知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2023-505137ピノセンブリンジヒドロカルコン及びその組成物並びに農薬としてのそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-08
(54)【発明の名称】ピノセンブリンジヒドロカルコン及びその組成物並びに農薬としてのそれらの使用
(51)【国際特許分類】
A01N 35/02 20060101AFI20230201BHJP
A01N 25/02 20060101ALI20230201BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20230201BHJP
【ＦＩ】
A01N35/02
A01N25/02
A01P3/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022532706
(86)(22)【出願日】2020-12-02
(85)【翻訳文提出日】2022-07-26
(86)【国際出願番号】 IL2020051239
(87)【国際公開番号】W WO2021111437
(87)【国際公開日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】102019000022740
(32)【優先日】2019-12-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522048786
【氏名又は名称】メタボリック インサイツ エルティーディー．
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ ＩＮＳＩＧＨＴＳ ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パニック、ダビデ
(72)【発明者】
【氏名】コルマン、イド
【テーマコード（参考）】
4H011
【Ｆターム（参考）】
4H011AA01
4H011BB05
4H011DA13
4H011DC05
4H011DD03
4H011DD04
4H011DE15
4H011DE17
(57)【要約】
ピノセンブリンジヒドロカルコン又はその農業的に許容され得る塩を有効農薬成分として含む組成物が提供される。植物、植物器官、植物部分又は植物繁殖材料への植物病原体の侵襲の事例を防除するため、予防するため、低減するため、又は根絶するための方法がさらに提供され、その方法は、植物、植物部分、植物器官若しくは植物繁殖材料又は前記植物の周囲の土壌に、農薬有効量の、ピノセンブリンジヒドロカルコン又はそれを含む農薬組成物を含む活性な作用物質を適用する工程を含み、前記植物病原体は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ及びＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａから選択されるＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｃｅａｅ科の属；Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ科のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｌｅｓ；Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ綱のＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ；並びにＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓから選択されるＧａｍｍａ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの目から選択されるメンバーである。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
植物、植物器官、植物部分又は植物繁殖材料への植物病原体の侵襲の事例を防除するため、予防するため、低減するため、又は根絶するための方法であって、前記方法は、植物、植物部分、植物器官若しくは植物繁殖材料又は前記植物の周囲の土壌に、農薬有効量のピノセンブリンジヒドロカルコン、又は農薬有効量のピノセンブリンジヒドロカルコンを含む農薬組成物を適用する工程を含み、前記植物病原体は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ及びＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａから選択されるＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｃｅａｅ科の属；Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ科のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｌｅｓ；Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ綱のＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ；並びにＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓから選択されるＧａｍｍａ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの目から選択されるメンバーである、方法。
【請求項2】
前記植物病原体が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属のメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ属の植物病原体が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｖｅｎａｃｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂｕｂｉｇｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｉｒｃｉｎａｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｌａｎｇｓｅｔｈｉａｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｉｎｃｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ及びＦｕｓａｒｉｕｍ ｖｉｒｇｕｌｉｆｏｒｍｅから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記植物病原体が、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属のメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属の植物病原体が、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｂｕｌｂｏｒｕｍ（Ｗａｋｋｅｒ）Ｓａｃｃ．、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ Ｆ．Ｔ．Ｂｅｎｎ．、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｍｉｎｏｒ Ｊａｇｇｅｒ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｒｉｃｉｎｉ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ（Ｌｉｂ．）ｄｅ Ｂａｒｙ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｐｅｒｍｏｐｈｉｌａ Ｎｏｂｌｅ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｕｌｃａｔｅ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ Ｅｒｉｋｓｓ．及びＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｖｅｒａｔｒｉから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記植物病原体が、Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ科のメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ科の植物病原体が、Ｐｙｔｈｉｕｍ属のメンバーである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記Ｐｙｔｈｉｕｍ属の植物病原体が、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｃａｎｔｈｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｃａｎｔｈｏｐｈｏｒｏｎ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｃｒｏｇｙｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｄｈａｅｒｅｎｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｍａｓｃｕｌｉｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｎａｎｄｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｎｇｕｓｔａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｌｅｒｏｔｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｑｕａｔｉｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｒｒｈｅｎｏｍａｎｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｔｔｒａｎｔｈｅｒｉｄｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｂｉｆｕｒｃａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｂｏｒｅａｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｂｕｉｓｍａｎｉａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｂｕｔｌｅｒｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｍｕｒａｎｄｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｍｐａｎｕｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｎａｒｉｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｒｂｏｎｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｒｏｌｉｎｉａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｈａｍａｅｈｙｐｈｏｎ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｈｏｎｄｒｉｃｏｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｏｌｏｒａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｏｎｔｉｇｕａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｒｙｐｔｏｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｙｓｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｌｉｃｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｉｃｌｉｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｉｍｏｒｐｈｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｉｓｓｉｍｉｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｉｓｓｏｔｏｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｅｍｉｎｅｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｅｒｉｎａｃｅｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｆｌｅｖｏｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｌｏｍｅｒａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｎｄｉｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｈｅｌｉｃａｎｄｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｈｅｌｉｃｏｉｄｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｈｙｄｎｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｈｙｐｏｇｙｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｗａｙａｍａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｊａｓｍｏｎｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｋｕｎｍｉｎｇｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｌｉｔｏｒａｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｌｏｎｇａｎｄｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｌｏｎｇｉｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｌｕｔａｒｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｍｉｌｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｒｓｕｐｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｓｔｏｐｈｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｅｇａｃａｒｐｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｉｄｄｌｅｔｏｎｉｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｉｎｕｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｏｎｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｏｎｔａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｕｌｔｉｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｙｒｉｏｔｙｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｎａｇａｉｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｎｕｎｎ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｅｄｏｃｈｉｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｋａｎｏｇａｎｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｌｉｇａｎｄｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｏｐａｐｉｌｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｒｎａｃａｒｐｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｒｔｈｏｇｏｎｏｎ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｓｔｒａｃｏｄｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐａｃｈｙｃａｕｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐａｃｈｙｃａｕｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐａｄｄｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐａｒｏｅｃａｎｄｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｅｃｔｉｎｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｅｒｉｉｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｅｒｉｐｌｏｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｅｒｎｉｃｉｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｅｒｐｌｅｘｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｈｒａｇｍｉｔｉｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｌｅｒｏｔｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｌｕｒｉｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｏｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｏｌｙｍａｓｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｏｒｐｈｙｒａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｒｏｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｕｌｃｈｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｙｒｉｌｏｂｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｑｕｅｒｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒａｄｉｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒａｍｉｆｉｃａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒｈｉｚｏ－ｏｒｙｚａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒｏｓｔｒａｔｉｆｉｎｇｅｎｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒｏｓｔｒａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓａｌｐｉｎｇｏｐｈｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｅｉｃｈｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｅｇｎｉｔｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｅｃｕｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｉｎｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｔｅｒｉｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｔｉｐｉｔａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｕｌｃａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ ｖａｒ．ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｎｃｉｎｕｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｎｄｕｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｖａｎｔｅｒｐｏｏｌｉｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｖｉｎｉｆｅｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｖｉｏｌａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｖｏｌｕｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｚｉｎｇｉｂｅｒｉｓ及びＰｙｔｈｉｕｍ ｚｉｎｇｉｂｅｒｕｍから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記植物病原体が、Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ綱のメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記植物病原体が、Ｃａｎｔｈａｒｅｌｌａｌｅｓ目のメンバーである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記Ｃａｎｔｈａｒｅｌｌａｌｅｓ目の植物病原体が、Ｃｅｒａｔｏｂａｓｉｄｉａｃｅａｅ科のメンバーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記Ｃｅｒａｔｏｂａｓｉｄｉａｃｅａｅ科の植物病原体が、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属のメンバーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属の植物病原体が、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｂａｔａｔｉｃｏｌａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃａｒｏｔａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｒｏｃｏｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｇｏｏｄｙｅｒａｅ－ｒｅｐｅｎｔｉｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ及びＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｒａｍｉｃｏｌａから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記植物病原体が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目のメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記植物病原体が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科のメンバーである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の植物病原体が、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のメンバーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の植物病原体が、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒａｔｏｖｏｒｕｍ及びＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｒｏｉｄｅａｒｕｍから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記植物病原体が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目のメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目の植物病原体が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科のメンバーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科の植物病原体が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のメンバーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の植物病原体が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
ピノセンブリンジヒドロカルコン又はその組成物が、噴霧、浸漬、包帯、コーティング、ペレッティング又は浸すことによって前記植物、植物部分、植物器官若しくは植物繁殖材料又は前記植物の周囲の土壌に適用される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記組成物が、ピノセンブリンジヒドロカルコンを１０ｐｐｍ～２０００ｐｐｍ、例えば、１００～５００ｐｐｍ及び１００、２００、３００ｐｐｍの濃度で含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
ピノセンブリンジヒドロカルコン又はその農業的に許容され得る塩を有効農薬成分として含む、農薬組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１９年１２月２日出願のイタリア特許出願第１０２０１９００００２２７４０号に対する優先権の利益を主張する。この特許出願の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
本願は、２０１９年１２月２日出願のイタリア特許出願第１０２０１９００００２２７４０号に対する優先権の利益を主張する。この特許出願の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【0002】
［技術分野］
本発明は、概して、農業利用のための殺真菌特性及び殺菌特性を有する化合物に関する。
本発明は、概して、農業利用のための殺真菌特性及び殺菌特性を有する化合物に関する。
【背景技術】
【0003】
植物病原体及び植物病は、現代農業の生産性に対して大きな課題となっている。
【0004】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ属種は、子嚢菌綱の系統学的系列に属する糸状菌の大きな属である。Ｆｕｓａｒｉｕｍの多くの種は、植物に対して病原性であり、経済的に重要な植物、主に野菜の萎凋（ｗｉｌｔ）又は「腐れ（ｒｏｔ）」のような深刻な病気の原因となる。さらに、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種は、穀類に感染して、トウモロコシにおいて頭枯れ（ｈｅａｄ ｂｌｉｇｈｔ）及び穂腐れ（ｅａｒ ｒｏｔ）を引き起こし、ある特定の条件下においてマイコトキシンを蓄積させる（Ｊ．Ｅ．Ｅ．Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｙ．Ｓ．Ｃｌａｒｋ ａｎｄ Ａ．Ｅ．Ｂｕｃｋｌｅ，１９９８）。
【0005】
土壌伝染性植物病原体は、農業作物に対して重大な被害をもたらす。植物病原性真菌であるＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属種は、担子菌綱の系統学的系列に属し、ブラウンパッチ、実生の立ち枯れ病、根腐れ及び腹腐れなどの広範囲の商業的に重大な植物病の原因となる。植物におけるすべてのリゾクトニア病及びその後の二次感染は、防除が難しい（Ｅｒｌａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属種の適切な防除は、イネ及び各種野菜などの様々な農業作物の生産性にとって極めて重要である。
【0006】
Ｐｙｔｈｉｕｍ属種は、タバコ、トマト、マスタード、トウガラシ及びクレソンの実生の広範な「立ち枯れ病」（「ｄｕｍｐｌｉｎｇ ｏｆｆ」病）の原因となる卵菌綱と呼ばれる真核微生物の系統学的系列に属する植物病原性の真菌様生物である（Ｍａｒｔｉｎ＆Ｌｏｐｅｒ，２０１０）。
【0007】
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属種は、子嚢菌綱の系統学的系列に属する植物病原性真菌である。Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属種は、多くの植物宿主（そのほとんどが野菜である）において白カビ病と呼ばれる病気の原因となる（ＡＮＲ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ８０４２．Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｄｉｓｅａｓｅｓ－ＩＳＢＮ ９７８－１－６０１０７－２２０－７）。
【0008】
Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍは、栽培中、輸送中及び貯蔵中に多くの野菜（キャベツ、ジャガイモ、タマネギ、ラディッシュなど）において軟腐病を引き起こし、主に収穫後の貯蔵中にかなりの経済的損害をもたらす、Ｇａｍｍａ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの系統学的系列に属する細菌性の植物病原体である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
【0009】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種は、系統発生系列のＧａｍｍａ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａにも属する植物病原菌属である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種は、経済的に重要な作物植物及び果樹において、パースニップ及びトマトにおける髄壊死、イネにおける褐色斑点病及び葉鞘褐色腐敗病、アーモンドにおける細菌性かいよう病（ｂａｃｔｅｉａｌ ｃａｎｋｅｒ）、並びにオリーブにおけるオリーブがんしゅ病（ｏｌｉｖｅ ｋｎｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ）などの葉及び茎の病変をもたらす（Ｍｏｏｒｅ Ｌ．Ｗ．，１９８８；Ｈｏｆｔｅ Ｍ．ａｎｄ Ｄｅ Ｖｏｓ Ｐ．，２００６）。作物植物におけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種の管理について種々の方法が試験され、それらの方法としては、栽培上の管理、宿主抵抗性、微生物アンタゴニストによる生物学的防除、及び化学的防除が挙げられる。それらのいずれも完全な防除はできない。
【0010】
これらの病気から作物を保護する目的で利用可能な活性成分の数は、病原体の抵抗性が高まっていること、気候条件が不安定であること、及び規制圧力が高まっていることに起因して、年々減少している。新規の化学分子に基づく新しい活性成分が、作物保護の解決法を開発するための有望な手段となる。
【発明の概要】
【0011】
１つの態様において、本発明は、ピノセンブリンジヒドロカルコン又はその農業的に許容され得る塩を有効農薬成分として含む農薬組成物に関する。
【0012】
別の態様において、本発明は、植物、植物器官、植物部分又は植物繁殖材料への植物病原体の侵襲又はその事例を防除するため、予防するため、低減するため、又は根絶するための方法を提供し、その方法は、植物、植物器官若しくは植物繁殖材料、又は前記植物の周囲の土壌に、下記で述べる実施形態のうちのいずれか１つにおいて定義されるような、農薬有効量のピノセンブリンジヒドロカルコン又は病害に対して有効量のピノセンブリンジヒドロカルコンを含む農薬組成物を適用する工程を含み、前記植物病原体は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ及びＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａから選択されるＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｃｅａｅ科の属；Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ科のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｌｅｓ；Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ綱のＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ；並びにＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓから選択されるＧａｍｍａ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの目から選択されるメンバーである。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ接種の３週間後の生存パーセンテージとして測定された、３つの独立した実験におけるキュウリ実生の生存に対するピノセンブリンジヒドロカルコン（ＰＤＣ）の効果を示している。＊は、ｐ値＜０．０５を意味し、＊＊は、ｐ値が＜０．０１であることを意味し、＊＊＊は、ｐ値が＜０．００１であることを意味する。製剤３－実施例７を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明によれば、ピノセンブリンジヒドロカルコンは、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｃｅａｅ科の２つの属；Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ科のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｌｅｓ；Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ綱のＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ；及びＧａｍｍａ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの２つの異なる目に対する強力な農薬であることが見出された。
【0015】
ピノセンブリンジヒドロカルコンは、カルコンＣ－グリコシドというクラスのメンバーである。ＣＡＳ登録では、ピノセンブリンジヒドロカルコンを、以下の別名：１－プロパノン、３－フェニル－１－（２，４，６－トリヒドロキシフェニル）、３－フェニル－１－（２，４，６－トリヒドロキシフェニル）－１－プロパノン及び２’，４’，６’－トリヒドロキシジヒドロカルコンも有する３－フェニル－１－（２，４，６－トリヒドロキシフェニル）プロパン－１－オンとして特定している。ＣＡＳ登録番号は、１０８８－０８－０である。
【0016】
したがって、本発明は、１つの態様において、ピノセンブリンジヒドロカルコン又はその農業的に許容され得る塩を有効農薬成分として含む農薬組成物に関する。
【0017】
ある特定の実施形態において、農薬組成物は、農業的に好適な又は農業的に許容され得る溶媒又は可溶化剤をさらに含む。
【0018】
ある特定の実施形態において、農業的に許容され得る溶媒又は可溶化剤は、ピノセンブリンジヒドロカルコンを溶解又は可溶化できる水混和性溶媒である。
【0019】
ある特定の実施形態において、ピノセンブリンジヒドロカルコンを溶解又は可溶化できる水混和性溶媒は、極性溶媒、例えば、アルコール、ケトン、ラクトン、ケトアルコール、グリコール、グリコエーテル、アミド、アルカノールアミン、スルホキシド及びピロリドンである。
【0020】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、非イオン性界面活性剤をさらに含む。この界面活性剤の非限定的な例は、ポリソルベート型界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、又はポリエチレンオキシド－エーテル界面活性剤、例えば、ＢＲＩＪ（登録商標）３５、ＢＲＩＪ（登録商標）５８及びＢＲＩＪ（登録商標）９３である。
【0021】
特定の実施形態において、上記組成物は、ジメチルスルホキシド又はエタノールから選択される溶媒、及びＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ポリソルベート２０）であるポリソルベート型非イオン性界面活性剤を含む。
【0022】
別の態様において、本発明は、植物、植物器官、植物部分又は植物繁殖材料への植物病原体の侵襲又はその事例を防除するため、予防するため、低減するため、又は根絶するための方法を提供し、その方法は、植物、植物器官若しくは植物繁殖材料又は前記植物の周囲の土壌に、農薬有効量のピノセンブリンジヒドロカルコン、又は上記実施形態のいずれか１つの農薬有効量のピノセンブリンジヒドロカルコンを含む農薬組成物若しくは農薬製剤を適用する工程を含み、前記植物病原体は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ及びＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａから選択されるＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｃｅａｅ科の属；Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ科のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｌｅｓ；Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ綱のＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ；並びにＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓから選択されるＧａｍｍａ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの目から選択されるメンバーである。
【0023】
本発明の処置方法は、例えば、萎凋又は腐れ；トウモロコシにおける頭枯れ及び穂腐れ；ブラウンパッチ；根腐れ及び腹腐れ；タバコ、トマト、マスタード、トウガラシ及びクレソンの実生の立ち枯れ病；野菜などの多くの植物宿主における白カビ；多くの野菜（キャベツ、ジャガイモ、タマネギ、ラディッシュなど）における軟腐病；パースニップ及びトマトにおける髄壊死；イネにおける褐色斑点病及び葉鞘褐色腐敗病、アーモンドにおける細菌性かいよう病；並びにオリーブにおけるオリーブがんしゅ病のような病気に対して有用である。
【0024】
ある特定の実施形態において、植物病原体は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属のメンバー、例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｖｅｎａｃｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂｕｂｉｇｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｉｒｃｉｎａｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｌａｎｇｓｅｔｈｉａｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｉｎｃｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ及びＦｕｓａｒｉｕｍ ｖｉｒｇｕｌｉｆｏｒｍｅである。
【0025】
ある特定の実施形態において、植物病原体は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍである。
【0026】
ある特定の実施形態において、植物病原体は、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属のメンバー、例えば、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｂｕｌｂｏｒｕｍ（Ｗａｋｋｅｒ）Ｓａｃｃ．、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ Ｆ．Ｔ．Ｂｅｎｎ．、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｍｉｎｏｒ Ｊａｇｇｅｒ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｒｉｃｉｎｉ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ（Ｌｉｂ．）ｄｅ Ｂａｒｙ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｐｅｒｍｏｐｈｉｌａ Ｎｏｂｌｅ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｕｌｃａｔｅ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ Ｅｒｉｋｓｓ．及びＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｖｅｒａｔｒｉである。
【0027】
ある特定の実施形態において、植物病原体は、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍである。
【0028】
ある特定の実施形態において、植物病原体は、Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ科のメンバーである。
【0029】
ある特定の実施形態において、Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ科の植物病原体は、Ｐｙｔｈｉｕｍ属のメンバー、例えば、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｃａｎｔｈｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｃａｎｔｈｏｐｈｏｒｏｎ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｃｒｏｇｙｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｄｈａｅｒｅｎｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｍａｓｃｕｌｉｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｎａｎｄｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｎｇｕｓｔａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｌｅｒｏｔｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｑｕａｔｉｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｒｒｈｅｎｏｍａｎｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｔｔｒａｎｔｈｅｒｉｄｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｂｉｆｕｒｃａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｂｏｒｅａｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｂｕｉｓｍａｎｉａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｂｕｔｌｅｒｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｍｕｒａｎｄｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｍｐａｎｕｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｎａｒｉｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｒｂｏｎｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｒｏｌｉｎｉａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｈａｍａｅｈｙｐｈｏｎ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｈｏｎｄｒｉｃｏｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｏｌｏｒａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｏｎｔｉｇｕａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｒｙｐｔｏｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｃｙｓｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｌｉｃｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｉｃｌｉｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｉｍｏｒｐｈｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｉｓｓｉｍｉｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｉｓｓｏｔｏｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｅｍｉｎｅｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｅｒｉｎａｃｅｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｆｌｅｖｏｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｌｏｍｅｒａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｒａｎｄｉｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｈｅｌｉｃａｎｄｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｈｅｌｉｃｏｉｄｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｈｙｄｎｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｈｙｐｏｇｙｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｗａｙａｍａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｊａｓｍｏｎｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｋｕｎｍｉｎｇｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｌｉｔｏｒａｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｌｏｎｇａｎｄｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｌｏｎｇｉｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｌｕｔａｒｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｍｉｌｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｒｓｕｐｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍａｓｔｏｐｈｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｅｇａｃａｒｐｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｉｄｄｌｅｔｏｎｉｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｉｎｕｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｏｎｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｏｎｔａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｕｌｔｉｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｙｒｉｏｔｙｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｎａｇａｉｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｎｕｎｎ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｅｄｏｃｈｉｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｋａｎｏｇａｎｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｌｉｇａｎｄｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｏｐａｐｉｌｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｒｎａｃａｒｐｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｒｔｈｏｇｏｎｏｎ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｏｓｔｒａｃｏｄｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐａｃｈｙｃａｕｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐａｃｈｙｃａｕｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐａｄｄｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐａｒｏｅｃａｎｄｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｅｃｔｉｎｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｅｒｉｉｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｅｒｉｐｌｏｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｅｒｎｉｃｉｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｅｒｐｌｅｘｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｈｒａｇｍｉｔｉｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｌｅｒｏｔｉｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｌｕｒｉｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｏｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｏｌｙｍａｓｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｏｒｐｈｙｒａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｒｏｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｕｌｃｈｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｐｙｒｉｌｏｂｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｑｕｅｒｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒａｄｉｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒａｍｉｆｉｃａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒｈｉｚｏ－ｏｒｙｚａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒｏｓｔｒａｔｉｆｉｎｇｅｎｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｒｏｓｔｒａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓａｌｐｉｎｇｏｐｈｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｅｉｃｈｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｅｇｎｉｔｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｅｃｕｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｉｎｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｔｅｒｉｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｔｉｐｉｔａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｕｌｃａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ ｖａｒ．ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｎｃｉｎｕｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｎｄｕｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｖａｎｔｅｒｐｏｏｌｉｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｖｉｎｉｆｅｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｖｉｏｌａｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｖｏｌｕｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｚｉｎｇｉｂｅｒｉｓ及びＰｙｔｈｉｕｍ ｚｉｎｇｉｂｅｒｕｍである。
【0030】
ある特定の実施形態において、植物病原体は、Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ綱のメンバーである。
【0031】
ある特定の実施形態において、Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ綱の植物病原体は、Ｃａｎｔｈａｒｅｌｌａｌｅｓ目のメンバーである。
【0032】
ある特定の実施形態において、Ｃａｎｔｈａｒｅｌｌａｌｅｓ目の植物病原体は、Ｃｅｒａｔｏｂａｓｉｄｉａｃｅａｅ科のメンバーである。
【0033】
ある特定の実施形態において、Ｃｅｒａｔｏｂａｓｉｄｉａｃｅａｅ科の植物病原体は、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ属のメンバー、例えば、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａとしても知られるＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｂａｔａｔｉｃｏｌａ、Ｆｉｂｕｌｏｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃａｒｏｔａｅとしても知られるＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃａｒｏｔａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ、Ｔｈａｎａｔｏｐｈｙｔｕｍ ｃｒｏｃｏｒｕｍとしても知られるＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｒｏｃｏｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ、Ｃｅｒａｔｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｃｏｒｎｉｇｅｒｕｍとしても知られるＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｇｏｏｄｙｅｒａｅ－ｒｅｐｅｎｔｉｓ、Ｗａｉｔｅａ ｃｉｒｃｉｎａｔｅとしても知られるＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｏｒｙｚａｅ及びＣｅｒａｔｏｒｈｉｚａ ｒａｍｉｃｏｌａとしても知られるＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｒａｍｉｃｏｌａである。
【0034】
ある特定の実施形態において、植物病原体は、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉである。
【0035】
ある特定の実施形態において、植物病原体は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目のメンバーである。
【0036】
ある特定の実施形態において、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目の植物病原体は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科のメンバーである。
【0037】
ある特定の実施形態において、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の植物病原体は、例えば、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒａｔｏｖｏｒｕｍ及びＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｒｏｉｄｅａｒｕｍなどの、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のメンバーである。
【0038】
ある特定の実施形態において、植物病原体は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目のメンバーである。
【0039】
ある特定の実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目の植物病原体は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科のメンバーである。
【0040】
ある特定の実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科の植物病原体は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のメンバー、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅである。
【0041】
本発明の農薬組成物は、有効農薬成分の適用を容易にするために製剤に製剤化され得る。
【0042】
上記製剤の非限定的な例は、懸濁剤濃縮物（ＳＣ）、カプセル懸濁剤（ＣＳ）、水分散性顆粒剤（ＷＧ）、乳化性濃縮物（ＥＣ）、水和剤（ｗｅｔｔａｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒ）（ＷＰ）、可溶性（液体）濃縮物（ＳＬ）及び水溶剤（ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒ）（ＳＰ）であり得る。
【0043】
この製剤は、少なくとも１つの溶媒若しくは可溶化剤、アジュバント、キャリア、希釈剤及び／又は界面活性剤をさらに含み得る。
【0044】
アジュバントの非限定的な例は、アクチベーターアジュバント、例えば、陽イオン性、陰イオン性又は非イオン性界面活性剤；農薬製品の活性を改善できる油及び窒素ベースの肥料である。油は、イネ科雑草を防除するために使用される、作物油、例えば、パラフィン又はナフサベースの石油、乳化可能な石油ベースの油に基づく作物油濃縮物、及び種子油（通常、綿実油、亜麻仁油、大豆油又はヒマワリ油）から得られる植物油濃縮物であり得る。窒素ベースの肥料は、硫酸アンモニウム又は尿素－硝酸アンモニウムであり得る。
【0045】
可溶化剤又は溶媒の非限定的な例は、石油ベースの溶媒、上述の油、脂肪酸の液体混合物、エタノール、グリセロール及びジメチルスルホキシドである。農業的に許容され得る溶媒又は可溶化剤は、ピノセンブリンジヒドロカルコンを溶解又は可溶化できる水混和性溶媒、例えば、極性溶媒、例えば、アルコール、ケトン、ラクトン、ケトアルコール、グリコール、グリコエーテル、アミド、アルカノールアミン、スルホキシド及びピロリドンであり得る。
【0046】
キャリアの非限定的な例は、沈降シリカ、コロイドケイ酸、アタパルジャイト、陶土、タルク、カオリン及びそれらの組み合わせである。
【0047】
上記農薬製剤は、希釈剤、例えば、ラクトース、デンプン、尿素、水溶性無機塩及びそれらの組み合わせをさらに含み得る。
【0048】
上記農薬製剤は、例えば、ポリソルベート型非イオン性界面活性剤、スチレンアクリル分散剤ポリマー、酸性樹脂共重合体ベースの分散剤、ポリカルボン酸カリウム、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウムブレンド、ジイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ナフタレンスルホン酸縮合物のナトリウム塩、リグニンスルホン酸塩及びそれらの組み合わせなどの１つ以上の界面活性剤をさらに含み得る。
【0049】
ピノセンブリンジヒドロカルコン又はそれを含む組成物若しくは製剤は、上記実施形態のうちのいずれか１つの方法において、噴霧、浸漬、包帯、コーティング、ペレッティング又は浸すことによって植物又はその一部、器官若しくは植物繁殖材料に適用され得る。
【0050】
本発明のある特定の実施形態によると、ピノセンブリンジヒドロカルコンを含む組成物又は製剤におけるピノセンブリンジヒドロカルコンの濃度は、１０～２０００百万分率（ｐｐｍ；１ｐｐｍは、乾燥した形態のとき、１ｋｇあたり１ｍｇのピノセンブリンジヒドロカルコン、又は液体の形態のとき、１ｍｇ／Ｌに等しい）の範囲内であり得る。
【0051】
ある特定の実施形態において、ピノセンブリンジヒドロカルコンを含む組成物又は製剤におけるピノセンブリンジヒドロカルコンの濃度は、１０～２０００、１０～１５００、１０～１０００、１０～９００、１０～８００、１０～７００、１０～６００、１０～５００、１０～４００、１０～３００、１０～２００、１０～１００、１０～９０、１０～８０、１０～７０、１０～６０、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２０、２０～２０００、２０～１５００、２０～１０００、２０～９００、２０～８００、２０～７００、２０～６００、２０～５００、２０～４００、２０～３００、２０～２００、２０～１００、２０～９０、２０～８０、２０～７０、２０～６０、２０～５０、２０～４０、２０～３０、２０～２０．３０～２０００、３０～１５００、３０～１０００、３０～９００、３０～８００、３０～７００、３０～６００、３０～５００、３０～４００、３０～３００、３０～２００、３０～１００、３０～０、３０～１００、３０～９０、３０～８０、３０～７０、３０～６０、３０～５０、３０～４０、４０～２０００、４０～１５００、４０～１０００、４０～９００、４０～８００、４０～７００、４０～６００、４０～５００、４０～４００、４０～３００、４０～２００、４０～１００、４０～９０、４０～８０、４０～７０、４０～６０、４０～５０、５０～２０００、５０～１５００、５０～１０００、５０～９００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２００、５０～１００、５０～９０、５０～８０、５０～７０、５０～６０、６０～２０００、６０～１５００、６０～１０００、６０～９００、６０～８００、６０～７００、６０～６００、６０～５００、６０～４００、６０～３００、６０～２００、６０～１００、６０～９０、６０～８０、６０～７０、７０～２０００、７０～１５００、７０～１０００、７０～９００、７０～８００、７０～７００、７０～６００、７０～５００、７０～４００、７０～３００、７０～２００、７０～１００、７０～９０、７０～８０、８０～２０００、８０～１５００、８０～１０００、８０～９００、８０～８００、８０～７００、８０～６００、８０～５００、８０～４００、８０～３００、８０～２００、８０～１００、８０～９０、９０～２０００、９０～１５００、９０～１０００、９０～９００、９０～８００、９０～７００、９０～６００、９０～５００、９０～４００、９０～３００、９０～２００、９０～１００、１００～２０００、１００～１５００、１００～１０００、１００～９００、１００～８００、１００～７００、１００～６００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００、２００～２０００、２００～１５００、２００～１０００、２００～９００、２００～８００、２００～７００、２００～６００、２００～５００、２００～４００、２００～３００、３００～２０００、３００～１５００、３００～１０００、３００～９００、３００～８００、３００～７００、３００～６００、３００～５００、３００～４００、４００～２０００、４００～１５００、４００～１０００、４００～９００、４００～８００、４００～７００、４００～６００、４００～５００、５００～２０００、５００～１５００、５００～１０００、５００～９００、５００～８００、５００～７００、５００～６００、６００～２０００、６００～１５００、６００～１０００、６００～９００、６００～８００、６００～７００、７００～２０００、７００～１５００、７００～１０００、７００～９００、７００～８００、８００～２０００、８００～１５００、８００～１０００、８００～９００、９００～２０００、９００～１５００、９００～１０００、１０００～２０００又は１０００～１５００ｐｐｍの範囲内であり得る。
【0052】
特に、ピノセンブリンジヒドロカルコンを含む組成物又は製剤におけるピノセンブリンジヒドロカルコンの濃度は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、１０００、１５００又は２０００ｐｐｍであり得る。
【0053】
定義
本明細書中で使用される用語「農薬」とは、植物、植物器官、植物部分、植物繁殖材料又は前記植物の周囲の土壌における植物病原体の侵襲又はその事例を防除する、予防する、低減する、又は根絶するのに有効な化合物のことを指し、それらには、抗菌剤、殺真菌剤、除草剤及び殺虫剤が含まれる。
本明細書中で使用される用語「農薬」とは、植物、植物器官、植物部分、植物繁殖材料又は前記植物の周囲の土壌における植物病原体の侵襲又はその事例を防除する、予防する、低減する、又は根絶するのに有効な化合物のことを指し、それらには、抗菌剤、殺真菌剤、除草剤及び殺虫剤が含まれる。
【0054】
本明細書中の用語「有効農薬成分」とは、農薬として有効な化合物のことを指す。
【0055】
本明細書中で使用される用語「植物器官」とは、葉、茎、根及び繁殖構造のことを指す。
【0056】
本明細書中で使用される用語「植物部分」とは、挿し木若しくは塊茎などの栄養性植物材料；葉、花、樹皮又は茎のことを指す。
【0057】
本明細書中で使用される用語「植物繁殖材料」とは、種子、根、果実、塊茎、鱗茎、根茎、又は植物の一部のことを指す。
【0058】
本明細書中で使用される用語「農薬有効量」とは、植物、植物器官、植物部分、植物繁殖材料又は前記植物の周囲の土壌における植物病原体の侵襲又はその事例を防除する、予防する、低減する、又は根絶するのに有効な農薬の量のことを指す。
【0059】
用語「綱」、「目」、「科」、「属」及び「種」は、藻類、真菌類及び植物に対する国際命名規約のＡｒｔ３．１に従って本明細書中で使用される。
【0060】
請求項において使用される用語「～を含む」は、「オープンエンド」であり、記載のエレメント又はそれらの構造若しくは機能の等価物に加え、記載されていない他の任意のエレメントを意味する。それは、本明細書中以後列挙される意味に限定されると解釈されるべきでなく；他のエレメント又は工程を排除しない。それは、述べられている特徴、整数、工程又は構成要素の存在を言及されているとおりに明示していると解釈される必要があるが、１つ以上の他の特徴、整数、工程若しくは構成要素又はそれらの群の存在又は追加を排除しない。したがって、「ｘ及びｚを含む組成物」という表現の範囲は、化合物ｘ及びｚだけからなる組成物に限定されるべきでない。また、「工程ｘ及びｚを含む方法」という表現の範囲は、これらの工程だけからなる方法に限定されるべきでない。
【0061】
本明細書中で使用されるとき、用語「及び／又は」は、列挙されている関連項目の１つ以上の任意の組み合わせ及びすべての組み合わせを含む。別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての用語（専門用語及び科学用語を含む）は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。通常使用される辞書に定義されている用語などの用語は、本明細書及び関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致した意味を有すると解釈されるべきであって、理想的な意味又は過度に正式な意味として本明細書中で明確に定義されない限り、そのように解釈されるべきでない。周知の機能又は構成は、簡潔及び／又は明確にするために詳細に記載されていないかもしれない。
【0062】
別段示されない限り、本明細書において使用されるすべての数字は、すべての場合において用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。具体的に述べられていない限り、本明細書中で使用されるとき、用語「約」は、当該分野において通常許容される範囲内、例えば平均値の２標準偏差以内と理解される。１つの実施形態において、用語「約」は、その用語とともに使用されている報告されている数値の１０％以内、好ましくは、報告されている数値の５％以内を意味する。例えば、用語「約」は、述べられている値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％以内とすぐに理解され得る。他の実施形態において、用語「約」は、例えば使用される実験手法に応じて、より大きな変動の許容を意味し得る。特定の値の前記変動は、当業者によって理解される変動であり、本発明の文脈の範囲内である。例示として、「約１～約５」という数値範囲は、約１～約５という明示的に記載されている値を含むだけでなく、その記載の範囲内の個々の値及び部分範囲も含むと解釈されるべきである。したがって、この数値範囲に含まれるのは、２、３及び４などの個々の値、並びに例えば１～３、２～４及び３～５といった部分範囲、並びに個々に１、２、３、４、５又は６である。この同じ原理が、最小値又は最大値としてただ１つの数値を記載している範囲にも当てはまる。文脈から他のことが明らかでない限り、本明細書中に提供されるすべての数値が用語「約」によって修飾される。他の類似の用語（例えば、「実質的に」、「一般に」、「最大」など）も、ある用語又は値をそれが絶対的でないように修飾していると解釈されるべきである。そのような用語は、それらが修飾する状況及び用語によって、それらの用語が当業者によって理解されるように定義される。これは、少なくとも、値を測定するために用いられる所与の実験、手法又は機器に対して予想される実験誤差、技術誤差及び機器誤差の程度を含む。
【0063】
ここから、本発明を以下の非限定的な例によって例証する。
【実施例】
【0064】
略語の一覧：
ＲＰＭ－毎分回転数
ＲＣＦ－相対遠心力
ＣＦＵ－コロニー形成単位
ＰＤＢＣ－２０ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むポテトデキストロースブロス
ＰＤＡＣ－２０ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むポテトデキストロース寒天
ＰＤＡＴ １２ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むポテトデキストロース寒天
ＤＭＳＯ－ジメチルスルホキシド
ＬＢ－溶原ブロス
ＬＢＡ－寒天を含む溶原ブロス
ＳＣＨ－Ｓｃｈｍｉｔｔｎｅｒ培地
２：ＰＤＢＣ－滅菌蒸留水によって２倍希釈されたＰＤＢＣ
ＰＤＡ－ポテトデキストロース寒天
ＰＤＢＴ－１２ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むポテトデキストロースブロス
ＲＰＭ－毎分回転数
ＲＣＦ－相対遠心力
ＣＦＵ－コロニー形成単位
ＰＤＢＣ－２０ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むポテトデキストロースブロス
ＰＤＡＣ－２０ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むポテトデキストロース寒天
ＰＤＡＴ １２ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むポテトデキストロース寒天
ＤＭＳＯ－ジメチルスルホキシド
ＬＢ－溶原ブロス
ＬＢＡ－寒天を含む溶原ブロス
ＳＣＨ－Ｓｃｈｍｉｔｔｎｅｒ培地
２：ＰＤＢＣ－滅菌蒸留水によって２倍希釈されたＰＤＢＣ
ＰＤＡ－ポテトデキストロース寒天
ＰＤＢＴ－１２ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むポテトデキストロースブロス
【0065】
実施例１．Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍに対するピノセンブリンジヒドロカルコンの生物活性のマイクロプレートベースアッセイ
要旨：
希釈された精製済みピノセンブリンジヒドロカルコンをマイクロプレートウェルに加え、調製したばかりの胞子懸濁液と混合し、凍結胞子から始めたその真菌の成長をプレートリーダー及び目視検査によってモニターした。
要旨：
希釈された精製済みピノセンブリンジヒドロカルコンをマイクロプレートウェルに加え、調製したばかりの胞子懸濁液と混合し、凍結胞子から始めたその真菌の成長をプレートリーダー及び目視検査によってモニターした。
【0066】
背景：
Ｆｕｓａｒｉｕｍは、子嚢菌綱に属する真菌であり、土壌伝染性の病原体である。Ｆｕｓａｒｉｕｍの大量の胞子の産生はかなり容易であり、－２０℃の液体の６０％グリセロール中で生存することから、新鮮な胞子を実験ごとに調製するのではなく、凍結胞子のストックをこのスクリーニングにおいて使用することに決めた。
Ｆｕｓａｒｉｕｍは、子嚢菌綱に属する真菌であり、土壌伝染性の病原体である。Ｆｕｓａｒｉｕｍの大量の胞子の産生はかなり容易であり、－２０℃の液体の６０％グリセロール中で生存することから、新鮮な胞子を実験ごとに調製するのではなく、凍結胞子のストックをこのスクリーニングにおいて使用することに決めた。
【0067】
目的：
Ｆｕｓａｒｉｕｍの生存及び成長に対する種々の化合物の効果を測定すること。
Ｆｕｓａｒｉｕｍの生存及び成長に対する種々の化合物の効果を測定すること。
【0068】
以下の材料、方法及び装置を使用した：
【0069】
材料：ＰＤＡＣ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ）、ＰＤＢＣ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ）、ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＵＳ）。
【0070】
装置：プレートリーダー、遠心機、振盪機、インキュベーター
【0071】
方法：
Ｆｕｓａｒｉｕｍ胞子懸濁液の調製：
１）成長中のｆｕｓａｒｉｕｍの寒天ブロックをＰＤＡＣプレートの中央のＰＤＡＣの上に置き、２５℃で９日間生育する。
２）そのプレートを冷蔵庫内で少なくとも１時間冷却する。
３）冷蔵した３０ｍｌの滅菌６０％グリセロール溶液を５０ｍｌチューブに加える。
４）菌糸及び胞子を含む寒天を１枚のプレートからメスで小片に切断し、それらを３０ｍｌの６０％グリセロールが入った５０ｍｌチューブに入れる。
５）３０００ＲＰＭで１分間振盪する。
６）プロセス全体において胞子を氷上で維持する。
７）その液体を新しい５０ｍｌ滅菌チューブに移す。約２５ｍｌが回収されるはずである。
８）その胞子懸濁液を１６層のガーゼ布で清浄な滅菌５０ｍｌチューブに直接濾過して、菌糸を廃棄する。
９）胞子濃度を計算し（４０×１０倍率で×１０希釈度したものを数える）、冷却された滅菌６０％グリセロール溶液で希釈して、２×１０５胞子／ｍｌを得る。
１０）１ｍｌの胞子懸濁液を１．５ｍｌチューブに等分する。各等分によって、スクリーニング用のプレート２０枚分が取れるはずである。
１１）その胞子懸濁液を－２０℃で保存する。
Ｆｕｓａｒｉｕｍ胞子懸濁液の調製：
１）成長中のｆｕｓａｒｉｕｍの寒天ブロックをＰＤＡＣプレートの中央のＰＤＡＣの上に置き、２５℃で９日間生育する。
２）そのプレートを冷蔵庫内で少なくとも１時間冷却する。
３）冷蔵した３０ｍｌの滅菌６０％グリセロール溶液を５０ｍｌチューブに加える。
４）菌糸及び胞子を含む寒天を１枚のプレートからメスで小片に切断し、それらを３０ｍｌの６０％グリセロールが入った５０ｍｌチューブに入れる。
５）３０００ＲＰＭで１分間振盪する。
６）プロセス全体において胞子を氷上で維持する。
７）その液体を新しい５０ｍｌ滅菌チューブに移す。約２５ｍｌが回収されるはずである。
８）その胞子懸濁液を１６層のガーゼ布で清浄な滅菌５０ｍｌチューブに直接濾過して、菌糸を廃棄する。
９）胞子濃度を計算し（４０×１０倍率で×１０希釈度したものを数える）、冷却された滅菌６０％グリセロール溶液で希釈して、２×１０５胞子／ｍｌを得る。
１０）１ｍｌの胞子懸濁液を１．５ｍｌチューブに等分する。各等分によって、スクリーニング用のプレート２０枚分が取れるはずである。
１１）その胞子懸濁液を－２０℃で保存する。
【0072】
スクリーニング用の胞子懸濁液の調製：
１）１ｍｌの凍結胞子懸濁液を冷凍庫から取り出し、氷上で解凍する。
２）２００ｕｌの胞子懸濁液を、２０ｍｌの冷蔵ＰＤＢＣと５０ｍｌチューブ内で混合して、２０００胞子／ｍｌ懸濁液を生成する。
３）この量を使用して、１ウェルあたり１００個の胞子を含む４枚のマイクロプレートのスクリーニングを行う。
１）１ｍｌの凍結胞子懸濁液を冷凍庫から取り出し、氷上で解凍する。
２）２００ｕｌの胞子懸濁液を、２０ｍｌの冷蔵ＰＤＢＣと５０ｍｌチューブ内で混合して、２０００胞子／ｍｌ懸濁液を生成する。
３）この量を使用して、１ウェルあたり１００個の胞子を含む４枚のマイクロプレートのスクリーニングを行う。
【0073】
スクリーニング実験用のマイクロプレートの準備：
１）ＤＭＳＯ中の精製済み１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を冷凍庫から取り出し、卓上で解凍する。
２）１ｕｌの１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を取り、３９ｕｌの水で２５０ｐｐｍに希釈する。
３）３）マルチピペットを用いて、１０ｕｌの希釈済み（２５０ｐｐｍ）ピノセンブリンジヒドロカルコン溶液をマイクロプレートのウェルに入れる。
４）４）マルチピペットを用いて、激しく混合された４０ｕｌの胞子懸濁液接種材料をマイクロプレートのウェルに加える。
５）プレートを透明のシーラーで密封する。
６）プレートを２０００ＲＰＭで１０分間振盪して、上記材料を菌糸懸濁液と混合する。
７）プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心し、停止して、プレートの底に液体を集める。
８）マイクロプレートをプレートリーダーで読み出すまで、それを卓上で維持する。
９）プレートリーダーを用いてプレートを読み出す。
１０）プレートを卓上に集める。
１１）集めたプレートを、布カバー付きのプラスチックボックスに入れ、そのボックスを２５℃のインキュベーター内に置く。
１）ＤＭＳＯ中の精製済み１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を冷凍庫から取り出し、卓上で解凍する。
２）１ｕｌの１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を取り、３９ｕｌの水で２５０ｐｐｍに希釈する。
３）３）マルチピペットを用いて、１０ｕｌの希釈済み（２５０ｐｐｍ）ピノセンブリンジヒドロカルコン溶液をマイクロプレートのウェルに入れる。
４）４）マルチピペットを用いて、激しく混合された４０ｕｌの胞子懸濁液接種材料をマイクロプレートのウェルに加える。
５）プレートを透明のシーラーで密封する。
６）プレートを２０００ＲＰＭで１０分間振盪して、上記材料を菌糸懸濁液と混合する。
７）プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心し、停止して、プレートの底に液体を集める。
８）マイクロプレートをプレートリーダーで読み出すまで、それを卓上で維持する。
９）プレートリーダーを用いてプレートを読み出す。
１０）プレートを卓上に集める。
１１）集めたプレートを、布カバー付きのプラスチックボックスに入れ、そのボックスを２５℃のインキュベーター内に置く。
【0074】
プレートの読み出し：
１）プレートの読み出しをさらに３日、行う：アッセイ開始の３日後、７日後、１４日後及び２１日後。
２）各読み出し値と時間ゼロにおける読み出し値との吸光度の差を計算する。
３）各経過時点における各ウェルの成長阻害のパーセンテージを計算する。コントロールプレートのＤＭＳＯ処置の結果を１００％成長として使用する。
４）結果：実施例７を参照のこと。
１）プレートの読み出しをさらに３日、行う：アッセイ開始の３日後、７日後、１４日後及び２１日後。
２）各読み出し値と時間ゼロにおける読み出し値との吸光度の差を計算する。
３）各経過時点における各ウェルの成長阻害のパーセンテージを計算する。コントロールプレートのＤＭＳＯ処置の結果を１００％成長として使用する。
４）結果：実施例７を参照のこと。
【0075】
実施例２．Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ Ｓｏｌａｎｉに対するピノセンブリンジヒドロカルコンの生物活性のマイクロプレートベースアッセイ
要旨：
希釈された精製済みピノセンブリンジヒドロカルコンをマイクロプレートウェルに加え、５０ｕｌの菌糸懸濁液と混合し、混合された菌糸から始めたその真菌の成長をプレートリーダー及び目視検査によってモニターした。
要旨：
希釈された精製済みピノセンブリンジヒドロカルコンをマイクロプレートウェルに加え、５０ｕｌの菌糸懸濁液と混合し、混合された菌糸から始めたその真菌の成長をプレートリーダー及び目視検査によってモニターした。
【0076】
以下の材料、方法及び装置を使用した：
【0077】
材料：ＰＤＡＣ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製）、ＰＤＢＣ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製）、ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＵＳ製）
【0078】
装置：プレートリーダー、遠心機、振盪機、インキュベーター
【0079】
方法：
Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ菌糸の接種材料の調製：
１）Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａを９０ｍｍペトリプレート内のＰＤＡＣ上で生育して、１～４日以内に成長中の菌糸を得る。
２）５０ｍｌのＰＤＢＣ培地を２５０ｍｌ滅菌エルレンマイヤーフラスコに加える。
３）固形培地をメスでいくつかの小片に切断し、それらをエルレンマイヤーフラスコに入れる。
４）培養物を２～４日間、振盪機を用いて２７℃及び１５０ＲＰＭで生育する。
５）液体を廃棄し、菌糸を空のペトリ皿にあける。
６）メスを用いて菌糸を多数の小片に切断し、それらを、５０ｍｌのＰＤＢＣ培地が入った２５０ｍｌ滅菌エルレンマイヤーフラスコに入れる。
７）培養物を含む４本のボトルを調製し、２７℃で３日間、１５０ＲＰＭで振盪して生育する。
８）培養物を冷蔵庫内で１時間冷却する。
９）冷培養物を２５０ｍｌビーカーにあける。
１０）２０ｍｌの冷ＰＤＢＣを加える。
１１）ブレンダーを用いて２分間、ブレンダーを数回上下させ、氷上にて最大速度で培養物を混合する。
１２）混合物を氷上で維持する。
１３）約５ｍｌのブレンド混合物を氷上の１５ｍｌチューブに移す。
１４）１５ｍｌチューブ内の培養物を氷上で２分間ホモジナイズする。
１５）５ｍｌの数バッチを上記のようにホモジナイズして、必要な量を調製する（５ｍｌのホモジナイズされた培養物から約１００ｍｌの接種材料ができるだろう）。
１６）ホモジネートの一部を１０倍希釈して、ホモジネートの濃度をチェックする。懸濁液の濃度は４×１０４ＣＦＵ／ｍｌであるべきである（１０倍希釈された濃度は４０００ＣＦＵ／ｍｌであるべきである）。
１７）接種材料ストックを、ＰＤＢＣで２０ｍｌ中に１ｍｌにて１：２０希釈するか、又は２０００ＣＦＵ／ｍｌという最終濃度を調製するために必要な希釈度を計算する。各ウェル内の量は、１００ＣＦＵであるべきである。
Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ菌糸の接種材料の調製：
１）Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａを９０ｍｍペトリプレート内のＰＤＡＣ上で生育して、１～４日以内に成長中の菌糸を得る。
２）５０ｍｌのＰＤＢＣ培地を２５０ｍｌ滅菌エルレンマイヤーフラスコに加える。
３）固形培地をメスでいくつかの小片に切断し、それらをエルレンマイヤーフラスコに入れる。
４）培養物を２～４日間、振盪機を用いて２７℃及び１５０ＲＰＭで生育する。
５）液体を廃棄し、菌糸を空のペトリ皿にあける。
６）メスを用いて菌糸を多数の小片に切断し、それらを、５０ｍｌのＰＤＢＣ培地が入った２５０ｍｌ滅菌エルレンマイヤーフラスコに入れる。
７）培養物を含む４本のボトルを調製し、２７℃で３日間、１５０ＲＰＭで振盪して生育する。
８）培養物を冷蔵庫内で１時間冷却する。
９）冷培養物を２５０ｍｌビーカーにあける。
１０）２０ｍｌの冷ＰＤＢＣを加える。
１１）ブレンダーを用いて２分間、ブレンダーを数回上下させ、氷上にて最大速度で培養物を混合する。
１２）混合物を氷上で維持する。
１３）約５ｍｌのブレンド混合物を氷上の１５ｍｌチューブに移す。
１４）１５ｍｌチューブ内の培養物を氷上で２分間ホモジナイズする。
１５）５ｍｌの数バッチを上記のようにホモジナイズして、必要な量を調製する（５ｍｌのホモジナイズされた培養物から約１００ｍｌの接種材料ができるだろう）。
１６）ホモジネートの一部を１０倍希釈して、ホモジネートの濃度をチェックする。懸濁液の濃度は４×１０４ＣＦＵ／ｍｌであるべきである（１０倍希釈された濃度は４０００ＣＦＵ／ｍｌであるべきである）。
１７）接種材料ストックを、ＰＤＢＣで２０ｍｌ中に１ｍｌにて１：２０希釈するか、又は２０００ＣＦＵ／ｍｌという最終濃度を調製するために必要な希釈度を計算する。各ウェル内の量は、１００ＣＦＵであるべきである。
【0080】
活性実験に向けたマイクロプレートの準備：
１）ＤＭＳＯ中の精製済み１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を冷凍庫から取り出し、卓上で解凍する。
２）１ｕｌの１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を取り、３９ｕｌの水で２５０ｐｐｍに希釈する。
３）マルチピペットを用いて、１０ｕｌの希釈済み（２５０ｐｐｍ）ピノセンブリンジヒドロカルコン溶液をマイクロプレートのウェルに入れる。
４）マルチピペットを用いて、激しく混合された４０ｕｌの胞子懸濁液接種材料をマイクロプレートのウェルに加える。
５）プレートを透明のシーラーで密封する。
６）プレートを２０００ＲＰＭで１０分間振盪して、ピノセンブリンジヒドロカルコンを菌糸懸濁液と混合する。
７）プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心し、停止して、プレートの底に液体を集める。
８）マイクロプレートをプレートリーダーで読み出すまで、それを卓上で維持する。
９）プレートリーダーを用いてプレートを読み出す。
１０）プレートを卓上に集める。
１１）集めたプレートを、布カバー付きのプラスチックボックスに入れ、そのボックスを２７℃のインキュベーター内に置く。
１）ＤＭＳＯ中の精製済み１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を冷凍庫から取り出し、卓上で解凍する。
２）１ｕｌの１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を取り、３９ｕｌの水で２５０ｐｐｍに希釈する。
３）マルチピペットを用いて、１０ｕｌの希釈済み（２５０ｐｐｍ）ピノセンブリンジヒドロカルコン溶液をマイクロプレートのウェルに入れる。
４）マルチピペットを用いて、激しく混合された４０ｕｌの胞子懸濁液接種材料をマイクロプレートのウェルに加える。
５）プレートを透明のシーラーで密封する。
６）プレートを２０００ＲＰＭで１０分間振盪して、ピノセンブリンジヒドロカルコンを菌糸懸濁液と混合する。
７）プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心し、停止して、プレートの底に液体を集める。
８）マイクロプレートをプレートリーダーで読み出すまで、それを卓上で維持する。
９）プレートリーダーを用いてプレートを読み出す。
１０）プレートを卓上に集める。
１１）集めたプレートを、布カバー付きのプラスチックボックスに入れ、そのボックスを２７℃のインキュベーター内に置く。
【0081】
プレートのスクリーニング：
１）さらに３日、プレートをスクリーニングする：アッセイ開始の３日後、７日後、１４日後及び２１日後。
２）各スクリーニングと時間ゼロにおける読み出しとの吸光度の差を計算する。
３）各時点における各ウェルの成長阻害のパーセンテージを計算する。コントロールプレートのＤＭＳＯ処置の結果を１００％成長として使用する。
４）結果：実施例７を参照のこと。
１）さらに３日、プレートをスクリーニングする：アッセイ開始の３日後、７日後、１４日後及び２１日後。
２）各スクリーニングと時間ゼロにおける読み出しとの吸光度の差を計算する。
３）各時点における各ウェルの成長阻害のパーセンテージを計算する。コントロールプレートのＤＭＳＯ処置の結果を１００％成長として使用する。
４）結果：実施例７を参照のこと。
【0082】
実施例３．Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍに対するピノセンブリンジヒドロカルコンの生物活性のマイクロプレートベースアッセイ
要旨：
希釈された精製済みピノセンブリンジヒドロカルコンをマイクロプレートウェルに加え、５０ｕｌのＰＤＢＣ懸濁液中の遊走子と混合し、遊走子から始めたその真菌の成長をプレートリーダー及び目視検査によってモニターした。
要旨：
希釈された精製済みピノセンブリンジヒドロカルコンをマイクロプレートウェルに加え、５０ｕｌのＰＤＢＣ懸濁液中の遊走子と混合し、遊走子から始めたその真菌の成長をプレートリーダー及び目視検査によってモニターした。
【0083】
以下の材料、方法及び装置を使用した：
【0084】
材料：
ＳＣＨ、ＰＤＢＣ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製）、ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＵＳ製）
ＳＣＨ、ＰＤＢＣ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製）、ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＵＳ製）
【0085】
装置：
プレートリーダー、遠心機、振盪機、インキュベーター
プレートリーダー、遠心機、振盪機、インキュベーター
【0086】
方法：
Ｐｙｔｈｉｕｍ菌糸の接種材料の調製：
１）Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍを９０ｍｍペトリプレート内のＳＣＨ上で生育して、胞子形成中の菌糸を得る。各プレートから５０ｍｌの遊走子懸濁液が得られ、そこから９６ウェルプレート１０枚分が取れる。
２）６０ｍｌの滅菌Ｈ２Ｏを２５０ｍｌ滅菌エルレンマイヤーフラスコに加える。
３）２枚のプレートの固形培地をメスで１２片に（プレート１枚につき）切断し、それらをエルレンマイヤーフラスコに入れる（固形片は水で覆われているべきである）。
４）１７℃で一晩、菌糸に胞子形成させる。
５）エルレンマイヤーフラスコを手で振盪して、遊走子を懸濁する。
６）懸濁液を１６層ガーゼで５０ｍｌチューブに濾過する。
７）その懸濁液を滅菌５００ｍｌボトルに移す。
８）固体を廃棄し、エルレンマイヤーフラスコを次亜塩素酸塩で消毒する。
９）遊走子懸濁液を氷上で冷却する。
１０）懸濁液中の遊走子の濃度を評価する（濃度は１０００～４０００胞子／ｍｌの範囲内であるべきである）。
１１）必要に応じて、懸濁液を５００ｍｌ滅菌ボトル内において、滅菌された冷蔵蒸留Ｈ２Ｏで希釈する。
１２）（懸濁液と）同体積の２倍濃縮された滅菌冷蔵ＰＤＢＣを加えて、５００～２０００胞子／ｍｌ接種材料を得る。この希釈によって、各ウェルにおいて２５～１００遊走子という量がもたらされる。
１３）遊走子懸濁液接種材料を氷上で維持する。
Ｐｙｔｈｉｕｍ菌糸の接種材料の調製：
１）Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍを９０ｍｍペトリプレート内のＳＣＨ上で生育して、胞子形成中の菌糸を得る。各プレートから５０ｍｌの遊走子懸濁液が得られ、そこから９６ウェルプレート１０枚分が取れる。
２）６０ｍｌの滅菌Ｈ２Ｏを２５０ｍｌ滅菌エルレンマイヤーフラスコに加える。
３）２枚のプレートの固形培地をメスで１２片に（プレート１枚につき）切断し、それらをエルレンマイヤーフラスコに入れる（固形片は水で覆われているべきである）。
４）１７℃で一晩、菌糸に胞子形成させる。
５）エルレンマイヤーフラスコを手で振盪して、遊走子を懸濁する。
６）懸濁液を１６層ガーゼで５０ｍｌチューブに濾過する。
７）その懸濁液を滅菌５００ｍｌボトルに移す。
８）固体を廃棄し、エルレンマイヤーフラスコを次亜塩素酸塩で消毒する。
９）遊走子懸濁液を氷上で冷却する。
１０）懸濁液中の遊走子の濃度を評価する（濃度は１０００～４０００胞子／ｍｌの範囲内であるべきである）。
１１）必要に応じて、懸濁液を５００ｍｌ滅菌ボトル内において、滅菌された冷蔵蒸留Ｈ２Ｏで希釈する。
１２）（懸濁液と）同体積の２倍濃縮された滅菌冷蔵ＰＤＢＣを加えて、５００～２０００胞子／ｍｌ接種材料を得る。この希釈によって、各ウェルにおいて２５～１００遊走子という量がもたらされる。
１３）遊走子懸濁液接種材料を氷上で維持する。
【0087】
活性実験に向けたマイクロプレートの準備：
１）ＤＭＳＯ中の精製済み１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を冷凍庫から取り出し、卓上で解凍する。
２）１ｕｌの１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を取り、３９ｕｌの水で２５０ｐｐｍに希釈する。
３）マルチピペットを用いて、１０ｕｌの希釈済み（２５０ｐｐｍ）ピノセンブリンジヒドロカルコン溶液をマイクロプレートのウェルに入れる。
４）マルチピペットを用いて、激しく混合された４０ｕｌの胞子懸濁液接種材料をマイクロプレートのウェルに加える。
５）プレートを透明のシーラーで密封する。
６）プレートを２０００ＲＰＭで１０分間振盪して、ピノセンブリンジヒドロカルコンを菌糸懸濁液と混合する。
７）プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心し、停止して、プレートの底に液体を集める。
８）マイクロプレートをプレートリーダーで読み出すまで、それを卓上で維持する。
９）プレートリーダーを用いてプレートを読み出す。
１０）プレートを卓上に集める。
１１）集めたプレートを、布カバー付きのプラスチックボックスに入れ、そのボックスを２７℃のインキュベーター内に置く。
１）ＤＭＳＯ中の精製済み１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を冷凍庫から取り出し、卓上で解凍する。
２）１ｕｌの１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を取り、３９ｕｌの水で２５０ｐｐｍに希釈する。
３）マルチピペットを用いて、１０ｕｌの希釈済み（２５０ｐｐｍ）ピノセンブリンジヒドロカルコン溶液をマイクロプレートのウェルに入れる。
４）マルチピペットを用いて、激しく混合された４０ｕｌの胞子懸濁液接種材料をマイクロプレートのウェルに加える。
５）プレートを透明のシーラーで密封する。
６）プレートを２０００ＲＰＭで１０分間振盪して、ピノセンブリンジヒドロカルコンを菌糸懸濁液と混合する。
７）プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心し、停止して、プレートの底に液体を集める。
８）マイクロプレートをプレートリーダーで読み出すまで、それを卓上で維持する。
９）プレートリーダーを用いてプレートを読み出す。
１０）プレートを卓上に集める。
１１）集めたプレートを、布カバー付きのプラスチックボックスに入れ、そのボックスを２７℃のインキュベーター内に置く。
【0088】
プレートのスクリーニング：
１）プレートをさらに３日、読み出す：アッセイ開始の３日後、７日後、１４日後及び２１日後。
２）各読み出し値と時間ゼロにおける読み出し値との吸光度の差を計算する。
３）各時点における各ウェルの成長阻害のパーセンテージを計算する。コントロールプレートのＤＭＳＯ処置の結果を１００％成長として使用する。
４）結果：実施例７を参照のこと。
１）プレートをさらに３日、読み出す：アッセイ開始の３日後、７日後、１４日後及び２１日後。
２）各読み出し値と時間ゼロにおける読み出し値との吸光度の差を計算する。
３）各時点における各ウェルの成長阻害のパーセンテージを計算する。コントロールプレートのＤＭＳＯ処置の結果を１００％成長として使用する。
４）結果：実施例７を参照のこと。
【0089】
実施例４．Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍに対するピノセンブリンジヒドロカルコンの生物活性のマイクロプレートベースアッセイ
要旨：
希釈された精製済みピノセンブリンジヒドロカルコンをマイクロプレートウェルに加え、５０ｕｌの菌糸懸濁液と混合し、ブレンドされた菌糸から開始した真菌の成長を、目視検査によってモニターした。
要旨：
希釈された精製済みピノセンブリンジヒドロカルコンをマイクロプレートウェルに加え、５０ｕｌの菌糸懸濁液と混合し、ブレンドされた菌糸から開始した真菌の成長を、目視検査によってモニターした。
【0090】
背景：
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍは、子嚢菌綱に属する真菌であり、土壌伝染性の病原体である。Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍの大量の胞子の産生は難しいため、このスクリーニングでは接種のために胞子ではなく菌糸を使用することに決めた。
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍは、子嚢菌綱に属する真菌であり、土壌伝染性の病原体である。Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍの大量の胞子の産生は難しいため、このスクリーニングでは接種のために胞子ではなく菌糸を使用することに決めた。
【0091】
以下の材料、方法及び装置を使用した：
【0092】
材料：ＰＤＡＣ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製）、ＰＤＢＣ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製）、ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＵＳ製）
ＰＤＢＣ（ＰＤＢは、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製であり；クロラムフェニコールは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＡｌｆａ Ａｅｓａｒ製である）、ＰＤＡ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製）、ＰＤＡＴ（ＰＤＡは、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製であり；テトラサイクリンは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＡｌｆａ Ａｅｓａｒ製である）、ＰＤＢＴ（ＰＤＢは、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製であり；テトラサイクリンは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＡｌｆａ Ａｅｓａｒ製である）、ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＵＳ製）
ＰＤＢＣ（ＰＤＢは、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製であり；クロラムフェニコールは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＡｌｆａ Ａｅｓａｒ製である）、ＰＤＡ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製）、ＰＤＡＴ（ＰＤＡは、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製であり；テトラサイクリンは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＡｌｆａ Ａｅｓａｒ製である）、ＰＤＢＴ（ＰＤＢは、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製であり；テトラサイクリンは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＡｌｆａ Ａｅｓａｒ製である）、ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＵＳ製）
【0093】
装置：遠心機、振盪機、インキュベーター
【0094】
方法：
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ菌糸の接種材料の調製：
１）Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍをチューブ内のＰＤＡ上で２１℃において４日間生育する。
２）寒天ブロックを移し、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍを９０ｍｍペトリ皿内のＰＤＡＴ上で２１℃において生育して、３日以内に成長中の菌糸を得る。
３）５０ｍｌのＰＤＢＴ培地を２５０ｍｌ滅菌スクエアフラスコに加える。
４）固形培地をメスで１５個の極小片（１×５ｍｍ）に切断し、それらをスクエアフラスコに入れる。
５）培養物を２日間、振盪機を用いて２１℃、１３０ＲＰＭで生育する。
６）液体を廃棄し、菌糸を空のペトリ皿にあける。
７）メスを用いて菌糸を多数の小片に切断し（寒天片の使用を回避する）、それらを、５０ｍｌのＰＤＢＴ培地を含む２５０ｍｌ滅菌スクエアフラスコに入れる。
８）分散された菌糸を迅速に成長させるために、２１℃で２日間、１３０ＲＰＭで振盪しながら生育する。
９）培養物を冷蔵庫内で１時間冷却する。
１０）冷培養物を５０ｍｌチューブにあける。
１１）混合物を氷上で維持する。
１２）約５ｍｌのブレンド混合物を氷上の１５ｍｌチューブに移す。
１３）１５ｍｌチューブ内の培養物を氷上で２分間ホモジナイズする。
１４）５ｍｌの数バッチを上記のようにホモジナイズして、必要な量を調製する（５ｍｌのホモジナイズされた培養物から約５０ｍｌの接種材料ができるだろう）。
１５）ホモジネートの一部を１０倍希釈して、ホモジネートの濃度をチェックする。懸濁液の濃度は、２×１０４ＣＦＵ／ｍｌであるべきである（１０倍希釈された濃度は２０００ＣＦＵ／ｍｌであるべきである）。
１６）接種材料ストックを、ＰＤＢＣで２０ｍｌ中に２ｍｌにて１：１０希釈するか、又は２０００ＣＦＵ／ｍｌという最終濃度を調製するために必要な希釈度を計算する。最終的な菌糸数は、各ウェル内において１００ＣＦＵであるべきである。
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ菌糸の接種材料の調製：
１）Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍをチューブ内のＰＤＡ上で２１℃において４日間生育する。
２）寒天ブロックを移し、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍを９０ｍｍペトリ皿内のＰＤＡＴ上で２１℃において生育して、３日以内に成長中の菌糸を得る。
３）５０ｍｌのＰＤＢＴ培地を２５０ｍｌ滅菌スクエアフラスコに加える。
４）固形培地をメスで１５個の極小片（１×５ｍｍ）に切断し、それらをスクエアフラスコに入れる。
５）培養物を２日間、振盪機を用いて２１℃、１３０ＲＰＭで生育する。
６）液体を廃棄し、菌糸を空のペトリ皿にあける。
７）メスを用いて菌糸を多数の小片に切断し（寒天片の使用を回避する）、それらを、５０ｍｌのＰＤＢＴ培地を含む２５０ｍｌ滅菌スクエアフラスコに入れる。
８）分散された菌糸を迅速に成長させるために、２１℃で２日間、１３０ＲＰＭで振盪しながら生育する。
９）培養物を冷蔵庫内で１時間冷却する。
１０）冷培養物を５０ｍｌチューブにあける。
１１）混合物を氷上で維持する。
１２）約５ｍｌのブレンド混合物を氷上の１５ｍｌチューブに移す。
１３）１５ｍｌチューブ内の培養物を氷上で２分間ホモジナイズする。
１４）５ｍｌの数バッチを上記のようにホモジナイズして、必要な量を調製する（５ｍｌのホモジナイズされた培養物から約５０ｍｌの接種材料ができるだろう）。
１５）ホモジネートの一部を１０倍希釈して、ホモジネートの濃度をチェックする。懸濁液の濃度は、２×１０４ＣＦＵ／ｍｌであるべきである（１０倍希釈された濃度は２０００ＣＦＵ／ｍｌであるべきである）。
１６）接種材料ストックを、ＰＤＢＣで２０ｍｌ中に２ｍｌにて１：１０希釈するか、又は２０００ＣＦＵ／ｍｌという最終濃度を調製するために必要な希釈度を計算する。最終的な菌糸数は、各ウェル内において１００ＣＦＵであるべきである。
【0095】
活性実験に向けたマイクロプレートの準備：
１）ＤＭＳＯ中の精製済み１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を冷凍庫から取り出し、卓上で解凍する。
２）１ｕｌの１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を取り、３９ｕｌの水で２５０ｐｐｍに希釈する。
３）マルチピペットを用いて、１０ｕｌの希釈済み（２５０ｐｐｍ）ピノセンブリンジヒドロカルコン溶液をマイクロプレートのウェルに入れる。
４）マルチピペットを用いて、激しく混合された４０ｕｌの胞子懸濁液接種材料をマイクロプレートのウェルに加える。
５）プレートを透明のシーラーで密封する。
６）プレートを２０００ＲＰＭで１０分間振盪して、ピノセンブリンジヒドロカルコンを菌糸懸濁液と混合する。
７）プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心し、停止して、プレートの底に液体を集める。
８）すべてのマイクロプレートのインキュベーションの準備が整うまで、プレートを実験台上に集める。
９）マイクロプレートをプラスチックボックスに入れ、そのボックスを２１℃のインキュベーター内に置く。
１）ＤＭＳＯ中の精製済み１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を冷凍庫から取り出し、卓上で解凍する。
２）１ｕｌの１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を取り、３９ｕｌの水で２５０ｐｐｍに希釈する。
３）マルチピペットを用いて、１０ｕｌの希釈済み（２５０ｐｐｍ）ピノセンブリンジヒドロカルコン溶液をマイクロプレートのウェルに入れる。
４）マルチピペットを用いて、激しく混合された４０ｕｌの胞子懸濁液接種材料をマイクロプレートのウェルに加える。
５）プレートを透明のシーラーで密封する。
６）プレートを２０００ＲＰＭで１０分間振盪して、ピノセンブリンジヒドロカルコンを菌糸懸濁液と混合する。
７）プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心し、停止して、プレートの底に液体を集める。
８）すべてのマイクロプレートのインキュベーションの準備が整うまで、プレートを実験台上に集める。
９）マイクロプレートをプラスチックボックスに入れ、そのボックスを２１℃のインキュベーター内に置く。
【0096】
プレートのスクリーニング：
１）プレートを５日、スクリーニングする：接種の４、７、１４及び２１日後。
２）ランプを使用して真菌の成長に対する化合物の効果を経時的に視覚的に評価する。
３）カバーを取り除いた後、カバーに液体（内側からの）が付着している場合は、その液体を６０℃の加熱ブロックによって蒸発させた後、プレートをスクリーニングする。
４）各ウェルの菌糸の成長を、コントロールプレートウェル（有効な殺真菌剤又は０．５％ＤＭＳＯ溶液を含むウェル）の菌糸の成長と比較する。
５）結果を専用の形式で記述する：清澄なウェル＝３（菌糸の成長なし）、正常な菌糸の構造＝１（正常な成長）、不確定＝２（予想外のタイプの中実構造又は当該範囲の部分的な被覆）。
６）結果：実施例７を参照のこと。
１）プレートを５日、スクリーニングする：接種の４、７、１４及び２１日後。
２）ランプを使用して真菌の成長に対する化合物の効果を経時的に視覚的に評価する。
３）カバーを取り除いた後、カバーに液体（内側からの）が付着している場合は、その液体を６０℃の加熱ブロックによって蒸発させた後、プレートをスクリーニングする。
４）各ウェルの菌糸の成長を、コントロールプレートウェル（有効な殺真菌剤又は０．５％ＤＭＳＯ溶液を含むウェル）の菌糸の成長と比較する。
５）結果を専用の形式で記述する：清澄なウェル＝３（菌糸の成長なし）、正常な菌糸の構造＝１（正常な成長）、不確定＝２（予想外のタイプの中実構造又は当該範囲の部分的な被覆）。
６）結果：実施例７を参照のこと。
【0097】
実施例５．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅに対するピノセンブリンジヒドロカルコンの生物活性のマイクロプレートベースアッセイ
要旨：
希釈された精製済みピノセンブリンジヒドロカルコンをマイクロプレートウェルに加え、１００ｕｌの凍結細菌懸濁液と混合し、その細菌の増殖を目視検査によってモニターした。
要旨：
希釈された精製済みピノセンブリンジヒドロカルコンをマイクロプレートウェルに加え、１００ｕｌの凍結細菌懸濁液と混合し、その細菌の増殖を目視検査によってモニターした。
【0098】
背景：
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、グラム陰性の桿菌である。６０％グリセロールの凍結細菌ストックを接種材料としてスクリーニング実験に使用した。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、グラム陰性の桿菌である。６０％グリセロールの凍結細菌ストックを接種材料としてスクリーニング実験に使用した。
【0099】
以下の材料、方法及び装置を使用した：
【0100】
材料：ＬＢ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製）、ＬＢＡ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製）、ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＵＳ製）
【0101】
装置：遠心機、振盪機、インキュベーター
【0102】
方法：
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ懸濁液の調製：
１）ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓをＬＢＡプレート上で２８℃において２日間生育して、シングルコロニーを得る。
２）滅菌されたつま楊枝を用いて、５ｍｌのＬＢを含む５０ｍｌ滅菌チューブにシングルコロニーを移し、２８℃及び１５０ＲＰＭで２４生育する。
３）チューブを冷蔵庫内で１時間冷却する。
４）そのチューブに７．５ｍｌの滅菌された冷蔵グリセロール溶液を加えて、６０％グリセロール溶液を得る。
５）十分にではあるが穏やかに混合する。
６）１００ｕｌの６０％グリセロール中の細菌懸濁液を１．５ｍｌチューブに等分する。
７）６０％グリセロール中の細菌懸濁液を－２０℃で保存する。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ懸濁液の調製：
１）ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓをＬＢＡプレート上で２８℃において２日間生育して、シングルコロニーを得る。
２）滅菌されたつま楊枝を用いて、５ｍｌのＬＢを含む５０ｍｌ滅菌チューブにシングルコロニーを移し、２８℃及び１５０ＲＰＭで２４生育する。
３）チューブを冷蔵庫内で１時間冷却する。
４）そのチューブに７．５ｍｌの滅菌された冷蔵グリセロール溶液を加えて、６０％グリセロール溶液を得る。
５）十分にではあるが穏やかに混合する。
６）１００ｕｌの６０％グリセロール中の細菌懸濁液を１．５ｍｌチューブに等分する。
７）６０％グリセロール中の細菌懸濁液を－２０℃で保存する。
【0103】
スクリーニングに向けたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ懸濁液の調製：
１）１００ｕｌの凍結Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ懸濁液を含む１．５ｍｌチューブを冷凍庫から取り出し、氷上で解凍する。
２）４０ｍｌの冷蔵ＬＢを含む５０ｍｌチューブをフード内で調製する。
３）４０ｕｌの細菌懸濁液を４０ｍｌの冷蔵ＬＢと５０ｍｌチューブ内で混合する。この量は、１０枚のマイクロプレートの活性スクリーニングにとって十分な量である。
４）この懸濁液をスクリーニング実験に使用する。
１）１００ｕｌの凍結Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ懸濁液を含む１．５ｍｌチューブを冷凍庫から取り出し、氷上で解凍する。
２）４０ｍｌの冷蔵ＬＢを含む５０ｍｌチューブをフード内で調製する。
３）４０ｕｌの細菌懸濁液を４０ｍｌの冷蔵ＬＢと５０ｍｌチューブ内で混合する。この量は、１０枚のマイクロプレートの活性スクリーニングにとって十分な量である。
４）この懸濁液をスクリーニング実験に使用する。
【0104】
活性実験に向けたマイクロプレートの準備：
１）ＤＭＳＯ中の精製済み１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を冷凍庫から取り出し、卓上で解凍する。
２）１ｕｌの１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を取り、３９ｕｌの水で２５０ｐｐｍに希釈する。
３）マルチピペットを用いて、１０ｕｌの希釈済み（２５０ｐｐｍ）ピノセンブリンジヒドロカルコン溶液をマイクロプレートのウェルに入れる。
４）マルチピペットを用いて、激しく混合された４０ｕｌの細菌懸濁液接種材料をマイクロプレートのウェルに加える。
５）プレートを透明のシーラーで密封する。
６）プレートを２０００ＲＰＭで１０分間振盪して、ピノセンブリンジヒドロカルコンを細菌懸濁液と混合する。
７）プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心し、停止して、プレートの底に液体を集める。
８）プレートをカバー付きのプラスチックボックスに入れ、そのボックスを２８℃のインキュベーター内に置く。
１）ＤＭＳＯ中の精製済み１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を冷凍庫から取り出し、卓上で解凍する。
２）１ｕｌの１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を取り、３９ｕｌの水で２５０ｐｐｍに希釈する。
３）マルチピペットを用いて、１０ｕｌの希釈済み（２５０ｐｐｍ）ピノセンブリンジヒドロカルコン溶液をマイクロプレートのウェルに入れる。
４）マルチピペットを用いて、激しく混合された４０ｕｌの細菌懸濁液接種材料をマイクロプレートのウェルに加える。
５）プレートを透明のシーラーで密封する。
６）プレートを２０００ＲＰＭで１０分間振盪して、ピノセンブリンジヒドロカルコンを細菌懸濁液と混合する。
７）プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心し、停止して、プレートの底に液体を集める。
８）プレートをカバー付きのプラスチックボックスに入れ、そのボックスを２８℃のインキュベーター内に置く。
【0105】
マイクロプレートのスクリーニング：
１）マイクロプレートを５日、スクリーニングする：接種の３、５、７、１４及び２１日後。
２）ランプを使用して、細菌の増殖を視覚的に評価する。
３）スクリーニングに向けてプレートを準備する：プレートを２０００ＲＰＭで２分間振盪して、細菌を懸濁し、次いで、プレートを１０００ＲＣＦで数秒間遠心する。
４）カバーを取り除いた後、マイクロプレートをスクリーニングする。
５）各ウェルの透明度をコントロールウェル（コントロール殺菌剤又は０．５％ＤＭＳＯ溶液を含むウェル）の透明度と比較する。結果を専用の形式で記述する：清澄＝３（細菌の増殖なし）、混濁＝１（正常な細菌の増殖）、不確定＝２（０．５％ＤＭＳＯ溶液中の増殖と比べて非常に低い濁度）。
６）結果：実施例７を参照のこと。
１）マイクロプレートを５日、スクリーニングする：接種の３、５、７、１４及び２１日後。
２）ランプを使用して、細菌の増殖を視覚的に評価する。
３）スクリーニングに向けてプレートを準備する：プレートを２０００ＲＰＭで２分間振盪して、細菌を懸濁し、次いで、プレートを１０００ＲＣＦで数秒間遠心する。
４）カバーを取り除いた後、マイクロプレートをスクリーニングする。
５）各ウェルの透明度をコントロールウェル（コントロール殺菌剤又は０．５％ＤＭＳＯ溶液を含むウェル）の透明度と比較する。結果を専用の形式で記述する：清澄＝３（細菌の増殖なし）、混濁＝１（正常な細菌の増殖）、不確定＝２（０．５％ＤＭＳＯ溶液中の増殖と比べて非常に低い濁度）。
６）結果：実施例７を参照のこと。
【0106】
実施例６．Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍに対するピノセンブリンジヒドロカルコンの生物活性のマイクロプレートベースアッセイ
要旨：
希釈された精製済みピノセンブリンジヒドロカルコンをマイクロプレートウェルに加え、５０ｕｌの凍結細菌懸濁液と混合し、その細菌の増殖を目視検査によってモニターした。
要旨：
希釈された精製済みピノセンブリンジヒドロカルコンをマイクロプレートウェルに加え、５０ｕｌの凍結細菌懸濁液と混合し、その細菌の増殖を目視検査によってモニターした。
【0107】
背景：
Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍは、グラム陰性の桿菌で、主要な植物病原体であり、多くの農業作物に多大な損害をもたらす。６０％グリセロール中の凍結細菌ストックを、スクリーニング実験用の接種材料として使用した。
Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍは、グラム陰性の桿菌で、主要な植物病原体であり、多くの農業作物に多大な損害をもたらす。６０％グリセロール中の凍結細菌ストックを、スクリーニング実験用の接種材料として使用した。
【0108】
目的：
Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍの生存及び成長に対する種々の化合物の効果を測定すること。
Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍの生存及び成長に対する種々の化合物の効果を測定すること。
【0109】
材料：ＬＢ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製）、ＬＢＡ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳ製）、ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部であるＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＵＳ製）
【0110】
装置：遠心機、振盪機、インキュベーター
【0111】
方法：
Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液の調製：
１）ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをＬＢＡプレート上で２８℃において２日間生育して、シングルコロニーを得る。
２）滅菌されたつま楊枝を用いて、５ｍｌのＬＢを含む５０ｍｌ滅菌チューブにシングルコロニーを移し、２８℃、１５０ＲＰＭで２４生育する。
３）チューブを冷蔵庫内で１時間超、冷却する。
４）そのチューブに７．５ｍｌの滅菌された冷蔵グリセロール溶液を加えて、６０％グリセロール溶液を得る。
５）十分にではあるが穏やかに混合する。
６）１００ｕｌの６０％グリセロール中の細菌懸濁液を１．５ｍｌチューブに等分する。各アリコートは、１０枚のマイクロプレートのスクリーニングにとって十分な量をもたらすはずである。
７）６０％グリセロール中の細菌懸濁液を－２０℃で保存する。
Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液の調製：
１）ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをＬＢＡプレート上で２８℃において２日間生育して、シングルコロニーを得る。
２）滅菌されたつま楊枝を用いて、５ｍｌのＬＢを含む５０ｍｌ滅菌チューブにシングルコロニーを移し、２８℃、１５０ＲＰＭで２４生育する。
３）チューブを冷蔵庫内で１時間超、冷却する。
４）そのチューブに７．５ｍｌの滅菌された冷蔵グリセロール溶液を加えて、６０％グリセロール溶液を得る。
５）十分にではあるが穏やかに混合する。
６）１００ｕｌの６０％グリセロール中の細菌懸濁液を１．５ｍｌチューブに等分する。各アリコートは、１０枚のマイクロプレートのスクリーニングにとって十分な量をもたらすはずである。
７）６０％グリセロール中の細菌懸濁液を－２０℃で保存する。
【0112】
スクリーニングに向けたＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液の調製：
１）凍結Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液（１００ｕｌを含む）の１．５ｍｌチューブを冷凍庫から取り出し、氷上で解凍する。
２）滅菌水で８倍希釈された４０ｍｌの冷蔵ＬＢブロスが入った５０ｍｌチューブをフード内で調製する。
３）８ｕｌの細菌懸濁液を４０ｍｌの冷蔵された希釈済みＬＢブロスと５０ｍｌチューブ内で混合して、成長培地が入った使用準備済のＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を生成する。
４）氷上で維持する。
５）この懸濁液をスクリーニング実験に使用する。
１）凍結Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液（１００ｕｌを含む）の１．５ｍｌチューブを冷凍庫から取り出し、氷上で解凍する。
２）滅菌水で８倍希釈された４０ｍｌの冷蔵ＬＢブロスが入った５０ｍｌチューブをフード内で調製する。
３）８ｕｌの細菌懸濁液を４０ｍｌの冷蔵された希釈済みＬＢブロスと５０ｍｌチューブ内で混合して、成長培地が入った使用準備済のＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を生成する。
４）氷上で維持する。
５）この懸濁液をスクリーニング実験に使用する。
【0113】
スクリーニング実験に向けたマイクロプレートの準備：
１）ＤＭＳＯ中の精製済み１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を冷凍庫から取り出し、卓上で解凍する。
２）１ｕｌの１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を取り、３９ｕｌの水で２５０ｐｐｍに希釈する。
３）３）マルチピペットを用いて、１０ｕｌの希釈済み（２５０ｐｐｍ）ピノセンブリンジヒドロカルコン溶液をマイクロプレートのウェルに入れる。
４）マルチピペットを用いて、激しく混合された４０ｕｌの細菌懸濁液接種材料をマイクロプレートのウェルに加える。
５）プレートを透明のシーラーで冷凍庫密封する。
６）プレートを２０００ＲＰＭで１０分間振盪して、上記材料を細菌懸濁液と混合する。
７）プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心し、停止して、プレートの底に液体を集める。
８）プレートを、カバー付きのプラスチックボックスに入れ、そのボックスを２８℃のインキュベーター内に置く。
１）ＤＭＳＯ中の精製済み１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を冷凍庫から取り出し、卓上で解凍する。
２）１ｕｌの１％ピノセンブリンジヒドロカルコンの原液を取り、３９ｕｌの水で２５０ｐｐｍに希釈する。
３）３）マルチピペットを用いて、１０ｕｌの希釈済み（２５０ｐｐｍ）ピノセンブリンジヒドロカルコン溶液をマイクロプレートのウェルに入れる。
４）マルチピペットを用いて、激しく混合された４０ｕｌの細菌懸濁液接種材料をマイクロプレートのウェルに加える。
５）プレートを透明のシーラーで冷凍庫密封する。
６）プレートを２０００ＲＰＭで１０分間振盪して、上記材料を細菌懸濁液と混合する。
７）プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心し、停止して、プレートの底に液体を集める。
８）プレートを、カバー付きのプラスチックボックスに入れ、そのボックスを２８℃のインキュベーター内に置く。
【0114】
マイクロプレートのスクリーニング：
１）マイクロプレートを５日、スクリーニングする：接種の３、５、７、１４及び２１日後。
２）ランプを使用して、細菌の増殖を視覚的に評価する。
３）スクリーニングに向けてプレートを準備する：プレートを２０００ＲＰＭで２分間振盪して、細菌を懸濁し、次いで、プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心する。
４）カバーを取り除いた後、マイクロプレートにおける細菌増殖の目視評価を行う。
５）各ウェルの透明度をコントロールウェル（有効な殺菌剤又は０．５％ＤＭＳＯ溶液を含むウェル）の透明度と比較する。
６）結果を専用の形式で記述する：清澄＝３（細菌の増殖なし）、混濁＝１（正常な細菌の増殖）、不確定＝２（０．５％ＤＭＳＯ溶液中の増殖と比べて非常に低い濁度）。
７）結果：実施例７を参照のこと。
１）マイクロプレートを５日、スクリーニングする：接種の３、５、７、１４及び２１日後。
２）ランプを使用して、細菌の増殖を視覚的に評価する。
３）スクリーニングに向けてプレートを準備する：プレートを２０００ＲＰＭで２分間振盪して、細菌を懸濁し、次いで、プレートを１０００ＲＣＦで１秒間遠心する。
４）カバーを取り除いた後、マイクロプレートにおける細菌増殖の目視評価を行う。
５）各ウェルの透明度をコントロールウェル（有効な殺菌剤又は０．５％ＤＭＳＯ溶液を含むウェル）の透明度と比較する。
６）結果を専用の形式で記述する：清澄＝３（細菌の増殖なし）、混濁＝１（正常な細菌の増殖）、不確定＝２（０．５％ＤＭＳＯ溶液中の増殖と比べて非常に低い濁度）。
７）結果：実施例７を参照のこと。
【0115】
実施例７．実施例１～６のプロトコルに基づくインビトロ実験の結果
インビトロスクリーニングマトリックス
ピノセンブリンジヒドロカルコンを、１１の農業病原体（下記の表に示されるような）に対してスクリーニングした。生物活性値は、％を単位とし、標的病原体を根絶する可能性を反映する。
インビトロスクリーニングマトリックス
ピノセンブリンジヒドロカルコンを、１１の農業病原体（下記の表に示されるような）に対してスクリーニングした。生物活性値は、％を単位とし、標的病原体を根絶する可能性を反映する。
【0116】
生物活性の相対値計算のルール（最大値からの％を単位として表現される）
ａ．Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ－活性グレード（１／２／３）×反復数／１２（最大値３×４＝１２）＊１００
ｂ．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ－活性グレード（１／２／３）×反復数×活性の日数／２５２（最大値３×４×２１＝２５２）＊１００
ｃ．Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ－活性グレード（１／２／３）×反復数×活性の日数／１６８（最大値３×４×１４＝１６８）＊１００
ｄ．Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ－活性グレード（１／２／３）×反復数×活性の日数／８４（最大値３×４×７＝１６８）＊１００
ａ．Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ－活性グレード（１／２／３）×反復数／１２（最大値３×４＝１２）＊１００
ｂ．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ－活性グレード（１／２／３）×反復数×活性の日数／２５２（最大値３×４×２１＝２５２）＊１００
ｃ．Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ－活性グレード（１／２／３）×反復数×活性の日数／１６８（最大値３×４×１４＝１６８）＊１００
ｄ．Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ－活性グレード（１／２／３）×反復数×活性の日数／８４（最大値３×４×７＝１６８）＊１００
【0117】
【表1】
【0118】
まとめると、ピノセンブリンジヒドロカルコンは、以下の病原体に対して効果的な農薬である：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ（初めての肯定的な結果が、下記の植物内での結果の項に提供されている）、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ。
【0119】
実施例８．植物内検証のための製剤調製
製剤３（主成分）用の方法
ピノセンブリンジヒドロカルコンを、０．１％の濃度になるように水に溶解し、Ｎａ２ＣＯ３の２５％溶液でｐＨをｐＨ＝７．０に調整した。実験にとって望ましい濃度（１００、２００及び３００ｐｐｍ）が得られるように、その製剤を成長培地で希釈した。
製剤３（主成分）用の方法
ピノセンブリンジヒドロカルコンを、０．１％の濃度になるように水に溶解し、Ｎａ２ＣＯ３の２５％溶液でｐＨをｐＨ＝７．０に調整した。実験にとって望ましい濃度（１００、２００及び３００ｐｐｍ）が得られるように、その製剤を成長培地で希釈した。
【0120】
実施例９．Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍに感染したキュウリ実生のピノセンブリンジヒドロカルコン処置の植物内検証
以下の材料、方法及び装置を使用した：
以下の材料、方法及び装置を使用した：
【0121】
プロトコル名：Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ感染及び化合物の有効性試験のためのキュウリ実生カップシステム
【0122】
接種システムの準備：
１）オートクレーブ可能なプラスチックシートを使用する。ビーカーの内側のサイズにぴったり合うようにそのプラスチックシートを切断する。そのプラスチックシートに６つの穴を開ける。
２）３つの１０００ｕｌチップを使用して、そのプラスチックシートをビーカー内の液体培地表面から５ｍｍ上の高さで保持する。
３）５０ｍｌの蒸留水を加える。
４）０．５％の標準的な肥料を加える。
５）布及び輪ゴムを用いてそのビーカーを覆う。
６）１２１℃で３０分間オートクレーブする。
７）フード内で感染システムを冷却し、布製の蓋を開けて、支持プラスチックシートの３つの穴に３日齢の３～４つの発芽中のキュウリ実生を入れる。
８）ビーカーを布製の蓋で覆う。
９）感染システムを２２℃の育成室内に２日間置く。
１０）実生が５日齢になったら、上記病原体を接種する。１ｍｌの病原体接種材料を成長培地に加える。
１１）接種システムを、１２時間明期、２４℃体制であるインキュベーター内に２１日間置く。
１２）約２１日後、実生の枯死率をチェックする（未処置の実生の約１００％が枯れるはずである）。枯死した実生の数を記録する。
１）オートクレーブ可能なプラスチックシートを使用する。ビーカーの内側のサイズにぴったり合うようにそのプラスチックシートを切断する。そのプラスチックシートに６つの穴を開ける。
２）３つの１０００ｕｌチップを使用して、そのプラスチックシートをビーカー内の液体培地表面から５ｍｍ上の高さで保持する。
３）５０ｍｌの蒸留水を加える。
４）０．５％の標準的な肥料を加える。
５）布及び輪ゴムを用いてそのビーカーを覆う。
６）１２１℃で３０分間オートクレーブする。
７）フード内で感染システムを冷却し、布製の蓋を開けて、支持プラスチックシートの３つの穴に３日齢の３～４つの発芽中のキュウリ実生を入れる。
８）ビーカーを布製の蓋で覆う。
９）感染システムを２２℃の育成室内に２日間置く。
１０）実生が５日齢になったら、上記病原体を接種する。１ｍｌの病原体接種材料を成長培地に加える。
１１）接種システムを、１２時間明期、２４℃体制であるインキュベーター内に２１日間置く。
１２）約２１日後、実生の枯死率をチェックする（未処置の実生の約１００％が枯れるはずである）。枯死した実生の数を記録する。
【0123】
キュウリ新芽の準備：
１）正方形の透明カバー付きプラスチックプレート［１２×１２ｃｍ］を使用する。
２）寒天水溶液（ｗａｔｅｒ ａｇａｒ）２％を調製する。８ｇの寒天を５００ｍｌボトルに入れ、４００ｍｌの蒸留水を加える。
３）１２１℃で３０分間オートクレーブする。
４）５０ｍｌの寒天水溶液２％をその正方形プレートに加え、それを覆う。
５）寒天を冷却する。
６）２０個のキュウリ種子を各プレートに播く。
７）プレートを２７℃のインキュベーター内に３日間置く。
８）実生が３日齢になったら、十分に成長した新芽を実験に使用する。この段階において、新芽の約８０％が、分岐した長い根を有するはずである。
９）寒天から新芽を引き抜く。根に寒天が残っていてはいけない。
１）正方形の透明カバー付きプラスチックプレート［１２×１２ｃｍ］を使用する。
２）寒天水溶液（ｗａｔｅｒ ａｇａｒ）２％を調製する。８ｇの寒天を５００ｍｌボトルに入れ、４００ｍｌの蒸留水を加える。
３）１２１℃で３０分間オートクレーブする。
４）５０ｍｌの寒天水溶液２％をその正方形プレートに加え、それを覆う。
５）寒天を冷却する。
６）２０個のキュウリ種子を各プレートに播く。
７）プレートを２７℃のインキュベーター内に３日間置く。
８）実生が３日齢になったら、十分に成長した新芽を実験に使用する。この段階において、新芽の約８０％が、分岐した長い根を有するはずである。
９）寒天から新芽を引き抜く。根に寒天が残っていてはいけない。
【0124】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ遊走子懸濁液の調製：
１）ＦｕｓａｒｉｕｍのＰＤＡＴブロックをＰＤＡＴプレートの中央に置き、２５℃で８日間生育する。
２）そのプレートを冷蔵庫内で約１時間冷却する。
３）菌糸及び胞子を含む寒天を１枚のプレートからメスで８片に切断し、それらを５０ｍｌ滅菌チューブに入れる。
４）２５ｍｌの冷蔵滅菌水をそのチューブに加える。
５）３０００ＲＰＭで１分間振盪する。
６）プロセスの間、胞子を氷上で維持する。
７）その液体を新しい５０ｍｌ滅菌チューブに移す。約２５ｍｌが回収されるはずである。
８）胞子懸濁液を１６層のガーゼ布で清浄な滅菌５０ｍｌチューブに直接濾過して、菌糸を廃棄する。約２０ｍｌが回収されるはずである。
９）胞子濃度を計算し、冷滅菌水で希釈して、２×１０５胞子／ｍｌストックを得る。
１０）その胞子懸濁液ストックを水で希釈して、接種胞子懸濁液（５００又は１０００胞子／ｍｌ）を得る。
１１）上記実生の根に感染させるために直ちに使用する。５０ｍｌの培地に１ｍｌの胞子懸濁液を使用する。
１２）処方されたピノセンブリンカルコンを所望の濃度となるように培地に加える。
１）ＦｕｓａｒｉｕｍのＰＤＡＴブロックをＰＤＡＴプレートの中央に置き、２５℃で８日間生育する。
２）そのプレートを冷蔵庫内で約１時間冷却する。
３）菌糸及び胞子を含む寒天を１枚のプレートからメスで８片に切断し、それらを５０ｍｌ滅菌チューブに入れる。
４）２５ｍｌの冷蔵滅菌水をそのチューブに加える。
５）３０００ＲＰＭで１分間振盪する。
６）プロセスの間、胞子を氷上で維持する。
７）その液体を新しい５０ｍｌ滅菌チューブに移す。約２５ｍｌが回収されるはずである。
８）胞子懸濁液を１６層のガーゼ布で清浄な滅菌５０ｍｌチューブに直接濾過して、菌糸を廃棄する。約２０ｍｌが回収されるはずである。
９）胞子濃度を計算し、冷滅菌水で希釈して、２×１０５胞子／ｍｌストックを得る。
１０）その胞子懸濁液ストックを水で希釈して、接種胞子懸濁液（５００又は１０００胞子／ｍｌ）を得る。
１１）上記実生の根に感染させるために直ちに使用する。５０ｍｌの培地に１ｍｌの胞子懸濁液を使用する。
１２）処方されたピノセンブリンカルコンを所望の濃度となるように培地に加える。
【0125】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ接種材料の調製：
１）Ｆｕｓａｒｉｕｍの遊走子を準備する。
２）顕微鏡下で計数し、遊走子の濃度を計算する。
３）遊走子懸濁液を冷滅菌水で希釈して、所望の濃度である５００遊走子／ｍｌを得る。
４）植物に感染させるために直ちに使用する。
１）Ｆｕｓａｒｉｕｍの遊走子を準備する。
２）顕微鏡下で計数し、遊走子の濃度を計算する。
３）遊走子懸濁液を冷滅菌水で希釈して、所望の濃度である５００遊走子／ｍｌを得る。
４）植物に感染させるために直ちに使用する。
【0126】
感染の２１日後に、結果を評価した。各処置は、それぞれ３つの実生を含む３～４つのカップを含んだ。各ポットを視覚的評価によって別々に評価し、処置の平均（３～４つのカップの平均）を計算した。
【0127】
処置：
ピノセンブリンジヒドロカルコンを異なる濃度（１００、２００及び３００ｐｐｍ）で評価し、実施例７に記載されたように処方した。
ピノセンブリンジヒドロカルコンを異なる濃度（１００、２００及び３００ｐｐｍ）で評価し、実施例７に記載されたように処方した。
【0128】
植物内検証実験の統計解析：
感染植物における化合物の効果をコントロール植物（感染させたが処置は行わなかった）と比べて評価するために、データをスチューデントのｔ検定によって解析し、ｐ値を計算した。各実験の最小反復数は、３であった。ｐ＜０．０５の場合、結果を有意とみなした。
感染植物における化合物の効果をコントロール植物（感染させたが処置は行わなかった）と比べて評価するために、データをスチューデントのｔ検定によって解析し、ｐ値を計算した。各実験の最小反復数は、３であった。ｐ＜０．０５の場合、結果を有意とみなした。
【0129】
結果：本発明者らは、育成室内の制御された環境下で３回の独立した実験を行い、ピノセンブリンジヒドロカルコン（ＰＤＣ）がキュウリ実生においてＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍを予防及び防除する可能性を推定した（図１～３）。ＰＤＣは、実施されたすべての実験において非常にうまく機能し、非常に良好な有効性を示した。感染の３週間後のＦｕｓａｒｉｕｍ病の予防及び防除におけるピノセンブリンジヒドロカルコンの有効性の範囲は、１００ｐｐｍ及び２００ｐｐｍにおいて６６～１００％であり、３００ｐｐｍにおいて８８～１００％であった。
【0130】
実施例１１～１５．さらなる植物内実験
これらの実験は、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ及びＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍに対するピノセンブリンジヒドロカルコンの殺虫活性を評価するために行われる。
これらの実験は、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ及びＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍに対するピノセンブリンジヒドロカルコンの殺虫活性を評価するために行われる。
【0131】
実施例１１．Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉに感染したキュウリ実生のピノセンブリンジヒドロカルコン処置の植物内検証
手順：
接種システムの準備：
１）オートクレーブ可能なプラスチックシートを使用する。ビーカーの内側のサイズにぴったり合うようにそのプラスチックシートを切断する。そのプラスチックシートに６つの穴を開ける。
２）３つの１０００ｕｌチップを使用して、そのプラスチックシートをビーカーの５０ｍｌの表面から５ｍｍ上の高さで保持する。
３）５０ｍｌの蒸留水を加える。
４）０．５％の標準的な肥料（２５０ｕｌ）を加える。
５）布及び輪ゴムを用いてそのビーカーを覆う。
６）（１２１℃で）３０分間オートクレーブする。
７）フード内で感染システムを冷却し、布製の蓋を開けて、支持プラスチックシートの３つの穴に２日齢の３つの発芽中のキュウリ実生を入れる。
８）ビーカーを布製の蓋で覆う。
９）感染システムを２７℃の育成室内に１日間置く。
１０）実生が４日齢になったら、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉを接種する。
１１）接種：２ｍｌを接種し、菌糸が根に付着するまで十分に培地を混合する。
１２）カップを１００ＲＰＭで常時振盪する。
１３）接種の場合、最終濃度が１重量％になるように水で希釈された液体培地において１０日間生育したＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａを使用する。ピノセンブリンジヒドロカルコンを所望の濃度まで培地に加える。
１４）コントロール群の場合、２ｍｌの水を使用する。
１５）２７℃、１２時間の明期である育成室内の振盪機（１００ＲＰＭ）上に７日間、接種システムを置く。
１６）７日後、枯れた実生の数を記録し、生存率を計算し、コントロール群と比較する。
手順：
接種システムの準備：
１）オートクレーブ可能なプラスチックシートを使用する。ビーカーの内側のサイズにぴったり合うようにそのプラスチックシートを切断する。そのプラスチックシートに６つの穴を開ける。
２）３つの１０００ｕｌチップを使用して、そのプラスチックシートをビーカーの５０ｍｌの表面から５ｍｍ上の高さで保持する。
３）５０ｍｌの蒸留水を加える。
４）０．５％の標準的な肥料（２５０ｕｌ）を加える。
５）布及び輪ゴムを用いてそのビーカーを覆う。
６）（１２１℃で）３０分間オートクレーブする。
７）フード内で感染システムを冷却し、布製の蓋を開けて、支持プラスチックシートの３つの穴に２日齢の３つの発芽中のキュウリ実生を入れる。
８）ビーカーを布製の蓋で覆う。
９）感染システムを２７℃の育成室内に１日間置く。
１０）実生が４日齢になったら、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉを接種する。
１１）接種：２ｍｌを接種し、菌糸が根に付着するまで十分に培地を混合する。
１２）カップを１００ＲＰＭで常時振盪する。
１３）接種の場合、最終濃度が１重量％になるように水で希釈された液体培地において１０日間生育したＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａを使用する。ピノセンブリンジヒドロカルコンを所望の濃度まで培地に加える。
１４）コントロール群の場合、２ｍｌの水を使用する。
１５）２７℃、１２時間の明期である育成室内の振盪機（１００ＲＰＭ）上に７日間、接種システムを置く。
１６）７日後、枯れた実生の数を記録し、生存率を計算し、コントロール群と比較する。
【0132】
キュウリ新芽の準備：
１）正方形の透明カバー付きプラスチックプレート［１２×１２ｃｍ］を使用する。
２）寒天水溶液１％を調製する。４ｇの寒天を５００ｍｌボトルに入れ、４００ｍｌの蒸留水を加える。
３）（１２１℃で）３０分間オートクレーブする。
４）５０ｍｌの寒天水溶液１％をその正方形プレートに加え、それを覆う。
５）寒天を冷却する。
６）底となるプレートの片側にマークを付ける。
７）２０個のキュウリ種子を各プレートに入れる。それらの種子を３列に並べ、その種子のとがった面が底のマークに面するように固体内へ押し込む。
８）プレートを２７℃のインキュベーター内に２日間置く。
９）実生が２日齢になったら、十分に成長した新芽を実験に使用する。この段階において、新芽の約９０％が、分岐した長い根を有するはずである。
１０）新芽を引き抜くことによって、寒天から新芽を切断する。根に寒天が残っていてはいけない。
１）正方形の透明カバー付きプラスチックプレート［１２×１２ｃｍ］を使用する。
２）寒天水溶液１％を調製する。４ｇの寒天を５００ｍｌボトルに入れ、４００ｍｌの蒸留水を加える。
３）（１２１℃で）３０分間オートクレーブする。
４）５０ｍｌの寒天水溶液１％をその正方形プレートに加え、それを覆う。
５）寒天を冷却する。
６）底となるプレートの片側にマークを付ける。
７）２０個のキュウリ種子を各プレートに入れる。それらの種子を３列に並べ、その種子のとがった面が底のマークに面するように固体内へ押し込む。
８）プレートを２７℃のインキュベーター内に２日間置く。
９）実生が２日齢になったら、十分に成長した新芽を実験に使用する。この段階において、新芽の約９０％が、分岐した長い根を有するはずである。
１０）新芽を引き抜くことによって、寒天から新芽を切断する。根に寒天が残っていてはいけない。
【0133】
Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ接種材料の調製：
１）Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａを液体培地において１０日間生育する。
２）菌糸を回収し、それを水に入れ、ブレンダーを用いて菌糸のサイズを小さくする。
３）最終濃度が１重量％になるように水で希釈する。
４）植物に感染させるために直ちに使用する。
１）Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａを液体培地において１０日間生育する。
２）菌糸を回収し、それを水に入れ、ブレンダーを用いて菌糸のサイズを小さくする。
３）最終濃度が１重量％になるように水で希釈する。
４）植物に感染させるために直ちに使用する。
【0134】
実施例１２．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅに感染したトマト実生のピノセンブリンジヒドロカルコン処置の植物内検証
手順：
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ懸濁液の調製：
１）５ｍｌのＬＢが入った５０ｍｌ滅菌チューブを準備する。
２）冷凍庫からの５０ｕｌのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓストックを入れる。
３）チューブを蓋でしっかりと閉める。
４）１５０ＲＰＭの振盪機にチューブを置き、２７℃で１６時間生育する。
５）ジャガイモ切片に感染させるために直ちに使用する。
６）水で１：１０希釈された培養物の懸濁液を調製する。
手順：
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ懸濁液の調製：
１）５ｍｌのＬＢが入った５０ｍｌ滅菌チューブを準備する。
２）冷凍庫からの５０ｕｌのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓストックを入れる。
３）チューブを蓋でしっかりと閉める。
４）１５０ＲＰＭの振盪機にチューブを置き、２７℃で１６時間生育する。
５）ジャガイモ切片に感染させるために直ちに使用する。
６）水で１：１０希釈された培養物の懸濁液を調製する。
【0135】
接種に向けたトマト実生の準備：
１）３０日齢のトマト実生を使用する。
２）その実生を小型ポットに植える。
３）１週間後、トマト実生の葉に感染させる。
１）３０日齢のトマト実生を使用する。
２）その実生を小型ポットに植える。
３）１週間後、トマト実生の葉に感染させる。
【0136】
ピノセンブリンジヒドロカルコンの適用：
１）接種前に所望の濃度で水に溶解された試験される化学物質を適用し、ドラフト内で約３時間、それが乾くのを待つ。コントロール処置として水を使用する。
１）接種前に所望の濃度で水に溶解された試験される化学物質を適用し、ドラフト内で約３時間、それが乾くのを待つ。コントロール処置として水を使用する。
【0137】
トマト実生の葉への細菌の接種：
１）１ｍｌのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ懸濁液をスプレーとして各トマト実生に適用する（シリンジスプレーツールを用いて）。
２）その細菌を２５℃のインキュベーター内でトマト実生に感染させる。
３）トマト実生の葉は、接種の約５日後に感染するはずである。
４）コントロール群には水を噴霧する。
５）斑の数を数えることにより、当該化合物の処置の効果を評価し、コントロール群と比較する。
１）１ｍｌのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ懸濁液をスプレーとして各トマト実生に適用する（シリンジスプレーツールを用いて）。
２）その細菌を２５℃のインキュベーター内でトマト実生に感染させる。
３）トマト実生の葉は、接種の約５日後に感染するはずである。
４）コントロール群には水を噴霧する。
５）斑の数を数えることにより、当該化合物の処置の効果を評価し、コントロール群と比較する。
【0138】
実施例１３．Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍに感染したジャガイモ実生における植物内検証
手順：
Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液の調製：
１）５ｍｌのＬＢが入った５０ｍｌ滅菌チューブを準備する。
２）冷凍庫からの５０ｕｌのＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍストックを入れる。
３）チューブを蓋でしっかりと閉める。
４）１５０ＲＰＭの振盪機にチューブを置き、２７℃で１６時間生育する。
５）ジャガイモ切片に感染させるために直ちに使用する。
６）水で１：１０希釈された培養物の懸濁液を調製する。
手順：
Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液の調製：
１）５ｍｌのＬＢが入った５０ｍｌ滅菌チューブを準備する。
２）冷凍庫からの５０ｕｌのＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍストックを入れる。
３）チューブを蓋でしっかりと閉める。
４）１５０ＲＰＭの振盪機にチューブを置き、２７℃で１６時間生育する。
５）ジャガイモ切片に感染させるために直ちに使用する。
６）水で１：１０希釈された培養物の懸濁液を調製する。
【0139】
接種に向けたジャガイモ塊茎の準備：
１）滅菌された２枚の紙を清浄なチップボックスに入れる。
２）滅菌条件において作業する。
３）滅菌蒸留水を加えて、紙を湿らせる。２０ｍｌ（紙は最大限に湿っているべきであるが、さらに水が滴り落ちない）。
４）４～８℃においてビニール袋内で維持された、スーパーマーケットから入手した小さいジャガイモ塊茎を使用する。
５）滅菌メスを用いて、ジャガイモの表面上に非常に小さな切れ目を作る。
６）４つの小さいジャガイモをそのボックスの中の湿った紙の上に置く。
７）プレートを蓋で覆う。
１）滅菌された２枚の紙を清浄なチップボックスに入れる。
２）滅菌条件において作業する。
３）滅菌蒸留水を加えて、紙を湿らせる。２０ｍｌ（紙は最大限に湿っているべきであるが、さらに水が滴り落ちない）。
４）４～８℃においてビニール袋内で維持された、スーパーマーケットから入手した小さいジャガイモ塊茎を使用する。
５）滅菌メスを用いて、ジャガイモの表面上に非常に小さな切れ目を作る。
６）４つの小さいジャガイモをそのボックスの中の湿った紙の上に置く。
７）プレートを蓋で覆う。
【0140】
ピノセンブリンジヒドロカルコンの適用：
１）接種前に所望の濃度で水に溶解された試験される化学物質を適用し、ドラフト内で約３時間、それが乾くのを待つ。コントロール処置として水を使用する。
１）接種前に所望の濃度で水に溶解された試験される化学物質を適用し、ドラフト内で約３時間、それが乾くのを待つ。コントロール処置として水を使用する。
【0141】
ジャガイモへの細菌の接種：
１）１ｍｌのＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を１つのボックス内の４つのジャガイモに噴霧する（シリンジスプレーツールを用いて）。
２）皿を覆う。
３）その細菌を２５℃のインキュベーター内でジャガイモに感染させる。
４）ジャガイモは、約５日後に感染するはずである。それらは、軟らかくなり、黒くなるはずである。
１）１ｍｌのＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を１つのボックス内の４つのジャガイモに噴霧する（シリンジスプレーツールを用いて）。
２）皿を覆う。
３）その細菌を２５℃のインキュベーター内でジャガイモに感染させる。
４）ジャガイモは、約５日後に感染するはずである。それらは、軟らかくなり、黒くなるはずである。
【0142】
実施例１４．Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍに感染したキュウリ実生のピノセンブリンジヒドロカルコン処置の植物内検証
手順：
接種システムの準備：
１）オートクレーブ可能なプラスチックシートを使用する。ビーカーの内側のサイズにぴったり合うようにそのプラスチックシートを切断する。そのプラスチックシートに６つの穴を開ける。
２）３つの１０００ｕｌチップを使用して、そのプラスチックシートをビーカーの５０ｍｌの表面から５ｍｍ上の高さで保持する。
３）５０ｍｌの蒸留水を加える。
４）２５０ｕｌの標準的な肥料を５０ｍｌの培地に加える。
５）布及び輪ゴムを用いてそのビーカーを覆う。
６）１２１℃で３０分間オートクレーブする。
７）フード内で感染システムを冷却し、布製の蓋を開けて、支持プラスチックシートの３つの穴に３つの発芽中（３日齢）のキュウリ実生を入れる。
８）ビーカーを布で覆う。
９）感染システムを２２℃の育成室内に２日間置く。
１０）実生が５日齢になったら、上記病原体を接種する。１ｍｌのＰｙｔｈｉｕｍ接種材料を成長培地に加える。所望の濃度になるまでピノセンブリンジヒドロカルコンを培地に加える。
１１）コントロール群の場合、２ｍｌの水を使用する。
１２）接種システムを、１２時間明期／暗期体制である２７℃のインキュベーター内に７日間置く。
１３）７日後、枯れた実生の数を記録し、生存率をコントロール群と比較する。
手順：
接種システムの準備：
１）オートクレーブ可能なプラスチックシートを使用する。ビーカーの内側のサイズにぴったり合うようにそのプラスチックシートを切断する。そのプラスチックシートに６つの穴を開ける。
２）３つの１０００ｕｌチップを使用して、そのプラスチックシートをビーカーの５０ｍｌの表面から５ｍｍ上の高さで保持する。
３）５０ｍｌの蒸留水を加える。
４）２５０ｕｌの標準的な肥料を５０ｍｌの培地に加える。
５）布及び輪ゴムを用いてそのビーカーを覆う。
６）１２１℃で３０分間オートクレーブする。
７）フード内で感染システムを冷却し、布製の蓋を開けて、支持プラスチックシートの３つの穴に３つの発芽中（３日齢）のキュウリ実生を入れる。
８）ビーカーを布で覆う。
９）感染システムを２２℃の育成室内に２日間置く。
１０）実生が５日齢になったら、上記病原体を接種する。１ｍｌのＰｙｔｈｉｕｍ接種材料を成長培地に加える。所望の濃度になるまでピノセンブリンジヒドロカルコンを培地に加える。
１１）コントロール群の場合、２ｍｌの水を使用する。
１２）接種システムを、１２時間明期／暗期体制である２７℃のインキュベーター内に７日間置く。
１３）７日後、枯れた実生の数を記録し、生存率をコントロール群と比較する。
【0143】
キュウリ新芽の準備：
１）正方形の透明カバー付きプラスチックプレート［１２×１２ｃｍ］を使用する。
２）寒天水溶液２％を調製する。８ｇの寒天を５００ｍｌボトルに入れ、４００ｍｌの蒸留水を加える。
３）１２１℃で３０分間オートクレーブする。
４）５０ｍｌの寒天水溶液２％をその正方形プレートに加え、それを覆う。
５）寒天を冷却する。
６）２０個のキュウリ種子を各プレートに播く。
７）プレートを２７℃のインキュベーター内に３日間置く。
８）実生が３日齢になったら、十分に成長した新芽を実験に使用する。この段階において、新芽の約８０％が、分岐した長い根を有するはずである。
９）寒天から新芽を引き抜く。根に寒天が残っていてはいけない。
１）正方形の透明カバー付きプラスチックプレート［１２×１２ｃｍ］を使用する。
２）寒天水溶液２％を調製する。８ｇの寒天を５００ｍｌボトルに入れ、４００ｍｌの蒸留水を加える。
３）１２１℃で３０分間オートクレーブする。
４）５０ｍｌの寒天水溶液２％をその正方形プレートに加え、それを覆う。
５）寒天を冷却する。
６）２０個のキュウリ種子を各プレートに播く。
７）プレートを２７℃のインキュベーター内に３日間置く。
８）実生が３日齢になったら、十分に成長した新芽を実験に使用する。この段階において、新芽の約８０％が、分岐した長い根を有するはずである。
９）寒天から新芽を引き抜く。根に寒天が残っていてはいけない。
【0144】
Ｐｙｔｈｉｕｍ遊走子懸濁液の調製：
１）Ｐｙｔｈｉｕｍを９０ｍｍペトリプレート内のＳｃｈｍｉｔｔｎｅｒ固形培地上で生育して、胞子形成中の菌糸を得る。約８日以内に、各プレートから２５ｍｌの遊走子懸濁液が得られる。
２）６０ｍｌの滅菌Ｈ２Ｏを２５０ｍｌ滅菌エルレンマイヤーフラスコに加える。
３）２枚のプレートの固形培地をメスで１２片に（プレート１枚につき）切断し、それらをエルレンマイヤーフラスコに入れる（固形片は水で覆われているべきである）。
４）１７℃で一晩、菌糸に胞子形成させる。
５）翌日、エルレンマイヤーフラスコを手で振盪して、遊走子を懸濁する。
６）懸濁液を１６層ガーゼで５０ｍｌチューブに濾過する。
７）遊走子懸濁液を氷上で冷却する。遊走子の濃度は、１０００～４０００胞子／ｍｌであるべきである。
１）Ｐｙｔｈｉｕｍを９０ｍｍペトリプレート内のＳｃｈｍｉｔｔｎｅｒ固形培地上で生育して、胞子形成中の菌糸を得る。約８日以内に、各プレートから２５ｍｌの遊走子懸濁液が得られる。
２）６０ｍｌの滅菌Ｈ２Ｏを２５０ｍｌ滅菌エルレンマイヤーフラスコに加える。
３）２枚のプレートの固形培地をメスで１２片に（プレート１枚につき）切断し、それらをエルレンマイヤーフラスコに入れる（固形片は水で覆われているべきである）。
４）１７℃で一晩、菌糸に胞子形成させる。
５）翌日、エルレンマイヤーフラスコを手で振盪して、遊走子を懸濁する。
６）懸濁液を１６層ガーゼで５０ｍｌチューブに濾過する。
７）遊走子懸濁液を氷上で冷却する。遊走子の濃度は、１０００～４０００胞子／ｍｌであるべきである。
【0145】
Ｐｙｔｈｉｕｍ接種材料の調製：
１）Ｐｙｔｈｉｕｍ遊走子を準備する。
２）顕微鏡下で計数し、遊走子の濃度を計算する。
３）遊走子懸濁液を冷滅菌水で希釈して、所望の濃度である５００遊走子／ｍｌを得る。植物に感染させるために直ちに使用する。
１）Ｐｙｔｈｉｕｍ遊走子を準備する。
２）顕微鏡下で計数し、遊走子の濃度を計算する。
３）遊走子懸濁液を冷滅菌水で希釈して、所望の濃度である５００遊走子／ｍｌを得る。植物に感染させるために直ちに使用する。
【0146】
実施例１５．ＧＨ（温室）条件下における、Ｆｕｓａｒｉｕｍ感染に感染したキュウリ実生のピノセンブリンジヒドロカルコン処置の植物内検証
概要：Ｆｕｓａｒｉｕｍを別々に増やし、次いで、適正な齢において、トレーに置かれた土壌におけるキュウリ実生に病原体菌糸を感染させる。接種の約７、１４及び２１日後に、病気の重症度を観察する。Ｆｕｓａｒｉｕｍを接種する約２４時間前に、植物をピノセンブリンジヒドロカルコンで処置する。接種の約２１日後に、病気の重症度を解析する。
概要：Ｆｕｓａｒｉｕｍを別々に増やし、次いで、適正な齢において、トレーに置かれた土壌におけるキュウリ実生に病原体菌糸を感染させる。接種の約７、１４及び２１日後に、病気の重症度を観察する。Ｆｕｓａｒｉｕｍを接種する約２４時間前に、植物をピノセンブリンジヒドロカルコンで処置する。接種の約２１日後に、病気の重症度を解析する。
【0147】
Ｆｕｓａｒｉｕｍ接種材料の調製：
１）１０ｍｌのキヌア種子を１００ｍｌボトルに入れる。５０ｍｌチューブを使用して、その体積を計測する。
２）１０ｍｌの滅菌蒸留水を加える。
３）冷蔵庫内で２４時間、種子に水を吸収させる。
４）２４時間後、ボトルの上部に発芽用布（ｂｉｒｔｈｉｎｇ ｃｌｏｔｈ）を置き、上部の青い蓋をゆるく閉める。
５）（１２１℃で）４０分間オートクレーブする［液体サイクル］。
６）フード内で冷却させ、蓋を取り除く。
７）ＰＤＡＣプレート上で生育したＦｕｓａｒｉｕｍの小塊を接種する。
８）発芽用布及び蓋を戻す。
９）真菌の名称及び日付を記載する。
１０）固相生育ボトルを２７℃のインキュベーター内に置く。
１１）８～１０日後、Ｆｕｓａｒｉｕｍは、植物に接種される準備が整うはずである。
１２）ｆｕｓａｒｉｕｍ菌糸をホモジナイズする：
Ａ．２５０ｍｌビーカー及びスティックブレンダーを使用して、混合物を調製する。
Ｂ．１００ｍｌの水を加える。
Ｃ．１ｇのＦｕｓａｒｉｕｍ固相培養物を加えて、１％菌糸懸濁液を得る。
Ｄ．氷上で２分間、高速でホモジナイズする。
Ｅ．ホモジナイズされた菌糸懸濁液を滅菌水で希釈して、０．５％菌糸懸濁液を得る。
Ｆ．ホモジナイズされた希釈済み菌糸懸濁液（０．５％）を直ちに使用して、土壌系における実生に接種する。
１）１０ｍｌのキヌア種子を１００ｍｌボトルに入れる。５０ｍｌチューブを使用して、その体積を計測する。
２）１０ｍｌの滅菌蒸留水を加える。
３）冷蔵庫内で２４時間、種子に水を吸収させる。
４）２４時間後、ボトルの上部に発芽用布（ｂｉｒｔｈｉｎｇ ｃｌｏｔｈ）を置き、上部の青い蓋をゆるく閉める。
５）（１２１℃で）４０分間オートクレーブする［液体サイクル］。
６）フード内で冷却させ、蓋を取り除く。
７）ＰＤＡＣプレート上で生育したＦｕｓａｒｉｕｍの小塊を接種する。
８）発芽用布及び蓋を戻す。
９）真菌の名称及び日付を記載する。
１０）固相生育ボトルを２７℃のインキュベーター内に置く。
１１）８～１０日後、Ｆｕｓａｒｉｕｍは、植物に接種される準備が整うはずである。
１２）ｆｕｓａｒｉｕｍ菌糸をホモジナイズする：
Ａ．２５０ｍｌビーカー及びスティックブレンダーを使用して、混合物を調製する。
Ｂ．１００ｍｌの水を加える。
Ｃ．１ｇのＦｕｓａｒｉｕｍ固相培養物を加えて、１％菌糸懸濁液を得る。
Ｄ．氷上で２分間、高速でホモジナイズする。
Ｅ．ホモジナイズされた菌糸懸濁液を滅菌水で希釈して、０．５％菌糸懸濁液を得る。
Ｆ．ホモジナイズされた希釈済み菌糸懸濁液（０．５％）を直ちに使用して、土壌系における実生に接種する。
【0148】
土壌系における植物の接種：
１）実生トレー内の苗床からのキュウリの実生を使用する。実生は、６日齢（播種後）であって実際の第一葉が出る前か出たばかりのものであるべきである。
２）キュウリ実生が入ったトレーを灌水システム下の温室の台に置いて（温度２０±２７℃、光を補わない）、実生の発芽を可能にし、過剰な水は、円錐形のトレーから自由に出ていくはずである。
３）播種から６日目に、処置を適用するべきである（処方されたピノセンブリンジヒドロカルコン）。処置の２４時間後に接種を行うべきである。各植物を６ｍｌの製剤で処置し、同様に、接種の際の実生への体積は６ｍｌであるべきである。処置及び接種は、根圏に均等に分布すると予想される。
４）トレーに実験番号のしるしを付け、実験ページの処置及び接種の日付を更新する。
１）実生トレー内の苗床からのキュウリの実生を使用する。実生は、６日齢（播種後）であって実際の第一葉が出る前か出たばかりのものであるべきである。
２）キュウリ実生が入ったトレーを灌水システム下の温室の台に置いて（温度２０±２７℃、光を補わない）、実生の発芽を可能にし、過剰な水は、円錐形のトレーから自由に出ていくはずである。
３）播種から６日目に、処置を適用するべきである（処方されたピノセンブリンジヒドロカルコン）。処置の２４時間後に接種を行うべきである。各植物を６ｍｌの製剤で処置し、同様に、接種の際の実生への体積は６ｍｌであるべきである。処置及び接種は、根圏に均等に分布すると予想される。
４）トレーに実験番号のしるしを付け、実験ページの処置及び接種の日付を更新する。
【0149】
生育及び解析：
２）肥料（４０ｐｐｍ）を補充し、トレー下灌水（ｂｅｌｏｗ ｔｒａｙ ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ）を用いて、キュウリを７、１４及び２１日間生育する。７日目に、すべての植物を１００ｍｌトレーに移動して、さらなる植物の成長を可能にする。
３）７、１４及び２１日目に病気の発生を追跡調査する。
４）実生／植物が乾燥するまで、実生の子葉は、黄色くなるはずである（病気の症状）。
５）病気の実生及び枯れた実生の計数は、接種の７、１４、２１日後に行うべきである。
６）各処置あたりの乾燥した／枯れた植物のパーセンテージを計算する。
７）以下の処置が本実験に含められる：処方されたピノセンブリンジヒドロカルコン、産業用の参照製品、ブランク（水）。
２）肥料（４０ｐｐｍ）を補充し、トレー下灌水（ｂｅｌｏｗ ｔｒａｙ ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ）を用いて、キュウリを７、１４及び２１日間生育する。７日目に、すべての植物を１００ｍｌトレーに移動して、さらなる植物の成長を可能にする。
３）７、１４及び２１日目に病気の発生を追跡調査する。
４）実生／植物が乾燥するまで、実生の子葉は、黄色くなるはずである（病気の症状）。
５）病気の実生及び枯れた実生の計数は、接種の７、１４、２１日後に行うべきである。
６）各処置あたりの乾燥した／枯れた植物のパーセンテージを計算する。
７）以下の処置が本実験に含められる：処方されたピノセンブリンジヒドロカルコン、産業用の参照製品、ブランク（水）。
【0150】
［参考文献］
Erlacher A., Cardinale M., Grosch R., Grube M., Berg G. The impact of the pathogen Rhizoctonia solani and its beneficial counterpart Bacillus amyloliquefaciens on the indigenous lettuce microbiome. Front Microbiol. 2014; 5: 175.
Hofte M. and De Vos P. Plant pathogenic pseudomonas species. Gnanamanickam S.S. (ed.), Plant-Associated Bacteria, 2006; 507-533.
Jenkins J.E.E., Clark Y.S. and Buckle A.E. Fusarium diseases of cereals. Research Review 4. October 1988.
Frank N. Martin & Joyce E. Loper. Soilborne Plant Diseases Caused by Pythium spp.: Ecology, Epidemiology, and Prospects for Biological Control. Critical Reviews in Plant Sciences, 1999; 18:111-181.
Dong Hwan Lee, Jeong-A Lim, Juneok Lee, Eunjung Roh, Kyusuk Jung, Minseon Choi, Changsik Oh, Sangryeol Ryu, Jongchul Yun, Sunggi Heu. Characterization of genes required for the pathogenicity of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Pcc21 in Chinese cabbage. Microbiology. 2013 Jul; 159(Pt 7): 1487-1496.
Moore. L.W. Pseudomonas syringae: disease and ice nucleation activity. Ornamentals Northwest Newsletter. (1988) 12:4-16.
Erlacher A., Cardinale M., Grosch R., Grube M., Berg G. The impact of the pathogen Rhizoctonia solani and its beneficial counterpart Bacillus amyloliquefaciens on the indigenous lettuce microbiome. Front Microbiol. 2014; 5: 175.
Hofte M. and De Vos P. Plant pathogenic pseudomonas species. Gnanamanickam S.S. (ed.), Plant-Associated Bacteria, 2006; 507-533.
Jenkins J.E.E., Clark Y.S. and Buckle A.E. Fusarium diseases of cereals. Research Review 4. October 1988.
Frank N. Martin & Joyce E. Loper. Soilborne Plant Diseases Caused by Pythium spp.: Ecology, Epidemiology, and Prospects for Biological Control. Critical Reviews in Plant Sciences, 1999; 18:111-181.
Dong Hwan Lee, Jeong-A Lim, Juneok Lee, Eunjung Roh, Kyusuk Jung, Minseon Choi, Changsik Oh, Sangryeol Ryu, Jongchul Yun, Sunggi Heu. Characterization of genes required for the pathogenicity of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Pcc21 in Chinese cabbage. Microbiology. 2013 Jul; 159(Pt 7): 1487-1496.
Moore. L.W. Pseudomonas syringae: disease and ice nucleation activity. Ornamentals Northwest Newsletter. (1988) 12:4-16.
【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】