特表 2023-506111 分離チップアセンブリ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-15

(54)【発明の名称】分離チップアセンブリ

(51)【国際特許分類】

   B03B 5/00 20060101AFI20230208BHJP

   G01N 1/28 20060101ALI20230208BHJP

   G01N 1/40 20060101ALI20230208BHJP

   B01D 29/96 20060101ALI20230208BHJP

   B01D 29/01 20060101ALI20230208BHJP

   B01D 29/62 20060101ALI20230208BHJP

【ＦＩ】

B03B5/00 Z

G01N1/28 J

G01N1/40

B01D29/02 Z

B01D29/04 510A

B01D29/04 520C

B01D29/38 580C

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022522400

(86)(22)【出願日】2020-11-11

(85)【翻訳文提出日】2022-04-13

(86)【国際出願番号】 CN2020128176

(87)【国際公開番号】W WO2022099517

(87)【国際公開日】2022-05-19

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522022694

【氏名又は名称】深▲せん▼匯芯生物医療科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＨＵＩＸＩＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＣＯ．， ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ８１６８１４， Ｂｌｄｇ４ （ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｕｉｌｄｉｎｇ）， Ｙｅｓｕｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｎｏ． １３０１－７４， Ｇｕａｎｇｕａｎｇ Ｒｄ．， Ｘｉｎｌａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ， Ｇｕａｎｌａｎ Ｓｔ．， Ｌｏｎｇｈｕａ Ｄｉｓｔ． Ｓｈｅｎｚｈｅｎ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８１１０， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】陳 欲超

【テーマコード（参考）】

2G052

4D071

4D116

【Ｆターム（参考）】

2G052AA28

2G052AD29

2G052AD55

2G052BA22

2G052EA02

2G052EA11

2G052EA17

2G052GA29

2G052JA07

4D071AA02

4D071AB04

4D071AB32

4D071AB62

4D071CA05

4D071DA20

4D116AA25

4D116AA27

4D116BB02

4D116BC05

4D116BC71

4D116DD04

4D116EE02

4D116FF18B

4D116GG21

4D116KK06

4D116QA36B

4D116QA36E

4D116QA36F

4D116QB05

4D116QB17

4D116QB22

4D116QB24

4D116QB26

4D116QB48

4D116QB49

4D116QC26A

4D116QC26B

4D116QC28A

4D116QC28B

4D116QC29A

4D116QC29B

4D116RR01

4D116RR27

4D116UU01

4D116UU19

4D116VV30

(57)【要約】

分離チップアセンブリは、分離チップ、第１振動部及び第２振動部を備える。前記分離チップは、サンプルプールと、前記サンプルプールが対向する両側に位置して、孔径が前記標的粒子の粒子径よりも小さい第１濾過膜および第２濾過膜と、前記第１濾過膜を介して前記サンプルプールと連通する第１チャンバ、および前記第２濾過膜を介して前記サンプルプールと連通する第２チャンバと、を備える。前記第１振動部は、第１濾過膜と第２濾過膜に固定され、且つ振動時に第１振動波を発生させる。前記第２振動部は、第１チャンバの外面と第２チャンバの外面とに固定され、且つ振動時に第２振動波を発生させる。前記第１振動波の周波数は、前記第２振動波の周波数よりも大きく、前記第１振動波の振幅は、前記第２振動波の振幅よりも小さい。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

液体サンプルから標的粒子を分離して精製するための分離チップアセンブリであって、
前記分離チップアセンブリは、分離チップ、第１振動部及び第２振動部を備え、
前記分離チップは、サンプルプールと、前記サンプルプールが対向する両側に位置して、孔径が前記標的粒子の粒子径よりも小さい第１濾過膜および第２濾過膜と、前記第１濾過膜を介して前記サンプルプールと連通する第１チャンバ、および前記第２濾過膜を介して前記サンプルプールと連通する第２チャンバと、を備え、
前記第１振動部は、第１濾過膜と第２濾過膜に固定され、且つ振動時に第１振動波を発生させ、
前記第２振動部は、第１チャンバの外面と第２チャンバの外面とに固定され、且つ振動時に第２振動波を発生させ、
前記第１振動波の周波数は、前記第２振動波の周波数よりも大きく、前記第１振動波の振幅は、前記第２振動波の振幅よりも小さいことを特徴とする分離チップアセンブリ。

【請求項2】

前記第１振動波の周波数は、５０００Ｈｚ～８０００Ｈｚであり、第２周波数の振動数は、１００～５００Ｈｚであることを特徴とする請求項１に記載の分離チップアセンブリ。

【請求項3】

前記第１振動波の振動周波数は、前記第１濾過膜または前記第２濾過膜の共振周波数と同等であることを特徴とする請求項２に記載の分離チップアセンブリ。

【請求項4】

前記第１振動部と前記第２振動部とは、同一の水平面上に位置することを特徴とする請求項１に記載の分離チップアセンブリ。

【請求項5】

前記分離チップは、第１側蓋シートと第２側蓋シートとを備え、
前記第１側蓋シートは、第１カバーシート本体と、それぞれ前記第１カバーシート本体の両側に配置された第１ブロックシート及び第２ブロックシートとを含み、
前記第１濾過膜は、前記第１ブロックシート及び前記第２ブロックシートの間に固定され、且つ前記第１カバーシート本体と対向し、
前記第１カバーシート本体、前記第１ブロックシート、前記第２ブロックシート及び前記第１濾過膜は、共に前記第１チャンバを囲まれ、
前記第２側蓋シートは、第２カバーシート本体と、それぞれ前記第２カバーシート本体の両側に位置する第３ブロックシート及び第４ブロックシートとを含み、前記第３ブロックシートは、前記第１ブロックシートと対向し、前記第４ブロックシートは、前記第２ブロックシートと対向し、
前記第２濾過膜は、前記第２カバーシート本体に対向して、前記第３ブロックシート及び前記第４ブロックシートの間に固定され、
前記第２カバーシート本体、前記第３ブロックシート、前記第４ブロックシート及び前記第２濾過膜は、共に前記第２チャンバを囲まれ、
前記サンプルプールは、前記第１濾過膜と前記第２濾過膜との間に位置することを特徴とする請求項１に記載の分離チップアセンブリ。

【請求項6】

前記第２振動部は、前記第１カバーシート本体および前記第２カバーシート本体に固定されることを特徴とする請求項５に記載の分離チップアセンブリ。

【請求項7】

前記第１チャンバは、前記第１チャンバと外部とを連通する第１開口を設けられ、前記第２チャンバには、前記第２チャンバと外界とを連通する第２開口を設けられることを特徴とする請求項１に記載の分離チップアセンブリ。

【請求項8】

前記第１振動部は、ハーモニック発振器であることを特徴とする請求項１に記載の分離チップアセンブリ。

【請求項9】

前記第２振動部は、振動モータであることを特徴とする請求項１に記載の分離チップアセンブリ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、バイオテクノロジー分野に関し、詳しくは、液体サンプル中から標的粒子を分離するための分離チップアセンブリに関する。

【背景技術】

【0002】

エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は、細胞間のコミュニケーションの担体として母細胞からのタンパク質、核酸、代謝小分子などの特異的な成分を担持し、生細胞から大量に分泌され続け、直径が３０～１５０ｎｍであるビスリン脂質膜構造小胞である。多くの研究により、エクソソームは、腫瘍の発展に関する多くのイベントに関与し、多くのイベントは、免疫エスケープ、血管新生、腫瘍転移、腫瘍薬剤耐性などを含むことが明らかとなった。エクソソームは、より早く、持続的にがん細胞により放出されて、患者の血液循環システムに入り込み、その脂質二重膜構造は、担持されたタンパク質と包接された核酸系物質とを効果的に保護する。エクソソームは、血液、尿、腹水、組織液、涙、唾液、及び脳脊髄液等を含む多くの臨床サンプルに広く安定的に存在している。このうち、血液と尿のうちのエクソソームの数が多く、臨床サンプリングが容易である。そのため、エクソソームは、体外診断の研究および腫瘍の臨床検出分野における重要な研究対象であると考えられ、腫瘍の早期診断、腫瘍の転移・再発評価、腫瘍の異性評価、腫瘍の発生、発展と治療効果の動的検出、薬剤耐性変異検出、個別化用薬などの方面で大きな臨床価値を発揮することが期待されている。

【0003】

従来、エクソソームの臨床応用の主な障害は、分離過程で濾過膜の目詰まり現象が発生し、スループットが低く、純度が低いことである。

【発明の概要】

【0004】

以上の問題点に鑑みて、分離チップアセンブリを提供することを目的とする。

【0005】

液体サンプルから標的粒子を分離して精製するための分離チップアセンブリを提供する。分離チップアセンブリは、分離チップと、第１振動部と、第２振動部とを有する。分離チップは、サンプルプールと、前記サンプルプールが対向する両側に位置して、孔径が前記標的粒子の粒子径よりも小さい第１濾過膜および第２濾過膜と、前記第１濾過膜を介して前記サンプルプールと連通する第１チャンバおよび前記第２濾過膜を介して前記サンプルプールと連通する第２チャンバとを備えた分離チップ、振動時に第１振動波を発生させる第１濾過膜と第２濾過膜とに固定された第１振動部と、振動時に第２振動波を発生させる第１チャンバの外面と第２チャンバの外面とに固定された第２振動部とを備え、前記第１振動波の周波数は、前記第２振動波の周波数よりも大きく、前記第１振動波の振幅は、前記第２振動波の振幅よりも小さい。

【0006】

ある可能な実現態様において、前記第１振動波の周波数は、５０００Ｈｚ～８０００Ｈｚであり、前記第２周波数の振動数は、１００～５００Ｈｚである。

【0007】

ある可能な実現態様において、前記第１振動波の振動周波数は、前記第１濾過膜または前記第２濾過膜の共振周波数と同等である。

【0008】

ある可能な実現形態において、前記第１振動部と前記第２振動部とは、同一の水平面上に位置する。

【0009】

ある可能な実現態様において、前記分離チップは、第１側蓋シートと第２側蓋シートとを備え、前記第１側蓋シートは、第１カバーシート本体と、それぞれ前記第１カバーシート本体の両側に配置された第１ブロックシート及び第２ブロックシートとを含み、前記第１濾過膜は、前記第１ブロックシート及び前記第２ブロックシートの間に固定され、且つ、前記第１カバーシート本体と対向しており、前記第１カバーシート本体、前記第１ブロックシート、前記第２ブロックシート及び前記第１濾過膜は、共に前記第１チャンバ１５を囲まれており、前記第２側蓋シートは、前記第２カバーシート本体と、それぞれ前記第２カバーシート本体の両側に位置する第３ブロックシート及び第４ブロックシートとを含み、前記第３ブロックシートは前記第１ブロックシートと対向して、前記第４ブロックシートは前記第２ブロックシートと対向しており、前記第２濾過膜は、前記第２カバーシート本体に対向して、前記第３ブロックシート及び前記第４ブロックシートの間に固定され、前記第２カバーシート本体、前記第３ブロックシート、前記第４ブロックシート及び前記第２濾過膜は共に前記第２チャンバを囲まれており、前記サンプルプールは、前記第１濾過膜と前記第２濾過膜との間に位置する。

【0010】

ある可能な実現態様において、前記第２振動部は、前記第１カバーシート本体および前記第２カバーシート本体に固定される。

【0011】

ある可能な実現態様において、前記第１チャンバは、前記第１チャンバと外部とを連通する第１開口を設けられ、前記第２チャンバには、前記第２チャンバと外界とを連通する第２開口を設けられる。

【0012】

ある可能な実現態様において、前記第１振動部は、ハーモニック発振器である。

【0013】

ある可能な実現態様において、前記第２振動部は、振動モータである。

【発明の効果】

【0014】

本願の第１振動部は、従来技術と比較して、第１濾過膜および第２濾過膜に第１振動波を伝達し、濾過膜の膜孔に吸着した標的粒子を速やかに濾過膜の膜孔から分離し、還流した液体サンプル中に懸濁し直すことができる。第２振動部は、第２振動波を伝達し、第１振動波と第２振動波とが併せて液体サンプルと濾過膜を摂動して音響効果を生じさせ、標的粒子が目詰まったり、凝集したりすることが防止され、効率的な分離を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】本願実施例による分離チップアセンブリの概略構造図である。

【図2】図１に示す分離チップアセンブリに負圧を与える模式図である。

【図3】図１に示す分離チップアセンブリに印加される第１振動波及び第２振動波の模式図である。

【図4】本願実施例による分離装置の機能ブロック模式図である。

【図5】本願実施例と比較例１～４で得られたエクソソームの含有量の経時変化の傾向図である。

【図6】本願実施例で得られたエクソソームの走査電子顕微鏡の図である。

【図7】本願において体積とエクソソームの濃度が異なる尿サンプルを分離して精製して得られたエクソソームの含量テスト図である。

【図8】本願において異なる種類の液体サンプルを、分離して精製して得られたエクソソームの含量のテスト図である。

【図9】本願実施例および比較例５で得られたエクソソームについてウエスタンブロット解析を行った得るグラフである。

【図10】本願実施例および比較例５の精製時間、エクソソーム収量およびエクソソーム濃度の３つの面の比較模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本願の好ましい実施形態及び実施例に併せて、本願の技術案について説明する。なお、一方のユニットが他方のユニットに「接続」されると記載される場合、他方のユニットに直接接続されたり、中央部ユニットが同時に存在したりする。一方のユニットが他のユニットに「設置」されると記載される場合、他のユニットに直接設置されたり、中央部ユニットが同時に存在したりする。特に定義しない限り、本文で使用するすべての技術及び科学用語は、本願の技術分野に属する技術者が一般的に理解する意味と同様である。本願の明細書で使用される素子又は機器の名称は、具体的な実施例を記述する目的のみであり、本願を限定することは意図していない。

【0017】

図１を参照して、本願実施例は、液体サンプル中の異なるサイズの粒子を分離して精製されて、特定のサイズの標的粒子を得るための分離チップアセンブリ１を提供する。この液体サンプルは、人体血漿、血清、髄液、唾液、尿および胃液などであってもよい。標的粒子は、エクソソームや循環腫瘍細胞などであってもよい。分離チップアセンブリ１は、分離チップ１０と、第１振動部２０と、第２振動部３０とを備える。

【0018】

分離チップ１０は、サンプルプール１３と、サンプルプール１３が対向する両側に位置する第１濾過膜１４および第２濾過膜１６とを備える。サンプルプール１３は、液体サンプルを収容するためのものである。第１濾過膜１４および第２濾過膜１６の孔径は、いずれも標的粒子の粒径よりも小さい。

【0019】

さらに、分離チップ１０は、第１濾過膜１４を介してサンプルプール１３と連通する第１チャンバ１５と、第２濾過膜１６を介してサンプルプール１３と連通する第２チャンバ１７とを備え、第１チャンバ１５には、第１チャンバ１５と外部とを連通する第１開口部１５２が設けられる。第２チャンバ１７は、サンプルプール１３を介して第２濾過膜１６と連通し、第２チャンバ１７には、第２チャンバ１７を介して外部と連通する第２開口部１７２が設けられている。ここで、第１チャンバ１５と第２チャンバ１７とは、それぞれ当該サンプルプール１３が対向する両側に位置している。

【0020】

分離チップアセンブリ１を使用される場合、サンプルプール１３に液体サンプルを入れ、第１開口１５２と第２開口１７２とをそれぞれ真空システム５０（図４を参照する）に接続する。真空システム５０が第１開口１５２を介して第１チャンバ１５を吸引させると、第１チャンバ１５に負圧を発生させる。第１チャンバ１５の負圧により、サンプルプール１３における液体サンプルのうち、第１濾過膜１４の濾過孔径よりも小さいサイズの成分（小粒子および液体成分を含む）は、第１濾過膜１４に向かって移動し、第１濾過膜１４を介して第１チャンバ１５に流入する。真空システム５０が第２開口１７２を介して第２チャンバ１７を吸引させると、第２チャンバ１７に負圧を発生させる。第２チャンバ１７の負圧により、サンプルプール１３における液体サンプルのうち、サイズが第２濾過膜１６の濾過孔径より小さい成分は、第２濾過膜１６に向かって移動し、第２濾過膜１６を介して第２チャンバ１７に流入すると同時に、サンプルプール１３における液体サンプルが第１濾過膜１４に還流する現象が生じて、第１濾過膜１４に付着した成分の低減や除去が行われ、濾過分離過程中の濾過膜の目詰まりの発生を防止する。繰り返し交互に、第１チャンバ１５及び第２チャンバ１７内に負圧を発生させることで、液体サンプルを第１濾過膜１４及び第２濾過膜１６に効率よく交互に流して、液体サンプルにおける第１濾過膜１４及び第２濾過膜１６の孔径よりも大きなサイズの成分（すなわち標的粒子）をサンプル１３に残させる。分離チップ１０の構造の設計は、第１濾過膜１４及び第２濾過膜１６の表面に吸着した成分を、交互に繰り返し負圧変化で濾過膜の表面から容易に脱落させるように、濾過膜の膜孔が閉塞されるのを効果的に防止することができる。

【0021】

図２を併せて参照しながら、ある実施例では、当該真空システム５０が、当該第１チャンバ１５及び当該第２チャンバ１７内で交互に発生する負圧（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ、ＮＰ）は、周期的な台形パルス信号を形成する。矩形パルス信号の幅は１０Ｖ_ｐｐであり、周波数は５０００Ｈｚないし７０００Ｈｚである。そのうち、台形パルス信号は、負圧方向の急変による第１濾過膜１４及び第２濾過膜１６の破損を防止することができる。ある実施例では、血漿サンプル中のタンパク質含有量が多いことを鑑みて、濾過膜の目詰まり現象をより回避するために、一方のチャンバ内で負圧を発生させつつ、他方のチャンバ内で正圧（Ａｉｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ、 ＡＰ）を発生させ、濾過膜での還流現象を補強することができる。

【0022】

図１に示すように、第１振動材２０の数は２つである。一方の第１振動材２０は、第１濾過膜１４における第２濾過膜１６から離れた表面に固定される。他方の第１振動材２０は、第２濾過膜１６における第１濾過膜１４から離れた表面に固定される。第１振動材２０は、振動によって横方向の第１振動波を発生させ、第１濾過膜１４及び第２濾過膜１６に第１振動波を伝達して第１濾過膜１４及び第２濾過膜１６を高周波振動させる。このため、濾過膜の膜孔に吸着した標的粒子が、濾過膜の膜孔から速やかに分離され、還流される液体サンプルに新たに浮遊することが可能となり、濾過膜の膜孔が閉塞されるのをさらに防止し、効率的な分離が可能となる。

【0023】

第２振動部３０の数は２つである。そのうちの１つの第２振動部３０は、第１チャンバ１５の外面に固定されている。他方の第２振動部３０は、第２チャンバ１７の外面に固定されている。第２振動部３０は、振動において横方向の第２振動波を発生させるためのものである。図３を併せて参照すると、第１振動波の周波数は第２振動波の周波数より大きく、第１振動波の振幅は第２振動波の振幅より小さい。第２振動波は、第１チャンバ１５及び第２チャンバ１７を通じて分離チップ１０の全体に伝達され、分離チップ１０を低周波振動させる。第２振動波は、第１振動波とともに液体サンプルや濾過膜を摂動して音響流効果を生じさせ、目的粒子が濾孔を詰まらせたり、凝集したりすることを防止して、分離して精製効率を向上させることができる。一実施形態において、第１振動部２０はハーモニック発振器であり、第２振動部３０は振動モータであってもよい。

【0024】

一実施形態では、第１振動波の振動周波数は、５０００Ｈｚ～８０００Ｈｚであり、第２振動波の振動周波数は、１００～５００Ｈｚである。この振動周波数における第１振動波及び第２振動波は、いずれモターゲット粒子にダメージを与えない。好ましくは、第１振動波の振動周波数は、第１濾過膜１４又は第２濾過膜１６の共振周波数と略同一とすることができ、この場合、第１濾過膜１４又は第２濾過膜１６がより大きな振幅で振動し、濾過膜に吸着された標的粒子がより速やかに分離することが容易となる。

【0025】

ある実施形態においては、第１振動部２０と第２振動部３０とは同じ水平面に位置している。すなわち、第１振動波と第２振動波とが互いに重なり合って協調振動するように、第１振動波と第２振動波とが同一方向を向く。

【0026】

ある実施形態では、分離チップ１０は、第１側蓋シート１１と第２側蓋シート１２とを備える。第１側蓋シート１１は、第１カバーシート本体１１０と、それぞれ第１カバーシート本体１１０の両側に配置された第１ブロックシート１１１及び第２ブロックシート１１２とを含み、第１濾過膜１４は、第１ブロックシート１１１及び第２ブロックシート１１２の間に固定され、且つ、第１カバーシート本体１１０と対向している。第１カバーシート本体１１０、第１ブロックシート１１１、第２ブロックシート１１２及び第１濾過膜１４は、共に第１チャンバ１５を囲む。第２側蓋シート１２は、第２カバーシート本体１２０と、それぞれ第２カバーシート本体１２０の両側に位置する第３ブロックシート１２１及び第４ブロックシート１２２とを含み、第３ブロックシート１２１は、第１ブロックシート１１１と対向し、第４ブロックシート１２２は、第２ブロックシート１１２と対向し、第２濾過膜１６は、第２カバーシート本体１２０に対向して、第３ブロックシート１２１及び第４ブロックシート１２２の間に固定され、第２カバーシート本体１２０、第３ブロックシート１２１、第４ブロックシート１２２及び第２濾過膜１６は、共に第２チャンバ１７を囲んでいる。サンプルプール１３は、第１濾過膜１４と第２濾過膜１６との間に位置する。なお、第２振動部３０は、第１カバーシート１１０又は第２カバーシート本体１２０の外面に固定されている。

【0027】

さらに、第１ブロックシート１１１および第三ブロックシート１２１は、サンプルプール１３に連通するサンプル導入口１３１を規定するように離間して配置されている。分離チップ１０は、サンプル導入口１３１を介してサンプルプール１３と連通するサンプル充填室１８をさらに備える。操作時に、サンプル充填室１８に液体サンプルを入れ、サンプル充填口１３１は、試料充填室１８内の液体サンプルがサンプル充填室１８から流出してサンプルプール１３に入れるように使用される。

【0028】

なお、図４を参照して、本願の実施形態は、上述したような分離チップアセンブリ１と、真空システム５０と、周波数変換モジュール４０と、コントローラ６０とを備えた分離装置１００をさらに提供する。

【0029】

真空システム５０は、分離チップアセンブリ１の第１チャンバ１５及び第２チャンバ１７のそれぞれに負圧を発生させるためのものである。真空システム５０は、２つの独立した真空システムであってもよいし、設計された１つの真空システムであってもよい。真空システム５０は、マイクロ真空ポンプやマイクロ吸引ポンプ等の機器を含んでもよい。真空システム５０と分離チップ１０との間は、気密性の良い配管で接続できることが理解できる。ある実施形態では、真空システム５０は、分離チップ１０の第１開口１５２に接続された第１真空ポンプ５１０と、分離チップ１０の第２開口１７２に接続された第２真空ポンプ５２０とを含む。

【0030】

周波数変換モジュール４０は、真空システム５０に電気的に接続され、周波数変換モジュール４０は、真空システム５０に供給する電源電圧を制御して、第１チャンバ１５と第２チャンバ１７内に交互に負圧を発生させることができる。ある実施形態において、周波数変換モジュール４０は、周波数変換器４１０と、周波数変換器４１０に接続される制御弁４２０とを含む。制御弁４２０は、液路コンバーターであってもよいが、電磁弁や回転弁に限定されない。制御弁４２０は、それぞれ第１真空ポンプ５１０及び第２真空ポンプ５２０の一方と連通し、第１真空ポンプ５１０と第２真空ポンプ５２０とを交互に繰り返し作動させる。例えば、制御弁４２０を第１真空ポンプ５１０に連通させることで、周波数変換器４１０が第１真空ポンプ５１０の運転を制御し、第１開口１５２を通して抽気して第１チャンバ１５内に負圧を発生させ、サンプルプール１３における液体サンプルの液体と第１濾過膜１４の孔径よりも小さいサイズの成分とが負圧によって第１濾過膜１４を通して第１チャンバ１５に入り込み、そして、周波数変換器４１０は、第１真空ポンプ５１０を制御して運転を停止する。その後、制御弁４２０を第２真空ポンプ５２０に連通させることで、周波数変換器４１０は、第２真空ポンプ５２０の運転を制御し、第２開口１７２を介して吸引して第２チャンバ１７内に負圧を発生させることで、サンプルプール１３における液体サンプル中の液体と第２濾過膜１６の孔径よりも小さいサイズの成分とを、負圧により第２濾過膜１６を通して第２チャンバ１７に入れる。その後、周波数変換器４１０は、第２真空ポンプ５２０を制御して運転を停止する。上記ステップを複数回繰り返す。

【0031】

制御部６０は、第１チャンバ１５の吸引が停止されるときに、第１振動波及び第２振動波がそれぞれ発生するように、第１振動部２０及び第２振動部３０の振動を制御する。また、制御部６０は、第２チャンバ１７の吸引が停止されるときに、第１振動波及び第２振動波がそれぞれ発生するように、第１振動部２０及び第２振動部３０の振動を制御する。ここで、コントローラ６０は、第１真空ポンプ５１０と第２真空ポンプ５２０と電気的に接続可能であり、第１真空ポンプ５１０または第２真空ポンプ５２０の運転が停止すると、コントローラ６０は、第１チャンバ１５において第１真空ポンプ５１０の吸引が停止されたと判定したり、または第２チャンバ１７において第２真空ポンプ５２０の吸引が停止されたと判定したりすると、対応する第１振動部２０および第２振動部３０の振動の開始を通知することができる。

【0032】

本願実施例は、さらに、以下の工程を含み、上記分離チップアセンブリ１に適用される液体サンプル中の標的粒子を分離する方法を提供する。
ステップＳ１は、本願の分離チップアセンブリ１を提供し、該当分離チップアセンブリ１のサンプルプール１３に液体サンプルを供給する。

【0033】

ステップＳ２では、第１開口１５２により第１チャンバ１５が吸引され、第１チャンバ１５内に負圧を発生させる。
ここで、吸引を行う前に、第１開口１５２、第２開口１７２をそれぞれ分離装置１００の真空システム５０に接続する。このように、真空システム５０は、第１開口１５２により第１チャンバ１５を吸引し、第１チャンバ１５内に負圧を発生させる。サンプルプール１３における液体サンプル中の液体およびサイズが第１濾過膜１４の孔径よりも小さい成分は、負圧によって第１濾過膜１４に向かって移動し、第１濾過膜１４を介して第１チャンバ１５に入れてもよい。

【0034】

ステップＳ３では、第１チャンバ１５の吸引が停止され、第１振動部２０及び第２振動部３０の振動を制御して、第１振動波及び第２振動波をそれぞれ発生させる。同時に、通過した第２開口１７２が第２チャンバ１７を吸引して第２チャンバ１７内に負圧を発生させる。
ここで、第１振動波は、第１濾過膜１４を高周波振動させるものであり、濾過膜の膜孔に吸着した標的粒子を速やかに濾過膜の膜孔から分離させ、還流される液体サンプル中に再懸濁させることができる。第２振動波は、標的粒子が凝集してしまうことを防ぐことができる。同時に、真空システム５０は、第２開口１７２により第２チャンバ１７を吸引し、第２チャンバ１７内に負圧を発生させる。第１濾過膜１４の表面に付着した成分は、気流及び／又は液流サンプルプール１３においてサンプルプール１３における液体サンプル中の液体と第２濾過膜１６の孔径よりも小さい成分とが負圧により第２濾過膜１６に向かって移動し、第２濾過膜１６を介して第２チャンバ１７に入れてもよい。

【0035】

ステップＳ４では、第２チャンバ１７の吸引が停止され、第１振動部２０及び第２振動部３０を振動させるように制御する。
そして、ステップＳ２～ステップＳ４は、複数回循環され、液体サンプル中の濾過膜の孔径よりも小さい成分が除去され、濾過膜の孔径よりも大きい成分がサンプルプール１３に閉じ込められることにより、分離精製効果をより優れたものとすることができる。

【0036】

以下、実施例および比較例を併せて本願について具体的に説明する。

【実施例】

【0037】

本願で提供する分離チップアセンブリを用いて２ｍＬの尿サンプルをエクソソームと分離して精製を行い、第１振動部の周波数が６２５０Ｈｚ（濾過膜の共振周波数と略同じ）、第２振動部の周波数が２００Ｈｚである。

【比較例１】

【0038】

分離チップを用いて２ｍＬの尿サンプルをエクソソームと分離して精製を行ったところ、比較例１の分離チップは、第１振動部および第２振動部を含んでいない点が、実施例の分離チップアセンブリと相違する。

【比較例２】

【0039】

分離チップを用いて２ｍＬの尿サンプルをエクソソームと分離して精製を行ったところ、実施例２の分離チップには、第２振動部（周波数２００Ｈｚ）のみが含まれ、第１振動部が含まれていない点で、実施例の分離チップアセンブリと相違する。

【比較例３】

【0040】

分離チップを用いて２ｍＬの尿サンプルをエクソソームと分離して精製を行ったところ、実施例３の分離チップは、第１振動部（周波数６２５０Ｈｚ）のみを含み、第２振動部を含まない点で、実施例の分離チップモジュールと相違する。

【比較例４】

【0041】

デッドエンド濾過法（ｄｅａｄ－ｅｎｄ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて２ｍＬの尿サンプルをエクソソームと分離して精製を行ったところ、デッドエンド濾過が実施例の分離チップと同じ濾過膜を用いたが、濾過膜の上流に液体サンプルを置き、圧力差の押し込みにより、濾過膜に液体成分と膜孔よりも粒子径の小さい粒子とを透過させる点で相違する。
実施例および比較例１～４が経時的に得られたエクソソームの含有量を測定した結果を図５に記録した。図５に示すように、実施例は、１０ｍｉｎ以内に約３０μｍのエクソソームを分離でき、比較例１～４よりも分離効率がかなり大きい。さらに、実施例で得られたエクソソームについて、透過型電子顕微鏡試験（スケールラベル２５０ｎｍ）を行い、試験結果を図６に示す。このうち分離されたエクソソームの粒子径は５０ｎｍ～２００ｎｍであり、エクソソームの理論粒子径と一致し、且つその形は円形またはカップ形であり、高い完全性を有する。

【0042】

また、エクソソーム濃度が異なる４種類の尿サンプルを、同一の分離チップアセンブリを用いて同一の方法で分離して精製を繰り返し行い、各尿サンプルの体積は１ｍＬから２０ｍＬまで様々である。そして、分離するたびに得られるエクソソームごとに微量紫外可視光分光光度計を用いてタンパク質含量試験を行った結果を図７に記録した。図７に示すように、精製されたエクソソームの含有率は、エクソソーム濃度ごとに尿サンプル体積の増加に伴って線形に増大する傾向にあり、これは、種々の異なる体積の尿サンプルまたは尿サンプルが種々の異なる量のエクソソームを有する場合に、本願の実施例の分離チップアセンブリを用いて分離して精製することは、構造安定性が高いことが示された。また、同じ分離チップアセンブリを用いて体積１０ｍＬの尿サンプルを分離して精製することを繰り返し、２０回繰り返した後に、得られたエクソソーム含量の変異係数（ＣＶ）が９．９％未満であることが認められ、その分離チップアセンブリを用いた分離して精製が高い反復性を有することが示された。

【0043】

さらに、本願が提供する分離チップアセンブリーは、血漿（ｐｌａｓｍａ）、細胞培養液（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）、涙（ｔｅａｒ）、唾液（ｓａｌｉｖａ）、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）等を含む他の液体サンプルに対してエクソソーム分離して精製を行うこともできる。図８に示すように、これらのいくつかの液体サンプルから高濃度のエクソソームが分離され、本願において提供される分離チップアセンブリは、様々な液体サンプルと分離して精製に適していることが示された。また、分離されたエクソソームの粒子径は、同じく５０ｎｍ～２００ｎｍである。

【比較例５】

【0044】

従来の超遠心（ＵＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿、ホスファチジルセリン（ＰＳ）アフィニティー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、膜アフィニティー（ＭＡ）等の方法を用いて、同じ尿サンプルからエクソソームが分離される。

【0045】

具体的には、実施例および比較例５において、各分離して精製方法で得られたエクソソーム中のＡＬＩＸ、ＣＤ６３、ＴＳＧ１０１、ＣＤ８１タンパク質マーカーを、タンパク質インプリント法を用いて試験した。このうち、ウロモジュリン（ＵＭＯＤ）は、尿サンプル中の含有量が高いタンパク質であり、エクソソーム精製後の純度を表すために使用できる。図９に示すように、従来と分離して精製方法に対して、尿サンプルを分離チップアセンブリ（図９にＥＸＯＤＵＳと記載）で分離して精製したエクソソームにおいて、高濃度の４種類のタンパク質マーカーを同時に検出でき、精製収量が高いことが示された。また、エクソソームには、多量のウロモジュリンが吸着されておらず、精製精度が高いことが示された。

【0046】

このうち、精製にかかる時間、エクソソーム収量及びエクソソーム純度は、異なる分離して精製方法を表すための３つの面のパラメータである。図１０に示されるように、実施例の分離チップアセンブ（図１０においてＥＸＯＤＵＳと記載）は、比較例５の従来と分離して精製方法に比べ、分離して精製にかかる時間が短く（９５％低減）、エクソソームの産出量が高く（５２６％向上）、エクソソーム純度が高く（２５９％向上）、市販されている種々のエクソソーム分離手段に比べ、強い競合力を有することが示された。

【0047】

上記実施例は本願の好ましい実施形態であるが、本願の実施形態は上記実施例に限られるものではなく、以上の実施形態は特許請求の範囲の解釈に過ぎない。しかし、本願の保護範囲が明細書に限られず、当業者は、本願が開示される技術範囲内で、容易に想到し得る変化または置き換えが、本願の保護範囲に含まれる。

【符号の説明】

【0048】

１ 分離チップアセンブリ
１０ 分離チップ
１１ 第１側蓋シート
１２ 第２側蓋シート
１３ サンプルプール
１４ 第１濾過膜
１５ 第１チャンバ
１６ 第２濾過膜
１７ 第２チャンバ
１８ サンプル充填室
２０ 第１振動部
３０ 第２振動部
４０ 周波数変換モジュール
５０ 真空システム
６０ コントローラ
１００ 分離装置
１１０ 第１カバーシート本体
１１１ 第１ブロックシート
１１２ 第２ブロックシート
１２０ 第２カバーシート本体
１２１ 第３ブロックシート
１２２ 第４ブロックシート
１３１ サンプル導入口
１５２ 第１開口部
１７２ 第２開口部
４１０ 周波数変換器
４２０ 制御弁
５１０ 第１真空ポンプ
５２０ 第２真空ポンプ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】