知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2023-505063トレフォイル因子ファミリーメンバー２モジュレーターによる老化関連障害処置のための方法および組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-08
(54)【発明の名称】トレフォイル因子ファミリーメンバー２モジュレーターによる老化関連障害処置のための方法および組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20230201BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230201BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230201BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230201BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230201BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230201BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20230201BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20230201BHJP
C07K 16/18 20060101ALN20230201BHJP
C07K 17/00 20060101ALN20230201BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61K31/7088
A61K39/395 N
A61P25/28
A61K48/00
A61P21/00
C07K14/47
C12N15/113 Z
C07K16/18
C07K17/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022531046
(86)(22)【出願日】2020-11-25
(85)【翻訳文提出日】2022-07-22
(86)【国際出願番号】 US2020062177
(87)【国際公開番号】W WO2021108511
(87)【国際公開日】2021-06-03
(31)【優先権主張番号】62/940,477
(32)【優先日】2019-11-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/071,515
(32)【優先日】2020-08-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517404061
【氏名又は名称】アルカヘスト，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114557
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 英仁
(74)【代理人】
【識別番号】100078868
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 登夫
(72)【発明者】
【氏名】クジル，エバ
(72)【発明者】
【氏名】ダンデ，オンカー エス．
(72)【発明者】
【氏名】ミナミ，エス．サクラ
(72)【発明者】
【氏名】ソウケ，バラージュ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，シンディ フ－ジェン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA15
4C084ZC52
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB31
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA15
4H045AA30
4H045CA40
4H045EA20
(57)【要約】
【解決手段】老化関連状態を処置および／または予防するための方法および組成物が記載される。その方法で使用される組成物は、神経認知障害などの老化関連状態を処置および／または予防するのに有効な、トレフォイル因子ファミリーメンバー２（ＴＦＦ２）の生物学的濃度を調節する薬剤を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
老化関連障害について成体哺乳動物を処置する方法であって、前記老化関連障害の前記成体哺乳動物を処置するのに十分な方法で前記哺乳動物におけるトレフォイル因子ファミリーメンバー２（ＴＦＦ２）を調節すること
を含む方法。
【請求項2】
前記哺乳動物のＴＦＦ２濃度を低減することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記哺乳動物の血液からＴＦＦ２を除去することにより前記哺乳動物の前記ＴＦＦ２濃度を低減させる、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記哺乳動物の前記血液からＴＦＦ２を体外で除去することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
有効量のＴＦＦ２レベル低減剤を前記哺乳動物に投与することにより前記ＴＦＦ２濃度を低減させる、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記ＴＦＦ２レベル低減剤がＴＦＦ２発現阻害剤を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ＴＦＦ２発現阻害剤が核酸を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＴＦＦ２レベル低減剤がＴＦＦ２結合剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
前記ＴＦＦ２結合剤が抗体またはその結合フラグメントを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記抗体または結合フラグメントが、固定された基質に結合される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ＴＦＦ２結合剤が小分子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
ＴＦＦ２は、前記哺乳動物におけるＴＦＦ２活性を低減させることによって調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
有効量の活性ＴＦＦ２低減剤を前記哺乳動物に投与することにより前記ＴＦＦ２活性を低減させる、請求項１２記載の方法。
【請求項14】
前記活性ＴＦＦ２低減剤が、ＴＦＦ２の第２の分子への結合を低減させる薬剤である、請求項１３記載の方法。
【請求項15】
前記活性ＴＦＦ２低減剤がＴＦＦ２結合剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ＴＦＦ２結合剤が抗体またはその結合フラグメントを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＴＦＦ２結合剤が小分子を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
前記活性ＴＦＦ２低減剤がＴＦＦ２発現修飾剤を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項19】
前記ＴＦＦ２発現修飾剤が核酸を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記活性ＴＦＦ２低減剤が、ＴＦＦ２に結合する分子の発現阻害剤を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項21】
前記ＴＦＦ２に結合する分子の発現阻害剤が核酸を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記哺乳動物が霊長類である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記霊長類がヒトである、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記成体哺乳動物が高齢哺乳動物である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記高齢哺乳動物は、６０歳以上のヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記老化関連障害が認知障害を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記抗体が、配列番号０２、配列番号０４、配列番号０６、配列番号０８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択される抗原に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項28】
前記抗体が、配列番号０２、配列番号０４、配列番号０６、配列番号０８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
この発明は、筋肉の疾患および損傷の予防および処置に関する。本発明は、神経認知障害および神経変性障害などの老化に関連する状態を処置および／または予防するための、血漿画分などの血液製剤の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
生物の老化は、時間の経過による変化の蓄積を伴う。神経系では、老化は、健康な個人の認知機能低下と変性障害への感受性とを促進する構造的および神経生理学的変化を伴う（Ｈｅｅｄｅｎ＆Ｇａｂｒｉｅｌｉ、「老化する心への洞察：認知神経科学からの見解」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００４）５：８７－９６；Ｒａｚ ｅｔ ａｌ．、「認知老化の神経解剖学的相関：構造的磁気共鳴画像法からの証拠」、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ（１９９８）１２：９５－１１４；Ｍａｔｔｓｏｎ＆Ｍａｇｎｕｓ、「老化と神経脆弱性」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００６）７：２７８－２９４；およびＲａｐｐ＆Ｈｅｉｎｄｅｌ、「通常の病理学的老化における記憶システム」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９４）７：２９４－２９８）。これらの変化には、シナプス喪失とその結果生じる神経機能喪失とが含まれる。したがって、重大なニューロン死は典型的には自然老化プロセス中には観察されないが、老化脳のニューロンは、構造、シナプス完全性、およびシナプスでの分子プロセシングにおける致死量以下の老化関連変化に対して脆弱であり、これらはすべて認知機能を損なう。
【0003】
自然老化中の通常シナプス喪失に加えて、シナプス喪失は多くの神経変性状態に共通する初期病理学的事象であり、これらの状態に関連する神経および認知障害と最もよく相関する。実際、老化は、アルツハイマー病（ＡＤ）などの認知症関連神経変性疾患の唯一の最も支配的なリスク要因であり続けている（Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ．、「老化および認知機能低下の神経メカニズム」、Ｎａｔｕｒｅ（２０１０）４６４：５２９－５３５（２０１０）；Ｈｅｅｄｅｎ＆Ｇａｂｒｉｅｌｉ、「老化する心への洞察：認知神経科学からの見解」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００４）５：８７－９６；Ｍａｔｔｓｏｎ＆Ｍａｇｎｕｓ、「老化と神経脆弱性」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００６）７：２７８－２９４）。
【0004】
ヒトの寿命が延びるにつれて、人口の大部分が老化関連認知障害に罹患しており、老化の影響から保護するか、またはさらにはそれに対抗することによって認知完全性を維持する手段を解明することが重要になっている（Ｈｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、「米国人口におけるアルツハイマー病：２０００年の国勢調査を使用した有病率推定」、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２００３）６０：１１１９－１１２２；Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ．、「老化および認知機能低下の神経メカニズム」、Ｎａｔｕｒｅ（２０１０）４６４：５２９－５３５）。
【0005】
トレフォイル因子ファミリーメンバー２（ＴＦＦ２、鎮痙性ポリペプチドとしても知られる）は、ペプチドのトレフォイルファミリーの小さなペプチドメンバーである。ペプチドのトレフォイルファミリーは、胃腸粘膜から分泌される小さな（７～１２ｋＤａ）プロテアーゼ耐性タンパク質である。ＴＦＦ２は主に腸の上皮に見られるが、免疫細胞、リンパ組織、中枢神経系、特に視床下部、および内分泌系、特に下垂体前葉にも見られる。その主要な発現領域である胃上皮および十二指腸ブルンナー腺では、それは通常、ムチンＭＵＣ６で発現され、それらが一緒になって粘液バリアの形成および安定化に働く。ＴＦＦ２は、１～２０μｇ／ｍｌの濃度でヒトの胃液にも存在する（Ｍａｙ，ｅｔ ａｌ．、「ヒト２ドメイントレフォイルタンパク質ＴＦＦ２は、胃の中にてインビボでグリコシル化される」、Ｇｕｔ（２０００）４６：４５４－４５９）。
【0006】
哺乳動物のＴＦＦ２には、他の哺乳動物のトレフォイルペプチドとは異なり、２つのトレフォイルまたはＰドメインが含まれている。これらのドメインには複数の二次構造要素が含まれており、これは、複数のファーマコフォアを示唆し、ＴＦＦの複数の観察された機能と一致する。しかし現在、ＴＦＦ２の分子メカニズムについてはほとんど分かっておらず、これまでのところ、説得力を持って典型的な膜貫通型受容体を実証しようとする試みはすべて失敗であった。ＴＦＦ２はまたＰＡＲ４を活性化することも報告されており、これは粘膜の治癒に寄与するようである（Ｚｈａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．、「カエルトレフォイル因子（ＴＦＦ）２によるプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）１およびヒトＴＦＦ２によるＰＡＲ４の活性化」、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（２０１１）６８：３７７１－３７８０）。ブタＴＦＦ２はインテグリンβ１に非共有結合し、インテグリンβ１は、ＴＦＦペプチドによって増強される細胞移動に重要な役割を果たす（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｗ．、「ＴＦＦ２、胃粘液バリアなどを安定化するＭＵＣ６結合レクチン」Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．（２０１５）４７：８０６－８１６；Ｏｔｔｏ Ｗ、Ｔｈｉｍ Ｌ．、「トレフォイル因子ファミリー相互作用タンパク質」、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（２００５）６２：２９３９－２９４６）。ブタＴＦＦ２は、粘膜の先天性免疫および保護に役割を果たす細胞外マトリックス関連多機能タンパク質であるシステインリッチ反復糖タンパク質（ＭＷ＞３４０ｋＤａ）ＤＭＢＴ１（旧称：ヘンシン、ムクリン）に非共有結合することもわかっている（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｗ．、「ＴＦＦ２、胃粘液バリアなどを安定化するＭＵＣ６結合レクチン」、Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ（２０１５）４７：８０６－８１６；Ａｌｂｅｒｔ ＴＫ，ｅｔ ａｌ．、「ヒト腸ＴＦＦ３は、粘液関連ＦＣＧＢＰタンパク質とジスルフィド結合したヘテロマーを形成し、硫化水素によって放出される」、Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．（２０１０）９：３１０８－３１１７）。静脈内投与されたＴＦＦ２は、粘液頸部細胞、壁細胞、および幽門腺細胞に取り込まれ、その後に粘液層に出現することがわかっており、これは、受容体を介したトランスサイトーシスの兆候である可能性がある（Ｐｏｕｌｓｅｎ ＳＳ、Ｔｈｕｌｅｓｅｎ Ｊ、Ｎｅｘｏ ＥおよびＴｈｉｍ Ｌ、「ラットにおける静脈内投与トレフォイル因子２／ブタ鎮痙性ポリペプチドの分布および代謝」、Ｇｕｔ（１９９８）４３：２４０－２４７）。
【0007】
ＴＦＦ２は、複数の生理学的機能を持つ粘性のある胃粘液バリアの重要な部分である。粘液バリアは、未消化食物の通過を滑らかにして、機械的損傷およびペプシン消化から上皮を保護するバイオフィルムである。それは、酸性胃液へのｐＨ勾配を維持するために不可欠であり、それは、（Ｈ．ピロリなどの）微生物の付着およびコロニー形成をサポートおよびまた制限する（Ａｌｌｅｎ Ａ、「胃腸粘液．セクション６：胃腸系」：生理学ハンドブック、Ｖｏｌ．Ｉｌｌ、Ｓｃｈｕｌｔｚ ＳＧ（ｅｄ．）Ａｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｏｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８９）ｐｐ．３５９－３８２）。ＴＦＦ２はレクチンと見なすことができ、胃粘液バリアを安定させ、それによってその粘弾性特性に影響を与える（Ｓｔｕｒｍｅｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．、「人工唾液としても使用される市販のブタ胃ムチン製剤はレクチンＴＦＦ２の豊富な源である：インビトロ結合研究にて」、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１８）１９：２５９８－２６０８；Ｈａｎｉｓｃｈ ＦＧ，ｅｔ ａｌ．、「ヒトトレフォイル因子２は、アルファ－ＧｌｃＮＡｃでキャップされたムチングリカンをヘリコバクターピロリに対する抗生物質活性で結合するレクチンである」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２０１４）２８９：２７３６３－２７３７５）。ＴＦＦ２はＭＵＣ６のＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ１→Ｒ部分に高度に特異的に結合し、末端のα－ＧｌｃＮＡｃはヘリコバクターピロリに対して抗菌活性を有し、ヘリコバクターピロリはＬａｂＡを介してＴＦＦ２のＬａｃｄｉＮＡｃオリゴ糖にも付着する可能性があり、コロニー形成メカニズムを示唆している（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｗ．、「ＴＦＦ２、胃粘液バリアなどを安定化させるＭＵＣ６結合レクチン」、Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ（２０１５）４７：８０６－８１６；Ｓｔｕｒｍｅｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．、「人工唾液としても使用される市販のブタ胃ムチン調製物は、レクチンＴＦＦ２の豊富な源である：インビトロ結合研究にて」、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１８）１９：２５９８－２６０８； Ｈａｎｉｓｃｈ ＦＧ，ｅｔ ａｌ．、「ヒトトレフォイル因子２は、アルファ－ＧｌｃＮＡｃでキャップされたムチングリカンをヘリコバクターピロリに対する抗生物質活性で結合するレクチンである」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２０１４）２８９：２７３６３－２７３７５）。
【0008】
中枢神経系では、ＴＦＦ２は食欲、満腹、および体重に関連する視床下部で発現および調節されることがわかっている（Ｇｉｏｒｇｉｏ，ｅｔ ａｌ．、「トレフォイル因子ファミリーメンバー２（Ｔｆｆ２）ＫＯマウスは高脂肪食誘発性肥満から保護される」、Ｏｂｅｓｉｔｙ（２０１３）２１：１３８９－１３９５）。ＴＦＦ２ ＫＯマウスは、ＷＴマウスよりもエネルギーの蓄積効率が低く、ＷＴマウスよりも体重および脂肪量が少ないことがわかった（Ｇｉｏｒｇｉｏ，ｅｔ ａｌ．、「トレフォイル因子ファミリーメンバー２（Ｔｆｆ２）ＫＯマウスは高脂肪食誘発性肥満から保護される」、Ｏｂｅｓｉｔｙ（２０１３）２１：１３８９－１３９５）。ＴＦＦ２は、マウス脳の下垂体前葉にも見られ、それは体の残りの部分に放出されるようである（Ｈｉｎｚ Ｍ、Ｓｃｈｗｅｇｌｅｒ Ｈ、Ｃｈｗｉｅｒａｌｓｋｉ ＣＥ、Ｌａｕｂｅ Ｇ、Ｌｉｎｋｅ Ｒ、Ｐｏｈｌｅ ＷおよびＨｏｆｆｍａｎｎ Ｗ、「マウス脳および下垂体におけるトレフォイル因子ファミリー（ＴＦＦ）発現：発達中の小脳の変化」、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２００４）２５：８２７－８３２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、年齢と相対的血清血漿ＴＦＦ２レベルとの間の関係を開示し、そこではそのようなＴＦＦ２レベルは年齢とともに増加する。本発明はまた、成体哺乳動物におけるＴＦＦ２の活性を低減、遮断、または低下させることにより、老化関連状態について成体哺乳動物を処置する方法を開示する。認知障害などの老化の疾患を処置する際の長年の満たされていないニーズに照らして、本発明の組成物および方法は、例えばこれらに限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、軽度認知障害、認知症などの認知障害と診断された対象においてＴＦＦ２の活性を低減、遮断、または低下させるための薬剤を投与する方法を提供することによってその必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
老化関連状態について成体哺乳動物を処置する方法が提供される。方法の態様は、老化関連障害について哺乳動物を処置するのに十分な方法で、哺乳動物におけるトレフォイル因子ファミリーペプチド２（ＴＦＦ２）レベルまたはその活性を低減させることを含む。認知障害を含むさまざまな老化関連障害は、本方法の実践によって処置され得る。
【0011】
［参照による組み込み］
この明細書に記載されているすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
この明細書に記載されているすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】５つの異なる年齢グループのドナーからの血漿中のＴＦＦ２のｌｏｇ２相対濃度の「箱ひげ図」を示す。１８、３０、４５、５５、および６６歳の男性（各年齢グループで５０人）の血漿を、ＳｏｍａＳｃａｎアプタマーベースのプロテオミクスアッセイ（ＳｏｍａＬｏｇｉｃ、コロラド州ボールダー）を使用して測定した。健康な血漿レベルは、この年齢範囲にわたって非常に有意な単調増加を示す（ｐ＝１．６ｅ－９、ヨンクヒール－タプストラトレンドテスト）。各箱内の線は中央値を示す。
【図2】ラジアルアームウォーター迷路（ＲＡＷＭ）アッセイの結果を示し、このアッセイは、マウスに手がかりを利用させて脱出プラットフォームの位置を特定するよう命じることにより、参照および作業記憶パフォーマンスをテストする（例えばＰｅｎｌｅｙ ＳＣ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．、（８２）：５０９４０（２０１３）を参照）。ｈＴＦＦ２で処置された若いマウスは、ビヒクルで処置されたマウスと比較して、迷路をナビゲートするときに多くのエラーを起こした。
【図3】Ｙ迷路挙動テストの結果を示す。Ｙ迷路テストは、手がかりのあるＹ迷路に（既知アームではなく）新規アームに入るために好みによって測定される海馬依存認知を決定する。進入の割合は、新規または既知アーム（「Ｙ」迷路の２つのアーム）への進入回数を、新規および既知アームへの総進入回数に正規化することによって計算された。ウィルコクソンのマッチドペア符号付き順位検定を使用して、進入回数のパーセントで新規アームと既知アームとの間の統計的有意性を評価した。図２の結果は、若いマウスにヒトＴＦＦ２（ｈＴＦＦ２）を投与すると、Ｙ迷路の新規アームへの進入回数が少なくなる傾向にあることを示し、認知パフォーマンスの低下を示す。
【図4】ｈＴＦＦ２処置およびビヒクル処置マウスからの海馬ｍＲＮＡの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を示す。本図は、ビヒクル処置マウスと比較して、炎症マーカーであるＩＬ－６の発現が増加していることを示す。（＊Ｐ＜０．０５、マンホイットニーＵ検定）。
【図5】ｈＴＦＦ２およびビヒクル処置マウスからの海馬ｃＤＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲを示す。本図は、ビヒクル処置マウスと比較して、反応性星状細胞のマーカーであるＧｇｔａ１の発現が増加する傾向があることを示す。反応性星状細胞は、傷害および疾患の際に中枢神経系によって強く誘導される（Ｌｉｄｄｅｌｏｗ ＳＡ，ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、５４１（７６３８）：４８１－８７（２０１７）。
【図6】阻害剤で処置された老齢マウスが既知アームよりも有意に多く新規アームに入ったため、Ｌ－ピログルタミン酸によるＴＦＦ２阻害が認知能力を改善したことを報告している（ｐ＜０．００２）。さらに、新規アームおよび既知アームへの進入回数の間の差は、ビヒクルで観察されたものよりも大きかった。データは平均±ＳＥＭとして示されている。
【図7】ビヒクルと比較した、ＴＦＦ２阻害剤で処置された老齢マウスの海馬における免疫染色の定量分析からの結果を示す。シナプス密度は、μｍ３あたりのシナプス数として測定された。ＴＦＦ２阻害剤で処置されたマウスでは、海馬のＣＡ１領域でシナプス密度が高くなる傾向が強かった。データは平均±ＳＥＭとして示されている。
【図8A】２２ヶ月齢Ｃ５７Ｂ１６マウスの脳溶解物でＴＦＦ２タンパク質が検出されたことを示すウエスタンブロットである。
【図8B】抗ＴＦＦ２抗体がマウスとヒトの両方の組換ＴＦＦ２を認識し、マウスＴＦＦ２（１２ｋＤａ）とヒトＴＦＦ２（１４ｋＤａ）とをインビボでグリコシル化できることを示す。
【図9】ジャーカット細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化のＴＦＦ２バイオアッセイを示す。
【図10】ジャーカット細胞をヒトＴＦＦ２で処置すると、ＥＲＫ１／２リン酸化が増加することを示すウエスタンブロットを示す。
【図11】抗ヒトＴＦＦ２抗体がヒトＴＦＦ２に対してジャーカット細胞で中和活性を有することを示すウエスタンブロットである。
【図12A】抗ＴＦＦ２抗体がジャーカット細胞のマウスＴＦＦ２活性を中和できることを示す。マウスＴＦＦ２が高濃度でジャーカット細胞にてＥＲＫ１／２リン酸化を誘導できることを示す。さらに、抗ヒトＴＦＦ２抗体クローンＨＳＰＧＥ１６Ｃが１００ｎＭ ＴＦＦ２の処置でＥＲＫ１／２リン酸化を阻害できるが、３００ｎＭでは阻害できないことを示す。
【図12B】抗ＴＦＦ２抗体がジャーカット細胞のマウスＴＦＦ２活性を中和できることを示す。低濃度ではマウスＴＦＦ２がＥＲＫ１／２リン酸化を誘導できなくなったことを示す。さらに、抗ヒトＴＦＦ２抗体クローンＨＳＰＧＥ１６Ｃが１００ｎＭ ＴＦＦ２の処置でＥＲＫ１／２リン酸化を阻害できるが、３００ｎＭでは阻害できないことを示す。
【図13】ＨＳＰＧＥ１６Ｃ抗ｈＴＦＦ２抗体が濃度依存的にジャーカット細胞のマウスＴＦＦ２活性を中和できることを示すウエスタンブロットを示す。
【図14】ジャーカット細胞におけるＴＦＦ２活性の中和についてテストされた市販の抗ＴＦＦ２抗体、それらの免疫原情報、抗体が認識または結合するＴＦＦ２の種、抗体が育った宿主種、それらのクローン性、およびそれらのアイソタイプの表を示す。
【図15A】配列番号０１とラベル付けされた全長マウスＴＦＦ２、および配列番号０２とラベル付けされたヒトＴＦＦ２のペプチド配列、および特定のタンパク質ドメインの抗体を生成するために使用されるＴＦＦ２抗原またはエピトープを示す。マウス配列は黒い長方形で表され、ヒト配列は白い長方形で表され、各ペプチド領域は全長ＴＦＦ２タンパク質と整列している。抗原には、マウスＴＦＦ２のアミノ酸２４～１２９（配列番号０３）；ヒトＴＦＦ２のアミノ酸２４～１２９（配列番号０４）；マウスＴＦＦ２のアミノ酸２７～１２９（配列番号０５）；ヒトＴＦＦ２のアミノ酸２７～１２９（配列番号０６）；マウスＴＦＦ２のアミノ酸２９～７３（配列番号０７）；ヒトＴＦＦ２のアミノ酸２９～７３（配列番号０８）；マウスＴＦＦ２のアミノ酸７９～１２２（配列番号０９）；ヒトＴＦＦ２のアミノ酸７９～１２２（配列番号１０）；マウスＴＦＦ２のアミノ酸１１４～１２９（配列番号１１）；およびヒトＴＦＦ２のアミノ酸１１４～１２９（配列番号１２）が含まれる。これらの抗原ペプチドフラグメントは、カスタムＴＦＦ２抗体の生成に使用されたか、またはそれに使用することができる。
【図15B】図１５Ａで説明した配列番号０１から１２の多重配列アライメントを示す。アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ ０（１．２．４）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ａｌｉｇｎ／で入手可能）を使用して実行された。
【図16】１３種類の抗ＴＦＦ２抗体によるジャーカット細胞の処置を示すウエスタンブロットからの正規化された相対ｐＥＲＫ／ＧＡＰＤＨ値を示す。ビヒクル、ＴＦＦ２、および陽性対照（マウスＳＤＦ－１）での処置と比較した、図１４にリストされた１３種類の抗ＴＦＦ２抗体のそれぞれについて４μｇ／ｍｌの濃度でのジャーカット細胞の処置の結果を示す。
【図17】クローン＃１－２抗ＴＦＦ２抗体および中和ウサギポリクローナル抗体で処置した後のジャーカット細胞における相対ｐＥＲＫ１／２ＥＬＩＳＡ発現を示す。市販のクローン＃１－２抗体がジャーカット細胞のマウスＴＦＦ２活性を低下させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
老化関連障害について成体哺乳動物を処置する方法が提供される。方法の態様には、老化関連障害について哺乳動物を処置するのに十分な方法で、哺乳動物におけるトレフォイル因子ファミリーペプチド２（ＴＦＦ２）のレベルを低減させるか、またはその活性を低下させることが含まれる。認知障害を含むさまざまな老化関連障害は、本方法の実践によって処置され得る。
【0014】
本方法および組成物が記載される前に、この発明は、記載された特定の方法または組成物に限定されず、それ自体、もちろんさまざまであり得ることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0015】
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、下限の単位の１０分の１までの、その範囲の上限と下限との間における各介在値もまた具体的に記載されていることが理解されよう。記載された値または記載された範囲内の介在値と、その記載された範囲内の他の記載されたまたは介在する値との間のそれぞれのより小さな範囲は、本発明に含まれる。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して範囲に含まれるかまたは除外され得、いずれかまたは両方の限界がより小さな範囲に含まれる、または含まれない各範囲もまた、記載範囲において特に除外された任意の限界を条件として、本発明に含まれる。記載範囲が一方または両方の限界を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
【0016】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または均等の任意の方法および材料が、本発明の実施またはテストに使用され得るが、いくつかの潜在的かつ好ましい方法および材料がここに記載されている。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用されることに関連する方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾がある限りにおいて、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先することが理解される。
【0017】
この開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に記載および図示された個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離またはそれに組み合わされ得る別個の構成要素および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙されたイベントの順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実行されることができる。
【0018】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「ペプチド」への言及は、１つ以上のペプチドおよびその均等物、例えば当業者に知られているポリペプチドなどへの言及を含む。
【0019】
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなるものも、本発明が先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される発行日は、個別に確認する必要があり得る実際の発行日とは異なり得る。
【0020】
［方法］
上で要約したように、本発明の態様は、成体哺乳動物における老化関連障害を処置する方法を含む。老化関連障害は、いくつかの異なる方法で、例えば老化関連認知障害および／または生理学的障害として、例えば限定されないが、細胞傷害、組織損傷、臓器機能障害、老化関連寿命短縮および発癌など、身体の中枢または末梢器官への損傷の形で、神経新生の減少などの形で、現れ得、関心対象の特定の臓器および組織には、皮膚、ニューロン、筋肉、膵臓、脳、腎臓、肺、胃、腸、脾臓、心臓、脂肪組織、精巣、卵巣、子宮、肝臓、骨が含まれるが、これらに限定されない。
上で要約したように、本発明の態様は、成体哺乳動物における老化関連障害を処置する方法を含む。老化関連障害は、いくつかの異なる方法で、例えば老化関連認知障害および／または生理学的障害として、例えば限定されないが、細胞傷害、組織損傷、臓器機能障害、老化関連寿命短縮および発癌など、身体の中枢または末梢器官への損傷の形で、神経新生の減少などの形で、現れ得、関心対象の特定の臓器および組織には、皮膚、ニューロン、筋肉、膵臓、脳、腎臓、肺、胃、腸、脾臓、心臓、脂肪組織、精巣、卵巣、子宮、肝臓、骨が含まれるが、これらに限定されない。
【0021】
いくつかの実施形態では、老化関連障害は、個人の認知能力における老化関連障害、すなわち、老化関連認知障害である。認知能力、または「認知」とは、注意および集中、複雑なタスクおよび概念の学習、記憶（短期的および／または長期的な新しい情報の取得、保持、および検索）、情報処理（五感で収集した情報の取り扱い）、視空間機能（視覚、奥行き知覚、精神的イメージの使用、図のコピー、オブジェクトまたは形の構築）、言語の生成および理解、言語の流暢さ（単語発見）、問題解決、意思決定、ならびに実行機能（計画および優先順位付け）を含む精神的プロセスを意味する。「認知機能低下」とは、これらの能力の１つ以上が徐々に低下、例えば記憶、言語、思考、判断などが低下することを意味する。「認知能力の障害」および「認知障害」とは、健康な個人、例えば年齢が一致する健康な個人と比較した、または、より早い時点、例えば２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、または１０年またはそれ以上前の時点での個人の能力と比較した、認知能力の低減を意味する。老化関連認知障害には、典型的には老化に関連する認知能力の障害が含まれ、これには例えば軽度認知障害（Ｍ．Ｃ．Ｉ．）などの自然老化プロセスに関連する認知障害、および、老化関連疾患に関連する認知障害、すなわち、老化の増大に伴って見られる頻度が増加する障害、例えばアルツハイマー病、パーキンソン５病、前頭側頭認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋緊張性ジストロフィー、血管性認知症などの神経変性状態が含まれる。
【0022】
「処置」とは、成体哺乳動物を苦しめる老化関連障害に関連する１つ以上の症状の少なくとも改善が達成されることを意味し、改善とは広義において、少なくともパラメータの大きさの、例えば処置される障害に関連する症状の、少なくとも低減を指すために使用される。したがって、処置には、病的状態または少なくともそれに関連する症状を、完全に抑制する、例えば起こるのを防ぐ、または停止する、例えば成体哺乳動物がもはや障害または少なくとも障害を特徴付ける症状に罹患することがないように終了させる、状況が含まれる。場合によっては、「処置」、「処置すること」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点で予防的であり得、ならびに／または、疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒に関して治療的であり得る。「処置」は、哺乳動物の疾患の任意の処置であり得、（ａ）疾患の素因があり得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患が発生するのを防ぐこと、（ｂ）疾患を阻害する、すなわちその発症を阻止すること、または（ｃ）疾患を和らげる、すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含む。処置は、例えば遺伝子発現の調節、神経新生の増加、組織または器官の若返りなど、さまざまな異なる身体的表明をもたらし得る。いくつかの実施形態では、進行中の疾患の処置が発生し、該処置は患者の望ましくない臨床症状を安定化または低減する。このような処置は、影響を受けた組織の機能が完全に失われる前に行われ得る。対象療法は、疾患の症候性段階の間、および場合によっては疾患の症候性段階の後に投与され得る。
【0023】
老化関連障害が老化関連認知機能低下であるいくつかの例では、本開示の方法による処置は、老化関連認知機能低下の進行を遅らせるか、または低減させる。言い換えれば、個人の認知能力は、開示された方法による処置の前または非存在下よりも、開示された方法による処置後の方が、仮にあったとしても、よりゆっくりと低下する。場合によっては、本開示の方法による処置は、個人の認知能力を安定させる。例えば老化関連認知機能低下に罹患する個人の認知機能低下の進行は、開示された方法による処置後に停止される。別の例として、老化関連認知機能低下に罹患すると予測される個人、例えば４０歳以上の個人の認知機能低下は、開示された方法による処置後に予防される。言い換えれば、（さらなる）認知障害は観察されない。場合によっては、本開示の方法による処置は、例えば老化関連認知機能低下に罹患する個人の認知能力を改善することによって観察されるように、認知障害を低減または逆転させる。言い換えれば、開示された方法による処置後の老化関連認知機能低下に罹患する個人の認知能力は、開示された方法による処置前よりも優れている、すなわち、処置により改善する。場合によっては、本開示の方法による処置は、認知障害を消失させる。言い換えると、老化関連認知機能低下に罹患する個人の認知能力は、老化関連認知機能低下に罹患する個人の認知能力の改善によって証明されるように、開示された方法による治療後、例えば個人が約４０歳以下であったときのそのレベルにまで回復する。
【0024】
場合によっては、方法に従って成体哺乳動物を処置すると、中枢器官、例えば脳、脊髄などの中枢神経系器官に変化が生じ、その変化は、例えば分子的、構造的および／または機能的、例えば増強された神経発生の形態を含むがこれらに限定されないいくつかの異なった方法で、以下により詳細に記載されるように現れ得る。
【0025】
上に要約したように、本明細書に記載の方法は、例えば上記のように成体哺乳動物における老化関連障害を処置する方法である。成体哺乳動物とは、成熟に達した、すなわち完全に発達した哺乳動物を意味する。そのため、成体哺乳動物は幼体ではない。本方法で処置され得る哺乳動物種には、イヌおよびネコ；馬；牛；羊など、およびヒトを含む霊長類が含まれる。主題の方法、組成物、および試薬はまた、例えば実験的調査において、例えばネズミ、兎形目などの小型哺乳動物を含む動物モデルに適用され得る。以下の議論は、主題の方法、組成物、試薬、デバイス、およびキットのヒトへの適用に焦点を当てるが、そのような記述を当技術分野の知識に基づいて関心対象の他の哺乳動物に容易に変更できることが、当業者によって理解されよう。
【0026】
成体哺乳動物の年齢は、処置される哺乳動物の種類によってさまざまであり得る。成体哺乳動物がヒトである場合、ヒトの年齢は一般に１８歳以上である。場合によっては、成体哺乳動物は、老化関連認知障害などの老化関連障害に罹患している、または罹患するリスクのある個体であり、成体哺乳動物は、例えば老化関連認知障害などの老化関連障害に罹患している、または罹患するリスクがあると診断を受けることの形態で決定されたものであり得る。「老化関連認知障害に罹患している、または罹患するリスクのある個人」という表現は、約５０歳以上、例えば６０歳以上、７０歳以上、８０歳以上、場合によっては９０歳などの１００歳以下、つまり約５０～１００歳、例えば５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または約９０歳である個人を指す。個人は、老化関連状態、例えば自然老化プロセスに関連する認知障害、例えばＭ．Ｃ．Ｉ．に罹患し得る。あるいは、個人は、５０歳以上、例えば６０歳以上、７０歳以上、８０歳以上、９０歳以上、場合によっては１００歳以下、つまり約５０～１００歳、例えば５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または約１００歳であり得、認知障害などの老化関連状態の症状をまだ示し始めていない。さらに他の実施形態では、個人は、老化関連疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋緊張性ジストロフィー、認知症などのために認知障害に個人が罹患している任意の年齢であり得る。場合によっては、個人は、典型的に認知障害を伴う、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、進行性核上麻痺、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄筋萎縮症、多発性硬化症、多系統性萎縮症、緑内障、運動失調症、筋萎縮性ジストロフィー、認知症などの老化関連疾患と診断された任意の年齢の個人であり、該個人は認知障害の症状をまだ示し始めていない。
【0027】
上に要約したように、方法の態様は、例えば上記のように、哺乳動物の老化関連障害を処置するのに十分な方法で、哺乳動物のトレフォイル因子ファミリーペプチド２（ＴＦＦ２）のレベルを低減させるか、またはその活性を低下させることを含む。ＴＦＦ２のレベルを低減させるとは、哺乳動物の細胞外ＴＦＦ２の量など、哺乳動物のＴＦＦ２の量を減らすことを意味する。ＴＦＦ２ペプチドの活性を低下させることは、その作用機序、例えば受容体に特異的に結合するその能力を通じて、またはそのような結合を妨害する薬剤を提供することなどを通じて作用するＴＦＦ２の能力を低下させることを意味する。活性の低下はまた、ＴＦＦ２が老化または認知にその有害な影響を与えるのに必要な基質分子と相互作用するＴＦＦ２の能力を妨げることを意味し得る。低減または低下の大きさはさまざまであり得るが、場合によっては、大きさは（適切な対照と比較して）２倍以上、例えば５倍以上、１０倍以上、例えば１５倍以上、２０倍以上または２５倍以上であり、場合によっては、本発明による介入前に検出可能であった量に対して個体の循環系における検出可能な遊離ＴＦＦ２の量が５０％以下、例えば２５％以下、１０％以下、例えば１％以下であるようなものであり、場合によっては、その量は介入後に検出不可能である。
【0028】
ＴＦＦ２レベルは、任意の便利なプロトコルを使用して低減され得る。場合によっては、成体哺乳動物から全身性ＴＦＦ２を除去することによって、例えば成体哺乳動物の循環系からＴＦＦ２を除去することによって、ＴＦＦ２レベルが低減される。このような場合、循環系のＴＦＦ２を除去するための任意の便利なプロトコルが採用され得る。例えば血液を成体哺乳動物から採取し、体外処置してＴＦＦ２を血液から除去し、ＴＦＦ２枯渇血液を生成し得、そして結果として得られたＴＦＦ２枯渇血液を成体哺乳動物に戻し得る。このようなプロトコルは、得られた血液からＴＦＦ２を除去するために、さまざまな異なる技術を採用し得る。例えば得られた血液は、ＴＦＦ２の通過を可能にするが、他の血液成分、例えば細胞などの通過を阻害する濾過成分、例えば膜などと接触させられ得る。場合によっては、得られた血液を、血液からＴＦＦ２を吸収するＴＦＦ２吸収成分、例えば多孔質ビーズまたは粒子状組成物と接触させ得る。場合によっては、得られた血液を、ＴＦＦ２に選択的に結合してその血中レベルを低減させるＴＴＦ２特異的抗体と接触させ得る。さらに他の例では、得られた血液を、ＴＦＦ２が結合部材に結合し、それによって固体支持体に固定化されるように、固体支持体に安定して結合したＴＦＦ２結合部材と接触させ得、それにより、他の血液成分からのＴＦＦ２の分離を提供し得る。採用されるプロトコルは、必要に応じて、得られた血液からＴＦＦ２を選択的に除去するように構成され得、または構成されなくともよい。
【0029】
いくつかの実施形態において、ＴＦＦ２レベルは、哺乳動物に有効量のＴＦＦ２レベル低減剤を投与することによって低減される。したがって、本発明のこれらの実施形態による方法を実施する際に、有効量の活性剤、例えばＴＦＦ２調節剤が成体哺乳動物に提供される。
【0030】
実施されている特定の実施形態に応じて、さまざまな異なるタイプの活性剤を採用し得る。場合によっては、薬剤は、遺伝子からのＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現を調節し、それにより、それはなんらかの方法で標的遺伝子からのＲＮＡまたはタンパク質の発現を変化させる。これらの場合、薬剤は、いくつかの異なる方法でＲＮＡまたはタンパク質の発現を変化させ得る。特定の実施形態において、薬剤は、ＴＦＦ２タンパク質の発現を、阻害を含め低減させるものである。ＴＦＦ２タンパク質発現の阻害は、ＴＦＦ２タンパク質発現を阻害する薬剤、例えば限定されないが、ＲＮＡｉ剤、アンチセンス剤、ＴＦＦ２遺伝子のプロモーター配列に結合する転写因子を妨害する薬剤、または例えば組換技術等を通じてＴＦＦ２遺伝子を不活性化する薬剤の使用を含む、任意の便利な手段を使用して達成され得る。
【0031】
例えばＴＦＦ２タンパク質の転写レベルは、ＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡを使用した遺伝子サイレンシングによって調節されることができる（例えばＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９９）１３：１３９－１４１参照）。二本鎖ＲＮＡ干渉（ｄｓＲＮＡｉ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのＲＮＡｉは、線虫Ｃ．エレガンス（Ｆｉｒｅ，ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９１：８０６－８１１）で広く文書化されており、さまざまなシステムで遺伝子を「ノックダウン」するために日常的に使用されている。ＲＮＡｉ剤は、ｄｓＲＮＡ、または細胞内でｄｓＲＮＡを生成するために使用できる干渉リボ核酸の転写テンプレートであり得る。これらの実施形態において、転写テンプレートは、干渉リボ核酸をコードするＤＮＡであり得る。ＲＮＡｉに関連する方法および手順はまた、その出願の開示が参照により本明細書に組み込まれる公開されたＰＣＴ出願公報番号ＷＯ０３／０１０１８０およびＷＯ０１／６８８３６に記載されている。ｄｓＲＮＡは、インビトロおよびインビボ方法ならびに合成化学アプローチを含む、当技術分野で知られている多くの方法のいずれか、に従って調製されることができる。そのような方法の例には、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＳａｄｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．（１９８７）１４：１０１５；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４３：４８４；および米国特許番号５，７９５，７１５によって記載された方法が含まれるが、これらに限定されない。一本鎖ＲＮＡはまた、酵素合成および有機合成の組み合わせを使用して、または全有機合成によって生成されることもできる。合成化学的方法を使用することにより、所望の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体をｄｓＲＮＡに導入することが可能になる。ｄｓＲＮＡはまた、いくつかの確立された方法に従ってインビボで調製されることもできる（例えばそれぞれが参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）分子クローニング：実験室マニュアル、第２版；転写および翻訳（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，およびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；ＤＮＡクローニング、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．，１９８５）；およびオリゴヌクレオチド合成（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４を参照）。細胞培養、組織、器官、または胚などの細胞または細胞集団にｄｓＲＮＡを送達するために、いくつかのオプションを利用することができる。例えばＲＮＡは細胞内に直接、導入することができる。マイクロインジェクションによる投与など、さまざまな物理的方法がそのような場合に一般に利用される（例えばＺｅｒｎｉｃｋａ－Ｇｏｅｔｚ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９７）１２４：１１３３－１１３７；およびＷｉａｎｎｙ，ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ（１９９８）１０７：４３０－４３９を参照）。細胞送達の他のオプションには、ｄｓＲＮＡの存在下での細胞膜の透過化およびエレクトロポレーション、リポソームを介したトランスフェクション、またはリン酸カルシウムなどの化学物質を使用したトランスフェクションが含まれる。いくつかの確立された遺伝子治療技術もまた利用して、ｄｓＲＮＡを細胞に導入することもできる。例えばウイルス粒子内にウイルス構築物を導入することにより、細胞への発現構築物の効率的な導入および構築物によってコードされるＲＮＡの転写を達成することができる。ＴＦＦ２発現を低減させるために採用され得るＲＮＡｉ剤の特定の例には、市販のＴＦＦ２ ｓｉＲＮＡ（例えば市販のヒトＴＦＦ２ ｓｉＲＮＡ（＃ＭＢＳ８２０４１５３）を提供するＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（カリフォルニア州サンディエゴ）；ＴＦＦ２を標的とする３つのユニークな市販の２７ｍｅｒヒトｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ二重鎖（アイテム番号ＳＲ３０４７９８、ＴＬ３０８８６５、ＴＲ３０８８６５）を提供するＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州ロックビル）；および、市販のヒトＴＦＦ２ ｓｉＲＮＡ（カタログ番号ＡＭ１６７０８）を提供するＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを参照）が含まれるが、これらに限定されない。
【0032】
場合によっては、アンチセンス分子を使用して、細胞内のＴＦＦ２遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、特に天然核酸からの化学修飾を有する合成ＯＤＮ、またはＲＮＡなどのアンチセンス分子を発現する核酸構築物であり得る。アンチセンス配列は、標的タンパク質のｍＲＮＡに相補的であり、標的タンパク質の発現を阻害する。アンチセンス分子は、例えば翻訳に利用できるｍＲＮＡの量を低減することによって、ＲＮＡｓｅ Ｈの活性化または立体障害を通じてなど、さまざまなメカニズムを通じて遺伝子発現を阻害する。アンチセンス分子の１つまたは組み合わせが投与され得、組み合わせは、複数の異なる配列を含み得る。
【0033】
アンチセンス分子は、適切なベクターにおける標的遺伝子配列の全部または一部の発現によって生成され得、転写開始は、アンチセンス鎖がＲＮＡ分子として生成されるように配向される。あるいは、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に、少なくとも約７、通常は少なくとも約１２、より通常は少なくとも約２０ヌクレオチドの長さ、および約５００以下、通常は約５０以下、より通常は約３５ヌクレオチド以下の長さであり、長さは、阻害の効率、交差反応性の欠如を含む特異性などによって支配される。長さが７～８塩基の短いオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現の強力かつ選択的な阻害剤となることができる（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）１４：８４０－８４４を参照）。
【0034】
内因性センス鎖ｍＲＮＡ配列の特定の１つ以上の領域は、アンチセンス配列によって補完されるように選択される。オリゴヌクレオチドの特定の配列の選択は、経験的方法を使用し得、いくつかの候補配列が、インビトロまたは動物モデルにおける標的遺伝子の発現の阻害についてアッセイされる。配列の組み合わせもまた使用され得、ｍＲＮＡ配列のいくつかの領域がアンチセンス相補性のために選択される。
【0035】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野で知られている方法によって化学的に合成され得る（上記のＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）を参照）。オリゴヌクレオチドは、それらの細胞内安定性および結合親和力を高めるために、ネイティオブなホスホジエステル構造から化学的に修飾され得る。骨格、糖または複素環式塩基の化学的性質を変える多くのそのような修飾が文献に記載されている。骨格の化学的性質における有用な変化には、ホスホロチオエート；非架橋酸素の両方が硫黄で置換されているホスホロジチオエート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートがある。アキラルなリン酸誘導体には、３’－Ｏ－５’－Ｓ－ホスホロチオエート、３’－Ｓ－５’－Ｏ－ホスホロチオエート、３’－ＣＨ．ｓｕｂ．２－５’－Ｏ－ホスホネートおよび３’－ＮＨ－５’－Ｏホスホロアミデートが含まれる。ペプチド核酸は、リボースホスホジエステル骨格全体をペプチド結合で置き換える。糖修飾はまた、安定性および親和性を高めるためにも使用される。デオキシリボースのα－アノマーが使用され得、塩基は天然のβ－アノマーに対して反転している。リボース糖の２’－ＯＨは、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－アリル糖を形成するように変更され得、これは、親和性を含まずに分解に対する耐性を提供する。複素環式塩基の修飾は、適切な塩基対を維持する必要がある。いくつかの有用な置換には、デオキシウリジンのデオキシチミジンとの置換；５－メチル－２’－デオキシシチジンおよび５－ブロモ－２’－デオキシシチジンのデオキシシチジンとの置換が含まれる。５－プロピニル－２’－デオキシウリジンおよび５－プロピニル－２’－デオキシシチジンは、それぞれデオキシチミジンおよびデオキシシチジンと置換するとき、親和性および生物活性を増加させることが示されている。
【0036】
アンチセンス阻害剤の代替として、触媒核酸化合物、例えばリボザイム、アンチセンスコンジュゲートなどが、遺伝子発現を阻害するために使用され得る。リボザイムは、インビトロで合成されて患者に投与され得るか、または発現ベクター上にコードされ得、そこから、リボザイムが標的細胞において合成される（例えば国際特許出願ＷＯ９５２３２２５、およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９５）２３：４４３４－４２を参照）。触媒活性を有するオリゴヌクレオチドの例は、ＷＯ９５０６７６４に記載されている。ｍＲＮＡ加水分解を媒介することができる金属錯体、例えばテルピリジルＣｕ（ＩＩ）とのアンチセンスＯＤＮのコンジュゲートは、Ｂａｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）５４：４３－５６に記載されている。
【0037】
別の実施形態において、ＴＦＦ２遺伝子は、それがもはや機能的タンパク質を発現しないように不活性化される。不活性化とは、遺伝子、例えばコード配列および／またはその調節エレメントが、それが例えば少なくともＴＦＦ２老化障害活性に関して、機能的ＴＦＦ２タンパク質をもはや発現しないように遺伝子修飾されることを意味する。変化または変異は、例えば１つ以上のヌクレオチド残基の欠失を介して、１つ以上のヌクレオチド残基の交換を介してなど、いくつかの異なる形態をとり得る。コード配列にそのような変更を加える１つの手段は、相同組換によるものである。相同組換を介して標的遺伝子修飾を生成するための方法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許番号６，０７４，８５３；５，９９８，２０９；５，９９８，１４４；５，９４８，６５３；５，９２５，５４４；５，８３０，６９８；５，７８０，２９６；５，７７６，７４４；５，７２１，３６７；５，６１４，３９６；５，６１２，２０５に記載されているものを含んで、当技術分野で知られている。
【0038】
特定の実施形態においてまた関心対象となるのは、ＴＦＦ２タンパク質のドミナントネガティブ変異体であり、細胞におけるそのような変異体の発現は、ＴＦＦ２媒介性老化障害の調節、例えば減少をもたらす。ＴＦＦ２のドミナントネガティブ変異体は、ドミナントネガティブＴＦＦ２活性を示す変異タンパク質である。本明細書で使用される場合、「ドミナントネガティブＴＦＦ２活性」または「ドミナントネガティブ活性」という用語は、ＴＦＦ２の特定活性、特にＴＦＦ２媒介性老化障害の阻害、否定、または減少を指す。ドミナントネガティブ変異は、対応タンパク質に対して容易に生成される。これらは、基質結合ドメインの変異；触媒ドメインの変異；タンパク質結合ドメインの変異（例えば多量体形成、エフェクター、またはタンパク質結合ドメインの活性化）；細胞局在ドメインの変異などを含む、いくつかの異なるメカニズムによって作用し得る。変異体ポリペプチドは、野生型ポリペプチド（他の対立遺伝子から作製される）と相互作用し、非機能的多量体を形成し得る。特定の実施形態において、変異体ポリペプチドは過剰産生されるであろう。そのような効果を持つ点変異が作製される。さらに、タンパク質の末端へのさまざまな長さの異なるポリペプチドの融合、または特定ドメインの欠失は、ドミナントネガティブ変異体を生じさせることができる。ドミナントネガティブ変異体を作製するための一般的な戦略が利用可能である（例えばＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：２１９、および上記参考文献を参照）。このような技術は、タンパク質機能を決定するのに役立つ機能喪失変異を作成するために使用される。当業者に周知の方法を使用して、細胞に導入された外因性遺伝子の発現を増加させるためのコード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えばインビトロ組換ＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換が含まれる。あるいは、遺伝子産物配列をコードすることができるＲＮＡが、例えばシンセサイザーを使用して化学的に合成され得る。例えば「オリゴヌクレオチド合成」、１９８４、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．ｅｄ．、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄに記載されている技術を参照されたい。
【0039】
さらに他の実施形態では、薬剤は、ＴＦＦ２に結合することによって、および／またはＴＦＦ２の第２のタンパク質、例えばインターロイキン１βへの結合を阻害することによって、ＴＦＦ２活性を調節する（例えば、阻害する）薬剤である。例えばＴＦＦ２に結合し、その活性を阻害する小分子が関心対象である。関心対象の天然生起または合成小分子化合物には、有機分子、例えば分子量が５０超～約２，５００ダルトン未満の小有機化合物などの多数の化学クラスが含まれる。候補薬剤には、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合のための官能基が含まれ、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能化学基が含まれる。候補薬剤は、上記官能基の１つ以上で置換された環状炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含み得る。候補薬剤はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組み合わせを含む生体分子の中に見出される。そのような分子はとりわけ、以下に記載されるスクリーニングプロトコルを採用することによって同定され得る。
【0040】
特定の実施形態において、投与される活性剤は、ＴＦＦ２特異的結合メンバーである。一般に、有用なＴＦＦ２特異的結合メンバーは、ヒトＴＦＦ２などの標的ＴＦＦ２に対して親和性（Ｋｄ）を示し、これは、老化関連障害ＴＦＦ２活性の望ましい低減をもたらすのに十分である。本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、２つの薬剤の可逆結合の平衡定数を指し；「親和性」は、解離定数（Ｋｄ）として表すことができる。親和性は、無関係なアミノ酸配列に対する抗体の親和性よりも、少なくとも１倍大きく、少なくとも２倍大きく、少なくとも３倍大きく、少なくとも４倍大きく、少なくとも５倍大きく、少なくとも６倍大きく、少なくとも７倍大きく、少なくとも８倍大きく、少なくとも９倍大きく、少なくとも１０倍大きく、少なくとも２０倍大きく、少なくとも３０倍大きく、少なくとも４０倍大きく、少なくとも５０倍大きく、少なくとも６０倍大きく、少なくとも７０倍大きく、少なくとも８０倍大きく、少なくとも９０倍大きく、少なくとも１００倍大きく、または少なくとも１０００倍大きく、またはそれ以上大きくすることができる。標的タンパク質への特異的結合メンバーの親和性は、例えば約１００ナノモル（ｎＭ）から約０．１ｎＭ、約１００ｎＭから約１ピコモル（ｐＭ）、または約１００ｎＭから約１フェムトモル（ｆＭ）などとすることができる。「結合」という用語は、例えば塩橋および水橋などの相互作用を含む、共有、静電、疎水性、およびイオンおよび／または水素結合相互作用による、２つの分子間の直接的な会合を指す。いくつかの実施形態において、抗体は、ナノモル親和性またはピコモル親和性でヒトＴＦＦ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、約１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満または１ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＦＦ２に結合する。
【0041】
ＴＦＦ２特異的結合メンバーの例には、ＴＦＦ２抗体およびその結合フラグメントが含まれる。そのような抗体の非限定的な例には、ＴＦＦ２の任意のエピトープに対して向けられた抗体が含まれる。前記エピトープの例には、例としてこれらに限定されないが、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６、配列番号０７、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２のアミノ酸配列が含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、前記エピトープは、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６、配列番号０７、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のいずれかの配列同一性を有する。
【0042】
二重特異性抗体、すなわち２つの結合ドメインのそれぞれが異なる結合エピトープを認識する抗体もまた含まれる。ヒトＴＦＦ２のアミノ酸配列は、Ｍａｙ，Ｆ．Ｅ．Ｂ．＆Ｓｅｍｐｌｅ、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ＆Ｎｅｗｔｏｎ、Ｊ．Ｌ．＆Ｗｅｓｔｌｅｙ，Ｂ．Ｒ．、「ヒト２ドメイントレフォイルタンパク質ＴＦＦ２は、胃においてインビボでグリコシル化される」、Ｇｕｔ．（２０００）４６：４５４－４５９に開示されている。
【0043】
採用され得る抗体特異的結合メンバーには、任意のアイソタイプの完全抗体または免疫グロブリン、ならびにＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、および抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質を含むがこれらに限定されない、抗原への特異的結合を保持する抗体のフラグメントが含まれる。抗体は、例えば放射性同位元素、検出可能産物を生成する酵素、蛍光タンパク質などで検出可能に標識され得る。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチンアビジン特異的結合対のメンバー）などの他の部分にさらにコンジュゲートされ得る。この用語にはまた、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、および／または抗原への特異的結合を保持する他の抗体フラグメント、およびモノクローナル抗体が含まれる。抗体は一価または二価であり得る。
【0044】
「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部、例えば無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する、「Ｆａｂ」と呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、容易に結晶化する能力を反映する名称を有する残留「Ｆｃ」フラグメントとが生成される。ペプシン処置により、２つの抗原結合部位を持ち、依然として抗原を架橋できるＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成される。
【0045】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、緊密な非共有結合の１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体で構成されている。この構成では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を定義する。まとめると、６つのＣＤＲは抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を持っている。
【0046】
「Ｆａｂ」フラグメントにはまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）も含まれている。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端にいくつかの残基が付加されることにより、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、ここではＦａｂ’の名称であり、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を担っている。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは元々、ヒンジシステインをその間に持つＦａｂ’フラグメントのペアとして生成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングもまた知られている。
【0047】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分類され得る。
【0048】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓＦｖのレビューについては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、モノクローナル抗体の薬理学、ｖｏｌ．１１３、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ ｅｄｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
【0049】
したがって、本開示に関連して使用され得る抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント（例えばＶＨまたはＶＬ）、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントおよびｄｓＦｖ抗体フラグメントを包含することができる。さらに、抗体分子は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。いくつかの実施形態において、抗体分子は、モノクローナルの完全ヒト抗体である。
【0050】
本開示に関連して使用され得る抗体は、任意の免疫グロブリン定常領域に連結された、成熟または未処理の任意の抗体可変領域を含むことができる。軽鎖可変領域が定常領域に連結されている場合、それはカッパ鎖定常領域とすることができる。重鎖可変領域が定常領域に連結されている場合、それは、ヒトガンマ１、ガンマ２、ガンマ３またはガンマ４定常領域、より好ましくはガンマ１、ガンマ２またはガンマ４、さらにより好ましくはガンマ１またはガンマ４とすることができる。
【0051】
いくつかの実施形態において、ＴＦＦ２に対して向けられた完全ヒトモノクローナル抗体は、マウスシステムではなく、ヒト免疫システムの一部を保有するトランスジェニックマウスを使用して生成される。
【0052】
抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列のわずかな変化は、アミノ酸配列の変化が配列の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％を維持することを条件として、本発明に含まれる。特に、保存的なアミノ酸置換が企図される。保存的置換とは、その側鎖にて関連するアミノ酸ファミリー内で行われる置換である。アミノ酸の変化が機能的なペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。抗体または免疫グロブリン分子のフラグメント（または類似体）は、当業者によって容易に調製することができる。フラグメントまたは類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近くに発生する。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公的または独自の配列データベースと比較することによって特定することができる。好ましくは、コンピュータ化された比較方法を使用して、既知の構造および／または機能の他のタンパク質で発生する配列モチーフまたは予測タンパク質コンフォメーションドメインを特定する。既知の三次元構造に折りたたまれるタンパク質配列を同定する方法が知られている。配列モチーフおよび構造的コンフォメーションを使用して、本発明による構造的および機能的ドメインを定義し得る。
【0053】
ＴＦＦ２の発現または活性を低減させるために採用され得る抗体剤の特定の例には、市販の抗体（例えば、市販のヒト抗ＴＦＦ２ポリクローナル抗体（＃ＭＢＳ９１２５３０１）を提供するＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（カリフォルニア州サンディエゴ）；市販のヒト抗ＴＦＦ２ポリクローナル抗体（カタログ番号ＬＳ－Ａ９８４０－５０）を提供するＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ワシントン州シアトル）；市販のヒト抗ＴＦＦ２モノクローナル抗体（カタログ番号ＭＡＢ４０７７）を提供するＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）；市販のヒト抗ＴＦＦ２（カタログ番号ｏｒｂ１９７８００）を提供するＢｉｏｒｂｙｔ（英国ケンブリッジ）；市販のヒト抗ＴＦＦ２モノクローナル抗体（カタログ番号４Ｇ７Ｃ３）を提供するＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；および以前にも記載されている他の抗ＴＦＦ２ヒト抗体を参照）が含まれるが、これらに限定されない（例えばＳｉｕ Ｌ－Ｓ，ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、２５（５）：８５５－６３（２００４）を参照）。モノクローナル抗体を作製および設計する方法は、当業者に共通して知られており、例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ＥＡ、抗体：実験室マニュアル、第２版（２０１４）およびＫｏｈｌｅｒ Ｇ，ｅｔ ａｌ．、事前定義された特異性の抗体を分泌する融合細胞の連続培養、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－９７（１９７５）を含む。
【0054】
活性剤が成体哺乳動物に投与されるそれらの実施形態において、活性剤（複数可）は、望ましい活動をもたらすことができる任意の便利な投与プロトコルを使用して成体哺乳動物に投与され得る。したがって、薬剤は治療的投与のために、さまざまな製剤、例えば薬学的に許容されるビヒクルに組み込むことができる。より具体的には、本発明の薬剤は、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって医薬組成物に製剤することができ、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏（例えばスキンクリーム）、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体の形態の調製物に製剤され得る。したがって、薬剤の投与は、経口、口腔内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内などの投与を含むさまざまな方法で達成することができる。
【0055】
医薬剤形において、薬剤は、それらの医薬的に許容される塩の形態で投与され得る、またはそれらはまた、単独でまたは、他の医薬的に活性な化合物と適切に関連して、ならびに組み合わせて使用され得る。以下の方法および賦形剤は単なる例示であり、決して限定するものではない。
【0056】
経口製剤の場合、薬剤を単独で、または適切な添加剤と組み合わせて使用して、例えばラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはポテトスターチなどの従来の添加剤と；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤と；コーンスターチ、ポテトスターチ、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤と；タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤と；必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤および香料などとともに錠剤、粉末、顆粒またはカプセルを作製することができる。
【0057】
薬剤は、必要に応じて可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、防腐剤などの従来の添加剤とともに、植物性または他の同様の油、合成脂肪族酸グリセリド、高級脂肪族酸のエステルまたはプロピレングリコールなどの水性または非水性溶媒にそれらを溶解、懸濁または乳化することにより、注射用製剤に製剤することができる。
【0058】
薬剤は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にて利用することができる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な噴射剤に製剤されることができる。
【0059】
さらに、乳化剤ベースまたは水溶性ベースなどのさまざまなベースと混合することにより、薬剤を坐剤に作製することができる。本発明の化合物は、坐剤を介して直腸に投与することができる。坐剤には、体温で溶けるが室温では固化したままであるカカオバター、カーボワックス、ポリエチレングリコールなどのビヒクルを含めることができる。
【0060】
シロップ、エリクシール、および懸濁液などの経口または直腸投与用の単位剤形が提供され得、各剤形単位は、例えば小さじ１杯、大さじ１杯、錠剤または坐剤であり、１つ以上の阻害剤を含む所定量の組成物を含む。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水、または別の薬学的に許容される担体中の溶液としての組成物中の阻害剤（複数可）を含み得る。
【0061】
本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物対象の単位投与量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、製薬上許容される希釈剤、担体またはビヒクルと関連して所望の効果を生み出すのに十分な量で計算された本発明の所定量の化合物を含む。本発明の新規の単位剤形の仕様は、採用される特定の化合物および達成される効果、ならびに宿主中の各化合物に関連する薬力学に依存する。
【0062】
ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、公衆に容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質は、公衆に容易に入手可能である。
【0063】
薬剤がポリペプチド、ポリヌクレオチド、類似体またはそれらの模倣物である場合、それは、ウイルス感染、マイクロインジェクション、または小胞融合を含む任意の数の経路によって組織または宿主細胞に導入され得る。ジェット注射はまた、Ｆｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）２０５：３６５－３６８によって記載されているように、筋肉内投与に使用され得る。ＤＮＡは、金微粒子上にコーティングされ、粒子衝撃装置、または文献に記載されている「遺伝子銃」によって皮膚内に送達され得（例えばＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５６：１５２－１５４を参照）、金の微小発射体がＤＮＡでコーティングされ、そして皮膚細胞に衝突する。核酸治療薬については、当技術分野で知られているように、ウイルスおよび非ウイルスベクターシステムを含む、多くの異なる送達ビヒクルに使用が見出されている。
【0064】
当業者は、用量レベルを特定の化合物、送達ビヒクルの性質などの関数としてさまざまとすることができることを容易に理解するであろう。所与化合物の好ましい投与量は、さまざまな手段によって当業者によって容易に決定可能である。
【0065】
有効量の活性剤が成体哺乳動物に投与されるこれらの実施形態において、その量または投薬量は、障害の低減、例えば成体哺乳動物における認知低下および／または認知改善を証明するために、適切な期間、例えば１週間以上、２週間以上、例えば３週間以上、４週間以上、８週間以上などの間、投与された場合に有効である。例えば有効用量は、適切な期間、例えば少なくとも約１週間、場合によっては約２週間、またはそれ以上、最大で約３週間、４週間、８週間、またはそれ以上の期間、投与された場合に、例えば約２０％以上、例えば３０％以上、４０％以上、または５０％以上、場合によっては６０％以上、７０％、８０％以上、または９０％以上、自然な老化または老化関連障害に罹患する患者の認知機能を遅らせる、例えば停止させる用量である。場合によっては、有効量または用量の活性剤は、病状の進行を遅らせるかまたは停止させるだけでなく、病状の逆転を誘発する、すなわち、認知能力の改善を引き起こすであろう。例えば場合によっては、有効量は、適切な期間、通常は少なくとも約１週間、場合によっては約２週間以上、最大で約３週間、４週間、８週間、またはそれ以上、投与された場合に、老化関連認知障害に罹患する個人の認知能力を、血液製剤投与前の認知と比較して例えば１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、場合によっては６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍、またはそれ以上、改善するであろう量である。
【0066】
必要に応じて、処置の有効性は、任意の便利なプロトコルを使用して評価され得る。例えば注意力と集中力、複雑なタスクおよび概念を学ぶ能力、記憶、情報処理、視空間機能、言語を生成して理解する能力、問題を解決して決定を下す能力、および実行機能を実施する能力などの認知能力を測定するための認知テストおよびＩＱテストは、当技術分野でよく知られており、それらのいずれも、主題の血液製剤による処置前および／または処置中および処置後の個人の認知能力を測定するために、例えば有効量が投与されたことを確認するために使用され得る。これらには、例えば認知の一般開業医評価（ＧＰＣＯＧ）テスト、記憶障害スクリーン、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、カリフォルニア言語学習テスト（第２版、短縮形、記憶用）、Ｄｅｌｉｓ－Ｋａｐｌａｎ実行機能システムテスト、アルツハイマー病評価尺度（ＡＤＡＳ－Ｃｏｇ）、老年精神医学評価尺度（ＰＡＳ）などが含まれる。機能性脳改善進行は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）などの脳画像化技術によって検出され得る。日常生活動作、実行機能、可動性などを監視するために、広範囲の追加機能評価が適用され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、認知能力を測定するステップと、血液製剤投与後の認知能力低下の減少率、認知能力の安定化、および／または認知能力増加を、血液製剤が投与される前の個人の認知能力と比較して検出するステップとを含む。そのような測定は、血液製剤投与後１週間以上、例えば１週間、２週間、３週間、またはそれ以上、例えば４週間、６週間、または８週間、またはそれ以上、例えば３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月、またはそれ以上、行われ得る。
【0067】
生化学的に、活性剤の「有効量」または「有効用量」とは、約２０％以上、例えば３０％以上、４０％以上、または５０％以上、場合によっては６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上、場合によっては約１００％、すなわち、ごくわずかな量まで、阻害、拮抗、減少、低減、または抑制する、場合によっては、自然老化プロセス中または老化関連障害の進行中に発生するシナプス可塑性の低下およびシナプスの喪失を逆転させる、活性剤の量を意味する。言い換えれば、本発明の方法に従って処置された成体哺乳動物に存在する細胞は、シナプスの形成および維持を促進する手がかり、例えば活性手がかりに対してより応答的になるであろう。
【0068】
本発明の方法のパフォーマンスは、例えば上記のように、長期増強の誘導として、インビトロおよびインビボの両方で、観察されたシナプス可塑性の改善として現れ得る。例えば神経回路でのＬＴＰの誘導は、例えば覚醒している個人に非侵襲的刺激技術を実行して、局所的な神経活性にＬＴＰのような長期的変化を誘発することによって（Ｃｏｏｋｅ ＳＦ、Ｂｌｉｓｓ ＴＶ（２００６）ヒトの中枢神経系の可塑性、Ｂｒａｉｎ．１２９（Ｐｔ７）：１６５９－７３）；例えば陽電子放出断層撮影、機能的磁気共鳴画像法、および／または経頭蓋磁気刺激法を使用して個人の可塑性および神経回路活性増加をマッピングすることによって（ＣｒａｍｅｒおよびＢａｓｔｉｎｇｓ、「脳卒中後の臨床的に関連する可塑性のマッピング」、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０００）３９：８４２－５１）；および、例えば検索関連脳活性を分析して学習後の神経可塑性、すなわち記憶の改善を検出することによって（Ｂｕｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、「プリオンタンパク質Ｍ１２９Ｖ多型は検索関連脳活性に影響を与える」、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉａ．（２００８）４６：２３８９－４０２）、または、例えば馴染みのあるオブジェクトおよび馴染みのないオブジェクトを使用した繰り返しプライミング後の機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）による脳組織の画像化によって（Ｓｏｌｄａｎ ｅｔ ａｌ．、「視覚刺激のグローバルな馴染みは反復関連神経可塑性に影響するが、反復プライミングには影響しない」、Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ．（２００８）３９：５１５－２６；Ｓｏｌｄａｎ ｅｔ ａｌ．、「老化は、新規オブジェクトの知覚的プライミングに関連する反復効果の脳パターンに影響を与えない」、Ｊ．Ｃｏｇｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００８）２０：１７６２－７６）、覚醒している個人で観察され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、シナプス可塑性を測定するステップと、血液製剤の投与後のシナプス可塑性の喪失率の低下、シナプス可塑性の安定化、および／またはシナプス可塑性の増加を、血液製剤が投与される前の個人のシナプス可塑性と比較して検出するステップとを含む。そのような測定は、血液製剤の投与後１週間以上、例えば１週間、２週間、３週間、またはそれ以上、例えば、４週間、６週間、または８週間、またはそれ以上、例えば３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月、またはそれ以上、行われ得る。
【0069】
場合によっては、本方法は、（以下の実験セクションで説明されるように）例えば適切な対照と比較して、宿主の１つ以上の組織における１つ以上の遺伝子の発現レベルの変化をもたらす。所与遺伝子の発現レベルの変化は、０．５倍以上、例えば１．０倍以上、１．５倍以上であり得る。組織はさまざまであり得、場合によっては、神経系組織、例えば中枢神経系組織であり、脳組織、例えば海馬組織を含む。場合によっては、海馬遺伝子発現の調節は、例えば適切な対照と比較して、海馬の可塑性の増強として現れる。
【0070】
場合によっては、処置は、（以下の実験セクションで説明されるように）例えば適切な対照と比較して、宿主の１つ以上の組織における１つ以上のタンパク質のレベルの増強をもたらす。所与タンパク質のタンパク質レベルにおける変化は、０．５倍以上、例えば１．０倍以上、１．５倍以上であり得、場合によっては、レベルは、健康な野生型レベルのものに、例えば健康な野生型レベルの５０％以下、例えば２５％以下、１０％以下、例えば５％以下に近づき得る。組織はさまざまであり得、場合によっては、神経系組織、例えば中枢神経系組織であり、脳組織、例えば海馬組織を含む。
【0071】
場合によっては、本方法は、１つ以上の組織に１つ以上の構造変化をもたらす。組織はさまざまであり得、場合によっては、神経系組織、例えば中枢神経系組織、脳組織、例えば海馬組織を含む。関心対象の構造変化には、例えば適切な対照と比較した場合の海馬の歯状回（ＤＧ）の成熟ニューロンの樹状突起棘密度の増加が含まれる。場合によっては、海馬構造の調節は、例えば適切な対照と比較して、増強されたシナプス形成として現れる。場合によっては、本方法は、例えば適切な対照と比較して、長期強化作用の増強をもたらし得る。
【0072】
場合によっては、例えば上記のように方法を実施すると、成体哺乳動物の神経新生が増加する結果となる。増加は、例えば以下の実験セクションで説明するように、いくつかの異なる方法で識別され得る。場合によっては、神経新生の増加は、Ｄｃｘ陽性の未成熟ニューロンの量の増加として現れ、例えばその増加は２倍以上になり得る。場合によっては、神経新生の増加は、ＢｒｄＵ／ＮｅｕＮ陽性細胞の数の増加として現れ、その増加は２倍以上になり得る。
【0073】
場合によっては、本方法は、例えば適切な対照と比較して、学習および記憶の増強をもたらす。学習および記憶の増強は、例えば以下の実験セクションで説明する文脈的恐怖条件付けおよび／またはラジアルアームウォーター迷路（ＲＡＷＭ）パラダイムなどの、いくつかの異なる方法で評価され得る。文脈的恐怖条件付けによって測定された場合、処置は、状況に応じた、しかし手がかりのない記憶テストにおいて、フリーズの増加をもたらす場合がある。ＲＡＷＭで測定すると、タスクのテスト段階で、処置によってプラットフォームの場所の学習および記憶の増強をもたらす場合がある。場合によっては、処置は、例えば適切な対照と比較して、海馬依存性の学習および記憶における増強された認知改善として現れる。
【0074】
いくつかの実施形態では、例えば上記のように、ＴＦＦ２レベルの低減は、老化関連認知障害を処置するのに適した活性を有する活性剤と組み合わせて実施され得る。例えば多くの活性剤は、例えばコリンエステラーゼ阻害剤（例えばドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、タクリン）、メマンチン、およびビタミンＥなど、アルツハイマー病の認知症状（例えば記憶喪失、混乱、ならびに、思考および推論の問題）の処置においてなんらかの効力を有すると示されている。別の例として、多くの活性剤は、例えばシタロプラム（セレクサ）、フルオキセチン（プロザック）、パロキセチン（パキシル）、セルトラリン（ゾロフト）、トラゾドン（デシレル）、ロラゼパム（アティバン）、オキサゼパム（セラックス）、アリピプラゾール（アビリファイ）、クロザピン（クロザリル）、ハロペリドール（ハルドール）、オランザピン（ジプレキサ）、ケチアピン（セロクエル）、リスペリドン（リスパダール）、およびジプラシドン（ジオドン）など、アルツハイマー病の行動または精神症状の処置においてなんらかの効力を有すると示されている。
【0075】
主題の方法のいくつかの態様では、本方法は、例えば本明細書に記載または当技術分野で公知の方法を使用して、処置後の認知および／またはシナプス可塑性を測定するステップと、認知低下またはシナプス可塑性の喪失の速度が低減している、および／またはその認知能力またはシナプス可塑性が個人で改善されていることを決定するステップとをさらに含む。いくつかのそのような例では、認知またはシナプス可塑性テストの結果を、同じ個人に対してより以前に、例えば２週間前、１ヶ月前、２ヶ月前、３ヶ月前、６ヶ月前、１年前、２年前、５年前、または１０年前、またはそれ以上前に実行されたテストの結果と比較することによって、決定が行われる。
【0076】
いくつかの実施形態では、主題の方法は、血液製剤を含む主題の血漿を投与する前に、例えば本明細書に記載の方法または認知およびシナプス可塑性を測定するための当技術分野で知られている方法を使用して、認知障害を有すると個人を診断することをさらに含む。場合によっては、診断は、認知および／またはシナプス可塑性を測定すること、および、認知またはシナプス可塑性テストの結果を１つ以上の参照、例えば陽性対照および／または陰性対照と比較することを含むであろう。例えば参照は、老化関連認知障害を経験する（すなわち、陽性対照）、または老化関連認知障害を経験しない（すなわち、陰性対照）１人以上の年齢が一致する個人によって実施されたテストの結果であり得る。別の例として、参照は、同じ個人が以前に、例えば２週間前、１ヶ月前、２ヶ月前、３ヶ月前、６ヶ月前、１年前、２年前、５年前、または１０年前、またはそれ以上前に実行したテストの結果であり得る。
【0077】
いくつかの実施形態において、主題の方法は、老化関連障害、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、進行性核上麻痺、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄筋萎縮症、多発性硬化症、多系統萎縮症、緑内障、運動失調、筋萎縮性ジストロフィー、認知症などを有すると個人を診断することをさらに含む。そのような老化関連障害を診断するための方法は当技術分野で周知であり、そのいずれもが、個人を診断する際に当業者によって使用され得る。いくつかの実施形態では、主題の方法は、老化関連障害を有すると個人を診断することと、認知障害を有すると個人を診断することとの両方をさらに含む。
【0078】
［実用性］
主題の方法は、老化関連障害およびそれに関連する状態、例えば個人の認知能力の障害を予防することを含む処置に使用が見出される。老化関連認知障害に罹患している、または発症するリスクのある個人には、約５０歳以上、例えば６０歳以上、７０歳以上、８０歳以上、９０歳以上、および通常は１００歳以下、すなわち、約５０～１００歳、例えば５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または約１００歳であり、自然老化プロセスに関連する認知障害、例えば軽度認知障害（Ｍ．Ｃ．Ｉ．）に罹患している個人；および約５０歳以上、例えば６０歳以上、７０歳以上、８０歳以上、９０歳以上、および通常は１００歳以下、つまり約５０～９０歳、例えば５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または約１００歳であり、まだ認知障害の症状を示し始めていない個人が含まれる。自然な老化に起因する認知障害の例には、以下が含まれる。
主題の方法は、老化関連障害およびそれに関連する状態、例えば個人の認知能力の障害を予防することを含む処置に使用が見出される。老化関連認知障害に罹患している、または発症するリスクのある個人には、約５０歳以上、例えば６０歳以上、７０歳以上、８０歳以上、９０歳以上、および通常は１００歳以下、すなわち、約５０～１００歳、例えば５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または約１００歳であり、自然老化プロセスに関連する認知障害、例えば軽度認知障害（Ｍ．Ｃ．Ｉ．）に罹患している個人；および約５０歳以上、例えば６０歳以上、７０歳以上、８０歳以上、９０歳以上、および通常は１００歳以下、つまり約５０～９０歳、例えば５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または約１００歳であり、まだ認知障害の症状を示し始めていない個人が含まれる。自然な老化に起因する認知障害の例には、以下が含まれる。
【0079】
軽度認知障害（Ｍ．Ｃ．Ｉ．）は、全体的な精神機能と日常の活動は損なわれていないものの時とともに悪化した、記憶、または、計画、指示服従または意思決定などの他の精神機能の問題として現れる、認知の中程度の混乱である。したがって、重大なニューロン死は典型的には発生しないが、老化した脳のニューロンは、構造、シナプス完全性、およびシナプスでの分子プロセシングにおける致死量以下の老化関連変化に対して脆弱であり、これらはすべて認知機能を損なう。
【0080】
例えば本明細書に開示される方法による、主題の血漿含有血液製剤による処置から利益を得るであろう老化関連認知障害に罹患している、または発症するリスクがある個人にはまた、老化関連障害のために認知障害に罹患している任意の年齢の個人；および、まだ認知障害の症状を示し始めていないが、典型的には認知障害を伴う老化関連障害と診断された任意の年齢の個人も含まれる。このような老化関連疾患の例には、以下が含まれる。
【0081】
アルツハイマー病（ＡＤ）。アルツハイマー病は、大脳皮質および皮質下灰白質の過剰な数の老人斑に関連する進行性の容赦のない認知機能喪失であり、タウタンパク質からなるｂアミロイドおよび神経原線維変化も含まれている。共通する形態は６０歳超の人に影響を及ぼし、その発生率は年齢が進むにつれて増加する。それは、高齢者の認知症の６５％超を占めている。
【0082】
アルツハイマー病の原因は不明である。その疾患は、症例の約１５～２０％で家族に発症する。残りのいわゆる散発的な症例には、いくつかの遺伝的決定要因がある。その疾患は、ほとんどの早期発症型および一部の遅発型の症例で常染色体優性の遺伝的パターンを有するが、晩年の浸透度は変動する。環境要因は積極的な調査の焦点である。
【0083】
疾患の過程で、シナプス、および最終的にニューロンは、大脳皮質、海馬、および皮質下構造（マイネルト基底核の選択的細胞喪失を含む）、青斑および核背側核内で失われる。脳グルコースの使用および灌流は、脳の一部の領域（初期疾患では頭頂葉および側頭皮質、後期疾患では前頭前野）で減少する。神経突起または老人斑（神経突起、星状細胞、およびアミロイドコアの周りのグリア細胞で構成される）および神経原線維変化（対のらせん状フィラメントで構成される）は、アルツハイマー病の病因において役割を果たす。老人斑および神経原線維変化は通常の老化で起こるが、それらはアルツハイマー病の人にはるかに多く見られる。
【0084】
パーキンソン病。パーキンソン病（ＰＤ）は、特発性で、ゆっくりと進行し、退行性である、ＣＮＳ障害であり、遅くて低下した動き、筋固縮、安静時振戦、および姿勢不安定性を特徴とする。もともとは主に運動障害と考えられていたが、ＰＤは現在、認知、行動、睡眠、自律神経機能、および感覚機能にも影響を与えると認識されている。最も一般的な認知障害には、注意力および集中力、作業記憶、実行機能、言語生成、視空間機能の障害が含まれる。
【0085】
原発性パーキンソン病では、黒質、青斑、および他の脳幹ドーパミン作動性細胞群の色素性ニューロンが失われる。原因は不明である。尾状核と被殻に投射される黒質ニューロンの喪失は、これらの領域の神経伝達物質ドーパミンの枯渇をもたらす。発症は一般的に４０歳以降であり、高齢者群では発生率が高くなる。
【0086】
二次性パーキンソニズムは、他の特発性変性疾患、薬物、または外因性毒素による大脳基底核でのドーパミンの作用の喪失または干渉に起因する。二次性パーキンソニズムの最も一般的な原因は、ドーパミン受容体を遮断することによってパーキンソニズムを引き起こす抗精神病薬またはレセルピンの摂取である。あまり一般的ではない原因には、一酸化炭素またはマンガン中毒、水頭症、構造的病変（中脳または大脳基底核に影響を与える腫瘍、梗塞）、硬膜下血腫、および線条体黒質変性を含む変性疾患が含まれる。
【0087】
前頭側頭型認知症。前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、脳の前頭葉の進行性の悪化に起因する状態である。時間の経過とともに、変性は側頭葉に進行し得る。有病率でアルツハイマー病（ＡＤ）に唯一次ぐＦＴＤは、初老期認知症の症例の２０％を占めている。症状は、影響を受ける前頭葉および側頭葉の機能に基づいて３つのグループに分類される；行動変種ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、これは一方では無気力および自発性喪失、もう一方では脱抑制を含む症状を伴う；進行性非流暢性失語症（ＰＮＦＡ）、この症状では、調音困難、音韻論的および／または構文エラーによる発話流暢さの崩壊が観察されるが、単語の理解は維持される；および意味認知症（ＳＤ）、この症状では、患者は通常の音韻論および構文に堪能なままであるが、命名および単語の理解がますます困難になっている。すべてのＦＴＤ患者に共通する他の認知症状には、実行機能および集中力の障害が含まれる。知覚、空間スキル、記憶、実践を含む他の認知能力は典型的には、無傷のままである。ＦＴＤは、構造的ＭＲＩスキャンで前頭葉および／または前頭側頭葉の萎縮を明らかにする観察で診断できる。
【0088】
ＦＴＤのいくつかの形態が存在し、それらのいずれも、主題の方法および組成物を使用して処置または予防され得る。例えば前頭側頭型認知症の１つの形態は、意味認知症（ＳＤ）である。ＳＤは、言語ドメインと非言語ドメインとの両方で意味記憶が失われることを特徴としている。ＳＤ患者はしばしば単語発見の難しさを訴える。臨床的兆候には、流暢な失語症、名詞想起困難症、単語の意味の理解障害、および連想的な視覚失認症（意味的に関連する絵またはオブジェクトを一致させることができない）が含まれる。疾患が進行するにつれて、行動および人格変化が、前頭側頭型認知症で見られるものと同様に見られることがよくあるが、後期行動症状がほとんどない「純粋な」意味認知症の症例が報告されている。構造的ＭＲＩ画像化は、側頭葉（主に左側）の萎縮の特徴的パターンを示しており、下側頭葉は上部病変よりも大きく、前側頭葉萎縮は後部よりも大きい。
【0089】
別の例として、前頭側頭型認知症の別の形態はピック病（ＰｉＤ、またはＰｃＤ）である。その疾患を定義づける特徴は、ニューロンにタウタンパク質が蓄積し、「ピックボディ」として知られる銀染色の球状凝集体に蓄積することである。症状には、発話の喪失（失語症）および認知症が含まれる。眼窩前頭機能障害のある患者は、攻撃的で社会的に不適切になることがある。彼らは、盗んだり、または、強迫観念的または反復的なステレオタイプの行動を示したりし得る。背内側または背外側前頭機能障害のある患者は、懸念の欠如、無関心、または自発性の低下を示し得る。患者は、自己モニタリングの欠如、異常な自己認識、および意味を理解できないことを示すことがある。両側後外側眼窩前頭皮質および右前部島の灰白質喪失の患者は、病的な甘党などの摂食行動の変化を示し得る。前外側眼窩前頭皮質でより限局性の灰白質喪失を伴う患者は、過食症を発症し得る。症状のいくつかは最初に軽減されることがあるが、疾患は進行し、患者はしばしば２年から１０年以内に死亡する。
【0090】
ハンチントン病。ハンチントン病（ＨＤ）は、感情的、行動的、精神医学的異常；知的または認知機能の喪失；および運動異常（運動障害）の発症を特徴とする遺伝性の進行性神経変性疾患である。ＨＤの典型的な兆候には、舞踏病の発症（顔、腕、脚、または体幹に影響を与え得る不随意で、急速な、不規則の、ぎくしゃくした動き）ならびに思考処理および獲得知的能力の段階的喪失を含む認知機能低下が含まれる。記憶、抽象的思考、判断力の障害；時間、場所、またはアイデンティティの不適切な認識（方向感覚喪失）；落ち着きのなさの増加；および人格変化（人格の崩壊）があり得る。症状は典型的には、生後４０年または５０年の間に明らかになるが、発症年齢はさまざまであり、幼児期から成人期後期（例えば７０代または８０代）の範囲である。
【0091】
ＨＤは、常染色体優性形質として家族内で伝達される。その障害は、４番染色体（４ｐ１６．３）の遺伝子内のコード化された命令の異常に長いシーケンスまたは「反復」の結果として発生する。ＨＤに関連する神経系機能の進行性喪失は、大脳基底核および大脳皮質を含む脳の特定領域のニューロンの喪失に起因する。
【0092】
筋萎縮性側索硬化症。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンを攻撃し、急速に進行する、常に致命的な神経疾患である。筋力衰弱および萎縮、ならびに前角細胞機能障害の兆候は、最初は手で最も頻繁に見られ、足ではあまり見られない。発症部位はランダムであり、進行は非対称である。痙攣は一般的であり、衰弱の前に起こり得る。まれに、患者が３０年生き残ることがあり；５０％は発症から３年以内に死亡し、２０％は５年生存し、１０％は１０年生存する。診断特徴には、成人期の中期または後期の発症、および感覚異常のない進行性の全身性運動障害が含まれる。神経伝達速度は、疾患の後半まで正常である。最近の研究では、認知障害の症状、ならびに特に、即時の言語記憶、視覚記憶、言語、および実行機能の低減も記録されている。
【0093】
細胞体の面積、シナプスの数、およびシナプスの全長の減少は、ＡＬＳ患者の正常に見えるニューロンでさえ報告されている。活性ゾーンの可塑性がその限界に達すると、シナプスの継続的喪失が機能障害につながる可能性があることが示唆されている。形成または新しいシナプスを促進すること、またはシナプスの喪失を防ぐことは、これらの患者のニューロン機能を維持し得る。
【0094】
多発性硬化症。多発性硬化症（ＭＳ）は、寛解および再発性悪化を伴う、ＣＮＳ機能障害のさまざまな症状および兆候を特徴としている。最も一般的に現れる症状は、１つ以上の四肢、体幹、または顔の片側の知覚異常；脚または手の脱力感または不器用さ；または視覚障害、例えば片方の眼の部分的な失明および痛み（眼球後視神経炎）、視力の低下、または暗点である。一般的な認知障害には、記憶障害（新しい情報の取得、保持および検索）、注意および集中（特に注意の分割）、情報処理、実行機能、視空間機能、ならびに言語の流暢さが含まれる。一般的な初期症状は、二重視力（複視）をもたらす眼性麻痺、１つ以上の四肢の一時的な衰弱、手足のわずかなこわばりまたは異常な疲労感、軽度の歩行障害、膀胱制御の困難、めまい、および軽度の感情障害であり；すべてが散在するＣＮＳの関与を示しており、多くの場合、疾患が認識される数ヶ月または数年前に発生する。過度の熱は症状および兆候を強調し得る。
【0095】
経過は非常に多様で、予測不可能であり、ほとんどの患者で寛解している。最初は、特に疾患が眼球後視神経炎で始まる場合、数ヶ月または数年の寛解がエピソードを分離し得る。しかし、一部の患者は頻繁に発作を起こし、急速に無能力になり；いくつかの場合、経過は急速に進行することがある。
【0096】
緑内障。緑内障は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）に影響を与える一般的な神経変性疾患である。証拠は、ＲＧＣ内を含むシナプスおよび樹状突起内の区画化された変性プログラムの存在を裏付けている。最近の証拠はまた、高齢者の認知障害と緑内障との相関関係を示す（Ｙｏｃｈｉｍ ＢＰ，ｅｔ ａｌ．緑内障の高齢者における認知障害、うつ病、および不安症状の有病率．Ｊ Ｇｌａｕｃｏｍａ．２０１２； ２１（４）：２５０－２５４）。
【0097】
筋緊張性ジストロフィー。筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）は、ジストロフィー性筋力衰弱および筋緊張症を特徴とする常染色体優性多系統障害である。分子欠陥は、染色体１９ｑのミオトニンタンパク質キナーゼ遺伝子の３’非翻訳領域にある拡張トリヌクレオチド（ＣＴＧ）リピートである。症状はどの年齢でも発生する可能性があり、臨床的重症度の範囲は広い。筋緊張症は手の筋肉で顕著であり、眼瞼下垂は軽度の場合でも一般的である。重症の場合、白内障、若はげ、斧様顔貌、心不整脈、精巣萎縮、および内分泌異常（例えば真性糖尿病）をしばしば伴う、顕著な末梢筋力衰弱が発生する。精神遅滞は、重度の先天性形態で一般的であるが、前頭葉および側頭葉の認知機能、特に言語および実行機能の老化関連低下は、軽度の成人型の障害で観察される。重篤な影響を受けた人は５０代前半までに死亡する。
【0098】
認知症。認知症は、日常の機能を妨げるほど深刻な思考および社会的能力に影響を与える症状を有する障害のクラスを説明する。上記の老化関連障害の後期に観察される認知症に加えて、認知症の他の例には、以下に記載される血管性認知症およびレビー小体を伴う認知症が含まれる。
【0099】
血管性認知症、または「多発梗塞性認知症」では、認知障害は、脳への血液供給の問題、典型的には一連の小さな脳卒中、または場合によっては、他の小さな脳卒中の前後にある１つの大きな脳卒中によって引き起こされる。血管病変は、小血管疾患などのびまん性脳血管疾患、または限局性病変、あるいはその両方の結果である可能性がある。血管性認知症に罹患している患者は、急性脳血管イベントの後に、急性または亜急性に認知障害を示し、その後、進行性の認知機能低下が観察される。認知障害は、言語、記憶、複雑な視覚処理、または実行機能の障害を含む、アルツハイマー病で観察されるものと同様であるが、脳の関連する変化はＡＤの病状によるものではなく、脳内の慢性的な血流の減少によるものであるが、最終的には認知症を引き起こす。単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）および陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）ニューロイメージングを使用して、精神状態検査を含む評価と併せて多発性梗塞性認知症の診断を確認し得る。
【0100】
レビー小体型認知症（ＤＬＢ、レビー小体型認知症、びまん性レビー小体型認知症、皮質レビー小体型認知症、レビー小体型老人性認知症など、他のさまざまな名前でも知られている）は、死後の脳組織学で検出可能な、ニューロンにおけるレビー小体（アルファ－シヌクレインおよびユビキチンタンパク質の塊）の存在によって解剖学的に特徴づけられる認知症の一種である。その主な特徴は、特に実行機能の認知機能低下である。覚醒と短期記憶とは上下する。鮮明で詳細な画像を伴う持続的または再発性の視覚的幻覚が、多くの場合、初期の診断症状である。ＤＬＢは、その初期段階でアルツハイマー病および／または血管性認知症と混同されることがよくあるが、アルツハイマー病は通常、非常にゆっくりと始まるのに対し、ＤＬＢはしばしば急速または急性の発症を示す。ＤＬＢの症状にはまた、パーキンソン病と同様の運動症状も含まれる。ＤＬＢは、パーキンソン病の症状と比較して、認知症の症状が現れる時間枠によってパーキンソン病で時々発生する認知症と区別される。認知症を伴うパーキンソン病（ＰＤＤ）は、認知症の発症がパーキンソン病の発症から１年超経過した場合の診断になるであろう。ＤＬＢは、認知症状がパーキンソン病の症状と同時に、またはそれから１年以内に始まるときに診断される。
【0101】
進行性核上性麻痺。進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）は、複雑な眼球運動および思考の問題に加えて、歩行およびバランスの制御に深刻で進行性の問題を引き起こす脳障害である。疾患の典型的な兆候の１つは、目を適切に向けることができないことであり、これは、眼球運動を調整する脳の領域の病変が原因で発生する。一部の個人は、この効果をぼやけていると説明している。影響を受けた個人は、うつ病および無関心、ならびに進行性の軽度の認知症など、気分および行動の変化を示すことがよくある。その障害の長い名前は、疾患がゆっくりと始まり、悪化し続け（進行性）、眼球運動を制御する核と呼ばれるエンドウ豆サイズの構造の上（核上）の脳の特定部分に損傷を与えることによって衰弱（麻痺）を引き起こすことを示す。ＰＳＰは、３人の科学者がパーキンソン病と状態を区別する論文を発表した１９６４年に最初に明確な障害として説明された。障害を定義した科学者の名前を組み合わせたものを反映して、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群と呼ばれることもある。ＰＳＰは次第に悪化するが、ＰＳＰ自体で死亡する人は誰もいない。
【0102】
運動失調。運動失調の人々は、運動およびバランスを制御する神経系の部分が影響を受けるため、協調に問題がある。運動失調は、指、手、腕、脚、体、発話、および眼球運動に影響を与え得る。運動失調という言葉は、感染症、怪我、その他の疾患、または中枢神経系の変性変化に関連する可能性のある協調運動障害の症状を説明するためによく使用される。運動失調はまた、国立運動失調財団の主要な強調である遺伝性および散発性運動失調と呼ばれる神経系の特定変性疾患グループを示すためにも使用される。
【0103】
多系統萎縮症。多系統萎縮症（ＭＳＡ）は、退行性の神経障害である。ＭＳＡは、脳の特定領域の神経細胞の変性に関連している。この細胞変性は、運動、バランス、および膀胱制御または血圧調節などの身体の他の自律神経機能に問題を引き起こす。ＭＳＡの原因は不明であり、特定の危険因子は特定されていない。症例の約５５％は男性で発生し、典型的な発症年齢は５０代後半から６０代前半である。ＭＳＡは、パーキンソン病と同じ症状のいくつかを示すことがよくある。しかし、ＭＳＡ患者は一般に、パーキンソン病に使用されるドーパミン薬に対する反応があったとしても最小限に抑えられる。
【0104】
フレイル。フレイル症候群（「フレイル」）は、運動能力の低下、筋力衰弱、身体的遅さ、持久力の低下、身体活動の低下、栄養失調、および不随意の体重減少を含む機能的および身体的衰退を特徴とする老年症候群である。そのような衰退はしばしば、認知機能障害および癌などの疾患に付随し、その結果である。しかし、フレイルは疾患がなくても発生する可能性がある。フレイルに罹患する個人は、骨折、偶発的な転倒、障害、併存症、および早期死亡による予後不良のリスクが高くなる（Ｃ．Ｂｕｉｇｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．フレイル症候群に対するプレバイオティクス製剤の効果：無作為化二重盲検臨床試験、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１６，１７，９３２）。さらに、フレイルに罹患する個人は、より高い医療費の発生率が高くなる（同上）。
【0105】
フレイルの一般的な症状は、特定の種類のテストによって判断できる。例えば意図しない体重減少には、少なくとも１０ポンドまたは前年の体重の５％以上の減少が含まれ；筋力衰弱は、ベースライン（性別およびＢＭＩで調整）での最低２０％の握力の低減によって判断でき；身体的な遅さは、１５フィートの距離を歩くのに必要な時間に基づくことができ；持久力の低下は、個人の倦怠感の自己報告によって判断でき：低い身体活動は、標準化された質問票を使用して測定されることができる（Ｚ．Ｐａｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．、フレイル症候群、Ｔｏｄａｙ’ｓ Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（１）、ａｔ１８（２０１４））。
【0106】
いくつかの実施形態において、主題の方法および組成物は、老化関連認知障害の進行を遅らせることに使用を見出す。言い換えれば、個人の認知能力は、開示された方法による処置の前または非存在下よりも、開示された方法による処置後の方がゆっくりと低下するであろう。いくつかのそのような例において、主題の処置方法は、処置後の認知機能低下の進行を測定すること、および認知機能低下の進行が低減していることを決定することを含む。いくつかのそのような例では、決定は、参照、例えば処置前の個人の認知低下率、例えば主題の血液製剤の投与前の２つ以上の時点での認知を測定することによって決定されるものと比較することによって行われる。
【0107】
主題の方法および組成物はまた、個人、例えば老化関連認知機能低下に罹患する個人または老化関連認知機能低下に罹患するリスクのある個人の認知能力を安定化するのに使用を見出す。例えば個人は、なんらかの老化関連認知障害を示し得、開示された方法による処置の前に観察された認知障害の進行は、開示された方法による処置の後に停止されるであろう。別の例として、個人は老化関連認知機能低下を発症するリスクがあり得（例えば個人は５０歳以上であり得、または老化関連障害と診断されていてもよい）、開示された方法による処置前と比較して、開示された方法による処置後は、個人の認知能力は実質的に変化しない、つまり、認知機能の低下は検出できない。
【0108】
主題の方法および組成物はまた、老化関連認知障害に罹患する個人の認知障害を低減するのに使用を見出す。言い換えれば、認知能力は、主題の方法による処置後の個人において改善される。例えば個人の認知能力は、主題の方法による処置の前に個人で観察される認知能力と比較して主題の方法による処置後に、例えば２倍以上、５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、または４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、または１００倍以上、増加する。場合によっては、主題の方法および組成物による処置は、老化関連認知機能低下に罹患する個人の認知能力を、例えば個人が約４０歳以下であったときのそのレベルにまで回復させる。言い換えれば、認知障害は排除される。
【0109】
［試薬、デバイス、およびキット］
上記の方法の１つ以上を実施するための試薬、デバイス、およびそのキットも提供される。主題の試薬、デバイス、およびそのキットは大きく異なり得る。関心対象の試薬およびデバイスには、成体哺乳動物のＴＦＦ２レベルを低減させる方法、および老化関連障害または認知障害と診断された対象のＴＦＦ２のレベルまたは活性を弱める方法に関する上記のものが含まれる。
上記の方法の１つ以上を実施するための試薬、デバイス、およびそのキットも提供される。主題の試薬、デバイス、およびそのキットは大きく異なり得る。関心対象の試薬およびデバイスには、成体哺乳動物のＴＦＦ２レベルを低減させる方法、および老化関連障害または認知障害と診断された対象のＴＦＦ２のレベルまたは活性を弱める方法に関する上記のものが含まれる。
【0110】
上記のコンポーネントに加えて、主題のキットには、主題の方法を実践するための説明書がさらに含まれる。これらの説明書は、さまざまな形で主題のキットに存在し得、そのうちの１つ以上がキットに存在し得る。これらの説明書が存在し得る１つの形式は、適切な媒体または基板に印刷された情報として、例えば情報が印刷された１枚または複数枚の紙、キットのパッケージ、添付文書などである。さらに別の手段は、情報が記録されているコンピュータ可読媒体、例えばディスケット、ＣＤ、ポータブルフラッシュドライブなどであろう。存在し得るさらに別の手段は、移動先サイトの情報にアクセスするためにインターネットを介して使用され得るウェブサイトアドレスである。キットには、任意の便利な手段が存在し得る。
【0111】
［実施例］
以下の実施例は、限定ではなく説明のために提供されている。
ａ．実験例
ｉ．ＴＦＦ２レベルは年齢とともに増加する
図１は、５つの異なる年齢グループのドナーからの血漿中のＴＦＦ２のｌｏｇ２相対濃度の「箱ひげ図」を示す。１８、３０、４５、５５、および６６歳の男性（各年齢グループで５０人）の血漿を、ＳｏｍａＳｃａｎアプタマーベースのプロテオミクスアッセイ（ＳｏｍａＬｏｇｉｃ、コロラド州ボールダー）を使用して測定した。健康な血漿レベルは、この年齢範囲にわたって非常に有意な単調増加を示す（ｐ＝１．６ｅ－９、ヨンクヒール－タプストラトレンドテスト）。各箱内の線は中央値を示す。
以下の実施例は、限定ではなく説明のために提供されている。
ａ．実験例
ｉ．ＴＦＦ２レベルは年齢とともに増加する
図１は、５つの異なる年齢グループのドナーからの血漿中のＴＦＦ２のｌｏｇ２相対濃度の「箱ひげ図」を示す。１８、３０、４５、５５、および６６歳の男性（各年齢グループで５０人）の血漿を、ＳｏｍａＳｃａｎアプタマーベースのプロテオミクスアッセイ（ＳｏｍａＬｏｇｉｃ、コロラド州ボールダー）を使用して測定した。健康な血漿レベルは、この年齢範囲にわたって非常に有意な単調増加を示す（ｐ＝１．６ｅ－９、ヨンクヒール－タプストラトレンドテスト）。各箱内の線は中央値を示す。
【0112】
ｉｉ．若いＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるヒト組換ＴＦＦ２タンパク質の効果
３ヶ月齢のＣ５７ＢＬ６マウスを組換ヒトＴＦＦ２（「ｈＴＦＦ２」、１．２５μｇ／マウス、ＩＰ）またはビヒクル（ＰＢＳ）で１日おきに４週間（グループあたりｎ＝１４～１５））、処置した。マウスは一連の行動アッセイでテストされ、その後、脳が分析された。
３ヶ月齢のＣ５７ＢＬ６マウスを組換ヒトＴＦＦ２（「ｈＴＦＦ２」、１．２５μｇ／マウス、ＩＰ）またはビヒクル（ＰＢＳ）で１日おきに４週間（グループあたりｎ＝１４～１５））、処置した。マウスは一連の行動アッセイでテストされ、その後、脳が分析された。
【0113】
図１［［高齢血漿と若い血漿の差分相対定量化］］
【0114】
図２は、ラジアルアームウォーター迷路（ＲＡＷＭ）アッセイの結果を示し、このアッセイは、マウスに手がかりを利用させて脱出プラットフォームの位置を特定するよう命じることにより、参照および作業記憶パフォーマンスをテストする（例えばＰｅｎｌｅｙ ＳＣ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．、（８２）：５０９４０（２０１３）を参照）。ｈＴＦＦ２で処置された若いマウスは、ビヒクルで処置されたマウスと比較して、迷路をナビゲートするときに多くのエラーを起こした。
【0115】
図３は、Ｙ迷路挙動テストの結果を示す。Ｙ迷路テストは、手がかりのあるＹ迷路に（既知アームではなく）新規アームに入るために好みによって測定される海馬依存認知を決定する。進入の割合は、新規または既知アーム（「Ｙ」迷路の２つのアーム）への進入回数を、新規および既知アームへの総進入回数に正規化することによって計算された。ウィルコクソンのマッチドペア符号付き順位検定を使用して、進入回数のパーセントで新規アームと既知アームとの間の統計的有意性を評価した。図３の結果は、若いマウスにヒトＴＦＦ２（ｈＴＦＦ２）を投与すると、Ｙ迷路の新規アームへの進入回数が少なくなる傾向にあることを示し、認知パフォーマンスの低下を示す。
【0116】
図４は、ｈＴＦＦ２処置マウスおよびビヒクル処置マウスからの海馬ｍＲＮＡの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を示す。本図は、ビヒクル処置マウスと比較して、炎症マーカーであるＩＬ－６の発現が増加していることを示す。（＊Ｐ＜０．０５、マンホイットニーＵ検定）。
【0117】
図５は、ｈＴＦＦ２およびビヒクル処置マウスの海馬ｃＤＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲを示す。本図は、ビヒクル処置マウスと比較して、反応性星状細胞のマーカーであるＧｇｔａ１の発現が増加する傾向があることを示す。反応性星状細胞は、傷害および疾患の際に中枢神経系によって強く誘導される（Ｌｉｄｄｅｌｏｗ ＳＡ，ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、５４１（７６３８）：４８１－８７（２０１７）。
【0118】
このデータは、若いマウスの認知パフォーマンスがｈＴＦＦ２の存在によって損なわれる可能性があり、ＴＦＦ２を認知疾患または他の障害の抑制の標的とし得ることを示す。
ｉｉｉ．２１ヶ月齢のマウスにおけるＴＦＦ２阻害
ｉｉｉ．２１ヶ月齢のマウスにおけるＴＦＦ２阻害
【0119】
２１ヶ月齢のＣ５７ＢＬ６マウスを、ＴＦＦ２阻害剤、Ｌ－ピログルタミン酸（３０ｍｇ／ｋｇ、毎日のＰＯ）またはビヒクル（滅菌Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ／ＥｔＯＨ中の４％ＤＭＳＯ）で４週間（グループあたりｎ＝１５）、処置し、行動テストに供した。行動テストは、３週間の処置後に開始された。最後の行動テストの終了の翌日、マウスを犠牲にした。
【0120】
図６は、阻害剤で処置された老齢マウスが既知アームよりも有意に多く新規アームに入ったため、Ｌ－ピログルタミン酸によるＴＦＦ２阻害がＹ迷路テストにおける認知パフォーマンスを改善したこと（ｐ＜０．００２）、ならびに、新規アームおよび既知アームへの進入回数の間の差が、ビヒクルで観察されたものよりも大きかったことを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。
【0121】
図７は、ビヒクルと比較した、ＴＦＦ２阻害剤で処置された老齢マウスの海馬における免疫染色の定量分析からの結果を示す。シナプス密度は、μｍ３あたりのシナプス数として測定された。ＴＦＦ２阻害剤で処置されたマウスでは、海馬のＣＡ１領域でシナプス密度が高くなる傾向が強かった。データは平均±ＳＥＭとして示されている。
【0122】
ｉｖ．ＴＦＦ２活性に対する抗ＴＦＦ２抗体の効果
２２ヶ月齢のＣ５７Ｂ１６マウスの半脳を、プロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳでホモジナイズした。４～６匹のマウスからのサンプルをウサギポリクローナル抗ヒトＴＦＦ２抗体（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏ、ＬＳ－Ｃ４８９５）でプローブした。図８Ａは、４匹の２２ヶ月齢マウスの脳溶解物でＴＦＦ２タンパク質が検出されたことを示すウエスタンブロットである。図８Ｂは、抗ＴＦＦ２抗体がマウスとヒトの両方の組換ＴＦＦ２を認識し、マウスＴＦＦ２（１２ｋＤａ）とヒトＴＦＦ２（１４ｋＤａ）とをインビボでグリコシル化できることを示す。
２２ヶ月齢のＣ５７Ｂ１６マウスの半脳を、プロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳでホモジナイズした。４～６匹のマウスからのサンプルをウサギポリクローナル抗ヒトＴＦＦ２抗体（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏ、ＬＳ－Ｃ４８９５）でプローブした。図８Ａは、４匹の２２ヶ月齢マウスの脳溶解物でＴＦＦ２タンパク質が検出されたことを示すウエスタンブロットである。図８Ｂは、抗ＴＦＦ２抗体がマウスとヒトの両方の組換ＴＦＦ２を認識し、マウスＴＦＦ２（１２ｋＤａ）とヒトＴＦＦ２（１４ｋＤａ）とをインビボでグリコシル化できることを示す。
【0123】
図９は、ジャーカット細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ－１５２）におけるＥＲＫ１／２リン酸化のＴＦＦ２バイオアッセイを示す。ジャーカット細胞は、ＴＦＦ２と相互作用してリガンドＳＤＦ－１に結合すると報告されている受容体であるＣＸＣＲ４を発現するヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株である。ＣＸＣＲ４の刺激は、ＥＲＫ１／２のリン酸化を含む下流のシグナル伝達経路の活性化につながる。本明細書では、ＥＲＫ１／２リン酸化のウエスタンブロッティングを介してインビトロでＴＦＦ２の活性化および阻害を測定するためのアッセイを開発した。アッセイは次のように実行される：ジャーカット細胞を、Ｔ－７５フラスコ内で１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地でコンフルエンシーまで増殖させる。細胞をカウントし、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩにて１０７個の細胞を再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。血清飢餓細胞をカウントし、２×１０５個の細胞をサンプルチューブに追加する。細胞を、ビヒクル、ＴＦＦ２、または陽性対照マウスＳＤＦ－１で処置する。そして、テストされる抗ＴＦＦ２抗体を細胞に添加し、サンプルを３７℃、５％ＣＯ２で１５～３０分間インキュベートする。細胞をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むＲＩＰＡで溶解し、溶解物をＭＯＰＳバッファー中の４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルで泳動する。メンブレントランスファー後、ブロットを５％ＢＳＡでブロックし、ウサギ抗ホスホＥＲＫ１／２抗体でプローブする（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４３０７）。
【0124】
図１０は、ジャーカット細胞をヒトＴＦＦ２で処置すると、ＥＲＫ１／２リン酸化が増加することを示すウエスタンブロットを示す。ジャーカット細胞を１００または６００ｎＭのＴＦＦ２でインキュベートすると、対照（ＰＢＳ、無処置（Ｔｘなし）、または水（Ｖｅｈ））よりもＥＲＫ１／２リン酸化が誘導される。陽性対照マウスＳＤＦ－１（１０ｇ／ｍｌ）は、強いＥＲＫ１／２リン酸化を示す。ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をローディングコントロールとして使用した。
【0125】
図１１は、抗ヒトＴＦＦ２抗体がヒトＴＦＦ２に対してジャーカット細胞で中和活性を有することを示すウエスタンブロットである。２つのモノクローナル抗ヒトＴＦＦ２抗体を、ＴＦＦ２バイオアッセイで、さまざまな濃度（８、２、０．２μｇ／ｍＬ）での中和活性についてテストした。ＨＳＰＧＥ１６Ｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）はＴＦＦ２の最後の２０アミノ酸に対して生成されたが、クローン３６６５０８はＴＦＦ２の一部（Ｇｌｕ２４－Ｔｙｒ１２９）を認識する。ＩｇＭアイソタイプコントロールを同じ濃度で使用したが、ＥＲＫ１／２リン酸化を阻害しない。ＨＳＰ ＧＥ１６抗体クローンは最高濃度で阻害を示すが、クローン３６６５０８は中程度の阻害を示す。総ＥＲＫ１／２はローディングコントロールとして使用された。
【0126】
図１２Ａおよび図１２Ｂは、抗ＴＦＦ２抗体がジャーカット細胞のマウスＴＦＦ２活性を中和できることを示す。マウスＴＦＦ２（「ＴＦＦ２」カラム）は、高濃度でジャーカット細胞にＥＲＫ１／２リン酸化を誘導することもできる（図１２Ａは３００ｎＭおよび１００ｎＭであるが３０ｎＭ ＴＦＦ２ではない、図１２Ｂを参照）。抗ヒトＴＦＦ２抗体クローンＨＳＰＧＥ１６Ｃは、１００ｎＭ ＴＦＦ２の処置でＥＲＫ１／２リン酸化を阻害できるが、３００ｎＭは阻害できない。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。
【0127】
図１３は、ＨＳＰＧＥ１６Ｃ抗ｈＴＦＦ２抗体が濃度依存的にジャーカット細胞のマウスＴＦＦ２活性を中和することができ、高濃度でＥＲＫ１／２リン酸化を減少させることを示すウエスタンブロットである。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。
【0128】
ｖ．ＴＦＦ２抗体はジャーカット細胞のＴＦＦ２活性を阻害する
市販の抗ＴＦＦ２抗体は、ジャーカット細胞におけるＴＦＦ２活性の中和についてテストされた。図１４は、ジャーカット細胞におけるＴＦＦ２活性の中和についてテストされた市販の抗ＴＦＦ２抗体、それらの免疫原情報、抗体が認識するＴＦＦ２の種、それらが産生された宿主種、それらのクローン性、およびそれらのアイソタイプの表を示す。
市販の抗ＴＦＦ２抗体は、ジャーカット細胞におけるＴＦＦ２活性の中和についてテストされた。図１４は、ジャーカット細胞におけるＴＦＦ２活性の中和についてテストされた市販の抗ＴＦＦ２抗体、それらの免疫原情報、抗体が認識するＴＦＦ２の種、それらが産生された宿主種、それらのクローン性、およびそれらのアイソタイプの表を示す。
【0129】
図１５Ａは、配列番号０１とラベル付けされた全長マウスＴＦＦ２、配列番号０２とラベル付けされたヒトＴＦＦ２、および特定のタンパク質ドメインに対する抗体を生成するために使用されるＴＦＦ２抗原のペプチド配列の表現を示す。マウス配列は黒い長方形で表され、ヒト配列は白い長方形で表され、各ペプチド領域は全長ＴＦＦ２タンパク質と整列している。抗原には、マウスＴＦＦ２のアミノ酸２４～１２９（配列番号０３）；ヒトＴＦＦ２のアミノ酸２４～１２９（配列番号０４）；マウスＴＦＦ２のアミノ酸２７～１２９（配列番号０５）；ヒトＴＦＦ２のアミノ酸２７～１２９（配列番号０６）；マウスＴＦＦ２のアミノ酸２９～７３（配列番号０７）；ヒトＴＦＦ２のアミノ酸２９～７３（配列番号０８）；マウスＴＦＦ２のアミノ酸７９～１２２（配列番号０９）；ヒトＴＦＦ２のアミノ酸７９～１２２（配列番号１０）；マウスＴＦＦ２のアミノ酸１１４～１２９（配列番号１１）；およびヒトＴＦＦ２のアミノ酸１１４～１２９（配列番号１２）が含まれる。タンパク質ドメインに特異的な抗体を生成するために、さまざまなペプチドフラグメントと完全長のマウスおよびヒトＴＦＦ２とが使用される。これらの配列から生成された市販の抗体を、ＴＦＦ２への特異的結合およびインビトロでの中和についてスクリーニングした。これらの抗原は、カスタムＴＦＦ２抗体を生成するためにも使用でき、ＴＦＦ２活性の減衰においてより効果的な抗体の生成をもたらす抗原領域の特定に役立つ。
【0130】
図１５Ｂは、図１５Ａで説明した配列番号１から１２の多重配列アライメントを示す。アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ ０（１．２．４）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ａｌｉｇｎ／で入手可能）を使用して実行された。
【0131】
図１６は、図１４の１３個の抗ＴＦＦ２抗体がジャーカット細胞のＴＦＦ２活性に及ぼす影響を示し、いくつかの抗ＴＦＦ２抗体がジャーカット細胞のＴＦＦ２活性を阻害できることを示す。ウエスタンブロットＴＦＦ２バイオアッセイは、各抗ＴＦＦ２抗体に対して実行された。ジャーカット細胞は、Ｔ－７５フラスコ内で１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地でコンフルエンシーまで増殖させた。細胞をカウントし、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩにて１０７個の細胞を再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。血清飢餓細胞がカウントされ、２×１０５個の細胞をサンプルチューブに追加した。細胞をビヒクル、ＴＦＦ２、または陽性対照マウスＳＤＦ－１で処置した。テストされる抗ＴＦＦ２抗体を４μｇ／ｍｌで細胞に添加し、サンプルを３７℃、５％ＣＯ２で１５～３０分間インキュベートした。細胞をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むＲＩＰＡで溶解し、サンプルをＭＯＰＳバッファー中の４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルで泳動した。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏトランスファーを使用して、ゲルをニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。メンブレントランスファー後、ブロットを５％ＢＳＡで１時間ブロックし、ウサギ抗ホスホＥＲＫ１／２およびＧＡＰＤＨ抗体で５％ＢＳＡ中４℃で一晩プローブした。メンブレンを洗浄し、ＨＲＰにコンジュゲートされた適切な二次抗体をＲＴで１時間インキュベートした後、ＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃシステムを使用して現像および画像化を行った。バンドは、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用してバンド強度を定量化し、同じメンブレンからブロットしたＧＡＰＤＨローディングコントロールに対して正規化した。図１６は、１３個の抗ＴＦＦ２抗体によるジャーカット細胞の処置を示すウエスタンブロットからの正規化された相対ｐＥＲＫ／ＧＡＰＤＨ値を示す。本図は、ビヒクル、ＴＦＦ２、および陽性対照（マウスＳＤＦ－１）での処置と比較した、図１４にリストされた１３の抗ＴＦＦ２抗体のそれぞれについて４μｇ／ｍｌの濃度でのジャーカット細胞の処置の結果を示す。
【0132】
図１７は、特定の市販のモノクローナル抗ｈＴＦＦ２抗体であるクローン＃１－２が、ジャーカット細胞のマウスＴＦＦ２活性を中和することを示す。ホスホ－ＥＲＫ１／２ ＥＬＩＳＡを使用してテストを実施した。ＴＦＦ２バイオアッセイを実施し、ｐＥＲＫ ＥＬＩＳＡを製造元の指示（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に従って実施した。ジャーカット細胞は、Ｔ－７５フラスコ内で１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地でコンフルエンシーまで増殖させた。細胞をカウントし、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩにて１０７個の細胞を再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。血清飢餓細胞がカウントされ、２×１０５個の細胞をサンプルチューブに追加した。細胞をビヒクル、ＴＦＦ２、または陽性対照マウスＳＤＦ－１で処置した。抗ＴＦＦ２抗体を細胞に追加し、サンプルを３７℃、５％ＣＯ２で１５～３０分間インキュベートした。細胞をＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｍｉｘ（５×）で溶解し、室温で１０分間振とうした（約３００ｒｐｍ）。調製したサンプル溶解物と陽性および陰性対照とをＩｎｓｔａｎｔＯｎｅ ＥＬＩＳＡ（商標）アッセイウェルに追加した。検出および捕捉抗体を含む抗体カクテルを各テストウェルに加え、次にマイクロプレートをマイクロプレートシェーカー上で室温で１時間インキュベートした（約３００ｒｐｍ）。ウェルを適切に洗浄した後、検出試薬を追加し、３００ｒｐｍで振とうしながら１５分間インキュベートした。停止液を加えた後、４５０ｎｍに設定したＣｌａｒｉｏＳｔａｒ Ｐｌｕｓプレートリーダーを使用してプレートを読み取り、サンプルの吸光度を測定した。
【0133】
関連出願への相互参照
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従い、この出願は、２０１９年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／９４０，４７７号、２０２０年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０７１，５１５号の出願日に優先権を主張し、それらの出願の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従い、この出願は、２０１９年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／９４０，４７７号、２０２０年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０７１，５１５号の出願日に優先権を主張し、それらの出願の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】