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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-08
(54)【発明の名称】抗ＴＩＲＣ７抗原結合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230201BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20230201BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230201BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230201BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230201BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230201BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230201BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230201BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230201BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230201BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230201BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230201BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230201BHJP
A61P 5/14 20060101ALI20230201BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230201BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230201BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230201BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230201BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230201BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230201BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230201BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230201BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20230201BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20230201BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K16/40 ZNA
C07K19/00
C07K16/46
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N5/10
A61K39/395 U
A61P19/02
A61P37/02
A61P37/04
A61P1/16
A61P11/00
A61P5/14
A61P29/00
A61P27/02
A61P13/12
A61P17/00
A61P43/00
A61K48/00
A61P9/00
A61K35/17 Z
C07K14/705
C07K16/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022519994
(86)(22)【出願日】2020-09-30
(85)【翻訳文提出日】2022-05-27
(86)【国際出願番号】 EP2020077422
(87)【国際公開番号】W WO2021073877
(87)【国際公開日】2021-04-22
(31)【優先権主張番号】19200324.2
(32)【優先日】2019-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519046694
【氏名又は名称】ネコナル エス．ア．エール．エル．
(74)【代理人】
【識別番号】100123984
【弁理士】
【氏名又は名称】須藤 晃伸
(74)【代理人】
【識別番号】100102314
【弁理士】
【氏名又は名称】須藤 阿佐子
(74)【代理人】
【識別番号】100206689
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 恵理子
(74)【代理人】
【識別番号】100159178
【弁理士】
【氏名又は名称】榛葉 貴宏
(72)【発明者】
【氏名】ウツク，ナラン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA33
4C084ZA36
4C084ZA59
4C084ZA75
4C084ZA81
4C084ZA89
4C084ZB07
4C084ZB08
4C084ZB11
4C084ZC06
4C084ZC54
4C085AA14
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZA33
4C087ZA36
4C087ZA59
4C087ZA75
4C087ZA81
4C087ZA89
4C087ZB07
4C087ZB08
4C087ZB11
4C087ZC06
4C087ZC54
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、新規のヒトＴ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）抗原結合タンパク質、例えば、ＴＩＲＣ７への結合親和性及び／又は活性が改善された抗体を提供する。本発明のＴＩＲＣ７抗体は、親ＴＩＲＣ７抗体の変異によって作製され、様々な細胞実験において試験された。本発明はまた、本発明の抗原結合タンパク質、それらをコードする核酸、並びにそれらを発現させるためのベクター及び宿主細胞を作製するための方法にも関する。本発明はさらに、自己免疫疾患、癌疾患又は他の免疫関連疾患、例えば、細胞性免疫応答が関わる疾患などの疾患を、本発明の抗ＴＩＲＣ７抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を用いて処置又は診断する方法に関する。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）に結合することができる抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）であって、（ｉ）配列番号０１の相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１（ＧＹＴＦＴＴＹＶ）、配列番号０２のＣＤＲＨ２（ＩＮＰＹＮＤＧＴ）及び配列番号０３のＣＤＲＨ３（ＡＥＦＩＴＫＴＶＧＧＳＮＷＹＬＤＶ）を含むか、又は各場合において独立して、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号０１、配列番号０２又は配列番号０３と比べて１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号０５のＣＤＲＬ１（ＳＳＩＳＹ）、配列番号０６のＣＤＲＬ２（ＤＴＳ）及び配列番号０７のＣＤＲＬ３（ＨＱＲＳＳＹＴＷＴ）を含むか、又は各場合において独立して、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号０５、配列番号０６又は配列番号０７と比べて１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域とを含み、
前記重鎖可変領域は、配列番号２９のアミノ酸配列と比べて１０個以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む配列を含むことを特徴とする、抗原結合タンパク質。
【請求項2】
前記１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域及び前記１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域リュ尾がそれぞれ、ヒト抗体コンセンサスフレームワーク配列の少なくとも一部を有する抗体フレームワークを含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項3】
前記重鎖可変領域内において、前記１０個以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失が、フレームワーク（ＦＲ）３領域内ではないか、又は好ましくは、前記重鎖可変領域ＦＲ３が、配列番号２９に示されているＦＲ３と同一である、請求項１又は２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項4】
前記１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域が、配列番号０３の配列（ＡＥＦＩＴＫＴＶＧＧＳＮＷＹＬＤＶ）を有するＣＤＲ３を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項5】
免疫細胞と接触したとき、免疫細胞の活性化及び／又は増殖を抑制し、好ましくは、Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を抑制又は低減し、及び／又はＴ細胞と接触したとき、Ｔ細胞媒介性のインターフェロン－γ放出を低減する、請求項１～４のいずれか１項に記載のＡＢＰ。
【請求項6】
エフェクター基を含む、及び／又は標識されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項7】
Ｆｃレセプター結合が減弱している、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項8】
単離された、且つ／又は実質的に純粋な、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項9】
モノクローナル抗体などの抗体であるか、又はモノクローナル抗体のフラグメントなどの抗体フラグメントである、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項10】
前記抗原結合タンパク質が、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＭ免疫グロブリンであり、好ましくは、ＩｇＧ免疫グロブリンである、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項11】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦ（ａｂ’）２からなるリストから選択される抗体フラグメントである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項12】
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項13】
前記ＴＩＲＣ７以外の抗原、例えば、哺乳動物Ｔ細胞上に存在する抗原、最も好ましくは、ヒトＣＤ３又はヒトＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に結合する１つ以上のさらなる抗原結合ドメインを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項14】
二重特異性であり、好ましくは、ＴＩＲＣ７に結合する１つ又は２つの結合部位、及び前記ＴＩＲＣ７以外の抗原、例えば、哺乳動物Ｔ細胞上に存在する抗原、最も好ましくは、ヒトＣＤ３又はヒトＴＣＲに結合する１つ又は２つの結合部位を含む、請求項１３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項15】
表面プラズモン共鳴によって測定したときＴＩＲＣ７の細胞外ドメインに１００ｐＭ未満、好ましくは、５０ｐＭ未満のＫＤで結合する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項16】
ヒトＴＩＲＣ７に結合することができ、ＴＩＲＣ７への請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質の結合と競合することができる、抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）又はその抗原結合フラグメント。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又は抗原結合タンパク質の抗原結合フラグメントもしくはモノマー、例えば、重鎖もしくは軽鎖をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項18】
請求項１７に記載の核酸、及びコードされる抗原結合タンパク質又は前記抗原結合タンパク質の構成要素（例えば、抗体の重鎖又は軽鎖）の発現を（宿主）細胞において可能にする１つ以上のさらなる配列特徴を含む、核酸構築物（ＮＡＣ）。
【請求項19】
請求項１７に記載の核酸又は請求項１８に記載のＮＡＣを含む、組換え宿主細胞。
【請求項20】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であるか、又はヒト免疫細胞である、請求項１９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項21】
（ｉ）請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、又は（ｉｉ）請求項１７に記載の核酸もしくは請求項１８に記載の核酸構築物、又は（ｉｉｉ）請求項１９もしくは２０に記載の組換え宿主細胞、並びに薬学的に許容され得るキャリア、安定剤及び／又は賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項22】
医薬において使用するための構成要素であって、前記構成要素は、請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、請求項１７に記載の単離された核酸又は請求項１８に記載の核酸構築物、請求項１９又は２０に記載の組換え宿主細胞、及び請求項２１に記載の薬学的組成物からなるリストから選択される、構成要素。
【請求項23】
前記構成要素が、被験体の細胞性免疫応答を調節する使用のためである、請求項２２に記載の使用するための構成要素。
【請求項24】
前記免疫応答の調節が、細胞性免疫応答の阻害である、請求項２３に記載の使用するための構成要素。
【請求項25】
細胞性免疫応答の前記阻害が、リンパ球などの免疫細胞の増殖の阻害であり、且つ／又はリンパ球などの免疫細胞におけるサイトカイン発現の阻害である、請求項２４に記載の使用するための構成要素。
【請求項26】
細胞性免疫応答の前記阻害が、エフェクターメモリーＴ細胞の増殖／活性の低減及び／又は制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）の増殖／活性の増大である、請求項２４又は２５に記載の使用するための構成要素。
【請求項27】
前記使用が、病的な免疫応答を処置するためであり、好ましくは、炎症性疾患、自己免疫疾患、同種移植片拒絶（移植片対宿主病）の処置において使用するためである、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の使用するための構成要素。
【請求項28】
ヒトＴＩＲＣ７を発現するヒト細胞における細胞性免疫応答を調節する方法であって、前記細胞をＴ細胞などの免疫細胞の存在下において請求項２２に記載の構成要素と接触させ、それにより、前記細胞性免疫応答を調節する、好ましくは、阻害することを含む、方法。
【請求項29】
被験体の病的な免疫応答に関連する疾患を予防及び／又は処置するための方法であって、治療有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与することを含み、病的な免疫応答に関連する前記疾患は、前記病的な免疫応答に関わる細胞におけるＴＩＲＣ７の発現及び／又は活性を特徴とする、方法。
【請求項30】
前記病的な免疫応答が、細胞性免疫応答、好ましくは、Ｔ細胞媒介性免疫応答である、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記疾患が、乾癬性関節炎、移植片対宿主病、自己免疫性肝炎、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、ＩｇＧ４関連自己免疫疾患、線維性疾患、例えば、肺線維症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、バセドウ病、ブドウ膜炎又は尿細管間質性腎炎を伴うブドウ膜炎、脈管炎、慢性疲労症候群及び全身性強皮症から選択される自己免疫疾患などの自己免疫疾患である、請求項２９又は３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＴＩＲＣ７への結合親和性及び／又は活性が改善された新規のヒトＴ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）抗原結合タンパク質、例えば抗体を提供する。本発明のＴＩＲＣ７抗体は、親ＴＩＲＣ７抗体の変異によって作製され、様々な細胞実験において試験された。本発明はまた、本発明の抗原結合タンパク質、それらをコードする核酸、並びにそれらを発現させるためのベクター及び宿主細胞を作製するための方法にも関する。本発明はさらに、自己免疫疾患、癌疾患又は他の免疫関連疾患、例えば、細胞性免疫応答が関わる疾患などの疾患を、本発明の抗ＴＩＲＣ７抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を用いて処置又は診断する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
膜タンパク質であるＴ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）は、同種抗原によって活性化されたヒト末梢血リンパ球におけるディファレンシャルディスプレイによって同定され、その活性化プロセスの初期において一過性にアップレギュレートされた［１，２，３，４］。抗ＴＩＲＣ７抗体は、臓器の拒絶反応を予防すること及び腎臓の同種移植片の生存時間を延長することが示された［１］ことから、ＴＩＲＣ７が、臓器移植及び他の自己免疫疾患の状況における望まれない（細胞性）免疫応答を抑制するための新規の標的になり得ることが示唆された。
【0003】
ＴＩＲＣ７遺伝子は、１５個のエクソンから構成され、全長が７．９ｋｂであり、染色体１１ｑ１３．４からｑ１３．５に局在化している［５］。Ｔ細胞活性化に関わるどの公知のタンパク質ともアミノ酸の相同性は関連付けられていない。ＴＩＲＣ７は、免疫受容抑制性チロシンモチーフを含み、このことは、免疫系において阻害性の役割を示し得る［６］。リンパ球において発現される現在同定されている共刺激分子のほとんどが、免疫グロブリンスーパーファミリー又はＴＮＦレセプタースーパーファミリーに属する。したがって、ＴＩＲＣ７の予測される複数回貫通の膜貫通構造及び非定型の細胞外Ｃ末端は、特有のものであるとみられる。
【0004】
ＴＩＲＣ７は、刺激されていないＴ及びＢリンパ球のサブセット（それぞれ５～１０％及び１０～４０％）［１４］、並びに単球（３０～９０％）の、細胞膜に及び細胞内コンパートメント内に存在する。Ｔ細胞の活性化の後、３０分以内にＴＩＲＣ７の細胞表面発現が増加し、２時間以内に最高レベルに達する［１５］。細胞の活性化の前、ＴＩＲＣ７の発現は、リンパ球の細胞表面と比べて細胞内コンパートメントにおいておよそ１００倍高い。細胞刺激の後、細胞表面でのタンパク質発現が最大になるのと同時に、ＴＩＲＣ７の細胞内レベルは低下し、細胞内と細胞外の両方の発現が６時間以内にコントロールレベルに戻る。これらの結果は、ＴＩＲＣ７が、予め形成されたタンパク質として細胞内コンパートメントに存在し、Ｔ細胞が活性化されたとき、細胞表面に転位し、その後、細胞質の貯蔵所に戻ることを示す。クラスリンで覆われたベシクルが、ＴＩＲＣ７輸送の潜在的なビヒクルとして特定された［１５］。免疫シナプスに局在する他のＴ細胞活性化関連分子と同様に［１６－２０］、ＴＩＲＣ７は、抗原活性化の際に活性化プロテインＣ結合部位に集中し、細胞内ＴＩＲＣ７が抗原結合部位に向かって有向で移動することと、細胞表面におけるＴＩＲＣ７の再配向とが平行して起きる［１５］。これらのデータは、ＴＩＲＣ７が、予め形成された状態で細胞内コンパートメントの中に存在し、免疫活性化の数分以内に細胞表面に移動するので、それがさらなる下流のシグナルを制御する初期のシグナル伝達事象に関わることを示唆している。
【0005】
活性化の際の細胞膜での早期の発現とともに、リンパ球サブセット間のＴＩＲＣ７の分布パターンは、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３、ＣＤ４又は細胞傷害性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ）－４などの治療的介入に使用される他の共刺激分子と異なる。これらのタンパク質は、Ｔ細胞上（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０Ｌ）又はＢ細胞上（ＣＤ２０、ＣＤ４０）にもっぱら且つ恒常的に発現されるか、又は免疫活性化の２４時間後に細胞表面上に見られる（ＣＴＬＡ－４）［２０］。したがって、ＴＩＲＣ７は、活性化後の免疫細胞に提供される最初の負の制御シグナルである可能性がある。抗ＴＩＲＣ７抗体は、Ｔ細胞の表面上にＣＴＬＡ－４を早く誘導し、マイトジェン又は同種抗原で刺激されたヒト末梢血リンパ球の増殖の有意な阻害を示し、ｔｂｅｔに続いてＩＦＮγ、ＩＬ６、ＩＬ１２及びＩＬ－２（Ｔヘルパー細胞型１［Ｔｈ１］及び［Ｔｈ１７］サイトカインに相当する）（Ｆｒｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６）の強力な阻害を用量依存的様式で引き起こしたのに対し、ＩＬ－４又はＩＬ－１０の抑制は観察されなかった。したがって、ＴＩＲＣ７抗体の標的化は、炎症関連サイトカイン、並びにＴｈ１及びＴｈ１７を制御する主要な転写因子としてのｔ－ｂｅｔの選択的な阻害をもたらす。組換えＩＬ－２を培養物に添加したとき、増殖の阻害が逆転した。ゆえに、細胞が再刺激に応答するとき、ＴＩＲＣ７の標的化は、アネルギーをもたらした。しかしながら、ＩＦＮγ発現は、部分的にしか消失しなかったことから、ＴＩＲＣ７ｍＡｂが、安定した区別されたサイトカイン阻害を誘導することができることが示された。
【0006】
アゴニスト性の抗ＴＩＲＣ７抗体を用いた研究から生成されたデータは、ＴＩＲＣ７の抗増殖性効果及び抗炎症効果を理由に、リンパ球の機能におけるＴＩＲＣ７の負の調節的役割を割り当てた［１４］。この抗体は、特にＣＤ４＋細胞の増殖を減少させると示された。アゴニスト性の抗ＴＩＲＣ７ｍＡｂのＩＣ５０値は、リンパ球とのインキュベーションの前にそのｍＡｂを架橋することによって有意に低下した。さらに、抗ＴＩＲＣ７ｍＡｂは、増殖アッセイにおいてＦａｂフラグメントを使用したとき、負のシグナル伝達特性を失うことから、抗ＴＩＲＣ７抗体のアゴニスト性の役割が示された。さらに、ＴＩＲＣ７欠損細胞は、様々な抗原に対して有意な過剰増殖性のＴ及びＢ細胞応答を示した［２３］ことから、リンパ球の機能におけるＴＩＲＣ７の負の調節的役割の仮説が裏付けられた。より重要なことには、エフェクターメモリーＴ細胞の集団は、ＴＩＲＣ７ノックアウトマウスにおいて有意に増加したが、ＣＴＬＡ－４発現は低下した。したがって、ＴＩＲＣ７は、他の公知のチェックポイント阻害剤の上流の細胞表面において、そのリガンドであるＨＬＡＤＲアルファ２への結合を介して負のシグナルを誘導するチェックポイント阻害剤として作用する。
【0007】
世界中の数百万人が自己免疫疾患に罹患している。８０を超える自己免疫疾患が知られており、それらには、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、狼瘡、クローン病及びＩ型糖尿病、並びにさらに多くのものが含まれる。多発性硬化症（ＭＳ）は、西洋の集団において約１０００人に１人が罹患し、ミエリンタンパク質、例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、リン脂質タンパク質（ＰＬＰ）又はミエリン乏突起膠細胞タンパク質（ＭＯＧ）に対して自己反応性のＴ細胞の拡大に起因すると考えられている（Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：５１７２－５１７６）。免疫応答の制御において役割を果たす細胞には、制御性Ｔ細胞が含まれる。多発性硬化症と１型糖尿病の両方を含むいくつかの自己免疫疾患は、制御性Ｔ細胞の数又は機能の不足と関連する（Ａｓｔｉｅｒ，Ａ．Ｌ．ａｎｄ Ｈａｆｌｅｒ，Ｄ．Ａ．２００７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１９１（ｌ－２）：７０－７８）ので、Ｔ細胞で発現されるタンパク質が様々な免疫学的障害に対する興味深い治療標的となる。
【0008】
上記のことに基づくと、細胞性免疫、例えば、好ましくはＴ細胞媒介性の免疫応答だけでなくＢ細胞媒介性及び単球媒介性の免疫応答に関連する免疫疾患に特に対処する治療用抗体が本分野で必要とされている。ゆえに、上記で概説したような問題のうちの少なくとも１つに対処する改善された治療用のＡＢＰ、ゆえにＡＢＰを標的化するヒト化されたＴＩＲＣ７タンパク質が必要とされている。今日まで、抗ＴＩＲＣ７抗体のヒト化バリアントの提供は未だ対処されず必要とされている。
【発明の概要】
【0009】
概して、また、簡単な説明として、本発明の主な態様は、以下のとおり説明することができる。
【0010】
第１の態様において、本発明は、ヒトＴ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）に結合することができる抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）に関し、この抗原結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号０１のＣＤＲＨ１（ＧＹＴＦＴＴＹＶ）、配列番号０２のＣＤＲＨ２（ＩＮＰＹＮＤＧＴ）及び配列番号０３のＣＤＲＨ３（ＡＥＦＩＴＫＴＶＧＧＳＮＷＹＬＤＶ）を含むか、又は各場合において独立して、そのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号０１、配列番号０２又は配列番号０３と比べて３つ又は２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域、及び
（ｉｉ）配列番号０５のＣＤＲＬ１（ＳＳＩＳＹ）、配列番号０６のＣＤＲＬ２（ＤＴＳ）及び配列番号０７のＣＤＲＬ３（ＨＱＲＳＳＹＴＷＴ）を含むか、又は各場合において独立して、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号０５、配列番号０６又は配列番号０７と比べて３つ又は２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域
を含み、
（ｉ）その１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域及びその１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域はそれぞれ、ヒト抗体コンセンサスフレームワーク配列の少なくとも一部を有する抗体フレームワーク領域を含み、且つ／又は（ｉｉ）第１の態様のＡＢＰは、その重鎖可変ドメインが、配列番号２９に示されている配列と比べて１０個以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む配列を含むことを特徴とする、ことを特徴とする。
（ｉ）配列番号０１のＣＤＲＨ１（ＧＹＴＦＴＴＹＶ）、配列番号０２のＣＤＲＨ２（ＩＮＰＹＮＤＧＴ）及び配列番号０３のＣＤＲＨ３（ＡＥＦＩＴＫＴＶＧＧＳＮＷＹＬＤＶ）を含むか、又は各場合において独立して、そのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号０１、配列番号０２又は配列番号０３と比べて３つ又は２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域、及び
（ｉｉ）配列番号０５のＣＤＲＬ１（ＳＳＩＳＹ）、配列番号０６のＣＤＲＬ２（ＤＴＳ）及び配列番号０７のＣＤＲＬ３（ＨＱＲＳＳＹＴＷＴ）を含むか、又は各場合において独立して、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号０５、配列番号０６又は配列番号０７と比べて３つ又は２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域
を含み、
（ｉ）その１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域及びその１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域はそれぞれ、ヒト抗体コンセンサスフレームワーク配列の少なくとも一部を有する抗体フレームワーク領域を含み、且つ／又は（ｉｉ）第１の態様のＡＢＰは、その重鎖可変ドメインが、配列番号２９に示されている配列と比べて１０個以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む配列を含むことを特徴とする、ことを特徴とする。
【0011】
第２の態様において、本発明は、ＴＩＲＣ７に結合することができ、ＴＩＲＣ７への第１の態様のＡＢＰの結合と競合することができる、抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）又はその抗原結合フラグメントに関する。
【0012】
第３の態様において、本発明は、第１もしくは第２の態様のＡＢＰ又はＡＢＰの抗原結合フラグメントもしくはモノマー（例えば、重鎖又は軽鎖）をコードする配列、又は第３の態様に記載の二重特異性ＡＢＰをコードする配列を含む、単離された核酸に関する。
【0013】
第４の態様において、本発明は、第４の態様の核酸、及びコードされる抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）又は前記ＡＢＰの構成要素（例えば、抗体の重鎖又は軽鎖）の発現を細胞において可能にする１つ以上のさらなる配列特徴を含む核酸構築物（ＮＡＣ）に関する。
【0014】
第５の態様において、本発明は、第３の態様の核酸又は第２の態様に記載の核酸構築物（ＮＡＣ）を含む組換え宿主細胞に関する。
【0015】
第６の態様において、本発明は、（ｉ）第１もしくは第２の態様の抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）、又は（ｉｉ）第３の態様の核酸もしくは第４の態様のＮＡＣ、又は（ｉｉｉ）第５の態様に記載の組換え宿主細胞、並びに薬学的に許容され得るキャリア、安定剤及び／又は賦形剤を含む薬学的組成物に関する。
【0016】
第７の態様において、本発明は、医薬において使用するための構成要素に関し、その構成要素は、（ｉ）第１もしくは第２の態様の抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）、又は（ｉｉ）第３の態様の核酸又は第４の態様のＮＡＣ、又は（ｉｉｉ）第５の態様に記載の組換え宿主細胞及び第６の態様に記載の薬学的組成物からなるリストから選択される。
【0017】
第９の態様において、本発明は、ヒトＴＩＲＣ７を発現するヒト細胞における細胞性免疫応答を調節する方法に関し、その方法は、その細胞をＴ細胞などの免疫細胞の存在下において第７の態様に記載の構成要素と接触させ、それにより、細胞性免疫応答を調節する、好ましくは阻害することを含む。
【0018】
第１０の態様において、本発明は、被験体の病的な免疫応答に関連する障害を予防及び／又は処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量の第７の態様に記載の構成要素を被験体に投与することを含み、病的な免疫応答に関連する障害は、その障害に関連する細胞におけるＴＩＲＣ７の発現を特徴とする。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素は、具体的な実施形態とともに列挙されるが、しかしながら、それらは、任意の様式で且つ任意の数で組み合わされて、さらなる実施形態を形成し得ることが理解されるべきである。様々に説明される例及び好ましい実施形態は、明示的に説明された実施形態だけに本発明を限定すると解釈されるべきでない。この説明は、明示的に説明された実施形態の２つ以上を組み合わせる実施形態、又は明示的に説明された実施形態の１つ以上を任意の数の開示される及び／もしくは好ましい要素と組み合わせる実施形態を裏付ける及び包含すると理解されるべきである。さらに、文脈が他のことを示さない限り、本願において説明されるすべての要素の任意の順列及び組み合わせが、本願の説明によって開示されるとみなされるべきである。
【0020】
化合物
第１の態様において、本発明は、配列番号０１のＣＤＲＨ１（ＧＹＴＦＴＴＹＶ）、配列番号０２のＣＤＲＨ２（ＩＮＰＹＮＤＧＴ）及び配列番号０３のＣＤＲＨ３（ＡＥＦＩＴＫＴＶＧＧＳＮＷＹＬＤＶ）を含むか、又は各場合において独立して、そのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号０１、配列番号０２又は配列番号０３と比べて３つ又は２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域、並びに配列番号０５のＣＤＲＬ１（ＳＳＩＳＹ）、配列番号０６のＣＤＲＬ２（ＤＴＳ）及び配列番号０７のＣＤＲＬ３（ＨＱＲＳＳＹＴＷＴ）を含むか、又は各場合において独立して、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号０５、配列番号０６又は配列番号０７と比べて３つ又は２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域を含む、ヒトＴ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）に結合することができる抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を提供する。好ましくは、（ｉ）本発明のＡＢＰは、その１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域及びその１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域がそれぞれ、ヒト抗体コンセンサスフレームワーク配列の少なくとも一部を有する抗体フレームワーク領域を含むことを特徴とし得、且つ／又は（ｉｉ）第１の態様のＡＢＰは、重鎖可変ドメインが、配列番号２９に示されている配列と比べて１０個以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む配列を含むことを特徴とする。
第１の態様において、本発明は、配列番号０１のＣＤＲＨ１（ＧＹＴＦＴＴＹＶ）、配列番号０２のＣＤＲＨ２（ＩＮＰＹＮＤＧＴ）及び配列番号０３のＣＤＲＨ３（ＡＥＦＩＴＫＴＶＧＧＳＮＷＹＬＤＶ）を含むか、又は各場合において独立して、そのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号０１、配列番号０２又は配列番号０３と比べて３つ又は２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域、並びに配列番号０５のＣＤＲＬ１（ＳＳＩＳＹ）、配列番号０６のＣＤＲＬ２（ＤＴＳ）及び配列番号０７のＣＤＲＬ３（ＨＱＲＳＳＹＴＷＴ）を含むか、又は各場合において独立して、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号０５、配列番号０６又は配列番号０７と比べて３つ又は２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域を含む、ヒトＴ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）に結合することができる抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を提供する。好ましくは、（ｉ）本発明のＡＢＰは、その１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域及びその１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域がそれぞれ、ヒト抗体コンセンサスフレームワーク配列の少なくとも一部を有する抗体フレームワーク領域を含むことを特徴とし得、且つ／又は（ｉｉ）第１の態様のＡＢＰは、重鎖可変ドメインが、配列番号２９に示されている配列と比べて１０個以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む配列を含むことを特徴とする。
【0021】
本発明は、マウス親抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体の重鎖及び軽鎖のフレームワーク領域に挿入することを意味するＣＤＲ移植によって本明細書で初めてヒト化された、抗ＴＩＲＣ抗体（下記の表１に開示されているｃＡｂ１４５７抗体の配列に従うマウス抗ＴＩＲＣ７抗体）のヒト化バージョンに由来する高親和性の有効な新規の抗体構築物も提供する。しかしながら、本発明のＡＢＰを得るために、そのヒト化抗体は、可変領域の配列を大幅に変更しなければならなかった。ヒト化プロセス中の様々な問題を克服するためには、フレームワーク３領域における非直観的な（ｎｏｎ－ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ）ヒトからマウスへの復帰突然変異を含む様々な変更が必要であった。最も驚いたことには、本発明の抗体は、ヒト化されているが、少なくとも１桁を超える標的結合親和性の改善を示す。原則として、任意の可変ヒト軽鎖及び／又は可変重鎖が、ＣＤＲ移植の骨格として働くことができる。本発明のヒト化抗体の例証的な一例において、その抗体の軽鎖のＣＤＲ（配列番号５から配列番号７のＣＤＲループを意味する）は、ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭデータベースに寄託されているヒトκ軽鎖配列ＩＧＫＶ１－９（アクセッション番号Ｚ０００１３）、ＩＧＫＶ３－１１（アクセッション番号Ｘ０１６６８）、ＩＧＫＶ６－２１＊０１又はＩＧＫＶ１－１７＊０３の（可変ドメイン）に挿入され得る。Ｉｃｈｉｙｏｓｈｉ Ｙ．，Ｚｈｏｕ Ｍ．，Ｃａｓａｌｉ Ｐ．Ａ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ｉｎｓｕｌｉｎ ＩｇＧ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ａｒｉｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｌｏｎａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ‘ｇｅｒｍ－ｌｉｎｅ’ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｍｐｌａｔｅ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｖ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（１）：２２６－２３８（１９９５）も参照のこと。本発明のヒト化抗体の例証的な別の例では、その抗体の重鎖のＣＤＲ（配列番号１から配列番号３のＣＤＲループを意味する）は、ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭデータベースに寄託されている重鎖配列ＩＧＨＶ１－２（アクセッション番号Ｘ０７４４８）、ＩＧＨＶ７－４－１＊０２又はＩＧＨＶ１－４６＊０１の（可変ドメイン）に含められ得る（Ｗａｔｓｏｎ Ｃ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ，ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ａｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｅｌｉｃ ａｎｄ ｃｏｐｙ－ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．９２（４）：５３０－５４６（２０１３）も参照のこと。
【0022】
本明細書中で使用される用語「抗原結合タンパク質」又は「ＡＢＰ」は、標的抗原によって提示される又は標的抗原上に存在する１つ以上のエピトープなどの標的抗原に特異的に結合するタンパク質を意味する。本発明のＡＢＰの抗原は、ＴＩＲＣ７である。通常、抗原結合タンパク質は、抗体（又はそのフラグメント）であるが、しかしながら、他の形態の抗原結合タンパク質も本発明によって想定される。例えば、ＡＢＰは、小さい頑健な非免疫グロブリン「骨格」に由来する別の（非抗体）レセプタータンパク質、例えば、コンビナトリアルタンパク質の設計方法（Ｇｅｂａｕｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，２００９；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，１３：２４５）を用いることなどによって結合機能が備わったものであってもよい。そのような非抗体ＡＢＰの特定の例としては、プロテインＡのＺドメインに基づくアフィボディ分子（Ｎｙｇｒｅｎ，２００８；ＦＥＢＳ Ｊ ２７５：２６６８）、結晶性ガンマ－Ｂ及び／又はユビキチンに基づくアフィリン（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ，２００７；Ｊ Ｍｏ Ｂｉｏｌ，３７２：１７２）、シスタチンに基づくアフィマー（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，２０１２；Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８４：６５５３）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｃａｌｄａｒｉｕｓ由来のＳａｃ７ｄに基づくアフィチン（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ，２００８；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８３：１０５８）、三重らせんコイルドコイルに基づくアルファボディ（Ｄｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ，２０１４；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｓ ５：５２３７）、リポカリンに基づくアンチカリン（Ｓｋｅｒｒａ，２００８；ＦＥＢＳ Ｊ ２７５：２６７７）、様々な膜レセプターのＡドメインに基づくアビマー（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００５；Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：１５５６）、アンキリンリピートモチーフに基づくＤＡＲＰｉｎ（Ｓｔｒｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ，２００８；Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，１３：６９５）、ＦｙｎのＳＨ３ドメインに基づくファイノマー（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ，２００７；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：３１９６）、様々なプロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインに基づくクニッツドメインペプチド（Ｎｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ，９：２６１）、並びにフィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメインに基づくセンチリン（Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ）及びモノボディ（Ｄｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２７：４１９ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｕｏ１６；Ｋｏｉｄｅ ＆ Ｋｏｉｄｅ，２００７；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５２：９５）が挙げられる。
【0023】
本明細書中で使用される用語「相補性決定領域」（又は「ＣＤＲ」又は「超可変領域」）は、抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域に見られる超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上のことを広く指す。例えば、“ＩＭＧＴ”，Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ，２０００３，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５；Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００１，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９：６５７、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ＆ Ｍａｒｔｉｎ，２００８，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３８３２、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄを参照のこと。これらの表現には、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって定義されたような超可変領域、又は抗体の３次元構造における超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１）が含まれる。各鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によって近位に保持され、その他の鎖のＣＤＲとともに、抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲ内には、抗体－抗原相互作用においてＣＤＲが用いる重要な接触残基に相当する選択性決定領域（ＳＤＲ）と説明されてきた選択されたアミノ酸が存在する（Ｋａｓｈｍｉｒｉ，２００５；Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５）。
【0024】
本明細書中で使用される「ＡＢＰ」は、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ又は免疫グロブリンＥの対応する天然に存在するドメインと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有する１つ以上のドメインを有し得る。この点において、本明細書中で使用される用語「約」又は「およそ」は、所与の値又は範囲の２０％の偏差以内、例えば、１０％の偏差以内又は５％以内を意味することに注意されたい。
【0025】
用語「抗体」とは、一般に、免疫グロブリンに基づくタンパク質性結合分子のことを指す。そのような抗体の典型例は、結合特異性を有する免疫グロブリンの誘導体又は機能的フラグメントである。抗体及び抗体フラグメントを作製するための手法は、本分野で周知である。用語「抗体」には、種々のクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）及びサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ｌｇＧ２など）の免疫グロブリン（Ｉｇ）も含まれる。上でも述べたように、抗体誘導体又は抗体分子の例証的な例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ又はドメイン抗体が挙げられる（Ｈｏｌｔ ＬＪ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（１１），２００３，４８４－４９０）。したがって、用語「抗体」の定義には、キメラ抗体、一本鎖抗体及びヒト化抗体などの実施形態も含まれる。
【0026】
本発明において使用される「パーセント（％）配列同一性」は、本発明のポリペプチドの配列と対象の配列の長いほうの配列の残基数を基準とした、これらの２つの配列の相同性アラインメントの後の対の同一残基のパーセンテージを意味する。パーセントアミノ酸配列同一性を求めることを目的としたアラインメントは、本分野の技術範囲内の様々なやり方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、達成され得る。当業者は、比較されている配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムをはじめとした、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定できる。本明細書中に開示されるヌクレオチド配列にも同じことが当てはまる。
【0027】
「免疫グロブリン」は、本明細書中で使用されるとき、通常、それぞれおよそ２５ｋＤａの２本の軽（Ｌ）鎖及びそれぞれおよそ５０ｋＤａの２本の重（Ｈ）鎖から構成されるグリコシル化された四量体タンパク質である。ラムダ及びカッパーと呼ばれる２つのタイプの軽鎖が、免疫グロブリンに見られ得る。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、５つの主要クラスＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ及びＭに割り当てることができ、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けることができる。ＩｇＭ免疫グロブリンは、５つの基本的なヘテロ四量体単位に加えて、Ｊ鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドからなり、１０個の抗原結合部位を含み、ＩｇＡ免疫グロブリンは、重合してＪ鎖とともに多価集合体を形成し得る２～５個の基本的な４本鎖単位を含む。ＩｇＧの場合、その４本鎖単位は、一般に約１５０，０００ダルトンである。
【0028】
免疫グロブリンのＩｇＧクラスでは、重鎖に免疫グロブリンドメインがいくつかある。本明細書中の「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、異なる三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。ＩｇＧ抗体の状況において、ＩｇＧアイソタイプはそれぞれ、３つのＣＨ領域を有する。「ＣＨ１」とは、ＫａｂａｔらにおけるようなＥＵインデックスに従う、１１８～２２０位のことを指し、「ＣＨ２」とは、２３７～３４０位のことを指し、「ＣＨ３」とは、３４１～４４７位のことを指す。本明細書中の「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」又は「免疫グロブリンヒンジ領域」又は「Ｈ」は、抗体の第１の定常ドメインと第２の定常ドメインとの間のアミノ酸を含む可動性のポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインは、ＥＵ２２０位で終わり、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、ＥＵ２３７位の残基から始まる。したがって、ＩｇＧの場合、ヒンジは、２２１位（ＩｇＧ１におけるＤ２２１）から２３６位（ＩｇＧ１におけるＧ２３６）を含むと本明細書中で定義され、ここで、そのナンバリングは、ＫａｂａｔらにおけるようなＥＵインデックスに従う。本明細書中で定義されるような定常重鎖とは、ＣＨ１ドメインのＮ末端からＣＨ３ドメインのＣ末端のことを指し、ゆえに１１８～４４７位を含み、ここで、ナンバリングは、ＥＵインデックスに従う。
【0029】
用語「可変」とは、その配列の多様性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関わる、免疫グロブリンドメインの部分（すなわち、「可変ドメイン」）のことを指す。多様性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布するのではなく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中する。これらのサブドメインは、「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（すなわち、超可変でない）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、３つの超可変領域によって接続された４つのＦＲ領域（たいていβ－シート配置をとる）を含み、その３つの超可変領域は、そのβ－シート構造をつなげる、及びいくつかの場合ではそのβ－シート構造の一部を形成する、ループを形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって近位に保持され、他の鎖の超可変領域とともに、抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照のこと、下記を参照のこと）。一般に、天然に存在する免疫グロブリンは、６つのＣＤＲ（下記を参照のこと）、すなわち、ＶＨにおける３つ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）及びＶＬにおける３つ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）を含む。天然に存在する免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３は、６つのＣＤＲのうち最も広範な多様性を示し、特にＣＤＲＨ３は、免疫グロブリンに対して優れた特異性を付与する際にユニークな役割を果たすと考えられている。定常ドメインは、抗原の結合に直接関わらないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存的な細胞媒介性の細胞傷害及び補体活性化を示す。
【0030】
用語「ＶＨ」（ＶＨとも称される）及び「ＶＬ」（ＶＬとも称される）は、本明細書中において、それぞれ免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのことを指すために使用される。免疫グロブリンの軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、３つの超可変領域によって分断された「フレームワーク」領域からなる。したがって、用語「超可変領域」とは、抗原の結合に関与する抗体のアミノ酸残基のことを指す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖及び３つの軽鎖ＣＤＲ（又はＣＤＲ領域）が存在する。したがって、本明細書中で使用される「ＣＤＲ」とは、３つすべての重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）もしくは３つすべての軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）、又は適切な場合には、すべての重鎖ＣＤＲとすべての軽鎖ＣＤＲの両方のことを指す。３つのＣＤＲが軽鎖可変領域の結合特性を構成し、３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する。ＣＤＲは、免疫グロブリン分子の抗原特異性を決定し、足場領域又はフレームワーク領域を含むアミノ酸配列によって分断されている。ＣＤＲを定義づける正確な境界線及び長さは、種々の分類体系及びナンバリング体系に左右される。抗体の構造及びタンパク質折り畳みが、他の残基を抗原結合領域の一部とみなすことを意味する場合があり、当業者によってそのように理解されるであろう。ＣＤＲは、免疫グロブリンが抗原又はエピトープに結合するための接触残基の大部分を提供する。
【0031】
ＣＤＲ３は、通常、抗体結合部位内で最も分子多様性のある起源である。例えば、Ｈ３は、２アミノ酸残基もの短さであり得るか、又は２６アミノ酸超であり得る。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元配置が、本分野で周知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ，１９８８を参照のこと。当業者は、各サブユニット構造、例えば、ＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、ＦＲ構造が、活性なフラグメント、例えば、抗原に結合する、ＶＨ、ＶＬもしくはＣＤＲサブユニットの一部、すなわち抗原結合フラグメント、又は例えば、Ｆｃレセプター及び／もしくは補体などに結合する及び／もしくはそれらを活性化する、ＣＨサブユニットの一部、を含むことを認識するであろう。ＣＤＲは、通常、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）、Ｋａｂａｔら編に記載されているようなＫａｂａｔ ＣＤＲのことを指す。抗原結合部位を特徴付ける別の規格は、Ｃｈｏｔｈｉａが報告したような超可変ループを指すものである。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．（１９９２；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９－８１７；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：４６２８－４６３８を参照のこと。さらに別の規格は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアが使用するＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を広く参照のこと。Ｋａｂａｔ ＣＤＲに関して説明される実施形態は、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ又はＡｂＭ定義のループに関して説明される類似の関係を用いて代替的に実施できる。本発明の文脈において、ある抗体の可変ドメイン内の具体的な位置は、ＩＭＧＴデータベースの命名法に従って言及される。
【0032】
対応する免疫グロブリンミュー重鎖、ガンマ重鎖、アルファ重鎖、デルタ重鎖、イプシロン重鎖、ラムダ軽鎖又はカッパー軽鎖は、任意の種、例えば、げっ歯類の種、両生類、例えば平滑両生亜綱（例えばカエル、ヒキガエル、サンショウウオ又はイモリを含む）、又は無脊椎動物の種をはじめとした哺乳動物の種のものであり得る。哺乳動物の例としては、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハリネズミ、カモノハシ、アメリカナキウサギ、アルマジロ、イヌ、キツネザル、ヤギ、ブタ、ウシ、オポッサム、ウマ、コウモリ、ウッドチャック、オランウータン、アカゲザル、ウーリーモンキー、マカク、チンパンジー、タマリン（ワタボウシタマリン）、マーモセット又はヒトが挙げられるが、これらに限定されない。
【0033】
本明細書中で言及されるとき、免疫グロブリンは、通常、ジスルフィド結合によって連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質又はその抗原結合部分である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中ではＶＨと省略される）及び重鎖定常領域を有する。いくつかの実施形態において、重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中ではＶＬと省略される）及び軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分され得る。ＣＤＲは、その抗体と抗原との特異的な相互作用に関与する残基のほとんどを含む。各ＶＨ及び各ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを有する。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原のエピトープと相互作用する結合ドメインを含む。
【0034】
「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」の残基は、超可変領域以外の可変ドメイン残基である。異なる軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。したがって、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％又はそれ以上、通常、９０～９５％又はそれ以上）のフレームワーク領域である。ある抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成要素の軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域が組み合わされたものは、ＣＤＲの位置を決め、ＣＤＲを整列させるように働く。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合に関与する。
【0035】
用語「Ｆａｂ」、「Ｆａｂ領域」、「Ｆａｂ部分」又は「Ｆａｂフラグメント」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを定義すると理解される。Ｆａｂは、この領域を単独で指し得るか、又はＡＢＰ並びに完全長免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメントの状況におけるこの領域を指し得る。通常、Ｆａｂ領域は、抗体の軽鎖全体を含む。Ｆａｂ領域は、免疫グロブリン分子の「アーム」を定義すると解釈され得る。それは、そのＩｇのエピトープ結合部分を含む。天然に存在する免疫グロブリンのＦａｂ領域は、パパイン消化によってタンパク分解性フラグメントとして得ることができる。「Ｆ（ａｂ’）２部分」は、ペプシンで消化された免疫グロブリンのタンパク分解性フラグメントである。「Ｆａｂ’部分」は、Ｆ（ａｂ’）２部分のジスルフィド結合の還元に由来する生成物である。本明細書中で使用されるとき、用語「Ｆａｂ」、「Ｆａｂ領域」、「Ｆａｂ部分」又は「Ｆａｂフラグメント」は、抗体アームのＣ末端を定義するヒンジ領域をさらに含む場合がある。このヒンジ領域は、ＡＢＰのアームがＹを定義するように解釈され得る、完全長免疫グロブリンの中のＣＨ１ドメインのＣ末端に見られるヒンジ領域に対応する。免疫グロブリンがこの領域においていくらかの可動性を有するので、ヒンジ領域という用語が本分野において使用される。本明細書中で使用される「Ｆａｂ重鎖」は、ＶＨ及びＣＨ１を含むＦａｂフラグメントの部分又はポリペプチドとして理解されるのに対して、本明細書中で使用される「Ｆａｂ軽鎖」は、ＶＬ及びＣＬを含むＦａｂフラグメントの部分又はポリペプチドとして理解される。
【0036】
用語「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃフラグメント」は、天然配列のＦｃ領域及びバリアントのＦｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために本明細書中で使用される。Ｆｃ部は、抗体のエフェクター機能、例えば、補体系、及びＦｃレセプターを有する免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）の活性化を媒介する。ヒトＩｇＧ分子では、Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６のＮ末端のパパイン切断によって生成される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界線は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位又はＰｒｏ２３０のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端までに及ぶと定義される。Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（ＥＵナンバリングシステムに従う残基４４７）は、例えば、ＡＢＰの作製中もしくは精製中に、又はＡＢＰの重鎖をコードする核酸を組換え的に操作することによって、除去され得る。天然配列のＦｃ領域には、哺乳動物、例えば、ヒト又はマウスの、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれる。Ｆｃ領域は、抗体のクラスに応じて２つ又は３つの定常ドメインを含む。免疫グロブリンがＩｇＧである実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。本発明のある特定の好ましい実施形態において、本発明のＡＢＰのＦｃ領域は、Ｆｃレセプター結合を低減するように、及びそれにより、ＡＤＣＣを低減するように変異される。本発明のそのような好ましいＡＢＰは、「Ｆｃ減弱型」である。
【0037】
用語「一本鎖可変フラグメント」（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）可変領域と軽鎖（ＶＬ）可変領域とが１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドによって融合された抗体フラグメントを定義するために本明細書中で使用される。そのリンカーは、通常、可動性のためにグリシンリッチであり、また、溶解性のためにセリンリッチ又はトレオニンリッチであり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続できるか、又はＶＬのＮ末端をＶＨのＣ末端に接続できる。ｓｃＦｖフラグメントは、特異的な抗原結合部位を有するが、免疫グロブリンの定常ドメインを有しない。
【0038】
「抗原決定基」としても知られる用語「エピトープ」とは、抗体又はＴ細胞レセプターが特異的に結合し、それにより、複合体を形成する、抗原の一部のことを指す。したがって、用語「エピトープ」には、免疫グロブリン又はＴ細胞レセプターへの特異的結合が可能な任意の分子又はタンパク質決定基が含まれる。本明細書中に記載されるＡＢＰの結合部位（パラトープ）は、標的構造に対してユニークである、立体構造エピトープ又は連続エピトープに特異的に結合し得る／相互作用し得る。エピトープ決定基は、通常、分子の化学的に活性な表面の分類、例えば、アミノ酸又は糖側鎖からなり、通常、特異的な３次元構造の特性、並びに特異的な電荷特性を有する。いくつかの実施形態において、エピトープ決定基には、分子の化学的に活性な表面の分類、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルが含まれ、ある特定の実施形態において、エピトープ決定基は、特異的な３次元構造特性及び／又は特異的な電荷特性を有し得る。ポリペプチド抗原に関して、立体構造エピトープ又は不連続エピトープは、２つ以上の別個のアミノ酸残基が一次配列において隔てられて存在しているが、そのポリペプチドが天然のタンパク質／抗原に折り畳まれたとき、その分子の表面上に一貫した構造に組み立てられることを特徴とする（Ｓｅｌａ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９６９）１６６，１３６５－１３７４；Ｌａｖｅｒ，Ｗ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（１９９０）６１，５５３－５５６）。エピトープに寄与するそれらの２つ以上の別個のアミノ酸残基は、１つ以上のポリペプチド鎖の別々の区画に存在し得る。これらの残基は、そのポリペプチド鎖が３次元構造に折り畳まれてエピトープを構成するとき、その分子の表面上で一体となる。対照的に、連続エピトープ又は線状エピトープは、あるポリペプチド鎖の単一の線状セグメントとして存在する２つ以上の別個のアミノ酸残基からなる。
【0039】
この文脈における用語「特異的」、又は「～を対象にしている」としても使用される「～に特異的に結合する」は、本発明によれば、その抗体又は免疫レセプターフラグメントが、特異的な抗原もしくはリガンド又は特異的な抗原もしくはリガンドのセットと特異的に相互作用できる及び／又は結合できるが、他の抗原又はリガンドに本質的に結合しないことを意味する。そのような結合は、「鍵と鍵穴の原理」という特異性によって例証され得る。抗体は、抗体が相互に競合する場合、「同じエピトープに結合する」と言われ、１つの抗体だけが所与の時点においてそのエピトープに結合でき、すなわち、一方の抗体が、他方の結合又は調節効果を妨げる。
【0040】
本明細書中で使用される用語「単離されたＡＢＰ」とは、特定され、天然の環境の構成要素から分離及び／又は回収されたＡＢＰのことを指す。その天然の環境の混入構成要素は、その抗体の診断用途又は治療用途を干渉し得る物質であり、それらとしては、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性溶質又は非タンパク質性溶質が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、Ｌｏｗｒｙ法によって測定したとき、抗体の９５重量％超（例えば、９９重量％超）まで精製される。いくつかの実施形態において、その抗体は、クマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いて還元条件下又は非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって判断するとき、均一に精製される。単離されたＡＢＰは、いくつかの実施形態において、抗体の天然の環境の１つ以上の構成要素が存在しない組換え細胞内に存在し得る。通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【0041】
本明細書中に記載されるようなＴＩＲＣ７及び／又はＴＩＲＣ７を発現する免疫細胞に結合する本発明の（組換え）ＡＢＰは、任意の好適な組換え抗体の形式で、例えば、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントとして、使用され得る。本発明の組換えＡＢＰは、定常ドメイン（領域）、そのようなヒトＩｇＧ定常領域、ＣＨ１ドメイン（Ｆａｂフラグメントが含むように）及び／又はＦｃ領域全体も含み得る。あるいは、本発明のＡＢＰは、完全長（完全）抗体、好ましくは、二重特異的な形式でもあり得る。
【0042】
抗体が、必要とされるシグナル伝達経路の遮断を介した抗増殖、レセプター－リガンド相互作用の模倣、又はリガンド－レセプター相互作用の阻止、抗原のターンオーバー又は内部移行の調節をはじめとした細胞効果を媒介する可能性がある機構はいくつか存在する。ＴＩＲＣ７抗体の有効性は、これらの機構の組み合わせに起因することがあり、自己免疫に対する臨床治療におけるそれらの相対的な重要性は、疾患依存的であるとみられる。
【0043】
本発明のＡＢＰは、ヒトＴＩＲＣ７に結合することができる。用語「Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７」又は「ＴＩＲＣ７」は、本明細書中で交換可能に使用され、ヒトＴＩＲＣ７のバリアント、アイソフォーム及び種ホモログを含む。ヒトＴＩＲＣ７タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ１３４８８（２０１９年９月２６日のバージョン）を有する。このタンパク質のさらなる同義語としては、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼ１１６ｋＤａサブユニットａアイソフォーム３が挙げられる。ヒトＴＩＲＣ７の遺伝子（ＴＣＩＲＧ１とも命名される）は、１１ｑ１３．２に位置し、ＨＧＮＣ：１１６４７というＨＧＮＣアクセッション（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ－２０１９年９月２６日のＨＧＮＣバージョン）を有する。しかしながら、本発明の抗体は、ある特定の好ましい場合において、ヒト以外の種由来のＴＩＲＣ７と交差反応しない場合がある。
【0044】
エピトープを決定するために、本分野で公知の標準的なエピトープマッピング法を使用することができる。例えば、上記抗体に結合するＴＩＲＣ７のフラグメント（ペプチド）（例えば、合成ペプチド）である可溶性タンパク質は、候補抗体又はその抗原結合フラグメントが同じエピトープに結合するかを判定するために使用できる。線状エピトープの場合、規定の長さ（例えば、８又はそれ以上のアミノ酸）の重複ペプチドが合成される。それらのペプチドを１アミノ酸ずつずらして、ＴＩＲＣ７タンパク質配列のすべての８アミノ酸フラグメントをカバーする一連のペプチドを調製することができる。ずらすアミノ酸を多くする、例えば、２又は３アミノ酸を用いることによって、より少ないペプチドを調製することができる。さらに、より長いペプチド（例えば、９、１０又は１１ｍｅｒ）を合成することもできる。抗体又は抗原結合フラグメントへのペプチドの結合は、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）及びＥＬＩＳＡアッセイをはじめとした標準的な方法を用いて測定できる。立体構造エピトープを調べる場合、より大きなＴＩＲＣ７フラグメントを使用できる。立体構造エピトープを定義するために質量分析を使用する他の方法がすでに報告されており、存在し得る（例えば、Ｂａｅｒｇａ－Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１：１３００－１３０８，２００２及びそれに引用されている参考文献を参照のこと）。エピトープを決定するためのさらに他の方法は、標準的な研究室の参考資料、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ＳｏｎｓのＵｎｉｔ６．８（“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂ－ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ”）及びＵｎｉｔ９．８（“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”）に提供されている。エピトープは、既知のエピトープに点変異又は欠失を導入し、次いで１つ以上の抗体又は抗原結合フラグメントとの結合を試験して、どの変異がその抗体又は抗原結合フラグメントの結合を低減させるかを判定することによって、確かめることができる。
【0045】
他の実施形態において、ＴＩＲＣ７機能の調節因子である、ＴＩＲＣ７に結合するＡＢＰは、代替的に又は追加的に、
・細胞性免疫応答（例えば、インビトロアッセイ又は被験体（例えば、それを必要とする被験体）におけるもの）を阻害し得るか、損ない得るか、低減し得るか、もしくは逆転し得る、且つ／又は
・液性免疫（例えば、インビトロアッセイ又は被験体（例えば、それを必要とする被験体）におけるもの）を阻害し得るか、損ない得るか、低減し得るか、もしくは逆転し得る。
・細胞性免疫応答（例えば、インビトロアッセイ又は被験体（例えば、それを必要とする被験体）におけるもの）を阻害し得るか、損ない得るか、低減し得るか、もしくは逆転し得る、且つ／又は
・液性免疫（例えば、インビトロアッセイ又は被験体（例えば、それを必要とする被験体）におけるもの）を阻害し得るか、損ない得るか、低減し得るか、もしくは逆転し得る。
【0046】
本明細書中で使用される用語「細胞性免疫応答」には、Ｔ細胞の成熟、増殖、活性化、遊走、浸潤及び／もしくは分化、並びに／又はマクロファージ、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球（又はＴ細胞）、ヘルパーＴリンパ球、メモリーＴリンパ球及び／もしくは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化／調節／遊走／浸潤、並びに／又は細胞が分泌可能な１つ以上の因子もしくは細胞によって分泌される１つ以上の因子、例えば、サイトカインもしくはオータコイド（特に炎症促進性サイトカイン）の産生、放出及び／もしくは効果、並びに／又はそのようなプロセスのいずれかの１つ以上の構成要素（例えば、サイトカイン又はオータコイド、特に炎症促進性サイトカイン）のうちのいずれか１つ又はそれらの組み合わせに関わる、それらを使用する及び／又は促進する、宿主生物における応答が含まれ得るが、これらに限定されない。本明細書中で使用される用語「細胞性免疫応答」には、遺伝的に操作された、インビトロで培養された、自己の、異種の、改変された、及び／又は移入されたＴリンパ球が関わる細胞応答が含まれ得るか、又は遺伝子操作によって作製される、細胞が分泌可能な因子又は細胞によって分泌される因子（例えば、サイトカイン又はオータコイド、特に炎症促進性サイトカイン）が含まれ得る。細胞性免疫応答は、好ましくは、宿主を害する可能性がある病的な免疫応答である。
【0047】
ある特定の実施形態において、細胞性免疫応答を媒介する細胞は、炎症促進性サイトカイン（例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７及びＩＬ－１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）［アルファ］、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）並びに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子からなる群より選択されるもの）を分泌することができる（例えば、分泌する）細胞（例えば、免疫細胞）によって媒介され得る。
【0048】
ある特定の実施形態において、細胞性免疫応答は、炎症促進性サイトカインを分泌する細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）、特に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって媒介され得る。
【0049】
特定の実施形態において、細胞性免疫応答は、自己免疫疾患の状況において自己細胞の殺滅を誘導し得る。
【0050】
用語「液性免疫」（又は「液性免疫応答」）も、当業者によって容易に理解され、分泌型抗体、補体タンパク質及びある特定の抗菌ペプチドなどの細胞外液中に見られる高分子によって媒介される免疫応答の態様を含む。液性免疫は、体液（ｈｕｍｏｒｓ）すなわち体液（ｂｏｄｙ ｆｌｕｉｄ）中に見られる物質が関与するので、そのように命名された。抗体が関わる態様は、抗体性免疫と呼ぶことができる。
【0051】
本発明のＡＢＰは、いくつかの好ましい実施形態において、その第１の抗原結合ドメインに、対立遺伝子ＩＧＨＶ１－２（アクセッション番号Ｘ０７４４８）、ＩＧＨＶ７－４－１＊０２又はＩＧＨＶ１－４６＊０１のヒトフレームワーク領域を含む重鎖可変領域を含み、好ましくは、ＩＧＨＶ１－２である。本発明のＡＢＰは、軽鎖内に、ＩＧＫＶ１－９（アクセッション番号Ｚ０００１３）、ＩＧＫＶ３－１１（アクセッション番号Ｘ０１６６８）、ＩＧＫＶ６－２１＊０１又はＩＧＫＶ１－１７＊０３のフレームワークを有する可変領域を好ましくは含む。しかしながら、結合親和性、アビディティー、並びに／又はリンパ球の動員及びリンパ球によって媒介される抗腫瘍細胞傷害性の活性化、特にＴ細胞媒介性免疫の活性化に対する活性が改善されたヒト化抗ＴＩＲＣ７抗体の変異バリアントを提供することが本発明の成果の１つである。ゆえに、本発明によれば、ＴＩＲＣ７に特異的な第１の抗原結合ドメインにおける本発明のＡＢＰであるＡＢＰは、ＩＭＧＴナンバリングに従う７８、８０、８２及び／又は８５位から選択される１つ以上の位置に変異を有する重鎖可変領域を含むことが好ましい。最も好ましくは、それらの変異は、ＩＭＧＴナンバリングに従う７８Ｌ、８０Ｓ、８２Ｋ及び／又は８５Ｓのうちのいずれか１つもしくは任意の組み合わせ又はすべてである。
【0052】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、重鎖可変領域が、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３又は８５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％という配列同一性を有するか、又は各場合において独立して、必要に応じて、これらの配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む、アミノ酸配列を含み、且つ／又は軽鎖可変領域が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４又は８６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％という配列同一性を有するか、又は各場合において独立して、必要に応じて、これらの配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む、アミノ酸配列を含む、ＡＢＰが提供される。
【0053】
本発明のいくつかの実施形態において、ＡＢＰの重鎖可変領域は、配列番号１１に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１２に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＡＢＰの重鎖可変領域は、配列番号１１に示されているアミノ酸配列、又は必要に応じて、この配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含むアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１２に示されているアミノ酸、又は必要に応じてこの配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含むアミノ酸を含む。
【0054】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、重鎖可変領域が、配列番号２５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは１００％という配列同一性を有するか、又は必要に応じてこの配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む、アミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４又は８６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列、又は各場合において独立して、必要に応じて、これらの配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む、アミノ酸配列を含む、ＡＢＰが提供される。
【0055】
本発明のいくつかの実施形態において、ＡＢＰの重鎖可変領域は、配列番号２５に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２６に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＡＢＰの重鎖可変領域は、配列番号２５に示されているアミノ酸配列、又は必要に応じて、この配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含むアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２６に示されているアミノ酸、又は必要に応じて、この配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含むアミノ酸を含む。
【0056】
本発明のいくつかの実施形態において、ＡＢＰの重鎖可変領域は、配列番号２７に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２８に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＡＢＰの重鎖可変領域は、配列番号２７に示されているアミノ酸配列、又は必要に応じて、この配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含むアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２８に示されているアミノ酸、又は必要に応じて、この配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含むアミノ酸を含む。
【0057】
本発明のいくつかの実施形態において、ＡＢＰの重鎖可変領域は、配列番号２９に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３０に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＡＢＰの重鎖可変領域は、配列番号２９に示されているアミノ酸配列、又は必要に応じて、この配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含むアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３０に示されているアミノ酸、又は必要に応じて、この配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含むアミノ酸を含む。
【0058】
本発明のいくつかの実施形態において、ＡＢＰの重鎖可変領域は、配列番号３１に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３２に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＡＢＰの重鎖可変領域は、配列番号３１に示されているアミノ酸配列、又は必要に応じて、この配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含むアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３２に示されているアミノ酸、又は必要に応じて、この配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含むアミノ酸を含む。
【0059】
本発明のいくつかの特定の実施形態において、重鎖可変領域が７８Ｌを含むＡＢＰが好ましく、ここで、そのナンバリングは、ＩＭＧＴシステムに従う。
【0060】
本発明に従うＡＢＰは、いくつかの実施形態において、ヒト抗体重鎖定常配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はヒト抗体重鎖定常配列と比べて２０、１５、１０、９、８、７、６、４個以下、好ましくは、３つ又は２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つの抗体重鎖定常配列を含むＡＢＰであり得る。そのような抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３領域のうちの１つ以上を有し得る。
【0061】
いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体重鎖配列、及び少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体軽鎖配列から構成される抗体又はその抗原結合フラグメントであり、ここで、その抗体重鎖配列及び抗体軽鎖配列はそれぞれ、以下の組み合わせのうちの１つの可変領域配列を含む。
【0062】
さらに、本発明のいくつかの実施形態は、ＴＩＲＣ７への結合について本発明のＡＢＰと競合して、例えば、ＴＩＲＣ７への本発明の抗体の結合を競合的に阻害する、ＡＢＰに関する。競合阻害を測定するために、当業者に公知の種々のアッセイを使用できる。例えば、交差競合アッセイを用いることにより、抗体又はその抗原結合フラグメントが、別の抗体又はその抗原結合フラグメントによるＴＩＲＣ７への結合を競合的に阻害するかを判定することができる。これらには、フローサイトメトリー又は固相結合解析を用いる細胞ベースの方法が含まれる。細胞表面上に発現されていないＴＩＲＣ７分子に対して抗体又はその抗原結合フラグメントが交差競合する能力を固相又は液相において評価する他のアッセイも使用できる。
【0063】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＢＰは、ＴＩＲＣ７又はそのパラログ、オルソログもしくは他のバリアントに（例えば、それらの１つ以上の細胞外ドメインによって提示される１つ以上のエピトープを介して）結合し得るか、又は特に、ＴＩＲＣ７の細胞外ドメインに２０ｎＭ未満（例えば、約１０ｎＭ、５ｎＭ又は２ｎＭ未満（特に、約１ｎＭ未満）のＫＤで結合し得る。好ましい実施形態において、本発明のＡＢＰは、ＴＩＲＣ７もしくはドメイン又はそのバリアント（例えば、それらのエピトープ）に１００ｐＭ未満のＫＤで結合する。より好ましい実施形態において、本発明のＡＢＰは、ＴＩＲＣ７もしくは細胞外ドメイン又はそのバリアントに５０ｐＭ未満のＫＤで結合する。最も好ましい実施形態において、本発明のＡＢＰは、ＴＩＲＣ７もしくはドメイン又はそのバリアントに３０ｐＭ未満のＫＤで、ある特定の実施形態では１０ｐＭ未満のＫＤで結合する。ＫＤは、好ましくは表面プラズモン共鳴によって測定される。
【0064】
本明細書中で使用される用語「細胞外ドメイン」（「ＥＣＤ」又は「ＥＣ」ドメイン）とは、通常、リガンド又は抗体の結合に関与する、細胞外の空間に露出された、タンパク質の領域のことを指す。ＴＩＲＣ７は、細胞内Ｎ末端、膜貫通ドメイン５と６との間のより大きな細胞外ループ及び細胞外の可動性のＣ末端を含む７回膜貫通ドメインタンパク質である。本発明のＡＢＰが結合する好ましい細胞外ドメインは、ＴＩＲＣ７の５番目の膜貫通ドメインと６番目の膜貫通ドメインとの間のタンパク質ループに位置する領域である。
【0065】
本明細書中で使用される用語「ＫＤ」は、ＫｄとＫａとの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表現される、解離定数のことを指すように意図されている。抗体のＫＤ値は、プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））、ＥＬＩＳＡ及びＫＩＮＥＸＡなどの本分野において確立された方法を用いて測定できる。抗体のＫＤを測定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによる方法、好ましくは、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる方法又はＥＬＩＳＡによる方法である。本明細書中で使用される「Ｋａ」（又は「Ｋ－ａｓｓｏｃ」）は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度のことを広く指すのに対して、本明細書中で使用される用語「Ｋｄ」（又は「Ｋ－ｄｉｓｓ」）は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度のことを指す。
【0066】
本発明に係るＡＢＰは、２本の鎖、つまり、いくつかの実施形態では軽鎖であり得る短い鎖及びいくつかの実施形態では重鎖としても扱われ得る主鎖を有し得る。ＡＢＰは、通常、これらの２本の鎖の二量体である。
【0067】
本発明のＡＢＰは、好ましくは、二重特異性ＡＢＰであり得る。二重特異性ＡＢＰは、（ｉ）前述の請求項のいずれか１項において定義されたような重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む可変領域であって、ここで、その可変領域は、ヒトＴＩＲＣ７に結合することができる第１の抗原結合ドメインを含む、可変領域、並びに（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインを含むＡＢＰの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得る。ＴＩＲＣ７に対する結合部位は、好ましくは、本明細書中に記載される本発明のＴＩＲＣ７結合抗体の結合部位であると理解される。
【0068】
「二重特異性」又は「二機能性」ＡＢＰは、２つの異なるエピトープ／抗原結合ドメイン（又は「部位」）を有するＡＢＰであって、ゆえに２つの異なる標的エピトープに対して結合特異性を有するＡＢＰである。これらの２つのエピトープは、同じ抗原のエピトープであってもよいし、本発明において好ましい場合、異なる抗原であるＴＩＲＣ７及びＣＤ３又はＴＩＲＣ７及びＴＣＲなどの異なる抗原のエピトープであってもよく、好ましくは、これらの抗原はヒト抗原である。
【0069】
「二重特異性ＡＢＰ」は、重鎖と軽鎖又は主鎖と短鎖／小鎖との第１の対によって定義される２つ以上の結合アームのうちの１つを用いて１つの抗原又はエピトープに結合し、重鎖と軽鎖又は主鎖と小さい鎖との第２の対によって定義される第２のアーム上で異なる抗原又はエピトープに結合する、ＡＢＰであり得る。二重特異性ＡＢＰのそのような実施形態は、特異性とＣＤＲ配列の両方が異なる２つの抗原結合アームを有する。通常、二重特異性ＡＢＰは、それが結合する各抗原に対して一価であり、すなわち、それぞれの抗原又はエピトープに対して１つのアームだけで結合する。しかしながら、二重特異性抗体は、二量体化又は多量体化も可能であり、これは本発明の状況において好ましい。二重特異性抗体は、第１の軽鎖可変領域と第１の重鎖可変領域とによって定義される第１の結合領域及び第２の軽鎖可変領域と第２の重鎖可変領域とによって定義される第２の結合領域を有し得る、ハイブリッドＡＢＰであり得る。これらの結合領域のうちの１つが重鎖／軽鎖対によって定義され得ることが本発明によって想定される。本発明の状況において、二重特異性ＡＢＰは、主鎖と小鎖との可変領域によって定義される第１の結合部位及びＡＢＰの主鎖に含まれるｓｃＦｖフラグメントの可変領域によって定義される第２の異なる結合部位を有し得る。
【0070】
二重特異性ＡＢＰを作製する方法は、本分野で公知であり、例えば、２つの異なるモノクローナル抗体の化学的結合体化、又は例えば、２つの抗体フラグメント、例えば、２つのＦａｂフラグメントの化学的結合体化である。あるいは、二重特異性ＡＢＰは、親抗体を産生するハイブリドーマの融合によるクアドローマ技術によって作製される。Ｈ鎖とＬ鎖との組み合わせがランダムであるので、１０個の異なる抗体構造の潜在的な混合物が生成され、そのうちのただ１つが所望の結合特異性を有する。
【0071】
本発明の二重特異性ＡＢＰは、各標的に対してモノクローナル抗体（ｍＡｂ）として作用できる。いくつかの実施形態において、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である。二重特異性ＡＢＰは、例えば、二重特異性タンデム一本鎖Ｆｖ、二重特異性Ｆａｂ２又は二重特異性ダイアボディであり得る。
【0072】
この文脈において、ＡＢＰが１つ以上の変異したアミノ酸残基を含み得ることが本発明の範囲内であることに注意されたい。核酸又はポリペプチドに関する用語「変異した」、「変異体」及び「変異」とは、「天然」又は「親」（参照が提供される場合）の核酸又はポリペプチド、すなわち、野生型を定義すると解釈できる参照配列と比べて、それぞれ１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の交換、欠失又は挿入のことを指す。例えば、親４Ｇ８分子の広範な突然変異変更によって得られる、本明細書中に記載されるような本発明のＡＢＰの可変ドメインが、親配列として解釈され得る。
【0073】
この点において、用語「位置」は、本発明に従って使用されるとき、本明細書中に描かれるアミノ酸配列内のアミノ酸の位置を意味すると理解される。この位置は、似ている天然配列、例えば、天然に存在するＩｇＧドメイン又は鎖の配列を基準にして指摘され得る。本明細書中で使用される用語「対応する」も、位置が、必ずしも前述のヌクレオチド／アミノ酸の番号によって決定されないこと、つまり前述のヌクレオチド／アミノ酸の番号だけによって決定されないことを含む。したがって、置換され得る本発明に従う所与のアミノ酸の位置は、抗体鎖のどこかにおけるアミノ酸の欠失又は付加に起因して、変動し得る。
【0074】
したがって、本発明に従う「対応する位置」の下において、アミノ酸は、指摘される番号が異なり得るが、類似の隣接アミノ酸をなおも有し得ることが理解されるべきである。交換、欠失又は付加され得るアミノ酸は、用語「対応する位置」によっても包含される。所与のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基が、天然に存在する免疫グロブリンドメイン又は鎖のアミノ酸配列におけるある特定の位置に対応するかを判定するために、当業者は、本分野で周知の手段及び方法、例えば、手作業によるアラインメント又はコンピュータプログラム（例えば、ベーシックローカルアラインメントサーチツールの略語であるＢＬＡＳＴ２．０もしくはＣｌｕｓｔａｌＷ又は配列アラインメントを生成するのに適した他の任意の好適なプログラム）を用いるアラインメントを使用できる。
【0075】
いくつかの実施形態において、置換（又は置き換え）は、保存的置換である。保存的置換は、一般に、以下に列挙される置換であり、変異される各アミノ酸の後に、保存的であると解釈できる１つ以上の置き換えが続いている。Ａｌａ→Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ；Ａｒｇ→Ｌｙｓ；Ａｓｎ→Ｇｌｎ、Ｈｉｓ；Ａｓｐ→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ→Ｓｅｒ；Ｇｌｎ→Ａｓｎ；Ｇｌｕ→Ａｓｐ；Ｇｌｙ→Ａｌａ；Ｈｉｓ→Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｉｌｅ→Ｌｅｕ、Ｖａｌ；Ｌｅｕ→Ｉｌｅ、Ｖａｌ；Ｌｙｓ→Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ；Ｍｅｔ→Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ；Ｐｈｅ→Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ；Ｓｅｒ→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ→Ｔｒｐ、Ｐｈｅ；Ｖａｌ→Ｉｌｅ、Ｌｅｕ。他の置換も許容でき、それは経験的に決定され得るか、又は他の公知の保存的置換もしくは非保存的置換と一致し得る。さらなるオリエンテーションとして、以下の８つの群はそれぞれ、互いに対して保存的置換を定義すると通常解釈され得るアミノ酸を含む。
－アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）；
－アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；
－アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）；
－アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）；
－イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）；
－フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）；
－セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）；及び
－システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）
－アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）；
－アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；
－アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）；
－アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）；
－イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）；
－フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）；
－セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）；及び
－システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）
【0076】
そのような置換が、生物学的活性を変化させる場合、より実質的な変更、例えば、以下のもの又はアミノ酸クラスに関して下記でさらに説明されるような変更が導入され得、その生成物が所望の特徴についてスクリーニングされ得る。そのようなより実質的な変更の例は、Ａｌａ→Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；Ａｒｇ→Ｇｌｎ；Ａｓｎ→Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；Ａｓｐ→Ａｓｎ；Ｃｙｓ→Ａｌａ；Ｇｌｎ→Ｇｌｕ；Ｇｌｕ→Ｇｌｎ；Ｈｉｓ→Ｌｙｓ；Ｉｌｅ→Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；Ｌｅｕ→Ａｌａ、Ｍｅｔ、ノルロイシン；Ｌｙｓ→Ａｓｎ；Ｍｅｔ→Ｐｈｅ；Ｐｈｅ→Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ；Ｔｒｐ→Ｐｈｅ；Ｔｙｒ→Ｔｈｒ、Ｓｅｒ；Ｖａｌ→Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａである。
【0077】
いくつかの実施形態において、本発明に係るＡＢＰは、システイン残基を介する二量体化を妨げるように又はＦｃ機能を調節するように変異される（上記を参照のこと）１つ以上のアミノ酸残基（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個のアミノ酸残基を含む）を含む。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、ＣＨ２ドメイン、及び／又はＦｃレセプターへの結合を媒介できるヒンジ領域の１つ以上のアミノ酸残基が変異される。Ｆｃレセプターへの結合を媒介できる１つ以上のアミノ酸残基は、存在する場合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）を活性化できるアミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃレセプターへの結合を媒介することができるそれぞれのアミノ酸残基は、一般に、配列をＩｇＧなどの免疫グロブリンにおける対応する天然に存在するドメインの配列と比較するとき、別のアミノ酸によって置換される。いくつかの実施形態において、Ｆｃレセプターへの結合を媒介することができるそのようなアミノ酸残基は、一般に、ＩｇＧなどの免疫グロブリンにおける対応する天然に存在するドメインの配列を基準として、欠失される。
【0078】
必要に応じて、上で説明したように、アミノ酸残基の置換又は欠失は、この効果のために行われ得る。好適な変異は、例えば、Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［１９９９］２９，２６１３－２６２４）から得ることができる。抗体鎖の配列への変異に適したさらなる位置は、ＦｃγＲＩＩＩとヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントとの複合体について公開された結晶構造データから得られ得る（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ［２０００］４０６，２６７－２７３）。「Ｆｃ減弱」又は結合親和性喪失のレベルを評価するために、上に記載されたような結合親和性の測定に加えて、Ｆｃレセプターへの結合を媒介する能力（の欠如）を機能的に評価することも可能である。１つの標的としてＣＤ３に結合するＡＢＰの場合、例えば、細胞上のそのようなＣＤ３結合ＡＢＰの有糸分裂促進性を通じて結合を評価することが可能である。有糸分裂促進性は、単球などのアクセサリー細胞上のＦｃレセプターにＣＤ３抗体が結合することによって媒介される。ＣＤ３に対して１つの結合部位を有する本発明のＡＢＰが細胞分裂促進作用を示さないのに対して、機能的Ｆｃ部を有する親モノクローナル抗ＣＤ３抗体が、Ｔ細胞において強い有糸分裂を誘導する場合、有糸分裂が起きないことに起因して、本発明のＡＢＰは、Ｆｃ結合の能力を欠き、ゆえに「Ｆｃノックアウト」分子とみなされ得ることが明白である。抗ＣＤ３媒介性の有糸分裂促進性を評価する方法の例証的な例は、Ｄａｖｉｓ，Ｖｉｄａ ＆ Ｌｉｐｓｋｙ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８６）１３７，３７５８）及びＣｅｕｐｐｅｎｓ，ＪＬ，＆ ｖａｎ Ｖａｅｃｋ，Ｆ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３９，４０６７又はＣｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１１８，１３６を参照のこと）によって説明されている。抗体の有糸分裂促進性を評価するためのアッセイのさらなる例証的で好適な例は、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ－Ａｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ－Ａｌｌｉｅｒｉ ＭＡ，Ｔｉｃｃｉｏｎｉ Ｍ，Ｄｅｃｋｅｒｔ Ｍ，Ｂｒｅｉｔｔｍｅｙｅｒ ＪＰ，Ｒｏｃｈｅｔ Ｎ，Ｒｏｕｌｅａｕｘ Ｍ，ａｎｄ Ｓｅｎｉｋ Ａ，Ｂｅｒｎｅｒｄ Ａ，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５ １６３（１）：８８－９５）及びＧｒｏｓｓｅ－Ｈｏｖｅｓｔ ｅｔ ａｌ．（Ｇｒｏｓｓｅ－Ｈｏｖｅｓｔ Ｌ，Ｈａｒｔｌａｐｐ Ｉ，Ｍａｒｗａｎ Ｗ，Ｂｒｅｍ Ｇ，Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ Ｈ－Ｇ，ａｎｄ Ｊｕｎｇ Ｇ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．［２００３］Ｍａｙ；３３（５）：１３３４－１３４０）によって説明されている。さらに、Ｆｃ結合の欠如は、本発明のＡＢＰがＦｃ部の周知のエフェクター機能のうちの１つ以上を媒介できるかによって評価され得る。
【0079】
上で述べたように、１つ以上のジスルフィド結合を導入するため又は除去するために（潜在的な又は以前から存在するジスルフィド結合の導入又は除去を含む）、システイン残基の置換又は欠失が行われ得る。それにより、本発明に係るＡＢＰの主鎖と、より低分子量の／より長さの短い鎖との連結が制御（確立、強化又は消失を含む）され得る。１つ以上のシステイン残基を導入又は除去することによって、ジスルフィド架橋が導入又は除去され得る。例証的な例として、本発明に係る四量体のＡＢＰは、一般に、２つの二量体ＡＢＰを連結する１つ以上のジスルフィド結合を有する。そのようなジスルフィド結合の１つは、通常、第１の二量体ＡＢＰの主鎖におけるシステイン及び第２の二量体ＡＢＰのヒンジ領域におけるシステインによって定義される。この点において、いくつかの実施形態において、本発明に係る抗体は、Ｋａｂａｔナンバリング［ＥＵインデックス］に従うヒトＩｇＧ免疫グロブリンの配列を基準にしたとき２２６及び／又は２２９位における天然のシステイン残基の、別のアミノ酸残基によるアミノ酸置換を含み得る。
【0080】
抗体のグリコシル化パターンを改変するために、アルギニン、アスパラギン、セリン、トレオニン又はチロシン残基などのアミノ酸残基の置換又は欠失も行われ得る。例証的な例として、ＩｇＧ分子は、単一のＮ結合型二分岐炭水化物をＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に有する。血清由来のＩｇＧ、又はハイブリドーマもしくは操作された細胞においてエキソビボで生成されたＩｇＧの場合、そのＩｇＧは、Ａｓｎ２９７に連結した炭水化物に関して不均一である。ヒトＩｇＧの場合、コアのオリゴ糖は、通常、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃからなり、外側の残基の数は異なる。
【0081】
示されるように、抗原／エピトープの結合のほかに、免疫グロブリンは、免疫グロブリンのＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域又はアミノ酸配列バリアントのＦｃ領域）に起因し得る生物学的活性であるさらなる「エフェクター機能」を有し、免疫グロブリンのアイソタイプによって異なると知られている。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション、並びにＢ細胞活性化が挙げられる。抗体のエフェクター機能の発揮には、一般に、エフェクター細胞の動員が必要である。いくつかの免疫グロブリンのエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃレセプター（ＦｃＲ）によって媒介される。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対する特異性によって定義され、ＩｇＧ抗体に対するＦｃレセプターは、ＦｃγＲと称され、ＩｇＥに対するＦｃレセプターは、ＦｃεＲと称され、ＩｇＡに対するＦｃレセプターは、ＦｃαＲと称されるなど。本発明のＡＢＰがＦｃ結合の能力を欠くかを評価するために、ＣＤＣ又はＡＤＣＣなどのこれらのエフェクター機能（又はそのようなエフェクター機能の喪失）のいずれかを使用できる。
【0082】
この文脈において、用語「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合することができるレセプター、一般にタンパク質を定義することに注意されたい。Ｆｃレセプターは、生物の免疫系のある特定の細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球及びマスト細胞の表面上に見られる。インビボのＦｃレセプターは、感染細胞上に固定化された又は侵入病原体上に存在する免疫グロブリンに結合する。それらの活性は、貪食細胞又は細胞傷害性細胞を刺激して、抗体性食作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害によって微生物又は感染細胞を破壊する。フラビウイルスなどの一部のウイルスは、抗体依存性感染増強として知られる機構によって、細胞に感染するのを助けるようにＦｃレセプターを使用する。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）において概説されている。
【0083】
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」とは、補体の存在下における標的細胞の溶解のことを指す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１成分（Ｃｌｑ）が、同族抗原に結合した抗体（適切なサブクラスの抗体）に結合することによって惹起される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９７）に記載されているようなアッセイが行われ得る。
【0084】
用語「補体系」は、一般に、不活性な前駆体（プロタンパク質）として循環している、血液中に見られる、補体因子と呼ばれるいくつかの低分子タンパク質のことを指すために本分野において使用される。この用語は、この変更できず適応できない系が、抗体及び食細胞が細菌などの病原体並びに抗原－抗体複合体を生物から除去する能力を「補完」する能力のことを指す。補体因子の例は、Ｃ１ｑ並びに２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒ及びＣ１ｓを含むＣ１複合体である。このＣ１複合体は、ＣＤＣ経路の構成要素である。Ｃ１ｑは、およそ４６０，０００の分子量を有する６価の分子であり、６つのコラーゲンの「柄」が６つの球状頭部領域に接続されているチューリップの花束に連結した構造を有する。補体カスケードを活性化するためには、Ｃ１ｑは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３のうちの少なくとも２つの分子に結合しなければならない。
【0085】
「抗体依存性細胞傷害」又はＡＤＣＣとは、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター（ＦｃＲ）上に結合した免疫グロブリン分子によって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、その後、その標的細胞を細胞毒によって殺滅することが可能になる、細胞傷害の１つの形態のことを指す。抗体は、細胞傷害性細胞を「武装」させ、この機構による標的細胞の殺滅に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩだけを発現するのに対して、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲｌＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ（例えば、米国特許第５，５００，３６２号又は同第５，８２１，３３７号に記載されているアッセイ）が行われ得る。そのようなアッセイにとって有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボにおいて、例えば、動物モデル（例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されている動物モデル）において、評価され得る。
【0086】
本発明は、ある特定の好ましい実施形態において、抗体の細胞傷害性を低下させる又は無くすように開発された公知のすべてのストラテジーを包含するものとする。ヒト抗体において効果的なストラテジーの１つは、残基Ａｓｎ２９７におけるＮ結合型グリコシル化を無くすことであり、それは、Ａｓｎ２９７をアラニン、グリシンもしくはアスパラギン酸で置換すること、又は２９９位のセリン／トレオニン残基を改変することによって達成される。抗体のエフェクター機能を緩和するための、本発明に包含される代替のストラテジーとしては、抗体の下部のヒンジにおける残基の置換、例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）が挙げられる。これらの残基は、ＣＨ２ドメイン上のＦｃγレセプター結合部位の一部を形成しており、エフェクター機能がより高い又はより低い抗体アイソタイプ間でこれらの残基が交換されていることから、ＡＤＣＣにおける重要性が明らかになった。これらの部位におけるアラニン置換は、ヒト抗体とマウス抗体の両方においてＡＤＣＣの低下に有効であるが、これらの置換は、ＣＤＣ活性の低下にはあまり有効でない。ＦｃのＣ１ｑ結合部位をマッピングするためのランダム変異誘発アプローチによって特定された別の単一バリアントであるＰ３２９Ａが、ＡＤＣＣ活性を保持しつつ、ＣＤＣ活性の低下に非常に効果的であると示された。
【0087】
本発明のＡＢＰは、任意の公知の確立された発現系及び組換え細胞培養技術を用いて、例えば、細菌宿主（原核細胞系）、又は真核細胞系、例えば、酵母、真菌、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞における発現によって、作製され得る。本発明のＡＢＰは、トランスジェニック生物、例えば、ヤギ、植物、又はヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きなフラグメントを有し、マウス抗体産生が欠損している、操作されたマウス系統であるＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスにおいても作製され得る。抗体は、化学合成によっても作製され得る。
【0088】
本発明の組換えＡＢＰを作製する場合、通常、抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニング（増幅）又は発現に向けて、プラスミドなどの複製可能なベクターに挿入する。好適な発現系の例証的な例は、グルタミン酸シンテターゼ系（例えば、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから販売されているもの）であり、ここで、宿主細胞は、例えばＣＨＯ又はＮＳｏである。抗体をコードするポリヌクレオチドは、従来の手順を用いて容易に単離され、配列決定される。使用され得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体が挙げられ、それらのうち、プラスミドが典型的な実施形態である。一般に、そのようなベクターはさらに、発現を容易にするように軽鎖及び／又は重鎖ポリヌクレオチドに作動可能に連結された、シグナル配列、複製開始点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列を含む。軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別個のベクターに挿入され、同じ宿主細胞にトランスフェクトされてもよいし、所望であれば、重鎖と軽鎖の両方が、同じベクターに挿入されて、宿主細胞へトランスフェクションされてもよい。両方の鎖が、Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９４）Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｉｇｈｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｇｅｎｅ １５１，１３１－１３５又はＳｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９４）Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ，ｐＡＳＫ８４，ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｇｅｎｅ １４１，７９－８に記載されているように、例えば、ジシストロニックオペロンの支配下に配置され、発現されて、正しく折り畳まれた機能的なＡＢＰをもたらすことができる。したがって、本発明の１つの態様によれば、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖及び／又は重鎖をコードするベクターを構築するプロセスが提供され、その方法は、本発明のＡＢＰの軽鎖及び／又は重鎖をコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入することを含む。
【0089】
組換え手法を使用するとき、ＡＢＰは、細胞内にもしくは細胞周辺腔に生成され得るか、又は培地中に直接分泌され得る（Ｓｋｅｒｒａ １９９４，前出も参照のこと）。抗体が、第１の工程として細胞内に生成される場合、宿主細胞又は溶解されたフラグメントである粒子状の残屑が、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）には、Ｅ ｃｏｌｉの細胞周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順が説明されている。抗体は、任意の酸化環境においても生成され得る。そのような酸化環境は、Ｅ．ｃｏｌｉなどのグラム陰性菌の周辺質、グラム陽性菌の細胞外環境又は真核細胞（昆虫細胞又は哺乳動物細胞などの動物細胞を含む）の小胞体の内腔に提供され得、通常、構造的なジスルフィド結合の形成に好都合である。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞のサイトゾルにおいて本発明のＡＢＰを生成することも可能である。この場合、そのポリペプチドは、折り畳まれた可溶性の状態で直接得ることができるか、又は封入体の形態で回収された後、インビトロで再生できる。さらなる選択肢は、細胞内の酸化環境を有するがゆえに、サイトゾルにおいてジスルフィド結合の形成が可能であり得る、特異的な宿主株を使用することである（Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｍ，Ｓｅｉｆｅｒｔ Ｃ，Ｈｕｎｔｅ Ｃ．（２００２）“Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｎ ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５，１－８）。
【0090】
上記細胞によって産生されたＡＢＰは、任意の従来の精製技術、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティークロマトグラフィーが、好ましい精製手法の１つである。ＡＢＰは、ＣＨ１又はＣＬドメインなどの定常ドメインに特異的且つ可逆的に結合するタンパク質／リガンドを用いた親和性精製を介して精製され得る。そのようなタンパク質の例は、免疫グロブリンに結合する細菌タンパク質、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ又はプロテインＬであり、ここで、プロテインＬの結合は、カッパー軽鎖を含むＡＢＰに限定される。κ－軽鎖を有する抗体を精製するための代替方法は、ビーズに結合した抗カッパー抗体（ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ）を使用することである。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適格性は、その抗体に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、抗体を精製するために使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプ及びヒトガンマ３に対して推奨されている（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。本発明の特定のＡＢＰに対して使用される精製方法の選択は、当業者の知識の範囲内である。
【0091】
本発明のＡＢＰの鎖のうちの１つに１つ以上の親和性タグを備え付けることも可能である。Ｓｔｒｅｐ－タグ（登録商標）又はＳｔｒｅｐ－タグ（登録商標）ＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５，７５３－７６６）、ｍｙｃ－タグ、ＦＬＡＧＴＭ－タグ、Ｈｉｓ６－タグ又はＨＡ－タグなどの親和性タグが、組換えＡＢＰの容易な検出を可能にし、その簡便な精製も可能にする。
【0092】
ここで本発明の核酸に目を向けると、本発明に係る抗体の１つ以上の鎖をコードする核酸分子は、一本鎖、二本鎖又はそれらの組み合わせなど、任意の存在し得る配置の任意の核酸であり得る。核酸としては、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ヌクレオチドアナログ又は核酸化学を用いて作製されるＤＮＡ又はＲＮＡのアナログ、ロックト核酸分子（ＬＮＡ）、及びタンパク質核酸分子（ＰＮＡ）が挙げられる。ＤＮＡ又はＲＮＡは、ゲノム起源であってもよいし、合成起源であってもよく、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。そのような核酸は、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ合成ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとの共重合体、オリゴヌクレオチドなどであり得る。それぞれの核酸はさらに、非天然のヌクレオチドアナログを含んでもよく、且つ／又は親和性タグもしくはラベルに連結されてもよい。
【0093】
いくつかの実施形態において、本発明に係る抗体の主鎖及び／又は小鎖などの鎖をコードする核酸配列は、プラスミドなどのベクターに含められる。抗体の天然に存在するドメイン又は領域と比べて置換又は欠失が抗体鎖に含められる場合、それぞれの天然のドメイン／領域のコード配列、例えば、免疫グロブリンの配列に含まれるコード配列が、突然変異誘発のための出発点として使用され得る。選択されたアミノ酸位置の変異誘発のために、当業者は、部位特異的変異誘発のために確立された様々な標準的な方法を自由に利用できる。通常使用される手法は、所望の配列位置に縮重塩基組成物を有する合成オリゴヌクレオチドの混合物を使用したＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて変異を導入することである。例えば、コドンＮＮＫ又はＮＮＳ（ここで、Ｎ＝アデニン、グアニン又はシトシン又はチミン；Ｋ＝グアニン又はチミン；Ｓ＝アデニン又はシトシンである）を使用することにより、突然変異誘発において２０個すべてのアミノ酸及びアンバー停止コドンを組み込むことが可能になるのに対して、コドンＶＶＳは、そのポリペプチド配列の選択された位置にアミノ酸Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌが組み込まれることを排除するので、組み込まれる可能性があるアミノ酸の数を１２個に限定する。コドンＮＭＳ（ここで、Ｍ＝アデニン又はシトシンである）を使用することにより、例えば、選択された配列位置にアミノ酸Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌが組み込まれることを排除するので、選択された配列位置に存在する可能性のあるアミノ酸の数を１１個に限定する。この点において、セレノシステイン又はピロリシン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）などの他のアミノ酸（通例の２０個の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸）に対するコドンも、ＡＢＰの核酸に組み込まれ得ることに注意されたい。Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２，４９８－５００又はＷａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１，１－１１に説明されているように、他の珍しいアミノ酸、例えば、ｏ－メチル－Ｌ－チロシン又はｐ－アミノフェニルアラニンを挿入するために、通常、終止コドンとして認識されるＵＡＧなどの「人工」コドンを使用することも可能である。
【0094】
例えば、イノシン、８－オキソ－２’デオキシグアノシン又は６（２－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノシル）－３，４－ジヒドロ－８Ｈ－ピリミン－ド－１，２－オキサジン－７－オン（Ｚａｃｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５，５８９－６０３）のような、塩基対の特異性が低いヌクレオチド基本単位の使用は、選択された配列セグメントに変異を導入するための別の選択肢である。さらなる可能性は、いわゆるトリプレット突然変異誘発である。この方法では、異なるヌクレオチドトリプレットの混合物（各々が、コード配列に組み込むための１つのアミノ酸をコードする）を使用する（Ｖｉｒｎｅｋａｓ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２，５６００－５６０７）。
【0095】
本発明に係る抗体の主鎖及び／又は小鎖などの鎖をコードする核酸分子は、任意の好適な発現系を用いて、例えば、好適な宿主細胞又は無細胞系において、発現され得る。得られたＡＢＰは、選択及び／又は単離によって、濃縮され得る。好ましくは、本発明の核酸は、ベクター／プラスミドなどの遺伝子構築物として提供される。
【0096】
核酸のシステム、すなわち、そのような本発明の核酸を含む構築物がさらに提供され、ここで、本発明のシステムは、本発明の少なくとも２つの核酸を含み、それらの核酸の各々が本発明のＡＢＰの１つのモノマーをコードし、例えば、１つの核酸が重鎖配列をコードし、第２の核酸が軽鎖配列をコードする。
【0097】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＢＰのポリペプチドは、インビボ又はインビトロで発現するための核酸によってコードされ得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＡＢＰをコードする単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態において、その核酸は、本発明のＡＢＰの一部分又はモノマー（例えば、抗体の２本の鎖（重鎖及び軽鎖）のうちの一方）をコードし、且つ／又は別の核酸が、本発明のＡＢＰの別の一部分又はモノマー（例えば、抗体の２本の鎖のうちの他方）をコードする。そのような核酸は、組み合わせて、又は一緒に１つの系として、提供され得る。いくつかの実施形態において、その核酸は、２つ以上のＡＢＰポリペプチド鎖、例えば、少なくとも２本の抗体鎖をコードする。複数のＡＢＰ鎖をコードする核酸は、少なくとも２つの鎖配列の間に核酸切断部位を含み得、２つ以上の鎖配列の間に転写開始部位又は翻訳開始部位をコードし得、且つ／又は２つ以上のＡＢＰ鎖の間にタンパク分解性の標的部位をコードし得る。
【0098】
関係する１つの態様において、本発明は、本発明の少なくとも１つの核酸（例えば、上に記載されたもの）を含む核酸構築物（ＮＡＣ）に関する。そのようなＮＡＣは、細胞（例えば、宿主細胞）において、コードされるＡＢＰ又は前記ＡＢＰの構成要素の発現を可能にする１つ以上のさらなる特徴を含み得る。本発明のＮＡＣの例としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ｍＲＮＡ、非エピソーム哺乳動物ベクター及び発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の核酸構築物は、本発明の核酸を、宿主細胞などの細胞におけるその核酸の発現に適した形態で含み得る（下記を参照のこと）。本発明の核酸構築物は、通常、組換え核酸であり、且つ／又は単離されたもの及び／もしくは実質的に純粋なものであり得る。組換え核酸は、通常、非天然のものであり、特に、異なる種に由来する部分及び／又は合成の、インビトロのもしくは変異原性の方法に由来する部分を含む場合、非天然のものである。
【0099】
いくつかの実施形態において、本発明のＮＡＣは、１つ以上の構築物を含み、それらの構築物のいずれかは、抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、本発明のＮＡＣは、２つの構築物を含み、それらの構築物の一方が、抗体の重鎖をコードする核酸を含み、他方が、抗体の軽鎖をコードする核酸を含み、その結果、両方の構築物からの発現によって、完全な抗体分子が生成され得る。いくつかの実施形態において、本発明のＮＡＣは、抗体の重鎖と軽鎖の両方をコードする核酸を含む構築物を含み、その結果、１つの構築物から完全な抗体分子が発現され得る。他の実施形態において、本発明のＮＡＣは、例えばコードされるＡＢＰがｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科動物の抗体）である場合、本発明のＡＢＰを形成するのに十分な一本鎖をコードする単一の構築物を含み得る。
【0100】
さらに、本発明の１つのさらなる態様は、本明細書中に開示されるようなＡＢＰ又はＡＢＰの一部もしくはモノマーをコードする核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。例えば、ＡＢＰが多量体タンパク質であるいくつかの実施形態では、その核酸は、抗原構築物の１つのポリペプチド鎖だけをコードする。ゆえに、そのような抗原結合構築物を発現するために、本発明の発現ベクターは、各々がＡＢＰの別個の一部又はモノマーをコードする２つ以上の核酸を含み得、それらの核酸は、組み合わさってＡＢＰ全体を発現する。同じように、抗原結合構築物の一部又はモノマーだけをコードする核酸を含む本発明の発現ベクターは、各々がＡＢＰの別個の一部又はモノマーをコードする本発明の他の別個の発現ベクターと組み合わせて使用され得る。他の実施形態において、その核酸は、本発明のＡＢＰの複数のポリペプチド鎖をコードする。いくつかの実施形態において、その発現ベクターには、哺乳動物での発現用のｐｃＤＮＡ３．１ＴＭ／ｍｙｃ－Ｈｉｓ（－）バージョンＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）又はそのバリアントが含まれる。ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターは、哺乳動物での発現用のＣＭＶプロモーター、及び哺乳動物（ネオマイシン）選択マーカーと細菌（アンピシリン）選択マーカーの両方を特徴とする。いくつかの実施形態において、発現ベクターには、プラスミドが含まれる。いくつかの実施形態において、ベクターには、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター又はアデノウイルスベクターが含まれる。実施形態において、ベクターには、コスミド、ＹＡＣ又はＢＡＣが含まれる。
【0101】
別の関係する態様では、本発明は、本発明の１つ以上の核酸を含む細胞（例えば、宿主細胞及び／又は組換え宿主細胞）に関する。好ましくは、そのような細胞は、その核酸によってコードされるＡＢＰ（又はその構成要素）を発現することができる。例えば、本発明のＡＢＰが、２つの別個のポリペプチド鎖（例えば、ＩｇＧの重鎖及び軽鎖）を含む場合、本発明の細胞は、そのようなＡＢＰの重鎖をコードする（及び発現できる）第１の核酸並びにそのようなＡＢＰの軽鎖をコードする（及び発現できる）第２の核酸を含んでもよいし、或いは、その細胞は、そのようなＡＢＰの両方の鎖をコードする単一の核酸を含んでもよい。このように、そのような本発明の細胞は、本発明の機能的ＡＢＰを発現することができるであろう。本発明の（宿主）細胞は、本明細書中の他の箇所に記載されているような、哺乳動物、原核生物又は真核生物の宿主細胞のうちの１つであり得、特に、その細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【0102】
そのような態様のある特定の実施形態において、（宿主）細胞は、ヒト細胞であり、特に、特定の個体からサンプリングされたヒト細胞（例えば、自己ヒト細胞）であり得る。そのような実施形態では、そのようなヒト細胞は、本発明の核酸を導入するために、インビトロで増殖及び／又は操作され得る。特定の個体由来の操作されたヒト細胞の有用性は、治療において使用するためなど、そのような操作されたヒト細胞の集団をヒト被験体に再導入することを含む、本発明のＡＢＰを作製することであり得る。ある特定のそのような使用において、操作されたヒト細胞は、最初にサンプリングされた同じヒト個体に、例えば自己ヒト細胞として、導入され得る。
【0103】
そのような操作に供されるヒト細胞は、任意の生殖細胞型又は身体内の体細胞型であり得る。例えば、ドナー細胞は、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、グリア細胞、アストロサイト、心臓細胞、食道細胞、筋細胞、メラノサイト、造血細胞、マクロファージ、単球及び単核細胞からなる群より選択される体細胞又は生殖細胞であり得る。ドナー細胞は、身体内の任意の臓器又は組織から得ることができ、例えば、肝臓、胃、腸、肺、膵臓、角膜、皮膚、胆嚢、卵巣、精巣、腎臓、心臓、膀胱及び尿道からなる群より選択される臓器由来の細胞であり得る。
薬学的組成物
薬学的組成物
【0104】
本発明は、本発明のＡＢＰ、並びに必要に応じて、薬学的に許容され得る賦形剤及び／又はキャリアを含む薬学的組成物も提供する。
【0105】
治療において使用されるために、本発明のＡＢＰ、核酸又はＮＡＣ（又は宿主細胞などの細胞）は、動物又はヒトへの投与を容易にするのに適切な薬学的組成物に製剤化され得る。用語「薬学的組成物」は、薬学的に使用するための、治療的に活性な物質（例えば、本発明のＡＢＰ）を含む物質の混合物を意味する。
【0106】
例として、本発明の薬学的組成物は、０．１％～１００％（ｗ／ｗ）の活性成分（例えば、本発明のＡＢＰ）、例えば、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、８％ １０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、好ましくは、約１％～約２０％、約１０％～５０％又は約４０％～９０％を含み得る。
【0107】
本発明に係るＡＢＰは、タンパク質性薬物にとって治療的に有効な任意の腸管外経路又は非腸管外（経腸的）経路を介して投与され得る。腸管外の適用方法としては、例えば、注射溶液、注入溶液又はチンキ剤の形態などでの、皮内、皮下、筋肉内、気管内、鼻腔内、硝子体内又は静脈内注射及び注入の手法、並びにエアロゾル混合物、スプレー又は粉末の形態などでの、エアロゾル注入及び吸入が挙げられる。薬物の肺送達、すなわち、エアロゾルの吸入（鼻腔内投与でも使用され得る）又は気管内注入のいずれかを介する送達に関する概説は、例えば、Ｊ．Ｓ．Ｐａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｌｕｎｇｓ ａｓ ａ ｐｏｒｔａｌ ｏｆ ｅｎｔｒｙ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃ．２００４ Ｖｏｌ．１ ｐａｇｅｓ ３３８－３４４に提供されている。非腸管外の送達様式は、例えば、丸剤、錠剤、カプセル剤、溶液もしくは懸濁液の形態などでの、経口的な様式、又は坐剤の形態などでの、直腸的な様式である。本発明のＡＢＰは、従来の無毒性の薬学的に許容され得る賦形剤又はキャリア、添加物及びビヒクルを所望のとおり含む製剤として全身的又は局所的に投与され得る。
【0108】
本発明の１つの実施形態において、医薬品は、哺乳動物、特にヒトに、腸管外に投与される。対応する投与方法としては、例えば、注射溶液、注入溶液又はチンキ剤の形態などでの、皮内、皮下、筋肉内、気管内又は静脈内注射及び注入の手法、並びにエアロゾル混合物、スプレー又は粉末の形態などでの、エアロゾル注入及び吸入が挙げられるが、これらに限定されない。静脈内及び皮下注入及び／又は注射の組み合わせは、血清半減期が比較的短い化合物の場合に最も好都合であり得る。薬学的組成物は、水溶液、水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンであり得る。
【0109】
この点において、Ｍｅｉｄａｎ ＶＭ ａｎｄ Ｍｉｃｈｎｉａｋ ＢＢ ２００４ Ａｍ．Ｊ．Ｔｈｅｒ．１１（４）：３１２－３１６に記載されているような経皮的送達技術、例えば、イオン導入、ソノフォレーシス又はマイクロニードルによって強化される送達も、本明細書中に記載されるＡＢＰの経皮的送達に使用できることに注意されたい。非腸管外の送達様式は、例えば、丸剤、錠剤、カプセル剤、溶液もしくは懸濁液の形態などでの、経口的な様式、又は坐剤の形態などでの、直腸的な投与である。本発明のＡＢＰは、種々の従来の無毒性の薬学的に許容され得る賦形剤又はキャリア、添加物及びビヒクルを含む製剤として全身的又は局所的に投与され得る。
【0110】
適用されるＡＢＰの投与量は、所望の予防効果又は治療反応を達成するための広い範囲内で変動し得る。それは、例えば、選択される標的に対するＡＢＰの親和性、並びにＡＢＰとリガンドとの複合体のインビボ半減期に依存する。さらに、最適な投与量は、ＡＢＰ又はその結合体の体内分布、投与の様式、処置される疾患／障害の重症度、並びに患者の病状に依存する。例えば、局所的適用のために軟膏として使用されるときは、高濃度のＡＢＰを使用できる。しかしながら、求められれば、ＡＢＰは、徐放製剤、例えば、ＰｏｌｙＡｃｔｉｖｅＴＭ又はＯｃｔｏＤＥＸＴＭ（Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｂｒｉｅｆｉｎｇ：Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ ２００３：１－６を参照のこと）のようなリポソーム分散液又はヒドロゲルベースのポリマーミクロスフェアとしても投与され得る。他の利用可能な徐放製剤は、例えば、ＰＬＧＡベースのポリマー（ＰＲ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＰＬＡ－ＰＥＧベースのヒドロゲル（Ｍｅｄｉｎｃｅｌｌ）及びＰＥＡベースのポリマー（Ｍｅｄｉｖａｓ）である。
【0111】
したがって、本発明のＡＢＰは、薬学的に許容され得る成分並びに確立された調製方法（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｌ．ａｎｄ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を用いて組成物に製剤化され得る。薬学的組成物を調製するために、薬学的に不活性な無機賦形剤又は有機賦形剤が使用され得る。例えば、丸剤、散剤、ゼラチンカプセル剤又は坐剤を調製するために、例えば、ラクトース、タルク、ステアリン酸及びその塩、脂肪、ろう、固体又は液体のポリオール、天然油並びに硬化油が使用され得る。溶液、懸濁液、エマルジョン、エアロゾル混合物、又は使用前に溶液もしくはエアロゾル混合物に再構成する粉末を作製するのに好適な賦形剤としては、水、アルコール、グリセロール、ポリオール及びそれらの好適な混合物並びに植物油が挙げられる。
【0112】
薬学的組成物は、添加物、例えば、充填剤、結合剤、湿潤剤、滑剤、安定剤、保存剤、乳化剤、及びさらには、デポー効果を達成するための溶媒又は可溶化剤又は作用物質も含み得る。後者は、融合タンパク質が、持続放出系又は徐放系又は標的化送達系、例えば、リポソーム及びマイクロカプセルに組み込まれ得るものである。
【0113】
上記製剤は、細菌保持フィルターによる濾過を含む数多くの手段によって、又は使用直前に滅菌水もしくは他の滅菌媒質に溶解もしくは分散され得る滅菌された固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌され得る。
【0114】
投与を容易にするため、及び投与量の均一性のために、経口、直腸又は腸管外組成物を投与単位形態（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）で製剤化することが特に有益である。本明細書中で使用される投与単位形態には、処置される被験体に対する単位投与量としてふさわしい物理的に不連続な単位が含まれる。各単位は、必要な薬学的キャリアとともに所望の治療効果をもたらすと計算される所定の量の活性な化合物を含む。本発明の投与単位形態の仕様は、活性な化合物のユニークな特性及び達成されるべき特定の治療効果、並びに個体を処置するためにそのような活性な化合物を配合する技術に固有の限界によって規定され、それらに直接依存する。
【0115】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＢＰ又は他の構成要素（例えば、核酸又はＮＡＣ）を含む薬学的組成物は、１０～１０００ｍｇの本発明のＡＢＰ又は他の構成要素という単位用量の形態である。いくつかの実施形態において、本発明のＡＢＰ又は他の構成要素を含む薬学的組成物は、１０～２００ｍｇのＡＢＰ又は他の構成要素という単位用量の形態である。いくつかの実施形態において、ＡＢＰを含む薬学的組成物は、２００～４００ｍｇのＡＢＰ又は他の構成要素という単位用量の形態である。いくつかの実施形態において、ＡＢＰ又は他の構成要素を含む薬学的組成物は、４００～６００ｍｇのＡＢＰ又は他の構成要素という単位用量の形態である。いくつかの実施形態において、ＡＢＰ又は他の構成要素を含む薬学的組成物は、６００～８００ｍｇのＡＢＰ又は他の構成要素という単位用量の形態である。いくつかの実施形態において、ＡＢＰ又は他の構成要素を含む薬学的組成物は、８００～１０００ｍｇのＡＢＰ又は他の構成要素という単位用量の形態である。
【0116】
ＡＢＰ又は他の構成要素を含む薬学的組成物の例示的な単位剤形は、錠剤、カプセル剤（例えば、散剤、顆粒剤、微小錠剤又はマイクロペレットとして）、懸濁液又は使い捨ての充填済みシリンジである。ある特定の実施形態において、単一用量の投与単位を作製するためのキットが提供される。そのキットは、乾燥した活性成分を有する第１の容器と水性製剤を有する第２の容器の両方を含み得る。あるいは、そのキットは、シングルチャンバー及びマルチチャンバーの充填済みシリンジを含み得る。
【0117】
そのような活性成分の毒性及び治療効果（例えば、有効性）は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死性の用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を測定するための、標準的な薬学的手順によって細胞培養物又は実験動物において測定され得る。毒性と治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現され得る。高い治療指数を示す活性な作用物質が好ましい。毒性の副作用を示す化合物も使用してよいが、非感染細胞に対する潜在的な損傷を最小限に抑え、それにより副作用を低減させるために、そのような化合物を罹患組織部位に標的化する送達系をデザインするように注意を払うべきである。
【0118】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ある範囲の投与量の活性成分（例えば、本発明のＡＢＰ又は他の構成要素）を製剤化する際に、例えば、ヒトにおいて使用するために使用できる。そのような活性成分の投与量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。その投与量は、使用される剤形及び使用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の治療的アプローチにおいて使用されるいずれの活性成分についても、（治療）有効量は、まずは細胞培養アッセイから推定され得る。動物モデルでは、細胞培養において測定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する活性成分の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように用量を製剤化できる。そのような情報を用いることにより、例えばヒトに投与するための、有用な（例えば、有効な）量又は用量をより正確に決定できる。薬学的組成物は、投与の指示書と共に、容器、パック又はディスペンサーに含められ得る。
【0119】
本発明の文脈において、有効量の本発明のＡＢＰ又は他の構成要素又は薬学的組成物は、研究者、科学者、薬理学者、薬剤師、獣医師、医師又は他の臨床医が調べている細胞、組織、系、身体、動物、個体、患者又はヒトの生物学的、生理学的、薬理学的、治療的又は医学的な応答を誘発する、例えば、障害、疾患又は状態（例えば、増殖性障害、例えば、癌又は腫瘍）の影響／症状を和らげる、又は増殖性障害に関わる細胞（例えば、腫瘍細胞）を殺滅するもしくはその成長を阻害する、ものであり得る。その有効量は、下記で説明される手順を含む標準的な手順によって決定され得る。
【0120】
本明細書中に提供される処置の医学的な使用及び方法のあらゆる態様及び実施形態によれば、本発明のＡＢＰ又は他の構成要素による処置を必要とする被験体に少なくとも１回投与される有効量は、通常、１投与あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１投与あたり約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、被験体に少なくとも１回投与されるＡＢＰ又は他の構成要素の有効量は、１投与あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、１投与あたり約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、１投与あたり約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、１投与あたり約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、１投与あたり約１０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ又は１投与あたり約５０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇである。
【0121】
疾患の予防又は処置の場合、ＡＢＰ又は他の構成要素（又はそれらを含む薬学的組成物）の適切な投与量は、処置される疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、ＡＢＰ又は他の構成要素及び／又は薬学的組成物が予防目的で投与されるのか又は治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の病歴、年齢、サイズ／体重及びＡＢＰもしくは他の構成要素及び／又は薬学的組成物に対する応答、並びに主治医の裁量に依存する。ＡＢＰもしくは他の構成要素及び／又は薬学的組成物は、一度に又は一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。そのようなＡＢＰもしくは他の構成要素及び／又は薬学的組成物が、一連の処置にわたって投与される場合、所与の処置経過における投与の総数は、合計約２、３、４、５、６、７、８、９、１０回又は約１０回を超える処置からなり得る。例えば、ある処置が、１週間、１ヶ月間又は数ヶ月間にわたって１日に１回（又は、１日に２、３又は４回）投与され得る。ある特定の実施形態において、処置経過は、無限に継続する場合がある。
【0122】
投与されるＡＢＰもしくは他の構成要素及び／又は薬学的組成物の量は、処置される疾患又は適応症のタイプ及び程度、患者の全体的な健康状態、年齢、サイズ／体重、ＡＢＰもしくは他の構成要素及び／又は薬学的組成物のインビボ効力、並びに投与経路などの変数に依存する。初回投与量は、速やかに所望の血中レベル又は組織レベルを達成するために、上限を超えて増加させることができる。あるいは、初回投与量は、最適量より少なくすることができ、処置経過の間に１日投与量を徐々に増加させてもよい。ヒト投与量は、例えば、比較的少ない初回量、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの活性成分から実施するようにデザインされた従来の第Ｉ相用量漸増研究において最適化され得る。投与頻度は、投与経路、投与量及び処置される疾患などの因子に応じて変動し得る。例示的な投与頻度は、１日につき１回、１週間につき１回及び２週間ごとに１回である。本発明の（又は本発明とともに使用するための）ＡＢＰ又は他の構成要素の製剤化は、本分野の通常の技術範囲内である。本発明のいくつかの実施形態において、そのようなＡＢＰ又は他の構成要素は、凍結乾燥されており、投与時に緩衝食塩水で再構成される。ＡＢＰもしくは他の構成要素及び／又は薬学的組成物はさらに、処置される疾患の再発を減少させ得るか、又は薬物耐性の発生率を低下させ得るか、又は薬物耐性が現れるまでの時間を延長し得、癌の場合は、無増悪生存期間及び／又は全生存期間を延長し得る。
疾患の処置及び診断
疾患の処置及び診断
【0123】
本発明のＡＢＰ、並びに任意の核酸、ＮＡＣ、細胞又は組成物は、被験体の疾患の処置及び／又は予防に好適であり得、それらにおいて使用され得る。好ましくは、そのような疾患は、例えば、自己抗原又は異質（同種）抗原に対する応答における、被験体の病的な免疫応答である。したがって、炎症性疾患及び自己免疫疾患が、本発明の構成要素によっておそらく処置可能である。関連する態様において、本発明は、医薬において使用するための生成物又は構成要素に関し、薬を製造するための生成物の使用に関し、その生成物は、本発明のＡＢＰ、核酸、ＮＡＣもしくは宿主細胞、又は前述のいずれかを含む薬学的組成物からなるリストから選択される。
【0124】
本明細書中の他の箇所に記載される他の態様では、哺乳動物被験体の疾患、障害又は状態を検出及び／又は診断する方法が提供され、好ましくは、そのような方法は、ＴＩＲＣ７又はＴＩＲＣ７陽性細胞への本発明のＡＢＰの結合を検出する工程を含む。
【0125】
本発明は、組換え細胞株又は本発明のＡＢＰ、本発明のＡＢＰを産生できるハイブリドーマ又は宿主細胞を生成する様々な方法にも関し、並びに様々な測定方法及び／もしくは診断方法、又は使用、並びにそのような測定方法及び／もしくは診断方法に有用なキット、並びに化合物を特定するため及び／又は特徴付けるための様々な方法及び／又はＡＢＰを特定するため、作製するため及び／又は生成するための方法、例えば、医薬において使用するのに適した方法に関する。
【0126】
本発明における用語「処置」は、治療、例えば、治療的な処置、並びに疾患（又は障害又は状態）に対する予防的又は抑制的な措置を含むように意味される。したがって、例えば、疾患の発症前のＡＢＰ（又は核酸又はＮＡＣ又は細胞、例えば、宿主細胞）の投与の成功は、その疾患の処置をもたらす。「処置」には、疾患（又はその症状）を回復させる又は根絶するために、その疾患が現れた後にＡＢＰを投与することも包含される。臨床症状の軽減が見込まれ、場合によっては疾患が回復することもある、発症後及び臨床症状が現れた後のＡＢＰの投与も、疾患の処置を構成する。「処置を必要とする」者には、すでに疾患、障害又は状態を有する被験体（例えば、ヒト被験体）、並びに疾患、障害もしくは状態になりやすい又はそれらを有すると疑われる者（疾患、障害又は状態が予防されるべき者を含む）が含まれる。
【0127】
自己免疫疾患：用語「自己免疫疾患」とは、適応免疫系及び自然免疫系が自己抗原に応答し、細胞損傷及び組織損傷を媒介するような、自己寛容の崩壊によって引き起こされる疾患のことを指す。自己免疫疾患は、単一の臓器もしくは単一の細胞型の関与又は複数の臓器もしくは又は組織系の関与によって特徴付けられることが多い。自己免疫疾患は、「膠原」病又は「膠原血管」病又は「結合組織」病とも称されてきた。自己免疫障害は、過敏症反応を伴うことが多い。本発明の構成要素は、様々なタイプの自己免疫疾患の処置及び／又は予防に有用であり得る。自己免疫障害の非限定的な具体例は、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性（Ｉ型）糖尿病、炎症性関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、慢性侵襲性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、悪性貧血の自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性脳脊髄炎、脳炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性膵炎、後天性血友病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、円形脱毛症、ライム病、硬化性苔癬、ベーチェット症候群、心筋症、封入体筋炎、自己免疫性心筋炎、抗ＧＢＭ腎炎、スティル病、水疱性類天疱瘡、結節性多発動脈炎、乾癬性関節炎、線維筋痛症、リウマチ熱、サルコイドーシス、全身性硬化症、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、バセドウ病、免疫性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性筋炎、１型糖尿病、甲状腺眼疾患、ＩｇＡ腎症、亜急性細菌性心内膜炎、グッドパスチャー症候群、線維化肺胞炎、再発性多発性軟骨炎、好酸球性筋膜炎、食道炎、子宮内膜症、原発性硬化性胆管炎、皮膚炎、リウマチ性多発性筋痛、川崎病、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素病、多発性筋炎、皮膚筋炎、円板状狼瘡、交感性眼炎、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症、線維筋炎、ギランバレー症候群、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、全身性硬化症、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、高ＩｇＥ、全身性進行性硬化症、乾癬、ライター症候群、サルコイドーシス、全身硬直症候群、ブドウ膜炎又は尿細管間質性腎炎を伴うブドウ膜炎、脈管炎、天疱瘡、視神経炎、未分化炎症性結合組織病、横断性脊髄炎、トロサ・ハント症候群、強膜炎、交感性眼炎、白斑、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー病、悪性貧血、アジソン病、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、重症筋無力症、バセドウ病、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、セリアック病、シャーガス病、線維性疾患などである（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．３４５，Ｎｏ．５，Ａｕｇｕｓｔ ２，２００１，Ｐ３４０－３５０）。ＤＮＡ含有又はＲＮＡ含有微生物から放出されるＤＮＡ又はＲＮＡは、自己のＲＮＡ含有又はＤＮＡ含有複合体に特異的な自己抗体の産生を刺激することがあり、その結果として、ＳＬＥを含むがこれに限定されない自己免疫疾患に至ることがある。
【0128】
本発明のＡＢＰ又は本明細書中に開示される別の構成要素で処置され得る自己免疫疾患は、Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害及び／又は低減によって処置可能な疾患である。例えば、本発明のＡＢＰを用いて処置及び／又は予防され得るそのような疾患は、本明細書中の図８に示される例示的なＡＢＰの免疫抑制効果の恩恵を受ける疾患から選択される。
【0129】
本発明の構成要素及び方法によって処置可能又は予防可能な好ましい自己免疫疾患は、自己免疫性肝炎、ＩｇＧ４関連自己免疫疾患、肺線維症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎又は尿細管間質性腎炎を伴うブドウ膜炎、脈管炎、慢性疲労症候群及び全身性強皮症の群から選択される。
【0130】
本発明のＡＢＰ又は他の構成要素は、ある特定の処置、例えば、そのような処置を受けている患者において望まれない免疫応答（例えば、細胞性免疫応答、例えば、Ｔ細胞応答）を誘導し得る処置によって引き起こされる免疫学的副作用の処置にさらに有用である。ＣＡＲ、抗体、Ｔ細胞レセプター又は他の任意の巨大タンパク質などの生物学的複合体による任意の処置が、患者の免疫系にその治療薬を潜在的な外来性脅威として「攻撃」させることがある。例えば、治療用抗体、キメラ抗原レセプター又は免疫チェックポイント阻害剤による処置を受けている癌患者における典型的な副作用は、サイトカインストームとして知られる有害な免疫応答の発生である。ゆえに、好ましくは、自己免疫疾患は、サイトカインストームなどの、第一選択処置によって引き起こされる病的な免疫応答である。
【0131】
さらに、ある特定の状況においては、液性免疫不全及び免疫調節不全によって特徴付けられる、不均一且つ不可解な原発性免疫不全障害である分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）といったＢ細胞によって媒介される疾患も、本発明のＡＢＰ又は他の構成要素で処置され得る。
【0132】
「過敏症」：過敏症は、内因性又は外来性の起源の抗原に対する液性又は細胞性応答の結果として組織損傷が起きる障害のことを指し、４つのタイプに分類される。Ｉ型過敏症（アナフィラキシー性の、即時型の、アトピー性の、レアギン性の（ｒｅａｇｅｎｉｃ）、ＩｇＥ媒介性の、過敏症反応又はアレルギーと称されることが多い）は、一般に、特定の外来性抗原との接触後の、ＩｇＥで感作された好塩基球及びマスト細胞からの、ヒスタミン、アナフィラキシー遅反応性物質（ＳＲＳ－Ａ）及び好酸球性走化因子（ＥＣＦ）などの薬理学的に活性な物質の放出に起因する。Ｉ型過敏症には、アレルギー性外因性喘息、季節性アレルギー性鼻炎及び全身アナフィラキシーが含まれるが、これらに限定されない。ＩＩ型過敏症（細胞傷害性、細胞溶解性、補体依存性又は細胞刺激性の過敏症反応とも称される）は、抗体が、細胞もしくは組織エレメントの抗原性の構成要素、又は細胞もしくは組織に密接に結合するようになった抗原もしくはハプテンと反応するとき、生じる。ＩＩ型過敏症としては、自己免疫性溶血性貧血、胎児赤芽球症及びグッドパスチャー病が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＩＩ型過敏症（毒性複合体、可溶性複合体又は免疫複合体による過敏症反応とも称される）は、免疫複合体の沈着部位に急性炎症反応を伴う、可溶性の循環抗原－抗体複合体が血管又は組織に沈着することに起因する。ＩＩＩ型過敏症としては、アルチュス反応、血清病、全身性エリテマトーデス及びある特定のタイプの糸球体腎炎が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＶ型過敏症（細胞過敏症反応、細胞性過敏症反応、遅延型過敏症反応又はツベルクリン型過敏症反応と呼ばれることが多い）は、特定の抗原との接触に起因する感作Ｔリンパ球によって引き起こされる。ＩＶ型過敏症としては、接触皮膚炎及び同種移植片拒絶が挙げられるが、これらに限定されない（Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｗ．Ｈ．ＦＲＥＥＭＡＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ）。
【0133】
「微生物による宿主免疫系の過剰刺激に関連する疾患」：微生物の侵入は、深刻な場合、時折、被験体において全身性炎症反応を引き起こし、微生物による宿主免疫系の過剰刺激に関連する疾患に至る場合がある。インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）又は細菌感染症の場合など、それらの疾患が発症する際の事象としては、ＴＮＦａ、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ－ａ）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、ケモカイン、インターフェロン誘導タンパク質１０、単球走化性タンパク質１、インターロイキン－８、インターロイキン－１β及び単球走化性タンパク質１の有意に高い血中濃度が挙げられる。そのような応答は、多くの患者において観察される敗血症、ＡＲＤＳ及び多臓器不全に部分的に関与するサイトカイン媒介性の致死性ショックをもたらし得る（Ｔｈｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｈ５．Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ（Ｈ５Ｎ１）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００５；３５３：１３７４－８５）。微生物感染後のサイトカインの血中濃度の有意な上昇は、高サイトカイン血症又はサイトカインストームと呼ばれる。研究から、鳥インフルエンザ又はＳＡＲＳに接触する患者は、抗ウイルス薬に加えて、免疫応答を抑制する薬物を必要とする場合があることが示唆された。ゆえに、本発明のＡＢＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９などの、行き過ぎの免疫応答に関連するウイルス性疾患の処置に有用であり得る。
【0134】
本発明の化合物は、被験体における微生物による宿主免疫系の刺激に関連する疾患を処置及び／又は予防するために使用され得る。それらの疾患を引き起こす微生物としては、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、及び海綿状脳症の病原因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【0135】
微生物による宿主免疫系の過剰刺激に関連する疾患を引き起こすウイルスとしては、ＳＡＲＳ ＣｏＶ、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、インフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、ＨＩＶ－１、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、ハンタンウイルス、ブンガ（ｂｕｎｇａ）ウイルス、フレボウイルス、ナイロウイルス、出血熱ウイルス、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及びＨＳＶ－２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、海綿状脳症の病原因子、デルタ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス及び鳥インフルエンザウイルスが挙げられる。微生物による宿主免疫系の過剰刺激に関連する疾患、例えば、敗血症を引き起こし得る細菌としては、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、マイコバクテリアの種（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．Ｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、連鎖球菌属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、連鎖球菌属（嫌気性菌の種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性のカンピロバクター属の種、エンテロコッカス属の種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、コリネバクテリウム属の種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｙｔｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、バクテロイデス属の種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ、レプトスピラ属及びＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉが挙げられる。微生物による宿主免疫系の過剰刺激に関連する疾患を引き起こし得る真菌としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられるが、これらに限定されない。微生物による宿主免疫系の過剰刺激に関連する疾患を引き起こし得る寄生生物としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉが挙げられる。
【0136】
「移植片拒絶反応」：移植片拒絶反応（移植片対宿主病）は、臓器移植又は組織移植によって引き起こされる免疫媒介性の障害である。移植は、ドナーからレシピエントへの移植組織（移植片）の移動を意味する。移植片は、ドナーからレシピエントに移植される生細胞、組織又は臓器である。自家移植片は、ある場所から別の場所に移動される自身の組織の移植片であり、同系移植片（アイソグラフト）は、一卵性双生児間の移植片であり、同種異系移植片（ホモグラフト）は、同じ種の遺伝的に非類似のメンバー間の移植片であり、異種移植片（ヘテログラフト）は、異なる種のメンバー間の移植組織である。被験体が、同種異系移植片又は異種移植片のレシピエントであるとき、その身体は、ドナー組織に対して免疫応答を起こし得る。この状況では、移植片の拒絶を回避するために、その免疫応答を抑制する明確な必要性がある（Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｗ．Ｈ．ＦＲＥＥＭＡＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ）。移植片の例は、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚、角膜、肺、膵臓、小腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｕｍ ｔｅｎｕｅ）、肢、筋肉、神経、十二指腸、小腸（ｓｍａｌｌ－ｂｏｗｅｌ）、膵島細胞、幹細胞などである。
【0137】
上記融合タンパク質で処置される被験体は、ヒト又は非ヒト動物であり得る。そのような動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウサギ、マウス、ラット、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ又はウマであり、最も好ましくは、ヒトである。
【0138】
本発明のＡＢＰは、本明細書中に記載されるような疾患などの疾患の診断にも使用され得る。ＡＢＰは、この目的のために、好適な検出可能なシグナル標識で標識され得る。そのような標識されたＡＢＰは、ＴＩＲＣ７レベル、又は白血病もしくは上述の癌のいずれかなどの癌又は被験体の検出又は定量化を可能にし得る。インビボで使用するためにデザインする場合、検出可能なシグナル標識は、好ましくは、インビボで検出可能な標識である。
【0139】
標識されたＡＢＰは、免疫イメージング法において使用され得る。そして、その検出可能なシグナル標識は、例えば、診断のために使用される免疫イメージング法に基づいて選択され得、例えば、ガンマカメライメージング法／ＳＰＥＣＴの場合は、ガンマ線を放射する放射性核種（又はガンマ放射体）、ＭＲＩ又はＰＥＴイメージング法の場合は、それぞれ金属又は陽電子放射体であり得る。この点において、本開示の１つ以上の検出可能なシグナル標識には、ガンマカメラでイメージング可能な作用物質、ＰＥＴでイメージング可能な作用物質及びＭＲＩでイメージング可能な作用物質、例えば、放射性核種、蛍光剤、フルオロゲン（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ）、発色団、色素原、リン光体、化学発光体及び生物発光体が含まれる。
【0140】
好適な検出可能なシグナル標識は、放射性核種であり得る。放射性核種は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、ＩＩＩＩｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ及び２０１Ｔ１からなる群より選択され得る。
【0141】
好適な検出可能なシグナル標識は、フルオロフォア又はフルオロゲンであってもよい。フルオロフォア又はフルオロゲンは、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド、フルオレサミン、フルオレセイン誘導体、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ロードールグリーン又はテキサスレッドからなる群より選択され得る。
【0142】
標識されるＡＢＰは、検出可能なシグナル標識に直接又は間接的に結合され得る。例えば、そのＡＢＰは、検出可能なシグナル標識に直接（例えば、ＡＢＰのチロシン残基を介して）又は間接的に（例えば、金属キレート剤としてのリンカーを介して）結合され得る。他のいくつかの実施形態では、そのＡＢＰは、使用時に及び使用する場所で、検出可能なシグナル標識に（インビトロ又はインビボで）結合できる分子に結合され得る。
【0143】
検出可能なシグナル標識は、ＡＢＰに結合した１つ以上のジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）残基を介してＡＢＰに結合され得る。
【0144】
本明細書中で定義される疾患を検出又は診断するインビトロ方法も本発明によって企図される。そのような方法は、被験体から得られたサンプルを本発明の好ましく標識されたＡＢＰと接触させることを含み得る。そのサンプルは、血液、尿又は脳脊髄液サンプルであり得るが、好ましくは、液体サンプル又は生検サンプルであり得る。検出又は診断される疾患は、好ましくは、ＡＬＬ又はＡＭＬなどの白血病である。
【0145】
第９の態様において、本発明は、ヒトＴＩＲＣ７を発現するヒト細胞における細胞性免疫応答を調節する方法に関し、その方法は、前記細胞をＴ細胞などの免疫細胞の存在下において第７の態様に記載された構成要素と接触させ、それにより、細胞性免疫応答を調節する、好ましくは、阻害することを含む。
【0146】
第１０の態様において、本発明は、被験体の病的な免疫応答に関連する障害を予防及び／又は処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量の第７の態様に記載された構成要素をその被験体に投与することを含み、病的な免疫応答に関連する障害は、その障害に関連する細胞におけるＴＩＲＣ７の発現を特徴とする。
【0147】
さらに、本発明は、以下の一連の項目別実施形態に関する。
項目１：
（ｉ）配列番号０１のＣＤＲＨ１（ＧＹＴＦＴＴＹＶ）、配列番号０２のＣＤＲＨ２（ＩＮＰＹＮＤＧＴ）及び配列番号０３のＣＤＲＨ３（ＡＥＦＩＴＫＴＶＧＧＳＮＷＹＬＤＶ）を含むか、又は各場合において独立して、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号０１、配列番号０２又は配列番号０３と比べて３つ又は２つ以下、好ましくは、１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域、及び
（ｉｉ）配列番号０５のＣＤＲＬ１（ＳＳＩＳＹ）、配列番号０６のＣＤＲＬ２（ＤＴＳ）及び配列番号０７のＣＤＲＬ３（ＨＱＲＳＳＹＴＷＴ）を含むか、又は各場合において独立して、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号０５、配列番号０６又は配列番号０７と比べて３つ又は２つ以下、好ましくは、１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域を含む、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）に結合することができる抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）であって、その１つ、好ましくは２つの重鎖可変ドメイン及びその１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域はそれぞれ、ヒト抗体コンセンサスフレームワーク配列の少なくとも一部を有する抗体フレームワーク領域を含むことを特徴とする、
抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）。
項目２：重鎖可変領域ヒト抗体コンセンサスフレームワーク配列が、ＩＧＨＶ１－２（アクセッション番号Ｘ０７４４８）、ＩＧＨＶ７－４－１＊０２又はＩＧＨＶ１－４６＊０１に由来し、且つ／又は軽鎖可変領域ヒト抗体コンセンサスフレームワーク配列が、ＩＧＫＶ１－９（アクセッション番号Ｚ０００１３）、ＩＧＫＶ３－１１（アクセッション番号Ｘ０１６６８）、ＩＧＫＶ６－２１＊０１又はＩＧＫＶ１－１７＊０３に由来する、項目１に記載のＡＢＰ。
項目３：ＡＢＰが、１つ、好ましくは２つの抗体重鎖可変配列を含み、その１つ、好ましくは２つの抗体重鎖可変配列において、７８、８０、８２及び／又は８５位のうちの１つが、欠損しているか又は変異しており、そのナンバリングは、ＩＭＧＴ命名法に従う、項目１又は２に記載のＡＢＰ。
項目４：ＡＢＰが、１つ、好ましくは２つの抗体重鎖可変配列を含み、その１つ、好ましくは２つの抗体重鎖可変配列は、７８Ｌ、８０Ｓ、８２Ｋ及び／又は８５Ｓを含み、そのナンバリングは、ＩＭＧＴ命名法に従う、項目１～３のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目５：ＡＢＰが、１つ、好ましくは２つの抗体重鎖可変配列を含み、その１つ、好ましくは２つの抗体重鎖可変配列は、７８Ｌを含み、そのナンバリングは、ＩＭＧＴ命名法に従う、項目１～３のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目６：重鎖可変領域が、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３又は８５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は各場合において独立して、必要に応じて、これらの配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含み、且つ／又は軽鎖可変領域が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４又は８６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は各場合において独立して、必要に応じて、これらの配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む、項目１～５のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目７：ＡＢＰが、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体重鎖配列、及び少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体軽鎖配列から構成される、抗体又はその抗原結合フラグメントであり、その抗体重鎖配列及び抗体軽鎖配列はそれぞれ、以下の組み合わせのうちの１つにおける可変領域配列を含む、項目１～６のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目８：エフェクター基を含む、且つ／又は標識されている、項目１～７のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目９：単離された、且つ／又は実質的に純粋な、項目１～８のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目１０：モノクローナル抗体などの抗体であるか、又はモノクローナル抗体のフラグメントなどの抗体フラグメントである、項目１～９のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目１１：抗体が、ヒトキメラ抗体などのキメラ抗体である、項目１０に記載のＡＢＰ。
項目１２：抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＭ免疫グロブリン、好ましくは、ＩｇＧ免疫グロブリンである、項目１０又は１１に記載のＡＢＰ。
項目１３：Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦ（ａｂ’）２からなるリストから選択される抗体フラグメントである、項目１０～１２のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目１４：ＡＢＰが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大するように改変又は操作されており、好ましくは、ＡＢＰが、脱フコシル化されている、項目１～１３のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目１５：キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）である、項目１～１４のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目１６：哺乳動物Ｔ細胞上に存在する抗原などのＴＩＲＣ７以外の抗原、最も好ましくはヒトＣＤ３に結合する１つ以上のさらなる抗原結合ドメインを含む、項目１～１５のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目１７：二重特異性であり、好ましくは、ＴＩＲＣ７に結合する１つ又は２つの結合部位、及び哺乳動物Ｔ細胞上に存在する抗原などのＴＩＲＣ７以外の抗原、最も好ましくはヒトＣＤ３に結合する１つ又は２つの結合部位を含む、項目１６に記載のＡＢＰ。
項目１８：ヒトＴＩＲＣ７に結合することができ、ＴＩＲＣ７への項目１～１７のいずれか１つに記載のＡＢＰの結合と競合することができる、抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）又はその抗原結合フラグメント。
項目１９：項目１～１８のいずれか１つに記載のＡＢＰ又はＡＢＰの抗原結合フラグメントもしくはモノマー、例えば、重鎖もしくは軽鎖をコードする配列を含む、単離された核酸。
項目２０：項目１９に記載の核酸、及びコードされるＡＢＰ又はＡＢＰの構成要素（例えば、抗体の重鎖又は軽鎖）の発現を（宿主）細胞において可能にする１つ以上のさらなる配列特徴を含む、核酸構築物（ＮＡＣ）。
項目２１：項目１９に記載の核酸又は項目２０に記載のＮＡＣを含む、組換え宿主細胞。
項目２２：（ｉ）項目１～１８のいずれか１つに記載のＡＢＰ、又は（ｉｉ）項目１９に記載の核酸もしくは項目２０に記載のＮＡＣ、又は（ｉｉｉ）項目２１に記載の組換え宿主細胞、並びに薬学的に許容され得るキャリア、安定剤及び／又は賦形剤を含む、薬学的組成物。
項目２３：医薬において使用するための構成要素であって、その構成要素は、項目１～１８のいずれか１つに記載のＡＢＰ、項目１９に記載の単離された核酸又は項目２０に記載のＮＡＣ、項目２１に記載の組換え宿主細胞、及び項目２２に記載の薬学的組成物からなるリストから選択される、構成要素。
項目２４：構成要素が、被験体の細胞性免疫応答を調節する使用のためである、項目２３に記載の使用するための構成要素。
項目２５：免疫応答の調節が、細胞性免疫応答の阻害である、項目２４に記載の使用するための構成要素。
項目２６：阻害が、リンパ球などの免疫細胞の増殖の阻害であり、且つ／又はリンパ球などの免疫細胞におけるサイトカイン発現の阻害である、項目２５に記載の使用するための構成要素。
項目２７：細胞性免疫応答の阻害が、エフェクターメモリーＴ細胞の増殖／活性の低減及び／又は制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）の増殖／活性の増大である、項目２４又は２５に記載の使用するための構成要素。
項目２８：使用が、病的な免疫応答を処置するためであり、好ましくは、炎症性疾患、自己免疫疾患、同種移植片拒絶（移植片対宿主病）の処置において使用するためである、項目２３～２７のいずれか１つに記載の使用するための構成要素。
項目２９：ヒトＴＩＲＣ７を発現するヒト細胞における細胞性免疫応答を調節する方法であって、その細胞をＴ細胞などの免疫細胞の存在下において項目２３に記載の構成要素と接触させ、それにより、その細胞性免疫応答を調節する、好ましくは、阻害することを含む、方法。
項目３０：被験体の病的な免疫応答に関連する障害を予防及び／又は処置するための方法であって、治療有効量の項目２３に記載の構成要素を被験体に投与することを含み、病的な免疫応答に関連する障害は、その障害に関連する細胞におけるＴＩＲＣ７の発現／活性を特徴とする、方法。
項目１：
（ｉ）配列番号０１のＣＤＲＨ１（ＧＹＴＦＴＴＹＶ）、配列番号０２のＣＤＲＨ２（ＩＮＰＹＮＤＧＴ）及び配列番号０３のＣＤＲＨ３（ＡＥＦＩＴＫＴＶＧＧＳＮＷＹＬＤＶ）を含むか、又は各場合において独立して、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３が、それぞれ配列番号０１、配列番号０２又は配列番号０３と比べて３つ又は２つ以下、好ましくは、１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの重鎖可変領域、及び
（ｉｉ）配列番号０５のＣＤＲＬ１（ＳＳＩＳＹ）、配列番号０６のＣＤＲＬ２（ＤＴＳ）及び配列番号０７のＣＤＲＬ３（ＨＱＲＳＳＹＴＷＴ）を含むか、又は各場合において独立して、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号０５、配列番号０６又は配列番号０７と比べて３つ又は２つ以下、好ましくは、１つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有する配列を含む、１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域を含む、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）に結合することができる抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）であって、その１つ、好ましくは２つの重鎖可変ドメイン及びその１つ、好ましくは２つの軽鎖可変領域はそれぞれ、ヒト抗体コンセンサスフレームワーク配列の少なくとも一部を有する抗体フレームワーク領域を含むことを特徴とする、
抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）。
項目２：重鎖可変領域ヒト抗体コンセンサスフレームワーク配列が、ＩＧＨＶ１－２（アクセッション番号Ｘ０７４４８）、ＩＧＨＶ７－４－１＊０２又はＩＧＨＶ１－４６＊０１に由来し、且つ／又は軽鎖可変領域ヒト抗体コンセンサスフレームワーク配列が、ＩＧＫＶ１－９（アクセッション番号Ｚ０００１３）、ＩＧＫＶ３－１１（アクセッション番号Ｘ０１６６８）、ＩＧＫＶ６－２１＊０１又はＩＧＫＶ１－１７＊０３に由来する、項目１に記載のＡＢＰ。
項目３：ＡＢＰが、１つ、好ましくは２つの抗体重鎖可変配列を含み、その１つ、好ましくは２つの抗体重鎖可変配列において、７８、８０、８２及び／又は８５位のうちの１つが、欠損しているか又は変異しており、そのナンバリングは、ＩＭＧＴ命名法に従う、項目１又は２に記載のＡＢＰ。
項目４：ＡＢＰが、１つ、好ましくは２つの抗体重鎖可変配列を含み、その１つ、好ましくは２つの抗体重鎖可変配列は、７８Ｌ、８０Ｓ、８２Ｋ及び／又は８５Ｓを含み、そのナンバリングは、ＩＭＧＴ命名法に従う、項目１～３のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目５：ＡＢＰが、１つ、好ましくは２つの抗体重鎖可変配列を含み、その１つ、好ましくは２つの抗体重鎖可変配列は、７８Ｌを含み、そのナンバリングは、ＩＭＧＴ命名法に従う、項目１～３のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目６：重鎖可変領域が、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３又は８５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は各場合において独立して、必要に応じて、これらの配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含み、且つ／又は軽鎖可変領域が、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４又は８６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％という配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は各場合において独立して、必要に応じて、これらの配列と比べて１０、９、８、７、６、５、４個以下、好ましくは、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む、項目１～５のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目７：ＡＢＰが、少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体重鎖配列、及び少なくとも１つ、好ましくは２つの抗体軽鎖配列から構成される、抗体又はその抗原結合フラグメントであり、その抗体重鎖配列及び抗体軽鎖配列はそれぞれ、以下の組み合わせのうちの１つにおける可変領域配列を含む、項目１～６のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目９：単離された、且つ／又は実質的に純粋な、項目１～８のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目１０：モノクローナル抗体などの抗体であるか、又はモノクローナル抗体のフラグメントなどの抗体フラグメントである、項目１～９のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目１１：抗体が、ヒトキメラ抗体などのキメラ抗体である、項目１０に記載のＡＢＰ。
項目１２：抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＭ免疫グロブリン、好ましくは、ＩｇＧ免疫グロブリンである、項目１０又は１１に記載のＡＢＰ。
項目１３：Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦ（ａｂ’）２からなるリストから選択される抗体フラグメントである、項目１０～１２のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目１４：ＡＢＰが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大するように改変又は操作されており、好ましくは、ＡＢＰが、脱フコシル化されている、項目１～１３のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目１５：キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）である、項目１～１４のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目１６：哺乳動物Ｔ細胞上に存在する抗原などのＴＩＲＣ７以外の抗原、最も好ましくはヒトＣＤ３に結合する１つ以上のさらなる抗原結合ドメインを含む、項目１～１５のいずれか１つに記載のＡＢＰ。
項目１７：二重特異性であり、好ましくは、ＴＩＲＣ７に結合する１つ又は２つの結合部位、及び哺乳動物Ｔ細胞上に存在する抗原などのＴＩＲＣ７以外の抗原、最も好ましくはヒトＣＤ３に結合する１つ又は２つの結合部位を含む、項目１６に記載のＡＢＰ。
項目１８：ヒトＴＩＲＣ７に結合することができ、ＴＩＲＣ７への項目１～１７のいずれか１つに記載のＡＢＰの結合と競合することができる、抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）又はその抗原結合フラグメント。
項目１９：項目１～１８のいずれか１つに記載のＡＢＰ又はＡＢＰの抗原結合フラグメントもしくはモノマー、例えば、重鎖もしくは軽鎖をコードする配列を含む、単離された核酸。
項目２０：項目１９に記載の核酸、及びコードされるＡＢＰ又はＡＢＰの構成要素（例えば、抗体の重鎖又は軽鎖）の発現を（宿主）細胞において可能にする１つ以上のさらなる配列特徴を含む、核酸構築物（ＮＡＣ）。
項目２１：項目１９に記載の核酸又は項目２０に記載のＮＡＣを含む、組換え宿主細胞。
項目２２：（ｉ）項目１～１８のいずれか１つに記載のＡＢＰ、又は（ｉｉ）項目１９に記載の核酸もしくは項目２０に記載のＮＡＣ、又は（ｉｉｉ）項目２１に記載の組換え宿主細胞、並びに薬学的に許容され得るキャリア、安定剤及び／又は賦形剤を含む、薬学的組成物。
項目２３：医薬において使用するための構成要素であって、その構成要素は、項目１～１８のいずれか１つに記載のＡＢＰ、項目１９に記載の単離された核酸又は項目２０に記載のＮＡＣ、項目２１に記載の組換え宿主細胞、及び項目２２に記載の薬学的組成物からなるリストから選択される、構成要素。
項目２４：構成要素が、被験体の細胞性免疫応答を調節する使用のためである、項目２３に記載の使用するための構成要素。
項目２５：免疫応答の調節が、細胞性免疫応答の阻害である、項目２４に記載の使用するための構成要素。
項目２６：阻害が、リンパ球などの免疫細胞の増殖の阻害であり、且つ／又はリンパ球などの免疫細胞におけるサイトカイン発現の阻害である、項目２５に記載の使用するための構成要素。
項目２７：細胞性免疫応答の阻害が、エフェクターメモリーＴ細胞の増殖／活性の低減及び／又は制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）の増殖／活性の増大である、項目２４又は２５に記載の使用するための構成要素。
項目２８：使用が、病的な免疫応答を処置するためであり、好ましくは、炎症性疾患、自己免疫疾患、同種移植片拒絶（移植片対宿主病）の処置において使用するためである、項目２３～２７のいずれか１つに記載の使用するための構成要素。
項目２９：ヒトＴＩＲＣ７を発現するヒト細胞における細胞性免疫応答を調節する方法であって、その細胞をＴ細胞などの免疫細胞の存在下において項目２３に記載の構成要素と接触させ、それにより、その細胞性免疫応答を調節する、好ましくは、阻害することを含む、方法。
項目３０：被験体の病的な免疫応答に関連する障害を予防及び／又は処置するための方法であって、治療有効量の項目２３に記載の構成要素を被験体に投与することを含み、病的な免疫応答に関連する障害は、その障害に関連する細胞におけるＴＩＲＣ７の発現／活性を特徴とする、方法。
【0148】
本明細書中で使用される用語「［本］発明の」、「本発明に従う」、「本発明に係る」などは、本明細書中に記載される及び／又は特許請求される本発明のすべての態様及び実施形態のことを言及すると意図される。
【0149】
本明細書中で使用されるとき、用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と「～からなる」の両方を包含すると解釈されるべきであり、この両方の意味が、本発明に従って明確に意図される、ゆえに、個別に開示される、実施形態である。「及び／又は」は、本明細書中で使用されるとき、２つの特定の特徴又は構成要素の各々の、他方を伴う又は伴わない、明確な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれが本明細書中に個別に示されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の明確な開示と解釈されるべきである。本発明の文脈において、用語「約」及び「およそ」は、対象の特徴の技術的効果がなおも確保されると当業者が理解する精度の幅のことを表す。この用語は、通常、記載の数値からの、±２０％、±１５％、±１０％及び例えば±５％のずれを示す。当業者が認識するように、所与の技術的効果に対するある数値のそのような具体的なずれは、その技術的効果の性質に左右される。例えば、天然の又は生物学的な技術的効果は、一般に、人為的又は工学的な技術的効果よりも大きなそのようなずれを有し得る。当業者が認識するように、所与の技術的効果に対するある数値のそのような具体的なずれは、その技術的効果の性質に左右される。例えば、天然の又は生物学的な技術的効果は、一般に、人為的又は工学的な技術的効果よりも大きなそのようなずれを有し得る。単数形の名詞を言及するときに不定冠詞又は定冠詞、例えば、「ａ」、「ａｎ」又は「ｔｈｅ」を使用する場合、何か他のことが明確に述べられない限り、これには、複数のその名詞が含まれる。
【0150】
本発明の教示を特定の問題又は環境に適用すること、及び本発明又はそのさらなる特徴（例えば、さらなる態様及び実施形態）のバリエーションの包含は、本明細書中に含められる教示に照らして、当業者の能力の範囲内であろうことが理解されるべきである。
【0151】
文脈が他のことを示さない限り、上記に示された特徴の説明及び定義は、本発明のいずれの特定の態様又は実施形態にも限定されず、説明されるすべての態様及び実施形態に等しく適用される。
【0152】
本明細書に引用されるすべての参考文献、特許及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【0153】
上記に鑑みて、本発明は、以下の項目別実施形態にも関することが認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0154】
図面及び配列の簡単な説明
図面は、以下を示す。
図面は、以下を示す。
【0155】
【図1】１７－２０（親マウス抗体）のＶＨ（Ａ）及びＶＬ（Ｂ）配列と、最もマッチする生殖細胞系列配列とのアラインメント及びアノテーションを示している。
【0156】
【図2】１７－２０（親抗体）のＶＨ及びＶＬドメインのモデルを示している。重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域が示されている。
【0157】
【図3】１７－２０のＶＨ及びＶＬドメインのモデルを示している。ＣＤＲ領域が示されている。キメラ抗体ｃＡｂ１４５７－１０．０とヒト化抗体ｃＡｂ１４５９－１０．０との差が、「棒」として表されるアミノ酸側鎖によって示されている。ヒト化部位の大部分が、ＣＤＲに対して影響を及ぼさないとみられるが、Ｈ－８０、Ｈ－８２及びＨ－８５位は、ＣＤＲＨ１及びＨ２に非常に近いため、それらの折り畳み及び配向に影響を及ぼす可能性がある。
【0158】
【図4】ヒト化ＶＨ配列と元の親配列とのアラインメントを示している。ＣＤＲが示されており、支持アミノ酸がさらなる四角形に囲まれている。
【0159】
【図5】ヒト化ＶＬ配列と元の親配列とのアラインメントを示している。ＣＤＲが示されており、支持アミノ酸がさらなる四角形に囲まれている。
【0160】
【図6】１７－２０（親）のＶＨ及びＶＬドメインのモデルを示している。重鎖及び軽鎖のＣＤＲが示されている。
【0161】
【図7】タンパク質収率によって整理された本発明の抗体の比較を示している。精製タンパク質（％）及びモノマー含有率（％）がさらに示されている。
【0162】
【図8】タンパク質収率によって整理された本発明の抗体の生物学的活性の比較を示している。ＩＦＮｇ産生の阻害、ＴＩＲＣ７＋細胞の誘導、ＴＩＲＣ７＋ＴＲＥＧの誘導及びＴＲＥＧの誘導の量が、以下の符号を用いて示されている。＊＝弱い効果→＊＊＊＊＊＝非常に強い効果。
【0163】
【図9】産生及び機能によってランク付けされた（図７及び８）ＶＨ鎖ヒト化アラインメントを示している。有望な興味深い部位が強調されている。これらの図において、ナンバリング及びＣＤＲの位置決めは、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７，７７６－７９８、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．，１４，４６２８－４６３８及びＷｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６４，２２０－２３２（ＶＢａｓｅ．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ－ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ２．ｐｈｐ＃ＪＨＥＸに例が示されている）に従う。鎖「Ｍｕ１７－２０－ＶＫは、本明細書中でｃＡＢ１４５７とも称されるマウス親配列を表す。ＣＤＲ領域に下線が引かれている。
【0164】
【図10】産生及び機能によってランク付けされたＶＬ鎖ヒト化アラインメントを示している（図９及び１０）。これらの図において、ナンバリング及びＣＤＲの位置決めは、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７，７７６－７９８、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．，１４，４６２８－４６３８及びＷｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６４，２２０－２３２（ＶＢａｓｅ．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ－ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ２．ｐｈｐ＃ＪＨＥＸに例が示されている）に従う。鎖「Ｍｕ１７－２０－ＶＫは、本明細書中でｃＡＢ１４５７とも称されるマウス親配列を表す。ＣＤＲ領域に下線が引かれている。
【0165】
【図11】アロ刺激の後に本発明の抗体バリアントで処置された混合リンパ球の増殖アッセイを示している。上のパネルは、２０μｇ／ｍｌの試験抗体を用いた実験を示しており、下のパネルは、４０μｇ／ｍｌの試験抗体を用いた実験を示している。コントロールは、抗体なしの処置、ＩｇＧコントロール及び親キメラ抗体である。抗体のナンバリングは、表１に示されるとおりである。特許管理は、親マウス抗体（ｃＡｂ１４５７）の使用に関する。３つの独立した実験の平均値が示されている。
【0166】
【図12】フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激マイトジェンの後に本発明の抗体バリアントで処置されたリンパ球の増殖アッセイを示している。上のパネルは、２０μｇ／ｍｌの試験抗体を用いた実験を示しており、下のパネルは、４０μｇ／ｍｌの試験抗体を用いた実験を示している。コントロールは、抗体なしの処置、ＩｇＧコントロール及び親キメラ抗体である。抗体のナンバリングは、表１に示されるとおりである。特許管理は、親マウス抗体（ｃＡｂ１４５７）の使用に関する。３つの独立した実験の平均値が示されている。
【0167】
本発明のＡＢＰはすべて、配列表及び以下の表１に記載される。
【表1】
【0168】
実施例
以下、本明細書中に示される説明、図面及び表を参照して、本発明のある特定の態様及び実施形態を例として説明する。本発明の方法、使用及び他の態様のそのような例は、単に代表例であって、本発明の範囲をそのような代表例だけに限定すると解釈されるべきでない。
以下、本明細書中に示される説明、図面及び表を参照して、本発明のある特定の態様及び実施形態を例として説明する。本発明の方法、使用及び他の態様のそのような例は、単に代表例であって、本発明の範囲をそのような代表例だけに限定すると解釈されるべきでない。
【0169】
実施例は、以下を示す。
【0170】
実施例１：バリアント抗ＴＩＲＣ７抗体及びヒト化抗ＴＩＲＣ７抗体の作製
【0171】
相補性決定領域（ＣＤＲ）を特定する目的及び最もマッチする生殖細胞系列配列を解析する目的で、ＩＭＧＴ Ｄｏｍａｉｎ Ｇａｐ Ａｌｉｇｎツールを使用した。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ．ｃｇｉ．
【0172】
以前に公開された抗体の結晶構造に対する相同性に基づき、社内のソフトウェアを用いてＶＨ及びＶＬドメインの分子モデルを構築した。任意の分子可視化ソフトウェアで表示するために要求に応じてＰＤＢファイルを提供できる。画像はＰｙＭｏｌを用いて生成した。
【0173】
Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（登録商標）クローニングベクター及び発現ベクターへのクローニングを可能にするために、適切な制限酵素認識部位を５’及び３’末端に有する可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインをデザインした。可変ドメイン配列のコドンをヒト細胞での発現用に最適化した。遺伝子を合成した後、可変ドメインを適切な種及びタイプのＡｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（登録商標）ベクターにクローニングした。ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアを用いて生データを解析するＳａｎｇｅｒシーケンシングによって正しい配列を確かめた。確認されたら、適切なサイズのプラスミドＤＮＡの調製を行って、トランスフェクション用に十分量の高品質ＤＮＡを生成した。
【0174】
ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎２９３）哺乳動物細胞を、一過性のトランスフェクションに最適な段階にまで継代した。重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターを細胞に一過性にトランスフェクトし、その細胞をさらに６日間培養した。培養物を４０００ｒｐｍでの遠心分離によって収集し、０．２２μＭフィルターで濾過した。クエン酸ｐＨ３．０緩衝液での溶出の後、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ９．０で中和するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、精製の第１工程を行った。次いで、溶出したタンパク質の緩衝液を、脱塩カラムを用いてＰＢＳに交換した。抗体濃度をＵＶ分光法によって測定し、必要に応じて抗体を濃縮した。
【0175】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）及びＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって抗体の純度を測定した。適切なサイズ排除カラム（ＳＥＣ）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズの装置においてＳＥＣ－ＨＰＬＣを行った。抗体の発現力価をプロテインＡ ＨＰＬＣによって測定した。
【0176】
１７－２０のＶＨ及びＶＬ配列をＩＧＭＴ Ｇａｐ Ａｌｉｇｎツールにかけて、すべての公知の抗体生殖細胞系列配列に対して解析した（図１）。ＩＭＧＴ定義を用いてＣＤＲ領域を割り当てた。予想通り、その配列は、マウスに最も近くアラインメントされ、詳細には、重鎖についてはＩＧＨＶ１－２、ＩＧＨＶ１－４６＊０１及びＩＧＨＶ７－４－１＊０２、軽鎖についてはＩＧＫＶ１－９、ＩＧＫＶ３－１１、ＩＧＫＶ６－２１＊０１及びＩＧＫＶ１－１７＊０３に最も近くアラインメントされる。
【0177】
構造情報に基づくヒト化を可能にするために、図２に示されているように、１７－２０マウスＶＨ及びＶＬ配列に対してモデルを構築した。
【0178】
それらのＶＨ及びＶＬ配列を、ヒト生殖細胞系列配列のＡｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（登録商標）データベースとアラインメントした。表１は、ヒト化のためにフレームワークとして選択された生殖細胞系列配列を示している。
【0179】
表２及び３：ヒト化フレームワークとして選択された重鎖及び軽鎖の生殖細胞系列配列、並びに元のマウスＶＨ及びＶＬ配列に対するそれらの同一性パーセント
【表2】
【表3】
【0180】
上記ＶＨ及びＶＬ配列をＣＤＲ移植アルゴリズムにかけて、それらのＣＤＲをマウス抗体１７－２０から、選択されたヒト生殖細胞系列配列に移した。ＣＤＲは、主に抗原への結合に関与すると定義されるが、これらの領域の外にある、フレームワーク領域として知られる領域内のアミノ酸は、結合と直接関わること又はＣＤＲに正しく配向させる役割を果たすことが可能である。結合の完全性を保持するために元のマウスアミノ酸の中のどのフレームワークアミノ酸を残すかを、構造情報に基づくアプローチを用いて判定した（図３及び６）。表１は、作製された配列を含んでいる。
【0181】
実施例２：機能的なヒト化抗ＴＩＲＣ７抗体を得るために生殖細胞系列の組み合わせ及び非直観的な復帰突然変異が必要であった。
【0182】
実施例１に記載されたように、ヒト化重鎖及びヒト化軽鎖をデザインした。これらの各々を別々に合成し、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖発現ベクター及びヒトカッパー軽鎖発現ベクターにクローニングした。トランスフェクションの時点において、それらのヒト化配列の可能なすべての組み合わせを行って、合計１２個の異なるヒト化抗体を作製した。これらに加えて、元のマウス抗体並びにキメラヒトＩｇＧ１をコントロールとして作製した。
【0183】
作製されたほとんどのヒト化鎖は、発現しなかったか、低いモノマー含有率で発現されたか、又は活性を失った。いくつかの妥当なヒト化配列を特定するためには、合計５回のヒト化の試みが必要であり、通常の移植手順及びＣＤＲ領域近傍の復帰突然変異に加えて、重鎖配列にさらなる非直観的な復帰突然変異が必要であった。これは驚くべきことであった。
【0184】
上記の表１に示されたいくつかの抗体のアラインメントを図４及び５に提供する。
【0185】
重鎖をヒト化する１つの試みにおいて、本発明者らは、ＩＧＨＶ７－４－１ヒト生殖細胞系列配列を使用して、ヒト化重鎖を作製した。残念なことに、作製された配列のすべてが、全く発現できなかった（図７を参照のこと。重鎖配列ｃＡＢ２７１４－ＶＨ又はｃＡＢ２７１２－ＶＨを有する抗体）。
【0186】
さらなる試みでは、ヒト生殖細胞系列配列ＩＧＨＶ１－４６を移植に使用した。得られた鎖は、ｃＡＢ２２８８－ＶＨ及びｃＡＢ２２８７－ＶＨであり、そのうちのｃＡＢ２２８７－ＶＨは、全く発現できなかったが、ｃＡＢ２２８８－ＶＨは、いくらか発現を示した。しかしながら、ｃＡＢ２２８８－ＶＨ鎖を有する抗体は、発現されたとき、モノマー含有率を示さなかった（図７）。
【0187】
別の試みであるＩＧＨＶ１－２を移植に使用したところ、ｃＡＢ１９０１ＶＨ鎖が得られた。この鎖を有する抗体も全く発現できなかった。
【0188】
さらなる２回のヒト化では、異なる生殖細胞系列配列由来のヒトフレームワーク領域を組み合わせる（これは通常のアプローチにあたる）ために、上で説明された生殖細胞系列配列の３つすべてに基づく鎖を、選択された位置に様々な変異を導入して作製した（特に、鎖ｃＡＢ１４５８－ＶＨ、ｃＡＢ１４６２－ＶＨ、ｃＡＢ１４６６－ＶＨ、ｃＡＢ２０２１－ＶＨ及びｃＡＢ２０２３－ＶＨ）。少なくともいくつかの抗体における作製された重鎖配列は、少なくとも低い程度に発現できた。しかしながら、ｃＡＢ２０２１－ＶＨ又はｃＡＢ２０２３－ＶＨ鎖を含む抗体は、低い又は検出不可能なモノマー含有率を有し、最終的な選択から外された。
【0189】
残りの鎖を、それらを含む抗体の保持される生物学的活性によって比較した。結果を図８に示す。最も驚いたことには、３つの非直観的な復帰突然変異がフレームワーク３（ＦＲ３）に導入された重鎖を含む抗体は、好ましいタンパク質発現及びモノマー含有率を有しつつ、驚くべき生物学的活性を示した（鎖ｃＡＢ１４６６－ＶＨ）。まとめると、ｃＡＢ１４６７－１０．０、ｃＡＢ１４６８－１０．０及びｃＡＢ１４５９－１０．０と表される抗体が、最善の候補であり、ｃＡＢ１４６７－１０．０、ｃＡＢ１４６８－１０．０（両方ともがｃＡＢ１４６６－ＶＨ鎖を含む）が最善である。
【0190】
結論：
【0191】
標準的なヒト化の後、どのヒト生殖細胞系列遺伝子が元のマウスハイブリドーマ配列に最も近いか、及びゆえにＣＤＲ移植のためのドナーフレームワークとして使用できるかを判定するために解析を行った。多くのヒト化プロセスの変法において、２つの異なるヒトＶＨ遺伝子由来のＣＤＲ移植用フレームワークドナーの組み合わせも試した。広範な実験により、より良い結果をもたらすドナーの組み合わせが明らかになった。配列の比較を、目的の位置を強調して図９（重鎖）及び１０（軽鎖）に示す。これらの図では、ナンバリング及びＣＤＲの位置決めは、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７，７７６－７９８、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．，１４，４６２８－４６３８及びＷｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６４，２２０－２３２）に従う。ＶＢａｓｅ．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ－ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ２．ｐｈｐ＃ＪＨＥＸに例が示されている。
・ＦＲ１及びＦＲ２（ハイライトによって示されている）用のドナーとしてＩＧＨＶ１－２を使用した
・ＦＲ３（ハイライトによって示されている）用のドナーとしてＩＧＨＶ１－４６＊０１を使用した
・ＦＲ１及びＦＲ２（ハイライトによって示されている）用のドナーとしてＩＧＨＶ１－２を使用した
・ＦＲ３（ハイライトによって示されている）用のドナーとしてＩＧＨＶ１－４６＊０１を使用した
【0192】
ヒト化抗体の高親和性及び高安定性をもたらすために、フレームワーク３において元のマウス配列への変則的な復帰突然変異が必要であった。
・７１位－マウスＬ（Ｌｅｕ，疎水性）へのヒトドナーＲ（Ａｒｇ、塩基性）の復帰突然変異
・７３位－マウスＫ（Ｌｙｓ、塩基性）へのヒトドナーＴ（Ｔｈｒ、求核性）の復帰突然変異
・６９位－マウスＬ（Ｌｅｕ、疎水性）へのヒトドナーＭ（Ｍｅｔ、疎水性）の復帰突然変異。軽微な変更だが、ｃＡｂ１４６６－ＶＨをｃＡｂ２０２１よりも良好にするようである。
・７１位－マウスＬ（Ｌｅｕ，疎水性）へのヒトドナーＲ（Ａｒｇ、塩基性）の復帰突然変異
・７３位－マウスＫ（Ｌｙｓ、塩基性）へのヒトドナーＴ（Ｔｈｒ、求核性）の復帰突然変異
・６９位－マウスＬ（Ｌｅｕ、疎水性）へのヒトドナーＭ（Ｍｅｔ、疎水性）の復帰突然変異。軽微な変更だが、ｃＡｂ１４６６－ＶＨをｃＡｂ２０２１よりも良好にするようである。
【0193】
フレームワーク２においても変則的な変異を作製した。
・元のＶＨ１７－２０、提案されるすべてのヒトドナーＶＨ、及びヒト化候補のほとんどにおいて、４３位はＱ（Ｇｌｎ、アミド）であった。しかしながら、最善のヒト化ＶＨ（ｃＡｂ１４６６－ＶＨ）では、Ｑ（Ｇｌｎ、アミド）からＫ（Ｌｙｓ、塩基性）への４３位の変異が、次善のヒト化ＶＨ（ｃＡｂ２０２１－ＶＨ）よりも首尾良い親和性／安定性にとって重要であるとみられる。
・元のＶＨ１７－２０、提案されるすべてのヒトドナーＶＨ、及びヒト化候補のほとんどにおいて、４３位はＱ（Ｇｌｎ、アミド）であった。しかしながら、最善のヒト化ＶＨ（ｃＡｂ１４６６－ＶＨ）では、Ｑ（Ｇｌｎ、アミド）からＫ（Ｌｙｓ、塩基性）への４３位の変異が、次善のヒト化ＶＨ（ｃＡｂ２０２１－ＶＨ）よりも首尾良い親和性／安定性にとって重要であるとみられる。
【0194】
ゆえに、複数のヒト生殖細胞系列配列の組み合わせ、及びマウス復帰突然変異の非直観的な導入だけが、発現及び生物学的活性が改善された少数の最終候補抗体をもたらし得ることが実証される。
【0195】
軽鎖ヒト化－インタクトなｍＡｂの親和性と安定性の両方において十分機能することができたヒト化軽鎖の広い多様性は、そのｍＡｂの成功のほとんどが重鎖に起因すること、及び重鎖は軽鎖選択においてむしろ無秩序であることを示唆している。
【0196】
実施例３：ヒトリンパ球に対する本発明の改善された抗ＴＩＲＣ７抗体の効果
【0197】
混合リンパ球増殖についての免疫アッセイ及びリンパ球のＰＨＡ刺激による免疫アッセイにおいて、本発明の抗体を試験した。その結果は、親キメラ抗体よりも驚くほど強い本発明の改善された抗体の効果を示す。結果をそれぞれ図１１及び１２に示す。
【0198】
実施例４：抗体親和性の表面プラズモン共鳴試験
【0199】
作製された抗体の標的結合を親分子と比較するために、親抗体及び選択された作製済みのヒト化バージョン抗体の結合定数をＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴試験から得た。親抗体に対する既知の結合物質である最も大きいＴＩＲＣ７細胞外ドメインを、ＣＭ５センサーチップ（ＣＭ５チップ、研究グレード）のカルボキシメチル化されたデキストラン表面上に固定化した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を、動力学的相互作用の定量的解析のために２５℃の解析温度及び５０μｌ／分という流速で使用した。解析用緩衝液は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０であった。
【0200】
速度定数又は吸収作用を測定するために、各抗体について、複数のＢｉａｃｏｒｅ ＳＰＲ解析列を様々な濃度で行った。特定の定数が、この緩衝液の条件に対して非常に再現性のある定数であった。親抗体は、３００＋／－１００ｐＭという平均ＫＤを示した。３つのヒト化抗体について測定を同じ設定で行った。結果を表４に提供する。驚いたことに、それらの結果は、選択されたヒト化ＡＢバリアントのＴＩＲＣ７に対するＡＢ親和性が、親分子よりも少なくとも１桁高いことを示した。
【0201】
【表4】
【0202】
以下の参考文献を引用する。
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３．Ｄａｎｇｏｎｄ Ｆ，Ｈａｆｌｅｒ ＤＡ，Ｔｏｎｇ ＪＫ，Ｒａｎｄａｌｌ Ｊ，Ｋｏｊｉｍａ Ｒ，Ｕｔｋｕ Ｎ，Ｇｕｌｌａｎｓ ＳＲ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ（ＨＤＡＣ３）ｃＤＮＡ ｆｒｏｍ ＰＨＡ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（１９９８）２４２（３）：６４８－６５２．
４．Ｕｔｋｕ Ｎ，Ｂｕｌｗｉｎ ＧＣ，Ｂｅｉｎｋｅ Ｓ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｂｅａｔｏ Ｆ，Ｒａｎｄａｌｌ Ｊ，Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒｓ Ｂ，Ｓａｎｄｈｏｆｆ Ｋ，Ｖｏｌｋ Ｈ－Ｄ，Ｍｉｌｆｏｒｄ Ｅ，Ｇｕｌｌａｎｓ ＳＲ：Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｃｏｒｎｉｃｈｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａｌｌｏａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ（１９９９）１４４９（３）：２０３－２１０．
５．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｂｕｌｗｉｎ ＧＣ，Ｒａｎｄａｌｌ Ｊ，Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒｓ Ｂ，Ｓａｎｄｈｏｆｆ Ｋ，Ｖｏｌｋ ＨＤ，Ｍｉｌｆｏｒｄ Ｅ，Ｇｕｌｌａｎｓ ＳＲ，Ｕｋｔｕ Ｎ：Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ＴＩＲＣ７，ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９９）５７（３）：３９８－４０６．
６．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＨＳ，ｄａ Ｒｏｃｈａ Ｄｉａｓ Ｓ，Ｈｕ Ｈ，Ｒｕｄｄ ＣＥ：Ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＹＶＫＭ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ＣＴＬＡ－４ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００１）３１（７）：２０４２－２０５０．
７．Ｋｌａｂｕｎｄｅ Ｔ，Ｈｅｓｓｌｅｒ Ｇ：Ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２００２）３（１０）：９２８－９４４．
８．Ｓｅｘｔｏｎ ＰＭ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ Ａ：Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ（２００６）１２（１４）：１６８１－１６８２．
９．Ｌｉ ＹＰ，Ｃｈｅｎ Ｗ，Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ Ｐ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ １１６－ｋＤａ ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｏｎ ｐｕｍｐ ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（１９９６）２１８（３）：８１３－３２１．
・ｃＤＮＡ ＯＣ１１６がヒト破骨細胞腫細胞株から単離され、ヒト骨巨細胞腫細胞および膵臓癌細胞から得られた細胞において限定的に発現していることの最初の証明。
１０．Ｓｍｉｒｎｏｖａ ＡＳ，Ｍｏｒｇｕｎ Ａ，Ｓｈｕｌｚｈｅｎｋｏ Ｎ，Ｓｉｌｖａ ＩＤ，Ｇｅｒｂａｓｅ－ＤｅＬｉｍａ Ｍ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｅ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ＴＣＩＲＧ１ ｇｅｎｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（２００５）３３０（３）：９４３－９４９．
１１．Ｌｉ ＹＰ，Ｃｈｅｎ Ｗ，Ｌｉａｎｇ Ｙ，Ｌｉ Ｗ，Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ Ｐ：Ａｔｐ６ｉ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｅｘｈｉｂｉｔ ｓｅｖｅｒｅ ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ｌｏｓｓ ｏｆ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（１９９９）２３（４）：４４７－４５１
１２．Ｌｅｅ Ｃ，Ｇｈｏｓｈａｌ Ｋ，Ｂｅａｍａｎ ＫＤ：Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｏｒ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｉｔｈ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９０）２７（１１）：１１３７－１１４４．
１３．Ｍａｎｏｌｓｏｎ ＭＦ，Ｐｒｏｔｅａｕ Ｄ，Ｊｏｎｅｓ ＥＷ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ９５－１２０ ｋＤａ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｖ－ＡＴＰａｓｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ（１９９２）１７２：１０５－１１２．
１４．Ｕｔｋｕ Ｎ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｍ，Ｂｕｌｗｉｎ ＧＣ，Ｓｃｈｌａｗｉｎｓｋｙ Ｍ，Ｆｒａｓｅｒ Ｐ，Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｓ ＥＥ，Ｖｏｌｋ ＨＤ，Ｂｌｕｍｂｅｒｇ ＲＳ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＴＩＲＣ７ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）１４４（１）：１４２－１５１．
１５．Ｂｕｌｗｉｎ ＧＣ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｂｕｇｇｅ Ｖ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｍ，Ｌｏｈａｎ Ａ，Ｓｃｈｌａｗｉｎｓｋｙ Ｍ，Ｓｃｈｕｌｚｅ Ａ，Ｗａｌｔｅｒ Ｓ，Ｓａｂａｔ Ｒ，Ｓｃｈｕｌｅｉｎ Ｒ，Ｗｉｅｓｎｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ：ＴＩＲＣ７ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＴＬＡ－４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）１７７（１０）：６８３３－６８４１．
１６．Ｂｒｏｍｌｅｙ ＳＫ，Ｂｕｒａｃｋ ＷＲ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＫＧ，Ｓｏｍｅｒｓａｌｏ Ｋ，Ｓｉｍｓ ＴＮ，Ｓｕｍｅｎ Ｃ，Ｄａｖｉｓ ＭＭ，Ｓｈａｗ ＡＳ，Ａｌｌｅｎ ＰＭ，Ｄｕｓｔｉｎ ＭＬ：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００１）１９：３７５－３９６．
１７．Ｇｒａｋｏｕｉ Ａ，Ｂｒｏｍｌｅｙ ＳＫ，Ｓｕｍｅｎ Ｃ，Ｄａｖｉｓ ＭＭ，Ｓｈａｗ ＡＳ，Ａｌｌｅｎ ＰＭ，Ｄｕｓｔｉｎ ＭＬ：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ：Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｃｈｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８５（５４２５）：２２１－２２７．
１８．Ｍｏｎｋｓ ＣＲ，Ｆｒｅｉｂｅｒｇ ＢＡ，Ｋｕｐｆｅｒ Ｈ，Ｓｃｉａｋｙ Ｎ，Ｋｕｐｆｅｒ Ａ：Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９５（６６９７）：８２－８６．
１９．Ｅｇｅｎ ＪＧ，Ａｌｌｉｓｏｎ ＪＰ：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－４ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌ ｓｔｒｅｎｇｔｈ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）１６（１）：２３－３５．
２０．Ｌｉｎｓｌｅｙ ＰＳ，Ｂｒａｄｓｈａｗ Ｊ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｊ，Ｐｅａｃｈ Ｒ，Ｂｅｎｎｅｔｔ ＫＬ，Ｍｉｔｔｌｅｒ ＲＳ：Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ｆｏｃａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏｗａｒｄｓ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ＴＣＲ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９６）４（６）：５３５－５４３．
２１．Ｋｕｍａｍｏｔｏ Ｙ，Ｔｏｍｓｃｈｅｇｇ Ａ，Ｂｅｎｎａｉ－Ｓａｎｆｏｕｒｃｈｅ Ｆ，Ｂｏｅｒｎｅｒ Ａ，Ｋａｓｅｒ Ａ，Ｓｃｈｍｉｄｔ－Ｋｎｏｓａｌｌａ Ｉ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｓｃｈｌａｗｉｎｓｋｙ Ｍ，Ｂｌｕｍｂｅｒｇ ＲＳ，Ｖｏｌｋ ＨＤ，Ｕｔｋｕ Ｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ＴＩＲＣ７ ｉｎｄｕｃｅｓ ｄｏｎｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｅｒｇｙ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２００４）４（４）：５０５－５１４．
２２．Ｋｕｍａｍｏｔｏ Ｙ，Ｔａｍｕｒａ Ａ，Ｖｏｌｋ ＨＤ，Ｒｅｉｎｋｅ Ｐ，Ｌｏｈｌｅｒ Ｊ，Ｔｕｌｌｉｕｓ ＳＧ，Ｕｔｋｕ Ｎ：ＴＩＲＣ７ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒｅｊｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙｓ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＴＩＲＣ７ ｍＡｂ ｗｉｔｈ ＦＫ５０６ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｋｉｄｎｅｙ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）１６（３－４）：２３８－２４４．
２３．Ｕｔｋｕ Ｎ，Ｂｏｅｒｎｅｒ Ａ，Ｔｏｍｓｃｈｅｇｇ Ａ，Ｂｅｎｎａｉ－Ｓａｎｆｏｕｒｃｈｅ Ｆ，Ｂｕｌｗｉｎ ＧＣ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｌｏｅｈｌｅｒ Ｊ，Ｂｌｕｍｂｅｒｇ ＲＳ，Ｖｏｌｋ ＨＤ：ＴＩＲＣ７ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃａｕｓｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００４）１７３（４）：２３４２－２３５２．
２４．Ｆｒｉｓｃｈｅｒ Ｊ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ ＥＬ，Ｌａｓｓｍａｎｎ Ｈ，Ｕｔｋｕ Ｎ Ｒｏｌｅ ｏｆ ＴＩＲＣ７ ａｎｄ ＨＬＡＤＲ ａｘｉｓ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１４），２０．９：１１７１－１１８１，ＩＦ：４．６７１
２５．Ｃａｎｔｒｅｌｌ Ｄ：Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）１４：２５９－２７４．
１．Ｕｔｋｕ Ｎ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｔｕｌｌｉｕｓ ＳＧ，Ｂｕｌｗｉｎ ＧＣ，Ｂｅｉｎｋｅ Ｓ，Ｂｌｕｍｂｅｒｇ ＲＳ，Ｂｅａｔｏ Ｆ，Ｒａｎｄａｌｌ Ｊ，Ｋｏｊｉｍａ Ｒ，Ｂｕｓｃｏｎｉ Ｌ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＥＳ ｅｔ ａｌ：Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｕｔｅ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＴＩＲＣ７，ａ ｎｏｖｅｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９８）９（４）：５０９－５１８．
２．Ｌｉａｎｇ Ｐ，Ｐａｒｄｅｅ ＡＢ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５７（５０７２）：９６７－９７１．
３．Ｄａｎｇｏｎｄ Ｆ，Ｈａｆｌｅｒ ＤＡ，Ｔｏｎｇ ＪＫ，Ｒａｎｄａｌｌ Ｊ，Ｋｏｊｉｍａ Ｒ，Ｕｔｋｕ Ｎ，Ｇｕｌｌａｎｓ ＳＲ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ（ＨＤＡＣ３）ｃＤＮＡ ｆｒｏｍ ＰＨＡ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（１９９８）２４２（３）：６４８－６５２．
４．Ｕｔｋｕ Ｎ，Ｂｕｌｗｉｎ ＧＣ，Ｂｅｉｎｋｅ Ｓ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｂｅａｔｏ Ｆ，Ｒａｎｄａｌｌ Ｊ，Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒｓ Ｂ，Ｓａｎｄｈｏｆｆ Ｋ，Ｖｏｌｋ Ｈ－Ｄ，Ｍｉｌｆｏｒｄ Ｅ，Ｇｕｌｌａｎｓ ＳＲ：Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｃｏｒｎｉｃｈｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａｌｌｏａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ（１９９９）１４４９（３）：２０３－２１０．
５．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｂｕｌｗｉｎ ＧＣ，Ｒａｎｄａｌｌ Ｊ，Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒｓ Ｂ，Ｓａｎｄｈｏｆｆ Ｋ，Ｖｏｌｋ ＨＤ，Ｍｉｌｆｏｒｄ Ｅ，Ｇｕｌｌａｎｓ ＳＲ，Ｕｋｔｕ Ｎ：Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ＴＩＲＣ７，ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９９）５７（３）：３９８－４０６．
６．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＨＳ，ｄａ Ｒｏｃｈａ Ｄｉａｓ Ｓ，Ｈｕ Ｈ，Ｒｕｄｄ ＣＥ：Ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＹＶＫＭ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ＣＴＬＡ－４ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００１）３１（７）：２０４２－２０５０．
７．Ｋｌａｂｕｎｄｅ Ｔ，Ｈｅｓｓｌｅｒ Ｇ：Ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２００２）３（１０）：９２８－９４４．
８．Ｓｅｘｔｏｎ ＰＭ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ Ａ：Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ（２００６）１２（１４）：１６８１－１６８２．
９．Ｌｉ ＹＰ，Ｃｈｅｎ Ｗ，Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ Ｐ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ １１６－ｋＤａ ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｏｎ ｐｕｍｐ ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（１９９６）２１８（３）：８１３－３２１．
・ｃＤＮＡ ＯＣ１１６がヒト破骨細胞腫細胞株から単離され、ヒト骨巨細胞腫細胞および膵臓癌細胞から得られた細胞において限定的に発現していることの最初の証明。
１０．Ｓｍｉｒｎｏｖａ ＡＳ，Ｍｏｒｇｕｎ Ａ，Ｓｈｕｌｚｈｅｎｋｏ Ｎ，Ｓｉｌｖａ ＩＤ，Ｇｅｒｂａｓｅ－ＤｅＬｉｍａ Ｍ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｅ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ＴＣＩＲＧ１ ｇｅｎｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（２００５）３３０（３）：９４３－９４９．
１１．Ｌｉ ＹＰ，Ｃｈｅｎ Ｗ，Ｌｉａｎｇ Ｙ，Ｌｉ Ｗ，Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ Ｐ：Ａｔｐ６ｉ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｅｘｈｉｂｉｔ ｓｅｖｅｒｅ ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ｌｏｓｓ ｏｆ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（１９９９）２３（４）：４４７－４５１
１２．Ｌｅｅ Ｃ，Ｇｈｏｓｈａｌ Ｋ，Ｂｅａｍａｎ ＫＤ：Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｏｒ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｉｔｈ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９０）２７（１１）：１１３７－１１４４．
１３．Ｍａｎｏｌｓｏｎ ＭＦ，Ｐｒｏｔｅａｕ Ｄ，Ｊｏｎｅｓ ＥＷ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ９５－１２０ ｋＤａ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｖ－ＡＴＰａｓｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ（１９９２）１７２：１０５－１１２．
１４．Ｕｔｋｕ Ｎ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｍ，Ｂｕｌｗｉｎ ＧＣ，Ｓｃｈｌａｗｉｎｓｋｙ Ｍ，Ｆｒａｓｅｒ Ｐ，Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｓ ＥＥ，Ｖｏｌｋ ＨＤ，Ｂｌｕｍｂｅｒｇ ＲＳ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＴＩＲＣ７ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）１４４（１）：１４２－１５１．
１５．Ｂｕｌｗｉｎ ＧＣ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｂｕｇｇｅ Ｖ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｍ，Ｌｏｈａｎ Ａ，Ｓｃｈｌａｗｉｎｓｋｙ Ｍ，Ｓｃｈｕｌｚｅ Ａ，Ｗａｌｔｅｒ Ｓ，Ｓａｂａｔ Ｒ，Ｓｃｈｕｌｅｉｎ Ｒ，Ｗｉｅｓｎｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ：ＴＩＲＣ７ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＴＬＡ－４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）１７７（１０）：６８３３－６８４１．
１６．Ｂｒｏｍｌｅｙ ＳＫ，Ｂｕｒａｃｋ ＷＲ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＫＧ，Ｓｏｍｅｒｓａｌｏ Ｋ，Ｓｉｍｓ ＴＮ，Ｓｕｍｅｎ Ｃ，Ｄａｖｉｓ ＭＭ，Ｓｈａｗ ＡＳ，Ａｌｌｅｎ ＰＭ，Ｄｕｓｔｉｎ ＭＬ：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００１）１９：３７５－３９６．
１７．Ｇｒａｋｏｕｉ Ａ，Ｂｒｏｍｌｅｙ ＳＫ，Ｓｕｍｅｎ Ｃ，Ｄａｖｉｓ ＭＭ，Ｓｈａｗ ＡＳ，Ａｌｌｅｎ ＰＭ，Ｄｕｓｔｉｎ ＭＬ：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ：Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｃｈｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８５（５４２５）：２２１－２２７．
１８．Ｍｏｎｋｓ ＣＲ，Ｆｒｅｉｂｅｒｇ ＢＡ，Ｋｕｐｆｅｒ Ｈ，Ｓｃｉａｋｙ Ｎ，Ｋｕｐｆｅｒ Ａ：Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９５（６６９７）：８２－８６．
１９．Ｅｇｅｎ ＪＧ，Ａｌｌｉｓｏｎ ＪＰ：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－４ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌ ｓｔｒｅｎｇｔｈ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）１６（１）：２３－３５．
２０．Ｌｉｎｓｌｅｙ ＰＳ，Ｂｒａｄｓｈａｗ Ｊ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｊ，Ｐｅａｃｈ Ｒ，Ｂｅｎｎｅｔｔ ＫＬ，Ｍｉｔｔｌｅｒ ＲＳ：Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ｆｏｃａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏｗａｒｄｓ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ＴＣＲ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９６）４（６）：５３５－５４３．
２１．Ｋｕｍａｍｏｔｏ Ｙ，Ｔｏｍｓｃｈｅｇｇ Ａ，Ｂｅｎｎａｉ－Ｓａｎｆｏｕｒｃｈｅ Ｆ，Ｂｏｅｒｎｅｒ Ａ，Ｋａｓｅｒ Ａ，Ｓｃｈｍｉｄｔ－Ｋｎｏｓａｌｌａ Ｉ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｓｃｈｌａｗｉｎｓｋｙ Ｍ，Ｂｌｕｍｂｅｒｇ ＲＳ，Ｖｏｌｋ ＨＤ，Ｕｔｋｕ Ｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ＴＩＲＣ７ ｉｎｄｕｃｅｓ ｄｏｎｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｅｒｇｙ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２００４）４（４）：５０５－５１４．
２２．Ｋｕｍａｍｏｔｏ Ｙ，Ｔａｍｕｒａ Ａ，Ｖｏｌｋ ＨＤ，Ｒｅｉｎｋｅ Ｐ，Ｌｏｈｌｅｒ Ｊ，Ｔｕｌｌｉｕｓ ＳＧ，Ｕｔｋｕ Ｎ：ＴＩＲＣ７ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒｅｊｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙｓ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＴＩＲＣ７ ｍＡｂ ｗｉｔｈ ＦＫ５０６ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｋｉｄｎｅｙ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）１６（３－４）：２３８－２４４．
２３．Ｕｔｋｕ Ｎ，Ｂｏｅｒｎｅｒ Ａ，Ｔｏｍｓｃｈｅｇｇ Ａ，Ｂｅｎｎａｉ－Ｓａｎｆｏｕｒｃｈｅ Ｆ，Ｂｕｌｗｉｎ ＧＣ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｔ，Ｌｏｅｈｌｅｒ Ｊ，Ｂｌｕｍｂｅｒｇ ＲＳ，Ｖｏｌｋ ＨＤ：ＴＩＲＣ７ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃａｕｓｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００４）１７３（４）：２３４２－２３５２．
２４．Ｆｒｉｓｃｈｅｒ Ｊ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ ＥＬ，Ｌａｓｓｍａｎｎ Ｈ，Ｕｔｋｕ Ｎ Ｒｏｌｅ ｏｆ ＴＩＲＣ７ ａｎｄ ＨＬＡＤＲ ａｘｉｓ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１４），２０．９：１１７１－１１８１，ＩＦ：４．６７１
２５．Ｃａｎｔｒｅｌｌ Ｄ：Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）１４：２５９－２７４．
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】