＳによって置換されており、８１位におけるアミノ酸はＹによって置換されており、９７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、１９３位におけるアミノ酸はＴによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＴによって置換されており、３３７位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３４２位におけるアミノ酸はＳ又はＨによって置換されている。好ましくは、野生型ＤＡＡＯは、配列番号２と、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％又は９５％、特に９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。
【0050】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは５４位、５８位、２１３位及び２２１位にアミノ酸置換を含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされている。好ましくは、５４位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、５８位におけるアミノ酸はＱによって置換されており、２１３位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されている。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、２１０位及び／又は５６位におけるアミノ酸置換（複数可）をさらに含む。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されており、２１０位におけるアミノ酸はＡによって置換されている。好ましくは、本発明の改変ＤＡＡＯは、２位、８１位、９７位、１９３位、３００位、３３７位及び３４２位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含み、ここで、２位におけるアミノ酸はＣ又はＳによって置換されており、８１位におけるアミノ酸はＹによって置換されており、９７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、１９３位におけるアミノ酸はＴによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＴによって置換されており、３３７位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３４２位におけるアミノ酸はＳ又はＨによって置換されている。好ましくは、野生型ＤＡＡＯは、配列番号２と、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％又は９５％、特に９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。
【0051】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、その野生型と比較して、４～２０、４～１５、４～１４、４～１３、４～１２、４～１１、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６又は４～５のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、その野生型と比較して、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上のアミノ酸置換を含む。
【0052】
いくつかの実施形態において、野生型ＤＡＡＯは、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を含むという点で配列番号１～３のうちの１つとは異なる。いくつかの実施形態において、野生型ＤＡＡＯは、配列番号１～３のうちの１つと比較して、１つ又は複数のアミノ酸の保存された置換を含む。いくつかの実施形態において、野生型ＤＡＡＯは、配列番号１～３のうちの１つと比較して、１つ又は複数のアミノ酸の挿入又は欠失を含む。
【0053】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、その野生型ＤＡＡＯと比較して、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上のアミノ酸置換を含み、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、５４位、５６位、５８位及び２１３位にアミノ酸置換を含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされており、改変ＤＡＡＯは、配列番号１～３のうちの１つと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％又は９８％同一である。好ましくは、５４位におけるアミノ酸は、Ｉ、Ｖ、Ｔ又はＬ、より好ましくはＩ又はＶによって置換されている。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されている。好ましくは、５８位におけるアミノ酸は、Ｈ又はＱ、より好ましくはＨによって置換されている。好ましくは、２１３位におけるアミノ酸はＳ又はＴ、より好ましくはＳによって置換されている。いくつかの好ましい実施形態において、改変ＤＡＡＯポリペプチドは、その野生型ＤＡＡＯと比較して、５４Ｖ、５６Ｎ、５８Ｈ及び２１３Ｓ、又は５４Ｉ、５６Ｎ、５８Ｈ及び２１３Ｓの置換の組合せを含む。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、２１０位及び／又は２２１位におけるアミノ酸置換（複数可）をさらに含む。好ましくは、２１０位におけるアミノ酸はＡ、Ｇ又はＰ、より好ましくはＡによって置換されている。好ましくは、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されている。
【0054】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは５４位、５８位、２１３位及び２２１位にアミノ酸置換を含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされており、改変ＤＡＡＯは、配列番号１～３のうちの１つと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％又は９８％同一である。好ましくは、５４位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、５８位におけるアミノ酸はＱによって置換されており、２１３位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されている。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、２１０位及び／又は５６位におけるアミノ酸置換（複数可）をさらに含む。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されており、２１０位におけるアミノ酸はＡによって置換されている。
【0055】
いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、２位、８１位、９７位、１９３位、１９４位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位、３１９位、３３７位、及び３４２位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされており、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。好ましくは、２位におけるアミノ酸はＣ又はＳによって置換されており、８１位におけるアミノ酸はＹによって置換されており、９７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、１９３位におけるアミノ酸はＴによって置換されており、１９４位におけるアミノ酸はＶ又はＣによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸はＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸はＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸はＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＳ又はＴによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸はＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸はＫによって置換されており、３３７位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３４２位におけるアミノ酸はＳ又はＨによって置換されている。
【0056】
或いは、いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、１９４位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７及び３１９位からなる群から選択される１つ又は複数の位置における置換をさらに含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされており、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。好ましくは、１９４位におけるアミノ酸はＶ又はＣによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸はＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸はＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸はＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸はＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸はＫによって置換されている。
【0057】
或いは、いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、２位、８１位、９７位、１９３位、３００位、３３７位、及び３４２位からなる群から選択される１つ又は複数の位置における置換をさらに含み、位置は配列番号２を参照して番号付けされており、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。好ましくは、２位におけるアミノ酸はＣ又はＳによって置換されており、８１位におけるアミノ酸はＹによって置換されており、９７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、１９３位におけるアミノ酸はＴによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＴによって置換されており、３３７位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３４２位におけるアミノ酸はＳ又はＨによって置換されている。
【0058】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡは、配列番号１と比較して、５４位、５８位、１９４位及び２１３位にアミノ酸置換を含み、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有し、改変ＤＡＡＯは、配列番号１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％又は９８％同一である。好ましくは、５４位におけるアミノ酸は、Ｉ、Ｖ、Ｔ又はＬによって置換されており、５８位におけるアミノ酸はＨ又はＱによって置換されており、１９４位におけるアミノ酸はＶ又はＣによって置換されており、２１３位におけるアミノ酸はＳ又はＴによって置換されている。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、５６位、２１０位、２２１位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位及び３１９位からなる群から選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、５６位におけるアミノ酸はＮによって置換されており、２１０位におけるアミノ酸は、Ａ、Ｇ又はＰによって置換されており、２２１位におけるアミノ酸はＲによって置換されており、２３７位におけるアミノ酸はＶによって置換されており、２６５位におけるアミノ酸はＣによって置換されており、２７３位におけるアミノ酸はＤによって置換されており、２７４位におけるアミノ酸はＥによって置換されており、３００位におけるアミノ酸はＳによって置換されており、３１７位におけるアミノ酸はＹ又はＷによって置換されており、３１９位におけるアミノ酸はＫによって置換されている。いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯは、配列番号１と比較して、１つ若しくは複数のアミノ酸の保存された置換をさらに含むか、又は１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入若しくは欠失を含む。
【0059】
用語「保存された置換」は、「相同」なアミノ酸残基による置換とも称し、アミノ酸が類似の側鎖を有するアミノ酸残基、例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）で置き換えられる置換を意味する。
【0060】
一般的に、アミノ酸の保存された置換は、得られたタンパク質の活性に最小の影響をもたらす。そのような置換を以下に記載する。保存された置換は、アミノ酸を、サイズ、疎水性、電荷、極性、空間特性、及び芳香族性が類似したアミノ酸に置換することである。タンパク質の特性を正確に制御することが望ましい場合、一般的に置換は保存される。
【0061】
本明細書で使用する、「相同」なアミノ酸残基は、疎水性、電荷、極性、立体特性、芳香族特性等に関連する、類似の化学的特性を有するアミノ酸残基を指す。互いに相同なアミノ酸の例としては、正に荷電している、リジン、アルギニン、及びヒスチジン、負に荷電しているグルタミン酸及びアスパラギン酸、疎水性であるグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、及びフェニルアラニン、極性であるセリン、スレオニン、システイン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、芳香族であるフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、化学的に類似の側鎖基を有する、セリンとスレオニン、又はグルタミンとアスパラギン、又はロイシンとイソロイシンが挙げられる。
【0062】
タンパク質における保存的なアミノ酸置換としては以下が挙げられる：ＡｌａはＳｅｒによって置換されており、ＡｒｇはＬｙｓによって置換されており、ＡｓｎはＧｌｎ又はＨｉｓによって置換されており、ＡｓｐはＧｌｕによって置換されており、ＣｙｓはＳｅｒによって置換されており、ＧｌｎはＡｓｎによって置換されており、ＧｌｕはＡｓｐによって置換されており、ＧｌｙはＰｒｏによって置換されており、ＨｉｓはＡｓｎ又はＧｌｎによって置換されており、ＩｌｅはＬｅｕ又はＶａｌによって置換されており、ＬｅｕはＩｌｅ又はＶａｌによって置換されており、ＬｙｓはＡｒｇ又はＧｌｎによって置換されており、ＭｅｔはＬｅｕ又はＩｌｅによって置換されており、ＰｈｅはＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒによって置換されており、ＳｅｒはＴｈｒによって置換されており、ＴｈｒはＳｅｒによって置換されており、ＴｒｐはＴｙｒによって置換されており、ＴｙｒはＴｒｐ又はＰｈｅによって置換されており、ＶａｌはＩｌｅ又はＬｅｕによって置換されている。
【0063】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、配列番号５～８６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、若しくはこれからなるか、又は改変ＤＡＡＯは、配列番号５～３０及び６６～７６のうちの１つと比較して、５４位、５６位、５８位、１９４位、２１０位、２１３位、２２１位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位、及び３１９位以外の位置に１～１０のアミノ酸置換を含むか、配列番号３１～５７及び７７～８６のうちの１つと比較して、２位、５４位、５６位、５８位、８１位、９７位、１９３位、２１０位、２１３位、２２１位、３００位、３３７位及び３４２位以外の位置に１～１０のアミノ酸置換を含むか、若しくは配列番号５８～６５のうちの１つと比較して、５４位、５６位、５８位、２１０位、２１３位及び２２１位以外の位置に１～１０のアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列を含み、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、配列番号５～８６のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、若しくはこれからなるか、又は改変ＤＡＡＯは、配列番号５～３０及び６６～７６のうちの１つと比較して、５４位、５６位、５８位、１９４位、２１０位、２１３位、２２１位、２３７位、２６５位、２７３位、２７４位、３００位、３１７位、及び３１９位以外の位置に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれ以上のアミノ酸置換を含むか、若しくは配列番号３１～５７及び７７～８６のうちの１つと比較して、２位、５４位、５６位、５８位、８１位、９７位、１９３位、２１０位、２１３位、２２１位、３００位、３３７位及び３４２位以外の位置に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれ以上のアミノ酸置換を含むか、若しくは配列番号５８～６５のうちの１つと比較して、５４位、５６位、５８位、２１０位、２１３位及び２２１位以外の位置に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれ以上のアミノ酸置換を含み、ここで、改変ＤＡＡＯはＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化を触媒する活性を有する。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、配列番号１～３のうちの１つと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。
【0064】
本明細書で使用する、酵素の活性は、特定の条件下で単位質量当たりの酵素によって触媒される化学反応における単位時間当たりの基質の減少又は生成物の増加を指す。例えば、本発明の改変ＤＡＡＯの活性は、特定の条件下における単位質量の改変ＤＡＡＯの触媒の下における単位時間当たりのＤ－グルホシネートの減少量又はＰＰＯの増加量によって表すことができる。
【0065】
また、本明細書における酵素の活性は、酵素の相対活性を指していてもよく、同一の反応を触媒する所定の酵素の活性に対する目的の酵素の活性の比、例えばパーセンテージ相対活性で表される。
【0066】
いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯの活性は配列番号４と比較したパーセンテージ相対活性で表される。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯのＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化の触媒に対する活性は、配列番号４のＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化の触媒に対する活性の少なくとも１００％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％、１７０％、２００％、２５０％、３００％又はそれ以上である。
【0067】
また、改変ＤＡＡＯの安定性を改善させることは、工業生産上も有益である。いくつかの実施形態において、安定性とは熱安定性であり、これは、特定の温度（例えば４０～６０℃以上）で一定時間（例えば１０分～１時間）インキュベーションした後に酵素の活性を維持する能力を指す。いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、配列番号４のポリペプチドよりも優れた熱安定性を有する。例えば、４３～４５℃で２０分間インキュベーションした後、本発明の改変ＤＡＡＯの活性は、配列番号４のポリペプチドの活性の１００％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％、１７０％、２００％、２５０％、３００％又はそれ以上の高さである。或いは、本発明の改変ＤＡＡＯはより高いＴ５０を有し、ここでＴ５０は１時間のインキュベーション後に酵素活性が５０％減少する温度を指す。いくつかの実施形態において、本発明の改変ＤＡＡＯのＴ５０は、配列番号４のポリペプチドよりも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０℃又はそれ以上高い。
【0068】
いくつかの実施形態において、改変ＤＡＡＯは、配列番号４のポリペプチドよりも優れた熱安定性を有し、そのＤ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化の触媒に対する活性は、Ｄ－グルホシネートのＰＰＯへの酸化の触媒に対する配列番号４の活性の少なくとも１００％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％、１７０％、２００％、２５０％、３００％又はそれ以上である。
【0069】
ＩＩ．改変ＤＡＡＯをコードするポリヌクレオチド
本明細書で使用する、用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）並びにヌクレオチドアナログを用いて産生されたＤＮＡ又はＲＮＡのアナログを含む。核酸分子は、一本鎖であっても又は二本鎖であってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸の合成には、ヌクレオチドアナログ又は誘導体（例えば、イノシン又はホスホロチオエートヌクレオチド）を使用し得る。このようなヌクレオチドは、例えば、塩基対形成能が変化した核酸又はヌクレアーゼ耐性が増大した核酸を調製するために使用し得る。
本明細書で使用する、用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）並びにヌクレオチドアナログを用いて産生されたＤＮＡ又はＲＮＡのアナログを含む。核酸分子は、一本鎖であっても又は二本鎖であってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸の合成には、ヌクレオチドアナログ又は誘導体（例えば、イノシン又はホスホロチオエートヌクレオチド）を使用し得る。このようなヌクレオチドは、例えば、塩基対形成能が変化した核酸又はヌクレアーゼ耐性が増大した核酸を調製するために使用し得る。
【0070】
また、本発明は、本発明の改変ＤＡＡＯをコードするポリヌクレオチドを提供する。したがって、本発明において、改変という用語はまた、本発明のＤＡＡＯポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの遺伝的な操作も含む。改変は、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及び／又は付加であり得る。
【0071】
本明細書で使用する、用語「コードする」は、ポリヌクレオチドが、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接的に特定することを意味する。コード配列の境界は一般的に、オープンリーディングフレームによって決定され、これは一般的にＡＴＧ開始コドン又は他の開始コドン、例えばＧＴＧ及びＴＴＧで開始し、終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡで終わる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は組換えヌクレオチド配列であり得る。
【0072】
さらに、本発明の核酸配列の全て又は一部をカバーする核酸分子は、配列中に含まれる配列情報に基づいて設計及び合成されるオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離し得る。
【0073】
本発明のポリヌクレオチドは、標準的なＰＣＲ増幅技術によって、鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ及び適切なプライマーを使用して増幅し得る。上記のように増幅した核酸は、適切なベクターにクローニングされ、ＤＮＡ配列分析によって特徴づけ得る。
【0074】
本発明のポリヌクレオチドは、標準的な合成技術により、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を用いて調製し得る。
【0075】
本発明はまた、本明細書に記載する核酸分子の相補鎖に関する。他のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、他のヌクレオチド配列とハイブリダイズして安定的な二本鎖を形成することができるように十分にヌクレオチドに相補的である分子である。
【0076】
本明細書中で使用する、用語「ハイブリダイゼーション」は、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、及びより好ましくは少なくとも９８％互いに相同であるヌクレオチド配列が、所与のストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、一般的に互いに対するハイブリダイゼーションを維持することである。
【0077】
当業者には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件等、種々のハイブリダイゼーションの条件が知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．を参照。
【0078】
当然のことながら、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ配列（例えばｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ））又はポリＴ（又はＵ）残基の相補的伸長部にのみハイブリダイズするポリヌクレオチドを含まない。
【0079】
ＩＩＩ．改変ＤＡＡＯの発現及び産生
また、本発明の改変ＤＡＡＯを発現させるために、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物及びベクター、例えば発現ベクターも提供される。
また、本発明の改変ＤＡＡＯを発現させるために、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物及びベクター、例えば発現ベクターも提供される。
【0080】
本明細書中で使用する、用語「発現」は、ポリペプチドの産生に関わる任意のステップを含み、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変及び分泌を含むが、これらに限定されない。
【0081】
用語「核酸構築物」は、天然に存在する遺伝子から単離されているか、又は天然には存在しない核酸セグメントを含むように改変された一本鎖又は二本鎖の核酸分子を指す。核酸構築物が本発明のコード配列を発現するのに必要な制御配列を含む場合、核酸構築物という用語は、「発現カセット」という用語と同義である。
【0082】
用語「発現ベクター」は、本明細書において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの発現のために提供されるさらなるヌクレオチド、例えば、制御配列に作動可能に連結して含む線状又は環状のＤＮＡ分子を指す。発現ベクターには、ウイルスベクター又はプラスミドベクターが含まれる。
【0083】
本明細書における用語「制御配列」は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するために必要又は有益な全てのエレメントを含む。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して天然であっても外来であってもよく、又は互いに天然であっても外来であってもよい。このような制御配列としては、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列は、プロモーターと、転写及び翻訳の終了のためのシグナルとを含む。
【0084】
例えば、制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するために宿主細胞によって認識されるヌクレオチド配列である、適切なプロモーター配列であってもよい。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンであり得る。プロモーターには、変異体、切断型、及びハイブリッドのプロモーターも含まれ、宿主細胞に対して相同又は異種である、細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【0085】
本明細書において、用語「作動可能に連結された」は、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に制御配列が配置され、それによって制御配列がポリペプチドコード配列の発現を指示する構成を指す。
【0086】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を可能にする種々の操作に供し得る。それをベクターに挿入する前に、発現ベクターによるポリヌクレオチドの操作が望ましいか、又は必要である。組換えＤＮＡ方法を用いてポリヌクレオチド配列を改変する技術は、当技術分野でよく知られている。
【0087】
本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を特定及び選択するために、本発明のベクターは、好ましくは１つ又は複数の選択可能なマーカーを含み、これにより形質転換、トランスフェクション、形質導入等がされた細胞の容易な選択が可能になる。選択可能なマーカーは遺伝子であり、その生成物は殺生物剤又はウイルス耐性、重金属耐性、補助剤栄養素要求株等を提供するものである。例えば、細菌の選択可能なマーカーは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）若しくはバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子であるか、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール若しくはテトラサイクリン耐性等の抗生物質耐性を与えるマーカーである。
【0088】
本発明のベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、又はゲノムから独立して、細胞内で自律的に複製され得る。宿主細胞のゲノムへの組み込み又は自律的複製に必要なエレメントは、当技術分野で公知である（例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照）。
【0089】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって原核細胞又は真核細胞に導入し得る。本明細書中で使用する、用語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、宿主細胞に外来の核酸（ＤＮＡ等）を導入するための種々の技術を指し、これは当技術分野でよく知られており、例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）及び他の研究室マニュアルに記載されている。
【0090】
本発明はまた、ＤＡＡＯポリペプチドの組換え産生に好都合に使用される、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。本発明のポリクレオチドを含むベクターは、宿主細胞に導入され、これにより、ベクターは染色体組み込み体として、又は自己複製染色体外ベクターとして保持される。当業者には、タンパク質発現のための従来のベクター及び宿主細胞は知られている。
【0091】
いくつかの実施形態において、本発明の宿主細胞は、大腸菌細胞、例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である。いくつかの実施形態において、発現ベクターはｐＥＴ－３０ａ（＋）である。
【0092】
本発明の改変ＤＡＡＯは、非ＤＡＡＯポリペプチド（例えば、異種アミノ酸配列）に作動可能に連結して、融合タンパク質を形成し得る。例えば、一実施形態において、融合タンパク質はＧＳＴ－ＤＡＡＯ融合タンパク質であり、ここで、ＤＡＡＯ配列はＧＳＴ配列のＣ末端に融合している。この融合タンパク質は、組換えＤＡＡＯの精製を容易にし得る。他の実施形態において、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＤＡＡＯタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物及び酵母宿主細胞）において、ＤＡＡＯの発現及び／又は分泌は、異種シグナル配列の使用により増大させることができる。
【0093】
ＩＶ． Ｌ－グルホシネートの産生
さらに、本発明は、Ｌ－グルホシネートを調製する方法であって、本発明の改変ＤＡＡＯ又は宿主細胞をＤ－グルホシネートと接触させるステップを含む、方法を提供する。
さらに、本発明は、Ｌ－グルホシネートを調製する方法であって、本発明の改変ＤＡＡＯ又は宿主細胞をＤ－グルホシネートと接触させるステップを含む、方法を提供する。
【0094】
いくつかの実施形態において、本発明のＬ－グルホシネート－アンモニウムを調製する方法は、以下のステップ：
（ａ）本発明の改変ＤＡＡＯの活性及びＤ－グルホシネートを反応媒体に供給し、任意選択でカタラーゼ活性を反応媒体に供給するステップ、
（ｂ）反応媒体をインキュベーションして、Ｄ－グルホシネートをＰＰＯに酸化するステップ、及び
（ｃ）Ｌ－グルホシネートを、ＰＰＯの還元又はアミノ基転移によって産生するステップ
を含む。
（ａ）本発明の改変ＤＡＡＯの活性及びＤ－グルホシネートを反応媒体に供給し、任意選択でカタラーゼ活性を反応媒体に供給するステップ、
（ｂ）反応媒体をインキュベーションして、Ｄ－グルホシネートをＰＰＯに酸化するステップ、及び
（ｃ）Ｌ－グルホシネートを、ＰＰＯの還元又はアミノ基転移によって産生するステップ
を含む。
【0095】
いくつかの実施形態において、無細胞触媒作用方法を使用して、Ｌ－グルホシネートを産生し、本発明の改変ＤＡＡＯはステップ（ａ）において供給される。いくつかの実施形態において、遊離しているか、又は固定化されている、本発明の改変ＤＡＡＯを使用し得る。また、カタラーゼを固定化してもよい。
【0096】
いくつかの実施形態において、インキュベーションは、２０～５０℃、好ましくは２５～４０℃、より好ましくは２８～３５℃、例えば３０℃で行われる。
【0097】
いくつかの実施形態において、媒体は、ＰＢＳ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等の緩衝液である。一実施形態において、媒体は、５０ｍＭ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液である。
【0098】
いくつかの実施形態において、反応媒体は、一部又は全部が細胞培養培地から構成される媒体であり、本発明の改変ＤＡＡＯの活性は、反応媒体中で培養される本発明の宿主細胞によって提供される。
【0099】
いくつかの実施形態において、反応媒体は、一部又は全部が細胞培養培地から構成される媒体であり、カタラーゼ活性は、反応媒体中の培養物である、本発明の宿主細胞又は第２の宿主細胞によって提供される。
【0100】
いくつかの実施形態において、本発明の宿主細胞及び／又は第２の宿主細胞を細胞培地中で培養及び増殖させ、次いで増殖した宿主細胞を細胞培養培地から分離し、緩衝液又は水を使用してバイオマスを再懸濁させる。Ｄ－グルホシネートを、増殖させた宿主細胞の添加前、添加中、又は添加後に、緩衝液又は水に添加する。
【0101】
いくつかの実施形態において、細菌細胞、例えば大腸菌細胞を使用し得る。
【実施例】
【0102】
当業者は、以下の実施例を通じて、本発明をより明確に理解することができるであろう。実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、例示のみのためのものであることが理解されるべきである。
【0103】
実施例１．材料及び方法
本発明で使用する実験方法は、特に断らない限り、全て慣用的な方法である。特定の遺伝子クローニング操作については、上述のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に見ることができる。
本発明で使用する実験方法は、特に断らない限り、全て慣用的な方法である。特定の遺伝子クローニング操作については、上述のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に見ることができる。
【0104】
ｉ）試薬：
ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びＤｐｎＩエンドヌクレアーゼはＴａＫａＲａから購入し；プラスミド分離キットはアキシジェンＡｘｙｇｅｎから購入し；カタラーゼはＺａｏｚｈｕａｎｇ Ｑｕａｎｄｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ，Ｌｔｄ．、商品番号ＱＤ－００１から購入し；及びＤ，Ｌ－グルホシネートは、Ｌｉｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ， Ｌｔｄ．から購入した。
ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びＤｐｎＩエンドヌクレアーゼはＴａＫａＲａから購入し；プラスミド分離キットはアキシジェンＡｘｙｇｅｎから購入し；カタラーゼはＺａｏｚｈｕａｎｇ Ｑｕａｎｄｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ，Ｌｔｄ．、商品番号ＱＤ－００１から購入し；及びＤ，Ｌ－グルホシネートは、Ｌｉｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ， Ｌｔｄ．から購入した。
【0105】
ｉｉ）ベクター及び株：
使用した発現ベクターはｐＥＴ－３０ａ（＋）、プラスミドはＮｏｖａｇｅｎから購入し；及び使用した宿主細胞はＴｉａｎｇｅｎ ＢｉｏＴｅｃｈ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であった。
使用した発現ベクターはｐＥＴ－３０ａ（＋）、プラスミドはＮｏｖａｇｅｎから購入し；及び使用した宿主細胞はＴｉａｎｇｅｎ ＢｉｏＴｅｃｈ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であった。
【0106】
ｉｉｉ）配列決定及びプライマー合成は、Ｓｙｎｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって達成された。
【0107】
ｉｖ）部位特異的変異導入：
変異が必要なアミノ酸位置に対応する塩基に所望の置換を導入するために、特定のプライマー対を設計した。単離した変異前プラスミド（野生型ＤＡＡＯのコード配列とｐＥＴ－３０ａ（＋）骨格とを含む）を鋳型として使用し、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ技術（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４、３２（１４）：ｅ１１５）を使用したＰＣＲにより変異を導入した。ＰＣＲ増幅後、増幅生成物をＤｐｎＩで４時間消化して、鋳型プラスミドを除去した。消化した産物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換した後、細胞をＬＢ寒天培地（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に広げ、シングルコロニーをＬＢブロス（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に培養のために拾い、配列決定によって正しい変異体を検証した。検証されたクローンは、将来の使用のために－８０℃で保存する。
変異が必要なアミノ酸位置に対応する塩基に所望の置換を導入するために、特定のプライマー対を設計した。単離した変異前プラスミド（野生型ＤＡＡＯのコード配列とｐＥＴ－３０ａ（＋）骨格とを含む）を鋳型として使用し、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ技術（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４、３２（１４）：ｅ１１５）を使用したＰＣＲにより変異を導入した。ＰＣＲ増幅後、増幅生成物をＤｐｎＩで４時間消化して、鋳型プラスミドを除去した。消化した産物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換した後、細胞をＬＢ寒天培地（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に広げ、シングルコロニーをＬＢブロス（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に培養のために拾い、配列決定によって正しい変異体を検証した。検証されたクローンは、将来の使用のために－８０℃で保存する。
【0108】
ｖ）タンパク質の発現及び粗製酵素溶液の調製：
保存したクローンをＬＢ寒天培地上で活性化した。その後、シングルコロニーをＬＢブロス（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に接種し、３７℃で１２時間振とうしてインキュベーションした。１ｍＬの培養液を５０ｍＬの新鮮なＬＢブロス（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に移し、３７℃でＯＤ６００が約０．６になるまで振とうしてインキュベーションし、ＩＰＴＧ（最終濃度０．４ｍＭ）添加後に２５℃で１６時間インキュベーションしてタンパク質発現を誘導した。
保存したクローンをＬＢ寒天培地上で活性化した。その後、シングルコロニーをＬＢブロス（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に接種し、３７℃で１２時間振とうしてインキュベーションした。１ｍＬの培養液を５０ｍＬの新鮮なＬＢブロス（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に移し、３７℃でＯＤ６００が約０．６になるまで振とうしてインキュベーションし、ＩＰＴＧ（最終濃度０．４ｍＭ）添加後に２５℃で１６時間インキュベーションしてタンパク質発現を誘導した。
【0109】
インキュベーション後、培養物を４，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を廃棄し、大腸菌細胞を収集した。収集した大腸菌細胞の細胞を１５ｍＬの予め冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．０に懸濁し、４℃で超音波処理した。この細胞破砕溶液を６，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離して沈殿物を除去し、得られた上清を組換え酵素を含む粗製酵素溶液（１３ｇ／Ｌ）とした。
【0110】
ｖｉ）酵素活性の決定
Ｄ，Ｌ－グルホシネーは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝８に溶解し、溶液中のＤ，Ｌ－グルホシネートの最終濃度は１００ｍＭであった。上記溶液に粗製酵素２ｇ／Ｌの粗製酵素及び２ｇ／Ｌカタラーゼを添加し、次いで３０℃で２時間振とう器で連続振とう（４００ｒｐｍ）した。サンプリングし、ＯＰＡプレカラム誘導体化高速液体クロマトグラフィーで検出することによって、Ｄ－グルホシネートの減少及びｅｅ値を検出し、触媒反応の初期速度を決定した。
Ｄ，Ｌ－グルホシネーは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝８に溶解し、溶液中のＤ，Ｌ－グルホシネートの最終濃度は１００ｍＭであった。上記溶液に粗製酵素２ｇ／Ｌの粗製酵素及び２ｇ／Ｌカタラーゼを添加し、次いで３０℃で２時間振とう器で連続振とう（４００ｒｐｍ）した。サンプリングし、ＯＰＡプレカラム誘導体化高速液体クロマトグラフィーで検出することによって、Ｄ－グルホシネートの減少及びｅｅ値を検出し、触媒反応の初期速度を決定した。
【0111】
実施例２．ロドトルラ・トルロイデス由来のＤＡＡＯ（ＲｔＤＡＡＯ）の変異体の調製及び検出
変異体は、鋳型としてＲｔＤＡＡＯ（配列番号１）をコードする核酸を使用して実施例１の方法に従って調製した。得られた変異体を表１に示し、ここで、配列番号４の変異体は、米国特許第９，８３４，８０２号（ＲｔＤＡＡＯ Ｎ５４Ｖ、Ｆ５８Ｑ、Ｍ２１３Ｓ）において報告されている変異体である。得られた変異体を４５℃で２０分間インキュベーションし、酵素活性を実施例１に記載する方法に従って測定した。結果を表１に示し、ここで、相対酵素活性は、変異体の活性対配列番号４の活性のパーセンテージ（インキュベーション後）を指す（１００～１５０％は「＋」、１５０～２００％は「＋＋」、及び２００％超は「＋＋＋」と表す）。
変異体は、鋳型としてＲｔＤＡＡＯ（配列番号１）をコードする核酸を使用して実施例１の方法に従って調製した。得られた変異体を表１に示し、ここで、配列番号４の変異体は、米国特許第９，８３４，８０２号（ＲｔＤＡＡＯ Ｎ５４Ｖ、Ｆ５８Ｑ、Ｍ２１３Ｓ）において報告されている変異体である。得られた変異体を４５℃で２０分間インキュベーションし、酵素活性を実施例１に記載する方法に従って測定した。結果を表１に示し、ここで、相対酵素活性は、変異体の活性対配列番号４の活性のパーセンテージ（インキュベーション後）を指す（１００～１５０％は「＋」、１５０～２００％は「＋＋」、及び２００％超は「＋＋＋」と表す）。
【0112】
【表1】
【0113】
次に、配列番号１２に基づいてさらに変異を導入し、得られた変異体を表２に示す。変異体の相対酵素活性を測定した（変異体の活性対配列番号４の活性のパーセンテージ、熱処理なし）。次に、得られた変異体を一連の温度（４０～６０℃）で１時間インキュベーションし、Ｔ５０を測定した（この温度で１時間インキュベーションした後、酵素活性が５０％低下した）。結果を表２に示す。
【0114】
【表2】
【0115】
配列番号１４に基づいてさらにアミノ酸置換を導入し、変異体の酵素活性を試験した（熱処理なし）。結果を表３に示す。相対酵素活性とは、変異体の活性対配列番号４の活性の、熱処理なしのパーセンテージを指す（１１０～１２０％は「＋」、１２０～１５０％は「＋＋」、１５０～２００％は「＋＋＋」、及び２００％超は「＋＋＋＋」と表す）。
【0116】
【表3】
【0117】
実施例３．ロドトルラ種ＪＧ－１ｂ由来のＤＡＡＯ（ＲｓＤＡＡＯ）の変異体の調製及び検出
ＲｓＤＡＡＯ（配列番号２）をコードする核酸を鋳型として使用し、実施例１の方法に従って変異体を調製し、酵素活性を測定した。得られた変異体及びその酵素活性を表４に示し、ここで、相対酵素活性は、変異体の活性対配列番号４の活性、熱処理なしのパーセンテージを指し（７０％未満は「－－」、７０～１００％は「－」、１１０～１２０％は「＋」、１２０～１５０％は「＋＋」、１５０～２００％は「＋＋＋」、２００％超は「＋＋＋＋」と表す）、野生型ＲｓＤＡＡＯ（配列番号２）の活性は、０である。
ＲｓＤＡＡＯ（配列番号２）をコードする核酸を鋳型として使用し、実施例１の方法に従って変異体を調製し、酵素活性を測定した。得られた変異体及びその酵素活性を表４に示し、ここで、相対酵素活性は、変異体の活性対配列番号４の活性、熱処理なしのパーセンテージを指し（７０％未満は「－－」、７０～１００％は「－」、１１０～１２０％は「＋」、１２０～１５０％は「＋＋」、１５０～２００％は「＋＋＋」、２００％超は「＋＋＋＋」と表す）、野生型ＲｓＤＡＡＯ（配列番号２）の活性は、０である。
【0118】
【表4】
【0119】
配列番号３８に基づいて、さらにアミノ酸置換を導入し、得られた変異体の酵素活性を測定した。得られた変異体を表５に示す。変異体（熱処理なし）の活性は配列番号３８と同等である。配列番号３８の変異体及びアミノ酸置換をさらに導入することによって得られた変異体を、４３℃で２０分間インキュベーションし、インキュベーションした変異体の活性を測定した。結果を表５に示し、ここで、相対酵素活性は、（４３℃で２０分間インキュベーションした後の）変異体の活性対配列番号３８の活性のパーセンテージを指す（１５０～２００％を「＋＋」、及び２００％超を「＋＋＋」と表す）。
【0120】
【表5】
【0121】
配列番号５４に基づいて、さらにアミノ酸置換を導入し、得られた変異体の酵素活性を測定した。得られた変異体及びその酵素活性を表６に示し、ここで、相対酵素活性は、（熱処理なし）変異体の活性対配列番号４の活性のパーセンテージを指す（１２０～１５０％を「＋＋」、１５０～２００％を「＋＋＋」、及び２００％超を「＋＋＋＋」と表す）。
【0122】
【表6】
【0123】
実施例４．ロドトルラ・タイワネンシス由来のＤＡＡＯ（ＲｔｎＤＡＡＯ）の変異体の調製及び検出
ＲｔｎＤＡＡＯ（配列番号３）をコードする核酸を鋳型として使用して、実施例１の方法に従って変異体を調製し、酵素活性を測定した。得られた変異体及びその酵素活性を表７に示し、ここで、相対酵素活性は、変異体の活性対配列番号４の活性のパーセンテージを指し（７０％未満は「－－」、７０～１００％は「－」、１１０～１２０％は「＋」、１２０～１５０％は「＋＋」と表す）、野生型ＲｔｎＤＡＡＯ（配列番号３）の活性は０である。
ＲｔｎＤＡＡＯ（配列番号３）をコードする核酸を鋳型として使用して、実施例１の方法に従って変異体を調製し、酵素活性を測定した。得られた変異体及びその酵素活性を表７に示し、ここで、相対酵素活性は、変異体の活性対配列番号４の活性のパーセンテージを指し（７０％未満は「－－」、７０～１００％は「－」、１１０～１２０％は「＋」、１２０～１５０％は「＋＋」と表す）、野生型ＲｔｎＤＡＡＯ（配列番号３）の活性は０である。
【0124】
【表7】
【0125】
実施例５：異なる野生型に基づく置換の種々の組合せを有する変異体の調製
上記実施例に記載の方法に従い、野生型ＲｔＤＡＡＯ及びＲｓＤＡＡＯに種々の変異の組合せを導入することによって変異体を調製し、その酵素活性を測定した。
上記実施例に記載の方法に従い、野生型ＲｔＤＡＡＯ及びＲｓＤＡＡＯに種々の変異の組合せを導入することによって変異体を調製し、その酵素活性を測定した。
【0126】
ＲｔＤＡＡＯに基づく変異体及びその酵素活性を表８に示し、ここで、相対酵素活性は、変異体の活性対配列番号４の活性のパーセンテージを指す（１１０～１２０％は「＋」、１２０～１５０％は「＋＋」、１５０～２００％は「＋＋＋」、及び２００％超は「＋＋＋＋」と表す）。
【0127】
【表8】
【0128】
ＲｓＤＡＡＯに基づく変異体及びその酵素活性を表９に示し、ここで、相対酵素活性は、変異体の活性対配列番号７７の活性のパーセンテージを指す（１１０～１２０％は「＋」、１２０～１５０％は「＋＋」、１５０～２００％は「＋＋＋」、及び２００％超は「＋＋＋」と表す）。
【0129】
【表9】
【配列表】
【国際調査報告】