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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-13
(54)【発明の名称】フィブリノゲン製剤の製造方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/75 20060101AFI20230206BHJP
A61K 38/36 20060101ALI20230206BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20230206BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20230206BHJP
C07K 1/18 20060101ALN20230206BHJP
【ＦＩ】
C07K14/75
A61K38/36
A61K9/19
A61P7/04
C07K1/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022535244
(86)(22)【出願日】2020-12-08
(85)【翻訳文提出日】2022-07-28
(86)【国際出願番号】 EP2020085094
(87)【国際公開番号】W WO2021116110
(87)【国際公開日】2021-06-17
(31)【優先権主張番号】19214919.3
(32)【優先日】2019-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】595107379
【氏名又は名称】ビオテスト・アクチエンゲゼルシャフト
【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏｔｅｓｔ ＡＧ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】オット，ヴェラ
(72)【発明者】
【氏名】メラー，ヴォルフガング
(72)【発明者】
【氏名】マネーク，オリヴァー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA29
4C076CC14
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA06
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA44
4C084DC11
4C084NA05
4C084NA20
4C084ZA53
4H045AA10
4H045AA20
4H045CA40
4H045DA65
4H045EA20
4H045GA23
(57)【要約】
本発明は、血漿由来フィブリノゲン含有ソースからフィブリノゲン製剤を製造することに関する。この方法は、血漿フィブリノゲンを含む液相を提供するステップ；前記液相を陽イオン交換クロマトグラフィー材料と、フィブリノゲンの結合をもたらす条件下に接触させるステップ；ここで、該液相は、フィブリノゲンのｐＩに近いまたはそれよりも高いｐＨ５．６～ｐＨ７．０の範囲のｐＨを有する；場合により、未結合化合物を陽イオン交換クロマトグラフィー材料から洗い流すステップ；フィブリノゲンを陽イオン交換材料から溶離させるステップ、を含む。本発明の方法は、フォン・ヴィルブランド因子の低減のためにも適当である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血漿由来フィブリノゲン含有ソースからフィブリノゲン製剤を製造する、以下のステップを含む方法：ａ）血漿フィブリノゲンを含む液相を提供するステップ；
ｂ）前記液相を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）材料と、フィブリノゲンの結合をもたらす条件下に接触させるステップ；ここで、該液相は、５．６～７．０の範囲のｐＨを有する；
ｃ）場合により、未結合化合物を陽イオン交換クロマトグラフィー材料から洗い流すステップ；
ｄ）溶離バッファーを用いてフィブリノゲンを陽イオン交換材料から溶離させるステップ。
【請求項2】
該プロセスが、前記ソースがフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）を含む場合にフォン・ヴィルブランド因子の量を低減するために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
該プロセスが、プリオンの量を低減するために用いられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ステップｂ）の液相のｐＨが６．３～６．９、より好ましくはｐＨ６．４～６．８の範囲である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
ステップｂ）の液相が、５～１５ｍＳ／ｃｍ、好ましくは７～１１ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは８～１０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、強陽イオン交換クロマトグラフィー材料である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料がマクロポーラス材料である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、スルホネート官能基、好ましくはスルホプロピル基を含む材料である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、スルホネート官能基がポリヒドロキシル表面を介してスルホプロピルとして結合している架橋ポリスチレンジビニルベンゼンからなる樹脂骨格を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
洗い流しが、５．６～７．０の範囲のｐＨ、および５～１５ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する洗浄バッファーを用いて行われる、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
溶離が、フィブリノゲンの結合をもたらす条件よりも少なくとも０．２単位高いｐＨを有する溶離バッファーを用いて行われる、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
溶離が、フィブリノゲンの結合をもたらす条件よりも少なくとも２ｍＳ／ｃｍ高いイオン強度を有する溶離バッファーを用いて行われる、請求項１～１１のいずれか、特に請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
溶離バッファーが１つ以上の医薬製剤化合物を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
医薬製剤化合物が、少なくとも１つのアミノ酸、好ましくはアルギニンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
該方法が、フィブリノゲンを医薬組成物に製剤化するステップｅ）を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
該製造方法が、下記ステップの少なくとも１つをさらに含む、請求項１～１５のいずれかに記載の方法：出発材料としてのヒト血漿のクリオプレシピテートの使用；
Ａｌ（ＯＨ）３吸着；
Ｓ／Ｄ処理；
陰イオン交換クロマトグラフィー、およびフロースルーの使用；
グリシン沈殿；
ＵＶ－Ｃ処理；
限外濾過；
凍結乾燥；
乾熱処理。
【請求項17】
請求項１６に挙げられるステップが行われ、請求項１～１４のいずれかに記載される陽イオン交換クロマトグラフィーステップが、ＵＶ－Ｃ処理と限外濾過との間に行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれかに記載の方法、好ましくは請求項１７に記載の方法によって得られるフィブリノゲン製剤。
【請求項19】
該フィブリノゲン製剤が、０．５～２．０FＸIII：Ａｇ（% of norm）のFＸIII濃度、および／または１６FＸIII：Ａｃ（% of norm）未満のFＸIII活性を有する、請求項１８に記載のフィブリノゲン製剤。
【請求項20】
該フィブリノゲン製剤が、検出可能な量のＤダイマーを示さない、請求項１８または１９に記載のフィブリノゲン製剤。
【請求項21】
請求項１８～２０のいずれかに記載のフィブリノゲン製剤から得られる医薬組成物。
【請求項22】
凍結乾燥物である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項23】
止血異常の処置、または出血の予防もしくは治療用である、請求項２１または２２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血漿由来のフィブリノゲン含有ソースからのフィブリノゲン製剤の製造に関する。
【背景技術】
【0002】
フィブリノゲンは、血餅の形成に関与する血液中の主要な構造タンパク質である。これは止血異常の処置のために非常に重要である。
【0003】
フィブリノゲンの重要なソースは、血漿、特にヒト血漿からのその単離である。この精製中に、血漿のまたは製造法による他の成分は、特定の純粋な凝固血液プロダクトを得る目的のために除去されなければならない。そのような他の成分は通常、他の血漿タンパク質、特にフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）である。
【0004】
血漿からのフィブリノゲンの精製は通常、沈殿法とその後のクロマトグラフ法および溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）のようなウイルス不活化ステップおよび／または濾過のようなウイルス除去ステップの組み合わせによって行われる。したがって、他の血漿タンパク質だけでなく、先のプロセスステップで使用された試薬または添加物も除去することが重要である。
【0005】
ＷＯ００／１７２３４Ａ１／ＥＰ１１１５７４２Ｂ１には、トランスジェニック動物の乳から、製剤から乳タンパク質カゼインを除去するために陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を使用して、組換えフィブリノゲンを精製することが開示されている。
【0006】
ＷＯ９８／３８２１９Ａ１には、陽イオン交換クロマトグラフィーの負に荷電したゲルマトリックスを使用して、ｖＷＦ（等電点５．５～６）を精製することが開示されている。ｖＷＦは低塩濃度で陽イオン交換体に結合され、５．０～８．５の範囲のｐＨを有するバッファーで溶出される。
【0007】
ＷＯ９１／０１８０８Ａ１には、全血、血漿または血清のような水性液体から、ＬＤＬ、フィブリノゲンおよび／または尿素を選択的に除去することが開示されている。この方法は、グラフトコポリマーを形成するスルホネート基を含むモノマーのポリマー鎖で修飾されたFractogel（登録商標）材料（Ｍｅｒｃｋ， Ｇｅｒｍａｎｙ）をベースとする吸着材料（テンタクル陽イオン交換材料）を使用する。該陽イオン交換材料の特異的吸着特性は、テンタクル様リガンド構造の存在に依存する。
【0008】
ＥＰ２２６７０２５Ａ２には、フィブリノゲンの精製にＣＥＸを使用することが記載されている。フィブリノゲンはＣＥＸマトリックスに結合しない。
【発明の概要】
【0009】
本発明の課題は、フィブリノゲンの容易かつ効率的な精製を、好ましくは性質の改善と共に可能にする、血漿由来フィブリノゲン含有ソースからフィブリノゲン製剤を製造する方法を提供することである。
【0010】
前記課題は、特許請求の範囲の独立請求項に記載される発明によって解決される。該目的は、血漿由来フィブリノゲン含有ソースからフィブリノゲン製剤を製造する、以下のステップを含む方法によって達成される：
ａ）血漿フィブリノゲンを含む液相を提供するステップ；
ｂ）前記液相を陽イオン交換クロマトグラフィー材料と、フィブリノゲンの結合をもたらす条件下に接触させるステップ；ここで、該液相は、フィブリノゲンのｐＩに近いまたはそれよりも高いｐＨ５．６～ｐＨ７．０の範囲のｐＨを有する；
ｃ）場合により、未結合化合物を陽イオン交換クロマトグラフィー材料から洗い流すステップ；
ｄ）フィブリノゲンを陽イオン交換材料から溶離させるステップ。
ａ）血漿フィブリノゲンを含む液相を提供するステップ；
ｂ）前記液相を陽イオン交換クロマトグラフィー材料と、フィブリノゲンの結合をもたらす条件下に接触させるステップ；ここで、該液相は、フィブリノゲンのｐＩに近いまたはそれよりも高いｐＨ５．６～ｐＨ７．０の範囲のｐＨを有する；
ｃ）場合により、未結合化合物を陽イオン交換クロマトグラフィー材料から洗い流すステップ；
ｄ）フィブリノゲンを陽イオン交換材料から溶離させるステップ。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明の目的は、下記に説明する方法によっても達成される。下記において、方法の個々のステップをより詳細に説明する。ステップは、必ずしも本書に記載する順序で行う必要はない。また、明示的に記載していないさらなるステップが、方法の一部をなしうる。
【0012】
本書において、用語「フィブリノゲン」は、血漿中に存在する血餅形成に関与する主要な構造タンパク質をいい、好ましくは糖タンパク質形態のフィブリノゲン全体をいう。好ましくは、これは血漿フィブリノゲン、すなわち血漿由来のフィブリノゲンをさす。より好ましくは、これはヒト血漿フィブリノゲンである。
【0013】
タンパク質のｐＩまたは等電点（ＩＥＰ）は、タンパク質が正味の電荷を持たないｐＨの値である。ｐＩよりも高いｐＨ値では、タンパク質は正味の負電荷を有し、ｐＩよりも低いｐＨ値では、タンパク質は正味の正電荷を有する。本書において、フィブリノゲンのｐＩは、例えばＷＯ００／１７２３４Ａ１に記載されるとおりのｐＨ５．５である。いくつかの他の文献によると、フィブリノゲンのｐＩは、トロンビンによる凝固反応における極性残基の切断に応じて、約ｐＨ５．５～６．０の範囲である（Guo et al. nature nanotechnology 2016, 11, 817-824）。
【0014】
本書において「陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）材料」は、負に荷電した基を含む固相である。タンパク質は、樹脂の負に荷電した基とタンパク質の正に荷電した基との相互作用に基づいて分離される。相互作用の強度は、バッファーのイオン強度（すなわち導電率）にも依存する。溶離は通常、バッファーのイオン強度を、陽イオン交換材料の荷電部位をタンパク質と競合するように高めることによってなされる。タンパク質を溶離させるもう１つの方法として、ｐＨを変化させ、それによってタンパク質の電荷を変化させることがある。導電率および／またはｐＨの変化は、徐々に、または段階的に行いうる。
【0015】
ＣＥＸ材料の電荷は、固相への１つ以上の荷電リガンドの、例えば共有結合による結合によって提供されうる。本発明において好ましいＣＥＸ材料は、強ＣＥＸ材料である。これは、固相上の負電荷を、広いｐＨ範囲にわたって維持する材料である。これは通常、スルホエチル、スルホプロピル、スルホブチルまたはスルホイソブチル基のようなスルホン酸誘導体を官能基として含む（例えば、スルホネート、Ｓ型、またはスルホプロピル基、ＳＰ型）。
【0016】
市販の陽イオン交換材料は、カルボキシ-メチル-セルロース、BAKERBOND ABX（商標）、アガロースにスルホプロピル（ＳＰ）が固定化されたもの（例えばSP-SEPHAROSE FAST FLOW（商標）、SP-SEPHAROSE FAST FLOW XL（商標）、またはSP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE（商標）、GE Healthcare）、CAPTO S（商標）（GE Healthcare）、アガロースにスルホニルが固定化されたもの（例えばS-SEPHAROSE FAST FLOW（商標）、GE Healthcare）、およびSUPER SP（商標）（Tosoh Biosciences）を包含する。本発明において好ましい陽イオン交換材料は、スルホプロピル基で官能化されたポリヒドロキシル化ポリマーでコーティングされた架橋ポリ（スチレン-ジビニルベンゼン）フロースルー粒子（固相）（例えばPOROS（商標）50 HSクロマトグラフィー樹脂、Thermo Fisher Scientific）、またはスルホン酸基を有するメタクリルコポリマー（例えばMacro-Prep（登録商標）High S、Bio-Rad）を包含する。特に好ましいＣＥＸ材料は、平均孔サイズが５０ｎｍ以上、好ましくは１００ｎｍ以上、例えば平均孔サイズが１６０ｎｍの孔を有するものである。
【0017】
従来のプロセスによると、当業者はＣＥＸ基材を、関心のタンパク質がＣＥＸ基材に結合するように、分離を行うための媒体のｐＨを関心のタンパク質のｐＩよりも低くするようにして使用する。
【0018】
「固相」は、１つ以上の荷電リガンドを付けることができる、非水性のマトリックスを意味する。固相は、精製カラム（エクスパンデッド・ベッドおよび充填層カラムを包含するが、それに限定されない）、個々の粒子の不連続相、膜、またはフィルター等でありうる。固相を形成する材料の例は、多糖（例えばアガロースおよびセルロース）、および他の機械的に安定なマトリックス、例えばシリカ（例えば制御多孔質ガラス）、ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）、メタクリレートコポリマー、ポリアクリルアミド、セラミック粒子、ならびに上記の任意のものの誘導体を包含し、好ましくはポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）およびメタクリレートコポリマーである。
【0019】
本書において用語「血漿フィブリノゲンを含む液相」とは、陽イオン交換材料にロードされる組成物をいう。好ましくは、陽イオン交換材料は、精製すべき組成物のローディング前に平衡化バッファーで平衡化される。
【0020】
「バッファー」は、その酸－塩基共役成分の作用によってｐＨ変化に抵抗する溶液である。所望のバッファーｐＨに応じてさまざまなバッファーを使用することができる。
【0021】
「平衡化バッファー」は、陽イオン交換材料を、フィブリノゲンを含む液相のローディング前に平衡化するために使用されるバッファーである。平衡化バッファーの組成は、使用されるＣＥＸ材料による。
【0022】
本書において用いられる用語「洗浄バッファー」とは、組成物のローディング後、ＣＥＸ材料に結合したフィブリノゲンの溶離の前に、陽イオン交換材料上に流されるバッファーをいう。洗浄バッファーは、陽イオン交換材料から、結合したフィブリノゲンを実質的に溶離することなく１つ以上の汚染物を除去するのに役立ちうる。結合フィブリノゲンの溶離の前に、１つ以上の洗浄バッファーを使用することができる。
【0023】
「溶離バッファー」は、固相からのフィブリノゲンの溶離に用いられる。本発明において溶離バッファーは、陽イオン交換材料からフィブリノゲンが溶離されるように、最終の洗浄バッファーよりも実質的に高い導電率および／または高いｐＨを有する。好ましくは、溶離バッファーの導電率および／またはｐＨは、フィブリノゲンを含む液相、および先に使用されたバッファー、すなわち使用された平衡化バッファーおよびすべての洗浄バッファーのそれぞれと比べて実質的に高い。「実質的により高い導電率」とは、例えば、バッファーが、比較される組成物またはバッファーよりも、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０導電率単位（ｍＳ／ｃｍ）だけ高い導電率を有することを意味する。「実質的により高いｐＨ」とは、例えば、バッファーが、比較される組成物またはバッファーよりも、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５ｐＨ単位だけ高いｐＨを有することを意味する。溶離のための条件は、使用されるＣＥＸ材料による。
【0024】
「再生バッファー」は、陽イオン交換材料を再使用可能とするよう再生するために用いられうる。再生バッファーは、陽イオン交換材料から、実質的にすべての汚染物および残留する可能性のあるフィブリノゲンを除去するのに必要な導電率および／またはｐＨを有する。
【0025】
用語「導電性」とは、水溶液が２つの電極間に電流を流す能力をいう。溶液中で、電流はイオンの輸送によって流れる。したがって、水溶液中に存在するイオンの量が多いほど、溶液は高い導電率を示しうる。導電率測定の基本単位は、通常ｍＳ／ｃｍで測定される１メートル当たりのジーメンス（Ｓ／ｍ）であり、導電率計を使用して測定しうる。導電性は電流を流す溶液中のイオンの能力であるから、溶液の導電率は、その中のイオン濃度の変化によって変化しうる。例えば、所望の導電率を達成するために、溶液中の緩衝剤の濃度および／または塩（例えば塩化ナトリウム、酢酸ナトリウムまたは塩化カリウム）の濃度を変えうる。好ましくは、さまざまなバッファーの塩濃度が、所望の導電率の達成のために調節される。さらに、有機陽イオン、好ましくはカチオン性アミノ酸、好ましくはアルギニンの塩が、特に塩酸塩として存在するとき、導電性に寄与しうる。
【0026】
用語「血漿由来のフィブリノゲン含有ソース」は、フィブリノゲンのソースが、血漿または血漿画分、好ましくはヒト血漿であることを規定する。特に、これは組換えまたは合成フィブリノゲンではない。さらには、これは、他の生物または液体における組換え産生によって製造されるものではない。血漿ソースはまた、アルブミン、フィブロネクチン、ＩｇＧ、ｖＷＦまたはフィブリノペプチドＡのような、関連する汚染物の存在の可能性を規定する。
【0027】
本発明のアプローチによるフィブリノゲン製剤の製造方法は、純度および活性プロファイルの改善を伴った、フィブリノゲンプロダクトの精製を可能にする。本方法は、フィブリノゲン製剤からｖＷＦを分離し、それによって得られる組成物中のｖＷＦ含量を低減するのに特に有用である。好ましくは、液相のｐＨがｐＨ５．６～７．０、好ましくはｐＨ６．０～６．９、より好ましくはｐＨ６．３～６．９であるステップｂ）において、フィブリノゲンおよびｖＷＦの両方が陽イオン交換クロマトグラフィー材料に結合する。ステップｄ）によってフィブリノゲンを材料から溶離させる際、ｖＷＦは陽イオン交換材料上に留まり、フィブリノゲンが選択的に溶離される。例えば、溶離は、クロマトグラフィーマトリックスへのｖＷＦの結合を維持しフィブリノゲンの選択的溶離を可能にするｐＨ７．０で行われる。
【0028】
一般論として、陽イオン交換クロマトグラフィーの方法的な理論に従えば、フィブリノゲンは、該関心のタンパク質のｐＩよりも高いｐＨでは、陽イオン交換クロマトグラフィー材料に結合しないはずである。したがって、例えばＥＰ２２６７０２５Ａ２は、フィブリノゲン精製方法における陽イオン交換クロマトグラフィーステップの適用を記載しているが、ここではフィブリノゲンは該マトリックスに結合しない。驚くべきことに、本発明者は、本発明において用いられる条件下に、特にフィブリノゲンのｐＩ値よりも高いｐＨ値において、フィブリノゲンが前記クロマトグラフィー材料に結合することを見出した。さらに、ｖＷＦも、フィブリノゲンと非常に近い等電点を示すにもかかわらず、前記クロマトグラフィー材料に結合する。ＷＯ９８／３８２１９Ａ１によれば、ｖＷＦの等電点は５．５～６の範囲である。したがって、第１に、両タンパク質が前記材料に結合すること、第２に、両タンパク質、特にフィブリノゲンが、両タンパク質の等電点が非常に近いにもかかわらず選択的に溶離されうることは、驚くべきことである。本発明者は、適用する特定の条件下に、ｖＷＦがフィブリノゲンよりもわずかに強く結合することを見出した。したがって、本発明の方法により、フィブリノゲンを選択的にカラムから溶離することが可能であり、該クロマトグラフィーステップを、フィブリノゲン製剤中のｖＷＦ量を効果的に低減するために適用しうる。したがって、本発明は、本書に記載される陽イオン交換クロマトグラフィーの使用によって、フィブリノゲンを含む組成物中のｖＷＦ量を低減するための方法にも関する。
【0029】
したがって、本発明の好ましい態様において、フィブリノゲンを含む液相はｖＷＦをさらに含む。本発明の方法は、ＯＤ２８０による総タンパク質測定で、ｖＷＦが少なくとも０．３Ｕ／ｍｇ総タンパク質（例えば、ＶＷＦ抗原によるＶＷＦレベルの評価）、例えば、少なくとも０．４Ｕ／ｍｇ総タンパク質以上の量で存在する液相に使用しうる。好ましい態様において、液相中のｖＷＦ含量は、約０．４～１．０Ｕ／ｍｇ総タンパク質である。ｖＷＦ含量は、フィブリノゲンのソース、および先行の精製ステップによる。したがって、ｖＷＦ含量は、より高いことがありうる。
【0030】
好ましい態様において、ＣＥＸ材料にロードされる液相は、すでに部分的に精製されているフィブリノゲン製剤である。部分的に精製されたフィブリノゲン製剤は、フィブリノゲンを９０％以上、好ましくは９５％以上含みうる。好ましい態様において、液相はフィブリノゲン以外のタンパク質、好ましくは他の血漿タンパク質を、１０％未満、好ましくは５％未満の量で含む。ＣＥＸ材料にロードされる液相中のｖＷＦの量は、例えば、０．４～１．０Ｕ／ｍｇ総タンパク質でありうる。好ましくは、ロード材料のｖＷＦ含量は、少なくとも０．５Ｕ／ｍｇ総タンパク質、好ましくは０．５～１．０Ｕ／ｍｇ総タンパク質である。
【0031】
さらに、本発明の方法は、フィブリノゲン製剤中のプリオンの量を低減するために特に有用である。本発明者は、本書に記載される陽イオン交換クロマトグラフィーステップによって、プリオンが検出限界未満まで効果的に除去されることを示すことができた。この効果を示すために、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病の十分に確立された試験モデルであるハムスターのプリオンがスパイク実験に用いられている。したがって、本発明は、本書に記載される陽イオン交換クロマトグラフィーの使用によって、フィブリノゲンを含む組成物中のプリオンを除去または低減するための方法にも関する。
【0032】
フィブリノゲンを含む液相は、好ましくは水相である。液相は、１つ以上の、ポリソルベート８０のような界面活性剤および／またはトリブチルホスフェート（ＴｎＢＰ）のような溶媒をさらに含みうる。そのような界面活性剤および溶媒は、先行のウイルス除去のためのＳ／Ｄ処理によって存在しうる。先行の製造ステップに由来しうる、製剤中のそのような他の望ましくない化合物の除去、例えば先行のＳ／Ｄ処理のような先行のウイルス不活化ステップに由来する界面活性剤および／または溶媒の除去も可能であることが、本発明の方法の大きな利点である。
【0033】
好ましい態様において、フィブリノゲン含有ソースを、ウイルス不活化プロセス、例えば溶媒界面活性剤プロセス（Ｓ／Ｄ処理）に付す。
【0034】
好ましい態様において、液相は、グリシン沈殿の沈殿物を再懸濁することによって調製する。
【0035】
液相は、陽イオン交換クロマトグラフィー材料と、フィブリノゲンの結合をもたらす条件下に接触させ、ここで液相は、５．６～７．０のｐＨを有する。ローディング前に液相のｐＨおよび／または導電率を、対応する条件にさらに調節する必要がありうる。その後、液相を陽イオン交換クロマトグラフィー材料にロードする。
【0036】
特に好ましい態様において、液相は、陽イオン交換クロマトグラフィー材料との接触の際、６．０～６．９、より好ましくは６．３～６．９、より一層好ましくは６．４～６．８、最も好ましくは６．５～６．７の範囲のｐＨを有する。
【0037】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料との接触の際の液相のイオン強度は、好ましくは５～１５ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは７～１１ｍＳ／ｃｍ、特に９．０±１．５ｍＳ／ｃｍ、好ましくは９．０±１．０ｍＳ／ｃｍの範囲である。
【0038】
好ましい態様において、液相は、５．６～７．０の範囲のｐＨ、および５～１５ｍＳ／ｃｍの範囲のイオン強度、より好ましくは６．０～６．９の範囲のｐＨ、および５～１５ｍＳ／ｃｍの範囲のイオン強度、より一層好ましくは６．３～６．９の範囲のｐＨ、および７～１１ｍＳ／ｃｍの範囲のイオン強度、最も好ましくは６．４～６．８の範囲のｐＨ、および９．０±１．５ｍＳ／ｃｍの範囲のイオン強度、より好ましくは６．４～６．８の範囲のｐＨ、および９．０±１．０ｍＳ／ｃｍの範囲のイオン強度、より一層好ましくは６．５～６．７の範囲のｐＨ、および９．０±１．０ｍＳ／ｃｍの範囲のイオン強度を有する。
【0039】
好ましい態様において、液相のｐＨをバッファー系の使用によって安定化する。これは、クエン酸、リン酸または酢酸バッファーでありうる。好ましいバッファーは、クエン酸バッファー、より好ましくはクエン酸三ナトリウムバッファーである。
【0040】
好ましい態様において、バッファーの濃度は、達成すべきイオン強度に応じて、５０ｍＭ未満、より好ましくは３０ｍＭ未満である。バッファーの濃度は、好ましくは５ｍＭを超え、より好ましくは１０ｍＭを超える。好ましい態様において、バッファー物質の濃度は１５ｍＭである。
【0041】
要すれば、イオン強度を、１つ以上の塩、好ましくは液相に可溶のハロゲン化物の塩、より好ましくは塩化ナトリウムの添加によって調節しうる。
【0042】
好ましくは、タンパク質のロードは、２２ｇ／ｌ陽イオン交換クロマトグラフィー材料以下、好ましくは２１ｇ／ｌ以下、より好ましくは２０ｇ／ｌ以下である。好ましい態様において、タンパク質のロードは、５～２２ｇ／ｌ、好ましくは１０～２１ｇ／ｌ、より好ましくは１０～２０ｇ／ｌである。
【0043】
陽イオン交換クロマトグラフィーのプロセスは、好ましくは１６℃～２８℃、より好ましくは１８℃～２６℃、より好ましくは２２℃±４℃の温度で行う。
【0044】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、好ましくは強ＣＥＸ材料である。
【0045】
ＣＥＸ材料は好ましくは、孔を有する粒子を含む材料である。好ましくは、ＣＥＸ材料は、マクロポーラス材料、特にマクロポーラスポリマー材料である。好ましい態様において、ＣＥＸ材料は、孔直径の範囲が５０ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは１００～１０００ｎｍである粒子を含む。好ましくは、平均孔サイズは１６０ｎｍである。特に好ましい態様において、クロマトグラフィー材料は、拡散がもはや制限的ではないように、小さい拡散孔、およびさらに、粒子を通る対流を少ないパーセンテージで可能にする比較的大きい流通孔を含む。そのような材料において好ましくは、クロマトグラフィー材料は、孔直径２００ｎｍ～１０００ｎｍの大きい孔、および直径５～３０ｎｍの小さい孔、好ましくは直径２５０ｎｍ～６００ｎｍの大きい孔、および直径５～２０ｎｍの小さい孔を有する粒子を含む（測定は、Pirrung S.M. et al. Biotechnol. Prog. 2018, 34(4), 1006-1018の開示による）。
【0046】
好ましい態様において、ＣＥＸ材料は、平均粒径サイズが３０～１００μｍ、好ましくは３０～７０μｍ、より好ましくは約５０μｍの粒子を含む。
【0047】
好ましい態様において、ＣＥＸ材料は、官能基、特にスルホネート官能基（－ＳＯ３－）を含む。好ましくは、スルホネート基は、炭素原子数２～６、好ましくは炭素原子数２～４の直鎖または分枝アルキル基、より好ましくはエチル、プロピル、ブチル基、より好ましくはエチル、ｎ－プロピルおよびイソブチルに結合したものであり得、より一層好ましくはスルホプロピル（好ましくはｎ－プロピルに対応する）でありうる。好ましい態様において、陽イオン交換材料上のスルホネート基は、ＣＥＸ材料のポリマー鎖に結合されている。
【0048】
他の好ましい態様において、ＣＥＸ材料は、テンタクル型の陽イオン交換材料（例えばMerck MilliporeのFractogel（登録商標））ではない。これは、ＳＯ３－基を含むモノマーのポリマー側鎖によるグラフトポリマーである。そのようなＣＥＸ材料は、フィブリノゲンおよび同様のタンパク質を、本発明の目的に関して、強く結合し過ぎる傾向を有する。
【0049】
好ましい態様において、材料は、スルホプロピル基を伴うポリヒドロキシル表面コーティングを含む。樹脂骨格は好ましくは、スルホネート官能基がポリヒドロキシル表面を介してスルホプロピルとして結合している架橋ポリスチレンジビニルベンゼンから形成される。好ましいＣＥＸ材料の一例はPOROS（商標）クロマトグラフィー樹脂、より好ましくはPOROS（商標）50 HS（ThermoFisher, USA）である。この材料も、前記のような大きい孔と小さい孔を有する粒子を含む。
【0050】
本発明の他の態様において、ＣＥＸ材料は、スルホネート官能基を有するメタクリレートコポリマーである。この態様において、平均粒子サイズは５０μｍ、平均孔直径は１００ｎｍでありうる。この態様における好ましいＣＥＸ材料の一例は、Macro-Prep（登録商標）、より好ましくはMacro-Prep（登録商標）High S（BioRad, USA）である。
【0051】
好ましい態様において、フィブリノゲンを含む液相をＣＥＸ材料に加える前に、ＣＥＸ材料を平衡化させる。これは平衡化バッファーを使用して行う。平衡化バッファーのｐＨ範囲は、好ましくは５．６～７．０、より好ましくは６．０～６．９、より一層好ましくは６．３～６．９、より好ましくは６．４～６．８、より一層好ましくは６．５～６．７である。
【0052】
平衡化バッファーのイオン強度は、好ましくは５～１５ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは７～１２ｍＳ／ｃｍ、特に９．０±１．５ｍＳ／ｃｍまたは９．０±１ｍＳ／ｃｍである。
【0053】
好ましい態様において、平衡化バッファーは、ｐＨが５．６～７．０の範囲でイオン強度が５～１５ｍＳ／ｃｍの範囲、より好ましくはｐＨが６．０～６．９の範囲でイオン強度が５～１５ｍＳ／ｃｍの範囲、より一層好ましくはｐＨが６．３～６．９の範囲でイオン強度が７～１１ｍＳ／ｃｍの範囲、最も好ましくはｐＨが６．４～６．８の範囲でイオン強度が９．０±１．５ｍＳ／ｃｍの範囲、より好ましくはｐＨが６．４～６．８の範囲でイオン強度が９．０±１．０ｍＳ／ｃｍの範囲、さらに好ましくはｐＨが６．５～６．７の範囲でイオン強度が９．０±１．０ｍＳ／ｃｍの範囲である。
【0054】
好ましい態様において、平衡化バッファーのｐＨはバッファー系の使用により安定化される。好ましいバッファー系は、リン酸、酢酸またはクエン酸バッファー、好ましくはクエン酸バッファー、より好ましくはクエン酸三ナトリウムをベースとするものである。
【0055】
好ましい態様において、バッファーの濃度は、達成すべきイオン強度に応じて、５０ｍＭ未満、より好ましくは３０ｍＭ未満である。バッファーの濃度は好ましくは５ｍＭを超え、より好ましくは１０ｍＭを超える。好ましい態様において、バッファー成分１５ｍＭの濃度である。
【0056】
好ましい態様において、平衡化バッファーは、塩、好ましくは塩化ナトリウムを含む。塩の濃度は、好ましくは１００ｍＭ未満、より好ましくは８０ｍＭ未満、特に７０ｍＭ未満である。塩の濃度は、低い方の範囲としては好ましくは４０ｍＭを超え、より好ましくは５０ｍＭを超え、より一層好ましくは６０ｍＭを超え、それぞれ上限は前記のとおりとし、好ましくは４０ｍＭ～８０ｍＭ、より好ましくは６０ｍＭ～８０ｍＭ、より好ましくは６５ｍＭ±１～２ｍＭである。バッファー系および塩の量は、好ましいイオン強度の平衡化バッファーが得られるように調節される。
【0057】
平衡化は好ましくは、ＣＥＸ材料を、少なくとも２カラム体積の平衡化バッファーで洗うことによって行う。
【0058】
本発明の方法のステップｂ）にしたがってＣＥＸ材料に液相をロードした後、次の任意のステップとして、未結合化合物をＣＥＸ材料から洗い流す。そのようなステップのために、ＣＥＸ材料を洗浄バッファーで洗う。好ましくは、洗浄バッファーのｐＨは、５．６～７．０、より好ましくは６．０～６．９、より一層好ましくは６．３～６．９、さらに好ましくは６．４～６．８、最も好ましくは６．５～６．７の範囲である。
【0059】
洗浄バッファーのイオン強度は、好ましくは５～１５ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは７～１１ｍＳ／ｃｍ、特に９．０±１．５ｍＳ／ｃｍまたは９．０＋１．０ｍＳ／ｃｍである。
【0060】
好ましい態様において、洗浄バッファーは、ｐＨが５．６～７．０の範囲でイオン強度が５～１５ｍＳ／ｃｍの範囲、より好ましくはｐＨが６．０～６．９の範囲でイオン強度が５～１５ｍＳ／ｃｍの範囲、より一層好ましくはｐＨが６．３～６．９の範囲でイオン強度が７～１１ｍＳ／ｃｍの範囲、最も好ましくはｐＨが６．４～６．８の範囲でイオン強度が９．０±１．５ｍＳ／ｃｍの範囲、より好ましくはｐＨが６．４～６．８の範囲でイオン強度が９．０±１．０ｍＳ／ｃｍの範囲、さらに好ましくはｐＨが６．５～６．７の範囲でイオン強度が９．０±１．０ｍＳ／ｃｍの範囲である。
【0061】
好ましい態様において、洗浄バッファーのｐＨは、バッファー系の使用により安定化される。好ましいバッファー系は、リン酸、酢酸またはクエン酸バッファー、好ましくはクエン酸バッファー、より好ましくはクエン酸三ナトリウムをベースとするものである。
【0062】
好ましい態様において、洗浄バッファーの濃度は、達成すべきイオン強度に応じて、５０ｍＭ未満、より好ましくは３０ｍＭ未満である。そしてバッファーの濃度は５ｍＭを超え、好ましくは１０ｍＭを超え、好ましい態様において１５ｍＭのバッファー成分である。
【0063】
好ましい態様において、洗浄バッファーは、塩、好ましくは塩化物塩、より好ましくは塩化ナトリウムを含む。塩の濃度は、好ましくは１００ｍＭ未満、より好ましくは８０ｍＭ未満、特に７０ｍＭ未満である。塩の濃度は、低い方の範囲としては好ましくは４０ｍＭを超え、より好ましくは５０ｍＭを超え、より一層好ましくは６０ｍＭを超え、それぞれ上限は前記のとおりとし、好ましくは４０ｍＭ～８０ｍＭ、より好ましくは６０ｍＭ～８０ｍＭ、より好ましくは６５ｍＭ±１～２ｍＭである。バッファー系および塩の量は、好ましいイオン強度の洗浄バッファーが得られるように調節される。
【0064】
好ましい態様において、ローディング後にＣＥＸ材料を、少なくとも１カラム体積の洗浄バッファー、好ましくは少なくとも２カラム体積の洗浄バッファーで洗浄する。
【0065】
本発明の好ましい態様において、平衡化バッファーおよび洗浄バッファーは少なくとも同じｐＨおよび／またはイオン強度、より好ましくは同じｐＨと同じイオン強度とを有する。より一層好ましい態様においては、両バッファーは同じ組成を有する。
【0066】
本発明の方法のステップｂ）およびｃ）にしたがうローディングおよび好ましくは洗浄の後、次のステップにおいて、本発明の方法のステップｄ）にしたがって陽イオン交換材料からフィブリノゲンを溶離する。このステップのために、溶離バッファーをＣＥＸ材料に流す。溶離バッファーは、ＣＥＸ材料からフィブリノゲンが選択的に溶離され、好ましくはｖＷＦはカラムに留まるように、最終の洗浄バッファー、または洗浄バッファーが使用されない場合には液相と比較して、高い導電率および／または高いｐＨを有する。条件は、使用されるＣＥＸ材料によりうる。
【0067】
好ましくは、溶離バッファーは、ＣＥＸ材料へのフィブリノゲンの結合の際に用いた条件よりも少なくとも０．２、０．３、０．４または０．５単位高いｐＨを有する。好ましい態様において、ｐＨは、結合条件よりも０．２～１ｐＨ単位高く、特に０．２～０．５単位高い。好ましい態様において、溶離バッファーのｐＨは、７．０±０．１である。
【0068】
溶離バッファーのイオン強度は、好ましくはＣＥＸ材料へのフィブリノゲンの結合の際に用いた条件よりも少なくとも２、３、４、５ｍＳ／ｃｍ高く、より好ましくは少なくとも５ｍＳ／ｃｍ高く、より一層好ましくは５～１５ｍＳ／ｃｍ高く、特に１０±１．５ｍＳ／ｃｍ高い。好ましい態様において、該イオン強度は、結合の際に用いた条件のイオン強度の少なくとも１．５～２．５倍、より好ましくは１．８～２．２倍である。好ましい態様において、該イオン強度は１９．５±１．５ｍＳ／ｃｍである。値はいずれも２０℃における値である。
【0069】
好ましい態様において、溶離バッファーは、フィブリノゲンをＣＥＸ材料に結合させるために用いられる条件よりも少なくとも０．２、０．３、０．４または０．５単位高いｐＨを有し、フィブリノゲンをＣＥＸ材料に結合させるために用いられる条件よりも少なくとも５ｍＳ／ｃｍ超高いイオン強度を有し、好ましくはフィブリノゲンの結合のために用いられる条件よりも、ｐＨが０．２～１ｐＨ単位高くイオン強度が５～１５ｍＳ／ｃｍ、より一層好ましくはｐＨが０．２～０．５単位高くイオン強度が１０±１．５ｍＳ／ｃｍ高い。
【0070】
好ましい態様において、溶離バッファーのｐＨは、バッファー系の使用により安定化される。好ましいバッファーは、リン酸、酢酸またはクエン酸バッファー、好ましくはクエン酸バッファー、より好ましくはクエン酸三ナトリウムに基づくものである。
【0071】
好ましい態様において、溶離バッファー系の濃度は、達成すべきイオン強度に応じて、３０ｍＭ未満、より好ましくは１０ｍＭ未満である。バッファーの濃度は、好ましくは５ｍＭ～３０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ～１０ｍＭである。好ましい態様において、バッファーの濃度は７．５ｍＭである。
【0072】
好ましい態様において、溶離バッファーは、塩、好ましくは塩化ナトリウムを含む。溶離バッファーの塩の濃度は、好ましくは１００ｍＭを超え、より好ましくは１１０ｍＭを超え、特に１２０ｍＭを超え、最も好ましくは１５０ｍＭである。該濃度は好ましくは３５０ｍＭ未満、より好ましくは２５０ｍＭ未満である。バッファー系および塩の量は、好ましいイオン強度の平衡化バッファーが得られるように調節される。
【0073】
好ましい態様において、溶離バッファーは１つ以上の医薬製剤化合物、例えばアミノ酸、例えばグリシン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、好ましくはカチオン性アミノ酸、好ましくはアルギニンを含む。アミノ酸は塩酸塩として加えることができる。好ましい態様において、溶離バッファーは、５０ｍＭを超える医薬製剤化合物を含む。医薬製剤化合物がイオン強度に寄与する場合は特に、溶離バッファー中の塩の濃度を低下することができる。したがって、カラム材料からのフィブリノゲン溶離のために十分なイオン強度を提供するために、溶離バッファーにおいて、例えば５０～１００ｍＭの医薬製剤化合物、好ましくは７０～８０ｍＭ、より好ましくは７５±２ｍＭの医薬製剤化合物を、好ましくは１００～２００ｍＭの塩化ナトリウム、好ましくは１５０±５ｍＭの塩化ナトリウムと組み合わせて使用することが特に好ましい。それによって最終医薬プロダクトにとって不都合でありうる過剰な塩濃度が回避される。さらに、溶離の目的のために医薬製剤の成分を使用することによって、さらなるバッファー交換ステップを回避しうる。
【0074】
好ましい態様において、溶離バッファーは、５０～１００ｍＭのアルギニン（好ましくは塩酸塩として加えられる）および１００～２００ｍＭの塩化ナトリウム、好ましくは７０～８０ｍＭのアルギニンおよび１００～２００ｍＭの塩化ナトリウム、より好ましくは７５±２ｍＭのアルギニンおよび１５０±５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【0075】
溶離は、フィブリノゲンがカラムから溶離されるまで行う。これはＵＶ吸収の測定によって検出することができる。
【0076】
本発明の方法を、精製プロセスの最終ステップの１つとして使用する場合、過剰な塩または他の望ましくない化合物を除去するためのダイアフィルトレーションステップを省略することができる。本発明の方法のプロダクトからの医薬物質組成物の調製の前に、タンパク質の濃縮のために限外濾過ステップを用いれば十分でありうる。
【0077】
フィブリノゲンの溶離後、カラムを再生バッファーの使用により再生しうる。この再生ステップ中に、ｖＷＦがカラムからストリップされうる。再生バッファーは、ｐＨが５．５～７．５、好ましくは６．０～７．０、より好ましくは６．５～６．７でありうる。イオン強度は、好ましくは５０ｍＳ／ｃｍを超え、より好ましくは１００ｍＳ／ｃｍを超える。好ましい態様において、イオン強度は５０～１５０ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは１００ｍＳ／ｃｍ～１３０ｍＳ／ｃｍである。再生バッファーは、例えば１．５ＭのＮａＣｌを含みうる（高塩濃度）。
【0078】
好ましい態様において、カラムの材料は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液、好ましくは少なくとも０．１Ｍの濃度、より好ましくは０．５Ｍ～１．５Ｍ水酸化ナトリウム濃度のもの、最も好ましくは１Ｍ水酸化ナトリウムを使用して、さらに洗浄することができる。洗浄後、クロマトグラフィー材料を、例えば０．１Ｍ ＮａＯＨ中でさらなる使用まで保管しうる。
【0079】
本発明の方法は、組成物、特に血漿由来組成物中のｖＷＦ量を低減するために特に有用である。これは特に驚くべきことである。というのは、ｖＷＦとフィブリノゲンが同様のｐＩ特性を有するからである。それにもかかわらず、発明者が示しているように、ｖＷＦがカラムに留まる陽イオン交換材料からフィブリノゲンを選択的に溶離することが可能なのである。したがって、本発明の方法は、フィブリノゲンからｖＷＦを分離することができる。好ましいことに、本発明の方法による陽イオン交換クロマトグラフィーステップによって、ｖＷＦの量（Ｕ／ｍｇ総タンパク質）は、少なくとも２、好ましくは少なくとも３，より好ましくは４まで、またはそれ以上のファクターで低減されうる。ここで、ファクターは、ローディング材料のｖＷＦ含量に直接依存する。好ましい態様において、溶離フィブリノゲンフラクション中のｖＷＦ量は、０．５Ｕ／ｍｇ総タンパク質未満、より好ましくは０．４Ｕ／ｍｇ総タンパク質未満、より好ましくは０．３Ｕ／ｍｇ総タンパク質未満、より一層好ましくは０．２Ｕ／ｍｇ未満まで低減される。典型的には、陽イオン交換ステップからの溶離フィブリノゲンフラクションは、約０．１～０．３Ｕ／ｍｇ総タンパク質の量のｖＷＦを含みうる。フィブリノゲンフラクション中のｖＷＦ量を低減する陽イオン交換クロマトグラフィーステップの能力を、ｖＷＦをスパイクした試験材料でも試験した。本発明者は、スパイクした試験材料の陽イオン交換クロマトグラフィーステップについて、ｖＷＦの除去係数が１０またはそれ以上にもなりうることを示すことができた。
【0080】
フィブリノゲンを含む溶離フラクションは、好ましくは、規定のフィブリノゲン含量のフィブリノゲン製剤が得られるように、さらに濃縮され、および／または希釈される。
【0081】
好ましい態様において、フィブリノゲンを含む溶離フラクションは、０．０１ｍｇ／ｍｌ未満のポリソルベート８０、および０．８μｇ／ｍｌ未満のＴｎＢＰを含む。
【0082】
好ましい態様において、本発明の方法は、フィブリノゲンを医薬組成物に製剤化するステップｅ）をさらに含む。
【0083】
血漿からのフィブリノゲン製造のための精製プロトコル中に本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーステップを用いることには、いくつもの利点がある。第一に、陽イオン交換ステップは、フィブリノゲンプロダクト中のｖＷＦ量を効果的に低減することができる。第二に、アルギニンのようなさらなる医薬プロダクト成分および／または他の製剤バッファー成分を、陽イオン交換クロマトグラフィーの溶離バッファー中にすでに含めることができ、それによって、費用および労力のかかるダイアフィルトレーションのようなさらなるバッファー交換ステップを回避することができる。第三に、陽イオン交換クロマトグラフィーステップは、プリオンの低減または除去に非常に有効であり、それによってプリオン低減または除去のためのさらなる余分なステップを回避することができる。陽イオン交換クロマトグラフィーステップの四つ目の利点は、ポリソルベート８０およびＴｎＢＰのような溶媒／界面活性剤を非常に効率的に除去できることである。要するに、本発明者により提示される陽イオン交換クロマトグラフィーステップを含む製造方法は、フィブリノゲンの製造のために非常に効果的で経済的な優れた方法である。該製造方法は、比較的少なく比較的実施の容易なプロセスステップを含む。
【0084】
先に述べたとおり、陽イオン交換材料にロードされる液相は、すでに部分的に精製されたフィブリノゲン製剤でありうる。したがって、フィブリノゲン製剤の製造のための本発明の方法は、好ましくは１つ以上のウイルス不活化ステップを包含する、先行するおよび／または連続する精製および製造ステップを含みうる。特に好ましい態様において、製造方法は、下記ステップの少なくとも１つをさらに含む：
出発材料としてのヒト血漿のクリオプレシピテートの使用；
Ａｌ（ＯＨ）３吸着；
Ｓ／Ｄ処理；
陰イオン交換クロマトグラフィー、およびフロースルーのさらなるフィブリノゲン精製のための使用；
グリシン沈殿；
ＵＶ－Ｃ処理；
限外濾過；
凍結乾燥；
乾熱処理。
出発材料としてのヒト血漿のクリオプレシピテートの使用；
Ａｌ（ＯＨ）３吸着；
Ｓ／Ｄ処理；
陰イオン交換クロマトグラフィー、およびフロースルーのさらなるフィブリノゲン精製のための使用；
グリシン沈殿；
ＵＶ－Ｃ処理；
限外濾過；
凍結乾燥；
乾熱処理。
【0085】
好ましい態様において、血漿から出発する完全な製造方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー、グリシン沈殿、および本書に記載する陽イオン交換クロマトグラフィーのステップを含む。好ましくは、Ｓ／Ｄ処理および／またはＵＶ－Ｃ処理および／または乾熱処理のような、ウイルス不活化またはウイルス低減のさらなるステップを実施する。陰イオン交換クロマトグラフィーステップによって、約１～２のｖＷＦ除去係数が達成されうる。グリシン沈殿ステップによって、約４～５のｖＷＦ除去係数が達成されうる。陽イオン交換クロマトグラフィーステップによって、少なくとも３のｖＷＦ除去係数が達成されうる。完全な製造方法全体として、溶解クリオプレシピテートに対して約２０またはそれ以上のｖＷＦ除去係数が達成されうる。
【0086】
好ましくは、最終プロダクトの精製フィブリノゲンの比活性は、総タンパク質に対して少なくとも９５％凝固可能タンパク質活性、好ましくは９８％±０．８である（凝固可能タンパク質およびＯＤ２８０による測定活性）。
【0087】
特に好ましい態様において、製造方法は前記ステップのすべてを含み、ここで、本書に記載される陽イオン交換クロマトグラフィーステップは、前記ＵＶ－Ｃ処理と前記限外濾過との間に行われる。好ましくは、それ以外のステップは、前記に挙げた順序で行われる。
【0088】
好ましいステップの実施形態を、以下、より詳細に説明する：
【0089】
ヒト血漿のクリオプレシピテートは、本発明の方法において好ましいフィブリノゲンソースである。
【0090】
クリオプレシピテートは、適当なバッファー条件下に、特に中性ｐＨにおいて、好ましくは溶液バッファー中で、再構成または可溶化し、吸着、特にＡｌ（ＯＨ）３による吸着に付し、生じたゲルを除去、好ましくは遠心分離によって除去する。必要なら、上清を濾過しうる。次のステップとして、上清を、ウイルス不活化、好ましくは溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理によりウイルス不活化しうる。ポリソルベート８０およびＴｎＢＰ（トリ－ｎ－ブチルホスフェート）といったＳ／Ｄ化合物が好ましい。
【0091】
その後、得られた溶液をクロマトグラフ法を用いてさらに精製しうる。これは典型的には、Ｓ／Ｄ処理したタンパク質溶液を陰イオン交換材料と接触させることによって行いうる。そのために好ましい材料は、マトリックス材料にグラフトされた陰イオン交換基としてジエチルアミノエチル（ＥＤＡＥ）基を有する材料である。そのような材料の一例は、マトリックス材料としてヒドロキシル化メタクリルポリマービーズが使用されたToyopeal DEAEである。溶液を陰イオン交換材料と、フィブリノゲンが該弱陰イオン交換材料に結合しない条件下に接触させる。フィブリノゲンはフロースルー中に存在する。
【0092】
その後、得られたフィブリノゲン溶液を、グリシン沈殿、好ましくは１～１．５Ｍのグリシン、より好ましくは約１．２Ｍのグリシンによるグリシン沈殿に付しうる。好ましくは、グリシン沈殿のために、ＮａＣｌ、好ましくは１～３ＭのＮａＣｌ、より好ましくは約２ＭのＮａＣｌをさらに使用する。グリシンおよび／またはＮａＣｌを溶液に直接加えることによって、前記濃度を達成しうる。溶液は、２０～４０ｍＭのシトレートによって６．７～７．２の範囲に緩衝する。その後、フィブリノゲン含有沈殿を、遠心分離、好ましくはフロースルー遠心分離によって分離することができる。単回のフィブリノゲン沈殿で通常十分である。フィブリノゲンペーストを－７０℃以下の温度で保存しうる。
【0093】
次のステップとして、沈殿を再懸濁し、その溶液をさらなるウイルス不活化、特にパルボウイルス不活化のためにＵＶ－Ｃ処理に付しうる。好ましい態様において、UVivatecシステム（Sartorius Stedim Biotech GmbH, Germany）を使用する。バッファーとして、好ましくはクエン酸ナトリウムバッファーを使用する。好ましくは、得られる溶液は、本発明による陽イオン交換クロマトグラフィーにもう適している。
【0094】
次のステップとして、フィブリノゲン溶液を、前記方法による陽イオン交換クロマトグラフィーに付す。
【0095】
その後、得られたフィブリノゲン溶液を、限外濾過によって、好ましくは２０～７０ｇ／ｌ、好ましくは５５±１０ｇ／ｌの濃度までさらに濃縮する。得られた濃縮物を、所望の終濃度まで、対応するバッファーを用いて希釈しうる。所望の終濃度は、好ましくは２５～４０ｇ／ｌ、好ましくは３３±３ｇ／ｌである。これらステップの間に、最終医薬プロダクトのためのさらなる成分を加えうる。溶液のｐＨを、例えばｐＨ７．０±０．５に調節しうる。
【0096】
得られた溶液を濾過（０．２μｍ）して異なるバイアルに入れ、凍結乾燥しうる。その後、さらなるウイルス不活化ステップとして最後の乾熱処理（例えばオートクレーブにおいて１００℃で３０分間）を行いうる。最終溶液または凍結乾燥物において、総タンパク質は実質的にフィブリノゲンからなる。
【0097】
得られた凍結乾燥物を、好ましくは１２～２５ｇ／ｌのフィブリノゲン、より好ましくは１８～２４ｇ／ｌのフィブリノゲン、２０～６５ｍｍｏｌ／ｌのアルギニン、より好ましくは２５～５５ｍｍｏｌ／ｌのアルギニン、２～１０ｍｍｏｌ／ｌのシトレート、より好ましくは３～７ｍｍｏｌ／ｌのシトレートを含む、ｐＨ６．５～７．５の溶液が得られるように、再構成しうる。
【0098】
本発明の製造方法にしたがって得られるフィブリノゲン製剤もまた、本発明の対象である。該フィブリノゲン製剤は、有利な純度および活性プロファイルによって特徴付けられる。特に、該フィブリノゲン製剤は、第ＸIII因子含量が非常に低いことによって特徴付けられる。好ましくは、該フィブリノゲン製剤は、０．５～２．０FＸIII：Ａｇ（% of norm）のFＸIII濃度、および／または１６FＸIII：Ａｃ（% of norm）未満のFＸIII活性を有し、したがって、従来のフィブリノゲンプロダクトと比べて純度の改善を示す。これは、＜０．００８ＩＵ／ｍｇフィブリノゲンのFＸIII：Ａｃ値に相当する（２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンにおいて）。５～２．０FＸIII：Ａｇ（% of norm）は、０．０００３～０．００１０ＩＵ／ｍｇフィブリノゲンにほぼ相当する（２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンにおいて）。
【0099】
これにより、本発明のフィブリノゲン製剤を医療目的で使用するとき、共存物のより少ない因子が投与される。さらに、本発明のフィブリノゲン製剤は従来のフィブリノゲンプロダクトと比べて、良好またはより改善された血餅硬度を示す。さらに、本発明のフィブリノゲン製剤は、検出可能な量のＤダイマーを示さず（＜０．１７ｍｇ／ｌ）、これは、本発明のフィブリノゲン製剤が特に有利な生理学的活性および改善された純度を有することをさらに示すものである。
【0100】
本発明は、０．５～２．０FＸIII：Ａｇ（% of norm）のFＸIII濃度を有する、および／または１６FＸIII：Ａｃ（% of norm）未満のFＸIII活性を有する、および／または検出可能な量のＤダイマーを含まない（＜０．１７ｍｇ／ｌ）、および／または最大血餅硬度が２０～３０ｍｍである（２．５ｇ／ｌのフィブリノゲンでFib-temアッセイ）、フィブリノゲンプロダクトにも関する。
【0101】
フィブリノゲン製剤から得られる医薬組成物もまた、本発明の対象である。好ましくは、本発明の医薬組成物は、記載される本発明の方法によって得られるフィブリノゲン製剤、および好ましくは少なくとも１つの医薬用担体を含む。
【0102】
医薬組成物は、適当なバイアルに充填することができる。
【0103】
得られる医薬組成物は、血餅硬度アッセイによって示される良好な生理学的性質および高い安定性を示す。これは、高分子物質の含量が低く、純度に優れている。医薬組成物は好ましくは、凍結乾燥物として供される。
【0104】
医薬組成物が、溶液として、好ましくは凍結乾燥フィブリノゲンプロダクトから提供されるとき、ｖＷＦ含量は好ましくは０．５Ｕ／ｍｇ総タンパク質未満、より好ましくは０．４Ｕ／ｍｇ総タンパク質未満である。例えば、好ましい態様においてｖＷＦ含量は、０．３５Ｕ／ｍｇ総タンパク質に相当する２０ｇ／ｌのフィブリノゲン量における７Ｕ／ｍｌ未満である。
【0105】
好ましい態様において、医薬組成物は、溶液として、好ましくは凍結乾燥物から調製されるとき、以下の成分を含む：１２～２５ｇ／ｌの濃度のフィブリノゲン、ｐＨ６．５～７．５、２０～６５ｍｍｏｌ／ｌのアルギニン、２～１０ｍｍｏｌ／ｌのシトレート。
【0106】
本発明の方法により得られる医薬組成物は好ましくは、静脈内使用のために、好ましくはヒトにおいて適当である。
【0107】
医薬組成物は実質的に、止血異常の処置、および／または出血の予防もしくは治療のために有用である。好ましい態様において、止血異常は、先天性フィブリノゲン欠乏、後天性フィブリノゲン欠乏、外傷性傷害、および出血の予防または治療である。本発明の医薬組成物の投与による出血の予防または治療は、手術中または手術後、特に脊髄手術中または婦人科手術中に行われうる。したがって、本発明は、本発明の医薬組成物の投与による止血異常の処置方法にも関する。
【実施例】
【0108】
実施例１
ヒト血漿のクリオプレシピテートをフィブリノゲンソースとして用いた。クリオプレシピテートは、凍結血漿を０～４℃で解凍し、沈殿物を分離することによって得る。
ヒト血漿のクリオプレシピテートをフィブリノゲンソースとして用いた。クリオプレシピテートは、凍結血漿を０～４℃で解凍し、沈殿物を分離することによって得る。
【0109】
クリオプレシピテート１ｋｇにつき、２．９１ｋｇの水（ＷＦＩ）、１１４ｇのエタノール２５％（ｖ／ｖ）、および９０００ＩＵのヘパリンの混合物を調製する。ＷＦＩ／エタノール／ヘパリン溶液にクリオプレシピテートを撹拌しながら加える。ｐＨ値を７．０に調節する。
【0110】
用いるクリオプレシピテート１ｋｇにつき、１０８ｇの２％水酸化アルミニウム懸濁液を加え、混合物を２２．５℃で撹拌する。ｐＨ値を６．５５に調節し、その後、連続的に作動する遠心分離機によって遠心分離する。
【0111】
１％のポリソルベート８０および０．３％のトリ－ｎ－ブチルホスフェートを撹拌しながら加える。該タンパク質溶液を２５．０℃で少なくとも８時間にわたり撹拌する。
【0112】
カラムクロマトグラフィーによるさらなる精製のために、陰イオン交換ゲルToyopearl TSK DEAE-650（ジエチルアミノエチル基を有するマトリックス材料としてのヒドロキシル化メタクリルポリマービーズ）を使用する。タンパク質のローディングは、陰イオン交換ゲル１ｍｌ当たり約５０±１０ｍｇのタンパク質である。
【0113】
タンパク質溶液のクロリド含量を、ＮａＣｌ溶液の添加によって１２０ｍｍｏｌ／ｌに調節する。タンパク質溶液をカラムに適用し、フロースルーフラクションを収集する。
【0114】
１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１２０ｍＭのグリシン、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のポリソルベート８０および０．３％のＴｎＢＰを含む、ｐＨ７．０～７．１の、得られるフィブリノゲン溶液を、グリシン沈殿に付す。フィブリノゲンを沈殿させるために、グリシンを終濃度１．２Ｍで加える。ＮａＣｌを終濃度２Ｍで加える。次いで、フィブリノゲン含有沈殿を遠心分離によって分離する。フィブリノゲンペーストを－７０℃以下で貯蔵しうる。
【0115】
沈殿物をバッファー（１５ｍＭクエン酸三ナトリウム二水和物、ｐＨ値６．９±０．１、導電率３．３±０．５ｍＳ／ｃｍ）に再懸濁する。該組成物は、他のタンパク質（例えば０．７～０．９Ｕ／ｍｇのｖＷＦ）のほか、ＴｎＢＰ、ポリソルベート８０、グリシンおよびＮａＣｌを含む。組成物を濾過し、UVivatecデバイス（Sartorius Stedim Biotech）のようなデバイスを使用するウイルス不活化のためのＵＶ－Ｃ処理に付す。照射は好ましくは、２５４ｎｍ±１ｎｍにおいて１２５～２００Ｊ／ｍ２で行う。
【0116】
次の陽イオン交換クロマトグラフィーステップのために、カラム（POROS（商標）50 HS）を平衡化バッファー（１５ｍＭ無水クエン酸三ナトリウム、６５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ値６．５±０．１、導電率９．０±１．５ｍＳ／ｃｍ、２～５カラム体積）で平衡化する。
【0117】
ＵＶ照射ステップからのフィブリノゲン含有液相を、該組成物を１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、ｐＨ値６．５±０．１および導電率９．０±１．５ｍＳ／ｃｍに調節することによって準備する。ゲル体積１リットル当たりのタンパク質量１０～２０ｇ／ｌでカラムにロードする。
【0118】
カラムを洗浄バッファー（１５ｍＭ無水クエン酸三ナトリウム、６５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ値６．５±０．１、導電率９．０±１．０ｍＳ／ｃｍ、２～５カラム体積）で洗う。
【0119】
その後、溶離バッファー（７．５ｍＭ無水クエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭ Ｌ－アルギニン一塩酸塩、ｐＨ値７．０±０．１、導電率１９．５±１．５ｍＳ／ｃｍ）を用いてフィブリノゲンを溶離する。このステップにおいて、フィブリノゲンがカラムから溶離される。ｖＷＦの多くはカラムに結合して留まる。
【0120】
次いで、カラムを、塩濃度のより高いバッファー（１５ｍＭ無水クエン酸三ナトリウム、１．５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ値６．５±０．１、導電率１１３．５±５．０ｍＳ／ｃｍ）で洗う。ｖＷＦがカラムから溶離される。その後、カラムを１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて洗浄する。
【0121】
本方法において、アルブミンおよびＩｇＧはＣＥＸ材料に結合しない。フィブリノゲンを含む液相中に存在するｖＷＦの５０％超を、本方法を用いて除去することができる。
【0122】
医薬物質の調製のために、溶離されたフラクションを限外濾過によって濃縮し、タンパク質濃度をクエン酸バッファーを用いて１リットル当たりフィブリノゲン３３ｇに調節する。さらなる成分を加えて最終医薬物質を形成しうる。
【0123】
医薬物質を濾過（０．２μｍ）して異なるバイアルに入れ、凍結乾燥する。その後、さらなるウイルス不活化ステップとして、スチームオートクレーブ内で最終熱処理を行った（１００℃、３０分間）。プロダクトは驚くほど安定である。
【0124】
最終プロダクトは、標準ヒト血漿対照（２７ｍｍ）および血漿プール（２２ｍｍ）と比べて、最大血餅硬度（ＭＣＦ）として測定される血餅安定性が良好である（２．５ｇ／ｌのフィブリノゲンでFib-temアッセイ、２５ｍｍ）。これは、生理学的活性が良好であることの強い証拠である。
【0125】
さらに、該フィブリノゲン製剤は、１．５ＦXIII：Ａｇ（% of norm）以下のＦXIII濃度および１６ＦXIII：Ａｃ（% of norm）以下のＦXIII活性を有する。さらに、フィブリノゲン製剤は、検出可能な量のＤダイマーを示さない。両パラメータは、本発明のフィブリノゲンプロダクトの純度が非常に良好であることを示している。データを表１に示す（サンプル１、２、３：本発明の実施例１の方法による製剤 - 可溶化最終プロダクト、タンパク質２０ｍｇ／ｍｌ）。
【0126】
【表1】
【0127】
市販フィブリノゲンプロダクトサンプルは、本発明プロダクトと比較して、はるかに高いＦXIII活性および高いＤダイマー量を示す（データを示さず）。
【0128】
実施例２
実施例１に記載のように調製したグリシン沈殿物２５ｇを、ＵＶ－Ｃ処理し、実施例１に記載のように陽イオン交換クロマトグラフィー（POROS（商標）50 HS）を用いて精製した。表２に、ローディング溶液、フロースルーおよび溶離液の組成を示す。
実施例１に記載のように調製したグリシン沈殿物２５ｇを、ＵＶ－Ｃ処理し、実施例１に記載のように陽イオン交換クロマトグラフィー（POROS（商標）50 HS）を用いて精製した。表２に、ローディング溶液、フロースルーおよび溶離液の組成を示す。
【0129】
【表2】
【0130】
総タンパク質が実質的にフィブリノゲンに対応するとすれば、ＯＤ２８０で測定されるタンパク質濃度に基づき、溶離液中のタンパク質収率は９５．５％である。総ｖＷＦの３７．９％がフィブリノゲン溶離液中に存在する。Ｆｉｂ：Ａｇとしての測定でフィブリノゲンの１００．３％が溶離液中に存在する。
【0131】
この具体例のロード中のｖＷＦ含量は比較的低いので、この例におけるｖＷＦの除去係数は２．４である（０．４５から０．１９Ｕ／ｍｇへ）。本発明者は他の例において、ロード材料中のｖＷＦ含量が０．６～０．９Ｕ／ｍｇ総タンパク質の範囲であるときにｖＷＦ除去係数が３～６の範囲であることを示している。
【0132】
実施例３
POROS（商標）50 HSの代わりに強陽イオン交換カラム材料としてMacro-Prep（登録商標）High Sを使用したことを除き、陽イオン交換クロマトグラフィーステップに関して実施例１に記載のものと同様のプロセスを行った。ローディングおよびウォッシング中のカラムへのフィブリノゲンの改善された結合のために、導電率を４．５ｍＳ／ｃｍに設定し、ｐＨをフィブリノゲンのｐＩよりも高い６．０に設定した。ｐＨ７および導電率１９．５ｍＳ／ｃｍの溶離条件下に、フィブリノゲンの９４．８％のがカラムから溶離される。溶離フラクション中のｖＷＦ量は０．４Ｕ／ｍｇタンパク質未満である。ＣＥＸカラムへのタンパク質ロード中のｖＷＦの約１８．３％だけを、溶離液中に検出することができた。溶離フラクション中にポリソルベート８０またはＴｎＢＰは検出することができなかった。
POROS（商標）50 HSの代わりに強陽イオン交換カラム材料としてMacro-Prep（登録商標）High Sを使用したことを除き、陽イオン交換クロマトグラフィーステップに関して実施例１に記載のものと同様のプロセスを行った。ローディングおよびウォッシング中のカラムへのフィブリノゲンの改善された結合のために、導電率を４．５ｍＳ／ｃｍに設定し、ｐＨをフィブリノゲンのｐＩよりも高い６．０に設定した。ｐＨ７および導電率１９．５ｍＳ／ｃｍの溶離条件下に、フィブリノゲンの９４．８％のがカラムから溶離される。溶離フラクション中のｖＷＦ量は０．４Ｕ／ｍｇタンパク質未満である。ＣＥＸカラムへのタンパク質ロード中のｖＷＦの約１８．３％だけを、溶離液中に検出することができた。溶離フラクション中にポリソルベート８０またはＴｎＢＰは検出することができなかった。
【0133】
実施例４
溶離フィブリノゲンフラクション中のｖＷＦ量の低下における陽イオン交換クロマトグラフィーステップの能力を調べるために、ｖＷＦ（スパイクした）に富むローディング材料を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーを、実施例１に記載のようにPOROS（商標）50 HSを用いて行った。ロードのｖＷＦ含量は、１．０９Ｕ／ｍｇ総タンパク質（スパイクしていない材料）ないしいくつかのスパイクサンプルにおける４．４９Ｕ／ｍｇ総タンパク質であった（表３参照）。フィブリノゲンの選択的溶離（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の後、ｖＷＦを高塩フラクション（１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶離した。表３からわかるように、溶離フィブリノゲンフラクション（フィブリノゲン溶離液）中のｖＷＦ量は、ロードのｖＷＦ含量が増加しても、０．２１Ｕ／ｍｇ総タンパク質（スパイクなしの材料）から０．３５Ｕ／ｍｇ総タンパク質（４．４９Ｕ／ｍｇ総タンパク質でロードにスパイクした場合）の範囲にあって実質的に一定であった。ｖＷＦの除去係数は、スパイクなしのロード材料の場合の５から、４．４９Ｕ／ｍｇ総タンパク質でスパイクしたロード材料の場合の１２まで、ロード材料のスパイクにしたがって増加した。
溶離フィブリノゲンフラクション中のｖＷＦ量の低下における陽イオン交換クロマトグラフィーステップの能力を調べるために、ｖＷＦ（スパイクした）に富むローディング材料を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーを、実施例１に記載のようにPOROS（商標）50 HSを用いて行った。ロードのｖＷＦ含量は、１．０９Ｕ／ｍｇ総タンパク質（スパイクしていない材料）ないしいくつかのスパイクサンプルにおける４．４９Ｕ／ｍｇ総タンパク質であった（表３参照）。フィブリノゲンの選択的溶離（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の後、ｖＷＦを高塩フラクション（１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶離した。表３からわかるように、溶離フィブリノゲンフラクション（フィブリノゲン溶離液）中のｖＷＦ量は、ロードのｖＷＦ含量が増加しても、０．２１Ｕ／ｍｇ総タンパク質（スパイクなしの材料）から０．３５Ｕ／ｍｇ総タンパク質（４．４９Ｕ／ｍｇ総タンパク質でロードにスパイクした場合）の範囲にあって実質的に一定であった。ｖＷＦの除去係数は、スパイクなしのロード材料の場合の５から、４．４９Ｕ／ｍｇ総タンパク質でスパイクしたロード材料の場合の１２まで、ロード材料のスパイクにしたがって増加した。
【0134】
表４に、より大きなスケールで典型的サンプルの溶解クリオプレシピテートと比較した除去係数を示す。プロセス全体で、溶解クリオプレシピテートとの比較で２４．２の除去係数が達成される。
【0135】
【表3】
【0136】
【表4】
【0137】
実施例５
カラム（POROS（商標）50 HS）へのローディングの際のｐＨ値および導電率に関して陽イオン交換クロマトグラフィーステップのロバスト性を示すために、実施例１にしたがうカラムへのローディングの際の６．３～６．７の範囲のｐＨを試験した。カラムへのローディングの際の導電率は７～１１ｍＳ／ｃｍであった。タンパク質ロードは、カラム材料１リットル当たり２０ｇ～２２ｇタンパク質であった。試験したすべての条件において、ｖＷＦは、図１からわかるように０．５Ｕ／ｍｇ総タンパク質未満まで除去された（図１は、異なるタンパク質ロードについて、異なる値のローディング溶液導電率およびｐＨに対する、ｖＷＦ量の関連を示す（上段はｐＨ６．４～６．６および８～１０ｍＳ／ｃｍ；下段はｐＨ６．３～６．７および７～１１ｍＳ／ｃｍ）。結果は、フィブリノゲン溶離液中のｖＷＦの低減（ここで、ｖＷＦは０．４Ｕ／ｍｇ未満まで除去）のために６．４～６．６の範囲が特に有利であることを示している。結果はさらに、フィブリノゲン溶離液中のｖＷＦの低減（０．４Ｕ／ｍｇ未満までのｖＷＦ除去をもたらす）のために８～１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率が特に有利であることを示している。さらに、ｖＷＦの効果的な除去のために、総タンパク質ロードは２１ｇ／ｌカラム材料以下、特に２０ｇ／ｌカラム材料以下であることが有利である。
カラム（POROS（商標）50 HS）へのローディングの際のｐＨ値および導電率に関して陽イオン交換クロマトグラフィーステップのロバスト性を示すために、実施例１にしたがうカラムへのローディングの際の６．３～６．７の範囲のｐＨを試験した。カラムへのローディングの際の導電率は７～１１ｍＳ／ｃｍであった。タンパク質ロードは、カラム材料１リットル当たり２０ｇ～２２ｇタンパク質であった。試験したすべての条件において、ｖＷＦは、図１からわかるように０．５Ｕ／ｍｇ総タンパク質未満まで除去された（図１は、異なるタンパク質ロードについて、異なる値のローディング溶液導電率およびｐＨに対する、ｖＷＦ量の関連を示す（上段はｐＨ６．４～６．６および８～１０ｍＳ／ｃｍ；下段はｐＨ６．３～６．７および７～１１ｍＳ／ｃｍ）。結果は、フィブリノゲン溶離液中のｖＷＦの低減（ここで、ｖＷＦは０．４Ｕ／ｍｇ未満まで除去）のために６．４～６．６の範囲が特に有利であることを示している。結果はさらに、フィブリノゲン溶離液中のｖＷＦの低減（０．４Ｕ／ｍｇ未満までのｖＷＦ除去をもたらす）のために８～１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率が特に有利であることを示している。さらに、ｖＷＦの効果的な除去のために、総タンパク質ロードは２１ｇ／ｌカラム材料以下、特に２０ｇ／ｌカラム材料以下であることが有利である。
【0138】
実施例６
陽イオン交換クロマトグラフィーステップの、溶離フィブリノゲンフラクション中のポリソルベート８０およびＴｎＢＰ量を低下する能力を試験するために、ポリソルベート８０およびＴｎＢＰ（スパイクした）の両方に富むローディング材料を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーを、ＵＶ－Ｃ照射ステップを省略したことを除いては実施例１に記載のようにPOROS（商標）50 HSを用いて行った。ロードのポリソルベート８０およびＴｎＢＰ含量は、１．１１ｍｇ／ｍｌおよび約２０μｇ／ｍｌ（スパイクなしの材料）ないしいくつかのスパイクしたサンプルにおける１０．７４ｍｇ／ｍｌおよび２５９０μｇ／ｍｌであった（表５参照）。フィブリノゲンの選択的溶離（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の後、ｖＷＦを高塩フラクション（１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶離した。カラム溶離液中のフィブリノゲン収量はすべての実験にわたり一定であることが、クロマトグラムから推定された（データを示さず）。表５からわかるように、溶離フィブリノゲンフラクション（フィブリノゲン溶離液）中のポリソルベート８０およびＴｎＢＰの含量は、ＴｎＢＰを最も多くスパイクした場合に約３０μｇ／ｍｌのＴｎＢＰが溶離液中に検出されたことを除きポリソルベート８０／ＴｎＢＰスパイクを適用したすべての場合について、分析方法の検出限界未満である。したがって、フィブリノゲン含有サンプルのPOROS（商標）50 HSクロマトグラフィーを用いて、ポリソルベート８０およびＴｎＢＰを１０００のファクターまでで除去することができた。同時に、フィブリノゲン溶離液のｖＷＦ含量は、ポリソルベート８０／ＴｎＢＰを最も多くスパイクした場合にわずかな増加が見られただけで、ほとんど影響されないままであった。
陽イオン交換クロマトグラフィーステップの、溶離フィブリノゲンフラクション中のポリソルベート８０およびＴｎＢＰ量を低下する能力を試験するために、ポリソルベート８０およびＴｎＢＰ（スパイクした）の両方に富むローディング材料を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーを、ＵＶ－Ｃ照射ステップを省略したことを除いては実施例１に記載のようにPOROS（商標）50 HSを用いて行った。ロードのポリソルベート８０およびＴｎＢＰ含量は、１．１１ｍｇ／ｍｌおよび約２０μｇ／ｍｌ（スパイクなしの材料）ないしいくつかのスパイクしたサンプルにおける１０．７４ｍｇ／ｍｌおよび２５９０μｇ／ｍｌであった（表５参照）。フィブリノゲンの選択的溶離（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の後、ｖＷＦを高塩フラクション（１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶離した。カラム溶離液中のフィブリノゲン収量はすべての実験にわたり一定であることが、クロマトグラムから推定された（データを示さず）。表５からわかるように、溶離フィブリノゲンフラクション（フィブリノゲン溶離液）中のポリソルベート８０およびＴｎＢＰの含量は、ＴｎＢＰを最も多くスパイクした場合に約３０μｇ／ｍｌのＴｎＢＰが溶離液中に検出されたことを除きポリソルベート８０／ＴｎＢＰスパイクを適用したすべての場合について、分析方法の検出限界未満である。したがって、フィブリノゲン含有サンプルのPOROS（商標）50 HSクロマトグラフィーを用いて、ポリソルベート８０およびＴｎＢＰを１０００のファクターまでで除去することができた。同時に、フィブリノゲン溶離液のｖＷＦ含量は、ポリソルベート８０／ＴｎＢＰを最も多くスパイクした場合にわずかな増加が見られただけで、ほとんど影響されないままであった。
【0139】
【表5】
【0140】
実施例７
本発明者は、陽イオン交換クロマトグラフィーステップによってプリオンが検出限界未満まで効果的に除去されることを示すことができた。この効果を示すために、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病の十分に確立された試験モデルであるハムスターのプリオン（株２６３Ｋ）を試験した。プリオンをスパイクした試験材料で除去能力を分析した。プリオン力価をウエスタンブロットによって測定した。陽イオン交換クロマトグラフィーステップの溶離液において、フィブリノゲンからプリオンは、≧３．２７のｌｏｇ１０ないし検出限界未満まで除去され、陽イオン交換クロマトグラフィーステップによる信頼できるプリオン除去が示される。プリオンは１．５ＭのＮａＣｌ（高塩濃度）によってカラムからストリップされる。
本発明者は、陽イオン交換クロマトグラフィーステップによってプリオンが検出限界未満まで効果的に除去されることを示すことができた。この効果を示すために、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病の十分に確立された試験モデルであるハムスターのプリオン（株２６３Ｋ）を試験した。プリオンをスパイクした試験材料で除去能力を分析した。プリオン力価をウエスタンブロットによって測定した。陽イオン交換クロマトグラフィーステップの溶離液において、フィブリノゲンからプリオンは、≧３．２７のｌｏｇ１０ないし検出限界未満まで除去され、陽イオン交換クロマトグラフィーステップによる信頼できるプリオン除去が示される。プリオンは１．５ＭのＮａＣｌ（高塩濃度）によってカラムからストリップされる。
【0141】
実験結果を表６にまとめる。試験材料はプリオン（ハムスター順化スクレイピー分離株、株２６３Ｋ、供給者：ViruSure GmbH, Austria）をスパイクし、該プリオンストックからサンプルを取り試験材料にスパイクし、プリオン力価をウエスタンブロットによって測定した。スパイクした試験材料を約９４ｍｌの体積でカラムにロードし、カラムを洗った。フロースルーおよび洗液を収集し、体積を測定した。フィブリノゲンを５０ｍｌの体積でカラムから溶離し、カラムを１．５ＭのＮａＣｌで洗った。各フラクションのサンプルを取り、プリオン力価を分析した。本試験の結果を下記表６に示す。フィブリノゲンからプリオンが≧３．２７のｌｏｇ１０ないし検出限界未満まで除去されることが示される。
【0142】
【表6】
ｂ）１０倍濃縮サンプル（－１．０ ｌｏｇ）は非反応性であった。
ｃ）サンプルを希釈した。
【0143】
分析方法
タンパク質測定
タンパク質測定をＵV吸収法によって行った（Spektralphotometer Genesys（商標）6、Spektralphotometer Genesys（商標）10）。溶液中でタンパク質は、芳香族アミノ酸、主としてチロシンおよびトリプトファンの存在のゆえに、２８０ｎｍの波長のＵＶ光を吸収する。この性質が、２８０ｎｍでのタンパク質測定の根拠となっている。タンパク質のＵＶ分光測定の精度は、試験標本による光の散乱によって低下しうる。この効果の補正のために、２８０ｎｍにおける吸収から３６０ｎｍにおける吸収を差し引く。
タンパク質測定
タンパク質測定をＵV吸収法によって行った（Spektralphotometer Genesys（商標）6、Spektralphotometer Genesys（商標）10）。溶液中でタンパク質は、芳香族アミノ酸、主としてチロシンおよびトリプトファンの存在のゆえに、２８０ｎｍの波長のＵＶ光を吸収する。この性質が、２８０ｎｍでのタンパク質測定の根拠となっている。タンパク質のＵＶ分光測定の精度は、試験標本による光の散乱によって低下しうる。この効果の補正のために、２８０ｎｍにおける吸収から３６０ｎｍにおける吸収を差し引く。
【0144】
フィブリノゲン（Ｆｉｂ：Ａｇ）測定
Ｆｉｂ：Ａｇ濃度はBN Prospec (Siemens) 比濁計による比ろう法によって測定する。フィブリノゲンは特異的抗体と複合体を形成する。この複合体は、照射された光の散乱を引き起こす。散乱の増加がフィブリノゲン濃度に相関する。
Ｆｉｂ：Ａｇ濃度はBN Prospec (Siemens) 比濁計による比ろう法によって測定する。フィブリノゲンは特異的抗体と複合体を形成する。この複合体は、照射された光の散乱を引き起こす。散乱の増加がフィブリノゲン濃度に相関する。
【0145】
凝固可能タンパク質によるフィブリノゲン活性の測定
フィブリノゲン活性（＝凝固可能タンパク質）のアッセイのために、サンプル製剤を、十分なトロンビンを含む適当なバッファー溶液と混合し、３７℃でインキュベートする。上清中の残留タンパク質を２８０／３６０ｎｍにおけるＵＶ分光測定によって測定し、その結果を総タンパク質量（前記参照）から差し引いて、凝固可能タンパク質を計算する。
フィブリノゲン活性（＝凝固可能タンパク質）のアッセイのために、サンプル製剤を、十分なトロンビンを含む適当なバッファー溶液と混合し、３７℃でインキュベートする。上清中の残留タンパク質を２８０／３６０ｎｍにおけるＵＶ分光測定によって測定し、その結果を総タンパク質量（前記参照）から差し引いて、凝固可能タンパク質を計算する。
【0146】
フィブリノゲンの比活性の決定
フィブリノゲンの比活性を、ＵＶ吸収（２８０ｎｍ）により測定された総タンパク質に対する凝固可能タンパク質活性によって決定する。
フィブリノゲンの比活性を、ＵＶ吸収（２８０ｎｍ）により測定された総タンパク質に対する凝固可能タンパク質活性によって決定する。
【0147】
血餅安定性測定
血餅安定性を、ROTEM全血アナライザー（Tem Innovations GmbH, Munich）を用いるFib-temアッセイによって測定する。これは、全血の止血試験のための確立された粘弾性的な方法である。
血餅安定性を、ROTEM全血アナライザー（Tem Innovations GmbH, Munich）を用いるFib-temアッセイによって測定する。これは、全血の止血試験のための確立された粘弾性的な方法である。
【0148】
製造者の指示にしたがって試験を行う。方法の妥当性を、コントロール製剤（Rotrol NおよびP）を用いて試験する。
【0149】
Fib-temの測定のために、フィブリノゲンサンプルを製造者の指示にしたがって溶解し、フィブリノゲン欠損血漿によるさらなる希釈を行って、フィブリノゲン濃度を１．５ｇ／ｌ、２．０ｇ／ｌおよび２．５ｇ／ｌとする。
【0150】
ｖＷＦ活性（ｖＷＦ：Ａｇ）測定
テストキット「vWF Ag」は、Behring coagulation system (BCS XP) で測定される、ヒト血漿または血漿プロダクト中のフォン・ヴィルブランド因子抗原（ｖＷＦ：Ａｇ）の免疫比濁測定のための試薬を含む。
テストキット「vWF Ag」は、Behring coagulation system (BCS XP) で測定される、ヒト血漿または血漿プロダクト中のフォン・ヴィルブランド因子抗原（ｖＷＦ：Ａｇ）の免疫比濁測定のための試薬を含む。
【0151】
提供される試薬ならびにcoagulation system BCS XPの規定の試験定義および測定指示を含み、製造者の指示にしたがって試験を行う。サンプルの結果を、標準／参照曲線を用いて評価する。
【0152】
標準／参照曲線の作製のために、標準ヒト血漿（Siemens）を異なる希釈段階で二重の測定において使用する。coagulation system（BCS XP）は、カリブレーターを基準の１０～２００％の範囲で自動希釈する。参照曲線の妥当性を、コントロール製剤（Control Plasma N）を用いて試験する。
【0153】
測定のために、Owren's Veronal Buffer中１１：１、１：１０希釈で、フィブリノゲン濃厚物サンプルの希釈シリーズを調製する。すべての他の希釈、インキュベーション、試薬キット中に提供される異なる試薬の使用は、試験システム（BCS XP）により自動的に準備される。
【0154】
ＦXIII活性（ＦXIII：Ａｃ）測定
ＦXIIIの活性を、Behring coagulation system (BCS XP, Siemens Healthcare) で測定される測光試験（Berichrom FXIII, Siemens Healthcare Diagnostics GmbH）によって測定する。
ＦXIIIの活性を、Behring coagulation system (BCS XP, Siemens Healthcare) で測定される測光試験（Berichrom FXIII, Siemens Healthcare Diagnostics GmbH）によって測定する。
【0155】
提供される試薬ならびにcoagulation system BCS XPの規定の試験定義および測定指示を含み、製造者の指示にしたがって試験を行う。サンプルの結果を、標準／参照曲線を用いて評価する。
【0156】
標準／参照曲線の作製のために、標準ヒト血漿（Siemens）を異なる希釈段階で二重の測定において使用する。coagulation system（BCS XP）は、カリブレーターを基準の１５～１３０％の範囲で自動希釈する。参照曲線の妥当性を、コントロール製剤（Control Plasma N）を用いて試験する。ここで、基準の１００％（Siemens標準ヒト血漿（ＣｏＡ））は、ＷＨＯ基準での１ＩＵ／ｍｌに相当する。
【0157】
測定のために、ＮａＣｌ溶液（０．９％、ｗ／ｖ）中１：１、１：３および１：５希釈で、フィブリノゲン濃厚物サンプルの希釈シリーズを調製する。すべての他の希釈、インキュベーション、試薬キット中に提供される異なる試薬の使用は、coagulation system（BCS XP）により自動的に準備される。
【0158】
ＦXIII：Ａｇ濃度測定
この測定は、Matched-Pair抗体セットおよびVisuLize Buffer Pak（いずれもAffinity Biologicals）を用いるサンドイッチElisaアッセイに基づく。提供される試薬ならびに規定の試験定義および測定指示を含み、製造者の指示にしたがって試験を行う。較正の目的で、標準ヒト血漿（Siemens）を、１：１００から７段階の１：２希釈で使用する。
この測定は、Matched-Pair抗体セットおよびVisuLize Buffer Pak（いずれもAffinity Biologicals）を用いるサンドイッチElisaアッセイに基づく。提供される試薬ならびに規定の試験定義および測定指示を含み、製造者の指示にしたがって試験を行う。較正の目的で、標準ヒト血漿（Siemens）を、１：１００から７段階の１：２希釈で使用する。
【0159】
ＦXIII Ａサブユニットに対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体をマイクロタイタープレートにコーティングする。残りの結合部位を、ウシ血清アルブミンでブロックする。洗浄後、標準およいサンプルを適用する。結合ＦXIIIを、ペルオキシダーゼ結合ＦXIII抗体で検出する。ペルオキシダーゼ活性をＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン）に作用させ、Ｈ２ＳＯ４で停止する。４９０ｎｍにおけるＯＤを測定する。ここで、基準の１００％は、ＷＨＯ基準での１ＩＵ／ｍｌにほぼ相当する。
【0160】
Ｄダイマー測定
INNOVANCE D-Dimerは、Behring coagulation system (BCS XP) で測定される、ヒト血漿または血漿プロダクト中の架橋フィブリン分解産物（Ｄダイマー）の定量測定のための粒子増強免疫比濁アッセイである。
INNOVANCE D-Dimerは、Behring coagulation system (BCS XP) で測定される、ヒト血漿または血漿プロダクト中の架橋フィブリン分解産物（Ｄダイマー）の定量測定のための粒子増強免疫比濁アッセイである。
【0161】
提供される試薬ならびにcoagulation system BCS XPの規定の試験定義および測定指示を含み、製造者の指示にしたがって試験を行う。サンプルを、標準／参照曲線を用いて評価する。
【0162】
標準／参照曲線の作製のために、INNOVANCE D-dimerカリブレーターを異なる希釈段階で二重の測定において使用する。coagulation system（BCS XP）は、カリブレーターを０．１７～４．４ｍｇ／ｌの範囲で自動希釈する。参照曲線の妥当性を、コントロール製剤（Control Plasma N）を用いて試験する。
【0163】
測定のために、希釈剤（試験キット中に提供される）中１：１、１：５希釈で、フィブリノゲン濃厚物サンプルの希釈シリーズを調製する。すべての他の希釈、インキュベーション、試験キット中に提供される異なる試薬の使用は、試験システム（BCS XP）により自動的に準備される。
【0164】
ＴｎＢＰ濃度測定
サンプル溶液からのＴＮＢＰ抽出のためにN-Hexanを使用する。規格限界と同じ量を含む参照溶液を調製し、他のサンプルと同じ抽出手順に付す。参照およびサンプル溶液からのヘキサン相をガスクロマトグラフィーによって分析する。
サンプル溶液からのＴＮＢＰ抽出のためにN-Hexanを使用する。規格限界と同じ量を含む参照溶液を調製し、他のサンプルと同じ抽出手順に付す。参照およびサンプル溶液からのヘキサン相をガスクロマトグラフィーによって分析する。
【0165】
規格への適合の評価を、サンプルおよび対応する参照溶液からのクロマトグラムにおけるＴＮＢＰピーク高さの比較によって行う。参照溶液は、TNBP-Assay-Testからの有効標準溶液から希釈によって調製する。
【0166】
ポリソルベート８０濃度測定
ポリソルベート８０の測定を、欧州薬局方最新版２．２．２５にしたがう測光法によって行う。
ポリソルベート８０の測定を、欧州薬局方最新版２．２．２５にしたがう測光法によって行う。
【0167】
タンパク質溶液中のポリソルベート８０を測光アッセイによって測定する。ポリソルベート８０のようなポリオキシル化化合物は、アンモニウムコバルトチオシアネートと青色の複合体を形成する。
【0168】
高タンパク質含量による妨害を、エタノールによる除タンパクによって回避する。エタノールによるタンパク質沈殿の後、上清を乾固に近づくまで蒸発させる。複合体をジクロロメタンで抽出し、６２０ｎｍで光度測定する。校正関数を、除タンパクステップを行わずに作成する。
【0169】
リストセチンコファクター活性（ＲＣｏＦ、ｖＷＦ：ＲｉＣｏ）
フォン・ヴィルブランド因子のコファクター活性を、Behring coagulation system (BCS XP) で測定される、血小板凝集によるヒト血漿または血漿プロダクト中のフォン・ヴィルブランド因子のリストセチンコファクター活性の測定のためのインビトロ試験であるBCフォン・ヴィルブランド試薬によって測定する。
フォン・ヴィルブランド因子のコファクター活性を、Behring coagulation system (BCS XP) で測定される、血小板凝集によるヒト血漿または血漿プロダクト中のフォン・ヴィルブランド因子のリストセチンコファクター活性の測定のためのインビトロ試験であるBCフォン・ヴィルブランド試薬によって測定する。
【0170】
試験は原則として、提供される試薬を含み製造者の指示にしたがって行う。参照曲線を、基準の２０～１５０％から５～１００％に変更する。coagulation system BCS XPの試験定義および測定指示を適合させる。サンプルを、標準／参照曲線を用いて評価する。
【0171】
較正／参照曲線の作製のために、標準ヒト血漿を異なる希釈段階で二重の測定において使用する。coagulation system（BCS XP）は、カリブレーターを基準の５～１００％の範囲で自動希釈する。参照曲線の妥当性を、コントロール製剤（Control Plasma N）を用いて試験する。
【0172】
測定のために、ＮａＣｌ溶液（０．９％、ｗ／ｖ）中１：１および１：５希釈で、フィブリノゲン濃厚物サンプルの希釈シリーズを調製する。すべての他の希釈、インキュベーション、試験キット中に提供される異なる試薬の使用は、試験システム（BCS XP）により自動的に準備される。
【図面の簡単な説明】
【0173】
（原文に記載なし）
【図1】
【国際調査報告】