(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-08
(54)【発明の名称】体細胞をリプログラムするための方法およびキット
(51)【国際特許分類】
C12N 5/074 20100101AFI20230201BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20230201BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20230201BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230201BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20230201BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20230201BHJP
C07K 14/435 20060101ALN20230201BHJP
【ＦＩ】
C12N5/074 ZNA
C12M3/00 Z
A61K35/545
A61P25/00
A61P19/00
A61L27/38 300
C07K14/435
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022552688
(86)(22)【出願日】2020-11-11
(85)【翻訳文提出日】2022-07-07
(86)【国際出願番号】 US2020060071
(87)【国際公開番号】W WO2021096998
(87)【国際公開日】2021-05-20
(31)【優先権主張番号】62/933,926
(32)【優先日】2019-11-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522183803
【氏名又は名称】越智 厚雄
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】越智 厚雄
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
4C081
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA08
4B029AA21
4B029BB11
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BC41
4B065BD38
4B065BD39
4B065CA44
4C081AB02
4C081AB18
4C081CD34
4C081EA11
4C087AA01
4C087AA03
4C087BB64
4C087NA20
4C087ZA01
4C087ZA96
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA32
4H045CA50
4H045DA83
4H045EA60
(57)【要約】
本発明は、体細胞を多能性幹細胞様細胞にリプログラムするための方法に関する。そのような細胞は、外因性の遺伝子、タンパク質、または化学物質を導入することなく、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２を含む多能性誘導遺伝子を発現する可能性がある。体細胞における機械感受性伸展活性化イオンチャネルの阻害が多能性誘導因子遺伝子を特異的に活性化するという発見は、体細胞を阻害剤、ＧｓＭＴＸ４とともに、機械感受性伸展活性化イオンチャネルに対してインキュベートし、軟質ヒドロゲル表面で培養するか、コレステロール枯渇物質、メチル－ベータ－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）で処理する細胞リプログラミング培養方法を引き出した。記載されている方法は、多能性幹細胞様細胞を産生し、続いて、脂肪細胞、骨細胞、神経細胞を含む細胞に再分化する。体細胞リプログラミングの効率を高めるために、方法を組み合わせることができる。体細胞リプログラミングキットはまた、ヒドロゲル（脱水）およびＭβＣＤでキャストされた組織培養ディッシュで作成された。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導する方法であって、前記非多能性哺乳動物細胞を、以下：
ａ．前記哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｂ．前記哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｃ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させることを含む、方法。
【請求項2】
前記非多能性哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４のＬエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４のＤエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４の配列と少なくとも９０％同一である配列を有するペプチド、またはそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度である、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞コレステロール低減剤が、シクロデキストリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記シクロデキストリンが、メチル－β－シクロデキストリンである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記シクロデキストリンが、約５ｍＭの濃度である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記人工多能性幹細胞が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される細胞型に分化することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の前記発現が、前記非多能性哺乳動物細胞と比較して前記人工多能性幹細胞で誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
２番目の非多能性細胞型を有する細胞の単離集団を含む医薬組成物であって、前記細胞が、１番目の非多能性細胞型から動物細胞を変換する組成物により得られ、前記組成物が、ａ．前記非多能性哺乳動物細胞を、以下：
ｉ．前記哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｉｉ．前記哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｉｉｉ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させること、
および
ｂ．ステップ（ａ）からの前記細胞の前記２番目の非多能性細胞型への分化を誘導すること
により１番目の細胞型の非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導することを含む、医薬組成物。
【請求項14】
ａ．細胞培養培地、ｂ．以下：
ｉ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｉｉ．前記哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤
の１つまたは両方で処理された１つまたは複数の前記哺乳動物細胞；および
ｃ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
を含む細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１． 関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９３３，９２６号の優先権を主張するものである。
本出願は、２０１９年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９３３，９２６号の優先権を主張するものである。
【0002】
２． 配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている配列表を含む。２０２０年１１月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、００１ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズが２６，６２７バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている配列表を含む。２０２０年１１月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、００１ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズが２６，６２７バイトである。
【0003】
本発明は、一般に、分化能を保持する多能性幹細胞様細胞になる体細胞をリプログラムする方法に関する。記載の方法、試薬、組成物、幹細胞様細胞ならびに神経細胞、脂肪細胞、筋肉細胞および骨細胞などの分化した細胞は、再生療法を必要とする種々の疾患を処置するために使用される。
【背景技術】
【0004】
変性疾患の分子および細胞メカニズムの現在の理解をするため、多能性幹細胞および分化した細胞は、再生医療の進歩に対応するために大きな需要となっている。
【0005】
多細胞生物の恒常性メカニズムの下で、最終的に分化して損傷した細胞は、プログラム細胞死により除去されるが、除去されたものは、同じ機能を保持する新規に分化した細胞で即座に置き換えられる。細胞死が、病原性の環境内で、または大部分の組織が喪失している組織の損傷により、新規細胞の生成を上回る場合、再生療法は、喪失した組織を回復して、臓器機能を修復するために不可欠になる。多能性分化能を保持する胚盤胞における幹細胞の存在の発見は、分化した細胞を生成して、喪失した臓器の一部または臓器全体を再構築することができる再生幹細胞療法を確立するための挑戦を促した。以下に列記するものは、再生療法に適用するのに有用な種々の種類の細胞を生成するために、エクスビボでの操作を通じて分化能を保持すると現在認識されている細胞源である。
【0006】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）
ＥＳ細胞は、ヒトまたはマウスの初期胚、胚盤胞に由来する多能性細胞であり［Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１５４（１９８１）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７６３４（１９８１）］、生体内に存在する全種類の細胞に分化する能力を維持しながら、長期間にわたってインビトロで培養することができる特有の特徴を有している。ヒト胚性幹細胞は、上述した特性を利用する、パーキンソン病、若年性糖尿病、および白血病などの種々の疾患のための細胞移植療法に有用であると期待されている。しかし、ＥＳ細胞の移植は、臓器移植と同様に、拒絶反応を引き起こす問題を有している。さらに、倫理的観点から、ヒト胚を破壊することにより確立されるＥＳ細胞の使用に対する多くの反対意見がある。
ＥＳ細胞は、ヒトまたはマウスの初期胚、胚盤胞に由来する多能性細胞であり［Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１５４（１９８１）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７６３４（１９８１）］、生体内に存在する全種類の細胞に分化する能力を維持しながら、長期間にわたってインビトロで培養することができる特有の特徴を有している。ヒト胚性幹細胞は、上述した特性を利用する、パーキンソン病、若年性糖尿病、および白血病などの種々の疾患のための細胞移植療法に有用であると期待されている。しかし、ＥＳ細胞の移植は、臓器移植と同様に、拒絶反応を引き起こす問題を有している。さらに、倫理的観点から、ヒト胚を破壊することにより確立されるＥＳ細胞の使用に対する多くの反対意見がある。
【0007】
造血幹細胞
造血幹細胞は、血液または骨髄から単離された細胞であり、それ自体で更新することができ、種々の特化された細胞に分化することができ、骨髄を循環血液に移動することができ、プログラム細胞死を実行することができ、それによって有害であるか不要である細胞が自己破壊する。骨髄内の１００，０００細胞ごとに約１つの細胞は、長期の造血性の幹細胞であり、骨髄に存在する他の細胞には、間質細胞、間質幹細胞、血液前駆細胞、ならびに成熟した、および成熟する白血球細胞および赤血球細胞が含まれる。
造血幹細胞は、血液または骨髄から単離された細胞であり、それ自体で更新することができ、種々の特化された細胞に分化することができ、骨髄を循環血液に移動することができ、プログラム細胞死を実行することができ、それによって有害であるか不要である細胞が自己破壊する。骨髄内の１００，０００細胞ごとに約１つの細胞は、長期の造血性の幹細胞であり、骨髄に存在する他の細胞には、間質細胞、間質幹細胞、血液前駆細胞、ならびに成熟した、および成熟する白血球細胞および赤血球細胞が含まれる。
【0008】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
ＭＳＣは、組織または骨髄間質細胞および臍帯細胞および脂肪由来間質／幹細胞を含む「成体」幹細胞の一例である。それらは、１種類より多くではあるが全ての種類ではない、体の特化された細胞を産生することができることを意味する「多能性」である。ＭＳＣは、骨格細胞において認められる異なる特化された細胞を作製成する。例えば、それらは、軟骨細胞（軟骨細胞（chondrocyte））、骨細胞（骨芽細胞）および脂肪細胞（脂肪細胞（adipocyte））に分化または特化することができる。これらの特化された細胞は、それぞれ、独自の特徴的な形状、構造および機能を有し、それぞれ、特定の組織に属する。ＭＳＣの分化能が、心筋修復、ならびに骨および神経細胞の修復のような種々の疾患における細胞療法に有用である可能性があることを示唆するが、精製された間葉系幹細胞の増殖は、個体、年齢および組織の起源の間で一致していない。さらに、細胞の増殖は、数回の継代後に低下し、多数の細胞の調製には、問題がある。
ＭＳＣは、組織または骨髄間質細胞および臍帯細胞および脂肪由来間質／幹細胞を含む「成体」幹細胞の一例である。それらは、１種類より多くではあるが全ての種類ではない、体の特化された細胞を産生することができることを意味する「多能性」である。ＭＳＣは、骨格細胞において認められる異なる特化された細胞を作製成する。例えば、それらは、軟骨細胞（軟骨細胞（chondrocyte））、骨細胞（骨芽細胞）および脂肪細胞（脂肪細胞（adipocyte））に分化または特化することができる。これらの特化された細胞は、それぞれ、独自の特徴的な形状、構造および機能を有し、それぞれ、特定の組織に属する。ＭＳＣの分化能が、心筋修復、ならびに骨および神経細胞の修復のような種々の疾患における細胞療法に有用である可能性があることを示唆するが、精製された間葉系幹細胞の増殖は、個体、年齢および組織の起源の間で一致していない。さらに、細胞の増殖は、数回の継代後に低下し、多数の細胞の調製には、問題がある。
【0009】
人工多能性幹細胞
患者自身の分化した体細胞の分化が、多能性およびＥＳ細胞と類似の増殖能を有する細胞を確立するために誘導される可能性がある場合、そのような人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、拒絶反応または倫理的困難がない理想的な多能性細胞として使用することができる［米国特許第１０，０１７，７４４号］。山中グループにより最初に報告されたｉＰＳＣ［Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ １２６：６６３（２００６）；米国特許第８，０４８，９９９号］は、胚性幹細胞の明確な特性を維持するために重要な遺伝子および因子を強制的に発現させることにより、胚性幹細胞様状態に遺伝子的にリプログラムされたマウス成体細胞である。ヒトｉＰＳＣは、２００７年後期に最初に報告された［Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３１：８６１（２００７）；米国特許公開第２０１３／００６５３１１号］。マウスｉＰＳＣは、幹細胞マーカーの発現、３つの胚葉すべてからの細胞を含む腫瘍の形成、および発生の非常に早い段階でマウス胚に注入された場合に多くの異なる組織に寄与することができることを含む、多能性幹細胞の重要な特徴を示した。ヒトｉＰＳＣはまた、幹細胞マーカーを発現し、３つの胚葉すべてに特徴的な細胞を生成することができる。ｉＰＳＣは、多能性幹細胞の定義基準に合致しているが、ｉＰＳＣおよび胚性幹細胞が臨床的に重要な方法において異なるかは知られていない。
患者自身の分化した体細胞の分化が、多能性およびＥＳ細胞と類似の増殖能を有する細胞を確立するために誘導される可能性がある場合、そのような人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、拒絶反応または倫理的困難がない理想的な多能性細胞として使用することができる［米国特許第１０，０１７，７４４号］。山中グループにより最初に報告されたｉＰＳＣ［Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ １２６：６６３（２００６）；米国特許第８，０４８，９９９号］は、胚性幹細胞の明確な特性を維持するために重要な遺伝子および因子を強制的に発現させることにより、胚性幹細胞様状態に遺伝子的にリプログラムされたマウス成体細胞である。ヒトｉＰＳＣは、２００７年後期に最初に報告された［Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３１：８６１（２００７）；米国特許公開第２０１３／００６５３１１号］。マウスｉＰＳＣは、幹細胞マーカーの発現、３つの胚葉すべてからの細胞を含む腫瘍の形成、および発生の非常に早い段階でマウス胚に注入された場合に多くの異なる組織に寄与することができることを含む、多能性幹細胞の重要な特徴を示した。ヒトｉＰＳＣはまた、幹細胞マーカーを発現し、３つの胚葉すべてに特徴的な細胞を生成することができる。ｉＰＳＣは、多能性幹細胞の定義基準に合致しているが、ｉＰＳＣおよび胚性幹細胞が臨床的に重要な方法において異なるかは知られていない。
【0010】
モロニーマウス白血病ウイルスおよびレンチウイルスは、元来、成体細胞にリプログラミング因子を導入するために使用されていた［米国特許第８，４４０，４６１号］。このプロセスが、結果として、ウイルスの組込みとなるので、技術が癌の発生の可能性を回避するためにヒトにとって有用な処置をもたらすことができる前に調節して試験する必要がある。動物研究において、幹細胞因子を導入するために使用されるウイルスは、時として癌を引き起こす。アデノウイルスおよびセンダイウイルスは、非組込みウイルス（non-integrating virus）であり、また、因子（ＰＩＦ）を成体細胞に誘導する多能性を導入するために使用されたが、リプログラミング効率は低い［Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２７：２６６７（２００９）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ．１５：５０３（２０１３）］。ウイルス感染およびゲノム組込みに基づくリプログラミング法を非ウイルス送達戦略に採用するための研究者らによるチャレンジは、結果として、体細胞における遺伝子発現を誘導する一過性の多能性を誘導するための代替技術となった。それらは、エピソーム、ＲＮＡおよび組換えタンパク質を使用するリプログラミング因子送達システムであるが、それぞれ、（タンパク質に基づく送達システムについて）低効率または調製における困難などの欠点を有する［Ｗｏｌｔｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５８：７６６（２００９）；米国特許公開第２０１８／００７２９９９号；Ｋｏｇｕｔ Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９：７４５（２０１８）；米国特許公開第２０１３／０３０２２９５号；国際特許公開第ＷＯ２００９／０７７１３４号；Ｚｈｏｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：３８１（２００９）；米国特許第９，０６８，１７０号］。これらの技術は、発生運命が以前決定されていると想定されていた細胞を「脱分化」することを可能にする。ｉＰＳＣ技術は、リプログラミング因子を導入することにより、ヒト疾患のモデリング、薬剤開発およびスクリーニング、ならびに個別化された再生細胞療法のために患者固有の幹細胞を生成する機会を与える。
【0011】
化学的に支援され、リプログラムされた体細胞（ｃｉＰＳＣ）
ＰＩ遺伝子発現のためのウイルスベクターおよび腫瘍遺伝子の使用は、診療所におけるこれらの細胞の安全な使用について正当な関心事を生じている。したがって、当分野は、新規化学物質／小分子（＜９００ダルトン）に基づくリプログラミング戦略にシフトしている。最初に報告されたのは、化学的に支援されたｃｉＰＳＣの生成であり、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）を使用することにより、癌遺伝子ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４（４つの山中因子のうちの２つ）の必要性を排除し、また、リプログラミング効率が、４つの転写因子法［Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：１２６９（２００８）；米国特許第９，９８２，２３７号］の１００倍に増加したことが認められている。他方で、研究は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）阻害剤ＢＩＸ－０１２９４を使用して、原形質膜のカルシウムチャネルを活性化し、Ｄｉｎｇの研究室からの４つの山中因子を使用するリプログラミング効率を改善した［Ａｒｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，４：３６９２（２０１４）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３：５６８ ２００８）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２：５２５（２００８）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，６：８０５（２００９）］。初代ヒト線維芽細胞（ＣＲＬ２０９７またはＢＪ）上のトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦβ）受容体およびＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）の阻害剤は、４つの山中因子をコードする遺伝子を保持するレトロウイルスで形質導入された［オーストラリア特許出願第２０１５２０１０２６号］。それらは、７つの小分子の組み合わせにより、処置から１週間以内にヒト線維芽細胞からのｉＰＳＣ生成の効率が２００倍よりも高く改善することを示した。続いて、いくらかの群は、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃを必要とせずに、単一の転写因子Ｏｃｔ４の存在下で３週間以内にマウス胚および成体線維芽細胞からのリプログラミングを可能にするのに充分であった、特定の化学物質の組み合わせを同定した［Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２１：１９６（２０１１）；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２９：５４９（２０１１）；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７：６５１（２０１０）］。このプロトコルを使用して開発されたｉＰＳＣは、多能性遺伝子の発現、エピジェネティックな状態、およびグローバルな遺伝子発現プロファイルの点で、マウスＥＳ（ｍＥＳ）細胞に類似である。
ＰＩ遺伝子発現のためのウイルスベクターおよび腫瘍遺伝子の使用は、診療所におけるこれらの細胞の安全な使用について正当な関心事を生じている。したがって、当分野は、新規化学物質／小分子（＜９００ダルトン）に基づくリプログラミング戦略にシフトしている。最初に報告されたのは、化学的に支援されたｃｉＰＳＣの生成であり、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）を使用することにより、癌遺伝子ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４（４つの山中因子のうちの２つ）の必要性を排除し、また、リプログラミング効率が、４つの転写因子法［Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：１２６９（２００８）；米国特許第９，９８２，２３７号］の１００倍に増加したことが認められている。他方で、研究は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）阻害剤ＢＩＸ－０１２９４を使用して、原形質膜のカルシウムチャネルを活性化し、Ｄｉｎｇの研究室からの４つの山中因子を使用するリプログラミング効率を改善した［Ａｒｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，４：３６９２（２０１４）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３：５６８ ２００８）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２：５２５（２００８）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，６：８０５（２００９）］。初代ヒト線維芽細胞（ＣＲＬ２０９７またはＢＪ）上のトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦβ）受容体およびＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）の阻害剤は、４つの山中因子をコードする遺伝子を保持するレトロウイルスで形質導入された［オーストラリア特許出願第２０１５２０１０２６号］。それらは、７つの小分子の組み合わせにより、処置から１週間以内にヒト線維芽細胞からのｉＰＳＣ生成の効率が２００倍よりも高く改善することを示した。続いて、いくらかの群は、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃを必要とせずに、単一の転写因子Ｏｃｔ４の存在下で３週間以内にマウス胚および成体線維芽細胞からのリプログラミングを可能にするのに充分であった、特定の化学物質の組み合わせを同定した［Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２１：１９６（２０１１）；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２９：５４９（２０１１）；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７：６５１（２０１０）］。このプロトコルを使用して開発されたｉＰＳＣは、多能性遺伝子の発現、エピジェネティックな状態、およびグローバルな遺伝子発現プロファイルの点で、マウスＥＳ（ｍＥＳ）細胞に類似である。
【0012】
Ｈｏｕらは、７つの小分子化合物ＶＣ６ＴＦＺ：ＶＰＡ、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）、６１６４５２、トラニルシプロミン、フォルスコリン（ＦＳＫ）、２－メチル－５－ヒドロキシトリプタミン（２－Ｍｅ－５ＨＴ）、およびＤ４４７６の組み合わせを使用して最大０．２％の効率でマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）からのマウスｉＰＳＣのすべての化学的生成を最初に報告した［Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４１：６５１（２０１３）；国際特許公開第ＷＯ２０１５／００３６４３号］。この方法は、また、山中のｉＰＳＣプロトコル（０．０１％～０．１％）と比較してより高い誘導効率を有していた。化学的人工多能性幹細胞（ｃｉＰＳＣ）は、ｍＥＳ細胞と類似のグローバル遺伝子発現プロファイルを示した。この研究は、小分子を使用することにより、マスターレギュレーター遺伝子の異所性発現が細胞運命のリプログラミングに必要ではないという原理の証明を提供し、したがって、細胞療法のための機能的に望ましい細胞型を生成する際に潜在的に使用される全化学的リプログラミング戦略への道を示す。ｃｉＰＳＣを生成するためにこれまで使用されてきたほとんどの小分子は、エピジェネティック修飾因子、細胞シグナル伝達およびアポトーシスの修飾因子、ｗｉｎｇｌｅｓｓ統合部位増殖因子（ＷＮＴ）シグナル調節因子、細胞老化の調節因子、または代謝の調節因子として分類することができる。
【0013】
特異的様式の細胞培養により誘導された幹細胞様表現型細胞
組織微小環境内の核リプログラミングイベントは、多くの発生過程および組織維持にとって重要である［Ｈａｌｌｅｙ－Ｓｔｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４０：２４６８（２０１３）；Ｒｅｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：１０８９（２００１）；Ｌａｍｏｕｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５：１７８（２０１４）］。画期的な実験において、生物学的因子は、インビトロでの体細胞のｉＰＳＣへの核リプログラミングを誘導することが示された［Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ，１２６：６６３（２００６）；Ｄｅ Ｍａｔｔｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２７：２７６１（２００９）；Ｄｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，１２：１１５４（２０１３）］。しかし、インビトロで、細胞は、外因性因子の非存在下で異なる系統に分化形質転換し、局所的な機械化学的因子が重要な要素であり得、そのような変化を誘導するのに充分であることを示唆する［Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１１：５２５２（２０１４）］。これと一致して、最近の結果は、リプログラミング因子と組み合わせた位置特異的なパターンで、または異なる基板剛性で細胞を培養すると、結果として核リプログラミングの有効性が高まることになる［Ｓｕ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３４：３２１５（２０１３）；Ｋｉｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０７：４８７２（２０１０）；Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２６：６７７（２００６）；Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１４：３８８２（２０１７）］ことを示している。しかし、核リプログラミングにおける生化学的因子の非存在下で異なる機械的手がかりにより果たされる役割は、充分に確立されていない。機械的制約（例えば、基板剛性および細胞形態）は、細胞増殖、アポトーシス、および分化を含む多くの細胞プロセスを制御するのに不可欠である［Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１４２５（１９９７）；ＭｃＧｒａｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２９：１２８０（２０１５）；Ｋｓｈｉｔｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ．，４：１００８（２０１２）；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３３０８９（２０１２）］。生物物理学的力は、上皮から間葉系への変形を調節する上で重要であることが示されている［Ｄｅｓｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，１５：４７０（２００８）］。マトリックス剛性、細胞形状、および表面形状はすべて、インビトロで幹細胞分化を指示することが示されている［ＭｃＧｒａｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２９：１２８０（２０１５）；Ｋｓｈｉｔｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ．，４：１００８（２０１２）；米国特許公開第２００８／０１８７９９５号］。加えて、発生中のショウジョウバエ胚に力を適用することを含むインビボ実験は、組織のメカニズムを変更することで、分化プログラムを変更することができることを示している［Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７：ｅ３３０８９Ａ（２０１２）；Ｄｅｓｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，１５：４７０（２００８）］。まとめると、これらの結果は、幹細胞分化を指示する上で生物物理学的手がかりの重要性を強調する。
組織微小環境内の核リプログラミングイベントは、多くの発生過程および組織維持にとって重要である［Ｈａｌｌｅｙ－Ｓｔｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４０：２４６８（２０１３）；Ｒｅｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：１０８９（２００１）；Ｌａｍｏｕｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５：１７８（２０１４）］。画期的な実験において、生物学的因子は、インビトロでの体細胞のｉＰＳＣへの核リプログラミングを誘導することが示された［Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ，１２６：６６３（２００６）；Ｄｅ Ｍａｔｔｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２７：２７６１（２００９）；Ｄｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，１２：１１５４（２０１３）］。しかし、インビトロで、細胞は、外因性因子の非存在下で異なる系統に分化形質転換し、局所的な機械化学的因子が重要な要素であり得、そのような変化を誘導するのに充分であることを示唆する［Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１１：５２５２（２０１４）］。これと一致して、最近の結果は、リプログラミング因子と組み合わせた位置特異的なパターンで、または異なる基板剛性で細胞を培養すると、結果として核リプログラミングの有効性が高まることになる［Ｓｕ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３４：３２１５（２０１３）；Ｋｉｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０７：４８７２（２０１０）；Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２６：６７７（２００６）；Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１４：３８８２（２０１７）］ことを示している。しかし、核リプログラミングにおける生化学的因子の非存在下で異なる機械的手がかりにより果たされる役割は、充分に確立されていない。機械的制約（例えば、基板剛性および細胞形態）は、細胞増殖、アポトーシス、および分化を含む多くの細胞プロセスを制御するのに不可欠である［Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１４２５（１９９７）；ＭｃＧｒａｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２９：１２８０（２０１５）；Ｋｓｈｉｔｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ．，４：１００８（２０１２）；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３３０８９（２０１２）］。生物物理学的力は、上皮から間葉系への変形を調節する上で重要であることが示されている［Ｄｅｓｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，１５：４７０（２００８）］。マトリックス剛性、細胞形状、および表面形状はすべて、インビトロで幹細胞分化を指示することが示されている［ＭｃＧｒａｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２９：１２８０（２０１５）；Ｋｓｈｉｔｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ．，４：１００８（２０１２）；米国特許公開第２００８／０１８７９９５号］。加えて、発生中のショウジョウバエ胚に力を適用することを含むインビボ実験は、組織のメカニズムを変更することで、分化プログラムを変更することができることを示している［Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７：ｅ３３０８９Ａ（２０１２）；Ｄｅｓｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，１５：４７０（２００８）］。まとめると、これらの結果は、幹細胞分化を指示する上で生物物理学的手がかりの重要性を強調する。
【0014】
本明細書で使用されるように、以下の用語は、定められた意味を有するものとする。それ以外の場合、すべての用語は、関連技術の当業者により通常与えられる意味を有するものとする。
【0015】
用語「胚盤胞」は、胚が発生する内部細胞塊と呼ばれる細胞のクラスターを含む初期胚発生における薄壁の中空構造を指す。
【0016】
用語「多能性誘導遺伝子」は、その発現が、体細胞を多能性状態にリプログラムするのに寄与する遺伝子を指す。
【0017】
用語「多能性誘導因子」は、多能性誘導遺伝子の発現生成物を指す。多能性誘導因子は、多能性因子である可能性があるが、そうである必要はない。外因的に導入された多能性誘導因子の発現は、一過性である可能性がある、すなわち、それは、多能性を誘導するためおよび／または安定した多能性状態を確立するために、リプログラミングプロセスの少なくとも一部の間に必要である可能性があるが、その後、多能性を維持する必要はない。インビトロで体細胞を多能性にリプログラムするための目的のＰＩＦの例は、Ｏｃｌ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、Ｋｉｔ’ｄ、ｃ－ｈｆｙｃ、および体細胞をインビトロでリプログラムする方法においてこれらの１つまたは複数を置き換えることができる任意の遺伝子／タンパク質である。
【0018】
用語「リプログラミング因子」は、細胞リプログラミングに、例えばインビトロで促進または寄与する遺伝子、ＲＮＡ、またはタンパク質を指す。
【0019】
用語「ヒドロゲル」は、大量の水または生物体液を吸収することができる三次元の親水性ポリマーネットワークであることを指す。それらの高い水分含量、多孔性、および柔らかい粘稠度のため、それらは、天然の生体組織を厳密にシミュレートする。
【0020】
用語「機械感受性伸展活性化イオンチャネル（ＭＳＡＩＣ）」は、正電荷イオン（すなわちカチオン）を、例えばチャネルを発現する細胞に適用される機械的な力または圧力に応答して細胞に出入りする通過を可能にするように開くイオンチャネルを指す。本明細書で使用されるように、その用語はまた、機械的に活性化されたカチオンチャネルのポリペプチド成分、例えば、カチオンチャネルのサブユニットも含む。いくらかの実施形態において、本発明の機械的に活性化されたカチオンチャネルは、ニューロンなどの細胞を含むが、それらに限定されない、疼痛伝達などの感覚伝達に関与する。
【0021】
用語「幹細胞」は、培養中に無期限で分割して特化された細胞を生じさせる能力を有する細胞を指す。
【0022】
用語「体細胞」は、配偶子（卵子または精子）以外の任意の体細胞を指す。
【0023】
用語「胚性幹細胞」は、着床前段階の胚に由来し、培養中に長期間分化することなく分割することができ、３つの主要な胚葉の細胞および組織に発生することが知られている初期（未分化）細胞を指す。
【0024】
用語「分化」は、特化されていない胚性細胞が心臓細胞、肝臓細胞、または筋肉細胞などの特化された細胞の特徴を獲得するプロセスを指す。分化は、細胞の遺伝子の、細胞の外側の物理的および化学的条件との相互作用により、通常は、細胞表面に埋め込まれたタンパク質を含むシグナル伝達経路を通じて制御される。
【0025】
用語「多能性」は、臓器のすべての組織に分化することができるが、単独では完全な生物の発生を維持することができない単一細胞の状態を指す。
【0026】
用語「人工多能性幹細胞」は、ある特定の胚性遺伝子の体細胞への導入により形成された、胚性幹細胞と類似の一種の多能性幹細胞を指す。
【0027】
用語「核リプログラミング」は、核を新規細胞質環境に導入することにより実験的に導入される遺伝子活性における変化を記述すること、細胞の分化状態が、別の状態に変化するプロセスを指す。
【0028】
用語「多能性幹細胞様細胞」は、ＰＩ因子を発現する細胞を指す。
【0029】
用語「山中因子」は、胚性幹（ＥＳ）細胞において高度に発現される一連の遺伝子、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃを指し、それらの過剰発現は、マウス体細胞およびヒト体細胞の両方に多能性を誘導することができ、これらの因子がＥＳ細胞の多能性に必要な発生シグナル伝達ネットワークを調節することを示唆する。
【0030】
用語「シクロデキストリン」は、α－（１，４）結合したグルコピラノースサブユニットで構成される環状多糖類のファミリーを指す。シクロデキストリン（ＣＤ）は、有用な分子キレート剤である。それらは、クリプタンド、カリックスアレーン、シクロファン、スフェランドおよびクラウンエーテルから形成される構造と同じである、ケージ様の超分子構造を保持する。超分子構造を有するこれらの化合物は、相互作用する分子、イオンまたはラジカルの間に共有結合が形成されない分子間相互作用を含む化学反応を実行する。これらの反応すべての大部分は、「ホスト－ゲスト」型である。上述したすべての超分子ホストと比較して、シクロデキストリンは、最も重要である。それらの包接錯体形成能のため、それらが複雑になる材料の特性を大幅に変更することができる。分子錯化現象の結果として、ＣＤは、多くの工業製品、技術、および分析方法に幅広く使用されている。ＣＤの無視できる細胞毒性効果は、薬物担体、食品および香料、化粧品、包装、布、分離プロセス、環境保護、発酵および触媒などの用途において重要な性質である。
【発明の概要】
【0031】
本発明は、機械感受性伸展活性化イオンチャネル（ＭＳＡＩＣ）に特異的な阻害が、体細胞（骨髄細胞）における一連のＰＩＦの発現を活性化させ、続いて、細胞が多能性幹細胞様表現型を獲得するようにする発見に基づく。発見によるさらなる教示は、体細胞がＭＳＡＩＣの阻害後、２つの種類、１）１６時間以内にＰＩＦの発現を増加させるもの（例えば、骨髄細胞）および２）ＰＩＦの発現を抑制するものに分割するができることであった。線維芽細胞などの２番目の種類の細胞が、細胞コレステロール含量を低減するＭβＣＤで処理される場合、ＰＩＦの発現は、１番目の種類の細胞のように１６時間内のＭＳＡＩＣ阻害後に増加した。追加の発見は、ＭＳＡＩＣ阻害が継続する場合、ＰＩＦの発現を低減する２番目の種類の細胞が７２時間まで最終的にＰＩＦ発現を増加させたことを示した。したがって、ＭＳＡＩＣの持続的な阻害が、体細胞における転写因子の発現を活性化し、多能性幹細胞様表現型を獲得した。ＭＳＡＩＣの阻害に続いて幹細胞様表現型を誘導する可能性は、ＭＳＡＩＣシグナル伝達を弱める実験条件により調査された。試験されたものは、１）ＧｓＭＴＸ４によりＭＳＡＩＣを阻害すること、２）ポリアクリルアミドゲルで製造された軟質マトリックス上で細胞を培養すること、ならびに３）体細胞をＭβＣＤなどのコレステロール枯渇化合物で処理することであった。すべてのアプローチは、ＭＳＡＩＣの弱化が幹細胞様表現型に必要な転写因子のレパートリーを誘導し、また新規表現型を有する「再」分化細胞を示した、本発明の原理の証拠を提供した。インビトロ培養における分化した細胞の新規表現型は、脂肪細胞、骨形成細胞、筋肉細胞、腱形成細胞、ニューロン、ミクログリア、内皮細胞、赤血球前駆細胞などを含んでいた。最後に、この原理の適用により、ソフトゲルおよびコレステロール枯渇化学物質を含む体細胞リプログラミングキットの調製が可能になった。本発明は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ－Ｍｙｃを含むが限定されない転写因子を発現し、続いて形態学的に多様な体細胞に分化する幹細胞様細胞を生成し、したがって、本発明が再生医療に著しく有益であることを示した。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図9】図９Ａ～図９Ｂは、ヒドロゲル上の球体および溶解した球体細胞の顕微鏡検査を示す。図１Ａは、１６時間のインキュベーション後のヒドロゲル上の球体を示す。図１Ｂは、１４日後にヒドロゲル上の円形細胞クラスターに溶解した球体を示す。
【図10】図１０Ａ～図１０Ｃは、ヒドロゲル上の球体およびディッシュ底面上の細胞のＰＩ遺伝子のメッセージ分析を示す。図１０Ａは、Ｏｃｔ４遺伝子発現を示す；図１０Ｂは、Ｎａｎｏｇ遺伝子発現を示す；および図１０Ｃは、Ｓｏｘ２遺伝子発現を示す。
【図17】図１７Ａ～図１７Ｅは、ＭβＣＤおよびヒドロゲルで処理されたマウスＥＦ細胞に由来するインビトロで分化させた脂肪細胞様細胞を示す。図１７Ａは、褐色脂肪細胞を示す；図１７Ｂは、白色脂肪細胞を示す；図１７－Ｃ－Ｅは、オイルレッドＯ染色脂肪細胞を示す。
【図19】図１９Ａ～図１９Ｄは、ＭβＣＤおよびヒドロゲルで処理されたマウスＥＦ細胞に由来するインビトロで分化させた神経細胞様細胞を示す。図１９Ａは、皮質ニューロンを示す；図１９Ｂは、星状細胞を示す；図１９Ｃは、ミクログリアを示す；図１９Ｄは、オリゴデンドロサイトを示す。
【図21】図２１Ａ～図２１Ｆは、ＭβＣＤおよびヒドロゲルで処理されたマウスＥＦ細胞に由来するインビトロで分化させた細胞クラスターを示す。図２１Ａは、星状細胞様細胞を示す；図２１Ｂは、ミクログリア様細胞を示す；図２１Ｃは、非分類細胞のクラスターを示す。細胞型は、形態学に基づいて標識された。
【図25】ＭβＣＤおよびヒドロゲルで処理されたマウスＥＦ細胞に由来するインビトロで分化させた筋芽細胞様細胞。
【発明を実施するための形態】
【0033】
１）非多能性細胞を１つまたは複数のコレステロール枯渇剤と接触させること、２）非多能性細胞を１つまたは複数のＭＳＡＩＣ阻害剤と接触させること、３）軟質マトリックス上で細胞を培養すること、または４）前述のいずれかの組み合わせにより非多能性細胞から多能性細胞を産生するための方法が本明細書で提供される。組み合わせが利用される場合、ステップは、順次または同時に実行することができる。特定の実施形態において、方法は、１）非多能性細胞を１つまたは複数のコレステロール枯渇剤と接触させることおよび非多能性幹細胞を１つまたは複数のＭＳＡＩＣ阻害剤と接触させること、２）非多能性細胞を１つまたは複数のコレステロール枯渇剤と接触させることおよび細胞を軟質マトリックス上で培養すること、ならびに３）非多能性細胞を１つまたは複数のＭＳＡＩＣ阻害剤と接触させることおよび細胞を軟質マトリックス上で培養することを含む。一実施形態において、細胞を軟質マトリックス上で培養する前に、コレステロール枯渇剤を、非多能性細胞と接触させる。特定の実施形態において、細胞を例えばチューブで懸濁させている間に細胞をコレステロール枯渇剤と接触させる。別の実施形態において、細胞を軟質マトリックス上で培養する前に、細胞をＭＳＡＩＣ阻害剤と接触させる。一実施形態において、細胞を軟質マトリックス上で培養するのと同時に、細胞をＭＳＡＩＣ阻害剤と接触させる。特定のコレステロール枯渇剤およびＭＳＡＩＣ阻害剤を、細胞との接触のそれらの濃度および時間とともに、以下に提供する。同様に、ｋＰａで測定されたマトリックスの柔軟性の度合いを、以下に提供する。
【0034】
種々の非多能性細胞は、開示された方法にしたがって誘導することができる。ヒト細胞を含む哺乳動物細胞が好ましい。細胞型には、ヒト線維芽細胞およびヒト末梢血単核細胞が含まれる。一実施形態において、非多能性細胞は、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２などの多能性誘導因子を発現するように遺伝的に修飾されていない細胞である。一実施形態において、多能性誘導因子を発現するように遺伝的に修飾されていない非多能性細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態において、多能性誘導因子を発現するように遺伝的に修飾されていない非多能性細胞は、ヒト細胞である。ある特定の実施形態において、１つまたは複数の遺伝子、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の発現は、非多能性哺乳動物細胞と比較して、多能性幹細胞で誘導される。
【0035】
種々の非多能性細胞は、開示された方法にしたがって誘導することができる。ヒト細胞を含む哺乳動物細胞が好ましい。細胞型には、ヒト線維芽細胞およびヒト末梢血単核細胞が含まれる。ある特定の実施形態において、１つまたは複数の遺伝子、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の発現は、非多能性哺乳動物細胞と比較して、多能性幹細胞で誘導される。
【0036】
ＭＳＡＩＣ阻害剤
本発明の一実施形態は、非多能性細胞をＭＳＡＩＣ阻害剤と接触させることにより非多能性（体）細胞で多能性を誘導する方法を提供する。ある特定の実施形態において、ＭＳＡＩＣ阻害剤は、体細胞で、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ－Ｍｙｃを含むが限定されないＰＩＦの転写を活性化する。ＭＳＡＩＣ阻害剤は既知であり、ガドリニウム、ルテニウムレッド、およびＧｓＭＴＸ４を含む。一実施形態において、ＭＳＡＩＣ阻害剤は、ピエゾ１伸展活性化チャネルの阻害剤である。ＭＳＡＩＣ阻害剤の好ましい実施形態は、ＧｓＭＴＸ４である。ＧｓＭＴＸ４は、クモ毒から精製された水溶性の３４ｍｅｒペプチドである。水溶性阻害剤は、ＰＩＦの発現が、インビトロ培養においてＤＭＳＯにより抑制されることが認められたため、ＤＭＳＯのみに溶解するものが好ましい［Ｃｚｙｓｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（２）（２０１５）］。理論に縛られることなく、ＧｓＭＴＸ４を用いるＭＳＡＩＣの阻害が、ポリスチレン細胞培養表面（本質的に無限の伸長力を保持する）上での微小環境を段階分けし、軟質細胞外マトリックスと接触している細胞の環境をシミュレートすると仮定される。
本発明の一実施形態は、非多能性細胞をＭＳＡＩＣ阻害剤と接触させることにより非多能性（体）細胞で多能性を誘導する方法を提供する。ある特定の実施形態において、ＭＳＡＩＣ阻害剤は、体細胞で、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ－Ｍｙｃを含むが限定されないＰＩＦの転写を活性化する。ＭＳＡＩＣ阻害剤は既知であり、ガドリニウム、ルテニウムレッド、およびＧｓＭＴＸ４を含む。一実施形態において、ＭＳＡＩＣ阻害剤は、ピエゾ１伸展活性化チャネルの阻害剤である。ＭＳＡＩＣ阻害剤の好ましい実施形態は、ＧｓＭＴＸ４である。ＧｓＭＴＸ４は、クモ毒から精製された水溶性の３４ｍｅｒペプチドである。水溶性阻害剤は、ＰＩＦの発現が、インビトロ培養においてＤＭＳＯにより抑制されることが認められたため、ＤＭＳＯのみに溶解するものが好ましい［Ｃｚｙｓｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０（２）（２０１５）］。理論に縛られることなく、ＧｓＭＴＸ４を用いるＭＳＡＩＣの阻害が、ポリスチレン細胞培養表面（本質的に無限の伸長力を保持する）上での微小環境を段階分けし、軟質細胞外マトリックスと接触している細胞の環境をシミュレートすると仮定される。
【0037】
ある特定の実施形態において、細胞は、ＭＳＡＩＣ阻害剤と、少なくとも１μＭ、約１０μＭから約１μＭ、１０μＭから１μＭ、約７μＭから約３μＭ、７μＭから３μＭ、約５μＭまたは５μＭの濃度で接触する。特定の実施形態において、ＭＳＡＩＣ阻害剤は、約１０μＭから約１μＭ、１０μＭから１μＭ、約７μＭから約３μＭ、７μＭから３μＭ、約５μＭまたは５μＭの濃度でのＧｓＭＴＸ４である。好ましい実施形態において、細胞は、ＧｓＭＴＸ４と５μＭの濃度で接触する。
【0038】
ある特定の実施形態において、細胞は、ＭＳＡＩＣ阻害剤と、少なくとも１２時間、約１２時間から約９６時間、１２時間から２０時間、約１６時間、１６時間、２４時間から９６時間、４８時間から９６時間、約７２時間、または７２時間接触する。一実施形態において、細胞は、ＧｓＭＴＸ４と、５μＭの濃度で１６時間接触する。別の実施形態において、細胞は、ＧｓＭＴＸ４と５μＭの濃度で７２時間接触する。
【0039】
ある特定の実施形態において、細胞は、ＭＳＡＩＣ阻害剤と約４℃から４２℃の温度、約２０℃から４０℃の温度、約３７℃の温度、３７℃の温度、約２５℃の温度、または２５℃の温度で接触する。
【0040】
コレステロール枯渇剤
本発明の一実施形態は、非多能性細胞をコレステロール枯渇剤と接触させることにより非多能性（体）細胞において多能性を誘導する方法を提供する。ある特定の実施形態において、コレステロール枯渇剤は、体細胞で、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ－Ｍｙｃを含むが限定されないＰＩＦの転写を活性化する。コレステロール枯渇剤は、メチル－β－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン（ＨＰαＣＤ）、およびヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）などのシクロデキストリンを含む。
本発明の一実施形態は、非多能性細胞をコレステロール枯渇剤と接触させることにより非多能性（体）細胞において多能性を誘導する方法を提供する。ある特定の実施形態において、コレステロール枯渇剤は、体細胞で、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｃ－Ｍｙｃを含むが限定されないＰＩＦの転写を活性化する。コレステロール枯渇剤は、メチル－β－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン（ＨＰαＣＤ）、およびヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）などのシクロデキストリンを含む。
【0041】
ＧｓＭＴＸ４などのＭＳＡＩＣ阻害剤を用いる処理は、体細胞を２つの種類に分割し、１番目は、ＰＩＦを１６時間以内に発現するが、２番目は、抑制の期間後に遅延した様式でＰＩＦを発現する。本発明の一実施形態は、コレステロール枯渇剤を用いて処理することにより、インビトロで２番目の種類の細胞を１番目の種類に変化させる方法を提供する。一実施形態において、コレステロール枯渇剤は、シクロデキストリンファミリーに属するものである。好ましい実施形態において、細胞コレステロールは、ＭβＣＤ（環状オリゴ糖）を用いる処理により枯渇される。細胞コレステロールの枯渇の後、ＧｓＭＴＸ４での処理は、２番目の種類の体細胞におけるＰＩ因子を１６時間以内に活性化する。したがって、また、２番目の種類の体細胞を、ＧｓＭＴＸ４での処理に続いてすでに多能性幹細胞様細胞にリプログラミング可能である１番目の種類の体細胞に変換する方法も、本明細書で提供される。本発明の追加の実施形態は、体細胞を多能性幹細胞様細胞にリプログラムするための細胞コレステロール枯渇剤およびＭＳＡＩＣ阻害剤の相乗利用を提供する。相乗効果を引き起こす好ましい実施形態は、ＭβＣＤおよびＧｓＭＴＸ４を使用する。
【0042】
ある特定の実施形態において、細胞は、コレステロール枯渇剤と、少なくとも１ｍＭ、約１０ｍＭから約１ｍＭ、１０ｍＭから１ｍＭ、約７ｍＭから約３ｍＭ、７ｍＭから３ｍＭ、約５ｍＭまたは５ｍＭの濃度で接触する。特定の実施形態において、コレステロール枯渇剤は、約１０ｍＭから約１ｍＭ、１０ｍＭから１ｍＭ、約７ｍＭから約３ｍＭ、７ｍＭから３ｍＭ、約５ｍＭまたは５ｍＭの濃度でのＭβＣＤである。好ましい実施形態において、細胞は、ＭβＣＤと５ｍＭの濃度で接触する。
【0043】
ある特定の実施形態において、細胞は、コレステロール枯渇剤と、少なくとも１２時間、約１２時間から約９６時間、１２時間から２０時間、約１６時間、１６時間、２４時間から９６時間、４８時間から９６時間、約７２時間、または７２時間接触する。一実施形態において、細胞は、ＭβＣＤと５ｍＭの濃度で２０分間接触する。
【0044】
ある特定の実施形態において、細胞は、コレステロール枯渇剤と、約４℃から４２℃の温度、約２０℃から４０℃の温度、約３７℃の温度、３７℃の温度、約２５℃の温度、または２５℃の温度で接触する。
【0045】
軟質細胞外マトリックス
本発明の別の実施形態は、細胞を軟質細胞外マトリックス上で培養することにより、体（非多能性）細胞に多能性を誘導する方法を提供する。一実施形態において、細胞におけるＰＩＦの発現は、軟質細胞外マトリックス上で培養することで誘導される。好ましい実施形態において、軟質細胞外マトリックスは、ヒドロゲルで製造される。本発明の実施形態は、ヒドロゲルが、ポリアクリルアミドゲルまたはシリコンゲルであることを示唆する。ポリアクリルアミドゲルの柔軟性は、水、アクリル、およびビス－アクリルアミドの比率を変更することにより調整可能である。上記に示すように、ＰＩＦの誘導は、特定の範囲の（パスカルにより示される）柔軟性に依存する。異なる種類の細胞は、本開示の教示により与えられる知識の利益を有する当業者により決定可能である、細胞外マトリックスの異なる柔軟性を必要とする可能性がある。
本発明の別の実施形態は、細胞を軟質細胞外マトリックス上で培養することにより、体（非多能性）細胞に多能性を誘導する方法を提供する。一実施形態において、細胞におけるＰＩＦの発現は、軟質細胞外マトリックス上で培養することで誘導される。好ましい実施形態において、軟質細胞外マトリックスは、ヒドロゲルで製造される。本発明の実施形態は、ヒドロゲルが、ポリアクリルアミドゲルまたはシリコンゲルであることを示唆する。ポリアクリルアミドゲルの柔軟性は、水、アクリル、およびビス－アクリルアミドの比率を変更することにより調整可能である。上記に示すように、ＰＩＦの誘導は、特定の範囲の（パスカルにより示される）柔軟性に依存する。異なる種類の細胞は、本開示の教示により与えられる知識の利益を有する当業者により決定可能である、細胞外マトリックスの異なる柔軟性を必要とする可能性がある。
【0046】
本発明の一実施形態は、軟質細胞外マトリックス上でのインビトロ培養において、ＰＩＦであるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの非スプライシングメッセージを発現する前駆体多能性幹細胞様細胞を維持する方法を提供した。
【0047】
好ましい実施形態において、本発明は、７．４ｋパスカル（ｋＰａ）、３．２ｋＰａおよび１．７ｋＰａでの柔軟性の例を提供し、３．２ｋＰａが好ましい実施形態である。異なる実施形態において、細胞外マトリックスは、約２０ｋＰａ以下、約１５ｋＰａ以下、約１０ｋＰａ以下、約７．４ｋＰａ以下、約３．２ｋＰａ以下、約１．７ｋＰａ以下、約１ｋＰａ以下、２０ｋＰａ以下、１５ｋＰａ以下、１０ｋＰａ以下、７．４ｋＰａ以下、３．２ｋＰａ以下、１．７ｋＰａ以下、１ｋＰａ以下、２０ｋＰａ、１５ｋＰａ、１０ｋＰａ、７．４ｋＰａ、３．２ｋＰａ、１．７ｋＰａ、２０ｋＰａ、１５ｋＰａ、１０ｋＰａ、７．４ｋＰａ、３．２ｋＰａ、１．７ｋＰａ、１ｋＰａのヤング弾性率を有する。
【0048】
分化した細胞
したがって、本発明の一実施形態は、１０％ノックアウト血清代替物、１×非必須アミノ酸、および５×１０－５Ｍの２－メルカプトエタノールを添加した培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２で体細胞の種類を分化させる方法を提供する。分化した細胞の例には、オイルレッドＯ陽性白色脂肪細胞および褐色脂肪細胞、神経細胞、アリザリン陽性骨芽細胞が含まれる。
したがって、本発明の一実施形態は、１０％ノックアウト血清代替物、１×非必須アミノ酸、および５×１０－５Ｍの２－メルカプトエタノールを添加した培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２で体細胞の種類を分化させる方法を提供する。分化した細胞の例には、オイルレッドＯ陽性白色脂肪細胞および褐色脂肪細胞、神経細胞、アリザリン陽性骨芽細胞が含まれる。
【0049】
例えば、褐色脂肪細胞は、同時に大量の多様な栄養素（例えば、グルコース、脂質、アミノ酸）を摂取して消費し、同化代謝および異化代謝の両方に同時に携わることができるので肥満症の治療に需要がある［Ｐａｙａｂ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ（２０２０）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１３６６－０２０－０６１６－５］。本明細書で提供される方法は、多能性細胞を、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞を含む種々の細胞型に分化する方法を含む。神経細胞の場合、神経細胞型は、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトを含むことができる。多能性細胞を誘導して異なる系統に分化させる方法は既知であり、本開示の技術にしたがって作成された多能性細胞を分化させるのに使用することができる。
【0050】
上記の本発明の実施形態は、複数の方法を組み合わせて機械感受性伸展活性化イオンチャネルを弱める方法を提供した（図２９）。例えば、胚性線維芽細胞をＭβＣＤで処理し、その後、ポリアクリルアミドで製造された軟質ヒドロゲル上で培養した。別の実施例において、胚性線維芽細胞をＧｓＭＴＸ４で処理し、その後、ポリアクリルアミドで製造された軟質ヒドロゲルで培養した。一実施形態において、細胞－コレステロール枯渇化合物および軟質細胞外マトリックスの併用は、より頻繁なリプログラミングおよび新規に分化された表現型を保持する細胞の出現の増加を誘導する。追加の実施形態において、体細胞リプログラミングキットが提供され、その構成要素は、コレステロール枯渇剤、例えばＭβＣＤ、および低弾性ヒドロゲル、例えばポリアクリルアミドをペトリ皿に含む。特定の実施形態において、ポリアクリルアミドゲルは、３．５ｃｍ径のペトリ皿にキャストした後、空気乾燥する。リプログラミング培地を用いる乾燥したポリアクリルアミドの再水和は、低弾性細胞培養マトリックス表面を調製する。固定量のコレステロール枯渇剤、例えばＭβＣＤ粉末を、培地を含む試験管中で溶解することにより、コレステロール枯渇溶液を調製する。一実施形態において、コレステロール枯渇剤と接触した体細胞は、コレステロール含量を低下させ、低弾性ポリアクリルアミドゲルで培養して幹細胞様細胞を生成する。
【0051】
また、開示された方法にしたがって産生された多能性細胞、開示された方法にしたがって産生された分化した細胞を含む医薬組成物、およびその方法で使用した試薬、例えば組織培養培地および細胞培養容器も提供する。細胞培養容器は、ディッシュ、ボトル、プレートおよびマルチウェルプレートを含む。
【0052】
全体として、本発明の実施形態は、体細胞をＰＳＣ様細胞にリプログラムし、その後、それらを再生医療に有用な種々の体細胞に細分化させる新規方法および必要なツールを提供した。本発明が、本明細書に提示される実施形態のいずれかの１つまたは複数の任意の態様、または１つもしくは複数の態様の任意の組み合わせを包含することが企図される。
【0053】
８． 実施形態
明示的に企図される実施形態には、以下が含まれる：
１．非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導する方法であって、非多能性哺乳動物細胞を以下：
ａ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｂ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｃ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させることを含む、方法。
２．非多能性哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されていない、実施形態１の方法。
３．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４のＬエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４のＤエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４の配列と少なくとも９０％同一である配列を有するペプチド、またはそれらの混合物からなる群より選択される、実施形態１の方法。
４．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４である、実施形態１の方法。
５．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約１０μＭから約１μＭの濃度である、実施形態３の方法。
６．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、１０μＭから１μＭの濃度である、実施形態３の方法。
７．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約７μＭから約３μＭの濃度である、実施形態３の方法。
８．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、７μＭから３μＭの濃度である、実施形態３の方法。
９．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度である、実施形態３の方法。
１０．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、５μＭの濃度である、実施形態３の方法。
１１．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約１２時間から約９６時間接触する、実施形態３の方法。
１２．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と１２時間から２０時間接触する、実施形態３の方法。
１３．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約１６時間接触する、実施形態３の方法。
１４．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と１６時間接触する、実施形態３の方法。
１５．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と２４時間から９６時間接触する、実施形態３の方法。
１６．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と４８時間から９６時間接触する、実施形態３の方法。
１７．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約７２時間接触する、実施形態３の方法。
１８．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と７２時間接触する、実施形態３の方法。
１９．細胞コレステロール低減剤が、シクロデキストリンである、実施形態１の方法。
２０．シクロデキストリンが、メチル－β－シクロデキストリンである、実施形態１９の方法。
２１．シクロデキストリンが、約１０ｍＭから約１ｍＭの濃度である、実施形態２０の方法。
２２．シクロデキストリンが、１０ｍＭから１ｍＭの濃度である、実施形態２０の方法。
２３．シクロデキストリンが、約７ｍＭから約３ｍＭの濃度である、実施形態２０の方法。
２４．シクロデキストリンが、７ｍＭから３ｍＭの濃度である、実施形態２０の方法。
２５．シクロデキストリンが、約５ｍＭの濃度である、実施形態２０の方法。
２６．シクロデキストリンが、５ｍＭの濃度である、実施形態２０の方法。
２７．細胞が、シクロデキストリンと約１５分間から約６０分間接触する、実施形態２０の方法。
２８．細胞が、シクロデキストリンと１５分間から６０分間接触する、実施形態２０の方法。
２９．細胞が、シクロデキストリンと約２０分間から約４０分間接触する、実施形態２０の方法。
３０．細胞が、シクロデキストリンと２０分間から４０分間接触する、実施形態２０の方法。
３１．細胞が、シクロデキストリンと約１５分間から約３０分間接触する、実施形態２０の方法。
３２．細胞が、シクロデキストリンと２０分間から３０分間接触する、実施形態２０の方法。
３３．細胞が、シクロデキストリンと約２０分間接触する、実施形態２０の方法。
３４．細胞が、シクロデキストリンと２０分間接触する、実施形態２０の方法。
３５．細胞が、シクロデキストリンと約３０分間接触する、実施形態２０の方法。
３６．細胞が、シクロデキストリンと３０分間接触する、実施形態２０の方法。
３７．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１の方法。
３８．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１の方法。
３９．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１の方法。
４０．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１の方法。
４１．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１の方法。
４２．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１の方法。
４３．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態３の方法。
４４．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態３の方法。
４５．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態３の方法。
４６．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態３の方法。
４７．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態３の方法。
４８．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態３の方法。
４９．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１９の方法。
５０．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１９の方法。
５１．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１９の方法。
５２．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１９の方法。
５３．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１９の方法。
５４．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１９の方法。
５５．細胞外マトリックスが、ヒドロゲルである、実施形態１の方法。
５６．細胞外マトリックスが、ポリアクリルアミドゲルである、実施形態５５の方法。
５７．細胞外マトリックスが、シリコンゲルである、実施形態１の方法。
５８．人工多能性幹細胞が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される種類型に分化することができる、実施形態１の方法。
５９．多能性幹細胞が、神経細胞に分化することができ、神経細胞型が、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される、実施形態５８の方法。
６０．非多能性哺乳動物細胞が、線維芽細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択されるヒト細胞である、実施形態１の方法。
６１．遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の発現が、非多能性哺乳動物細胞と比較して人工多能性幹細胞で誘導される、実施形態１の方法。
６２．非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導する方法であって、非多能性哺乳動物細胞を以下：
ａ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｂ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｃ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させることを含み；
非多能性哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されておらず；
存在する場合、１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度でのＧｓＭＴＸ４を含み；
存在する場合、１つまたは複数のコレステロール低減剤が、約５ｍＭの濃度でのメチル－β－シクロデキストリンであり；および
存在する場合、軟質細胞外マトリックスが、約７．５ｋＰａのヤング弾性率を有する
方法を含む、実施形態。
６３．非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導する方法であって、非多能性哺乳動物細胞を以下：
ａ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｂ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｃ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させることを含み；
非多能性哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されておらず；
存在する場合、１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度でのＧｓＭＴＸ４を含み、非多能性哺乳動物脂肪が、ＧｓＭＴＸ４と約１６時間接触し；
存在する場合、１つまたは複数のコレステロール低減剤が、約５ｍＭの濃度でのメチル－β－シクロデキストリンであり、非多能性哺乳動物細胞が、メチル－β－シクロデキストリンと約２０分間接触し；および
存在する場合、軟質細胞外マトリックスが、約７．５ｋＰａのヤング弾性率を有する
方法を含む、実施形態。
６４．人工多能性幹細胞が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される細胞型に分化することができる、実施形態６２の方法。
６５．多能性幹細胞が、神経細胞に分化することができ、神経細胞型が、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される、実施形態６２の方法。
６６．非多能性哺乳動物細胞が、線維芽細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択されるヒト細胞である、実施形態６２の方法。
６７．遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の発現が、非多能性哺乳動物細胞と比較して人工多能性幹細胞で誘導される、実施形態６２の方法。
６８．人工多能性幹細胞が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される細胞型に分化することができる、実施形態６３の方法。
６９．多能性幹細胞が、神経細胞に分化することができ、神経細胞型は、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される、実施形態６３の方法。
７０．非多能性哺乳動物細胞が、線維芽細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択されるヒト細胞である、実施形態６３の方法。
７１．遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の発現が、非多能性哺乳動物細胞と比較して人工多能性幹細胞で誘導される、実施形態６３の方法。
７２．２番目の非多能性細胞型を有する細胞の単離集団を含む医薬組成物であって、細胞が、１番目の非多能性細胞型から動物細胞を変換する組成物により得られ、組成物が、
ａ．非多能性哺乳動物細胞を、以下：
ｉ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｉｉ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｉｉｉ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させること、
および
ｂ．ステップ（ａ）からの細胞の２番目の非多能性細胞型への分化を誘導すること
により１番目の細胞型の非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導することを含む、医薬組成物。
７３．１番目の非多能性哺乳動物細胞も２番目の非多能性哺乳動物細胞も、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されていない、実施形態７２の組成物。
７４．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４のＬエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４のＤエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４の配列と少なくとも９０％同一である配列を有するペプチド、またはそれらの混合物からなる群より選択される、実施形態７２の組成物。
７５．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４である、実施形態７２の組成物。
７６．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約１０μＭから約１μＭの濃度である、実施形態７４の組成物。
７７．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、１０μＭから１μＭの濃度である、実施形態７４の組成物。
７８．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約７μＭから約３μＭの濃度である、実施形態７４の組成物。
７９．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、７μＭから３μＭの濃度である、実施形態７４の組成物。
８０．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度である、実施形態７４の組成物。
８１．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、５μＭの濃度である、実施形態７４の組成物。
８２．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約１２時間から約９６時間接触する、請求項７４に記載の実施形態。
８３．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約１２時間から約２０時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
８４．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約１６時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
８５．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と１６時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
８６．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と２４時間から９６時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
８７．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と４８時間から９６時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
８８．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約７２時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
８９．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と７２時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
９０．細胞コレステロール低減剤が、シクロデキストリンである、実施形態７２の組成物。
９１．シクロデキストリンが、メチル－β－シクロデキストリンである、実施形態９０の組成物。
９２．シクロデキストリンが、約１０ｍＭから約１ｍＭの濃度である、実施形態９１の組成物。
９３．シクロデキストリンが、１０ｍＭから１ｍＭの濃度である、実施形態９１の組成物。
９４．シクロデキストリンが、約７ｍＭから約３ｍＭの濃度である、実施形態９１の組成物。
９５．シクロデキストリンが、７ｍＭから３ｍＭの濃度である、実施形態９１の組成物。
９６．シクロデキストリンが、約５ｍＭの濃度である、実施形態９１の組成物。
９７．シクロデキストリンが、５ｍＭの濃度である、実施形態９１の組成物。
９８．細胞が、シクロデキストリンと約１５分間から６０分間接触する、実施形態９１の組成物。
９９．細胞が、シクロデキストリンと１５分間から６０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１００．細胞が、シクロデキストリンと約２０分間から約４０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０１．細胞が、シクロデキストリンと２０分間から４０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０２．細胞が、シクロデキストリンと約１５分間から約３０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０３．細胞が、シクロデキストリンと２０分間から３０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０４．細胞が、シクロデキストリンと約２０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０５．細胞が、シクロデキストリンと２０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０６．細胞が、シクロデキストリンと約３０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０７．細胞が、シクロデキストリンと３０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０８．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７２の組成物。
１０９．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７２の組成物。
１１０．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７２の組成物。
１１１．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７２の組成物。
１１２．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７２の組成物。
１１３．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７２の組成物。
１１４．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７４の組成物。
１１５．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７４の組成物。
１１６．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７４の組成物。
１１７．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７４の組成物。
１１８．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７４の組成物。
１１９．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７４の組成物。
１２０．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態９０の組成物。
１２１．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態９０の組成物。
１２２．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態９０の組成物。
１２３．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態９０の組成物。
１２４．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態９０の組成物。
１２５．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態９０の組成物。
１２６．細胞外マトリックスが、ヒドロゲルである、実施形態７２の組成物。
１２７．細胞外マトリックスが、ポリアクリルアミドゲルである、実施形態１２６の組成物。
１２８．細胞外マトリックスが、シリコンゲルである、実施形態７２の組成物。
１２９．２番目の非多能性細胞型が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される、実施形態７２の組成物。
１３０．２番目の非多能性細胞型が、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される神経細胞型である、実施形態１２９の組成物。
１３１．１番目の非多能性細胞型が、線維芽細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択されるヒト細胞である、実施形態７２の組成物。
１３２．遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の発現が、１番目の非多能性細胞型で誘導される、実施形態７２の組成物。
１３３．２番目の非多能性細胞型を有する細胞の単離集団を含む医薬組成物であって、細胞が、１番目の非多能性細胞型から動物細胞を変換する組成物により得られ、組成物が、
ａ．非多能性哺乳動物細胞を、以下：
ｉ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｉｉ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｉｉｉ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させること、
および
ｂ．ステップ（ａ）からの細胞の２番目の非多能性細胞型への分化を誘導すること
により１番目の細胞型の非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導することを含み；
非多能性哺乳動物細胞は、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されておらず；
存在する場合、１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度でのＧｓＭＴＸ４を含み；
存在する場合、１つまたは複数のコレステロール低減剤が、約５ｍＭの濃度でのメチル－β－シクロデキストリンであり；および
存在する場合、軟質細胞外マトリックスが、約７．５ｋＰａのヤング弾性率を有する
医薬組成物。
１３４．２番目の非多能性細胞型が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される細胞型である、実施形態１３３の組成物。
１３５．２番目の非多能性細胞型が、神経細胞型であり、神経細胞型が、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される、実施形態１３３の組成物。
１３６．１番目の非多能性細胞型が、線維芽細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択されるヒト細胞である、実施形態１３３の組成物。
１３７．遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の発現が、１番目の非多能性細胞型に誘導される、実施形態１３３の組成物。
１３８．２番目の非多能性細胞型を有する細胞の単離集団を含む医薬組成物であって、細胞が、１番目の非多能性細胞型から動物細胞を変換する組成物により得られ、組成物が、
ａ．非多能性哺乳動物細胞を、以下：
ｉ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｉｉ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｉｉｉ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させること、
および
ｂ．ステップ（ａ）からの細胞の２番目の非多能性細胞型への分化を誘導すること
により１番目の細胞型の非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導することを含み；
非多能性哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されておらず；
存在する場合、１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度でのＧｓＭＴＸ４を含み、非多能性哺乳動物脂肪が、ＧｓＭＴＸ４と約１６時間接触し；
存在する場合、１つまたは複数のコレステロール低減剤が、約５ｍＭの濃度でのメチル－β－シクロデキストリンであり、非多能性哺乳動物細胞が、メチル－β－シクロデキストリンと約２０分間接触し；および
存在する場合、軟質細胞外マトリックスが、約７．５ｋＰａのヤング弾性率を有する、医薬組成物。
１３９．２番目の非多能性細胞型が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される細胞型である、実施形態１３８の組成物。
１４０．２番目の非多能性細胞型が、神経細胞型であり、神経細胞型が、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される、実施形態１３８の組成物。
１４１．１番目の非多能性細胞型が、線維芽細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択されるヒト細胞である、実施形態１３８の組成物。
１４２．遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の発現が、１番目の非多能性細胞型に誘導される、実施形態１３８の組成物。
１４３．ａ．細胞培養培地、
ｂ．以下：
ｉ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｉｉ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤
の１つまたは両方で処理された１つまたは複数の哺乳動物細胞；および
ｃ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
を含む細胞培養容器。
１４４．哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されていない、実施形態１４３の容器。
１４５．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４のＬエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４のＤエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４の配列と少なくとも９０％同一である配列を有するペプチド、またはそれらの混合物からなる群より選択される、実施形態１４３の容器。
１４６．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４である、実施形態１４３の容器。
１４７．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約１０μＭから約１μＭの濃度である、実施形態１４５の容器。
１４８．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、１０μＭから１μＭの濃度である、実施形態１４５の容器。
１４９．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約７μＭから約３μＭの濃度である、実施形態１４５の容器。
１５０．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、７μＭから３μＭの濃度である、実施形態１４５の容器。
１５１．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度である、実施形態１４５の容器。
１５２．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、５μＭの濃度である、実施形態１４５の容器。
１５３．細胞コレステロール低減剤が、シクロデキストリンである、実施形態１４３の容器。
１５４．シクロデキストリンが、メチル－β－シクロデキストリンである、実施形態１５３の容器。
１５５．シクロデキストリンが、約１０ｍＭから約１ｍＭの濃度である、実施形態１５４の容器。
１５６．シクロデキストリンが、１０ｍＭから１ｍＭの濃度である、実施形態１５４の容器。
１５７．シクロデキストリンが、約７ｍＭから約３ｍＭの濃度である、実施形態１５４の容器。
１５８．シクロデキストリンが、７ｍＭから３ｍＭの濃度である、実施形態１５４の容器。
１５９．シクロデキストリンが、約５ｍＭの濃度である、実施形態１５４の容器。
１６０．シクロデキストリンが、５ｍＭの濃度である、実施形態１５４の容器。
１６１．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４３の容器。
１６２．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４３の容器。
１６３．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４３の容器。
１６４．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４３の容器。
１６５．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４３の容器。
１６６．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４３の容器。
１６７．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４５の容器。
１６８．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４５の容器。
１６９．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４５の容器。
１７０．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４５の容器。
１７１．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４５の容器。
１７２．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４５の容器。
１７３．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１５３の容器。
１７４．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１５３の容器。
１７５．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１５３の容器。
１７６．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１５３の容器。
１７７．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１５３の容器。
１７８．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１５３の容器。
１７９．細胞外マトリックスが、ヒドロゲルである、実施形態１４３の容器。
１８０．細胞外マトリックスが、ポリアクリルアミドゲルである、実施形態１７９の容器。
１８１．細胞外マトリックスが、シリコンゲルである、実施形態１４３の容器。
１８２．ａ．細胞培養培地、
ｂ．以下：
ｉ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｉｉ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤
の１つまたは両方で処理された１つまたは複数の哺乳動物細胞；および
ｃ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
を含み、
非多能性哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されておらず；
存在する場合、１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度でのＧｓＭＴＸ４を含み；
存在する場合、１つまたは複数のコレステロール低減剤が、約５ｍＭの濃度でのメチル－β－シクロデキストリンであり；および
存在する場合、軟質細胞外マトリックスが、約７．５ｋＰａのヤング弾性率を有する、細胞培養容器。
１８３．体細胞における内因性多能性誘導転写因子の発現を増加させる方法であって、細胞膜受容体のシグナル伝達を修飾することを含む、方法。
１８４．体細胞が、線維芽細胞である、実施形態１８３の方法。
１８５．多能性誘導転写因子が、Ｏｃｔ－４、Ｓｏｘ－２、Ｎａｎｏｇおよびｃ－Ｍｙｃから選択される、実施形態１８３の方法。
１８６．細胞膜受容体が、機械感受性および／または伸展活性化イオンチャネルである、実施形態１８３の方法。
１８７．細胞膜受容体シグナル伝達が、細胞を機械感受性および／または伸展活性化イオンチャネル特異的阻害剤と接触させることにより修飾される、実施形態１８３の方法。
１８８．阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４である、実施形態１８７の方法。
１８９．細胞膜受容体シグナル伝達が、少なくとも１つの細胞脂質の枯渇により修飾される、実施形態１８３の方法。
１９０．少なくとも１つの細胞脂質が、コレステロールである、実施形態１８９の方法。
１９１．細胞外脂質の枯渇が、細胞をシクロデキストリンファミリーの分子と接触させることにより生じる、実施形態１８９の方法。
１９２．分子が、メチル－ベータ－シクロデキストリンである、実施形態１９１の方法。
１９３．細胞膜受容体シグナル伝達が、細胞を低弾性細胞外マトリックスで培養することにより修飾される、実施形態１８３の方法。
１９４．マトリックスが、ポリアクリルアミドゲルである、実施形態１９３の方法。
１９５．ポリアクリルアミドゲルの弾性が、７．４ｋパスカル未満である、実施形態１９４の方法。
１９６．細胞膜受容体シグナル伝達が、
ａ．細胞を機械感受性および／または伸展活性化イオンチャネル特異的阻害剤と接触させること；
ｂ．少なくとも１つの細胞脂質の枯渇；ならびに
ｃ．細胞を低弾性細胞外マトリックスで培養すること
により修飾される、実施形態１８３の方法。
１９７．実施形態１８３の方法により産生される細胞であって、内因性多能性転写因子を発現する、細胞。
１９８．実施形態１８３の方法により産生される細胞であって、多能性誘導転写因子を発現する、細胞。
１９９．分化した細胞であって、実施形態１９８の細胞に由来する、細胞。
２００．実施形態１８３の方法を実行するためのキット。
２０１．コレステロール枯渇化合物および低弾性細胞外マトリックスを含む、実施形態２００のキット。
２０２．メチル－β－シクロデキストリンおよび乾燥ポリアクリルアミドゲルを含む、実施形態２００のキット。
明示的に企図される実施形態には、以下が含まれる：
１．非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導する方法であって、非多能性哺乳動物細胞を以下：
ａ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｂ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｃ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させることを含む、方法。
２．非多能性哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されていない、実施形態１の方法。
３．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４のＬエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４のＤエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４の配列と少なくとも９０％同一である配列を有するペプチド、またはそれらの混合物からなる群より選択される、実施形態１の方法。
４．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４である、実施形態１の方法。
５．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約１０μＭから約１μＭの濃度である、実施形態３の方法。
６．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、１０μＭから１μＭの濃度である、実施形態３の方法。
７．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約７μＭから約３μＭの濃度である、実施形態３の方法。
８．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、７μＭから３μＭの濃度である、実施形態３の方法。
９．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度である、実施形態３の方法。
１０．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、５μＭの濃度である、実施形態３の方法。
１１．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約１２時間から約９６時間接触する、実施形態３の方法。
１２．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と１２時間から２０時間接触する、実施形態３の方法。
１３．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約１６時間接触する、実施形態３の方法。
１４．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と１６時間接触する、実施形態３の方法。
１５．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と２４時間から９６時間接触する、実施形態３の方法。
１６．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と４８時間から９６時間接触する、実施形態３の方法。
１７．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約７２時間接触する、実施形態３の方法。
１８．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と７２時間接触する、実施形態３の方法。
１９．細胞コレステロール低減剤が、シクロデキストリンである、実施形態１の方法。
２０．シクロデキストリンが、メチル－β－シクロデキストリンである、実施形態１９の方法。
２１．シクロデキストリンが、約１０ｍＭから約１ｍＭの濃度である、実施形態２０の方法。
２２．シクロデキストリンが、１０ｍＭから１ｍＭの濃度である、実施形態２０の方法。
２３．シクロデキストリンが、約７ｍＭから約３ｍＭの濃度である、実施形態２０の方法。
２４．シクロデキストリンが、７ｍＭから３ｍＭの濃度である、実施形態２０の方法。
２５．シクロデキストリンが、約５ｍＭの濃度である、実施形態２０の方法。
２６．シクロデキストリンが、５ｍＭの濃度である、実施形態２０の方法。
２７．細胞が、シクロデキストリンと約１５分間から約６０分間接触する、実施形態２０の方法。
２８．細胞が、シクロデキストリンと１５分間から６０分間接触する、実施形態２０の方法。
２９．細胞が、シクロデキストリンと約２０分間から約４０分間接触する、実施形態２０の方法。
３０．細胞が、シクロデキストリンと２０分間から４０分間接触する、実施形態２０の方法。
３１．細胞が、シクロデキストリンと約１５分間から約３０分間接触する、実施形態２０の方法。
３２．細胞が、シクロデキストリンと２０分間から３０分間接触する、実施形態２０の方法。
３３．細胞が、シクロデキストリンと約２０分間接触する、実施形態２０の方法。
３４．細胞が、シクロデキストリンと２０分間接触する、実施形態２０の方法。
３５．細胞が、シクロデキストリンと約３０分間接触する、実施形態２０の方法。
３６．細胞が、シクロデキストリンと３０分間接触する、実施形態２０の方法。
３７．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１の方法。
３８．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１の方法。
３９．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１の方法。
４０．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１の方法。
４１．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１の方法。
４２．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１の方法。
４３．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態３の方法。
４４．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態３の方法。
４５．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態３の方法。
４６．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態３の方法。
４７．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態３の方法。
４８．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態３の方法。
４９．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１９の方法。
５０．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１９の方法。
５１．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１９の方法。
５２．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１９の方法。
５３．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１９の方法。
５４．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１９の方法。
５５．細胞外マトリックスが、ヒドロゲルである、実施形態１の方法。
５６．細胞外マトリックスが、ポリアクリルアミドゲルである、実施形態５５の方法。
５７．細胞外マトリックスが、シリコンゲルである、実施形態１の方法。
５８．人工多能性幹細胞が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される種類型に分化することができる、実施形態１の方法。
５９．多能性幹細胞が、神経細胞に分化することができ、神経細胞型が、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される、実施形態５８の方法。
６０．非多能性哺乳動物細胞が、線維芽細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択されるヒト細胞である、実施形態１の方法。
６１．遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の発現が、非多能性哺乳動物細胞と比較して人工多能性幹細胞で誘導される、実施形態１の方法。
６２．非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導する方法であって、非多能性哺乳動物細胞を以下：
ａ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｂ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｃ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させることを含み；
非多能性哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されておらず；
存在する場合、１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度でのＧｓＭＴＸ４を含み；
存在する場合、１つまたは複数のコレステロール低減剤が、約５ｍＭの濃度でのメチル－β－シクロデキストリンであり；および
存在する場合、軟質細胞外マトリックスが、約７．５ｋＰａのヤング弾性率を有する
方法を含む、実施形態。
６３．非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導する方法であって、非多能性哺乳動物細胞を以下：
ａ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｂ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｃ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させることを含み；
非多能性哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されておらず；
存在する場合、１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度でのＧｓＭＴＸ４を含み、非多能性哺乳動物脂肪が、ＧｓＭＴＸ４と約１６時間接触し；
存在する場合、１つまたは複数のコレステロール低減剤が、約５ｍＭの濃度でのメチル－β－シクロデキストリンであり、非多能性哺乳動物細胞が、メチル－β－シクロデキストリンと約２０分間接触し；および
存在する場合、軟質細胞外マトリックスが、約７．５ｋＰａのヤング弾性率を有する
方法を含む、実施形態。
６４．人工多能性幹細胞が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される細胞型に分化することができる、実施形態６２の方法。
６５．多能性幹細胞が、神経細胞に分化することができ、神経細胞型が、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される、実施形態６２の方法。
６６．非多能性哺乳動物細胞が、線維芽細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択されるヒト細胞である、実施形態６２の方法。
６７．遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の発現が、非多能性哺乳動物細胞と比較して人工多能性幹細胞で誘導される、実施形態６２の方法。
６８．人工多能性幹細胞が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される細胞型に分化することができる、実施形態６３の方法。
６９．多能性幹細胞が、神経細胞に分化することができ、神経細胞型は、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される、実施形態６３の方法。
７０．非多能性哺乳動物細胞が、線維芽細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択されるヒト細胞である、実施形態６３の方法。
７１．遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の発現が、非多能性哺乳動物細胞と比較して人工多能性幹細胞で誘導される、実施形態６３の方法。
７２．２番目の非多能性細胞型を有する細胞の単離集団を含む医薬組成物であって、細胞が、１番目の非多能性細胞型から動物細胞を変換する組成物により得られ、組成物が、
ａ．非多能性哺乳動物細胞を、以下：
ｉ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｉｉ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｉｉｉ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させること、
および
ｂ．ステップ（ａ）からの細胞の２番目の非多能性細胞型への分化を誘導すること
により１番目の細胞型の非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導することを含む、医薬組成物。
７３．１番目の非多能性哺乳動物細胞も２番目の非多能性哺乳動物細胞も、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されていない、実施形態７２の組成物。
７４．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４のＬエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４のＤエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４の配列と少なくとも９０％同一である配列を有するペプチド、またはそれらの混合物からなる群より選択される、実施形態７２の組成物。
７５．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４である、実施形態７２の組成物。
７６．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約１０μＭから約１μＭの濃度である、実施形態７４の組成物。
７７．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、１０μＭから１μＭの濃度である、実施形態７４の組成物。
７８．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約７μＭから約３μＭの濃度である、実施形態７４の組成物。
７９．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、７μＭから３μＭの濃度である、実施形態７４の組成物。
８０．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度である、実施形態７４の組成物。
８１．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、５μＭの濃度である、実施形態７４の組成物。
８２．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約１２時間から約９６時間接触する、請求項７４に記載の実施形態。
８３．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約１２時間から約２０時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
８４．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約１６時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
８５．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と１６時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
８６．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と２４時間から９６時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
８７．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と４８時間から９６時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
８８．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と約７２時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
８９．細胞が、機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤と７２時間接触する、実施形態７４に記載の組成物。
９０．細胞コレステロール低減剤が、シクロデキストリンである、実施形態７２の組成物。
９１．シクロデキストリンが、メチル－β－シクロデキストリンである、実施形態９０の組成物。
９２．シクロデキストリンが、約１０ｍＭから約１ｍＭの濃度である、実施形態９１の組成物。
９３．シクロデキストリンが、１０ｍＭから１ｍＭの濃度である、実施形態９１の組成物。
９４．シクロデキストリンが、約７ｍＭから約３ｍＭの濃度である、実施形態９１の組成物。
９５．シクロデキストリンが、７ｍＭから３ｍＭの濃度である、実施形態９１の組成物。
９６．シクロデキストリンが、約５ｍＭの濃度である、実施形態９１の組成物。
９７．シクロデキストリンが、５ｍＭの濃度である、実施形態９１の組成物。
９８．細胞が、シクロデキストリンと約１５分間から６０分間接触する、実施形態９１の組成物。
９９．細胞が、シクロデキストリンと１５分間から６０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１００．細胞が、シクロデキストリンと約２０分間から約４０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０１．細胞が、シクロデキストリンと２０分間から４０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０２．細胞が、シクロデキストリンと約１５分間から約３０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０３．細胞が、シクロデキストリンと２０分間から３０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０４．細胞が、シクロデキストリンと約２０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０５．細胞が、シクロデキストリンと２０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０６．細胞が、シクロデキストリンと約３０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０７．細胞が、シクロデキストリンと３０分間接触する、実施形態９１の組成物。
１０８．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７２の組成物。
１０９．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７２の組成物。
１１０．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７２の組成物。
１１１．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７２の組成物。
１１２．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７２の組成物。
１１３．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７２の組成物。
１１４．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７４の組成物。
１１５．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７４の組成物。
１１６．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７４の組成物。
１１７．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７４の組成物。
１１８．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７４の組成物。
１１９．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態７４の組成物。
１２０．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態９０の組成物。
１２１．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態９０の組成物。
１２２．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態９０の組成物。
１２３．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態９０の組成物。
１２４．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態９０の組成物。
１２５．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態９０の組成物。
１２６．細胞外マトリックスが、ヒドロゲルである、実施形態７２の組成物。
１２７．細胞外マトリックスが、ポリアクリルアミドゲルである、実施形態１２６の組成物。
１２８．細胞外マトリックスが、シリコンゲルである、実施形態７２の組成物。
１２９．２番目の非多能性細胞型が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される、実施形態７２の組成物。
１３０．２番目の非多能性細胞型が、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される神経細胞型である、実施形態１２９の組成物。
１３１．１番目の非多能性細胞型が、線維芽細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択されるヒト細胞である、実施形態７２の組成物。
１３２．遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の発現が、１番目の非多能性細胞型で誘導される、実施形態７２の組成物。
１３３．２番目の非多能性細胞型を有する細胞の単離集団を含む医薬組成物であって、細胞が、１番目の非多能性細胞型から動物細胞を変換する組成物により得られ、組成物が、
ａ．非多能性哺乳動物細胞を、以下：
ｉ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｉｉ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｉｉｉ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させること、
および
ｂ．ステップ（ａ）からの細胞の２番目の非多能性細胞型への分化を誘導すること
により１番目の細胞型の非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導することを含み；
非多能性哺乳動物細胞は、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されておらず；
存在する場合、１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度でのＧｓＭＴＸ４を含み；
存在する場合、１つまたは複数のコレステロール低減剤が、約５ｍＭの濃度でのメチル－β－シクロデキストリンであり；および
存在する場合、軟質細胞外マトリックスが、約７．５ｋＰａのヤング弾性率を有する
医薬組成物。
１３４．２番目の非多能性細胞型が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される細胞型である、実施形態１３３の組成物。
１３５．２番目の非多能性細胞型が、神経細胞型であり、神経細胞型が、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される、実施形態１３３の組成物。
１３６．１番目の非多能性細胞型が、線維芽細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択されるヒト細胞である、実施形態１３３の組成物。
１３７．遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の発現が、１番目の非多能性細胞型に誘導される、実施形態１３３の組成物。
１３８．２番目の非多能性細胞型を有する細胞の単離集団を含む医薬組成物であって、細胞が、１番目の非多能性細胞型から動物細胞を変換する組成物により得られ、組成物が、
ａ．非多能性哺乳動物細胞を、以下：
ｉ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｉｉ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤；
ｉｉｉ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
の２つまたはそれより多くと接触させること、
および
ｂ．ステップ（ａ）からの細胞の２番目の非多能性細胞型への分化を誘導すること
により１番目の細胞型の非多能性哺乳動物細胞を人工多能性幹細胞に誘導することを含み；
非多能性哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されておらず；
存在する場合、１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度でのＧｓＭＴＸ４を含み、非多能性哺乳動物脂肪が、ＧｓＭＴＸ４と約１６時間接触し；
存在する場合、１つまたは複数のコレステロール低減剤が、約５ｍＭの濃度でのメチル－β－シクロデキストリンであり、非多能性哺乳動物細胞が、メチル－β－シクロデキストリンと約２０分間接触し；および
存在する場合、軟質細胞外マトリックスが、約７．５ｋＰａのヤング弾性率を有する、医薬組成物。
１３９．２番目の非多能性細胞型が、脂肪細胞、神経細胞、骨細胞、内皮細胞、赤血球、樹状細胞、血小板、リンパ球、および筋芽細胞からなる群より選択される細胞型である、実施形態１３８の組成物。
１４０．２番目の非多能性細胞型が、神経細胞型であり、神経細胞型が、皮質ニューロン、星状細胞、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される、実施形態１３８の組成物。
１４１．１番目の非多能性細胞型が、線維芽細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択されるヒト細胞である、実施形態１３８の組成物。
１４２．遺伝子Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の１つまたは複数の発現が、１番目の非多能性細胞型に誘導される、実施形態１３８の組成物。
１４３．ａ．細胞培養培地、
ｂ．以下：
ｉ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｉｉ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤
の１つまたは両方で処理された１つまたは複数の哺乳動物細胞；および
ｃ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
を含む細胞培養容器。
１４４．哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されていない、実施形態１４３の容器。
１４５．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４のＬエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４のＤエナンチオマー、ＧｓＭＴＸ４の配列と少なくとも９０％同一である配列を有するペプチド、またはそれらの混合物からなる群より選択される、実施形態１４３の容器。
１４６．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４である、実施形態１４３の容器。
１４７．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約１０μＭから約１μＭの濃度である、実施形態１４５の容器。
１４８．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、１０μＭから１μＭの濃度である、実施形態１４５の容器。
１４９．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約７μＭから約３μＭの濃度である、実施形態１４５の容器。
１５０．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、７μＭから３μＭの濃度である、実施形態１４５の容器。
１５１．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度である、実施形態１４５の容器。
１５２．機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、５μＭの濃度である、実施形態１４５の容器。
１５３．細胞コレステロール低減剤が、シクロデキストリンである、実施形態１４３の容器。
１５４．シクロデキストリンが、メチル－β－シクロデキストリンである、実施形態１５３の容器。
１５５．シクロデキストリンが、約１０ｍＭから約１ｍＭの濃度である、実施形態１５４の容器。
１５６．シクロデキストリンが、１０ｍＭから１ｍＭの濃度である、実施形態１５４の容器。
１５７．シクロデキストリンが、約７ｍＭから約３ｍＭの濃度である、実施形態１５４の容器。
１５８．シクロデキストリンが、７ｍＭから３ｍＭの濃度である、実施形態１５４の容器。
１５９．シクロデキストリンが、約５ｍＭの濃度である、実施形態１５４の容器。
１６０．シクロデキストリンが、５ｍＭの濃度である、実施形態１５４の容器。
１６１．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４３の容器。
１６２．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４３の容器。
１６３．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４３の容器。
１６４．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４３の容器。
１６５．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４３の容器。
１６６．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４３の容器。
１６７．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４５の容器。
１６８．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４５の容器。
１６９．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４５の容器。
１７０．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４５の容器。
１７１．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４５の容器。
１７２．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１４５の容器。
１７３．細胞外マトリックスが、約１５ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１５３の容器。
１７４．細胞外マトリックスが、約１０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１５３の容器。
１７５．細胞外マトリックスが、約７．４ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１５３の容器。
１７６．細胞外マトリックスが、約３．２ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１５３の容器。
１７７．細胞外マトリックスが、約１．７ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１５３の容器。
１７８．細胞外マトリックスが、約１ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する、実施形態１５３の容器。
１７９．細胞外マトリックスが、ヒドロゲルである、実施形態１４３の容器。
１８０．細胞外マトリックスが、ポリアクリルアミドゲルである、実施形態１７９の容器。
１８１．細胞外マトリックスが、シリコンゲルである、実施形態１４３の容器。
１８２．ａ．細胞培養培地、
ｂ．以下：
ｉ．哺乳動物細胞のイオンチャネルを阻害するのに充分な量の１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤；
ｉｉ．哺乳動物細胞のコレステロールレベルを低減するのに充分な量の１つまたは複数の細胞コレステロール低減剤
の１つまたは両方で処理された１つまたは複数の哺乳動物細胞；および
ｃ．２０ｋＰａまたはそれより小さいヤング弾性率を有する軟質細胞外マトリックス
を含み、
非多能性哺乳動物細胞が、多能性誘導因子を発現するように遺伝子操作されておらず；
存在する場合、１つまたは複数の機械感受性伸展活性化イオンチャネル阻害剤が、約５μＭの濃度でのＧｓＭＴＸ４を含み；
存在する場合、１つまたは複数のコレステロール低減剤が、約５ｍＭの濃度でのメチル－β－シクロデキストリンであり；および
存在する場合、軟質細胞外マトリックスが、約７．５ｋＰａのヤング弾性率を有する、細胞培養容器。
１８３．体細胞における内因性多能性誘導転写因子の発現を増加させる方法であって、細胞膜受容体のシグナル伝達を修飾することを含む、方法。
１８４．体細胞が、線維芽細胞である、実施形態１８３の方法。
１８５．多能性誘導転写因子が、Ｏｃｔ－４、Ｓｏｘ－２、Ｎａｎｏｇおよびｃ－Ｍｙｃから選択される、実施形態１８３の方法。
１８６．細胞膜受容体が、機械感受性および／または伸展活性化イオンチャネルである、実施形態１８３の方法。
１８７．細胞膜受容体シグナル伝達が、細胞を機械感受性および／または伸展活性化イオンチャネル特異的阻害剤と接触させることにより修飾される、実施形態１８３の方法。
１８８．阻害剤が、ＧｓＭＴＸ４である、実施形態１８７の方法。
１８９．細胞膜受容体シグナル伝達が、少なくとも１つの細胞脂質の枯渇により修飾される、実施形態１８３の方法。
１９０．少なくとも１つの細胞脂質が、コレステロールである、実施形態１８９の方法。
１９１．細胞外脂質の枯渇が、細胞をシクロデキストリンファミリーの分子と接触させることにより生じる、実施形態１８９の方法。
１９２．分子が、メチル－ベータ－シクロデキストリンである、実施形態１９１の方法。
１９３．細胞膜受容体シグナル伝達が、細胞を低弾性細胞外マトリックスで培養することにより修飾される、実施形態１８３の方法。
１９４．マトリックスが、ポリアクリルアミドゲルである、実施形態１９３の方法。
１９５．ポリアクリルアミドゲルの弾性が、７．４ｋパスカル未満である、実施形態１９４の方法。
１９６．細胞膜受容体シグナル伝達が、
ａ．細胞を機械感受性および／または伸展活性化イオンチャネル特異的阻害剤と接触させること；
ｂ．少なくとも１つの細胞脂質の枯渇；ならびに
ｃ．細胞を低弾性細胞外マトリックスで培養すること
により修飾される、実施形態１８３の方法。
１９７．実施形態１８３の方法により産生される細胞であって、内因性多能性転写因子を発現する、細胞。
１９８．実施形態１８３の方法により産生される細胞であって、多能性誘導転写因子を発現する、細胞。
１９９．分化した細胞であって、実施形態１９８の細胞に由来する、細胞。
２００．実施形態１８３の方法を実行するためのキット。
２０１．コレステロール枯渇化合物および低弾性細胞外マトリックスを含む、実施形態２００のキット。
２０２．メチル－β－シクロデキストリンおよび乾燥ポリアクリルアミドゲルを含む、実施形態２００のキット。
【0054】
９． 実施例
本明細書に記載の本発明の代表的な実施形態のある特定の特徴および特性を強調している以下の実施例は、例示の目的のために提供され、限定されるものではない。
９．１． 実施例１
９．１．１． 材料および方法
マウス、細胞および抗体
本明細書に記載の本発明の代表的な実施形態のある特定の特徴および特性を強調している以下の実施例は、例示の目的のために提供され、限定されるものではない。
９．１． 実施例１
９．１．１． 材料および方法
マウス、細胞および抗体
【0055】
Ｃ５７ＢＬ／６オスマウス（４週齢～６週齢）をジャクソンラボラトリーから購入した。骨髄細胞および脾臓細胞を、４週齢～６週齢のオスＣ５７ＢＬ／６マウスから得た。単一細胞懸濁液中の細胞は、使用前に赤血球が枯渇していた。骨髄間質細胞を培養し、記載されている［Ｔｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ ４：ｅ１０３１（２０１４）］ように、Ｔ７５培養フラスコで継代した。胚性線維芽細胞を、前述した［Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ ６：ｅ１８５９（２０１６）］ように、Ｃ５７ＢＬ／６の１３日胎児から調製した。リプログラミングに使用した細胞は、２回から４回の継代期間で培養したものであった。
【0056】
ＧｓＭＴＸ４を用いるＭＳＡＩＣ阻害アッセイ
細胞を、群あたり３連で、６ウェルプレート（１０７細胞／ウェル）で培養した。ＰＢＳに溶解したＧｓＭＴＸ４を、実験群に濃度５μＭで添加した。１６時間後、脾臓細胞および骨髄細胞については、スクレーパーにより細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン）またはＴｒｉｚｏｌ（インビトロジェン）を用いた全ＲＮＡ抽出のためにペレット化した。ＥＦ細胞およびＢＭ間質細胞について細胞培養培地を排出し、培養ウェルの細胞溶解緩衝液に直接再懸濁した。抽出したＲＮＡをｃＤＮＡ合成（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に供し、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（バイオ・ラッド、ＣＦＸ３８４）によりマウスＰＩ遺伝子および対照遺伝子に特異的なメッセージを分析した。使用したプライマは：Ｏｃｔ４（５’：CTACAGTCCCAGGACATGAA（配列番号５）、３’：TGGTCTCCAGACTCCACCTC（配列番号６）、Ｓｏｘ２（５’：ATGATGGAGACGGAGCTGAA（配列番号７）、３’：TTGCTGATCTCCGAGTTGTG（配列番号８）、Ｎａｎｏｇ（５’：AAGTACCTCAGCCTCCAGCA（配列番号９０）、３’：GCTTGCACTTCATCCTTTGG（配列番号１０）、ＣＦＢＰ／α（５’：CGACTTCTACGAGGTGGAGC（配列番号１１）、３’：TCGATGTAGGCCGCTGATGTC（配列番号１２）、ｃ－Ｍｙｃ（５’：CACCATGCCCCTCAACGTGA（配列番号１３）、３’：TTATGCACCAGAGTTTCG（配列番号１４）、ＲＵＮＸ１（５’：CGTATCCCCGTAGATGGCAG（配列番号１５）、３’：GCCAGGGTGGTCAGCTAGTA（配列番号１６）、ＰＵ．１（５’：AGAGCATACCAACGTCCAATGC（配列番号１７）、３’：GTGCGGAGAAATCCCAGTAGTG（配列番号１８）、ＩＲＦ８（５’：CGTGGAAGACGAGGTTACGCTG（配列番号１９）、３’：GCTGAATGGTGTGTGTCATAGGC（配列番号２０）、ＦＯＸＰ１（５’：ATCCCAGAACGGGTCCAGCGGTGGCAACCAC（配列番号２１）、３’：GATCTGCTGCATTTGTTGAGGAGTGATAAC（配列番号２２）、ＫＬＦ４（５’：GGTGCAGCTTGCAGCAGTAA（配列番号２３）、３’：AAAGTCTAGGTCCAGGAGGTCGTT（配列番号２４）、アクチン（５’：GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG（配列番号２５）、３’：AGGGGCCGGACTCATCGTACTC（配列番号２６）、ＧＡＰＤＨ ５’：CATCACCATCTTCCAGGAGCG（配列番号２７）、３’：ACGGACACATTGGGGGTAGG（配列番号２８）であった。各Ｃｑ（Ｃｔ）の値は、アクチンまたはＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子のメッセージレベルと比較して、各特定の遺伝子のメッセージレベル（インデックス値で示される）を推定する式に適用された。
細胞を、群あたり３連で、６ウェルプレート（１０７細胞／ウェル）で培養した。ＰＢＳに溶解したＧｓＭＴＸ４を、実験群に濃度５μＭで添加した。１６時間後、脾臓細胞および骨髄細胞については、スクレーパーにより細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン）またはＴｒｉｚｏｌ（インビトロジェン）を用いた全ＲＮＡ抽出のためにペレット化した。ＥＦ細胞およびＢＭ間質細胞について細胞培養培地を排出し、培養ウェルの細胞溶解緩衝液に直接再懸濁した。抽出したＲＮＡをｃＤＮＡ合成（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に供し、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（バイオ・ラッド、ＣＦＸ３８４）によりマウスＰＩ遺伝子および対照遺伝子に特異的なメッセージを分析した。使用したプライマは：Ｏｃｔ４（５’：CTACAGTCCCAGGACATGAA（配列番号５）、３’：TGGTCTCCAGACTCCACCTC（配列番号６）、Ｓｏｘ２（５’：ATGATGGAGACGGAGCTGAA（配列番号７）、３’：TTGCTGATCTCCGAGTTGTG（配列番号８）、Ｎａｎｏｇ（５’：AAGTACCTCAGCCTCCAGCA（配列番号９０）、３’：GCTTGCACTTCATCCTTTGG（配列番号１０）、ＣＦＢＰ／α（５’：CGACTTCTACGAGGTGGAGC（配列番号１１）、３’：TCGATGTAGGCCGCTGATGTC（配列番号１２）、ｃ－Ｍｙｃ（５’：CACCATGCCCCTCAACGTGA（配列番号１３）、３’：TTATGCACCAGAGTTTCG（配列番号１４）、ＲＵＮＸ１（５’：CGTATCCCCGTAGATGGCAG（配列番号１５）、３’：GCCAGGGTGGTCAGCTAGTA（配列番号１６）、ＰＵ．１（５’：AGAGCATACCAACGTCCAATGC（配列番号１７）、３’：GTGCGGAGAAATCCCAGTAGTG（配列番号１８）、ＩＲＦ８（５’：CGTGGAAGACGAGGTTACGCTG（配列番号１９）、３’：GCTGAATGGTGTGTGTCATAGGC（配列番号２０）、ＦＯＸＰ１（５’：ATCCCAGAACGGGTCCAGCGGTGGCAACCAC（配列番号２１）、３’：GATCTGCTGCATTTGTTGAGGAGTGATAAC（配列番号２２）、ＫＬＦ４（５’：GGTGCAGCTTGCAGCAGTAA（配列番号２３）、３’：AAAGTCTAGGTCCAGGAGGTCGTT（配列番号２４）、アクチン（５’：GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG（配列番号２５）、３’：AGGGGCCGGACTCATCGTACTC（配列番号２６）、ＧＡＰＤＨ ５’：CATCACCATCTTCCAGGAGCG（配列番号２７）、３’：ACGGACACATTGGGGGTAGG（配列番号２８）であった。各Ｃｑ（Ｃｔ）の値は、アクチンまたはＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子のメッセージレベルと比較して、各特定の遺伝子のメッセージレベル（インデックス値で示される）を推定する式に適用された。
【0057】
低弾性組織培養プレートおよび培養プレートにおけるヒドロゲルキャスティング
定義された弾性表面（０．２ｋｐａ、４ｋｐａ、５０ｋｐａ）を有する組織培養プレートを、Ｍａｔｒｉｇｅｎから購入した。ポリアクリルアミドゲルをペトリ皿にキャストするため、３．５ｃｍのペトリ皿を使用した。各ディッシュに３３０μＬのポリアクリルアミドゲルカクテルを入れ、すぐにサイズをあわせた落し蓋（ポリプロピレン）を上に載せた（図３０）。ポリアクリルアミドゲルの３つの異なる弾性を、研究中に調製した。［アクリルアミド（４０％）：ビス－アクリルアミド（２％）：水］の比を刊行されているデータ［Ｔｓｅ ａｎｄ Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｃｈａｐｔ．１０ Ｕｎｉｔ １０．１６（２０１０）］にしたがって決定した。それらは、１．７ｋｐａでは（７５：１１２．５：８１２．５）、３．２ｋｐａでは（１００：１５０：７５０）、７．４ｋｐａでは（２５０：３０：７２０）であった。５０ｍｌのコニカル遠沈管キャップのスライスを落とし蓋に使用した（図３０において矢印の先）。
定義された弾性表面（０．２ｋｐａ、４ｋｐａ、５０ｋｐａ）を有する組織培養プレートを、Ｍａｔｒｉｇｅｎから購入した。ポリアクリルアミドゲルをペトリ皿にキャストするため、３．５ｃｍのペトリ皿を使用した。各ディッシュに３３０μＬのポリアクリルアミドゲルカクテルを入れ、すぐにサイズをあわせた落し蓋（ポリプロピレン）を上に載せた（図３０）。ポリアクリルアミドゲルの３つの異なる弾性を、研究中に調製した。［アクリルアミド（４０％）：ビス－アクリルアミド（２％）：水］の比を刊行されているデータ［Ｔｓｅ ａｎｄ Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｃｈａｐｔ．１０ Ｕｎｉｔ １０．１６（２０１０）］にしたがって決定した。それらは、１．７ｋｐａでは（７５：１１２．５：８１２．５）、３．２ｋｐａでは（１００：１５０：７５０）、７．４ｋｐａでは（２５０：３０：７２０）であった。５０ｍｌのコニカル遠沈管キャップのスライスを落とし蓋に使用した（図３０において矢印の先）。
【0058】
９０分後、落し蓋を注意深く取り除き、ディッシュ内のゲルを３ｍｌの滅菌水で５回洗浄した。ディッシュからの水の各吸引は、１ｍｌのマイクロピペッタを用いて穏やかに実行された。洗浄中、キャストされたアクリルアミドゲルは、底からはずれる。最後に、ゲルを、使用の前の２時間、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で飽和させた。ＴＥＭＥＤを除くポリアクリルアミドゲルのための各成分をフィルタ滅菌した。落し蓋は、７０％Ｅｔ－ＯＨで滅菌し、組織培養フード内で乾燥させた。全プロセスは、組織培養フード内で実行された。
【0059】
ＭβＣＤを用いる細胞の処理およびリプログラミング培養
細胞を、１５ｍｌの遠沈管内で、２×１０６／ｍｌの濃度で５ｍＭのＭβＣＤを添加したＤＭＥＭに懸濁した。細胞懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートし、５分毎に穏やかに撹拌した。３７℃に温めたＤＭＥＭ／Ｆ１２で１回洗浄し、少量の完全培地（３０μｌ／２×１０６細胞）［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（コーニング）、２０％ノックアウト血清代替物（Ｇｉｂｃｏ）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、５×１０－５Ｍの２－メルカプトエタノール］に再懸濁した。ヒドロゲル上でリプログラミング培養を開始するため、ペトリ皿に２．５ｍｌの完全培地を添加し、その後、細胞懸濁液３０μｌをヒドロゲルに載せた。複数のディッシュを、水を充填して蓋をしていない６ｃｍのペトリ皿を有する１５ｃｍ径のペトリ皿に収容した。ゲル上およびディッシュの底面上の細胞を毎日観察し、注目すべき表現型の細胞をＥＶＯＳ細胞モニタリングシステム（サーモフィッシャー）で記録した。種々の表現型の細胞が、一般的に利用可能な方法として細胞系統に特異的なマーカー（例えば、脂肪細胞にはオイルレッドＯ、カルシウム沈着細胞にはアリザリン）のアッセイにより特徴づけられた。
細胞を、１５ｍｌの遠沈管内で、２×１０６／ｍｌの濃度で５ｍＭのＭβＣＤを添加したＤＭＥＭに懸濁した。細胞懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートし、５分毎に穏やかに撹拌した。３７℃に温めたＤＭＥＭ／Ｆ１２で１回洗浄し、少量の完全培地（３０μｌ／２×１０６細胞）［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（コーニング）、２０％ノックアウト血清代替物（Ｇｉｂｃｏ）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、５×１０－５Ｍの２－メルカプトエタノール］に再懸濁した。ヒドロゲル上でリプログラミング培養を開始するため、ペトリ皿に２．５ｍｌの完全培地を添加し、その後、細胞懸濁液３０μｌをヒドロゲルに載せた。複数のディッシュを、水を充填して蓋をしていない６ｃｍのペトリ皿を有する１５ｃｍ径のペトリ皿に収容した。ゲル上およびディッシュの底面上の細胞を毎日観察し、注目すべき表現型の細胞をＥＶＯＳ細胞モニタリングシステム（サーモフィッシャー）で記録した。種々の表現型の細胞が、一般的に利用可能な方法として細胞系統に特異的なマーカー（例えば、脂肪細胞にはオイルレッドＯ、カルシウム沈着細胞にはアリザリン）のアッセイにより特徴づけられた。
【0060】
ＥＦ細胞のリプログラミング培養におけるＰＩ遺伝子の発現のためのＲＴ－ＰＣＲアッセイ
ペトリ皿内のＭβＣＤ処理済みでヒドロゲル曝露済みの培養に由来する細胞を、Ｔｒｉｚｏｌによる全ＲＮＡの抽出に供した。上述したようにｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲマスターミクス（バイオツールズ）およびリアルタイムＰＣＲアッセイのために上記で列記したプライマを使用して、通常のＰＣＲを実行した（３５サイクル）。ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル、エチジウムブロマイド染色を使用して分解し、結果は、ゲルドキュメンテーションシステム（バイオ・ラッド）により獲得した。
９．２． 実施例２
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の核リプログラミング
ペトリ皿内のＭβＣＤ処理済みでヒドロゲル曝露済みの培養に由来する細胞を、Ｔｒｉｚｏｌによる全ＲＮＡの抽出に供した。上述したようにｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲマスターミクス（バイオツールズ）およびリアルタイムＰＣＲアッセイのために上記で列記したプライマを使用して、通常のＰＣＲを実行した（３５サイクル）。ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル、エチジウムブロマイド染色を使用して分解し、結果は、ゲルドキュメンテーションシステム（バイオ・ラッド）により獲得した。
９．２． 実施例２
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の核リプログラミング
【0061】
ヒトＰＢＭＣは、利用可能なｉＰＳＣ技術による幹細胞へのリプログラミングのための体細胞の魅力的な源である。末梢血のサンプリングは、医学における一般的な方法であり、個々の特定の様式で得ることが可能である。ＰＢＭＣの精製もまた、フィコール（Ficol）勾配遠心分離による標準の方法である。以前、レンチウイルスを使用する標準ｉＰＳＣ技術により、結果として一連のｉＰＳＣの確立となった［Ｓｉｍａｒａ，Ｐａｖｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｖｏｌ．２７，１０－（２０１８）、ＵＳ９４４７３８２Ｂ２］。本発明の方法が、ヒトＰＢＭＣを幹細胞様細胞にリプログラムするため、またインビトロでデノボ表現型に分化させるために適用することができるかを調べるため、細胞をＭβＣＤで処理し、その後、以下に（infula）記載されるように、軟質ポリアクリルアミドゲル上で培養する実験を実行した。
【0062】
ヒト末梢血を、左前腕静脈からヘパリン処理済みチューブに回収した（corrected）。フィコール－ハイパーク法（密度、１．０７７；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウプサラ、スウェーデン）を使用して血液単核細胞を分離した。細胞を３７℃で２０分間、ＤＭＥＭ中の５ｍＭのＭβＣＤと２回繰り返してインキュベートし、室温で９００ｇでの遠心分離によりペレット化した。３７℃に温めたＤＭＥＭ／Ｆ１２で１回洗浄し、少量の完全培地（３０μｌ／２×１０６細胞）［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（コーニング）、２０％ノックアウト血清代替物（Ｇｉｂｃｏ）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、５×１０－５Ｍの２－メルカプトエタノール］に再懸濁した。培養ペトリ皿の細胞を毎日顕微鏡により監視し、新規表現型細胞を記録した。図３１Ａ～図３１Ｄに示すように、我々は、赤血球、赤血球前駆細胞、樹状細胞様細胞、リンパ球様小細胞および血小板様小粒子に似た新規表現型細胞を観察した。それらの細胞は、培養１週間後に認識され、未成熟赤血球様細胞の数は、培養期間が２週間よりも長くなると増加した。ＭβＣＤでも軟質ヒドロゲルでも処理されていなかった対照の培養は、多数の細胞死を示し、顕微鏡検査により、類似の状況は、観察されなかった。
【0063】
図３１Ａ～図３１Ｄは、ＭβＣＤ細胞およびヒドロゲルで処理されたヒト末梢血単核細胞に由来する未成熟赤血球様および巨核球／血小板様細胞のインビトロ発生を示す。図３１Ａ～図３１Ｂは、赤血球様細胞のクラスターを示し、図３１Ｃ～図３１Ｅは、巨核球／血小板様細胞のクラスターを示す。
【0064】
重要なことに、赤血球の産生は、末梢血単核細胞ではなく骨髄細胞に由来するものに厳密に限定されることが既知である［Ｄｚｉｅｒｚａｋ ａｎｄ Ｓｊａａｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ．３，４ ａ０１１６０１．１Ａｐｒ．２０１３，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０１１６０１］。したがって、本発明は、需要を満たすために細胞を生成し、貧血ならびにリンパ球減少症に血球を輸血するための独特で貴重な機会を提供した。
９．３． 実施例３
体細胞リプログラミングキット
９．３． 実施例３
体細胞リプログラミングキット
【0065】
現在の発見は、体細胞が機械的ストレスの減衰後に多能性幹細胞様細胞にリプログラミング可能であることを教示した。これに関連して、低パスカル（例えば、３．２ｋｐａ）のアクリルアミドゲル表面上でのインビトロ培養は、線維芽細胞を多能性幹細胞様細胞に変形させる。加えて、ＭβＣＤを用いる細胞コレステロール枯渇は、線維芽細胞を多能性幹細胞様細胞にリプログラムする。潜在的に、それらの技術は、体細胞を幹細胞にリプログラムし、続いて異なる種類の細胞に分化させるための新規プラットフォームを生成する可能性がある。標準的な熟練者が体細胞をリプログラムすることを可能にするキットは、軟質ポリアクリルアミドゲルがキャストされ、乾燥させた３．５ｃｍ径のペトリ皿、およびチューブ内のＭβＣＤ粉末のアリコートを含む。以下に、「体細胞リプログラミングキット」に関連する「材料、方法、および手順」を説明する。
９．３．１． 材料および方法
９．３．１． 材料および方法
【0066】
リプログラミング試薬（ＭβＣＤ）を含むチューブ。１つの細胞型のリプログラミング用の各チューブ。乾燥幹細胞マトリックス（アクリルアミドゲル）を含む３５ｍｍのペトリ皿をセットする。各ペトリ皿は、１つが１．７ｋｐａ、２番目が３．２ｋｐａ、３番目が７．４ｋｐａを有しているので、再水和後の弾性が異なる乾燥ポリアクリルアミドゲルを有している。したがって、各ディッシュにおけるマトリックスの異なる柔軟性は、目的の特定の体細胞の最適なリプログラミングおよび後に続く再分化のために選択することができる。
抗生物質を有するＤＭＥＭ
完全培地：抗生物質、ノックアウト血清（２０％）、非必須アミノ酸（１×）、５×１０－５Ｍで２－メルカプトエタノールを有するＤＭＥＭ／Ｆ－１２
ペトリ皿（１４ｃｍ径；６ｃｍ径）
使い捨て１０ｍｌシリンジ
シリンジフィルタ（０．２２μｍ）
記録を保持するための細胞イメージングシステム、例えばＥＶＯＳ細胞イメージングシステム（サーモフィッシャー）。
抗生物質を有するＤＭＥＭ
完全培地：抗生物質、ノックアウト血清（２０％）、非必須アミノ酸（１×）、５×１０－５Ｍで２－メルカプトエタノールを有するＤＭＥＭ／Ｆ－１２
ペトリ皿（１４ｃｍ径；６ｃｍ径）
使い捨て１０ｍｌシリンジ
シリンジフィルタ（０．２２μｍ）
記録を保持するための細胞イメージングシステム、例えばＥＶＯＳ細胞イメージングシステム（サーモフィッシャー）。
【0067】
毎日のプロトコル
１日目
組織培養フード内で、ペトリ皿を、清浄水が満たされた蓋がない５．５ｃｍのペトリ皿を収容している１４ｃｍのペトリ皿に入れる。３ｍｌの完全培地を、幹細胞マトリックス（乾燥ポリアクリルアミドゲル）を有する３．５ｃｍのペトリ皿に添加する。
例えば図３２を参照されたい。
２日目
汚染および再構成された幹細胞マトリックスの存在についてペトリ皿を監視する。
３日目
汚染についてペトリ皿を監視する。
使用直前にリプログラミング溶液を調製する。リプログラミング試薬をチューブ内で５ｍｌのＤＭＥＭに溶解する。充分にボルテックスして完全に混合／溶解し、シリンジフィルタにより滅菌する。
３７℃で温める。
胚性線維芽細胞（３００億個～５００億個の細胞）を１５ｍｌのコニカルチューブに回収する。
ＤＭＥＭで１回洗浄する。
細胞ペレットを半量のリプログラミングＭβＣＤ溶液（約２．５ｍｌ）に再懸濁し、３７℃で２０分間、５分毎に混合しながらインキュベートする。回転させてペレット化し、上清を取り除いた後、リプログラミング溶液の残りの半分（約２．５ｍｌ）に再度、再懸濁し、５分毎に混合しながらさらに２０分間、３７℃でのインキュベーションを継続する。スピンダウン（洗浄不要）し、ペレットを２０μｌから３０μｌの完全培地に再懸濁する。２００μｌのピペットマンを用いて、３５ｍｍのペトリ皿の幹細胞マトリックスに静かに細胞を播種する。ペトリ皿１つにつき、マトリックス上に約２０μｌを播種する（図３３）。組織培養フード内で細胞がマトリックス上に沈降するまで２０分待機する。ペトリ皿コンボ全体を３７℃のＣＯ２インキュベータに静かに移し、リプログラミング／分化培養を開始する。
７日目
βＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。
８日目以降
マトリックス上の細胞および培養の底面を監視する。
１日目
組織培養フード内で、ペトリ皿を、清浄水が満たされた蓋がない５．５ｃｍのペトリ皿を収容している１４ｃｍのペトリ皿に入れる。３ｍｌの完全培地を、幹細胞マトリックス（乾燥ポリアクリルアミドゲル）を有する３．５ｃｍのペトリ皿に添加する。
例えば図３２を参照されたい。
２日目
汚染および再構成された幹細胞マトリックスの存在についてペトリ皿を監視する。
３日目
汚染についてペトリ皿を監視する。
使用直前にリプログラミング溶液を調製する。リプログラミング試薬をチューブ内で５ｍｌのＤＭＥＭに溶解する。充分にボルテックスして完全に混合／溶解し、シリンジフィルタにより滅菌する。
３７℃で温める。
胚性線維芽細胞（３００億個～５００億個の細胞）を１５ｍｌのコニカルチューブに回収する。
ＤＭＥＭで１回洗浄する。
細胞ペレットを半量のリプログラミングＭβＣＤ溶液（約２．５ｍｌ）に再懸濁し、３７℃で２０分間、５分毎に混合しながらインキュベートする。回転させてペレット化し、上清を取り除いた後、リプログラミング溶液の残りの半分（約２．５ｍｌ）に再度、再懸濁し、５分毎に混合しながらさらに２０分間、３７℃でのインキュベーションを継続する。スピンダウン（洗浄不要）し、ペレットを２０μｌから３０μｌの完全培地に再懸濁する。２００μｌのピペットマンを用いて、３５ｍｍのペトリ皿の幹細胞マトリックスに静かに細胞を播種する。ペトリ皿１つにつき、マトリックス上に約２０μｌを播種する（図３３）。組織培養フード内で細胞がマトリックス上に沈降するまで２０分待機する。ペトリ皿コンボ全体を３７℃のＣＯ２インキュベータに静かに移し、リプログラミング／分化培養を開始する。
７日目
βＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。
８日目以降
マトリックス上の細胞および培養の底面を監視する。
【0068】
９．４． 考察
骨髄細胞におけるＭＳＡＩＣのシグナル伝達が多能性誘導（ＰＩ）遺伝子の発現を活性化することができたかを試験するために調査が実行された。ＭＳＡＩＣのシグナル伝達を修飾するため、採用されたものは、ＧｓＭＴＸ４であり［Ｇｎａｎａｓａｍｂａｎｄａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１１２：３１（２０１７）］、それは、ＭＳＡＩＣに対して特定の機能的ブロッキング活性を保持している［Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＡＩＮ，１３７：２０８（２００８）］。ＧｓＭＴＸ４は、感覚ニューロンの触覚、圧力、固有受容、および疼痛の機械的閾値を高めるために以前使用されていたトリクイグモ科のクモ（タランチュラ）のクモ毒から精製された水溶性３４ｍｅｒペプチドである［Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ，４９：２４９（２００７）］。ＰＩ遺伝子発現を特徴づけるため、他のいくらかのＭＳＡＩＣ阻害剤（例えばＨＣ０６７０４７［Ｅｖｅｒａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１９０８４（２０１０）］）が、ＤＭＳＯまたはアルコールにのみ溶解し、それ自体でＰＩ遺伝子の発現を変化させることが既知であったため、水溶性ＧｓＭＴＸ４は、有用であった［Ｃｚｙｓｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１０（２）（２０１５）；Ｏｇｏｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．，２２：２１９６（２０１３）］。
骨髄細胞におけるＭＳＡＩＣのシグナル伝達が多能性誘導（ＰＩ）遺伝子の発現を活性化することができたかを試験するために調査が実行された。ＭＳＡＩＣのシグナル伝達を修飾するため、採用されたものは、ＧｓＭＴＸ４であり［Ｇｎａｎａｓａｍｂａｎｄａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１１２：３１（２０１７）］、それは、ＭＳＡＩＣに対して特定の機能的ブロッキング活性を保持している［Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＡＩＮ，１３７：２０８（２００８）］。ＧｓＭＴＸ４は、感覚ニューロンの触覚、圧力、固有受容、および疼痛の機械的閾値を高めるために以前使用されていたトリクイグモ科のクモ（タランチュラ）のクモ毒から精製された水溶性３４ｍｅｒペプチドである［Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ，４９：２４９（２００７）］。ＰＩ遺伝子発現を特徴づけるため、他のいくらかのＭＳＡＩＣ阻害剤（例えばＨＣ０６７０４７［Ｅｖｅｒａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１９０８４（２０１０）］）が、ＤＭＳＯまたはアルコールにのみ溶解し、それ自体でＰＩ遺伝子の発現を変化させることが既知であったため、水溶性ＧｓＭＴＸ４は、有用であった［Ｃｚｙｓｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１０（２）（２０１５）；Ｏｇｏｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．，２２：２１９６（２０１３）］。
【0069】
実験において、マウス骨髄細胞をインビトロで、５μＭのＧｓＭＴＸ４の存在下、３７℃で１６時間培養した。その後、細胞を、図１の左に列記されたようなＰＩ遺伝子のメッセージについてアッセイした。この細胞培養において、細胞を、本質的に無限の伸長力を保持する硬質ポリエチレン表面に曝露した。培養におけるＧｓＭＴＸ４の存在は、細胞が、ＭＳＡＩＣによる強い伸展ストレスを検知することを防止すると予想された。際立ったことに、ＧｓＭＴＸ４の存在下で培養した細胞は、対照細胞と比較して、Ｏｃｔ４メッセージの１００倍よりも強く発現した（図１）。また、造血幹細胞の表現型に関与していると報告されているＳｏｘ２、Ｃ／ＥＢＰαおよびＲＵＮＸ１も、細胞内で顕著に活性化された［Ｈａｓｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．１０（１）：ｅ１００４０７９（２０１４）；Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２２：１５８（２００４）］。したがって、データは、ＧｓＭＴＸ４での処理が、幹細胞の表現型に重要な特定の遺伝子発現を大幅に活性化したことを示した。
【0070】
新鮮な骨髄細胞を、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ中、ＧｓＭＴＸ４（５μＭ）を有する６ウェルプレートで１６時間培養した。左に列記された遺伝子に特異的なメッセージを、リアルタイムＰＣＲで特徴づけ、β－アクチンメッセージの値と比較した相対的な指標として提示された。示された各実験値は、３連の試料の平均および標準偏差であった。示された結果は、類似の結果を有する３つの実験を表す。
【0071】
非ＰＩ遺伝子、ＩＲＦ８およびＦＯＸＰ１の発現についてＲＮＡをアッセイする場合、発現の変化は小さく、ＰＩ遺伝子に匹敵しない。そのため、ＧｓＭＴＸ４は、遺伝子特異的な方法でＰＩ遺伝子発現を強化した。研究は、ＭＳＡＩＣにより検出された伸展傷害が、骨髄細胞におけるＰＩ遺伝子の発現を敏感に／優勢的に抑制した。より硬質な細胞外マトリックス刺激ＭＳＡＩＣシグナル伝達が、多能性分化能を低下させることにより、幹細胞分化を促進すると解釈することができる。
【0072】
ＭＳＡＩＣのＧｓＭＴＸ４媒介阻害は、細胞が軟質細胞外マトリックスと接触した微小環境を与えることが想定されている。これに関連して、深層的な洞察を得るために、種々の剛性率の組織培養ウェルで培養した骨髄細胞の応答を調査した。選択された剛性率は、０．２ｋパスカル、４ｋパスカルおよび５０ｋパスカルであった。細胞を、ウェルで１６時間培養し、上述したようにＰＩ遺伝子発現についてアッセイした。重要なことに、ＰＩ遺伝子の顕著な発現は、４ｋパスカルが最も高く誘導し、０．２ｋパスカルまたは５０ｋパスカルが最も低いレベルの誘導を示したように、特定の剛性率で観察された（図２）。
【0073】
骨髄細胞を、左に列記されたように特定の剛性率のマトリックスでコートされた６ウェルプレートで培養した。左に列記された遺伝子のメッセージを、図１に記載されるようにｑＰＣＲで特徴づけた。結果は、過度に柔らかくまたは硬くても、ＰＩ遺伝子の発現が大幅に増加することにはならなかったので、ＰＩ遺伝子の活性化が細胞外マトリックスの剛性率の特定の範囲に依存したことを示唆した。
【0074】
ＧｓＭＴＸ４による脾臓細胞におけるＰＩ遺伝子の調節は、骨髄細胞で観察されたものと矛盾する。脾臓細胞をＧｓＭＴＸ４の存在下で１６時間培養する場合、ＰＩ遺伝子の活性化が観察されず、代わりに、発現レベルが低かったが、ＰＩ遺伝子発現は、一貫して抑制されていた（図３）。脾臓細胞を図１に記載されるように６ウェルプレートで培養した。左に列記された遺伝子発現を、図１に示したものと同じ方法により評価した。
【0075】
同じ圧力および伸展ストレスに曝露した場合、反対の表現型を保持する細胞をより明確に調査するため、研究は、骨髄由来の間質細胞株およびＥＦ株を準備することにより拡張された。ＧｓＭＴＸ４の存在下、骨髄間質細胞株がＯ／Ｎで培養された場合、細胞におけるＰＩ遺伝子の活性化は、新鮮な骨髄細胞の活性化と類似していた（図４）。骨髄間質細胞株を、図１に記載されるようにＧｓＭＴＸ４で処理した。左に列記された遺伝子発現を、図１に示したものと同じ方法により評価した。同様な方法で、ＥＦ細胞は、新鮮な脾臓細胞の研究において観察されたように応答した（図５）。胚性線維芽細胞を、図１に記載されるようにＧｓＭＴＸ４で処理した。左に列記された遺伝子発現を、図１に示したものと同じ方法により評価した。
【0076】
データは、機械的ストレスにより誘導されるＰＩ遺伝子の調節パターンが、インビトロで適応した細胞株に受け継がれる可能性があることを示した。データはまた、ＭＳＡＩＣシグナル伝達に応答する特定の表現型が、インビボからインビトロの適応に起因する一過性のメカニズムによるものではなく、本質的にプログラムされたメカニズムによるものであることを示唆した。ＭＳＡＩＣによるＰＩ遺伝子調節のこの安定した表現型は、体細胞に多能性を保持させるメカニズムに関連する可能性がある。
【0077】
さらなる実験において、脾臓細胞およびＥＦ細胞におけるＰＩ遺伝子調節は、抑制が継続しているかの洞察を得るために、ＧｓＭＴＸ４処理の開始から３日後に調査された。ＰＩ遺伝子発現をアッセイする場合、抑制はもはや検出されず、代わりに、ＰＩ遺伝子の活性化が有意に観察された（図６）。
【0078】
脾臓細胞を、図１に記載されるように６ウェルプレートで培養した。細胞を３日目に回収し、図１に示したものと同じ方法により左に列記された多能性幹細胞転写因子の発現についてアッセイした。類似の方法において、ＥＦ細胞におけるＰＩ遺伝子の発現は、ＧｓＭＴＸ４処理後の３日後に活性化されることが認められた（図７）。ＥＦ細胞を、図１に記載されるように６ウェルプレートで培養した。細胞を３日目に回収し、図１に示したものと同じ方法により左に列記されたＰＩＦの発現についてアッセイした。
【0079】
データは、ＭＳＡＩＣ阻害剤に応答したＰＩ遺伝子の抑制が一過性であったことを示した。したがって、細胞の起源は、ＰＩ遺伝子の発現により測定された機械的ストレスに対する初期応答に影響するように見えた。結果は、先例のない受容体メカニズムを明らかにしたように見え、その刺激の同じ入力は、おそらく細胞分化の異なる段階のために、細胞の種類に応じて完全に異なる結果を引き起こす。
【0080】
結果は、ＭＳＡＩＣシグナル伝達の減衰に続く、別個の種類の体細胞の存在を示唆した；１つは、ＰＩ遺伝子を即座に活性化し、２番目は、一過性の抑制後にＰＩ遺伝子を活性化する遅延モードで応答する。データはまた、ＭＳＡＩＣシグナル伝達の長期的な減衰が、両方の体細胞型をリプログラムして、高レベルのＰＩ遺伝子を保持する幹細胞様表現型を獲得する可能性があることも示した。
【0081】
脾臓細胞からのコレステロール枯渇は、骨髄細胞と類似の方法でＧｓＭＴＸ４に対して応答するように細胞を修飾した。
【0082】
ＭＳＡＩＣ阻害後に脾臓細胞を骨髄細胞から識別する分子メカニズムへの洞察を得るため、異なる剛性率の役割および細胞膜のシグナル伝達の可能性を調べた。安定した温度の生理学的条件において、骨髄よりも脾臓で高いと知られているコレステロールレベルは、細胞膜の剛性率を変更する［Ｌｏｓ ａｎｄ Ｍｕｒａｔａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６６６：１４２（２００４）；Ｓｉｍｏｎｓ ａｎｄ Ｓａｍｐａｉｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．３（１０）（２０１１）］。コレステロールはまた、ＭＳＡＩＣが存在し、機械感覚シグナルを開始する脂質ラフトを形成することにより膜受容体シグナル伝達の中心的な役割を果たす［Ｓｚｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２８：６７（２０１０）］。脾臓細胞は、細胞膜からコレステロールを枯渇させるＭβＣＤでの処理後のＰＩ遺伝子の発現について調査された［Ｍａｈａｍｍａｄ ａｎｄ Ｐａｒｍｒｙｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２３２：９１（２０１５）］。驚いたことに、ＭβＣＤで処理された脾臓細胞は、Ｏ／Ｎの培養におけるＧｓＭＴＸ４処理に応答してＰＩ遺伝子の活性化を示した（図８）。
【0083】
【0084】
結果は、細胞膜におけるコレステロールのレベルが、ＭＳＡＩＣ阻害剤に応答して得られるＰＩ遺伝子発現を決定したことを示した。
【0085】
細胞脂質および／または軟質細胞外マトリックスの枯渇によるＥＦ細胞の多能性幹細胞様細胞への変換。
【0086】
ＰＩ遺伝子で遺伝子トランスフェクトされたＥＦ細胞で見られたように、細胞が多能性幹細胞活性を獲得する細胞培養方法を開発した［Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ，１２６：６６３（２００６）］。細胞をＭβＣＤで処理し、その後、低パスカルのヒドロゲル（１．７ｋｐａ、３．２ｋｐａおよび７．４ｋｐａ）上に播種した。６０分以内で、培養の開始後、細胞は、ヒドロゲルにしっかりと付着し、その後、種々のサイズの球体の形成が、Ｏ／Ｎの培養で観察された（図９Ａ）。
【0087】
ＰＩ遺伝子の発現を調べるため、球体およびウェルの底に付着した細胞（播種手順中にゲル表面からこぼれた）からの全ＲＮＡを、１．５％アガロースゲル電気泳動法によりＲＴ－ＰＣＲで特徴づけた。
【0088】
ＥＦ細胞をＭβＣＤで処理し、ＲＮＡ抽出の前の７日間、ヒドロゲルをキャストしたペトリ皿で培養した。ヒドロゲルの剛性率を、各レーンの上に列記した。球体およびディッシュに付着した細胞からの全ＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲによりＰＩ遺伝子の発現について分析した。ＰＣＲ増幅したフラグメントを、１．５％アガロースゲルに溶解し、エチジウムブロマイドで染色した。マウス胚性幹（ｍＥＳ）細胞の全ＲＮＡを陽性対照として使用した。左から右に、ａ；Ｏｃｔ４分析、ｂ；Ｎａｎｏｇ分析、ｃ；Ｓｏｘ２分析である。
【0089】
図１０に示すように、１週間の培養では、予測されたサイズで底に付着した細胞において、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２について有意なメッセージを示したが、球体から得られたＲＮＡは、Ｏｃｔ４に特異的な予測されたバンドを示さず、代わりに、約１０００ｂｐｓで目立ったバンドを示した（図１０Ａ）。しかし、これらのバンドは、予測されたサイズのバンドが出現したときに完全に消失した。また、Ｎａｎｏｇ発現についてのアッセイにおいて、同様の結果が観察された（図１０Ｂ）。しかし、イントロンを含まない遺伝子であるＳｏｘ２は、大きいサイズのバンドを示さなかった［Ｎａｇａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４１：３６３（１９９６）］（図１０Ｃ）。Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの特異的ＲＴ－ＰＣＲ研究におけるこれらの約１０００ｂｐｓのバンドが、スプライシングされていないメッセージに由来するフラグメントを表したと仮定された。精製した約１０００ｂｐｓのフラグメントの配列決定からの結果（図１１）（配列番号１）は、実際に、イントロン（図１４）（配列番号４）を含むＯｃｔ４のエクソン３およびエクソン５（図１２）（配列番号２）ならびにＮａｎｏｇのエクソン２およびエクソン３（図１３）（配列番号３）を包含する報告された配列と一致した。それに対応して、癌細胞におけるマウスのスプライシングされていないＯｃｔ４前駆体ｍＲＮＡの存在は、以前の報告［Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３３：５４６８（２０１８）］においてＯｃｔ４と指定された。
【0090】
【0091】
ＥＦ細胞をＭβＣＤで処理し、ペトリ皿で培養した。実験の開始後１日目、４日目および７日目の顕微鏡形態学的観察をＡに示した。全ＲＮＡを上に列記した時点で抽出した。各ＰＩ遺伝子についてのメッセージを図１に記載されるように分析し、Ｂに示した。
【0092】
驚いたことに、コレステロール枯渇後２４時間以内にスプライシングされていないメッセージを検出した。スプライシングされたメッセージは、７日間培養した細胞にのみ存在した。結果は、１）コレステロール枯渇が、２４時間以内にＰＩ遺伝子前駆体転写を活性化したこと、２）スプライシングされたメッセージの発現が、４日後であるが、７日前に開始されること、および３）軟質ヒドロゲルが、ＰＩ遺伝子の前駆体メッセージのスプライシングを防止したことを示唆した。したがって、細胞外マトリックスの柔軟性は、体細胞におけるＰＩ遺伝子の活性化およびスプライシングメカニズムを大きく制御した。
【0093】
新規表現型の細胞の分化がそれらのＰＩ遺伝子活性化多能性幹細胞様細胞からの継続的な培養で続くかを調べるため、細胞を長期間培養した。１４日以内に、ゲル上のほとんどの球体は、丸い細胞のクラスターに溶解した（図９Ｂ）。同時に、細胞のヒドロゲルへの付着は弱くなり、細胞が、ディッシュの底に放出されたように見えた。驚いたことに、１週間以内に培養ディッシュの底で特有の表現型細胞の分化が観察された。ＥＦ細胞研究において、ヒドロゲル付着細胞の増殖または形態学的変化は、ほとんど観察されなかった。したがって、結果は、ペトリ皿表面に播種された細胞およびアクリルアミドゲルからペトリ皿表面にこぼれた細胞が特有の表現型の細胞に分化したことを示唆した。ディッシュの底に現れた特有の表現型細胞の例を、図１７から図２７に示した。
【0094】
具体的には、ＥＦ細胞をＭβＣＤで処理し、３．２ｋｐａのヒドロゲルをキャストしたペトリ皿で培養した。ディッシュの底で分化した細胞を観察しながら写真撮影した。報告された異なる系統の細胞の表現型に基づいて、元のＥＦ細胞に特有の各細胞（図１６）は、写真の上に示すように暫定的に標識された。元のＥＦ細胞とは明らかに異なるが、特定の細胞型名を割り当てることができなかった細胞は、「分類されない」として標識された。パネルの白色バーは、１００μｍのサイズ参照を示す。
【0095】
細胞のクラスターは、未成熟脂肪細胞に類似しており、それらの細胞は、数日内に成熟脂肪細胞に変形した（図１７Ａ～図１７Ｂ）。それらの細胞は、脂質特異的色素、オイルレッドＯで陽染された（図１７Ｃ～図１７Ｅ）。
【0096】
【0097】
【0098】
【0099】
【0100】
多くの場合、皮質ニューロン様細胞（図１９Ａ）、星状細胞様細胞（図１９Ｂ）、ミクログリア様細胞（図１９Ｃ）およびオリゴデンドロサイト様細胞（図１９Ｄ）を含む神経細胞が１０日以内に観察された。円で接続された内皮細胞様細胞も、同じタイミングで観察された（図２０）。
【0101】
【0102】
【0103】
３週間後、充分に発達した神経細胞クラスター（図２２Ａ～図２２Ｃ）および独自に凝集した非分類の細胞クラスターが顕著になった（図２３）。充分に成熟した脂肪細胞塊も同様に明らかになった（図２４）。４週間後、筋芽細胞様細胞（図２５）、および腱細胞／前駆細胞様細胞が目立つようになった（図２６Ａ～図２６Ｂ）。また、培養の４週間後に、細胞の鎖が相互作用して微細構造を構築することも観察された（図２７Ａ～図２７Ｅ）。
【0104】
相互作用し、アラインメントを形成した細胞の５つの実施例を示した。
【0105】
したがって、結果は、ＥＦ細胞に由来する多能性幹細胞様細胞が、インビトロで種々の系統の細胞に活発に分化したことを示唆した。
【0106】
図９に記載されるように、３．２ｋｐａのアクリルアミドゲルの表面からトリプシン処理で球体を回収した。細胞を洗浄し、２４ウェル組織培養プレート中、ポリスチレン表面に再播種した。
【0107】
ヒドロゲル単独では、ＥＦにおいてＰＩ遺伝子を活性化して幹細胞様細胞を生成することができるが、効率は低く、リプログラムされ分化された細胞がペトリ皿の底面で増殖し始める前に、長いインキュベーション時間がかかる。
【0108】
ＭβＣＤのみの処理では、ヒドロゲルのみの場合より高い効率で１週間以内に幹細胞様細胞を誘導する。
【0109】
ＭβＣＤおよびヒドロゲルの併用処理では、結果として、ペトリ皿の底での分化した細胞の発生が最も高い効率となった。
【0110】
上記で提示された実施例は、本発明が、体細胞を、異なる機能を有する種々の表現型細胞に分化する機能を保持する多能性幹細胞様細胞にリプログラムすることができることを示唆した。発見は、ＭＳＡＩＣシグナルが、ＰＩ遺伝子発現を抑制し、ＭＳＡＩＣシグナルの阻害により、体細胞がＰＩ遺伝子を発現し、多能性を獲得することである。発見は、体細胞におけるＭＳＡＩＣシグナル伝達を減衰させる複数の方法：特異的阻害剤、ＧｓＭＴＸ４、軟質ポリアクリルアミドゲルおよびＭβＣＤを用いるコレステロール枯渇を教示した。すべての方法は、ＰＩ遺伝子を活性化することができ、体細胞をリプログラムすることができる。発見はまた、異なる方法の併用が体細胞のリプログラミングを増強することも教示した。発見は、多能性幹細胞様細胞の再分化が体細胞の大きなレパートリーを生成することも教示した。それらの分化した細胞はすべて、再生療法に有用であると期待されている。その中でも、例えば、骨細胞は、骨折を再構成するのに有用であり、神経細胞は、神経損傷および脳疾患、パーキンソン病およびアルツハイマー病を回復することが期待されている。これらの実施例に基づいて、本発明は、細胞再生を強化または抑制する疾患の処置の新規方法を提供することも予想される。本発明は、特定の種類の体細胞の存在の増強が望ましい、疾患の処置または予防のためのＰＳ様細胞および再分化した細胞の使用を広く包含するであろう。
【0111】
本発明が、上述した実施形態に限定されず、権利が、例示された実施形態および以下の特許請求の範囲の範囲内に入るすべての修正に保有されることが理解されるべきである。
【0112】
本明細書で引用されるジャーナル、特許、および他の刊行物への種々の参照は、最先端技術を含み、完全に記載されているかのように参照することにより組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-07-13
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】