▶ アベリノ ラボ ユーエスエー インコーポレイテッドの特許一覧
特表2023-505737Ｒ１２４Ｈ突然変異を備えたトランスフォーミング増殖因子ベータ誘導遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡを使用したアレル特異的サイレンシング
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-10
(54)【発明の名称】Ｒ１２４Ｈ突然変異を備えたトランスフォーミング増殖因子ベータ誘導遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡを使用したアレル特異的サイレンシング
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230203BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230203BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230203BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20230203BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALN20230203BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61P27/02
A61K48/00
A61K31/713
C12Q1/6883 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022536545
(86)(22)【出願日】2020-12-11
(85)【翻訳文提出日】2022-08-11
(86)【国際出願番号】 IB2020061852
(87)【国際公開番号】W WO2021117009
(87)【国際公開日】2021-06-17
(31)【優先権主張番号】62/946,880
(32)【優先日】2019-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/975,713
(32)【優先日】2020-02-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515179406
【氏名又は名称】アベリノ ラボ ユーエスエー インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ａｖｅｌｌｉｎｏ Ｌａｂ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】コワルチク，アマンダ
(72)【発明者】
【氏名】ムーア，タラ
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA17
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA331
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA33
(57)【要約】
本開示は、対象者の顆粒状角膜変性症２型に伴う症状を予防、改善又は治療するための、リボ核酸（ＲＮＡ）複合体及びその使用方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１～１９のうち１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖を含んでいるリボ核酸（ＲＮＡ）複合体。
【請求項2】
前記鎖は配列番号４、１１又は１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項3】
前記鎖は、配列番号４、１１、若しくは１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号４、１１、若しくは１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端、のうち少なくとも一方を含む、請求項２に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項4】
前記鎖は、配列番号４、１１、又は１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のシチジン１リン酸（ｒＣ）、配列番号４、１１、又は１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のウリジン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＣ）、配列番号４、１１、又は１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号４、１１、又は１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号４、１１、又は１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル化グアノシン１リン酸（ｏＧ‐ｏＧ）、及び配列番号４、１１、又は１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている、請求項３に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項5】
配列番号２３、３０又は３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む、請求項２～４のいずれか１項に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項6】
配列番号２３、３０又は３５の配列を含む鎖をさらに含む、請求項２～４のいずれか１項に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項7】
鎖は配列番号４、１１、又は１６の配列を含む、請求項１に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項8】
ＲＮＡ複合体は、野生型の１２４ＣのＴＧＦＢＩ遺伝子と比較して少なくとも１つのＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位を各々含んでいる第１鎖及び第２鎖を含む、請求項１に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項9】
前記第１鎖は、１個の塩基が第２鎖の相対する塩基に対してミスマッチであることを除いて配列番号４、９又は１１の配列と同一の配列を含む、請求項８に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項10】
ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から３～７塩基離れている、請求項９に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項11】
前記第１鎖及び第２鎖は各々が１６～２３塩基の長さである、請求項８～１０のいずれか１項に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項12】
ＲＮＡ複合体はデオキシチミジンの突出端を有する、請求項８～１１のいずれか１項に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項13】
配列番号２０～３８のうち１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖を含んでいるリボ核酸（ＲＮＡ）複合体。
【請求項14】
前記鎖は配列番号２３、３０又は３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１３に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項15】
前記鎖は、配列番号２３、３０若しくは３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号２３、３０若しくは３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端、のうち少なくとも一方を備えている、請求項８５に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項16】
トランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）タンパク質のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列とオーバーラップする配列を有する鎖であってＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞Ａという一塩基多型（ＳＮＰ）に対応する位置にアデニンを含んでいる鎖を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）複合体。
【請求項17】
センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖のうち少なくとも一方はｄＴｄＴ突出端を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）複合体。
【請求項18】
前記センス鎖及びアンチセンス鎖は各々がｄＴｄＴ突出端を含む、請求項１７に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項19】
前記センス鎖は突出端としてＧＧヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖は突出端としてＵＣヌクレオチドを含む、請求項１７に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項20】
（ａ）前記センス鎖は一連の繰り返される２’‐ＯＭｅを含み、かつ（ｂ）前記アンチセンス鎖は２’‐ＯＭｅを含む；（ａ）センス鎖は、１５個の塩基と、交互パターンをなす２’‐ＯＭｅ及び２’‐Ｆとを含み、かつ（ｂ）アンチセンス鎖は交互パターンをなす２’‐ＯＭｅ及び２’‐Ｆを含み、ＲＮＡ複合体はセンス鎖及びアンチセンス鎖両方の３’及び５’末端に追加のホスホロチオエート結合を含む；又は、
（ａ）センス鎖は、５’末端に２ユニットの２’‐ＯＭｅと、９位以外のＵ又はＧ残基のいずれかに少なくとも２個の２’‐ＯＭｅ修飾とを含み；かつ（ｂ）アンチセンス鎖は、５’末端から２番目の位置に１個の２’‐ＯＭｅと、ｄＴｄＴ突出端にＰＳ結合とを含み、すべてのピリミジンが２’Ｆ‐ＲＮＡユニットに置換されている、
請求項１７～１９のいずれか１項に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項21】
前記ＲＮＡ複合体は、短鎖干渉ＲＮＡ二重鎖；短鎖干渉ＲＮＡ二重鎖を形成するために構成された二本鎖ＲＮＡ複合体；及び／又はＲＮＡヘアピンを備えている、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項22】
対象者に請求項１～２１のいずれか１項に記載のＲＮＡ複合体を投与するステップを含む、対象者の顆粒状角膜変性症２型を予防、改善、又は治療する方法。
【請求項23】
投与するステップは、ＲＮＡ複合体を、トランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞Ａという一塩基多型（ＳＮＰ）を有しているデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含有及び発現している細胞に導入することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
対象者にＲＮＡ複合体を投与するステップの前に：対象者の配列情報を入手するステップ；及び、
対象者がＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞ＡというＳＮＰを有するアレルと、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞ＡというＳＮＰを有していないアレルとを有することを判定するステップ
をさらに含む、請求項２２～２３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、概して低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）を介した遺伝子発現の阻害に関し、特に、対象者における突然変異型トランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）タンパク質の発現を阻害するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
リボ核酸（ＲＮＡ）は生細胞において様々な役割を果たす。特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、タンパク質の合成を可能にするためにデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）からの遺伝子情報を伝える。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、疾患の原因となる遺伝子のような特定の遺伝子の発現を阻害又は低減する方法として明らかにされている。臨床試験でＲＮＡｉ療法による治療がなされた病気には、先天性爪肥厚症、加齢黄斑変性症、Ｃ型肝炎、及び慢性骨髄性白血病が挙げられる（Davidson BL, McCray PB. “Current prospects for RNA interference-based therapies.” Nat Rev Genet., （英）, 2011, vol. 12, p. 329-340）。
【0003】
角膜は、前眼部にみられる無血管の透明な組織である。角膜の主な機能は、外界に対する構造的な障壁として作用すること、及び目の屈折力の大部分を提供することである。角膜は、５つの層すなわち上皮層、ボーマン層、実質層、デスメ膜、及び内皮層に分けられる。
【0004】
ＴＧＦＢＩ遺伝子は、細胞遺伝学的バンド５ｑ３１．１に位置する。ＴＧＦＢＩ遺伝子の突然変異は、顆粒状角膜変性症Ｉ型、顆粒状角膜変性症ＩＩ型、格子状角膜変性症Ｉ型、ティール‐ベンケ角膜変性症、及びライス‐ビュックラー角膜変性症を含む一連の角膜変性症を引き起こす（Munier FL, Frueh BE, Othenin-Girard Pら, “BIGH3 mutation spectrum in corneal dystrophies.”, Invest Ophthalmol Vis Sci., （米）, 2002, vol. 43, p. 949-954）。これらの角膜変性症は、角膜におけるＴＧＦＢＩタンパク質の過剰蓄積をもたらしその結果として視覚障害を生じる可能性がある。
【0005】
そのような角膜変性症の従来の治療法は、レーザー表層角膜切除術、及び、病変角膜組織が（全層又は一部のいずれかを）切除されて移植ドナー組織に置き換えられる侵襲的処置である外科的角膜形成術である。これらの治療法は部分的にしか有効ではなく、長期にモニタリングする経過観察を必要とし、かつ様々な合併症を伴う可能性がある。特に、これらの治療法は、治療中に生じた角膜の損傷に起因する突然変異型ＴＧＦＢＩタンパク質の発現上昇を誘発する可能性があり、これにより通常は視覚障害の再発がもたらされる。
【0006】
同様に、同じく角膜の損傷の原因となるレーザー角膜内切削形成術（ＬＡＳＩＫ）は、突然変異型ＴＧＦＢＩタンパク質の過剰蓄積を誘発することにより視覚障害を加速させる可能性がある。特に、一般にＬＡＳＩＫ手術を受けなければ視覚障害を遅発することになるヘテロ接合の人は、ＬＡＳＩＫ手術後に視力の低下を加速し始めることが観察されている（Jun, R. M.ら, Ophthalmology（米）, 2004, vol. 111, p. 463）。
【0007】
角膜変性症は常染色体優性遺伝病である場合がある。よって、１個の野生型ＴＧＦＢＩアレル及び１個の突然変異型ＴＧＦＢＩアレルを有しているヘテロ接合の人は、角膜変性症に罹患する可能性がある。しかしながら、野生型ＴＧＦＢＩアレル及び突然変異型ＴＧＦＢＩアレルの両方をサイレンシングすると、細胞接着の調節及び角膜の創傷治癒など細胞内で極めて重要な役割を果たしている野生型ＴＧＦＢＩタンパク質の発現が阻害される。
【発明の概要】
【0008】
したがって、細胞の生命力を維持し、かつ突然変異型ＴＧＦＢＩに関連した角膜変性症を治療、低減、及び予防するために、突然変異型ＴＧＦＢＩアレルのアレル特異的サイレンシングが必要である。突然変異型ＴＧＦＢＩアレルのそのようなアレル特異的サイレンシングは、本明細書中に開示される１又は複数のＲＮＡ複合体によって達成される。
【0009】
いくつかの実施形態によれば、リボ核酸（ＲＮＡ）複合体は、配列番号１～１９のうち１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖を備えている。
【0010】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
【0011】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端、のうち少なくとも１つを備えている。
【0012】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のシチジン１リン酸（ｒＣ）、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のウリジン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＣ）、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル化グアノシン１リン酸（ｏＧ‐ｏＧ）、及び配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている。
【0013】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む。
【0014】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３の配列を含む鎖をさらに含む。
【0015】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３の配列で構成される鎖をさらに含む。
【0016】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は配列番号４の配列を含む。
【0017】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号４の配列の５’末端の突出端又は配列番号４の配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。
【0018】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号４の配列の５’末端のシチジン１リン酸（ｒＣ）、配列番号４の配列の５’末端のウリジン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＣ）、配列番号４の配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号４の配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号４の配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル化グアノシン１リン酸（ｏＧ‐ｏＧ）、及び配列番号４の配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている。
【0019】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、野生型１２４ＣのＴＧＦＢＩ遺伝子と比較して少なくとも１つのＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位を各々含んでいる、第１鎖及び第２鎖を含む。
【0020】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、第１鎖は、１個の塩基が第２鎖の相対する塩基に対してミスマッチであることを除いて配列番号４の配列と同一の配列を含む。
【0021】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、第１鎖及び第２鎖は各々が１個のＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位を含む。
【0022】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から３～７塩基離れている。
【0023】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から３塩基離れている。
【0024】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から４塩基離れている。
【0025】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から５塩基離れている。
【0026】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から６塩基離れている。
【0027】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から７塩基離れている。
【0028】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、第１鎖及び第２鎖は各々が１６～２３塩基の長さである。
【0029】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、第１鎖及び第２鎖は各々が２２塩基の長さである。
【0030】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体はデオキシチミジンの突出端を有する。
【0031】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、第１鎖は、１個の塩基が第２鎖の相対する塩基に対してミスマッチであることを除いて配列番号９の配列と同一の配列を含む。
【0032】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、第１鎖及び第２鎖は各々が１個のＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位を含む。
【0033】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から３～７塩基離れている。
【0034】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から３塩基離れている。
【0035】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から４塩基離れている。
【0036】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から５塩基離れている。
【0037】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から６塩基離れている。
【0038】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から７塩基離れている。
【0039】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、第１鎖及び第２鎖は各々が１６～２３塩基の長さである。
【0040】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、第１鎖及び第２鎖は各々が２２塩基の長さである。
【0041】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体はデオキシチミジンの突出端を有する。
【0042】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、第１鎖は、１個の塩基が第２鎖の相対する塩基に対してミスマッチであることを除いて配列番号１１の配列と同一の配列を含む。
【0043】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、第１鎖及び第２鎖は各々が１個のＲ１２４Ｈ突然変異部位を含む。
【0044】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から３～７塩基離れている。
【0045】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から３塩基離れている。
【0046】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から４塩基離れている。
【0047】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から５塩基離れている。
【0048】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から６塩基離れている。
【0049】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から７塩基離れている。
【0050】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、第１鎖及び第２鎖は各々が１６～２３塩基の長さである。
【0051】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、第１鎖及び第２鎖は各々が２２塩基の長さである。
【0052】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体はデオキシチミジンの突出端を有する。
【0053】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む。
【0054】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３の配列を含む鎖をさらに含む。
【0055】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３の配列で構成される鎖をさらに含む。
【0056】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は配列番号４の配列で構成される。
【0057】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む。
【0058】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３の配列を含む鎖をさらに含む。
【0059】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３の配列で構成される鎖をさらに含む。
【0060】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
【0061】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端、のうち少なくとも一方を備えている。
【0062】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のアデノシン１リン酸（ｒＡ）、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のウリジン１リン酸‐アデノシン１リン酸（ｒＵ‐ｒＡ）、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたシチジン１リン酸‐ウリジン１リン酸（ｏＣ‐ｏＵ）、及び配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている。
【0063】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む。
【0064】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０の配列を含む鎖をさらに含む。
【0065】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０の配列で構成される鎖をさらに含む。
【0066】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は配列番号１１の配列を含む。
【0067】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号１１の配列の５’末端の突出端、又は配列番号１１の配列の３’末端の突出端、のうち少なくとも一方を備えている。
【0068】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号１１の配列の５’末端のアデノシン１リン酸（ｒＡ）、配列番号１１の配列の５’末端のウリジン１リン酸‐アデノシン１リン酸（ｒＵ‐ｒＡ）、配列番号１１の配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号１１の配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号１１の配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたシチジン１リン酸‐ウリジン１リン酸（ｏＣ‐ｏＵ）、及び配列番号１１の配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている。
【0069】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む。
【0070】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０の配列を含む鎖をさらに含む。
【0071】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０の配列で構成される鎖をさらに含む。
【0072】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は配列番号１１の配列で構成される。
【0073】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む。
【0074】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０の配列を含む鎖をさらに含む。
【0075】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０の配列で構成される鎖をさらに含む。
【0076】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
【0077】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。
【0078】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のグアノシン１リン酸（ｒＧ）、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の２個のグアノシン１リン酸（ｒＧ‐ｒＧ）、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたグアノシン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｏＧ‐ｏＣ）、及び配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている。
【0079】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む。
【0080】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５の配列を含む鎖をさらに含む。
【0081】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５の配列で構成される鎖をさらに含む。
【0082】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は配列番号１６の配列を含む。
【0083】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号１６の配列の５’末端の突出端、又は配列番号１６の配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。
【0084】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号１６の配列の５’末端のグアノシン１リン酸（ｒＧ）、配列番号１６の配列の５’末端の２個のグアノシン１リン酸（ｒＧ‐ｒＧ）、配列番号１６の配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号１６の配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号１６の配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたグアノシン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｏＧ‐ｏＣ）、及び配列番号１６の配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている。
【0085】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む。
【0086】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５の配列を含む鎖をさらに含む。
【0087】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５の配列で構成される鎖をさらに含む。
【0088】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は配列番号１６の配列で構成される。
【0089】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む。
【0090】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５の配列を含む鎖をさらに含む。
【0091】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５の配列で構成される鎖をさらに含む。
【0092】
いくつかの実施形態によれば、リボ核酸（ＲＮＡ）複合体は、配列番号２０～３８のうち１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖を備えている。
【0093】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
【0094】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。
【0095】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
【0096】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。
【0097】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
【0098】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、鎖は、配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。
【0099】
いくつかの実施形態によれば、リボ核酸（ＲＮＡ）複合体は、トランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）タンパク質のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列と重複する配列を有する鎖であってＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞Ａという一塩基多型（ＳＮＰ）に対応する位置にアデニンを含んでいる鎖を備えている。
【0100】
いくつかの実施形態によれば、リボ核酸（ＲＮＡ）複合体はセンス鎖及びアンチセンス鎖を備え、センス鎖及びアンチセンス鎖のうち少なくとも一方はｄＴｄＴの突出端を備えている。
【0101】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は各々がｄＴｄＴの突出端を含む。
【0102】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、センス鎖は突出端としてＧＧヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は突出端としてＵＣヌクレオチドを含む。
【0103】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、（ａ）センス鎖は一連の繰り返される２’‐ＯＭｅを含み；かつ（ｂ）アンチセンス鎖は２’‐ＯＭｅを含む。
【0104】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、（ａ）センス鎖は、１５個の塩基と、交互パターンをなす２’‐ＯＭｅ及び２’‐Ｆとを含み；かつ（ｂ）アンチセンス鎖は、交互パターンをなす２’‐ＯＭｅ及び２’‐Ｆを含み；ＲＮＡ複合体は、センス鎖及びアンチセンス鎖両方の３’及び５’末端に追加のホスホロチオエート結合を含む。
【0105】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、（ａ）センス鎖は、５’末端に２ユニットの２’‐ＯＭｅ、及び９位以外のＵ又はＧ残基のいずれかに少なくとも２個の２’‐ＯＭｅ修飾を含み；かつ（ｂ）アンチセンス鎖は、５’末端から２番目の位置に１個の２’‐ＯＭｅ、ｄＴｄＴ突出端にＰＳ結合を含み、すべてのピリミジンが２’Ｆ‐ＲＮＡユニットに置換されている。
【0106】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は短鎖干渉ＲＮＡ二重鎖を備えている。
【0107】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、短鎖干渉ＲＮＡ二重鎖を形成するために構成された二本鎖ＲＮＡ複合体を備えている。
【0108】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、ＲＮＡ複合体はＲＮＡヘアピンを備えている。
【0109】
いくつかの実施形態によれば、対象者の顆粒状角膜変性症２型を予防、改善、又は治療する方法は、対象者に対して本明細書中に記載の任意のＲＮＡ複合体を投与するステップを含む。
【0110】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、投与するステップはＲＮＡ複合体を対象者に注射することを含む。
【0111】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、投与するステップは、ＲＮＡ複合体を含有する溶液を対象者に施用することを含む。
【0112】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、投与するステップは、ＲＮＡ複合体を、トランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞Ａという一塩基多型（ＳＮＰ）を有しているデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含有及び発現している細胞に導入することを含む。
【0113】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、対象者は脊椎動物である。
【0114】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、対象者はヒトである。
【0115】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、方法は、対象者にＲＮＡ複合体を投与するステップの前に：対象者の配列情報を入手するステップ；及び、対象者がＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞ＡというＳＮＰを有するアレルと、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞ＡというＳＮＰを有していないアレルとを有することを判定するステップをさらに含む。
【0116】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、対象者の配列情報はＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４の配列情報で構成される。
【0117】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、対象者の配列情報は、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のうち全部ではなく一部の配列情報を備えている。
【0118】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、対象者の配列情報は、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞ＡというＳＮＰの配列情報のみを備えている。
【0119】
上述又は後述の実施形態のうち各々又はいずれかの一部の実施形態では、対象者の配列情報は、対象者の全ゲノムの配列情報を備えている。
【図面の簡単な説明】
【0120】
上述の概要、加えて本開示の以降の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めば一層よく理解されるであろう。本開示を例証する目的で、図面には現時点で好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本開示は示されたそのままの配置構成、実施例及び手段に限定されないことは理解されるべきである。
【0121】
【図1】図１Ａ～１Ｕは、ｓｉＬＵＣ（図１Ａ）、ＮＳＣ４（図１Ｂ）、ｓｉＲＮＡ１／配列番号１（図１Ｃ）、ｓｉＲＮＡ２／配列番号２（図１Ｄ）、ｓｉＲＮＡ３／配列番号３（図１Ｅ）、ｓｉＲＮＡ４／配列番号４（図１Ｆ）、ｓｉＲＮＡ５／配列番号５（図１Ｇ）、ｓｉＲＮＡ６／配列番号６（図１Ｈ）、ｓｉＲＮＡ７／配列番号７（図１Ｉ）、ｓｉＲＮＡ８／配列番号８（図１Ｊ）、ｓｉＲＮＡ９／配列番号９（図１Ｋ）、ｓｉＲＮＡ１０／配列番号１０（図１Ｌ）、ｓｉＲＮＡ１１／配列番号１１（図１Ｍ）、ｓｉＲＮＡ１２／配列番号１２（図１Ｎ）、ｓｉＲＮＡ１３／配列番号１３（図１Ｏ）、ｓｉＲＮＡ１４／配列番号１４（図１Ｐ）、ｓｉＲＮＡ１５／配列番号１５（図１Ｑ）、ｓｉＲＮＡ１６／配列番号１６（図１Ｒ）、ｓｉＲＮＡ１７／配列番号１７（図１Ｓ）、ｓｉＲＮＡ１８／配列番号１８（図１Ｔ）、及びｓｉＲＮＡ１９／配列番号１９（図１Ｕ）を使用した、トランスフェクションの２４時間後のルシフェラーゼ発現に対する様々な野生型（青色）及び突然変異型（丸の付いた線）のｓｉＲＮＡの効果について示す図。Ｄｕａｌ‐Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）レポーターアッセイ（英国サザンプトンのプロメガ（Promega））を、製造業者の説明書に従ってルシフェラーゼの発現を計測するために使用したが、ここで、第１に培地を除去して細胞をＰＢＳで洗浄してからパッシブライシス（passive lysis）バッファー（プロメガ）に置き換え、第２に細胞をプレートシェーカーで１５分間振盪して確実に十分に溶解させ、次いでホタル及びウミシイタケ（Renilla）の両方のルシフェラーゼの活性を、ＬＵＭＩｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ（英国エールズベリーのビーエムジーラブテック（BMG Labtech））を使用して順次計測した。
【0122】
【図2】ｓｉＲＮＡの配列について、Ｒ１２４Ｈ突然変異を赤色とし、該ｓｉＲＮＡ配列に導入されたミスマッチには黄色マーカーを付けて示す図。
【0123】
【図3】様々な長さのｓｉＲＮＡ配列についてｓｉＲＮＡ４を長さ改変の基準として示す図。「５」又は「３」は基準の配列に対してヌクレオチドが付加（＋）又は除去（－）された末端を表し、「－ｎ－ｎ」は両末端から除去された塩基対の数を表し、「＋ｎ＋ｎ」は両末端への付加を表す。
【0124】
【図4】長さを改変したｓｉＲＮＡの０．２５ｎＭ用量における上位５つを示す図。４連での結果を平均して非処理群のウェルに対して標準化した。青色の棒は野生型（ｗｔ）ＴＧＦＢＩバリアントのノックダウンを、赤色の棒は疾患を引き起こす突然変異型（ｍｕｔ）のノックダウンを表わしており、標準誤差のバー及びデータの表と共に示されている。
【0125】
【図5】長さを改変したｓｉＲＮＡの６．２５ｎＭ用量における上位５つを示す図。４連での結果を平均して非処理群のウェルに対して標準化した。青色の棒は野生型（ｗｔ）アレルのノックダウンを、赤色の棒は疾患を引き起こす突然変異型（ｍｕｔ）アレルのノックダウンを表わしており、標準誤差のバー及びデータの表と共に示されている。
【0126】
【図6】１ｎＭ用量における平均のノックダウンを非処理群のウェルに対して標準化して示す図。４連での結果を平均して非処理群のウェルに対して標準化した。灰色の棒はｌｕｃ２プラスミドのノックダウンを表わし、標準誤差のバー及びデータの表と共に示されている。
【0127】
【図7】８連のｌｕｃ２プラスミドの平均のノックダウンを、非処理群のウェル（０ｎＭ）に対して標準化して示す図。使用した用量は０．１ｎＭ～１０ｎＭである。緑色で示すのは化学的に改変されていないｓｉＬｕｃ‐ｄＴｄＴの応答曲線であり、紫色でプロットしたのはｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３の応答である。標準偏差を示すエラーバーも示されている。
【0128】
【図8】ウシ胎児血清中に見られるヌクレアーゼによって引き起こされるｓｉＲＮＡバリアントの０～７２時間の段階的分解について実証する、同時実施のゲル電気泳動を示す図。安定性アッセイは２連で策定された。
【0129】
【図9】最終の７８時間時点のｓｉＲＮＡバリアントについて追加のゲル電気泳動のデータを示す図。
【0130】
【図10】第２候補のｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ１１‐ミスマッチ２についての平均ルシフェラーゼ活性を示す図。プロットは８ウェルの平均であり；４連で別々に２回実験を行い、標準誤差のバーを示し、活性は非処理群のウェルに対して標準化した。青色の線は健康な野生型アレルの活性を表わす一方、丸の付いた線は疾患を引き起こす突然変異型アレルの活性を表わす。
【0131】
【図11】ｓｉＲＮＡ４（図１１Ａ）、ｓｉＲＮＡ９（図１１Ｂ）、及びｓｉＲＮＡ１１（図１１Ｃ）についての平均のルシフェラーゼ活性を示す図。グラフはそれぞれ８ウェルの平均を表わし；４連で別々に２回実験を行い、標準誤差のバーを示し、活性は非処理群のウェルに対して標準化した。青色の棒は健康な野生型アレルのノックダウンを表わす一方、丸の付いた橙色の棒は疾患を引き起こす突然変異型アレルのノックダウンを表わす。負の値は、野生型プラスミドに対するノックダウン効果がなかったことを意味する。ミスマッチを有するｓｉＲＮＡについて、２用量すなわち０．２５ｎＭ（左パネル）及び６．２５ｎＭ（右パネル）でスクリーニングした。
【0132】
【発明を実施するための形態】
【詳細な説明】
【0133】
本明細書全体を通じて使用されるように、範囲はその範囲内にある全ての値について述べるための簡易表現として使用されている。範囲内のいずれの値も、その範囲の端の値として選択することができる。加えて、本明細書中で引用された参照文献はすべて、参照によりあらゆる目的においてその全体が本願に組み込まれる。本開示における定義と引用された参照文献における定義とが矛盾する場合には、本開示が優先される。
【0134】
リボ核酸（ＲＮＡ）は遺伝子の発現において極めて重要な役割を果たす。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子が標的遺伝子の転写後の発現をサイレンシング又はノックダウンする生物学的機構である。短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は合成のＲＮＡｉ機構仲介因子である。ｓｉＲＮＡは典型的には２１～２３個の塩基対を含有するｄｓＲＮＡ分子であり、標的遺伝子の発現をサイレンシングするように特別に設計されている。ｓｉＲＮＡは、外部から細胞内へと短い形態で（最初からｓｉＲＮＡ二重鎖として）、又は長いｄｓＲＮＡ分子の形態で導入可能であり、長いｄｓＲＮＡ分子は細胞内で（例えばダイサー酵素により）プロセシングを受けてｓｉＲＮＡに変換される。ダイサー酵素は典型的には３’方向に２ヌクレオチドの突出端を、５’方向にリン酸基を残す。ｓｉＲＮＡはその後、ＲＩＳＣ‐Ａｇｏ２酵素複合体によって認識される。ｓｉＲＮＡ鎖のうちの一方は分解され、アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体がサイレンシングを必要とする正しいｍＲＮＡ配列を見つけるためのガイドとして働く（図３）。
【0135】
いくつかの実施形態によれば、リボ核酸（ＲＮＡ）複合体は、配列番号１～１９のうちの１つに対して少なくとも８０％（例えば８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有する配列を備えた鎖（例えばセンス鎖）を備えている。いくつかの実施形態では、鎖は以下に示すように突然変異部位の近傍に（例えば突然変異部位から３塩基対、５塩基対、又は７塩基対離隔して）１個のヌクレオチドミスマッチを有する。
【0136】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されたＲＮＡ複合体は、各々が野生型のＴＧＦＢＩと比較してＴＧＦＢＩ遺伝子の中の部位に相当する少なくとも１個又は１個の突然変異部位を含んでいる、第１鎖及び第２鎖を含むことができる。典型的なＴＧＦＢＩ突然変異については、Yamazoeら（R124H; doi.org/10.1371/journal.pone.0133397）及びKitamotoら（Nature, Scientific Reports, 2020, vol. 10, Article No. 2000）の文献に記載されており、前記文献は参照によりその全体が援用される。いくつかの実施形態では、第１鎖は、１個の塩基が第２鎖の相対する塩基に対してミスマッチであることを除いて配列番号１～１９の配列と同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１鎖は、１個の塩基が第２鎖の相対する塩基に対してミスマッチであることを除いて配列番号４、９又は１１の配列と同一の配列を含む。さらなる実施形態では、ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩのＲ１２４Ｈ突然変異部位から３、４、５、６、又は７塩基離れている。さらに別の実施形態では、第１鎖及び第２鎖は各々１６～２３塩基の長さである。さらに別の実施形態では、ＲＮＡ複合体はデオキシチミジンの突出端を有する。
【0137】
いくつかの実施形態では、鎖は標的配列に対してミスマッチである２以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列に対してミスマッチである２以上のヌクレオチドは連続して配置される。いくつかの実施形態では、標的配列に対してミスマッチである２以上のヌクレオチドは互いに離れて配置される。
【0138】
いくつかの実施形態では、同一度（％）は、鎖の配列の突出端を含めて測定される（例えば、２個のウリジンの突出端が１９量体の配列に付加されている場合、同一度は突出端を含む２１量体の配列に基づいて測定される）。いくつかの実施形態では、同一度（％）は、鎖の配列の突出端を除いて測定される（例えば、２個のウリジンの突出端が１９量体の配列に付加されている場合、同一度は突出端を含まない１９量体の配列に基づいて測定される）。
【0139】
いくつかの実施形態では、鎖は配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えている。
【0140】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも１つを備えている。いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のシチジン１リン酸（ｒＣ）、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のウリジン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＣ）、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル化グアノシン１リン酸（ｏＧ‐ｏＧ）、及び配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている。
【0141】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖（例えばアンチセンス鎖）をさらに備えている。いくつかの実施形態では、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列及び配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列は、同じ鎖（例えばヘアピン構造を形成する一本鎖）に位置付けられる。いくつかの実施形態では、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列及び配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列は、別々の鎖に位置付けられる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３の配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３の配列で構成された鎖をさらに備えている。
【0142】
いくつかの実施形態では、鎖は配列番号４の配列を備えている。
【0143】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号４の配列の５’末端の突出端又は配列番号４の配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号４の配列の５’末端のシチジン１リン酸（ｒＣ）、配列番号４の配列の５’末端のウリジン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＣ）、配列番号４の配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号４の配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号４の配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル化グアノシン１リン酸（ｏＧ‐ｏＧ）、及び配列番号４の配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている。
【0144】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖（例えばアンチセンス鎖）をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３の配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３の配列で構成された鎖をさらに備えている。
【0145】
いくつかの実施形態では、鎖は配列番号４の配列で構成されている。
【0146】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖（例えばアンチセンス鎖）をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３の配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２３の配列で構成された鎖をさらに備えている。
【0147】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えている。
【0148】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも１つを備えている。
【0149】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のアデノシン１リン酸（ｒＡ）、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のウリジン１リン酸‐アデノシン１リン酸（ｒＵ‐ｒＡ）、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたシチジン１リン酸‐ウリジン１リン酸（ｏＣ‐ｏＵ）、及び配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている。
【0150】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖（例えばアンチセンス鎖）をさらに備えている。いくつかの実施形態では、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列及び配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列は、同じ鎖（例えばヘアピン構造を形成する一本鎖）に位置付けられる。いくつかの実施形態では、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列及び配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列は、別々の鎖に位置付けられる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０の配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０の配列で構成された鎖をさらに備えている。
【0151】
いくつかの実施形態では、鎖は配列番号１１の配列を備えている。
【0152】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号１１の配列の５’末端の突出端、又は配列番号１１の配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号１１の配列の５’末端のアデノシン１リン酸（ｒＡ）、配列番号１１の配列の５’末端のウリジン１リン酸‐アデノシン１リン酸（ｒＵ‐ｒＡ）、配列番号１１の配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号１１の配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号１１の配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたシチジン１リン酸‐ウリジン１リン酸（ｏＣ‐ｏＵ）、及び配列番号１１の配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている。
【0153】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０の配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０の配列で構成された鎖をさらに備えている。
【0154】
いくつかの実施形態では、鎖は配列番号１１の配列で構成されている。
【0155】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖（例えばアンチセンス鎖）をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０の配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３０の配列で構成された鎖をさらに備えている。
【0156】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えている。
【0157】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のグアノシン１リン酸（ｒＧ）、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の２個のグアノシン１リン酸（ｒＧ‐ｒＧ）、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたグアノシン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｏＧ‐ｏＣ）、及び配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている。
【0158】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列及び配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列は、同じ鎖（例えばヘアピン構造を形成する一本鎖）に位置付けられる。いくつかの実施形態では、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列及び配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列は、別々の鎖に位置付けられる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５の配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５の配列で構成された鎖をさらに備えている。
【0159】
いくつかの実施形態では、鎖は配列番号１６の配列を備えている。
【0160】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号１６の配列の５’末端の突出端、又は配列番号１６の配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号１６の配列の５’末端のグアノシン１リン酸（ｒＧ）、配列番号１６の配列の５’末端の２個のグアノシン１リン酸（ｒＧ‐ｒＧ）、配列番号１６の配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号１６の配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号１６の配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたグアノシン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｏＧ‐ｏＣ）、及び配列番号１６の配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）のうち少なくとも１つを備えている。
【0161】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５の配列を備えた鎖をさらに備えている。
【0162】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５の配列で構成された鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、鎖は配列番号１６の配列で構成されている。
【0163】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖（例えばアンチセンス鎖）をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５の配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号３５の配列で構成された鎖をさらに備えている。
【0164】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えている。
【0165】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。
【0166】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のグアノシン１リン酸（ｒＧ）、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のウリジン１リン酸‐グアノシン１リン酸（ｒＵ‐ｒＧ）、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたアデノシン１リン酸‐グアノシン１リン酸（ｏＡ‐ｏＧ）、及び配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）のうち少なくとも１つを備えている。
【0167】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２５の配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２５の配列で構成された鎖をさらに備えている。
【0168】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号９の配列を備えている。
【0169】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号９の配列の５’末端の突出端、又は配列番号９の配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。
【0170】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のグアノシン１リン酸（ｒＧ）、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のウリジン１リン酸‐グアノシン１リン酸（ｒＵ‐ｒＧ）、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたアデノシン１リン酸‐グアノシン１リン酸（ｏＡ‐ｏＧ）、及び配列番号９に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）のうち少なくとも１つを備えている。
【0171】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２５の配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２５の配列で構成された鎖をさらに備えている。
【0172】
いくつかの実施形態では、鎖は配列番号９の配列で構成されている。
【0173】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２５の配列を備えた鎖をさらに備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、配列番号２５の配列で構成された鎖をさらに備えている。
【0174】
いくつかの実施形態によれば、リボ核酸（ＲＮＡ）複合体は、配列番号２０～３８のうち１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えた鎖（例えばアンチセンス鎖）を備えている。
【0175】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えている。いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。
【0176】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えている。いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。
【0177】
いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を備えている。いくつかの実施形態では、鎖は、配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている。
【0178】
いくつかの実施形態によれば、リボ核酸（ＲＮＡ）複合体は、トランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）タンパク質のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列と重複する配列を有する鎖であって、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞Ａという一塩基多型（ＳＮＰ）に対応する位置にアデニンを含んでいる鎖を、備えている。
【0179】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は短鎖干渉ＲＮＡ二重鎖を備えている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は短鎖干渉ＲＮＡ二重鎖である（例えば、ＲＮＡ複合体は、３０量体よりも短いセンス鎖及び３０量体よりも短いアンチセンス鎖を備えた二本鎖ＲＮＡ構造を有する）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、２４量体よりも短いセンス鎖及び２４量体よりも短いアンチセンス鎖を備えた二本鎖ＲＮＡ構造を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、１８量体よりも長いセンス鎖及び１８量体よりも長いアンチセンス鎖を備えた二本鎖ＲＮＡ構造を有する。
【0180】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、短鎖干渉ＲＮＡ二重鎖を形成するために構成された二本鎖ＲＮＡ複合体を備えている（例えば、ＲＮＡ複合体は、少なくとも１つの鎖が３０量体よりも長い二本鎖ＲＮＡ構造を有する）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、両方の鎖が３０量体よりも長い、場合によっては５０量体又は１００量体よりも長い、二本鎖ＲＮＡ構造を有する。
【0181】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体はＲＮＡヘアピンを備えている。例えば、ＲＮＡ複合体は、同じ一本の鎖にセンス鎖の配列及びアンチセンス鎖の配列を含んでいる一本鎖によって形成されてもよい。
【0182】
上記に説明されたように、細胞内にあるダイサー酵素は二本鎖ＲＮＡ複合体又はＲＮＡヘアピンを開裂してｓｉＲＮＡ二重鎖を提供することができる。
【0183】
いくつかの実施形態によれば、対象者の顆粒状角膜変性症２型を予防、改善、又は治療する方法は、対象者に対して本明細書中に記載された任意のＲＮＡ複合体を投与するステップを含む。例えば、ＲＮＡ複合体は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、リン酸カルシウム、又はカチオン性脂質のようなトランスフェクション試薬によって細胞内に送達可能である。別例として、ＲＮＡ複合体は電気穿孔法を使用して細胞内に送達されてもよい。場合によっては、ＲＮＡ複合体はウイルス感染（例えばアデノウイルス、レトロウイルス、又はその他のウイルスベクターを使用）によって送達される。他のいくつかの場合には、ＲＮＡ複合体を送達するためにナノ粒子が使用されてもよい。
【0184】
いくつかの実施形態では、投与するステップは対象者にＲＮＡ複合体を注射することを含む。例えば、ＲＮＡ複合体を含有する溶液が実質内注射によって提供される。
【0185】
いくつかの実施形態では、投与するステップは、ＲＮＡ複合体を含有する溶液を対象者に施用することを含む。例えば、ＲＮＡ複合体を含有する点眼剤が、眼内にＲＮＡ複合体が吸収されるように眼に対して施用されてもよい。
【0186】
いくつかの実施形態では、投与するステップは、ＲＮＡ複合体を、トランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞Ａという一塩基多型（ＳＮＰ）を有しているデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含有及び発現している細胞に導入することを含む。例えば、該細胞が、ＧＣＤ２の原因となる突然変異型ＴＧＦＢＩタンパク質を生産する突然変異型アレルを含有していてもよい。
【0187】
いくつかの実施形態では、対象者は脊椎動物である。いくつかの実施形態では、対象者はヒトである。
【0188】
いくつかの実施形態では、該方法はさらに、対象者にＲＮＡ複合体を投与するステップの前に、対象者の配列情報を入手するステップ；及び、対象者がＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞ＡというＳＮＰを有するアレルと、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞ＡというＳＮＰを有していないアレルとを有することを判定するステップを含む。この場合、対象者がＧＣＤ２の突然変異型アレルを有するという診断情報により、ＧＣＤ２の突然変異型アレルを有していない患者を本明細書中に記載のＲＮＡ複合体で治療することを回避又は低減することができる。加えて、対象者が野生型アレルも有しているという診断情報は、その対象者が、実施すればＴＧＦＢＩタンパク質が生産されないＴＧＦＢＩ遺伝子の完全なサイレンシング（例えば両方のアレルのサイレンシング）に伴う何らかの悪影響を経験する可能性が低いことを示す。
【0189】
いくつかの実施形態では、対象者の配列情報はＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４の配列情報で構成される。
【0190】
いくつかの実施形態では、対象者の配列情報は、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のうち全部ではなく一部の配列情報を備えている。
【0191】
いくつかの実施形態では、対象者の配列情報は、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞ＡのＳＮＰの配列情報のみを備えている。いくつかの実施形態では、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞ＡのＳＮＰの配列情報は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ（例えばリアルタイムＰＣＲアッセイ）のような、点突然変異を検出する方法によって得られる。
【0192】
いくつかの実施形態では、対象者の配列情報は、対象者の全ゲノムの配列情報を備えている。
【実施例】
【0193】
実施例１：ｓｉＲＮＡの設計
＜方法及び材料＞
Ｒ１２４Ｈ突然変異を含有する可能な全ての配列をスクリーニングするために、合計１９種のｓｉＲＮＡを合成した（ドイツ連邦共和国エーバースベルクのユーロフィンズ・エムダブリュジー・オペロン（Eurofins MWG Operon））。ｓｉＲＮＡはそれぞれ１９ヌクレオチドに２個の３’デオキシチミジンヌクレオチド突出端を備えて構成された。対照として、それぞれ特異的効果を持たないように、及びルシフェラーゼの発現を阻害するように作用する、非特異的なｓｉＲＮＡ及びルシフェラーゼｓｉＲＮＡも設計した。
＜方法及び材料＞
Ｒ１２４Ｈ突然変異を含有する可能な全ての配列をスクリーニングするために、合計１９種のｓｉＲＮＡを合成した（ドイツ連邦共和国エーバースベルクのユーロフィンズ・エムダブリュジー・オペロン（Eurofins MWG Operon））。ｓｉＲＮＡはそれぞれ１９ヌクレオチドに２個の３’デオキシチミジンヌクレオチド突出端を備えて構成された。対照として、それぞれ特異的効果を持たないように、及びルシフェラーゼの発現を阻害するように作用する、非特異的なｓｉＲＮＡ及びルシフェラーゼｓｉＲＮＡも設計した。
【表1】
【表2】
【0194】
ＮＳＣ４のセンス配列は５’‐ＵＡＧＣＧＡＣＵＡＡＡＣＡＣＡＵＣＡＡＵＵ‐３’（配列番号３９のβ‐ガラクトシダーゼ逆配列にウラシル２個の突出端を備えたもの）であり、ｓｉＬＵＣのセンス鎖は５’‐ＧＵＧＣＧＵＵＧＣＵＡＧＵＡＣＣＡＡＣＵＵ‐３’（配列番号４０にウラシル２個の突出端を備えたもの）である（両方ともユーロフィンズ・エムダブリュジー・オペロンにより合成された）。ＮＳＣ４のアンチセンス配列（配列番号４１を備えている）及びｓｉＬＵＣのアンチセンス配列（配列番号４２を備えている）も表３に示す。
【表3】
【0195】
＜細胞培養＞
ＡＤ２９３ヒト胎児腎細胞（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies））を、１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン）が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（英国ペイズリーのインビトロジェン（Invitrogen））で培養した。
ＡＤ２９３ヒト胎児腎細胞（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies））を、１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン）が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（英国ペイズリーのインビトロジェン（Invitrogen））で培養した。
【0196】
＜Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイ＞
ｓｉＲＮＡのスクリーニング用に、ＡＤ２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間前に６．５×１０３個／ウェルとして９６ウェルプレートに播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン）を使用して製造業者の説明書に従って細胞をトランスフェクションした。細胞を、突然変異型及び野生型のＴＧＦＢＩ及びホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ発現構築物、及び濃度０～６．２５ｎＭの突然変異特異的ｓｉＲＮＡ（いずれもＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）（インビトロジェン）で希釈した）を用いて４連でトランスフェクションした。非特異的対照ｓｉＲＮＡ（ＮＳＣ４）、及びベクターのルシフェラーゼ部分を標的とするｓｉＬＵＣ対照も、突然変異特異的なｓｉＲＮＡと同じ濃度でトランスフェクションした。
ｓｉＲＮＡのスクリーニング用に、ＡＤ２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間前に６．５×１０３個／ウェルとして９６ウェルプレートに播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン）を使用して製造業者の説明書に従って細胞をトランスフェクションした。細胞を、突然変異型及び野生型のＴＧＦＢＩ及びホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ発現構築物、及び濃度０～６．２５ｎＭの突然変異特異的ｓｉＲＮＡ（いずれもＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）（インビトロジェン）で希釈した）を用いて４連でトランスフェクションした。非特異的対照ｓｉＲＮＡ（ＮＳＣ４）、及びベクターのルシフェラーゼ部分を標的とするｓｉＬＵＣ対照も、突然変異特異的なｓｉＲＮＡと同じ濃度でトランスフェクションした。
【0197】
Ｄｕａｌ‐Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイ（英国サザンプトンのプロメガ）を使用して、トランスフェクションの２４時間後にルシフェラーゼの発現に対するｓｉＲＮＡの効果を計測した。アッセイは製造業者の説明書に従って利用され、すなわち、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄した後にパッシブライシス（passive lysis）バッファー（プロメガ）に置き換えた。細胞をプレートシェーカーで１５分間振盪して十分な溶解を確実とし、その後ホタル及びウミシイタケのルシフェラーゼ両方の活性を、ＬＵＭＩｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ（英国エールズベリーのビーエムジーラブテック）を使用して順次計測した。
【0198】
＜結果＞
図１は、様々な構築物についてのルシフェラーゼの活性を示す。各パネルに示す結果は、４連で別々に２回の実施に相当する８ウェルの平均に基づいている。ｓｉＲＮＡ１の結果は配列番号１を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ２の結果は配列番号２を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ３の結果は配列番号３を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ４の結果は配列番号４を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ５の結果は配列番号５を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ６の結果は配列番号６を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ７の結果は配列番号７を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ８の結果は配列番号８を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ９の結果は配列番号９を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１０の結果は配列番号１０を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１１の結果は配列番号１１を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１２の結果は配列番号１２を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１３の結果は配列番号１３を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１４の結果は配列番号１４を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１５の結果は配列番号１５を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１６の結果は配列番号１６を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１７の結果は配列番号１７を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１８の結果は配列番号１８を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１９の結果は配列番号１９を使用して得られた。
図１は、様々な構築物についてのルシフェラーゼの活性を示す。各パネルに示す結果は、４連で別々に２回の実施に相当する８ウェルの平均に基づいている。ｓｉＲＮＡ１の結果は配列番号１を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ２の結果は配列番号２を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ３の結果は配列番号３を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ４の結果は配列番号４を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ５の結果は配列番号５を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ６の結果は配列番号６を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ７の結果は配列番号７を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ８の結果は配列番号８を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ９の結果は配列番号９を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１０の結果は配列番号１０を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１１の結果は配列番号１１を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１２の結果は配列番号１２を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１３の結果は配列番号１３を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１４の結果は配列番号１４を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１５の結果は配列番号１５を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１６の結果は配列番号１６を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１７の結果は配列番号１７を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１８の結果は配列番号１８を使用して得られ、ｓｉＲＮＡ１９の結果は配列番号１９を使用して得られた。
【0199】
図１は、配列番号４、１１、及び１６が、野生型アレル（ＷＴ）の発現を維持する一方で突然変異型アレル（ＭＵＴ）の発現を抑制することを示している。よって、いくつかの実施形態では、突然変異型アレルの発現を抑制するために配列番号４が使用される。いくつかの実施形態では、突然変異型アレルの発現を抑制するために配列番号１１が使用される。いくつかの実施形態では、突然変異型アレルの発現を抑制するために配列番号１６が使用される。図１はさらに、配列番号９が強力なノックダウン効果を有することを示している。よって、いくつかの実施形態では、突然変異型アレルの発現を抑制するために配列番号９が使用される。
実施例２：Ｒ１２４Ｈ突然変異部位近傍への１個のヌクレオチドミスマッチの付加によるアレル特異性の改善及び候補ｓｉＲＮＡの長さの改変による能力の改善
実施例２：Ｒ１２４Ｈ突然変異部位近傍への１個のヌクレオチドミスマッチの付加によるアレル特異性の改善及び候補ｓｉＲＮＡの長さの改変による能力の改善
【0200】
ＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ ｓｉＲＮＡの識別力を改善するために、Ｒ１２４Ｈ突然変異を含有する１９種の可能な配列全てを用いた遺伝子ウォーキング研究で事前に発見された、高いアレル特異性及び活性（突然変異型アレルのノックダウン）を備えた上位２候補であるｓｉＲＮＡ４及びｓｉＲＮＡ１１、並びに全体的には能力が最も高いが強いアレル特異性を欠くもう１つの候補（ｓｉＲＮＡ９）を改変することにより、新たなミスマッチｓｉＲＮＡを設計した。ミスマッチｓｉＲＮＡは、Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から３ｂｐ及び５～７ｂｐ離れておりかつｓｉＲＮＡのシード領域内に追加のミスマッチヌクレオチド（誤った対合）を含有するものとした（図２）。全てのｓｉＲＮＡｓが、デオキシチミジンの突出端（ｄＴ‐ｄＴ）を備えた１９ヌクレオチド二重鎖で構成された（ドイツ連邦共和国エーバースベルクのユーロフィンズ・エムダブリュジー・オペロン）。
【0201】
加えて、上位３つの候補ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ４、ｓｉＲＮＡ１１及びｓｉＲＮＡ１６）を併用混合してトランスフェクションし、突然変異型プラスミドの全体的なノックダウンが向上するかどうかを確認した。事前のデータからは、転写物内の複数の領域を標的とするｓｉＲＮＡ配列混合物がオフターゲット効果の低減に有益かもしれないことが示唆された。最後に、最良の候補ｓｉＲＮＡを、図３に示されるように１６ｂｐから２３ｂｐまで様々に改変された長さを有するように再設計した。ｓｉＲＮＡの有効性に対する長さの潜在的な影響を確認するために、５’末端又は３’末端のいずれかにおいてヌクレオチドをさらに付加又は除去した。
【0202】
＜方法及び材料＞
ヒトＡＤ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン）を添加したＤＭＥＭ（英国ペイズリーのインビトロジェン）で培養した。ｓｉＲＮＡのスクリーニング用に、ＡＤ２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間前に６．５×１０３個／ウェルとして９６ウェルプレートに播種した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（インビトロジェン）を使用して製造業者の説明書に従ってトランスフェクションした。細胞を、ＴＧＦＢＩ‐ルシフェラーゼの野生型又は突然変異型プラスミドを用いて４連でトランスフェクションし、細胞トランスフェクションの内部標準用のウミシイタケルシフェラーゼ発現構築物、及び被験物の突然変異特異的ｓｉＲＮＡを、同時にトランスフェクションした。この研究では、現時点で最も強力な候補と、そのバリアントであって配列内に追加のミスマッチヌクレオチドを含有するものとの間の差を確認することを目標とした。アッセイは、ＯｐｔｉＭＥＭ（インビトロジェン）で希釈して調製された２用量の各ｓｉＲＮＡについて実施し、使用した濃度は以下すなわち０ｎＭ（非処理）、０．２５ｎＭ（低用量）及び６．５ｎＭ（高用量）とした。同じ方法論を、候補ｓｉＲＮＡの長さの改変についての評価にも使用した。
ヒトＡＤ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン）を添加したＤＭＥＭ（英国ペイズリーのインビトロジェン）で培養した。ｓｉＲＮＡのスクリーニング用に、ＡＤ２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間前に６．５×１０３個／ウェルとして９６ウェルプレートに播種した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（インビトロジェン）を使用して製造業者の説明書に従ってトランスフェクションした。細胞を、ＴＧＦＢＩ‐ルシフェラーゼの野生型又は突然変異型プラスミドを用いて４連でトランスフェクションし、細胞トランスフェクションの内部標準用のウミシイタケルシフェラーゼ発現構築物、及び被験物の突然変異特異的ｓｉＲＮＡを、同時にトランスフェクションした。この研究では、現時点で最も強力な候補と、そのバリアントであって配列内に追加のミスマッチヌクレオチドを含有するものとの間の差を確認することを目標とした。アッセイは、ＯｐｔｉＭＥＭ（インビトロジェン）で希釈して調製された２用量の各ｓｉＲＮＡについて実施し、使用した濃度は以下すなわち０ｎＭ（非処理）、０．２５ｎＭ（低用量）及び６．５ｎＭ（高用量）とした。同じ方法論を、候補ｓｉＲＮＡの長さの改変についての評価にも使用した。
【0203】
対照として、非特異的なｓｉＲＮＡ（ＮＳＣ４）及びベクターのルシフェラーゼ部分を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）も、突然変異特異的ｓｉＲＮＡｓと同じ濃度でトランスフェクションした。対照のｓｉＲＮＡは、それぞれ、非特異的な効果を持たないように（ＮＳＣ４）、及びＴＧＦＢＩ発現構築物に組み込まれたルシフェラーゼレポーターの発現を阻害するように（ｓｉＬＵＣ）、設計した。ＮＳＣ４のセンス配列は５’‐ＵＡＧＣＧＡＣＵＡＡＡＣＡＣＡＵＣＡＡＵＵ‐３’（β‐ガラクトシダーゼ逆配列）であり、ｓｉＬＵＣのセンス鎖は５’‐ＧＵＧＣＧＵＵＧＣＵＡＧＵＡＣＣＡＡＣＵＵ‐３’である（いずれもユーロフィンズ・エムダブリュジー・オペロンにより合成された）。
【0204】
Ｄｕａｌ‐Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイ（英国サザンプトンのプロメガ）を使用して、トランスフェクションの２４時間後にＴＧＦＢＩ‐ルシフェラーゼの発現に対するｓｉＲＮＡの効果を計測した。アッセイは製造業者の説明書に従って利用され；すなわち、簡潔に述べると、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄した後にパッシブライシスバッファー（プロメガ）に置き換えた。細胞をプレートシェーカーで１５分間振盪して十分な溶解を確実とし、その後ホタル及びウミシイタケのルシフェラーゼ両方の活性を、ＬＵＭＩｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ（英国エールズベリーのビーエムジーラブテック）を使用して順次計測した。結果を非処理のウェル（０ｎＭのｓｉＲＮＡ）に対して標準化し、平均ノックダウンを計算して標準誤差のバーを含めた。
【0205】
＜ミスマッチヌクレオチドを備えたｓｉＲＮＡについての結果＞
未改変のｓｉＲＮＡ４、ｓｉＲＮＡ９及びｓｉＲＮＡ１１は、低用量・高用量を問わず突然変異型アレルの強いノックダウンを示すことが確認された（表４）。ｓｉＲＮＡを併せた試料には、ＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈのサイレンシングに対する好ましい効果がなく、アレル特異的なターゲティングには非常に厳密な設計が必要であることから個々のｓｉＲＮＡ配列を使用するほうがより良好な結果が生じるであろうことが示唆された。
未改変のｓｉＲＮＡ４、ｓｉＲＮＡ９及びｓｉＲＮＡ１１は、低用量・高用量を問わず突然変異型アレルの強いノックダウンを示すことが確認された（表４）。ｓｉＲＮＡを併せた試料には、ＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈのサイレンシングに対する好ましい効果がなく、アレル特異的なターゲティングには非常に厳密な設計が必要であることから個々のｓｉＲＮＡ配列を使用するほうがより良好な結果が生じるであろうことが示唆された。
【0206】
追加のミスマッチヌクレオチドが導入された場合に、アレル特異性が改善された。一般に、ミスマッチｓｉＲＮＡは野生型アレルと突然変異型アレルとの間の識別力により優れていることが観察された。ｓｉＲＮＡ１１のミスマッチ型は突然変異型アレルのみを標的とし、突然変異部位から５ｂｐ離れた部位のミスマッチ（ｓｉＲＮＡ１１‐ミスマッチ２）が最も強力であった。ｓｉＲＮＡ９のバリアントはいずれも野生型アレルに対する効果を全く又はほとんど示さなかった（特異性が改善された）が、突然変異型アレルのノックダウンが低減された。ｓｉＲＮＡ４の配列へのミスマッチヌクレオチドの導入は改善を示さなかった（ｓｉＲＮＡ４‐ミスマッチ１）。したがって、両方の選択肢（ｓｉＲＮＡ４及びｓｉＲＮＡ１１‐ミスマッチ２）についてさらに検討し、結果を図１０～１２に示し、かつ表４にまとめた。表４は、試験したミスマッチ導入型の全てのｓｉＲＮＡの平均ノックダウンを、野生型（ｗｔ）及び突然変異型（ｍｕｔ）アレルのノックダウンの差と共に示しており、負のノックダウン値はｗｔ及びｍｕｔのノックダウンの差を計算するために０に丸めてある。
【表4】
【0207】
結果に基づくと、低用量及び高用量において最も高いノックダウンを示し、加えて野生型及び突然変異型のアレル間の最も高い識別を実証していることから、ｓｉＲＮＡ４が最良の候補であると同定され、したがってｓｉＲＮＡ４が潜在的に最も優れた治療可能性を有するであろうことが示された。
【0208】
＜長さを改変したｓｉＲＮＡ４についての結果＞
ｓｉＲＮＡの有効性に対する長さの潜在的効果について確認するために、ｓｉＲＮＡ４を１６ｂｐ～２３ｂｐの様々に改変された長さを備えるように再設計した。基本のｓｉＲＮＡ４の長さが変更されると、効果は著しく変化した。試験した長さ改変ｓｉＲＮＡの平均ノックダウンについて野生型（ｗｔ）及び突然変異型（ｍｕｔ）のアレルのノックダウンの差も含めて示す表５に見られるように、大多数のｓｉＲＮＡはその効力又はアレル特異性が低下した（表中、負のノックダウン値はｗｔ及びｍｕｔのノックダウンの差を計算するために０に丸めてあり、最高の力を発揮した上位５つのｓｉＲＮＡは強調表示されている）。しかしながら、いくつかの配列は改変前の候補と同様の活性を示した。
ｓｉＲＮＡの有効性に対する長さの潜在的効果について確認するために、ｓｉＲＮＡ４を１６ｂｐ～２３ｂｐの様々に改変された長さを備えるように再設計した。基本のｓｉＲＮＡ４の長さが変更されると、効果は著しく変化した。試験した長さ改変ｓｉＲＮＡの平均ノックダウンについて野生型（ｗｔ）及び突然変異型（ｍｕｔ）のアレルのノックダウンの差も含めて示す表５に見られるように、大多数のｓｉＲＮＡはその効力又はアレル特異性が低下した（表中、負のノックダウン値はｗｔ及びｍｕｔのノックダウンの差を計算するために０に丸めてあり、最高の力を発揮した上位５つのｓｉＲＮＡは強調表示されている）。しかしながら、いくつかの配列は改変前の候補と同様の活性を示した。
【0209】
図４及び５は、低用量（０．２５ｎＭ）及び高用量（６．２５ｎＭ）において最高の力を発揮した上位５つのｓｉＲＮＡ、すなわちｓｉＲＮＡ４－５＋１、ｓｉＲＮＡ４－５＋２、ｓｉＲＮＡ４－５＋３、ｓｉＲＮＡ４－３＋１、ｓｉＲＮＡ４－５－１を示す。これらのｓｉＲＮＡのうち、ｓｉＲＮＡ４－５＋１が最高の効力を示してｍｕｔは低用量で８１％及び高用量で８４％ノックダウンされたが、アレルの識別については、ｓｉＲＮＡ４－５＋１によってｗｔの２５％（低用量）及び２３％（高用量）がノックダウンされたので、ｗｔについて１３％／２２％のノックダウンを示したｓｉＲＮＡ４と比較して負の影響がもたらされた。加えて、ｓｉＲＮＡ４－５－１は低用量では優れた効力を示したが、用量を６．２５ｎＭに上げてしまうとアレルの識別が損なわれてｗｔの４６％がノックダウンされた（図１０～１２）。
【表5】
【0210】
この結果に基づくと、ｓｉＲＮＡ４は、低用量及び高用量において最も高いノックダウンを示し、加えて野生型及び突然変異型アレルの間の最も高い識別力を示すことから最良の候補であると特定され、したがってｓｉＲＮＡ４は潜在的に最も優れた治療可能性を有するであろうことが示された。ｓｉＲＮＡ１１‐ミスマッチ２は、配列４よりも能力がわずかに低いにもかかわらずこのｓｉＲＮＡが健康な野生型アレルには影響を及ぼさなかった（図１０～１２）ので、代替候補として特定された。
【0211】
ｓｉＲＮＡ４の配列の長さが変更されると、その活性及び特異性に対する様々な影響が観察された。ｓｉＲＮＡ４－５＋１は、より優れた能力を示した一方で野生型と突然変異型との間の違いがｓｉＲＮＡ４と同様のままであったが、長さが伸びることにより、意図せぬ経路に対して害になる効果を有する可能性のあるオフターゲットの可能性が高まることが考えられた。ｓｉＲＮＡ４－５＋１は、ｉｎ ｖｉｖｏでの適用のためさらなる能力が必要な場合のｓｉＲＮＡ４候補に対する実現可能な代案とすることも考えられる。とはいえ、１９ｎｔの標準的なｓｉＲＮＡ設計物について既に最適化されている化学的改変のための新たな設計物も必要であろう。
【0212】
実施例３：ｓｉＲＮＡの活性及び血清中安定性に対する化学的改変設計の効果
ｓｉＲＮＡの化学的改変の重要な側面は、ｓｉＲＮＡの薬らしい面を洗練することにより治療法におけるその有用性を改善することである。薬らしい面には、全体的な安定性（ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性）、遺伝子サイレンシング効果の持続、特異性の増大及び細胞毒性の低減が挙げられる。この有用性の改善を達成するために、様々な改変を施し、かつ該ｓｉＲＮＡ分子のアレル特異性及び安定性に対する化学的改変の効果を比較することによりアベリノ角膜変性症という観点で実験的に検証することが考えられる。遺伝子ウォーキング由来のｓｉＲＮＡ候補の効力をさらに高めるために、３つの可能な改変候補を選んだ。
ｓｉＲＮＡの化学的改変の重要な側面は、ｓｉＲＮＡの薬らしい面を洗練することにより治療法におけるその有用性を改善することである。薬らしい面には、全体的な安定性（ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性）、遺伝子サイレンシング効果の持続、特異性の増大及び細胞毒性の低減が挙げられる。この有用性の改善を達成するために、様々な改変を施し、かつ該ｓｉＲＮＡ分子のアレル特異性及び安定性に対する化学的改変の効果を比較することによりアベリノ角膜変性症という観点で実験的に検証することが考えられる。遺伝子ウォーキング由来のｓｉＲＮＡ候補の効力をさらに高めるために、３つの可能な改変候補を選んだ。
【0213】
ｓｉＲＮＡ分子の活性及び安定性に対する化学的改変設計の効果について調査した。ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）を選択したが、その理由は、（ａ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現が迅速に検出されること、（ｂ）プラスミドを介して細胞内で、及び遺伝子改変された生物発光レポーターマウスの中で生得的に発現させることが可能なルシフェラーゼと同じｓｉＬｕｃ配列を使用してｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で実験を実施することが可能なこと、である。文献検索を実施して、候補ｓｉＲＮＡの総合的性能を改善する可能性のある化学的改変、すなわちｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ１、ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ２、ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３を見出した。これらを、ｄＴｄＴ突出端又はｒＮｒＮ突出端のいずれかを含有する未改変のｓｉＲＮＡ配列と比較した。最も効果的なパターンを、最も優れたアレル特異的な候補ｓｉＲＮＡに適用した。
【0214】
＜方法及び材料：化学的改変ｓｉＲＮＡの設計＞
≪ｓｉＬｕｃ‐未改変≫ これは、１９ｂｐ及び各鎖にｄＴｄＴ突出端を含んだ標準的な設計であった。このｓｉＲＮＡを基準として用い、３つの異なる化学的改変ｓｉＲＮＡを比較した。
≪ｓｉＬｕｃ‐未改変≫ これは、１９ｂｐ及び各鎖にｄＴｄＴ突出端を含んだ標準的な設計であった。このｓｉＲＮＡを基準として用い、３つの異なる化学的改変ｓｉＲＮＡを比較した。
【0215】
≪ｓｉＬｕｃ‐ｒＮｒＮ≫ １９ｂｐそのままのｓｉＲＮＡにｒＮｒＮ突出端を備えたこのバリアントは、ｄＴｄＴ突出端によってもたらされるヌクレアーゼ抵抗性を検査するために加えられた。センス鎖ではＧＧヌクレオチドが突出端として付加された一方、アンチセンス鎖ではＵＣヌクレオチドが付加されたが、どちらもｌｕｃ２の遺伝子配列と一致する。
【0216】
≪ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ１：改変を最小限としたｓｉＲＮＡ≫ この設計には、（１）ＲＮＡｉ活性を阻害してセンス鎖が関与するオフターゲット効果を防止する、一連の繰り返される２’‐ＯＭｅを有する（ヌクレオシドのリボース部分の２’水酸基にメチル基が付加された）センス鎖；（２）ガイド鎖の以下の位置すなわち（ａ）オフターゲット効果を低減するためにシード領域に、及び（ｂ）ヌクレアーゼから鎖を保護するために３’末端に、付加される追加の２’‐ＯＭｅ；並びに（３）ヌクレアーゼによる分解からｓｉＲＮＡをさらに保護するために含まれるｄＴｄＴ突出端、が含まれた。
【0217】
≪ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ２：最大限改変された非対称ｓｉＲＮＡ≫ この設計には、（１）センス鎖がＲＩＳＣに取り込まれるのを防止し、従って全てのセンス鎖のオフターゲット効果を防止する、１５ｂｐに短縮されたセンス鎖；（２）アンチセンス鎖上への、２’‐ＯＭｅ（２’‐Ｏ‐メチル‐リボヌクレオチド）及び２’‐Ｆ（２’‐デオキシ‐２’‐フルオロ‐リボヌクレオチド）が交互になったパターンの適用であって、最良のパターンではほとんどのピリミジンが２’‐Ｆ‐ＲＮＡで置換されるもの；（３）センス鎖上への、２’‐ＯＭｅ及び２’‐Ｆの交互パターンの適用であって、例えば（ａ）ＭＦＭＦＭＦ＜センス鎖及び（ｂ）ＦＭＦＭＦＭ＜アンチセンス鎖のように最初に異なる修飾で始まるもの；（４）アンチセンス鎖の５’末端の、５’‐リン酸の復活；並びに（５）両方の鎖の３’末端及び５’末端へのホスホロチオエート結合（＊）の付加、が含まれた。
【0218】
≪ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３：文献探索に基づいた部分的な改変≫ この設計には、（１）パッセンジャー鎖をブロックしてＲＩＳＣによるアンチセンス鎖の取り込みを促進することによりオフターゲット効果を低減する、センス鎖の５’末端の２個の２’‐ＯＭｅユニット；（２）ｓｉＲＮＡの特異性を改善し、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲへのシード領域の相同性に関係するオフターゲット効果を低減する（ｍｉＲＮＡ経路への関与を阻止する）、ガイド鎖の５’末端から２番目の位置の単一の２’‐ＯＭｅ；（３）免疫賦活作用を低減する、センス鎖のＵ残基又はＧ残基のいずれか（９位のもの以外）における少なくとも２個の２’‐ＯＭｅ修飾の組み込み；（４）アンチセンスのｄＴｄＴ突出端を安定させるための該突出端への３’‐エキソヌクレアーゼ安定性を改善するＰＳ結合の導入と、これとは対照的にセンス鎖に単純なｄＴｄＴを残してパッセンジャー鎖を不安定化して免疫賦活作用を維持すること；並びに（５）アンチセンス鎖のすべてのピリミジンの２’Ｆ‐ＲＮＡユニットによる置き換え（最初のヌクレオチドが５’末端にある場合、５’Ｐを復活させる）、が含まれた。
【0219】
＜Ｄｕａｌ‐ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイ＞
ヒトＡＤ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン）を添加したＤＭＥＭ（英国ペイズリーのインビトロジェン）で培養した。化学的改変のスクリーニング用に、ＡＤ２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間前に６．５×１０３個／ウェルとして９６ウェルプレートに播種した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（インビトロジェン）を使用して製造業者の説明書に従ってトランスフェクションした。細胞を、ｌｕｃ２プラスミドを用いて４連でトランスフェクションし、細胞トランスフェクションの内部標準用のウミシイタケルシフェラーゼ発現構築物、及び被験物の化学的に改変されたｓｉＲＮＡを、同時にトランスフェクションした。実験は、ｓｉＲＮＡへの化学的改変の付加によって引き起こされる何らかのノックダウンの低下を特定することを目標とした。アッセイは２つの濃度すなわち０ｎＭ（非処理）及び１ｎＭで実施した。
ヒトＡＤ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン）を添加したＤＭＥＭ（英国ペイズリーのインビトロジェン）で培養した。化学的改変のスクリーニング用に、ＡＤ２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間前に６．５×１０３個／ウェルとして９６ウェルプレートに播種した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（インビトロジェン）を使用して製造業者の説明書に従ってトランスフェクションした。細胞を、ｌｕｃ２プラスミドを用いて４連でトランスフェクションし、細胞トランスフェクションの内部標準用のウミシイタケルシフェラーゼ発現構築物、及び被験物の化学的に改変されたｓｉＲＮＡを、同時にトランスフェクションした。実験は、ｓｉＲＮＡへの化学的改変の付加によって引き起こされる何らかのノックダウンの低下を特定することを目標とした。アッセイは２つの濃度すなわち０ｎＭ（非処理）及び１ｎＭで実施した。
【0220】
Ｄｕａｌ‐Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイ（英国サザンプトンのプロメガ）を使用して、トランスフェクションの２４時間後にｌｕｃ２の発現に対するｓｉＲＮＡの効果を計測した。アッセイは製造業者の説明書に従って使用した；簡潔に述べると、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄した後にパッシブライシスバッファー（プロメガ）に置き換えた。細胞をプレートシェーカーで１５分間振盪して十分な溶解を確実とし、その後ホタル及びウミシイタケのルシフェラーゼ両方の活性を、ＬＵＭＩｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ（英国エールズベリーのビーエムジーラブテック）を使用して順次計測した。結果を非処理のウェル（０ｎＭ ｓｉＲＮＡ）に対して標準化し、平均ノックダウンを計算して標準誤差のバーを含め、さらに結果を未改変のｓｉＬｕｃ ｓｉＲＮＡと比較した場合のノックダウンの相対的な差として示した。
【0221】
＜ｓｉＲＮＡ安定性アッセイ＞
ｓｉＲＮＡ安定性アッセイを使用してｓｉＲＮＡのヌクレアーゼに対する抵抗性及び安定性を計測した。４μｇのｓｉＲＮＡを（２０μＬのヌクレアーゼ非含有水の中に）含有するストックをウシ胎児血清（インビトロジェン）に添加して１００μｌの全体積に対して８０％ＦＢＳとし、試料を３７Ｃに一定させてインキュベートした。使用した時点は以下すなわち０、０．５、１、２、４、６、２４、４８、７２、及び７８時間とした。５μｌのアリコートを各時点で採取し（２００ｎｇ相当）、６×ローディングバッファーに加え、続いてドライアイス上で瞬間凍結させ、－８０Ｃで保管した。アリコートを、２％ＴＢＥアガロースゲルを用いた１００Ｖで２０分間のゲル電気泳動を使用して分析した。
ｓｉＲＮＡ安定性アッセイを使用してｓｉＲＮＡのヌクレアーゼに対する抵抗性及び安定性を計測した。４μｇのｓｉＲＮＡを（２０μＬのヌクレアーゼ非含有水の中に）含有するストックをウシ胎児血清（インビトロジェン）に添加して１００μｌの全体積に対して８０％ＦＢＳとし、試料を３７Ｃに一定させてインキュベートした。使用した時点は以下すなわち０、０．５、１、２、４、６、２４、４８、７２、及び７８時間とした。５μｌのアリコートを各時点で採取し（２００ｎｇ相当）、６×ローディングバッファーに加え、続いてドライアイス上で瞬間凍結させ、－８０Ｃで保管した。アリコートを、２％ＴＢＥアガロースゲルを用いた１００Ｖで２０分間のゲル電気泳動を使用して分析した。
【0222】
＜結果＞
未改変のｓｉＬｕｃは、使用した３’突出端の種類（ｄＴｄＴ又はｎＮｒＮ）にかかわらずルシフェラーゼ発現の顕著なノックダウンを引き起こした（図３）。ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ１の化学的改変によりｓｉＲＮＡは不活化され、したがってノックダウンは観察されなかった。対してｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ２は性能が損なわれ、未改変のｓｉＲＮＡより２７％低い平均ノックダウンを示した。最後に、ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３は全ての化学的改変バリアントの中で最も優れた性能を示し、未改変のｓｉＬｕｃと比較した場合に最小のノックダウン低下は１％未満、最大のノックダウン低下は１８％、全体で平均１０％低い活性を備えていた。ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３及び未改変のｓｉＬｕｃ‐ｄＴｄＴの完全な力価測定についても分析し、化学的改変が配列に適用されると一貫して悪影響があり、１ｎＭより高い用量及び０．１ｎＭ用量において重なり始めることが実証された（図７）。この活性のわずかな差は、ｓｉＲＮＡの濃度が０．１～１０ｎＭに固定されているというトランスフェクション条件の一方で配列各々の分子量は変化した（未改変のｓｉＬｕｃ‐ｄＴｄＴは１３３４５ｇ／ｍｏｌであり、ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３は１３５６３ｇ／ｍｏｌである）結果であるとも考えられる。
未改変のｓｉＬｕｃは、使用した３’突出端の種類（ｄＴｄＴ又はｎＮｒＮ）にかかわらずルシフェラーゼ発現の顕著なノックダウンを引き起こした（図３）。ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ１の化学的改変によりｓｉＲＮＡは不活化され、したがってノックダウンは観察されなかった。対してｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ２は性能が損なわれ、未改変のｓｉＲＮＡより２７％低い平均ノックダウンを示した。最後に、ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３は全ての化学的改変バリアントの中で最も優れた性能を示し、未改変のｓｉＬｕｃと比較した場合に最小のノックダウン低下は１％未満、最大のノックダウン低下は１８％、全体で平均１０％低い活性を備えていた。ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３及び未改変のｓｉＬｕｃ‐ｄＴｄＴの完全な力価測定についても分析し、化学的改変が配列に適用されると一貫して悪影響があり、１ｎＭより高い用量及び０．１ｎＭ用量において重なり始めることが実証された（図７）。この活性のわずかな差は、ｓｉＲＮＡの濃度が０．１～１０ｎＭに固定されているというトランスフェクション条件の一方で配列各々の分子量は変化した（未改変のｓｉＬｕｃ‐ｄＴｄＴは１３３４５ｇ／ｍｏｌであり、ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３は１３５６３ｇ／ｍｏｌである）結果であるとも考えられる。
【0223】
いくつかの化学的改変は、ｓｉＲＮＡの安定性を高めることが観察された（図８）。ｒＮｒＮは６時間以内にほぼ完全に分解し、よってｄＴｄＴ突出端を備えたｓｉＲＮＡ及び化学的に改変されたバリアントほどは安定でないことを示した。６時間のインキュベーション後には標準設計（ｓｉＬｕｃ‐ｄＴｄＴ）の分解されていないｓｉＲＮＡがごく少量だけ検出されたが、この配列は２４時間で完全に分解された。２４時間の時点で、ｓｉＬｕｃ２‐ｍｏｄ１は分解されずに残っているｓｉＲＮＡがごく少量だけであることを示したので、２’ＯＭｅのみを用いた部分的な化学的改変はヌクレアーゼ抵抗性に対してほとんど効果がなかった。対照的に、最大限改変されたｓｉＬｕｃ２‐ｍｏｄ２は０～２４時間では安定性を示した一方、４８～７２時間では量が減り始めた。しかしながら、この化学的改変はノックダウンについてかなりの相対的低下を引き起こし、ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３よりも劣る候補となってしまうと結論された。最も性能が優れたバリアントはｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３であり、２４時間まで強い安定性を示し、４８～７２時間ではより少ない量のｓｉＲＮＡが安定なｓｉＲＮＡのままであった。７８時間の時点を追加して別のアガロースゲルで視覚化すると、ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ２及びｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３の両方が未分解のｓｉＲＮＡをわずかに残していてｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３のほうがより多く、従って最も安定性が高いことを示していることが実証された（図９）。
【0224】
結果に基づくと、最も性能が優れた化学的改変物はｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３であることが確認され、ｓｉＬｕｃ‐ｍｏｄ３は、配列への化学的改変の導入により引き起こされるサイレンシング活性の低下を最小限としつつ顕著に改善された安定性を示した。よって、いくつかの実施形態では、この化学的改変がＴＧＦＢＩ‐Ｒ１２４Ｈ ｓｉＲＮＡ候補に対して適用される。
【0225】
［実施形態］
実施形態１。配列番号１～１９のうち１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖を含んでいるリボ核酸（ＲＮＡ）複合体。
実施形態１。配列番号１～１９のうち１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖を含んでいるリボ核酸（ＲＮＡ）複合体。
【0226】
実施形態２。鎖は配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0227】
実施形態３。鎖は、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0228】
実施形態４。鎖は、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のシチジン１リン酸（ｒＣ）、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のウリジン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＣ）、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル化グアノシン１リン酸（ｏＧ‐ｏＧ）、及び配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0229】
実施形態５。ＲＮＡ複合体は配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0230】
実施形態６。ＲＮＡ複合体は配列番号２３の配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0231】
実施形態７。ＲＮＡ複合体は配列番号２３の配列で構成される鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0232】
実施形態８。鎖は配列番号４の配列を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0233】
実施形態９。鎖は、配列番号４の配列の５’末端の突出端又は配列番号４の配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0234】
実施形態１０。鎖は、配列番号４の配列の５’末端のシチジン１リン酸（ｒＣ）、配列番号４の配列の５’末端のウリジン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＣ）、配列番号４の配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号４の配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号４の配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル化グアノシン１リン酸（ｏＧ‐ｏＧ）、及び配列番号４の配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0235】
実施形態１１。ＲＮＡ複合体は、野生型の１２４ＣのＴＧＦＢＩ遺伝子と比較して少なくとも１つのＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位を各々含んでいる第１鎖及び第２鎖を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0236】
実施形態１２。第１鎖は、１個の塩基が第２鎖の相対する塩基に対してミスマッチであることを除いて配列番号４の配列と同一の配列を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0237】
実施形態１３。第１鎖及び第２鎖は各々が１個のＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0238】
実施形態１４。ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から３～７塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0239】
実施形態１５。ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から３塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0240】
実施形態１６。ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から４塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0241】
実施形態１７。ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から５塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0242】
実施形態１８。ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から６塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0243】
実施形態１９。ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から７塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0244】
実施形態２０。第１鎖及び第２鎖は各々が１６～２３塩基の長さである、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0245】
実施形態２１。第１鎖及び第２鎖は各々が２２塩基の長さである、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0246】
実施形態２２。ＲＮＡ複合体はデオキシチミジンの突出端を有する、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0247】
実施形態２３。第１鎖は、１個の塩基が第２鎖の相対する塩基に対してミスマッチであることを除いて配列番号９の配列と同一の配列を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0248】
実施形態２４。第１鎖及び第２鎖は各々が１個のＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0249】
実施形態２５。ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から３～７塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0250】
実施形態２６。ミスマッチである塩基はＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ突然変異部位から３塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0251】
実施形態２７。ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から４塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0252】
実施形態２８。ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から５塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0253】
実施形態２９。ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から６塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0254】
実施形態３０。ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から７塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0255】
実施形態３１。第１鎖及び第２鎖は各々が１６～２３塩基の長さである、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0256】
実施形態３２。第１鎖及び第２鎖は各々が２２塩基の長さである、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0257】
実施形態３３。ＲＮＡ複合体はデオキシチミジンの突出端を有する、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0258】
実施形態３４。第１鎖は、１個の塩基が第２鎖の相対する塩基に対してミスマッチであることを除いて配列番号１１の配列と同一の配列を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0259】
実施形態３５。第１鎖及び第２鎖は各々が１個のＲ１２４Ｈ突然変異部位を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0260】
実施形態３６。ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から３～７塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0261】
実施形態３７。ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から３塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0262】
実施形態３８。ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から４塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0263】
実施形態３９。ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から５塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0264】
実施形態４０。ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から６塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0265】
実施形態４１。ミスマッチである塩基はＲ１２４Ｈ突然変異部位から７塩基離れている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0266】
実施形態４２。第１鎖及び第２鎖は各々が１６～２３塩基の長さである、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0267】
実施形態４３。第１鎖及び第２鎖は各々が２２塩基の長さである、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0268】
実施形態４４。ＲＮＡ複合体はデオキシチミジンの突出端を有する、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0269】
実施形態４５。ＲＮＡ複合体は配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0270】
実施形態４６。ＲＮＡ複合体は配列番号２３の配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0271】
実施形態４７。ＲＮＡ複合体は配列番号２３の配列で構成される鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0272】
実施形態４８。鎖は配列番号４の配列で構成される、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0273】
実施形態４９。ＲＮＡ複合体は配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0274】
実施形態５０。ＲＮＡ複合体は配列番号２３の配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0275】
実施形態５１。ＲＮＡ複合体は配列番号２３の配列で構成される鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0276】
実施形態５２。鎖は配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0277】
実施形態５３。鎖は、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0278】
実施形態５４。鎖は、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のアデノシン１リン酸（ｒＡ）、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のウリジン１リン酸‐アデノシン１リン酸（ｒＵ‐ｒＡ）、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたシチジン１リン酸‐ウリジン１リン酸（ｏＣ‐ｏＵ）、及び配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0279】
実施形態５５。ＲＮＡ複合体は配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0280】
実施形態５６。ＲＮＡ複合体は配列番号３０の配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0281】
実施形態５７。ＲＮＡ複合体は配列番号３０の配列で構成される鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0282】
実施形態５８。鎖は配列番号１１の配列を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0283】
実施形態５９。鎖は、配列番号１１の配列の５’末端の突出端又は配列番号１１の配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0284】
実施形態６０。鎖は、配列番号１１の配列の５’末端のアデノシン１リン酸（ｒＡ）、配列番号１１の配列の５’末端のウリジン１リン酸‐アデノシン１リン酸（ｒＵ‐ｒＡ）、配列番号１１の配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号１１の配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号１１の配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたシチジン１リン酸‐ウリジン１リン酸（ｏＣ‐ｏＵ）、及び配列番号１１の配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0285】
実施形態６１。ＲＮＡ複合体は配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0286】
実施形態６２。ＲＮＡ複合体は配列番号３０の配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0287】
実施形態６３。ＲＮＡ複合体は配列番号３０の配列で構成される鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0288】
実施形態６４。鎖は配列番号１１の配列で構成される、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0289】
実施形態６５。ＲＮＡ複合体は配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0290】
実施形態６６。ＲＮＡ複合体は配列番号３０の配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0291】
実施形態６７。ＲＮＡ複合体は配列番号３０の配列で構成される鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0292】
実施形態６８。鎖は配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0293】
実施形態６９。鎖は、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0294】
実施形態７０。鎖は、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端のグアノシン１リン酸（ｒＧ）、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の２個のグアノシン１リン酸（ｒＧ‐ｒＧ）、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたグアノシン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｏＧ‐ｏＣ）、及び配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0295】
実施形態７１。ＲＮＡ複合体は配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0296】
実施形態７２。ＲＮＡ複合体は配列番号３５の配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0297】
実施形態７３。ＲＮＡ複合体は配列番号３５の配列で構成される鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0298】
実施形態７４。鎖は配列番号１６の配列を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0299】
実施形態７５。鎖は、配列番号１６の配列の５’末端の突出端又は配列番号１６の配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0300】
実施形態７６。鎖は、配列番号１６の配列の５’末端のグアノシン１リン酸（ｒＧ）、配列番号１６の配列の５’末端の２個のグアノシン１リン酸（ｒＧ‐ｒＧ）、配列番号１６の配列の３’末端の２個のウリジン１リン酸（ｒＵ‐ｒＵ）、配列番号１６の配列の３’末端の２個のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴ‐ｄＴ）、配列番号１６の配列の３’末端の２’‐Ｏ‐メチル化されたグアノシン１リン酸‐シチジン１リン酸（ｏＧ‐ｏＣ）、及び配列番号１６の配列の３’末端の２個の２’‐Ｏ‐メチル‐ウリジン１リン酸（ｏＵ‐ｏＵ）、のうち少なくとも１つを備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0301】
実施形態７７。ＲＮＡ複合体は配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0302】
実施形態７８。ＲＮＡ複合体は配列番号３５の配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0303】
実施形態７９。ＲＮＡ複合体は配列番号３５の配列で構成される鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0304】
実施形態８０。鎖は配列番号１６の配列で構成される、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0305】
実施形態８１。ＲＮＡ複合体は配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0306】
実施形態８２。ＲＮＡ複合体は配列番号３５の配列を含む鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0307】
実施形態８３。ＲＮＡ複合体は配列番号３５の配列で構成される鎖をさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0308】
実施形態８４。配列番号２０～３８のうち１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む鎖を含んでいるリボ核酸（ＲＮＡ）複合体。
【0309】
実施形態８５。鎖は配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0310】
実施形態８６。鎖は、配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号２３に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0311】
実施形態８７。鎖は配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0312】
実施形態８８。鎖は、配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号３０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0313】
実施形態８９。鎖は配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0314】
実施形態９０。鎖は、配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の５’末端の突出端、又は配列番号３５に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の３’末端の突出端のうち少なくとも一方を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0315】
実施形態９１。トランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）タンパク質のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列と重複する配列を有する鎖であってＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞Ａという一塩基多型（ＳＮＰ）に対応する位置にアデニンを含んでいる鎖を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）複合体。
【0316】
実施形態９２。センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖のうち少なくとも一方はｄＴｄＴ突出端を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）複合体。
【0317】
実施形態９３。センス鎖及びアンチセンス鎖は各々がｄＴｄＴ突出端を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0318】
実施形態９４。センス鎖は突出端としてＧＧヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は突出端としてＵＣヌクレオチドを含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0319】
実施形態９５。（ａ）センス鎖は一連の繰り返される２’‐ＯＭｅを含み、かつ（ｂ）アンチセンス鎖は２’‐ＯＭｅを含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0320】
実施形態９６。（ａ）センス鎖は、１５個の塩基と、交互パターンをなす２’‐ＯＭｅ及び２’‐Ｆとを含み、かつ（ｂ）アンチセンス鎖は交互パターンをなす２’‐ＯＭｅ及び２’‐Ｆを含み；ＲＮＡ複合体は、センス鎖及びアンチセンス鎖両方の３’及び５’末端に追加のホスホロチオエート結合を含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0321】
実施形態９７。（ａ）センス鎖は、５’末端に２ユニットの２’‐ＯＭｅ、及び９位以外のＵ又はＧ残基のいずれかに少なくとも２個の２’‐ＯＭｅ修飾を含み；かつ（ｂ）アンチセンス鎖は、５’末端から２番目の位置に１個の２’‐ＯＭｅ、ｄＴｄＴ突出端にＰＳ結合を含み、すべてのピリミジンが２’Ｆ‐ＲＮＡユニットに置換されている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0322】
実施形態９８。ＲＮＡ複合体は短鎖干渉ＲＮＡ二重鎖を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0323】
実施形態９９。ＲＮＡ複合体は、短鎖干渉ＲＮＡ二重鎖を形成するために構成された二本鎖ＲＮＡ複合体を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0324】
実施形態１００。ＲＮＡ複合体はＲＮＡヘアピンを備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかのＲＮＡ複合体。
【0325】
実施形態１０１。対象者に対して本明細書中に記載の任意のＲＮＡ複合体を投与するステップを含む、対象者の顆粒状角膜変性症２型を予防、改善、又は治療する方法。
【0326】
実施形態１０２。投与するステップはＲＮＡ複合体を対象者に注射することを含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかの方法。
【0327】
実施形態１０３。投与するステップはＲＮＡ複合体を含有する溶液を対象者に対して施用することを含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかの方法。
【0328】
実施形態１０４。投与するステップは、ＲＮＡ複合体を、トランスフォーミング増殖因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞Ａという一塩基多型（ＳＮＰ）を有しているデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含有及び発現している細胞に導入することを含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかの方法。
【0329】
実施形態１０５。対象者は脊椎動物である、上記又は下記の実施形態のうちいずれかの方法。
【0330】
実施形態１０６。対象者はヒトである、上記又は下記の実施形態のうちいずれかの方法。
【0331】
実施形態１０７。方法は、対象者にＲＮＡ複合体を投与するステップの前に：対象者の配列情報を入手するステップ；及び、対象者がＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞ＡというＳＮＰを有するアレルと、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞ＡというＳＮＰを有していないアレルとを有することを判定するステップをさらに含む、上記又は下記の実施形態のうちいずれかの方法。
【0332】
実施形態１０８。対象者の配列情報はＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４の配列情報で構成される、上記又は下記の実施形態のうちいずれかの方法。
【0333】
実施形態１０９。対象者の配列情報は、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のうち全部ではなく一部の配列情報を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかの方法。
【0334】
実施形態１１０。対象者の配列情報は、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエキソン４のｃ．３７１Ｇ＞ＡというＳＮＰの配列情報のみを備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかの方法。
【0335】
実施形態１１１。対象者の配列情報は、対象者の全ゲノムの配列情報を備えている、上記又は下記の実施形態のうちいずれかの方法。
【0336】
別段の指示のないかぎり、明細書及び特許請求の範囲において使用される成分量、分子量のような特性、反応条件などを表現する全ての数字は、いかなる場合でも「約」という用語で修飾されているものとして理解されなければならない。従って、相反する指示のないかぎり、明細書及び添付の特許請求の範囲において記載される数的パラメータは、本開示により得られるように求められた所望の特性に応じて変化してもよい。最低限でも、かつ特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとするものではなく、各々の数的パラメータは少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、かつ通常の丸め方を適用して、解釈されるべきである。
【0337】
本開示の広い範囲を示している数的な範囲及びパラメータは近似値であるものの、具体的な実施例において示される数値は可能なかぎり正確に報告されている。しかしながら、いかなる数値も、それぞれの実験計測値に見られる標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を本質的に包含している。
【0338】
本開示について説明する状況において（特に以降の特許請求の範囲に関連して）使用される用語「１つの（a）」、「１つの（an）」、「その（the）」及び同様の指示対象は、本明細書中に別段の指示があるか又は文脈から明白に否定されるのでないかぎり、単数及び複数の両方を対象とすると解釈されるべきである。本明細書中における値の範囲についての記述は、その範囲内にある各々の個別の値に個々に言及する簡便な方法としての役割を果たすように意図されているにすぎない。本明細書中に別段の指示がないかぎり、個々の値はそれぞれ、その値があたかも本明細書中に個々に記述されているかのように明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載された方法は全て、本明細書中に別段の指示があるか又は他の点で文脈から明白に否定されるのでないかぎり、任意の適切な順序で実施することが可能である。本明細書中に提供されるあらゆる実施例、又は例示の言葉（例えば「のような」）の使用は、単に本開示の理解をより容易にするように意図されており、他の形で特許請求の範囲に記載された本開示の範囲に対する限定を提示するものではない。明細書中のいずれの言葉も、本開示の実行にとって不可欠な特許請求の範囲に記載されていない何らかの要素を示していると解釈されるべきではない。
【0339】
本明細書中に開示された本開示の別例の要素又は実施形態がグループ化されても限定として解釈されるべきではない。グループを構成する各々の要素は、個々に、又はグループの他の構成要素や本明細書中に見出される他の要素との任意の組み合わせで、言及すること及び特許請求の範囲に記載することが可能である。便宜上及び／又は特許性の理由から、グループの１以上の構成要素がグループに包含されるか又はグループから削除される可能性があることは予想されることである。何らかのそのような包含又は削除が生じた場合、明細書は、そのグループを修正されたものとして、したがって添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュグループの書面による説明を満たすものとして、含有するとみなされる。
【0340】
本開示のある一定の実施形態が、本開示の実行のための本発明者らが承知している最良の態様を含めて、本明細書に記載されている。当然ながら、これらの記載された実施形態の変形形態は、先述の説明を読めば当業者には明白となろう。本発明者は当業者がそのような変形形態を必要に応じて使用することを見込んでおり、かつ本発明者らは本開示が本明細書中に具体的に記載されたのとは別の形で実行されることを意図している。従って本開示は、適用法で認められるように本明細書に添付された特許請求の範囲に記述された主題の改変形態及び等価物を全て含む。さらに、上記要素のあらゆる可能な変形形態における任意の組み合わせも、本明細書中に別段の指示があるか又は他の形で文脈から明白に否定されるのでないかぎり、本開示によって包含される。
【0341】
本明細書中に開示された特定の実施形態は、特許請求の範囲において、「～で構成される（consisting of）」又は「～で本質的に構成される（consisting essentially of）」という言葉を使用してさらに限定される可能性がある。特許請求の範囲において使用される場合、出願時であるか補正による追加であるかに関わらず、結びの語句（transition term）「～で構成される」は、請求項において特定されないいかなる要素、ステップ、又は成分も除外する。結びの語句「～で本質的に構成される」は、請求項の範囲を、特定された材料又はステップ及び基本的かつ新規な特徴を実質的にもたらさないものに限定する。そのように特許請求の範囲に記載された本開示の実施形態は、本明細書中に本来的かつ明白に記載されており、かつ利用可能である。
【0342】
本明細書中に開示された本開示の実施形態が本開示の原理の例証であることは理解されるはずである。使用可能なその他の改変形態は本開示の範囲内にある。よって、例として、ただし限定するものではないが、本開示の別例の構成を本明細書中の教示に従って利用することができる。従って本開示は、図示及び記載された全くそのとおりのものに限定はされない。
【0343】
本開示について、様々な具体的な材料、方法及び実施例に言及することにより本明細書中に記載及び例証してきたが、本開示はその目的のために選択された材料及び方法の特定の組み合わせに限定されないものと了解される。そのような細部の数多くの変形形態が、当業者に認識されるように黙示されることが可能である。詳説及び実施例は、以降の特許請求の範囲によって本開示の真の範囲及び思想が示されたうえでの例示にすぎないと見なされるように意図されている。本出願において参照された参考文献、特許文献、及び特許出願は全て、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【国際調査報告】