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2023-505492ＴＮＦαおよびＩＬ－２３を標的化する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-09
(54)【発明の名称】ＴＮＦαおよびＩＬ－２３を標的化する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230202BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230202BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230202BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230202BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230202BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230202BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230202BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230202BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230202BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230202BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230202BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230202BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230202BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230202BHJP
C07K 16/24 20060101ALN20230202BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/46 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 N
A61P37/06
A61P29/00
A61P19/02
A61P17/06
A61P17/00 101
A61P1/04
C07K16/24
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022533410
(86)(22)【出願日】2020-12-03
(85)【翻訳文提出日】2022-07-21
(86)【国際出願番号】 EP2020084430
(87)【国際公開番号】W WO2021110816
(87)【国際公開日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】62/944,619
(32)【優先日】2019-12-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】20305056.2
(32)【優先日】2020-01-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20000090.9
(32)【優先日】2020-02-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20305216.2
(32)【優先日】2020-03-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517123807
【氏名又は名称】アブリンクス・エヌ・フェー
(71)【出願人】
【識別番号】504456798
【氏名又は名称】サノフイ
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】ハイディ・ロメラエレ
(72)【発明者】
【氏名】クリスティアン・アスブラント
(72)【発明者】
【氏名】アン・ブリジュ
(72)【発明者】
【氏名】ジーグリット・コルネリス
(72)【発明者】
【氏名】エリク・ローレン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA08
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4C085AA14
4C085BB17
4C085CC23
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本技術は、新規の種類の薬物を提供することを目的とする。特に、本技術は、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドであって、少なくとも１つのＩＳＶＤがＴＮＦαに結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤがＩＬ－２３に結合することを特徴とする、ポリペプチドを提供する。本技術はまた、核酸、ベクターおよび組成物を提供する。
【選択図】図１６
【選択図】図１６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
医薬としての使用のためのポリペプチド、該ポリペプチドを含む組成物、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、該ポリペプチドはＴＮＦαおよびＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合し、該ポリペプチドは少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含みまたはからなり、前記ＩＳＶＤの各々は、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、
前記使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【請求項2】
ａ）前期第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％より高い配列同一性を含み；ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％より高い配列同一性を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％より高い配列同一性を含む、
請求項１に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【請求項3】
ａ）前記第１のＩＳＶＤは配列番号２のアミノ酸配列からなり；ｂ）前記第２のＩＳＶＤは配列番号３のアミノ酸配列からなり；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは配列番号５のアミノ酸配列からなる、
請求項１または２に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【請求項4】
前記ポリペプチドは、ｉ．配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列または配列番号１６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤをさらに含む、
請求項１～３のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【請求項5】
ヒト血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％より高い配列同一性を含む、請求項４に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【請求項6】
該ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはからなる、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【請求項7】
自己免疫または炎症性疾患の処置における使用のための、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【請求項8】
自己免疫または炎症性疾患は、（クローン病または潰瘍性大腸炎のような）炎症性腸疾患、乾癬、乾癬性関節炎および化膿性汗腺炎から選択される、請求項７に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【請求項9】
ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含みまたはからなり、前記ＩＳＶＤの各々は、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、
前記ポリペプチド。
【請求項10】
ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％より高い配列同一性を含み；ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％より高い配列同一性を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％より高い配列同一性を含む、
請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項11】
ａ）前記第１のＩＳＶＤは配列番号２のアミノ酸配列からなり；ｂ）前記第２のＩＳＶＤは配列番号３のアミノ酸配列からなり；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは配列番号５のアミノ酸配列からなる、
請求項９または１０に記載のポリペプチド。
【請求項12】
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列または配列番号１６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤをさらに含む、
請求項９～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項13】
ヒト血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％より高い配列同一性を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項14】
配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはからなる、請求項９～１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項15】
請求項９～１４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項16】
請求項１５に記載の核酸を含む宿主または宿主細胞。
【請求項17】
請求項９～１４のいずれか１項に記載のポリペプチドを製造する方法であって、少なくとも、ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中または別の好適な発現系中で、請求項１５に記載の核酸を発現させる工程；場合によりこれに続いて：
ｂ）請求項９～１４のいずれか１項に記載のポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む、前記方法。
【請求項18】
少なくとも１つの請求項９～１４のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１５に記載の核酸を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１ 本技術の分野
本技術は、ＴＮＦαおよびＩＬ－２３のｐ１９サブユニットを標的化するポリペプチドに関する。本技術はまた、該ポリペプチドをコードする核酸分子および該核酸を含むベクター、ならびにこれらのポリペプチド、核酸またはベクターを含む組成物に関する。本技術はさらに、炎症性腸疾患、乾癬、乾癬性関節炎または化膿性汗腺炎を患う対象を処置する方法における使用のためのこれらの製造物に関する。さらに、本技術は、これらの製造物を製造する方法に関する。
本技術は、ＴＮＦαおよびＩＬ－２３のｐ１９サブユニットを標的化するポリペプチドに関する。本技術はまた、該ポリペプチドをコードする核酸分子および該核酸を含むベクター、ならびにこれらのポリペプチド、核酸またはベクターを含む組成物に関する。本技術はさらに、炎症性腸疾患、乾癬、乾癬性関節炎または化膿性汗腺炎を患う対象を処置する方法における使用のためのこれらの製造物に関する。さらに、本技術は、これらの製造物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
２ 技術的背景
自己免疫または炎症性疾患は、それ自身の組織に対して身体により生成される免疫応答の結果である。自己免疫または炎症性疾患は多くの場合に慢性であり、生命を脅かすものでさえあり得る。多くの中でも、自己免疫または炎症性疾患としては、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎ならびに化膿性汗腺炎が挙げられる。炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎は、腸炎症および随伴的な上皮傷害を伴う慢性炎症性疾患である。他の慢性自己免疫疾患、例えば乾癬、乾癬性関節炎および化膿性汗腺炎は、赤い、乾燥した、痒いまたは鱗状の皮膚の斑点、関節の有痛性の炎症または皮膚上の炎症して腫れた塊により特徴付けられる。乾癬を患う患者は、糖尿病および炎症性腸疾患、例えばクローン病または潰瘍性大腸炎、およびがんを含めて、ある特定の併存症を有する可能性がより高いことが見出されている。
自己免疫または炎症性疾患は、それ自身の組織に対して身体により生成される免疫応答の結果である。自己免疫または炎症性疾患は多くの場合に慢性であり、生命を脅かすものでさえあり得る。多くの中でも、自己免疫または炎症性疾患としては、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎ならびに化膿性汗腺炎が挙げられる。炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎は、腸炎症および随伴的な上皮傷害を伴う慢性炎症性疾患である。他の慢性自己免疫疾患、例えば乾癬、乾癬性関節炎および化膿性汗腺炎は、赤い、乾燥した、痒いまたは鱗状の皮膚の斑点、関節の有痛性の炎症または皮膚上の炎症して腫れた塊により特徴付けられる。乾癬を患う患者は、糖尿病および炎症性腸疾患、例えばクローン病または潰瘍性大腸炎、およびがんを含めて、ある特定の併存症を有する可能性がより高いことが見出されている。
【0003】
インターロイキン２３（ＩＬ－２３）は、慢性炎症の誘導の間の様々な免疫細胞の活性化において重要なサイトカインである。ＩＬ－２３は、サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１７、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－２２の上流調節因子であり、ｐ４０サブユニット（ｐ４０サブユニットはサイトカインＩＬ－１２と共有され、ＩＬ－１２ベータサブユニットとも呼ばれる）に共有結合的に連結したｐ１９サブユニット（本明細書においてＩＬ－２３ｐ１９と称されることもあるＩＬ－２３アルファサブユニット）からなるヘテロ二量体である。追加的に、ＩＬ－２３は、Ｔ細胞炎症性免疫応答の他に、自然リンパ球の炎症活性の調節において重要な役割を果たす。ＩＬ－２３は、炎症性腸疾患および他の自己免疫疾患を含む炎症性疾患と結び付けられている。
【0004】
腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、主に単球およびマクロファージにより産生されるが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔリンパ球により分泌されることも公知のホモ三量体サイトカインである。ＴＮＦαは、可溶性形態または膜貫通タンパク質として存在することができる。ＴＮＦαの主要な役割は免疫細胞の調節にある。ＴＮＦαは内因性パイロジェンとして作用し、その産生の調節異常は、炎症性腸疾患および他の自己免疫疾患、例えば乾癬を含む様々なヒト疾患に結び付けられている。
【0005】
ＦＤＡにより現在承認されている炎症性腸疾患に対する処置としては、抗ＴＮＦα生物学的製剤（例えばＳｉｍｐｏｎｉ（登録商標）［ゴリムマブ］、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）［エタネルセプト］、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）［インフリキシマブ］およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）［アダリムマブ］）が挙げられる。しかしながら、炎症性腸疾患に対する現行の抗ＴＮＦα処置は、大きいパーセンテージの患者が、現在利用可能な処置に対して非応答性であるということに直面しており、抗ＴＮＦα処置に対する応答の喪失が、１２か月の処置後の患者の高いパーセンテージにおいて起こる。
【0006】
乾癬および乾癬性関節炎について、患者の少数のみが、生物学的製剤（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）［インフリキシマブ］およびＨＵＭＩＲＡ（登録商標）［アダリムマブ］の他に、サイトカインＩＬ－１２およびＩＬ－２３の共有されたｐ４０サブユニットを標的化するＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）［ウステキヌマブ］を含む）で処置される。ＩＬ－２３を標的化するさらなる抗体処置が開発途上であり、これには、グセルクマブ（Ｔｒｅｍｆｙａ；乾癬において承認されており、炎症性腸疾患および乾癬性関節炎について臨床試験フェーズ３にある）ならびにリサンキズマブ（Ｓｋｙｒｉｚｉ；乾癬において承認されており、乾癬性関節炎およびクローン病について臨床試験フェーズ３にある）が含まれる。ｐ１９標的化抗ＩＬ－２３抗体のクラスは、乾癬における何らかの疾患抑制性の効能を付与し得るが、異なるおよび／または追加の自己免疫疾患を有する患者は、それらの処置から必ずしも同じ程度まで利益を得ない。例えば乾癬性関節炎において、抗ＩＬ２３での処置は、炎症した関節の応答を改善しない。炎症性腸疾患において、患者の半数より多くは、ＴＮＦ阻害剤に対して応答しないか、または応答を喪失する。同じことが化膿性汗腺炎に当てはまり、化膿性汗腺炎に対する唯一のこれまでに承認された処置はＨＵＭＩＲＡ（登録商標）［アダリムマブ］であるが、患者の約５０％しか応答しない。
【0007】
複数の疾患因子の標的化は、例えば、２つの別々の生物学的製剤、例えば異なる治療標的に結合する抗体の併用投与または組合せ使用により達成することができる。しかしながら、別々の生物学的製剤の併用投与または組合せ使用は、実際的観点および商業的観点の両方から、困難であり得る。例えば、別々の製造物の２つの注射は、患者にとってより不便かつより有痛性の処置レジームを結果としてもたらし、遵守に負に影響し得る。２つの別々の製造物の単一の注射に関して、両方の製造物の要求される濃度および好適な安定性で許容される粘度を可能とする製剤を提供することは困難または不可能であり得る。追加的に、併用投与および併用製剤は、２つの別々の薬物の製造を要求し、これは全体的なコストを増加させ得る。
【0008】
２つの異なる抗原に結合できる二特異性抗体は、別々の生物学的製剤、例えば抗体の併用投与または組合せ使用に関連するそのような制限に対処するための１つの戦略として示唆されている。
【0009】
二特異性抗体構築物が複数のフォーマットで提案されている。例えば、二特異性抗体フォーマットは、２つの抗体またはその断片の化学的共役を伴い得る（非特許文献１；非特許文献２）。ある特定のフォーマットで、特異的な抗原に結合する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片が、別々の抗原に結合するＩｇＧ抗体に連結される（例えば、抗ＴＮＦα／抗ＩＬ－２３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二特異性抗体を記載する特許文献１）。特許文献２は、重鎖および軽鎖可変領域の１つのペアがＴＮＦαを標的化し、重鎖および軽鎖可変領域の他のペアがＩＬ－２３を標的化するヘテロ二量体ＩｇＧ抗体を記載する。
【0010】
そのような二特異性抗体フォーマットの欠点としては、しかしながら、高濃度での高い粘度が挙げられ、これは例えば皮下投与を困難とし、また各結合単位は、特異的かつ高い親和性の結合のために２つの可変ドメインの相互作用を要求し、これはポリペプチド安定性および製造の効率に対する含意を含む。そのような二特異性抗体フォーマットはまた、軽鎖の誤対合または重鎖の誤対合に関する化学、製造および品質管理（ＣＭＣ）の問題に潜在的に繋がり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】ＷＯ２０１６／０７３４０６
【特許文献2】ＷＯ２０１９／０２７７８０
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５．２２９（４７０８）：第８１～８３頁
【非特許文献2】Ｇｌｅｎｎｉｅ， Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８７．１３９（７）：第２３６７～２３７５頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0013】
３ 本技術の要約
一部の実施形態において、本技術は、ＴＮＦαおよびＩＬ－２３を特異的に標的化するポリペプチドまたは構築物に関する。ＴＮＦαおよびＩＬ－２３を同時に標的化することは、単一特異性抗ＴＮＦαまたは抗ＩＬ－２３ポリペプチドと比較して炎症応答をモジュレートする効率の増加に繋がる。
一部の実施形態において、本技術は、ＴＮＦαおよびＩＬ－２３を特異的に標的化するポリペプチドまたは構築物に関する。ＴＮＦαおよびＩＬ－２３を同時に標的化することは、単一特異性抗ＴＮＦαまたは抗ＩＬ－２３ポリペプチドと比較して炎症応答をモジュレートする効率の増加に繋がる。
【0014】
ＴＮＦαおよびＩＬ－２３（例えばヒトおよびカニクイザルＴＮＦαおよびＩＬ－２３）に対して非常に強力であることが示された上記ポリペプチドは、（例えば微生物宿主、例えばピキア属、例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において）効率的に製造することができ、高い濃度で低い粘度を示したが、これは皮下投与のために有利かつ好都合である。さらには、そのようなポリペプチドは、処置されるべき対象における既存の抗体（すなわち抗体構築物での最初の処置の前に対象中に存在する抗体）に対して制限された反応性を有することを示すことができた。他の実施形態において、そのようなポリペプチドは、処置されるべき対象において連続する処置を好都合に間隔を空けることができるように十分に長い半減期を呈する。
【0015】
本技術のポリペプチドは、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含みまたはからなり、少なくとも１つのＩＳＶＤはＴＮＦαに特異的に結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤはＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する。１つの実施形態において、ＴＮＦαに結合する少なくとも１つのＩＳＶＤはヒトＴＮＦαに特異的に結合し、ＩＬ－２３に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤはヒトＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する。
【0016】
１つの実施形態において、ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有しない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する。例えば、結合単位は、（ヒト）血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤであり得る。
【0017】
本技術のポリペプチドを発現する能力を有する核酸分子、該核酸を含むベクター、およびこれらのポリペプチド、核酸またはベクターを含む組成物もまた提供される。
【0018】
本技術のポリペプチド、該ポリペプチドを含む組成物、および該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物は、医薬として使用することができる。医薬としての使用のためのポリペプチドは、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含みまたはからなり、上記ＩＳＶＤの各々は、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤは、Ｎ末端から開始する順序である。
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤは、Ｎ末端から開始する順序である。
【0019】
本技術の組成物は、医薬としての使用のためのものである。組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含み、場合により１つまたはそれ以上のさらなる薬学的に活性のポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物であり得る。
【0020】
そのようなポリペプチド（場合により組成物中に存在するまたは場合により核酸によりコードされる）は、少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含みまたはからなり、上記ＩＳＶＤの各々は、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤは、Ｎ末端から開始する順序である。
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤは、Ｎ末端から開始する順序である。
【0021】
１つの実施形態において、ポリペプチドはＴＮＦαおよびＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する。１つの実施形態において、ポリペプチドはヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する。１つの実施形態において、ポリペプチド中に存在する第１のＩＳＶＤはＴＮＦαに特異的に結合し、ポリペプチド中に存在する第２および第３のＩＳＶＤはＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する。１つの実施形態において、ポリペプチド中に存在する第１のＩＳＶＤはヒトＴＮＦαに特異的に結合し、ポリペプチド中に存在する第２および第３のＩＳＶＤはヒトＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する。
【0022】
本技術のポリペプチドは：
ａ）配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む第１のＩＳＶＤ；
ｂ）配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む第２のＩＳＶＤ；ならびに
ｃ）配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む第３のＩＳＶＤ
を含んでもよい。
ａ）配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む第１のＩＳＶＤ；
ｂ）配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む第２のＩＳＶＤ；ならびに
ｃ）配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む第３のＩＳＶＤ
を含んでもよい。
【0023】
本技術のポリペプチドは：
ａ）配列番号２と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含むアミノ酸配列を有する第１のＩＳＶＤ；
ｂ）配列番号３と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含むアミノ酸配列を有する第２のＩＳＶＤ；および
ｃ）配列番号５と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含むアミノ酸配列を有する第３のＩＳＶＤ
を含んでもよい。
ａ）配列番号２と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含むアミノ酸配列を有する第１のＩＳＶＤ；
ｂ）配列番号３と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含むアミノ酸配列を有する第２のＩＳＶＤ；および
ｃ）配列番号５と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含むアミノ酸配列を有する第３のＩＳＶＤ
を含んでもよい。
【0024】
本技術のポリペプチドは：
ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む第１のＩＳＶＤ；
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２のＩＳＶＤ；および
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第３のＩＳＶＤ
を含んでもよい。
ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む第１のＩＳＶＤ；
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２のＩＳＶＤ；および
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第３のＩＳＶＤ
を含んでもよい。
【0025】
本技術のポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含んでもよく、上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有しない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する。増加した半減期を有するポリペプチドを提供する上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小さいタンパク質またはペプチドからなる群から選択することができる。増加した半減期を有するポリペプチドを提供する結合単位は、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）または血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）、例えばヒト血清アルブミンに結合することができる結合単位からなる群から選択することができる。
【0026】
本技術のポリペプチドは：
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列または配列番号１６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含んでもよい。
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列または配列番号１６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含んでもよい。
【0027】
１つの実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。１つの実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号４と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含む。１つの実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはからなる。
【0028】
ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、本技術のポリペプチド中の任意の位置（すなわちＮ末端、２つのビルディングブロックの間、またはＣ末端）に配置することができる。１つの実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する第２および第３のＩＳＶＤの間に配置される。
【0029】
本技術のポリペプチドは、配列番号１と９０％より高い（例えば９５％）の配列同一性を含むアミノ酸配列を含んでもよい。１つの実施形態において、本技術のポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはからなる。
【0030】
本技術のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供される。
【0031】
そのような核酸を含む宿主または宿主細胞もまた提供される。
【0032】
本技術のポリペプチドを製造する方法もまた提供され、上記方法は、少なくとも：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中または別の好適な発現系中で、本技術のポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程；場合によりこれに続いて：
ｂ）ポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む。
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中または別の好適な発現系中で、本技術のポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程；場合によりこれに続いて：
ｂ）ポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む。
【0033】
少なくとも１つの本技術のポリペプチド、または本技術のポリペプチドをコードする核酸を含む組成物もまた提供される。組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含み、場合により１つまたはそれ以上のさらなる薬学的に活性のポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物であってもよい。
【0034】
本技術のポリペプチドは、処置において使用することができる。より特には、本技術のポリペプチドは、自己免疫または炎症性疾患、例えば炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎ならびに化膿性汗腺炎から選択される疾患の処置において使用することができる。
【0035】
よって、本技術はまた、自己免疫または炎症性疾患を処置する方法を包含する。一部の実施形態において、本技術は、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎ならびに化膿性汗腺炎から選択される疾患を処置する方法を包含し、上記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に活性の量の本技術のポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする核酸またはそれを含む組成物を投与することを含む。
【0036】
よって、本技術はまた、自己免疫または炎症性疾患を処置するための医薬組成物の製造における本技術のポリペプチドの使用を包含する。一部の実施形態において、本技術はまた、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎ならびに化膿性汗腺炎から選択される疾患を処置するための医薬組成物の製造における本技術のポリペプチドの使用を包含する。
【0037】
特に、本技術は以下の実施形態を提供する：
【0038】
実施形態１．医薬としての使用のための、ポリペプチド、該ポリペプチドを含む組成物、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、該ポリペプチドは少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含みまたはからなり、上記ＩＳＶＤの各々は、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｘ．配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｉ．配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｘｉｉｉ．配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｉｖ．配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｖ．配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｘｖｉ．配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｖｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｖｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤは、Ｎ末端から開始する順序である、
前記使用のためのポリペプチドまたは組成物。
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｘ．配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｉ．配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｘｉｉｉ．配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｉｖ．配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｖ．配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｘｖｉ．配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｖｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｖｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤは、Ｎ末端から開始する順序である、
前記使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0039】
実施形態２．少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含み、場合により１つまたはそれ以上のさらなる薬学的に活性のポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、実施形態１に記載の使用のための組成物。
【0040】
実施形態３．該ポリペプチドはＴＮＦαおよびＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する、実施形態１または２に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0041】
実施形態４．該ポリペプチドはヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0042】
実施形態５．第１のＩＳＶＤはＴＮＦαに特異的に結合し、第２および第３のＩＳＶＤはＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する、実施形態１～４のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0043】
実施形態６．第１のＩＳＶＤはヒトＴＮＦαに特異的に結合し、第２および第３のＩＳＶＤはヒトＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する、実施形態１～５のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0044】
実施形態７．ａ）上記第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）上記第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）上記第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
実施形態１～６のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
ｂ）上記第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）上記第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
実施形態１～６のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0045】
実施形態８．ａ）上記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含み；
ｂ）上記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含み；
ｃ）上記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含む、
実施形態１～７のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
ｂ）上記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含み；
ｃ）上記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含む、
実施形態１～７のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0046】
実施形態９．ａ）上記第１のＩＳＶＤは配列番号２のアミノ酸配列を含み；
ｂ）上記第２のＩＳＶＤは配列番号３のアミノ酸配列を含み；
ｃ）上記第３のＩＳＶＤは配列番号５のアミノ酸配列を含む、
実施形態１～８のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
ｂ）上記第２のＩＳＶＤは配列番号３のアミノ酸配列を含み；
ｃ）上記第３のＩＳＶＤは配列番号５のアミノ酸配列を含む、
実施形態１～８のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0047】
実施形態１０．上記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有しない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有する該ポリペプチドを提供する、実施形態１～９のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0048】
実施形態１１．増加した半減期を有する該ポリペプチドを提供する上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小さいタンパク質またはペプチドからなる群から選択される、実施形態１０に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0049】
実施形態１２．増加した半減期を有する該ポリペプチドを提供する上記結合単位は、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）または血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、実施形態１０または１１に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0050】
実施形態１３．増加した半減期を有する該ポリペプチドを提供する上記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、実施形態１２に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0051】
実施形態１４．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列または配列番号１６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、実施形態１３に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列または配列番号１６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、実施形態１３に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0052】
実施形態１５．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、実施形態１３または１４に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0053】
実施形態１６．ヒト血清アルブミンに結合する上記ＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含む、実施形態１３～１５のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0054】
実施形態１７．ヒト血清アルブミンに結合する上記ＩＳＶＤは配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはからなる、実施形態１３～１６のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0055】
実施形態１８．該ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0056】
実施形態１９．該ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはからなる、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0057】
実施形態２０．自己免疫疾患または炎症性疾患、例えば炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎ならびに化膿性汗腺炎から選択される疾患の処置における使用のための、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。
【0058】
実施形態２１．ポリペプチドであって、該ポリペプチドは少なくとも３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含みまたはからなり、上記ＩＳＶＤの各々は、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｘ．配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｉ．配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｘｉｉｉ．配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｉｖ．配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｖ．配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｘｖｉ．配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｖｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｖｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤは、Ｎ末端から開始する順序である、
前記ポリペプチド。
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｘ．配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｉ．配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｘｉｉｉ．配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｉｖ．配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｖ．配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｘｖｉ．配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｖｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｖｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤは、Ｎ末端から開始する順序である、
前記ポリペプチド。
【0059】
実施形態２２．ＴＮＦαおよびＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する、実施形態２１に記載のポリペプチド。
【0060】
実施形態２３．ヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する、実施形態２１または２２に記載のポリペプチド。
【0061】
実施形態２４．第１のＩＳＶＤはＴＮＦαに特異的に結合し、第２および第３のＩＳＶＤはＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する、実施形態２１～２３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0062】
実施形態２５．第１のＩＳＶＤはヒトＴＮＦαに特異的に結合し、第２および第３のＩＳＶＤはヒトＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する、実施形態２１～２４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0063】
実施形態２６．ａ）上記第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）上記第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）上記第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
実施形態２１～２５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
ｂ）上記第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）上記第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
実施形態２１～２５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0064】
実施形態２７．ａ）上記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含み；
ｂ）上記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含み；
ｃ）上記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含む、
実施形態２１～２６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
ｂ）上記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含み；
ｃ）上記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含む、
実施形態２１～２６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0065】
実施形態２８．ａ）上記第１のＩＳＶＤは配列番号２のアミノ酸配列を含み；
ｂ）上記第２のＩＳＶＤは配列番号３のアミノ酸配列を含み；
ｃ）上記第３のＩＳＶＤは配列番号５のアミノ酸配列を含む、
実施形態２１～２７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
ｂ）上記第２のＩＳＶＤは配列番号３のアミノ酸配列を含み；
ｃ）上記第３のＩＳＶＤは配列番号５のアミノ酸配列を含む、
実施形態２１～２７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0066】
実施形態２９．上記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有しない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有する該ポリペプチドを提供する、実施形態２１～２８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0067】
実施形態３０．増加した半減期を有する該ポリペプチドを提供する上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小さいタンパク質またはペプチドからなる群から選択される、実施形態２９に記載のポリペプチド。
【0068】
実施形態３１．増加した半減期を有する該ポリペプチドを提供する上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）または血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、実施形態２９または３０に記載のポリペプチド。
【0069】
実施形態３２．増加した半減期を有する該ポリペプチドを提供する上記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、実施形態３１に記載のポリペプチド。
【0070】
実施形態３３．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは：
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列または配列番号１６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、実施形態３２に記載のポリペプチド。
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列または配列番号１６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、実施形態３２に記載のポリペプチド。
【0071】
実施形態３４．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、実施形態３２または３３に記載のポリペプチド。
【0072】
実施形態３５．ヒト血清アルブミンに結合する上記ＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含む、実施形態３２～３４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0073】
実施形態３６．ヒト血清アルブミンに結合する上記ＩＳＶＤは配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはからなる、実施形態３２～３５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0074】
実施形態３７．該ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％より高い（例えば９５％）配列同一性を含む、実施形態２１～３６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0075】
実施形態３８．配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはからなる、実施形態２１～３７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【0076】
実施形態３９．実施形態２１～３８のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【0077】
実施形態４０．実施形態３９に記載の核酸を含む宿主または宿主細胞。
【0078】
実施形態４１．実施形態２１～３８のいずれか１つに記載のポリペプチドを製造する方法であって、少なくとも：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中または別の好適な発現系中で、実施形態３９に記載の核酸を発現させる工程；場合によりこれに続いて：
ｂ）実施形態２１～３８のいずれか１つに記載のポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む、前記方法。
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中または別の好適な発現系中で、実施形態３９に記載の核酸を発現させる工程；場合によりこれに続いて：
ｂ）実施形態２１～３８のいずれか１つに記載のポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む、前記方法。
【0079】
実施形態４２．少なくとも１つの実施形態２１～３８のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態３９に記載の核酸を含む、組成物。
【0080】
実施形態４３．少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含み、場合により１つまたはそれ以上のさらなる薬学的に活性のポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、実施形態４２に記載の組成物。
【0081】
実施形態４４．自己免疫疾患または炎症性疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、薬学的に活性の量の、実施形態２１～３８のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態４２または４３に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【0082】
実施形態４５．自己免疫疾患または炎症性疾患は、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎ならびに化膿性汗腺炎から選択される、実施形態４４に記載の方法。
【0083】
実施形態４５．自己免疫疾患または炎症性疾患を処置するための医薬組成物の製造における、実施形態２１～３８のいずれか１つに記載のポリペプチド、または実施形態４２もしくは４３に記載の組成物の使用。
【0084】
実施形態４６．自己免疫疾患または炎症性疾患は、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎ならびに化膿性汗腺炎から選択される、実施形態４５に記載のポリペプチドまたは組成物の使用。
【図面の簡単な説明】
【0085】
４ 図面の簡単な説明
【図1】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を介して捕捉されたＦ０２７５０００６９へのＴＮＦαおよびＩＬ－２３の同時の結合を示すセンサーグラム。
【図2】Ｇｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（商標） ＨＥＫ２９３＿ＮＦκＢ－ＮＬｕｃＰレポーターアッセイにおけるＦ０２７５０００６９および抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂによる可溶性ヒト（Ａ）およびカニクイザル（Ｂ）ＴＮＦαの阻害。ＩＲＲ０００９６は陰性対照ＶＨＨである。データ点は全体の平均値（ｎ＝２）であり、エラーバーは＋／－ＳＤを表す。
【図3】Ｇｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（商標） ＨＥＫ２９３＿ヒトＩＬ－２３Ｒ／ＩＬ－１２Ｒｂ１－Ｌｕｃ２ＰレポーターアッセイにおけるＦ０２７５０００６９、抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ１、抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ２を使用したヒト（Ａ）およびカニクイザル（Ｂ）ＩＬ－２３の阻害。ＩＲＲ０００９６は陰性対照ＶＨＨである。データ点は全体の平均値（ｎ＝２）であり、エラーバーは＋／－ＳＤを表す。
【図4】対照Ｆ０２７３０１０９９と比較したＦ０２７５０００６９に対する９６のヒト血清試料中に存在する既存の抗体の結合を示すボックスプロット。
【図5】対照ポリペプチドＦ０２７３０１０９９およびＦ０２７３０１１８６と比較したＦ０２７５０００６９、Ｆ０２７５０００９３、Ｆ０２７５０００９５およびＦ０２７５０００９６に対する９６のヒト血清試料中に存在する既存の抗体の結合を示すボックスプロット。
【図6】Ｔｇ１９７ヒトＴＮＦトランスジェニックマウスモデルにおける多発性関節炎の阻害。異なる処置群（ｎ＝８マウス／群）における経時的な関節炎スコアをプロットしている。６週齢に開始して、週に２回の指し示される化合物の腹腔内注射を動物に与えた。平均の週毎の関節炎スコア±ＳＥＭを示す。統計は二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。
【図7】Ｔｇ１９７マウスモデルにおける経時的な関節炎スコアの曲線下面積の棒グラフ。個々の値（記号）および平均±ＳＥＭ（バー）を示す。統計は一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。
【図8】Ｔｇ１９７マウスモデルの足の組織学スコアの棒グラフ。個々の値（記号）および平均±ＳＥＭ（バー）を示す。統計は一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。
【図9】ヒトＩＬ－２３モデルにおける皮膚炎症の阻害。棒グラフは異なる処置群（ｎ＝１０マウス／群）の耳皮膚腫脹を示す。１～４日目に組換えヒトＩＬ－２３またはＰＢＳの１日毎の皮内注射を動物に与えた。１および３日目に指し示される化合物の腹腔内注射を動物に与えた。５日目におけるベースラインからの耳皮膚厚平均変化±ＳＥＭを示す。統計はＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。
【図10】ヒトＩＬ－２３誘導性皮膚炎症モデルの５日目における皮膚生検からの組織ＩＬ－２２濃度の棒グラフ。個々の値（記号）および平均±ＳＥＭ（バー）を示す。統計はＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。
【図11】腹腔内経路および皮下経路の両方により投与されたＦ０２７５０００６９による皮膚炎症の阻害。棒グラフは異なる処置群（ｎ＝８マウス／群）の耳皮膚腫脹を示す。１～４日目に組換えヒトＩＬ－２３またはＰＢＳの１日毎の皮内注射を動物に与えた。指し示される用量の腹腔内（ＩＰ）または皮下（ＳＣ）注射を１および３日目に投与した。５日目におけるベースラインからの耳皮膚厚平均変化±ＳＥＭを示す。統計はＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。
【図12】腹腔内経路および皮下経路の両方により送達されたＦ０２７５０００６９での５日目における皮膚生検からの組織ＩＬ－２２濃度の棒グラフ。個々の値（記号）および平均±ＳＥＭ（バー）を示す。統計はＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。
【図13】ヒトＴＮＦα／ＴＮＦＲ１ノックインマウスにおけるコラーゲン抗体誘導性関節炎（ＣＡＩＡ）モデルにおける関節炎スコアの抑制。異なる処置群（ｎ＝８マウス／群）における経時的な関節炎スコアを示す。１日目にＬＰＳ注射の６時間後に指し示される化合物の単回の腹腔内注射を動物に与えた。平均の１日毎の関節炎スコア±ＳＥＭを示す。統計は二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。
【図14】ＩＬ－２３およびＴＮＦαの二重阻害は、ヒトＴＮＦαノックインマウス（ｎ＝４～１０マウス／群）において行われたヒトＩＬ－２３皮膚注射モデルにおいて炎症を誘導した。１～４日目に組換えヒトＩＬ－２３またはＰＢＳの１日毎の皮内注射を動物に与えた。１および３日目に指し示される化合物の腹腔内注射。５日目におけるベースラインからの耳皮膚厚平均変化±ＳＥＭを示す。統計はＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定である。
【図15】サイトカインの一または二特異性阻害後の炎症した皮膚組織における差次的な皮膚組織遺伝子発現。差次的に発現された遺伝子（ＤＥＧ、ｐ＜０．００１で倍数変化＞２）のベン図。Ｆ０２７５０００６９において全７６９個のＤＥＧのうちの１９９個はこの処置に対して特異的であった。
【図16】ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７５０００６９の図式的な表現であり、Ｎ末端からＣ末端へと、９ＧＳリンカーを介して接続された、一価ビルディングブロック／ＩＳＶＤ ６Ｃ１１、１１９Ａ０３／１、ＡＬＢ２３００２、および８１Ａ１２を示す。
【発明を実施するための形態】
【0086】
５ 本技術の詳細な説明
本技術は、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎または化膿性汗腺炎を処置するための新規の種類の薬物を提供することを目的とする。
本技術は、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎または化膿性汗腺炎を処置するための新規の種類の薬物を提供することを目的とする。
【0087】
本発明者らは、驚くべきことに、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであって、少なくとも１つのＩＳＶＤはＴＮＦαに特異的に結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤはＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する、ポリペプチドは、単一特異性抗ＴＮＦαまたは抗ＩＬ－２３ｐ１９ポリペプチドと比較して自己免疫または炎症性疾患のより効率的な処置のために使用することができることを見出した。
【0088】
一部の実施形態において、本技術のポリペプチドは、ＴＮＦαおよびＩＬ－２３（例えばヒトまたはカニクイザルＴＮＦαおよびＩＬ－２３）に対して高い効力を示す。一部の実施形態において、本技術のポリペプチドは（例えば微生物宿主、例えばピキア属、例えばＰ．パストリスにおいて）効率的に製造される。一部の実施形態において、本技術のポリペプチドは高い濃度で低い粘度を有し、これは皮下投与のために有利かつ好都合である。さらには、一部の実施形態において、本技術のポリペプチドは、処置されるべき対象における既存の抗体（すなわち抗体構築物での最初の処置の前に対象中に存在する抗体）に対して制限された反応性を有する。他の実施形態において、そのようなポリペプチドは、処置されるべき対象において連続する処置を好都合に間隔を空けることができるように十分に長い半減期を呈する。
【0089】
ポリペプチドは少なくとも二特異性であるが、例えば三特異性、四特異性または五特異性でもあり得る。さらに、ポリペプチドは少なくとも三価であるが、例えば四価または五価でもあり得る。
【0090】
「二特異性」、「三特異性」、「四特異性」または「五特異性」という用語は全て、「多特異性」という用語に含まれ、それぞれ２、３、４または５つの異なる標的分子に結合することを指す。「二価」、「三価」、「四価」または「五価」という用語は全て、「多価」という用語に含まれ、それぞれ２、３、４または５つの結合単位（例えばＩＳＶＤ）の存在を指し示す。例えば、ポリペプチドは三特異性－四価であってもよく、例えばポリペプチドは４つのＩＳＶＤを含みまたはからなり、１つのＩＳＶＤはヒトＴＮＦαに結合し、２つのＩＳＶＤはヒトＩＬ－２３に結合し、１つのＩＳＶＤはヒト血清アルブミンに結合する。そのようなポリペプチドは、例えば２つのＩＳＶＤがＩＬ－２３のｐ１９サブユニット上の２つの異なるエピトープに結合する場合に、同時に二重パラトープ性であってもよい。「二重パラトープ性」という用語は、同じ標的分子の２つの異なる部分（すなわち、エピトープ）に結合することを指す。
【0091】
「第１のＩＳＶＤ」、「第２のＩＳＶＤ」、「第３のＩＳＶＤ」などの用語は、本明細書において使用される場合、互いに対するＩＳＶＤの相対的な位置を指し示すに過ぎず、ナンバリングは本技術のポリペプチドのＮ末端から開始される。「第１のＩＳＶＤ」はそのため、「第２のＩＳＶＤ」よりもＮ末端に近い一方、「第２のＩＳＶＤ」は「第３のＩＳＶＤ」よりもＮ末端に近い、などである。よって、ＩＳＶＤの並びは、Ｃ末端から考慮された場合に反対である。ナンバリングは絶対的なものではなく、少なくとも３つのＩＳＶＤの相対的な位置を指し示すに過ぎないため、他の結合単位／ビルディングブロック、例えばＴＮＦαもしくはＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに結合する追加のＩＳＶＤ、または別の標的に結合するＩＳＶＤがポリペプチド中に存在し得ることは除外されない。さらに、それは、他の結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤが間に位置し得る可能性を除外しない。例えば、以下にさらに記載されるように（特に、セクション５．３「（インビボ）半減期の延長」を参照）、ポリペプチドは、例えば、「第２のＩＳＶＤ」および「第３のＩＳＶＤ」の間に位置することさえ可能な、ヒト血清アルブミンに結合する別のＩＳＶＤをさらに含み得る。
【0092】
上記に照らして、本技術は、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むまたはからなるポリペプチドであって、少なくとも１つのＩＳＶＤはＴＮＦαに特異的に結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤはＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する、ポリペプチドを提供する。
【0093】
ＩＬ－２３に特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに結合する。ＩＬ－２３に特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤはＩＬ－２３のｐ１９サブユニット上の異なるエピトープに結合してもよい。ＩＬ－２３に特異的に結合するＩＳＶＤのうちの少なくとも１つは、ＩＬ－２３の機能を遮断する能力、例えばＩＬ－２３およびＩＬ－２３Ｒの間の相互作用を遮断する能力ならびに／またはＩＬ－２２のＩＬ－２３誘導性放出を阻害する能力を有してもよい。
【0094】
ポリペプチドの構成要素、例えばＩＳＶＤは、１つまたはそれ以上の好適なリンカー、例えばペプチド性リンカーにより、互いに連結することができる。
【0095】
２つまたはそれ以上の（ポリ）ペプチドを接続するためのリンカーの使用は当該技術分野において周知である。例示的なペプチド性リンカーは表Ａ－５に示される。１つの多くの場合に使用されるペプチド性リンカーのクラスは「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」または「ＧＳ」リンカーとして公知である。これらは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）残基から本質的になり、通常、ペプチドモチーフ、例えばＧＧＧＧＳ（配列番号４７）モチーフの１つまたはそれ以上の反復を含む（例えば、式（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを有し、ｎは、１、２、３、４、５、６、７またはより大きくてもよい）リンカーである。一部の多くの場合に使用されるそのようなＧＳリンカーの例は、９ＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号５０）、１５ＧＳリンカー（ｎ＝３；配列番号５２）および３５ＧＳリンカー（ｎ＝７；配列番号５７）である。例えば、Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔ １５； ６５（１０）：第１３５７～１３６９頁；およびＫｌｅｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１４） ２７ （１０）：第３２５～３３０頁を参照。本技術のポリペプチドの１つの実施形態において、ポリペプチドの構成要素を互いに連結するために９ＧＳリンカーが使用される。
【0096】
１つの実施形態において、ＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤはポリペプチドのＮ末端に配置される。本発明者らは、驚くべきことに、そのような構成は、ポリペプチドの製造収率を増加させ得ることを見出した。
【0097】
また、実施形態において、ＩＬ－２３に特異的に結合するＩＳＶＤのうちの１つはポリペプチドのＣ末端に配置される。
【0098】
よって、ポリペプチドは、以下を、ポリペプチドのＮ末端から開始する順序で含むまたはからなる：ＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤ、ＩＬ－２３の機能を遮断し得るＩＬ－２３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、本明細書において定義されるような増加した半減期を有するポリペプチドを提供する場合による結合単位、およびＩＬ－２３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤ。１つの実施形態において、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する結合単位はＩＳＶＤである。
【0099】
１つの実施形態において、ポリペプチドは、以下を、ポリペプチドのＮ末端から開始する順序で含むまたはからなる：ＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤ、リンカー、ＩＬ－２３の機能を遮断し得るＩＬ－２３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、リンカー、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ、リンカー、およびＩＬ－２３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤ。１つの態様において、各リンカーは９ＧＳリンカーである。
【0100】
ポリペプチドのそのような構成は、製造収率の増加、ならびに発現収率、粘度および他の生物物理学的特性を含めて、良好なＣＭＣの特徴を提供し得る。
【0101】
１つの実施形態において、本技術のポリペプチドは、ヒト血清中の既存の抗体による低減された結合を呈する。この目的のために、１つの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中の（Ｋａｂａｔのナンバリングにしたがって）アミノ酸位置１１におけるバリン（Ｖ）およびアミノ酸位置８９におけるロイシン（Ｌ）を含む。１つの実施形態において、ポリペプチドは、各ＩＳＶＤ中の（Ｋａｂａｔのナンバリングにしたがって）アミノ酸位置１１におけるバリン（Ｖ）およびアミノ酸位置８９におけるロイシン（Ｌ）を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、Ｃ末端ＩＳＶＤのＣ末端における、１～５個の（天然に存在する）アミノ酸の伸長、例えば単一アラニン（Ａ）伸長を含む。ＩＳＶＤのＣ末端は通常ＶＴＶＳＳ（配列番号１１２）である。別の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中の（Ｋａｂａｔのナンバリングにしたがって）位置１１０におけるリジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）を含む。別の実施形態において、ＩＳＶＤは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中の（Ｋａｂａｔのナンバリングにしたがって）位置１１２におけるリジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）を含む。これらの実施形態において、ＩＳＶＤのＣ末端は、ＶＫＶＳＳ（配列番号１１３）、ＶＱＶＳＳ（配列番号１１４）、ＶＴＶＫＳ（配列番号１４６）、ＶＴＶＱＳ（配列番号１４７）、ＶＫＶＫＳ（配列番号１４８）、ＶＫＶＱＳ（配列番号１４９）、ＶＱＶＫＳ（配列番号１５０）、またはＶＱＶＱＳ（配列番号１５１）であり、その結果、単一のアラニンの付加後に、ポリペプチドのＣ末端は、例えば、配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号１１５）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号１１６）、ＶＱＶＳＳＡ（配列番号１１７）、ＶＴＶＫＳＡ（配列番号１５２）、ＶＴＶＱＳＡ（配列番号１５３）、ＶＫＶＫＳＡ（配列番号１５４）、ＶＫＶＱＳＡ（配列番号１５５）、ＶＱＶＫＳＡ（配列番号１５６）、またはＶＱＶＱＳＡ（配列番号１５７）を含む。１つの実施形態において、Ｃ末端はＶＫＶＳＳＡ（配列番号１１６）を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、各ＩＳＶＤ中の（Ｋａｂａｔのナンバリングにしたがって）アミノ酸位置１１におけるバリン（Ｖ）およびアミノ酸位置８９におけるロイシン（Ｌ）、場合により少なくとも１つのＩＳＶＤ中の（Ｋａｂａｔのナンバリングにしたがって）位置１１０におけるリジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）を含み、Ｃ末端ＩＳＶＤのＣ末端における、１～５個の（天然に存在する）アミノ酸の伸長、例えば単一アラニン（Ａ）伸長を含み、その結果、ポリペプチドのＣ末端は、例えば、配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号１１５）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号１１６）またはＶＱＶＳＳＡ（配列番号１１７）、例えばＶＫＶＳＳＡ（配列番号１１６）を含む。これに関するさらなる情報について、例えばＷＯ２０１２／１７５７４１およびＷＯ２０１５／１７３３２５を参照。
【0102】
別の実施形態において、本技術のポリペプチドは、配列番号１と９０％より高い、例えば９５％より高いまたは９９％より高い、配列同一性を含むアミノ酸配列を含みまたはからなり、４つのＩＳＶＤのＣＤＲは、それぞれ以下のセクション「５．１ 免疫グロブリン単一可変ドメイン」および「５．３ （インビボ）半減期の延長」において記載される項目Ａ～Ｄ（またはＫａｂａｔ定義を使用する場合はＡ’～Ｄ’）において定義される通りであり、特に：
・ＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
または代替的にＫａｂａｔ定義を使用する場合：
・ＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号１２２のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号１２３のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号１２５のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号１２４のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４０のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。
・ＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
または代替的にＫａｂａｔ定義を使用する場合：
・ＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号１２２のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号１２３のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号１２５のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
・ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号１２４のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４０のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。
【0103】
別の実施形態において、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはからなる。別の実施形態において、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【0104】
１つの実施形態において、本技術のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較してヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ－２３に対する少なくとも半分の結合親和性、または少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、同じ方法、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定される。
【0105】
５．１ 免疫グロブリン単一可変ドメイン
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（ＩＳＶＤ）という用語は、「単一可変ドメイン」と交換可能に使用され、抗原結合性部位が単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、単一の免疫グロブリンドメインにより形成される、免疫グロブリン分子を定義する。これは、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合性部位を形成する「従来の」免疫グロブリン（例えばモノクローナル抗体）またはそれらの断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ジ－ｓｃＦｖ）からＩＳＶＤを隔てる。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して抗原結合性部位を形成する。この場合、ＶＨおよびＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合性部位に寄与し、すなわち、全部で６個のＣＤＲが抗原結合性部位の形成に関与する。
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（ＩＳＶＤ）という用語は、「単一可変ドメイン」と交換可能に使用され、抗原結合性部位が単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、単一の免疫グロブリンドメインにより形成される、免疫グロブリン分子を定義する。これは、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合性部位を形成する「従来の」免疫グロブリン（例えばモノクローナル抗体）またはそれらの断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ジ－ｓｃＦｖ）からＩＳＶＤを隔てる。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して抗原結合性部位を形成する。この場合、ＶＨおよびＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合性部位に寄与し、すなわち、全部で６個のＣＤＲが抗原結合性部位の形成に関与する。
【0106】
上記の定義を考慮して、従来の４鎖抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥ分子；当該技術分野において公知）の、またはそのような従来の４鎖抗体に由来するＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、例えばジスルフィド連結ＦｖもしくはｓｃＦｖ断片、もしくはダイアボディ（全て当該技術分野において公知）の抗原結合性ドメインは、通常、ＩＳＶＤとはみなされず、これらの場合には、抗原の各々のエピトープへの結合は、１つの単一の免疫グロブリンドメインによっては通常起こらず、会合する免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖および重鎖可変ドメインのペアにより起こり、すなわち、一緒になって各々の抗原のエピトープに結合する免疫グロブリンドメインのＶＨ－ＶＬペアにより起こる。
【0107】
対照的に、ＩＳＶＤは、追加の免疫グロブリン可変ドメインと対合することなく抗原のエピトープに特異的に結合する能力を有する。ＩＳＶＤの結合性部位は、単一のＶＨ、単一のＶＨＨまたは単一のＶＬドメインにより形成される。
【0108】
そのため、ＩＳＶＤは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）もしくはその好適な断片；または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列もしくはＶＨＨ配列）もしくはその好適な断片であってもよく；但し、それは、単一の抗原結合単位；すなわち、ＩＳＶＤから本質的になる機能的な抗原結合単位を形成する能力を有し、その結果、単一の抗原結合性ドメインは、機能的な抗原結合単位を形成するために別の可変ドメインと相互作用する必要はない。
【0109】
ＩＳＶＤは、例えば、重鎖ＩＳＶＤ、例えば、ラクダ化ＶＨまたはヒト化ＶＨＨを含む、ＶＨ、ＶＨＨであり得る。１つの実施形態において、それは、ラクダ化ＶＨまたはヒト化ＶＨＨを含む、ＶＨＨである。重鎖ＩＳＶＤは、従来の４鎖抗体または重鎖抗体に由来し得る。
【0110】
例えば、ＩＳＶＤは、単一ドメイン抗体（もしくは単一ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」もしくはｄＡｂ（もしくはｄＡｂとしての使用のために好適なアミノ酸配列）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（本明細書において定義される通りであり、ＶＨＨが挙げられるがそれに限定されない）；他の単一可変ドメイン、またはこれらの任意の１つの任意の好適な断片であってもよい。
【0111】
特に、ＩＳＶＤは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（例えば、ヒト化ＶＨＨもしくはラクダ化ＶＨを含む、ＶＨＨ）またはその好適な断片であってもよい。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）およびＮａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）は登録商標である。
【0112】
ＶＨＨ、ＶＨＨ抗体断片、およびＶＨＨ抗体としても公知の「ＶＨＨドメイン」は、「重鎖抗体」の；すなわち「軽鎖を欠いた抗体」の抗原結合性免疫グロブリン可変ドメインとして元々は記載された。Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：第４４６～４４８頁、１９９３を参照。「ＶＨＨドメイン」という用語は、本明細書において「ＶＨドメイン」と称される従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメインから、および本明細書において「ＶＬドメイン」と称される従来の４鎖抗体中に存在する軽鎖可変ドメインからこれらの可変ドメインを区別するために選択された。ＶＨＨのさらなる説明について、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによる総説論文（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：第２７７～３０２頁、２００１）を参照。
【0113】
典型的には、免疫グロブリンの生成は、実験動物の免疫化、ハイブリドーマを作出するための免疫グロブリン産生細胞の融合および所望の特異性についてのスクリーニングを伴う。代替的に、免疫グロブリンは、例えばファージディスプレイによる、ナイーブ、免疫または合成ライブラリーのスクリーニングにより生成することができる。
【0114】
免疫グロブリン配列、例えばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の生成は様々な刊行物において大規模に記載されており、その中でもＷＯ９４／０４６７８、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３（Ｎａｔｕｒｅ ３６３：第４４６～４４８頁、１９９３）およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：第２７７～３０２頁、２００１）を例示することができる。これらの方法において、ラクダ科動物が、標的抗原に対する免疫応答を誘導するために上記標的抗原で免疫化される。上記免疫化から得られるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）のレパートリーは、標的抗原に結合するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）についてさらにスクリーニングされる。
【0115】
これらの事例において、抗体の生成は、免疫化および／またはスクリーニングのために精製された抗原を要求する。抗原は、天然の供給源から、または組換え製造の過程で精製することができる。
【0116】
免疫グロブリン配列についての免疫化および／またはスクリーニングは、そのような抗原のペプチド断片を使用して行うことができる。
【0117】
本技術は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒトおよびラクダ科動物免疫グロブリン配列を含む、異なる起源の免疫グロブリン配列を使用してもよい。本技術はまた、完全ヒト、ヒト化またはキメラ配列を含む。例えば、本技術は、ラクダ科動物免疫グロブリン配列およびヒト化ラクダ科動物免疫グロブリン配列、またはラクダ化ドメイン抗体、例えばＷａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ ３４１： ５４４、１９８９）に記載されるようなラクダ化ｄＡｂを含む（例えばＷＯ９４／０４６７８ならびにＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．、３３９：第２８５～２９０頁、１９９４およびＰｒｏｔ．Ｅｎｇ．、９：第５３１～５３７頁、１９９６を参照）。さらに、本技術はまた、例えば多価および／または多特異性構築物を形成する、融合した免疫グロブリン配列（１つまたはそれ以上のＶＨＨドメインを含有する多価および多特異性ポリペプチドおよびそれらの製造について、Ｃｏｎｒａｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７６巻、１０．第７３４６～７３５０頁、２００１の他に、例えばＷＯ９６／３４１０３およびＷＯ９９／２３２２１も参照）、ならびに、本技術の免疫グロブリン配列から誘導可能な、タグまたは他の機能的部分、例えば毒素、標識、放射性化学物質などを含む免疫グロブリン配列を使用する。
【0118】
「ヒト化ＶＨＨ」は、天然に存在するＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化」、すなわち、上記天然に存在するＶＨＨ配列（特にフレームワーク配列）のアミノ酸配列中の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、（例えば上記に指し示される）ヒトからの従来の４鎖抗体からのＶＨドメイン中の対応する位置において起こるアミノ酸残基の１つまたはそれ以上により置き換えることにより「ヒト化」された、アミノ酸配列を含む。これは、それ自体公知の方式で行うことができ、例えば本明細書中のさらなる記載および先行技術（例えばＷＯ２００８／０２００７９）に基づいて、当業者に明らかであろう。さらに、そのようなヒト化ＶＨＨは、それ自体公知の任意の好適な方式で得ることができ、そのため、天然に存在するＶＨＨドメインを含むポリペプチドを出発材料として使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されないことが留意されるべきである。
【0119】
「ラクダ化ＶＨ」は、天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ化」、すなわち、従来の４鎖抗体からの天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメイン中の対応する位置において起こるアミノ酸残基の１つまたはそれ以上により置き換えることにより「ラクダ化」された、アミノ酸配列を含む。これは、それ自体公知の方式で行うことができ、例えば本明細書中のさらなる記載および先行技術（例えばＷＯ２００８／０２００７９）に基づいて、当業者に明らかであろう。そのような「ラクダ化」置換は、通常、ＶＨ－ＶＬインターフェースを形成しかつ／もしくはそこに存在するアミノ酸位置において、ならびに／または、本明細書において定義されるような、いわゆるラクダ科ホールマーク残基において挿入される（例えばＷＯ９４／０４６７８ならびにＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９４および１９９６、上掲を参照）。１つの実施形態において、ラクダ化ＶＨを生成または設計するための出発材料または出発点として使用されるＶＨ配列は、哺乳動物からのＶＨ配列、またはヒトのＶＨ配列、例えばＶＨ３配列である。しかしながら、そのようなラクダ化ＶＨは、それ自体公知の任意の好適な方式で得ることができ、そのため、天然に存在するＶＨドメインを含むポリペプチドを出発材料として使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されないことが留意されるべきである。
【0120】
ＩＳＶＤ配列の構造は、当該技術分野および本明細書においてそれぞれ「フレームワーク領域１」（「ＦＲ１」）；「フレームワーク領域２」（「ＦＲ２」）；「フレームワーク領域３」（「ＦＲ３」）；および「フレームワーク領域４」（「ＦＲ４」）と称される４つのフレームワーク領域（「ＦＲ」）から構成されると考えることができ；これらのフレームワーク領域は、当該技術分野および本明細書においてそれぞれ「相補性決定領域１」（「ＣＤＲ１」）；「相補性決定領域２」（「ＣＤＲ２」）；および「相補性決定領域３」（「ＣＤＲ３」）と称される３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を差し挟まれている。
【0121】
ＷＯ０８／０２００７９の第５８および５９頁のパラグラフｑ）においてさらに記載されるように、ＩＳＶＤのアミノ酸残基は、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２０００の論文（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４０（１－２）：第１８５～１９５頁；例えばこの文献の図２を参照）におけるラクダ科動物からのＶＨＨドメインに適用されるような、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）により与えられるＶＨドメインについての一般的ナンバリングにしたがってナンバリングすることができる。ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについて当該技術分野において周知のように、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は、変動することがあり、Ｋａｂａｔのナンバリングにより指し示されるアミノ酸残基の総数に対応しないことがあることが留意されるべきである。すなわち、Ｋａｂａｔのナンバリングによる１つまたはそれ以上の位置は実際の配列中で占有されないことがあり、または実際の配列は、Ｋａｂａｔのナンバリングにより許容される数よりも多くのアミノ酸残基を含有することがある。一般に、Ｋａｂａｔによるナンバリングは、実際の配列中のアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応することもあるし、または対応しないこともあることをこれは意味する。ＶＨドメインおよびＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常１１０～１２０、多くの場合に１１２～１１５の範囲内にある。しかしながら、より短いおよびより長い配列もまた、本明細書に記載の目的のために好適であり得ることが留意されるべきである。
【0122】
本出願において、他に指し示されなければ、ＣＤＲ配列は、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編、２０１０、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ、Ｍａｒｔｉｎ、Ｃｈａｐｔｅｒ ３、第３３～５１頁）に記載されるようなＡｂＭナンバリングにしたがって決定された。この方法によれば、ＦＲ１は位置１～２５のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は位置２６～３５のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は位置３６～４９のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ２は位置５０～５８のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は位置５９～９４のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は位置９５～１０２のアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は位置１０３～１１３のアミノ酸残基を含む。
【0123】
ＣＤＲ領域の決定はまた、異なる方法にしたがって行うことができる。ＫａｂａｔによるＣＤＲの決定において、ＩＳＶＤのＦＲ１は位置１～３０のアミノ酸残基を含み、ＩＳＶＤのＣＤＲ１は位置３１～３５のアミノ酸残基を含み、ＩＳＶＤのＦＲ２は位置３６～４９のアミノ酸残基を含み、ＩＳＶＤのＣＤＲ２は位置５０～６５のアミノ酸残基を含み、ＩＳＶＤのＦＲ３は位置６６～９４のアミノ酸残基を含み、ＩＳＶＤのＣＤＲ３は位置９５～１０２のアミノ酸残基を含み、ＩＳＶＤのＦＲ４は位置１０３～１１３のアミノ酸残基を含む。
【0124】
そのような免疫グロブリン配列において、フレームワーク配列は任意の好適なフレームワーク配列であってもよく、好適なフレームワーク配列の例は、例えば標準的なハンドブックならびに本明細書において言及されるさらなる開示および先行技術に基づいて、当業者に明らかである。
【0125】
フレームワーク配列は、免疫グロブリンフレームワーク配列、または、例えばヒト化もしくはラクダ化により、免疫グロブリンフレームワーク配列から誘導されたフレームワーク配列の好適な組合せである。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えばＶＬ配列）および／または重鎖可変ドメイン（例えばＶＨ配列もしくはＶＨＨ配列）に由来するフレームワーク配列であってもよい。１つの態様において、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列から誘導されたフレームワーク配列であり、上記フレームワーク配列は場合により部分的もしくは完全にヒト化されており、または（本明細書において定義されるような）ラクダ化された従来のＶＨ配列である。
【0126】
特に、本技術において使用されるＩＳＶＤ配列中に存在するフレームワーク配列は、（本明細書において定義されるような）ホールマーク残基のうちの１つまたはそれ以上を含有してもよく、その結果、ＩＳＶＤ配列はＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、例えば、ヒト化ＶＨＨまたはラクダ化ＶＨを含む、ＶＨＨである。そのようなフレームワーク配列の好適な組合せの一部の非限定的な例は、本明細書中のさらなる開示から明らかとなる。
【0127】
また、免疫グロブリン配列について本明細書に一般に記載されるように、以上の任意の好適な断片または断片の組合せを使用することも可能であり、これは例えば、好適には１つまたはそれ以上のフレームワーク配列により隣接されかつ／またはそれを介して連結された、１つまたはそれ以上のＣＤＲ配列を含有する断片であり；例えば、これらのＣＤＲおよびフレームワーク配列は、断片の由来となる全長免疫グロブリン配列において起こり得るのと同じ順序にある。
【0128】
しかしながら、本技術は、ＩＳＶＤ配列の起源もしくはその発現のために使用されるヌクレオチド配列の起源に関しても、ＩＳＶＤ配列もしくはヌクレオチド配列が生成もしくは取得されるもしくは生成もしくは取得された方法に関しても、限定されないことが留意されるべきである。そのため、ＩＳＶＤ配列は、（任意の好適な種からの）天然に存在する配列または合成もしくは半合成配列であってもよい。特有であるが非限定的な態様において、ＩＳＶＤ配列は、（任意の好適な種からの）天然に存在する配列または合成もしくは半合成配列であり、これには、（本明細書において定義されるような）「ヒト化」免疫グロブリン配列（例えば部分的もしくは完全にヒト化されたマウスもしくはウサギ免疫グロブリン配列、特に部分的もしくは完全にヒト化されたＶＨＨ配列）、（本明細書において定義されるような）「ラクダ化」免疫グロブリン配列の他に、技術、例えば親和性成熟（例えば、合成、ランダムもしくは天然に存在する免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲグラフト、ベニア化、異なる免疫グロブリン配列に由来する断片の組合せ、オーバーラップするプライマーを使用するＰＣＲアセンブリー、および当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための類似した技術により得られた免疫グロブリン配列；または以上のいずれかの任意の好適な組合せが含まれるがこれらに限定されない。
【0129】
同様に、ヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド配列または合成もしくは半合成配列であってもよく、例えば、好適な天然に存在する鋳型、例えば細胞から単離されたＤＮＡもしくはＲＮＡからＰＣＲにより単離された配列、ライブラリー（特に発現ライブラリー）から単離されたヌクレオチド配列、（それ自体公知の任意の好適な技術、例えばミスマッチＰＣＲを使用して）天然に存在するヌクレオチド配列に突然変異を導入することにより製造されたヌクレオチド配列、オーバーラップするプライマーを使用してＰＣＲにより製造されたヌクレオチド配列、またはそれ自体公知のＤＮＡ合成用の技術を使用して製造されたヌクレオチド配列であってもよい。
【0130】
上記のように、ＩＳＶＤはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）またはその好適な断片であってもよい。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の一般的記載について、以下のさらなる記載の他に、そこにおいて参照される先行技術を参照。これに関して、しかしながら、この記載および先行技術は、いわゆる「ＶＨ３クラス」のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、すなわちＶＨ３クラスのヒト生殖系列配列、例えばＤＰ－４７、ＤＰ－５１またはＤＰ－２９に対して高い程度の配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を主に記載していることが留意されるべきである。しかしながら、その最も広い意味における本技術は、任意の種類のＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）を一般に使用することができることが留意されるべきであり、例えばＷＯ２００７／１１８６７０に記載される、例えばいわゆる「ＶＨ４クラス」に属するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、すなわちＶＨ４クラスのヒト生殖系列配列、例えばＤＰ－７８に対して高い程度の配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）も使用される。
【0131】
一般に、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（特に（部分的に）ヒト化されたＶＨＨ配列およびラクダ化ＶＨ配列を含む、ＶＨＨ配列）は、（本明細書に記載されるような）フレームワーク配列のうちの１つまたはそれ以上における（再び、本明細書にさらに記載されるような）１つまたはそれ以上の「ホールマーク残基」の存在により特徴付けることができる。そのため、一般に、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、（一般）構造
ＦＲ１ － ＣＤＲ１ － ＦＲ２ － ＣＤＲ２ － ＦＲ３ － ＣＤＲ３ － ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であって、ＦＲ１～ＦＲ４がそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３がそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、ホールマーク残基のうちの１つまたはそれ以上が本明細書においてさらに定義される通りであるものとして定義することができる。
ＦＲ１ － ＣＤＲ１ － ＦＲ２ － ＣＤＲ２ － ＦＲ３ － ＣＤＲ３ － ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であって、ＦＲ１～ＦＲ４がそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３がそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、ホールマーク残基のうちの１つまたはそれ以上が本明細書においてさらに定義される通りであるものとして定義することができる。
【0132】
特に、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、（一般）構造
ＦＲ１ － ＣＤＲ１ － ＦＲ２ － ＣＤＲ２ － ＦＲ３ － ＣＤＲ３ － ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であって、ＦＲ１～ＦＲ４がそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３がそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、フレームワーク配列が本明細書においてさらに定義される通りであるものであり得る。
ＦＲ１ － ＣＤＲ１ － ＦＲ２ － ＣＤＲ２ － ＦＲ３ － ＣＤＲ３ － ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であって、ＦＲ１～ＦＲ４がそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３がそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、フレームワーク配列が本明細書においてさらに定義される通りであるものであり得る。
【0133】
より特には、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、（一般）構造
ＦＲ１ － ＣＤＲ１ － ＦＲ２ － ＣＤＲ２ － ＦＲ３ － ＣＤＲ３ － ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であって、ＦＲ１～ＦＲ４がそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３がそれぞれ相補性決定領域１～３を指し：
Ｋａｂａｔのナンバリングによる位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８におけるアミノ酸残基のうちの１つまたはそれ以上が、以下の表Ａ－６に記載のホールマーク残基から選択されるものであり得る。
ＦＲ１ － ＣＤＲ１ － ＦＲ２ － ＣＤＲ２ － ＦＲ３ － ＣＤＲ３ － ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であって、ＦＲ１～ＦＲ４がそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３がそれぞれ相補性決定領域１～３を指し：
Ｋａｂａｔのナンバリングによる位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８におけるアミノ酸残基のうちの１つまたはそれ以上が、以下の表Ａ－６に記載のホールマーク残基から選択されるものであり得る。
【0134】
【表1-1】
【表1-2】
【0135】
本技術は、とりわけ、ＴＮＦαまたはＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに結合することができるＩＳＶＤを使用する。本技術の文脈において、ある特定の標的分子「に結合する」は、抗体およびそれらの各々の抗原の文脈において理解されるような当該技術分野における通常の意味を有する。
【0136】
本技術のポリペプチドは、ＴＮＦαに結合する１つまたはそれ以上のＩＳＶＤおよびＩＬ－２３に結合する２つまたはそれ以上のＩＳＶＤを含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、ＴＮＦαに結合する１つのＩＳＶＤおよびＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに結合する２つのＩＳＶＤを含んでもよい。
【0137】
一部の実施形態において、少なくとも１つのＩＳＶＤはその標的分子を機能的に遮断することができる。例えば、ＩＳＶＤは、ＴＮＦαおよびＴＮＦＲ（ＴＮＦ受容体）の間の相互作用を遮断することができ、またはＩＬ－２３およびＩＬ－２３Ｒ（ＩＬ－２３受容体）の間の相互作用を遮断することができる。本技術のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのＩＳＶＤは、例えばＩＬ－２３およびＩＬ－２３Ｒの間の相互作用を遮断することならびに／またはＩＬ－２２のＩＬ－２３誘導性放出を阻害することにより、ＩＬ－２３を機能的に遮断することができる。よって、１つの実施形態において、本技術のポリペプチドは、ＴＮＦαに結合してＴＮＦαを機能的に遮断する１つのＩＳＶＤ、および、その１つがＩＬ－２３を機能的に遮断することができる、ＩＬ－２３に結合する２つのＩＳＶＤを含む。
【0138】
本技術において使用されるＩＳＶＤは、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むまたはからなる本技術のポリペプチドの部分を形成し、その結果、ポリペプチドは、ＴＮＦαおよびＩＬ－２３に特異的に結合することができる。
【0139】
よって、本技術のポリペプチドにおいて使用されるような少なくとも３つのＩＳＶＤの標的分子はＴＮＦαおよびＩＬ－２３である。例は哺乳動物ＴＮＦαおよびＩＬ－２３である。ヒトＴＮＦα（ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ０１３７５）およびヒトＩＬ－２３（ｐ１９サブユニット、ＩＬ－２３ＡについてのＵｎｉｐｒｏｔアクセッション：Ｑ９ＮＰＦ７）の他に、他の種からのバージョンもまた本技術に適用可能であり、例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長動物、例えばカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ）（本明細書において「カニクイザル」（ｃｙｎｏ）と称されることもある）、またはラクダ科動物、例えばラマもしくはアルパカからのＴＮＦαおよびＩＬ－２３がある。
【0140】
本技術において使用することができるＴＮＦαまたはＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合するＩＳＶＤの特有の例は、以下の項目Ａ～Ｃに記載される通りである：
【0141】
Ａ．ヒトＴＮＦαに特異的に結合し、
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
【0142】
１つの実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。
【0143】
ヒトＴＮＦαに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの例は、（先行する項目Ａにおいて定義されるようなＣＤＲに加えて）表Ａ－２における構築物６Ｃ１１について指し示されるような１つもしくはそれ以上の、または全ての、フレームワーク領域を有する。１つの実施形態において、それは、構築物６Ｃ１１の全体アミノ酸配列（配列番号２、表Ａ－１および表Ａ－２を参照）を含むまたはからなるＩＳＶＤである。
【0144】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％より高い、例えば９５％より高いまたは９９％より高い、配列同一性を有してもよく、ＣＤＲは、先行する項目Ａにおいて定義される通りである。１つの実施形態において、ＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤは配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはからなる。
【0145】
ＴＮＦαに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ａ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１個のアミノ酸差異を有する場合、ＩＳＶＤは、構築物６Ｃ１１（配列番号２）と比較してヒトＴＮＦαに対する少なくとも半分の結合親和性、または少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される。
【0146】
Ｂ．ヒトＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合し、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
【0147】
１つの実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。
【0148】
ヒトＩＬ－２３に特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの例は、（先行する項目Ｂにおいて定義されるようなＣＤＲに加えて）表Ａ－２における構築物１１９Ａ０３／１について指し示されるような１つもしくはそれ以上の、または全ての、フレームワーク領域を有する。１つの実施形態において、それは、構築物１１９Ａ０３／１の全体アミノ酸配列（配列番号３、表Ａ－１および表Ａ－２を参照）を含むまたはからなるＩＳＶＤである。
【0149】
また、別の実施形態において、ヒトＩＬ－２３に特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％より高い、例えば９５％より高いまたは９９％より高い、配列同一性を有してもよく、ＣＤＲは、先行する項目Ｂにおいて定義される通りである。１つの実施形態において、ＩＬ－２３に結合するＩＳＶＤは配列番号３のアミノ酸配列を含むまたはからなる。
【0150】
ＩＬ－２３に結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｂ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１個のアミノ酸差異を有する場合、ＩＳＶＤは、構築物１１９Ａ０３／１（配列番号３）と比較してヒトＩＬ－２３に対する少なくとも半分の結合親和性、または少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される。
【0151】
１つの実施形態において、配列番号１１（ＴＩＥＳＧＳＲＴＮ）と２または１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ２を含むＩＳＶＤは、ＣＤＲ２配列のアミノ酸位置３におけるＥからＮへの置換を有さず、かつ／またはＣＤＲ２配列のアミノ酸位置９におけるＮからＹへの置換を有しない。別の実施形態において、そのようなＩＳＶＤは、ＣＤＲ２配列のアミノ酸位置３におけるＥからＮへの置換を有さず、ＣＤＲ２配列のアミノ酸位置９におけるＮからＹへの置換を有しない。配列番号１１（ＴＩＥＳＧＳＲＴＮ）と２または１個のアミノ酸差異を有するＣＤＲ２を含むＩＳＶＤのそのような実施形態において、Ｅは上記ＣＤＲ２配列の位置３におけるアミノ酸として維持され、かつ／またはＮは位置９におけるアミノ酸として維持される。別の実施形態において、上記ＣＤＲ２配列のアミノ酸位置３におけるＥおよびアミノ酸位置９におけるＮの両方は維持される。上記ＣＤＲ２配列のアミノ酸位置３におけるＮを含むＩＳＶＤの使用は、上記アミノ酸位置においてＮを含まない同じポリペプチドと比較して、特に上記アミノ酸位置においてＥを含む同じポリペプチドと比較して、例えば脱アミノ化に起因して、ポリペプチドの製造の間の低減されたアミノ酸配列安定性を結果としてもたらし得る。上記ＣＤＲ２配列のアミノ酸位置９におけるＹを含むＩＳＶＤの使用は、上記アミノ酸位置においてＹを含まない同じポリペプチドと比較して、特に上記アミノ酸位置においてＮを含む同じポリペプチドと比較して、ポリペプチドの増加したタンパク質凝集を結果としてもたらし得る。
【0152】
Ｃ．ヒトＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合し、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
【0153】
１つの実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。
【0154】
ヒトＩＬ－２３に特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの例は、（先行する項目Ｃにおいて定義されるようなＣＤＲに加えて）表Ａ－２における構築物８１Ａ１２について指し示されるような１つもしくはそれ以上の、または全ての、フレームワーク領域を有する。１つの実施形態において、それは、構築物８１Ａ１２の全体アミノ酸配列（配列番号５、表Ａ－１および表Ａ－２を参照）を含むまたはからなるＩＳＶＤである。
【0155】
また、別の実施形態において、ヒトＩＬ－２３に特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％より高い、例えば９５％より高いまたは９９％より高い、配列同一性を有してもよく、ＣＤＲは、先行する項目Ｃにおいて定義される通りである。１つの実施形態において、ＩＬ－２３に結合するＩＳＶＤは配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはからなる。
【0156】
ＩＬ－２３に特異的に結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｃ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１個のアミノ酸差異を有する場合、ＩＳＶＤは、構築物８１Ａ１２（配列番号５）と比較してヒトＩＬ－２３に対する少なくとも半分の結合親和性、または少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される。
【0157】
実施形態において、上記の項目Ａ～Ｃの下で定義されるようなＩＳＶＤの各々は、本技術のポリペプチドに含まれる。上記の項目Ａ～Ｃの下で定義されるようなＩＳＶＤの各々を含む本技術のそのようなポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較してヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ－２３に対する少なくとも半分の結合親和性、または少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される。
【0158】
上記の項目Ａ～Ｃにおいて参照される配列番号は、ＡｂＭ定義によるＣＤＲ定義に基づく（表Ａ－２を参照）。Ｋａｂａｔ定義にしたがって同じＣＤＲを定義する配列番号（表Ａ－２．１を参照）は同様に上記の項目Ａ～Ｃにおいて使用できることが留意される。
【0159】
よって、ＡｂＭ定義を使用して上記のように本技術において使用することができるＴＮＦαまたはＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する特有のＩＳＶＤはまた、以下の項目Ａ’～Ｃ’において記載されるようにＫａｂａｔ定義を使用して記載することができる：
【0160】
Ａ’．ヒトＴＮＦαに特異的に結合し、
ｉ．配列番号１２２のアミノ酸配列または配列番号１２２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３０のアミノ酸配列または配列番号１３０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１３８のアミノ酸配列または配列番号１３８と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号１２２のアミノ酸配列または配列番号１２２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３０のアミノ酸配列または配列番号１３０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１３８のアミノ酸配列または配列番号１３８と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
【0161】
１つの実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号１２２のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３０のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１３８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。
【0162】
ヒトＴＮＦαに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの例は、（先行する項目Ａ’において定義されるようなＣＤＲに加えて）表Ａ－２．１における構築物６Ｃ１１について指し示されるような１つもしくはそれ以上の、または全ての、フレームワーク領域を有する。１つの実施形態において、それは、構築物６Ｃ１１の全体アミノ酸配列（配列番号２、表Ａ－１および表Ａ－２．１を参照）を含むまたはからなるＩＳＶＤである。
【0163】
また、別の実施形態において、ヒトＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％より高い、例えば９５％より高いまたは９９％より高い、配列同一性を有してもよく、ＣＤＲは、先行する項目Ａ’において定義される通りである。１つの実施形態において、ＴＮＦαに特異的に結合するＩＳＶＤは配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはからなる。
【0164】
ＴＮＦαに特異的に結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ａ’）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１個のアミノ酸差異を有する場合、ＩＳＶＤは、構築物６Ｃ１１（配列番号２）と比較してヒトＴＮＦαに対する少なくとも半分の結合親和性、または少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される。
【0165】
Ｂ’．ヒトＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合し、
ｉ．配列番号１２３のアミノ酸配列または配列番号１２３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３１のアミノ酸配列または配列番号１３１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１３９のアミノ酸配列または配列番号１３９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号１２３のアミノ酸配列または配列番号１２３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３１のアミノ酸配列または配列番号１３１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１３９のアミノ酸配列または配列番号１３９と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
【0166】
１つの実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号１２３のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３１のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１３９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。
【0167】
ヒトＩＬ－２３に特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの例は、（先行する項目Ｂ’において定義されるようなＣＤＲに加えて）表Ａ－２．１における構築物１１９Ａ０３／１について指し示されるような１つもしくはそれ以上の、または全ての、フレームワーク領域を有する。１つの実施形態において、それは、構築物１１９Ａ０３／１の全体アミノ酸配列（配列番号３、表Ａ－１および表Ａ－２．１を参照）を含むまたはからなるＩＳＶＤである。
【0168】
また、別の実施形態において、ヒトＩＬ－２３に特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％より高い、例えば９５％より高いまたは９９％より高い、配列同一性を有してもよく、ＣＤＲは、先行する項目Ｂ’において定義される通りである。１つの実施形態において、ＩＬ－２３に結合するＩＳＶＤは配列番号３のアミノ酸配列を含むまたはからなる。
【0169】
ＩＬ－２３に結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｂ’）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１個のアミノ酸差異を有する場合、ＩＳＶＤは、構築物１１９Ａ０３／１（配列番号３）と比較してヒトＩＬ－２３に対する少なくとも半分の結合親和性、または少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される。
【0170】
１つの実施形態において、配列番号１３１（ＴＩＥＳＧＳＲＴＮＹＡＤＳＶＫＧ）と２または１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列を含むまたはからなるＣＤＲ２を含むＩＳＶＤは、上記ＣＤＲ２配列のアミノ酸位置３におけるＥからＮへの置換を有さず、かつ／またはアミノ酸位置９におけるＮからＹへの置換を有しない。別の実施形態において、そのようなＩＳＶＤは、ＣＤＲ２配列のアミノ酸位置３におけるＥからＮへの置換を有さず、ＣＤＲ２配列のアミノ酸位置９におけるＮからＹへの置換を有しない。配列番号１３１（ＴＩＥＳＧＳＲＴＮＹＡＤＳＶＫＧ）と２または１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列を含むまたはからなるＣＤＲ２を含むＩＳＶＤのそのような実施形態において、Ｅは上記ＣＤＲ２配列の位置３におけるアミノ酸として維持され、かつ／またはＮは位置９におけるアミノ酸として維持される。別の実施形態において、上記ＣＤＲ２配列のアミノ酸位置３におけるＥおよびアミノ酸位置９におけるＮの両方は維持される。上記ＣＤＲ２配列のアミノ酸位置３においてＮを含むＩＳＶＤの使用は、上記アミノ酸位置においてＮを含まない同じポリペプチドと比較して、特に上記アミノ酸位置においてＥを含む同じポリペプチドと比較して、例えば脱アミノ化に起因して、ポリペプチドの製造の間の低減されたアミノ酸配列安定性を結果としてもたらし得る。上記ＣＤＲ２配列のアミノ酸位置９においてＹを含むＩＳＶＤの使用は、上記アミノ酸位置においてＹを含まない同じポリペプチドと比較して、特に上記アミノ酸位置においてＮを含む同じポリペプチドと比較して、ポリペプチドの増加したタンパク質凝集を結果としてもたらし得る。
【0171】
Ｃ’．ヒトＩＬ－２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合し、
ｉ．配列番号１２５のアミノ酸配列または配列番号１２５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３３のアミノ酸配列または配列番号１３３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４１のアミノ酸配列または配列番号１４１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号１２５のアミノ酸配列または配列番号１２５と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３３のアミノ酸配列または配列番号１３３と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４１のアミノ酸配列または配列番号１４１と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
【0172】
１つの実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号１２５のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。
【0173】
ヒトＩＬ－２３に特異的に結合するそのようなＩＳＶＤの例は、（先行する項目Ｃ’において定義されるようなＣＤＲに加えて）表Ａ－２．１における構築物８１Ａ１２について指し示されるような１つもしくはそれ以上の、または全ての、フレームワーク領域を有する。１つの実施形態において、それは、構築物８１Ａ１２の全体アミノ酸配列（配列番号５、表Ａ－１および表Ａ－２．１を参照）を含むまたはからなるＩＳＶＤである。
【0174】
また、別の実施形態において、ヒトＩＬ－２３に特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％より高い、例えば９５％より高いまたは９９％より高い、配列同一性を有してもよく、ＣＤＲは、先行する項目Ｃ’において定義される通りである。１つの実施形態において、ＩＬ－２３に結合するＩＳＶＤは配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはからなる。
【0175】
ＩＬ－２３に特異的に結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｃ’）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１個のアミノ酸差異を有する場合、ＩＳＶＤは、構築物８１Ａ１２（配列番号５）と比較してヒトＩＬ－２３に対する少なくとも半分の結合親和性、または少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される。
【0176】
実施形態において、上記の項目Ａ’～Ｃ’の下で定義されるようなＩＳＶＤの各々は本技術のポリペプチドに含まれる。上記の項目Ａ’～Ｃ’の下で定義されるようなＩＳＶＤの各々を含む本技術のそのようなポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較してヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ－２３に対する少なくとも半分の結合親和性、または少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される。
【0177】
第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の間の「配列同一性」のパーセンテージは、［第２のアミノ酸配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と同一の第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］で割り、［１００％］を掛けることにより算出することができ、第１のアミノ酸配列と比較した第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の各々の欠失、挿入、置換または付加は、単一のアミノ酸残基における（すなわち単一の位置における）差異として考慮される。
【0178】
通常、上記に概説される算出方法にしたがって２つのアミノ酸配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、最大数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１」のアミノ酸配列とし、他のアミノ酸配列を「第２」のアミノ酸配列とする。
【0179】
「アミノ酸差異」は、本明細書において使用される場合、参照配列と比べた単一のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を指す。１つの実施形態において、「アミノ酸差異」は置換である。
【0180】
１つの実施形態において、アミノ酸置換は保存的置換である。そのような保存的置換は、以下の群（ａ）～（ｅ）内の１つのアミノ酸が同じ群内の別のアミノ酸残基で置換される置換である：（ａ）小さい脂肪族の、非極性または僅かに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性の、負に荷電した残基およびそれらの（非荷電性）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きい脂肪族の非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。
【0181】
１つの実施形態において、保存的置換は以下の通りである：ＡｌａをＧｌｙもしくはＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；ＡｓｎをＧｌｎもしくはＨｉｓへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＣｙｓをＳｅｒへ；ＧｌｎをＡｓｎへ；ＧｌｕをＡｓｐへ；ＧｌｙをＡｌａもしくはＰｒｏへ；ＨｉｓをＡｓｎもしくはＧｌｎへ；ＩｌｅをＬｅｕもしくはＶａｌへ；ＬｅｕをＩｌｅもしくはＶａｌへ；ＬｙｓをＡｒｇ、ＧｌｎもしくはＧｌｕへ；ＭｅｔをＬｅｕ、ＴｙｒもしくはＩｌｅへ；ＰｈｅをＭｅｔ、ＬｅｕもしくはＴｙｒへ；ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｈｒをＳｅｒへ；ＴｒｐをＴｙｒへ；ＴｙｒをＴｒｐへ；および／またはＰｈｅをＶａｌ、ＩｌｅもしくはＬｅｕへ。
【0182】
５．２ 特異性
「特異性」、「特異的に結合する」または「特異的結合」という用語は、特定の結合単位、例えばＩＳＶＤが十分に高い親和性（以下を参照）で結合できる、同じ生物からの異なる標的分子、例えば抗原の数を指す。「特異性」、「特異的に結合する」または「特異的結合」は、本明細書において「選択性」、「選択的に結合する」または「選択的結合」と交換可能に使用される。結合単位、例えばＩＳＶＤは、それらの指定される標的に特異的に結合する。
「特異性」、「特異的に結合する」または「特異的結合」という用語は、特定の結合単位、例えばＩＳＶＤが十分に高い親和性（以下を参照）で結合できる、同じ生物からの異なる標的分子、例えば抗原の数を指す。「特異性」、「特異的に結合する」または「特異的結合」は、本明細書において「選択性」、「選択的に結合する」または「選択的結合」と交換可能に使用される。結合単位、例えばＩＳＶＤは、それらの指定される標的に特異的に結合する。
【0183】
結合単位の特異性／選択性は、親和性に基づいて決定することができる。親和性は分子相互作用の強さまたは安定性を表す。親和性はＫＤ、または解離定数により一般的に与えられ、これはｍｏｌ／リットル（またはＭ）の単位を有する。親和性はまた会合定数、ＫＡとして表すことができ、これは１／ＫＤに等しく、（ｍｏｌ／リットル）－１（またはＭ－１）の単位を有する。
【0184】
親和性は、部分および標的分子上の結合性部位の間の結合強度の度合いであり：ＫＤの値がより低いほど、標的分子および標的化部分の間の結合強度はより大きい。
【0185】
典型的には、本技術において使用される結合単位、例えばＩＳＶＤは、１０－５～１０－１２モル／リットルもしくはそれ未満、１０－７～１０－１２モル／リットルもしくはそれ未満、または１０－８～１０－１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）（すなわち１０５～１０１２リットル／モルもしくはより高い、１０７～１０１２リットル／モルもしくはより高い、または１０８～１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ））でそれらの標的に結合する。
【0186】
１０－４ｍｏｌ／リットルより高い任意のＫＤ値（または１０４リットル／ｍｏｌより低い任意のＫＡ値）は、非特異的結合を指し示すと一般に考えられる。
【0187】
特異的であると考えられる生物学的相互作用、例えば免疫グロブリン配列の抗原への結合についてのＫＤは、典型的には、１０－５モル／リットル（１００００ｎＭもしくは１０μＭ）～１０－１２モル／リットル（０．００１ｎＭもしくは１ｐＭ）またはそれ未満の範囲内である。
【0188】
よって、特異的／選択的結合は、同じ測定方法、例えばＳＰＲを使用して、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）が１０－５～１０－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値でＴＮＦαおよび／またはＩＬ－２３に結合し、１０－４モル／リットルより高いＫＤ値で関連するサイトカインに結合することを意味し得る。ＩＬ－２３の関連するサイトカインの例はＩＬ－１２であり、それはＩＬ－２３とｐ４０サブユニットを共有する。ＴＮＦαの関連するサイトカインの例は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーＦＡＳＬ、ＴＮＦβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、ＲＡＮＫＬである。そのため、本技術の実施形態において、ポリペプチドに含まれる少なくとも１つのＩＳＶＤは、１０－５～１０－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値で（ヒト）ＴＮＦαに結合し、１０－４モル／リットルより高いＫＤ値で同じ種のＦＡＳＬ、ＴＮＦβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、ＲＡＮＫＬに結合し、ポリペプチドに含まれる少なくとも２つのＩＳＶＤは、１０－５～１０－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値でＩＬ－２３に結合し、１０－４モル／リットルより高いＫＤ値で同じ種のＩＬ－１２に結合する。
【0189】
そのため、本技術のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較してヒトＴＮＦαおよびヒトＩＬ－２３に対する少なくとも半分の結合親和性、または少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される。
【0190】
ある特定の種からのある特定の標的に対する特異的結合は、結合単位が異なる種からの類似の標的にも特異的に結合できることを除外しない。例えば、ヒトＴＮＦαに対する特異的結合は、結合単位またはそれを含むポリペプチドがカニクイザルからのＴＮＦαにも特異的に結合できることを除外しない。同様に、例えば、ヒトＩＬ－２３に対する特異的結合は、結合単位またはそれを含むポリペプチドがカニクイザル（「カニクイザル」（ｃｙｎｏ））からのＩＬ－２３にも特異的に結合できることを除外しない。
【0191】
その指定される標的への結合単位の特異的結合は、それ自体公知の任意の好適な方式で決定することができ、該方式としては、例えば、スキャッチャード分析および／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイ、ならびに当該技術分野においてそれ自体公知のその異なるバリアントの他に；本明細書において言及される他の技術が挙げられる。
【0192】
解離定数は、当業者に明らかであるように、実際のまたは見かけの解離定数であってもよい。解離定数を決定する方法は当業者に明らかであり、例えば以下に記載される技術が挙げられる。これに関して、１０－４モル／リットルまたは１０－３モル／リットルより高い（例えば１０－２モル／リットルの）解離定数を測定することは不可能であり得ることもまた明らかである。場合により、これも当業者に明らかなように、（実際のまたは見かけの）解離定数は、関係性［ＫＤ＝１／ＫＡ］によって、（実際のまたは見かけの）会合定数（ＫＡ）に基づいて算出してもよい。
【0193】
２分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体公知の異なる技術、例えば周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術を介して測定することができる（例えばＯｂｅｒら、２００１、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：第１５５１～１５５９頁を参照）。「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書において使用される場合、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によりリアルタイム生体分子特異的相互作用の分析を可能とする光学的な現象を指し、１つの分子がバイオセンサーチップに固定化され、他の分子が、固定化された分子上を流れ条件下で通されて、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定値およびそれゆえＫＤ（またはＫＡ）値が得られる。これは、例えば、周知のＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して行うことができる。さらなる説明について、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９３、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：第１９～２６頁）、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：第６２０～６２７頁）、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら（１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：第１２５～１３１頁）、およびＪｏｈｎｎｓｏｎら（１９９１、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：第２６８～２７７頁）を参照。
【0194】
生体分子相互作用の親和性を決定するための別の周知のバイオセンサー技術はバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）である（例えばＡｂｄｉｃｈｅら、２００８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７７：第２０９～２１７頁を参照）。「バイオレイヤー干渉法」または「ＢＬＩ」という用語は、本明細書において使用される場合、２つの表面：内部参照層（参照ビーム）およびバイオセンサーチップ上の固定化されたタンパク質の層（シグナルビーム）から反射された光の干渉パターンを分析する標識フリーの光学技術を指す。バイオセンサーのチップに結合した分子の数における変化は、波長シフト（ｎｍ）として報告される、干渉パターンにおけるシフトを引き起こし、その大きさは、バイオセンサーチップ表面に結合した分子の数の直接的な度合いである。相互作用をリアルタイムで測定できるので、会合および解離速度ならびに親和性を決定することができる。ＢＬＩは、例えば、周知のＯｃｔｅｔ（登録商標）システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの支部、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＵＳＡ）を使用して行うことができる。
【0195】
代替的に、親和性は、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）プラットフォーム（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、Ｂｏｉｓｅ、ＵＳＡ）を使用して、速度論的排除アッセイ（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ；ＫｉｎＥｘＡ）（例えばＤｒａｋｅら、２００４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２８：第３５～４３頁を参照）において測定することができる。「ＫｉｎＥｘＡ」という用語は、本明細書において使用される場合、非修飾分子の真の平衡結合親和性および速度論を測定するための溶液ベースの方法を指す。抗体／抗原複合体の平衡化された溶液が、抗原（または抗体）を予備コーティングされたビーズを有するカラムに通され、遊離の抗体（または抗原）を、コーティングされた分子に結合させる。そのようにして捕捉された抗体（または抗原）の検出は、抗体（または抗原）に結合する蛍光標識されたタンパク質を用いて達成される。
【0196】
ＧＹＲＯＬＡＢ（登録商標）イムノアッセイシステムは、自動化された生物分析のためのプラットフォームおよび迅速な試料ターンアラウンドを提供する（Ｆｒａｌｅｙら、２０１３、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ５：第１７６５～７４頁）。
【0197】
５．３ （インビボ）半減期の延長
ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含んでもよく、上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有しない対応するポリペプチドと比較して、増加した（インビボ）半減期を有するポリペプチドを提供する。インビボ半減期の延長は、例えば、ポリペプチドが、投与後に、哺乳動物、例えばヒト対象において増加した半減期を有することを意味する。半減期は例えばｔ１／２ベータとして表すことができる。
ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含んでもよく、上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有しない対応するポリペプチドと比較して、増加した（インビボ）半減期を有するポリペプチドを提供する。インビボ半減期の延長は、例えば、ポリペプチドが、投与後に、哺乳動物、例えばヒト対象において増加した半減期を有することを意味する。半減期は例えばｔ１／２ベータとして表すことができる。
【0198】
基、残基、部分または結合単位の種類は一般に制約されず、例えば、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小さいタンパク質またはペプチドからなる群から選択することができる。
【0199】
より特には、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、または血清免疫グロブリン、例えばＩｇＧに結合することができる結合単位からなる群から選択することができる。１つの実施形態において、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する上記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができる結合単位である。１つの実施形態において、結合単位はＩＳＶＤである。
【0200】
例えば、ＷＯ２００４／０４１８６５は、タンパク質の半減期を増加させるために他のタンパク質（例えば所望の標的に結合する１つまたはそれ以上の他のＩＳＶＤ）に連結させることができる血清アルブミン（特にヒト血清アルブミン）に結合するＩＳＶＤを記載する。
【0201】
国際出願ＷＯ２００６／１２２７８７は、（ヒト）血清アルブミンに対する多数のＩＳＶＤを記載する。これらのＩＳＶＤは、Ａｌｂ－１（ＷＯ２００６／１２２７８７における配列番号５２）およびそのヒト化バリアント、例えばＡｌｂ－８（ＷＯ２００６／１２２７８７における配列番号６２）と呼ばれるＩＳＶＤを含む。また、これらは、治療用タンパク質およびポリペプチドならびに他の治療用の実体または部分の半減期を延長させるために使用することができる。
【0202】
さらに、ＷＯ２０１２／１７５４００は、Ａｌｂ－２３と呼ばれる、Ａｌｂ－１のさらなる改良されたバージョンを記載する。
【0203】
１つの実施形態において、ポリペプチドは、Ａｌｂ－１、Ａｌｂ－３、Ａｌｂ－４、Ａｌｂ－５、Ａｌｂ－６、Ａｌｂ－７、Ａｌｂ－８、Ａｌｂ－９、Ａｌｂ－１０（ＷＯ２００６／１２２７８７）およびＡｌｂ－２３から選択される血清アルブミン結合性部分を含む。１つの実施形態において、血清アルブミン結合性部分は、ＷＯ２０１２／１７５４００の第７～９頁に示されるような、Ａｌｂ－８もしくはＡｌｂ－２３またはそのバリアントである。１つの実施形態において、血清アルブミン結合性部分は、ＷＯ２０１２／１７５７４１、ＷＯ２０１５／１７３３２５、ＷＯ２０１７／０８０８５０、ＷＯ２０１７／０８５１７２、ＷＯ２０１８／１０４４４４、ＷＯ２０１８／１３４２３５、およびＷＯ２０１８／１３４２３４に記載されるアルブミンバインダーから選択される。一部の血清アルブミンバインダーはまた、表Ａ－４に示される。１つの実施形態において、本技術のポリペプチドのさらなる構成要素は、以下の項目Ｄに記載される通りである：
【0204】
Ｄ．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列または配列番号１６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列または配列番号１６と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
【0205】
１つの実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。
【0206】
ヒト血清アルブミンに結合するそのようなＩＳＶＤの例は、（先行する項目Ｄにおいて定義されるようなＣＤＲに加えて）表Ａ－２における構築物ＡＬＢ２３００２について指し示されるような１つもしくはそれ以上の、または全ての、フレームワーク領域を有する。１つの実施形態において、それは、構築物ＡＬＢ２３００２の全体アミノ酸配列（配列番号４、表Ａ－１および表Ａ－２を参照）を含むまたはからなるＩＳＶＤである。
【0207】
項目Ｄはまた、Ｋａｂａｔ定義を使用して以下のように記載することができる：
Ｄ’．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号１２４のアミノ酸配列または配列番号１２４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３２のアミノ酸配列または配列番号１３２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４０のアミノ酸配列または配列番号１４０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
Ｄ’．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号１２４のアミノ酸配列または配列番号１２４と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３２のアミノ酸配列または配列番号１３２と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１４０のアミノ酸配列または配列番号１４０と２もしくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。
【0208】
１つの実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号１２４のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１４０のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。
【0209】
ヒト血清アルブミンに結合するそのようなＩＳＶＤの例は、（先行する項目Ｄ’において定義されるようなＣＤＲに加えて）表Ａ－２．１における構築物ＡＬＢ２３００２について指し示されるような１つもしくはそれ以上の、または全ての、フレームワーク領域を有する。１つの実施形態において、それは、構築物ＡＬＢ２３００２の全体アミノ酸配列（配列番号４、表Ａ－１および表Ａ－２．１を参照）を含むまたはからなるＩＳＶＤである。
【0210】
また、別の実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％より高い、例えば９５％より高いまたは９９％より高い、配列同一性を有してもよく、ＣＤＲは、先行する項目ＤまたはＤ’において定義される通りである。１つの実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはからなる。
【0211】
ヒト血清アルブミンに結合するそのようなＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目ＤまたはＤ’）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１個のアミノ酸差異を有する場合、ＩＳＶＤは、構築物ＡＬＢ２３００２（配列番号４）と比較してヒト血清アルブミンに対する少なくとも半分の結合親和性、または少なくとも同じ結合親和性を有し、結合親和性は、同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される。
【0212】
１つの実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するそのようなＩＳＶＤがＣ末端位置を有する場合、それはＣ末端伸長、例えばＣ末端アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）伸長を呈する。１つの実施形態において、そのようなＩＳＶＤは、配列番号：３３、３４、３６、３８、３９、４０、４１、４２、４３、および４５（以下の表Ａ－４を参照）から選択される。別の実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、Ｃ末端位置とは別の位置を有する（すなわち本技術のポリペプチドのＣ末端ＩＳＶＤではない）。１つの実施形態において、そのようなＩＳＶＤは、配列番号：４、３１、３２、３５、および３７（以下の表Ａ－４を参照）から選択される。
【0213】
５．４ 核酸分子
本技術のポリペプチドをコードする核酸分子もまた提供される。
本技術のポリペプチドをコードする核酸分子もまた提供される。
【0214】
「核酸分子」（「核酸」と交換可能に使用される）は、リン酸骨格を介して互いに連結されてヌクレオチド配列を形成したヌクレオチド単量体の鎖である。核酸は、例えばポリペプチドの発現および／または製造のために、宿主細胞または宿主生物の形質転換／トランスフェクションのために使用することができる。製造目的のための好適な宿主または宿主細胞は当業者に明らかであり、例えば、任意の好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞系または任意の好適な真菌、原核もしくは真核生物であってもよい。本技術のポリペプチドをコードする核酸を含む宿主または宿主細胞もまた本技術に包含される。
【0215】
核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのハイブリッドであってもよく、ＰＮＡのような（例えば化学的に）修飾されたヌクレオチドも含むことができる。それは一本鎖または二本鎖であり得る。１つの実施形態において、それは二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本技術のヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡであってもよい。
【0216】
本技術の核酸は、それ自体公知の方式で製造もしくは取得することができ、かつ／または好適な天然の供給源から単離することができる。天然に存在する（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列を例えば部位特異的突然変異誘発に供することができ、それにより、配列バリエーションを有するポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。また、当業者に明らかなように、核酸を製造するために、いくつかのヌクレオチド配列、例えば標的化部分をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列および例えば１つまたはそれ以上のリンカーをコードする核酸を好適な方式で連結させることもできる。
【0217】
核酸を生成するための技術は当業者に明らかであり、例えば自動化されたＤＮＡ合成；部位特異的突然変異誘発；２つもしくはそれ以上の天然に存在するおよび／もしくは合成配列（もしくはその２つもしくはそれ以上の部分）の組合せ、切断された発現産物の発現に繋がる突然変異の導入；１つもしくはそれ以上の制限部位の導入（例えば好適な制限酵素を使用して容易に消化および／もしくはライゲーションが可能なカセットおよび／もしくは領域を作出するため）、ならびに／または１つもしくはそれ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用するＰＣＲ反応による突然変異の導入を挙げることができるがこれらに限定されない。
【0218】
５．５ ベクター
本技術のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターもまた提供される。ベクターは、本明細書において使用される場合、遺伝材料を細胞中に運ぶために好適な媒体である。ベクターは、ネイキッドの核酸、例えばプラスミドもしくはｍＲＮＡ、またはより大きい構造物に包埋された核酸、例えばリポソームもしくはウイルスベクターを含む。
本技術のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターもまた提供される。ベクターは、本明細書において使用される場合、遺伝材料を細胞中に運ぶために好適な媒体である。ベクターは、ネイキッドの核酸、例えばプラスミドもしくはｍＲＮＡ、またはより大きい構造物に包埋された核酸、例えばリポソームもしくはウイルスベクターを含む。
【0219】
一部の実施形態において、ベクターは、場合により１つまたはそれ以上の調節エレメント、例えば１つまたはそれ以上の好適なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどに連結された、少なくとも１つの核酸を含む。１つの実施形態において、ベクターは発現ベクター、すなわち好適な条件下で、例えばベクターが（例えばヒト）細胞に導入される場合に、コードされるポリペプチドまたは構築物を発現するために好適なベクターである。ＤＮＡベースのベクターは、転写（例えばプロモーターおよびポリＡシグナル）ならびに翻訳（例えばＫｏｚａｋ配列）のためのエレメントの存在を含む。
【0220】
１つの実施形態において、ベクターにおいて、上記少なくとも１つの核酸および上記調節エレメントは互いに「作動可能に連結して」おり、これにより、それらが互いと機能的な関係性にあることが一般に意味される。例えば、プロモーターは、コーディング配列の転写および／または発現を開始させることまたは他に制御／調節することができる場合に、コーディング配列に「作動可能に連結して」いると考えられる（この場合、上記コーディング配列は、上記プロモーターの「制御下」にあるとして理解されるべきである）。一般に、２つのヌクレオチド配列が作動可能に連結している場合、それらは同じ配向性にあり、通常はまた、同じリーディングフレームにある。それらはまた、通常、本質的に連続しているが、これは要求されないこともある。
【0221】
１つの実施形態において、ベクターの任意の調節エレメントは、意図される宿主細胞または宿主生物中でそれらの意図される生物学的機能を提供する能力を有するようなものである。
【0222】
例えば、プロモーター、エンハンサーまたはターミネーターは、意図される宿主細胞または宿主生物中で「作動可能」であるべきであり、これにより、例えば上記プロモーターが、それが作動可能に連結されたヌクレオチド配列、例えばコーディング配列の転写および／または発現を開始させる能力または他に制御／調節する能力を有するべきであることが意味される。
【0223】
５．６ 組成物
本技術はまた、少なくとも１つの本技術のポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子またはそのような核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを含む、組成物を提供する。組成物は医薬組成物であってもよい。組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含んでもよく、場合により１つまたはそれ以上のさらなる薬学的に活性のポリペプチドおよび／または化合物を含んでもよい。
本技術はまた、少なくとも１つの本技術のポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子またはそのような核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを含む、組成物を提供する。組成物は医薬組成物であってもよい。組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含んでもよく、場合により１つまたはそれ以上のさらなる薬学的に活性のポリペプチドおよび／または化合物を含んでもよい。
【0224】
５．７ 宿主生物
本技術はまた、本技術のポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする核酸、および／または本技術のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む、宿主細胞または宿主生物に関する。
本技術はまた、本技術のポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする核酸、および／または本技術のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む、宿主細胞または宿主生物に関する。
【0225】
好適な宿主細胞または宿主生物は当業者に明らかであり、例えば、任意の好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞系または任意の好適な真菌、原核もしくは真核生物である。特有の例は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む。１つの実施形態において、宿主はピキア・パストリスである。
【0226】
５．８ 方法およびポリペプチドの使用
本技術はまた、本技術のポリペプチドを製造する方法を提供する。方法は、ポリペプチドをコードする核酸で宿主細胞または宿主生物を形質転換／トランスフェクトすること、宿主中でポリペプチドを発現させること、場合によりこれに続いて１つまたはそれ以上の単離および／または精製工程を含んでもよい。特に、方法は：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中または別の好適な発現系中で、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させること；場合によりこれに続いて：
ｂ）ポリペプチドを単離および／または精製すること
を含んでもよい。
本技術はまた、本技術のポリペプチドを製造する方法を提供する。方法は、ポリペプチドをコードする核酸で宿主細胞または宿主生物を形質転換／トランスフェクトすること、宿主中でポリペプチドを発現させること、場合によりこれに続いて１つまたはそれ以上の単離および／または精製工程を含んでもよい。特に、方法は：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中または別の好適な発現系中で、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させること；場合によりこれに続いて：
ｂ）ポリペプチドを単離および／または精製すること
を含んでもよい。
【0227】
製造目的のための好適な宿主細胞または宿主生物は当業者に明らかであり、例えば、任意の好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞系または任意の好適な真菌、原核もしくは真核生物であってもよい。特有の例は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌またはピキア・パストリスを含む。１つの実施形態において、宿主はピキア・パストリスである。
【0228】
本技術のポリペプチド、記載されるような核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物は医薬として有用である。
【0229】
よって、本技術は、医薬としての使用のための本技術のポリペプチド、記載されるような核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物を提供する。
【0230】
（予防的および／または治療的）処置における使用のための本技術のポリペプチド、記載されるような核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物もまた提供される。
【0231】
自己免疫または炎症性疾患の（予防的および／または治療的）処置における使用のための本技術のポリペプチド、記載されるような核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物もまた提供される。
【0232】
炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎ならびに化膿性汗腺炎の（予防的および／または治療的）処置における使用のための本技術のポリペプチド、記載されるような核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物もまた提供される。
【0233】
自己免疫または炎症性疾患を処置する（予防および／または治療）方法がさらに提供され、上記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に活性の量の本技術のポリペプチド、記載されるような核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物を投与することを含む。
【0234】
炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎ならびに化膿性汗腺炎を処置する（予防および／または治療）方法がさらに提供され、上記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に活性の量の本技術のポリペプチド、記載されるような核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物を投与することを含む。
【0235】
自己免疫または炎症性疾患を処置するための医薬組成物の製造における本技術のポリペプチド、記載されるような核酸分子もしくはベクター、またはポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物の使用がさらに提供される。
【0236】
炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎または化膿性汗腺炎を処置するための医薬組成物の製造における本技術のポリペプチド、記載されるような核酸分子もしくはベクター、またはポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物の使用がさらに提供される。
【0237】
炎症性腸疾患は、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎であってもよい。
【0238】
「対象」は、本技術の文脈において言及される場合、任意の動物であり得る。１つの実施形態において、対象は哺乳動物である。哺乳動物の中で、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の間で区別することができる。非ヒト動物は、例えば、伴侶動物（例えばイヌ、ネコ）、家畜動物（例えばウシ科、ウマ科、ヒツジ科、ヤギ科、もしくはブタ科動物）、または研究目的のためおよび／もしくは抗体を製造するために一般に使用される動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長動物、例えばカニクイザル、もしくはラクダ科動物、例えばラマもしくはアルパカ）であってもよい。
【0239】
予防および／または治療目的の文脈において、対象は任意の動物、より特には任意の哺乳動物であり得る。１つの実施形態において、対象はヒト対象である。
【0240】
ポリペプチド、核酸分子およびベクターを含めて、物質、または組成物は、対象に任意の好適な投与の経路により、例えば経腸（例えば経口もしくは直腸）または非経口（例えば皮膚上、舌下、頬側、経鼻、関節内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、もしくは経粘膜）投与により、投与することができる。１つの実施形態において、物質は、非経口投与、例えば筋肉内、皮下または皮内投与により投与される。１つの実施形態において、皮下投与が使用される。
【0241】
有効量の記載されるようなポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、またはポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物は、意図される処置結果を提供するために対象に投与することができる。
【0242】
１つまたはそれ以上の用量を投与することができる。１つより多くの用量が投与される場合、用量は、ポリペプチド、組成物、核酸分子またはベクターの効果を最大化するために好適な間隔で投与することができる。
【0243】
【表2】
【0244】
【表3】
【0245】
【表4】
【0246】
【表5】
【0247】
【表6-1】
【表6-2】
【0248】
【表7】
【0249】
６ 実施例
６．１ 実施例１：多特異性ＩＳＶＤ構築物の生成
ＴＮＦαおよびＩＬ－２３に結合するＩＳＶＤ含有ポリペプチドＦ０２７５０００６９（配列番号１）の同定は、抗ＴＮＦα ＶＨＨビルディングブロック（ＴＮＦ０６Ｃ１１（ＷＯ２０１７／０８１３２０）、ＴＮＦ０１Ｃ０２（ＷＯ２０１５／１７３３２５、配列番号３２７）およびＶＨＨ＃３Ｅ（ＷＯ２００４／０４１８６２、配列番号４））、抗ＩＬ－２３ｐ１９ ＶＨＨビルディングブロック（２３ＩＬ３７Ｄ０５、２３ＩＬ１１９Ａ０３および２３ＩＬ８１Ａ１２（ＷＯ２００９／０６８６２７））ならびに抗ＨＳＡ ＶＨＨビルディングブロックＡＬＢ２３００２（ＷＯ２０１７０８５１７２、配列番号１０）に基づくビルディングブロックが含まれるデータ駆動型多特異性操作およびフォーマット化キャンペーンの結果としてもたらされた。ビルディングブロックの異なる位置／配向性および異なるリンカー長さ（９ＧＳ対３５ＧＳ）を適用したところ、これらは異なるパラメーター（効力、交差反応性、発現など）のために不可欠であることが判明した。この文脈における効力は、実施例６においてアッセイされたようなインビトロでのＴＮＦα誘導性ＮＦκＢ活性化の阻害ならびに実施例７および８においてアッセイされたようなエクスビボでのＩＬ－２３誘導性ｍＩＬ－２２産生の阻害の他に、インビトロでのＩＬ－２３誘導性ＳＩＥプロモーター活性化の阻害を指す。
６．１ 実施例１：多特異性ＩＳＶＤ構築物の生成
ＴＮＦαおよびＩＬ－２３に結合するＩＳＶＤ含有ポリペプチドＦ０２７５０００６９（配列番号１）の同定は、抗ＴＮＦα ＶＨＨビルディングブロック（ＴＮＦ０６Ｃ１１（ＷＯ２０１７／０８１３２０）、ＴＮＦ０１Ｃ０２（ＷＯ２０１５／１７３３２５、配列番号３２７）およびＶＨＨ＃３Ｅ（ＷＯ２００４／０４１８６２、配列番号４））、抗ＩＬ－２３ｐ１９ ＶＨＨビルディングブロック（２３ＩＬ３７Ｄ０５、２３ＩＬ１１９Ａ０３および２３ＩＬ８１Ａ１２（ＷＯ２００９／０６８６２７））ならびに抗ＨＳＡ ＶＨＨビルディングブロックＡＬＢ２３００２（ＷＯ２０１７０８５１７２、配列番号１０）に基づくビルディングブロックが含まれるデータ駆動型多特異性操作およびフォーマット化キャンペーンの結果としてもたらされた。ビルディングブロックの異なる位置／配向性および異なるリンカー長さ（９ＧＳ対３５ＧＳ）を適用したところ、これらは異なるパラメーター（効力、交差反応性、発現など）のために不可欠であることが判明した。この文脈における効力は、実施例６においてアッセイされたようなインビトロでのＴＮＦα誘導性ＮＦκＢ活性化の阻害ならびに実施例７および８においてアッセイされたようなエクスビボでのＩＬ－２３誘導性ｍＩＬ－２２産生の阻害の他に、インビトロでのＩＬ－２３誘導性ＳＩＥプロモーター活性化の阻害を指す。
【0250】
３８の構築物を含むパネル（表１）について小スケール製造のためにピキア・パストリスにおいて形質転換を行った。ＩＳＶＤ構築物発現の誘導は、メタノールの段階的な添加により行った。ＩＳＶＤ構築物が分泌された清澄化された培地を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを介する精製、続いて脱塩のための出発材料として使用した。精製された試料を機能的な特徴付けおよび発現評価のために使用した。
【0251】
一部の構築物は、リンカー長さおよびＩＳＶＤビルディングブロックの相対位置に依存して効力の障害を示した。例えば：カニクイザルＴＮＦαに対する二価ＶＨＨ＃３Ｅの効力は、短い９ＧＳリンカーを用いて連結された場合に強く障害された。別の例は、多特異性構築物中の抗ＩＬ－２３ ＩＳＶＤビルディングブロック、３７Ｄ０５の位置は、最大の効力を得るために不可欠であったことである。
【0252】
【表8-1】
【表8-2】
【0253】
その後に、両方の標的（ヒトおよびカニクイザル）に対して強力であることが判明し、事前の収率概算値に基づいて、高い発現レベルの潜在能力を含む、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７５０００６９、Ｆ０２７５０００９３、Ｆ０２７５０００９５およびＦ０２７５０００９６からなる４つの多特異性構築物のパネルまで大きいパネルをトリミングした。
【0254】
ピキア・パストリスでのより大スケールの２Ｌでの製造を発現収率決定ならびに生物物理学的特性および既存の抗体の反応性の評価のために行った。表２は、ビルディングブロックの特有の配向性が、ピキア・パストリスにおいて高い発現レベルを得るために要求されたことを示す。同じビルディングブロックを有するが異なる配向性および異なるリンカー長さを有する４つのフォーマット化ＩＳＶＤ構築物について５ｍｌの培養物から得られた発現収率は、ＩＳＶＤ ６Ｃ１１は良好な発現のためにＮ末端位置を必要とすることを明確に指し示す。これはＦ０２７５０００６９およびＦ０２７５０００７０の２Ｌでの発酵で裏付けられ、それにおいて、Ｎ末端６Ｃ１１を有するＩＳＶＤ構築物（Ｆ０２７５０００６９）は６．４ｇ／Ｌの力価に達し、これはＣ末端６Ｃ１１を有するＦ０２７５０００７０よりも３．２倍高かった。
【0255】
【表9】
【0256】
表３および実施例９は、既存の抗体の反応性は各々のＩＳＶＤ構築物の組成および価数により駆動されることを示す。
【0257】
【表10】
【0258】
最後に、効力、既存の抗体に対する低減された結合、優れた発現レベルおよびＣＭＣの特徴、定義された緩衝液中での１００ｍｇ／ｍＬの濃度で３．３ｃＰ、１４６ｍｇ／ｍＬで６．４ｃＰの低い粘度に基づいて、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７５０００６９を選択した。
【0259】
６．２ 実施例２：ＴＮＦα、ＩＬ－２３および血清アルブミンに対する多特異性ＩＳＶＤ構築物の結合親和性
ヒトおよびカニクイザルＴＮＦα、ヒトおよびカニクイザルＩＬ－２３ならびにヒトおよびカニクイザル血清アルブミンに対するＦ０２７５０００６９の、平衡解離定数（ＫＤ）として表される親和性を、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｇｙｒｏｓ）での溶液中親和性測定によって定量化した。
ヒトおよびカニクイザルＴＮＦα、ヒトおよびカニクイザルＩＬ－２３ならびにヒトおよびカニクイザル血清アルブミンに対するＦ０２７５０００６９の、平衡解離定数（ＫＤ）として表される親和性を、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｇｙｒｏｓ）での溶液中親和性測定によって定量化した。
【0260】
ＫＤ制御測定下で、ＴＮＦαもしくはＩＬ－２３（１μＭ～０．１ｐＭの範囲内）または血清アルブミン（１０μＭ～１ｐＭの範囲内）の段階希釈液および固定量のＦ０２７５０００６９（ＴＮＦαの場合は５０ｐＭ、ＩＬ－２３の場合は２０ｐＭまたは１２．５ｐＭ、血清アルブミンの場合は１ｎＭ）を混合して相互作用させ、２４もしくは４８時間（ＩＬ－２３およびＴＮＦαの場合）または２時間（血清アルブミンの場合）インキュベートして平衡に到達させた。
【0261】
受容体制御測定下で、ＴＮＦαもしくはＩＬ－２３（１μＭ～０．１ｐＭの範囲内）または血清アルブミン（１０μＭ～１ｐＭの範囲内）の段階希釈液および固定量のＦ０２７５０００６９（ＴＮＦαの場合は５ｎＭ、ＩＬ－２３の場合は１．２５ｎＭ、血清アルブミンの場合は５０ｎＭ）を混合して相互作用させ、２４もしくは４８時間（ＩＬ－２３およびＴＮＦαの場合）または２時間（血清アルブミンの場合）インキュベートして平衡に到達させた。
【0262】
ビーズのカラムを含有し、平衡化溶液からの遊離Ｆ０２７５０００６９を捕捉するための分子プローブとして使用されるＧｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ １０００ ＣＤの微細構造中にビオチン化ヒトＴＮＦα／ＩＬ－２３／血清アルブミンを捕捉させた。ＴＮＦα／ＩＬ－２３／血清アルブミンおよびＦ０２７５０００６９の混合物（遊離ＴＮＦα／ＩＬ－２３／血清アルブミン、遊離Ｆ０２７５０００６９およびＴＮＦα／ＩＬ－２３／血清アルブミン－Ｆ０２７５０００６９複合体を含有する）をビーズを通じて流したところ、小さいパーセンテージの遊離Ｆ０２７５０００６９が捕捉され、これは遊離ＩＳＶＤ濃度に比例する。蛍光標識された抗ＶＨＨ抗体を次に注入して、任意の捕捉されたＦ０２７５０００６９を標識し、過剰な蛍光プローブをリンスして除去した後に、蛍光における変化を決定した。Ｇｙｒｏｌａｂ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して希釈系列のフィッティングを行い、ＫＤおよび受容体制御曲線を分析してＫＤ値を決定した。
【0263】
結果（表４）は、多特異性ＩＳＶＤ構築物はヒト／カニクイザルＩＬ－２３およびヒト／カニクイザルＴＮＦαに高い親和性で結合することを実証する。
【0264】
【表11】
【0265】
６．３ 実施例３：膜結合型ＴＮＦαに結合する多特異性ＩＳＶＤ構築物
ヒト膜ＴＮＦα発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞、ならびに、ＰＢＭＣから単離され、ＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激された活性化ＣＤ４＋細胞においてフローサイトメトリーを使用して膜結合型ＴＮＦαに対するＦ０２７５０００６９の結合を実証した（ＴＮＦα発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞についてのデータを示す）。簡潔に述べれば、細胞を１×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、１００ｎＭから開始して０．５ｐＭまでのＦ０２７５０００６９の希釈系列と共に４℃で１時間インキュベートした。並行して、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドで固定した後に播種し（膜結合型ＴＮＦαの検出を増加させるため）、ＩＳＶＤの希釈系列と共に４℃で１時間または室温で２４時間インキュベートした。細胞を３回洗浄した後に、抗ＶＨＨ ｍＡｂと４℃で３０分間インキュベートし、再び洗浄し、４℃でヤギ抗マウスＰＥ標識化抗体と３０分間インキュベートした。試料を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（５ｎＭのＴＯＰＲＯ３を補充した１０％ ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＤ－ＰＢＳ）に再懸濁した。細胞懸濁液を次にｉＱｕｅｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＥＣ５０値を算出した。Ｆ０２７５０００６９のＥＣ５０値は、１時間のインキュベーション後に生存細胞および固定された細胞について同じ範囲内にあったが、細胞の固定は膜上のＴＮＦαのより高い発現レベルを結果としてもたらした（表５）。２４時間のインキュベーション後に、結合の平衡に達し、ＥＣ５０の随伴的な６．６倍の向上があった。
ヒト膜ＴＮＦα発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞、ならびに、ＰＢＭＣから単離され、ＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激された活性化ＣＤ４＋細胞においてフローサイトメトリーを使用して膜結合型ＴＮＦαに対するＦ０２７５０００６９の結合を実証した（ＴＮＦα発現ＨＥＫ２９３Ｈ細胞についてのデータを示す）。簡潔に述べれば、細胞を１×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、１００ｎＭから開始して０．５ｐＭまでのＦ０２７５０００６９の希釈系列と共に４℃で１時間インキュベートした。並行して、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドで固定した後に播種し（膜結合型ＴＮＦαの検出を増加させるため）、ＩＳＶＤの希釈系列と共に４℃で１時間または室温で２４時間インキュベートした。細胞を３回洗浄した後に、抗ＶＨＨ ｍＡｂと４℃で３０分間インキュベートし、再び洗浄し、４℃でヤギ抗マウスＰＥ標識化抗体と３０分間インキュベートした。試料を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（５ｎＭのＴＯＰＲＯ３を補充した１０％ ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＤ－ＰＢＳ）に再懸濁した。細胞懸濁液を次にｉＱｕｅｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＥＣ５０値を算出した。Ｆ０２７５０００６９のＥＣ５０値は、１時間のインキュベーション後に生存細胞および固定された細胞について同じ範囲内にあったが、細胞の固定は膜上のＴＮＦαのより高い発現レベルを結果としてもたらした（表５）。２４時間のインキュベーション後に、結合の平衡に達し、ＥＣ５０の随伴的な６．６倍の向上があった。
【0266】
【表12】
【0267】
６．４ 実施例４：ＴＮＦαおよびＩＬ－２３に選択的に結合する多特異性ＩＳＶＤ構築物
ＴＮＦαおよびＩＬ－２３関連ヒトサイトカインに対する結合の非存在をＳＰＲを介して評価した。ｈＩＬ－１２はＩＬ－２３とｐ４０サブユニットを共有するので、それを試験した。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーヒトＦＡＳＬ、ＴＮＦβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、ＲＡＮＫＬをＴＮＦαの関連するサイトカインとして試験した。
ＴＮＦαおよびＩＬ－２３関連ヒトサイトカインに対する結合の非存在をＳＰＲを介して評価した。ｈＩＬ－１２はＩＬ－２３とｐ４０サブユニットを共有するので、それを試験した。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーヒトＦＡＳＬ、ＴＮＦβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、ＲＡＮＫＬをＴＮＦαの関連するサイトカインとして試験した。
【0268】
アミンカップリングを使用して標的を１０μｇ／ｍＬで６００秒間固定化し、活性化のためにＥＤＣ／ＮＨＳの４２０秒の注入および失活のために１ＭのエタノールアミンＨＣｌの４２０秒の注入を行った（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ ＩＩ、カタログ番号ＡＣＫ－００１－０２５）。活性化、失活およびリガンド注入のための流速は１０μｌ／分に設定した。１０ｍＭ酢酸固定化緩衝液のｐＨは、各リガンドのｐＩから約１．５を引くことにより選択した。
【0269】
次に、１μＭのＦ０２７５０００６９を２分間注入し、４５μＬ／分の流速で９００秒間解離させた。ランニングバッファーとして１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ ｐＨ７．４を使用した。陽性対照として、０．２μＭ α－ｈｕＩＬ－１２ Ａｂおよび０．５μＭ α－ｈｕＦＡＳＬ Ａｂ、０．５μＭ α－ｈｕＴＮＦβ Ａｂ、０．５μＭ α－ｈｕＬＩＧＨＴ Ａｂ、０．５μＭ α－ｈｕＴＬ－１Ａ Ａｂおよび０．５μＭ α－ｈｕＲＡＮＫＬ ＶＨＨを注入した。固定化された標的とのＦ０２７５０００６９および陽性対照の間の相互作用を、結合でのチップ上の質量変化の結果として起こる抵抗性指数（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｉｎｄｅｘ）における増加の検出により測定した。
【0270】
全ての陽性対照はそれらの各々の標的に結合した。ヒトＩＬ－１２、ＦＡＳＬ、ＴＮＦβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ－１Ａ、ＲＡＮＫＬに対するＦ０２７５０００６９の結合は検出されなかった。
【0271】
６．５ 実施例５：ｈＩＬ－２３およびｈＴＮＦαに対する多特異性ＩＳＶＤ構築物の同時の結合
ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器を使用して、Ｆ０２７５０００６９はｈＴＮＦαおよびｈＩＬ－２３に同時に結合できるのかどうかを決定した。このために、ＨＳＡをアミンカップリングを介してＧＬＣ ＰｒｏｔｅＯｎセンサーチップ上に固定化した。１００ｎＭのＦ０２７５０００６９を１０μｌ／分でＨＳＡ表面に２分間注入して、ＡＬＢ２３００２ビルディングブロックを介してＩＳＶＤを捕捉した。その後に１００ｎＭのｈＩＬ－２３、ｈＴＮＦαまたはｈＯＸ４０Ｌのいずれかを注入するか、または１００ｎＭ ＩＬ－２３ ＋ １００ｎＭ ＴＮＦα、１００ｎＭ ＩＬ－２３ ＋ １００ｎＭ ＯＸ４０Ｌもしくは１００ｎＭ ＴＮＦα ＋ １００ｎＭ ＩＬ－１３の混合物を１０μｌ／分の流速で２分間注入し、その後に６００秒の解離工程を行った。ＨＳＡ表面を４５μｌ／分でのＨＣＩ（１００ｍＭ）の２分の注入で再生させた。応答単位における増加：ＴＮＦαのみからの約５００ＲＵの増加、ＩＬ－２３のみからの約８８０ＲＵの増加、ならびにＩＬ－２３およびＴＮＦα混合物についての約１３００ＲＵの増加により示されるように、Ｆ０２７５０００６９はヒトＩＬ－２３およびヒトＴＮＦαに同時に結合できることをセンサーグラム（図１）は実証する。
ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器を使用して、Ｆ０２７５０００６９はｈＴＮＦαおよびｈＩＬ－２３に同時に結合できるのかどうかを決定した。このために、ＨＳＡをアミンカップリングを介してＧＬＣ ＰｒｏｔｅＯｎセンサーチップ上に固定化した。１００ｎＭのＦ０２７５０００６９を１０μｌ／分でＨＳＡ表面に２分間注入して、ＡＬＢ２３００２ビルディングブロックを介してＩＳＶＤを捕捉した。その後に１００ｎＭのｈＩＬ－２３、ｈＴＮＦαまたはｈＯＸ４０Ｌのいずれかを注入するか、または１００ｎＭ ＩＬ－２３ ＋ １００ｎＭ ＴＮＦα、１００ｎＭ ＩＬ－２３ ＋ １００ｎＭ ＯＸ４０Ｌもしくは１００ｎＭ ＴＮＦα ＋ １００ｎＭ ＩＬ－１３の混合物を１０μｌ／分の流速で２分間注入し、その後に６００秒の解離工程を行った。ＨＳＡ表面を４５μｌ／分でのＨＣＩ（１００ｍＭ）の２分の注入で再生させた。応答単位における増加：ＴＮＦαのみからの約５００ＲＵの増加、ＩＬ－２３のみからの約８８０ＲＵの増加、ならびにＩＬ－２３およびＴＮＦα混合物についての約１３００ＲＵの増加により示されるように、Ｆ０２７５０００６９はヒトＩＬ－２３およびヒトＴＮＦαに同時に結合できることをセンサーグラム（図１）は実証する。
【0272】
６．６ 実施例６：インビトロでのＴＮＦα誘導性ＮＦｋＢ活性化の多特異性ＩＳＶＤ構築物による阻害
ＨＥＫ２９３＿ＮＦｋＢ－ＮＬｕｃＰ細胞は、ＮＦｋＢ依存性プロモーターの制御下のＮａｎｏルシフェラーゼをコードするレポーター構築物を安定的にトランスフェクトされたＴＮＦ受容体発現細胞である。可溶性ヒトおよびカニクイザルＴＮＦαとの細胞のインキュベーションは、ＮＦκＢ媒介性Ｎａｎｏルシフェラーゼ遺伝子発現を結果としてもたらした。細胞に添加された１：５０の比で溶解緩衝液と混合されたＮａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を使用してＮａｎｏルシフェラーゼ発光を測定した。試料をシェーカー上で５分混合して完全な溶解を得た。
ＨＥＫ２９３＿ＮＦｋＢ－ＮＬｕｃＰ細胞は、ＮＦｋＢ依存性プロモーターの制御下のＮａｎｏルシフェラーゼをコードするレポーター構築物を安定的にトランスフェクトされたＴＮＦ受容体発現細胞である。可溶性ヒトおよびカニクイザルＴＮＦαとの細胞のインキュベーションは、ＮＦκＢ媒介性Ｎａｎｏルシフェラーゼ遺伝子発現を結果としてもたらした。細胞に添加された１：５０の比で溶解緩衝液と混合されたＮａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を使用してＮａｎｏルシフェラーゼ発光を測定した。試料をシェーカー上で５分混合して完全な溶解を得た。
【0273】
透明底を有する白色組織培養（ＴＣ）処理９６ウェルプレート中の通常の増殖培地中２００００細胞／ウェルでＧｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（商標） ＨＥＫ２９３＿ＮＦｋＢ－ＮＬｕｃＰ細胞を播種した。Ｆ０２７５０００６９または参照化合物（抗ＴＮＦα参照ｍＡｂ）の希釈系列を２５ｐＭのヒトまたは７０ｐＭのカニクイザルＴＮＦαに加え、３０μＭのＨＳＡの存在下３７℃で細胞と５時間インキュベートした。
【0274】
Ｆ０２７５０００６９は、抗ＴＮＦα参照ｍＡｂと同等の３８．８ｐＭ（ヒトＴＮＦα）および１２８ｐＭ（カニクイザルＴＮＦα）のＩＣ５０と共に濃度依存性の方式でヒトおよびカニクイザルＴＮＦα誘導性ＮＦκＢ活性化を阻害した（表６、図２）。
【0275】
【表13】
【0276】
６．７ 実施例７：エクスビボでのＩＬ－２３誘導性ｍＩＬ－２２産生の多特異性ＩＳＶＤ構築物による阻害
ヒト（およびカニクイザル）ＩＬ－２３は、マウス脾臓細胞からのｍＩＬ－１７およびｍＩＬ－２２分泌を刺激した（Ａｇｇａｒｗａｌら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３）：第１９１０～４頁）。Ｆ０２７５０００６９はエクスビボでｍＩＬ－２２のＩＬ－２３誘導性発現を遮断することが実証された。５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓を取り出し、脾臓細胞を収穫し、単一細胞懸濁液を調製した。細胞を２０ｎｇ／ｍｌの組換えｍＩＬ－２の存在下で培養し、４０００００細胞／ウェルで９６ウェル平底プレートに播種した。Ｆ０２７５０００６９または参照化合物（抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ１および抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ２）の段階希釈液を組換えｈＩＬ－２３（３６ｐＭ）またはカニクイザルからの組換えＩＬ－２３（３６ｐＭ）と培養培地中、室温で３０分間プレインキュベートし、次に脾臓細胞と３０μＭ ＨＳＡの存在下３７℃でさらに３日間インキュベートした。上清を収集し、ＥＬＩＳＡを使用してｍＩＬ－２２のレベルを測定した。
ヒト（およびカニクイザル）ＩＬ－２３は、マウス脾臓細胞からのｍＩＬ－１７およびｍＩＬ－２２分泌を刺激した（Ａｇｇａｒｗａｌら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３）：第１９１０～４頁）。Ｆ０２７５０００６９はエクスビボでｍＩＬ－２２のＩＬ－２３誘導性発現を遮断することが実証された。５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓を取り出し、脾臓細胞を収穫し、単一細胞懸濁液を調製した。細胞を２０ｎｇ／ｍｌの組換えｍＩＬ－２の存在下で培養し、４０００００細胞／ウェルで９６ウェル平底プレートに播種した。Ｆ０２７５０００６９または参照化合物（抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ１および抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ２）の段階希釈液を組換えｈＩＬ－２３（３６ｐＭ）またはカニクイザルからの組換えＩＬ－２３（３６ｐＭ）と培養培地中、室温で３０分間プレインキュベートし、次に脾臓細胞と３０μＭ ＨＳＡの存在下３７℃でさらに３日間インキュベートした。上清を収集し、ＥＬＩＳＡを使用してｍＩＬ－２２のレベルを測定した。
【0277】
表７に示される結果は、Ｆ０２７５０００６９は４３ｐＭ（ヒトＩＬ－２３）および３１ｐＭ（カニクイザルＩＬ－２３）のＩＣ５０と共に濃度依存性の方式でｈＩＬ－２３およびカニクイザルＩＬ－２３誘導性ｍＩＬ－２２産生を阻害したことを実証する。阻害は、参照化合物抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ１および抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ２による阻害よりも強力であった。
【0278】
６．８ 実施例８：インビトロでのＩＬ－２３誘導性ＳＩＥプロモーター活性化の多特異性ＩＳＶＤ構築物による阻害
Ｇｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（商標） ＨＥＫ２９３＿ヒトＩＬ－２３Ｒ／ＩＬ－１２Ｒｂ１－Ｌｕｃ２Ｐ細胞に、ＳＩＥ応答性プロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター構築物を安定的にトランスフェクトした。追加的に、これらの細胞は、ヒトＩＬ－２３受容体の両方のサブユニット、すなわちＩＬ－１２Ｒｂ１およびＩＬ－２３Ｒを構成的に過剰発現した。ＩＬ－２３によるこれらの細胞の誘導で、ルシフェラーゼレポータータンパク質が発現され、それを基質、５’－フルオロルシフェリン（Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）の添加によるその酵素活性に基づいて定量化する。
Ｇｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（商標） ＨＥＫ２９３＿ヒトＩＬ－２３Ｒ／ＩＬ－１２Ｒｂ１－Ｌｕｃ２Ｐ細胞に、ＳＩＥ応答性プロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター構築物を安定的にトランスフェクトした。追加的に、これらの細胞は、ヒトＩＬ－２３受容体の両方のサブユニット、すなわちＩＬ－１２Ｒｂ１およびＩＬ－２３Ｒを構成的に過剰発現した。ＩＬ－２３によるこれらの細胞の誘導で、ルシフェラーゼレポータータンパク質が発現され、それを基質、５’－フルオロルシフェリン（Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）の添加によるその酵素活性に基づいて定量化する。
【0279】
細胞を通常の増殖培地中で培養し、透明底を有する９６ウェル白色組織培養処理プレート中１５０００細胞／ウェルで播種した。Ｆ０２７５０００６９または参照化合物（抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ１および抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ２）の段階希釈液を細胞に加え、続いて組換えｈＩＬ－２３（１０ｐＭ）またはカニクイザルＩＬ－２３（４０ｐＭ）を加えた。細胞を３０μＭ ＨＳＡの存在下３７℃で４時間１５分インキュベートした。その後にＢｉｏ－Ｇｌｏを各ウェルの細胞に加え、ルシフェラーゼ発光を測定した。Ｆ０２７５０００６９は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ－２３依存性のシグナル伝達をそれぞれ２５０ｐＭおよび３２３ｐＭのＩＣ５０と共に阻害した（表７および図３）。
【0280】
【表14】
【0281】
６．９ 実施例９：既存の抗体に結合する多特異性ＩＳＶＤ構築物
ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用してＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７５０００６９の既存の抗体の反応性を正常ヒト血清（ｎ＝９６）において評価した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ ７．４、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）をランニングバッファーとして使用し、２５℃で実験を行った。
ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用してＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７５０００６９の既存の抗体の反応性を正常ヒト血清（ｎ＝９６）において評価した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ ７．４、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）をランニングバッファーとして使用し、２５℃で実験を行った。
【0282】
チップ上に固定化されたＨＳＡへのＡＬＢ２３００２ビルディングブロックの結合を介してＩＳＶＤをチップ上に捕捉させた。ＨＳＡを固定化するために、ＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣセンサーチップのリガンドレーンをＥＤＣ／ＮＨＳ（流速３０μｌ／分）で活性化させ、ＨＳＡをｐＨ ４．５のＰｒｏｔｅＯｎ酢酸緩衝液中１００μｌ／ｍｌで注入し、約３２００ＲＵの固定化レベルとした。固定化後に、エタノールアミンＨＣＩ（流速３０μｌ／分）で表面を不活性化させた。
【0283】
その後に、ＩＳＶＤ構築物を４５μｌ／分でＨＳＡ表面に２分間注入して約８００ＲＵのＩＳＶＤ捕捉レベルとした。既存の抗体を含有する試料を１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）中１：１０で希釈した後に、４５μｌ／分で２分間注入し、その後に４００秒の解離工程を行った。各サイクル後（すなわち新たなＩＳＶＤ捕捉および血液試料注入工程の前）に、４５μｌ／分でのＨＣＩ（１００ｍＭ）の２分の注入でＨＳＡ表面を再生させた。既存の抗体結合を示すセンサーグラムが、１）ＩＳＶＤ－ＨＳＡ解離および２）参照リガンドレーンへの非特異的結合を引くことによる二重の照合後に得られた。既存の抗体の結合レベルを、報告点を１２５秒（会合の終了の５秒後）に設定することにより決定した。既存の抗体の結合における低減パーセンテージを、参照ＩＳＶＤの１２５秒での結合レベルと比べて算出した。
【0284】
各ビルディングブロックにおける突然変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９ＬならびにＣ末端アラニンの導入による既存の抗体の結合の低減のために最適化された四価ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７５０００６９は、対照非最適化四価ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０１０９９と比較して既存の抗体に対する実質的により低い結合を示した（表８および図４）。
【0285】
【表15】
【0286】
既存の抗体の結合は多特異性構築物の価数および組成に依存した。表３および図５は、構築物Ｆ０２７５０００６９は構築物Ｆ０２７５０００９５およびＦ０２７５０００９６よりも低い既存の抗体の反応性を示したことを実証する。
【0287】
６．１０ 実施例１０：ヒトＴＮＦαトランスジェニックＴｇ１９７多発性関節炎モデルにおけるＦ０２７５０００６９の評価。
Ｆ０２７５０００６９をＴＮＦ駆動性の進行性多発性関節炎のＴｇ１９７マウスモデル（Ｋｅｆｆｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：第４０２５～４０３１頁）においてプロファイリングした。これらのマウスにおいて、改変されたヒトＴＮＦα遺伝子を導入遺伝子としてマウスに挿入した。ヒト遺伝子は、転写されたｍＲＮＡがより安定となるように改変され、そのため１００％の表現率で４つ全ての足においてＴＮＦαの過剰発現および自発的な進行性関節炎に繋がった。徴候および症状は約６週齢時に見られるようになり、処置されない場合、常に増加して、約１０週齢以降に重大な瀕死および死亡に繋がる。関節炎重症度を以下に詳述されるようなスコアリングシステムにより臨床的に評価した：
Ｆ０２７５０００６９をＴＮＦ駆動性の進行性多発性関節炎のＴｇ１９７マウスモデル（Ｋｅｆｆｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：第４０２５～４０３１頁）においてプロファイリングした。これらのマウスにおいて、改変されたヒトＴＮＦα遺伝子を導入遺伝子としてマウスに挿入した。ヒト遺伝子は、転写されたｍＲＮＡがより安定となるように改変され、そのため１００％の表現率で４つ全ての足においてＴＮＦαの過剰発現および自発的な進行性関節炎に繋がった。徴候および症状は約６週齢時に見られるようになり、処置されない場合、常に増加して、約１０週齢以降に重大な瀕死および死亡に繋がる。関節炎重症度を以下に詳述されるようなスコアリングシステムにより臨床的に評価した：
【0288】
【表16】
【0289】
関節炎は、ヒトＴＮＦαの阻害に向けられた治療剤での処置に感受性であった（Ｓｈｅａｌｙら、２００２、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．４（５）：Ｒ７）。
【0290】
用量依存的な効能を確立する目的のために、異なる用量のＦ０２７５０００６９を週に２回の腹腔内注射により治療的な方式で関節炎の目に見える徴候および症状を有する６週齢の動物（ｎ＝８動物／群）に投与した。ヒト骨髄腫血清から精製されたヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ ＃ＢＥ０２９７）を陰性対照として使用し、抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂを陽性対照として使用して関節炎を抑制した。Ｆ０２７５０００６９をそれぞれ１．３ｍｇ／ｋｇ体重、４ｍｇ／ｋｇ、および１３．５ｍｇ／ｋｇの３つの異なる用量強度で投与した。処置を１１週齢まで継続した。臨床的な関節炎スコアを週に１回決定した。図６に示されるように、Ｆ０２７５０００６９での処置は、経時的な臨床的な関節炎スコアの用量依存的な抑制を結果としてもたらした。
【0291】
ヒトＩｇＧ１陰性対照抗体で処置された動物は、１１週目までに１．０９９±０．１０７１の平均関節炎スコアとなった。抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂは関節炎の進行を完全に抑制し、１１週目までに０．４８４４±０．０５９４の平均スコアであった。Ｆ０２７５０００６９は、１１週目まで関節炎の進行を低減させ、０．８０４７±０．０９２９（１．３ｍｇ／ｋｇ）、０．７９６９±０．０５８５（４ｍｇ／ｋｇ）、および０．６０１６±０．０３４９（１３．５ｍｇ／ｋｇ）の平均スコアであった。関節炎の全体的な抑制を曲線下面積（ＡＵＣ、図７）により分析した。Ｆ０２７５０００６９の全ての用量は、Ｔｇ１９７関節炎モデルにおいて抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂと同等に関節炎の進行を有意に抑制した。
【0292】
処置の完了時に、後足首関節を組織学のために処理し、以下のスコアリングシステムを用いて切片を関節炎の構造的徴候について評価した：
【0293】
【表17】
【0294】
組織学的スコア付けの結果を図８に描写する。構造的関節炎および関節破壊がより高用量のＦ０２７５０００６９により有意に抑制された。
【0295】
結論として、抗ＴＮＦα参照ｍＡｂと同等の程度までのＦ０２７５０００６９による関節炎の徴候および症状の用量依存性の抑制の他に、構造的進行の阻害を結果は実証する。
【0296】
６．１１ 実施例１１：ヒトＩＬ－２３誘導性皮膚炎症モデルにおけるＦ０２７５０００６９の評価。
マウスにおける組換えＩＬ－２３の皮内注射は、注射部位の周囲の赤化および腫脹を伴う急性皮膚炎症に繋がった。組織学的に、乾癬性皮膚炎の特徴が見られ、これは例えばケラチノサイト過形成による上皮肥厚、角化、ならびにＴ細胞およびマクロファージのような免疫細胞浸潤であった。分子レベルで、モデルにおけるトランスクリプトームの変化は、正常な皮膚と比べてヒト乾癬損傷性皮膚において観察されるものと概しては重なった（Ｇａｕｌｄら、２０１８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９２：第４５～５３頁）。そのため、ＩＬ－２３皮膚炎症モデルは乾癬の機構的モデルに似ている。
マウスにおける組換えＩＬ－２３の皮内注射は、注射部位の周囲の赤化および腫脹を伴う急性皮膚炎症に繋がった。組織学的に、乾癬性皮膚炎の特徴が見られ、これは例えばケラチノサイト過形成による上皮肥厚、角化、ならびにＴ細胞およびマクロファージのような免疫細胞浸潤であった。分子レベルで、モデルにおけるトランスクリプトームの変化は、正常な皮膚と比べてヒト乾癬損傷性皮膚において観察されるものと概しては重なった（Ｇａｕｌｄら、２０１８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９２：第４５～５３頁）。そのため、ＩＬ－２３皮膚炎症モデルは乾癬の機構的モデルに似ている。
【0297】
ＩＬ－２３媒介性炎症の阻害を調べるために、Ｒｉｚｚｏら、２０１１、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ； １８６：第１４９５～１５０２頁から適合させた皮膚炎症モデルにおいてＦ０２７５０００６９を試験した。２０μｌの総体積中の組換えヒトＩＬ－２３ １μｇを雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右耳に１、２、３、および４日目に皮内注射した。ＰＢＳを１つの群のマウスの耳に対照として注射した。耳皮膚の肥厚を１日毎にキャリパーにより測定した。Ｆ０２７５０００６９および対照化合物を腹腔内注射により１および３日目に投与した。５日目に、マウスを屠殺し、皮膚パンチ生検を採取した。プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充したＰＢＳ中で生検をホモジナイズし、下流のエフェクターサイトカインＩＬ－２２レベルを決定した。
【0298】
用量依存的な効能を確立する目的のために、異なる用量のＩＳＶＤ構築物を週に２回の腹腔内注射により：治療的な方式で、関節炎の目に見える徴候および症状を有する６週齢の動物（ｎ＝１０動物／群）に投与した。ヒト骨髄腫血清から精製されたヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ ＃ＢＥ０２９７）を陰性対照として使用し、抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ１を陽性対照として使用して皮膚炎症を抑制した。Ｆ０２７５０００６９をそれぞれ０．１３ｍｇ／ｋｇ体重、０．４ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および４ｍｇ／ｋｇの４つの異なる用量強度で投与した。図９に示されるように、Ｆ０２７５０００６９での処置は、５日目におけるベースラインからの耳厚における変化として描写される皮膚腫脹の用量依存的な抑制を結果としてもたらした。
【0299】
皮膚生検を５日目に採取し、組織ホモジネートを調製した。Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖ－ｐｌｅｘ ｍｏｕｓｅ ＩＬ－２２ ａｓｓａｙ ｋｉｔを利用してマウスＩＬ－２２レベルを測定した（＃Ｋ１５２ＷＶＤ、図１０）。ＩＬ－２３の投与は測定可能なレベルのＩＬ－２２に繋がり、ＰＢＳを注射した皮膚からの全ての試料は用いられたアッセイの定量限界未満（ＬＬＯＱ）であった。全ての用量のＦ０２７５０００６９の他に抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ１は、ＩＬ－２２組織レベルを有意に抑制した（１ｍｇ／ｋｇ用量群についてＩＬ－２２レベルは決定されなかった）。
【0300】
追加的に、皮下投与の実現可能性をＩＬ－２３誘導性皮膚炎症モデルにおける別の実験において評価した。２つの用量のＦ０２７５０００６９（０．１ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ）を１および３日目に腹腔内注射または皮下注射のいずれかとして投与し、耳厚変化を得た（図１１）。この実験において、１ｍｇ／ｋｇの用量の無関連ＶＨＨを陰性対照として使用し（Ｎａｂ対照）、３ｍｇ／ｋｇの用量の抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ１（ＩＰ）を陽性対照として使用した。
【0301】
追加的に、組織ＩＬ－２２レベルを５日目の皮膚生検ホモジネートから測定した（図１２）。
【0302】
結論として、結果は、皮膚肥厚および組織エフェクターサイトカインレベルの両方においてＩＬ－２３誘導性皮膚炎症の抑制を実証する。腹腔内および皮下の両方の投与の経路が実現可能である。
【0303】
６．１２ 実施例１２：ヒトＴＮＦα／ＴＮＦＲ１ノックインマウスにおけるコラーゲン抗体誘導性関節炎モデルにおけるＦ０２７５０００６９の評価。
ＴＮＦαおよびＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）の両方の遺伝子座が各々のヒト遺伝子座に置き換えられた専売マウスにおけるコラーゲン抗体誘導性関節炎（ＣＡＩＡ）モデルにおいてＦ０２７５０００６９をプロファイリングした。
ＴＮＦαおよびＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）の両方の遺伝子座が各々のヒト遺伝子座に置き換えられた専売マウスにおけるコラーゲン抗体誘導性関節炎（ＣＡＩＡ）モデルにおいてＦ０２７５０００６９をプロファイリングした。
【0304】
群当たり８匹の動物に０日目に軟骨のコラーゲン２に向けられたモノクローナル抗体のカクテル８ｍｇを注射した（ＡｒｔｈｒｉｔｏＭａｂ、ＭＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＩＡ－ＭＡＢ－２Ｃ）。１日目に、関節炎の発症を２５μｇの細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の注射により誘導した。試験化合物を単回注射として１回、ＬＰＳ注射の６時間後に投与した。関節炎の徴候および症状の進展を１日毎に７日目まで、以下に詳述されるような関節炎スコアに基づいて評価した：
【0305】
【表18】
【0306】
Ｆ０２７５０００６９を１．３ｍｇ／ｋｇ体重で投与し、抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂ陽性対照を０．５ｍｇ／ｋｇで投与した。図１３は、経時的な関節炎の徴候および症状の進展を示す。Ｆ０２７５０００６９または抗ｈＴＮＦα参照ｍＡｂの両方の単回の予防的な投与は関節炎発症の完全な抑制を結果としてもたらした。
【0307】
６．１３ 実施例１３：ヒトＴＮＦαノックインマウスにおけるヒトＩＬ－２３誘導性皮膚炎症モデルにおけるＦ０２７５０００６９の評価。
Ｆ０２７５０００６９はヒトまたは霊長動物標的（ＩＬ－２３およびＴＮＦαの両方）のみに結合して阻害するので、ヒトＩＬ－２３誘導性皮膚炎症をＴＮＦαヒト化マウスにおいて繰り返した。この専売系統において、マウス中の全ゲノムＴＮＦα座位をヒト遺伝子座で置き換えた。エクソン－イントロン構造および調節エレメントはマウスおよびヒトの間で保存される。忠実な発現の他に、マウスにおいて応答を誘発するヒトＴＮＦαの機能的な能力は前もって評価した。
Ｆ０２７５０００６９はヒトまたは霊長動物標的（ＩＬ－２３およびＴＮＦαの両方）のみに結合して阻害するので、ヒトＩＬ－２３誘導性皮膚炎症をＴＮＦαヒト化マウスにおいて繰り返した。この専売系統において、マウス中の全ゲノムＴＮＦα座位をヒト遺伝子座で置き換えた。エクソン－イントロン構造および調節エレメントはマウスおよびヒトの間で保存される。忠実な発現の他に、マウスにおいて応答を誘発するヒトＴＮＦαの機能的な能力は前もって評価した。
【0308】
ｈＩＬ－２３の皮内注射はＴＮＦα発現における中程度の増加に繋がった（自身のデータおよびＧａｕｌｄら、２０１８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９２：第４５～５３頁）。等モル用量のＦ０２７５０００６９ならびに対応する単一特異性ＩＳＶＤビルディングブロックＦ０２７５００１０１（抗ＴＮＦα）およびＦ０２７５０００１７（抗ＩＬ－２３）をこのモデルにおいて投与して、二重標的化の潜在的な付加的効果を調べた。投与された用量強度は３．６ｎｍｏｌ／ｋｇであり、約０．１ｍｇ／ｋｇに対応した。この低い用量は、ある程度の残存遊離ＩＬ－２３およびそのため下流のＴＮＦα分泌物を可能とするように選択した。追加的に、高用量のＦ０２７５０００６９の他に抗ｈＩＬ－２３参照ｍＡｂ１を陽性対照として投与した。耳厚における変化を高対照（Ｎａｂ陰性対照）および低（無ＩＬ－２３注射）対照に対して正規化した（（試料－低対照）／（高対照－低対照））。図１４は結果を図示する。３．６ｎｍｏｌ／ｋｇのＦ０２７５００１０１での単一特異性ＴＮＦα阻害は皮膚腫脹を阻害せず、３．６ｎｍｏｌ／ｋｇのＦ０２７５０００１７での単一特異性ＩＬ－２３阻害は中等度であるが有意な効果を有した。３．６ｎｍｏｌ／ｋｇのＦ０２７５０００６９でのＴＮＦαおよびＩＬ－２３の両方の二重標的化は皮膚腫脹の数値的に優れた抑制に繋がった。
【0309】
皮膚生検を５日目に採取し、標準的な方法を使用してｍＲＮＡを調製した。ｍＲＮＡをＩｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ（商標） ６０００プラットフォーム上のペアードエンド、バルクベースの全トランスクリプトームシークエンシングに供した。ＮＡｂ対照と比べて差次的に発現された遺伝子（ＤＥＧ、ｐ＜０．００１で倍数変化＞２）を処置群の間のオーバーラップについて分析した。図１５に示されるように、多特異性処置群との単一特異性処置群の大きいオーバーラップにもかかわらず、依然として７６９のＤＥＧのうちの１９９個はＦ０２７５０００６９処置に特異的であった。このモデルにおけるＴＮＦαおよびＩＬ－２３の両方の二重標的化は独特の分子応答および恐らくはヒト疾患の相乗的な寛解に繋がったことをこれは指し示す。
【0310】
結論として、ＩＬ－２３誘導性皮膚炎症におけるＩＬ－２３およびＴＮＦαの両方の多特異的阻害は、皮膚肥厚に対する数値的に付加的な効果に繋がり、独特のトランスクリプトームプロファイルを誘発したことを結果は実証する。
【産業上の利用可能性】
【0311】
７ 産業上の利用可能性
本明細書に記載のポリペプチド、それをコードする核酸分子、核酸を含むベクターおよび組成物は、処置、例えば炎症性腸疾患、乾癬、乾癬性関節炎または化膿性汗腺炎を患う対象の処置における例のために使用することができる。
本明細書に記載のポリペプチド、それをコードする核酸分子、核酸を含むベクターおよび組成物は、処置、例えば炎症性腸疾患、乾癬、乾癬性関節炎または化膿性汗腺炎を患う対象の処置における例のために使用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】