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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-08
(54)【発明の名称】ナチュラルキラー細胞を製造する方法およびその組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20230201BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022531631
(86)(22)【出願日】2020-11-24
(85)【翻訳文提出日】2022-07-26
(86)【国際出願番号】 US2020061984
(87)【国際公開番号】W WO2021108389
(87)【国際公開日】2021-06-03
(31)【優先権主張番号】10-2019-0157727
(32)【優先日】2019-11-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】63/062,694
(32)【優先日】2020-08-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】513205259
【氏名又は名称】エヌケーマックス カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＫＭＡＸ ＣＯ．， Ｌｔｄ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パク，ソンウ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ヨンマン
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ジェソブ
(72)【発明者】
【氏名】カン，ヨンミ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065BD09
4B065BD12
4B065CA44
(57)【要約】
ナチュラルキラー細胞を製造する方法が開示される。方法は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液試料から単離すること；ＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞のうちの少なくとも１つをＰＢＭＣから単離すること；ならびにＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞のうちの少なくとも１つをフィーダー細胞の組合せと共にサイトカインの存在下で共培養することを含む。方法は、ＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞を凍結させかつ解凍することをさらに含み得る。がんを処置するための組成物もまた開示される。組成物は、開示される方法により製造されるＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞およびサイトカインを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
培養においてナチュラルキラー細胞を拡大増殖させる方法であって、ＣＤ５６＋細胞を血液試料から単離すること；
前記単離されたＣＤ５６＋細胞をＩＬ－２１の存在下で第１の期間にわたり共培養すること；
前記第１の期間後に前記共培養されたＣＤ５６＋細胞を凍結させること；
前記凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；および
前記解凍されたＣＤ５６＋細胞をＩＬ－２１の存在下で第２の期間にわたり共培養することを含む、方法。
【請求項2】
前記凍結されたＣＤ５６＋細胞を－１００℃よりも低い温度で貯蔵することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍の前に１日よりも長く貯蔵することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記単離されたＣＤ５６＋細胞が、凍結の前に１３～１６日にわたり共培養される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記単離されたＣＤ５６＋細胞が、ＩＬ－２１の存在下で、１つまたは複数の照射されたフィーダー細胞と共に共培養される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記解凍されたＣＤ５６＋細胞が、ＩＬ－２１の存在下で、１つまたは複数の照射されたフィーダー細胞と共に共培養される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
１つまたは複数のフィーダー細胞が、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞およびＰＢＭＣからなる群から選択される１つまたは複数である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＣＤ５６＋細胞が、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞と前記フィーダー細胞との比で共培養される、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記ＣＤ５６＋細胞が、約１：２のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ＣＤ５６＋細胞が、約１：５～１：３０のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養される、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記ＣＤ５６＋細胞が、約１：１０のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養される、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記ＣＤ５６＋細胞が、約１：３０のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養される、請求項８に記載の方法。
【請求項13】
前記ＣＤ５６＋細胞が、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養される、請求項８に記載の方法。
【請求項14】
ＩＬ－２１が、前記第１および／または第２の期間の間に１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ＩＬ－２１が、前記第１および／または第２の期間の間に２０～８０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
ＩＬ－２１が、前記第１および／または第２の期間の間に３０～７０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
ＩＬ－２１が、前記第１および／または第２の期間の間に１回よりも多く添加される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
培養においてナチュラルキラー細胞を拡大増殖させる方法であって、ＣＤ５６＋を血液試料から単離すること；
前記ＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養すること；
前記ＣＤ５６＋細胞を凍結させること；
前記凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；および
前記解凍されたＣＤ５６＋細胞を拡大増殖させることを含む、方法。
【請求項19】
前記ＣＤ５６＋細胞を－１００℃よりも低い温度で凍結させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記凍結されたＣＤ５６＋細胞を１日より長く、かつ１０年より短い期間にわたり貯蔵することをさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ＣＤ５６＋細胞が、凍結の前に１３～１６日にわたり共培養される、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
１つまたは複数のフィーダー細胞が、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞およびＰＢＭＣからなる群から選択される１つまたは複数である、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記ＣＤ５６＋細胞が、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養される、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
ＩＬ－２１が、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加される、請求項１８～２３のいずれかに記載の方法。
【請求項25】
ＩＬ－２１が、１回よりも多く添加される、請求項１８～２４のいずれかに記載の方法。
【請求項26】
ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性を増加させる方法であって、前記ナチュラルキラー細胞を提供すること；
前記ナチュラルキラー細胞を凍結させること；
前記凍結されたナチュラルキラー細胞を解凍すること；および
前記解凍されたナチュラルキラー細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養すること
を含む、方法。
【請求項27】
前記凍結されたナチュラルキラー細胞を－１００℃よりも低い温度で貯蔵することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記凍結されたナチュラルキラー細胞を解凍前に１日よりも長く貯蔵することをさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項29】
１つまたは複数のフィーダー細胞が、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞およびＰＢＭＣからなる群から選択される１つまたは複数である、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記解凍されたナチュラルキラー細胞が、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養される、請求項２６～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
ＩＬ－２１が、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加される、請求項２６～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
ＩＬ－２１が、１回よりも多く添加される、請求項２６～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
対象を処置する方法であって、ＣＤ５６＋細胞を前記対象から収集すること；
前記ＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養すること；
前記共培養されたＣＤ５６＋細胞を少なくとも１日にわたり凍結させること；
前記凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；
前記解凍されたＣＤ５６＋細胞を拡大増殖させること；および
前記拡大増殖されたＣＤ５６＋細胞を前記対象に投与することを含み、前記第２の拡大増殖からの前記細胞の細胞傷害性が凍結の前の前記共培養されたＣＤ５６＋細胞の細胞傷害性の少なくとも８０％である、方法。
【請求項34】
前記凍結されたＣＤ５６＋細胞を－１００℃よりも低い温度で貯蔵することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍の前に１日よりも長く貯蔵することをさらに含む、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項36】
前記単離されたＣＤ５６＋細胞が、凍結の前に１３～１６日にわたり共培養される、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記解凍されたＣＤ５６＋細胞を拡大増殖させることが、前記解凍されたＣＤ５６＋を１つまたは複数の照射されたフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養することを含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
１つまたは複数のフィーダー細胞が、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞およびＰＢＭＣからなる群から選択される１つまたは複数である、請求項３３～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記ＣＤ５６＋細胞が、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養される、請求項３３～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
ＩＬ－２１が、前記第１および／または第２の期間の間に１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加される、請求項３３～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
ＩＬ－２１が、前記第１および／または第２の期間の間に１回よりも多く添加される、請求項３３～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する有効量のＣＤ５６＋細胞を含む組成物であって、前記ＣＤ５６＋細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液試料から単離すること；
ＣＤ５６＋細胞を前記ＰＢＭＣから単離すること；
前記ＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共に１つまたは複数のサイトカインの存在下で共培養すること；
前記ＣＤ５６＋細胞を凍結させること；
前記凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；および
前記解凍されたＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共に１つまたは複数のサイトカインの存在下で共培養することにより調製される、組成物。
【請求項43】
患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する有効量のＣＤ５６＋細胞；ＩＬ－２；および
ＩＬ－２１を含む、細胞組成物。
【請求項44】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＣＤ５６＋細胞の第１の集団；氷；および
ＩＬ－２、
ＩＬ－２１、を含む組成物であって、
解凍された場合に、前記ＣＤ５６＋細胞がＣＤ５６＋細胞の第２の集団の少なくとも８０％の細胞傷害性を有し、ＣＤ５６＋細胞の前記第２の集団が凍結されていない、組成物。
【請求項45】
培養においてナチュラルキラー細胞を拡大増殖させる方法であって、ＰＢＭＣを提供すること；
前記ＰＢＭＣをＩＬ－２１の存在下で第１の期間にわたり共培養すること；
前記第１の期間の後の前記共培養されたＰＢＭＣを凍結させること；
前記凍結されたＰＢＭＣを解凍すること；および
前記解凍されたＰＢＭＣをＩＬ－２１の存在下で第２の期間にわたり共培養することを含む、方法。
【請求項46】
フィーダー細胞に対するＰＢＭＣの比が１：０．５：０．５である、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
請求項１ではなく、請求項４５に従属する、請求項２～１７のいずれかに記載の方法。
【請求項48】
注射準備済みの溶液中で凍結させることをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項49】
前記細胞傷害性が、凍結無しでの拡大増殖（ＩＬ－２１有りおよび無し）と凍結有りかつ第１の工程においてＩＬ－２１＋で共培養された拡大増殖との比較であり、前記凍結有りでの拡大増殖の平均細胞傷害性が前記凍結無しの９７．７％である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項50】
前記細胞傷害性が、凍結無しでの拡大増殖（ＩＬ－２１有りおよび無し）と凍結有りかつ第１の工程においてＩＬ－２１＋で共培養しなかった拡大増殖との比較であり、前記凍結有りでの拡大増殖の平均細胞傷害性が前記凍結無しでの拡大増殖の８１．４％である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項51】
ＩＬ－２１が、凍結の前および後の両方において添加され、かつ平均細胞傷害性が凍結無しでの拡大増殖の１１４％である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項52】
ＩＬ－２；５～１０％のＤＭＳＯ；
９０～９５％のＦＢＳ；および
任意選択的にＣＤ５６＋細胞であるＮＫ細胞
を含む、組成物。
【請求項53】
凍結された固体である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項54】
前記ＮＫ細胞が前記組成物の細胞集団の少なくとも９０％である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項55】
ＩＬ－２；５～１０％のＤＭＳＯ；
８０～９５％のＨａｒｔｍａｎ溶液；
１～１０％のヒト血清アルブミン；および
ＮＫ細胞を含む、組成物。
【請求項56】
ＣｒｙｏＳｔｏｒ溶液をさらに含む、請求項５２～５５のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ナチュラルキラー細胞の製造、貯蔵および／またはナチュラルキラー細胞自体に関する。
【背景技術】
【0002】
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、先天免疫細胞の一種であり、酵素、例えばパーフォリンおよびグランザイムを用いてまたはＦａｓ－ＦａｓＬ相互作用により非特異的にがんを殺傷し、ウイルスおよび細菌などを認識して殺傷し、病原体を殺傷することが公知である。がん患者の場合、これらのＮＫ細胞のがん細胞細胞傷害性における減少は、様々な種類のがん、例えば肺がん（Ｃａｒｒｅｇａ Ｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ，
２００８： １１２： ８６３－８７５）、肝臓がん（Ｊｉｎｕｓｈｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．， ２００５： ４３； １０１３－１０２０）、乳がん（Ｂａｕｅｒｎｈｏｆｅｒ Ｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
２００３： ３３： １１９－１２４）、子宮がん（Ｍｏｃｃｈｅｇｉａｎｉ Ｅ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ ｊ Ｃａｎｃｅｒ．， １９９９： ７９： ２４４－２５０）、および血液がん（Ｔａｊｉｍａ Ｆ．， ｅｔ ａｌ， Ｌｅｋｅｍｉａ １９９６： １０： ４７８－４８２）などの開始と関連付けられることが報告されている。
２００８： １１２： ８６３－８７５）、肝臓がん（Ｊｉｎｕｓｈｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．， ２００５： ４３； １０１３－１０２０）、乳がん（Ｂａｕｅｒｎｈｏｆｅｒ Ｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
２００３： ３３： １１９－１２４）、子宮がん（Ｍｏｃｃｈｅｇｉａｎｉ Ｅ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ ｊ Ｃａｎｃｅｒ．， １９９９： ７９： ２４４－２５０）、および血液がん（Ｔａｊｉｍａ Ｆ．， ｅｔ ａｌ， Ｌｅｋｅｍｉａ １９９６： １０： ４７８－４８２）などの開始と関連付けられることが報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本出願は、高純度のナチュラルキラー細胞を製造する方法、ならびに高純度のナチュラルキラー細胞およびサイトカインを含むがんを処置するための細胞治療用組成物に関する。本明細書に開示される任意の特徴、構造、または工程は、本明細書に開示される任意の他の特徴、構造、もしくは工程を用いる置換えもしくは組合せ、または省略が可能である。さらに、本開示を要約する目的のために、本発明のある特定の態様、利点、および特徴が本明細書に記載されている。必ずしも任意または全てのそのような利点が、本明細書に開示される発明の任意の特定の実施形態にしたがって達成されるわけではないことが理解されるべきである。本開示の個々の態様は本質的または不可欠なものではない。
【課題を解決するための手段】
【0004】
一部の実施形態において、培養においてナチュラルキラー細胞を拡大増殖させる方法が開示される。当該方法は、ＣＤ５６＋細胞を血液試料から単離すること；単離されたＣＤ５６＋細胞をＩＬ－２１（およびフィーダー細胞）の存在下で第１の期間にわたり共培養すること；第１の期間後に共培養されたＣＤ５６＋細胞を凍結させること；凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；ならびに解凍されたＣＤ５６＋細胞をＩＬ－２１（およびフィーダー細胞）の存在下で第２の期間にわたり共培養することを含む。
【0005】
本明細書において提供される任意の実施形態の方法および／または本明細書に開示される任意の方法は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含み得る。前記方法は、凍結されたＣＤ５６＋細胞を－１００℃よりも低い温度で貯蔵することをさらに含み得る。前記方法は、凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍の前に１日よりも長く貯蔵することをさらに含み得る。単離されたＣＤ５６＋細胞は、凍結前に１３～１６日（または９～２５日）にわたり共培養され得る。単離されたＣＤ５６＋細胞は、１つまたは複数の照射されたフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養され得る。解凍されたＣＤ５６＋細胞は、１つまたは複数の照射されたフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養され得る。１つまたは複数のフィーダー細胞は、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｌｉｎｅ；ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞およびＰＢＭＣ（例えば、自己ＰＢＭＣを含む）からなる群から選択される１つまたは複数であり得る。ＣＤ５６＋細胞は、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。一部の実施形態において、任意のフィーダー細胞が、第１、第２、または第１および第２の拡大増殖のために（例えば、Ｉｌ－２１の使用と共に）使用され得る。ＣＤ５６＋細胞は、約１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：３０または１：１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。一部の実施形態において、これらの比はＫＬ１／ＥＢＶＬＣＬについてのものであり、他のフィーダー細胞について、例えば１：１～１：１０が使用され得る。ＩＬ－２１は、第１および／または第２の期間の間に、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加され得る。ＩＬ－２１は、第１および／または第２の期間の間に、２０～８０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加され得る。ＩＬ－２１は、第１および／または第２の期間の間に、３０～７０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加され得る。ＩＬ－２１は、第１および／または第２の期間の間に１回よりも多く添加され得る。
【0006】
一部の実施形態において、培養においてナチュラルキラー細胞を拡大増殖させる方法が提供される。当該方法は、ＣＤ５６＋を血液試料から（例えば、ＰＢＭＣ、新鮮または凍結、臍帯血、および／または血液試料からＣＤ５６＋、ＣＤ５６＋ＣＤ３－、およびＣＤ３－細胞が単離された血液から）単離すること；ＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養すること；ＣＤ５６＋細胞を凍結させること；凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；ならびに解凍されたＣＤ５６＋細胞を（再び、任意の種類の適切なフィーダー細胞と共に）拡大増殖させることを含む。
【0007】
任意の実施形態の方法および／または本明細書に開示される任意の方法は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含み得る。ＣＤ５６＋細胞を凍結させることは、－１００℃よりも低い温度で行われ得る。前記方法は、凍結されたＣＤ５６＋細胞を１日より長く、かつ１０年より短い期間にわたり貯蔵することをさらに含み得る。ＣＤ５６＋細胞は、凍結の前に１３～１６（または９～２５）日にわたり共培養され得る。１つまたは複数のフィーダー細胞は全ての実施形態において限定されず、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞、ｍｂ１５－ｋ５６２、ｍｂ２１－ｋ５６２フィーダー細胞、ＨｕＴ７８、および／またはＰＢＭＣのうちの少なくとも１つからなる群から選択される１つまたは複数であり得る。ＣＤ５６＋細胞は、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。ＩＬ－２１は、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加され得る。ＩＬ－２１は、１回よりも多く添加され得る。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は任意のフィーダー細胞種と共に使用され得るが、但し、ＩＬ－２１が凍結前に使用され、かつ次に凍結からの解凍後に再刺激過程が後続する。
【0008】
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性を増加させる方法が開示される。当該方法は、前記ナチュラルキラー細胞を提供すること；前記ナチュラルキラー細胞を凍結させること；凍結されたナチュラルキラー細胞を解凍すること；および解凍されたナチュラルキラー細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養することを含む。任意選択的に、ナチュラルキラー細胞を凍結させる前に、ナチュラルキラー細胞は、フィーダー細胞およびＩＬ－２１と共に共培養（拡大増殖）され得る。
【0009】
任意の先行するパラグラフの方法および／または本明細書に開示される任意の方法は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含み得る。前記方法は、凍結されたナチュラルキラー細胞を－１００℃よりも低い温度で貯蔵することをさらに含み得る。前記方法は、凍結されたナチュラルキラー細胞を解凍前に１日よりも長く貯蔵することをさらに含み得る。
１つまたは複数のフィーダー細胞は、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞、ｍｂ１５－ｋ５６２、ｍｂ２１－ｋ５６２フィーダー細胞、ＨｕＴ７８、および／またはＰＢＭＣからなる群から選択される１つまたは複数である。解凍されたナチュラルキラー細胞は、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。ＩＬ－２１は、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加され得る。ＩＬ－２１は、１回よりも多く添加され得る。
１つまたは複数のフィーダー細胞は、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞、ｍｂ１５－ｋ５６２、ｍｂ２１－ｋ５６２フィーダー細胞、ＨｕＴ７８、および／またはＰＢＭＣからなる群から選択される１つまたは複数である。解凍されたナチュラルキラー細胞は、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。ＩＬ－２１は、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加され得る。ＩＬ－２１は、１回よりも多く添加され得る。
【0010】
一部の実施形態において、対象を処置する方法が開示される。当該方法は、ＣＤ５６＋細胞を対象から収集すること；ＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養すること；共培養されたＣＤ５６＋細胞を少なくとも１日にわたり凍結させること；凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；解凍されたＣＤ５６＋細胞を拡大増殖させること；および拡大増殖されたＣＤ５６＋細胞を対象に投与することを含み、第２の拡大増殖からの細胞の細胞傷害性は、凍結の前の共培養されたＣＤ５６＋の細胞傷害性の少なくともＸ％である。
【0011】
任意の先行するパラグラフの方法および／または本明細書に開示される任意の方法は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含み得る。前記方法は、凍結されたＣＤ５６＋細胞を－１００℃よりも低い温度で貯蔵することをさらに含み得る。前記方法は、凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍の前に１日よりも長く貯蔵することをさらに含み得る。単離されたＣＤ５６＋細胞は、凍結の前に１３～１６（または９～２５）日にわたり共培養され得る。解凍されたＣＤ５６＋細胞を拡大増殖させることは、解凍されたＣＤ５６＋を１つまたは複数の照射されたフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養することを含み得る。１つまたは複数のフィーダー細胞は、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞、ｍｂ１５－ｋ５６２、ｍｂ２１－ｋ５６２フィーダー細胞、ＨｕＴ７８、および／またはＰＢＭＣからなる群から選択される１つまたは複数であり得る。ＣＤ５６＋細胞は、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。ＩＬ－２１は、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で第１および／または第２の期間の間に添加され得る。ＩＬ－２１は、第１および／または第２の期間の間に１回よりも多く添加され得る。
【0012】
一部の実施形態において、組成物が提供される。当該組成物は、患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する有効量のＣＤ５６＋細胞を含む。ＣＤ５６＋細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液試料から単離すること；ＣＤ５６＋細胞をＰＢＭＣから単離すること；ＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共に１つまたは複数のサイトカインの存在下で共培養すること；ＣＤ５６＋細胞を凍結させること；凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；および解凍されたＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共に１つまたは複数のサイトカインの存在下で共培養することにより調製される。
【0013】
一部の実施形態において、細胞組成物が開示される。当該細胞組成物は、患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する有効量のＣＤ５６＋細胞；ＩＬ－２；およびＩＬ－２１を含む。
【0014】
一部の実施形態において、組成物が開示される。当該組成物は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＣＤ５６＋細胞の第１の集団；氷；ＩＬ－２；およびＩＬ－２１を含む。解凍された場合に、ＣＤ５６＋細胞はＣＤ５６＋細胞の第２の集団の少なくとも８０％の細胞傷害性を有し、ＣＤ５６＋細胞の第２の集団は凍結されていない。
【0015】
一部の実施形態において、培養においてナチュラルキラー細胞を拡大増殖させる方法が提供される。当該方法は、ＣＤ５６＋細胞を血液試料から単離すること；単離されたＣＤ５６＋細胞をＩＬ－２１の存在下で第１の期間にわたり共培養すること；第１の期間の後の共培養されたＣＤ５６＋細胞を凍結させること；凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；および解凍されたＣＤ５６＋細胞をＩＬ－２１の存在下で第２の期間にわたり共培養することを含み得る。
【0016】
一部の実施形態において、培養においてナチュラルキラー細胞を拡大増殖させる方法が提供される。当該方法は、ＣＤ５６＋を血液試料から単離すること；ＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養すること；ＣＤ５６＋細胞を凍結させること；凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；および解凍されたＣＤ５６＋細胞を拡大増殖させることを含む。
【0017】
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性を増加させる方法が提供され、前記方法は、前記ナチュラルキラー細胞を提供すること；前記ナチュラルキラー細胞を凍結させること；凍結されたナチュラルキラー細胞を解凍すること；および解凍されたナチュラルキラー細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養することを含む。
【0018】
一部の実施形態において、対象を処置する方法が提供され、前記方法は、ＣＤ５６＋細胞を対象から収集すること；ＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養すること；共培養されたＣＤ５６＋細胞を少なくとも１日にわたり凍結させること；凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；解凍されたＣＤ５６＋細胞を拡大増殖させること；および拡大増殖されたＣＤ５６＋細胞を対象に投与することを含み、第２の拡大増殖からの細胞の細胞傷害性は、凍結の前の共培養されたＣＤ５６＋の細胞傷害性の少なくとも８０％である。
【0019】
一部の実施形態において、組成物が提供され、前記組成物は、患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する有効量のＣＤ５６＋細胞を含み、ＣＤ５６＋細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液試料から単離すること；ＣＤ５６＋細胞をＰＢＭＣから単離すること；ＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共に１つまたは複数のサイトカインの存在下で共培養すること；ＣＤ５６＋細胞を凍結させること；凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；および解凍されたＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共に１つまたは複数のサイトカインの存在下で共培養することにより調製される。
【0020】
一部の実施形態において、細胞組成物が提供され、前記細胞組成物は、患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する有効量のＣＤ５６＋細胞；ＩＬ－２；およびＩＬ－２１を含む。
【0021】
一部の実施形態において、組成物が提供され、前記組成物は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＣＤ５６＋細胞の第１の集団；氷；およびＩＬ－２、ＩＬ－２１を含む。解凍された場合に、ＣＤ５６＋細胞はＣＤ５６＋細胞の第２の集団の少なくとも８０％の細胞傷害性を有し、ＣＤ５６＋細胞の第２の集団は凍結されていない。
【0022】
一部の実施形態において、培養においてナチュラルキラー細胞を拡大増殖させる方法が提供され、前記方法は、ＰＢＭＣを提供すること；ＰＢＭＣをＩＬ－２１の存在下で第１の期間にわたり共培養すること；第１の期間の後の共培養されたＰＢＭＣを凍結させること；凍結されたＰＢＭＣを解凍すること；および解凍されたＰＢＭＣをＩＬ－２１の存在
下で第２の期間にわたり共培養することを含む。
下で第２の期間にわたり共培養することを含む。
【0023】
一部の実施形態において、組成物は、ＩＬ－２；５～１０％のＤＭＳＯ；９０～９５％のＦＢＳ；および任意選択的にＣＤ５６＋細胞であるＮＫ細胞を含む。一部の実施形態において、それはＣｒｙｏＳｔｏｒ溶液をさらに含む。一部の実施形態において、組成物は、再拡大増殖前の凍結された細胞用である。
【0024】
一部の実施形態において、組成物は、ＩＬ－２；５～１０％のＤＭＳＯ；８０～９５％のＨａｒｔｍａｎ溶液；１～１０％のヒト血清アルブミン；およびＮＫ細胞を含む。一部の実施形態において、それはＣｒｙｏＳｔｏｒ溶液をさらに含む。一部の実施形態において、組成物は、注射前の凍結された細胞用である。
【0025】
様々な実施形態が添付の図面において実例的な目的のために描写されるが、実施形態の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。さらには、異なる開示される実施形態の様々な特徴を組み合わせて、本開示の部分である追加の実施形態を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図13A】図１３Ａは、ＩＬ－２１有りで拡大増殖され、ＩＬ－２１有りで再拡大増殖（ＩＬ－２１＋／＋）されたＮＫ細胞、およびＩＬ－２１無しで拡大増殖され、ＩＬ－２１無しで再拡大増殖（ＩＬ－２１－／－）されたＮＫ細胞の集団倍加レベル（ＰＤＬ）のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
任意の優先権出願に対する参照による組込み
本出願は、２０２０年８月７日に出願された米国仮出願第６３／０６２６９４号、および２０１９年１１月２９日に出願された韓国特許出願第１０－２０１９－０１５７７２７号の利益を主張し、これらの各々の開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年８月７日に出願された米国仮出願第６３／０６２６９４号、および２０１９年１１月２９日に出願された韓国特許出願第１０－２０１９－０１５７７２７号の利益を主張し、これらの各々の開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0028】
ＮＫ細胞が凍結保存およびそれからの回復を経ることを補助する方法が開発され、本明細書において提供される。ＣＤ５６＋細胞が最初に（初期拡大増殖の間に）フィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養された場合に、ＣＤ５６＋細胞は凍結および解凍後に成功裏に拡大増殖され得ることが見出された。ＩＬ－２１を使用することにより、高純度のＣＤ５６＋ ＮＫ細胞を結果としてもたらすことができ、驚くべきことに、それらは特に高い細胞傷害性を保持する。さらには、ＮＫ細胞が解凍された後に、それらは（ＩＬ－２１無しで、またはよりいっそう有利には、追加のＩＬ－２１の存在下で）さらに拡大増殖され得る。そのため、凍結前過程（例えば第１の拡大増殖）におけるＩＬ－２１は、後の時点における優れた再拡大増殖を可能とし得る。また、結果としてもたらされる製造物は、２回の拡大増殖、および１回の凍結の後であっても、驚くべきことに高い細胞傷害性を保持し、これは、ＩＬ－２１が第１の拡大増殖の間に使用されるだけでなく、第２の拡大増殖の間にも使用される場合にさらに増強される。一部の実施形態において、この凍結および再拡大増殖過程は、複数回（各回に、任意選択的に再拡大増殖の間のＩＬ－２１の別のラウンドを伴う）繰り返され得る。
【0029】
一部の実施形態において、培養においてナチュラルキラー細胞を拡大増殖させる方法が提供される。方法は、ＰＢＭＣを提供すること；ＰＢＭＣをＩＬ－２１の存在下で第１の期間にわたり共培養すること；第１の期間の後の共培養されたＰＢＭＣを凍結させること；凍結されたＰＢＭＣを解凍すること；および解凍されたＰＢＭＣをＩＬ－２１の存在下で第２の期間にわたり共培養することを含む。一部の実施形態において、フィーダー細胞に対するＰＢＭＣの比は１：０．５：０．５である。一部の実施形態において、比は、（例えば、ＣＤ５６＋の代替として）ＰＢＭＣについて約１：０．５：０．５～１：１０：１０であり得る。一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞について、比は、例えば、１０または２０で掛け算される（例えば、１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞）。一部の実施形態において、拡大増殖はＣＤ５６＋またはＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞
から為される。
から為される。
【0030】
一部の実施形態によれば、高純度のＮＫ細胞を製造する方法は、ＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞から選択される細胞をフィーダー細胞と共に第１のサイトカイン、例えばＩＬ－２１の存在下で共培養すること（「第１の培養工程」または「第１の拡大増殖工程」）；共培養された細胞を凍結させること（「凍結工程」）；凍結された細胞を解凍すること（「解凍工程」）；および解凍された細胞を、任意選択的にさらにＩＬ－２１と共に、添加されたフィーダー細胞と共に共培養すること（「第２の培養工程」または「第２の拡大増殖工程」）を含み得る。各工程は本明細書においてより詳細に記載される。開示される方法にしたがって製造されるＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞は、より高い純度およびより高い抗がん活性だけでなく、他の区別的な特徴を呈することができ、例えば異なる表面マーカーまたは活性化された受容体、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６９、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２６６、ＣＤ２４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ２Ｓ、ＫＩＲ３Ｓ、Ｌｙ９４Ｄ、ＮＣＲｓ、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－ｂ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ５７からの１つまたは複数を有し得る。
【0031】
本明細書において使用される場合、「工程」は、過程の部分であり、次の「工程」が始まり得る前に１つの「工程」が完了されることを要求しない。記載されなければ、工程は、適宜、オーバーラップする時間的期間においてまたは同時に提供されてもよい。当然ながら、１つの工程が事象（例えば凍結）の前に起こり、かつ別の工程が同じ事象の後に起こる場合、オーバーラップは無い（例えば、第１のＩＬ－２１インキュベーションおよび第２のＩＬ－２１インキュベーション）。
【0032】
本明細書において、「ＣＤ５６＋細胞」という用語は、「ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞」、または「ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞」と交換可能に使用することができ、「ＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞」という用語は、「ＣＤ３－／ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞」と交換可能に使用することができる。ＣＤ５６＋細胞またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞は、細胞表面上にＣＤ５６糖タンパク質が発現される細胞、またはさらに、ＣＤ３糖タンパク質が発現されないがＣＤ５６糖タンパク質が発現される細胞を含み得る。同じ種類の免疫細胞であっても、細胞表面に結合したＣＤタイプおよび発現率において差異を有することがあり、そのため、その機能は異なることがある。
【0033】
一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞は以下の工程により得られる：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液試料から単離すること（「第１の単離工程」）；ＣＤ５６＋細胞およびＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞からなる群から選択される細胞を末梢血単核細胞から単離すること（「第２の単離工程」）。
【0034】
本明細書において、「血液試料」は、末梢血の全血または白血球アフェレーシスを使用して末梢血から単離された白血球であってもよいがこれらに限定される必要はない。さらに、末梢血は、正常なヒト、がんのリスクを有する患者、またはがん患者から得られ得るが、末梢血の供給源はこれらに限定されない。
【0035】
本明細書において、「白血球アフェレーシス」という用語は、収集された血液から白血球を選択的に取り出し（単離し）、次に血液を患者に再び与える方法を指すことができ、一部の実施形態において、該方法により単離された白血球は、追加の方法、例えばＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配法を伴わずに使用されてもよい。
【0036】
本明細書において、「末梢血単核細胞」という用語は、「ＰＢＭＣ」、「単核細胞」と交換可能に使用することができ、抗がん免疫療法のために一般に使用される末梢血から単
離された単核細胞を指すことができる。末梢血単核細胞は、収集されたヒト血液から公知の方法、例えばＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配法を使用して得られてもよい。
離された単核細胞を指すことができる。末梢血単核細胞は、収集されたヒト血液から公知の方法、例えばＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配法を使用して得られてもよい。
【0037】
一部の実施形態において、末梢血単核細胞は自己のものであり得るが、同種異系末梢血単核細胞もまた、本明細書に記載の方法にしたがって抗がん免疫療法用の高純度のＮＫ細胞を製造するために使用され得る。さらに、一部の実施形態において、末梢血単核細胞は、正常なヒトから得られ得るが、末梢血単核細胞はまた、がんのリスクを有する患者および／またはがん患者から得られ得る。
【0038】
一部の実施形態において、血液試料からのＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞の単離のための第２の単離工程は、ＣＤ５６マイクロビーズおよびＣＤ３マイクロビーズからなる群から選択される少なくとも１つ、または機器、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳｓ、フローサイトメトリー細胞選別機、もしくはＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ、磁気選別システムなどを使用する単離方法を使用して行われ得る。
【0039】
例えば、ＣＤ５６マイクロビーズおよび／またはＣＤ３マイクロビーズを使用する単離方法は、ＣＤ５６マイクロビーズをＰＢＭＣに添加し、次に非特異的結合を除去することにより行うことができ、またはＣＤ３マイクロビーズをＰＢＭＣに添加して特異的結合を除去し、次にＣＤ５６マイクロビーズを再び添加して非特異的結合を除去することにより行うことができる。一部の事例において、ＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞をＰＢＭＣから単離することを通じて、Ｔ細胞または他の非ナチュラルキラー細胞が除去され得る。
【0040】
本明細書において、「フィーダー細胞」という用語は、分裂および増殖しないが、様々な代謝物を産生する代謝活性を有し、そのため、標的細胞の増殖を助ける細胞を指すことができる。
【0041】
一部の実施形態において、フィーダー細胞は、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、ＰＢＭＣ、ＨＦＷＴ、ＲＰＭＩ １８６６、Ｄａｕｄｉ、ＭＭ－１７０、Ｋ５６２、またはＫ５６２（例えば、Ｋ５６２－ｍｂＩＬ－１５－４１ＢＢリガンド）を標的化することにより遺伝子改変された細胞からなる群から選択される少なくとも１つであり得る。例えば、１つの実施形態において、フィーダー細胞は、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞であり得る。一部の実施形態において、本明細書において提供されるように、ＮＫ細胞がＩＬ－２１の存在下で最初に拡大増殖され、次に凍結され、解凍され、次に再拡大増殖に供された場合に、再拡大増殖を可能とする限り、任意のフィーダー細胞種が使用され得る。
【0042】
本明細書において、「ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞」または「ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞株」という用語は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のＡｒｔｈｕｒ Ｗｅｉｓｓ博士により開発された血液がん（不死化された急性Ｔ細胞白血病）細胞株を指すことができる。様々なケモカイン受容体が発現され、ＩＬ－２を産生する能力を有するジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞は、抗がん免疫療法用のフィーダー細胞の可能な候補として一般に考慮されておらず、その理由は、ナチュラルキラー細胞活性化阻害因子であるＭＨＣクラスＩがその細胞表面上に高発現されるからである。ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞はＡＴＣＣから入手することができる（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）。
【0043】
本明細書において、「ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞」または「ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞株」という用語は、エプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）（Ｄ．Ｍ． Ｋｏｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １９９３：９１： ９６１－９６８）を指し、これは試験管中でヒトＢ細胞をエプスタイン・バーウイルスに感染させることにより作製されるＢ細胞株である。ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞は、ＰＢＭＣにＥＢＶを感染させる過程においてサイクロスポリンＡを添加する方法により一般の研究室において直接的に調製および使用され得る。一部の実施形態において、ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞は、以下の工程により調製され得る。３０×１０６個のＰＢＭＣを９ｍＬの培養培地に加え、混合物をＴ２５培養フラスコに加え、次に９ｍＬのＥＢＶ上清を加える。８０μＬのサイクロスポリンＡ（５０μｇ／ｍＬ）を加え、次に３７℃で培養する。７日の培養後に、上清の半分を除去し、新鮮な培養培地を加え、次に４０μＬのサイクロスポリンＡを加える。同じ過程を７日毎に１回、２８日の培養まで繰り返すことができる。細胞株は２８日の培養後に使用可能であり得、この時点の後に、細胞株は、サイクロスポリンＡを加えることなく培養培地中で培養され得る。
【0044】
ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞は、照射後にフィーダー細胞として使用され得る。
【0045】
一部の実施形態において、投与の前に、方法は、拡大増殖された細胞を注射準備済み（ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｉｎｊｅｃｔ）の溶液中で２回目の凍結に供することをさらに含み得る。
【0046】
一部の実施形態において、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞および照射されたＥＢＶ－ＬＣＬ細胞は、１：０．１～５、１：０．１～４、１：０．１～３、１：０．１～２、１：０．１～１．５、１：０．５～１．５、１：０．７５～１．２５、０．１～５：１、０．１～４：１、０．１～３：１、０．１～２：１、０．１～１．５：１、０．５～１．５：１または０．７５～１．２５：１の含有量比で含まれ得る。例えば、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞および照射されたＥＢＶ－ＬＣＬ細胞は、１：１の含有量比で含まれ得る。
【0047】
一部の実施形態において、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞および照射されたＥＢＶ－ＬＣＬ細胞は、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２００、５０～１５０、７０～１３０、８０～１２０または９０～１１０Ｇｙの照射で処理することにより得られ得る。例えば、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞および／または照射されたＥＢＶ－ＬＣＬ細胞は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞および／またはＥＢＶ－ＬＣＬ細胞を１００Ｇｙの照射で処理することにより得られ得る。
【0048】
本明細書において、「サイトカイン」という用語は、「第１のサイトカイン」、または「第２のサイトカイン」と交換可能に使用することができ、ＮＫ細胞に分化するように末梢血単核細胞を誘導するために使用可能な免疫活性化合物を指すことができる。一部の実施形態において、サイトカインは（第１の拡大増殖および第２の拡大増殖の両方、ならびに任意のさらなるラウンドの拡大増殖のために）ＩＬ－２１である。
【0049】
本明細書において使用される場合、「共培養」および「拡大増殖」という用語は交換可能であり、拡大増殖された細胞の集団を結果としてもたらすためにＮＫ細胞が培養されることを表す。「再拡大増殖」という用語は、１ラウンドの共培養または拡大増殖がＮＫ細胞について既に行われていることを表す。一部の実施形態において、共培養または拡大増殖は、フィーダー細胞およびサイトカイン、例えばＩＬ－２１の存在下で行われる。本明細書の一部の状況において、「培養」という用語が「共培養」の短縮表現として使用される。
【0050】
一部の実施形態において、サイトカインは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３－Ｌ）、幹細胞因
子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、ＩＬ－１８、ＩＬ－４、Ｉ型インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ １）であり得るがこれらに限定されない。
子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、ＩＬ－１８、ＩＬ－４、Ｉ型インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ １）であり得るがこれらに限定されない。
【0051】
一部の実施形態において、第１のサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３－Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、ＩＬ－１８、ＩＬ－４、Ｉ型インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ １）、またはこれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態において、第２のサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３－Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、ＩＬ－１８、ＩＬ－４、Ｉ型インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ １）、またはこれらの任意の組合せであり得る。例えば、第２のサイトカインはＩＬ－２１であり得る。一部の実施形態において、１つより多くのサイトカインが、本明細書において提供される工程のうちの１つまたは複数を通じて存在し得る。一部の実施形態において、Ｉｌ－２１およびＩＬ－２の両方が、拡大増殖の第１および第２のラウンド（または任意のその後のラウンド）のうちの少なくとも１つにおいて存在する。追加的に、本明細書において提供される様々な実施形態が拡大増殖の様々なラウンドの各々におけるサイトカイン（例えばＩＬ－２１）の繰返しの使用も伴う場合、そのようなサイトカインは、１回目（または第１のラウンドもしくは工程の間）および２回目（例えば再拡大増殖工程の間）に用いられ得る。そのため、一部の実施形態において、第１のサイトカイン（例えばＩＬ－２１）は、共培養の第１のラウンドおよび第２のラウンドの両方のために使用され得る。これはまた、例えば、第１のサイトカインおよび第２のサイトカインの両方がＩＬ－２１である第１のサイトカインおよび第２のサイトカインとして代替的に記載され得る。
【0052】
ＮＫ細胞を製造する方法
図１は、様々な例示的なフィーダー細胞を使用してＮＫ細胞を拡大増殖させる一部の方法を図示するフローチャートである。一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞は、フィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養することにより拡大増殖される。フィーダー細胞は、任意の種類のフィーダー細胞、例えば、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞（「タイプ１」）、Ｋ５６２細胞（「タイプ２」）またはＰＢＭＣ（「タイプ３」）であり得る。一部の実施形態において、細胞は、培養の１７日目もしくは約１７日目（または１６～２１もしくは９～２５日目のいずれかの時点）に収集され、製造された細胞は本明細書中で「ＩＬ２１＋．」と称され得る。凍結保存も第２の培養工程も伴わないそのような細胞拡大増殖過程は、本明細書中で「元々の過程」と称され得る。一部の実施形態において、細胞は、１４日目もしくは約１４日目（または１４～１８もしくは９～２５日目のいずれかの時点）に収集され、凍結保存に供される。凍結保存前の培養は、本明細書中で「第１の培養工程」または「第１の拡大増殖工程」または「第１の共培養工程」と称され得る。凍結保存された細胞は、解凍され、フィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で（「ＩＬ－２１＋／＋」）またはＩＬ－２１の非存在下で（「ＩＬ－２１＋／－」）再び共培養して拡大増殖され得る。そのような第２の拡大増殖過程は、「第２の培養工程」または「再刺激過程」または「第２の共培養工程」または第２の拡大増殖工程と称され得る。細胞は、培養の１７日目もしくは約１７日目（または１６～２１もしくは９～２５日目のいずれかの時点）に収集され得る。一部の実施形態において、さらなる再拡大増殖または再刺激工程またはサイクルが行われ得る。図１４Ｂに示されるように、一部の実施形態において、第１の刺激、続いて２またはより多くの再刺激工程が存在し得る。
図１は、様々な例示的なフィーダー細胞を使用してＮＫ細胞を拡大増殖させる一部の方法を図示するフローチャートである。一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞は、フィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養することにより拡大増殖される。フィーダー細胞は、任意の種類のフィーダー細胞、例えば、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞（「タイプ１」）、Ｋ５６２細胞（「タイプ２」）またはＰＢＭＣ（「タイプ３」）であり得る。一部の実施形態において、細胞は、培養の１７日目もしくは約１７日目（または１６～２１もしくは９～２５日目のいずれかの時点）に収集され、製造された細胞は本明細書中で「ＩＬ２１＋．」と称され得る。凍結保存も第２の培養工程も伴わないそのような細胞拡大増殖過程は、本明細書中で「元々の過程」と称され得る。一部の実施形態において、細胞は、１４日目もしくは約１４日目（または１４～１８もしくは９～２５日目のいずれかの時点）に収集され、凍結保存に供される。凍結保存前の培養は、本明細書中で「第１の培養工程」または「第１の拡大増殖工程」または「第１の共培養工程」と称され得る。凍結保存された細胞は、解凍され、フィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で（「ＩＬ－２１＋／＋」）またはＩＬ－２１の非存在下で（「ＩＬ－２１＋／－」）再び共培養して拡大増殖され得る。そのような第２の拡大増殖過程は、「第２の培養工程」または「再刺激過程」または「第２の共培養工程」または第２の拡大増殖工程と称され得る。細胞は、培養の１７日目もしくは約１７日目（または１６～２１もしくは９～２５日目のいずれかの時点）に収集され得る。一部の実施形態において、さらなる再拡大増殖または再刺激工程またはサイクルが行われ得る。図１４Ｂに示されるように、一部の実施形態において、第１の刺激、続いて２またはより多くの再刺激工程が存在し得る。
【0053】
一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞は、フィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在無しに共培養することにより拡大増殖される。典型的には、これは、ＩＬ－２１有りの初期培養工程後の培養工程において適用される。フィーダ
ー細胞は、ＮＫ細胞用の任意の種類のフィーダー細胞であり得、これには、例えば、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞（「タイプ１」）、Ｋ５６２細胞（「タイプ２」）またはＰＢＭＣ（「タイプ３」）が含まれる。一部の実施形態において、細胞は、培養の１７日目もしくは約１７日目（または１６～２１日目）に収集され、製造された細胞は本明細書中で「ＩＬ２１－．」と称され得る。一部の実施形態において、細胞は、１４日目もしくは約１４日目（または１４～１８日目）に収集され、凍結保存に供される。凍結保存された細胞は、解凍され、フィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で（「ＩＬ－２１－／＋」）またはＩＬ－２１の非存在下で（「ＩＬ－２１－／－」）再び共培養して拡大増殖され得る。そのような第２の拡大増殖過程は「第２の培養工程」または「再刺激過程」と称され得る。細胞は、培養の１７日目もしくは約１７日目（または１６～２１もしくは９～２５日目）に収集され得る。本明細書に詳述されるように、第１の拡大増殖におけるＩＬ－２１の使用は、ＮＫ細胞の凍結および解凍、ならびに任意選択的に追加のＩＬ－２１を伴う（これは、例えば細胞傷害性の向上といったいっそうさらなる利益を有する）その後の優れた拡大増殖を可能とする。
ー細胞は、ＮＫ細胞用の任意の種類のフィーダー細胞であり得、これには、例えば、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞（「タイプ１」）、Ｋ５６２細胞（「タイプ２」）またはＰＢＭＣ（「タイプ３」）が含まれる。一部の実施形態において、細胞は、培養の１７日目もしくは約１７日目（または１６～２１日目）に収集され、製造された細胞は本明細書中で「ＩＬ２１－．」と称され得る。一部の実施形態において、細胞は、１４日目もしくは約１４日目（または１４～１８日目）に収集され、凍結保存に供される。凍結保存された細胞は、解凍され、フィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で（「ＩＬ－２１－／＋」）またはＩＬ－２１の非存在下で（「ＩＬ－２１－／－」）再び共培養して拡大増殖され得る。そのような第２の拡大増殖過程は「第２の培養工程」または「再刺激過程」と称され得る。細胞は、培養の１７日目もしくは約１７日目（または１６～２１もしくは９～２５日目）に収集され得る。本明細書に詳述されるように、第１の拡大増殖におけるＩＬ－２１の使用は、ＮＫ細胞の凍結および解凍、ならびに任意選択的に追加のＩＬ－２１を伴う（これは、例えば細胞傷害性の向上といったいっそうさらなる利益を有する）その後の優れた拡大増殖を可能とする。
【0054】
第１の培養（拡大増殖または共培養）工程
第１の培養工程は、サイトカインを１回または複数回、培養の０～６日目の間に添加することを含み得る。１つより多くのサイトカインが使用され得る（例えばＩＬ－２も用いられ得る）。例えば、第１の培養工程は、サイトカインの１つまたは両方を１回、培養の０日目および３日目の各々に添加することを含み得る。
第１の培養工程は、サイトカインを１回または複数回、培養の０～６日目の間に添加することを含み得る。１つより多くのサイトカインが使用され得る（例えばＩＬ－２も用いられ得る）。例えば、第１の培養工程は、サイトカインの１つまたは両方を１回、培養の０日目および３日目の各々に添加することを含み得る。
【0055】
フィーダー細胞および第１のサイトカインと共に共培養する場合、０～６日目の間の１回または複数回の別のサイトカインのさらなる添加を伴う培養は、優れた増殖および／または抗がん活性を呈し得る。一部の実施形態において、１４日のサイクル中の６日間のフィーダー細胞および追加のサイトカインの添加を伴う培養は、優れた増殖および／または抗がん活性を呈し得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２１は、少なくとも１回、ならびに任意選択的に凍結の前および後に、使用される。一部の実施形態において、ＩＬ－２がさらなるサイトカインとして含まれ得る。
【0056】
一部の実施形態において、第１のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２１）は、１０～１，０００、１０～５００、１０～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、または１０～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用され得る。一部の実施形態において、追加のサイトカインは、５０～１，０００、５０～９００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５５０、１００～５５０、１５０～５５０、２００～５５０、２５０～５５０、３００～５５０、３５０～５５０、４００～５５０、または４５０～５５０ＩＵ／ｍＬの濃度で使用され得る。一部の実施形態において、濃度は約５０ｎｇ／ｍｌである。
【0057】
ＮＫ細胞を増殖させる従来の方法は、高濃度の様々なサイトカインを利用する。反対に、本明細書に記載のＮＫ細胞を増殖させる方法の一部の実施形態において、高い収率および高い純度を有するＮＫ細胞が、低い濃度の１つのサイトカインのみを使用して増殖され得る。
【0058】
一部の実施形態において、共培養（培養、拡大増殖（再拡大増殖を含む））は、末梢血単核細胞ならびにフィーダー細胞（例えば、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）を１：１～１００、１：１～９０、１：１～８０、１：１～７０、１：１０～６５、１：２０～６５、１：３０～６５、１：４０～６５、１：５０～６５または１：５５～６５の混合比で含めることにより行われ得る。一部の実施形態において、共培養は、末梢血単核細胞ならびにフィーダー細胞（例えば、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）を様々な混合比で含めることにより行われ得る。一部の実施形態において、比は、（例えば、ＣＤ５６＋の代替として）ＰＢＭＣについて約１：０．５：０．５～１：１０：１０であり得る。一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞について、比は、例えば１０または２０で掛け算される（例えば、１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞）。
【0059】
共培養は培地中で行うことができ、当該技術分野においてＮＫ細胞への末梢血単核細胞の誘導および増殖のために一般に使用される任意の好適な培地が、限定無くそのような培地として使用され得る。例えば、ＲＰＭＩ－１６４０、ＤＭＥＭ、ｘ－ｖｉｖｏ１０、ｘ－ｖｉｖｏ２０、またはｃｅｌｌｇｒｏ ＳＣＧＭ培地がそのような培地として使用され得る。追加的に、培養条件、例えば温度は、当該技術分野において公知の末梢血単核細胞の任意の好適な培養条件に従い得る。
【0060】
一部の実施形態において、第１の培養工程は、０～４５、０～４２、０～４０、０～３０、０～２０、０～１９、０～１８、０～１７、０～１６、０～１５または０～１４日にわたり行われ得る。
【0061】
凍結工程
第１の培養工程からの培養および提供されたナチュラルキラー細胞は、培地中に収集および懸濁され、その後に凍結および凍結保存され得る。一部の実施形態において、培地は、ＦＢＳおよび／またはＤＭＳＯを含み得る。例えば、培地は、９０％のＦＢＳおよび１０％のＤＭＳＯ、または９０～９５％のＦＢＳおよび５～１０％のＤＭＳＯを含み得る。一部の実施形態において、他の許容される凍結保存剤、例えばＣｒｙｏＳｔｏｒ溶液（ＣＳ１０、ＣＳ５）など、または他の成分、例えばスクロースもしくはグリセロールが含められ得る。一部の実施形態において、好適な保存剤は、ＤＭＳＯ、グリセロール、エチレングリコール、スクロース、トレハロース、デキストロース、またはポリビニルピロリドンなどを含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２および／またはヒト血清アルブミンが存在し得る。
第１の培養工程からの培養および提供されたナチュラルキラー細胞は、培地中に収集および懸濁され、その後に凍結および凍結保存され得る。一部の実施形態において、培地は、ＦＢＳおよび／またはＤＭＳＯを含み得る。例えば、培地は、９０％のＦＢＳおよび１０％のＤＭＳＯ、または９０～９５％のＦＢＳおよび５～１０％のＤＭＳＯを含み得る。一部の実施形態において、他の許容される凍結保存剤、例えばＣｒｙｏＳｔｏｒ溶液（ＣＳ１０、ＣＳ５）など、または他の成分、例えばスクロースもしくはグリセロールが含められ得る。一部の実施形態において、好適な保存剤は、ＤＭＳＯ、グリセロール、エチレングリコール、スクロース、トレハロース、デキストロース、またはポリビニルピロリドンなどを含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２および／またはヒト血清アルブミンが存在し得る。
【0062】
一部の実施形態において、凍結保存は、提供されたナチュラルキラー細胞を、イソプロピルアルコールを含む凍結保存容器に移し、凍結保存容器中のナチュラルキラー細胞を超低温冷凍機中で終夜凍結させ、ナチュラルキラー細胞を－１９２℃またはより低い温度で保存することを含み得る。一部の実施形態において、凍結されたナチュラルキラー細胞は、－１０℃もしくはより低い温度、－２０℃もしくはより低い温度、－５０℃もしくはより低い温度、－７０℃もしくはより低い温度、－１００℃もしくはより低い温度、－１５０℃もしくはより低い温度、－１９２℃もしくはより低い温度、または－２００℃もしくはより低い温度で凍結されて保存され得る。一部の実施形態において、凍結されたナチュラルキラー細胞は、１日もしくはより長く、２日もしくはより長く、３日もしくはより長く、７日もしくはより長く、１４日もしくはより長く、３０日もしくはより長く、６０日もしくはより長く、または１８０日もしくはより長く（先行する値の任意の２つの間の任意の範囲を含む）にわたり保存され得る。一部の実施形態において、温度は－１３５Ｃ～－１９６Ｃである。一部の実施形態において、細胞は、０．５、１、２、３、４、または５年（先行する値の任意の２つの間の任意の範囲を含む）にわたり貯蔵される。
【0063】
一部の実施形態において、提供されるナチュラルキラー細胞は、速度制御冷凍機（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒａｔｅ ｆｒｅｅｚｅｒ；ＣＲＦ）を使用して冷却および／または凍結され得る。一部の実施形態において、凍結されたナチュラルキラー細胞は、液体窒素下で保存され得る。
【0064】
一部の実施形態において、提供されるナチュラルキラー細胞は、速度制御冷凍機（ＣＲＦ）を使用して冷却および／または凍結され得る。一部の実施形態において、これは、遅
い速度で（例えば、１～８時間、例えば、１、２、３、４、５、６、７もしくは８時間またはより長い）行われ得る。それはまた、イソプロピルアルコールを使用することにより手動で緩徐に凍結され得、その場合、ＮＫ細胞のバイアルはクライオ容器（例えばＮａｌｇｅｎｅ Ｍｒ． Ｆｒｏｓｔｙ）に入れられ、－７０℃で終夜貯蔵される。翌日、細胞は液体窒素（ＬＮ２）に移される。
い速度で（例えば、１～８時間、例えば、１、２、３、４、５、６、７もしくは８時間またはより長い）行われ得る。それはまた、イソプロピルアルコールを使用することにより手動で緩徐に凍結され得、その場合、ＮＫ細胞のバイアルはクライオ容器（例えばＮａｌｇｅｎｅ Ｍｒ． Ｆｒｏｓｔｙ）に入れられ、－７０℃で終夜貯蔵される。翌日、細胞は液体窒素（ＬＮ２）に移される。
【0065】
解凍工程
凍結されたナチュラルキラー細胞は、任意の好適な方法を使用して凍結保存後に解凍され得る。一部の実施形態において、凍結／凍結保存されたナチュラルキラー細胞は、水浴を使用して、例えば３７℃で、解凍され得る。一部の実施形態において、凍結されたナチュラルキラー細胞は、１時間もしくはより長く、２時間もしくはより長く、５時間もしくはより長く、または１０時間にわたり解凍され得る。一部の実施形態において、過程は、水またはビーズ浴中で実行される。一部の実施形態において、解凍過程は、凍結させた状態（例えば、液体窒素）から取り出した後にできるだけ迅速にまたはその直後に行われる。
凍結されたナチュラルキラー細胞は、任意の好適な方法を使用して凍結保存後に解凍され得る。一部の実施形態において、凍結／凍結保存されたナチュラルキラー細胞は、水浴を使用して、例えば３７℃で、解凍され得る。一部の実施形態において、凍結されたナチュラルキラー細胞は、１時間もしくはより長く、２時間もしくはより長く、５時間もしくはより長く、または１０時間にわたり解凍され得る。一部の実施形態において、過程は、水またはビーズ浴中で実行される。一部の実施形態において、解凍過程は、凍結させた状態（例えば、液体窒素）から取り出した後にできるだけ迅速にまたはその直後に行われる。
【0066】
一部の実施形態において、凍結されたナチュラルキラー細胞は、１０分以内に３７Ｃの水浴中で解凍することができ、その場合、凍結されたバイアルまたはバッグは、解凍過程を加速させるために振盪され得る。一部の実施形態において、細胞はまた、機器、例えばヒートブロック、バイアル用の自動化細胞解凍機器（例えばＴｈａｗＳｔａｒ、Ｂｉｏｃｉｓｉｏｎ）、またはバッグ用の解凍機器（例えば、ＶＩＡ Ｔｈａｗ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して解凍され得る。
【0067】
第２の培養（第２の共培養、第２の拡大増殖、または再拡大増殖、または任意のその後の培養工程）工程
細胞は最初に第１の培養工程においてＩＬ－２１で処理され、第２の拡大増殖工程がそれにより可能となる。そのため、方法は、１つの拡大増殖工程だけでなく、２つの拡大増殖工程（例えば、１つまたは複数の再拡大増殖工程）を含み得る。好ましくは、第２の拡大増殖工程は、試料が凍結され、何らかの時間的期間にわたり貯蔵され、次に解凍された後に行われる。
細胞は最初に第１の培養工程においてＩＬ－２１で処理され、第２の拡大増殖工程がそれにより可能となる。そのため、方法は、１つの拡大増殖工程だけでなく、２つの拡大増殖工程（例えば、１つまたは複数の再拡大増殖工程）を含み得る。好ましくは、第２の拡大増殖工程は、試料が凍結され、何らかの時間的期間にわたり貯蔵され、次に解凍された後に行われる。
【0068】
第２の培養工程の間に、解凍されたナチュラルキラー細胞は、１回または複数回のフィーダー細胞の添加と共に培養され得る。
【0069】
一部の実施形態において、フィーダー細胞は、培養の１４日のサイクル（または９～２５日のサイクル）の間に１回または複数回、添加され得る。
【0070】
一部の実施形態において、１４日のサイクルの間の１回または複数回のフィーダー細胞の添加を伴う培養は、凍結および解凍後に優れた増殖および／または抗がん活性を呈し得るだけでなく、持続された細胞増殖を維持することができ、その結果、ナチュラルキラー細胞が臨床使用のために十分な量で製造される。
【0071】
一部の実施形態において、第２の培養工程は、第２のラウンドのサイトカイン（例えば、追加のＩＬ－２１またはＩＬ－２１に加えて他のサイトカイン）を添加することを含み得る。
【0072】
一部の実施形態において、第２の培養工程は、培養の０～６日目の間に１回または複数回、その後のラウンドのサイトカインを添加することを含み得る。
【0073】
本明細書の他の箇所におけるサイトカインの任意の記載は、第２の培養工程のためのサ
イトカインに適用され得る。例えば、一部の実施形態において、第２のサイトカインは、１０～１，０００、１０～５００、１０～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、もしくは１０～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用され得、かつ／または追加のサイトカインは、５０～１，０００、５０～９００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５５０、１００～５５０、１５０～５５０、２００～５５０、２５０～５５０、３００～５５０、３５０～５５０、４００～５５０、もしくは４５０～５５０ＩＵ／ｍＬの濃度で使用され得る。第２の拡大増殖のために使用されるサイトカインは好ましくはＩＬ－２１である。
イトカインに適用され得る。例えば、一部の実施形態において、第２のサイトカインは、１０～１，０００、１０～５００、１０～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、もしくは１０～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用され得、かつ／または追加のサイトカインは、５０～１，０００、５０～９００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５５０、１００～５５０、１５０～５５０、２００～５５０、２５０～５５０、３００～５５０、３５０～５５０、４００～５５０、もしくは４５０～５５０ＩＵ／ｍＬの濃度で使用され得る。第２の拡大増殖のために使用されるサイトカインは好ましくはＩＬ－２１である。
【0074】
一部の実施形態において、組成物は、再拡大増殖前の凍結された細胞の組成物であり、ＩＬ－２；５～１０％のＤＭＳＯ；９０～９５％のＦＢＳ；および任意選択的にＣＤ５６＋細胞であるＮＫ細胞を含み得る。一部の実施形態において、組成物は、凍結された固体である。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、組成物の細胞集団の少なくとも９０％である。一部の実施形態において、それはＣｒｙｏＳｔｏｒ溶液をさらに含む。一部の実施形態において、組成物は、再拡大増殖前の凍結された細胞用である。
【0075】
一部の実施形態において、組成物は、再拡大増殖前の凍結された細胞用の組成物であり、ＩＬ－２；５～１０％のＤＭＳＯ；８０～９５％のＨａｒｔｍａｎ溶液；１～１０％のヒト血清アルブミン；およびＮＫ細胞を含み得る。一部の実施形態において、それはＣｒｙｏＳｔｏｒ溶液をさらに含む。一部の実施形態において、組成物は、注射前の凍結された細胞用である。
【0076】
一部の実施形態において、培養においてナチュラルキラー細胞を拡大増殖させる方法は、ＣＤ５６＋細胞を血液試料から単離すること；単離されたＣＤ５６＋細胞をＩＬ－２１の存在下で第１の期間にわたり共培養すること；第１の期間の後の共培養されたＣＤ５６＋細胞を凍結させること；凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；および解凍されたＣＤ５６＋細胞をＩＬ－２１の存在下で第２の期間にわたり共培養することを含み得る。
【0077】
一部の実施形態において、方法は、凍結されたＣＤ５６＋細胞を－１００℃よりも低い温度で貯蔵することをさらに含み得る。一部の実施形態において、凍結されたＣＤ５６＋細胞は、－１０℃もしくはより低い温度、－２０℃もしくはより低い温度、－５０℃もしくはより低い温度、－７０℃もしくはより低い温度、－１５０℃もしくはより低い温度、－１９２℃もしくはより低い温度、または－２００℃もしくはより低い温度で貯蔵されてもよい。一部の実施形態において、凍結されたＣＤ５６＋細胞は、解凍前に１日よりも長く貯蔵され得る。一部の実施形態において、凍結されたＣＤ５６＋細胞は、２日もしくはより長く、３日もしくはより長く、７日もしくはより長く、１４日もしくはより長く、３０日もしくはより長く、６０日もしくはより長く、または１８０日もしくはより長く（先行する値の任意の２つの間の任意の範囲を含む）にわたり貯蔵され得る。一部の実施形態において、細胞は、解凍された場合に生存可能である限りの長さの期間にわたり凍結され得る。
【0078】
一部の実施形態において、単離されたＣＤ５６＋細胞は、凍結の前に１３～１６日にわたり共培養され得る。例えば、単離されたＣＤ５６＋細胞は、凍結の前に１４または１５日にわたり共培養され得る。一部の実施形態において、共培養または拡大増殖は、適切な任意の時間にわたり行われ得る。一部の実施形態において、共培養または拡大増殖（再拡大増殖を含む）は、９～２５日、例えば、１０～２４、１１～２３、１３～２２、１４～２１、１４～１８、１４～１６日などにわたり為され得る。これらの時間枠は、本明細書において提供される任意の拡大増殖および／または再拡大増殖期間（他の細胞に関する実施形態を含む）に適用され得る。
【0079】
一部の実施形態において、単離されたＣＤ５６＋細胞は、１つまたは複数の照射されたフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養され得る。一部の実施形態において、解凍されたＣＤ５６＋細胞は、１つまたは複数の照射されたフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養され得る。１つまたは複数のフィーダー細胞は、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞、ｍｂ１５－ｋ５６２、ｍｂ２１－ｋ５６２フィーダー細胞、ＨｕＴ７８、および／またはＰＢＭＣからなる群から選択される１つまたは複数を含み得るがこれらに限定されない。一部の実施形態において、拡大増殖は、ＰＢＭＣ、ＣＤ５６＋および／またはＣＤ５６＋ＣＤ３－細胞を用いて行われる。一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞は、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。例えば、ＣＤ５６＋細胞は、約１：２、１：５、１：１０、１：３０または１：１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。
【0080】
一部の実施形態において、ＩＬ－２１は、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で第１および／または第２の期間の間に添加され得る。例えば、ＩＬ－２１は、２０～８０ｎｇ／ｍＬ、３０～７０ｎｇ／ｍＬ、または４０～６０ｎｇ／ｍＬの濃度で第１および／または第２の期間の間に添加され得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２１は、第１および／または第２の期間の間に１回よりも多く添加され得る。
【0081】
一部の実施形態において、培養においてナチュラルキラー細胞を拡大増殖させる方法は、ＣＤ５６＋を血液試料から単離すること；ＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養すること；ＣＤ５６＋細胞を凍結させること；凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；および解凍されたＣＤ５６＋細胞を拡大増殖させることを含み得る。
【0082】
一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞は、－１００℃よりも低い温度で凍結され得る。一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞は、－１０℃もしくはより低い温度、－２０℃もしくはより低い温度、－５０℃もしくはより低い温度、－７０℃もしくはより低い温度、－１５０℃もしくはより低い温度、－１９２℃もしくはより低い温度、または－２００℃もしくはより低い温度で凍結され得る。一部の実施形態において、凍結されたＣＤ５６＋細胞は、解凍前に１日よりも長く貯蔵され得る。一部の実施形態において、凍結されたＣＤ５６＋細胞は、２日もしくはより長く、３日もしくはより長く、７日もしくはより長く、１４日もしくはより長く、３０日もしくはより長く、６０日もしくはより長く、または１８０日もしくはより長く（先行する値の任意の２つの間の任意の範囲を含む）にわたり貯蔵され得る。例えば、凍結されたＣＤ５６＋細胞は、１日より長く、かつ１０年より短い期間にわたり貯蔵されてもよい。
【0083】
一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞は、凍結の前に１３～１６日にわたり共培養され得る。例えば、ＣＤ５６＋細胞は、凍結の前に１４または１５日にわたり共培養され得る。一部の実施形態において、共培養または拡大増殖（再拡大増殖を含む）は、９～２５日、例えば、１０～２４、１１～２３、１３～２２、１４～２１、１４～１８、１４～１６日などにわたり為され得る。これらの時間枠は、本明細書において提供される任意の拡大増殖および／または再拡大増殖期間（他の細胞に関する実施形態を含む）に適用され得る。
【0084】
一部の実施形態において、１つまたは複数のフィーダー細胞は、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞およびＰＢＭＣからなる群から選択される１つまたは複数であり得る。ＣＤ５６＋細胞は、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフ
ィーダー細胞との比で共培養され得る。例えば、ＣＤ５６＋細胞は、約１：２、１：５、１：１０、１：３０または１：１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。
ィーダー細胞との比で共培養され得る。例えば、ＣＤ５６＋細胞は、約１：２、１：５、１：１０、１：３０または１：１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。
【0085】
一部の実施形態において、ＩＬ－２１は、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加され得る。例えば、ＩＬ－２１は、２０～８０ｎｇ／ｍＬ、３０～７０ｎｇ／ｍＬ、または４０～６０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加され得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２１は、１回よりも多く添加され得る。
【0086】
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性を増加させる方法は、前記ナチュラルキラー細胞を提供すること；前記ナチュラルキラー細胞を凍結させること；凍結されたナチュラルキラー細胞を解凍すること；および解凍されたナチュラルキラー細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養することを含み得る。
【0087】
一部の実施形態において、方法は、凍結されたナチュラルキラー細胞を－１００℃よりも低い温度で貯蔵することをさらに含み得る。一部の実施形態において、凍結されたナチュラルキラー細胞は、－１０℃もしくはより低い温度、－２０℃もしくはより低い温度、－５０℃もしくはより低い温度、－７０℃もしくはより低い温度、－１５０℃もしくはより低い温度、－１９２℃もしくはより低い温度、または－２００℃もしくはより低い温度で貯蔵されてもよい。一部の実施形態において、凍結されたナチュラルキラー細胞は、解凍前に１日よりも長く貯蔵され得る。一部の実施形態において、凍結されたナチュラルキラー細胞は、２日もしくはより長く、３日もしくはより長く、７日もしくはより長く、１４日もしくはより長く、３０日もしくはより長く、６０日もしくはより長く、または１８０日もしくはより長く（先行する値の任意の２つの間の任意の範囲を含む）にわたり貯蔵され得る。一部の実施形態において、細胞は、解凍された際に細胞のいずれかが生存可能なままである限りの長さにわたり貯蔵される。
【0088】
一部の実施形態において、１つまたは複数のフィーダー細胞は、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞およびＰＢＭＣからなる群から選択される１つまたは複数であり得る。一部の実施形態において、解凍されたナチュラルキラー細胞は、約１：１～１００のナチュラルキラー細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。
【0089】
一部の実施形態において、ＩＬ－２１は、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加され得る。例えば、ＩＬ－２１は、２０～８０ｎｇ／ｍＬ、３０～７０ｎｇ／ｍＬ、または４０～６０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加され得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２１は、１回よりも多く添加され得る。
【0090】
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞を製造する方法は、以下の工程：凍結工程；解凍工程；およびフィーダー細胞の添加を伴う共培養を含む第２の培養工程を繰り返すことを含み得る。
【0091】
一部の実施形態において、図１４Ａ（データ曲線の上のバーの時点）に示されるように、再刺激または再拡大増殖の１つより多くのサイクルが適用され得る。一部の実施形態において、第１の刺激、続いて細胞培養、続いて凍結（任意選択的）、続いて第２の刺激（再刺激）、続いて第２の細胞培養工程、続いて凍結（任意選択的）、続いて第３の刺激（第２の再刺激）、続いて別の培養工程が為される。ＩＬ－２１は、本明細書において提供されるような刺激工程の各々において使用され得る。任意選択的な凍結工程は、細胞の全体、または細胞の画分に適用され得る。一部の実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多くのラウンドの刺激（例えば、１ラウンドの刺激および次に１、２、３、４、５、６、７、８、９またはより多くのラウンドの再刺激）が為される。再刺激の各々の後に、別の細胞培養／拡大増殖工程が為され得る。一部の実施形態において、細胞培養または再拡大増殖の各々は、９～２５日にわたり為され得る。各細胞培養工程に続いて凍結工程が為され得る。一部の実施形態において、過程は、所望されるだけ多くの回数繰り返される、ａ）刺激（または再刺激）、続いてｂ）細胞培養、続いてｃ）凍結（任意選択的）、続いてｄ）解凍（任意選択的）のサイクルであり得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２１の量は１０～１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、５０ｎｇ／ｍＬである。図１４Ａにおける刺激／再刺激は、細胞へのＩＬ－２１の添加を表す。
【0092】
一部の実施形態において、本明細書において提供される任意の過程は、１つまたは複数の凍結工程を含み得る。
【0093】
一部の実施形態において、本明細書において提供されるＮＫ細胞に関する任意の実施形態は、天然のＮＫ細胞の他に、遺伝子改変されたＮＫ細胞を含み得る。
【0094】
がんを処置するための細胞治療用組成物
一部の実施形態によれば、がんの処置用の細胞治療用組成物は末梢血由来ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞を含み得る。細胞は、少なくとも第１のラウンドがＩＬ－２１の存在下で為される少なくとも２ラウンドの拡大増殖を経たものである、またはその結果である。
一部の実施形態によれば、がんの処置用の細胞治療用組成物は末梢血由来ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞を含み得る。細胞は、少なくとも第１のラウンドがＩＬ－２１の存在下で為される少なくとも２ラウンドの拡大増殖を経たものである、またはその結果である。
【0095】
本明細書において、「末梢血由来」という用語は、細胞が「末梢血の全血」または「白血球アフェレーシスを使用して末梢血から単離された白血球」に由来することを意味し得る。末梢血由来ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞と交換可能に使用され得る。
【0096】
一部の実施形態において、サイトカインは、１８～１８０，０００、２０～１００，０００、５０～５０，０００、５０～１，０００、５０～９００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５５０、１００～５５０、１５０～５５０、２００～５５０、２５０～５５０、３００～５５０、３５０～５５０、４００～５５０、４５０～５５０ＩＵ／ｍＬの濃度で使用され得る。サイトカインがこれらの範囲内で使用される場合、それは、がん処置組成物に含まれるＮＫ細胞のアポトーシスを抑制し、ＮＫ細胞の抗がん活性を増加させ得る。
【0097】
一部の実施形態において、組成物は、ＩＬ－２を（例えば、ＩＬ－２１に加えて）追加のサイトカインとして含み得る。
【0098】
一部の実施形態において、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞は、本明細書の他の箇所に記載されるように得られ得る。例えば、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞は、フィーダー細胞（例えば照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞および照射されたＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）と共培養することにより得られ得る。一部の実施形態において、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞と全細胞との比（純度）は、８５％もしくはより高い％、９０％もしくはより高い％、９５％もしくはより高い％、または９８％もしくはより高い％であり得る。
【0099】
一部の実施形態において、がんは、血液がん、胃がん、膵臓がん、胆管癌、結腸がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、肺がん、腎臓がん、前立腺がんまたは神経芽腫であり得るがこれらに限定されない。一部の実施形態において、方法は、例えば、神経変性疾患および急性感染症における、同種異系ＮＫ細胞療法に適用され得る。
【0100】
一部の実施形態において、組成物は、Ｔ細胞を含まなくてもよく、または微量のみのＴ細胞を含んでもよい。例えば、組成物中のＴ細胞と全細胞との比は、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満またはより低い％であり得る。
【0101】
本明細書において、「Ｔ細胞」という用語は、胸腺に由来するリンパ球であって、以前に遭遇した抗原を「記憶」して情報をＢ細胞に提供することができ、それにより、抗体の産生を促し、細胞免疫系において重要な役割を果たすものを指す。これらのＴ細胞は、異なる抗原間の非常に小さい差異を区別して同種異系抗原に対する免疫応答を誘導できるので、自己療法が可能であるが、同種異系療法のための使用には制限があり得る。よって、Ｔ細胞を含まない細胞治療用組成物は同種移植のために好適であり得る。
【0102】
本明細書において、「細胞治療剤」という用語は、一連の行為、例えば細胞および組織の機能を回復させるためまたは他の方法により細胞の生物学的特徴を変化させるためのインビトロでの自己、同種異系、および異種生細胞の増殖およびスクリーニングを通じて、処置、診断、および予防のために使用される医薬を指す。細胞治療剤は、米国において１９９３年からおよび韓国において２００２年から医療用製造物として規制されている。これらの細胞治療剤は、大きくは２つの分野に分類することができ、これは第１に、組織再生または臓器機能の回復のための幹細胞治療剤、第２に、免疫応答の調節、例えばインビボでの免疫応答の阻害または免疫応答の増強のための免疫細胞治療剤である。
【0103】
本明細書に記載の細胞治療用組成物の投与経路は、組成物が標的組織に達する限り、任意の好適な経路であり得る。投与は、非経口投与、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、または皮内投与であり得るがこれらに限定されない。
【0104】
本明細書に記載の細胞治療用組成物は、細胞療法のために好適なまたは一般に使用される薬学的に許容される担体と共に好適な形態に製剤化され得る。「薬学的に許容される」は、ヒト身体に投与された場合に、生理学的に許容され、かつアレルギー性反応、例えば胃腸障害、もしくはめまいなど、またはそれに類似した反応を一般に引き起こさない組成物を指す。薬学的に許容される担体は、例えば、非経口投与担体、例えば水、好適な油、食塩水、ならびに水性グルコースおよびグリコールなどを含むことができ、安定化剤および保存剤をさらに含むことができる。好適な安定化剤としては、抗酸化剤、例えば亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸、スクロース、またはアルブミンなどが挙げられる。好適な保存剤としては、ＤＭＳＯ、グリセロール、エチレングリコール、スクロース、トレハロース、デキストロース、またはポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【0105】
細胞治療用組成物はまた、細胞治療剤が標的細胞へと移動し得る任意のデバイスにより投与され得る。
【0106】
細胞治療用組成物は、疾患の処置のための治療有効量の細胞治療剤を含み得る。「治療有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師、または他の臨床医により考慮される組織系、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘導する活性成分または細胞治療用組成物の量を意味し、処置されるべき疾患または障害の症状の軽減を誘導する量を含む。細胞治療用組成物に含まれる細胞治療剤は、所望される効果にしたがって変化し得ることは当業者に明らかである。したがって、細胞治療剤の最適な含有量は、当業者により容易に決定され得、様々な要因、例えば疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有される他の成分の含有量、製剤の種類、ならびに患者の年齢、体重、全般的健康状態、性別、および食事、投与時間、投与経路、組成物の分泌比（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）、処置期間、ならびに同時に使用される薬物にしたがって調整され得る。要因の全てを考慮することにより副作用無しで最小量により最大の効果を得る能力を有する量を含めるこ
とが重要である。例えば、細胞治療用組成物は、１×１０６～５×１０８細胞／ｋｇ体重の細胞治療剤を含み得る。
とが重要である。例えば、細胞治療用組成物は、１×１０６～５×１０８細胞／ｋｇ体重の細胞治療剤を含み得る。
【0107】
一部の実施形態において、細胞治療用組成物のＮＫ細胞は、それらの凍結前の集団と比較して５０％もしくはより高い％、６０％もしくはより高い％、７０％もしくはより高い％、８０％もしくはより高い％、８５％もしくはより高い％、９０％もしくはより高い％、９３％もしくはより高い％、９５％もしくはより高い％、または９８％もしくはより高い％の細胞傷害性を有し得る。
【0108】
一部の実施形態において、組成物は、患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する有効量のＣＤ５６＋細胞を含み得る。ＣＤ５６＋細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液試料から単離すること；ＣＤ５６＋細胞をＰＢＭＣから単離すること；ＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共に１つまたは複数のサイトカインの存在下で共培養すること；ＣＤ５６＋細胞を凍結させること；凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；および解凍されたＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共に１つまたは複数のサイトカインの存在下で共培養することにより調製され得る。
【0109】
一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞の有効量は、１×１０６～５×１０８細胞／ｋｇ体重であり得る。
【0110】
一部の実施形態において、細胞組成物は、患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する有効量のＣＤ５６＋細胞；ＩＬ－２；およびＩＬ－２１を含み得る。
【0111】
一部の実施形態において、組成物は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＣＤ５６＋細胞の第１の集団；氷；ＩＬ－２およびＩＬ－２１を含み得る。解凍された場合に、ＣＤ５６＋細胞はＣＤ５６＋細胞の第２の集団の少なくとも８０％の細胞傷害性を有し、ＣＤ５６＋細胞の第２の集団は凍結されていない。一部の実施形態において、細胞傷害性は、少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％である。
【0112】
一部の実施形態において、凍結無しでの拡大増殖（ＩＬ２１有りおよび無し、ＩＬ２１＋またはＩＬ２１－）と凍結有りかつ第１の工程におけるＩＬ２１＋との共培養有りでの拡大増殖を比較した場合、凍結有りでの拡大増殖の平均細胞傷害性は凍結無しの９７．７％であった（表Ｃ：８３％～１３１％の範囲）。一部の実施形態において、凍結無しでの拡大増殖（ＩＬ２１有りおよび無し、ＩＬ２１＋またはＩＬ２１－）と凍結有りかつ第１の工程におけるＩＬ２１＋との共培養無しでの拡大増殖（ＩＬ２１－－、ＩＬ２１－＋）を比較した場合、凍結有りでの拡大増殖の平均細胞傷害性は凍結無しでの拡大増殖の少なくとも８１．４％であり得る（表Ｄ、６１％～８３％の範囲）。ＩＬ２１を凍結有りでの拡大増殖の両方の工程において添加した場合（ＩＬ２１＋＋）、平均細胞傷害性は凍結無しでの拡大増殖の１１４％であった（表Ｃ、９８％～１３１％の値）。そのため、一部の実施形態において、ＩＬ２１＋／＋（７２％）対ＩＬ２１－／＋（４５％）は、第１の拡大増殖においてＩＬ２１有りかつ第２の工程においても同様の場合、細胞傷害性は、第１の工程においてＩＬ２１無しの場合よりも６０％高いことを表す。そのため、一部の実施形態において、第１の拡大増殖におけるＩＬ２１の存在は、６０％より高い、第２の、凍結後の拡大増殖を可能とする。ＩＬ２１＋／－（６２％）対ＩＬ２１－／－（４６．１％）について、第１の工程においてＩＬ２１有りの第１の拡大増殖であるが第２の工程においてはそうでない場合、細胞傷害性は、第１の工程におけるＩｌ２１無しの場合よりも少なくとも３５％高いものであり得ることをそれは意味する。
【0113】
一部の実施形態において、細胞傷害性は、凍結無しでの拡大増殖（ＩＬ２１有りおよび無し）と凍結有りかつ第１の工程におけるＩＬ２１＋との共培養有りでの拡大増殖との比
較であり、凍結有りでの拡大増殖の平均細胞傷害性は凍結無しの９７．７％である。一部の実施形態において、細胞傷害性は、凍結無しでの拡大増殖（ＩＬ２１有りおよび無し）と凍結有りかつ第１の工程におけるＩＬ２１＋との共培養無しでの拡大増殖との比較であり、凍結有りでの拡大増殖の平均細胞傷害性は凍結無しでの拡大増殖の８１．４％である。一部の実施形態において、ＩＬ２１が凍結の前および後の両方に添加され、平均細胞傷害性は凍結無しでの拡大増殖の１１４％である。
較であり、凍結有りでの拡大増殖の平均細胞傷害性は凍結無しの９７．７％である。一部の実施形態において、細胞傷害性は、凍結無しでの拡大増殖（ＩＬ２１有りおよび無し）と凍結有りかつ第１の工程におけるＩＬ２１＋との共培養無しでの拡大増殖との比較であり、凍結有りでの拡大増殖の平均細胞傷害性は凍結無しでの拡大増殖の８１．４％である。一部の実施形態において、ＩＬ２１が凍結の前および後の両方に添加され、平均細胞傷害性は凍結無しでの拡大増殖の１１４％である。
【0114】
一部の実施形態において、その後の再拡大増殖を可能とする共拡大増殖の間の初期ＩＬ２１処理の優れた性質は、以下の表Ａ～Ｄにおける結果と合致したものであり得る：
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【0115】
ＮＫ細胞の培養、拡大増殖（再拡大増殖を含む）の任意の実施形態において、共培養（
培養、拡大増殖（再拡大増殖を含む））の開始時の培養物中の末梢血単核細胞の数は、１×１０４～１×１０１５個の細胞の範囲内である。一部の実施形態において、共培養の開始時の培養物中の末梢血単核細胞の数は、１×１０４～５×１０４個の細胞、５×１０４～１×１０５個の細胞、１×１０５～５×１０５個の細胞、５×１０５～１×１０６個の細胞、１×１０６～１×１０７個の細胞、１×１０７～１×１０８個の細胞、１×１０８～１×１０９個の細胞、１×１０９～１×１０１０個の細胞、１×１０１１～１×１０１２個の細胞、１×１０１２～１×１０１３個の細胞、１×１０１３～１×１０１４個の細胞、または１×１０１４～１×１０１５個の細胞の範囲内である。一部の実施形態において、第１または初期拡大増殖の開始時の培養物中の末梢血単核細胞の数は、１×１０４～５×１０４個の細胞、５×１０４～１×１０５個の細胞、１×１０５～５×１０５個の細胞、５×１０５～１×１０６個の細胞、１×１０６～１×１０７個の細胞、１×１０７～１×１０８個の細胞、１×１０８～１×１０９個の細胞、１×１０９～１×１０１０個の細胞、１×１０１１～１×１０１２個の細胞、１×１０１２～１×１０１３個の細胞、１×１０１３～１×１０１４個の細胞、または１×１０１４～１×１０１５個の細胞の範囲内である。一部の実施形態において、再拡大増殖の開始時の培養物中の末梢血単核細胞の数は、１×１０４～５×１０４個の細胞、５×１０４～１×１０５個の細胞、１×１０５～５×１０５個の細胞、５×１０５～１×１０６個の細胞、１×１０６～１×１０７個の細胞、１×１０７～１×１０８個の細胞、１×１０８～１×１０９個の細胞、１×１０９～１×１０１０個の細胞、１×１０１１～１×１０１２個の細胞、１×１０１２～１×１０１３個の細胞、１×１０１３～１×１０１４個の細胞、または１×１０１４～１×１０１５個の細胞の範囲内である。本発明の方法は、従来のアプローチよりも大きいＮＫ細胞の拡大増殖を提供し得る。そのため、上記の実施形態のいずれかにおいて、共培養（培養、拡大増殖（再拡大増殖を含む））の開始時の培養物中の末梢血単核細胞の数は、例えば、治療的使用および／または凍結保存のための、類似した数のＮＫ細胞を提供するためにＮＫ細胞を拡大増殖させる（例えば、サイトカイン、例えばＩＬ－２１および／またはＩＬ－２無しで拡大増殖させる）ための従来のアプローチにおいては使用が困難な細胞の数である。
培養、拡大増殖（再拡大増殖を含む））の開始時の培養物中の末梢血単核細胞の数は、１×１０４～１×１０１５個の細胞の範囲内である。一部の実施形態において、共培養の開始時の培養物中の末梢血単核細胞の数は、１×１０４～５×１０４個の細胞、５×１０４～１×１０５個の細胞、１×１０５～５×１０５個の細胞、５×１０５～１×１０６個の細胞、１×１０６～１×１０７個の細胞、１×１０７～１×１０８個の細胞、１×１０８～１×１０９個の細胞、１×１０９～１×１０１０個の細胞、１×１０１１～１×１０１２個の細胞、１×１０１２～１×１０１３個の細胞、１×１０１３～１×１０１４個の細胞、または１×１０１４～１×１０１５個の細胞の範囲内である。一部の実施形態において、第１または初期拡大増殖の開始時の培養物中の末梢血単核細胞の数は、１×１０４～５×１０４個の細胞、５×１０４～１×１０５個の細胞、１×１０５～５×１０５個の細胞、５×１０５～１×１０６個の細胞、１×１０６～１×１０７個の細胞、１×１０７～１×１０８個の細胞、１×１０８～１×１０９個の細胞、１×１０９～１×１０１０個の細胞、１×１０１１～１×１０１２個の細胞、１×１０１２～１×１０１３個の細胞、１×１０１３～１×１０１４個の細胞、または１×１０１４～１×１０１５個の細胞の範囲内である。一部の実施形態において、再拡大増殖の開始時の培養物中の末梢血単核細胞の数は、１×１０４～５×１０４個の細胞、５×１０４～１×１０５個の細胞、１×１０５～５×１０５個の細胞、５×１０５～１×１０６個の細胞、１×１０６～１×１０７個の細胞、１×１０７～１×１０８個の細胞、１×１０８～１×１０９個の細胞、１×１０９～１×１０１０個の細胞、１×１０１１～１×１０１２個の細胞、１×１０１２～１×１０１３個の細胞、１×１０１３～１×１０１４個の細胞、または１×１０１４～１×１０１５個の細胞の範囲内である。本発明の方法は、従来のアプローチよりも大きいＮＫ細胞の拡大増殖を提供し得る。そのため、上記の実施形態のいずれかにおいて、共培養（培養、拡大増殖（再拡大増殖を含む））の開始時の培養物中の末梢血単核細胞の数は、例えば、治療的使用および／または凍結保存のための、類似した数のＮＫ細胞を提供するためにＮＫ細胞を拡大増殖させる（例えば、サイトカイン、例えばＩＬ－２１および／またはＩＬ－２無しで拡大増殖させる）ための従来のアプローチにおいては使用が困難な細胞の数である。
【0116】
本明細書に開示されるように、本開示の方法は、一部の実施形態において、治療的使用、例えば、免疫療法のために好適なＮＫ細胞を提供する。一部の実施形態において、本開示の方法は、治療的使用のために有効にその後の解凍および拡大増殖が可能なＮＫ細胞の凍結保存を提供する。そのため、ＮＫ細胞を培養しまたは拡大増殖（再拡大増殖を含む）させるための任意の実施形態において、ＮＫ細胞は拡大増殖されて、治療的使用のための拡大増殖されたＮＫ細胞の１つの集団、および凍結保存のための別の集団が製造される。一部の実施形態において、凍結保存されたＮＫ細胞は、治療的使用および／またはさらなる凍結保存のために後に解凍および再拡大増殖される。
【0117】
ＮＫ細胞を培養しまたは拡大増殖（再拡大増殖を含む）させるための任意の実施形態において、拡大増殖または再拡大増殖の終了時のＮＫ細胞の数は、治療的使用のために有効なＮＫ細胞の数よりも多い。一部の実施形態において、過剰なＮＫ細胞は、将来的な使用、例えば、将来的な解凍、拡大増殖およびそれを必要とする患者への投与のために凍結保存される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、療法、例えば、免疫療法のために使用されるまたは使用されるべきＮＫ細胞の数よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、もしくはより大きい％、または先行する値の任意の２つの間の範囲内のパーセンテージだけ多い細胞数の程度まで拡大増殖または再拡大増殖される。
【0118】
ＮＫ細胞を培養しまたは拡大増殖（再拡大増殖を含む）させるための任意の実施形態において、方法は、凍結－解凍－拡大増殖サイクルを繰り返すことを含み得る。一部の実施形態において、方法は、凍結－解凍－拡大増殖サイクルを１、２、３、４、５、６、７、
８またはより多くの回数繰り返すことを含む。
８またはより多くの回数繰り返すことを含む。
【0119】
凍結保存されたＮＫ細胞の組成物であって、ＮＫ細胞が、解凍後に、それらの生物学的活性、例えば、細胞傷害性を保持する、組成物もまた本明細書において提供される。一部の実施形態において、凍結保存されたＮＫ細胞は、解凍および再拡大増殖後に、それらの生物学的活性、例えば、細胞傷害性を保持する。一部の実施形態において、凍結保存されたＮＫ細胞の組成物は、本明細書に開示される、ＮＫ細胞を培養しまたは拡大増殖（再拡大増殖を含む）させる方法のいずれかにより調製される。一部の実施形態において、組成物は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはより多くのＮＫ細胞である免疫細胞の集団を含む。組成物は、好適な凍結保存培地を含有し得る。一部の実施形態において、組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および血清（例えば、ＦＢＳ、ヒト血清）を含む。一部の実施形態において、組成物は、１～１５％、２～１５％、５～１５％、５～１０％、または約１０％のＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、組成物は、少なくとも９０％のＮＫ細胞を含む凍結保存された免疫細胞の集団、１０％のＤＭＳＯおよび９０％のＦＢＳからなるまたは含む。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、対象から得られたＰＢＭＣに由来する。一部の実施形態において、組成物は、少なくとも９０％のＮＫ細胞を含む凍結保存された免疫細胞の集団、５～１０％のＤＭＳＯおよび９０～９５％のＦＢＳからなるまたは含む。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、対象から得られたＰＢＭＣに由来する。一部の実施形態において、それはＣｒｙｏＳｔｏｒ溶液をさらに含む。
【0120】
がんを予防または処置する方法
一部の実施形態において、がんを予防または処置する方法が提供される。方法は、末梢血由来ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞およびサイトカインを含む抗がん用細胞治療用組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態において、細胞は、少なくとも第１の拡大増殖過程がＩＬ－２１の存在下で行われる２回の拡大増殖過程の結果である。
一部の実施形態において、がんを予防または処置する方法が提供される。方法は、末梢血由来ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞およびサイトカインを含む抗がん用細胞治療用組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態において、細胞は、少なくとも第１の拡大増殖過程がＩＬ－２１の存在下で行われる２回の拡大増殖過程の結果である。
【0121】
「対象」という用語は、処置、観察、または試験の対象となる哺乳動物、好ましくはヒトを指す。対象は、血液がん、胃がん、膵臓がん、胆管癌、結腸がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、肺がん、腎臓がん、前立腺がんまたは神経芽腫の患者であり得るがこれらに限定されない。
【0122】
一部の実施形態において、成人の場合、細胞治療用組成物は、１日に１回～数回で投与され得る。細胞治療用組成物は、１日毎にまたは２～１８０日の間隔で投与され得る。組成物に含まれる細胞治療剤は、体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０１１個の末梢血由来ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞、例えば、約１×１０６～１×１０８個のＮＫ細胞を含み得る。一部の実施形態において、細胞治療用組成物中の末梢血由来ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞は少なくとも約９０％純粋である。一部の実施形態において、サイトカインは、約５０～５０，０００ＩＵ／ｍｌの範囲内の濃度のＩＬ－２である。
【0123】
一部の実施形態において、細胞治療用組成物は、細胞療法のために好適なまたは一般に使用される薬学的に許容される担体と共に好適な形態に製剤化され得る。「薬学的に許容される」は、ヒト身体に投与された場合に、生理学的に許容され、かつアレルギー性反応、例えば胃腸障害、もしくはめまいなど、またはそれに類似した反応を一般に引き起こさない組成物を指す。薬学的に許容される担体は、例えば、非経口投与担体、例えば水、好適な油、食塩水、水性グルコース、グリコール、基礎化合物、例えばＨａｒｔｍａｎ溶液、または生理食塩水溶液およびｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａのような代替物などを含むことができ、安定化剤および保存剤をさらに含むことができる。好適な安定化剤としては、抗酸化剤、例えば亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸、スクロース、アルブミン、またはヒト血清アルブミンなどが挙げられる。好適な保存剤としては、ＤＭＳＯ、グリセロール、エチレングリコール、スクロース、トレハロース、デキストロース、またはポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【0124】
一部の実施形態において、細胞治療用組成物は、任意の好適な方法、例えば直腸、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、外用、眼内、または皮内経路を通じた投与により投与され得る。一部の実施形態において、組成物に含まれるＮＫ細胞は、同種異系、すなわち、処置されている対象以外のヒトから得られたものであり得る。一部の実施形態において、該ヒトは、正常なヒトまたはがん患者であり得る。一部の実施形態において、組成物に含まれるＮＫ細胞は、自己、すなわち、処置されている対象から得られたものであり得る。
【0125】
一部の実施形態において、本明細書に開示されるＮＫ細胞および本明細書に開示されるＮＫ細胞を含む細胞治療用組成物は、がん以外の疾患または状態を処置するために使用され得る。ＮＫ細胞は、例えば、Ｔ細胞の調節により、免疫系の調節において重要な役割を果たすことが報告されており、そのため、ＮＫ細胞を有する細胞治療用組成物は、免疫系と関連付けられる状態を処置するために投与され得る。例えば、細胞治療用組成物は、神経変性障害（例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病）または自己免疫疾患（例えば関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、脊椎関節症、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、全身性硬化症）を処置するために投与され得る。
【0126】
一部の実施形態において、対象を処置する方法は、ＣＤ５６＋細胞を対象から収集すること；ＣＤ５６＋細胞を１つまたは複数のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下で共培養すること；共培養されたＣＤ５６＋細胞を少なくとも１日にわたり凍結させること；凍結されたＣＤ５６＋細胞を解凍すること；解凍されたＣＤ５６＋細胞を拡大増殖させること；および拡大増殖されたＣＤ５６＋細胞を対象に投与することを含むことができ、第２の拡大増殖からの細胞の細胞傷害性は、凍結の前の共培養されたＣＤ５６＋の細胞傷害性の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０、８５、９０、９５、または９７％）である。
【0127】
一部の実施形態において、方法は、凍結されたＣＤ５６＋細胞を－１００℃よりも低い温度で貯蔵することをさらに含み得る。一部の実施形態において、凍結されたＣＤ５６＋細胞は、－１０℃もしくはより低い温度、－２０℃もしくはより低い温度、－５０℃もしくはより低い温度、－７０℃もしくはより低い温度、－１５０℃もしくはより低い温度、－１９２℃もしくはより低い温度、または－２００℃もしくはより低い温度で貯蔵されてもよい。一部の実施形態において、凍結されたＣＤ５６＋細胞は、解凍前に１日よりも長く貯蔵され得る。一部の実施形態において、凍結されたＣＤ５６＋細胞は、２日もしくはより長く、３日もしくはより長く、７日もしくはより長く、１４日もしくはより長く、３０日もしくはより長く、６０日もしくはより長く、または１８０日もしくはより長く（先行する値の任意の２つの間の任意の範囲を含む）にわたり貯蔵され得る。
【0128】
一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞は、凍結の前に１３～１６日にわたり共培養され得る。例えば、ＣＤ５６＋細胞は、凍結の前に１４または１５日にわたり共培養され得る。一部の実施形態において、共培養または拡大増殖（再拡大増殖を含む）は、９～２５日、例えば、１０～２４、１１～２３、１３～２２、１４～２１、１４～１８、１４～１６日などにわたり為され得る。これらの時間枠は、本明細書において提供される任意の拡大増殖および／または再拡大増殖期間（他の細胞に関する実施形態を含む）に適用され得る。
【0129】
一部の実施形態において、解凍されたＣＤ５６＋細胞を拡大増殖させることは、解凍されたＣＤ５６＋を１つまたは複数の照射されたフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の存在下
で共培養することを含む。１つまたは複数のフィーダー細胞は、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞およびＰＢＭＣからなる群から選択される１つまたは複数である。一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞は、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。例えば、ＣＤ５６＋細胞は、約１：２、１：５、１：１０、１：３０または１：１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。
で共培養することを含む。１つまたは複数のフィーダー細胞は、照射されたジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、照射されたエプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、Ｋ５６２細胞およびＰＢＭＣからなる群から選択される１つまたは複数である。一部の実施形態において、ＣＤ５６＋細胞は、約１：１～１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。例えば、ＣＤ５６＋細胞は、約１：２、１：５、１：１０、１：３０または１：１００のＣＤ５６＋細胞とフィーダー細胞との比で共培養され得る。
【0130】
一部の実施形態において、ＩＬ－２１は、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で第１および／または第２の期間の間に添加され得る。例えば、ＩＬ－２１は、２０～８０ｎｇ／ｍＬ、３０～７０ｎｇ／ｍＬ、または４０～６０ｎｇ／ｍＬの濃度で第１および／または第２の期間の間に添加され得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２１は、第１および／または第２の期間の間に１回よりも多く添加され得る。
【0131】
一部の実施形態において、ＩＬ－２１は、ヒトＮＫ細胞のためにヒトＩＬ－２１である。
【0132】
本明細書において提供される一部の実施形態は、以下のような特徴および利点を含む：
（ａ）ナチュラルキラー細胞を製造する方法。
（ｂ）ナチュラルキラー細胞は、凍結保存の後であっても臨床使用のために十分な量で製造され得るので、がんの予防および処置の、特には、ナチュラルキラー細胞を使用する同種異系療法の効果を増強することが可能である。
（ｃ）２回の拡大増殖（ＩＬ－２１有りの少なくとも１回目、および任意選択的に同様に第２の拡大増殖）の結果としてもたらされる細胞の細胞傷害性は、ＩＬ－２１無しの拡大増殖（１回、および２回でさらに大きく）を受けた細胞よりも驚くべきほどに優れる。一部の実施形態において、細胞は、１～５０ｍＬのクライオバイアル、または１０～１００ｍＬのクライオバッグ中にある。
（ａ）ナチュラルキラー細胞を製造する方法。
（ｂ）ナチュラルキラー細胞は、凍結保存の後であっても臨床使用のために十分な量で製造され得るので、がんの予防および処置の、特には、ナチュラルキラー細胞を使用する同種異系療法の効果を増強することが可能である。
（ｃ）２回の拡大増殖（ＩＬ－２１有りの少なくとも１回目、および任意選択的に同様に第２の拡大増殖）の結果としてもたらされる細胞の細胞傷害性は、ＩＬ－２１無しの拡大増殖（１回、および２回でさらに大きく）を受けた細胞よりも驚くべきほどに優れる。一部の実施形態において、細胞は、１～５０ｍＬのクライオバイアル、または１０～１００ｍＬのクライオバッグ中にある。
【実施例】
【0133】
以下の実施例は、ある特定の具体的な特徴および／または実施形態の実例を示すために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載される特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
【0134】
高純度ＮＫ細胞製造方法の比較試験を、ＬＣＬ＋ＫＬ－１タイプのフィーダー細胞を使用してＩＬ－２１処理有りおよび無しで行った。本実施例において議論される任意の他のフィーダー細胞は、予言的な実施例として提供される。
【0135】
２つの製造方法におけるＩＬ－２１の有効性を検証する：１）元々の方法；これは、単離されたＣＤ５６＋細胞を１４～１７日にわたり異なる種類のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の処理下または非処理下で培養することを伴った（但し、その後の再拡大増殖は無し）。２）再刺激方法；これは、元々の方法からの凍結保存された拡大増殖されたＮＫ細胞を異なる種類のフィーダー細胞と共にＩＬ－２１の処理下または非処理下で培養することを伴った。異なる種類のフィーダー細胞および製造方法を表１および図１に示し、これはＮＫ細胞拡大増殖のための一般的なフィーダー細胞の代表であると理解される。
【表5】
【0136】
本実施例により提供される結果は、一般に比の範囲にわたるフィーダー細胞、貯蔵時間、およびＩｌ－２１が存在する中での追加の成分（例えば追加のサイトカイン）の代表的なものであることが理解される。
【0137】
実施例１：出発材料の単離および元々の方法
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト血液から得た。単離されたＰＢＭＣをＣＤ５６＋細胞選択のために使用した。ＰＢＭＣを、１．０７７ｇ／ｍＬのＦｉｃｏｌｌを用いる密度勾配遠心分離により単離し、ＰＢＳで数回洗浄し、ＣＤ５６マイクロビーズ試薬と共にＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｒｉｎｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて再懸濁した。製造者の使用説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にしたがって磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）システムを使用することによりＣＤ５６＋細胞を選択した。ＣＤ５６＋選択細胞を初期ＮＫ細胞培養培地に５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１の有りまたは無しで再懸濁した。懸濁された細胞を、１００Ｇｙで照射されたフィーダー細胞、ＬＣＬ＋ＫＬ－１、Ｋ５６２またはＰＢＭＣを添加した後の培養フラスコに播種し、次に３７℃、５％のＣＯ２で６または７日間培養した。各フィーダータイプを用いる細胞培養のための特有の条件は以下の表に示される通りである。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト血液から得た。単離されたＰＢＭＣをＣＤ５６＋細胞選択のために使用した。ＰＢＭＣを、１．０７７ｇ／ｍＬのＦｉｃｏｌｌを用いる密度勾配遠心分離により単離し、ＰＢＳで数回洗浄し、ＣＤ５６マイクロビーズ試薬と共にＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｒｉｎｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて再懸濁した。製造者の使用説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にしたがって磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）システムを使用することによりＣＤ５６＋細胞を選択した。ＣＤ５６＋選択細胞を初期ＮＫ細胞培養培地に５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１の有りまたは無しで再懸濁した。懸濁された細胞を、１００Ｇｙで照射されたフィーダー細胞、ＬＣＬ＋ＫＬ－１、Ｋ５６２またはＰＢＭＣを添加した後の培養フラスコに播種し、次に３７℃、５％のＣＯ２で６または７日間培養した。各フィーダータイプを用いる細胞培養のための特有の条件は以下の表に示される通りである。
【表6】
【0138】
培養６または７日目に、細胞を培養フラスコから遠心分離により収集し、細胞数を評価した。細胞をＮＫ細胞培養培地に再懸濁し、培養バッグに播種し、次に３７℃、５％のＣＯ２で１７または１８日まで培養した。３または４日毎に、細胞を新たな培地で継代した。
【0139】
実施例２：Ｄ１４の細胞の凍結保存
培養１４または１５日目に、細胞を培養バッグから遠心分離により収穫し、細胞数を評価した。細胞を、９０％のＦＢＳ、１０％のＤＭＳＯを含有し、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２有りまたは無しの培地に再懸濁し、バイアル中に５．０～１０．０×１０６細胞／ｍＬの濃度でアリコート化し、次に細胞を－１９６℃液体窒素タンクで１週、１、３、６、１２、２４か月およびより長期にわたり凍結保存した。
培養１４または１５日目に、細胞を培養バッグから遠心分離により収穫し、細胞数を評価した。細胞を、９０％のＦＢＳ、１０％のＤＭＳＯを含有し、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２有りまたは無しの培地に再懸濁し、バイアル中に５．０～１０．０×１０６細胞／ｍＬの濃度でアリコート化し、次に細胞を－１９６℃液体窒素タンクで１週、１、３、６、１２、２４か月およびより長期にわたり凍結保存した。
【0140】
実施例３：再刺激方法の凍結された細胞の解凍および細胞培養
元々の方法からのクライオ保存された細胞を３７℃の水浴中で解凍し、各フィーダー細胞条件用の補充物を含有し、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１有りまたは無しの初期ＮＫ細胞培養培地に再懸濁した。懸濁された細胞を、１００Ｇｙで照射されたフィーダー細胞、ＬＣＬ＋ＫＬ－１、Ｋ５６２または自己ＰＢＭＣを添加した後の培養フラスコに播種し、次に３７℃、５％のＣＯ２で６または７日間培養した。この過程を再刺激方法と呼んだ。培養６または７日目に、細胞を培養フラスコから遠心分離により収集し、細胞数を評価した。細胞をＮＫ細胞培養培地に再懸濁し、培養バッグに播種し、次に３７℃、５％のＣＯ２で１７または１８日まで培養した。３または４日毎に、細胞を新たな培地で継代した。総細胞培養期間は、Ｄ０の元々の方法から再刺激過程を通じて最終収穫まで３１～３３日を要した。
元々の方法からのクライオ保存された細胞を３７℃の水浴中で解凍し、各フィーダー細胞条件用の補充物を含有し、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１有りまたは無しの初期ＮＫ細胞培養培地に再懸濁した。懸濁された細胞を、１００Ｇｙで照射されたフィーダー細胞、ＬＣＬ＋ＫＬ－１、Ｋ５６２または自己ＰＢＭＣを添加した後の培養フラスコに播種し、次に３７℃、５％のＣＯ２で６または７日間培養した。この過程を再刺激方法と呼んだ。培養６または７日目に、細胞を培養フラスコから遠心分離により収集し、細胞数を評価した。細胞をＮＫ細胞培養培地に再懸濁し、培養バッグに播種し、次に３７℃、５％のＣＯ２で１７または１８日まで培養した。３または４日毎に、細胞を新たな培地で継代した。総細胞培養期間は、Ｄ０の元々の方法から再刺激過程を通じて最終収穫まで３１～３３日を要した。
【0141】
実施例４：集団倍加レベルおよび細胞増殖
６つの異なる条件に従うＮＫ細胞培養を、ＣＤ５６＋細胞を使用して、図１および表３に示される実験設計に基づいて実行した。それは、フィーダー細胞としての照射されたＬＣＬおよびＫＬ－１と共培養されたＮＫ細胞としての、実験設計タイプ１の結果を示す。過程のための特定の条件は、表３に示される通りである。
６つの異なる条件に従うＮＫ細胞培養を、ＣＤ５６＋細胞を使用して、図１および表３に示される実験設計に基づいて実行した。それは、フィーダー細胞としての照射されたＬＣＬおよびＫＬ－１と共培養されたＮＫ細胞としての、実験設計タイプ１の結果を示す。過程のための特定の条件は、表３に示される通りである。
【表7】
【0142】
ＮＫ細胞の細胞拡大増殖率を、播種細胞数と比べた拡大増殖倍数により、および３．３２（ｌｏｇＮ － ｌｏｇＮｏ）（ここで、Ｎは各継代の終わりの細胞の数であり、Ｎｏは最初にプレーティングされた細胞の数である）として算出される各継代日における集団倍加レベル（ＰＤＬ）により評価した。あらゆる培養工程におけるＮＫ細胞の数は、細胞をトリパンブルーで染色することにより評価した。
【0143】
２人の異なるドナーからの製造バッチをＰＤＬおよび拡大増殖倍数について比較した。表４、表５、および図２Ａ～３Ｂに示されるように、ＩＬ－２１有りの元々の方法による１人のドナーからのＮＫ細胞のＰＤＬおよび拡大増殖倍数は、ＩＬ－２１無しよりも高い増殖率であることが示された。しかし、他のドナーからのバッチは両方の条件において類似した増殖率を示した。
【表8】
【表9】
【0144】
元々の方法からのＤ１４における凍結保存された細胞を、フィーダー細胞と共にＩＬ－２１の処理または非処理により再刺激し、１７または１８日まで培養した。総細胞培養期間は、Ｄ０の元々の方法から再刺激過程を通じて最終収穫まで３１～３３日を要した（図１に示される）。
【0145】
２人のドナーからのいくつかの製造バッチをＰＤＬおよび拡大増殖倍数について比較した。表６、表７、および図４Ａ～５Ｂに示されるように、ＩＬ－２１有りでの再刺激方法のＮＫ細胞のＰＤＬおよび拡大増殖倍数は、ＩＬ－２１無しの条件よりも高い増殖率を提供した。そのため、ＩＬ－２１は、特に第１のラウンドの拡大増殖において、より有効なその後の拡大増殖工程を可能とするために非常に有用である。
【0146】
ドナー２からのＮＫ細胞は、元々の方法においてＩＬ－２１有りおよび無しの間で増殖率における差異を実証しなかったが、再刺激方法によるＩＬ－２１条件における増殖率は
、３１日目においてＩＬ－２１無しの条件よりも高いことが示された。
、３１日目においてＩＬ－２１無しの条件よりも高いことが示された。
【表10】
【表11】
【0147】
実施例５：ＮＫ細胞の純度
ＮＫ細胞は、ＣＤ５６を発現し、ＣＤ３を欠くことが公知である。拡大増殖の前ならびに元々の方法および再刺激方法による拡大増殖の後のＮＫ細胞の純度を調べるために、フローサイトメトリー分析を適用した。ＮＫ細胞を抗ＣＤ５６－ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ３－
ＰＥの蛍光色素標識抗体で染色し、次にフローサイトメトリーを使用することにより分析した。
ＮＫ細胞は、ＣＤ５６を発現し、ＣＤ３を欠くことが公知である。拡大増殖の前ならびに元々の方法および再刺激方法による拡大増殖の後のＮＫ細胞の純度を調べるために、フローサイトメトリー分析を適用した。ＮＫ細胞を抗ＣＤ５６－ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ３－
ＰＥの蛍光色素標識抗体で染色し、次にフローサイトメトリーを使用することにより分析した。
【0148】
ＮＫ細胞培養が両方の条件（ＩＬ－２１処理有りおよび無し）において元々の方法および再刺激方法により進行するにつれて、ＮＫ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３－）の割合は、２人の異なるドナーからの拡大増殖されたＮＫ細胞において急速に増加し、３１日目において９９％を上回った（表７）。他の細胞種の細胞表面マーカー、例えばＣＤ３＋、ＣＤ２０＋、およびＣＤ１４＋は、最終培養段階において非常に低い集団であることが示された（表８）。
【表12】
【表13】
【0149】
実施例６ ＮＫ細胞の細胞傷害機能
腫瘍標的細胞株に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を蛍光定量的細胞傷害性アッセイにより評価した。ＮＫ細胞を、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭで染色されたＫ－５６２細胞と１０：１、３：１、１：１、および０．５：１のＥ：Ｔ比で４時間、光保護下で共培養した。１０％のＦＢＳまたは２％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含有するＲＰＭＩ１６４０を標的細胞に加えて、自発放出および最大放出を提供した。Ｃａｌｃｅｉｎ放出アッセイのために、標的細胞とのＮＫ細胞のインキュベーション後の上清を回収し、その蛍光を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａ
ｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して評価する。特異的溶解パーセントを、式［（試験放出－自発放出）／（最大放出－自発放出）］×１００を使用して算出する。
腫瘍標的細胞株に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を蛍光定量的細胞傷害性アッセイにより評価した。ＮＫ細胞を、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭで染色されたＫ－５６２細胞と１０：１、３：１、１：１、および０．５：１のＥ：Ｔ比で４時間、光保護下で共培養した。１０％のＦＢＳまたは２％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含有するＲＰＭＩ１６４０を標的細胞に加えて、自発放出および最大放出を提供した。Ｃａｌｃｅｉｎ放出アッセイのために、標的細胞とのＮＫ細胞のインキュベーション後の上清を回収し、その蛍光を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａ
ｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して評価する。特異的溶解パーセントを、式［（試験放出－自発放出）／（最大放出－自発放出）］×１００を使用して算出する。
【0150】
元々の方法および再刺激方法による培養されたＮＫ細胞の細胞傷害性を、ＮＫ感受性標的である標準的なＫ－５６２細胞株を使用して試験した。ＩＬ－２１有りおよび無しの条件での元々の方法からの拡大増殖された細胞は、低いＥ：Ｔ比（１：１および０．５：１）においてさえＫ－５６２に対して強い細胞傷害活性を発揮した（図６～７）。しかし、再刺激方法によるＮＫ細胞の細胞傷害活性は、ＩＬ－２１処理有りおよび無しの異なる条件において異なるレベルを示した。元々の方法および再刺激方法の両方についてのＩＬ－２１処理によるＮＫ細胞は、他の条件よりも強い細胞傷害活性を発揮した（図８～１１）。
【0151】
しかし、元々の条件および再刺激条件の両方についてのＩＬ－２１非処理条件によるＮＫ細胞は、０．０５：１～３：１のＥ：Ｔ比で減少した細胞傷害活性であった。また、１０：１のＥ：Ｔ比においてＩＬ－２１処理条件よりも低いレベルの細胞傷害性を示した。
【0152】
ＩＬ－２１処理有りでの拡大増殖されたＮＫ細胞は、Ｋ－５６２細胞株に対して非常に強力な細胞傷害性を示し、元々の方法および再刺激方法により製造された両方のＮＫ細胞において類似した細胞傷害性であった（図６～１１）。図６は、Ｋ５６２細胞に対する、ＩＬ－２１有りで拡大増殖されたＮＫ細胞（ＩＬ－２１＋）の細胞傷害活性を示す。図７は、Ｋ５６２細胞に対する、ＩＬ－２１無しで拡大増殖されたＮＫ細胞（ＩＬ－２１－）の細胞傷害活性を示す。図８は、Ｋ５６２細胞に対する、ＩＬ－２１有りで拡大増殖され、ＩＬ－２１有りで再刺激されたＮＫ細胞（ＩＬ－２１＋／＋）の細胞傷害活性を示す。図９は、Ｋ５６２細胞に対する、ＩＬ－２１有りで拡大増殖され、ＩＬ－２１無しで再刺激されたＮＫ細胞（ＩＬ－２１＋／－）の細胞傷害活性を示す。図１０は、Ｋ５６２細胞に対する、ＩＬ－２１無しで拡大増殖され、ＩＬ－２１有りで再刺激されたＮＫ細胞（ＩＬ－２１－／＋）の細胞傷害活性を示す。図１１は、Ｋ５６２細胞に対する、ＩＬ－２１無しで拡大増殖され、ＩＬ－２１無しで再刺激されたＮＫ細胞（ＩＬ－２１－／－）の細胞傷害活性を示す。図１２Ａは、ＮＫ細胞の活性化受容体の表現型の比較を示す。図１２Ｂは、ＮＫ細胞の阻害およびケモカイン受容体の表現型の比較を示す。
【0153】
表面マーカー発現
ＮＫ細胞機能は、それらの表面上に発現される活性化受容体および阻害受容体の間の均衡により微細に調節される。活性化［ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＲＡＣＣ］または阻害ＮＫ受容体［ＮＫＧ２Ａ、ＫＩＲ：ＣＤ１５８ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３）、ＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ３ＤＬ１）］の発現レベルを表現型的に特徴付けるために、ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４）、または接着分子（ＣＤ６２Ｌ）を、ゲーティングされたＣＤ５６＋ ＮＫ細胞において拡大増殖の前（０日目；Ｄ０）ならびにＩＬ－２１処理有りでの１７～１８日間の元々の（旧）過程および再刺激過程による拡大増殖の後に分析した。表面受容体発現レベルを、試料中のＮＫ細胞の受容体陽性サブセットのパーセンテージとして算出した。元々の過程および再刺激過程の各段階におけるＮＫ細胞を各マーカーの蛍光色素標識された抗体で染色し、次にフローサイトメトリーを使用することにより分析する。
ＮＫ細胞機能は、それらの表面上に発現される活性化受容体および阻害受容体の間の均衡により微細に調節される。活性化［ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＲＡＣＣ］または阻害ＮＫ受容体［ＮＫＧ２Ａ、ＫＩＲ：ＣＤ１５８ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３）、ＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ３ＤＬ１）］の発現レベルを表現型的に特徴付けるために、ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４）、または接着分子（ＣＤ６２Ｌ）を、ゲーティングされたＣＤ５６＋ ＮＫ細胞において拡大増殖の前（０日目；Ｄ０）ならびにＩＬ－２１処理有りでの１７～１８日間の元々の（旧）過程および再刺激過程による拡大増殖の後に分析した。表面受容体発現レベルを、試料中のＮＫ細胞の受容体陽性サブセットのパーセンテージとして算出した。元々の過程および再刺激過程の各段階におけるＮＫ細胞を各マーカーの蛍光色素標識された抗体で染色し、次にフローサイトメトリーを使用することにより分析する。
【0154】
４人の異なるドナーについてタイプ１実験においてＩＬ－２１処理有りでの元々の過程および再刺激過程により培養された開始および最終段階（Ｄ０、Ｄ１７、およびＤ３２）からの細胞について表面受容体発現レベルを分析した。表面受容体発現レベルを、試料中のＮＫ細胞の受容体陽性サブセットのパーセンテージとして算出した。
【0155】
活性化受容体の中で、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、およびＣＲＡＣＣの発現レベルは、元々の過程（旧）により製造されたＮＫ細胞の拡大増殖の間に増加し、再刺激過程（新）による拡大増殖されたＮＫ細胞と類似していた一方、ＮＫＧ２Ｃおよび２Ｂ４の発現レベルは、両方の方法による培養拡大増殖の後に変化がなかった（図６）。阻害受容体、ＣＤ１５８ａおよびＣＤ１５８ｅの発現は、両方の過程（旧および新）による培養で概しては変化しないままであったが、ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ１５８ｂの割合は有意に増加した（図１２Ａ～Ｂ）。分析された全ての阻害受容体発現レベルは、両方の方法により製造されたＮＫ細胞において類似していた。ケモカイン受容体、例えばＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ４の発現も評価した。
【0156】
ＣＸＣＲ３＋ ＮＫ細胞の頻度は、類似した発現レベルと共に両方の方法（旧および新）によるＮＫ細胞拡大増殖の間に有意に増加した一方、ＣＸＣＲ４＋ ＮＫ細胞の頻度は、両方の方法による培養拡大増殖後に減少しており、新たな方法により製造されたＮＫ細胞においてわずかにより大きい減少であった（図１２Ａ～Ｂ）。ＣＤ６２Ｌの発現レベルは、両方の方法による拡大増殖されたＮＫ細胞においてわずかに増加していた。
【0157】
これらの結果により実証されるように、１つのセットは再拡大増殖手順を経たという事実にもかかわらず、ＩＬ２１＋およびＩＬ２１＋／＋で拡大増殖された細胞の性質は類似している。
【0158】
実施例７：ＩＬ－２１濃度
様々なＩＬ－２１濃度について、タイプ１実験設計（ＩＬ２１＋のみ、再刺激は行わない）の１０、３０、５０、および１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１有りでのＲＰＭＩ培地中の１０％のＦＢＳ、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、２０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有する初期ＮＫ細胞培養培地中に、単離されたＣＤ５６＋細胞を再懸濁した。
様々なＩＬ－２１濃度について、タイプ１実験設計（ＩＬ２１＋のみ、再刺激は行わない）の１０、３０、５０、および１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１有りでのＲＰＭＩ培地中の１０％のＦＢＳ、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、２０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有する初期ＮＫ細胞培養培地中に、単離されたＣＤ５６＋細胞を再懸濁した。
【0159】
実施例８：ＩＬ－２１濃度
１：１０：１０（ＣＤ５６＋細胞：ＬＣＬ：ＫＬ－１）、および１：２０：２０、１：３０：３０（ＩＬ２１＋のみ、再刺激は行わない）において異なる比のフィーダー細胞を用いてタイプ１実験を行った。
１：１０：１０（ＣＤ５６＋細胞：ＬＣＬ：ＫＬ－１）、および１：２０：２０、１：３０：３０（ＩＬ２１＋のみ、再刺激は行わない）において異なる比のフィーダー細胞を用いてタイプ１実験を行った。
【0160】
実施例９
この非限定的な実施例は、ＩＬ－２１は、凍結－解凍を伴うＣＤ５６＋およびＣＤ３－／ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞の拡大増殖を増強することを示す。
この非限定的な実施例は、ＩＬ－２１は、凍結－解凍を伴うＣＤ５６＋およびＣＤ３－／ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞の拡大増殖を増強することを示す。
【0161】
（１）ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の調製－１
最初に、血液ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ密度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配法）を使用して単離した。ＰＢＭＣを以下の１－１または１－２にしたがってさらに処理した。
最初に、血液ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ密度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配法）を使用して単離した。ＰＢＭＣを以下の１－１または１－２にしたがってさらに処理した。
【0162】
１－１． ＣＤ５６＋細胞単離
ＰＢＭＣをＭＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％のＨＳＡ）の添加により懸濁し、ＣＤ５６マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加えて１～２０μＬ／１．０×１０７個のＰＢＭＣを得、５～３０分間２～８℃でインキュベートした。インキュベーション後に、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて混合し、混合物を遠心分離（６００×ｇ）して細胞を沈殿させた。遠心分離後に、上清を除去し、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて細胞を再懸濁し、細胞を、カラムに連結されたＭＡＣＳ分離器に加えた。ＭＡＣＳ緩衝液をカラムに通過させて非特異的結合を除去した。カラムをＭＡＣＳ分離器から分離し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて、カラムに付着したＣＤ５６＋細胞を単離させた。
ＰＢＭＣをＭＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％のＨＳＡ）の添加により懸濁し、ＣＤ５６マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加えて１～２０μＬ／１．０×１０７個のＰＢＭＣを得、５～３０分間２～８℃でインキュベートした。インキュベーション後に、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて混合し、混合物を遠心分離（６００×ｇ）して細胞を沈殿させた。遠心分離後に、上清を除去し、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて細胞を再懸濁し、細胞を、カラムに連結されたＭＡＣＳ分離器に加えた。ＭＡＣＳ緩衝液をカラムに通過させて非特異的結合を除去した。カラムをＭＡＣＳ分離器から分離し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて、カラムに付着したＣＤ５６＋細胞を単離させた。
【0163】
１－２． ＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞単離
ＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞を以下のように単離した。ＰＢＭＣをＭＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％のＨＳＡ）の添加により懸濁し、ＣＤ３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加えて１～２０μＬ／１．０×１０７個のＰＢＭＣを得、５～３０分間２～８℃でインキュベートした。インキュベーション後に、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて混合し、混合物を遠心分離（６００×ｇ）して細胞を沈殿させた。遠心分離後に、上清を除去し、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて細胞を再懸濁し、細胞を、カラムに連結されたＭＡＣＳ分離器に加えた。ＭＡＣＳ緩衝液をカラムに通過させてＣＤ３－細胞を回収した。
ＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞を以下のように単離した。ＰＢＭＣをＭＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％のＨＳＡ）の添加により懸濁し、ＣＤ３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加えて１～２０μＬ／１．０×１０７個のＰＢＭＣを得、５～３０分間２～８℃でインキュベートした。インキュベーション後に、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて混合し、混合物を遠心分離（６００×ｇ）して細胞を沈殿させた。遠心分離後に、上清を除去し、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて細胞を再懸濁し、細胞を、カラムに連結されたＭＡＣＳ分離器に加えた。ＭＡＣＳ緩衝液をカラムに通過させてＣＤ３－細胞を回収した。
【0164】
回収されたＣＤ３－細胞にＭＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％のＨＳＡ）を加えてＣＤ３－細胞を再懸濁し、ＣＤ５６マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加えて１～２０μＬ／１．０×１０７個のＣＤ３－細胞を得、２～８℃で５～３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて混合し、混合物を遠心分離（６００×ｇ）して細胞を沈殿させた。遠心分離後に、上清を除去し、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて細胞を再懸濁し、細胞を、カラムに連結されたＭＡＣＳ分離器に加えた。ＭＡＣＳ緩衝液をカラムに通過させて非特異的結合を除去した。カラムをＭＡＣＳ分離器から分離し、１５ｍＬのコニカルチューブに移し、ＭＡＣＳ緩衝液を加えて、カラムに付着したＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞を単離させた。
【0165】
１－３．一次培養
１－１および１－２からの分離されたＣＤ５６＋細胞またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞を各々、インキュベーター中で、１００Ｇｙの照射により以前に調製されたフィーダー細胞（ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）と共にそれぞれ５００ＩＵ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－２およびＩＬ－２１の存在下で、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地中、３７℃、５％のＣＯ２で共培養した。
１－１および１－２からの分離されたＣＤ５６＋細胞またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞を各々、インキュベーター中で、１００Ｇｙの照射により以前に調製されたフィーダー細胞（ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）と共にそれぞれ５００ＩＵ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－２およびＩＬ－２１の存在下で、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地中、３７℃、５％のＣＯ２で共培養した。
【0166】
６日目に、細胞を１．０×１０５～２．０×１０６／ｍＬで３５０ｍＬの標準的なバッグに接種し、さらに４日間培養し、１０日目に細胞を１．０×１０５～２．０×１０６細胞／ｍＬで１Ｌのバッグに接種し、さらに４日間培養した。この時、比（ＣＤ５６＋細胞またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞）：（ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞）：（ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）はインキュベーションの間に１：３０：３０である。
【0167】
１－４．凍結および解凍後の二次培養
培養１（１－３）の１４日目に、培養された細胞を、９０％のＦＢＳおよび１０％のＤＭＳＯを含有する溶液に懸濁し、－１９２℃またはより低い温度で凍結して貯蔵し、培養スケジュールにしたがって３７℃の一定温度の水浴中で解凍した。
培養１（１－３）の１４日目に、培養された細胞を、９０％のＦＢＳおよび１０％のＤＭＳＯを含有する溶液に懸濁し、－１９２℃またはより低い温度で凍結して貯蔵し、培養スケジュールにしたがって３７℃の一定温度の水浴中で解凍した。
【0168】
次に、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０に、それぞれ５００ＩＵ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－２およびＩＬ－２１を、１００Ｇｙで照射されたフィーダー細胞（ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）と共に加えた。培地中に置いた後に、それを３７℃、５％のＣＯ２インキュベーター中で共培養した。
【0169】
解凍および培養後６日目に、細胞を（１．０×１０５～２．０×１０６／ｍＬで３５０ｍＬのバッグに接種し、さらに４日間インキュベートし、１０日目に細胞を１．０×１０５～２．０×１０６細胞／ｍＬで１Ｌの標準的なバッグに接種し、さらに４日間培養した。
【0170】
解凍後１４日目までの培養において細胞の増殖を持続させるために、細胞を、１００Ｇ
ｙで照射されたフィーダー細胞（ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）と共にそれぞれ５００ＩＵ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－２およびＩＬ－２１の存在下で共培養した。細胞を、１０％の添加されたＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中、インキュベーター中３７℃、５％のＣＯ２で培養した。
ｙで照射されたフィーダー細胞（ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）と共にそれぞれ５００ＩＵ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－２およびＩＬ－２１の存在下で共培養した。細胞を、１０％の添加されたＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中、インキュベーター中３７℃、５％のＣＯ２で培養した。
【0171】
解凍後２０日目に、細胞を１Ｌのバッグに１．０×１０５～２．０×１０６細胞／ｍＬで接種し、続いて４日間さらに培養し、解凍後の培養の２４日目に、細胞を１Ｌのバッグに１．０×１０５～２．０×１０６個の細胞／ｍＬで接種し、４日間さらに培養した。
【0172】
最後に、解凍後の培養の２８日目に、細胞を１Ｌのバッグに１．０×１０５～２．０×１０６個の細胞／ｍＬで接種し、続いて３～６日間さらに培養した。この時、（ＣＤ５６＋細胞またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞）：（ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞）：（ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）を１：３０：３０の比で培養した。
【0173】
（２）ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞の調製－２
１－４におけるサイトカインを添加する工程を除いて、（１）と同じ方式でナチュラルキラー細胞を調製した。
１－４におけるサイトカインを添加する工程を除いて、（１）と同じ方式でナチュラルキラー細胞を調製した。
【0174】
（３）比較例。サイトカイン処理工程を除外したナチュラルキラー細胞の調製
１－３および１－４におけるサイトカイン（ＩＬ－２１）を添加する工程を除いて、（１）と同じ方式でナチュラルキラー細胞を調製した。
１－３および１－４におけるサイトカイン（ＩＬ－２１）を添加する工程を除いて、（１）と同じ方式でナチュラルキラー細胞を調製した。
【0175】
（４）ＮＫ細胞増殖能力の確認
（１）～（３）の方法により培養されたＮＫ細胞の増殖能力を測定した。図１３Ａに見ることができるように、一次培養の間にサイトカイン処理を行わなかった場合（ＩＬ－２１ －／－）（上記（３）を参照）、凍結および解凍過程後に臨床応用のための十分な数のＮＫ細胞は製造されないことが見出された（図１３Ａ）。他方、細胞をサイトカインで処置した場合（ＩＬ－２１ ＋／＋；上記（１）を参照）、凍結および解凍過程後であっても臨床応用のために十分な数でＮＫ細胞が製造され、これらの結果は、凍結および解凍過程後にサイトカイン処理した場合だけではなかった。凍結および解凍後に細胞をサイトカインで処理しなかった場合（ＩＬ－２１ ＋／－；上記（２）を参照）、凍結および解凍後にサイトカインで処理された場合と同様に良好にＮＫ細胞は拡大増殖された（図１３Ｂ）。
（１）～（３）の方法により培養されたＮＫ細胞の増殖能力を測定した。図１３Ａに見ることができるように、一次培養の間にサイトカイン処理を行わなかった場合（ＩＬ－２１ －／－）（上記（３）を参照）、凍結および解凍過程後に臨床応用のための十分な数のＮＫ細胞は製造されないことが見出された（図１３Ａ）。他方、細胞をサイトカインで処置した場合（ＩＬ－２１ ＋／＋；上記（１）を参照）、凍結および解凍過程後であっても臨床応用のために十分な数でＮＫ細胞が製造され、これらの結果は、凍結および解凍過程後にサイトカイン処理した場合だけではなかった。凍結および解凍後に細胞をサイトカインで処理しなかった場合（ＩＬ－２１ ＋／－；上記（２）を参照）、凍結および解凍後にサイトカインで処理された場合と同様に良好にＮＫ細胞は拡大増殖された（図１３Ｂ）。
【0176】
実施例１０
様々な拡大増殖および凍結および再凍結過程の一部の実施形態のさらなる結果を図１４Ａおよび図１４Ｂに示す。図１４Ａは、結果としてもたらされたＰＤＬ（集団倍加レベル）を示し、拡大増殖の間の異なる期間の一部の実施形態を描写する。図１４Ｂは、該実施例についての結果としてもたらされた拡大増殖倍数を描写する。
様々な拡大増殖および凍結および再凍結過程の一部の実施形態のさらなる結果を図１４Ａおよび図１４Ｂに示す。図１４Ａは、結果としてもたらされたＰＤＬ（集団倍加レベル）を示し、拡大増殖の間の異なる期間の一部の実施形態を描写する。図１４Ｂは、該実施例についての結果としてもたらされた拡大増殖倍数を描写する。
【0177】
この実施例では、ＮＫ細胞は、少なくとも１回の凍結後に複数回、刺激または拡大増殖され得るのかどうか、およびＮＫ細胞の増殖は、単純に維持されるのではなく、停止および再開され得るのかどうかを分析する。ＮＫ細胞を最初に１４日培養した。ＮＫ細胞をＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）およびフィーダー細胞で２回、最初の６日の期間（０～６日目）の間に３日の間隔で処理した。
【0178】
この第１の１４日の拡大増殖後に細胞を９０日間凍結し、次に解凍してさらに１４日間培養した。ＮＫ細胞を再びＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）およびフィーダー細胞で２回、この第２の拡大増殖の間の最初の６日の期間（０～６日目）の間に３日の間隔で処理した。
【0179】
細胞を３回目にＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）およびフィーダー細胞で２回、この第２の拡大増殖の間の最初の６日の期間（０～６日目）の間に３日の間隔で再刺激することにより細胞を最後に１８日間、再培養した。
【0180】
ＮＫ細胞の拡大増殖を４６日の培養にわたりモニターした。図１４Ａおよび図１４Ｂに示されるように、フィーダー細胞およびＩＬ－２１で２回またはより多く処理された場合、細胞を凍結した後であっても、ＮＫ細胞は各刺激後に著しい拡大増殖を呈した。
【0181】
用語
例示的な実施形態の以上の記載は、実例および説明の目的のためにのみ提示されたものであり、網羅的であることも、開示される正確な形態に本発明を限定することも意図されない。多くの改変およびバリエーションが上記の教示に照らして可能である。上記に開示される実施形態の特有の特徴および態様の様々な組合せまたは部分的組合せを行うことができ、それらは依然として本発明の１つまたは複数に入ることが想定される。さらに、実施形態と関連した任意の特定の特質、態様、方法、特性、特徴、質、属性、または要素などの本明細書の開示は、本明細書に記載される全ての他の実施形態において使用され得る。よって、開示される実施形態の様々な特徴および態様は、開示される発明の種々の態様を形成するために互いに組み合わせまたは置換することができることが理解されるべきである。そのため、本明細書に開示される本発明の範囲は、上記の特定の開示される実施形態に限定されるべきではないことが意図される。さらに、本発明は様々な改変、および代替的な形態が可能であるが、その特有の例が図面に示され、本明細書に詳細に記載されている。しかしながら、本発明は、開示される特定の形態または方法に限定されず、その反対に、本発明は、記載される様々な実施形態および添付の請求項の精神および範囲に入る全ての改変、均等物、および代替物をカバーすることが理解されるべきである。本明細書に開示される任意の方法は、記載される順序で行われる必要はない。本明細書に開示される方法は、実施者により為されるある特定の行為を含むが、それらはまた、明示的または暗示的のいずれかでの、それらの行為の任意の第三者の指示を含むことができる。本明細書に開示される範囲はまた、任意および全ての重複、部分的範囲、およびそれらの組合せを包含する。
例示的な実施形態の以上の記載は、実例および説明の目的のためにのみ提示されたものであり、網羅的であることも、開示される正確な形態に本発明を限定することも意図されない。多くの改変およびバリエーションが上記の教示に照らして可能である。上記に開示される実施形態の特有の特徴および態様の様々な組合せまたは部分的組合せを行うことができ、それらは依然として本発明の１つまたは複数に入ることが想定される。さらに、実施形態と関連した任意の特定の特質、態様、方法、特性、特徴、質、属性、または要素などの本明細書の開示は、本明細書に記載される全ての他の実施形態において使用され得る。よって、開示される実施形態の様々な特徴および態様は、開示される発明の種々の態様を形成するために互いに組み合わせまたは置換することができることが理解されるべきである。そのため、本明細書に開示される本発明の範囲は、上記の特定の開示される実施形態に限定されるべきではないことが意図される。さらに、本発明は様々な改変、および代替的な形態が可能であるが、その特有の例が図面に示され、本明細書に詳細に記載されている。しかしながら、本発明は、開示される特定の形態または方法に限定されず、その反対に、本発明は、記載される様々な実施形態および添付の請求項の精神および範囲に入る全ての改変、均等物、および代替物をカバーすることが理解されるべきである。本明細書に開示される任意の方法は、記載される順序で行われる必要はない。本明細書に開示される方法は、実施者により為されるある特定の行為を含むが、それらはまた、明示的または暗示的のいずれかでの、それらの行為の任意の第三者の指示を含むことができる。本明細書に開示される範囲はまた、任意および全ての重複、部分的範囲、およびそれらの組合せを包含する。
【0182】
実施形態は、当業者が本発明および様々な実施形態を利用することを促進するように本発明の原理およびそれらの実際的応用を説明するために選択および記載されており、特定の使用に適するような様々な改変が想定される。以上の記載およびそこに記載される例示的な実施形態以外の、添付の請求項によりその発明が定義される代替的な実施形態が当業者に明らかとなるであろう。
【0183】
条件的な表現、例えば「～できる」（ｃａｎ）、「～し得る」（ｃｏｕｌｄ）、「～の可能性がある」（ｍｉｇｈｔ）、または「～であってもよい」（ｍａｙ）は、他に特に記載されないか、または使用された文脈内で他に理解されなければ、ある特定の実施形態はある特定の特徴、要素、および／または工程を含むが、他の実施形態はそれを含まないことを伝えることが一般に意図される。そのため、そのような条件的な表現は、特徴、要素、および／または工程が１つまたは複数の実施形態のために何らかの意味で要求されることを含意することは一般に意図されない。
【0184】
「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「含む」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、および「有する」などの用語は同義であり、包含的にオープンエンドの様式で使用され、追加の要素、特徴、行為、および操作などを除外しない。また、「または」という用語は、包含的な意味（排他的な意味ではない）で使用され、そのため、例えば、要素のリストを接続するために使用される場合、「または」という用語は、リスト中の要素の１つ、一部、または全
てを意味する。
てを意味する。
【0185】
本明細書に開示される範囲はまた、任意および全ての重複、部分的範囲、およびそれらの組合せを包含する。「～まで」、「少なくとも～」、「～より多い」、「～より少ない」、および「～の間」などの表現は、記載される数を含む。
【0186】
「おおよそ」、「約」、および「実質的に」などの用語により先行される数は、本明細書において使用される場合、記載される数（例えば、約１０％＝１０％）を含み、依然として所望の機能を行いまたは所望の結果を達成する記載される量に近い値も表す。例えば、「おおよそ」、「約」、および「実質的に」という用語は、記載される量の１０％以内、５％以内、１％以内、０．１％以内、および０．０１％以内の量を指すことができる。
【0187】
「一般に」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の値、量、または特徴を主に含むまたは主にその傾向がある値、量、または特徴を表す。例として、ある特定の実施形態において、「一般に均一な」という用語は、正確に均一から２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、および０．０１％未満だけ逸脱した値、量、または特徴を指す。
【0188】
本明細書に開示される範囲はまた、任意および全ての重複、部分的範囲、およびそれらの組合せを包含する。「～まで」、「少なくとも～」、「～より多い」、「～より少ない」、および「～の間」などの表現は、記載される数を含む。「約」または「おおよそ」などの用語により先行される数は、記載される数を含む。例えば、「約５．０ｃｍ」は「５．０ｃｍ」を含む。
【0189】
一部の実施形態は、模式図との関連で記載されている。しかしながら、模式図は縮尺通りに描かれていないことが理解されるべきである。距離は単に実例的なものであり、図示されるデバイスの実際の寸法および配置に対する正確な関係性を必ずしも持たない。
【0190】
本開示の目的のために、ある特定の態様、利点、および新規の特徴が本明細書に記載される。必ずしも全てのそのような利点が任意の特定の実施形態にしたがって達成され得るわけではないことが理解されるべきである。そのため、例えば、本開示は、本明細書において教示または示唆され得るような他の利点を必ずしも達成することなく本明細書において教示されるような１つの利点または利点の群を達成する方式で具現化または実行され得ることを当業者は認識する。
【0191】
さらに、実例的な実施形態が本明細書に記載されているが、同等の要素、改変、省略、組合せ（例えば、様々な実施形態にわたる態様の組合せ）、適合および／または変更を有する任意および全ての実施形態の範囲が、本開示に基づいて当業者により認められる。請求項における限定は、請求項において用いられた表現に基づいて広く解釈されるべきであり、本明細書または出願手続きの間に記載された例に限定されず、これらの例は非排他的であるとして解釈されるべきである。さらに、開示される過程および方法の行為は、行為の再順序付けおよび／または追加の行為の挿入および／または行為の欠失を含めて、任意の方式で改変されてもよい。したがって、本明細書および実施例は実例的なものとしてのみ考慮され、真の範囲および精神は請求項およびそれらの均等の全範囲により指し示されることが意図される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【国際調査報告】