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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-08
(54)【発明の名称】オリゴヌクレオチド合成装置およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C07H 21/00 20060101AFI20230201BHJP
【ＦＩ】
C07H21/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022532754
(86)(22)【出願日】2020-12-02
(85)【翻訳文提出日】2022-07-21
(86)【国際出願番号】 EP2020084324
(87)【国際公開番号】W WO2021110773
(87)【国際公開日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】19212971.6
(32)【優先日】2019-12-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522187708
【氏名又は名称】バッヘン・アクチエンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】アンドレアス・エミシェガー
(72)【発明者】
【氏名】ブラニスラフ・デュゴヴィッチ
(72)【発明者】
【氏名】マリオ・ジョーカー
(72)【発明者】
【氏名】マルティン・シュタウス
【テーマコード（参考）】
4C057
【Ｆターム（参考）】
4C057AA10
4C057BB02
4C057CC03
4C057MM01
(57)【要約】
本発明は、オリゴヌクレオチドおよび関連する化合物を合成するための装置および方法を提供する。特に、本発明は、そのようなオリゴマーを合成するための装置中に供給される試薬を効果的に製造することを可能とする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
オリゴヌクレオチド自動合成装置であって：ｅ）液体導管（９）を介して廃棄物容器（７）に接続された反応槽（６）と；
ｆ）反応槽（６）に液体試薬を送るための液体供給部（１９）と；
ｇ）反応槽（６）を通過させることなく液体供給部（１９）から廃棄物容器（７）中へ液体流を移動させるバイパス導管（１１）と；
ｈ）制御部（８）と
を含み、液体供給部（１９）は：
ｂ－１）少なくとも１つの混合装置（５）と、
ｂ－２）該少なくとも１つの混合装置に接続された少なくとも２つの液体供給ライン（１、２）であって、各液体供給ラインは、ｎが１から２５の間の整数であるｎ個の液体入口（ｉ１－ｎ、ｉ２－ｎ）を有する少なくとも１つの液体導管（ｌ１、ｌ２）、および少なくとも１つのポンプ（ｐ１、ｐ２）を含む、少なくとも２つの液体供給ラインと
を含む、前記オリゴヌクレオチド自動合成装置。
【請求項2】
少なくとも少なくとも１つの混合装置（５）および少なくとも２つの液体供給ライン（１、２）のうちの１つの内面は、耐酸性材料から作製される、および／または耐酸性被膜を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項3】
少なくとも少なくとも１つの混合装置（５）および少なくとも２つの液体供給ライン（１、２）のうちの１つの内面は、耐酸性合金から作製される、および／または耐酸性高分子被膜を含む、請求項２に記載の装置。
【請求項4】
液体供給部（１９）は、少なくとも１つの混合装置（５）に接続された第３の液体供給ライン（３）をさらに含み、前記第３の液体供給ライン（３）は、ｎ個の液体入口（ｉ３－ｎ）を有する少なくとも１つの液体導管（ｌ３）および少なくとも１つの液体ポンプ（ｐ３）を含み、ここで、ｎは１から２５の間の整数である、請求項１～３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項5】
少なくとも１つの混合装置（５）は、スタティックミキサを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項6】
少なくとも１つの混合装置（５）の下流に位置付けられ、混合装置（５）から出てくる液体の少なくとも１つの性質を決定するｎ個のセンサ（ｓ１～ｓｎ）をさらに含み、ここで、ｎは１以上の整数である、請求項１～５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項7】
センサ（ｓ１～ｓｎ）の少なくとも１つによって提供される少なくとも１つの計測値は、液体供給部（１９）に含まれる１つまたはそれ以上のポンプの活動を調整するためのフィードバック信号として使用される、請求項６に記載の装置。
【請求項8】
センサ（ｓ１～ｓｎ）の少なくとも１つによって提供される少なくとも１つの計測値は、液体流を反応槽（６）中に移動させるか、または反応槽（６）を通過させずに廃棄物容器（７）中に移動させるかを制御するために使用される、請求項６または７に記載の装置。
【請求項9】
少なくとも１つの混合装置（５）の上流の少なくとも２つの液体供給ライン（１、２）の各々に一体化される少なくとも１つの流量センサ（２４）をさらに含み、前記流量センサによって提供される少なくとも１つの計測値は、少なくとも１つのポンプ（ｐ１、ｐ２）のうちの１つまたはそれ以上の活動を調整するためのフィードバック信号として使用される、請求項１～８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項10】
液体供給部（１９）は、少なくとも１つの熱交換器（１３）をさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項11】
導電率センサ、温度センサ、およびＵＶ吸収センサを含む、請求項６～１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項12】
反応槽（６）は、充填カラム反応器またはバッチ式反応器である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項13】
反応槽を廃棄物容器に接続する液体導管（９）からの流れを、ポンプ（１７）によって反応槽（６）へ戻すよう移動させる再循環回路をさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項14】
再循環回路は、その入口（ｉ１－ｎ、ｉ２－ｎ）の１つおよび多方弁（１２）を介して液体導管（９）へ接続された少なくとも２つの液体供給ライン（１、２）のうちの１つに含まれ、そのポンプ（ｐ１、ｐ２）は、反応槽と廃棄物容器を接続する液体導管（９）から少なくとも１つの混合装置（５）を介して反応槽中に戻る流体の再循環を駆動することができる、請求項１３に記載の装置。
【請求項15】
カップリングサイクルを少なくとも２回反復させるオリゴヌクレオチドを合成する手順を実行し、該手順は、各カップリングサイクルに対し酸性脱保護試薬の組成を個別に定める、請求項２～１４のいずれか１項に記載の装置の使用。
【請求項16】
ビルディングブロックカップリングサイクルを繰り返すことによって自動的にオリゴヌクレオチド鎖を組み立てる方法であって、各ビルディングブロックカップリングサイクルにおいて以下の工程１から工程６：１．固体支持体に結合するｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドであって、組み込まれるビルディングブロックに含まれる第２の反応基と反応することによってオリゴヌクレオチド主鎖を伸長させることができる第１の反応基を含み、ここで、ｎは１以上の整数である、オリゴヌクレオチドを供給する工程；
２．ｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドの第１の反応基と反応することができる第２の反応基を含み、一時的な酸感受性保護基でブロックされた第１の反応基をさらに含む組み込まれるビルディングブロックを供給する工程；
３．ｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドの第１の反応基が、組み込まれるビルディングブロックの第２の反応基に結合することが可能な条件下で、組み込まれるビルディングブロックにｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドを接触させ、さらに伸長しないよう一時的な酸感受性保護基によってブロックされた、保護されかつ伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドを生成する工程；
４．少なくとも２つの液体組成物を混合することによって酸性脱保護試薬を製造する工程；
５．工程３の保護されかつ伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドを、工程４の酸性脱保護試薬に接触させ、それによって伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドから一時的な酸感受性保護基を切断する工程；および
６．伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドから脱保護試薬および可溶性切断産物を除去し、その後のカップリサイクルにおける工程１でｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドとして使用する工程
が改めて行われる、前記方法。
【請求項17】
脱保護試薬の組成は、少なくとも２つのカップリングサイクルで異なる、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
脱保護試薬の組成は、各カップリングサイクルに対し個別に定められる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項19】
脱保護試薬中の酸の含有量は、各カップリングサイクルに対し個別に０．１％（ｗ／ｗ）から５０％（ｗ／ｗ）の酸の範囲から選択される、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
酸感受性の一時的な保護基は、トリチル型の保護基である、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
第１の反応基は水酸基である、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
第２の反応基は、ホスホロアミダイト基およびＨ－ホスホン酸モノエステル基からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
工程３は、亜リン酸トリエステル基の形成が可能な条件下でビルディングブロックとｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドを接触させることと、結果として得られた化合物を酸化試薬または硫化試薬と混合して亜リン酸トリエステル基をリン酸トリエステル基またはチオリン酸トリエステル基にそれぞれ変換することとを含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、全体として、工業規模または実験室規模でのオリゴマー合成の分野に関する。オリゴマー、特にオリゴヌクレオチドおよび関連する高分子を合成するための改善された方法および装置が開示される。特に、本発明は、そのようなオリゴマーを合成するための装置に供給される試薬の効率的な製造を可能にする。
【背景技術】
【0002】
オリゴヌクレオチドおよび関連するオリゴマーは、一般的に用いられるホスホロアミダイト法を含む様々な合成戦略によって製造される。合成戦略は、一般的に、モノマービルディングブロックまたはオリゴマービルディングブロック、例えばヌクレオシドホスホロアミダイトの、成長するオリゴマー鎖への段階的な付加を含む。通常、成長するオリゴマー鎖はヌクレオチドまたはそれらの類似体で構成され、例えばリボース部分の水酸基を介して固体支持体に固定される。オリゴマー鎖上の反応性基は、意図せぬ反応を起こさないよう適切な保護基によってブロックされる。例えば、成長するオリゴヌクレオチド鎖は、３’水酸基を介して固体支持体に固定され、かつ反応を起こさないようリボース部分の水酸基部分および塩基部分の外環アミノ基をブロックするために、表１に挙げられるような保護基を担持することができる。
【0003】
【表1】
【0004】
一般的に、化学的なオリゴヌクレオチドの反復的合成法は、通常、鎖の伸長に関与しない塩基／塩基類似体およびリボース／リボース類似部分に配置される官能基に対する第１のタイプの保護基の使用、ならびに主鎖の伸長を制御するための第２のタイプの一時的な保護基の使用に依拠する。一時的な保護基は、ビルディングブロックの二重挿入またはビルディングブロック部位の多量体化を避けるために、付加されるビルディングブロック上に配置される。第１および第２のタイプの保護基は互いに直交し、これは、他方のタイプの保護基に影響を与えない条件下で一方のタイプを除去することが可能であることを意味する。一般的に、第１のタイプの保護基はアルカリ性条件下で切断可能であり、鎖の組立が完了した時点で初めて除去されるという点において「不変」である。第２のタイプの一時的な保護基は酸性条件下で切断可能であり、合成サイクルごとに１回除去される。したがって、カップリングサイクルは、保護されたビルディングブロックをオリゴヌクレオチド主鎖の非保護末端に連結させ、その後、続くカップリングサイクルに備えるために、こうして伸長したオリゴヌクレオチドを脱保護する工程を含む。
【0005】
ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成の場合、合成サイクルは、通常、５’水酸基の選択的脱保護から始まる。これは、脱保護試薬ＤＲ、通常はＤＭＴ基を除去可能な脱トリチル化試薬と共に固体支持体をインキュベートすることで達成される。次に、成長するオリゴヌクレオチド鎖を、適切に保護されたヌクレオシドホスホロアミダイトを含むカップリング試薬ＣＲおよび活性化試薬と共にインキュベートする。次いで、カップリング反応から生じた三配位亜リン酸トリエステルを、酸化試薬ＯＲを用いて酸化してリン酸トリエステルを生成する。ホスホロチオアートまたはホスホロジチオアート合成の場合、硫化試薬ＳＲを用い、酸化の代わりに硫化が行われ、ホスホロチオアートトリエステルを生成する。キャッピング工程は、ブロッキング試薬ＢＲとも称されるキャッピング試薬と共に固体支持体をインキュベートして樹脂上のあらゆる未反応基を
ブロックすることで、続くカップリング段階における配列欠失の発生を防止する工程を含む。他の場合において、三配位亜リン酸トリエステルの酸化の前または後にキャッピングを行うことができる。各工程の間で、処理溶媒、典型的にはアセトニトリルまたはトルエンを用いて樹脂を洗浄することができる。成長するオリゴヌクレオチド鎖は、考えられる任意の方法で、例えば、外環アミンを介して、またはリボース／リボース類似部分の水酸基を介して、固体支持体に固定される。また、５’－ホスホロアミダイトが付加される逆５’－３’オリゴヌクレオチド合成といった、ホスホロアミダイト合成の変形例が開示されている。
ブロックすることで、続くカップリング段階における配列欠失の発生を防止する工程を含む。他の場合において、三配位亜リン酸トリエステルの酸化の前または後にキャッピングを行うことができる。各工程の間で、処理溶媒、典型的にはアセトニトリルまたはトルエンを用いて樹脂を洗浄することができる。成長するオリゴヌクレオチド鎖は、考えられる任意の方法で、例えば、外環アミンを介して、またはリボース／リボース類似部分の水酸基を介して、固体支持体に固定される。また、５’－ホスホロアミダイトが付加される逆５’－３’オリゴヌクレオチド合成といった、ホスホロアミダイト合成の変形例が開示されている。
【0006】
ホスホナートオリゴヌクレオチド合成の場合、ＤＭＴといった一時的な酸感受性保護基を有するヌクレオシドＨ－ホスホナートモノエステルが使用される。ヌクレオシド間のＨ－ホスホナートジエステル結合は、鎖の組立の終了時に酸化される。使用される反応条件に依存し、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロセレノアートまたはホスホロアミダート類似体をこの工程で生成することができる。
【0007】
使用される厳密な手順に依存し、上記の試薬の組成は変化する可能性がある。表２は、一般的に使用される組成の非限定的な概要である。
【0008】
【表2】
【0009】
特許文献１および特許文献２は、オリゴヌクレオチド製造装置を開示する。市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置は、脱保護溶液ＤＳ、酸化溶液ＯＳ、および硫化溶液ＳＳが予め作られてタンクに入った状態で提供され、１つまたはそれ以上のポンプ回路によって合成反応器に利用されるよう構成される。ブロッキング溶液ＢＳは、２つの予め作られた溶液をインラインで混合することにより製造される。カップリング溶液ＣＳは、アセトニトリル中のホスホロアミダイトの溶液を、活性化剤の溶液と組み合わせることによって合成装置内で混合される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】ＵＳ２００８／００５８５１２
【特許文献2】ＵＳ５，６８１，５３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
しかし、この設計は、特定のカップリングサイクル用に、例えば脱保護剤の濃度を変えることによって試薬組成を「微調整」することができないという欠点がある。さらに、大規模なタンク群を用意する必要があり、合成のスケールアップは、タンクの容量によって制限される。これらの問題を克服するために、本発明は、全ての試薬をインライン混合によってオンデマンドで製造することができる、改良されたオリゴヌクレオチド合成装置を提供する。純粋な液体試薬は、各貯蔵容器から直接系内に供給することができる。液体以外の試薬は、濃縮された原液として系内に供給することができる。さらなる改良点として、本発明は、カラムベッド反応器の代わりにバッチ式反応器を含むオリゴヌクレオチド合成装置を提供し、それによって、合成方法を実行し制御するためのさらなる選択肢をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【0012】
１つの特定の態様において、本発明は、各カップリングサイクルに対し脱保護試薬の組成を定めることによって脱保護試薬の組成を「微調整」する方法を提供する。脱保護工程は、例えば脱プリン化に起因するオリゴヌクレオチド中間体の酸触媒による劣化を回避することと、保護基の効率的な除去を達成することとの間の微妙なバランスを維持する必要がある旨が、以前に報告されている。この課題を解決するために、様々な脱保護組成物が比較されており、例えば、Ｓｅｐｔａｋは、３％のＤＣＡまたは３％のＴＣＡではなく１５％のＤＣＡを使用することを教示している（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６年、２４巻、１５号、３０５３～３０５８ページ）。しかし、本発明者らの知る限り、オリゴヌクレオチドの自動合成法は、全て、所与の合成の全てのサイクルにおいて同一の脱保護剤の使用に依拠する。一方、本発明は、各カップリングサイクルに対し脱保護試薬の組成を個別に調整するための装置および方法を提供する。
【0013】
したがって、本発明の１つの実施形態は、オリゴヌクレオチド自動合成装置であって：
ａ）液体導管を介して廃棄物容器に接続された反応槽と；
ｂ）反応槽に液体試薬を送るための液体供給部と；
ｃ）反応槽を通過させることなく液体供給部から廃棄物容器中へ液体流を移動させることをバイパス導管と；
ｄ）制御部と
を含み、液体供給部は：
ｂ－１）少なくとも１つの混合装置と
ｂ－２）少なくとも１つの混合装置に接続された少なくとも２つの液体供給ラインであって、各液体供給ラインは、ｎが１から２５の間の整数であるｎ個の液体入口を有する少なくとも１つの液体導管、および少なくとも１つの液体ポンプを含む、少なくとも２つの液体供給ラインと
を含む、オリゴヌクレオチド自動合成装置に関する。
ａ）液体導管を介して廃棄物容器に接続された反応槽と；
ｂ）反応槽に液体試薬を送るための液体供給部と；
ｃ）反応槽を通過させることなく液体供給部から廃棄物容器中へ液体流を移動させることをバイパス導管と；
ｄ）制御部と
を含み、液体供給部は：
ｂ－１）少なくとも１つの混合装置と
ｂ－２）少なくとも１つの混合装置に接続された少なくとも２つの液体供給ラインであって、各液体供給ラインは、ｎが１から２５の間の整数であるｎ個の液体入口を有する少なくとも１つの液体導管、および少なくとも１つの液体ポンプを含む、少なくとも２つの液体供給ラインと
を含む、オリゴヌクレオチド自動合成装置に関する。
【0014】
したがって、本発明の別の態様は、オリゴマー合成装置であって：
ａ）液体導管を介して廃棄物容器に接続された反応槽と；
ｂ）反応槽に液体試薬を送るための液体供給部と；
ｃ）反応槽を通過させることなく液体供給部から廃棄物容器中へ液体流を移動させるバイパス導管と；
ｄ）制御部と
を含み、液体供給部は：
ｂ－１）少なくとも１つの混合装置と、
ｂ－２）少なくとも１つの混合装置に接続された少なくとも４つの上流液体供給ラインであって、各上流液体供給ラインは、ｎが１から２５の間の整数であるｎ個の液体入口を有する１つの液体導管、および１つの液体ポンプを含む、少なくとも４つの上流液体供給ラインと；
ｂ－３）ｎが１以上の整数であるｎ個のセンサとを含み、これらのセンサは、混合装置の下流に位置付けられ、混合装置から出てくる液体の少なくとも１つの性質を決定し、センサによって提供される少なくとも１つの計測値は、１つまたはそれ以上の液体ポンプの活動を調整するためのフィードバック信号として使用される、オリゴマー合成装置に関する。
ａ）液体導管を介して廃棄物容器に接続された反応槽と；
ｂ）反応槽に液体試薬を送るための液体供給部と；
ｃ）反応槽を通過させることなく液体供給部から廃棄物容器中へ液体流を移動させるバイパス導管と；
ｄ）制御部と
を含み、液体供給部は：
ｂ－１）少なくとも１つの混合装置と、
ｂ－２）少なくとも１つの混合装置に接続された少なくとも４つの上流液体供給ラインであって、各上流液体供給ラインは、ｎが１から２５の間の整数であるｎ個の液体入口を有する１つの液体導管、および１つの液体ポンプを含む、少なくとも４つの上流液体供給ラインと；
ｂ－３）ｎが１以上の整数であるｎ個のセンサとを含み、これらのセンサは、混合装置の下流に位置付けられ、混合装置から出てくる液体の少なくとも１つの性質を決定し、センサによって提供される少なくとも１つの計測値は、１つまたはそれ以上の液体ポンプの活動を調整するためのフィードバック信号として使用される、オリゴマー合成装置に関する。
【0015】
好ましくは、装置は、オリゴヌクレオチド、特にリボ核酸、２’－デオキシリボ核酸、オリゴヌクレオチドホスホロチオアート、ゼノ核酸、および関連する分子の固相合成に使用される。一部の実施形態において、装置は、ホスホロアミダイト法による固相合成方法に使用される。
【0016】
以下の図およびそれらの説明は、例示のみを目的として提供され、特許請求の範囲を限定すると解釈されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】４つの液体供給ラインを有するオリゴマー自動合成装置に関する基本的な実施形態である。
【図2】再循環導管を追加で含む装置に関するさらなる実施形態である。
【図3】液体供給ラインの１つが再循環回路として機能する装置に関するさらなる実施形態である。
【図4】貯蔵槽を有する装置に関するさらなる実施形態である。
【図5】多岐管を含む装置に関する別の実施形態である。
【図6】２つの混合装置および多岐管を含む装置に関する別の実施形態である。
【図7】２つの液体供給ラインを有する装置に関するさらなる実施形態である。
【図8】２つの液体供給ラインおよび再循環回路を有する装置に関する別の実施形態である。
【図12】３つの液体供給ラインを有し、液体供給ラインのうちの１つが再循環回路として機能する装置に関する別の実施形態である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という表現は、例えばホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ジアステレオマーとして純粋なホスホロチオアート、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、ヒ酸ジエステル、およびホスホロセレノアートにおいてみられるような、ホスホロジエステル部分または類似構造によって結合する少なくとも２つのヌクレオチド単位を含む任意のオリゴマーに関する最も一般的な意味で使用される。天然のヌクレオシド単位は、通常、リボースまたは２’－デオキシリボース部分、ならびにアデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルから選択される核酸塩基を含む。本明細書で使用されるヌクレオシド単位という表現は、天然のヌクレオシドだけでなく、人工化合物も包含する。後者は、リボース／リボース類縁部分中に置換基、例えば－Ｆ、－ＯＭｅ（－Ｏ－ＣＨ３）、もしくはメトキシエチル（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、ＭＯＥ、－Ｏ－メトキシエチルとしても知られる）置換基を担持することができるか、またはリボースは、２’水酸基と４’炭素を連結するさらなるメチレン架橋で修飾されるか、またはリボース部分は、ペントース（例えば、アラビノース）もしくはヘキソースといった別の環状単糖類によって、非環状単糖類（例えば、トレオース）によって、もしくは例えばシクロヘキセン、トレオニノール、セリノール、もしくはグリコールといった代替の構造によって置換される。本明細書において、これらの物質は、全て「リボース類似体」と称される。同様に、人工ヌクレオシドは、非標準塩基、核酸塩基の人工類似体、または脱塩基部位を呈することができる。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）以外のオリゴヌクレオチドの非限定的な例は、ロック核酸（ＬＮＡ）、アミノＬＮＡ、拘束エチル核酸類似体（ｃＥＴ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、トリシクロＤＮＡ、アンロック核酸（ＵＮＡ）、ホスホロアミダイトモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、ｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチドホスホロチオアート、ならびにそれらの誘導体および類似体である。
【0019】
本明細書で使用される、「液体供給部」という表現は、反応器（反応槽）に投入される液体試薬を提供するよう機能する本発明にかかる装置の部品を意味するよう使用される。特に、液体供給部は、１つまたはそれ以上の液体入口、貯蔵槽または液体タンク、液体導管、ポンプ、バルブ、液体混合装置、熱交換器、多岐管、およびセンサを含むことができる。
【0020】
本明細書で使用される、「液体供給ライン」という表現は、液体ポンプ、および１つまたはそれ以上の液体容器に接続された１つまたはそれ以上の液体入口を含む液体導管を意味するよう使用される。バルブによって各液体入口と導管の間の流体の連絡を調節することができる。したがって、液体供給ラインは、１つまたはそれ以上の液体入口／容器から下流の装置へ制御された液体流を提供することができる。ポンプおよびバルブは、局所制御部および／または中央制御部によって制御される。一部の実施形態において、各液体供給ラインは、１個から２５個の間の、好ましくは３個から１０個の間の入口を有する。そのような１つまたはそれ以上の入口は、分岐液体導管に接続され、次いで多数の貯蔵槽に接続されている。各液体供給ラインの最も外側の入口は、処理工程間でラインをガス抜きすることができるよう、処理溶媒および液体窒素の供給源に接続されている。
【0021】
一部の実施形態において、装置の液体供給部は、混合装置に接続された第３の液体供給ラインをさらに含む。第３の液体供給ラインは、ｎ個の液体入口を有する少なくとも１つの液体導管および少なくとも１つの液体ポンプを含み、ここで、ｎは１から２５の間の整数である。
【0022】
本文書全体を通して用いられるように、本装置の２つの部品は、それらの部品が互いに供給を受ける場合、「接続されている」と言うことができる。例えば、一方の部品から他方の部品へ液体を通すことができる液体導管によって、部品を接合することができる。
【0023】
液体入口は、不活性ガス中でその中身を保持するよう構成される貯蔵槽に接続されている。例えば、槽は、真空源に接続することができる制御可能なバルブ、および窒素といった不活性ガスの供給源に接続することができる第２の制御可能なバルブを含むことができる。自動不活化の場合、貯蔵槽は、電子式または機械式圧力制御装置をさらに含むことができ、バルブを自動で操作することができる。手動不活化の場合、貯蔵槽は、圧力測定器および手動で制御されるバルブを含むことができる。
【0024】
貯蔵槽は、任意の適切な材料、例えば金属、エナメル、またはポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、およびポリエーテルエーテルケトンといった高分子から作製することができる。好ましくは、貯蔵槽が曝露される試薬に対して本質的に不活性な材料が選択される。その内容物に依存し、様々な貯蔵槽を異なる材料から作製することができる。好ましくは、材料は、医薬品、化粧品、ならびに／または食品および飲料の製造に適用される規則に準拠する、すなわち、材料は、適正製造規範（ＧＭＰ：ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）に適合する。さらに、静電着火のリスクを最小限に抑えるため、導電性材料を使用することができる。一部の実施形態において、貯蔵槽は、ステンレス鋼もしくはＨＡＳＴＥＬＬＯＹ（登録商標）合金、または導電性高分子で被覆された金属から作製される。貯蔵槽の大きさは、意図される合成規模に従って選択することができ、その内容物に依存し、異なる大きさの貯蔵槽を同時に使用することができる。一部の実施形態において、貯蔵槽は、約１リットル（Ｌ）から４０立方メートル、例えば１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、５５０、７７０、９９０、１１２０、１３００、１５００Ｌの内容積を有することができる。一部の実施形態において、一部の貯蔵槽は、約１０から４０リットルの内容積を有することができる。一部の実施形態において、処理溶媒用、例えばアセトニトリルおよびトルエン用の貯蔵槽は、容積が２０から４０立方メートルの槽であってよい。特定の保護ヌクレオシドホスホロアミダイトの溶液といった他の試薬は、容積が約１または５リットルのはるかに小さい貯蔵槽中に用意される。
【0025】
当業者は、前述の液体供給部と共に任意の反応槽を使用することができることを理解するであろう。反応槽は、任意の適切な材料、例えば金属、ガラス、エナメル、またはポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、およびポリエーテルエーテルケトンといった高分子から作製することができる。好ましくは、反応槽が曝露される試薬に対して本質的に不活性であり、かつ適正製造規範（ＧＭＰ）に準拠する材料が選択される。さらに、静電着火のリスクを最小限に抑えるため、導電性材料を使用することができる。反応槽の大きさおよび寸法は、意図される合成規模に従って選択することができる。例えば、最大内容積が５、１０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１５０または２００リットルのカラム反応器を使用することができる。さらなる例として、最大内容積が５、１０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４５０、６００または６５０リットルのバッチ式反応器を使用することができる。さらなる例として、内容積が１００または２００ｍｌの反応器を使用することができる。本発明の一部の実施形態において、反応槽の内容積は、約３０～２５０リットル、好ましくは約４０～２００リットル、最も好ましくは約４０～１５０リットルである。本明細書で使用される「約」という表現は、与えられる値のプラスマイナス１０％の偏差が可能であることを示す。
【0026】
例えば、固相オリゴヌクレオチド合成は、通常、成長するオリゴヌクレオチド鎖が拘束される固体支持体が充填されたカラム反応器を使用して行われる。通常、カラム反応器は、底部フリットおよび頂部フリットを含むことができ、その間に固体支持体が充填される。最適な第１の保護ヌクレオチドを支持体に付着させた、または付着させない固体支持体が、様々な販売業者から入手することができる。
【0027】
特に、カラム反応器を使用する場合、ポンプを使用して試薬混合物をカラムで循環させることが有用である場合がある。したがって、一部の実施形態において、本装置は、反応槽と廃棄物容器を接続する液体導管から反応槽中へ戻るよう、ポンプを使用して流れを移動させる再循環回路をさらに含む。再循環回路は、装置の液体供給ラインの１つに一体化される。この場合、再循環回路は、その入口の１つおよび多方弁を介して液体導管へ接続された液体供給ラインの１つに含まれ、ポンプは、反応槽と廃棄物容器を接続する液体導管から混合装置を介して反応槽中に戻る流体の再循環を駆動することができる。再循環回路は、カラムを通る液体流の方向を反転させることができるよう配置される。例えば、カラム反応器は、液体が反応器を通って進行方向および反対方向に流れるだけでなく反応器を完全に迂回することを可能にするバルブ組立体を介して液体供給部に接続されている。
【0028】
代替案として、本発明者らは、バッチ式反応器を使用することができることを見出した。この反応器は、反応器内の支持体を保持するための底部フリットまたはろ布、混合装置、および反応器の内面をすすぐための１つまたはそれ以上のスプレーボールまたはノズルを含むことができる。回転式もしくは固定式のスプレーボールまたはノズルを使用することができ、スプレーボールまたはノズルは反応槽の頂部に位置付けられ、かつ液体供給源に接続されている。当業者は、混合される材料に依存し、例えば使用される支持体の物理的堅牢性の観点から、混合装置を習慣的に選択するであろう。例えば、回転するインペラを含む攪拌機を使用することができる。そのようなインペラは、反応槽内の液体の軸流、混合流、または放射状流を生じさせる乱流混合器であってもよい。既知のインペラとして、船舶型プロペラ、ピッチブレードタービン、フラットブレードタービン、およびフラットブレードパドルが挙げられる。バッフルブレードの使用は、混合を改善させるのに有用である。代わりに、または加えて、液体全体を気体でバブリングすることによって混合を達成することができる。代わりに、または加えて、例えばポンプ回路を使用して液体を循環させることによって混合を達成することができる。当業者は、通常、発泡を回避しつつ、反応媒体内で物質が効率的に分布するよう混合手段を選択するだろう。反応槽内で固体支持体を使用する場合、反応槽および攪拌ブレードは、好ましくは、剪断力を最小限に抑えるよう設計される。好ましくは、混合装置の動作は、制御部によって制御される。バッチ式反応器は、好ましくは、保護雰囲気中で動作するよう構成される。例えば、バッチ式反応器の反応槽は、真空源に接続することができる第１の制御可能なバルブ、窒素といった不活性ガスの供給源に接続することができる第２の制御可能なバルブ、および電子式または機械式圧力制御装置を含むことができる。好ましくは、バルブは自動的に操作され、制御部で制御される。温度制御を容易にするため、バッチ式反応器はジャケット付き反応器であってよい。バッチ式反応器の使用は、充填カラム反応器と比べ、固体材料のサンプリングが可能である点、反応器全体で反応条件をより均一にすることができる点でいくつかの利点を有する。
【0029】
したがって、本発明の別の実施形態は、バッチ式反応器内で合成が行われることを特徴とするオリゴヌクレオチド固相合成装置に関する。一部の実施形態において、当該反応器は、混合装置、反応器の内面をすすぐための１つまたはそれ以上のスプレーボールまたはノズルを含み、保護ガス中で動作するよう構成される。
【0030】
当業者は、装置全体を通して液体流を制御するために様々なバルブ、好ましくは自動バルブを使用することができることを十分理解するだろう。例えば、反応槽に流入するまたは反応槽から流出する液体流は、流入液体導管および流出液体導管に一体化されるバルブによって制御することができる。
【0031】
当業者は、最低で２つの流入液体、例えば３または４つの流入液体を混合して１つの均一な溶液にすることを可能にする任意の混合装置を本発明で使用することができることを理解するだろう。したがって、当業者は、混合効果、大きさ、および圧力損失の観点から特定の装置の状況に適合するよう混合装置を選択するだろう。混合装置は、少なくとも２つの流入流を連続して統合する一連の混合ティーまたは混合クロスから構成されるか、またはそれを含む。混合装置は、１つまたはそれ以上の混合ティーまたはＴバルブ、および熱交換器を含むことができる。混合装置は、スタティックミキサを含むことができる。混合装置は、少なくとも２つの入口および１つの出口を有するスタティックミキサから構成されるか、またはそれを含む。一部の実施形態において、混合装置は、多方弁、例えばＴバルブおよびスタティックミキサから構成されるか、またはそれを含む。多方弁およびスタティックミキサは、いくつかの流れがバルブによって統合され、次いでスタティックミキサへ誘導されるよう配置される。混合装置は、少なくとも２つの液体供給ラインの液体流を混合し、混合された流れをスタティックミキサまたは熱交換器中に移動させる多岐管から構成されるか、またはそれを含む。混合液の加熱または冷却を可能にするよう、混合装置に覆いをかけることができる。
【0032】
一実施形態において、少なくとも混合装置の内面および液体供給ラインの１つの内面は、耐酸性材料から作製される。これは、少なくとも、液体入口の少なくとも１つからポンプを経て混合装置を含めて混合装置までの、１つの液体供給ラインの内面は、耐酸性材料から作製されるか、または耐酸性材料で被覆されることを意味する。本明細書で使用される「耐酸性」は、材料が酸性溶液に対して、例えばトルエン中の５０％ＤＣＡ（ジクロロ酢酸）と２００ｐｐｍの水との溶液に対して耐性を有することが認められるか、または本質的に不活性であることを意味する。２００ｐｐｍの水を含む１００％ＤＣＡ溶液を使用して耐酸性を評価することもできる。２０１８年３月以降のＤＩＮ５０９０５－４に説明されているような十分に確立された手順を用いて、材料の耐酸性を試験することができる。酸を含む液体に曝された際に局所腐食の兆候を示さず、材料の損失が０．０１ｍｍ／年を下回る金属材料を耐酸性材料に分類することができる。曝される酸溶液中に多量の溶出物または抽出物を放出しない金属材料を耐酸性材料に分類することができる。溶出物や抽出物の量は、規制当局によって制定されたガイドラインに準じて医薬品成分として許容されない、検出可能な汚染を合成されるオリゴマーに生じさせる場合、多量であると考えられる。合成されたオリゴヌクレオチド中に検出される量の浸出物または抽出物を放出しない場合、材料は、耐酸性、例えば、２００ｐｐｍの水を含むトルエン中の５０％ＤＣＡ（ジクロロ酢酸）の溶液に対する耐性、または１００％ＤＣＡに対する耐性を有すると考えることができる。一実施形態において、少なくとも混合装置の内面および液体供給ラインの１つの内面は、耐酸性合金から作製される。さらに、少なくとも混合装置の内面および液体供給ラインの１つの内面は、耐酸性高分子被膜またはガラス被膜を含むことができる。例えば、耐酸性材料は、高い耐性を有するニッケル系合金、高分子被膜、およびガラスライニングからなる群から選択される。適切な高分子被膜は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）、エチレンテトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、またはエチレンクロロトリフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）を含む。適切なニッケル系合金は、例えば、ＨＡＳＴＥＬＬＯＹ（登録商標）Ｃ－４、Ｃ２２、Ｃ－２０００、およびＣ２７６合金を含み、これらは、材料番号／金属および合金のための統一採番システム（ＵＮＳ：Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｅｔａｌｓ ａｎｄ Ａｌｌｏｙｓ）によって、それぞれ２．４６１０／Ｎ０６４５５、２．４６０２／Ｎ０６０２２、２．４６７５／Ｎ０６２００、および２．４８１９／Ｎ１０２７６で識別される。
【0033】
本発明にかかる装置は、ｎ個のセンサをさらに含むことができ、ここで、ｎは１以上の整数であり、センサは、混合装置の下流に位置付けられ、混合装置から出てくる液体の少なくとも１つの性質を決定する。
ｎ個のセンサは、混合装置から出てくる液体の組成の分析を助け、それによって制御部に信号を送ることができる。例えば、センサの少なくとも１つによって提供される少なくとも１つの計測値を、液体供給部に含まれる１つまたはそれ以上のポンプの活動を調整するためのフィードバック信号として使用することができる。これにより、所与の設定値を達成し、かつ維持するよう液体ポンプから混合装置への流れを調節することが可能となる。したがって、センサは、各液体供給ラインのポンプを制御するフィードバックループの一部であってよい。加えて、または代わりに、装置は、混合装置の上流の各液体供給ラインに一体化される、例えばポンプと混合装置の間に位置付けられる少なくとも１つの流量センサを含むことができ、センサによって提供される少なくとも１つの計測値は、１つまたはそれ以上のポンプの活動を調節するためのフィードバック信号として使用される。さらに、少なくとも１つのセンサによって提供される少なくとも１つの計測値は、液体流を反応槽中に移動させるか、反応槽を通過させることなく廃棄物容器中に移動させるかを制御するために使用される。一部の実施形態において、センサの数ｎは、１、２、３、および４からなる群から選択される。当業者は、様々なセンサがこれに適することを理解し、想定される合成化学に依存して適切なセンサを選択するだろう。一部の実施形態において、ｎ個のセンサは、赤外分光光度計、密度センサ、屈折計、導電率センサ、温度センサ、インピーダンスセンサ、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収センサからなる群から独立して選択される。一部の実施形態において、ｎ個のセンサは、赤外分光光度計、屈折計、密度センサ、導電率センサ、温度センサ、インピーダンスセンサ、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収センサからなる群から独立して選択され、ｎ個のセンサの少なくとも１つは赤外分光光度計である。一部の実施形態において、ｎ個のセンサは、赤外分光光度計、屈折計、密度センサ、導電率センサ、温度センサ、インピーダンスセンサ、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収センサからなる群から独立して選択され、ｎ個のセンサの少なくとも１つは密度センサである。反応槽を廃棄物容器に接続する液体導管に、さらなるセンサを一体化させることができる。センサは、赤外分光光度計、密度センサ、屈折計、導電率センサ、温度センサ、インピーダンスセンサ、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収センサからなる群から選択される。一実施形態において、装置は、導電率センサ、温度センサ、およびＵＶ吸収センサを含むことができ、これらのセンサは、混合装置の下流に位置付けられ、混合装置から出てくる液体の少なくとも１つの性質を決定する。
ｎ個のセンサは、混合装置から出てくる液体の組成の分析を助け、それによって制御部に信号を送ることができる。例えば、センサの少なくとも１つによって提供される少なくとも１つの計測値を、液体供給部に含まれる１つまたはそれ以上のポンプの活動を調整するためのフィードバック信号として使用することができる。これにより、所与の設定値を達成し、かつ維持するよう液体ポンプから混合装置への流れを調節することが可能となる。したがって、センサは、各液体供給ラインのポンプを制御するフィードバックループの一部であってよい。加えて、または代わりに、装置は、混合装置の上流の各液体供給ラインに一体化される、例えばポンプと混合装置の間に位置付けられる少なくとも１つの流量センサを含むことができ、センサによって提供される少なくとも１つの計測値は、１つまたはそれ以上のポンプの活動を調節するためのフィードバック信号として使用される。さらに、少なくとも１つのセンサによって提供される少なくとも１つの計測値は、液体流を反応槽中に移動させるか、反応槽を通過させることなく廃棄物容器中に移動させるかを制御するために使用される。一部の実施形態において、センサの数ｎは、１、２、３、および４からなる群から選択される。当業者は、様々なセンサがこれに適することを理解し、想定される合成化学に依存して適切なセンサを選択するだろう。一部の実施形態において、ｎ個のセンサは、赤外分光光度計、密度センサ、屈折計、導電率センサ、温度センサ、インピーダンスセンサ、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収センサからなる群から独立して選択される。一部の実施形態において、ｎ個のセンサは、赤外分光光度計、屈折計、密度センサ、導電率センサ、温度センサ、インピーダンスセンサ、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収センサからなる群から独立して選択され、ｎ個のセンサの少なくとも１つは赤外分光光度計である。一部の実施形態において、ｎ個のセンサは、赤外分光光度計、屈折計、密度センサ、導電率センサ、温度センサ、インピーダンスセンサ、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収センサからなる群から独立して選択され、ｎ個のセンサの少なくとも１つは密度センサである。反応槽を廃棄物容器に接続する液体導管に、さらなるセンサを一体化させることができる。センサは、赤外分光光度計、密度センサ、屈折計、導電率センサ、温度センサ、インピーダンスセンサ、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収センサからなる群から選択される。一実施形態において、装置は、導電率センサ、温度センサ、およびＵＶ吸収センサを含むことができ、これらのセンサは、混合装置の下流に位置付けられ、混合装置から出てくる液体の少なくとも１つの性質を決定する。
【0034】
液体供給部は、少なくとも１つの熱交換器をさらに含むことができる。熱交換器は、混合装置とｎ個のセンサ（ｓ１からｓｎ）のうちの最初のセンサの間に位置付けられるか、または熱交換器は、混合装置の一部であってよい。
【0035】
好ましくは、液体供給ラインに一体化される液体ポンプは、試薬に曝される表面が不活性であるよう設計される。ポンプの少なくとも１つが耐腐食性表面（したがって、特に上記で定義された「耐酸性」表面）、例えばＨＡＳＴＥＬＬＯＹ合金またはポリテトラフルオロエチレン製の表面を有することが好ましい。液体供給ライン内での使用に特に適する液体ポンプは、最小の脈動で一定の流れをもたらし、液体流量を滑らかに変動させることを可能にする。例えば、ダイヤフラムポンプを使用することができる。本発明の一部の実施形態において、各ポンプは、最大で５０Ｌ／分、８０Ｌ／分、１００Ｌ／分、２００Ｌ／分、または３００Ｌ／分の最大流量を供給することができる。一部の実施形態において、ポンプの１つは、１００Ｌ／分の最大流量を供給すると同時に、他のポンプは、６０Ｌ／分の最大流量を供給することができる。一実施形態において、第１および第２の液体供給ラインのポンプｐ１およびｐ２は、１０ｍｌ／分を供給し、第３の液体供給ラインのポンプｐ３は、約５０ｍｌ／分の圧送力を有する。
【0036】
制御部は、とりわけ、装置のポンプおよび自動バルブの動作を制御し、操作者からだけでなくシステムのセンサ（ｎ個のセンサおよび／またはさらなるセンサ）からの信号を受信することができる。制御部は、監視制御およびデータ取得（ＳＣＡＤＡ：ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）制御システムアーキテクチャの場合のように、制御の各階層レベルを形成する複数の装置を含むことができる。例えば、制御部は、周辺装置からデータを収集し、周辺装置に制御コマンドを送信する１つまたはそれ以上の遠隔監視コンピュータ、ならびに遠隔端末装置（ＲＴＵ）、プログラマブルロジックコントローラ（ＰＬＣ）およびＧＵＩパネルなどのユーザインタフェースといった１つまたはそれ以上の周辺装置を含むことができる。ＰＬＣおよび監視ＳＣＡＤＡソフトウェアは、特に、温度、圧力、レベル、重量、位置、または濃度のセンサといったフィールドセンサから入力を受信することができる。１つまたはそれ以上のＳＣＡＤＡ監視コンピューティングプラットフォームは、加えて、製造実行システム（ＭＥＳ：ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）と相互作用することができ、ＭＥＳは、次に、企業資源計画（ＥＲＰ：ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｐｌａｎｎｉｎｇ）システムと相互作用することができる。さらに、１つまたはそれ以上のＳＣＡＤＡ監視コンピューティングプラットフォームは、特定の処理パラメータ、例えば脱保護試薬の組成に関するセンサデータを専用のデータベースに送信することによって、ロギングタスクを実行することができる。一部の実施形態において、制御部は、ポンプおよびバルブの動作を制御するセンサおよびアクタと共に、少なくとも１つのＳＣＡＤＡシステムおよび少なくとも１つのＰＬＣを含む。代わりに、局所制御部は、混合部の下流のセンサから受信された信号に依存し、ポンプの機能を調節することができる。したがって、局所制御部は、中央制御部の監督下に置かれても、または独立していてもよい。
【0037】
好ましくは、制御部は、カップリングサイクルを少なくとも２回反復する合成手順の実行を制御するよう構成され、手順は、各カップリングサイクルに対し酸性脱保護試薬の組成を個別に定義し、制御部は、それに応じて内表面が耐酸性材料から作製される少なくとも１つの液体供給ラインを通る試薬流を移動させる。制御部は、ユーザが処理工程の順序、および特に各カップリングサイクルに対しカップリング試薬の組成を定めることを可能にする。この合成手順を実行する際、制御部は、各カップリングサイクルにおいて脱保護試薬が特定の組成となるようバルブおよびポンプの動作を管理することができ、かつフィールドセンサからの、例えば混合装置上流の流量センサから、または混合装置と反応槽の間に位置付けられたセンサから得られた信号によって組成を制御することができる。
【0038】
一部の実施形態において、本発明にかかる装置、または少なくともその露出表面は、曝される試薬に対して本質的に不活性な材料で作製される。一部の実施形態において、装置、または少なくともその露出表面は、ステンレス鋼、ＨＡＳＴＥＬＬＯＹ（登録商標）合金、または高分子被覆金属で作製される。好ましくは、材料は、医薬品、化粧品、ならびに／または食品および飲料の製造に適用される規則に準拠する、すなわち、材料は、適正製造規範（ＧＭＰ）に適合する。一部の実施形態において、少なくとも混合装置ならびに装置の１つのライン、すなわち、１つまたはそれ以上の液体入口、バルブ、およびポンプを含む１つの液体導管であって、混合装置の入口で終わる、液体導管の露出表面は、耐酸性合金または耐酸性高分子被膜といった耐酸性材料から作製され、装置の他の部分はステンレス鋼から作製される。
【0039】
本発明にかかる装置の操作は、下記の工程を含むことができる。説明のために図４を参照して工程を説明するが、教示を図４の特定の装置に限定すると解釈するべきではない。さらに、合成戦略に応じて他の試薬を使用することができると理解されるべきである。したがって、以下の一連の工程は、１つの特定のカップリングサイクルにおける、可能性のある１つの定型の一例に過ぎない。
【0040】
１）液体供給ラインを設置する
常温で固体であり、原液として供給する必要がある試薬を含有しない限り、全ての槽は純粋な液体を含むことに留意されたい。
【表3】
【0041】
２）脱トリチル化溶液を製造する
液体は、槽ｖ１－３およびｖ２－２から混合装置５へ流れる。まず廃棄物容器７へ流れを移動させ、目的の混合物が得られるとすぐに反応槽（６）へ流れを移動させる。
３）槽ｖ１－１およびｖ２－１からのアセトニトリルでライン１および２、混合チャンバ、ならびに反応槽を洗い流す。
４）保護ヌクレオシドホスホロアミダイト１でカップリング溶液を製造する
液体は、槽ｖ３－２およびｖ４－３から混合装置５へ流れる。まず廃棄物容器７へ流れを移動させることができ、目的の混合物が得られるとすぐに反応槽６へ流れを移動させる。液体導管９からライン４および混合装置５を介して反応槽６へカップリング溶液を再循環させる。
５）槽ｖ２－１、ｖ３－１およびｖ４－１からのアセトニトリルでライン２、３および４、混合チャンバ、ならびに反応槽を洗い流す。
６）酸化溶液を製造する
液体は、槽ｖ１－４、ｖ４－５およびｖ３－ｎから混合装置５へ流れる。まず廃棄物容器７へ流れを移動させ、目的の混合物が得られるとすぐに反応槽６へ流れを移動させる。
代替法として：硫化溶液を製造する
液体は、槽ｖ４－４およびｖ３－ｎから混合装置５へ流れる。まず廃棄物容器７へ流れを移動させ、目的の混合物が得られるとすぐに反応槽６へ流れを移動させる。
反応中、ライン２を介して再循環を行う。
７）槽ｖ２－１、ｖ１－１、ｖ４－１およびｖ３－１（酸化）またはｖ２－１、ｖ４－１およびｖ３－１（硫化）からのアセトニトリルでライン２および１、４、３（酸化）または４、３（硫化）、混合チャンバ、ならびに反応槽を洗い流す。
８）ブロッキング（キャッピングとしても知られる）溶液を製造する
液体は、槽ｖ１－２、ｖ４－２、ｖ３－ｎおよびｖ２－１から混合装置５へ流れる。まず廃棄物容器７へ流れを移動させ、目的の混合物が得られるとすぐに反応槽６へ流れを移動させる。反応中、ライン２を介して再循環を行う。
９）槽ｖ１－１、ｖ２－１、ｖ３－１およびｖ４－１からのアセトニトリルでライン１、２、３および４、混合チャンバ、ならびに反応槽を洗い流す。
液体は、槽ｖ１－３およびｖ２－２から混合装置５へ流れる。まず廃棄物容器７へ流れを移動させ、目的の混合物が得られるとすぐに反応槽（６）へ流れを移動させる。
３）槽ｖ１－１およびｖ２－１からのアセトニトリルでライン１および２、混合チャンバ、ならびに反応槽を洗い流す。
４）保護ヌクレオシドホスホロアミダイト１でカップリング溶液を製造する
液体は、槽ｖ３－２およびｖ４－３から混合装置５へ流れる。まず廃棄物容器７へ流れを移動させることができ、目的の混合物が得られるとすぐに反応槽６へ流れを移動させる。液体導管９からライン４および混合装置５を介して反応槽６へカップリング溶液を再循環させる。
５）槽ｖ２－１、ｖ３－１およびｖ４－１からのアセトニトリルでライン２、３および４、混合チャンバ、ならびに反応槽を洗い流す。
６）酸化溶液を製造する
液体は、槽ｖ１－４、ｖ４－５およびｖ３－ｎから混合装置５へ流れる。まず廃棄物容器７へ流れを移動させ、目的の混合物が得られるとすぐに反応槽６へ流れを移動させる。
代替法として：硫化溶液を製造する
液体は、槽ｖ４－４およびｖ３－ｎから混合装置５へ流れる。まず廃棄物容器７へ流れを移動させ、目的の混合物が得られるとすぐに反応槽６へ流れを移動させる。
反応中、ライン２を介して再循環を行う。
７）槽ｖ２－１、ｖ１－１、ｖ４－１およびｖ３－１（酸化）またはｖ２－１、ｖ４－１およびｖ３－１（硫化）からのアセトニトリルでライン２および１、４、３（酸化）または４、３（硫化）、混合チャンバ、ならびに反応槽を洗い流す。
８）ブロッキング（キャッピングとしても知られる）溶液を製造する
液体は、槽ｖ１－２、ｖ４－２、ｖ３－ｎおよびｖ２－１から混合装置５へ流れる。まず廃棄物容器７へ流れを移動させ、目的の混合物が得られるとすぐに反応槽６へ流れを移動させる。反応中、ライン２を介して再循環を行う。
９）槽ｖ１－１、ｖ２－１、ｖ３－１およびｖ４－１からのアセトニトリルでライン１、２、３および４、混合チャンバ、ならびに反応槽を洗い流す。
【0042】
上記の工程からわかるように、出発原料が液体でなく、溶液として供給する必要がある場合を除き、全ての試薬を純粋な液体から混合することができる。手順上の利点とは別に、これは、使用する試薬の安定性、ひいては処理の安定性を高める。
【0043】
本明細書は、脱保護溶液、酸化溶液、および硫化溶液からなる群から独立して選択される少なくとも１つの溶液をインライン混合によって製造する、上記で詳述された装置を用いる有利なオリゴマー合成方法をさらに開示する。上記で詳述された装置を用いるさらに有利なオリゴマー合成方法において、脱保護溶液、ブロッキング溶液、酸化溶液、および硫化溶液からなる群から独立して選択される少なくとも２つの溶液が、インライン混合によって製造される。他の実施形態において、脱保護溶液、ブロッキング溶液、酸化溶液、および硫化溶液からなる群から独立して選択される少なくとも３つの溶液が、インライン混合によって製造される。
【0044】
本発明の装置は、カップリングサイクルを少なくとも２回反復するオリゴヌクレオチド合成手順を実行するために使用することができ、手順は、各カップリングサイクルに対し酸性脱保護試薬の組成を個別に定める。
【0045】
本発明の装置に関して上述された説明および定義は、本発明の方法に関しても同様に適用可能であり、その逆もまた同様である。好ましくは、本方法は、自動的に行われる。
【0046】
本明細書で使用される、「自動的に」という表現は、人が介入することなく、また人が常在して制御することなく機械的に実行される方法を説明する。これは、合成方法の工程が、上記で詳述したように、制御部によって管理されることを意味することがある。しかし、特定の状況下で人による介入を可能にするか、または要求すらするよう、装置および／または制御部を構成することができる。これは、例えば、処理パラメータが特定の予め定められた範囲から外れるといった予測できない事態が発生した場合に起こる可能性がある。さらに、例えば、人の制御下で、および／または人が介入して特定の重要な工程を実行しながら自動的にカップリングサイクルを一定の回数行うことができることが有利な場合がある。
【0047】
本明細書で詳述される方法の工程は、正確に記載される順序で実行することができる。しかし、当業者は、工程の順序は場合によって異なる可能性があることを理解する。本明細書で使用される「以下の工程１からｘが行われる」という表現は、必ずしも示された順序ではないが、工程１からｘの各工程が行われる方法を意味する。
【0048】
本明細書で使用される「カップリングサイクル」、「ビルディングブロック付加サイクル」、「反復高分子合成処理サイクル」、「伸長サイクル」、および「合成サイクル」という表現は、同義語であり、合成中に１つのビルディングブロックによって高分子鎖、例えばオリゴヌクレオチド鎖を伸長させるのに必要な工程に関する。通常、１回の合成サイクルは、保護されていない高分子鎖をカップリングに供給する工程、およびビルディングブロックを高分子鎖にカップリングする工程を少なくとも含む。保護基されていない高分子鎖を供給する工程は、一時的な保護基の除去、分離、および高分子鎖の洗浄を含む。
【0049】
１つの好ましい実施例において、本発明は、ビルディングブロックカップリングサイクルを繰り返すことによって自動的にオリゴヌクレオチド鎖を組み立てる方法であって、各ビルディングブロックカップリングサイクルにおいて以下の工程１から工程６：
１．固体支持体に結合するｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドであって、組み込まれるビルディングブロックに含まれる第２の反応基と反応することによってオリゴヌクレオチド主鎖を伸長させることができる第１の反応基を含み、ここで、ｎは１以上の整数である、オリゴヌクレオチドを供給する工程；
２．ｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドの第１の反応基と反応することができる第２の反応基を含み、一時的な酸感受性保護基でブロックされた第１の反応基をさらに含む、組み込まれるビルディングブロックを供給する工程；
３．ｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドの第１の反応基が、組み込まれるビルディングブロックの第２の反応基に結合することが可能な条件下で、組み込まれるビルディングブロックにｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドを接触させ、さらに伸長しないよう一時的な酸感受性保護基によってブロックされた、保護されかつ伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドを生成する工程；
４．少なくとも２つの液体組成物を混合することによって酸性脱保護試薬を製造する工程；
５．工程３の保護されかつ伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドを、工程４の酸性脱保護試薬に接触させ、それによって伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドから一時的な酸感受性保護基を切断する工程；および
６．伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドから脱保護試薬および可溶性切断産物を除去し、その後のカップリサイクルにおける工程１でｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドとして使用する工程
が改めて行われる、方法に関する。
１．固体支持体に結合するｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドであって、組み込まれるビルディングブロックに含まれる第２の反応基と反応することによってオリゴヌクレオチド主鎖を伸長させることができる第１の反応基を含み、ここで、ｎは１以上の整数である、オリゴヌクレオチドを供給する工程；
２．ｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドの第１の反応基と反応することができる第２の反応基を含み、一時的な酸感受性保護基でブロックされた第１の反応基をさらに含む、組み込まれるビルディングブロックを供給する工程；
３．ｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドの第１の反応基が、組み込まれるビルディングブロックの第２の反応基に結合することが可能な条件下で、組み込まれるビルディングブロックにｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドを接触させ、さらに伸長しないよう一時的な酸感受性保護基によってブロックされた、保護されかつ伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドを生成する工程；
４．少なくとも２つの液体組成物を混合することによって酸性脱保護試薬を製造する工程；
５．工程３の保護されかつ伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドを、工程４の酸性脱保護試薬に接触させ、それによって伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドから一時的な酸感受性保護基を切断する工程；および
６．伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドから脱保護試薬および可溶性切断産物を除去し、その後のカップリサイクルにおける工程１でｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドとして使用する工程
が改めて行われる、方法に関する。
【0050】
上記の「ｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドを供給する」という表現は、可能性のある最も広い意味で理解される。反応の初期に、工程１は、固体支持体に固定され、かつ主鎖の伸長を阻止する一時的な酸感受性保護基を担持するヌクレオシドを供給する工程を含むことができる。そのような固定されたヌクレオシドの一部は市販されている。次いで、酸性脱保護試薬と共にインキュベーションすることによって一時的な保護基を除去することができ、その後に脱水／洗浄工程が続き、ｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドが得られる。他の場合において、オリゴヌクレオチド鎖の組立は、固体支持体に結合するより長鎖のオリゴヌクレオチドで既に開始している可能性がある。各カップリングサイクルの間で、工程１は、先行するカップリングサイクルの工程５および工程６と、すなわち伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドからの一時的な保護基の切断と、部分的に重複することができ、かつ続くカップリング工程に使用するために、先行するカップリングサイクルで脱保護されかつ伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドの状態を整えるためにすすぎ工程をさらに含むことができる。
【0051】
当業者は、制御多孔質ガラス（ＣＰＧ：ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）および架橋ポリスチレンビーズから作製された支持体を含む、数多くの固体支持体をオリゴヌクレオチドの合成に使用することができることを十分理解する。第１のオリゴヌクレオチドを固体支持体に固定するためのリンカーも、同様に当分野でよく知られている。
ホスホジエステル結合によって結合する単糖部分由来の主鎖を有するオリゴヌクレオチドを合成する場合、第１の反応基は、水酸基、好ましくは、例えばリボース部分の５’水酸基といった一級水酸基であってよい。しかし、第１の反応基は、目下のオリゴヌクレオチド構造の主鎖形成に関与する任意の反応基であってよい。
ホスホジエステル結合によって結合する単糖部分由来の主鎖を有するオリゴヌクレオチドを合成する場合、第１の反応基は、水酸基、好ましくは、例えばリボース部分の５’水酸基といった一級水酸基であってよい。しかし、第１の反応基は、目下のオリゴヌクレオチド構造の主鎖形成に関与する任意の反応基であってよい。
【0052】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド主鎖」という表現は、核酸塩基／核酸塩基類似体が連結する骨格をもたらす、ホスホジエステル結合／ホスホジエステル類似結合およびリボース／リボース類似部分の繰り返し鎖を意味するよう使用される。通常、第１の反応基はオリゴヌクレオチド主鎖の一方の端部に位置し、第２の反応基はオリゴヌクレオチドの他方の端部に位置する。
【0053】
「ビルディングブロックを供給する」という表現は、可能性のある最も広い意味で理解される。組み込まれるビルディングブロックは、ヌクレオチド鎖に組み込まれる任意のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含むことができる。ビルディングブロックは、グリコシド結合またはそのような結合の類似物を介して結合する脱塩基部位、核酸塩基、または核酸塩基類似体を含むことができる。ビルディングブロックは、単量体であっても、オリゴマーであってもよい、すなわち、ビルディングブロックは、オリゴヌクレオチド自体であってもよい。ビルディングブロックは、コレステロールといった非ヌクレオシド修飾をさらに含むことができる。ビルディングブロックは、ｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドの第１の反応基と反応することができる第２の反応基を含む。第２の反応基は、ホスホロアミダイト基、例えば３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）基またはＨ－ホスホン酸モノエステルであってもよい。さらに、ビルディングブロックは、一時的な保護基によって反応しないようブロックされた第１の反応基を含む。ビルディングブロックに含まれる第１の反応基は、ｎｍｅｒのオリゴヌクレオチド上の対応する位置に存在する化学部分と同一である。ビルディングブロックの第１の反応基をブロックする酸感受性保護基は、トリチル型保護基、例えば、トリフェニルメチル（トリチル）、４－モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、９－フェニルキサンテン－９－イル（ピキシル）、または９－（ｐ－メトキシフェニル）キサンチン－９－イル（ＭＯＸ）であってよい。
【0054】
一部の実施形態において、第１の反応基は、水酸基、好ましくは一級水酸基、例えばリボース／リボース類似部分の５’水酸基であり、第２の反応基は、ホスホロアミダイト基、例えば、３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）基である。さらなる実施形態において、第１の反応基は、水酸基、好ましくは一級水酸基、例えばリボース／リボース類似部分の５’水酸基であり、第２の反応基は、ホスホン酸モノエステル基である。
【0055】
当業者は、ｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドの第１の反応基をビルディングブロックの第２の反応基と反応させるために必要とされる条件を十分理解する。例えば、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾールといった酸性アゾール触媒を使用し、無水溶媒、一般的にはアセトニトリル中でｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドをビルディングブロックに接触させることによって亜リン酸トリエステル基の形成を誘導することができる。当分野で一般的であるように、保護されかつ伸長したｎｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、次いで、亜リン酸トリエステル基を硫化試薬または酸化試薬に曝すことによって保護される。さらなる例として、第２の反応基がホスホン酸モノエステル基である場合、活性化剤として、塩化ピバロイル、２，４，６－トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（ＴＰＳ－Ｃｌ）、および他の化合物を使用することができる。
【0056】
本方法は、少なくとも２つの液体組成物を混合することにより、各カップリングサイクルで新たに酸性脱保護試薬を製造することを想定する。したがって、各カップリングサイクルに対し脱保護試薬の組成を個別に定めることができる。これにより、例えば酸の含有量を、各カップリングサイクルで生じる特定の状況に適応させることが可能となる。例えば、プリン塩基は、ピリミジン塩基よりも容易にオリゴヌクレオチドから切断され、脱塩基部位が残される。いわゆる脱プリンは、オリゴヌクレオチド鎖の中央部よりも端部でより容易に起こる。したがって、一時的な保護基を除去する条件を各工程で最適化できることは有利である。これにより、本手順は、不要な副反応を最小限に抑え、合成時に組み立てられた粗オリゴヌクレオチド鎖の純度を最大限に高めることを可能にする。
【0057】
本発明にかかる方法の一部において、脱保護試薬の組成は、少なくとも２つのカップリングサイクル間で異なる。脱保護試薬の組成は、特に、酸の含有量に関して異なることがある。例えば、サイクル回数と共に酸の濃度を増大させることができる。一実施形態において、脱保護試薬中の酸の含有量は、各カップリングサイクルに対し個別に０．１％（ｗ／ｗ）から５０％（ｗ／ｗ）の範囲の酸から選択される。例えば、脱保護試薬中の酸の濃度は、０．１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０％（ｗ／ｗ）とすることができる。多くの場合、脱保護試薬中の酸の濃度は、０．５から２０％の範囲のＤＣＡから選択することができる。脱保護試薬中に含有される酸は、ＤＣＡおよびＴＣＡから選択することができ、好ましくはＤＣＡである。脱保護試薬中の酸の含有量は、各カップリングサイクルに対し、溶媒中の０．１％（ｗ／ｗ）から５０％（ｗ／ｗ）の範囲のＤＣＡから個別に選択することができる。脱保護試薬中の酸の含有量は、各カップリングサイクルに対し、溶媒中の０．１％（ｗ／ｗ）から２０％（ｗ／ｗ）の範囲のＴＣＡから個別に選択することができる。好ましい溶媒はトルエンである。
【0058】
純粋なＤＣＡの流れと溶媒の流れを本発明の混合装置内で配合することによって脱保護試薬を製造することができる。純粋な酸の代わりに、溶媒中の各酸の濃縮溶液を使用し、逐次液体、例えば溶媒と混合することによって希釈することができる。例えば、トルエン中の５０％のＤＣＡの溶液を原液として供給することができ、トルエンと配合して目的の濃度とすることができる。代わりに、ＴＣＡ溶液を使用することができる。脱保護溶液は、通常、トルエンといった溶媒中でＤＣＡといった酸を希釈することによって作られるが、脱保護試薬は、カチオン捕捉剤といったさらなる成分を含むことができる。脱保護試薬は、脱保護反応完了後、固体支持体から排出させることによって、および／または洗浄工程によって除去される。脱保護試薬は、処理溶媒、例えばアセトニトリルで洗い流すことによって置き換えられる。
【0059】
本発明の以下の態様が同様に開示される：
１．オリゴマー合成装置であって：
ａ）液体導管を介して廃棄物容器に接続された反応槽と；
ｂ）反応槽に液体試薬を送るための液体供給部と；
ｃ）反応槽を通過させることなく液体供給部から廃棄物容器中へ液体流を移動させるバイパス導管と；
ｄ）主制御部と
を含み、液体供給部は：
ｂ－１）少なくとも１つの混合装置と、
ｂ－２）少なくとも１つの混合装置に接続された少なくとも４つの上流液体ラインであって、各上流液体ラインは、ｎが１から２５の間の整数であるｎ個の液体入口を有する１つの液体導管、および１つの液体ポンプを含む、少なくとも４つの上流液体ラインと；
ｂ－３）ｎが１以上の整数であるｎ個のセンサとを含み、これらのセンサは、混合装置の下流に位置付けられ、混合装置から出てくる液体の少なくとも１つの性質を決定し、センサによって提供される少なくとも１つの計測値は、１つまたはそれ以上の液体ポンプの活動を調整するためのフィードバック信号として使用される、オリゴマー合成装置。
２．主制御部は、ｎ個のセンサから入力を受け、１つまたはそれ以上のポンプからの液体流を調整する、態様１に記載の装置。
３．ポンプは、センサから入力を受ける局所制御部によって制御される、態様１または２に記載の装置。
４．混合装置は、液体導管を介して反応槽に接続されている、態様１から３のいずれか１つに記載の装置。
５．混合装置は、液体導管を介して多岐管に接続され、多岐管は、液体導管を介して反応槽に接続されている、態様１から３のいずれか１つに記載の装置。
６．多岐管は、液体ポンプによって液体入口から流入液体を供給する少なくとも１つの液体導管にさらに接続されている、態様５に記載の装置。
７．液体供給部は、少なくとも１つの熱交換器をさらに含み、好ましくは、熱交換器の少なくとも１つは、混合部とｎ個のサンサのうちの最初のセンサの間に位置付けられる、態様１から６のいずれか１つに記載の装置。
８．反応槽は、充填カラム反応器またはバッチ式反応器である、態様１から７のいずれか１つに記載の装置。
９．混合装置の内面および少なくとも１つの液体ラインは、耐腐食性材料、好ましくはＨＡＳＴＥＬＬＯＹ合金またはポリテトラフルオロエチレンから作製される、態様１から８のいずれか１つに記載の装置。
１０．ｎ個のセンサは、赤外分光光度計、密度センサ、屈折計、導電率センサ、温度センサ、インピーダンスセンサ、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収センサからなる群から独立して選択される、態様１から９のいずれか１つに記載の装置。
１１．ポンプによって混合部およびｎ個のセンサを介して液体導管から反応槽中に流れを移動させる再循環回路をさらに含む、態様１から１０のいずれか１つに記載の装置。
１２．ポンプによって混合部およびｎ個のセンサを介して液体導管から反応槽中に流れを移動させる再循環回路をさらに含み、液体ラインの１つは、当該液体ラインのポンプと共に、その入口の１つおよび三方弁を介して液体導管に接続され、再循環ラインとして機能する、態様１から１０のいずれか１つに記載の装置。
１３．オリゴヌクレオチド固相合成装置であって、バッチ式反応器の内部で合成を行うためのバッチ式反応器を含む、オリゴヌクレオチド固相合成装置。
１４．オリゴヌクレオチド合成方法であって、態様１から１３のいずれか１つに記載の装置を使用する、オリゴヌクレオチド合成方法。
１５．脱保護溶液、ブロック溶液、酸化溶液、および硫化溶液からなる群から独立して選択される少なくとも２つの溶液が、液体ライン中でインライン混合によって製造される、態様１４に記載の方法。
１．オリゴマー合成装置であって：
ａ）液体導管を介して廃棄物容器に接続された反応槽と；
ｂ）反応槽に液体試薬を送るための液体供給部と；
ｃ）反応槽を通過させることなく液体供給部から廃棄物容器中へ液体流を移動させるバイパス導管と；
ｄ）主制御部と
を含み、液体供給部は：
ｂ－１）少なくとも１つの混合装置と、
ｂ－２）少なくとも１つの混合装置に接続された少なくとも４つの上流液体ラインであって、各上流液体ラインは、ｎが１から２５の間の整数であるｎ個の液体入口を有する１つの液体導管、および１つの液体ポンプを含む、少なくとも４つの上流液体ラインと；
ｂ－３）ｎが１以上の整数であるｎ個のセンサとを含み、これらのセンサは、混合装置の下流に位置付けられ、混合装置から出てくる液体の少なくとも１つの性質を決定し、センサによって提供される少なくとも１つの計測値は、１つまたはそれ以上の液体ポンプの活動を調整するためのフィードバック信号として使用される、オリゴマー合成装置。
２．主制御部は、ｎ個のセンサから入力を受け、１つまたはそれ以上のポンプからの液体流を調整する、態様１に記載の装置。
３．ポンプは、センサから入力を受ける局所制御部によって制御される、態様１または２に記載の装置。
４．混合装置は、液体導管を介して反応槽に接続されている、態様１から３のいずれか１つに記載の装置。
５．混合装置は、液体導管を介して多岐管に接続され、多岐管は、液体導管を介して反応槽に接続されている、態様１から３のいずれか１つに記載の装置。
６．多岐管は、液体ポンプによって液体入口から流入液体を供給する少なくとも１つの液体導管にさらに接続されている、態様５に記載の装置。
７．液体供給部は、少なくとも１つの熱交換器をさらに含み、好ましくは、熱交換器の少なくとも１つは、混合部とｎ個のサンサのうちの最初のセンサの間に位置付けられる、態様１から６のいずれか１つに記載の装置。
８．反応槽は、充填カラム反応器またはバッチ式反応器である、態様１から７のいずれか１つに記載の装置。
９．混合装置の内面および少なくとも１つの液体ラインは、耐腐食性材料、好ましくはＨＡＳＴＥＬＬＯＹ合金またはポリテトラフルオロエチレンから作製される、態様１から８のいずれか１つに記載の装置。
１０．ｎ個のセンサは、赤外分光光度計、密度センサ、屈折計、導電率センサ、温度センサ、インピーダンスセンサ、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収センサからなる群から独立して選択される、態様１から９のいずれか１つに記載の装置。
１１．ポンプによって混合部およびｎ個のセンサを介して液体導管から反応槽中に流れを移動させる再循環回路をさらに含む、態様１から１０のいずれか１つに記載の装置。
１２．ポンプによって混合部およびｎ個のセンサを介して液体導管から反応槽中に流れを移動させる再循環回路をさらに含み、液体ラインの１つは、当該液体ラインのポンプと共に、その入口の１つおよび三方弁を介して液体導管に接続され、再循環ラインとして機能する、態様１から１０のいずれか１つに記載の装置。
１３．オリゴヌクレオチド固相合成装置であって、バッチ式反応器の内部で合成を行うためのバッチ式反応器を含む、オリゴヌクレオチド固相合成装置。
１４．オリゴヌクレオチド合成方法であって、態様１から１３のいずれか１つに記載の装置を使用する、オリゴヌクレオチド合成方法。
１５．脱保護溶液、ブロック溶液、酸化溶液、および硫化溶液からなる群から独立して選択される少なくとも２つの溶液が、液体ライン中でインライン混合によって製造される、態様１４に記載の方法。
【0060】
図の説明
図１は、本発明にかかる装置の基本的な実施形態を示す。装置の液体供給部１９は、第１の液体供給ライン１、第２の液体供給ライン２、第３の液体供給ライン３、および第４の液体供給ライン４の４つの液体供給ラインに接続された混合装置５を含むことができる。各液体供給ラインは、ポンプ（それぞれ（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、または（ｐ４））、液体導管（それぞれ（ｌ１）、（ｌ２）、（ｌ３）、または（ｌ４））、およびｎ個の入口（それぞれ（ｉ１－１からｉ１－ｎ）、（ｉ２－１からｉ２－ｎ）、（ｉ３－１からｉ３－ｎ）、および（ｉ４－１からｉ４－ｎ））を含み、ここで、ｎは１以上の整数である。各液体入口と導管の間の流体接続は、バルブ１０によって調整することができる。液体供給ライン１、２、３、４は、明確化のために点線の囲みで強調されている。混合装置５の入口までの液体導管（それぞれ（ｌ１）、（ｌ２）、（ｌ３）、または（ｌ４））の全長は、各液体供給ラインに属すると考えられることが理解される。混合装置５は、液体供給ライン１、２、３、４からのいずれかの流れを統合し、それらを混合して１つの均一な溶液をもたらす。均一な溶液は、ｎ個のセンサ（ｓ１からｓｎ）を含む液体導管２０を通って反応槽６中に導かれ、ここで、ｎは１以上の整数である。センサは、溶液の組成に関連するフィードバック信号を制御部８に送ることができる。制御部８は、フィードバック信号を使用してラインのポンプ（それぞれ（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、または（ｐ４））の流れを調整する。センサを通過する溶液の組成が所与の設定間隔で不安定でない限り、溶液は反応装置中に向かわずに、自動三方弁１２およびバイパス導管１１を介して廃棄物容器７中に誘導される。ポンプｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４に加え、制御部８は、導管１１、２０を通る流体流、および反応槽と廃棄物容器７を接続する液体導管９を通る液体流を制御する。それによって、制御部８は、反応槽の内容物と共にインキュベートする液体およびインキュベート時間を決定することができる。
図１は、本発明にかかる装置の基本的な実施形態を示す。装置の液体供給部１９は、第１の液体供給ライン１、第２の液体供給ライン２、第３の液体供給ライン３、および第４の液体供給ライン４の４つの液体供給ラインに接続された混合装置５を含むことができる。各液体供給ラインは、ポンプ（それぞれ（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、または（ｐ４））、液体導管（それぞれ（ｌ１）、（ｌ２）、（ｌ３）、または（ｌ４））、およびｎ個の入口（それぞれ（ｉ１－１からｉ１－ｎ）、（ｉ２－１からｉ２－ｎ）、（ｉ３－１からｉ３－ｎ）、および（ｉ４－１からｉ４－ｎ））を含み、ここで、ｎは１以上の整数である。各液体入口と導管の間の流体接続は、バルブ１０によって調整することができる。液体供給ライン１、２、３、４は、明確化のために点線の囲みで強調されている。混合装置５の入口までの液体導管（それぞれ（ｌ１）、（ｌ２）、（ｌ３）、または（ｌ４））の全長は、各液体供給ラインに属すると考えられることが理解される。混合装置５は、液体供給ライン１、２、３、４からのいずれかの流れを統合し、それらを混合して１つの均一な溶液をもたらす。均一な溶液は、ｎ個のセンサ（ｓ１からｓｎ）を含む液体導管２０を通って反応槽６中に導かれ、ここで、ｎは１以上の整数である。センサは、溶液の組成に関連するフィードバック信号を制御部８に送ることができる。制御部８は、フィードバック信号を使用してラインのポンプ（それぞれ（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、または（ｐ４））の流れを調整する。センサを通過する溶液の組成が所与の設定間隔で不安定でない限り、溶液は反応装置中に向かわずに、自動三方弁１２およびバイパス導管１１を介して廃棄物容器７中に誘導される。ポンプｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４に加え、制御部８は、導管１１、２０を通る流体流、および反応槽と廃棄物容器７を接続する液体導管９を通る液体流を制御する。それによって、制御部８は、反応槽の内容物と共にインキュベートする液体およびインキュベート時間を決定することができる。
【0061】
図２は、本発明の装置に関するさらなる実施形態を示し、図１に関する全ての所見が図２に適用される。前述の構成要素に加え、ポンプ１７を有する液体再循環導管１６が三方弁１２を介して液体導管９に接続されている。この配置により、混合装置５およびｎ個のセンサ（ｓ１からｓｎ）を有する液体導管２０を介して反応槽６から出てくる所与の溶液を、反応槽６へ戻すよう循環させることが可能となる。三方弁１２およびポンプ１７の動作は、制御部８によって制御される。再循環導管１６に追加の液体入口１８を設けることで柔軟性をもたらすことができる。
【0062】
図３は、本発明の装置に関するさらなる実施形態を示し、図１に関する全ての所見が図３に適用される。前述の構成要素に加え、混合装置５と最初のセンサｓ１の間の液体導管２０に熱交換機１３が一体化される。これにより、センサからより信頼性の高い計測値が得られるよう溶液の温度を調整し、かつ反応槽６内の試薬の温度を調整することが可能となる。さらに、反応槽の下流の液体導管９にさらなるセンサ２３が一体化される。このセンサも、同様に、反応槽内部の事象と相関する信号を制御部に送る。本実施形態の第２の液体供給ライン２は、センサ２３と廃棄物容器７の間に位置付けられる三方弁１２を介してその入口の１つが液体導管９に接続され、二重の機能を果たす。この配置により、図２に示される専用の再循環導管およびポンプを必要とせずに、液体導管ｌ２、混合装置５、およびｎ個のセンサ（ｓ１からｓｎ）を有する液体導管２０を介して反応槽６から出てくる所与の液体を、反応槽６へ戻すよう循環させることが可能となる。三方弁１２およびポンプｐ２の動作は、制御部８によって制御される。
【0063】
図４は、本発明の装置に関するさらなる実施形態を示し、図３に関する全ての所見が図４に適用される。各々４つの貯蔵槽（それぞれ（ｖ１－１からｖ１－４）、（ｖ３－１からｖ３－４）、（ｖ４－１からｖ４－４））およびｎ－４個の入口（それぞれ（ｉ１－５からｉ１－ｎ）、（ｉ３－５からｉ３－ｎ）、（ｉ４－５からｉ４－ｎ））を有する３つの液体供給ライン１、３、４が示され、ここで、ｎは７に等しいか、または７より大きい整数である。上記図３に関して説明されたように、第２の液体供給ライン２は、液体供給ラインと再循環導管の二重の機能を果たす。第２の液体供給ライン２は、２つの貯蔵槽（ｖ２－１）、（ｖ２－２）およびｎ－２個の入口（ｉ２－３からｉ２－ｎ）と共に示され、ここで、ｎは５に等しいか、または５より大きい整数である。液体供給部１９は、熱交換器１３および２つのセンサ（ｓ１）、（ｓ２）を含む。
【0064】
図５は、本発明の装置に関するさらなる実施形態を示す。装置の液体供給部１９は、４つの液体供給ライン１、２、３、４に接続された混合装置５を含むことができる。各液体供給ラインは、ポンプ（それぞれ（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）、または（ｐ４））、液体導管（それぞれ（ｌ１）、（ｌ２）、（ｌ３）、または（ｌ４））、およびｎ個の入口（それぞれ（ｉ１－１からｉ１－ｎ）、（ｉ２－１からｉ２－ｎ）、（ｉ３－１からｉ３－ｎ）、（ｉ４－１からｉ４－ｎ））を含み、ここで、ｎは１以上の整数である。各液体入口と導管の間の流体接続は、バルブ１０によって調整することができる。混合装置５から出る混合された溶液は、液体導管２１を介して多岐管１４へ送られる。熱交換器１３およびセンサ（ｓ１）が液体導管２１に一体化される。センサ（ｓ１）は、液体供給ラインのポンプ（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ３）または（ｐ４）の動作を調整する信号を局所制御部１５に送る。局所制御部１５は、制御部８に制御されてもよく、または独立していてもよい。多岐管１４は、各々がポンプ１７および２つの液体入口１８を含む４つの追加の液体導管にさらに接続されている。多岐管から出る液体流は、液体導管２２を通って、反応槽６へ送られる。追加の熱交換器１３およびセンサ２３は、液体導管２２に一体化される。他の構成要素は、全て、図３を基準として配置される。
【0065】
【0066】
図７は、２つの液体供給ラインを有する装置に関するさらなる実施形態を示す。図７の装置は、図１に関して説明された装置に本質的に対応するが、液体供給ライン１、２を２つのみ含み、混合装置５の下流に配置されるセンサを含まない。
【0067】
図８は、２つの液体供給ラインおよび再循環回路を有する装置に関する別の実施形態を示す。図８の装置は、図７に関して説明された装置に本質的に対応するが、液体再循環導管１６および液体ポンプ１７を含む再循環回路をさらに含む。図８に示される再循環回路は、追加の液体入口１８も含む。
【0068】
さらに、図１の実施形態は、各液体ポンプｐ１、ｐ２の下流でかつ混合装置５の上流に配置される２つの液体供給ライン１、２のそれぞれに配置される液体流量センサ２４を含む。
【0069】
【0070】
【0071】
【0072】
図１２は、液体供給ラインのうちの１つが再循環回路として機能する３つの液体供給ラインを有する装置に関する別の実施形態を示す。図１２の実施形態は、センサおよび第４の液体供給ラインが除かれる以外、図３に関して説明された実施形態と同様である。
【0073】
【符号の説明】
【0074】
１ 液体供給ライン１
ｉ１－１ ライン１の入口番号１
ｉ１－２ ライン１の入口番号２
ｉ１－３ ライン１の入口番号３
ｉ１－４ ライン１の入口番号４
ｉ１－ｎ ライン１の入口番号ｎ
ｐ１ ライン１の液体ポンプ
ｌ１ ライン１の液体導管
２ 液体供給ライン２
ｉ２－１ ライン２の入口番号１
ｉ２－２ ライン２の入口番号２
ｉ２－３ ライン２の入口番号３
ｉ２－４ ライン２の入口番号４
ｉ２－ｎ ライン２の入口番号ｎ
ｐ２ ライン２の液体ポンプ
ｌ２ ライン２の液体導管
３ 液体供給ライン３
ｉ３－１ ライン３の入口番号１
ｉ３－２ ライン３の入口番号２
ｉ３－３ ライン３の入口番号３
ｉ３－４ ライン３の入口番号４
ｉ３－ｎ ライン３の入口番号ｎ
ｐ３ ライン３の液体ポンプ
ｌ３ ライン３の液体導管
４ 液体供給ライン４
ｉ４－１ ライン４の入口番号１
ｉ４－２ ライン４の入口番号２
ｉ４－３ ライン４の入口番号３
ｉ４－４ ライン４の入口番号４
ｉ４－ｎ ライン４の入口番号ｎ
ｐ４ ライン４の液体ポンプ
ｌ４ ライン４の液体導管
ｖ１－ｎ ライン１の貯蔵槽番号ｎ
ｖ２－ｎ ライン２の貯蔵槽番号ｎ
ｖ３－ｎ ライン３の貯蔵槽番号ｎ
ｖ４－ｎ ライン４の貯蔵槽番号ｎ
５ 混合装置
６ 反応槽
７ 廃棄物容器
８ 制御部
９ 制御可能な液体導管
１０ バルブ
１１ バイパス導管
ｓ１ センサ１
ｓ２ センサ２
ｓｎ センサｎ
１２ 三方弁
１３ 熱交換器
１４ 多岐管
１５ 局所制御部
１６ 液体再循環導管
１７ 液体ポンプ
１８ 液体入口
１９ 液体供給部
２０ 混合装置と反応槽の間の液体導管
２１ 混合装置と多岐管の間の液体導管
２２ 多岐管と反応槽の間の液体導管
２３ センサ
２４ 流量センサ
ｉ１－１ ライン１の入口番号１
ｉ１－２ ライン１の入口番号２
ｉ１－３ ライン１の入口番号３
ｉ１－４ ライン１の入口番号４
ｉ１－ｎ ライン１の入口番号ｎ
ｐ１ ライン１の液体ポンプ
ｌ１ ライン１の液体導管
２ 液体供給ライン２
ｉ２－１ ライン２の入口番号１
ｉ２－２ ライン２の入口番号２
ｉ２－３ ライン２の入口番号３
ｉ２－４ ライン２の入口番号４
ｉ２－ｎ ライン２の入口番号ｎ
ｐ２ ライン２の液体ポンプ
ｌ２ ライン２の液体導管
３ 液体供給ライン３
ｉ３－１ ライン３の入口番号１
ｉ３－２ ライン３の入口番号２
ｉ３－３ ライン３の入口番号３
ｉ３－４ ライン３の入口番号４
ｉ３－ｎ ライン３の入口番号ｎ
ｐ３ ライン３の液体ポンプ
ｌ３ ライン３の液体導管
４ 液体供給ライン４
ｉ４－１ ライン４の入口番号１
ｉ４－２ ライン４の入口番号２
ｉ４－３ ライン４の入口番号３
ｉ４－４ ライン４の入口番号４
ｉ４－ｎ ライン４の入口番号ｎ
ｐ４ ライン４の液体ポンプ
ｌ４ ライン４の液体導管
ｖ１－ｎ ライン１の貯蔵槽番号ｎ
ｖ２－ｎ ライン２の貯蔵槽番号ｎ
ｖ３－ｎ ライン３の貯蔵槽番号ｎ
ｖ４－ｎ ライン４の貯蔵槽番号ｎ
５ 混合装置
６ 反応槽
７ 廃棄物容器
８ 制御部
９ 制御可能な液体導管
１０ バルブ
１１ バイパス導管
ｓ１ センサ１
ｓ２ センサ２
ｓｎ センサｎ
１２ 三方弁
１３ 熱交換器
１４ 多岐管
１５ 局所制御部
１６ 液体再循環導管
１７ 液体ポンプ
１８ 液体入口
１９ 液体供給部
２０ 混合装置と反応槽の間の液体導管
２１ 混合装置と多岐管の間の液体導管
２２ 多岐管と反応槽の間の液体導管
２３ センサ
２４ 流量センサ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】