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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-09
(54)【発明の名称】インターロイキン２キメラ構築物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/26 20060101AFI20230202BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230202BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230202BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230202BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230202BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230202BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230202BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230202BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230202BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20230202BHJP
C07K 14/55 20060101ALI20230202BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20230202BHJP
A61K 38/33 20060101ALI20230202BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230202BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230202BHJP
【ＦＩ】
C12N15/26
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K19/00
C07K14/47
C07K14/55
A61K38/20
A61K38/33
A61K47/68
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022535727
(86)(22)【出願日】2020-12-11
(85)【翻訳文提出日】2022-08-09
(86)【国際出願番号】 EP2020085830
(87)【国際公開番号】W WO2021116444
(87)【国際公開日】2021-06-17
(31)【優先権主張番号】19306637.0
(32)【優先日】2019-12-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518083571
【氏名又は名称】イルトゥー・ファルマ
【氏名又は名称原語表記】ＩＬＴＯＯ ＰＨＡＲＭＡ
(71)【出願人】
【識別番号】518059934
【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ
【氏名又は名称原語表記】ＳＯＲＢＯＮＮＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ
(71)【出願人】
【識別番号】591049848
【氏名又は名称】アンセルム
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ
(71)【出願人】
【識別番号】591140123
【氏名又は名称】アシスタンス ピュブリク－オピトー ドゥ パリ
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ － ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】クラッツマン，ダヴィド
(72)【発明者】
【氏名】ビリアル，ニコラ
(72)【発明者】
【氏名】バスケス，トマ
(72)【発明者】
【氏名】マリオー，ジェレミー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC15
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084DA14
4C084NA14
4C084ZB26
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA42
4H045DA04
4H045EA22
4H045FA74
4H045GA22
4H045GA23
(57)【要約】
本発明は、ｉ)インターロイキン２(ＩＬ２)部分およびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)またはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアントを含むキメラ構築物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ)少なくとも１個のインターロイキン２(ＩＬ２)部分およびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)またはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアントを含む、キメラ構築物。
【請求項2】
Ｃ４ＢＰβのフラグメントがＣ４ＢＰβのアミノ酸残基１９４～２５２または最大アミノ酸１３５までＮ末端で伸長するＣ４ＢＰβのより長いフラグメントを含むまたはそれからなる、請求項１のキメラ構築物。
【請求項3】
ａ)Ｃ４ＢＰβのフラグメントの修飾配列であって、ここで、フラグメントのアミノ酸の２５パーセント未満、好ましくは１０パーセント未満が除去または置換されており、そこで、２０２位および２１６位に位置するシステインならびに各システインの少なくとも３アミノ酸上流および下流が保存されている、修飾配列；またはｂ)Ｃ４ＢＰβのフラグメントの修飾配列であって、ここで、二量体化を担うシステインが、好ましくはアラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシンおよびトリプトファンから選択されるアミノ酸で置換され、フラグメントの他のアミノ酸がシステインで置換されている、修飾配列；または
ｃ)二量体化を担うシステインの間のベータ鎖に異種である配列の挿入により修飾されているＣ４ＢＰβのフラグメントの配列；または
ｄ)二量体化を担うシステイン間のアミノ酸の除去により修飾されているＣ４ＢＰβのフラグメントの配列
を含む、Ｃ４ＢＰβの機能的バリアントを含む、請求項１または２のキメラ構築物。
【請求項4】
該ＩＬ－２部分がヒトＩＬ－２またはその相同バリアントであり、ここで、バリアントがヒト野生型ＩＬ－２と少なくとも８５％アミノ酸同一性を有し、好ましくは、バリアントがヒト野生型ＩＬ－２と少なくとも９０％アミノ酸同一性を有するヒトＩＬ－２の活性アナログであり、ここで、該ＩＬ－２部分が好ましくは配列番号２のＮ８８位置に置換、なお好ましくは置換Ｎ８８Ｒを含むＩＬ２ムテインである、請求項１～３の何れかのキメラ構築物。
【請求項5】
ＩＬ２部分およびＣ４ＢＰβまたは該そのフラグメントがフレーム内でまたはアミノ酸リンカー、好ましくはポリＧリンカーを介して融合する、請求項１～４の何れかのキメラ構築物。
【請求項6】
ＩＬ２部分がＣ４ＢＰβのＮ末端または該そのフラグメントで融合し、好ましくはキメラタンパク質が融合タンパク質であり、一方のＩＬ２部分がＣ４ＢＰβまたは該そのフラグメントのＮ末端で融合し、他方のＩＬ２部分がＣ４ＢＰβまたは該そのフラグメントのＣ末端またはで融合する、請求項１～５の何れかのキメラ構築物。
【請求項7】
各々請求項１～６の何れかのキメラ産物からなる２個の融合ポリペプチドを含む、ホモ二量体タンパク質。
【請求項8】
請求項６に定義する組み換え二量体タンパク質を産生する方法であって：ａ)請求項１～６の何れかに定義するキメラ構築物である融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現可能とするベクターで宿主細胞をトランスフェクトし；
ｂ)トランスフェクト細胞を、融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現および二量体タンパク質の形成のためにインビボでの２個の融合ポリペプチドの共有結合的結合に適する条件下で培養し；
ｃ)形成された二量体タンパク質を回収する
ことを含む、方法。
【請求項9】
２個の融合ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質であって、ここで、第一融合ポリペプチドが請求項１～６の何れかのキメラ産物からなり、第二が、ｉ)少なくとも１個の異種ポリペプチドおよびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)またはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアントを含み、ここで、異種ポリペプチドが第一融合ポリペプチドのＩＬ－２部分と異なり、好ましくは、ここで、異種ポリペプチドが自己抗原または腫瘍抗原である、ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項10】
請求項９に定義する組み換えヘテロ二量体タンパク質を産生する方法であって：ａ.
ｉ. 請求項１～６の何れかに定義するキメラ構築物である第一融合ポリペプチド；および
ii. ｉ)少なくとも１個の異種ポリペプチドおよびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)を含み、ここで、異種ポリペプチドが第一融合ポリペプチドのインターロイキン２部分と異なる、第二融合ポリペプチドまたはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアント
をコードする１以上のヌクレオチド配列の発現を可能にする１以上のベクターで宿主細胞をトランスフェクトし；
ｂ. トランスフェクト細胞を、第一および第二融合ポリペプチドをコードする１以上のヌクレオチド配列の発現およびヘテロ二量体タンパク質の形成のためにインビボでの２個の融合ポリペプチドの結合を可能にする条件下で培養し；
ｃ. 形成されたヘテロ二量体タンパク質を回収する
ことを含む、方法。
【請求項11】
請求項１～６の何れかのキメラ構築物をコードする、核酸。
【請求項12】
請求項１１の核酸を含む、ベクター。
【請求項13】
請求項１１の核酸または請求項１２のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項14】
対象における炎症性および／または自己免疫性障害の処置に使用するための、請求項７のホモ二量体タンパク質または請求項９のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項15】
対象における癌の処置に使用するための、請求項７のホモ二量体タンパク質または請求項９のヘテロ二量体タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、薬物動態および／または薬力学が改善されたＩＬ２構築物に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
インターロイキン－２(ＩＬ２またはＩＬ－２)は、免疫系の重要な側面を制御するサイトカインである。ＩＬ２は、癌ならびに自己免疫性および／または炎症性疾患を有する患者における免疫応答をブーストする試みで使用されている。ＩＬ２は、抗原活性化Ｔ細胞のクローン性増殖を含む免疫応答を促進し、ＣＤ４＋Ｔヘルパー(Ｔｈ)１およびＴｈ２細胞の進展を駆動し、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)を終末的に分化させ、そしてＣＤ４＋Ｔｈｌ７およびＴ濾胞性ヘルパー(Ｔｆｈ)細胞の進展に対抗する、強力なＴ細胞増殖因子である。ＩＬ２はまたＴ細胞記憶リコール応答を形作る。
インターロイキン－２(ＩＬ２またはＩＬ－２)は、免疫系の重要な側面を制御するサイトカインである。ＩＬ２は、癌ならびに自己免疫性および／または炎症性疾患を有する患者における免疫応答をブーストする試みで使用されている。ＩＬ２は、抗原活性化Ｔ細胞のクローン性増殖を含む免疫応答を促進し、ＣＤ４＋Ｔヘルパー(Ｔｈ)１およびＴｈ２細胞の進展を駆動し、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)を終末的に分化させ、そしてＣＤ４＋Ｔｈｌ７およびＴ濾胞性ヘルパー(Ｔｆｈ)細胞の進展に対抗する、強力なＴ細胞増殖因子である。ＩＬ２はまたＴ細胞記憶リコール応答を形作る。
【0003】
低用量のＩＬ２は、自己組織の自己免疫性様攻撃と関連する望まない免疫応答を抑制するための寛容を選択的にブーストするのに使用される。今日までの経験は、この治療が安全であり、自己攻撃的Ｔ細胞の再活性化の兆候はないが、臨床的改善に付随する制御Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)がほぼ全患者で増加するとのことである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
それにも関わらず、治療としてのＩＬ２は、顕著にそのインビボでの短い半減期に関して改善の余地がある。これらの理由のため、新規ＩＬ２生物製剤は、薬物動態および／または薬力学が改善される必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
発明の概要
本発明は、ｉ)インターロイキン２(ＩＬ２)部分およびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)またはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアントを含む、キメラ構築物を提供する。
本発明は、ｉ)インターロイキン２(ＩＬ２)部分およびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)またはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアントを含む、キメラ構築物を提供する。
【0006】
このような構築物は、故にＩＬ２部分の半減期が改善されている。さらに、本発明者らは、驚くべきことにこのようなキメラ構築物がＴｒｅｇ拡大の選択性を改善することを示している。
【0007】
特定の実施態様において、キメラ構築物は二量体形態であり、ここで、これら単量体は、Ｃ４ＢＰβの２個のシステイン間の共有結合により結合する。ホモ二量体およびヘテロ二量体を、以下にさらに詳述する。
【0008】
好ましい実施態様において、Ｃ４ＢＰβフラグメントは、Ｃ４ＢＰβのアミノ酸残基１９４～２５２または最大アミノ酸１３５までＮ末端で伸長するＣ４ＢＰβのより長いフラグメントを含むまたはそれからなる。
【0009】
好ましい実施態様において、該Ｉｌ－２部分はヒトＩＬ－２またはその相同バリアントであり、ここで、バリアントはヒト野生型ＩＬ－２と少なくとも８５％アミノ酸同一性を有し、好ましくは、ここで、バリアントはヒト野生型ＩＬ－２と少なくとも９０％アミノ酸同一性を有するヒトＩＬ－２の活性アナログであり、ここで、該ＩＬ－２部分は、好ましくは配列番号２のＮ８８位置に置換、なお好ましくは置換Ｎ８８Ｒを含むＩＬ２ムテインである。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】Ｔｒｅｇ(Ａ)、Ｔｃｏｎｖ(Ｂ)およびＣＤ８ Ｔ細胞(Ｃ)におけるｐＳＴＡＴ５誘導の用量－応答を示す。Ｈｉ２はヒトＩＬ－２(配列番号１)であり、Ｈｉ２ｃｂはＣ４ＢＰβのＣ末端領域に融合したヒトＩＬ－２(配列番号６)であり、Ｈｉ２ｍｃｂはＣ４ＢＰβのＣ末端領域に融合した変異ＩＬ－２(配列番号７)である。
【0011】
【図2】１０１１ウイルスゲノムのＩＬ－２構築物を発現するＡＡＶ注射後のマウスにおける、４個の異なるＴ細胞コンパートメントおよびＮＫ細胞の増加倍率の反応速度曲線を示す。
【0012】
【図3】１０１１ウイルスゲノムのＩＬ－２構築物を発現するＡＡＶ注射後のマウスにおける経時的な血漿(Ａ)および尿(Ｂ)ヒトＩＬ－２の動態を示す。
【0013】
【図4】１０１２ウイルスゲノムのＩＬ－２構築物を発現するＡＡＶ注射後のマウスにおける４個の異なるＴ細胞コンパートメントおよびＮＫ細胞の増加倍率の反応速度曲線を示す。
【0014】
【図5】１０１２ウイルスゲノムのＩＬ－２構築物を発現するＡＡＶ注射後のマウスの生存カプラン・マイヤー曲線を示す。
【0015】
【図6】実験的自己免疫性脳脊髄炎(ＥＡＥ)モデルにおける、Ｈｉ２と比較した融合タンパク質Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂの治療有効性を示す。
【0016】
【図7】５日間連日の２５０００国際単位のＨｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂの１回注射に基づく実験的投与スケジュールを示す。免疫表現型検査を連日注射前に実施して、Ｔｒｅｇ動態を評価した。
【0017】
【図8】各構築物Ｈｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂの単回皮下注射後の薬物動態プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
発明の詳細な記載
定義
処置する「対象」または「患者」は、あらゆる哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。ヒト対象は小児、成人または高齢者であり得る。
定義
処置する「対象」または「患者」は、あらゆる哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。ヒト対象は小児、成人または高齢者であり得る。
【0019】
用語「処置する」または「処置」は、疾患の何らかの改善を意味する。少なくとも１個の症状の軽減または疾患の重症度もしくは進展の低減を含む。疾患が炎症性および／または自己免疫性障害であるとき、本用語は、より具体的に急性エピソード(フレア)のリスク、発生または重症度の低減を含む。用語「処置する」または「処置」は、疾患の進行の低減を包含する。特に本発明は、疾患進行の予防または減速を包含する。用語「処置する」または「処置」は、さらに、特に無症候性であるが、「リスクがある」と診断されている対象における、リスクの低減または疾患発症遅延による、予防的処置を包含する。
【0020】
「制御Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」は、免疫抑制性活性を有するＴリンパ球である。天然Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞として特徴づけられる。Ｔｒｅｇは炎症性疾患の制御に主要な役割を演ずるが、このような疾患における作用機序は十分には理解されていない。実際、大部分の炎症性疾患において、Ｔｒｅｇ枯渇は疾患を悪化させ、Ｔｒｅｇ付加は低減させる。大部分のＴｒｅｇはＣＤ４＋細胞であるが、抑制活性を有するＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔリンパ球の稀な集団も存在する。
【0021】
本発明の状況の範囲内で、「エフェクターＴ細胞」(または「Ｔｅｆｆ」)は、１以上のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を発現し、エフェクター機能(例えば、細胞毒性活性、サイトカイン分泌など)を発揮する、Ｔｒｅｇ以外の通常型Ｔリンパ球(文献ではＴｃｏｎｖと称されることもある)を意味する。本発明のヒトＴｅｆｆの主要集団は、ＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球(例えば、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｆｈ)およびＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球を含み、自己または非自己抗原に特異的であり得る。ＴｅｆｆはＦｏｘｐ３＋制御ＣＤ８＋Ｔ細胞を含まない。
【0022】
本発明の状況の範囲内で、「Ｔ濾胞性ヘルパー細胞」(または「Ｔｆｈ」)は、ＢｃＬ６、ＣＸＣＲ５およびＰＤ１を発現し、Ｆｏｘｐ３－であり、Ｂ細胞を助けるＴ ＣＤ４＋リンパ球を意味する。
【0023】
本発明の状況の中で、「Ｔ濾胞性制御性細胞」(または「Ｔｆｒ」)は、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＰＤ－１＋Ｂｃｌ６＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５－Ｔリンパ球を意味する。
【0024】
配列表は次の配列を示す：
配列番号１は野生型ヒトＩＬ２(２５３アミノ酸、シグナルペプチドを含む)である
配列番号２は成熟野生型ヒトＩＬ２(２３３アミノ酸、シグナルペプチドを含む)である
配列番号３はＣ４ＢＰベータ鎖(１～２５２)である
配列番号４はＣ４ＢＰベータ鎖のフラグメント１９４～２５２である
配列番号５はＣ４ＢＰベータ鎖のフラグメント１３７～２５２である
配列番号６はＨｉ２ｃｂのアミノ酸配列(シグナルペプチドを含む)である
配列番号７は、シグナルペプチドを含むＨｉ２ｍｃｂ(Ｎ８８Ｒ)のアミノ酸配列である
配列番号８はＧＧＧＧＳパターン(リンカー)である
配列番号９はシグナルペプチドを有しないＨｉ２ｃｂのアミノ酸配列シグナルペプチドである
配列番号１０はシグナルペプチドを有しないＨｉ２ｍｃｂ(Ｎ８８Ｒ)のアミノ酸配列である
配列番号１は野生型ヒトＩＬ２(２５３アミノ酸、シグナルペプチドを含む)である
配列番号２は成熟野生型ヒトＩＬ２(２３３アミノ酸、シグナルペプチドを含む)である
配列番号３はＣ４ＢＰベータ鎖(１～２５２)である
配列番号４はＣ４ＢＰベータ鎖のフラグメント１９４～２５２である
配列番号５はＣ４ＢＰベータ鎖のフラグメント１３７～２５２である
配列番号６はＨｉ２ｃｂのアミノ酸配列(シグナルペプチドを含む)である
配列番号７は、シグナルペプチドを含むＨｉ２ｍｃｂ(Ｎ８８Ｒ)のアミノ酸配列である
配列番号８はＧＧＧＧＳパターン(リンカー)である
配列番号９はシグナルペプチドを有しないＨｉ２ｃｂのアミノ酸配列シグナルペプチドである
配列番号１０はシグナルペプチドを有しないＨｉ２ｍｃｂ(Ｎ８８Ｒ)のアミノ酸配列である
【0025】
ＩＬ－２部分
ここで使用するインターロイキン－２(ＩＬ－２)は、哺乳動物野生型インターロイキン－２およびそのバリアントを包含する。好ましくは、ＩＬ－２はヒトＩＬ－２またはそのバリアントである。
ここで使用するインターロイキン－２(ＩＬ－２)は、哺乳動物野生型インターロイキン－２およびそのバリアントを包含する。好ましくは、ＩＬ－２はヒトＩＬ－２またはそのバリアントである。
【0026】
ＩＬ－２の活性バリアントは文献に開示されている。天然ＩＬ－２のバリアントは、そのフラグメント、アナログおよび誘導体であり得る。「フラグメント」は、ポリペプチド配列の一部しか含まないポリペプチドを意図する。「アナログ」は、１以上のアミノ酸置換、挿入または欠失を有する天然ポリペプチド配列を含むポリペプチドを意味する。ムテインおよびシュードペプチドは、アナログの具体例である。「誘導体」は、ＩＬ－２の性質(例えば、安定性、特異性など)を改善するためのグリコシル化、リン酸化、他のポリペプチドまたは分子への融合、重合化などまたは化学または酵素修飾もしくは付加を介するなど、あらゆる修飾天然ＩＬ－２ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはアナログを含む。活性バリアントのＩＬ－２部分は、一般に対象ＩＬ－２ポリペプチド、例えば成熟野生型ヒトＩＬ－２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、より好ましくは少なくとも９０％または少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する。
【0027】
ここで使用する「野生型ＩＬ－２」は、天然ヒトＩＬ－２で通常現れる１３３のアミノ酸配列を含む、天然であれ、組み換えであれ、ＩＬ－２を意味し、そのアミノ酸配列は、Fujita, et. al., PNAS USA, 80,7437-7441 (1983)に記載される。配列番号２(１３３アミノ酸)は、さらなる２０個のＮ末端アミノ酸からなるシグナルペプチドがないヒトＩＬ－２配列である。配列番号１(１５３アミノ酸)は、シグナルペプチドを含むヒトＩＬ－２配列である。
【0028】
ここで使用する「ＩＬ－２ムテイン」は、ヒト成熟インターロイキン－２タンパク質に特定のアミノ酸置換がなされているポリペプチドを意味する。アミノ酸の全ナンバリングは、特に断らない限り、配列番号２のヒト成熟インターロイキン－２タンパク質に対応してなされる。
【0029】
ある実施態様において、１２５位のシステインは、セリン(Ｃ１２５Ｓ)、アラニン(Ｃ１２５Ａ)、スレオニン(Ｃ１２５Ｔ)またはバリン(Ｃ１２５Ｖ)などの中性アミノ酸に置換される。
【0030】
例えば、Ｏ－グルコシル化部位の除去は、活性バリアントがＣＨＯまたはＨＥＫ細胞などの哺乳動物細胞で発現されたとき、より均質の産物をもたらす。
【0031】
ある実施態様において、活性バリアントは、ヒトＩＬ－２の残基３に対応する位置でのＩＬ－２のＯ－グルコシル化部位を除去するさらなるアミノ酸変異を含む。ある実施態様において、ヒトＩＬ－２の残基３に対応する位置でＩＬ－２のＯ－グルコシル化部位を除去する該さらなるアミノ酸変異はアミノ酸置換である。アミノ酸置換の例は、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３ＫおよびＴ３Ｐを含む。特定の実施態様において、該さらなるアミノ酸変異はアミノ酸置換Ｔ３Ａである。
【0032】
・Ｔ－ｒｅｇ細胞増殖、生存、活性化および／または機能を選択的に促進する活性バリアントは、炎症性および／または自己免疫性障害の処置に特に有用である。
【0033】
「選択的に促進」は、活性バリアントが、Ｔ－ｒｅｇ細胞における活性を促進するが、非制御Ｔ細胞における活性を促進する能力は限定的であるかまたはないことを意味する。ここにさらに記載されるのは、Ｔ－ｒｅｇ細胞増殖、生存、活性化および／または機能を選択的に促進する活性バリアントをスクリーニングするためのアッセイである。
【0034】
バリアントＩＬ－２ポリペプチドが活性であるか否かを決定する方法は、当分野で利用可能である。例えばＷＯ２０１６／０１４４２８参照。活性バリアントは、Ｔｒｅｇを刺激する能力を示すバリアントとして定義され、Ｔｒｅｇの刺激を超えてＴｅｆｆを刺激しない限り、野生型ＩＬ－２またはアルデスロイキン(下に定義する)と比較して、Ｔｒｅｇを刺激する能力が改善されたまたは類似の能力を有するまたは能力が低いバリアントを含む。候補分子がＴ細胞、特にＴｒｅｇまたはＮＫ細胞を刺激するか否かを試験する方法は周知である。バリアントを、エフェクターＴ細胞(例えばＣＤ８＋Ｔ細胞)、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇまたはＮＫ細胞を刺激する能力について試験し得る。好ましい実施態様において、活性バリアントは、野生型ＩＬ２またはアルデスロイキンと比較して、ＮＫ細胞を刺激する能力の低減を示す。ＳＴＡＴ５リン酸化のモニタリングは、Yu et al, Diabetes 2015;64:2172-2183に記載のとおり、バリアントがＴｅｆｆよりＴｒｅｇを優先的に刺激する能力を評価する単純な方法である。特定の実施態様において、バリアントは、Ｔｅｆｆを含む他の免疫細胞より少なくとも１０倍低い用量でＴｒｅｇであるレベルのＳＴＡＴ５リン酸化が達成されるとき、特に有用である。
【0035】
該活性バリアントは、Ｔｒｅｇ細胞の生存、増殖、活性化および／または機能を優先的に誘導するシグナル伝達事象を誘導する。ある実施態様において、ＩＬ－２バリアントは、Ｔｒｅｇ細胞において、ＳＴＡＴ５リン酸化および／またはＩＬ－２Ｒの下流のシグナル伝達分子の１以上、例えば、ｐ３８、ＥＲＫ、ＳＹＫおよびＬＣＫのリン酸化を刺激する能力を保持する。他の実施態様において、ＩＬ－２バリアントは、Ｔｒｅｇ細胞において、Ｔｒｅｇ細胞生存、増殖、活性化および／または機能に重要であるＦＯＸＰ３、Ｂｃｌ－２、ＣＤ２５またはＩＬ－１０などの遺伝子またはタンパク質の転写またはタンパク質発現を刺激する能力を保持する。他の実施態様において、ＩＬ－２バリアントは、ＣＤ２５＋Ｔ細胞表面でＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒ複合体のエンドサイトーシスを刺激する能力の低減を示す。他の実施態様において、ＩＬ－２バリアントは、ＡＫＴおよび／またはｍＴＯＲ(ラパマイシンの哺乳動物標的)のリン酸化が非効率的である、低減しているまたは存在しないなどＰＩ３－キナーゼシグナル伝達の刺激が非効率的である、低減しているまたは存在しない。さらに他の実施態様において、ＩＬ－２バリアントは、Ｔｒｅｇ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化および／またはＩＬ－２Ｒの下流のシグナル伝達分子の１以上のリン酸化を刺激する野生型ＩＬ－２の能力を保持し、なお、ＦＯＸＰ３－ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞においてＳＴＡＴ５、ＡＫＴおよび／またはｍＴＯＲまたはＩＬ－２Ｒの下流の他のシグナル伝達分子のリン酸化が非効率的である、低減しているまたは存在しないことが示される。他の実施態様において、ＩＬ－２バリアントは、ＦＯＸＰ３－ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の生存、増殖、活性化および／または機能の刺激が非効率的であるまたは不可能である。
【0036】
全ての場合、これらバリアントは、生物学的活性の決定に普遍的に使用され得るＣＴＬＬ－２またはＨＴ－２などの細胞株を刺激する能力を有する。
【0037】
例えば、ＩＬ－２の生物学的活性は、増殖がＩＬ－２に依存するＨＴ－２細胞株(クローンＡ５Ｅ、ＡＴＣＣ(登録商標)ＣＲＬ－１８４１TM)で実施される細胞ベースのアッセイで決定され得る。一定範囲の試験インターロイキン－２産物の存在下の細胞増殖を、ＩＬ－２国際標準(WHO 2nd International Standard for INTERLEUKIN 2 (Human, rDNA derived) NIBSC code: 86/500)で記録された増殖と比較する。細胞増殖を、[３－(４,５－ジメチルチアゾール－２－イル)－５－(３－カルボキシメトキシフェニル)－２－(４－スルフォフェニル)－２Ｈ－テトラゾリウム(分子内塩、ＭＴＳ)の添加および活性生存可能細胞によるホルマザンへの変換後に測定する。次いで、ホルマザン濃度を、４９０nmで分光測色法により測定する。
【0038】
ＩＬ－２バリアントの例は、例えば、ＥＰ１０９７４８、ＥＰ１３６４８９、ＵＳ４,７５２,５８５；ＥＰ２００２８０、ＥＰ１１８６１７、ＷＯ９９／６０１２８、ＥＰ２２８８３７２、ＵＳ９,６１６,１０５、ＵＳ９,５８０,４８６、ＷＯ２０１０／０８５４９５、ＷＯ２０１６／１６４９３７に開示される。
【0039】
例えば、ある変異は、ＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒβ／ＣＤ１２２および／またはＩＬ－２Ｒγ／ＣＤ１３２)のシグナル伝達鎖に対する親和性を低減させおよび／またはＩＬ－２受容体の一方または両方のサブユニットからシグナル伝達事象を誘導する能力を低減させる可能性がある。他の変異は、ＣＤ２５(ＩＬ－２Ｒα)に高い親和性を付与し得る。何れの場合も、このような変異は、Ｔｒｅｇの生存、増殖、活性化および／または機能を優先的に誘導する活性バリアントを規定する。この性質は、表面プラズモン共鳴によりモニターされ得る。
【0040】
有用なバリアントの特定の例は、選択アミノ酸が、そのアミノ酸が配列番号２の野生型ＩＬ－２の成熟配列で通常現れる位置を参照して同定されることを意味する、野生型ＩＬ－２に従う番号付けで、位置Ｄ２０、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｖ６９、Ｑ７４、Ｎ８８、Ｖ９１またはＱ１２６での少なくとも１個のアミノ酸置換を示すＩＬ－２ムテインを含む。
【0041】
好ましいＩＬ－２ムテインは、位置Ｄ２０Ｈ、Ｄ２０Ｉ、Ｄ２０Ｙ、Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９ＡＰ、Ｑ７４、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｉ、Ｖ９１ＫまたはＱ１２６Ｌに少なくとも１個の置換を含む。
【0042】
ある実施態様において、ＩＬ－２ムテイン分子は、Ｖ９１Ｋ置換を含む。ある実施態様において、ＩＬ－２ムテイン分子は、Ｎ８８Ｄ置換を含む。ある実施態様において、ＩＬ－２ムテイン分子は、Ｎ８８Ｒ置換を含む。ある実施態様において、ＩＬ－２ムテイン分子は、Ｈ１６Ｅ、Ｄ８４Ｋ、Ｖ９１Ｎ、Ｎ８８Ｄ、Ｖ９１ＫまたはＶ９１Ｒの置換、それらの何らかの組み合わせを含む。ある実施態様において、これらＩＬ－２ムテイン分子は、ここに記載する１２５位の置換も含む。ある実施態様において、ＩＬ－２ムテイン分子は、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ａ、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｈ、Ｄ２０Ｉ、Ｄ２０Ｙ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｅ９５ＧおよびＱ１２６からなる群から選択される１以上の置換を含む。ある実施態様において、ＩＬ－２ムテイン分子のアミノ酸配列は、成熟ＩＬ－２配列に示されるアミノ酸配列と、Ｃ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓ置換およびＴ３Ｎ、Ｔ３Ａ、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｅ９５Ｇ、Ｑ１２６Ｉ、Ｑ１２６ＬおよびＱ１２６Ｆから選択される１個の置換で異なる。ある実施態様において、ＩＬ－２ムテイン分子は、成熟ＩＬ－２配列に示されるアミノ酸配列と、Ｃ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓ置換およびＤ２０Ｈ、Ｄ２０Ｉ、Ｄ２０Ｙ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｗ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｓ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｔ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１ＫおよびＶ９１Ｓから選択される１個の置換で異なる。ある実施態様において、ＩＬ－２ムテインは、Ｎ８８Ｒおよび／またはＤ２０Ｈ変異を含む。
【0043】
これらの置換は、単独でまたは互いに組み合わせて使用され得る。ある実施態様において、ムテインはこれら置換の各々を含む。ある実施態様において、ムテインはこれら変異の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個を含む。
【0044】
ある実施態様において、ＩＬ－２ムテインは、Ｎ８８ＲまたはＮ８８Ｄ変異、好ましくはＮ８８Ｒを含む。ある実施態様において、ＩＬ－２ムテインは、Ｃ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓ変異を含む。これら置換は、単独でまたは互いに組み合わせて使用され得る。ある実施態様において、ムテインはこれら変異の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個を含む。ある実施態様において、ムテインはこれら置換の各々を含む。
【0045】
特定の実施態様において、ＩＬ－２部分はアルデスロイキンである。アルデスロイキンは、Proleukin(登録商標)の活性成分である。アルデスロイキンは、成熟ヒトＩＬ－２の配列(配列番号２)と比較して、第一アミノ酸(アラニン)の欠失および１２５位のシステインのセリンでの置換の２個のアミノ酸修飾を含む、成熟ヒトＩＬ－２のバリアントである。
【0046】
ＩＬ－２の保存的修飾および他の位置での置換(すなわち、ムテインの二次または三次構造に最小限に影響するもの)が包含される。このような保存的置換は、The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978), and by Argos in EMBO J., 8: 779-785 (1989)においてDayhoffにより記載されたものを含む。例えば、次の群の一つに属するアミノ酸は、保存的変化を表す：－ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；－ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；－ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；－ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；－ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ；および－ａｓｐ、ｇｌｕ。
【0047】
ＩＬ－２Ｒのαサブユニットへの結合を妨害する変異を有するバリアントは、このような変異体がＴｒｅｇを刺激する能力を低減させ得るため、好ましくない。
【0048】
・Ｔｅｆｆ細胞増殖、生存、活性化および／または機能を促進する活性バリアントは癌の処置に有用であり得る。
【0049】
このようなＩＬ－２の活性バリアントは、各々野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較において、異体ＩＬ－２ポリペプチドのＩＬ－２受容体のα－サブユニット(ＣＤ２５)に対する親和性を失くすかまたは低減させ、中間親和性ＩＬ－２受容体に対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドに対する親和性を保持する少なくとも１個のアミノ酸変異を含む。この性質は、表面プラズモン共鳴を使用してモニターされ得る。
【0050】
好ましい活性バリアントは、Ｆ４２Ａ、Ｋ４３Ｎ、Ｙ４５Ａおよび／またはＥ６２Ａ置換を含むＩＬ－２ムテインを含む。
【0051】
ＣＤ２５に対する親和性が減少したヒトＩＬ－２(ｈＩＬ－２)の変異体のような活性バリアントは、例えばアミノ酸位置３５、３８、４２、４３、４５、６２または７２またはそれらの組み合わせでのアミノ酸置換により産生され得る(ナンバリングは、配列番号２のヒトＩＬ－２配列に対応する)。アミノ酸置換の例は、Ｋ３５Ｅ、Ｋ３５Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｒ３８Ｅ、Ｒ３８Ｎ、Ｒ３８Ｆ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ３８Ｌ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｙ、Ｒ３８Ｗ、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｋ４３Ｅ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｅ６２Ｇ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｓ、Ｅ６２Ｔ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６２Ｅ、Ｅ６２Ｎ、Ｅ６２Ｄ、Ｅ６２Ｒ、Ｅ６２Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２ＲおよびＬ７２Ｋを含む。本発明のキメラ構築物に有用な特定の活性バリアントは、ヒトＩＬ－２の残基４２、４５または７２に対応するアミノ酸位置またはそれらの組み合わせにアミノ酸変異を含む。ある実施態様において、該アミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２ＲおよびＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換、より具体的にＦ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇの群から選択されるアミノ酸置換である。これら活性バリアントは、野生型形態のＩＬ－２変異体と比較して、中間親和性ＩＬ－２受容体への実質的に類似する結合親和性を示し、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットおよび高親和性ＩＬ－２受容体(ＩＬ２Ｒαβγ)への実質的に減少した親和性を有する。
【0052】
有用な活性バリアントの他の特徴は、ＩＬ－２受容体担持Ｔおよび／またはＮＫ細胞の増殖を誘導する能力、ＩＬ－２受容体担持Ｔおよび／またはＮＫ細胞におけるＩＬ－２シグナル伝達を誘導する能力、ＮＫ細胞による二次サイトカインとしてインターフェロン(ＩＦＮ)－γを産生する能力、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)による二次サイトカイン － 特にＩＬ－１０およびＴＮＦ－α － の同化を誘導する能力の低減、制御Ｔ細胞を活性化する能力の低減、Ｔ細胞におけるアポトーシスを誘導する能力の低減およびインビボでの毒性プロファイルの低減を含み得る。
【0053】
特定の活性バリアントは、活性バリアントのＩＬ－２受容体のα－サブユニットへの親和性を失くすかまたは低減させるが、活性バリアントの中間親和性ＩＬ－２受容体への親和性を保持する、３個のアミノ酸変異を含む。ある実施態様において、該３個のアミノ酸変異は、ヒトＩＬ－２の残基４２、４５および７２に対応する位置である。ある実施態様において、該３個のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。ある実施態様において、該３個のアミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２ＲおよびＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。特定の実施態様において、該３個のアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇである(ナンバリングは配列番号２のヒトＩＬ－２配列に対応する)。
【0054】
ある実施態様において、該アミノ酸変異は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＩＬ－２受容体のα－サブユニットへの親和性を、少なくとも５倍、特に少なくとも１０倍、より具体的に少なくとも２５倍低減させる。活性バリアントのＩＬ－２受容体のα－サブユニットへの親和性を低減する１を超えるアミノ酸変異がある実施態様において、アミノ酸変異の組み合わせは、活性バリアントのＩＬ－２受容体のα－サブユニットへの親和性を少なくとも３０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍低減させ得る。ある実施態様において、該アミノ酸変異またはアミノ酸変異の組み合わせは、活性バリアントのＩＬ－２受容体のα－サブユニットへの親和性を失くし、その結果結合が表面プラズモン共鳴で検出不可能である。
【0055】
中間親和性受容体への実質的に類似する結合、すなわち変異体ＩＬ－２ポリペプチドの該受容体への親和性の保存は、活性バリアントが、野生型形態のＩＬ－２変異体の中間親和性ＩＬ－２受容体への親和性の約７０パーセントを超える親和性を示すとき、達成される。本発明において有用な活性バリアントは、このような親和性を約８０パーセントを超えておよびさらには約９０パーセントを超えて示し得る。
【0056】
ＩＬ－２のＯ－グルコシル化の除去と組み合わせたＩＬ－２のＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する親和性の低減は、性質が改善されたＩＬ－２タンパク質をもたらす。
【0057】
特定の実施態様において、活性バリアントは、活性化Ｔリンパ球細胞の増殖、活性化Ｔリンパ球細胞の分化、細胞毒性Ｔ細胞(ＣＴＬ)活性、活性化Ｂ細胞の増殖、活性化Ｂ細胞の分化、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の増殖、ＮＫ細胞の細胞毒性活性、ＮＫ細胞の分化、活性化Ｔ細胞またはＮＫ細胞によるサイトカイン分泌およびＮＫ／リンパ球活性化キラー(ＬＡＫ)抗腫瘍細胞毒性からなる群から選択される細胞応答の１以上を誘導できる。
【0058】
ある実施態様において、これら活性バリアントは、ここに記載する１２５位の置換も含む。
【0059】
Ｃ４ＢＰβまたはＣ４ＢＰβフラグメント
Ｃ４ＢＰタンパク質は、凝血および補体系に関与する。Ｃ４ＢＰの主要形態は、７個の同一７５kDアルファ鎖および１個の４５kDベータ鎖からなる。アルファ鎖およびベータ鎖は、それぞれ８個および３個のＳＣＲ(ショートコンセンサスリピート)ドメインを含み、これらモチーフは多くの補体制御タンパク質で見られ、ベータシートに組織化された５０～７０アミノ酸からなる。ヒトＣ４ＢＰのベータ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３として示す。
Ｃ４ＢＰタンパク質は、凝血および補体系に関与する。Ｃ４ＢＰの主要形態は、７個の同一７５kDアルファ鎖および１個の４５kDベータ鎖からなる。アルファ鎖およびベータ鎖は、それぞれ８個および３個のＳＣＲ(ショートコンセンサスリピート)ドメインを含み、これらモチーフは多くの補体制御タンパク質で見られ、ベータシートに組織化された５０～７０アミノ酸からなる。ヒトＣ４ＢＰのベータ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３として示す。
【0060】
このポリペプチド配列に対応する核酸配列も、Hillarp and Dahlback (1990, PNAS, vol 87, pp 1183-1187)により記載されている。
【0061】
Ｃ４ＢＰタンパク質の重合におけるアルファ鎖の役割は、Kask et al (Biochemistry 2002, 41, 9349-9357)により試験されている。この著者らは、アルファ鎖のＣ末端部分、特にそのらせん構造および２個のシステインの存在が、アルファ鎖が異種系で発現されたとき、Ｃ４ＢＰタンパク質の重合に必要であることを示している。
【0062】
欧州特許出願２２２７０３０は、目的のポリペプチドと融合したＣ４ＢＰタンパク質のアルファ鎖およびベータ鎖のＣ末端フラグメントの使用による、ヘテロ多量体組み換えタンパク質の産生を記載する。
【0063】
ＵＳ特許７,８８４,１９０は、その用途と無関係に、二量体タンパク質の産生のためにＣ４ＢＰタンパク質のアルファ鎖と結合した、Ｃ４ＢＰタンパク質のベータ鎖の使用を記載する。
【0064】
本発明の実施に際して使用するＣ４ＢＰタンパク質は、有利にヒトＣ４ＢＰタンパク質である。
【0065】
好ましい実施態様において、ＩＬ２部分は少なくともアミノ酸１９４～２５２(配列番号４)を含むまたはそれからなるＣ４ＢＰβ鎖のフラグメントに融合される。
【0066】
ベータ鎖のより長いフラグメントまたはベータ鎖全体をコードする配列も使用され得る。ある適用について、凝血に参加するプロテインＳに結合できるベータ鎖をコードする配列の使用を回避することが好ましい。選択配列がベータ鎖の２つの最初のＳＣＲモチーフを含むフラグメントをコードするならば、これらは、好ましくは、プロテインＳとの相互作用の可能性を排除するために、アミノ酸の付加、欠失または置換により変異されたバージョンである。ＳＣＲモチーフおよび／または[ＧＳ]ドメインは、得られた融合ポリペプチドの柔軟性を修飾、例えば増加する目的でまたはキメラタンパク質が多量体、特に二量体形成のために適当な配座を採ることを可能とするために加え得る。
【0067】
Ｎ末端で最大アミノ酸１３５まで伸張するＣ４ＢＰβの長いフラグメントを使用し得る。
【0068】
特定の実施態様において、Ｃ４ＢＰβ鎖のフラグメントは、少なくともアミノ酸１８５～２５２、１８０～２５２、１７５～２５２、１７０～２５２、１６５～２５２、１６０～２５２、１５５～２５２、１５０～２５２、１４５～２５２、１４０～２５２または１３５～２５２を含むまたはそれから成ることができる(配列番号３に対応して)。
【0069】
特定の実施態様において、Ｃ４ＢＰβ鎖のフラグメントは、少なくともアミノ酸１３７～２５２(配列番号５)を含むまたはそれから成る。
【0070】
Ｃ４ＢＰβの機能的バリアントを使用し得る。機能的バリアントは、少なくとも１個の二量体、例えばホモ二量体またはヘテロ二量体、三量体、四量体または種々の数のキメラタンパク質を含むあらゆる多量体を形成する能力が維持されている。
【0071】
本発明の状況の範囲内で、用語「Ｃ４ＢＰβ鎖のフラグメントの機能的バリアント」は、ベータ鎖のフラグメントの配列に関して、１以上のアミノ酸の欠失、置換または付加により修飾されているポリペプチド配列を意味し、いずれにしても、該修飾配列は、本発明の方法を使用して、少なくとも二量体タンパク質を形成する能力を維持する。より厳密に、フラグメントの機能的バリアントをコードする配列を使用する二量体タンパク質の産生は、同一発現系で、該フラグメントをコードする天然配列(配列番号３またはそのフラグメント)で得られたものと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、なお好ましくは９５％等しいものであり得る。好ましくは、バリアントは、含まれる融合ポリペプチドの８０％超が、本発明により、真核生物発現系で二量体の形態で産生される。
【0072】
特定の実施態様において、ベータ鎖のフラグメントのバリアントは、Hillarp and Dahlback (1990, PNAS, Vol. 87, pp 1183-1187)により記載のとおり、ストリンジェントな条件下、フラグメントをコードする野生型配列とハイブリダイズできる核酸によりコードされる。
【0073】
用語「ストリンジェントな条件」は、約６５℃で、例えば、６＊ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ、５＊デンハルト溶液および１００μgの不特定のＤＮＡの溶液または同等なイオン強度を有するあらゆる他の溶液で、および６５℃で、例えば最大０.２＊ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳの溶液または同等なイオン強度を有するあらゆる他の溶液で洗浄後、２個の一本鎖ＤＮＡ配列の特定のハイブリダイゼーションを可能とする条件を意味する。
【0074】
好ましくは、該野生型フラグメントの機能的バリアントをコードし、該フラグメントをコードする配列とストリンジェントな条件下ハイブリダイズするヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーション部分において、フラグメントをコードする配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％の長さを有する。特定の実行において、該フラグメントの機能的バリアントをコードし、該フラグメントをコードする配列とストリンジェントな条件下ハイブリダイズするヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーション部分において、該フラグメントをコードする配列と実質的に同じ長さを有する。
【0075】
さらなる実行において、機能的バリアントは、二量体化機能に必須でない野生型フラグメント１以上のアミノ酸が除去または置換されているおよび／または二量体化に必須である１以上のアミノ酸が等価な官能基を有するアミノ酸で置き換えられている(保存的置換)、修飾配列を有する。２０１位および２１５位に位置する２個のシステインおよびこれらシステイン周囲のペプチド構造が、例えば、各システインの少なくとも３アミノ酸上流および下流の保存により、二量体化に必要なジスルフィド架橋を形成することが可能であるように保存されるのが特に推奨される。特に、機能的バリアントは、二量体化を担うシステインの間に、ベータ鎖の異種配列および特にＣ４ＢＰのアルファ鎖のドメインを挿入することにより、または、対照的に、同システイン間に存在するあるアミノ酸を除去することによりまた得られ得る。あるいは、機能的バリアントを、あるアミノ酸の点修飾により産生でき、特に二量体化を担うシステインを、特に二量体化過程を考慮して、中性アミノ酸に置換し(例えばアミノ酸Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｐ、Ｍ、Ｉ、ＬおよびＷ)および同時にシステイン間のイントラカテナリーおよび／またはインターカテナリージスルフィド架橋を形成する能力を保存するために、他のアミノ酸をシステインで置換する。これら修飾は、故に、多量体化過程、特に二量体化に関与する種々のシステイン間の距離のバリエーションをもたらす。
【0076】
好ましくは、１９４～２５２フラグメントのアミノ酸の５０％未満、好ましくは２５％未満または１０％未満(例えば５アミノ酸以下)または５％未満(例えば１または２アミノ酸)が除去または置換される。
【0077】
￥
特定の実施態様において、機能的バリアントは、
ａ)Ｃ４ＢＰβのフラグメント(好ましくは１９４～２５２フラグメント)の修飾配列であって、ここで、フラグメント(好ましくは１９４～２５２フラグメント)のアミノ酸の２５パーセント未満、好ましくは１０パーセント未満が除去または置換されており、そこで、２０２位および２１６位に位置するシステイン(配列番号３に対応して番号付け)ならびに各システインの少なくとも３アミノ酸上流および下流が保存されている、修飾配列；または
ｂ)Ｃ４ＢＰβのフラグメント(好ましくは１９４～２５２フラグメント)の修飾配列であって、ここで、二量体化を担うシステインが、好ましくはアラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシンおよびトリプトファンから選択されるアミノ酸で置換され、フラグメントの他のアミノ酸がシステインで置換されている、修飾配列；または
ｃ)二量体化を担うシステインの間のベータ鎖に異種である配列の挿入により修飾されているＣ４ＢＰβのフラグメント(好ましくは１９４～２５２フラグメント)の配列；または
ｄ)二量体化を担うシステイン間のアミノ酸の除去により修飾されているＣ４ＢＰβのフラグメント(好ましくは１９４～２５２フラグメント)の配列
を含むまたはそれからなる。
特定の実施態様において、機能的バリアントは、
ａ)Ｃ４ＢＰβのフラグメント(好ましくは１９４～２５２フラグメント)の修飾配列であって、ここで、フラグメント(好ましくは１９４～２５２フラグメント)のアミノ酸の２５パーセント未満、好ましくは１０パーセント未満が除去または置換されており、そこで、２０２位および２１６位に位置するシステイン(配列番号３に対応して番号付け)ならびに各システインの少なくとも３アミノ酸上流および下流が保存されている、修飾配列；または
ｂ)Ｃ４ＢＰβのフラグメント(好ましくは１９４～２５２フラグメント)の修飾配列であって、ここで、二量体化を担うシステインが、好ましくはアラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシンおよびトリプトファンから選択されるアミノ酸で置換され、フラグメントの他のアミノ酸がシステインで置換されている、修飾配列；または
ｃ)二量体化を担うシステインの間のベータ鎖に異種である配列の挿入により修飾されているＣ４ＢＰβのフラグメント(好ましくは１９４～２５２フラグメント)の配列；または
ｄ)二量体化を担うシステイン間のアミノ酸の除去により修飾されているＣ４ＢＰβのフラグメント(好ましくは１９４～２５２フラグメント)の配列
を含むまたはそれからなる。
【0078】
キメラ構築物
好ましくは、ＩＬ２部分は、Ｃ４ＢＰβのＮ末端または該そのフラグメントで融合する。
好ましくは、ＩＬ２部分は、Ｃ４ＢＰβのＮ末端または該そのフラグメントで融合する。
【0079】
好ましい実施態様において、キメラ構築物は、１個のＩＬ２部分がＣ４ＢＰβまたは該そのフラグメントのＮ末端で融合し、他のＩＬ２部分がＣ４ＢＰβまたは該そのフラグメントのＣ末端またはで融合する、融合タンパク質を含む。このような実施態様によると、融合タンパク質は、Ｎ末端→Ｃ末端で、次の配列を含む：ＩＬ２－Ｃ４ＢＰβ－ＩＬ２。
【0080】
ＩＬ２部分およびＣ４ＢＰβまたは該そのフラグメントは、フレーム内で(直接)またはアミノ酸リンカー、好ましくはポリＧリンカーを介して融合し得る。
【0081】
用語「リンカー」は、５～８０アミノ酸、好ましくは５～３０、なお好ましくは１０～２０アミノ酸を含む、(ポリ)ペプチドをいう。適当なリンカーは当分野で知られる。ある実施態様において、リンカーはＧＧＧＧＳ(配列番号８)反復を含むが、当業者は、一般的推奨(Argos, 1990, J Mol Biol. 20;211(4):943-58; George R, Heringa J. An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding. Protein Eng. 2002;15:871-879)に従う他の配列も使用できることを認識する。小さい、非極性(例えばＧｌｙ)または極性(例えばＳｅｒまたはＴｈｒ)アミノ酸からなるリンカーは、柔軟性を提供し、機能的ドメイン接続の可動性を可能とする。
【0082】
特定の実施態様において、キメラ構築物は、配列番号９または配列番号１０を含むまたはそれからなる。このようなキメラ構築物は、下記のとおり好ましくはホモ二量体を形成しまたはヘテロ二量体の産生に使用され得る。
【0083】
ホモ二量体およびヘテロ二量体構築物
ａ)ｉ)少なくとも１個のインターロイキン２(ＩＬ２)部分およびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)を含む融合ポリペプチドであるキメラ構築物をコードするヌクレオチド配列またはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアントの発現を可能とするベクターで宿主細胞をトランスフェクトし；
ｂ)トランスフェクト細胞を、融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現および二量体タンパク質の形成のためにインビボでの２個の融合ポリペプチドの共有結合的結合に適する条件下で培養し；
ｃ)形成された二量体タンパク質を回収し、好ましくは精製する
ことを含む、組み換え二量体タンパク質を産生する方法がここに記載される。
ａ)ｉ)少なくとも１個のインターロイキン２(ＩＬ２)部分およびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)を含む融合ポリペプチドであるキメラ構築物をコードするヌクレオチド配列またはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアントの発現を可能とするベクターで宿主細胞をトランスフェクトし；
ｂ)トランスフェクト細胞を、融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現および二量体タンパク質の形成のためにインビボでの２個の融合ポリペプチドの共有結合的結合に適する条件下で培養し；
ｃ)形成された二量体タンパク質を回収し、好ましくは精製する
ことを含む、組み換え二量体タンパク質を産生する方法がここに記載される。
【0084】
トランスフェクト細胞は、好ましくはＣ４ＢＰタンパク質の重合に関与するＣ４ＢＰタンパク質のアルファ鎖のＣ末端フラグメントをコードするヌクレオチド配列の発現を可能とする如何なる核酸も含まない。
【0085】
特定の実施態様において、ヘテロ二量体を産生する方法であって：
ａ.
ｉ. ｉ)少なくとも１個のインターロイキン２(ＩＬ２)部分およびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)を含む第一融合ポリペプチドまたはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアント；および
ii. ｉ)少なくとも１個の異種ポリペプチドおよびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)を含み、ここで、異種ポリペプチドが第一融合ポリペプチドのインターロイキン２(部分)と異なると定義される、第二融合ポリペプチドまたはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアント
をコードする１以上のヌクレオチド配列の発現を可能にする１以上のベクターで宿主細胞をトランスフェクトし；
ｂ. トランスフェクト細胞を、第一および第二融合ポリペプチドをコードする１以上のヌクレオチド配列の発現およびヘテロ二量体タンパク質の形成のためにインビボでの２個の融合ポリペプチドの結合を可能にする条件下で培養し；
ｃ. 形成されたヘテロ二量体タンパク質を回収し、好ましくは精製する
ことを含む、方法がここに記載される。
ａ.
ｉ. ｉ)少なくとも１個のインターロイキン２(ＩＬ２)部分およびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)を含む第一融合ポリペプチドまたはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアント；および
ii. ｉ)少なくとも１個の異種ポリペプチドおよびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)を含み、ここで、異種ポリペプチドが第一融合ポリペプチドのインターロイキン２(部分)と異なると定義される、第二融合ポリペプチドまたはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアント
をコードする１以上のヌクレオチド配列の発現を可能にする１以上のベクターで宿主細胞をトランスフェクトし；
ｂ. トランスフェクト細胞を、第一および第二融合ポリペプチドをコードする１以上のヌクレオチド配列の発現およびヘテロ二量体タンパク質の形成のためにインビボでの２個の融合ポリペプチドの結合を可能にする条件下で培養し；
ｃ. 形成されたヘテロ二量体タンパク質を回収し、好ましくは精製する
ことを含む、方法がここに記載される。
【0086】
好ましくは、第二融合ポリペプチドにおいて、Ｃ４ＢＰβまたは該フラグメントは、異種ポリペプチドのＣ末端に融合する。
【0087】
異種ポリペプチドを引用するときの用語「異なる」は、第一融合ポリペプチドのインターロイキン２(部分)の一次配列と少なくとも１個のアミノ酸が異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。あるいは、用語「異なる」はまた同じ一次配列を有するが、例えば、アセチル化、アミド化、ビオチニル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化もしくは硫酸化の点でまたは脂質(イソプレニル化、パルミトイル化およびミリストイル化)、糖質(グルコシル化)もしくはポリペプチド(ユビキチン化)付加により、翻訳後修飾が異なる異種ポリペプチドも含む。
【0088】
好ましい実施態様において、異種ポリペプチドはＩＬ２ではない。
【0089】
特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、自己抗原、そのような自己抗原をターゲティングするものを含む抗体または抗体フラグメントおよび例えば、ＩＬ２Ｒのアルファ鎖または受容体リガンドを含む受容体からなる群から選択され得る。このような構築物は、自己免疫性および／または炎症性障害の処置に特に有用である。このような実施態様において、第一融合ポリペプチドのＩＬ－２部分は、好ましくはＴｒｅｇ細胞増殖、生存、活性化および／または機能を促進する活性バリアントである。
【0090】
他の特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、腫瘍抗原、微生物抗原、このような抗原をターゲティングするものを含む抗体または抗体フラグメントまたはＩＬ２Ｒのアルファ鎖または受容体リガンドを含む受容体からなる群から選択され得る。このような構築物は、癌の処置に特に有用である。この場合、第一融合ポリペプチドのＩＬ－２部分は、好ましくはＴｅｆｆ細胞増殖、生存、活性化および／または機能を促進する活性バリアントである。
【0091】
このようなヘテロ二量体タンパク質も本発明の一部である。
【0092】
特定の実施態様において、宿主細胞は、２個の融合ポリペプチド、ｉ)少なくとも１個のインターロイキン２(ＩＬ２)部分およびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)を含む第一融合ポリペプチドＡまたはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアント；およびｉ)少なくとも１個の異種ポリペプチドおよびii)二量体タンパク質の形成ができるＣ４ｂ結合タンパク質のベータ鎖(Ｃ４ＢＰβ)を含み、ここで、異種ポリペプチドが第一融合ポリペプチドのインターロイキン２(部分)と異なると定義される、第二融合ポリペプチドＢまたはその少なくとも１個のフラグメントもしくは機能的バリアントの共発現を可能とする。この特定の実施態様において、２個の融合ポリペプチドの共発現は、ホモ二量体Ａ－ＡおよびＢ－Ｂの産生およびヘテロ二量体Ａ－Ｂの産生も可能とし得る。
【0093】
上に定義する二量体またはヘテロ二量体タンパク質の合成を可能とするおよび上に定義する産生方法の工程ａ)の実施により得られる組み換え真核生物細胞も提供される。宿主細胞のより詳細な産生を下に記載する。
【0094】
産生方法
融合タンパク質の形態であり、ホモまたはヘテロ二量体であるキメラ構築物は、適当な発現ベクターでＤＮＡ組み換え技術により産生できる。
融合タンパク質の形態であり、ホモまたはヘテロ二量体であるキメラ構築物は、適当な発現ベクターでＤＮＡ組み換え技術により産生できる。
【0095】
発現ベクターは、構築物が導入される宿主細胞に応じて選択される。好ましくは、発現ベクターは、真核生物細胞における発現を可能とするベクター、特に染色体ベクターまたはエピソームベクターまたはウイルス誘導体、特にプラスミド、酵母染色体またはウイルス、例えばバキュロウイルス、パルボウイルスまたはＳＶ４０、レトロウイルスまたはそれらの組み合わせ由来のベクター、特にファージミドおよびコスミドから選択される。特定の実施態様において、バキュロウイルスの発現を可能とするベクターは、昆虫細胞に感染できる。
【0096】
必要であれば、融合ポリペプチドをコードする配列は、好ましくはその５’部分に、融合ポリペプチドの分泌のためのシグナルペプチドをコードする配列も含む。慣用的に、シグナルペプチドの配列は１５～２０アミノ酸で、疎水性アミノ酸(Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔおよびＶａｌ)に富む配列である。
【0097】
ベクターは、融合ポリペプチドをコードする配列の発現に必要な配列全部を含む。特に、構築物が導入される宿主細胞に応じて選択される、適当なプロモーターを含む。
【0098】
本発明の状況の範囲内で、用語「宿主細胞」は、細胞に異種であり、トランスフェクション方法によりその細胞のゲノムに導入されている、核酸により運搬される遺伝子を発現できる細胞を意味する。
【0099】
好ましくは、宿主細胞は真核生物細胞である。真核生物宿主細胞は、特に出芽酵母などの酵母細胞、アスペルギルス属などの糸状菌細胞、ショウジョウバエのＳ２細胞またはスポドプテラ属のｓｆ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞および植物細胞から選択される。特に言及され得る哺乳動物細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅｐＧ２またはＬ(ＴＫ－)細胞などの哺乳動物細胞株である。好ましい実行において、該宿主細胞は、真核生物細胞株、好ましくはＳｆ９昆虫細胞から選択される。ｓｆ９昆虫細胞で組み換え二量体タンパク質を調製する方法は、ＵＳ特許７,８８４,１９０に記載される。
【0100】
異種核酸を発現する細胞の産生について当業者に知られるあらゆるトランスフェクション方法を、方法の工程ａ)の実施に使用し得る。トランスフェクション方法は、例えば、Sambrook et al, 2001, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載される。
【0101】
あるいは、キメラ構築物を、化学ペプチド合成により産生できる。例えば、タンパク質は、短いペプチドの平行合成により産生でき、それらは、その後組合わされて、正しいジスルフィド架橋を有するタンパク質の完全配列を産生する。ＩＬ－２の合成は、例えば引用により開示を本明細書に包含させるAsahina et al., Angewandte Chemie International Edition, 2015, Vol.54, Issue 28, 8226-8230に説明される。
【0102】
他の実施態様において、キメラタンパク質は、対象に該キメラタンパク質をコードする核酸を投与後、インビボで発現され得る。好ましい実施態様において、核酸は、アデノウイルス随伴ウイルス(ＡＡＶ)などのウイルスベクターにより運搬される。
【0103】
製剤および投与経路
好ましくは薬学的に許容される媒体、担体または添加物と組み合わせた(例えば、溶液、懸濁液または混合物)、ここに記載する構築物、核酸、ベクターまたはタンパク質を含む医薬組成物も、提供される。
好ましくは薬学的に許容される媒体、担体または添加物と組み合わせた(例えば、溶液、懸濁液または混合物)、ここに記載する構築物、核酸、ベクターまたはタンパク質を含む医薬組成物も、提供される。
【0104】
適当な添加物は、何れかの等張溶液、食塩水溶液、緩衝化溶液、徐放性製剤などを含む。液体、凍結乾燥または噴霧乾燥組成物は当分野で知られ、水性または非水性溶液または懸濁液として製造され得る。好ましくは、医薬組成物は、適切な安定化剤、緩衝剤、増量剤または組み合わせを含む。
【0105】
医薬組成物はさらに他の活性成分を含んでよくまたは何らかの他の活性成分と組み合わせて投与してよい。
【0106】
医薬組成物は、非経腸、例えば皮内、皮下または鼻腔内経路を含む、あらゆる慣用の経路を使用して投与し得る。皮下経路が好ましい。経口、舌下またはバッカル投与も包含される。
【0107】
皮下注射に適する製剤の例は、国際特許出願ＷＯ２０１７／０６８０３１に記載される。
【0108】
自己免疫および／または炎症性障害の処置
ここに記載する医薬組成物は、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、ＨＣＶ関連脈管炎、ブドウ膜炎、筋炎、全身性脈管炎、乾癬、アレルギー、喘息、クローン病、多発性硬化症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性甲状腺疾患、自己炎症性疾患、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症を含む神経変性疾患、急性および慢性移植片対宿主病、自然流産および同種移植片拒絶反応；固形臓器移植拒絶、脈管炎、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)およびアレルギー性喘息；脊椎関節炎または強直性脊椎炎；シェーグレン症候群、全身性硬化症、円形脱毛症または潰瘍性大腸炎などの自己免疫および／または炎症性障害を処置する方法に有用である。
ここに記載する医薬組成物は、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、ＨＣＶ関連脈管炎、ブドウ膜炎、筋炎、全身性脈管炎、乾癬、アレルギー、喘息、クローン病、多発性硬化症、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性甲状腺疾患、自己炎症性疾患、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症を含む神経変性疾患、急性および慢性移植片対宿主病、自然流産および同種移植片拒絶反応；固形臓器移植拒絶、脈管炎、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)およびアレルギー性喘息；脊椎関節炎または強直性脊椎炎；シェーグレン症候群、全身性硬化症、円形脱毛症または潰瘍性大腸炎などの自己免疫および／または炎症性障害を処置する方法に有用である。
【0109】
好ましい実施態様において、組成物を、週１回または２回または月１回または２回、好ましくは皮下経路により自己免疫および／または炎症性障害を処置する方法がここに記載される。ある実施態様において、３０MIU／日未満、好ましくは２０MIU／日未満、有利に１０MIU／日未満または１MIU／日～８MIU／日の投与量が好ましい。他の特定の実施態様において、１～５MIU／日、好ましくは０.１～３.５MIU／日の用量が使用される。
【0110】
一般に言って、Ｔｒｅｇ数の１.５倍、２倍、３倍、４倍または５倍増加を可能とする用量が好ましい。ＩＬ－２の量の標準単位は国際単位(IU)であり、これは、世界保健機関(ＷＨＯ)により決定されたとおり、技術的に重量を固定せず、特定の細胞増殖アッセイにおける一定の生物学的効果を産生する量である。ｉ)重量が分子の正確な配列およびそのグルコシル化プロファイルにより変わることおよびii)重要なのは分子の重量ではなく、活性であることがその理由である。
【0111】
国際単位の原則は、あらゆるＩＬ－２分子が比較できる標準を厳密に提供するためである(起源または野生型もしくは活性バリアント配列を含む配列に関係なく)。
【0112】
実際面では、ＷＨＯは、較正され、その効力により規定されたあるＩＬ－２の調製物(同様に該ＩＬ－２の起源または配列に関係なく)の投与量を決定する対象として役立つ、ＩＬ－２分子のアンプルを提供する。例えば、あるＩＬ－２の調製物の投与量を決定するために、候補ＩＬ－２調製物の生物学的活性を、ＣＴＬＬ－２などのＩＬ－２依存的細胞株を使用する標準細胞増殖アッセイで測定し、標準の生物学的活性と比較する。細胞は種々の用量の標準の存在下で増殖する。ＩＬ－２の用量がIUとしてＸ軸に、増殖(ｐｒ)の指標がＹ軸にプロットされる、ＩＬ－２の用量－応答効果が確立される。未知活性の何らかのＩＬ－２産物の活性を決定したいとき、該産物をＩＬ－２依存的細胞の増殖に使用し、増殖を測定する。次いで、ｐｒ値をＹ軸にプロットし、その値から、Ｘ軸に平行な線を引く。この線と用量応答線の交差する点から、次いでＹ軸に平行な線を引く。Ｘ軸とのその交差点により、候補ＩＬ－２産物の活性がIUで提供される。
【0113】
ＷＨＯ標準アンプルの何らかの変更は国際単位にも、何らかのＩＬ－２調製物の投与量決定にも影響しない。
【0114】
１回目の標準(ＷＨＯ国際標準コード８６／５０４、１９８７年付け)は、Ｊｕｒｋａｔ細胞由来の精製グリコシル化ＩＬ－２を含み、１００IU／アンプルの効力が任意に割り当てられた。１回目の国際標準(ＩＳ)の原液が少なくなったため、ＷＨＯはそれを置き換えなければならなかった。ＷＨＯは、他の較正ＩＬ－２アンプルを提供し、今回は大腸菌を塩油して、産生された。２回目の標準アンプルは、アンプルあたり２１０IUの生物学的活性を含んだ。標準アンプルの変更は、IU変化を意味しない。故に、試験ＩＬ－２調製物の投与量の決定は、１回目の標準アンプルまたは２回目の標準アンプルまたはその後の標準アンプルを対象として使用しても、変わらない。
【0115】
ある実施態様において、例えば、３日毎に１回～３カ月に１回の投与を含む慢性投与が実行される。このような一連の投与を、必要に応じて繰り返し得る。
【0116】
他の実施態様において、ＩＬ－２を、３日間～３カ月、好ましくは１～４週間続き得る、投与の中断後繰り返し得るサイクルで、１～２週間、隔日投与する。
【0117】
他の実施態様において、処置は、誘導コースとも称される第一のコースおよび維持コースである第二のコースを含み得る。
【0118】
特定の実施態様において、処置は、医薬組成物を少なくとも連続約２日間または３日間、好ましくは連続３～７日間、なお好ましくは連続４～５日間１日１回投与する少なくとも第一のコースを含み、好ましくは、例えば約６日間または約１～約４週間後、維持用量が続く。
【0119】
維持用量は、概して少なくとも１カ月間、好ましくは少なくとも約３カ月間、なお好ましくは少なくとも約６カ月間投与される。好ましい実施態様において、維持用量は約３カ月～約１２カ月、好ましくは約６カ月～約１２カ月投与する。
【0120】
好ましい実施態様において、維持処置は、週１回もしくは２回または１週もしくは２週毎または１カ月に１回の医薬組成物の投与からなる。
【0121】
好ましい実施態様において、維持処置は、少なくとも１カ月、好ましくは約３カ月～約１２カ月の期間、週１回もしくは２回、１週もしくは２週毎または１カ月に１回のインターロイキン－２の投与からなる。
【0122】
好ましくは、維持投与量は、第一のコースの投与量と実質的に同じでありまたは低もしくは高投与量であり得る。
【0123】
癌の処置
ここに記載する医薬組成物は、癌を処置する方法において有用である。ある実施態様において、対象は、局所進行または転移癌を有する。ある実施態様において、癌は固形腫瘍である。ある実施態様において、癌は結腸癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮内膜癌、乳癌、腎臓癌、食道癌または前立腺癌である。
ここに記載する医薬組成物は、癌を処置する方法において有用である。ある実施態様において、対象は、局所進行または転移癌を有する。ある実施態様において、癌は固形腫瘍である。ある実施態様において、癌は結腸癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮内膜癌、乳癌、腎臓癌、食道癌または前立腺癌である。
【0124】
ある実施態様において、３０MIU／日未満、好ましくは２０MIU／日未満の投与量、有利に１０MIU／日未満または３MIU／日～５MIU／日が好ましい。
【0125】
他の実施態様において、４００,０００～７５０,０００IU／kgまたは５５０,０００～７５０,０００IU／kg、好ましくは６００,０００～７００,０００IU／kgのＩＬ２が投与される。投与量は、PROLEUKIN(登録商標)で処方される量に類似し得るが、それより少ないことが予測される。
【0126】
組成物は、隔日に１回を含む、１日１回以上～週１回以上に投与され得る。当業者は、疾患重症度、先の処置、対象の一般的健康および／または年齢および存在する他の疾患を含む、ある因子が、対象を有効に処置するのに必要な投与量およびタイミングに影響し得ることを認識する。さらに、対象の処置は単回処置を含み得てまたは一連の処置を含み得る。
【0127】
自己免疫および／または炎症性障害に関連する上記プロトコールを、癌処置における使用に、同等にまたは類似して適用し得る。あるいは、他の例において、組成物を、５日間８時間毎に投与し、続いて２～１４日間、例えば、９日間休薬し、続いてさらに５日間８時間毎に投与することができる。ある実施態様において、投与は、４日毎投与で３回である。
【0128】
実施例および図は、範囲を限定することなく、本発明を説明する。
【実施例】
【0129】
実施例１：ＩＬ－２／Ｃ４ＢＰ融合タンパク質の産生および特徴づけ
レンチウイルスベクターを、ＩＬ－２融合タンパク質の産生に使用した。簡潔には、ヒトＩＬ－２(Ｈｉ２、配列番号１)、Ｃ４ＢＰβのＣ末端領域に融合したヒトＩＬ－２(Ｈｉ２ｃｂ、配列番号６)または変異ＩＬ－２を有する同じ分子(Ｎ８８Ｒバリアント；Ｈｉ２ｍｃｂ、配列番号７)を、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)プロモーター下、レンチウイルスプラスミドに統合した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、７０％コンフルエンスでポリエチレンイミン(ＰＥＩ)を使用してレンチウイルスプラスミドでトランスフェクトし、４８時間、無血清培地で培養した。次いで、上清を濾過し、超遠心分離法により濃縮し、適切な緩衝液に再懸濁し、その後－８０℃で保存した。安定なトランスフェクト細胞を得るために、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を種々の感染効率(ＭＯＩ)でレンチウイルスで感染させ、形質導入効率を選択マーカーとして産生された緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を使用するフローサイトメトリーで評価した。少なくとも５０％の形質導入効率および８０％生存能の細胞を、１週間完全培地で培養し、その後ほぼ１００％の細胞がＩＬ－２融合タンパク質を産生することを隔日にするために、ＧＦＰ＋細胞の細胞選別をした。
構築物の機能的設計のインビトロ評価を実施するために(ウェスタンブロット、ヒト全血ＳＴＡＴ５リン酸化)、安定な細胞株を４８時間無血清培地で培養し、上清を回収し、濾過し、濃縮し、クロマトグラフィーにより精製して、その後利用した。
組み換えアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)を、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における同じ目的の導入遺伝子および補助的プラスミドを有するＡＡＶ２／８ベクター(血清型８ ＡＡＶからのカプシドに封入された血清型２のゲノムを含むウイルス)のトランスフェクションにより産生した。ＡＡＶベクターを細胞上清から抽出し、それを遠心分離により浄化し、ウイルスを塩化セシウム勾配で精製し、透析した。
次いで、Ｈｉ２ｃｂおよびＨｉ２ｍｃｂを、一次抗ヒトＩＬ－２抗体または一次抗ヒトＣ４ＢＰβ抗体を使用するウェスタンブロットにより特徴づけした。還元条件下、Ｈｉ２ｃｂおよびＨｉ２ｍｃｂは、単量体に対応する約２３kDaの分子量で検出される。通常条件下、２個のバンドが検出され、主要なシグナルは、二量体に対応する約４６kDaの分子量であった。第二の弱シグナルは、約２３kDaで単量体に対応する。
レンチウイルスベクターを、ＩＬ－２融合タンパク質の産生に使用した。簡潔には、ヒトＩＬ－２(Ｈｉ２、配列番号１)、Ｃ４ＢＰβのＣ末端領域に融合したヒトＩＬ－２(Ｈｉ２ｃｂ、配列番号６)または変異ＩＬ－２を有する同じ分子(Ｎ８８Ｒバリアント；Ｈｉ２ｍｃｂ、配列番号７)を、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)プロモーター下、レンチウイルスプラスミドに統合した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、７０％コンフルエンスでポリエチレンイミン(ＰＥＩ)を使用してレンチウイルスプラスミドでトランスフェクトし、４８時間、無血清培地で培養した。次いで、上清を濾過し、超遠心分離法により濃縮し、適切な緩衝液に再懸濁し、その後－８０℃で保存した。安定なトランスフェクト細胞を得るために、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を種々の感染効率(ＭＯＩ)でレンチウイルスで感染させ、形質導入効率を選択マーカーとして産生された緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を使用するフローサイトメトリーで評価した。少なくとも５０％の形質導入効率および８０％生存能の細胞を、１週間完全培地で培養し、その後ほぼ１００％の細胞がＩＬ－２融合タンパク質を産生することを隔日にするために、ＧＦＰ＋細胞の細胞選別をした。
構築物の機能的設計のインビトロ評価を実施するために(ウェスタンブロット、ヒト全血ＳＴＡＴ５リン酸化)、安定な細胞株を４８時間無血清培地で培養し、上清を回収し、濾過し、濃縮し、クロマトグラフィーにより精製して、その後利用した。
組み換えアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)を、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における同じ目的の導入遺伝子および補助的プラスミドを有するＡＡＶ２／８ベクター(血清型８ ＡＡＶからのカプシドに封入された血清型２のゲノムを含むウイルス)のトランスフェクションにより産生した。ＡＡＶベクターを細胞上清から抽出し、それを遠心分離により浄化し、ウイルスを塩化セシウム勾配で精製し、透析した。
次いで、Ｈｉ２ｃｂおよびＨｉ２ｍｃｂを、一次抗ヒトＩＬ－２抗体または一次抗ヒトＣ４ＢＰβ抗体を使用するウェスタンブロットにより特徴づけした。還元条件下、Ｈｉ２ｃｂおよびＨｉ２ｍｃｂは、単量体に対応する約２３kDaの分子量で検出される。通常条件下、２個のバンドが検出され、主要なシグナルは、二量体に対応する約４６kDaの分子量であった。第二の弱シグナルは、約２３kDaで単量体に対応する。
【0130】
実施例２：ヒト全血ｐＳＴＡＴ５応答における融合タンパク質のＴｒｅｇ選択性
免疫表現型. 健常成人からの全血を、インフォームド・コンセントの上、集めた。ＳＴＡＴ５リン酸化(ｐＳＴＡＴ５)に対するＨｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂの効果を、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＣＤ４＋制御Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ；ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏ／－)、ＣＤ４＋通常型Ｔ細胞(Ｔｃｏｎｖ；ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－)およびＣＤ８＋Ｔ細胞で評価した。１０倍希釈したＨｉ２、Ｈｉ２ｃｂおよびＨｉ２ｍｃｂを１００μlの全血と１５分間、３７℃で混合し、その後ｐＳＴＡＴ５染色した。
図１は、目的の集団に対するｐＳＴＡＴ５誘導の用量－応答を示す。
Ｈｉ２は、Ｔｒｅｇ、ＴｃｏｎｖおよびＣＤ８ Ｔ細胞でＳＴＡＴ５リン酸化を誘導できる。ＩＬ－２－Ｃ４ＢＰβタンパク質両者も、ＴｒｅｇでＳＴＡＴ５リン酸化を誘導できるが、ＴｃｏｎｖおよびＣＤ８ Ｔ細胞ではできず、融合タンパク質が大きな治療ウィンドウでＴｒｅｇを選択的に標的とする能力を示す。
免疫表現型. 健常成人からの全血を、インフォームド・コンセントの上、集めた。ＳＴＡＴ５リン酸化(ｐＳＴＡＴ５)に対するＨｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂの効果を、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＣＤ４＋制御Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ；ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏ／－)、ＣＤ４＋通常型Ｔ細胞(Ｔｃｏｎｖ；ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－)およびＣＤ８＋Ｔ細胞で評価した。１０倍希釈したＨｉ２、Ｈｉ２ｃｂおよびＨｉ２ｍｃｂを１００μlの全血と１５分間、３７℃で混合し、その後ｐＳＴＡＴ５染色した。
図１は、目的の集団に対するｐＳＴＡＴ５誘導の用量－応答を示す。
Ｈｉ２は、Ｔｒｅｇ、ＴｃｏｎｖおよびＣＤ８ Ｔ細胞でＳＴＡＴ５リン酸化を誘導できる。ＩＬ－２－Ｃ４ＢＰβタンパク質両者も、ＴｒｅｇでＳＴＡＴ５リン酸化を誘導できるが、ＴｃｏｎｖおよびＣＤ８ Ｔ細胞ではできず、融合タンパク質が大きな治療ウィンドウでＴｒｅｇを選択的に標的とする能力を示す。
【0131】
実施例３：Ｔ細胞および糸球体濾過に対するＩＬ－２－Ｃ４ＢＰβコード化ＡＡＶのインビボ評価
マウス. ６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６(Ｊｒｊ)雌マウスに、Ｈｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂをコードするＡＡＶを、１０１１ウイルスゲノム(ｖｇ)で腹腔内経路で注射した。
免疫表現型. 血液サンプルを、週１回、血塊形成を避けるためにヘパリンチューブに集めた。溶血後、免疫細胞を染色し、をフローサイトメトリーにより分析して、Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋)、Ｔｅｆｆ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３－)、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ(ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋)およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ(ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３－)のパーセンテージを決定した。
投与量. 血液および尿を、ＩＬ－２投与に対し種々の時点でヒトＩＬ－２非被覆ＥＬＩＳＡキット(ThermoFisher)を使用して採取した。
図２は、対照と比較した、４個の異なるＴ細胞コンパートメントの増加倍率の反応速度曲線を示す。制御Ｔ細胞に関して、３タンパク質は、Ｔｒｅｇ(図２Ａ)およびＣＤ８＋Ｔｒｅｇ(図２Ｃ)の大きくかつ同等な増加を誘導し、融合タンパク質でわずかに良好な増加であり、Ｈｉ２と比較して高いプラトーである。一方Ｈｉ２は、１週間後Ｔｅｆｆ(３倍、図２Ｂ)およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ(１０倍、図２Ｄ)の大きなピーク増大およびＮＫ細胞の拡大(２倍、図２Ｅ)を示し、Ｈｉ２ｃｂは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両者について約１.５倍のわずかな増加に阻止し、ＮＫ細胞の拡大の完全な制御をするように見える。変異形態の融合タンパク質、Ｈｉ２ｍｃｂは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両者のエフェクターコンパートメントの完全な制御ならびにＮＫ細胞の一過性の増加にかかわらず制御を示し、この変異がＴｒｅｇ選択性を支持する能力を示す。
図３は、経時的な血漿(Ａ)および尿(Ｂ)ヒトＩＬ－２の動態を示す。血漿および尿両者におけるＨｉ２とＩＬ－２－Ｃ４ＢＰβ融合タンパク質の動態間の重要な差異が観察される。Ｈｉ２は、１週間後、約２０pg／mLの持続性プラトーを伴うピークを有する(図３Ａ)。対照的に、融合タンパク質は、２週間後に、きわめて高く持続する約３００pg／mLのプラトーを伴う遅いピークがある。尿において、ヒトＩＬ－２は、ｈＩＬ－２コード化ＡＡＶ後しか検出されず、一方ヒトＩＬ－２は、ＩＬ－２－Ｃ４ＢＰβコード化ＡＡＶ投与後尿で検出されない。これらの結果は、これらの融合タンパク質が腎臓により濾過されない能力を強調し、血漿におけるこれらＩＬ－２－Ｃ４ＢＰβ融合タンパク質の半減期の延長を示唆する。
マウス. ６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６(Ｊｒｊ)雌マウスに、Ｈｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂをコードするＡＡＶを、１０１１ウイルスゲノム(ｖｇ)で腹腔内経路で注射した。
免疫表現型. 血液サンプルを、週１回、血塊形成を避けるためにヘパリンチューブに集めた。溶血後、免疫細胞を染色し、をフローサイトメトリーにより分析して、Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋)、Ｔｅｆｆ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３－)、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ(ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋)およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ(ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３－)のパーセンテージを決定した。
投与量. 血液および尿を、ＩＬ－２投与に対し種々の時点でヒトＩＬ－２非被覆ＥＬＩＳＡキット(ThermoFisher)を使用して採取した。
図２は、対照と比較した、４個の異なるＴ細胞コンパートメントの増加倍率の反応速度曲線を示す。制御Ｔ細胞に関して、３タンパク質は、Ｔｒｅｇ(図２Ａ)およびＣＤ８＋Ｔｒｅｇ(図２Ｃ)の大きくかつ同等な増加を誘導し、融合タンパク質でわずかに良好な増加であり、Ｈｉ２と比較して高いプラトーである。一方Ｈｉ２は、１週間後Ｔｅｆｆ(３倍、図２Ｂ)およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ(１０倍、図２Ｄ)の大きなピーク増大およびＮＫ細胞の拡大(２倍、図２Ｅ)を示し、Ｈｉ２ｃｂは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両者について約１.５倍のわずかな増加に阻止し、ＮＫ細胞の拡大の完全な制御をするように見える。変異形態の融合タンパク質、Ｈｉ２ｍｃｂは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両者のエフェクターコンパートメントの完全な制御ならびにＮＫ細胞の一過性の増加にかかわらず制御を示し、この変異がＴｒｅｇ選択性を支持する能力を示す。
図３は、経時的な血漿(Ａ)および尿(Ｂ)ヒトＩＬ－２の動態を示す。血漿および尿両者におけるＨｉ２とＩＬ－２－Ｃ４ＢＰβ融合タンパク質の動態間の重要な差異が観察される。Ｈｉ２は、１週間後、約２０pg／mLの持続性プラトーを伴うピークを有する(図３Ａ)。対照的に、融合タンパク質は、２週間後に、きわめて高く持続する約３００pg／mLのプラトーを伴う遅いピークがある。尿において、ヒトＩＬ－２は、ｈＩＬ－２コード化ＡＡＶ後しか検出されず、一方ヒトＩＬ－２は、ＩＬ－２－Ｃ４ＢＰβコード化ＡＡＶ投与後尿で検出されない。これらの結果は、これらの融合タンパク質が腎臓により濾過されない能力を強調し、血漿におけるこれらＩＬ－２－Ｃ４ＢＰβ融合タンパク質の半減期の延長を示唆する。
【0132】
実施例４：ＡＡＶ高用量投与後のＨｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂの毒性
マウス. ６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６(Ｊｒｊ)雌マウスに、Ｈｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂをコードするＡＡＶを１０１２ｖｇで腹腔内経路で注射した。
免疫表現型. 血液サンプルを、週１回、血塊形成を避けるためにヘパリンチューブに集めた。溶血後、免疫細胞を染色し、をフローサイトメトリーにより分析して、Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋)、Ｔｅｆｆ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３－)、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ(ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋)およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ(ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３－)のパーセンテージを決定した。
図４Ａ～４Ｅ、対照と比較したのは、４個の異なるＴ細胞コンパートメントの増加倍率の反応速度曲線を示す。エフェクターおよび制御Ｔ細胞に対する３構築物の効果は、低用量のものに極めて類似した。簡潔には、Ｈｉ２ｍｃｂはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｒｅｇ両者を増加させ、同時にエフェクターレベルおよびＮＫ細胞両者を完全に制御する。この制御Ｔ細胞選択性は、良好な安全性プロファイルの根拠となる可能性が極めて高い。
Ｈｉ２ｃｂコード化ＡＡＶ後の動態は、ＣＤ４＋(ピークで３倍増加、図４Ｂ)およびＣＤ８＋(ピークで９倍増加、図４Ｄ)エフェクターコンパートメント増加を一部のみ制御する能力を示す。しかしながら、両Ｔｒｅｇコンパートメントは２週間後増加し、ほぼＴｒｅｇで４倍増加(図４Ａ)およびＣＤ８＋Ｔｒｅｇで７倍増加(図４Ｃ)に達した。最後に、Ｈｉ２処置マウス群において、全て１週間以内に死亡したが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｒｅｇの大きな増加(図４Ａ、Ｃ)およびＴｅｆｆ(２５倍増加、図４Ｂ)、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ(６２倍増加、図４Ｄ)およびＮＫ細胞(３倍増加、図４Ｅ)の劇的拡大があり、これが、おそらく急速な死亡に至る免疫恒常性の深刻なアンバランスを引き起こす。
図５は、ＡＡＶ高用量投与後のマウスのカプラン・マイヤー曲線を示す。３タンパク質の高用量の毒性評価は、古典的Ｈｉ２と比較して、ＩＬ－２－Ｃ４ＢＰβ融合タンパク質の極めて良好な安全性プロファイルを示す(図５)。実際、Ｈｉ２を注射したマウスは全て７日以内に死亡する。３匹のマウス中２匹が１７日目になって初めて死亡したため、死亡の遅延がＨｉ２ｃｂで観察された。最後に、Ｈｉ２ｍｃｂで処置した全マウスは、実験開始後２０週でなお生存しており、融合タンパク質の完全安全性を強調する。
マウス. ６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６(Ｊｒｊ)雌マウスに、Ｈｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂをコードするＡＡＶを１０１２ｖｇで腹腔内経路で注射した。
免疫表現型. 血液サンプルを、週１回、血塊形成を避けるためにヘパリンチューブに集めた。溶血後、免疫細胞を染色し、をフローサイトメトリーにより分析して、Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋)、Ｔｅｆｆ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３－)、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ(ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋)およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ(ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３－)のパーセンテージを決定した。
図４Ａ～４Ｅ、対照と比較したのは、４個の異なるＴ細胞コンパートメントの増加倍率の反応速度曲線を示す。エフェクターおよび制御Ｔ細胞に対する３構築物の効果は、低用量のものに極めて類似した。簡潔には、Ｈｉ２ｍｃｂはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｒｅｇ両者を増加させ、同時にエフェクターレベルおよびＮＫ細胞両者を完全に制御する。この制御Ｔ細胞選択性は、良好な安全性プロファイルの根拠となる可能性が極めて高い。
Ｈｉ２ｃｂコード化ＡＡＶ後の動態は、ＣＤ４＋(ピークで３倍増加、図４Ｂ)およびＣＤ８＋(ピークで９倍増加、図４Ｄ)エフェクターコンパートメント増加を一部のみ制御する能力を示す。しかしながら、両Ｔｒｅｇコンパートメントは２週間後増加し、ほぼＴｒｅｇで４倍増加(図４Ａ)およびＣＤ８＋Ｔｒｅｇで７倍増加(図４Ｃ)に達した。最後に、Ｈｉ２処置マウス群において、全て１週間以内に死亡したが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｒｅｇの大きな増加(図４Ａ、Ｃ)およびＴｅｆｆ(２５倍増加、図４Ｂ)、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ(６２倍増加、図４Ｄ)およびＮＫ細胞(３倍増加、図４Ｅ)の劇的拡大があり、これが、おそらく急速な死亡に至る免疫恒常性の深刻なアンバランスを引き起こす。
図５は、ＡＡＶ高用量投与後のマウスのカプラン・マイヤー曲線を示す。３タンパク質の高用量の毒性評価は、古典的Ｈｉ２と比較して、ＩＬ－２－Ｃ４ＢＰβ融合タンパク質の極めて良好な安全性プロファイルを示す(図５)。実際、Ｈｉ２を注射したマウスは全て７日以内に死亡する。３匹のマウス中２匹が１７日目になって初めて死亡したため、死亡の遅延がＨｉ２ｃｂで観察された。最後に、Ｈｉ２ｍｃｂで処置した全マウスは、実験開始後２０週でなお生存しており、融合タンパク質の完全安全性を強調する。
【0133】
実施例５：実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルにおける融合タンパク質の治療有効性
マウス. ６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６(Ｊｒｊ)雌マウスに、実験的自己免疫性脳脊髄炎モデル(ＥＡＥ)誘導７日前にＨｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂをコードするＡＡＶを、１０１１ｖｇで腹腔内経路により注射し、疾患開始時のＴｒｅｇ拡大を確実にした。全てのＩＬ－２ベースの分子での予防的処置は臨床的発症を遅らせた(図６Ａ)。しかしながら、疾患発症３～５日後、標準ＩＬ２処置マウス(黒色点)は、対照マウスと比較したとき(白抜き点、図６Ｃ)、類似する臨床症状の動態を示した。この結果は、全分析パラメータで確認および観察され、顕著な体重減少があり(図６Ｂ)、１００％のマウスが臨床症状を発症した(図６Ａ)。逆に、両融合タンパク質で処置したマウスは、同じ発症の遅延を示したが、臨床症状重症度の制御(それぞれ黒色四角および三角)、体重減少の完全制御(図６Ｂ)および何ら臨床症状がないマウスを意味する４０％の完全疾患予防を伴った(図６Ａ)。
マウス. ６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６(Ｊｒｊ)雌マウスに、実験的自己免疫性脳脊髄炎モデル(ＥＡＥ)誘導７日前にＨｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂをコードするＡＡＶを、１０１１ｖｇで腹腔内経路により注射し、疾患開始時のＴｒｅｇ拡大を確実にした。全てのＩＬ－２ベースの分子での予防的処置は臨床的発症を遅らせた(図６Ａ)。しかしながら、疾患発症３～５日後、標準ＩＬ２処置マウス(黒色点)は、対照マウスと比較したとき(白抜き点、図６Ｃ)、類似する臨床症状の動態を示した。この結果は、全分析パラメータで確認および観察され、顕著な体重減少があり(図６Ｂ)、１００％のマウスが臨床症状を発症した(図６Ａ)。逆に、両融合タンパク質で処置したマウスは、同じ発症の遅延を示したが、臨床症状重症度の制御(それぞれ黒色四角および三角)、体重減少の完全制御(図６Ｂ)および何ら臨床症状がないマウスを意味する４０％の完全疾患予防を伴った(図６Ａ)。
【0134】
実施例６：融合タンパク質の産生および評価
６.１. 融合タンパク質の産生
精製融合タンパク質を、安定な細胞株産生から得た。詳しくは、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を培養し、上清を集め、精製ＡＫＴＡTM系を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを実施して、陽性フラクションを集めた。最後に、集めたサンプルをアニオン交換クロマトグラフィーを通した。
６.１. 融合タンパク質の産生
精製融合タンパク質を、安定な細胞株産生から得た。詳しくは、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を培養し、上清を集め、精製ＡＫＴＡTM系を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを実施して、陽性フラクションを集めた。最後に、集めたサンプルをアニオン交換クロマトグラフィーを通した。
【0135】
６.２. 免疫表現型検査
マウス. ６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６(Ｊｒｊ)雌マウスに、５日間連日Ｈｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂ(２５０００ＵＩ)を皮下経路により注射した。
免疫表現型. 血液サンプルを１日１回注射前に、血塊形成を避けるためにヘパリンチューブに集めた。溶血後、免疫細胞を染色し、をフローサイトメトリーにより分析して、Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋)のパーセンテージおよびＴｒｅｇのＣＤ２５平均蛍光強度を決定した。
図７Ａは、５日間連日２５０００国際単位のタンパク質の１回注射に基づく実験的投与スケジュールを示す。免疫表現型検査を５日間、毎日、注射直前に実施した。
図７Ｂ～７Ｃは、対照と比較した、Ｔ細胞コンパートメントおよびＮＫ細胞増加倍率の反応速度曲線を示す。制御Ｔ細胞拡大はＨｉ２および融合タンパク質で極めて類似し、ＴｒｅｇでＣＤ２５ ＭＦＩの１.６倍増加があった。
マウス. ６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６(Ｊｒｊ)雌マウスに、５日間連日Ｈｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂ(２５０００ＵＩ)を皮下経路により注射した。
免疫表現型. 血液サンプルを１日１回注射前に、血塊形成を避けるためにヘパリンチューブに集めた。溶血後、免疫細胞を染色し、をフローサイトメトリーにより分析して、Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋)のパーセンテージおよびＴｒｅｇのＣＤ２５平均蛍光強度を決定した。
図７Ａは、５日間連日２５０００国際単位のタンパク質の１回注射に基づく実験的投与スケジュールを示す。免疫表現型検査を５日間、毎日、注射直前に実施した。
図７Ｂ～７Ｃは、対照と比較した、Ｔ細胞コンパートメントおよびＮＫ細胞増加倍率の反応速度曲線を示す。制御Ｔ細胞拡大はＨｉ２および融合タンパク質で極めて類似し、ＴｒｅｇでＣＤ２５ ＭＦＩの１.６倍増加があった。
【0136】
６.３. 投与量
血液および尿を、ＩＬ－２投与に対し種々の時点でヒトＩＬ－２非被覆ＥＬＩＳＡキット(ThermoFisher)を使用して採取した。
６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６(Ｊｒｊ)雌マウスにＨｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂ上清タンパク質を皮下経路により単回投与し、ｈＩＬ－２の血漿濃度を種々の時点で決定した。主要な薬物動態差異がＨｉ２および融合タンパク質間で見られた(図８)。実際、融合タンパク質は、Ｈｉ２と比較して血漿コンパートメントに長期に留まることができ、排泄が減少している。これらの結果は、これらの融合タンパク質が減少したクリアランス除去で、延長した半減期を有するとの事実を強調する。
血液および尿を、ＩＬ－２投与に対し種々の時点でヒトＩＬ－２非被覆ＥＬＩＳＡキット(ThermoFisher)を使用して採取した。
６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６(Ｊｒｊ)雌マウスにＨｉ２、Ｈｉ２ｃｂまたはＨｉ２ｍｃｂ上清タンパク質を皮下経路により単回投与し、ｈＩＬ－２の血漿濃度を種々の時点で決定した。主要な薬物動態差異がＨｉ２および融合タンパク質間で見られた(図８)。実際、融合タンパク質は、Ｈｉ２と比較して血漿コンパートメントに長期に留まることができ、排泄が減少している。これらの結果は、これらの融合タンパク質が減少したクリアランス除去で、延長した半減期を有するとの事実を強調する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】