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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-10
(54)【発明の名称】半固体状態での核酸操作
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20230203BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20230203BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230203BHJP
C40B 40/06 20060101ALN20230203BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 110Z
C12Q1/6806 Z
C12Q1/6869 Z
C40B40/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022535625
(86)(22)【出願日】2020-12-11
(85)【翻訳文提出日】2022-08-01
(86)【国際出願番号】 EP2020085694
(87)【国際公開番号】W WO2021116371
(87)【国際公開日】2021-06-17
(31)【優先権主張番号】19215708.9
(32)【優先日】2019-12-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508186875
【氏名又は名称】キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ハルジンク， レイモンド ヨゼフ マウリヌス
(72)【発明者】
【氏名】ホワイト， ステファン ジョン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QR82
4B063QS10
4B063QS15
4B063QS39
4B063QX04
(57)【要約】
本発明は、核酸を単離する方法に関係し、該核酸はヒドロゲル内で安定化している。ヒドロゲルは、溶解して（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）分子を破壊することなく核酸を放出し得る。好ましいヒドロゲルはアルギネートである。本発明は、核酸をシークエンシングするための方法、並びにヒドロゲル及び核酸を含む組成物と更に関係する。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
操作された長鎖核酸を含むヒドロゲルを取得するための方法であって、ａ）核酸を水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記核酸を含むヒドロゲルを形成するステップと、
ｃ）前記ヒドロゲル内で前記核酸を操作するステップと
を含み、前記ヒドロゲルが４５℃未満の温度で溶解し得る、方法。
【請求項2】
前記核酸が担体に含まれ、並びに好ましくは、前記担体がオルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つであり、並びに好ましくは、オルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つが、ステップｃ）において溶解されて前記核酸を放出する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
水溶液内のポリマーが、イオン性ポリマー、好ましくはカルボキシペンダント基を有するアニオン性ポリマー；及び
多糖類又はその誘導体、好ましくはウロン酸を含む多糖類又はその誘導体
のうちの少なくとも１つである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記多糖類又はその誘導体がアルギネート又はその誘導体であり、好ましくは前記多糖類又はその誘導体がアルギネートである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記担体が、ミトコンドリア、葉緑体、若しくは核であり、好ましくは前記担体が核であり、及び／又は前記担体が植物細胞であり、好ましくは前記植物細胞がプロトプラストである、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記核酸が、ＤＮＡ分子、好ましくはゲノムＤＮＡ分子である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記操作された長鎖核酸が、単離された超高分子量（ｕＨＭＷ）核酸であり、及び／又は好ましくは前記操作された長鎖核酸が、ヒドロゲルミクロスフェア内で安定化している、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
シークエンシングライブラリー、好ましくはロングリード・シークエンシングライブラリーを調製するための方法であって、請求項１～７のいずれか一項で定義される操作された長鎖核酸を含むヒドロゲルを取得するステップと、
前記ヒドロゲル内で前記核酸を改変してシークエンシングライブラリーを取得するステップと
を含む方法。
【請求項9】
請求項８で定義されるシークエンシングライブラリーを取得するステップと、ヒドロゲルを、好ましくは４５℃未満の温度で溶解させるステップと、
前記ライブラリーをシークエンシングするステップと
を含み、
好ましくは前記シークエンシングライブラリーが、前記ヒドロゲルを溶解させる前にシークエンサーフローセルに負荷され、及び好ましくは前記フローセルが、ロングリード・シークエンサー、好ましくはナノポアシークエンサーのフローセルである、
シークエンシング法、好ましくはディープシークエンシング法、より好ましくはロングリード・ディープシークエンシング法。
【請求項10】
前記ヒドロゲルが、シークエンシングバッファーを添加すること、
１価カチオン、好ましくはナトリウムカチオンを含むバッファーを添加すること、
前記温度を約２０℃～４０℃から約２℃～１０℃まで低下させること、及び
ｐＨを約５～６から約７～８、又は約７～８から約５～６に調整すること
のうちの少なくとも１つにより、溶解する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
核酸含有担体を含むヒドロゲルを取得するための方法であって、前記核酸含有担体を水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
前記ポリマー溶液をゲル化させて前記核酸含有担体を含むヒドロゲルを形成するステップと
を含み、前記ヒドロゲルが、請求項１～４のいずれか一項で定義されるヒドロゲルであり、及び好ましくは前記核酸含有担体がオルガネラであり、及び細胞を溶解して前記オルガネラを取得するステップを更に含む方法。
【請求項12】
請求項１～７及び１１のいずれか一項に記載の方法により取得可能なヒドロゲル。
【請求項13】
核酸含有担体、オルガネラ、及び操作された長鎖核酸、好ましくは単離されたｕＨＭＷ核酸のうちの少なくとも１つを含むヒドロゲルであって、請求項１～４のいずれか一項で定義されるヒドロゲルであり、好ましくはアルギネートを含むヒドロゲル。
【請求項14】
ゲノムシークエンシング、ロングレンジゲノム分析、
トランスクリプトーム分析、
マップに基づくクローニング、
ゲノム物理マッピング、
ラージインサートＢＡＣライブラリーの構築、及び
ラージインサートＢＩＢＡＣライブラリーの構築
のうちの少なくとも１つのための、請求項１２又は１３で定義されるヒドロゲルの使用。
【請求項15】
操作された長鎖核酸を含むヒドロゲルを取得するためのパーツキットであって、ｉ）請求項１～４のいずれか一項で定義されるヒドロゲルを形成するためのポリマーと、
ｉｉ）細胞及び／又はオルガネラ溶解バッファーと、
ｉｉｉ）任意選択的に、シークエンシングライブラリーを調製するための１つ又は複数のコンポーネントであって、好ましくは少なくとも１つ又は複数のアダプターを含むコンポーネントと
を含むパーツキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分子生物学の分野、より具体的にはゲノミクスの分野を対象とする。特に、本発明は、シークエンシングの分野、好ましくはロングリード・シークエンシングライブラリーの生成及びシークエンシングを対象とする。
【背景技術】
【0002】
超高分子量（ｕＨＭＷ）ＤＮＡ及びロングリード・シークエンシングライブラリーを取得する能力は、特にロングレンジゲノム及び遺伝情報が必須である用途（例えば、全ゲノムマッピング及びシークエンシング）にとって益々重要となっている。特に、ロングシークエンスリードが、特に大型及び／又は複雑なゲノムを内包する種について、新規ゲノムアセンブリの質を有意に改善することが明白となった。それに加えて、ロングリード・シークエンシング技術は、ロングリピート、倍数性、及びハプロタイプを解明する可能性を秘めており、またＣＮＶ検出を通じて複雑な形質と関連する遺伝要素の特定を促進する。
【0003】
今日、ロングリード・シークエンシング技術は、サイズ数百キロベースのリード（ｒｅａｄ）を生み出すことが可能であり、リード長はメガベースサイズを超える可能性がある。従って、ＤＮＡ分子の長さが、（例えば、ナノポアに基づく）ロングリード・シークエンシング技術のリード長を主に制限する。現行のライブラリー調製プロトコールは、インプットとして溶解した（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）ゲノムＤＮＡを必要とするので、ＤＮＡ単離がなおも必要である。しかしながら、ゲノムＤＮＡは、水溶液内で取り扱う際にきわめて破断しやすく、その結果、現行の最新ＤＮＡ単離法及びライブラリー調製プロトコールを使用する場合、ロングリード・シークエンシングからサイズがおよそ１００ｋｂよりも長い配列が得られることはほとんどない。
【0004】
最近数年間において、高品質ｕＨＭＷ ＤＮＡの単離及び（超）ロングシークエンスリードの生成と関連する課題に対処するために、いくつかの新構想が世界的に検討されている。いくつかのこれらの新構想から、商品化された技術がすでに生み出されており、またその他の技術も現在開発中又は商品化用に準備中である。例として、ボレアルゲノミクス（Ｂｏｒｅａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）社及びセージサイエンス（Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）社のｕＨＭＷ ＤＮＡ単離及び精製システム、サーキュロミクス（Ｃｉｒｃｕｌｏｍｉｃｓ）社及びエブロゲン（Ｅｖｒｏｇｅｎ）社のｕＨＭＷ ＤＮＡ単離及び精製キット、及びオックスフォードナノポアテクノロジーズ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社の自動化されたＤＮＡ単離及びライブラリー調製システム（すなわち、Ｖｏｌｔｒａｘ）が挙げられる。これらの開発にもかかわらず、ロングリード・シークエンシング法からサイズがおよそ１００ｋｂよりも長い配列が得られることは現在のところほとんどなく、またメガベースサイズのリードが優位を占める配列統計量への展望はいまだ開けていない。現在利用可能なシークエンシング法は、水溶液中に溶解した（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）ＤＮＡ分子の単離及び／又は操作（とりわけ、ライブラリー合成）に主に立脚する。上記したように、物理化学力に起因して、溶解した（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）ＤＮＡは取り扱う際にきわめて剪断されやすく、超長鎖（ｕｌｔｒａ－ｌｏｎｇ）メガベースサイズのＤＮＡ分子を含有するシークエンシングライブラリーの合成を妨害する。
【0005】
ゲノムＤＮＡ分子を捕捉するためにアガロースヒドロゲルを使用することが当技術分野においてこれまでに提案されている（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｇａｂａｓｅ－ｓｉｚｅｄ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｉ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ”（２０１２），Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ．７（３）：４６７－４７８を参照）。しかしながら、（超）長鎖（ｌｏｎｇ）ＤＮＡ分子をヒドロゲルから抽出すると、長鎖核酸分子の剪断を引き起こすことが公知である。
【0006】
このＤＮＡの剪断は、例えばＤＮＡを細胞環境から単離した後又は酵素反応を実施した後に、長鎖ＤＮＡ分子をすすぎ洗いする際にも問題である。
【0007】
従って、例えば核酸を細胞及びオルガネラ分子から精製又は単離する際に、（超）高分子量核酸分子の破断又は剪断を防止する必要性が当技術分野においてなおも存在する。それに加えて、超長鎖核酸分子をシークエンシングするための方法に対する必要性が当技術分野において存在する。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、下記の番号付きの実施形態において要約され得る：
実施形態１．操作された核酸を含むヒドロゲルを取得する方法であって、
ａ）核酸を水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記核酸を含むヒドロゲルを形成するステップと、
ｃ）前記ヒドロゲル内で前記核酸を操作するステップと
を含み、前記ヒドロゲルが４５℃未満の温度で溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る、方法。
実施形態１．操作された核酸を含むヒドロゲルを取得する方法であって、
ａ）核酸を水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記核酸を含むヒドロゲルを形成するステップと、
ｃ）前記ヒドロゲル内で前記核酸を操作するステップと
を含み、前記ヒドロゲルが４５℃未満の温度で溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る、方法。
【0009】
実施形態２．前記核酸が担体に含まれ、並びに好ましくは、前記担体がオルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つであり、並びに前記オルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つが、ステップｃにおいて溶解されて（ｌｙｓｅｄ）前記核酸を放出する、実施形態１に記載の方法。
【0010】
実施形態３．水溶液中のポリマーが、イオン性ポリマー、好ましくはカルボン酸ペンダント基を有するアニオン性ポリマーである、実施形態１又は２に記載の方法。
【0011】
実施形態４．水溶液中のポリマーが、多糖類又はその誘導体であり、好ましくは前記多糖類又はその誘導体がウロン酸を含む、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
【0012】
実施形態５．前記多糖類又はその誘導体が、アルギネート又はその誘導体であり、好ましくは前記多糖類又はその誘導体がアルギネートである、実施形態４に記載の方法。
【0013】
実施形態６．前記担体が、ミトコンドリア、葉緑体、又は核であり、好ましくは前記担体が核である、実施形態２～５のいずれか一項に記載の方法。
【0014】
実施形態７．前記核酸が、ＤＮＡ分子、好ましくはゲノムＤＮＡ分子である、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
【0015】
実施形態８．前記操作された核酸が、単離された超高分子量（ｕＨＭＷ）核酸である、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
【0016】
実施形態９．前記細胞が植物細胞であり、好ましくは前記植物細胞がプロトプラストである、実施形態１～８のいずれか一項に記載の方法。
【0017】
実施形態１０．前記操作された核酸が、ヒドロゲルミクロスフェア内で安定化している、実施形態１～９のいずれか一項に記載の方法。
【0018】
実施形態１１．シークエンシングライブラリー、好ましくはロングリード・シークエンシングライブラリーを調製する方法であって、
実施形態１～１０のいずれか一項で定義されるような操作された核酸を含むヒドロゲルを取得するステップと
前記ヒドロゲル内で前記核酸を改変してシークエンシングライブラリーを取得するステップと
を含む方法。
実施形態１～１０のいずれか一項で定義されるような操作された核酸を含むヒドロゲルを取得するステップと
前記ヒドロゲル内で前記核酸を改変してシークエンシングライブラリーを取得するステップと
を含む方法。
【0019】
実施形態１２．
実施形態１１で定義されるようなシークエンシングライブラリーを取得するステップと、
前記ヒドロゲルを、好ましくは４５℃未満の温度で溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）ステップと、
前記ライブラリーをシークエンシングするステップと
を含むシークエンシング法、好ましくはディープシークエンシング法、より好ましくはロングリード・ディープシークエンシング法。
実施形態１１で定義されるようなシークエンシングライブラリーを取得するステップと、
前記ヒドロゲルを、好ましくは４５℃未満の温度で溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）ステップと、
前記ライブラリーをシークエンシングするステップと
を含むシークエンシング法、好ましくはディープシークエンシング法、より好ましくはロングリード・ディープシークエンシング法。
【0020】
実施形態１３．前記シークエンシングライブラリーが、前記ヒドロゲルを溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）前にシークエンサーフローセルに負荷され、好ましくは前記フローセルが、ロングリード・シークエンサーのフローセルである、実施形態１２に記載の方法。
【0021】
実施形態１４．前記シークエンサーが、ナノポアシークエンサーである、実施形態１３に記載の方法。
【0022】
実施形態１５．前記ヒドロゲルが、
シークエンシングバッファーを添加すること、
１価のカチオン、好ましくはナトリウムカチオンを含むバッファーを添加すること、
前記温度を約２０℃～４０℃から約２℃～１０℃に低下させること、及び
ｐＨを約５～６から約７～８、又は約７～８から約５～６に調整すること
のうちの少なくとも１つにより溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）、実施形態１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
シークエンシングバッファーを添加すること、
１価のカチオン、好ましくはナトリウムカチオンを含むバッファーを添加すること、
前記温度を約２０℃～４０℃から約２℃～１０℃に低下させること、及び
ｐＨを約５～６から約７～８、又は約７～８から約５～６に調整すること
のうちの少なくとも１つにより溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）、実施形態１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
【0023】
実施形態１６．核酸含有担体を含むヒドロゲルを取得するための方法であって、
前記核酸含有担体を水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記核酸含有担体を含むヒドロゲルを形成するステップと
を含み、
前記ヒドロゲルが、実施形態１～５のいずれか一項で定義されるようなヒドロゲルである、方法。
前記核酸含有担体を水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記核酸含有担体を含むヒドロゲルを形成するステップと
を含み、
前記ヒドロゲルが、実施形態１～５のいずれか一項で定義されるようなヒドロゲルである、方法。
【0024】
実施形態１７．前記核酸含有担体がオルガネラであり、及び細胞を溶解して（ｌｙｓｉｎｇ）前記オルガネラを取得するステップを更に含む、実施形態１６に記載の方法。
【0025】
実施形態１８．実施形態１～１０、１６、及び１７のいずれか一項に記載の方法により取得可能なヒドロゲル。
【0026】
実施形態１９．核酸含有担体、オルガネラ、及び操作された核酸のうちの少なくとも１つ、好ましくは単離されたｕＨＭＷ核酸を含むヒドロゲルであって、実施形態１～５のいずれか一項で定義されるようなヒドロゲル。
【0027】
実施形態２０．前記ヒドロゲルが、アルギネートを含む、実施形態１９に記載のヒドロゲル。
【0028】
実施形態２１．
ゲノムシークエンシング、
ロングレンジゲノム分析、
トランスクリプトーム分析、
マップに基づくクローニング、
ゲノム物理マッピング、
ラージインサートＢＡＣライブラリーの構築、及び
ラージインサートＢＩＢＡＣライブラリーの構築
のうちの少なくとも１つのための、実施形態１８～２０のいずれか一項で定義されるようなヒドロゲルの使用。
ゲノムシークエンシング、
ロングレンジゲノム分析、
トランスクリプトーム分析、
マップに基づくクローニング、
ゲノム物理マッピング、
ラージインサートＢＡＣライブラリーの構築、及び
ラージインサートＢＩＢＡＣライブラリーの構築
のうちの少なくとも１つのための、実施形態１８～２０のいずれか一項で定義されるようなヒドロゲルの使用。
【0029】
実施形態２２．操作された核酸を含むヒドロゲルを取得するためのパーツキットであって、
ｉ）実施形態１～５のいずれか一項で定義されるようなヒドロゲルを形成するためのポリマーと、
ｉｉ）細胞及び／又はオルガネラ溶解（ｌｙｓｉｓ）バッファーと、
ｉｉｉ）任意選択的に、シークエンシングライブラリーを調製するための１つ又は複数のコンポーネントと
を含むパーツキット。
ｉ）実施形態１～５のいずれか一項で定義されるようなヒドロゲルを形成するためのポリマーと、
ｉｉ）細胞及び／又はオルガネラ溶解（ｌｙｓｉｓ）バッファーと、
ｉｉｉ）任意選択的に、シークエンシングライブラリーを調製するための１つ又は複数のコンポーネントと
を含むパーツキット。
【0030】
実施形態２３．シークエンシングライブラリーを調製するための前記コンポーネントが、少なくとも１つ以上のアダプターを含む、実施形態２２に記載のパーツキット。
【0031】
定義
本発明の方法、組成物、使用、及びその他の態様に関係する様々な用語が、本明細書及び特許請求の範囲全体を通じて使用される。そのような用語には、別途表示されない限り、本発明が関係する技術分野におけるその通常の意味が付与される。その他の特別に定義される用語は、本明細書に提示される定義と整合するように解釈される。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料が、本発明をテストするための実践において使用可能であるものの、好ましい材料及び方法が本明細書に記載されている。
本発明の方法、組成物、使用、及びその他の態様に関係する様々な用語が、本明細書及び特許請求の範囲全体を通じて使用される。そのような用語には、別途表示されない限り、本発明が関係する技術分野におけるその通常の意味が付与される。その他の特別に定義される用語は、本明細書に提示される定義と整合するように解釈される。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料が、本発明をテストするための実践において使用可能であるものの、好ましい材料及び方法が本明細書に記載されている。
【0032】
本発明の方法で使用される従来技術を実施する方法は、当業者にとって明白であろう。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養物、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、シークエンシング、及び関連する分野における従来技術の実践法は、当業者に周知されており、また例えば、下記の引用文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７、及び定期的更新版；並びにｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏにおいて議論されている。
【0033】
「Ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」：これら単数形の用語は、記載内容が別途明確に規定しない限り複数形の指示物を含む。従って、例えば、「ａ ｃｅｌｌ（一細胞）」と記載する場合、２つ以上の細胞の組合せ等が含まれる。
【0034】
本明細書で使用される場合、用語「約」が、小さな変動を記載及び説明するのに使用される。例えば、該用語は、±１０％以下、例えば±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％以下、又は±０．０５％以下等を指し得る。更に、量、比、及びその他の数値は、範囲形式で本明細書に提示される場合がある。そのような範囲形式は、利便性及び簡便性のために使用されると理解され、また範囲の限定として明示的に特定される数値が含まれるだけでなく、当該範囲内に包含されるすべての個々の数値又は部分範囲も、各数値及び部分範囲が明示的に特定されるかのように含まれると柔軟に理解すべきである。例えば、約１～約２００の範囲内の比には、約１及び約２００の明示的に列挙した限界値が含まれるだけでなく、個々の比、例えば約２、約３、及び約４等、及び部分範囲、例えば約１０～約５０、約２０～約１００等も含まれると理解すべきである。
【0035】
「及び／又は」：用語「及び／又は」とは、記載されたいくつかのケースのうちの１つ又は複数が、単独で、又は記載されたいくつかのケースの少なくとも１つ、最大記載されたいくつかのケースのすべてと組み合わさって生じ得る状況を指す。
【0036】
「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」：この用語は、包含的及び非限定的であり、非排他的であると解釈される。特に、該用語及びその変形形態は、所定の特性、ステップ、又はコンポーネントが含まれることを意味する。これらの用語は、その他の特性、ステップ、又はコンポーネントの存在を除外するとは解釈されない。
【0037】
本明細書で使用される場合、用語「アダプター」は、他の核酸、例えば二本鎖ＤＮＡ分子の一方又は両方の鎖の末端部に連結し得る、好ましくはライゲートし得る一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖、Ｙ字形、又はヘアピン核酸分子であり、また好ましくは限定された長さ、例えば長さ約１０～約２００、又は約１０～約１００塩基、又は約１０～約８０、又は約１０～約５０、又は約１０～約３０塩基対を有し、好ましくは化学的に合成される。アダプターの二本鎖構造は、互いに対をなす塩基である２つの異なるオリゴヌクレオチド分子により、又は単一のオリゴヌクレオチド鎖のヘアピン構造により形成され得る。明白なように、アダプターの連結可能な末端部は、制限酵素及び／又はプログラム可能なヌクレアーゼによる切断により生み出されたオーバーハングに適合性を有するように、及び任意選択的にライゲート可能なように設計され得る、非テンプレート伸長反応の付加（例えば、３’－Ａの付加）後に創出されたオーバーハングに適合性を有するように設計され得る、又は平滑末端を有し得る。
【0038】
核酸又は核酸反応と関連して使用される「増幅」とは、特定の核酸、例えば標的核酸又はタグ化された核酸等のコピーを作るｉｎ ｖｉｔｒｏ法を指す。核酸を増幅する非常に多くの方法が当技術分野において公知であり、また増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、ストランド置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、転写媒介式の増幅法、例えばＮＡＳＢＡ等（例えば、米国特許第５，４０９，８１８号）、ループ媒介式の増幅法（例えば米国特許第６，４１０，２７８号に記載されるような、例えばループ形成配列を使用する「ＬＡＭＰ」増幅法）、及び等温増幅反応が含まれる。増幅される核酸は、改変されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を含む、それらからなる、又はそれらに由来するＤＮＡであり得る。核酸分子（単数）又は核酸分子（複数）の増幅に起因する生成物（すなわち、「増幅産物」）は、開始核酸がＤＮＡ、ＲＮＡであるか、又はその両方であるかを問わず、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド若しくはヌクレオチドの両方の混合物であり得るか、或いは改変されたＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシド又はヌクレオチドを含み得る。
【0039】
「コピー」は、特定の配列に対して完全な配列相補性又は完全な配列同一性を有する配列であり得るが、但しこれに限定されない。或いは、コピーは、この特定の配列に対して完全な配列相補性又は同一性を必ずしも有さず、例えばある程度の配列変動が許容される。例えば、コピーは、ヌクレオチドアナログ、例えばデオキシイノシン又はデオキシウリジン等、意図的な配列変化（例えば、特定の配列に対してハイブリダイズ可能であるが、しかし相補的ではない配列を含むプライマーを通じて導入される配列変化等）、及び／又は増幅法期間中に生ずる配列エラーを含み得る。
【0040】
用語「相補性」は、本明細書においては、完全に相補的な鎖（例えば、第二又は逆の鎖）に対する配列の配列同一性として定義される。例えば、１００％相補的（又は完全に相補的）である配列は、本明細書では、相補鎖と１００％の配列同一性を有すると理解され、また例えば８０％相補的である配列は、本明細書では、（完全に）相補的な鎖に対して８０％の配列同一性を有すると理解される。
【0041】
「コンストラクト」又は「核酸コンストラクト」又は「ベクター」：この用語は、組換えＤＮＡ技術の使用に起因する人工核酸分子（宿主細胞中に外因性ＤＮＡを送達するのに使用可能であり、多くの場合、コンストラクトに含まれるＤＮＡ領域を宿主細胞内で発現させる目的を有する）を指す。コンストラクトのベクターバックボーンは、例えば（キメラ）遺伝子が組み込まれているプラスミドであり得る、又は適する転写制御配列（例えば、（誘導可能な）プロモーター）がすでに存在する場合には、所望のヌクレオチド配列（例えば、コーディング配列）のみが転写制御配列の下流に組み込まれる。ベクターは、分子クローニングにおけるその使用を促進する更なる遺伝要素、例えば選択マーカー、複数のクローニング部位等を含み得る。
【0042】
用語「二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ）」及び「二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）」は、本明細書で使用される場合、塩基対をなす、すなわち共にハイブリダイズする２つの相補的なポリヌクレオチドについて記載する。相補的なヌクレオチド鎖も、逆相補体として当技術分野において公知である。
【0043】
用語「有効量」とは、本明細書で使用される場合、所望の生物学的効果を誘発するのに十分である生物学的に活性な薬剤の量を指す。例えば、いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼの有効量は、保護されていない核酸の切断を誘発するのに十分であるエキソヌクレアーゼの量を意味し得る。当業者により認識されるように、薬剤の有効量は、様々な要因、例えば使用される薬剤、薬剤が使用される条件、及び所望の生物学的効果、例えば検出されるヌクレアーゼ切断の程度等に応じて変化し得る。
【0044】
「代表的な」：この用語は、「例、事例、又は例証としての役目を果たすこと」を意味し、また本明細書で開示されるその他の構成を排除すると解釈してはならない。
【0045】
「発現」：この用語は、ＤＮＡ領域（適する制御領域、特にプロモーターと作動可能にリンクしている）が、ＲＮＡに転写され、ひいてはタンパク質又はペプチドに翻訳され得るプロセスを指す。
【0046】
「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により容易に計算され得る。「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じてグローバル又はローカルアライメントアルゴリズムを使用して、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列をアライメントすることにより決定可能である。類似した長さの配列は、配列を全長にわたり最適にアライメントするグローバルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ法）を使用して好ましくはアライメントされる一方、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ法）を使用して好ましくはアライメントされる。配列が（例えば、デフォルトパラメーターを使用しながら、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適にアライメントされたとき）、少なくともある最低限度のパーセントの配列同一性（下記で定義される通り）を共有するとき、配列は「実質的に同一」又は「本質的に類似」と呼ぶことができる。ＧＡＰは、一致する数を最大化し、且つギャップの数を最低限に抑えながら、２つの配列をその全長（完全長）にわたりアライメントするために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを使用する。グローバルアライメントは、２つの配列が類似した長さを有するとき、配列同一性を決定するのに好適に使用される。一般的に、ギャップクリエイションペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップエクステンションペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）といったＧＡＰデフォルトパラメーターが使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、またタンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリックスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ ８９、９１５－９１９）。配列同一性の割合（％）に関する配列アラインメント及びスコアは、コンピュータープログラム、例えばアクセルリル（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．）社、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ９２１２１－３７５２、米国から入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ、バージョン１０．３等を使用して、又は上記ＧＡＰの場合と同じパラメーターを使用しながら、若しくはデフォルト設定（「Ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方、並びにタンパク質及びＤＮＡアライメントの両方について、デフォルトギャップオープニングペナルティは１０．０であり、及びデフォルトギャップエクステンションペナルティは０．５であり；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質についてＢｌｏｓｕｍ６２であり、及びＤＮＡについてＤＮＡＦｕｌｌである）を使用しながら、オープンソースソフトウェア、例えばＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０内のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用）、又は「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用）等を使用して決定され得る。配列が、実質的に異なる全体長を有する場合、ローカルアライメント、例えばＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するもの等が好ましい。
【0047】
或いは、類似性又は同一性の割合（％）は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムを使用しながら、公開データベースに照らして検索することにより決定され得る。従って、本発明の核酸及びタンパク質配列は、公開データベースに照らして検索を実施して、例えばその他のファミリーメンバー又は関連する配列を同定するための「問い合わせ配列」として更に使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施可能である。本発明の核酸分子と相同であるヌクレオチド配列を取得するために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索が、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施可能である。本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を取得するために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索が、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施可能である。比較目的でギャップ付きアライメントを取得するためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されるように、ギャップ付きＢＬＡＳＴが利用可能である。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメーターが使用可能である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／の国立生物工学情報センターのホームページを参照。
【0048】
用語「ヌクレオチド」には、グアニン、シトシン、アデニン、及びチミン（それぞれＧ、Ｃ、Ａ、及びＴ）を含む自然発生的なヌクレオチドが含まれるが、但しこれらに限定されない。用語「ヌクレオチド」には、公知のプリン及びピリミジン塩基だけでなく、改変されたその他の複素環式塩基も含有する部分が含まれるように更に意図される。そのような改変体として、メチル化されたプリン若しくはピリミジン、アシル化されたプリン若しくはピリミジン、アルキル化されたリボース、又はその他の複素環が挙げられる。それに加えて、用語「ヌクレオチド」には、ハプテン又は蛍光標識を含有する部分が含まれ、また従来のリボース及びデオキシリボース糖だけでなく、その他の糖もやはり含まれる場合もある。改変されたヌクレオシド又はヌクレオチドには、例えば、いくつかのヒドロキシル基のうちの１つ若しくは複数がハロゲン原子若しくは脂肪族基と置換され、又はエーテル、アミン等として機能化されている、糖部分の改変も含まれる。
【0049】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「核酸分子」は、本明細書ではヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される、任意の長さ、例えば約２塩基を上回る、約１０塩基を上回る、約１００塩基を上回る、約５００塩基を上回る、１０００塩基を上回る、最大約１０，０００又はそれを上回る塩基からなるポリマーを記載するのに交換可能に使用され、また酵素的に又は合成により生成され得る（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号及びその中で引用された参考資料に記載されるようなＰＮＡ）。核酸は、２つの自然発生的な核酸が、例えばワトソン・クリック塩基対形成相互作用に関与し得るのと類似して、自然発生的な核酸と配列特異的にハイブリダイズし得る。それに加えて、核酸及びポリヌクレオチドは、細胞、組織、及び／又は体液から単離され得る（及び任意選択的にその後断片化され得る）。核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ミトコンドリア若しくは葉緑体ＤＮＡ、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ等、ライブラリー由来のＤＮＡ、及び／又はライブラリー由来のＲＮＡであり得る。本発明で使用される核酸は、例えば、細胞、組織、生検、又は体液から単離され得る。
【0050】
本発明の方法で使用される核酸は、任意の起源、例えば全ゲノム、染色体の集合、単一の染色体、１つ若しくは複数の染色体、又は転写された遺伝子に由来する１つ若しくは複数の領域に由来し得るが、また生物起源から、又はラボ起源、例えば核酸ライブラリーから直接単離され得る。
【0051】
本発明の方法で使用するための核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＢＮＡ（架橋型核酸）、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルホリノ核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、エピジェネティックに改変されたヌクレオチド、例えばメチル化されたＤＮＡ等、並びにその模倣体及び組合せを含む、但しこれらに限定されない、天然及び非天然ヌクレオチドの両方、人工的又は非標準的なヌクレオチドを含み得る。
【0052】
用語「目的とする配列」、「目的とする標的ヌクレオチド配列」、及び「標的配列」は、本明細書では交換可能に使用され、好ましくは細胞内に存在する任意の遺伝子配列、例えば遺伝子、遺伝子の一部分、又は遺伝子内若しくはそれに隣接したノンコーディング配列等が挙げられるが、但しこれらに限定されない。目的とする配列は、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム、例えばミトコンドリア若しくは葉緑体ゲノム等、又は遺伝物質の本体とは無関係に存在し得る遺伝物質、例えば感染性ウイルスゲノム、プラスミド、エピソーム、トランスポゾン等内に存在し得る。目的とする配列は、遺伝子のコーディング配列内、転写されたノンコーディング配列、例えばリーダー配列、トレーラー配列、又はイントロン等内にあり得る。前記目的とする核酸配列は、二本鎖又は一本鎖核酸内に存在し得る。目的とする配列は、核酸、例えば遺伝子、遺伝子複合体、遺伝子座、偽遺伝子、制御領域、きわめて反復性の領域、多型領域、又はその一部分に含まれる任意の配列であり得る。目的とする配列は、表現型又は疾患を示唆する遺伝的又はエピジェネティックな変化を含む領域でもあり得る。目的とする配列は、多型、例えばＳＮＰを有し又は有すると疑われる配列であり得るが、但しそれに限定されない。
【0053】
「植物」とは、植物全体又は植物の一部分、例えば、植物から取得可能な細胞、プロトプラスト、カルス、組織、器官等（例えば、胚、花粉、胚珠、種子、配偶子、根、葉、花、花芽、葯、果実等）、並びにこれらのいずれかの派生体、及び自家受粉又は交配による植物由来の子孫を指す。植物の非限定的な例として、作物植物及び培養植物、例えばアフリカンエッグプラント（Ａｆｒｉｃａｎ ｅｇｇｐｌａｎｔ）、ネギ類、アーティチョーク、アスパラガス、大麦、ビート、ピーマン、ゴーヤー、ホオズキ、ヒョウタン（ｂｏｔｔｌｅ ｇｏｕｒｄ）、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、チコリー、インゲンマメ、コーンサラダ（ｃｏｒｎ ｓａｌａｄ）、綿花、キュウリ、ナス、エンダイブ、ウイキョウ、ガーキン、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、アブラナ、オクラ、パセリ、パースニップ、ペピーノ、コショウ、ジャガイモ、カボチャ、ラディッシュ、米、リッジガード（ｒｉｄｇｅ ｇｏｕｒｄ）、ロケット、ライ麦、カラスウリ、ソルガム、ホウレンソウ、ヘチマ（ｓｐｏｎｇｅ ｇｏｕｒｄ）、カボチャ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマティーヨ、トマト、トマト台木、アブラナ属の野菜、スイカ、トウガン、小麦、及びズッキーニ等が挙げられる。
【0054】
「植物細胞（複数可）」として、単離物内、又は組織、器官、若しくは生物内のプロトプラスト、配偶子、懸濁培養物、小胞子、花粉粒等が挙げられる。植物細胞は、例えば多細胞構造、例えばカルス、分裂組織、植物器官、又は外植片等の一部分であり得る。
【0055】
「エンドヌクレアーゼ」は、その標的又は認識部位と結合すると、二重鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖又はＲＮＡ分子の鎖を加水分解する酵素である。エンドヌクレアーゼは、本明細書においては部位特異的エンドヌクレアーゼとして理解され、及び用語「エンドヌクレアーゼ」及び「ヌクレアーゼ」は、本明細書において交換可能に使用される。制限エンドヌクレアーゼは、本明細書においては、ＤＮＡに二本鎖切断を導入すると同時に、二重鎖の両方の鎖を加水分解するエンドヌクレアーゼとして理解される。「ニッキング」エンドヌクレアーゼは、二重鎖の一方の鎖のみを加水分解して、切断ではなくニッキングされたＤＮＡ分子を生成するエンドヌクレアーゼである。
【0056】
「エキソヌクレアーゼ」は、本明細書においては、１つ又は複数のヌクレオチドをポリヌクレオチドの末端部（エキソ）から切断する任意の酵素として定義される。
【0057】
「複雑性を低下させること」又は「複雑性の低下」とは、本明細書においては、複雑な核酸サンプル、例えばゲノムＤＮＡに由来するサンプル、単離されたＲＮＡサンプル等の低下として理解される。複雑性の低下は、複雑な出発物質に含まれる１つ若しくは複数の特定の標的配列又は標的核酸断片（本明細書では標的断片とも命名される）の富化、及び／又はサンプルのサブセットの生成を引き起こし、その場合、サブセットは、複雑な出発物質内に含まれる１つ若しくは複数の特定の標的配列又は断片を含む又はそれから構成される一方、非標的配列又は断片の量は、出発物質内、すなわち複雑性が低下する前の非標的配列又は断片の量と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下する。複雑性の低下は、更なる分析又は方法ステップ、例えば増幅、バーコーディング、シークエンシング、エピジェネティックな変化の決定等の前に一般的に実施される。好ましくは、複雑性の低下は、再現性のある複雑性低下であり、それは、同一のサンプルについて同一の方法を使用して複雑性を低下させたとき、ランダムな複雑性低下とは反対に、同一又は少なくとも同等のサブセットが得られることを意味する。複雑性低下法の例として、例えば、ＡＦＬＰ（登録商標）（Ｋｅｙｇｅｎｅ Ｎ．Ｖ．、オランダ；例えば、欧州特許第０ ５３４ ８５８号を参照）、任意プライムＰＣＲ増幅法、キャプチャープローブハイブリダイゼーション、Ｄｏｎｇ（例えば、国際公開第０３／０１２１１８号、同第００／２４９３９号を参照）及びインデックスリンキング（Ｕｎｒａｕ Ｐ．ａｎｄ Ｄｅｕｇａｕ Ｋ．Ｖ．（１９９４）Ｇｅｎｅ １４５：１６３－１６９）により記載される方法、国際公開第２００６／１３７７３３号；同第２００７／０３７６７８号；同第２００７／０７３１６５号；同第２００７／０７３１７１号、米国特許出願公開第２００５／２６０６２８号、国際公開第０３／０１０３２８号、米国特許出願公開第２００４／１０１５３号に記載されている方法、ゲノムポーショニング（ｇｅｎｏｍｅ ｐｏｒｔｉｏｎｉｎｇ）（例えば、国際公開第２００４／０２２７５８号を参照）、遺伝子発現連鎖解析法（ＳＡＧＥ；例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５、上記参照、及びＭａｔｓｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．２０（６）：７１９－７２６を参照）、及びＳＡＧＥの改変法（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２６（１４）：３４４５－３４４６；及びＫｅｎｚｅｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｈｌｅｍａｎｎ，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２７（３）：９１７－９１８を参照）、ＭｉｃｒｏＳＡＧＥ法（例えば、Ｄａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２７（５）：１３００－１３０７を参照）、超並列シグネチャーシークエンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｇｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ；例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８：６３０－６３４、及びＢｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．９７（４）：１６６５－１６７０を参照）、自己減算型ｃＤＮＡライブラリー（ｓｅｌｆ－ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）（Ｌａｖｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３０（９）：ｅ３８）、リアルタイムマルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅法（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｂｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＴ－ＭＬＰＡ；例えば、Ｅｌｄｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，ｖｏｌ．３１ （２３）：ｅｌ５３を参照）、高カバー率発現プロファイリング法（Ｈｉｇｈ Ｃｏｖｅｒａｇｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＨｉＣＥＰ；例えば、Ｆｕｋｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３１（１６）：ｅ９４を参照）、Ｒｏｔｈら（Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．２２（４）：４１８－４２６）で開示されるようなユニバーサルマイクロアレイシステム、トランスクリプトーム減算法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３３（１６）：ｅｌ３６を参照）、及びフラグメントディスプレイ法（例えば、Ｍｅｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３２（１６）：ｅｌ２７を参照）が挙げられる。
【0058】
「配列」又は「ヌクレオチド配列」：この用語は、核酸の又は核酸内のヌクレオチドの順番を指す。換言すれば、核酸内のヌクレオチドのあらゆる順番が、配列又は核酸配列と呼ばれ得る。例えば、標的配列は、ＤＮＡ二重鎖のうちの一本の鎖に含まれるヌクレオチドの順番である。
【0059】
用語「シークエンシング」とは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの同一性（例えば、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、又は少なくとも２００個、又はそれを上回る連続したヌクレオチドの同一性）が取得される方法を指す。用語「次世代シークエンシング」とは、例えばイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）社、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、パックバイオ（ＰａｃＢｉｏ）社、及びロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社等により現在採用されているような、いわゆる並列化された合成によるシークエンシング法、又はライゲーションによるシークエンシング法プラットフォームを指す。次世代シークエンシング法には、ナノポアシークエンシング法、例えばオックスフォードナノポアテクノロジーズ社により商品化されている方法、又は電子検出に基づく方法、例えばライフテクノロジーズ社により商品化されているＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術等も含まれ得る。
【図面の簡単な説明】
【0060】
【図1】本発明の代表的な実施形態を示す図である。（Ａ）ヒドロゲルビーズ中への核のカプセル化と後続する核の溶解（lysis）、及びヒドロゲルのゲル化後の核酸の精製を図示する実施形態。ステップ１）生物学的担体、例えば細胞又は核等内の核酸、２）生物学的担体のヒドロゲル中へのカプセル化、３）ヒドロゲルの可逆的ゲル化及び生物学的担体の溶解（ｌｙｓｉｓ）、４）核酸の精製及び操作（例えば、配列ライブラリーの調製）、５）核酸の脱ゲル化及び回収、６）核酸の更なる処理（例えば、シークエンシング）（Ｂ）別の代表的な実施形態では、核酸（１）はヒドロゲル中に直接カプセル化することができ（２）、ポリマーの可逆的ゲル化及び核酸の操作が後続する（３）。ステップ４）は、核酸の脱ゲル化及び回収であり、並びに５）核酸の更なる処理である。（Ｃ）核酸は、細胞又はオルガネラ以外の担体、例えば人工ビーズ又はスキャフォールド内で又はそれともやはり会合し得る。ステップ１）生体細胞又はオルガネラ以外の担体中への又はそれに対する核酸の提示、２）ヒドロゲル内への核酸－担体複合体のカプセル化、３）ヒドロゲルの可逆的ゲル化及び核酸の操作、４）核酸の脱ゲル化及び回収、並びに５）核酸の更なる処理。表示の代表的な実施形態において、トラップされた核酸は、半固体状態で（酵素的に）操作可能であり（例えば、ライブラリーの調製）、ヒドロゲルが脱ゲル化されたとき又はその後に更なる処理が後続する。配列ライブラリーを含有するミクロスフェアは、フローセル内に直接「負荷」可能であり、それに粒子の溶解（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）が後続する。放出されたライブラリーＤＮＡ分子は、シークエンシングプロセスにアクセス可能となる。
【図2】実施例１及び２で半固体状態ナノポアライブラリーを調製する際に使用したいくつかの異なるバッファーにおいて、ヒドロゲルビーズからの拡散により失われたゲノムＤＮＡの割合（％）を示す図である。ナノポアライブラリー調製インキュベーション期間中に使用され、その後廃棄される各バッファー、すなわちＤＮＡ修復及び末端部調製前に洗浄用として使用されたバッファー溶液（１）、ＤＮＡ修復及び末端部調製用の酵素を含むバッファー（２）、ＤＮＡ修復及び末端部調製後の洗浄用のＭＱ（３）、ライゲーション前の洗浄用ライゲーションバッファー（４）、アダプターライゲーション用のリガーゼ及びアダプターを含むライゲーションバッファー（５）、及び平衡化用の溶出バッファー（６）から回収されたＤＮＡの相対的な量を示す。カプセル化に使用されたインプットＤＮＡの量を１００％に設定する。すべての分画において、及びすべての実施例について、水溶液中に失われたＤＮＡがほとんどないことから、ライブラリーの調製全体を通じて、カプセル化されたＤＮＡのヒドロゲルから溶液中への拡散はなかった、又は非常に低レベルであったことを示しており、アダプターライゲーションのステップ期間中の喪失割合（％）が最高であったが（挿入されたグラフを参照）、しかしながら、サイズ測定より、これは未ライゲートアダプターＤＮＡであることが明らかとなった（データ図示せず）。
【図3】参照ゲノムに対してマップ化したすべてのリードのリード長分布を示す図である。ｘ軸は、参照に対してマップ化する個々のリードすべてを示す。ｙ軸は、リード長を塩基数で示す。
【図4】核酸含有担体を含むヒドロゲルミクロスフェアのマイクロ流体に基づく合成の概略図を示す図であり、第１の反応物質は核酸含有担体を含み、及び第２の反応物質は水性ポリマー溶液を含む。任意選択的な第３の反応物質はゲル化誘発物質を含み得る。１Ａ）分散段階、例えば、細胞、オルガネラ、核酸、生体分子、１Ｂ）分散段階、水性ポリマー溶液、２）連続段階、例えばオイル－界面活性剤エマルジョン、３）収集段階。
【図5】ｕＨＭＷゲノム植物ＤＮＡのパルスフィールドゲル電気泳動を示す図である。Ａ）レーン１：サトウダイコン核を溶解（ｌｙｓｉｓ）した後に単離し、水性環境において更に精製した核ＤＮＡ。レーン２：染色体のサイズをｋｂで表した、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）染色体のパルスフィールドマーカー。個々の断片の分子量をゲルに隣接して示す。Ｂ）レーン１：サッカロマイセス・セレビシエ染色体のパルスフィールドマーカー。レーン２、４、及び５：アルギネート球体内でカプセル化及び溶解された（ｌｙｓｅｄ）サトウダイコンの核に由来するゲノムＤＮＡ。レーン３：アルギネート球体内でカプセル化及び溶解された（ｌｙｓｅｄ）インパチェンスの核に由来するゲノムＤＮＡ。レーン２及び３では、ｕＨＭＷ ＤＮＡを含有するアルギネート球体を、電気泳動前にパルスフィールドゲル内に直接負荷した。レーン４及び５では、ｕＨＭＷ ＤＮＡを、ウェルにクエン酸ナトリウムを添加することによりアルギネート球体から放出させた。
【発明を実施するための形態】
【0061】
本発明者らは、核酸分子の剪断を最低限に抑え、且つ考え得る酵素的操作ステップの有効性を高めつつ、細胞及び／又はオルガネラから好ましくは単離された、操作された核酸分子を取得するための新規方法を発見した。本明細書において詳記される方法は、水溶液中でＤＮＡを単離及び操作する必要性を回避する。本発明の代表的な実施形態を図１に示す。本発明は、ヒドロゲル粒子内での（長い）核酸の安定化に基づく（例えば、図１Ｂに例示する）。１つの実施形態（例えば、図１Ａに例示する）では、本発明は、架橋したヒドロゲル粒子内にカプセル化された組織、細胞、又はオルガネラから核酸を抽出し、任意選択的に操作すること（例えば、ライブラリーの調製）と関係する。組織、細胞、又はオルガネラの溶解（ｌｙｓｉｓ）後、遊離したｕＨＭＷ ＤＮＡは、ヒドロゲルマトリックスにおいてトラップされることとなり、（酵素的）操作、例えば配列ライブラリーの調製等のためにアクセス可能となる。最終的に、操作されたＤＮＡ（例えば、配列ライブラリー）を含有するヒドロゲルは、更に処理可能である（例えば、ナノポアフローセル内への負荷）。すべてのステップは、物理的に固定されたＤＮＡにおいて実施されるので、ＤＮＡ（又はライブラリー）に対するダメージの影響は、伝統的な溶液内の方式に基づく方法と比較してかなり低い。更に、ＤＮＡの固定化は、汚染物質及び酵素からの分子のより効率的な精製を可能にする。しかしながら、本発明は生物学的担体に限定されない。図１Ｃに例示するように、長い核酸分子を安定化及び／又は沈殿させる非生物学的担体も、同様にカプセル化された状態になり得る。放出された核酸分子は、その後本発明のヒドロゲルにおいて精製及び／又は操作され得る。
【0062】
従って第１の態様では、本発明は、操作された核酸分子を含むヒドロゲルを取得するための方法であって、
ａ）核酸を水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記核酸を含むヒドロゲルを形成するステップと、
ｃ）前記ヒドロゲル内で前記核酸を操作するステップと
を含む方法と関係する。
ａ）核酸を水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記核酸を含むヒドロゲルを形成するステップと、
ｃ）前記ヒドロゲル内で前記核酸を操作するステップと
を含む方法と関係する。
【0063】
ステップｃの「～を操作するステップ」は、本明細書では、洗浄、単離、又は放出、酵素的改変（例えば、分解、断片化、二本鎖切断又は一本鎖切断の導入、及び脱アミノ化等、但しこれらに限定されない）、タグ化、アダプターライゲーション、伸張、末端修復、平滑末端の創出、増幅、及び任意のこれらの組合せのうちの少なくとも１つとして理解される。ヒドロゲルは、好ましくは本明細書で定義されるようなヒドロゲルである。
【0064】
好ましくは、核酸は、担体に含まれ又はそれに連結しており、本明細書では、核酸を含む担体又は核酸含有担体として表示される。
従って、一実施形態では、本発明は、操作された核酸分子を含むヒドロゲルを取得するための方法であって、
ａ）核酸含有担体を水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記核酸含有担体を含むヒドロゲルを形成するステップと、
ｃ）前記ヒドロゲル内で前記核酸含有担体の核酸を操作するステップと
を含む方法を提供する。
従って、一実施形態では、本発明は、操作された核酸分子を含むヒドロゲルを取得するための方法であって、
ａ）核酸含有担体を水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記核酸含有担体を含むヒドロゲルを形成するステップと、
ｃ）前記ヒドロゲル内で前記核酸含有担体の核酸を操作するステップと
を含む方法を提供する。
【0065】
ヒドロゲルは、好ましくは本明細書で定義されるようなヒドロゲルである。核酸含有担体は、天然又は非天然の核酸含有担体、すなわち本明細書において更に詳記されるような自然界で生ずる担体又は人工的な核酸含有担体であり得る。考え得る天然の核酸含有担体は、細胞及び／又はオルガネラである。
【0066】
核酸含有担体が細胞である場合、方法は、細胞を溶解して（ｌｙｓｉｎｇ）オルガネラを取得するステップを更に含み得る。細胞は、オルガネラを水性ポリマー溶液と組み合わせる前に溶解され（ｌｙｓｅｄ）得る。或いは、細胞は、細胞を水性ポリマー溶液と組み合わせた後、及びポリマー溶液をゲル化させる前に溶解（ｌｙｓｅｄ）され得る。或いは、細胞は、ポリマー溶液をゲル化させてオルガネラを含むヒドロゲルを形成した後に溶解され（ｌｙｓｅｄ）得る。好ましくは、オルガネラを含むヒドロゲルは、無処理の細胞を含まない又は実質的に含まない。
【0067】
担体が細胞である場合、操作ステップｃは、好ましくは担体から核酸を放出させ、これにより単離された核酸を含むヒドロゲルを取得するステップである。本発明は、従って単離された核酸を含むヒドロゲルを取得するための方法にも関係する。用語「単離された」及び「抽出された」は、本明細書では交換可能に使用可能であり、また担体からの、任意選択的にその細胞内の場所からの核酸の放出を指す。従って、本発明は、単離された核酸を含むヒドロゲルを取得するための方法であって、
ａ）核酸を含む担体を水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記担体を含むヒドロゲルを形成するステップと
ｃ）前記担体から前記核酸を放出させて、単離された核酸を含むヒドロゲルを取得するステップと
を含む方法も提供する。
ａ）核酸を含む担体を水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記担体を含むヒドロゲルを形成するステップと
ｃ）前記担体から前記核酸を放出させて、単離された核酸を含むヒドロゲルを取得するステップと
を含む方法も提供する。
【0068】
好ましくは、ヒドロゲルは、４５℃未満の温度で溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る。
一実施形態では、担体はオルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つである。核酸は、好ましくは細胞又はオルガネラから単離される。オルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つは、核酸を放出するために溶解（ｌｙｓｅｄ）され得る。従って本実施形態では、方法は、
ａ）核酸を含むオルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つを、水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、オルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つを含むヒドロゲルを形成するステップと、
ｃ）前記オルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つを溶解して（ｌｙｓｉｎｇ）、単離された核酸を含むヒドロゲルを取得するステップと
を好ましくは含む。
一実施形態では、担体はオルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つである。核酸は、好ましくは細胞又はオルガネラから単離される。オルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つは、核酸を放出するために溶解（ｌｙｓｅｄ）され得る。従って本実施形態では、方法は、
ａ）核酸を含むオルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つを、水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、オルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つを含むヒドロゲルを形成するステップと、
ｃ）前記オルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つを溶解して（ｌｙｓｉｎｇ）、単離された核酸を含むヒドロゲルを取得するステップと
を好ましくは含む。
【0069】
好ましくは、核酸はヒドロゲル内で安定化している。用語「安定化」及び「固定化」は、本明細書では交換可能に使用可能である。ヒドロゲル内での核酸の安定化は、核酸の破断又は剪断を防止する。
【0070】
核酸含有担体、好ましくはオルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つは、水性ポリマー溶液と最初に組み合わされ、ポリマー溶液をゲル化させるステップが後続し得る。
【0071】
代替的又は付加的に、核酸含有担体、好ましくはオルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つは、水性ポリマー溶液をゲル化させる期間中に組み合わされ得る。
【0072】
細胞及びオルガネラのうちの少なくとも１つを溶解すること（ｌｙｓｉｎｇ）で、核酸がヒドロゲル中に放出される。従って、本発明の方法は、単離された核酸を取得するための方法であって、ヒドロゲル内でオルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つを溶解して（ｌｙｓｉｎｇ）単離された核酸を取得するステップを含み、単離された核酸が、ヒドロゲル、好ましくは本明細書において下記で定義されるようなヒドロゲル内で安定化している方法と更に関係する。
【0073】
任意選択的に、上記ステップａ～ｃに付加して、本発明の方法は、ｄ）（単離された）核酸及び／又は核酸含有担体を含むヒドロゲルを溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）ステップを更に含み得る。
【0074】
核酸
本発明の方法により取得可能な核酸は、少なくとも約１０ｋｂ（キロベース）、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、又は少なくとも約１０００ｋｂ（１Ｍｂ）のサイズを好ましくは有する。好ましくは、少なくとも約４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、又は少なくとも約１０００ｋｂ（１Ｍｂ）。
本発明の方法により取得可能な核酸は、少なくとも約１０ｋｂ（キロベース）、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、又は少なくとも約１０００ｋｂ（１Ｍｂ）のサイズを好ましくは有する。好ましくは、少なくとも約４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、又は少なくとも約１０００ｋｂ（１Ｍｂ）。
【0075】
核酸は、本発明の方法により取得可能な核酸である。従って、核酸のサイズは、本明細書で定義されるような（長鎖の）操作された核酸のサイズとして本明細書では理解され得る。
【0076】
好ましくは、本明細書に詳記されるような本発明の方法は、長鎖、ロングレンジ、又は高分子量（ＨＭＷ）核酸、すなわち上記したようなサイズを有する核酸を取得するのに使用可能である。好ましくは、本明細書に詳記されるような本発明の方法は、超高分子量（ｕＨＭＷ）核酸を取得するのに使用可能である。ｕＨＭＷ核酸は、好ましくは長鎖核酸のサブセットであり、少なくとも１Ｍｂの長さを有し得る。好ましくは、本発明の方法により取得可能な核酸は、少なくとも１．１Ｍｂ、１．３Ｍｂ、１．５Ｍｂ、１．７Ｍｂ、２Ｍｂ、２．５Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、又は少なくとも約１０Ｍｂ（メガベース）のサイズを有する。
【0077】
本発明の方法により取得可能な核酸は、核ゲノム又はサイトプラストオルガネラゲノムであり得る、又はそれから取得可能であり得る。核酸分子は、自然発生的な核酸又は人工的な核酸であり得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその混合物であり得る。核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＢＮＡ（架橋型核酸）、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルホリノ核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、エピジェネティックに改変されたヌクレオチド、例えばメチル化されたＤＮＡ等、並びにその模倣体及び組合せを含む、但しこれらに限定されない、天然及び非天然の両方のヌクレオチド、人工的又は非標準的なヌクレオチドが含まれ得る。核酸は、部分的に又は完全に一本鎖、二本鎖、又は三本鎖分子であり得る。
【0078】
本発明の方法により取得可能な核酸は、任意の起源、例えばヒト、動物、植物、微生物に由来し得るが、また任意の種類、例えば、細胞に対して内因性又は外因性、例えばゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、人工染色体、プラスミドＤＮＡ、又はエピソームＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、又はＢＡＣ若しくはＹＡＣ等の人工的ライブラリーのＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、核ＤＮＡ又はオルガネラＤＮＡであり得る。好ましくは、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、好ましくは細胞に対して内因性である。
【0079】
本発明の方法で得られた核酸は、目的とする配列、好ましくは本明細書において上記で定義されるような目的とする配列を含み得る。
【0080】
好ましくは、核酸分子は、ＤＮＡ分子、好ましくはゲノムＤＮＡ分子である。
核酸含有担体
好ましくは、核酸は核酸含有担体から単離される。核酸含有担体は、ＤＮＡ担体であり得る。核酸含有担体は、天然又は非天然の核酸含有担体、すなわち天然において生ずる担体又は人工核酸含有担体であり得る。
核酸含有担体
好ましくは、核酸は核酸含有担体から単離される。核酸含有担体は、ＤＮＡ担体であり得る。核酸含有担体は、天然又は非天然の核酸含有担体、すなわち天然において生ずる担体又は人工核酸含有担体であり得る。
【0081】
非天然の核酸含有担体の非限定的な例は、１つ又は複数の単離された染色体を含む担体である。単離された染色体は、染色体をペレット化した形態で維持するために、例えば追加の化合物又は化学的処理を伴う又は伴わない沈降した染色体であり得る。非天然核酸を含む担体は、核酸を含む、又は核酸が連結した固体又は半固体であり得る。
【0082】
好ましくは、核酸含有担体は天然の核酸含有担体である。天然の核酸含有担体は、好ましくは細胞及びオルガネラのうちの少なくとも１つである。従って、好ましくは、核酸は、細胞及びオルガネラのうちの少なくとも１つから単離される。オルガネラは、好ましくは細胞に含まれ、核酸、好ましくは本明細書で定義されるような核酸を含む。本明細書において定義され得る本発明の方法で使用するためのオルガネラは、膜結合型又は非膜結合型オルガネラであり得る。
【0083】
オルガネラは、膜結合型オルガネラであり得るが、例えばオルガネラは、脂質二重層、好ましくはリン脂質二重層を含む。脂質二重層、好ましくは、リン脂質二重層は核酸を取り巻く。従って、好ましいオルガネラは、核酸、好ましくは本明細書で定義されるような核酸を含む。好ましい膜結合型オルガネラは、核、葉緑体、ミトコンドリア、小胞体、鞭毛、ゴルジ装置、及び液胞のうちの少なくとも１つである。好ましいオルガネラは、核、葉緑体、及びミトコンドリアのうちの少なくとも１つである。好ましい膜結合型オルガネラは核である。本発明の方法で使用するための好ましいオルガネラは、核である。
【0084】
本発明の方法で使用するためのオルガネラは、非膜結合型オルガネラであり得る、すなわち脂質二重層を含まない。本発明の方法で使用するための好ましい非膜結合型オルガネラは、ヌクレオソーム、リボソーム、スプライセオソーム、核小体、ストレス顆粒、ＴＩＧＥＲドメイン、又はヴォールトのうちの少なくとも１つである。
【0085】
本発明の方法で使用するための核酸は、オルガネラからの核酸の単離を更に必要とすることなく、特に膜結合型オルガネラからの核酸の単離を必要とすることなく、細胞から単離され得る。非限定的な例として、核酸は細胞の細胞質から単離され得る。そのような核酸は、例えば、ＲＮＡ分子又は原核生物のＤＮＡ分子を構成し得る。
【0086】
本発明で使用するための核酸は、任意の種類の細胞から取得可能と考えられる。細胞は、ウイルス粒子、原核細胞、又は真核細胞であり得る。原核細胞は、古細菌細胞又は細菌細胞であり得る。細胞は細菌細胞であり得る。好ましい細菌細胞は、大腸菌属及びアグロバクテリウム属のうちの少なくとも１つ、好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のうちの少なくとも１つであり得る。
【0087】
細胞は、動物細胞、植物細胞、及び真菌細胞からなる群から選択される真核細胞であり得る。本発明の方法で使用するための細胞は、動物細胞であり得る。動物細胞は、齧歯類、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ヒト以外の霊長類、及びヒトからなる群から取得可能と考えられる。
【0088】
本発明の方法で使用するための細胞は、植物細胞であり得る。植物細胞は、植物プロトプラストであり得る。当業者は、植物プロトプラストを調製及び繁殖させるための方法及びプロトコールについて認識しており、例えば、Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＩＳＢＮ：９７８－０－１２－４１５９２０－４、Ｒｏｂｅｒｔａ Ｈ．Ｓｍｉｔｈ）を参照されたい。現行の本発明の方法で使用するための植物プロトプラストは、植物細胞プロトプラストの生成で使用される一般的手順を使用して提供可能であり、例えば細胞壁は、細胞を本明細書で定義されるような水性ポリマー溶液と組み合わせる前又は後に、セルロース、ペクチナーゼ、及び／又はキシラナーゼを使用して分解され得る。
【0089】
植物細胞プロトプラスト系は、例えばトマト、タバコ、及びほか多数（セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃｃａ ｓａｔｉｖａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ニコチアナ・ベンタミアーナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ペチュニア・ハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））について記載されている。本発明は、本明細書において参照により組み込まれている下記の参考資料：Ｂａｒｓｂｙ ｅｔ ａｌ．１９８６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５（２）：１０１－１０３；Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１１（１２）：６３２－６３６；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ５９：１８９－１９６；Ｎｉｅｄｚ ｅｔ ａｌ．１９８５，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３９：１９９－２０４；Ｐｒｉｏｌｉ ａｎｄ Ｓｏｎｄａｈｌ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：５８９－５９４；Ｓ．Ｒｏｅｓｔ ａｎｄ Ｇｉｌｉｓｓｅｎ １９８９，Ａｃｔａ Ｂｏｔ．Ｎｅｅｒｌ．３８（１）：１－２３；Ｓｈｅｐａｒｄ ａｎｄ Ｔｏｔｔｅｎ，１９７５，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５：６８９－６９４；Ｓｈｅｐａｒｄ ａｎｄ Ｔｏｔｔｅｎ，１９７７，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．６０：３１３－３１６のいずれか一報に記載されている系を含む、但しこれらに限定されない、任意のプロトプラスト系に一般的に適用可能である。
【0090】
好ましくは、本発明の方法で使用するための植物細胞は、作物植物又は培養植物、すなわちヒトにより培養及び育成される植物種から取得可能な細胞であり得る。作物植物は、食料又は飼料目的（例えば、農作物）、又は装飾目的（例えば、切り花用の花、芝生用の草の生産等）で培養され得る。本明細書で定義されるような作物植物には、非食品製品、例えば燃料用のオイル、プラスチックポリマー、医薬製品、コルク、繊維（例えば、綿等）等が採取される植物も含まれる。好ましくは、本明細書において教示されるような細胞は、作物植物由来である。
【0091】
植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物から取得され得る。単子葉植物は、イネ科に属する場合がある。双子葉植物は、ナス属、トウガラシ属、タバコ属、ウリ科、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）、マメ科、キク科、ヒユ科、アブラナ科、シソ科、及びバラ科からなる群から選択され得る。
【0092】
水性ポリマー溶液
水性ポリマー溶液は、１つ又は複数のポリマーを含む水溶液として本明細書では定義される。特定の条件下では、水性ポリマー溶液は、好ましくは核酸含有担体と組み合わさって、ヒドロゲル（本明細書では水性環境に埋め込まれた三次元親水性ネットワークとして定義される）を形成し得る。
水性ポリマー溶液は、１つ又は複数のポリマーを含む水溶液として本明細書では定義される。特定の条件下では、水性ポリマー溶液は、好ましくは核酸含有担体と組み合わさって、ヒドロゲル（本明細書では水性環境に埋め込まれた三次元親水性ネットワークとして定義される）を形成し得る。
【0093】
ゲル化とは、好ましくは核酸含有担体の存在下での、水性ポリマー溶液からのヒドロゲルの形成として本明細書では定義される。本明細書において、ゲル化（ｇｅｌａｔｉｏｎ）は、ゲル化（ｇｅｌｌｉｎｇ）に対する同意語として使用される。ゲル化期間中に、水性ポリマー溶液に含まれるポリマーの間で、好ましくは前記ポリマーと核酸含有担体の間でも架橋が形成される。
【0094】
前記架橋は、共有結合、イオン性結合、分子の絡み合い、水素結合、疎水的相互作用、ファンデルワールス力、及び／又は双極子－双極子相互作用を含み得る。好ましくは、前記架橋は、共有結合及び／又はイオン性結合を含む。これらの架橋の性質は、ポリマー及び核酸含有担体の化学構造により主に決定される。例えば、イオン性ペンダント基を有するポリマーを含む水溶液は、ゲル化する際にイオン性結合を形成し得る。架橋は、１つ又は複数のリンキング化合物、例えばイオン等を含み得る。
【0095】
ゲル化は可逆的プロセスであり得る。溶解（Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、ゲル化の逆のプロセスとして定義される。換言すれば、溶解（Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）期間中に、水性ポリマー溶液は、好ましくは１つ又は複数の追加化合物と組み合わさって、ヒドロゲルから形成される。本明細書において、溶解すること（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）は、溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）の同意語である。ゲル化の可逆性にもかかわらず、ヒドロゲル（第１の水溶液から形成された）が溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）すると、第２の水溶液となるが、その場合、前記第１の水溶液及び第２の水溶液は同一である必要はない。
【0096】
溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）には、ヒドロゲルを部分的に溶解させること（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）、例えば、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は約１００％のヒドロゲルを溶解させること（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）が含まれると本明細書では理解される。
【0097】
ゲル化及び溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、特定の条件下（１つ又は複数のパラメーター、例えば温度、ｐＨ、特定イオンの濃度等により特徴づけられ得る）、及びゲル化又は溶解誘発物質（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｒ）の存在下、単独で又はそれらが組み合わされて生ずる。
【0098】
水性ポリマー溶液は、下限臨界ゲル化温度（加熱した際にゲル化が生ずる温度）（ＬＣＧＴ）を有し得る。例えば、Ｐｏｌａｘａｍｅｒ又はＭｅＢｉｏｌの水溶液はＬＣＧＴを有する。ＬＣＧＴを有するヒドロゲルは、ＬＣＧＴを有する水性ポリマー溶液から形成されたヒドロゲルとして本明細書では定義される。逆に、ＬＣＧＴを有するヒドロゲルは、ＬＣＧＴ付近で冷却すると溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｅ）。
【0099】
水性ポリマー溶液は、上限臨界ゲル化温度（冷却した際にゲル化が生ずる温度）（ＵＣＧＴ）を有し得る。例えば、アガロースの水溶液はＵＣＧＴを有する。従って、アガロースの水溶液並びに１つ若しくは複数のオルガネラ及び／又は細胞から形成されたヒドロゲルは、溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｅ）ために加熱されなければならない。ＵＣＧＴを有するヒドロゲルは、ＵＣＧＴを有する水性ポリマー溶液から形成されたヒドロゲルとして定義される。逆に、ＵＣＧＴを有するヒドロゲルは、ＵＣＧＴ付近で加熱すると溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｅ）。
【0100】
温度の他に、ゲル化／溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）を誘発するための特定の条件には、特定イオンの濃度が含まれ得る。例えば、１つ又は複数のオルガネラと組み合わせたアルギネートの水溶液のゲル化は、カルシウムイオンの存在下で生ずる。この理論に拘泥するものではないが、カルシウムイオンはリンキング化合物として作用するので、このイオンはアルギネート鎖のカルボキシペンダント基の間でイオン性架橋の形成を可能にする。
【0101】
それに加えて、ゲル化又は溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）を誘発するための特定の条件には、ゲル化誘発物質又は溶解誘発物質（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｒ）の存在がそれぞれ含まれ得る。ゲル化誘発物質は、水性ポリマー溶液のゲル化が発生可能となるように、前記水性ポリマー溶液中に最低濃度で存在しなければならない化合物又は組成物である。溶解剤（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）は、ヒドロゲルの溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）が発生可能となるために、前記ヒドロゲル中に最低濃度で存在しなければならない化合物又は組成物である。
【0102】
所与の温度より低い又は高い温度でゲル化し得る水性ポリマー溶液が本明細書において記載される場合、又は所与の温度より低い又は高い温度で溶解（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）し得るヒドロゲルが本明細書において記載される場合は常に、ゲル化又は溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）に関するこれらの温度要件は必要条件と解釈され得るが、しかし必ずしも十分条件として解釈されない。例えば、アルギネート並びに１つ若しくは複数のオルガネラ及び／又は細胞の水溶液から形成されたヒドロゲルは、４５℃未満の温度において溶解可能（ｄｉｓｓｏｌｖａｂｌｅ）であると考えることも可能であるが、但しこの場合であっても、前記ヒドロゲルの溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）を誘発するためには、前記温度においてカルシウム濃度を有意に低下させる必要がある。
【0103】
ヒドロゲルの溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、溶解誘発物質（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｒ）の存在下で起こり得る。溶解誘発物質は、好ましくは溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）の前にヒドロゲルと接触する、又はそれと組み合わされる水溶液である。好ましくは、溶解誘発物質の導入は、溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）に必要とされる特定の条件を確立又は誘発するのに役立つ。例えば、溶解誘発物質を、アルギネートの水性ポリマー溶液から形成されたヒドロゲルと組み合わせることで、ヒドロゲルの溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）（又は溶解（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）が実現可能となる。
【0104】
本発明の文脈において、用語ポリマーは、ヒドロゲルを形成可能である水性ポリマー溶液に含まれるポリマーについて好ましくは使用され、好ましくは、前記ヒドロゲルは特定の条件下で溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る。
【0105】
好ましくは、本発明の水性ポリマー溶液は、上限臨界ゲル化温度（ＵＣＧＴ）を有し、及び／又は水性ポリマー溶液に含まれるもう１つ別の特定イオンの濃度が増加又は減少するとゲル化し得る。同様に、ヒドロゲルは、上限臨界ゲル化温度（ＵＣＧＴ）を好ましくは有し、及び／又はヒドロゲルに含まれるもう１つ別の特定イオンの濃度が増加又は減少すると溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る。
【0106】
好ましくは、本発明の水性ポリマー溶液は、約６０℃、５５℃、５０℃、４５℃、４０℃、３５℃、３０℃、２５℃、２０℃未満の上限臨界ゲル化温度を有する。同様に、ヒドロゲルは、約６０℃、５５℃、５０℃、４５℃、４０℃、３５℃、３０℃、２５℃、２０℃未満の上限臨界ゲル化温度を好ましくは有する。
【0107】
好ましくは、発明の水性ポリマー溶液は、下限臨界ゲル化温度（ＬＣＧＴ）を有し、及び／又は水性ポリマー溶液に含まれるもう１つ別の特定イオンの濃度が増加又は減少するとゲル化し得る。同様に、ヒドロゲルは、下限臨界ゲル化温度（ＬＣＧＴ）を好ましくは有し、及び／又はヒドロゲルに含まれるもう１つ別の特定イオンの濃度が増加又は減少すると溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る。
【0108】
好ましくは、本発明の水性ポリマー溶液は、約２５℃、３０℃、４０℃、４５℃を上回る下限臨界ゲル化温度を有する。同様に、ヒドロゲルは、約２５℃、３０℃、４０℃、４５℃未満の下限臨界ゲル化温度を好ましくは有する。
【0109】
好ましくは、本発明の水性ポリマー溶液及び／又はヒドロゲルは、ＬＣＧＴ及び／又はＵＣＧＴ、好ましくは本明細書で定義されるようなＬＣＧＴ又はＵＣＧＴを有する。
【0110】
好ましくは、本発明の水性ポリマー溶液は、多価イオン、好ましくは多価カチオン、好ましくはカルシウムの濃度が増加するとゲル化し得る。前記濃度の増加は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、又はそれ超の増加である。前記濃度の増加は、好ましくは、約６０℃、５５℃、５０℃、４５℃、４０℃、３５℃、３０℃、２５℃、２０℃未満の温度でゲル化を誘発することができる。同様に、ヒドロゲルは、多価イオン、好ましくは多価カチオン、好ましくはカルシウムの濃度が減少すると溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る。前記濃度の減少は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、又はそれ超の減少である。前記濃度の減少は、好ましくは、約６０℃、５５℃、５０℃、４５℃、４０℃、３５℃、３０℃、２５℃、２０℃未満の温度で溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）を誘発することができる。
【0111】
好ましくは、本発明の水性ポリマー溶液は、１価のイオン、好ましくは１価のカチオン、好ましくはナトリウム又はカリウム、好ましくはナトリウムの濃度が減少するとゲル化し得る。前記濃度の減少は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、又はそれ超の減少である。前記濃度の減少は、好ましくは、約６０℃、５５℃、５０℃、４５℃、４０℃、３５℃、３０℃、２５℃、２０℃未満の温度でゲル化を誘発することができる。同様に、ヒドロゲルは、１価のイオン、好ましくは１価のカチオン、好ましくはナトリウム又はカリウム、好ましくはナトリウムの濃度が増加すれば溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る。前記濃度の増加は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、又はそれ超の増加である。前記濃度の増加は、好ましくは、約６０℃、５５℃、５０℃、４５℃、４０℃、３５℃、３０℃、２５℃、２０℃未満の温度で溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）を誘発することができる。
【0112】
好ましくは、本発明の水性ポリマー溶液は、イオン性ポリマー、好ましくはアニオン性ポリマー、好ましくはカルボキシペンダント基を備えたアニオン性ポリマーを含む。同様に、ヒドロゲルは、イオン性ポリマー、好ましくはイオン性ポリマー、好ましくはカルボキシペンダント基を備えたアニオン性ポリマーを含む水性ポリマー溶液から好ましくは形成され、前記ヒドロゲルは、イオン性架橋を含む。そのようなイオン性架橋は、リンキング化合物としてイオン、好ましくはカルシウムを含む。
【0113】
本出願の文脈において、アニオン性の化合物又は基とは、前記化合物又は基は異なる条件下において中性又は正に荷電し得るにもかかわらず、対応する水性ポリマー溶液又はヒドロゲル中に存在する条件下では負に荷電している化合物又は基を指すと理解されよう。対応する定義は、中性及びカチオン性の化合物及び基についても当てはまる。
【0114】
好ましくは、本発明の水性ポリマー溶液は、多糖類又はその誘導体を含む。より好ましくは、前記多糖類又はその誘導体は、１つ又は複数の糖酸、好ましくはウロン酸を含む。好ましくは、本発明の水性ポリマー溶液は、アルギネート又はその誘導体を含む。同様に、ヒドロゲルは、多糖類又はその誘導体を含む水溶液から好ましくは形成され、より好ましくは前記多糖類又はその誘導体は、１つ又は複数の糖酸、好ましくはウロン酸を含む。
【0115】
アルギネートは、（１，４）連結型β－Ｄ－マンヌロネート（Ｍ）及びα－Ｌ－グルロネート（Ｇ）残基又はモノマーからなる直鎖状コポリマーのファミリーである。前記Ｍ及びＧモノマーは、アルギネート内で連続したＧ残基、連続したＭ残基として、又はＭ残基とＧ残基が交互に繰り返す配置で構成される。アルギネート内のＭ残基の数とＧ残基の数との比、並びにＧ残基のブロック、Ｍ残基のブロック、及びＭＧ残基のブロックの長さは、前記アルギネートが取得される起源に依存する。好ましいアルギネートの起源は、褐藻（褐藻類）の綱に含まれる種に由来する。アルギネートは、マクロシスチス属、サルガッスム属、及びラミナリア属のうちの少なくとも１つの種から取得可能と考えられる。好ましくは、ラミナリア属は、ラミナリア・ディギタータ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔｅ）、ラミナリア・ハイパーボレア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａ）、及びラミナリア・ダービリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ Ｄｕｒｖｉｌｌａｅａ）のうちの少なくとも１つである。
【0116】
好ましくは、Ｇ／Ｍ比は≧１．５である。好ましくは、Ｍ／Ｇ比は、少なくとも約０．７、又は０．８、好ましくは約０．７～１．４、又は約０．８～１．６である。
【0117】
水に溶解したときのアルギネートの粘度は、高、中、又は低であり得る。好ましくは、粘度（ｍＰａ／ｓ）は、約４～１２、又は約２０～２００である。好ましいアルギネート誘導体は、両親媒性アルギネート及びオリゴペプチドに共有結合的に連結しているアルギネートである。両親媒性アルギネートは、疎水基、例えばアルキル等をカルボキシペンダント基に共有結合的に連結させることにより、アルギネートから誘導可能である。
【0118】
本出願の文脈において、多糖類とは、別途明記されない限り、多糖類の誘導体も指す。本出願の文脈において、アルギネートとは、別途明記されない限り、アルギネートの誘導体も指す。
【0119】
好ましくは、核酸はヒドロゲル内で捕捉され、ヒドロゲルの外部には拡散しない、又は実質的に拡散しない。好ましくは、ヒドロゲルを室温で少なくとも約６０分間維持するとき、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の核酸分子が、ヒドロゲル内に留まる。 好ましくは、ヒドロゲルを室温で少なくとも約８時間維持するとき、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の核酸分子が、ヒドロゲル内に留まる。
【0120】
好ましくは、ヒドロゲルは、下流処理のいずれも妨害しない又は実質的に妨害しない。好ましくは、ヒドロゲルのポリマーは、核酸分子のシークエンシング、好ましくはディープシークエンシングを妨害しない又は実質的に妨害しない。
【0121】
オルガネラ／細胞及びヒドロゲルを組み合わせること
現行の本発明で使用するためのオルガネラ及び／又は細胞は、核酸、好ましくは本明細書で定義されるような核酸を好ましくは含むと本明細書では理解される。本発明の方法において、細胞は最初に溶解して（ｌｙｓｅｄ）オルガネラを放出し得るが、またオルガネラは、その後本明細書で定義されるような水性ポリマー溶液と組み合わされる。ポリマーは、その後、（相互に）リンクしたネットワークを形成して、オルガネラを含むヒドロゲルを取得することができる。
現行の本発明で使用するためのオルガネラ及び／又は細胞は、核酸、好ましくは本明細書で定義されるような核酸を好ましくは含むと本明細書では理解される。本発明の方法において、細胞は最初に溶解して（ｌｙｓｅｄ）オルガネラを放出し得るが、またオルガネラは、その後本明細書で定義されるような水性ポリマー溶液と組み合わされる。ポリマーは、その後、（相互に）リンクしたネットワークを形成して、オルガネラを含むヒドロゲルを取得することができる。
【0122】
代替的又は付加的に、無処理の細胞は水性ポリマー溶液と組み合わされ得るが、また核酸を含むオルガネラは、ポリマーを（相互に）リンクさせてヒドロゲルを形成する前に、細胞から放出され得る。
【0123】
代替的又は付加的に、無処理又は実質的に無処理の細胞は、水性ポリマー溶液と組み合わされ得るが、また核酸を含むオルガネラは、ヒドロゲル形成後に細胞から放出され得る。
【0124】
オルガネラ／細胞の溶解（ｌｙｓｉｎｇ）
無処理の細胞は、水性ポリマー溶液と組み合わされ得るが、またポリマーは、その後（相互に）リンクしてヒドロゲルを形成し得る。ヒドロゲル内で細胞を溶解すること（ｌｙｓｉｎｇ）で、１つ又は複数のオルガネラを更に分解する必要もなく、核酸を単離又は放出することができる。例えば、核酸は、例えば原核細胞の場合、細胞の細胞質内に存在し得るが、及び／又は核酸分子は細胞質ＲＮＡ分子である場合もある。従って、核酸の細胞内の場所に応じて、方法は、核酸を含むオルガネラを溶解する（ｌｙｓｉｎｇ）ステップを含み得る。
無処理の細胞は、水性ポリマー溶液と組み合わされ得るが、またポリマーは、その後（相互に）リンクしてヒドロゲルを形成し得る。ヒドロゲル内で細胞を溶解すること（ｌｙｓｉｎｇ）で、１つ又は複数のオルガネラを更に分解する必要もなく、核酸を単離又は放出することができる。例えば、核酸は、例えば原核細胞の場合、細胞の細胞質内に存在し得るが、及び／又は核酸分子は細胞質ＲＮＡ分子である場合もある。従って、核酸の細胞内の場所に応じて、方法は、核酸を含むオルガネラを溶解する（ｌｙｓｉｎｇ）ステップを含み得る。
【0125】
核酸の単離は、細胞を溶解し（ｌｙｓｉｎｇ）、及びオルガネラを溶解する（ｌｙｓｉｎｇ）ステップを必要とし得る。用語「細胞を溶解すること（ｌｙｓｉｎｇ）」とは、本明細書では、細胞膜を破壊すること又は分解すること、及び任意選択的に細胞壁も分解することとして理解される。同様に、用語「オルガネラを溶解すること（ｌｙｓｉｎｇ）」とは、本明細書では、オルガネラ膜を破壊すること又は分解することとして理解される。
【0126】
細胞溶解（Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）は、好ましくはオルガネラの放出を引き起こす。オルガネラを細胞から放出することは、当技術分野において公知の任意の従来法を使用して実現可能である。任意選択的に、細胞はゲル化させる前に溶解される（ｌｙｓｅｄ）。或いは、細胞は、ヒドロゲル形成後に溶解される（ｌｙｓｅｄ）。好ましくは、オルガネラは、ヒドロゲル形成後に溶解される（ｌｙｓｅｄ）。
【0127】
細胞膜、及び任意選択的に細胞壁は、任意の従来法、例えば機械的な力、酵素的処理、化学的処理、又は浸透圧処理等、但しこれらに限定されない方法を使用して破壊され得る。任意選択的に、オルガネラは、核酸を含むオルガネラを水性ポリマー溶液と組み合わせる前に、無処理の細胞、細胞デブリ、及びその他の種類のオルガネラのうちの少なくとも１つから分離可能である。或いは、溶解した（ｌｙｓｅｄ）細胞は、本明細書に記載されるような水性ポリマー溶液と組み合わされる。また細胞溶解（Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）は、核酸含有オルガネラの溶解（ｌｙｓｉｓ）を同時に引き起こす場合もある。或いは、細胞溶解のステップが最初に存在し、別のオルガネラの溶解（ｌｙｓｉｓ）ステップが後続する。
【0128】
オルガネラ、好ましくは本明細書で定義されるようなオルガネラの溶解（ｌｙｓｉｓ）は、核酸、好ましくは本明細書で定義されるような核酸の放出を好ましくは引き起こす。オルガネラの溶解（ｌｙｓｉｓ）は、当技術分野において公知の任意の慣習法、例えば機械的な力、酵素的処理、化学的処理、及び浸透圧処理等のうちの少なくとも１つを使用して実現可能である。酵素的処理の非限定的な例は、プロテイナーゼＫ処理である。
【0129】
ミクロスフェア
形成されるヒドロゲルは、任意の適するサイズ又は形状を有し得る。好ましくは、ヒドロゲルのサイズは、４５℃未満の温度でヒドロゲルを溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｅ）のに適する。ヒドロゲルのサイズは、ゲノムシークエンシング、ロングレンジゲノム分析、トランスクリプトーム解析、マップに基づくクローニング、ゲノム物理マッピング、ラージインサートＢＡＣライブラリーの構築、及びラージインサートＢＩＢＡＣライブラリーの構築のうちの少なくとも１つからなる後続するステップを実施するのに適する方式及び量でヒドロゲルを溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｅ）のに、好ましくは適する。好ましくは、ヒドロゲルのサイズは、ディープシークエンシング、好ましくはロングリード・ディープシークエンシングといった後続ステップを実施しやすくする条件下でヒドロゲルを溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｅ）のに適する。
形成されるヒドロゲルは、任意の適するサイズ又は形状を有し得る。好ましくは、ヒドロゲルのサイズは、４５℃未満の温度でヒドロゲルを溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｅ）のに適する。ヒドロゲルのサイズは、ゲノムシークエンシング、ロングレンジゲノム分析、トランスクリプトーム解析、マップに基づくクローニング、ゲノム物理マッピング、ラージインサートＢＡＣライブラリーの構築、及びラージインサートＢＩＢＡＣライブラリーの構築のうちの少なくとも１つからなる後続するステップを実施するのに適する方式及び量でヒドロゲルを溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｅ）のに、好ましくは適する。好ましくは、ヒドロゲルのサイズは、ディープシークエンシング、好ましくはロングリード・ディープシークエンシングといった後続ステップを実施しやすくする条件下でヒドロゲルを溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｅ）のに適する。
【0130】
ヒドロゲルのサイズ又は形状は、粒子であり得る。好ましくは、ヒドロゲルは微粒子であり得る。好ましくは、ヒドロゲルはミクロスフェアであり得る。好ましくは、操作された、好ましくは単離された、本明細書で定義されるような核酸は、ヒドロゲルミクロスフェア内で安定化している。本明細書で使用される場合、用語「ミクロスフェア」とは、形状が実質的に球形であり、且つ直径が約２ｍｍに等しい又はそれ未満である微粒子を指す。例えば、微粒子は、形状が実質的に球形であり、且つ直径は約１ｍｍに等しい又はそれ未満であり得る。
【0131】
本明細書で使用される場合、「実質的に球形」とは、最低の外部表面積を示す容積として定義される、完全な球体に近い形状を一般的に意味する。例えば、「実質的に球形」とは、ミクロスフェアの任意の断面を見たときに、大きい方の直径（又は最大直径）と小さい方の直径（又は最低直径）との間の差異は、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満であるミクロスフェアを指し得る。用語「実質的に球形」とは、大きい方の直径／小さい方の直径の比として約１．０～約２．０、約１．０～約１．５、又は約１．０～約１．２を有するミクロスフェアを指す場合もある。
【0132】
好ましくは、ミクロスフェアは、形状において球形又は実質的に球形である。ミクロスフェアの直径は変化し得る。例えば、いくつかの実施形態では、ミクロスフェアは、約１０μｍ～約２，０００μｍ、約３０μｍ～約１，５００μｍ、約３５μｍ～約１，０００μｍ、約４０μｍ～約９００μｍ、約４５μｍ～約５００μｍ、又は約２０μｍ～約２００μｍの平均直径を有する。
【0133】
ミクロスフェアは、サイズにおいても実質的に均一であり得る。例えば、個々のミクロスフェア間の直径の差異は、約０μｍｍ～約２５０μｍ、約０μｍ～約２００μｍ、約０μｍ～約１５０μｍ、約０μｍ～約１００μｍ、又は約０μｍ～約５０μｍであり得る。更なる実施形態では、個々のミクロスフェアは、直径において２００μｍ以下、１５０μｍ以下、１００μｍ以下、約５０μｍ以下、約２５μｍ以下、約１０μｍ以下、又は約５μｍ以下の差異を有する。
【0134】
好ましくは、ミクロスフェアは、５０％より多くが、平均直径±２０％、平均直径±１０％、又は平均直径±５％の直径を有するような集団内にある。１つの実施形態では、ミクロスフェアは、７５％より多くが、平均直径±２０％、平均直径±１０％、又は平均直径±５％の直径を有するような集団内にある。
【0135】
好ましくは、本明細書で定義されるような核酸を含む、好ましくは本明細書で定義されるようなシークエンシングライブラリーを含むヒドロゲルミクロスフェアをシークエンサーフローセルに負荷した後に、ヒドロゲルを溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）、核酸を放出させる。
【0136】
本明細書で定義されるようなヒドロゲルミクロスフェアは、当技術分野において公知の任意の従来法を使用して製造され得る。非限定的な例として、例えば、第１の反応物質が細胞及びオルガネラのうちの少なくとも１つを含み、並びに第２の反応物質が水性ポリマー溶液を含むような、マイクロ流体に基づく合成法（例えば、図４に例示の通り）を使用して、ミクロスフェアが製造可能である。任意選択的な第３の反応物質がゲル化誘発物質を含み得る。
【0137】
シークエンシングライブラリー
ヒドロゲル内に捕捉された、操作された、好ましくは単離された核酸は、核酸の断片化を生じさせることなく容易に改変及び／又は精製可能である。驚くべきことに、ヒドロゲル内で酵素反応を実施すると、水性環境において同一の反応を実施した場合と比較して、インプット材料として必要とされる核酸の量は有意に低下する。
ヒドロゲル内に捕捉された、操作された、好ましくは単離された核酸は、核酸の断片化を生じさせることなく容易に改変及び／又は精製可能である。驚くべきことに、ヒドロゲル内で酵素反応を実施すると、水性環境において同一の反応を実施した場合と比較して、インプット材料として必要とされる核酸の量は有意に低下する。
【0138】
例えば、酵素反応混合物のコンポーネントは、形成されたヒドロゲルマトリックス中に拡散する可能性がある。そのようなコンポーネントは、酵素、アダプター、抗体、オリゴヌクレオチド、及びプライマーのうちの少なくとも１つを含み得る。核酸を改変するための好ましい酵素として、特異的ＤＮＡ標的酵素、リガーゼ、エンドヌクレアーゼ、及びエキソヌクレアーゼが挙げられるが、但しこれらに限定されない。好ましい特異的ＤＮＡ標的酵素は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体である。
【0139】
付加的又は代替的に、酵素反応は、例えば、核酸に結合しているタンパク質を取り除くためのタンパク質消化であり得る。好ましい酵素反応は、プロテイナーゼＫのような、但しこれに限定されない１つ又は複数のプロテアーゼの添加である。
【0140】
方法は、酵素を不活性化するステップ、例えば、核酸改変酵素の不活性化及び／又はプロテイナーゼの不活性化を更に含み得る。
【0141】
付加的又は代替的に、核酸は、ヒドロゲルをすすぎ洗いし、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５回、又はそれを上回る回数ヒドロゲルをすすぎ洗いすることにより精製され得る。核酸、任意選択的に改変された核酸は、例えば、細胞デブリ、酵素、未結合アダプター、及び汚染物質のうちの少なくとも１つを取り除くために精製され得る。
【0142】
一実施形態では、オルガネラ、好ましくは、核はオルガネラから核酸を放出させる前にすすぎ洗いされ得る。オルガネラをすすぎ洗いすることで、例えば、そうしなければ核酸に結合し、シークエンシングプロセスを妨害するおそれがある細胞質汚染物質が取り除かれ得る。
【0143】
１つの態様では、本明細書において上記で定義されるような方法により取得される操作された核酸分子が改変され得る。一実施形態では、本発明は、シークエンシングライブラリーを調製する方法に関係する。シークエンシングライブラリーは、好ましくはロングリード・シークエンシングライブラリーである。好ましくは、シークエンシングライブラリーは、ディープシークエンシングライブラリーである。好ましくは、シークエンシングライブラリーは、次世代及び／又は第３世代シークエンシングに使用され得る。好ましくは、シークエンシングライブラリーは、ロングリード・シークエンシングに使用され得る。
【0144】
好ましくは、シークエンシングライブラリーは、本明細書で定義されるような核酸を含む。好ましくは、シークエンシングライブラリー内の核酸分子の少なくとも一部分は、少なくとも約１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、又は少なくとも約１０００ｋｂ（１Ｍｂ）のサイズを有する。好ましくは、シークエンシングライブラリー内の核酸分子の少なくとも一部分は、少なくとも１．１Ｍｂ、１．３Ｍｂ、１．５Ｍｂ、１．７Ｍｂ、２Ｍｂ、２．５Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、又は少なくとも約１０Ｍｂのサイズを有する。
【0145】
好ましくは、シークエンシングライブラリー内の核酸分子のＮ５０、又はリードＮ５０は、少なくとも約１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、又は少なくとも約１０００ｋｂ（１Ｍｂ）である。好ましくは、シークエンシングライブラリー内の核酸分子のＮ５０は、少なくとも１．１Ｍｂ、１．３Ｍｂ、１．５Ｍｂ、１．７Ｍｂ、２Ｍｂ、２．５Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、又は少なくとも約１０Ｍｂのサイズを有する。Ｎ５０は、データの半分が、これを上回るアライメント可能な長さを有するリード内に含まれる数値として本明細書において定義される。
【0146】
好ましくは、シークエンシングライブラリーの核酸分子の少なくとも一部分は、高分子量（ＨＭＷ）又は超高分子量（ｕＨＭＷ）核酸である。
好ましくは、シークエンシングライブラリーを調製するための本発明の方法は、
本明細書で定義されるような、操作された、好ましくは単離された核酸を含むヒドロゲルを取得するステップと、
ヒドロゲル内の核酸を改変してシークエンシングライブラリーを取得するステップと
を含む。
好ましくは、シークエンシングライブラリーを調製するための本発明の方法は、
本明細書で定義されるような、操作された、好ましくは単離された核酸を含むヒドロゲルを取得するステップと、
ヒドロゲル内の核酸を改変してシークエンシングライブラリーを取得するステップと
を含む。
【0147】
シークエンシングライブラリーを取得するために、分子をヒドロゲル内に維持しつつ、核酸が改変され得る。シークエンシングライブラリーを調製するプロセスの期間中にヒドロゲル内の核酸を安定化／固定化することで、従来の水溶液内でシークエンシングライブラリーを調製する場合と比較して、長い核酸分子の破断を実質的に低下させ、及び／又は防止することができる。
【0148】
シークエンシングライブラリーは、シークエンシングライブラリーを調製するための当技術分野において公知の任意の従来法を使用して調製可能である。シークエンシングライブラリーを調製するための試薬は、核酸がヒドロゲル内で固定した状態に留まっている間に核酸にアクセスすることができる。好ましくは、シークエンシングライブラリーは、１つ又は複数のアダプターを、核酸の一方又は両方の末端部に連結することにより調製可能である。好ましくは、１つ又は複数のアダプターは、核酸分子の１つ又は複数の末端部にライゲートされる。単数のアダプター又は複数のアダプターは、一本鎖、二本鎖、部分的二本鎖、Ｙ字形、環状化可能、又はヘアピンアダプターであり得る。
【0149】
１つ又は複数のアダプターは、保護性のアダプターであり得る。この文脈において、保護性のアダプターとは、アダプターにより捕捉された核酸をエキソヌクレアーゼに対して保護するように特別に設計されたアダプターとして、本明細書では理解される。そのようなアダプターは、化学的部分又はブロッキング基（例えば、ホスホロチオエート）の組み入れにより、又は末端部ヌクレオチドの欠損により（ヘアピン又はステムループアダプター、又は環状化可能アダプター）、エキソヌクレアーゼ分解に対し好ましくは保護する。
【0150】
これら１つ又は複数のアダプターは、制限部位ドメイン、捕捉ドメイン、シークエンシングプライマー結合部位、増幅プライマー結合部位、検出ドメイン、バーコード配列、転写プロモータードメイン、及びＰＡＭ配列、又は任意のこれらの組合せからなる群から好ましくは選択される機能的ドメインを含み得る。バーコードは、サンプルバーコード又は固有の分子識別子（ＵＭＩ）であり得るが、但しこれに限定されない。
【0151】
好ましくは、１つ又は複数のアダプターはシークエンシングアダプターであり、例えばロッシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシング、イルミナ（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）（商標）ソレクサ（ＳＯＬＥＸＡ）（商標）シークエンシング、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社のソリッド（ＳＯＬＩＤ）（商標）シークエンシング、パシフィックバイオサイエンス（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシング、ポロネーターポロニー（Ｐｏｌｌｏｎａｔｏｒ Ｐｏｌｏｎｙ）社のシークエンシング、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社又はコンプリートゲノミクス（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）社のシークエンシングを可能にする機能的ドメインを含む。好ましくは、機能的ドメインは、ナノポアシークエンシング及び一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））シークエンシングのうちの少なくとも１つを可能にする。好ましくは、機能的ドメインは、ナノポアシークエンシングを可能にする。
【0152】
アダプターデザインに応じて、単数のアダプター又は複数のアダプターは、一本鎖の、二本鎖、部分的二本鎖、Ｙ字形、ヘアピン、又は環状化可能アダプターであり得る。任意選択的に、１つ又は複数のアダプターが使用され得る。任意選択的に、２つのアダプターからなる１つ又は複数のセットが使用され得るが、その場合、あるセットの第１のアダプターは、核酸の５’末端側にライゲートされるように意図され、あるセットの第２のアダプターは、核酸の３’末端側にライゲートされるように意図される。
【0153】
好ましくは、あるセット内の第１及び第２のアダプターそれぞれは、アダプターがライゲートした核酸が、適合性を有するプライマーの対を使用して容易に増幅され、又は配列決定されるように、適合性を有するプライマー結合配列を含む。
【0154】
好ましくは、本発明のシークエンシングライブラリー調製法は、増幅及び／又はクローニングステップを含まない。ヌクレオチド改変情報（例えば、５－ｍＣ、６－ｍＡ等）はアンプリコンでは失われてしまうので、増幅ステップを減らすことが有益である。更なる増幅は、アンプリコン内に変動を呼び込むおそれがあり（例えば、増幅期間中のエラーにより）、そのヌクレオチド配列はオリジナルサンプルを反映しない。同様に、核酸を別の生物中にクローニングする場合、オリジナルのサンプル核酸中に存在する改変を多くの場合維持せず、従って好ましい実施形態では、本発明のシークエンシングライブラリーの調製法は、増幅又はクローニングステップを一般的に含まない。
【0155】
ステムループ又はヘアピンアダプターは一本鎖であるが、しかしその末端部は、アダプターがその上で折り返されて二本鎖部分及び一本鎖ループを生成するように相補的である。ステムループアダプターは、直鎖状の二本鎖核酸の末端部とリンクし得る。例えば、末端部ヌクレオチドが存在しないように（例えば、ポリメラーゼ及びリガーゼをそれぞれ使用して、すべてのギャップが埋められ、及びライゲートされている）、ステムループアダプターが二本鎖核酸の末端部に接続する場合、得られた分子は、末端部ヌクレオチドを欠いており、代わりに各末端部に一本鎖ループを担持する。
【0156】
核酸は、環状化可能なアダプターにライゲートされ得る。この場合、ヒドロゲル内の核酸は、断片（アダプターライゲーションに起因し得る、又はライゲートしたアダプターの制限酵素消化の結果として）のいずれかの側において適合性を有する構造が自己環状化することにより環状化し得る、又は所望の断片の末端部に対して相補的であるセレクタープローブにハイブリダイズすることにより環状化し得る。伸長及びライゲーションの最終ステップは、共有結合的に閉じた環、任意選択的に二本鎖核酸を創出する。
【0157】
任意選択的に、好ましくは、Ｔオーバーハングを含む部分的又は完全に二本鎖のアダプターへのライゲーションを促進するために、核酸の断片はＡテールを含むように改変され得る。従って、アダプターを核酸にアニーリングする前に、本発明の方法は、任意選択的に核酸をＡテール化するステップを含み得る。Ａテール化反応は当技術分野において周知されており、また当業者はＡテール化反応を、例えばＫｌｅｎｏｗ断片（エキソ－）を使用するなどして実施する方法を容易に理解する。
【0158】
本明細書で定義されるようなシークエンシングライブラリーを調製する方法は、任意選択的に複雑性を低下させるステップを含み得る。当業者は複雑性を低下させるステップを実施する方法を容易に理解する一方、本発明は、複雑性低減の方法ステップのいずれにも限定されない。
【0159】
非限定的な例として、ヒドロゲル内で安定化している核酸は、１つ又は複数のエンドヌクレアーゼにより消化され得る。
【0160】
核酸を断片化するための酵素消化として、エンドヌクレアーゼ制限が挙げられるが、但しこれに限定されない。例えばＡＦＬＰ（登録商標）技術で使用されるような酵素消化は、核酸の複雑性低下を更に引き起こす可能性がある。当業者は、ＤＮＡ制限用としてどの酵素を選択すべきか知っている。非限定的な例として、少なくとも１つの高頻度カッター（ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｃｕｔｔｅｒ）、及び少なくとも１つのレアカッター（ｒａｒｅ ｃｕｔｔｅｒ）が、核酸サンプルの断片化に使用可能である。例えば、ＭｓｅＩ等、但しこれに限定されない高頻度カッターは、好ましくは約３～５ｂｐの認識部位を有する。例えば、ＥｃｏＲＩ等、但しこれに限定されないレアカッターは、好ましくは＞５ｂｐの認識部位を有する。
【0161】
好ましい方法では、エンドヌクレアーゼはレアカッターである。
【0162】
本発明の方法は、特定の制限エンドヌクレアーゼのいずれにも限定されない。エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ、例えばＥｃｏＲＩ、Ｍｓｅｌ、Ｐｓｔｌ等であり得る。ある特定の実施形態では、ＩＩＳ型又はＩＩＩ型エンドヌクレアーゼ、すなわちその認識配列が制限部位から離れて位置するエンドヌクレアーゼ、例えば、非限定的にＡｃｅＩＩＩ、ＡＩｗＩ、ＡＩｗＸＩ、ＡＩｗ２６Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｂｓＩ、Ｂｅｄ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｇＩ、ＢｉｎＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３ＩＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨｇａＩ、ＨｉｎＧＵＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎＩＩ、ＮｇｏＶＩＩＩ、ＰＩｅＩ、ＲＩｅＡＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、ＴａｑＪＩ、及びＺｔｈｌｌ ＩＩＩ等が使用され得る。制限断片は、使用されるエンドヌクレアーゼに応じて、末端部が平滑末端化され、又はオーバーハング末端部を有し得る。
【0163】
高頻度カッター及びレアカッターのうちの少なくとも１つの認識部位は、目的とする配列バリアント内又はその直近に位置し、例えば、高頻度カッター又はレアカッターの認識部位は、目的とする配列バリアントから約０～１００００、１０～５０００、５０～１０００、又は約１００～５００塩基離れて位置する。
【0164】
本明細書に開示する現行法は、ＡＦＬＰ（登録商標）技術においても使用可能である。ＡＦＬＰ（登録商標）技術は、例えば、本明細書において参照により組み込まれている国際公開第２００７／１１４６９３号、同第２００６／１３７７３３号、及び同第２００７／０７３１６５号においてより詳細に記載されている。当技術分野に記載されるようなＡＦＬＰ（登録商標）技術は、制限された核酸サンプルにＵＭＩを連結することにより改変され得る。
【0165】
付加的又は代替的に、核酸は、プログラム可能なヌクレアーゼを使用して、好ましくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼのうちの少なくとも１つを使用して消化され得る。
【0166】
富化又は複雑性の低下は、本明細書において上記で定義されており、好ましくは複雑性の低下は、再現性のある複雑性の低下である。１つ又は複数の複雑性低下ステップ、例えば任意プライムＰＣＲ増幅法、キャプチャープローブハイブリダイゼーション、Ｄｏｎｇ（例えば、国際公開第０３／０１２１１８号、同第００／２４９３９号を参照）により記載される方法及びインデックスリンキング（Ｕｎｒａｕ Ｐ．ａｎｄ Ｄｅｕｇａｕ Ｋ．Ｖ．（１９９４）Ｇｅｎｅ １４５：１６３－１６９）、国際公開第２００６／１３７７３３号；同第２００７／０３７６７８号；同第２００７／０７３１６５号；同第２００７／０７３１７１号、米国特許出願公開第２００５／２６０６２８号、国際公開第０３／０１０３２８号、米国特許出願公開第２００４／１０１５３号に記載されている方法、ゲノムポーショニング（ｇｅｎｏｍｅ ｐｏｒｔｉｏｎｉｎｇ）（例えば、国際公開第２００４／０２２７５８号を参照）、遺伝子発現連鎖解析法（ＳＡＧＥ；例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５、上記参照、及びＭａｔｓｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．２０（６）：７１９－７２６を参照）、及びＳＡＧＥの改変法（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２６（１４）：３４４５－３４４６；及びＫｅｎｚｅｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｈｌｅｍａｎｎ，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２７（３）：９１７－９１８を参照）、ＭｉｃｒｏＳＡＧＥ法（例えば、Ｄａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２７（５）：１３００－１３０７を参照）、超並列シグネチャーシークエンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ；例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８：６３０－６３４、及びＢｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．９７（４）：１６６５－１６７０を参照）、自己減算型ｃＤＮＡライブラリー（ｓｅｌｆ－ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）（Ｌａｖｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３０（９）：ｅ３８）、リアルタイムマルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅法（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｂｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＴ－ＭＬＰＡ；例えば、Ｅｌｄｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，ｖｏｌ．３１ （２３）：ｅｌ５３を参照）、高カバー率発現プロファイリング法（Ｈｉｇｈ Ｃｏｖｅｒａｇｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＨｉＣＥＰ；例えば、Ｆｕｋｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３１（１６）：ｅ９４を参照）、Ｒｏｔｈら（Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．２２（４）：４１８－４２６）で開示されるようなユニバーサルマイクロアレイシステム、トランスクリプトーム減算法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３３（１６）：ｅｌ３６を参照）、及びフラグメントディスプレイ法（例えば、Ｍｅｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３２（１６）：ｅｌ２７を参照）からなる群から選択されるステップ等が使用可能であるが、但しこれらに限定されない。
【0167】
ヒドロゲル内で安定化している核酸は、好ましくは、本明細書において参照により組み込まれている国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０８２７９１号に記載されるように、標的核酸断片を富化するための方法で使用され得る。従って、本発明は、単離された核酸を含むヒドロゲルから標的核酸断片を富化させるための方法であって、前記標的核酸断片が目的とする配列を含み、並びに
ｉ）本明細書で定義されるような単離された核酸を含むヒドロゲルを提供するステップであって、前記単離された核酸が目的とする配列を含むステップと、
ｉｉ）少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体を用いてヒドロゲル内の単離された核酸を切断し、これにより目的とする配列を含む標的核酸断片、及び少なくとも１つの非標的核酸断片を含むヒドロゲルを生成するステップと、
ｉｉｉ）ステップｂ）で得られた、前記ヒドロゲル内の切断された核酸分子を、エキソヌクレアーゼと接触させ、前記エキソヌクレアーゼが前記ヒドロゲル内の前記少なくとも１つの非標的核酸断片を消化するのを可能にするステップと、
ｉｖ）任意選択的に、前記目的とする配列を含む前記ヒドロゲル内の前記標的核酸断片を、ステップｃ）で得られた消化物から精製するステップと
を含む方法と関係し得る。
ｉ）本明細書で定義されるような単離された核酸を含むヒドロゲルを提供するステップであって、前記単離された核酸が目的とする配列を含むステップと、
ｉｉ）少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体を用いてヒドロゲル内の単離された核酸を切断し、これにより目的とする配列を含む標的核酸断片、及び少なくとも１つの非標的核酸断片を含むヒドロゲルを生成するステップと、
ｉｉｉ）ステップｂ）で得られた、前記ヒドロゲル内の切断された核酸分子を、エキソヌクレアーゼと接触させ、前記エキソヌクレアーゼが前記ヒドロゲル内の前記少なくとも１つの非標的核酸断片を消化するのを可能にするステップと、
ｉｖ）任意選択的に、前記目的とする配列を含む前記ヒドロゲル内の前記標的核酸断片を、ステップｃ）で得られた消化物から精製するステップと
を含む方法と関係し得る。
【0168】
ステップｄ）が、標的核酸断片を含むヒドロゲルを溶解（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）させるステップを付加的又は代替的に含み得る。
【0169】
シークエンシング
１つの態様では、本発明は、シークエンシング法に関係し、特に本発明は、本明細書で定義されるような、操作された、好ましくは単離された核酸をシークエンシングするための方法に関する。
１つの態様では、本発明は、シークエンシング法に関係し、特に本発明は、本明細書で定義されるような、操作された、好ましくは単離された核酸をシークエンシングするための方法に関する。
【0170】
好ましくは、シークエンシングライブラリーは、本明細書において上記で定義されるような核酸から調製され、すなわちシークエンシングライブラリーは、ヒドロゲル内で調製される。好ましくは、シークエンシングライブラリーは、シークエンシングプロセスの前又は期間中にヒドロゲルから放出される。好ましくは、シークエンシングライブラリーは、シークエンシングプロセスの前にヒドロゲルから放出される。好ましくは、シークエンシングライブラリーは、ヒドロゲルを溶解させること（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）により、ヒドロゲルから放出される。
従って、好ましくは、本発明のシークエンシング法は、
本明細書で定義されるようなシークエンシングライブラリーを取得するステップと、
ヒドロゲルを溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）ステップと、
ライブラリーをシークエンシングするステップと
を含む。
従って、好ましくは、本発明のシークエンシング法は、
本明細書で定義されるようなシークエンシングライブラリーを取得するステップと、
ヒドロゲルを溶解させる（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）ステップと、
ライブラリーをシークエンシングするステップと
を含む。
【0171】
ヒドロゲルは、４５℃未満の温度で好ましくは溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）。温度が低いほど、核酸の破断が防止又は実質的に防止される。ヒドロゲルを溶解させ（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）及び核酸を放出させるのを更に促進するために、ヒドロゲルは、有益な表面積対容積比（ＳＡ／Ｖ比）を有し得るが、例えばヒドロゲルは、ヒドロゲルと溶解誘発物質（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｒ）との間の接触を促進する小粒子を含む又はそれから構成される。好ましくは、ヒドロゲルは、小粒子を含み又はそれから実質的に構成され得るが、好ましくは微粒子を含み又はそれから実質的に構成される。好ましくは、ヒドロゲルは、ミクロスフェア、好ましくは本明細書において上記で定義されるようなミクロスフェアを含み、又はそれから実質的に構成される。
【0172】
シークエンシングライブラリーは、当業者にとって公知の任意の従来法を使用して配列決定され得る。好ましくは、シークエンシングは、ディープシークエンシング、好ましくはロングリード・ディープシークエンシングである。好ましくは、シークエンシングは、第３世代シークエンシングである。好ましくは、シークエンシングは、ロッシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシング、イルミナ（商標）ソレクサ（商標）シークエンシング、アプライドバイオシステムズ社のソリッド（商標）シークエンシング、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシング、ポロネーターポロニー社のシークエンシング、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社又はコンプリートゲノミクス社のシークエンシングのうちの少なくとも１つを使用して実施され得る。好ましくは、シークエンシングは、ナノポアシークエンシング及び一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））シークエンシングのうちの少なくとも１つを使用して実施され得る。好ましくは、シークエンシングは、ナノポアシークエンシングのステップを含み得る。
【0173】
好ましくは、シークエンシングライブラリーは、シークエンシングプロセスの前又は実質的に前にヒドロゲルから放出される。シークエンシングライブラリーは、ヒドロゲルからシークエンサーフローセル内に放出され得る。従って、シークエンシングライブラリーを含むヒドロゲルは、シークエンサーフローセルに最初に負荷される可能性があり、好ましくは、ヒドロゲルは、微粒子、好ましくはミクロスフェアを含む、又はそれから実質的に構成される。シークエンサーフローセル内でヒドロゲルは溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得るが、これにより後続するシークエンシング、好ましくはロングリード・ディープシークエンシングのためのシークエンシングライブラリーを放出する。好ましくは、フローセルは、ロングリード・ディープシークエンサー、好ましくは第３世代シークエンサーのフローセルである。好ましくは、フローセルは、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））シークエンシング用のフローセル、又はナノポアシークエンシング用のフローセルである。好ましくは、フローセルは、ナノポアシークエンシング用である。
【0174】
好ましくは、シークエンシングライブラリーは、ヒドロゲルを溶解させること（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）、好ましくはヒドロゲルをフローセル内で溶解させること（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）によりヒドロゲルから放出される。
【0175】
好ましくは、ヒドロゲルは、シークエンシングバッファー、好ましくはナノポアシークエンシングに適するシークエンシングバッファーを添加することにより溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）。
【0176】
好ましくは、１価のカチオン、好ましくはカリウム又はナトリウムカチオン、好ましくはナトリウムを含むバッファーを添加することによりヒドロゲルは溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）。
【0177】
好ましくは、ヒドロゲルは、温度を約２０℃～４０℃から約２℃～１０℃まで下げることにより溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）。好ましくは、核酸は、酵素反応が起きるのに必要とされる温度でヒドロゲル内に留まる。好ましくは、ヒドロゲルは、効率的な酵素反応、好ましくはシークエンシングライブラリーを調製するための酵素反応、例えば約３７℃の温度での酵素反応に必要とされる温度では溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅ）ない。好ましくは、ヒドロゲルは、低めの温度、例えば酵素反応、好ましくは効率的な酵素反応に要する温度よりも低い温度で溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）。非限定的な例として、ヒドロゲルを約４℃の温度に配置したとき、ヒドロゲルは溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る。
【0178】
ヒドロゲルは、ｐＨ応答性ヒドロゲルであり得る。ヒドロゲルは、ｐＨを調整すること、すなわちｐＨを下げたり上げたりすることにより溶解し得る（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）。核酸は、好ましくは約５～８のｐＨにおいて安定に留まる。従って、一実施形態では、ヒドロゲルは、ｐＨを増加させることにより、例えばｐＨを約５～６から約７～８に調整することにより溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る。代替的実施形態では、ヒドロゲルは、ｐＨを減少させることにより、例えばｐＨを約７～８から約５～６に調整することにより溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る。
【0179】
組成物
１つの態様では、本発明は、本明細書において上記で定義されるような核酸及びヒドロゲルを含む組成物に関する。核酸は、ヒドロゲル内で安定化していると考えられ、核酸の破断しやすい傾向を低下させる。ヒドロゲルは、好ましくは４５℃未満の温度で溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る。好ましくは、ヒドロゲルは、ｐＨ感受性ヒドロゲルであり、好ましくはアルギネートを含む。好ましくは、ヒドロゲルは、微粒子、好ましくはミクロスフェアを含む。好ましくは、ヒドロゲルは、本明細書において上記で定義されるようなヒドロゲルである。
１つの態様では、本発明は、本明細書において上記で定義されるような核酸及びヒドロゲルを含む組成物に関する。核酸は、ヒドロゲル内で安定化していると考えられ、核酸の破断しやすい傾向を低下させる。ヒドロゲルは、好ましくは４５℃未満の温度で溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）得る。好ましくは、ヒドロゲルは、ｐＨ感受性ヒドロゲルであり、好ましくはアルギネートを含む。好ましくは、ヒドロゲルは、微粒子、好ましくはミクロスフェアを含む。好ましくは、ヒドロゲルは、本明細書において上記で定義されるようなヒドロゲルである。
【0180】
更なる態様では、本発明は、本明細書において上記で定義されるような細胞及び水性ポリマー溶液を含む組成物に関係する。本発明は、特定の種類の細胞のいずれかに限定されず、好ましくは、細胞は本明細書において上記で定義されるような細胞である。好ましくは、細胞は、植物細胞、好ましくは植物プロトプラストである。
【0181】
１つの態様では、本発明は、本明細書において上記で定義されるようなオルガネラ及び水性ポリマー溶液を含む組成物に関係する。オルガネラは、好ましくは核酸を含む。オルガネラは、好ましくは本明細書において上記で定義されるようなオルガネラである。好ましいオルガネラは、核、ミトコンドリア、及び葉緑体のうちの少なくとも１つである。好ましいオルガネラは、核である。オルガネラは、任意の細胞、好ましくは本明細書において上記で定義されるような細胞から取得可能であると考えられる。好ましくは、オルガネラは、植物細胞から取得可能である。
【0182】
ヒドロゲル
１つの態様では、本発明は、本発明の方法により取得可能なヒドロゲルに関係する。好ましくは、ヒドロゲルは、
核酸含有担体、好ましくは本明細書で定義されるような核酸含有担体、
オルガネラ、好ましくは本明細書で定義されるようなオルガネラ、
操作された核酸、好ましくは本明細書で定義されるような単離された核酸、好ましくはμＨＭＷ核酸、及び
シークエンシングライブラリー、好ましくは本明細書で定義されるようなシークエンシングライブラリー
のうちの少なくとも１つを含む。
１つの態様では、本発明は、本発明の方法により取得可能なヒドロゲルに関係する。好ましくは、ヒドロゲルは、
核酸含有担体、好ましくは本明細書で定義されるような核酸含有担体、
オルガネラ、好ましくは本明細書で定義されるようなオルガネラ、
操作された核酸、好ましくは本明細書で定義されるような単離された核酸、好ましくはμＨＭＷ核酸、及び
シークエンシングライブラリー、好ましくは本明細書で定義されるようなシークエンシングライブラリー
のうちの少なくとも１つを含む。
【0183】
ヒドロゲルは、好ましくは本明細書で定義されるようなヒドロゲルである。ヒドロゲルは、好ましくはアルギネートを含む。
パーツキット（Ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）
１つの態様では、本発明は、好ましくは本明細書で定義されるような方法で使用するためのパーツキットに関係する。パーツキットは、本明細書で定義されるようなヒドロゲルを形成するためのポリマーを含み得る。パーツキットは、
細胞及びオルガネラのうちの少なくとも１つを溶解する（ｌｙｓｉｎｇ）ための溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）；及び
シークエンシングライブラリー、好ましくはディープシークエンシングライブラリーを調製するための１つ又は複数のコンポーネント
のうちの少なくとも１つを更に含み得る。
パーツキット（Ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）
１つの態様では、本発明は、好ましくは本明細書で定義されるような方法で使用するためのパーツキットに関係する。パーツキットは、本明細書で定義されるようなヒドロゲルを形成するためのポリマーを含み得る。パーツキットは、
細胞及びオルガネラのうちの少なくとも１つを溶解する（ｌｙｓｉｎｇ）ための溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）；及び
シークエンシングライブラリー、好ましくはディープシークエンシングライブラリーを調製するための１つ又は複数のコンポーネント
のうちの少なくとも１つを更に含み得る。
【0184】
ポリマーは水溶液であり得る。或いは、ポリマーは真空凍結乾燥形態にあり、また本発明の方法で使用するために、水溶液を用いて再構成され得る。
【0185】
細胞及びオルガネラのうちの少なくとも１つを溶解する（ｌｙｓｉｎｇ）ための溶解バッファーは、細胞及び／又はオルガネラの溶解（ｌｙｓｉｓ）に適する、当技術分野において公知の溶解バッファーのいずれかを構成し得る。好ましくは、溶解バッファーは、ヒドロゲルの形成を破壊しない又は実質的に破壊しない。細胞溶解バッファーの非限定的な例は、ＮＰ－４０溶解バッファー、ＲＩＰＡ溶解バッファー、ＳＤＳ溶解バッファー、及びＡＣＫ溶解バッファーである。
【0186】
シークエンシングライブラリーを調製するための１つ又は複数のコンポーネントは、酵素及びアダプターのうちの少なくとも１つを含み得る。酵素はリガーゼであり得る。アダプターは、本明細書において上記で定義されるようなアダプターであり得る。
【0187】
代替的又は付加的に、パーツキットは、ヒドロゲル、好ましくは本明細書で定義されるようなヒドロゲルを含み得る。ヒドロゲルは、核酸、核酸含有担体、細胞、オルガネラ、及び単離された核酸のうちの少なくとも１つ、好ましくは本明細書で定義されるような核酸含有担体、細胞、オルガネラ、及び単離された核酸のうちの少なくとも１つを含み得る。キットは、シークエンシングライブラリー、好ましくはディープシークエンシングライブラリーを調製するための１つ又は複数のコンポーネントを更に含み得る。シークエンシングライブラリーを調製するための１つ又は複数のコンポーネントは、酵素及びアダプターのうちの少なくとも１つを含み得る。酵素はリガーゼであり得る。アダプターは、本明細書において上記で定義されるようなアダプターであり得る。
【0188】
好ましくは、キットに含まれる任意のバイアルの容積は、１００ｍＬ、５０ｍＬ、２０ｍＬ、１０ｍＬ、５ｍＬ、４ｍＬ、３ｍＬ、２ｍＬ、又は１ｍＬ以下である。
【0189】
試薬は、真空凍結乾燥された形態で、又は適するバッファー中に存在し得る。キットは、本発明を実施するのに必要な任意のその他のコンポーネント、例えばバッファー、ピペット、マイクロタイタープレート、及び指示書等も含み得る。本発明のキットのためのそのようなその他のコンポーネントは、当業者にとって公知である。
【0190】
更なる態様
１つの態様では、本発明は、本明細書において上記で定義されるような組成物の使用と関係する。本発明は、本明細書で定義されるような単離され及び安定化した核酸の（ディープ）シークエンシングに限定されないことは当業者にとって明白である。本明細書で定義されるような安定化した核酸は、非常に多くの用途を見出すことができる。好ましくは、本発明は、ゲノムシークエンシング、ロングレンジゲノム分析、トランスクリプトーム解析、マップに基づくクローニング、ゲノム物理マッピング、ラージインサートＢＡＣライブラリーの構築、及びラージインサートＢＩＢＡＣライブラリーの構築のうちの少なくとも１つのための、本明細書で定義されるような組成物の使用に関係する。
１つの態様では、本発明は、本明細書において上記で定義されるような組成物の使用と関係する。本発明は、本明細書で定義されるような単離され及び安定化した核酸の（ディープ）シークエンシングに限定されないことは当業者にとって明白である。本明細書で定義されるような安定化した核酸は、非常に多くの用途を見出すことができる。好ましくは、本発明は、ゲノムシークエンシング、ロングレンジゲノム分析、トランスクリプトーム解析、マップに基づくクローニング、ゲノム物理マッピング、ラージインサートＢＡＣライブラリーの構築、及びラージインサートＢＩＢＡＣライブラリーの構築のうちの少なくとも１つのための、本明細書で定義されるような組成物の使用に関係する。
【0191】
同様に、更なる態様では、本発明は、ゲノムシークエンシングに関する方法、ロングレンジゲノム分析に関する方法、トランスクリプトーム解析に関する方法、マップに基づくクローニングに関する方法、ゲノム物理マッピングに関する方法、ラージインサートＢＡＣライブラリーの構築に関する方法、及びラージインサートＢＩＢＡＣライブラリーの構築に関する方法のうちの少なくとも１つに関し、方法は、好ましくは
ａ）核酸、好ましくはオルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つを含む担体を、水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記オルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つを含むヒドロゲルを形成するステップと、
ｃ）前記担体から前記核酸を放出させて単離された核酸を取得するステップと
を含み、前記単離された核酸は、前記ヒドロゲル内で安定化している。
ａ）核酸、好ましくはオルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つを含む担体を、水性ポリマー溶液と組み合わせるステップと、
ｂ）前記ポリマー溶液をゲル化させて、前記オルガネラ及び細胞のうちの少なくとも１つを含むヒドロゲルを形成するステップと、
ｃ）前記担体から前記核酸を放出させて単離された核酸を取得するステップと
を含み、前記単離された核酸は、前記ヒドロゲル内で安定化している。
【0192】
好ましくは、核酸は、本明細書において上記で定義されるような核酸である。好ましくは、ヒドロゲルは、本明細書において上記で定義されるようなヒドロゲルである。
【実施例】
【0193】
実施例１ａ及びｂ：高分子量バクテリオファージラムダＤＮＡのアルギネート内カプセル化と、後続する半固体状態でのライブラリー調製及びナノポアシークエンシング。
実施例１ａ
メジアンサイズ４５Ｋｂ及び濃度８２．４ｎｇ／μＬの大腸菌属ウイルスラムダ（λ）ＤＮＡ（ＤＮＡの総量：８８３ｎｇ）、１０μＬを、１．５％のプロノバ（Ｐｒｏｎｏｖａ）（登録商標）ＵＰ ＬＶＧアルギネート（ノバマトリックス（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ）（商標））、１０μＬと、ロータリープラットフォーム上にて、４℃、一晩混合した。インキュベーション後、ＤＮＡの剪断を避けるために２００μＬ大孔径ピペットチップを使用しながら、アルギネート溶液を、２ｍｌ ＢＤプラスティパック（Ｐｌａｓｔｉｐａｋ）（商標）シリンジ（ＢＤ社）中にピペット採取した。０．４５×１３ｍｍマイクロランス（ＢＤ社）をシリンジに取り付け、アルギネート溶液を、２００ｍＭのＣａＣｌ２溶液、２０ｍＬを含有する１００ｍＬガラスビーカー中にゆっくりと滴下した。ミリメートルサイズの球形ビーズを取得するために、アルギネート溶液を滴下する前に、ガラスビーカーを磁気ロッドと共にマグネチックスターラープレート上に配置して、ＣａＣｌ２溶液を激しく撹拌した。この滴下法を用いた場合、０．７％のアルギネート－ＤＮＡ混合物、２０μＬを使用して約１～２個のビーズが生成可能であった。
実施例１ａ
メジアンサイズ４５Ｋｂ及び濃度８２．４ｎｇ／μＬの大腸菌属ウイルスラムダ（λ）ＤＮＡ（ＤＮＡの総量：８８３ｎｇ）、１０μＬを、１．５％のプロノバ（Ｐｒｏｎｏｖａ）（登録商標）ＵＰ ＬＶＧアルギネート（ノバマトリックス（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ）（商標））、１０μＬと、ロータリープラットフォーム上にて、４℃、一晩混合した。インキュベーション後、ＤＮＡの剪断を避けるために２００μＬ大孔径ピペットチップを使用しながら、アルギネート溶液を、２ｍｌ ＢＤプラスティパック（Ｐｌａｓｔｉｐａｋ）（商標）シリンジ（ＢＤ社）中にピペット採取した。０．４５×１３ｍｍマイクロランス（ＢＤ社）をシリンジに取り付け、アルギネート溶液を、２００ｍＭのＣａＣｌ２溶液、２０ｍＬを含有する１００ｍＬガラスビーカー中にゆっくりと滴下した。ミリメートルサイズの球形ビーズを取得するために、アルギネート溶液を滴下する前に、ガラスビーカーを磁気ロッドと共にマグネチックスターラープレート上に配置して、ＣａＣｌ２溶液を激しく撹拌した。この滴下法を用いた場合、０．７％のアルギネート－ＤＮＡ混合物、２０μＬを使用して約１～２個のビーズが生成可能であった。
【0194】
ゲル化した後、カプセル化されたλ ＤＮＡを含有するビーズを、２ｍＬエッペンドルフチューブに移し、ＤＮＡ修復及び末端調製に先立ち洗浄するために、１７．１倍稀釈したＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＦＦＰＥ ｒｅｐａｉｒ及びウルトラＩＩ Ｅｎｄ－ｐｒｅｐ反応バッファー（オックスフォードナノポアテクノロジーズ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（登録商標）Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）社用のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ）を含有するＤＮＡ修復及び末端調製混合物（酵素を含まない）、６０μＬ内で３０分間インキュベートした。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）バッファー溶液をピペッティングにより廃棄した。
【0195】
その後、ＤＮＡ修復及び末端調製するために、１７．１倍稀釈したＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＦＦＰＥ ｒｅｐａｉｒ及びウルトラＩＩ Ｅｎｄ－ｐｒｅｐ反応バッファー、３０倍稀釈したＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ Ｍｉｘ、及び２０倍稀釈したＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ウルトラＩＩ Ｅｎｄ－ｐｒｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（オックスフォードナノポアテクノロジーズ（登録商標）Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ニューイングランドバイオラボ社用のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ）を含有するＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＦＦＰＥ ｒｅｐａｉｒ及びウルトラＩＩ Ｅｎｄ－ｐｒｅｐ反応混合物、６０μＬ内で、ビーズを２０℃で３０分間及び６５℃で１０分間インキュベートした。
【0196】
ＤＮＡ修復及び末端調製後、ヌクレアーゼを含まない水、５００μＬ中でビーズを洗浄し、その後、新鮮なバッチのヌクレアーゼを含まない水、５００μＬ内、２０℃で３０分間インキュベートした。水をピペッティングにより廃棄し、アダプターライゲーション前に、４倍稀釈したＬｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）を含有するアダプターライゲーション混合物（酵素を含まず且つアダプターを含まない）、１００μＬ内で、ビーズを３０分間インキュベートした。ライゲーションバッファー溶液をピペッティングにより廃棄し、アダプターライゲーションするために、４倍稀釈したＬｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）、１０倍稀釈したＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ニューイングランドバイオラボ社用のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ）、及び２０倍稀釈したＡｄａｐｔｅｒ Ｍｉｘ（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）を含有するアダプターライゲーション混合物、１００μＬ内、４℃で２時間、ビーズをインキュベートした。
【0197】
アダプターライゲーションした後、Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）、５０μＬ内、室温で、ビーズを３０分間平衡化した。一方、Ｒ９．４．１フローセル（オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）を、製造業者の指示に従いプライミングした（Ｎａｎｏｐｏｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｂｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ、バージョンＧＤＥ＿９０６３＿ｖ１０９＿ｒｅｖＮ＿１４Ａｕｇ２０１９、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）。ビーズを平衡化した後、Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを廃棄し、２倍稀釈したＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）、７５μＬ内、氷上において３０分間、ビーズをインキュベートした。
【0198】
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ内でアルギネートビーズをインキュベートすると、アルギネートビーズの脱ゲル化を引き起こした。λ ＤＮＡ １Ｄシークエンシングライブラリーを含有するアルギネートスラリーを、ＳｐｏｔＯＮサンプルポート経由でＲ９．４．１フローセル（ＦＡＬ１６８３３）に負荷し、シークエンシング測定をＧｒｉｄＩＯＮシークエンサー（ＭｉｎＫＮＯＷバージョン３．４．８）上で開始した。生の配列データを、Ｇｕｐｐｙバージョン３．０．６（オックスフォードナノポアテクノロジーズ（登録商標））を用いてベースコールし、ベースコールされた配列データを、ＮａｎｏＰａｃｋツールを用いて更に処理した（Ｄｅ Ｃｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８．ＮａｎｏＰａｃｋ：ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｌｏｎｇ－ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３４－１５）。
【0199】
実施例１ｂ
実施例１ｂでは、２００ｍＭのクエン酸ナトリウムをシークエンシングバッファーに添加したこと、すなわち、最後のステップにおいて、２倍稀釈したＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）及び２００ｍＭのクエン酸ナトリウム、７５μＬ中でビーズをインキュベートしたことを除き、半固体状態のライブラリーを上記したように調製した。λ ＤＮＡライブラリーを含む脱ゲル化したアルギネートスラリーを新しいＲ９．４．１フローセル（ＦＡＬ０２９９０）に負荷し、シークエンシングをＧｒｉｄＩＯＮシークエンサー上で実施した。
実施例１ｂでは、２００ｍＭのクエン酸ナトリウムをシークエンシングバッファーに添加したこと、すなわち、最後のステップにおいて、２倍稀釈したＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）及び２００ｍＭのクエン酸ナトリウム、７５μＬ中でビーズをインキュベートしたことを除き、半固体状態のライブラリーを上記したように調製した。λ ＤＮＡライブラリーを含む脱ゲル化したアルギネートスラリーを新しいＲ９．４．１フローセル（ＦＡＬ０２９９０）に負荷し、シークエンシングをＧｒｉｄＩＯＮシークエンサー上で実施した。
【0200】
２回の４２時間λ ＤＮＡ配列測定の要約統計量を表１に示す。
【0201】
【表1】
【0202】
半固体状態で調製された実施例１ａのλ ＤＮＡライブラリーのシークエンシングでは、約９８，０００リードにより表される１ギガベースより多くのデータが生成した。メジアンリード長は３．３Ｋｂであり、メジアンリードクオリティは７．３である。対照的に、実施例１ｂのλ ＤＮＡ配列測定の配列収率は、１／４よりも低く（約３２５メガベース）、またメジアンリード長は１ｋｂ（７０２塩基）よりも短い。両方の実施例の間の配列メトリクスの差異は、大型ビーズのライブラリー調製後の処理における差異；すなわち、シークエンスバッファー（実施例１ａ）、又は２００ｍＭのクエン酸ナトリウムが添加されたシークエンスバッファー（実施例１ｂ）中でのアルギネートの脱ゲル化及び負荷に起因する。
【0203】
捕捉されたＤＮＡに由来し、且つライブラリー調製ステップ期間中にビーズから水溶液中に拡散したＤＮＡには由来しないラムダ配列リードを調査するために、ＤＮＡ量を各インキュベーションステップ後に測定した。図２は、ライブラリー調製期間中に異なるいくつかの洗浄ステップ及び酵素的ステップを実施し、その際に生じた拡散による相対的なＤＮＡ喪失量を示す。使用したバッファー及び酵素ミックスから、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズを用いてＤＮＡを単離し、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、サーモフィッシャーサイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社）を用いて量を決定した。図２に示すように、ナノポアライブラリー調製手順全体を通じて、異なる水溶液においてＤＮＡは検出できなかった。シークエンスアダプターも含有するライゲーション酵素混合物中でインキュベートした後、少量の低分子量（～約２００ｂｐ）ＤＮＡが観測可能であった。しかしながら、断片のサイズ及びライゲーション混合物の組成に基づき、回収されたＤＮＡは、非ライゲートナノポアアダプターであると結論付けられる。
【0204】
まとめとして、結果より、本発明は、半固体状態のカプセル化されたＨＭＷ ＤＮＡから開始するロングリードシークエンスライブラリーの調製に対して有用なプラットフォームを提供することが明らかである。
【0205】
実施例２：高分子量植物ＤＮＡのアルギネート内カプセル化と、後続する半固体状態でのライブラリー調製及びナノポアシークエンシング。
【0206】
実施例２では、実施例１ａに記載される手順と同一の実験手順に従ったが、但しメジアンピークサイズ約８０ｋｂ及びサイズ範囲１０～１２８ｋｂを有するゲノム植物ＤＮＡ、９９３ｎｇ（１０μＬ）をアルギネートと混合する点が異なった。植物ＤＮＡ １Ｄシークエンシングライブラリーを含有するアルギネートスラリーを、ＳｐｏｔＯＮサンプルポート経由でＲ９．４．１フローセル（ＦＡＫ９４９６０）に負荷した。シークエンシングをＧｒｉｄＩＯＮ（ＭｉｎＫＮＯＷバージョン３．４．８）上で実施し、生の配列データを、Ｇｕｐｐｙバージョン３．０．６（オックスフォードナノポアテクノロジーズ（登録商標））を用いてベースコールした。ベースコールされたシークエンスデータの更なる分析を、ＮａｎｏＰａｃｋツールを用いて実施した（Ｄｅ Ｃｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８．ＮａｎｏＰａｃｋ：ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｌｏｎｇ－ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３４－１５）。４２時間配列測定の要約統計量を表２に示す。
【0207】
【表2】
【0208】
半固体状態で調製した植物ＤＮＡライブラリーのシークエンシングでは、５５，１６５リードにより表される２２２Ｍｂよりも若干多いデータがもたらされた。これらの結果は、半固体状態のカプセル化された超ＨＭＷ ＤＮＡから開始するロングリードシークエンスライブラリーの調製及びシークエンシングの可能性を実証する。
【0209】
ライブラリー調製期間中に異なる水溶液中に含まれるレタスＤＮＡの量を定量化すると、ラムダＤＮＡの実施例と同様に、ヒドロゲルビーズのインキュベーション期間中に拡散は生じなかったことが明らかとなった。従って、得られたシークエンスリードは、カプセル化されたＤＮＡに由来し、また半固体状態でのライブラリー調製によって生み出されたと結論付けられる。ラムダの実施例の場合と同様に、ステップ５において回収された少量のＤＮＡは、アダプターＤＮＡであった。
【0210】
実施例３：アルギネート内での植物核のカプセル化及び溶解（lysis）と、後続する半固体状態でのライブラリー調製及び埋め込まれたＤＮＡのナノポアシークエンシング
Ｚｈａｎｇら、２０１２年（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｇａｂａｓｅ－ｓｉｚｅｄ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｉ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ．７（３）：４６７－４７８）において、植物、藻類、又は真菌組織について記載されている指示に本質的に従って、核を若い葉の組織から単離した。最終洗浄ステップの後、０．５×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；６９ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸、１．４ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）、１ｍＭのＣａＣｌ２、及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１％アルギネート（褐藻類由来のアルギン酸ナトリウム塩Ａ０６８２、シグマ－アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社）溶液内で、核を再懸濁した。
Ｚｈａｎｇら、２０１２年（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｇａｂａｓｅ－ｓｉｚｅｄ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｉ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ．７（３）：４６７－４７８）において、植物、藻類、又は真菌組織について記載されている指示に本質的に従って、核を若い葉の組織から単離した。最終洗浄ステップの後、０．５×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；６９ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸、１．４ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）、１ｍＭのＣａＣｌ２、及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１％アルギネート（褐藻類由来のアルギン酸ナトリウム塩Ａ０６８２、シグマ－アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）社）溶液内で、核を再懸濁した。
【0211】
核を完全に再懸濁した後、核の損傷を避けるために、２００μＬ大孔径ピペットチップを使用しながら、０．４５×１３ｍｍマイクロランス（ＢＤ社）が取り付けられた２ｍｌ ＢＤプラスティパック（商標）シリンジ（ＢＤ社）中に、懸濁物をピペット採取した。その後、アルギネート溶液を、２００ｍＭのＣａＣｌ２溶液、２０ｍＬを含有する１００ｍＬガラスビーカー中に撹拌条件下でゆっくりと滴下した。得られた植物核を含有するミリメートルサイズのアルギネートビーズを、アルギネートの更なるゲル化を促進するために撹拌を行わずに、２００ｍＭのＣａＣｌ２溶液中で３０分間、更にインキュベートした。ヨウ化プロピジウム内でビーズをインキュベートした後、多数の蛍光性の核が観測可能であった。
【0212】
アルギネートを完全にゲル化させた後、５００μｍ Ｐｌｕｒｉｓｔｒａｉｎｅｒ（プルリセレクトライフサイエンス（ＰｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）社）を使用してビーズを収集し、新しい５０ｍＬポリプロピレンチューブ（ＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＣａＣｌ２、及び３００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含有する溶解溶液（ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、２０ｍＬを収納する）に移し、７５ｒｐｍでの軌道撹拌設定を用いながら、振盪インキュベーター内、５０℃、核を一晩溶解した（ｌｙｓｅｄ）。
【0213】
溶解（ｌｙｓｉｓ）後、捕捉されたゲノムＤＮＡを含有するビーズを、新鮮な洗浄溶液（ＴＥバッファー及び５０ｍＭのＣａＣｌ２）、２０ｍＬ中で、３０分間、２回洗浄した。プロテイナーゼＫの完全不活性化は、ＴＥバッファー及び２ｍＭのペファブロック（Ｐｅｆａｂｌｏｃ）（登録商標）ＳＣ（シグマ－アルドリッチ社）を含有する溶液、２０ｍＬ中、３７℃、一晩インキュベーションすることにより達成された。ＴＥバッファー及び５０ｍＭのＣａＣｌ２溶液、２０ｍＬ中でビーズを２回インキュベートすることにより、ペファブロック（登録商標）ＳＣを除去し、カプセル化されたゲノムＤＮＡを含有するビーズを同一の溶液中に４℃で使用まで保管した。
【0214】
ナノポアライブラリー調製では、８．６倍稀釈したＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ウルトラＩＩ Ｅｎｄ－ｐｒｅｐ反応バッファー（ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ウルトラ（Ｕｌｔｒａ）（商標）ＩＩ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ／ｄＡ－Ｔａｉｌｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ、ニューイングランドバイオラボ社）、０．８３×ＮＡＤ＋（ＰｒｅＣＲ（登録商標）Ｒｅｐａｉｒ Ｍｉｘ、ニューイングランドバイオラボ社）、及び５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するＤＮＡ修復及び末端調製混合物、３０μＬ中で、４つのビーズを３０分間インキュベートした。溶液をピペッティングにより廃棄し、８．６倍稀釈したＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ウルトラＩＩ Ｅｎｄ－ｐｒｅｐ反応バッファー（ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ウルトラ（商標）ＩＩ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ／ｄＡ－Ｔａｉｌｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ、ニューイングランドバイオラボ社）、０．８３×ＮＡＤ＋（ＰｒｅＣＲ（登録商標）Ｒｅｐａｉｒ Ｍｉｘ、ニューイングランドバイオラボ社）、５ｍＭのＣａＣｌ２、２０倍稀釈したＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ Ｍｉｘ（ニューイングランドバイオラボ社）、及び１．３倍稀釈したＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ウルトラＩＩ Ｅｎｄ－ｐｒｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（ＮＥＢＮｅｘ（登録商標）ウルトラ（商標）ＩＩ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ／ｄＡ－Ｔａｉｌｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ、ニューイングランドバイオラボ社）を含有するＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＦＦＰＥ ｒｅｐａｉｒ及びウルトラＩＩ Ｅｎｄ－ｐｒｅｐ反応混合物、６０μＬ中、２０℃で１時間及び６５℃で２０分間、ビーズをインキュベートした。
【0215】
ＤＮＡ修復及び末端調製後、ビーズを、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ及び５ｍＭのＣａＣｌ２溶液、１ｍＬで洗浄し、その後新鮮なバッチの１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ及び５ｍＭのＣａＣｌ２溶液中、２０℃で１５分間インキュベートした。このインキュベーションステップを１回繰り返した。２回目のインキュベーションステップの後、溶液を廃棄し、２倍稀釈したＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ウルトラＩＩ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ウルトラ（商標）ＩＩ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ、ニューイングランドバイオラボ社）、５０倍稀釈したＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ウルトラ（商標）ＩＩ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ、ニューイングランドバイオラボ社）、１０μＬのＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｄａｐｔｏｒ Ｍｉｘ（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０８ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ １Ｄ、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）、及び５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するアダプターライゲーション混合物、５０μＬ中、２０℃で３０分間、ビーズをインキュベートした。インキュベーション後、ライゲーション混合物を廃棄し、ライゲーションステップを、新鮮なライゲーション混合物を用いて繰り返した。
【0216】
アダプターライゲーションの後、ビーズを、２５μＬ及び５０μＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０８ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ １Ｄ、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）において、室温で３０分間２回、それぞれ平衡化した。一方、Ｒ９．４フローセル（ＩＤ ＦＡＨ０５６８４、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）を、製造業者の指示（１Ｄ ｇＤＮＡ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｆｏｒ ｌｏｎｇ ｒｅａｄｓ、ＳＱＫ－ＬＳＫ１０８、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）に従いプライミングした。溶出バッファー中での平衡化後に、３５μＬのＲｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｆｕｅｌ（ＲＢＦ；ＳＱＫ－ＬＳＫ１０８ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ １Ｄ、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）、４μＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０８ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ １Ｄ、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）、２５．５μＬのＬｉｂｒａｒｙ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（ＥＸＰ－ＬＬＢ００１ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｅａｄｓ Ｋｉｔ、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）、及び１０μＬの１．５Ｍクエン酸ナトリウムを含有するシークエンシング前混合物、７５μＬ中、２０℃で３０分間、ビーズをインキュベートした。ビーズを２０℃で３０分間インキュベートし、スラリーを、大孔径ピペットを使用しながら、ＳｐｏｔＯＮサンプルポート経由でＲ９．４フローセルに負荷し、シークエンシング測定を、ＭｉｎＩＯＮ ＭＫ １ｂシークエンサー上で開始した。
【0217】
半固体状態で調製した植物ＤＮＡライブラリーについてシークエンシングした結果、参照全ゲノム配列に対してマッピング可能な（Ｍｉｎｉｍａｐ２）１，４４８個のリードがもたらされた（図３）。１０パーセントを超えるリードが９０％以上の類似性を有してマッピングされた。これらの結果は、カプセル化された植物核から開始して、半固体状態の方式でロングリードシークエンスライブラリーを調製及びシークエンシングする可能性を示す。
【0218】
実施例４：ＤＮＡサイズに対するアルギネート内での植物核のカプセル化及び溶解（ｌｙｓｉｓ）の効果
アルギネート球体内で核ＤＮＡを保護する効果について更に分析した。このために、サトウダイコン核の溶解（ｌｙｓｉｓ）後にゲノムＤＮＡを取得し、水性環境において更に精製した。この従来式に単離したＤＮＡの断片サイズを、アルギネート包埋核から単離されたゲノムＤＮＡの断片サイズと比較した。
アルギネート球体内で核ＤＮＡを保護する効果について更に分析した。このために、サトウダイコン核の溶解（ｌｙｓｉｓ）後にゲノムＤＮＡを取得し、水性環境において更に精製した。この従来式に単離したＤＮＡの断片サイズを、アルギネート包埋核から単離されたゲノムＤＮＡの断片サイズと比較した。
【0219】
アルギネート包埋サンプルでは、実施例３に記載されている手順に従い、サトウダイコン及びインパチェンスの核をアルギネート球体中にてカプセル化及び溶解（ｌｙｓｅｄ）した。アルギネート包埋μＨＭＷ ＤＮＡをゲル上に直接負荷するか、又はアルギネート球体から最初に放出させ、その後ゲル上に負荷した。
【0220】
図５に示すように、溶液内での穏和な単離手順は、５０～３００ｋｂのサイズ範囲のゲノムＤＮＡを一般的にもたらす。まったく対照的に、サトウダイコン又はインパチェンスの核をアルギネート球体内で溶解する（ｌｙｓｉｎｇ）と、大部分の断片は２００～８００ｋｂである２００ｋｂ～メガベースサイズの範囲のＤＮＡをもたらす。従って、核をアルギネート内で溶解する（ｌｙｓｉｎｇ）ことで、ゲノムＤＮＡが分解から有意に保護される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】