特表 2023-506254 ヒスチジン、プリン経路代謝生成物およびプラスミドＤＮＡの産生増強

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-15

(54)【発明の名称】ヒスチジン、プリン経路代謝生成物およびプラスミドＤＮＡの産生増強

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20230208BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20230208BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20230208BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20230208BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20230208BHJP

   C12N 15/60 20060101ALI20230208BHJP

   C12N 15/61 20060101ALI20230208BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230208BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230208BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230208BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230208BHJP

   C12P 13/24 20060101ALI20230208BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54

C12N15/10 Z ZNA

C12N15/11 Z

C12N15/53

C12N15/55

C12N15/60

C12N15/61

C12N15/10 200Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P13/24 C

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022536706

(86)(22)【出願日】2020-12-16

(85)【翻訳文提出日】2022-08-12

(86)【国際出願番号】 US2020065286

(87)【国際公開番号】W WO2021126961

(87)【国際公開日】2021-06-24

(31)【優先権主張番号】62/994,901

(32)【優先日】2020-03-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/948,730

(32)【優先日】2019-12-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/044,925

(32)【優先日】2020-06-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516286741

【氏名又は名称】ギンゴー バイオワークス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】ハジヴァシレイウ，アルキヴィアディス オルフェフス

(72)【発明者】

【氏名】キング，ジェイソン

(72)【発明者】

【氏名】マク，フェイ－ミン

(72)【発明者】

【氏名】ロドリゲス，ガブリエル

(72)【発明者】

【氏名】レンベック，エミリー イー

(72)【発明者】

【氏名】ヤング，デイビッド

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AE26

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA10

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA17

(57)【要約】

本発明の態様は、宿主細胞におけるヒスチジンの生合成に関する。例えば、宿主細胞は、プロモーター；リボソーム結合部位(ＲＢＳ)；およびｈｉｓＧ；ｈｉｓＤ；ｈｉｓＣ；ｈｉｓＢ；ｈｉｓＨ；ｈｉｓＡ；ｈｉｓＦ；および／またはｈｉｓＩを含む核酸を含み得る。宿主細胞は、野生型大腸菌ＲＰＰＫの配列と比較してリボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)をコードする核酸をさらに含み、所望により１以上のアミノ酸置換を含む。本発明の宿主細胞は、５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)酵素をコードする核酸を含み得る。本発明のさらなる態様は、宿主細胞におけるプリン経路代謝生成物および／またはプラスミドＤＮＡの産生に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

天然に存在しない核酸であって：
ａ)配列番号１または２と少なくとも９０％同一である配列を含むプロモーター；および
ｂ)
ｉ)ｈｉｓＧ；
ii)ｈｉｓＤ；
iii)ｈｉｓＣ；
iv)ｈｉｓＢ；
ｖ)ｈｉｓＨ；
vi)ｈｉｓＡ；
vii)ｈｉｓＦ；および／または
viii)ｈｉｓＩ
を含む１以上の核酸
を含み、ここで、(ａ)および(ｂ)が操作可能に結合される、核酸。

【請求項2】

天然に存在しない核酸がリボソーム結合部位(ＲＢＳ)をさらに含む、請求項１の天然に存在しない核酸。

【請求項3】

天然に存在しない核酸がインスレーターリボザイムをさらに含む、請求項１または２の天然に存在しない核酸。

【請求項4】

ａ)インスレーターリボザイムが配列番号５と少なくとも９０％同一である配列を含む；および／または
ｂ)ＲＢＳが配列番号３または４と少なくとも９０％同一である配列を含む、
請求項１～３の何れかの天然に存在しない核酸。

【請求項5】

ａ)ｈｉｓＧが配列番号７または９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードする；
ｂ)ｈｉｓＤが配列番号１１と少なくとも９０％同一であるであるアミノ酸配列をコードする；
ｃ)ｈｉｓＣが配列番号１３と少なくとも９０％同一であるであるアミノ酸配列をコードする；
ｄ)ｈｉｓＢが配列番号１５と少なくとも９０％同一であるであるアミノ酸配列をコードする；
ｅ)ｈｉｓＨが配列番号１７と少なくとも９０％同一であるであるアミノ酸配列をコードする；
ｆ)ｈｉｓＡが配列番号１９と少なくとも９０％同一であるであるアミノ酸配列をコードする；
ｇ)ｈｉｓＦが配列番号２１と少なくとも９０％同一であるであるアミノ酸配列をコードする；および／または
ｈ)ｈｉｓＩが配列番号２３と少なくとも９０％同一であるミノ酸配列をコードする、
請求項１～４の何れかの天然に存在しない核酸。

【請求項6】

ａ)ｈｉｓＧが配列番号６または８と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む；
ｂ)ｈｉｓＤが配列番号１０と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む；
ｃ)ｈｉｓＣが配列番号１２と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む；
ｄ)ｈｉｓＢが配列番号１４と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む；
ｅ)ｈｉｓＨが配列番号１６と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む；
ｆ)ｈｉｓＡが配列番号１８と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む；
ｇ)ｈｉｓＦが配列番号２０と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む；および／または
ｈ)ｈｉｓＩが配列番号２２と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む、
請求項１～５の何れかの天然に存在しない核酸。

【請求項7】

ｈｉｓＧがｈｉｓＧ^{(Ｅ２７１Ｋ)}を含む、請求項１～６の何れかの天然に存在しない核酸。

【請求項8】

プロモーターおよびＲＢＳが請求項１(ｂ)の(ｉ)～(viii)の１以上を含む核酸に操作可能に結合される、請求項２～７の何れかの天然に存在しない核酸。

【請求項9】

請求項１(ｂ)における核酸が(ｉ)～(viii)すべてを含む、請求項１～８の何れかの天然に存在しない核酸。

【請求項10】

請求項１(ｂ)における核酸が(ｉ)～(viii)を(ｉ)、(ii)、(iii)、(iv)、(ｖ)、(vi)、(vii)および(viii)の順序で含む、請求項９の天然に存在しない核酸。

【請求項11】

(ｂ)における核酸が配列番号２４と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１０の天然に存在しない核酸。

【請求項12】

核酸が配列番号２５または２６と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項９～１１の何れかの天然に存在しない核酸。

【請求項13】

配列番号２４～２６の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む、天然に存在しない核酸。

【請求項14】

核酸がリボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)をコードする異種遺伝子をさらに含み、ここで、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが
ａ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または
ｂ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基
にアミノ酸置換を含む、請求項１～１０の何れかの天然に存在しない核酸。

【請求項15】

野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ、請求項１４の天然に存在しない核酸。

【請求項16】

野生型大腸菌ＲＰＰＫの配列と比較して、ＲＰＰＫが野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＤ１１５に対応する残基にアミノ酸置換を含む、請求項１４または１５の天然に存在しない核酸。

【請求項17】

ＲＰＰＫが次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ｄ１１５Ｓ、Ｄ１１５Ｌ；Ｄ１１５Ｍ；およびＤ１１５Ｖ、請求項１６の天然に存在しない核酸。

【請求項18】

請求項１～１７の何れかの天然に存在しない核酸を含む、宿主細胞。

【請求項19】

天然に存在しない核酸が全体としてまたは一部宿主細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１８の宿主細胞。

【請求項20】

宿主細胞がＨＴＨ型転写リプレッサーＰｕｒＲの発現が減少するように修飾されている、請求項１８または１９の宿主細胞。

【請求項21】

修飾がＰｕｒＲ欠失を含む、請求項２０の宿主細胞。

【請求項22】

配列番号１または２と少なくとも９０％同一である配列を含むプロモーターおよびｈｉｓＧ；ｈｉｓＤ；ｈｉｓＣ；ｈｉｓＢ；ｈｉｓＨ；ｈｉｓＡ；ｈｉｓＦ；および／またはｈｉｓＩの１以上を含む天然に存在しない核酸の１以上を含む、宿主細胞。

【請求項23】

天然に存在しない核酸の１以上がリボソーム結合部位(ＲＢＳ)をさらに含む、請求項２２の宿主細胞。

【請求項24】

天然に存在しない核酸の１以上が宿主細胞のゲノムに組み込まれる、請求項２２または２３の宿主細胞。

【請求項25】

宿主細胞が細菌細胞である、請求項１８～２４の何れかの宿主細胞。

【請求項26】

細菌細胞が大腸菌細胞である、請求項２５の宿主細胞。

【請求項27】

宿主細胞が対照宿主細胞と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍または１００倍多くヒスチジンを産生でき、ここで、対照宿主細胞が野生型大腸菌細胞である、請求項１８～２６の何れかの宿主細胞。

【請求項28】

宿主細胞がＨＴＨ型転写リプレッサーＰｕｒＲの発現が減少するように修飾されている、請求項２２～２７の何れかの宿主細胞。

【請求項29】

修飾がＰｕｒＲ欠失を含む、請求項２８の宿主細胞。

【請求項30】

宿主細胞がリボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)をコードする異種遺伝子をさらに含み、ここで、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが
ａ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＤ１１５に対応する残基；
ｂ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または
ｃ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基
にアミノ酸置換を含む、請求項２２～２９の何れかの宿主細胞。

【請求項31】

野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ｄ１１５Ｓ；Ｄ１１５Ｌ；Ｄ１１５Ｍ；Ｄ１１５Ｖ；Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ、請求項３０の宿主細胞。

【請求項32】

リボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)をコードする天然に存在しない核酸であって、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが
ａ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または
ｂ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基
にアミノ酸置換を含む、天然に存在しない核酸。

【請求項33】

野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較してＲＰＰＫが次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ、請求項３２の天然に存在しない核酸。

【請求項34】

天然に存在しないリボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)であって、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが
ａ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または
ｂ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基
にアミノ酸置換を含む、ＲＰＰＫ。

【請求項35】

野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ、請求項３４のＲＰＰＫ。

【請求項36】

請求項３２または３３の天然に存在しない核酸を含む、宿主細胞。

【請求項37】

請求項１８～３１または３６の何れかの宿主細胞を培養することを含む、ヒスチジンを産生する方法。

【請求項38】

宿主細胞が５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)酵素をコードする異種核酸をさらに含む、請求項１８～３１または３６の何れかの宿主細胞。

【請求項39】

宿主細胞がＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸を２コピー以上含む、請求項３８の宿主細胞。

【請求項40】

ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸が宿主細胞の染色体に組み込まれる、請求項３８または３９の宿主細胞。

【請求項41】

ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸が合成プロモーターの制御下に発現される、請求項３８～４０の何れかの宿主細胞。

【請求項42】

合成プロモーターが構成的である、請求項４１の宿主細胞。

【請求項43】

ＭＴＨＦＤＣ酵素が配列番号３６と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項３８～４２の何れかの宿主細胞。

【請求項44】

プロモーターが配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項４１の宿主細胞。

【請求項45】

プロモーターが配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含む、請求項４４の宿主細胞。

【請求項46】

核酸が配列番号３５と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項３８～４５の何れかの宿主細胞。

【請求項47】

宿主細胞がＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする核酸を２コピー以上含まない宿主細胞と比較して、増加した量のヒスチジンを産生する、請求項３９～４６の何れかの宿主細胞。

【請求項48】

ａ)配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７と少なくとも９０％同一である配列を含むプロモーター；および
ｂ)５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)酵素をコードする遺伝子
を含む天然に存在しない核酸であって、
(ａ)および(ｂ)が操作可能に結合される、天然に存在しない核酸。

【請求項49】

ＭＴＨＦＤＣ酵素の配列が配列番号３６と少なくとも９０％同一である、請求項４８の天然に存在しない核酸。

【請求項50】

ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする遺伝子が配列番号３５と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項４８または４９の天然に存在しない核酸。

【請求項51】

請求項４８～５０の何れかの天然に存在しない核酸を含む、宿主細胞。

【請求項52】

宿主細胞が２コピー以上のＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする遺伝子を含む、請求項５１の宿主細胞。

【請求項53】

ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする遺伝子の１コピーがその天然プロモーターの制御下に、細胞で内因性に発現される、請求項５２の宿主細胞。

【請求項54】

宿主細胞天然に存在しない核酸を含まない宿主細胞と比較して増加した量のヒスチジンを産生する、請求項５１の宿主細胞。

【請求項55】

請求項３８～４７および５１～５４の何れかの宿主細胞を培養することを含む、ヒスチジンを産生する方法。

【請求項56】

５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)酵素をコードする異種核酸を含む宿主細胞であって、ここで、異種核酸が合成プロモーターの制御下に発現され、異種核酸を発現しない対照宿主細胞と比較して増加した量のプリン経路代謝生成物を産生する、宿主細胞。

【請求項57】

プリン経路代謝生成物がイノシン、グアノシン、キサントシン、アデノシン、ヒポキサンチン、グアニン、キサンチン、アデニン、イノシン一リン酸(ＩＭＰ)、キサントシン一リン酸(ＸＭＰ)、グアノシンリン酸(例えばＧＭＰ、ＧＤＰおよびＧＴＰ)および／またはアデノシンリン酸(例えばＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰ)である、請求項５６の宿主細胞。

【請求項58】

宿主細胞が異種核酸を発現しない対照宿主細胞と比較してＧＴＰからリボフラビンへの変換の増加を示す、請求項５６または５７の宿主細胞。

【請求項59】

宿主細胞が異種核酸を発現しない対照宿主細胞と比較して増加したフラボノイド補因子フラビンモノヌクレオチド(ＦＭＮ)および／またはフラビンアデニンジヌクレオチド(ＦＡＤ)を産生する、請求項５６～５８の何れかの宿主細胞。

【請求項60】

宿主細胞が異種核酸を発現しない対照宿主細胞と比較してキサンチンから尿酸への変換の増加を示す、請求項５６～５９の何れかの宿主細胞。

【請求項61】

ＭＴＨＦＤＣ酵素が配列番号３６と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項５６～６０の何れかの宿主細胞。

【請求項62】

プロモーターが構成的である、請求項５６～６１の何れかの宿主細胞。

【請求項63】

プロモーターが配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項５６～６２の何れかの宿主細胞。

【請求項64】

プロモーターが配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含む、請求項６３の宿主細胞。

【請求項65】

異種核酸が配列番号３５と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項５６～６４の何れかの宿主細胞。

【請求項66】

宿主細胞がＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸を２コピー以上含む、請求項５６～６５の何れかの宿主細胞。

【請求項67】

ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸が宿主細胞の染色体に組み込まれる、請求項５６～６６の何れかの宿主細胞。

【請求項68】

宿主細胞がＨＴＨ型転写リプレッサーＰｕｒＲの発現が減少するように修飾されている、請求項５６～６７の何れかの宿主細胞。

【請求項69】

修飾がＰｕｒＲ欠失を含む、請求項６８の宿主細胞。

【請求項70】

宿主細胞がリボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)をコードする異種遺伝子をさらに含み、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが
ａ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＤ１１５に対応する残基；
ｂ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または
ｃ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基
にアミノ酸置換を含む、請求項５６～６９の何れかの宿主細胞。

【請求項71】

野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ｄ１１５Ｓ；Ｄ１１５Ｌ；Ｄ１１５Ｍ；Ｄ１１５Ｖ；Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ、請求項７０の宿主細胞。

【請求項72】

宿主細胞が細菌細胞である、請求項５６～７１の何れかの宿主細胞。

【請求項73】

細菌細胞が大腸菌細胞である、請求項７２の宿主細胞。

【請求項74】

請求項５６～７３の何れかの宿主細胞を培養することを含む、方法。

【請求項75】

５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)酵素をコードする異種核酸を含む宿主細胞であって、異種核酸が合成プロモーターの制御下に発現され、異種核酸を発現しない対照宿主細胞と比較して増加した量のプラスミドＤＮＡ(ｐＤＮＡ)を産生する、宿主細胞。

【請求項76】

宿主細胞が合成プロモーターの制御下に、１以上のプリン生合成酵素をコードする１以上の異種遺伝子をさらに含む、請求項７５の宿主細胞。

【請求項77】

１以上のプリン生合成酵素をコードする異種遺伝子の１以上がｐｕｒＡ、ｐｕｒＢ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＤ、ｐｕｒＥ、ｐｕｒＦ、ｐｕｒＨ、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＴ、ｇｕａＡ、ｇｕａＢまたはａｄｋである、請求項７６の宿主細胞。

【請求項78】

宿主細胞がＨＴＨ型転写リプレッサーＰｕｒＲの発現が減少するように修飾されている、請求項７５～７７の何れかの宿主細胞。

【請求項79】

修飾がＰｕｒＲ欠失を含む、請求項７８の宿主細胞。

【請求項80】

宿主細胞が１以上のピリミジン生合成酵素をコードする１以上の異種遺伝子をさらに含む、請求項７５～７９の何れかの宿主細胞。

【請求項81】

１以上のピリミジン生合成酵素をコードする異種遺伝子の１以上がｃａｒＡＢ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、ｐｙｒＥ、ｐｙｒＦ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒＨまたはｐｙｒＩである、請求項８０の宿主細胞。

【請求項82】

宿主細胞がアルギニン応答性転写リプレッサーＡｒｇＲの発現が低減するように修飾されている、請求項７５～８１の何れかの宿主細胞。

【請求項83】

修飾がａｒｇＲ欠失を含む、請求項８２の宿主細胞。

【請求項84】

宿主細胞がリボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)をコードする異種遺伝子をさらに含み、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが
ａ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＤ１１５に対応する残基；
ｂ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または
ｃ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基
にアミノ酸置換を含む、請求項７５～８３の何れかの宿主細胞。

【請求項85】

野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ｄ１１５Ｓ；Ｄ１１５Ｌ；Ｄ１１５Ｍ；Ｄ１１５Ｖ；Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ、請求項８４の宿主細胞。

【請求項86】

宿主細胞がｅｎｄＡ１、ｒｅｃＡおよびｒｅｌＡの１以上の発現が低減するように修飾されている、請求項７５～８５の何れかの宿主細胞。

【請求項87】

宿主細胞がｒｅｌＡの発現が低減するように修飾されている、請求項８６の宿主細胞。

【請求項88】

修飾がｅｎｄＡ１、ｒｅｃＡまたはｒｅｌＡ欠失の１以上を含む、請求項８６の宿主細胞。

【請求項89】

修飾がｒｅｌＡ欠失を含む、請求項８８の宿主細胞。

【請求項90】

宿主細胞ｈｉｓＧをコードする核酸を含み、ａ)ｈｉｓＧがｈｉｓＧ^{(Ｅ２７１Ｋ)}を含まない、請求項７５～８９の何れかの宿主細胞。

【請求項91】

宿主細胞がｓｐｏＴ、ｆｒｕＲ、ｐｇｉ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ａｃｋＡ、ｅｕｔＤ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｐｔｓＧおよびｐｔｓＨの１以上の発現が低減するように修飾されている、請求項７５～９０の何れかの宿主細胞。

【請求項92】

修飾がｓｐｏＴ、ｆｒｕＲ、ｐｇｉ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ａｃｋＡ、ｅｕｔＤ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｐｔｓＧまたはｐｔｓＨ欠失の１以上を含む、請求項９１の宿主細胞。

【請求項93】

宿主細胞がＤＮＡポリメラーゼIII、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＰＥＰ非依存性糖パーミアーゼ、アンモニア輸送体、グルタミンシンターゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびグルタミン酸シンターゼの１以上をコードする異種遺伝子をさらに含む、請求項７５～９２の何れかの宿主細胞。

【請求項94】

(ｉ)ＰＥＰ非依存性糖パーミアーゼをコードする遺伝子がｇａｌＰまたはｍｇｌＢＡＣであり；
(ii)アンモニア輸送体をコードする遺伝子がａｍｔであり；
(iii)グルタミンシンターゼをコードする遺伝子がｇｌｎＡであり；そして
(iv)グルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子がｇｌｔＤＢである、
請求項９３の宿主細胞。

【請求項95】

宿主細胞がｐｒｉＡ、ｚｗｆおよびｒｐｉＡの１以上を含む異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項７５～９４の何れかの宿主細胞。

【請求項96】

宿主細胞がバチルスｇａｐＢ遺伝子をさらに含む、請求項７５～９５の何れかの宿主細胞。

【請求項97】

宿主細胞が枯草菌からのＮＡＤＨ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする異種遺伝子をさらに含む、請求項７５～９６の何れかの宿主細胞。

【請求項98】

ＭＴＨＦＤＣ酵素が配列番号３６と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項７５～９７の何れかの宿主細胞。

【請求項99】

プロモーターが構成的である、請求項７５～９８の何れかの宿主細胞。

【請求項100】

プロモーターが配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項７５～９９の何れかの宿主細胞。

【請求項101】

プロモーターが配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含む、請求項１００の宿主細胞。

【請求項102】

ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸を含む異種核酸が配列番号３５と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項７５～１０１の何れかの宿主細胞。

【請求項103】

宿主細胞がＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸を２コピー以上含む、請求項７５～１０２の何れかの宿主細胞。

【請求項104】

ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸が宿主細胞の染色体に組み込まれる、請求項７５～１０３の何れかの宿主細胞。

【請求項105】

宿主細胞が細菌細胞である、請求項７５～１０４の何れかの宿主細胞。

【請求項106】

細菌細胞が大腸菌細胞である、請求項１０５の宿主細胞。

【請求項107】

宿主細胞がｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｍ}またはｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｓ}を含み、ｒｅｌＡ、ｅｎｄＡ、ｒｅｃＡおよびｐｕｒＲの１以上の欠失をさらに含む、請求項７５～１０６の何れかの宿主細胞。

【請求項108】

請求項７５～１０７の何れかの宿主細胞を培養することを含む、プラスミドＤＮＡを産生する方法。

【請求項109】

５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)酵素をコードする異種核酸を含む宿主細胞を培養することを含む、プラスミドＤＮＡを産生する方法。

【請求項110】

宿主細胞が合成プロモーターの制御下に、１以上のプリン生合成酵素をコードする１以上の異種遺伝子をさらに含む、請求項１０９の方法。

【請求項111】

１以上のプリン生合成酵素をコードする異種遺伝子の１以上がｐｕｒＡ、ｐｕｒＢ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＤ、ｐｕｒＥ、ｐｕｒＦ、ｐｕｒＨ、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＴ、ｇｕａＡ、ｇｕａＢまたはａｄｋである、請求項１１０の方法。

【請求項112】

宿主細胞がＨＴＨ型転写リプレッサーＰｕｒＲの発現が減少するように修飾されている、請求項１０９～１１１の何れかの方法。

【請求項113】

修飾がＰｕｒＲ欠失を含む、請求項１１２の方法。

【請求項114】

宿主細胞が１以上のピリミジン生合成酵素をコードする１以上の異種遺伝子をさらに含む、請求項１０９～１１３の何れかの方法。

【請求項115】

１以上のピリミジン生合成酵素をコードする異種遺伝子の１以上がｃａｒＡＢ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、ｐｙｒＥ、ｐｙｒＦ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒＨまたはｐｙｒＩである、請求項１１４の方法。

【請求項116】

宿主細胞がアルギニン応答性転写リプレッサーＡｒｇＲの発現が低減するように修飾されている、請求項１０９～１１５の何れかの方法。

【請求項117】

修飾がａｒｇＲ欠失を含む、請求項１１６の方法。

【請求項118】

宿主細胞がリボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)をコードする異種遺伝子をさらに含み、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが
ｄ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＤ１１５に対応する残基；
ｅ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または
ｆ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基
にアミノ酸置換を含む、請求項１０９～１１７の何れかの方法。

【請求項119】

野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ｄ１１５Ｓ；Ｄ１１５Ｌ；Ｄ１１５Ｍ；Ｄ１１５Ｖ；Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ、請求項１１８の方法。

【請求項120】

宿主細胞がｅｎｄＡ１、ｒｅｃＡおよびｒｅｌＡの１以上の発現が低減するように修飾されている、請求項１０９～１１９の何れかの方法。

【請求項121】

修飾がｅｎｄＡ１、ｒｅｃＡまたはｒｅｌＡ欠失の１以上を含む、請求項１２０の方法。

【請求項122】

修飾がｒｅｌＡ欠失を含む、請求項１２１の方法。

【請求項123】

宿主細胞がｓｐｏＴ、ｆｒｕＲ、ｐｇｉ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ａｃｋＡ、ｅｕｔＤ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｐｔｓＧおよびｐｔｓＨの１以上の発現が低減するように修飾されている、請求項１０９～１２２の何れかの方法。

【請求項124】

修飾がｓｐｏＴ、ｆｒｕＲ、ｐｇｉ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ａｃｋＡ、ｅｕｔＤ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｐｔｓＧまたはｐｔｓＨ欠失の１以上を含む、請求項１２３の方法。

【請求項125】

宿主細胞がＤＮＡポリメラーゼIII、ＤｎａＢヘリカーゼ、(ｉ)ＰＥＰ非依存性糖パーミアーゼ、アンモニア輸送体、グルタミンシンターゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびグルタミン酸シンターゼをコードする異種遺伝子の１以上をさらに含む、請求項１０９～１２４の何れかの方法。

【請求項126】

(ｖ)ＰＥＰ非依存性糖パーミアーゼをコードする遺伝子がｇａｌＰまたはｍｇｌＢＡＣであり；
(vi)アンモニア輸送体をコードする遺伝子がａｍｔであり；
(vii)グルタミンシンターゼをコードする遺伝子がｇｌｎＡであり；そして
(viii)グルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子がｇｌｔＤＢである、請求項１２５の方法。

【請求項127】

宿主細胞がｐｒｉＡ、ｚｗｆおよびｒｐｉＡの１以上を含む異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１０９～１２６の何れかの方法。

【請求項128】

宿主細胞がバチルスｇａｐＢ遺伝子をさらに含む、請求項１０９～１２７の何れかの方法。

【請求項129】

宿主細胞が枯草菌からのＮＡＤＨ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする異種遺伝子をさらに含む、請求項１０９～１２８の何れかの方法。

【請求項130】

ＭＴＨＦＤＣ酵素が配列番号３６と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１０９～１２９の何れかの方法。

【請求項131】

プロモーターが構成的である、請求項１０９～１３０の何れかの方法。

【請求項132】

プロモーターが配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１０９～１３１の何れかの方法。

【請求項133】

プロモーターが配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含む、請求項１３２の方法。

【請求項134】

ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸を含む異種核酸が配列番号３５と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１０９～１３３の何れかの方法。

【請求項135】

宿主細胞がＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸を２コピー以上含む、請求項１０９～１３４の何れかの方法。

【請求項136】

ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸が宿主細胞の染色体に組み込まれる、請求項１０９～１３５の何れかの方法。

【請求項137】

宿主細胞が細菌細胞である、請求項１０９～１３６の何れかの方法。

【請求項138】

細菌細胞が大腸菌細胞である、請求項１３７の方法。

【請求項139】

宿主細胞がｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｍ}またはｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｓ}を含み、ｒｅｌＡ、ｅｎｄＡ、ｒｅｃＡおよびｐｕｒＲの１以上の欠失をさらに含む、請求項１０９～１３８の何れかの方法。

【請求項140】

リボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)をコードする異種遺伝子を含む宿主細胞であって、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＤ１１５に対応する残基；ａ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／またはｂ)野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基のアミノ酸置換を含み、ｅｎｄＡ、ｒｅｃＡ、ｒｅｌＡおよびｐｕｒＲの１以上の発現が低減するように修飾されている、宿主細胞。

【請求項141】

宿主細胞がｒｅｌＡ、ｅｎｄＡ、ｒｅｃＡおよびｐｕｒＲの１以上の欠失を含む、請求項１４０の宿主細胞。

【請求項142】

野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、ＲＰＰＫが次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ｄ１１５Ｓ；Ｄ１１５Ｌ；Ｄ１１５Ｍ；Ｄ１１５Ｖ；Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ、請求項１４０または１４１の宿主細胞。

【請求項143】

宿主細胞が５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)酵素をコードする異種核酸をさらに含み、異種核酸が合成プロモーターの制御下に発現される、請求項１４０～１４２の何れかの宿主細胞。

【請求項144】

宿主細胞が細菌細胞である、請求項１４０～１４３の何れかの宿主細胞。

【請求項145】

細菌細胞が大腸菌細胞である、請求項１４４の宿主細胞。

【請求項146】

請求項１４０～１４５の何れかの宿主細胞を培養することを含む、プラスミドＤＮＡを産生する方法。

【請求項147】

方法がｐＤＮＡの抽出をさらに含む、請求項１０８～１３９または１４６の何れかの方法。

【請求項148】

方法がｐＤＮＡの精製をさらに含む、請求項１４７の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、「Biosynthesis of Histidine」なる名称の２０１９年１２月１６日出願の米国仮出願６２／９４８,７３０、「Biosynthesis of Histidine」なる名称の２０２０年３月２６日出願の米国仮出願６２／９９４,９０１および「Biosynthesis of Histidine」なる名称の２０２０年６月２６日出願の米国仮出願６３／０４４,９２５に基づく利益を、35 U.S.C. § 119(e)の下に主張し、これら各々の開示全体を、全体として引用により本明細書に包含させる。

【0002】

EFS-WEBによりTEXTとして提出した配列表の記載
本出願は、EFS-WebによりASCII形式で提出し、引用により全体として本明細書に包含させる配列表を含む。２０２０年１２月１４日に作成したASCIIファイルはG091970035WO00-SEQ-EAS.txtなる名称であり、８３キロバイトサイズである。

【0003】

発明の分野
本発明は、ヒスチジンの産生、プリン経路代謝生成物の産生および／またはプラスミドＤＮＡなどの核酸の産生に有用な核酸、細胞および方法に関する。

【背景技術】

【0004】

背景
ヒスチジンは、大部分の生物で、ホスホリボシルピロリン酸(ＰＲＰＰ)およびＡＴＰの縮合から始まる、１０工程の分岐のない酵素経路を介して合成される。ヒスチジンの生合成は、産生されるヒスチジンあたり約４１のＡＴＰを必要とするエネルギー集約的過程であり、全タンパク新生アミノ酸で３番目にＡＴＰ要求が高い。ヒスチジン生合成は、厳密な転写および翻訳制御ならびに酵素レベルの制御を受けている。このような多面的制御は、高レベルでヒスチジンを産生するための宿主細胞の操作を困難とする。

【発明の概要】

【0005】

概要
本発明の態様は、ヒスチジンの産生に有用な天然に存在しない核酸、細胞および方法を提供する。ある実施態様において、天然に存在しない核酸は、(ａ)配列番号１または２と少なくとも９０％同一であるプロモーター；および(ｂ)ｈｉｓＧ；ｈｉｓＤ；ｈｉｓＣ；ｈｉｓＢ；ｈｉｓＨ；ｈｉｓＡ；ｈｉｓＦ；および／またはｈｉｓＩを含む１以上の核酸を含み、ここで、(ａ)および(ｂ)は操作可能に結合される。

【0006】

ある実施態様において、天然に存在しない核酸は、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)をさらに含む。ある実施態様において、天然に存在しない核酸は、インスレーターリボザイム(insulator ribozyme)をさらに含む。ある実施態様において、インスレーターリボザイムは、配列番号５と少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、ＲＢＳは、配列番号３または４と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0007】

ある実施態様において、天然に存在しない核酸は、配列番号７または９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするｈｉｓＧ；配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするｈｉｓＤ；配列番号１３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするｈｉｓＣ；配列番号１５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするｈｉｓＢ；配列番号１７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするｈｉｓＨ；配列番号１９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするｈｉｓＡ；配列番号２１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするｈｉｓＦ；および／または配列番号２３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするｈｉｓＩを含む。

【0008】

ある実施態様において、天然に存在しない核酸は、配列番号６または８と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むｈｉｓＧ；配列番号１０と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むｈｉｓＤ；配列番号１２と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むｈｉｓＣ；配列番号１４と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むｈｉｓＢ；配列番号１６と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むｈｉｓＨ；配列番号１８と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むｈｉｓＡ；配列番号２０と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むｈｉｓＦ；および／または配列番号２２と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むｈｉｓＩを含む。

【0009】

ある実施態様において、ｈｉｓＧはｈｉｓＧ^{(Ｅ２７１Ｋ)}を含む。ある実施態様において、プロモーター、ＲＢＳおよびｈｉｓＧ；ｈｉｓＤ；ｈｉｓＣ；ｈｉｓＢ；ｈｉｓＨ；ｈｉｓＡ；ｈｉｓＦ；および／またはｈｉｓＩの１以上を含む核酸は操作可能に結合される。ある実施態様において、天然に存在しない核酸は、ｈｉｓＧ；ｈｉｓＤ；ｈｉｓＣ；ｈｉｓＢ；ｈｉｓＨ；ｈｉｓＡ；ｈｉｓＦ；およびｈｉｓＩの全てを含む。ある実施態様において、天然に存在しない核酸は、ｈｉｓＧ；ｈｉｓＤ；ｈｉｓＣ；ｈｉｓＢ；ｈｉｓＨ；ｈｉｓＡ；ｈｉｓＦ；およびｈｉｓＩの全てを次の順番で含む：ｈｉｓＧ；ｈｉｓＤ；ｈｉｓＣ；ｈｉｓＢ；ｈｉｓＨ；ｈｉｓＡ；ｈｉｓＦ；およびｈｉｓＩ。ある実施態様において、ｈｉｓＧ；ｈｉｓＤ；ｈｉｓＣ；ｈｉｓＢ；ｈｉｓＨ；ｈｉｓＡ；ｈｉｓＦ；およびｈｉｓＩを含む天然に存在しない核酸は、配列番号２４と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0010】

本発明の態様は、配列番号２４～２６の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む天然に存在しない核酸を含む。

【0011】

ある実施態様において、核酸は、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)をコードする異種遺伝子をさらに含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＤ１１５に対応する残基にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、次のアミノ酸置換の１個を含む：Ｄ１１５Ｓ、Ｄ１１５Ｌ；Ｄ１１５Ｍ；およびＤ１１５Ｖ。

【0012】

本発明のさらなる態様は、天然に存在しない核酸を含む、宿主細胞を提供する。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号１または２と少なくとも９０％同一である配列を含むプロモーター；ならびにｈｉｓＧ；ｈｉｓＤ；ｈｉｓＣ；ｈｉｓＢ；ｈｉｓＨ；ｈｉｓＡ；ｈｉｓＦ；および／またはｈｉｓＩの１以上を含む、天然に存在しない核酸の１以上を含む。ある実施態様において、天然に存在しない核酸の１以上は、ＲＢＳをさらに含む。ある実施態様において、天然に存在しない核酸の１以上は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。ある実施態様において、宿主細胞は、細菌細胞である。ある実施態様において、細菌細胞は、大腸菌細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、対照宿主細胞と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍または１００倍多くヒスチジンを産生できる。ある実施態様において、対照宿主細胞は、野生型大腸菌細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、ＨＴＨ型転写リプレッサー(repressor)ＰｕｒＲの発現が減少するように修飾されている。ある実施態様において、宿主細胞の修飾は、ＰｕｒＲ欠失を含む。

【0013】

ある実施態様において、宿主細胞は、ＲＰＰＫをコードする異種遺伝子を含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＤ１１５に対応する残基；野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ｄ１１５Ｓ；Ｄ１１５Ｌ；Ｄ１１５Ｍ；Ｄ１１５Ｖ；Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ。

【0014】

本発明のさらなる態様は、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２７)のＡ１３２に対応する残基；および／または野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２７)のＬ１３０に対応する残基にアミノ酸置換を含む、ＲＰＰＫをコードする天然に存在しない核酸を提供する。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ。本発明のさらなる態様は、このようなＲＰＰＫをコードするこのような天然に存在しない核酸を含む宿主細胞に関する。

【0015】

本発明のさらなる態様は、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基にアミノ酸置換を含む、天然に存在しないＲＰＰＫタンパク質を提供する。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ。本発明のさらなる態様は、このような天然に存在しないＲＰＰＫを含む宿主細胞に関する。

【0016】

本発明のさらなる態様は、５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)酵素をコードする異種核酸を含む、宿主細胞を提供する。ある実施態様において、宿主細胞は、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸を２コピー以上含む。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれる。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸は、合成プロモーターの制御下に発現される。ある実施態様において、合成プロモーターは構成的である。

【0017】

ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号３６と少なくとも９０％同一である配列を含むＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７と少なくとも９０％同一である配列を含む、プロモーターを含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含むプロモーターを含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号３５と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする核酸を２コピー以上含まない宿主細胞と比較して増加した量のヒスチジンを産生する。

【0018】

本発明のさらなる態様は、(ａ)配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７と少なくとも９０％同一である配列を含む、プロモーター；および(ｂ)ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする遺伝子を含み、ここで、(ａ)および(ｂ)は操作可能に結合される、天然に存在しない核酸を含む。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣ酵素の配列は、配列番号３６と少なくとも９０％同一である。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする遺伝子は、配列番号３５と少なくとも９０％同一である配列を含む。本発明のさらなる態様は、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする遺伝子を２コピー以上含む、宿主細胞に関する。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする遺伝子の１コピーは、その天然プロモーターの制御下に、細胞で内因性に発現される。ある実施態様において、宿主細胞天然に存在しない核酸を含まない宿主細胞と比較して増加した量のヒスチジンを産生する。

【0019】

本発明のさらなる態様は、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸を含む宿主細胞であって、ＭＴＨＦＤＣをコードする異種核酸が合成プロモーターの制御下に発現され、異種核酸を発現しない対照宿主細胞と比較して増加した量のプリン経路代謝生成物を産生するものである、宿主細胞を提供する。ある実施態様において、プリン経路代謝生成物は、イノシン、グアノシン、キサントシン、アデノシン、ヒポキサンチン、グアニン、キサンチン、アデニン、イノシン一リン酸(ＩＭＰ)、キサントシン一リン酸(ＸＭＰ)、グアノシンリン酸(例えばＧＭＰ、ＧＤＰおよびＧＴＰ)および／またはアデノシンリン酸(例えばＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰ)である。ある実施態様において、宿主細胞は、異種核酸を発現しない対照宿主細胞と比較して増加したＧＴＰからリボフラビンへの変換を示す。ある実施態様において、宿主細胞は、異種核酸を発現しない対照宿主細胞と比較して増加したフラボノイド補因子フラビンモノヌクレオチド(ＦＭＮ)および／またはフラビンアデニンジヌクレオチド(ＦＡＤ)を産生する。ある実施態様において、宿主細胞は、異種核酸を発現しない対照宿主細胞と比較して増加したキサンチンから尿酸への変換を示す。

【0020】

ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣ酵素は、配列番号３６と少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは構成的である。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７と少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含む。ある実施態様において、異種核酸は、配列番号３５と少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸を２コピー以上含む。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれる。

【0021】

ある実施態様において、宿主細胞は、ＨＴＨ型転写リプレッサーＰｕｒＲの発現が低減するようにさらに修飾されている。ある実施態様において、宿主細胞の修飾は、ＰｕｒＲ欠失を含む。

【0022】

ある実施態様において、宿主細胞は、ＲＰＰＫをコードする異種遺伝子をさらに含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＤ１１５に対応する残基；野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ｄ１１５Ｓ；Ｄ１１５Ｌ；Ｄ１１５Ｍ；Ｄ１１５Ｖ；Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ。ある実施態様において、宿主細胞は、細菌細胞である。ある実施態様において、細菌細胞は、大腸菌細胞である。

【0023】

本発明のさらなる態様は、５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)酵素をコードする異種核酸を含む、宿主細胞を提供する。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸は、合成プロモーターの制御下に発現される。ある実施態様において、宿主細胞は、異種核酸を発現しない対照宿主細胞と比較して増加した量のプラスミドＤＮＡ(ｐＤＮＡ)を産生する。

【0024】

ある実施態様において、宿主細胞は、合成プロモーターの制御下に、１以上のプリン生合成酵素をコードする１以上の異種遺伝子をさらに含む。ある実施態様において、１以上のプリン生合成酵素は、ｐｕｒＡ、ｐｕｒＢ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＤ、ｐｕｒＥ、ｐｕｒＦ、ｐｕｒＨ、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＴ、ｇｕａＡ、ｇｕａＢまたはａｄｋである。

【0025】

ある実施態様において、宿主細胞は、ＨＴＨ型転写リプレッサーＰｕｒＲの発現が低減するようにさらに修飾されている。ある実施態様において、宿主細胞の修飾は、ＰｕｒＲ欠失を含む。

【0026】

ある実施態様において、宿主細胞は、１以上のピリミジン生合成酵素をコードする１以上の異種遺伝子をさらに含む。ある実施態様において、１以上のピリミジン生合成酵素は、ｃａｒＡＢ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、ｐｙｒＥ、ｐｙｒＦ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒＨまたはｐｙｒＩである。

【0027】

ある実施態様において、宿主細胞は、アルギニン応答性転写リプレッサーＡｒｇＲの発現が低減するようにさらに修飾されている。ある実施態様において、宿主細胞の修飾は、ａｒｇＲ欠失を含む。

【0028】

ある実施態様において、宿主細胞は、ＲＰＰＫをコードする異種遺伝子をさらに含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＤ１１５に対応する残基；野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ｄ１１５Ｓ；Ｄ１１５Ｌ；Ｄ１１５Ｍ；Ｄ１１５Ｖ；Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ。

【0029】

ある実施態様において、宿主細胞は、ｅｎｄＡ１、ｒｅｃＡおよびｒｅｌＡの１以上の発現が低減するようにさらに修飾されている。ある実施態様において、宿主細胞は、ｒｅｌＡの発現が低減するようにさらに修飾されている。ある実施態様において、宿主細胞の修飾は、ｅｎｄＡ１、ｒｅｃＡまたはｒｅｌＡ欠失を含む。ある実施態様において、宿主細胞の修飾は、ｒｅｌＡ欠失を含む。ある実施態様において、宿主細胞はｈｉｓＧをコードする核酸を含み、ここで、ｈｉｓＧはｈｉｓＧ^{(Ｅ２７１Ｋ)}を含まない。ある実施態様において、宿主細胞は、ｓｐｏＴ、ｆｒｕＲ、ｐｇｉ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ａｃｋＡ、ｅｕｔＤ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｐｔｓＧおよびｐｔｓＨの１以上の発現が低減するようにさらに修飾されている。ある実施態様において、宿主細胞の修飾は、ｓｐｏＴ、ｆｒｕＲ、ｐｇｉ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ａｃｋＡ、ｅｕｔＤ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｐｔｓＧまたはｐｔｓＨ欠失を含む。

【0030】

ある実施態様において、宿主細胞は、ＤＮＡポリメラーゼIII、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＰＥＰ非依存性糖パーミアーゼ、アンモニア輸送体、グルタミンシンターゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびグルタミン酸シンターゼの１以上をコードする異種遺伝子をさらに含む。ある実施態様において、ＰＥＰ非依存性糖パーミアーゼをコードする遺伝子は、ｇａｌＰまたはｍｇｌＢＡＣである。ある実施態様において、アンモニア輸送体をコードする遺伝子は、ａｍｔである。ある実施態様において、グルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子は、ｇｌｔＤＢである。

【0031】

ある実施態様において、宿主細胞は、ｐｒｉＡ、ｚｗｆおよびｒｐｉＡの１以上をコードする異種遺伝子をさらに含む。ある実施態様において、宿主細胞は、バチルスｇａｐＢ遺伝子をさらに含む。ある実施態様において、宿主細胞は、枯草菌からのＮＡＤＨ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする異種遺伝子をさらに含む。

【0032】

ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号３６と少なくとも９０％同一である配列を含むＭＴＨＦＤＣ酵素を含む。ある実施態様において、プロモーターは構成的である。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７と少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含む。ある実施態様において、異種核酸は、配列番号３５と少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸を２コピー以上含む。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれる。ある実施態様において、宿主細胞は、細菌細胞である。ある実施態様において、細菌細胞は、大腸菌細胞である。

【0033】

ある実施態様において、宿主細胞は、ｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｍ}またはｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｓ}を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ｒｅｌＡ、ｅｎｄＡ、ｒｅｃＡおよびｐｕｒＲの１以上の欠失をさらに含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ｒｅｌＡの欠失を含む。

【0034】

本発明のさらなる態様は、本明細書に記載する宿主細胞を培養することを含む、プラスミドＤＮＡを産生する方法を提供する。ある実施態様において、方法は、５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)酵素をコードする異種核酸を含む宿主細胞を培養することを含む。ある実施態様において、方法は、合成プロモーターの制御下に、１以上のプリン生合成酵素をコードする１以上の異種遺伝子を含む宿主細胞を培養することを含む。ある実施態様において、１以上のプリン生合成酵素は、ｐｕｒＡ、ｐｕｒＢ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＤ、ｐｕｒＥ、ｐｕｒＦ、ｐｕｒＨ、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＴ、ｇｕａＡ、ｇｕａＢまたはａｄｋである。

【0035】

ある実施態様において、プラスミドＤＮＡを産生する方法は、ＨＴＨ型転写リプレッサーＰｕｒＲの発現が低減するように修飾されている宿主細胞を培養することを含む。ある実施態様において、修飾は、ＰｕｒＲ欠失を含む。ある実施態様において、方法は、１以上のピリミジン生合成酵素をコードする１以上の異種遺伝子をさらに含む宿主細胞を培養することを含む。ある実施態様において、１以上のピリミジン生合成酵素は、ｃａｒＡＢ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、ｐｙｒＥ、ｐｙｒＦ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒＨまたはｐｙｒＩである。ある実施態様において、宿主細胞は、アルギニン応答性転写リプレッサーＡｒｇＲの発現が低減するように修飾されている。ある実施態様において、修飾は、ａｒｇＲ欠失を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)をコードする異種遺伝子をさらに含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＤ１１５に対応する残基；野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ｄ１１５Ｓ；Ｄ１１５Ｌ；Ｄ１１５Ｍ；Ｄ１１５Ｖ；Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ。ある実施態様において、宿主細胞は、ｅｎｄＡ１、ｒｅｃＡおよびｒｅｌＡの１以上の発現が低減するように修飾されている。ある実施態様において、宿主細胞は、ｒｅｌＡの発現が低減するように修飾されている。ある実施態様において、修飾は、ｅｎｄＡ１、ｒｅｃＡまたはｒｅｌＡ欠失の１以上を含む。ある実施態様において、修飾は、ｒｅｌＡの欠失を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ｓｐｏＴ、ｆｒｕＲ、ｐｇｉ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ａｃｋＡ、ｅｕｔＤ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｐｔｓＧおよびｐｔｓＨの１以上の発現が低減するように修飾されている。ある実施態様において、修飾は、ｓｐｏＴ、ｆｒｕＲ、ｐｇｉ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ａｃｋＡ、ｅｕｔＤ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｐｔｓＧまたはｐｔｓＨ欠失の１以上を含む。

【0036】

ある実施態様において、プラスミドＤＮＡを産生する方法は、ＤＮＡポリメラーゼIII、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＰＥＰ非依存性糖パーミアーゼ、アンモニア輸送体、グルタミンシンターゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびグルタミン酸シンターゼの１以上をコードする異種遺伝子をさらに含む宿主細胞を培養することを含む。ある実施態様において、ＰＥＰ非依存性糖パーミアーゼをコードする遺伝子は、ｇａｌＰまたはｍｇｌＢＡＣである。ある実施態様において、アンモニア輸送体をコードする遺伝子は、ａｍｔである。ある実施態様において、グルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子は、ｇｌｔＤＢである。ある実施態様において、宿主細胞は、ｐｒｉＡ、ｚｗｆおよびｒｐｉＡの１以上を含む異種ポリヌクレオチドをさらに含む。ある実施態様において、宿主細胞は、バチルスｇａｐＢ遺伝子をさらに含む。ある実施態様において、宿主細胞は、枯草菌からのＮＡＤＨ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする異種遺伝子をさらに含む。

【0037】

ある実施態様において、プラスミドＤＮＡを産生する方法は、配列番号３６と少なくとも９０％同一である配列を含むＭＴＨＦＤＣ酵素を含む宿主細胞を培養することを含む。ある実施態様において、プロモーターは構成的である。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７と少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７の配列を含む。ある実施態様において、異種核酸は、配列番号３５と少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸を２コピー以上含む。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする異種核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれる。ある実施態様において、宿主細胞は、細菌細胞である。ある実施態様において、細菌細胞は、大腸菌細胞である。

【0038】

ある実施態様において、プラスミドＤＮＡを産生する方法は、ｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｍ}またはｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｓ}を含む宿主細胞を培養することを含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ｒｅｌＡ、ｅｎｄＡ、ｒｅｃＡおよびｐｕｒＲの１以上の欠失をさらに含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ｒｅｌＡの欠失を含む。

【0039】

本発明のさらなる態様は、ＲＰＰＫをコードする異種核酸を含む宿主細胞を提供する。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＤ１１５に対応する残基；野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＡ１３２に対応する残基；および／または野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)のＬ１３０に対応する残基にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ｅｎｄＡ、ｒｅｃＡ、ｒｅｌＡおよびｐｕｒＲの１以上の発現が低減するようにさらに修飾されている。ある実施態様において、宿主細胞は、ｒｅｌＡの発現が低減するようにさらに修飾されている。ある実施態様において、宿主細胞は、ｒｅｌＡ、ｅｎｄＡ、ｒｅｃＡおよびｐｕｒＲの１以上の欠失を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ｒｅｌＡの欠失を含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の配列と比較して、次のアミノ酸置換の１以上を含む：Ｄ１１５Ｓ；Ｄ１１５Ｌ；Ｄ１１５Ｍ；Ｄ１１５Ｖ；Ａ１３２Ｃ；Ａ１３２Ｑ；Ｌ１３０Ｉ；およびＬ１３０Ｍ。ある実施態様において、宿主細胞は、５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)酵素をコードする異種核酸をさらに含み、ここで、異種核酸は、合成プロモーターの制御下に発現される。ある実施態様において、宿主細胞は、細菌細胞である。ある実施態様において、細菌細胞は、大腸菌細胞である。

【0040】

本発明のさらなる態様は、本明細書に記載する宿主細胞を培養することを含む、ヒスチジンを産生する方法を提供する。本発明のさらなる態様は、本明細書に記載する宿主細胞を培養することを含む、プリン経路代謝生成物を産生する方法を提供する。本発明のさらなる態様は、本明細書に記載する宿主細胞を培養することを含む、プラスミドＤＮＡ(ｐＤＮＡ)を産生する方法を提供する。ある実施態様において、方法は、ｐＤＮＡの抽出をさらに含む。ある実施態様において、方法は、ｐＤＮＡの精製をさらに含む。

【0041】

本発明の限定の各々は、本発明の種々の実施態様を含み得る。それ故に、ある一つの要素または複数要素の組み合わせを含む本発明の限定の各々は、本発明の各態様に包含され得ることが予測される。本発明は、以下の記載に示すまたは図面に図説する構成要素の詳細な構成および配置にその適用を限定されない。本発明は、他の実施態様が可能であり、種々の方法で実施または実行が可能である。また、本明細書で使用する表現および用語は、説明の目的であり、限定とみなしてはならない。「含む」、「含有する」または「有する」、「包含する」、「関与する」およびそれらの変形は、その前に列記された項目およびその等価物ならびにさらなる項目を含むことを意味する。単数表現は、その主体の１以上をいう。

【図面の簡単な説明】

【0042】

添付する図面は、縮尺どおりの記載を意図していない。図面において、種々の図に示される各同一またはほぼ同一の構成要素は、同種の番号で表す。明確にするために、全図で全構成要素が表示されていないかもしれない。図面は以下のとおりである。

【0043】

【図1】図１は、引用に全体として本明細書に包含させる、Winkler et al. (2009), EcoSal Plus Aug; 3(2), doi: 10.1128/ecosalplus.3.6.1.19からのヒスチジンオペロンの遺伝子成分を示す模式図である。

【0044】

【図2】図２Ａ～２Ｂは、ヒスチジン生合成を示す模式図である。図２Ａは、Winkler et al. (2009), EcoSal Plus Aug; 3(2), doi: 10.1128/ecosalplus.3.6.1.19からの大腸菌ヒスチジン生合成経路を示す。四角内の数字は、生合成経路内の工程をいう。二官能性である酵素について、(Ｃ)はカルボキシル末端が反応を触媒することを示し、(Ｎ)はアミノ末端が活性を担うことを示す。図２Ｂは、ヒスチジン生合成の制御を要約する。

【0045】

【図3】図３Ａ～３Ｂは、異なる組み合わせのプロモーターおよびリボソーム結合部位(ＲＢＳ)を有する宿主細胞におけるヒスチジン産生を示すグラフを示す。図３Ａは、異なる組み合わせのプロモーターおよびリボソーム結合部位(ＲＢＳ)を有するＷＧ１組み込み宿主株における、２４時間(各株左側の棒)および４８時間(各株右側の棒)のヒスチジン産生を示す。図３Ｂは、異なる組み合わせのプロモーターおよびリボソーム結合部位(ＲＢＳ)を有するＭＧ１６５５組み込み宿主株における、２４時間(各株左側の棒)および４８時間(各株右側の棒)のヒスチジン産生を示す。

【0046】

【図4】図４は、Ｐｒｓ遺伝子の生成物であるＲＰＰＫの可視化を示す。大腸菌(ＰＤＢ ４Ｓ２Ｕ)からの結晶構造は、変異された特定のアミノ酸残基の原子を球形で強調する。ＡＤＰを棒状で示し、触媒活性部位の位置を示す。

【0047】

【図5】図５は、ｐｒｓ変異体を発現する株におけるヒスチジン産生を示すグラフである。

【0048】

【図6】図６は、プラスミド上にフィードバック耐性ｐｒｓ変異を発現する株と比較した、染色体に組み込まれたフィードバック耐性ｐｒｓ変異体を含む株におけるヒスチジン産生を示すグラフである。

【0049】

【図7】図７は、中心的炭素代謝生成物ホスホリボシルピロリン酸(ＰＲＰＰ)からのヒスチジン生合成およびＰＲＰＰからヒスチジンへの効率的変換を駆動するための５－アミノ－１－(５－ホスホ－β－Ｄ－リボシル)イミダゾール－４－カルボキサミド(ＡＩＣＡＲ)からアデノシン三リン酸(ＡＴＰ)のリサイクルのための重要な変換を示す、模式図である。数字は、経路における化合物をいう：１＝ＰＲＰＰ；２＝ＰＲ－ＡＴＰ；３＝ＩＧＰ；４＝ヒスチジン；５＝ＡＩＣＡＲ。反応工程は、次のとおり標識される：Ｒ１＝酵素ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨｉｓＧ)により触媒される、ＡＴＰへのホスホリボシル転移；Ｒ２＝ヒスチジン生合成酵素ＨｉｓＩ、ＨｉｓＡおよびＨｉｓＨＦを使用するＰＲ－ＡＴＰからＡＩＣＡＲおよびＩＧＰへの多工程変換；Ｒ３＝ヒスチジン生合成酵素ＨｉｓＢ、ＨｉｓＣおよびＨｉｓＤを使用するＩＧＰからヒスチジンへの多工程変換；Ｒ４＝プリン生合成酵素ＰｕｒＨにより触媒される、ＩＭＰおよびＴＨＦを生じる１０－ＣＨＯ－ＴＨＦからＡＩＣＡＲへのホルミル基転移；Ｒ５＝酵素ＰｕｒＡ、ＰｕｒＢおよびＡｄｋを使用する、ＩＭＰからＡＴＰへの多工程変換；Ｒ６＝ｇｌｙＡ遺伝子によりコードされる大腸菌酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼおよび遺伝子ｇｃｖＨＰＴおよびｌｐｄによりコードされるグリシン切断系を介する、ＴＨＦから５,１０－ＣＨ２－ＴＨＦへのリサイクル；Ｒ７＝大腸菌遺伝子ｆｏｌＤによりコードされるＭＴＨＦＤＣにより触媒される５,１０－ＣＨ２－ＴＨＦから５,１０－ＣＨ－ＴＨＦおよびＮＡＤＰＨへの可逆性ＮＡＤＰ(＋)依存性酸化；Ｒ８＝大腸菌遺伝子ｆｏｌＤによりコードされるＭＴＨＦＤＣにより触媒される５,１０－ＣＨ－ＴＨＦから１０－ＣＨＯ－ＴＨＦへの可逆性加水分解。

【0050】

【図8】図８は、ｆｏｌＤ発現系のプラスミド地図を示す。プラスミドは、種々のセットのＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下に、ｐＳＣ１０１複製起点(ｏｒｉ)、カルベニシリン耐性遺伝子(ｂｌａ)、構成的に発現されるｌａｃＯ転写リプレッサー(ｌａｃＩ)および大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子を含む(表４参照)。

【0051】

【図9】図９は、ｆｏｌＤを発現するプラスミドを含まない対照株(大腸菌株ｔ５８９７９７)と比較した、種々のプロモーターと共にプラスミド上に大腸菌遺伝子ｆｏｌＤを過発現する宿主株におけるヒスチジン力価、速度および収量を示すグラフである。

【0052】

【図10】図１０は、ｆｏｌＤを過発現しない株(大腸菌株ｔ５８９７９７)またはプラスミド上にｆｏｌＤを発現する株(大腸菌株ｔ７３１３７４)と比較した、染色体に組み込まれたｆｏｌＤを含む株(大腸菌株ｔ７５０３４０)におけるヒスチジン産生を示すグラフである。

【0053】

【図11】図１１は、ｅｎｄＡおよびｒｅｌＡ発現が欠損しているが、ｆｏｌＤを過発現しない一般的プラスミド産生株大腸菌ＤＨ１０ｂ(株ｔ８１６３８６)と比較した、ｒｅｌＡ(株ｔ８２３０１０)またはｅｎｄＡ(株ｔ８２３０１２)にさらなるノックアウト変異を有する染色体に組み込まれたｆｏｌＤを含む株(大腸菌株ｔ８１６３８５)における大腸菌ｐＢＲ３２２由来ＤＮＡプラスミドの産生を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0054】

詳細な記載
本発明は、ある態様において、ヒスチジンの産生のために操作された宿主細胞を提供する。これらの操作された宿主細胞は、合成プロモーターの制御下に、ヒスチジンオペロン：ｈｉｓＧ、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＣ、ｈｉｓＢ、ｈｉｓＨ、ｈｉｓＡ、ｈｉｓＦおよび／またはｈｉｓＩの遺伝子を発現する。このような宿主細胞が、ヒスチジンの生合成に関連する先に報告された毒性および不安定性の問題を回避し、むしろ、驚くべきことに、対照と比較した増加したレベルのヒスチジンを産生することが実施例で示されている。ヒスチジン産生を増加させる、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)酵素の新規変異の驚くべき同定も、実施例に記載される。合成プロモーターの制御下の、５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)をコードする大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子の過発現が、ヒスチジンの産生を増加させる、驚くべき発見も実施例に記載される。合成プロモーターの制御下に、ＭＴＨＦＤＣをコードする大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子の過発現が、プラスミドＤＮＡ(ｐＤＮＡ)レベルを上昇させる驚くべき発見も、実施例に記載される。

【0055】

本明細書に記載する宿主細胞は、過去のアプローチと比較して、増加した速度でヒスチジンおよび他の生成物を産生するために使用し得る。本発明はまた、ある態様において、ｐＤＮＡの産生のために操作された宿主細胞を提供する。これらの操作された宿主細胞は、ｐＤＮＡの生産性および力価の増加の支持に使用できる遺伝子を発現する。本発明の宿主細胞により産生されたｐＤＮＡは、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｔＲＮＡを含むＲＮＡポリマーの産生が関与する治療目的のために、直接生成物としてまたは前駆体として使用され得る。ｐＤＮＡはまた遺伝子療法などの治療適用のためのＤＮＡポリマーの前駆体としても役立ち得る。さらに、本明細書に記載する宿主細胞により産生されたｐＤＮＡは、ＲＮＡまたはｍＲＮＡワクチン、ＤＮＡワクチン、タンパク質またはペプチドベースのワクチン、細菌ベクターワクチンおよびウイルスベクターワクチンを含む、ワクチン薬物生成物の前駆体としても役立ち得る。本明細書に記載する宿主細胞は、過去のアプローチと比較して、増加した速度でｐＤＮＡを産生するために使用し得る。

【0056】

ヒスチジン生合成遺伝子
ヒスチジン生合成は、複数酵素の多面的制御に依存する重要な細胞経路である。大腸菌細胞は、単一の多シストロン性ｍＲＮＡとして転写される、８個のヒスチジン生合成遺伝子(ｈｉｓＧ、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＣ、ｈｉｓＢ、ｈｉｓＨ、ｈｉｓＡ、ｈｉｓＦおよびｈｉｓＩ)を含むヒスチジンオペロンを含む(図１)。ヒスチジン生合成の態様は、Winkler et al. (2009), EcoSal Plus Aug; 3(2), doi: 10.1128/ecosalplus.3.6.1.19, Cho et al. (2011) Nucleic Acids Research, 39(15):6456 - 6464, and Brenner et al. (1971) In Vogel HJ (ed). Metabolic Pathways, vol. 5. Academic Press, New York, NY, pp. 349-387に記載され、引用により包含させる。

【0057】

用語「ヒスチジンオペロン」および「ｈｉｓオペロン」は本明細書では相互交換可能に使用して、一体となって単一の多シストロン性ｍＲＮＡに転写される、２以上のヒスチジン生合成遺伝子を含む核酸をいう。ヒスチジンオペロンは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または８個を超えるヒスチジン生合成遺伝子を含み得る。例えば、ヒスチジンオペロンは、ｈｉｓＧ、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＣ、ｈｉｓＢ、ｈｉｓＨ、ｈｉｓＡ、ｈｉｓＦおよびｈｉｓＩの２以上を含み得る。ある実施態様において、ヒスチジンオペロンは、ｈｉｓＧ、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＣ、ｈｉｓＢ、ｈｉｓＨ、ｈｉｓＡ、ｈｉｓＦおよびｈｉｓＩ全て含む。他の実施態様において、ヒスチジンオペロンは、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＣ、ｈｉｓＢ、ｈｉｓＨ、ｈｉｓＡ、ｈｉｓＦおよびｈｉｓＩを含む。ヒスチジンオペロンは、さらなる構成要素も含み得る。

【0058】

ある実施態様において、本明細書に記載するヒスチジンオペロンは、配列番号２５または２６；表３内のヒスチジンオペロン配列；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるヒスチジンオペロン配列の何れかに少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。

【0059】

ある実施態様において、ｈｉｓＧ、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＣ、ｈｉｓＢ、ｈｉｓＨ、ｈｉｓＡ、ｈｉｓＦおよびｈｉｓＩを含むヒスチジンオペロンの部分は、配列番号２４；表３内のヒスチジンオペロン配列；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるヒスチジンオペロン配列の何れかに少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である。

【0060】

ＨｉｓＧ
ＨｉｓＧは、ヒスチジン生合成経路の第一工程を触媒するＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素である(図２Ａ)。経路のこの工程は、ヒスチジンによる強いフィードバック阻害を受ける。ＨｉｓＧの活性は、ｐｐＧｐｐ；アデノシン一および二リン酸：ＡＭＰおよびＡＤＰ；およびホスホリボシル－ＡＴＰ(ＰＲ－ＡＴＰ)の細胞レベルにも影響される。野生型大腸菌細胞において、ＨｉｓＧ活性は、一般にヒスチジン生合成の律速である。その結果、ＨｉｓＧにおける変異は、ヒスチジンの産生の増加を可能とする、フィードバック耐性形態の酵素を産生するために、研究されている。例えば、ＨｉｓＧ^{Ｅ２７１Ｋ}と称される、野生型大腸菌タンパク質の残基２７１に対応するアミノ酸残基に置換を有するＨｉｓＧタンパク質は、フィードバック耐性形態のＨｉｓＧを表し、これは、Astvatsaturianz et al. (1988) Genetika 24(11):1928-1934;およびDoroshenko et al. (2013) Prikl Biokhim Mikrobiol. 49(2):149-154に記載され、引用により包含させる。

【0061】

本明細書で使用する用語「ＨｉｓＧ」は、野生型バージョンのＨｉｓＧを含み、フィードバック耐性バージョンのＨｉｓＧを含む変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＧも含む。ある実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は、野生型ＨｉｓＧタンパク質をコードする核酸を含み、一方他の実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は、フィードバック耐性ＨｉｓＧタンパク質を含む変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＧをコードする核酸を含む。例えば、宿主細胞は、ＨｉｓＧ^{Ｅ２７１Ｋ}をコードする核酸を含み得る。ある実施態様において、ｈｉｓＧは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現される。他の実施態様において、ｈｉｓＧは、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現されない。例えば、ｈｉｓＧは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの他の構成要素無しに発現され得る。

【0062】

本明細書に記載する宿主細胞は、ＨｉｓＧ酵素および／またはこのような酵素をコードする異種核酸を含み得る。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号７または９；表３におけるＨｉｓＧ酵素；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＧ酵素の何れかと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)であるアミノ酸配列を含む、ＨｉｓＧ酵素をコードする異種核酸を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号６または８；表３におけるＨｉｓＧ酵素をコードする核酸；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＧ酵素をコードする核酸の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である、異種核酸を含む。

【0063】

ＨｉｓＤ
ＨｉｓＤは、ヒスチジン生合成経路の最後の２工程を触媒するヒスチジノールデヒドロゲナーゼ酵素である(図２Ａ)。本明細書で使用する用語「ＨｉｓＤ」は野生型バージョンのＨｉｓＤを含み、変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＤも含む。ある実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は野生型ＨｉｓＤタンパク質をコードする核酸を含み、一方他の実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＤをコードする核酸を含む。ある実施態様において、ｈｉｓＤは、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現される。他の実施態様において、ｈｉｓＤは、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現されない。例えば、ｈｉｓＤは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの他の構成要素無しに発現され得る。

【0064】

本明細書に記載する宿主細胞は、ＨｉｓＤ酵素および／またはこのような酵素をコードする異種核酸を含み得る。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号１１；表３におけるＨｉｓＤ酵素；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＤ酵素の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)であるアミノ酸配列を含む、ＨｉｓＤ酵素をコードする、異種核酸を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号１０；表３におけるＨｉｓＤ酵素をコードする核酸；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＤ酵素をコードする核酸の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である、異種核酸を含む。

【0065】

ＨｉｓＣ
ＨｉｓＣは、ヒスチジン生合成経路の７番目の工程を触媒するヒスチジノールホスフェートアミノトランスフェラーゼ酵素である(図２Ａ)。本明細書で使用する用語「ＨｉｓＣ」は野生型バージョンのＨｉｓＣを含み、変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＣも含む。ある実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は野生型ＨｉｓＣタンパク質をコードする核酸を含み、一方他の実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＣをコードする核酸を含む。ある実施態様において、ｈｉｓＣは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現される。他の実施態様において、ｈｉｓＣは、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現されない。例えば、ｈｉｓＣは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの他の構成要素無しに発現され得る。

【0066】

本明細書に記載する宿主細胞は、ＨｉｓＣ酵素および／またはこのような酵素をコードする異種核酸を含み得る。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号１３；表３におけるＨｉｓＣ酵素；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＣ酵素の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)であるアミノ酸配列を含む、ＨｉｓＣ酵素をコードする、異種ポリヌクレオチドを含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号１２；表３におけるＨｉｓＣ酵素をコードする核酸；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＣ酵素をコードする核酸の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である、異種核酸を含む。

【0067】

ＨｉｓＢ
ＨｉｓＢは、ヒスチジン生合成経路の６番目(ＩＧＰデヒドラターゼ)および８番目(Ｈｏｌ－Ｐホスファターゼ)の工程を触媒する、二機能性酵素である(図２Ａ)。本明細書で使用する用語「ＨｉｓＢ」は野生型バージョンのＨｉｓＢを含み、変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＢも含む。ある実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は野生型ＨｉｓＢタンパク質をコードする核酸を含み、一方他の実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＢをコードする核酸を含む。ある実施態様において、ｈｉｓＢは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現される。他の実施態様において、ｈｉｓＢは、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現されない。例えば、ｈｉｓＢは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの他の構成要素無しに発現され得る。

【0068】

本明細書に記載する宿主細胞は、ＨｉｓＢ酵素および／またはこのような酵素をコードする異種核酸を含み得る。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号１５；表３におけるＨｉｓＢ酵素；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＢ酵素の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)であるアミノ酸配列を含む、ＨｉｓＢ酵素をコードする、異種核酸を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号１４；表３におけるＨｉｓＢ酵素をコードする核酸；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＢ酵素をコードする核酸の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である、異種核酸を含む。

【0069】

ＨｉｓＨ
ＨｉｓＨタンパク質はＨｉｓＦと二量体を形成し、その後、イミダゾールグリセロールホスフェート(ＩＧＰ)シンターゼ酵素として機能し、ヒスチジン生合成の５番目の工程を触媒する(図２Ａ)。本明細書で使用する用語「ＨｉｓＨ」は野生型バージョンのＨｉｓＨを含み、変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＨも含む。ある実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は野生型ＨｉｓＨタンパク質をコードする核酸を含み、一方他の実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＨをコードする核酸を含む。ある実施態様において、ｈｉｓＨは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現される。他の実施態様において、ｈｉｓＨは、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現されない。例えば、ｈｉｓＨは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの他の構成要素無しに発現され得る。

【0070】

本明細書に記載する宿主細胞は、ＨｉｓＨ酵素および／またはこのような酵素をコードする異種核酸を含み得る。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号１７；表３におけるＨｉｓＨ酵素；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＨ酵素の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)であるアミノ酸配列を含む、ＨｉｓＨ酵素をコードする、異種核酸を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号１６；表３におけるＨｉｓＨ酵素をコードする核酸；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＨ酵素をコードする核酸の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である、異種核酸を含む。

【0071】

ＨｉｓＡ
ＨｉｓＡは、ヒスチジン生合成経路の４番目の反応を触媒する、１－(５－ホスホリボシル)－５－[(５－ホスホリボシルアミノ)メチリデンアミノ]イミダゾール－４－カルボキサミドイソメラーゼ酵素である(図２Ａ)。本明細書で使用する用語「ＨｉｓＡ」は野生型バージョンのＨｉｓＡを含み、変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＡも含む。ある実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は野生型ＨｉｓＡタンパク質をコードする核酸を含み、一方他の実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＡをコードする核酸を含む。ある実施態様において、ｈｉｓＡは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現される。他の実施態様において、ｈｉｓＡは、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現されない。例えば、ｈｉｓＡは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの他の構成要素無しに発現され得る。

【0072】

本明細書に記載する宿主細胞は、ＨｉｓＡ酵素および／またはこのような酵素をコードする異種核酸を含み得る。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号１９；表３におけるＨｉｓＡ酵素；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＡ酵素の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)であるアミノ酸配列を含む、ＨｉｓＡ酵素をコードする、異種核酸を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号１８；表３におけるＨｉｓＡ酵素をコードする核酸；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＡ酵素をコードする核酸の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である、異種核酸を含む。

【0073】

ＨｉｓＦ
ＨｉｓＦタンパク質はＨｉｓＨと二量体を形成し、その後、イミダゾールグリセロールホスフェート(ＩＧＰ)シンターゼ酵素として機能し、ヒスチジン生合成の５番目の工程を触媒する(図２Ａ)。本明細書で使用する用語「ＨｉｓＦ」は野生型バージョンのＨｉｓＦを含み、変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＦも含む。ある実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は野生型ＨｉｓＦタンパク質をコードする核酸を含み、一方他の実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＦをコードする核酸を含む。ある実施態様において、ｈｉｓＦは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現される。他の実施態様において、ｈｉｓＦは、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現されない。例えば、ｈｉｓＦは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの他の構成要素無しに発現され得る。

【0074】

本明細書に記載する宿主細胞は、ＨｉｓＦ酵素および／またはこのような酵素をコードする異種核酸を含み得る。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号２１；表３におけるＨｉｓＦ酵素；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＦ酵素の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)であるアミノ酸配列を含む、ＨｉｓＦ酵素をコードする、異種核酸を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号２０；表３におけるＨｉｓＦ酵素をコードする核酸；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＦ酵素をコードする核酸の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である、異種核酸を含む。

【0075】

ＨｉｓＩ
ＨｉｓＩは、ヒスチジン生合成経路の２番目および３番目の工程を触媒する、二機能性酵素である(図２Ａ)。本明細書で使用する用語「ＨｉｓＩ」は野生型バージョンのＨｉｓＩを含み、変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＩも含む。ある実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は野生型ＨｉｓＩタンパク質をコードする核酸を含み、一方他の実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は変異体またはバリアントバージョンのＨｉｓＩをコードする核酸を含む。ある実施態様において、ｈｉｓＩは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現される。他の実施態様において、ｈｉｓＩは、ヒスチジンオペロンの一部として宿主細胞で発現されない。例えば、ｈｉｓＩは、プラスミド上でまたは細胞の染色体に組み込まれて、ヒスチジンオペロンの他の構成要素無しに発現され得る。

【0076】

本明細書に記載する宿主細胞は、ＨｉｓＩ酵素および／またはこのような酵素をコードする異種核酸を含み得る。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号２３；表３におけるＨｉｓＩ酵素；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＩ酵素の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)であるアミノ酸配列を含む、ＨｉｓＩ酵素をコードする、異種核酸を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号２２；表３におけるＨｉｓＩ酵素をコードする核酸；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＩ酵素をコードする核酸の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である、異種核酸を含む。

【0077】

ｐｒｓ／ＲＰＰＫ
リボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)はホスホリボシルピロリン酸シンターゼおよびリボースリン酸ジホスホキナーゼとしても知られ、ｐｒｓ遺伝子によりコードされ、ヒスチジン生合成に関与するさらなる酵素である。ＲＰＰＫは、リボース５－リン酸からのホスホリボシルピロリン酸(ＰＲＰＰ)の合成を触媒する。

【0078】

ヒスチジン合成におけるＲＰＰＫ活性は、フィードバック阻害に感受性である。従って、フィードバック耐性変異体が、ヒスチジン産生を増加させるために研究されている。例えば、野生型大腸菌ＲＰＰＫの残基１１５および他のＲＰＰＫタンパク質における対応する残基のアスパラギン酸からセリン置換は、いくつかの細胞でフィードバック耐性に寄与するとして同定されている(Roessler (1993) J. Biol. Chem. 268(35):26476-81; Taira (1987) J. Biol. Chem. 262(31):14867-70)。また、最近公開されたＲＰＰＫの結晶構造は、酵素の活性部位またはアロステリック部位内に位置する数残基を同定した。Zhou et al. (2019) BMC Structural Biology 19(1), https://doi.org/10.1186/s12900-019-0100-4。実施例に記載するとおり、新規ＲＰＰＫフィードバック耐性アミノ酸置換変異体が、本発明において驚くべきことに同定された。変異残基は、Zhou et al. が、解析された結晶構造に基づき、活性部位またはアロステリック部位内での結合に関与すると報告したのと同じ残基に対応しない。

【0079】

本明細書に記載する宿主細胞は、ＲＰＰＫ酵素および／またはこのような酵素をコードする異種核酸を含み得る。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号２８；表３におけるＲＰＰＫ酵素；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＲＰＰＫ酵素の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)であるアミノ酸配列を含む、ＲＰＰＫ酵素をコードする、異種核酸を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号２７；表３におけるＲＰＰＫ酵素をコードする核酸；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＲＰＰＫ酵素をコードする核酸の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である、異種核酸を含む。

【0080】

ＲＰＰＫタンパク質は、１以上のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を含み得る。ある実施態様において、ＲＰＰＫタンパク質は、対照配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４０を超えるアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫタンパク質は、配列番号２８の配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４０を超えるアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を含む。

【0081】

本明細書に記載するＲＰＰＫタンパク質は、フィードバック耐性に寄与する置換を含み得る。ある実施態様において、ＲＰＰＫタンパク質は、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の残基Ｄ１１５に対応する残基にアミノ酸置換を含む。例えば、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)におけるＤ１１５Ｓ、Ｄ１１５Ｌ、Ｄ１１５ＭまたはＤ１１５Ｖ置換に対応する置換を含み得る。ある実施態様において、ＲＰＰＫタンパク質は、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の残基Ａ１３２に対応する残基にアミノ酸置換を含む。例えば、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)におけるＡ１３２ＣまたはＡ１３２Ｑ置換に対応する置換を含み得る。ある実施態様において、ＲＰＰＫタンパク質は、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の残基Ｌ１３０に対応する残基にアミノ酸置換を含む。例えば、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)におけるＬ１３０ＩまたはＬ１３０Ｍ置換に対応する置換を含み得る。ある実施態様において、ＲＰＰＫタンパク質は、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)の残基Ｄ１１５、Ａ１３２およびＬ１３０に対応する２以上の残基にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)におけるＤ１１５Ｓ、Ｄ１１５Ｌ、Ｄ１１５Ｍ、Ｄ１１５Ｖ、Ａ１３２Ｃ、Ａ１３２Ｑ、Ｌ１３０ＩおよびＬ１３０Ｍ置換に対応する２以上の置換を含む。

【0082】

ある実施態様において、１以上のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を含むＲＰＰＫタンパク質を含むＲＰＰＫタンパク質をコードする異種核酸は、ヒスチジンオペロン内に発現される。他の実施態様において、１以上のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を含むＲＰＰＫタンパク質を含むＲＰＰＫタンパク質をコードする異種核酸は、ヒスチジンオペロン内に発現されない。

【0083】

ｆｏｌＤ／ＭＴＨＦＤＣ
大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子によりコードされる５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／５,１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(ＭＴＨＦＤＣ)は、ヒスチジン生合成に関与するさらなる酵素である。ＭＴＨＦＤＣは、大腸菌代謝生成物５,１０－ＣＨ_２－ＴＨＦから１０－ＣＨＯ－ＴＨＦの２工程変換と、付随する補因子ＮＡＤＰ(＋)からＮＡＤＰＨへの還元を触媒する、二機能性酵素である(図７、Ｒ７およびＲ８)。１０－ＣＨＯ－ＴＨＦは、二機能性酵素ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ／ＩＭＰシクロヒドロラーゼ(ＰｕｒＨ)の共基質であり、それは、ＡＩＣＡＲからイノシン一リン酸(ＩＭＰ)への変換中、１０－ＣＨＯ－ＴＨＦからプリン代謝生成物５－アミノ－１－(５－ホスホ－β－Ｄ－リボシル)イミダゾール－４－カルボキサミド(ＡＩＣＡＲ)へのホルミル炭素の転移を触媒する。ＡＩＣＡＲは、ヒスチジン産生の絶対的副生成物である。実施例に記載するとおり、種々の合成プロモーター制御下のＭＴＨＦＤＣの過発現は、驚くべきことにヒスチジン産生株の生産性および収量を改善した。

【0084】

本明細書で使用する用語「ＭＴＨＦＤＣ」は野生型バージョンのＭＴＨＦＤＣを含み、変異体またはバリアントバージョンのＭＴＨＦＤＣも含む。ある実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は野生型ＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードする核酸を含み、一方他の実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は変異体またはバリアントバージョンのＭＴＨＦＤＣをコードする核酸を含む。

【0085】

本明細書に記載する宿主細胞は、ＭＴＨＦＤＣ酵素および／またはこのような酵素をコードする核酸を含み得る。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号３６；表３におけるＭＴＨＦＤＣ酵素；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＭＴＨＦＤＣ酵素の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)であるアミノ酸配列を含む、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする核酸を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号３５；表３におけるＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする核酸；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする核酸の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である、核酸を含む。

【0086】

ＭＴＨＦＤＣタンパク質は、１以上のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を含み得る。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣタンパク質は、対照配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４０を超えるアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を含む。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣタンパク質は、配列番号３６の配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４０を超えるアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を含む。

【0087】

ある実施態様において、１以上のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を含むＭＴＨＦＤＣタンパク質を含むＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードする核酸は、プラスミド上に発現される。他の実施態様において、１以上のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を含むＭＴＨＦＤＣタンパク質を含むＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。ある実施態様において、宿主細胞は、１以上のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を含むＭＴＨＦＤＣタンパク質を含むＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードする核酸を２コピー以上含む。ある実施態様において、宿主細胞は、１以上のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を含むＭＴＨＦＤＣタンパク質を含むＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードする核酸を、３コピー以上、４コピー以上、５コピー以上、６コピー以上、７コピー以上、８コピー以上、９コピー以上または１０コピー以上含む。

【0088】

ある実施態様において、宿主細胞は、ＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードするｆｏｌＤ遺伝子の内因性コピーを、その天然プロモーターの制御下に発現する。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードするｆｏｌＤ遺伝子の内因性コピーを、その天然プロモーターの制御下に発現する宿主細胞は、ＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードするさらなる核酸も１コピー以上発現する。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードするさらなる核酸の１コピー以上は、プラスミド上で発現されるかまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれる。ある実施態様において、ＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードするさらなる核酸の１コピー以上は、１以上の合成プロモーターの制御下に発現される。

【0089】

本発明の態様は、ｆｏｌＤ遺伝子などのＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードする１以上の遺伝子を過発現する宿主細胞に関する。ｆｏｌＤ遺伝子などのＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させるあらゆる機構が本発明により意図されることは、認められるべきである。例えば、宿主細胞は、ｆｏｌＤ遺伝子などのＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードする遺伝子のコピー数が増加していてよいおよび／または遺伝子の１コピー以上が、その天然プロモーターと比較して遺伝子発現を増加させる強いプロモーターにより制御されていてよい。ある実施態様において、ｆｏｌＤ遺伝子などのＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードする遺伝子のコピー数増加は、１以上のプラスミド上への１コピー以上の発現により達成される。他の実施態様において、ｆｏｌＤ遺伝子などのＭＴＨＦＤＣタンパク質をコードする遺伝子のコピー数増加は、遺伝子の１コピー以上の染色体への組み込みにより達成される。

【0090】

ｆｏｌＤ遺伝子などのＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする遺伝子を過発現する宿主細胞を、ヒスチジン以外の生成物および代謝生成物の産生にも使用し得る。ある実施態様において、本開示と関連する宿主細胞は、プリン経路代謝生成物の産生に使用される。プリン経路代謝生成物の非限定的例は、イノシン、グアノシン、キサントシン、アデノシン、ヒポキサンチン、グアニン、キサンチン、アデニン、イノシン一リン酸(ＩＭＰ)、キサントシン一リン酸(ＸＭＰ)、グアノシンリン酸(例えば、ＧＭＰ、ＧＤＰおよびＧＴＰ)およびアデノシンリン酸(例えば、ＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰ)を含む。ある実施態様において、ｆｏｌＤ遺伝子などのＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする遺伝子の過発現は、生合成のためにこれら代謝生成物を出発物質として利用する生成物の増加をもたらし得る。例えば、ｆｏｌＤの過発現は、ＧＴＰからリボフラビンへの変換増加および／またはフラボノイド補因子フラビンモノヌクレオチド(ＦＭＮ)および／またはフラビンアデニンジヌクレオチド(ＦＡＤ)の産生増加をもたらし得る。ｆｏｌＤの過発現は、キサンチンから尿酸への変換増加ももたらし得る。ある実施態様において、本発明の宿主細胞は、さらにリボフラビン生合成オペロンの脱制御を含む。

【0091】

ｆｏｌＤ遺伝子などのＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする遺伝子を過発現する宿主細胞は、ｐＤＮＡの産生のためにも使用し得る。ある実施態様において、本開示と関連する宿主細胞は、ｐＤＮＡの産生に使用される。ある実施態様において、ｆｏｌＤ遺伝子などのＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする遺伝子の過発現は、プリン代謝生成物(例えば、アデニンおよびグアニン)増加ももたらし得る。ある実施態様において、本発明の宿主細胞は、ｐＤＮＡ生合成増加に関与する修飾をさらに含む。

【0092】

本発明と関連する遺伝子の発現制御
本発明は、宿主細胞における核酸の異種発現を含む、方法を包含する。ある遺伝子を含む核酸またはプロモーターもしくはリボソーム結合部位などの制御領域を含む核酸などの核酸に関する用語「異種」は、用語「外因性」および用語「組み換え」と相互交換可能に使用され、生物系に人工的に供給されている核酸；生物系内で修飾されている核酸；または発現もしくは制御が生物系内で操作されている核酸をいう。宿主細胞に導入されたまたは宿主細胞で発現される異種核酸は、宿主細胞と異なる生物または種由来の核酸であってよくまたは合成核酸であってよくまたは宿主細胞と同じ生物または種で内因性にも発現される核酸であってよい。例えば、宿主細胞で内因性に発現される核酸は、宿主細胞で非天然に配置される；宿主細胞で安定にまたは一過性に組み換えにより発現される；宿主細胞内で修飾される；宿主細胞内で選択的に編集される；宿主細胞内で非天然コピー数で発現される；または核酸の発現を制御する制御領域の操作によるなど宿主細胞内で非天然の方法で発現されるとき、異種と見なされ得る。ある実施態様において、異種核酸は、宿主細胞で内因性に発現されるが、その発現が該核酸の発現を天然で制御しないプロモーターにより駆動される核酸である。他の実施態様において、異種核酸は、宿主細胞で内因性に発現され、その発現が該核酸の発現を天然で制御するプロモーターにより駆動されるが、該プロモーターまたは他の制御領域が修飾されている、核酸である。ある実施態様において、プロモーターは、組み換えにより活性化または抑圧される。例えば、遺伝子編集ベースの技術を使用して、内因性プロモーターを含むプロモーターからの、内因性核酸を含む核酸の発現を制御し得る。例えば、Chavez et al., Nat Methods. 2016 Jul; 13(7): 563-567参照。異種核酸は、野生型配列または対照核酸配列と比較して変異配列を含み得る。

【0093】

ある実施態様において、本明細書に記載されるタンパク質の何れかをコードする核酸は、制御配列の制御下にある。ある実施態様において、核酸は、プロモーターの制御下に発現される。ある実施態様において、プロモーターは異種である。プロモーターは、遺伝子の発現の通常の制御を提供する、天然プロモーター、例えば、遺伝子が内因性にある状況でのプロモーターであり得る。あるいは、プロモーターは、遺伝子の天然プロモーターと異なるプロモーターであってよく、例えば、プロモーターは、遺伝子が内因性にある状況でのプロモーターと異なる。ある実施態様において、異なるプロモーターは、天然プロモーターに比して強度が増加しており、例えば、強力なプロモーターは、その天然プロモーターによる遺伝子の制御と比較して、遺伝子の発現を増加させる。当業者は、当分野で知られる方法に基づき、プロモーター強度をどのように評価するか理解している。本発明の態様は、合成プロモーターの制御下のヒスチジン生合成遺伝子の発現に関する。本明細書で使用する「合成プロモーター」は、天然では存在が知られていないプロモーターをいう。実施例に示されるとおり、合成プロモーターの制御下の８個のヒスチジン生合成遺伝子ｈｉｓＧＤＣＢＨＡＦＩを含むオペロンの発現は、ヒスチジン生合成に有効であった。同様に実施例に示されるとおり、合成プロモーターの制御下の大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子の発現は、ヒスチジン生合成の増加に有効であった。

【0094】

ある実施態様において、プロモーターは、配列番号１に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号１と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号２に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号２と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。

【0095】

ある実施態様において、プロモーターは、配列番号３７に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号３７と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号３８に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号３８と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号３９に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号３９と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４０に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４０と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４１に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４１と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４２に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４２と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４３に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４３と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４４に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４４と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４５に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４５と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４６に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４６と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４７に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４７と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。

【0096】

ある実施態様において、プロモーターは、Ｐ_{(ＣＰ２５)}またはその機能的フラグメントまたはＰ_{(ＣＰ１５)}またはその機能的フラグメントである。ある実施態様において、プロモーターは、配列番号４４またはその機能的フラグメントである、プロモーターは、Ｐ_{(Ｂｂａ＿ｊ２３１０４)}またはその機能的フラグメントである；プロモーターは、Ｐ_{(ｇａｌＰ)}またはその機能的フラグメントである、プロモーターは、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ３２２)}またはその機能的フラグメントである、プロモーターは、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ２９)}またはその機能的フラグメントである、プロモーターは、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ７６)}またはその機能的フラグメントである、プロモーターは、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ３３９)}またはその機能的フラグメントである、プロモーターは、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ３４６)}またはその機能的フラグメントである、プロモーターは、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ４６)}またはその機能的フラグメントである、プロモーターはＰ_{(ａｐＦＡＢ１０１)}またはその機能的フラグメントであるまたはプロモーターは、Ｐ_{(ｇｃｖＴｐ)}またはその機能的フラグメントである。核酸のフラグメントは、完全長核酸分子までの、しかしそれを含まない、部分をいう。本発明の核酸の機能的フラグメントは、核酸の生物学的活性部分をいう。プロモーターなどの遺伝子制御要素の生物学的活性部分は、完全長遺伝子制御要素の一部またはフラグメントを含み、完全長遺伝子制御要素と同じタイプの活性を有し得るが、遺伝子制御要素の生物学的活性部分の活性レベルは、完全長遺伝子制御要素の活性レベルと比較して変わり得る。

【0097】

合成プロモーターの他の非限定的例は、ＣＰ３８、ＣＰ４４、ｏｓｍＹ、ａｐＦＡＢ３８、ｘｔｈＡ、ｐｏｘＢ、ｌａｃＵＶ５、ｐＬｌａｃＯ１、ｐＬＴｅｔＯ１、ａｐＦＡＢ５６、Ｔｒｃ、ａｐＦＡＢ４５、ａｐＦＡＢ７０、ａｐＦＡＢ７１、ａｐＦＡＢ９２、Ｔ７Ａ１、ｂａｄおよびｒｈａを含む。

【0098】

ある実施態様において、天然プロモーター(例えば、ｈｉｓｐ１)を使用して、Winkler et al. (2009), EcoSal Plus Aug; 3(2), doi: 10.1128/ecosalplus.3.6.1.19に記載のかつ引用により本明細書に包含させる、ヒスチジンオペロンの１以上の構成要素の転写を駆動し得る。このような実施態様において、転写は、短オープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)およびリーダーペプチドを介して一次プロモーター(ｈｉｓｐ１)から伸び得る。本明細書で使用する「ｈｉｓＬ」は、多シストロン性ヒスチジンオペロンｍＲＮＡのリーダーペプチド／転写アテニュエータをコードする配列である。野生型ＨｉｓＬリーダーペプチドは、７連続Ｈｉｓアミノ酸を含む、ヒスチジンに富むポリペプチドである。ある実施態様において、天然ＨｉｓＬは宿主細胞に存在する。ある実施態様において、天然ＨｉｓＬ配列は、Panichkin et al. (2016) Applied Biochemistry and Microbiology, Vol. 52, No. 9, pp. 783-809に記載のとおり、宿主細胞から欠失され、ＴｒｐＥＤ翻訳共役接合部で置き換えられる。ある実施態様において、プロモーター後のＯＲＦは、下流にＲｈｏ非依存性ターミネーターが続く。ある実施態様において、ヒスチジンオペロンからの転写の減弱は、ｈｉｓＬ下流のＲｈｏ非依存性ターミネーターでリードスルー(またはリードスルーの欠如)の関数として起こる。ターミネーターでのリードスルーは、細胞レベルの荷電ｔＲＮＡ^Ｈｉｓにより制御され得る。

【0099】

本明細書に記載する宿主細胞は、ＨｉｓＬタンパク質および／またはこのようなタンパク質をコードする異種核酸を含み得る。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号３４；表３におけるＨｉｓＬタンパク質；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＬタンパク質の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)であるアミノ酸配列を含む、ＨｉｓＬタンパク質をコードする、異種核酸を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、配列番号３３；表３におけるＨｉｓＬタンパク質をコードする核酸；または本明細書に他に記載されたまたは当分野で知られるＨｉｓＬタンパク質をコードする核酸の何れかに少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である、異種ポリヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ＨｉｓＬタンパク質は、配列番号３４と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以下のアミノ酸置換、挿入、付加または欠失を含む。

【0100】

ある実施態様において、天然プロモーター(例えば配列番号４４)は、大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子の転写の駆動に使用し得る。

【0101】

ある実施態様において、プロモーターは、真核生物プロモーターである。真核生物プロモーターの非限定的例は、当業者に知られるとおり、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＰＫＣ１、ＰＤＣ１、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＲＰＬ１８Ｂ、ＳＳＡ１、ＴＤＨ２、ＰＹＫ１、ＴＰＩ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＧＡＬ３、ＧＡＬ２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ２５、ＨＸＴ３、ＨＸＴ７、ＡＣＴ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＣＵＰ１－１、ＥＮＯ２およびＳＯＤ１を含む(例えば、Addgeneウェブサイト：blog.addgene.org/plasmids-101-the-promoter-region参照)。ある実施態様において、プロモーターは、原核生物プロモーター(例えば、バクテリオファージまたは細菌プロモーター)である。バクテリオファージプロモーターの非限定的例は、Ｐｌｓ１ｃｏｎ、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６およびＰＬを含む。細菌プロモーターの非限定的例は、Ｐ_ｂａｄ、Ｐ_ｍｇｒＢ、Ｐ_ｔｒｃ２、Ｐ_{ｌａｃ／ａｒａ}、Ｐ_ｔａｃ、ＣＰ６、ＣＰ２５、ＣＰ３８、ＣＰ４４、ＣＰ４３、ＣＰ３１、ＣＰ２４、ＣＰ１８、ＣＰ２７、ＣＰ３７、ＣＰ１７、ＣＰ２、ＣＰ４、ＣＰ４５、ＣＰ１、ＣＰ２２、ＣＰ１９、ＣＰ３４、ＣＰ２０、ＣＰ１１、ＣＰ２６、ＣＰ３、ＣＰ１４、ＣＰ１３、ＣＰ４０、ＣＰ８、ＣＰ２８、ＣＰ１０、ＣＰ３２、ＣＰ３０、ＣＰ９、ＣＰ４６、ＣＰ２３、ＣＰ３９、ＣＰ３５、ＣＰ３３、ＣＰ１５、ＣＰ２９、ＣＰ１２、ＣＰ４１、ＣＰ１６、ＣＰ４２、ＣＰ７、Ｐｍ、Ｐ_Ｈ２０７、Ｐ_{Ｄ／Ｅ２０}、Ｐ_Ｎ２５、Ｐ_Ｇ２５、Ｐ_Ｊ５、Ｐ_Ａ１、Ｐ_Ａ２、Ｐ_Ｌ、Ｐ_ｌａｃ、Ｐ_{ｌａｃＵＶ５}、Ｐ_ｔａｃＩおよびＰ_ｃｏｎを含む。原核生物プロモーターは、さらにJensen et al. (1998) Appl Environ Microbiol. 64:82-7, Kosuri et al. (2013) Proc Natl Acad Sci U S A. 110:14024-9およびDeuschle et al. (1986) EMBO J. 5:2987-94に記載され、引用により本明細書に包含させる。

【0102】

ある実施態様において、プロモーターは、誘導型プロモーターである。本明細書で使用する「誘導型プロモーター」は、ある分子の存在または非存在により制御されるプロモーターである。これは、例えば、酵素発現の制御可能な誘導のために使用され得る。ある実施態様において、誘導型プロモーターを使用して、ヒスチジンの産生の微調整のために、宿主細胞におけるヒスチジン生合成に必要な１以上の酵素の発現を制御し得る。誘導型プロモーターの非限定的例は、化学的に制御されたプロモーターおよび物理的に制御されたプロモーターを含む。化学的に制御されたプロモーターについて、転写活性は、アルコール、テトラサイクリン、ガラクトース、ステロイド、金属または他の化合物などの１以上により制御され得る。物理的に制御されたプロモーターについて、転写活性は、光または温度などの現象により制御され得る。テトラサイクリン制御プロモーターの非限定的例は、ヒドロテトラサイクリン(ａＴｃ)応答性プロモーターおよび他のテトラサイクリン応答性プロモーター系(例えば、テトラサイクリンリプレッサータンパク質(ｔｅｔＲ)、テトラサイクリンオペレーター配列(ｔｅｔＯ)およびテトラサイクリントランスアクティベーター融合タンパク質(ｔＴＡ))を含む。ステロイド制御プロモーターの非限定的例は、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガのエクジソン受容体に基づくプロモーターおよびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーからのプロモーターを含む。金属制御プロモーターの非限定的例は、メタロチオネイン(金属イオンと結合し、捕捉するタンパク質)遺伝子由来のプロモーターを含む。病因制御プロモーターの非限定的例は、サリチル酸、エチレンまたはベンゾチアジアゾール(ＢＴＨ)により誘導されるプロモーターを含む。温度／熱誘導性プロモーターの非限定的例は、ヒートショックプロモーターを含む。光制御プロモーターの非限定的例は、植物細胞からの光応答性プロモーターを含む。ある実施態様において、誘導型プロモーターは、ガラクトース誘導性プロモーターである。ある実施態様において、誘導型プロモーターは、１以上の生理学的条件(例えば、ｐＨ、温度、放射線、浸透圧、食塩水勾配、細胞表面結合または１以上の外因性もしくは内因性誘導因子の濃度)により誘導される。外因性誘導因子または誘導剤の非限定的例は、アミノ酸およびアミノ酸アナログ、糖類および多糖、核酸、タンパク質転写アクティベーターおよびリプレッサー、サイトカイン、毒素、石油ベースの化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質アナログ、ホルモンまたはあらゆる組み合わせを含む。

【0103】

ある実施態様において、プロモーターは、構成的プロモーターである。本明細書で使用する「構成的プロモーター」は、遺伝子の連続的転写を可能とする、制御されないプロモーターをいう。構成的プロモーターの非限定的例は、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＰＫＣ１、ＰＤＣ１、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＲＰＬ１８Ｂ、ＳＳＡ１、ＴＤＨ２、ＰＹＫ１,ＴＰＩ１、ＨＸＴ３、ＨＸＴ７、ＡＣＴ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＥＮＯ２およびＳＯＤ１を含む。

【0104】

当業者に知られ得る合成プロモーターを含む他の誘導型プロモーターまたは構成的プロモーターも意図される。ある実施態様において、本発明に包含される合成プロモーターは、天然プロモーターと比較して、強度が増加している。

【0105】

ヒスチジンオペロンをコードする核酸の発現は、少なくとも一部、インスレーターリボザイムの存在により増強され得る。本発明のある実施態様において、インスレーターリボザイムは、プロモーターの下流およびリボソーム結合部位(ＲＢＳ)の上流に挿入される。ある実施態様において、インスレーターリボザイムは、ヒスチジンオペロンの発現を増加させる。ある実施態様において、インスレーターリボザイムは、Lou et al. (2012) Nat Biotechnol. November; 30(11):1137-1142, doi: 10.1038/nbt.2401およびClifton et al. (2018) J. Biol. Eng.; 12:23, doi: 10.1186/s13036-018-0115-6に記載のおよび引用により本明細書に包含させる、ＬｔｓｖＪ、ＳｃｃＪ、ＲｉｂｏＪ、ＳａｒＪ、ＰｌｍＪ、ＶｔｍｏＪ、ＣｈｍＪ、ＳｃｖｍＪ、ＳｌｔＪまたはＰｌｍｖＪである。当分野で知られる他のインスレーターリボザイムも、本発明の態様に適用できることは、認められるべきである。ある実施態様において、インスレーターリボザイムは、配列番号５に７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、インスレーターリボザイムは、配列番号５と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。

【0106】

ヒスチジンオペロンの翻訳は、少なくとも一部、ＲＢＳの存在により増強され得る。本明細書で使用する「ＲＢＳ」は、リボソーム動員に関与する、ｍＲＮＡにおける開始コドン上流の制御核酸領域をいう。ある実施態様において、ＲＢＳは異種である。宿主細胞は、天然ＲＢＳ、例えば、遺伝子またはオペロンの発現の通常の制御を提供するその内因性状況におけるＲＢＳを発現できる。あるいは、ＲＢＳは、遺伝子またはオペロンと関連する天然ＲＢＳと異なるＲＢＳであってよく、例えば、ＲＢＳは、その内因性状況における遺伝子またはオペロンのＲＢＳと異なる。ＲＢＳは合成され得る。本明細書で使用する「合成ＲＢＳ」は、天然に存在することが知られていないＲＢＳをいう。合成ＲＢＳは、Salis et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27, 946-950 (2009)にさらに記載され、引用により本明細書に包含させる。

【0107】

ある実施態様において、ＲＢＳは、配列番号３または４と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一または１００％同一(間に入る全数値を含む)である配列を含む。ある実施態様において、ＲＢＳは、配列番号３または４と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８以下のヌクレオチド置換、挿入、付加または欠失を含む。

【0108】

ある実施態様において、ＲＢＳは、ａｐＦＡＢ８７３、ａｐＦＡＢ８２６、ＤｅａｄＲＢＳ、ａｐＦＡＢ８７１、ＢＢａ＿Ｊ６１１３３、ＢＢａ＿Ｊ６１１３９、ａｐＦＡＢ８４３、ＢＢａ＿Ｊ６１１２４、ａｐＦＡＢ８６４、ａｐＦＡＢ９６４、ＢＢａ＿Ｊ６１１０１、ＢＢａ＿Ｊ６１１３１、ｓａｌｉｓ－３－１１、ＢＢａ＿Ｊ６１１２５、ＢＢａ＿Ｊ６１１１８、ａｐＦＡＢ９２２、ＢＢａ＿Ｊ６１１３０、ＢＢａ＿Ｊ６１１３４、ＢＢａ＿Ｊ６１１２８、ＢＢａ＿Ｊ６１１０７、ａｐＦＡＢ８６９、ａｐＦＡＢ８９０、ＢＢａ＿Ｊ６１１２０、ＢＢａ＿Ｊ６１１０９、ＢＢａ＿Ｊ６１１０３、ａｐＦＡＢ８６８、ａｐＦＡＢ９１４、ＢＢａ＿Ｊ６１１１９、ＢＢａ＿Ｊ６１１２６、Ｂ００３２＿ＲＢＳ、ａｐＦＡＢ８９５、ＢＢａ＿Ｊ６１１３６、ａｐＦＡＢ８６６、ＧＳＧＶ＿ＲＢＳ、ａｐＦＡＢ９１８、ＢＢａ＿Ｊ６１１２９、ａｐＦＡＢ８６７、ａｐＦＡＢ９０３、ａｐＦＡＢ８７２、ＢＢａ＿Ｊ６１１３７、ＢＢａ＿Ｊ６１１１１、ａｐＦＡＢ８２１、ａｐＦＡＢ８４４、ＢＢａ＿Ｊ６１１１０、ＢＢａ＿Ｊ６１１１２、ＢＢａ＿Ｊ６１１０４、ＢＢａ＿Ｊ６１１２２、ａｐＦＡＢ８５４、ＢＢａ＿Ｊ６１１２７、ＢＢａ＿Ｊ６１１１３、ＧＳＧ＿ＲＢＳ、ａｐＦＡＢ８９２、ＢＢａ＿Ｊ６１１１５、ａｐＦＡＢ９２７、ＢＢａ＿Ｊ６１１０８、Ａｎｄｅｒｓｏｎ＿ＲＢＳ、ａｐＦＡＢ８８３、ａｐＦＡＢ８９４、ＢＢａ＿Ｊ６１１３２、ａｐＦＡＢ８６０、ＢＢａ＿Ｊ６１１００、ａｐＦＡＢ８５６、ａｐＦＡＢ８６２、ａｐＦＡＢ８６５、ＢＢａ＿Ｊ６１１０６、ａｐＦＡＢ８４５、ａｐＦＡＢ８２０、ａｐＦＡＢ９５４、ａｐＦＡＢ９１０、ｓａｌｉｓ－４－１０、ａｐＦＡＢ９０１、ｓａｌｉｓ－４－４、ａｐＦＡＢ８３２、ａｐＦＡＢ９０９、ｓａｌｉｓ－４－７、ａｐＦＡＢ８６１、ａｐＦＡＢ８７６、ａｐＦＡＢ８２７、ｓａｌｉｓ－２－４、Ａｌｏｎ＿ＲＢＳ、ａｐＦＡＢ８３１、ａｐＦＡＢ８５７、ａｐＦＡＢ８６３、ａｐＦＡＢ９１２、ａｐＦＡＢ８８９、ａｐＦＡＢ８５１、ａｐＦＡＢ８８４、ａｐＦＡＢ８３３、ａｐＦＡＢ８４８、ａｐＦＡＢ８３９、ｓａｌｉｓ－１－２１、ａｐＦＡＢ９２３、Ｐｌｏｔｋｉｎ＿ＲＢＳ、ａｐＦＡＢ８４２、ｓａｌｉｓ－２－３、ａｐＦＡＢ８３７、ａｐＦＡＢ９１６、ａｐＦＡＢ８３４、ａｐＦＡＢ９０４、ａｐＦＡＢ９１７、ｓａｌｉｓ－１－１０、Ｉｎviｔｒｏｇｅｎ＿ＲＢＳ、ｓａｌｉｓ－１－１、ｓａｌｉｓ－１－３、ｓａｌｉｓ－３－３、ｓａｌｉｓ－４－２、ＪＢＥＩ＿ＲＢＳ、ｓａｌｉｓ－１－５、Ｂ００３４＿ＲＢＳ、Ｂ００３０＿ＲＢＳまたはＢｕｊａｒｄ＿ＲＢＳであり、これらは、Kosuri et al. (2013) Proc Natl Acad Sci U S A. 110:14024-9にさらに記載され、引用により本明細書に包含させる。ある実施態様において、ＲＢＳはａｐＦＡＢ８７３またはａｐＦＡＢ８２６である。

【0109】

コード配列および制御配列は、コード配列と制御配列が共有結合で結合されおよび／またはコード配列の発現または転写が制御配列のまたは制御下にあるとき、「操作可能に連結」または「操作可能に結合」と言える。ある実施態様において、Ｐ_{(ＣＰ２５)}またはその機能的フラグメントまたはＰ_{(ＣＰ１５)}またはその機能的フラグメントなどのプロモーターは、ｈｉｓＧ、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＣ、ｈｉｓＢ、ｈｉｓＨ、ｈｉｓＡ、ｈｉｓＦおよび／またはｈｉｓＩを含む１以上のヒスチジン生合成遺伝子に操作可能に結合する。ある実施態様において、Ｐ_{(ＣＰ２５)}またはその機能的フラグメントまたはＰ_{(ＣＰ１５)}またはその機能的フラグメントなどのプロモーターおよび１以上のＲＢＳは、ｈｉｓＧ、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＣ、ｈｉｓＢ、ｈｉｓＨ、ｈｉｓＡ、ｈｉｓＦおよび／またはｈｉｓＩを含む１以上のヒスチジン生合成遺伝子に操作可能に結合する。ある実施態様において、Ｐ_{(ＣＰ２５)}またはその機能的フラグメントまたはＰ_{(ＣＰ１５)}またはその機能的フラグメントなどのプロモーターおよび１以上のインスレーターリボザイムおよび／または１以上のＲＢＳは、ｈｉｓＧ、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＣ、ｈｉｓＢ、ｈｉｓＨ、ｈｉｓＡ、ｈｉｓＦおよび／またはｈｉｓＩを含む１以上のヒスチジン生合成遺伝子に操作可能に結合する。ある実施態様において、配列番号４４またはその機能的フラグメント、Ｐ_{(Ｂｂａ＿ｊ２３１０４)}またはその機能的フラグメント、Ｐ_{(ｇａｌＰ)}またはその機能的フラグメント、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ３２２)}またはその機能的フラグメント、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ２９)}またはその機能的フラグメント、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ７６)}またはその機能的フラグメント、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ３３９)}またはその機能的フラグメント、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ３４６)}またはその機能的フラグメント、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ４６)}またはその機能的フラグメント、Ｐ_{(ａｐＦＡＢ１０１)}またはその機能的フラグメントまたはＰ_{(ｇｃｖＴｐ)}またはその機能的フラグメントなどのプロモーター能的フラグメントまたはＰ_{(ｇｃｖＴｐ)}またはその機能的フラグメントは、大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子に操作可能に結合する。

【0110】

本明細書に記載する核酸は、当分野で知られる何れかの方法により、何れかの適切なベクターに取り込まれ得る。例えば、ベクターは、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター)、一過性発現に適するあらゆるベクター、構成的発現に適するあらゆるベクターまたは誘導型発現に適するあらゆるベクター(例えば、ガラクトース誘導性またはドキシサイクリン誘導性ベクター)を含むが、これらに限定されない発現ベクターであり得る。本明細書に記載するベクターは、当分野で知られる何れかの方法を使用して、適当な宿主細胞に導入され得る。

【0111】

ある実施態様において、ベクターは、細胞で自律的に複製する。ある実施態様において、ベクターは、細胞内の染色体に組み込まれる。ベクターは、細胞で複製可能な組み換えベクターを産生するために、本明細書に記載する遺伝子を含む核酸を挿入およびライゲートするための制限エンドヌクレアーゼにより切断される、１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含み得る。ベクターは、概してＤＮＡからなるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。クローニングベクターは、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノムおよび人工染色体を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する用語「発現ベクター」または「発現構築物」は、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能とする、一連の特定した核酸要素を有する、組み換えまたは合成により産生した核酸構築物をいう。ある実施態様において、本明細書に記載する遺伝子の核酸配列を、制御配列に操作可能に連結し、ある実施態様において、ＲＮＡ転写物として発現されるように、クローニングベクターに挿入する。ある実施態様において、ベクターは、組み換えベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を同定するための、本明細書に記載する選択可能マーカーなどの１以上のマーカーを含む。ある実施態様において、本明細書に記載する遺伝子の核酸配列が再コードされる。再コードは、再コードされない対照配列と比較して、遺伝子生成物の産生を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％(間に入る全数値を含む)増加させ得る。宿主細胞における１以上の遺伝子の発現の誘導に適する１以上の適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力の範囲内である。発現に必要な要素を含む発現ベクターは商業的に入手可能であり、当業者に知られる(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012参照)。

【0112】

さらなる細胞修飾
ヒスチジンの生合成、プリン経路代謝生成物の生合成および／またはプラスミドＤＮＡ(ｐＤＮＡ)の産生のための本明細書に記載する宿主細胞は、さらなる修飾を含み得る。

【0113】

ヒスチジンオペロンの発現は、プリンヌクレオチドのデノボ合成に関与する遺伝子の主リプレッサーである、ＨＴＨ型転写リプレッサーＰｕｒＲの発現により影響され得る。本発明のある実施態様において、ヒスチジンオペロンを含む宿主細胞を含む宿主細胞は、ｐｕｒＲを発現する。ある実施態様において、ヒスチジンオペロンを含む宿主細胞を含む宿主細胞は、対照と比較して、ｐｕｒＲ発現が減少している。例えば、ｐｕｒＲ遺伝子またはＰｕｒＲタンパク質の発現は、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸置換、欠失、挿入または付加の作成などの当分野で知られるあらゆる手段により減少され得る。ある実施態様において、ヒスチジンオペロンを含む宿主細胞を含む宿主細胞は、ｐｕｒＲ欠失(ΔｐｕｒＲ)を有する。

【0114】

本発明の宿主細胞への他の非限定的修飾は当業者に知られ、ラムダ発現減少または欠失(Δλ)；Ｆプラスミド発現減少または欠失(ΔＦ’)；および／またはＨｉｓＪ発現減少または欠失を含み得る。

【0115】

ｐＤＮＡの産生のための本明細書に記載する宿主細胞は、さらなる修飾を含み得る。ｐＤＮＡ産生のための開始プリン代謝生成物(例えば、アデニンおよびグアニン)の発現は、ｐｕｒＡ、ｐｕｒＢ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＤ、ｐｕｒＥ、ｐｕｒＦ、ｐｕｒＨ、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＴ、ｇｕａＡ、ｇｕａＢおよびａｄｋなどのデノボプリン生合成遺伝子の発現により影響され得る。本発明のある実施態様において、宿主細胞は、対照と比較してｐｕｒＡ、ｐｕｒＢ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＤ、ｐｕｒＥ、ｐｕｒＦ、ｐｕｒＨ、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＴ、ｇｕａＡ、ｇｕａＢおよびａｄｋの１以上の発現増加を含む。例えば、ｐｕｒＡ、ｐｕｒＢ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＤ、ｐｕｒＥ、ｐｕｒＦ、ｐｕｒＨ、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＴ、ｇｕａＡ、ｇｕａＢおよびａｄｋ遺伝子またはＰｕｒＡ、ＰｕｒＢ、ＰｕｒＣ、ＰｕｒＤ、ＰｕｒＥ、ＰｕｒＦ、ＰｕｒＨ、ＰｕｒＫ、ＰｕｒＬ、ＰｕｒＮ、ＰｕｒＭ、ＰｕｒＴ、ＧｕａＡ、ＧｕａＢおよびＡｄｋタンパク質の１以上の発現は、ｐｕｒＡ、ｐｕｒＢ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＤ、ｐｕｒＥ、ｐｕｒＦ、ｐｕｒＨ、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＴ、ｇｕａＡ、ｇｕａＢおよびａｄｋ遺伝子の１以上のコピー数増加、１以上のプラスミド上の１コピー以上の発現および／または染色体への１以上の遺伝子の１コピー以上の組み込みなど、当分野で知られるあらゆる手段により増加させ得る。

【0116】

ｐＤＮＡの産生のための開始ピリミジン代謝生成物(例えば、オロト酸、シトシンおよびウラシル)の発現は、アルギニン応答性転写リプレッサーａｒｇＲの発現および／またはｃａｒＡＢ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、ｐｙｒＥ、ｐｙｒＦ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒＨおよびｐｙｒＩなどのデノボピリミジン生合成酵素の発現により影響され得る。本発明のある実施態様において、宿主細胞は、１コピー以上のａｒｇＲを発現する。ある実施態様において、宿主細胞は、対照と比較してａｒｇＲの発現の減少を示す。例えば、ａｒｇＲ遺伝子またはａｒｇＲ遺伝子によりコードされるアルギニンリプレッサータンパク質の発現は、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸置換、欠失、挿入または付加の作成などの当分野で知られるあらゆる手段により低減され得る。ある実施態様において、宿主細胞は、ａｒｇＲの欠失(ΔａｒｇＲ)を含む。本発明のある実施態様において、宿主細胞は、対照と比較してｃａｒＡＢ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、ｐｙｒＥ、ｐｙｒＦ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒＨおよびｐｙｒＩ遺伝子の１以上の発現の増加を含む。例えば、ｃａｒＡＢ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、ｐｙｒＥ、ｐｙｒＦ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒＨおよびｐｙｒＩ遺伝子またはＣａｒＡＢ、ＰｙｒＢ、ＰｙｒＣ、ＰｙｒＤ、ＰｙｒＥ、ＰｙｒＦ、ＰｙｒＧ、ＰｙｒＨまたはＰｙｒＩタンパク質の１以上の発現は、１以上のプラスミド上への１コピー以上の発現および／または染色体への遺伝子の１以上の１コピー以上の組み込みによる、ｃａｒＡＢ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、ｐｙｒＥ、ｐｙｒＦ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒＨおよびｐｙｒＩ遺伝子の１以上のコピー数増加などの、当分野で知られるあらゆる手段により増加させ得る。

【0117】

ｐＤＮＡの産生およびｐＤＮＡ品質増加のための炭素取り込みおよび利用は、細胞溶解後、プラスミド分解を阻止するための大腸菌エンドヌクレアーゼコード化遺伝子ｅｎｄＡ１の発現減少；ｐＤＮＡの意図しない遺伝子組み換えおよび喪失もしくは分解を阻止するためのｒｅｃＡ発現減少；プラスミド複製機構の十分な存在を確実にするためのＤＮＡポリメラーゼIIIおよびＤｎａＢヘリカーゼの過発現；および／またはプラスミド増幅速度を改善するための遺伝子ｐｒｉＡの過発現により影響され得る。ある実施態様において、宿主細胞は、対照と比較して遺伝子ｅｎｄＡ１および／またはｒｅｃＡの発現の減少を含む。例えば、ｅｎｄＡ１遺伝子またはＥｎｄＡ１タンパク質および／またはｒｅｃＡ遺伝子またはＲｅｃＡタンパク質の発現は、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸置換、欠失、挿入または付加の作成などの当分野で知られるあらゆる手段により低減され得る。本発明のある実施態様において、宿主細胞は、ｅｎｄＡ１欠失(ΔｅｎｄＡ１)および／またはｒｅｃＡ欠失(ΔｒｅｃＡ)を含む。本発明のある実施態様において、宿主細胞は、対照と比較して、ＤＮＡポリメラーゼIII、ｄｎａＢヘリカーゼおよびｐｒｉＡの１以上の発現増加を含む。例えば、ＤＮＡポリメラーゼIII、ｄｎａＢヘリカーゼおよびｐｒｉＡ遺伝子またはＤＮＡポリメラーゼIII、ＤｎａＢヘリカーゼおよびＰｒｉＡタンパク質の１以上の発現は、１以上のプラスミド上への１コピー以上の発現および／または染色体への１以上の遺伝子の１コピー以上の組み込みによる、ＤＮＡポリメラーゼIII、ｄｎａＢヘリカーゼおよびｐｒｉＡ遺伝子の１以上のコピー数増加など、あらゆる手段により増加できる。

【0118】

ｐＤＮＡの産生に関する中心的炭素代謝は、緊縮性／飢餓応答を低減し、ｐＤＮＡ収量を改善するためのｓｐｏＴおよびｒｅｌＡ遺伝子の発現減少；中心的炭素代謝への異化制御応答を減少するための遺伝子ｆｒｕＲの発現減少；ヌクレオチド前駆体産生のためのペントースリン酸経路に向けた流動を改善するためのｚｗｆまたはｒｐｉＡ両者の過発現およびｐｇｉ、ｐｙｋＡまたはｐｙｋＦの減弱；および／またはｐＤＮＡ前駆体代謝生成物への流動再指示のための酢酸産生を減少させるためのａｃｋＡ、ｅｕｔＤ、ｐｔａまたはｐｏｘＢの不活性化により影響され得る。ｐｔｓＧまたはｐｔｓＨ遺伝子の発現減少またはｇａｌＰなどのＰＥＰ非依存性糖パーミアーゼ過発現などの炭素輸送のエネルギー効率を増加させるまたは宿主細胞の成長速度を低減させる修飾は、ｐＤＮＡの収量および生産性を改善できる。本発明のある実施態様において、宿主細胞は、対照と比較して、ｓｐｏＴ、ｒｅｌＡ、ｆｒｕＲ、ａｃｋＡ、ｅｕｔＤ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｐｔｓＧまたはｐｔｓＨの発現の減少を含む。例えば、ｓｐｏＴ、ｒｅｌＡ、ｆｒｕＲ、ａｃｋＡ、ｅｕｔＤ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｐｔｓＧまたはｐｔｓＨ遺伝子またはＳｐｏＴ、ＲｅｌＡ、ＦｒｕＲ、ＡｃｋＡ、ＥｕｔＤ、Ｐｔａ、ＰｏｘＢ、ＰｔｓＧまたはＰｔｓＨタンパク質の発現は、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸置換、欠失、挿入または付加の作成などの当分野で知られるあらゆる手段により低減され得る。本発明のある実施態様において、宿主細胞は、ｓｐｏＴ欠失(ΔｓｐｏＴ)、ｒｅｌＡ欠失(ΔｒｅｌＡ)、ｆｒｕＲ欠失(ΔｆｒｕＲ)、ａｃｋＡ欠失(ΔａｃｋＡ)、ｅｕｔＤ欠失(ΔｅｕｔＤ)、ｐｔａ欠失(Δｐｔａ)、ｐｏｘＢ欠失(ΔｐｏｘＢ)。ｐｔｓＧ欠失(ΔｐｔｓＧ)またはｐｔｓＨ欠失(ΔｐｔｓＨ)を含む。本発明のある実施態様において、宿主細胞は、ｒｅｌＡの欠失(ΔｒｅｌＡ)を含む。本発明のある実施態様において、宿主細胞は、対照と比較して、ｚｗｆ、ｒｐｉＡ、ｍｇｌＢＡＣまたはｇａｌＰの１以上の発現増加を含む。例えば、ｚｗｆ、ｒｐｉＡ、ｍｇｌＢＡＣおよびｇａｌＰ遺伝子またはＺｗｆ、ＲｐｉＡ、ＭｇｌＢＡＣおよびＧａｌＰタンパク質の１以上の発現は、１以上のプラスミド上への１コピー以上の発現および／または染色体への１以上の遺伝子の１コピー以上の組み込みによる、ｚｗｆ、ｒｐｉＡ、ｍｇｌＢＡＣおよびｇａｌＰ遺伝子の１以上のコピー数増加などの、当分野で知られるあらゆる手段により増加させ得る。

【0119】

ｐＤＮＡ産生改善のための窒素輸送および同化は、アンモニア輸送体(ａｍｔ)、グルタミンシンターゼ(ｇｌｎＡ)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(ｇｄｈＡ)およびグルタミン酸シンターゼ(ｇｌｔＤＢ)の発現により影響され得る。本発明のある実施態様において、宿主細胞は、対照と比較してａｍｔ、ｇｌｎＡ、ｇｄｈＡおよび／またはｇｌｔＤＢの発現増加を含む。例えば、ａｍｔ、ｇｌｎＡ、ｇｄｈＡおよびｇｌｔＤＢ遺伝子またはＡｍｔ、ＧｌｎＡ、ＧｄｈＡおよびＧｌｔＤＢタンパク質の１以上の発現は、１以上のプラスミド上への１コピー以上の発現および／または染色体への遺伝子の１以上の１コピー以上の組み込みによる、ａｍｔ、ｇｌｎＡ、ｇｄｈＡおよびｇｌｔＤＢ遺伝子の１以上のコピー数増加など、当分野で知られるあらゆる手段により増加させ得る。

【0120】

ＰＤＮＡ産生のためのＮＡＤＰ＋プール増加のためのＮＡＤＰＨ再生または大腸菌ＮＡＤキナーゼ(ｎａｄＫ)共発現は、天然大腸菌ｇａｐＡ遺伝子を、バチルス種(例えば、枯草菌またはバチルス・アミロリケファシエンス)からのｇａｐＢに置換することによりおよび／または枯草菌からのＮＡＤＨ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素の過発現により、影響され得る。本発明のある実施態様において、宿主細胞は、天然大腸菌ｇａｐＡ遺伝子の代わりにバチルス種(例えば、枯草菌またはバチルス・アミロリケファシエンス)からのｇａｐＢ遺伝子を含む。本発明のある実施態様において、宿主細胞は、対照と比較して枯草菌からのＮＡＤＨ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素の発現増加を含む。例えば、枯草菌からのＮＡＤＨ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子またはタンパク質の発現は、１以上のプラスミド上への１コピー以上の発現および／または染色体への遺伝子の１コピー以上の組み込みによる枯草菌からのＮＡＤＨ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数増加などの、当分野で知られるあらゆる手段により増加させ得る。

【0121】

当業者に知られるｐＤＮＡの産生を増加するための本発明の宿主細胞の他の非限定的修飾も意図される。

【0122】

ある実施態様において、本発明に関連する宿主細胞は、少なくとも２００mg／Ｌ、２０５mg／Ｌ、２１０mg／Ｌ、２１５mg／Ｌ、２２０mg／Ｌ、２２５mg／Ｌ、２３０mg／Ｌ、２３５mg／Ｌ、２４０mg／Ｌ、２４５mg／Ｌ、２５０mg／Ｌ、２５５mg／Ｌ、２６０mg／Ｌ、２６５mg／Ｌ、２７０mg／Ｌ、２７５mg／Ｌ、２８０mg／Ｌ、２８１mg／Ｌ、２８２mg／Ｌ、２８３mg／Ｌ、２８４mg／Ｌ、２８５mg／Ｌ、２８６mg／Ｌ、２８７mg／Ｌ、２８８mg／Ｌ、２８９mg／Ｌ、２９０mg／Ｌ、２９１mg／Ｌ、２９２mg／Ｌ、２９３mg／Ｌ、２９４mg／Ｌ、２９５mg／Ｌ、２９６mg／Ｌ、２９７mg／Ｌ、２９８mg／Ｌ、２９９mg／Ｌ、３００mg／Ｌ、３０５mg／Ｌ、３１０mg／Ｌ、３１５mg／Ｌ、３２０mg／Ｌ、３２５mg／Ｌ、３３０mg／Ｌ、３３５mg／Ｌ、３４０mg／Ｌ、３４５mg／Ｌ、３５０mg／Ｌまたは３５０mg／Ｌを超えるｐＤＮＡ(間に入る全数値を含む)を産生する。

【0123】

本明細書に記載する宿主細胞は、記載する遺伝子の何れかの内因性コピーを含んでも、含んでいなくてもよい。宿主細胞は、ヒスチジンオペロンの内因性コピーを含み得る。ある実施態様において、ヒスチジンオペロンの内因性コピーは変異または欠失される。

【0124】

ヒスチジン産生
本明細書に記載する核酸、タンパク質、宿主細胞および方法の何れもヒスチジンおよびヒスチジン前駆体の産生に使用され得る。一般に、用語「産生」は、例えば、特定の基質または反応物からの１以上の生成物(例えば、目的の生成物および／または副生成物／オフプロダクト)の産生をいうために使用される。産生量は、当業者に周知の計量を使用する、最終生成物または中間生成物などの経路の１以上の工程のいずれかで評価し得る。例えば、産生量は、単一酵素反応について評価され得る(例えば、ＨｉｓＧにより触媒されるヒスチジン生合成経路の第一工程)。それとは別にまたはそれに加えて、産生量は、一連の酵素反応について評価され得る(例えば、図２Ａおよび／または図２Ｂに示すヒスチジン生合成経路)。産生は、当分野で知られるあらゆる計量により、例えば、１以上の生成物(例えば、目的の生成物および／または副生成物／目的外生成物)の容積測定生産性、酵素速度論／反応速度、特異的生産性、バイオマス特異的生産性、力価、収量および総力価の評価により、評価できる。

【0125】

ある実施態様において、産生を測定するための計量は、連続的過程がモニターされるか
または特定の最終生成物が測定されるかに依存し得る。例えば、ある実施態様において、連続的過程による産生モニターに使用する計量は、容積測定生産性、酵素速度論および反応速度を含み得る。ある実施態様において、特定の生成物の産生モニターに使用する計量は、１以上の生成物(例えば、目的の生成物および／または副生成物／目的外生成物)の特異的生産性、バイオマス特異的生産性、力価、収量および総力価を含み得る。用語「容積測定生産性」または「産生速度」は、時間単位あたりに溶媒体積当たりに形成された生成物の量をいう。容積測定生産性は、時間あたりリットルあたりグラム(ｇ／Ｌ／ｈ)で報告され得る。

【0126】

生成物の「特異的生産性」なる用語は、単位体積または質量またはバイオマスにより正規化した生成物の形成速度をいい、単位質量または体積あたり単位時間あたり物質の量の物理的デイメンションを有する[Ｍ・Ｔ^－１・Ｍ^－１またはＭ・Ｔ^－１・Ｌ^－３、ここでＭは質量またはモルであり、Ｔは時間であり、Ｌは長さである]。

【0127】

用語「バイオマス特異的生産性」は、時間あたり細胞乾燥重量(ＣＤＷ)のグラムあたりの生成物のグラム(ｇ／ｇ ＣＤＷ／ｈ)または時間あたり細胞乾燥重量(ＣＤＷ)のグラムあたり生成物のmmol(mmol／ｇ ＣＤＷ／ｈ)での特定の生産性をいう。ある微生物についてＯＤ６００に対するＣＤＷの相関を使用することにより、特異的生産性はまた時間あたり６００nmでの培養液の光学密度(ＯＤ)あたり培養培地リットルあたりの生成物のグラム(ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ)としても表し得る。また、バイオマスの要素的組成が知られているならば、バイオマス特異的生産性は、時間あたりバイオマスのＣ－mol(炭素モル)あたり生成物のmmol(mmol／Ｃ－mol／ｈ)としても表され得る。

【0128】

用語「収量」は、ある基質の単位重量あたり得られた生成物の量をいい、ｇ基質あたりｇ生成物(ｇ／ｇ)または基質モルあたりの生成物のモル(mol／mol)として表わされ得る。収量はまた理論的収量のパーセンテージとしても表され得る。「理論的収量」は、生成物の産生に使用される代謝経路の化学量論により導かれるある量の基質あたり産生され得る最大量の生成物として定義され、ｇ基質あたりｇ生成物(ｇ／ｇ)または基質モルあたりの生成物のモル(mol／mol)として表わされ得る。

【0129】

用語「力価」は、溶液の強度または溶液中の物質の濃度をいう。例えば、発酵ブロス中の目的の生成物(例えば、小分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど)の力価は、発酵ブロスまたは無細胞ブロスリットルあたり溶液中の目的の生成物のｇ(ｇ／Ｌ)または発酵ブロスまたは無細胞ブロスkgあたり溶液中の目的の生成物のｇ(ｇ／Kg)として記載される。

【0130】

用語「総力価」は、過程の初期体積または過程の操作体積に対する、溶液中の目的の生成物、妥当ならばガス相中の目的の生成物および過程から除去されかつ回収された何れかの目的の生成物を含むが、これらに限定されない、過程において産生された全目的の生成物の合計をいう。例えば、発酵ブロス中の目的の生成物(例えば、小分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど)の総力価は、発酵ブロスまたは無細胞ブロスリットルあたり溶液中の目的の生成物のｇ(ｇ／Ｌ)または発酵ブロスまたは無細胞ブロスkgあたり溶液中の目的の生成物のｇ(ｇ／Kg)として記載される。

【0131】

ある実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ｇ／Ｌのヒスチジンの力価を産生し得る。ある実施態様において、本明細書に記載する宿主細胞は、ヒスチジンの産生について少なくとも０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.１、１.２、１.３、１.４または１.５ｇ／Ｌ／ｈの産生速度を示す。ある実施態様において、力価は約４０ｇ／Ｌである。ある実施態様において、産生速度は約１.０９ｇ／Ｌ／ｈである。ある実施態様において、宿主細胞は、対照宿主細胞と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍または１００倍多くヒスチジンを産生できる。ある実施態様において、対照宿主細胞は、１以上のヒスチジン生合成遺伝子を異種性に発現しない細胞である。ある実施態様において、対照宿主細胞は、野生型大腸菌細胞などの野生型細胞である。ある実施態様において、対照宿主細胞は、試験細胞と同じヒスチジン生合成遺伝子を含むが、ヒスチジン生合成遺伝子の１以上の発現を制御する異なる制御配列を含む。ある実施態様において、対照宿主細胞は、ヒスチジンオペロンを、その内因性プロモーターおよび／またはＲＢＳの制御下に発現する。

【0132】

バリアント
本発明の態様は、ポリペプチドをコードする核酸を含む核酸に関する。本明細書に記載する核酸およびポリペプチドのバリアントも、本発明により包含される。バリアントは、対照配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を共有し得る(間に入る全数値を含む)。

【0133】

特に断らない限り、用語「配列同一性」は、当分野で知られるとおり、配列比較(アラインメント)により決定した、２個のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の相関をいう。ある実施態様において、配列同一性は、対照配列などの配列の完全長にわたり決定され、一方他の実施態様において、配列同一性は、配列の領域にわたり決定される。ある実施態様において、配列同一性を、配列の領域(例えば、アミノ酸または核酸の区間、例えば、活性部位にわたる配列)にわたり決定する。例えば、ある実施態様において、配列同一性を、対照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％に対応する領域または１００％にわたり決定する。

【0134】

同一性は、特定の数学的モデル、アルゴリズムまたはコンピュータープログラムにより対処される、ギャップアラインメント(あるならば)を有する２以上の配列の小さいほうの同一マッチのパーセントを測定する。

【0135】

関連ポリペプチドまたは核酸配列の同一性は、当業者に知られる方法の何れかにより容易に計算され得る。２個の配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)のパーセント同一性は、例えば、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993におけるように改変された、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して、決定され得る。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴ^{(登録商標)}およびＸＢＬＡＳＴ^{(登録商標)}プログラム(version 2.0)に組み込まれている。ＢＬＡＳＴ^{(登録商標)}タンパク質サーチを、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、ワード長＝３を使用して実施し、本明細書に記載されるタンパク質に相同であるアミノ酸配列を得ることができる。２個の配列間にギャップが存在するとき、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ^{(登録商標)}を、例えば、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載のとおり利用できる。ＢＬＡＳＴ^{(登録商標)}およびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ^{(登録商標)}プログラムを使用するとき、各プログラムのデフォルトパラメータ(例えば、ＸＢＬＡＳＴ^{(登録商標)}およびＮＢＬＡＳＴ^{(登録商標)})を使用できまたはパラメータを、当業者により理解されるとおり適当に調節できる。

【0136】

私用され得る他の局所アラインメント技術は、例えば、Smith-Watermanアルゴリズム(Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) “Identification of common molecular subsequences.” J. Mol. Biol. 147:195-197)に基づく。使用し得る一般的包括的アラインメント技術は、例えば、動的プログラミングに基づく、Needleman-Wunschアルゴリズム((Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) “A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.” J. Mol. Biol. 48:443-453)である。

【0137】

さらに最近、Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm(ＦＯＧＳＡＡ)が開発され、これは、Needleman-Wunschアルゴリズムを含む他の最適包括的アラインメント方法より速く核酸およびアミノ酸配列の包括的アラインメントを作成すると言われる。ある実施態様において、２個のポリペプチドの同一性を、２個のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸数を計算し、アミノ酸配列の一方の長さで除すことにより計算する。ある実施態様において、２個の核酸の同一性を、２個のヌクレオチド配列を整列させ、同一ヌクレオチドを計算し、核酸の一方の長さで除すことにより計算する。

【0138】

複数配列アラインメントについて、Clustal Omega (Sievers et al., Mol Syst Biol. 2011 Oct 11;7:539)を含むコンピュータープログラムが使用され得る。

【0139】

好ましい実施態様において、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993におけるように改変された、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して配列同一性を決定したとき、本明細書に開示するおよび／または特許請求の範囲に引用する配列などの対照配列に対して特定のパーセント同一性を有することが判明する(例えば、ＢＬＡＳＴ^{(登録商標)}、ＮＢＬＡＳＴ(登録商標)、ＸＢＬＡＳＴ(登録商標)またはＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ^{(登録商標)}プログラムで、各プログラムのデフォルトパラメータを使用)。

【0140】

ある実施態様において、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、Smith-Watermanアルゴリズム(Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) “Identification of common molecular subsequences.” J. Mol. Biol. 147:195-197)またはNeedleman-Wunschアルゴリズム((Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) “A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.” J. Mol. Biol. 48:443-453)を使用して、デフォルトパラメータを使用して配列同一性を決定したとき、本明細書に開示するおよび／または特許請求の範囲に引用する配列などの対照配列に対して特定のパーセント同一性を有することが判明する。

【0141】

ある実施態様において、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm(ＦＯＧＳＡＡ)を使用して、デフォルトパラメータを使用して配列同一性を決定したとき、本明細書に開示するおよび／または特許請求の範囲に引用する配列などの対照配列に対して特定のパーセント同一性を有することが判明する。

【0142】

ある実施態様において、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、Clustal Omega (Sievers et al., Mol Syst Biol. 2011 Oct 11;7:539)を使用して、デフォルトパラメータを使用して配列同一性を決定したとき、本明細書に開示するおよび／または特許請求の範囲に引用する配列などの対照配列に対して特定のパーセント同一性を有することが判明する。

【0143】

配列「Ｘ」における本明細書で使用する残基(例えば核酸残基またはアミノ酸残基)は、配列「Ｘ」における残基が、配列「Ｙ」における「ｎ」の対応部分位置であり、配列ＸおよびＹを当分野で知られるアミノ酸配列アラインメントツールを使用してアラインしたとき、異なる配列「Ｙ」における位置または残基(例えば核酸残基またはアミノ酸残基)「ｎ」に対応するという。

【0144】

バリアント配列は相同配列であり得る。本明細書で使用する相同配列は、あるパーセント同一性(例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のパーセント同一性(間に入る全数値を含む)を共有する配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)である。相同配列は、パラロガス配列、オーソロガス配列または収斂進化に起因する配列を含むが、これらに限定されない。パラロガス配列は、ある種のゲノム内の遺伝子複製に起因し、一方オーソロガス配列は、種形成事象後分岐する。２個の異なる種は、独立して進化し得るが、各々収斂進化の結果として他の種の配列とあるパーセント同一性を共有する配列を含み得る。

【0145】

ある実施態様において、ポリペプチドバリアントは、対照ポリペプチドと二次構造(例えば、アルファらせん、ベータシート)を共有するドメインを有する。ある実施態様において、ポリペプチドバリアントは、対照ポリペプチドと三次構造を共有する。非限定的例として、ポリペプチドバリアントは、対照ポリペプチドと比較して、一次配列同一性は低いが(例えば、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満配列同一性)、対照ポリペプチドと１以上の二次構造(例えば、ループ、アルファらせんまたはベータシートを含むが、これらに限定されない)を共有するかまたは同じ三次構造を有することがある。例えば、ループは、ベータシートとアルファらせんの間、２個のアルファらせんの間または２個のベータシートの間に位置し得る。相同性モデリングを使用して、２以上の三次構造を比較し得る。

【0146】

酵素の機能的バリアントは、本発明により包含される。例えば、機能的バリアントは、同じ基質の１以上に結合するまたは同じ生成物の１以上を形成することができる。機能的バリアントは、当分野で知られる何れかの方法を使用して、同定され得る。例えば、上記Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して、既知機能を有する相同タンパク質を同定し得る。

【0147】

推定機能的バリアントも、機能的に注釈が付けられたドメインを有するポリペプチドのサーチによっても同定され得る。Ｐｆａｍ(Sonnhammer et al., Proteins. 1997 Jul;28(3):405-20)を含むデータベースを使用して、特定のドメインを有するポリペプチドを同定し得る。

【0148】

相同性モデリングも、機能に影響することなく変異させやすいアミノ酸残基の同定に使用され得る。このような方法の非限定的例は、位置特異的スコアリングマトリクス(ＰＳＳＭ)およびエネルギー最小化プロトコールの使用を含む。位置特異的スコアリングマトリクス(ＰＳＳＭ)は、コンセンサス配列(例えば、モチーフ)の同定のために位置加重マトリクスを使用する。ＰＳＳＭは核酸またはアミノ酸配列で実施できる。配列は整列され、方法は、特定の位置での特定の残基(例えば、アミノ酸またはヌクレオチド)の観察頻度および分析する配列の数を考慮する。例えば、Stormo et al., Nucleic Acids Res. 1982 May 11;10(9):2997-3011参照。ある位置で特定の残基を観察する可能性を計算できる。特定の理論に拘束されないが、配列における高可変性の位置は、機能的ホモログを産生するために変異させやすい(例えば、ＰＳＳＭスコア≧０)。

【0149】

ＰＳＳＭを、野生型と単一点変異体の間の差異を決定するロゼッタエネルギー関数の関数と対合させ得る。ロゼッタエネルギー関数は、この差異を(ΔΔＧ_ｃａｌｃ)として計算する。ロゼッタ関数を用いて、変異残基と周辺原子間の結合相互作用を使用して、変異がタンパク質安定性を増加または減少させるかを決定する。例えば、ＰＳＳＭスコアにより好ましいと指定された変異(例えばＰＳＳＭスコア≧０)を、次いで、ロゼッタエネルギー関数を使用して分析して、タンパク質安定性に対する変異の影響の可能性を決定し得る。特定の理論に拘束されないが、安定化する可能性のある変異は、タンパク質工学(例えば、機能的ホモログの産生)で望ましい。ある実施態様において、安定化する可能性のある変異は、－０.１未満(例えば、－０.２未満、－０.３未満、－０.３５未満、－０.４未満、－０.４５未満、－０.５未満、－０.５５未満、－０.６未満、－０.６５未満、－０.７未満、－０.７５未満、－０.８未満、－０.８５未満、－０.９未満、－０.９５未満または－１.０未満)ロゼッタエネルギー単位(Ｒ.ｅ.ｕ.)のΔΔＧ_ｃａｌｃ値を有する。例えば、Goldenzweig et al., Mol Cell. 2016 Jul 21;63(2):337-346. Doi: 10.1016/j.molcel.2016.06.012参照。

【0150】

ある実施態様において、コード配列は、対照コード配列と比較して、１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、１０箇所、１１箇所、１２箇所、１３箇所、１４箇所、１５箇所、１６箇所、１７箇所、１８箇所、１９箇所、２０箇所、２１箇所、２２箇所、２３箇所、２４箇所、２５箇所、２６箇所、２７箇所、２８箇所、２９箇所、３０箇所、３１箇所、３２箇所、３３箇所、３４箇所、３５箇所、３６箇所、３７箇所、３８箇所、３９箇所、４０箇所、４１箇所、４２箇所、４３箇所、４４箇所、４５箇所、４６箇所、４７箇所、４８箇所、４９箇所、５０箇所、５１箇所、５２箇所、５３箇所、５４箇所、５５箇所、５６箇所、５７箇所、５８箇所、５９箇所、６０箇所、６１箇所、６２箇所、６３箇所、６４箇所、６５箇所、６６箇所、６７箇所、６８箇所、６９箇所、７０箇所、７１箇所、７２箇所、７３箇所、７４箇所、７５箇所、７６箇所、７７箇所、７８箇所、７９箇所、８０箇所、８１箇所、８２箇所、８３箇所、８４箇所、８５箇所、８６箇所、８７箇所、８８箇所、８９箇所、９０箇所、９１箇所、９２箇所、９３箇所、９４箇所、９５箇所、９６箇所、９７箇所、９８箇所、９９箇所、１００箇所または１００箇所を超える変異を含む。ある実施態様において、コード配列は、対照コード配列と比較して、コード配列の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個またはそれ以上のコドンに変異を含む。当業者により理解されるとおり、コドン内の変異は、遺伝子コードの縮重により、該コドンによりコードされるアミノ酸を変えるかもしれないし、変えないかもしれない。ある実施態様において、コード配列における１以上の変異は、対照ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、コード配列のアミノ酸配列を変えない。

【0151】

ある実施態様において、コード配列における１以上の変異は、対照ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、対応するポリペプチドのアミノ酸配列を変える。ある実施態様において、１以上の変異は、対照ポリペプチドのアミノ酸配列と比較してポリペプチドのアミノ酸配列を変え、対照ポリペプチドと比較してポリペプチドの活性を変える(増強または低減)。

【0152】

本明細書に記載するポリペプチド(例えば、ＨｉｓＧ、ＨｉｓＤ、ＨｉｓＣ、ＨｉｓＢ、ＨｉｓＨ、ＨｉｓＡ、ＨｉｓＦおよびＨｉｓＩまたはＲＰＰＫ)の何れかの活性(例えば、比活性)を、日常的方法を使用して、測定できる。非限定的例として、ポリペプチドの活性を、その基質特異性、産生される生成物、産生される生成物の濃度またはそれらのあらゆる組み合わせの測定により決定し得る。本明細書で使用する組み換えポリペプチドの「比活性」は、単位時間あたりある量(例えば、濃度)の組み換えポリペプチドで産生される特定の生成物の量(例えば、濃度)をいう。

【0153】

当業者はまたポリペプチドコード配列における変異が、前記ポリペプチドの機能的に等しいバリアント、例えば、ポリペプチドの活性を保持するバリアントを提供する保存的アミノ酸置換をもたらし得ることを認識する。保存的置換は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対的電荷またはサイズ特性または機能的活性を変えない。

【0154】

いくつかの例において、アミノ酸はそのＲ基により特徴づけられる(例えば、表１参照)。例えば、アミノ酸は、非極性脂肪Ｒ基、正荷電Ｒ基、負荷電Ｒ基、非極性芳香Ｒ基または極性非荷電Ｒ基を含み得る。非極性脂肪Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンを含む。正荷電Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンを含む。負荷電Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。非極性、芳香Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを含む。極性非荷電Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、セリン、スレオニン、システイン、プロリン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。

【0155】

ポリペプチドの機能的に等しいバリアントの非限定的例は、本明細書に開示するタンパク質のアミノ酸配列に保存的アミノ酸置換を含み得る。本明細書で使用する「保存的置換」は「保存的アミノ酸置換」と相互交換可能に使用され、表１に提供するアミノ酸置換のいずれかをいう。

【0156】

ある実施態様において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個または２０個を超える残基を、バリアントポリペプチドを製造するとき変更し得る。ある実施態様において、アミノ酸は、保存的アミノ酸置換により置き換えられる。

【0157】

【表1】

【0158】

所望の性質および／または活性を有するポリペプチドバリアントを産生するためのポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、ポリペプチドのコード配列の変更によりなし得る。同様に、ポリペプチドの機能的に等しいバリアントを産生するためのポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、概して組み換えポリペプチドのコード配列の改変によりなされる。

【0159】

変異は、当業者に知られる多様な方法により、ヌクレオチド配列でなし得る。例えば、変異は、ＰＣＲ指向変異、Kunkel(Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985)の方法に従う部位特異的変異誘発、ポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成、遺伝子編集アプローチまたはタグ(例えば、ＨＩＳタグまたはＧＦＰタグ)挿入などの挿入によりなし得る。変異は、当分野で知られる何れかの方法により産生される、例えば、置換、欠失、挿入、付加、選択的編集、短縮化および転座を含み得る。非限定的例として、遺伝子は、遺伝子交換(例えば、選択マーカーを含むマーカーとの)を介して欠失させ得る。遺伝子は、トランスポゾン系の使用を介して切断もし得る(例えば、Poussu et al., Nucleic Acids Res. 2005; 33(12): e104参照)。遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲベースのテクノロジーなど当分野で知られる遺伝子編集テクノロジーの使用により編集もされ得る。変異を作成する方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, 2010などの参考書に見られ得る。

【0160】

ある実施態様において、バリアントを産生する方法は、円順列置換を含む(Yu and Lutz, Trends Biotechnol. 2011 Jan;29(1):18-25)。円順列置換において、ポリペプチドの線形一次配列を円形化し(例えば、配列のＮ末端およびＣ末端結合により)、ポリペプチドを異なる位置で機能させ得る(「破壊」)。故に、新規ポリペプチドの線形一次配列は、線形配列アラインメント方法(例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａまたはＢＬＡＳＴ)で決定したより低い配列同一性(例えば、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満(間に入る全数値を含む)を有する。しかしながら、２個のタンパク質の形態的分析は、２個のポリペプチドの三次構造が類似するまたは類似しないことを確認し得る。特定の理論に拘束されないが、対照ポリペプチドの円順列置換を介して作製され、対照ポリペプチドと類似する三次構造を有するバリアントポリペプチドは、類似する機能的特性(例えば、酵素活性、酵素速度論、基質特異性または生成物特異性)を共有し得る。いくつかの例において、円順列置換は二次構造、三次構造または四次構造を変え、異なる機能的特性(例えば、増加または減少した酵素活性、異なる基質特異性または異なる生成物特異性)の酵素を産生し得る。例えば、Yu and Lutz, Trends Biotechnol. 2011 Jan;29(1):18-25参照。

【0161】

円順列置換に付されたタンパク質において、タンパク質の線形アミノ酸配列は、円順列置換に付されていない対照タンパク質と異なることは、認められるべきである。しかしながら、当業者は、円順列置換に付されたタンパク質におけるどの残基が、順列置換に付されていない対照タンパク質のある残基に対応するかを、例えば、配列を整列させ、保存的モチーフを検出することによりおよび／または例えば、相同性モデリングにより、タンパク質の構造または予測構造を比較することにより、容易に決定できる。

【0162】

ある実施態様において、目的の配列および本明細書に記載する対照配列の間のパーセント同一性を決定するアルゴリズムは、配列間の円順列置換の存在を説明する。円順列置換の存在は、例えば、ＲＡＳＰＯＤＯＭ(Weiner et al., Bioinformatics. 2005 Apr 1;21(7):932-7)を含む、当分野で知られる何れかの方法を使用して決定し得る。ある実施態様において、円順列置換の存在は、目的の配列および本明細書に記載する配列の間のパーセント同一性の計算前に補正される(例えば、少なくとも１配列におけるドメインが再配置される)。本出願の特許請求の範囲は、対照配列に対するパーセント同一性が、配列の円順列置換の可能性を考慮した後に計算された配列を包含すると解釈されるべきである。

【0163】

宿主細胞
開示されるヒスチジン生合成方法および宿主細胞は、大腸菌を用いて例示しているが、当業者により理解されるとおり、他の宿主細胞にも応用可能である。プリン経路代謝生成物およびｐＤＮＡの開示される生合成方法も、当業者により理解されるとおり、広範な宿主細胞に適用可能である。

【0164】

適当な宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む動物細胞を含むが、これらに限定されない。

【0165】

ある実施態様において、宿主細胞は、原核生物細胞である。適当な原核生物細胞は、グラム陽性、グラム陰性およびグラム不定性細菌細胞を含む。ある非限定的実施態様において、宿主細胞は、アグロバクテリウム属、アリサイクロバチルス属、アナベナ属、アナシスティス属、アシネトバクター属、アシドサーマス属、アルスロバクター属、アゾトバクター属、バシラス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ブチリビブリオ属、ブクネラ属、カンペストリス属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、クロマチウム属、コプロコッカス属、エシェリキア属、エンテロコッカス属、エンテロバクター属、エルウィニア属、フソバクテリウム属、フィーカリバクテリウム属、フランシセラ属、フラボバクテリウム属、ジオバシラス属、ヘモフィルス属、ヘリコバクター属、クレブシエラ属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、イリオバクター属、マイクロコッカス属、マイクロバクテリウム属、メソリゾビウム属、メチロバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ナイセリア属、パントエア属、シュードモナス属、プロクロロコッカス属、ロドバクター属、ロドシュードモナス属、ロセブリア属、ロドスピリルム属、ロドコッカス属、セネデスムス属、ストレプトマイセス属、ストレプトコッカス属、シネコッカス属、サッカロモノスポラ属、サッカロポリスポラ属、スタフィロコッカス属、セラチア属、サルモネラ属、シゲラ属、サーモアナエロバクター属、トロフェリマ属、ツラレンシス属、テメキュラ属、サーモシネココッカス属、サーモコッカス属、ウレアプラズマ属、キサントモナス属、キシレラ属、エルシニア属およびザイモモナス属の種である。ある実施態様において、宿主細胞は、コリネバクテリウム・グルタミクム細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、セラチア・マルセセンス細胞である。

【0166】

ある実施態様において、細菌宿主株は、工業用株である。多数の細菌工業用株が知られ、本明細書に記載する方法および組成物に適する。

【0167】

ある実施態様において、細菌宿主細胞は、アグロバクテリウム種(例えば、アグロバクテリウム・ラジオバクター、アグロバクテリウム・リゾゲネス、アグロバクテリウム・ルビ)、アルスロバクター種(例えば、アルスロバクター・オーレセンス、アルスロバクター・シトレウス、アルスロバクター・グロビフォルミス、アルスロバクター・ヒドロカーボグルタミカス、アルスロバクター・マイソレンシス、アルスロバクター・ニコチアナエ、アルスロバクター・パラフィネウス、アルスロバクター・プロトフォニアエ、アルスロバクター・ロゼオパラフィヌス、アルスロバクター・スルフレウス、アルスロバクター・ウレアファシエンス)またはバチルス種(例えば、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・アントラシス、バチルス・メガテリウム、バチルス・サブチリス、バチルス・レンタス、バチルス・サーキュラルス、バチルス・プミルス、バチルス・ロータス、バチルス・コアグランス、バチルス・ブレビス、バチルス・フィルムス、バチルス・アルカオフィウス、バチルス・リチェニフォルミス、バチルス・クラウジー、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・ハロデュランスおよびバチルス・アミロリクエファシエンス)である。具体的実施態様において、宿主細胞は、バチルス・サブチリス、バチルス・プミルス、バチルス・リチェニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・クラウジー、バチルス・ステアロサーモフィラスおよびバチルス・アミロリクエファシエンスを含むが、これらに限定されない工業用バチルス株である。ある実施態様において、宿主細は、工業用クロストリジウム種(例えば、クロストリジウム・アセトブチリクム、クロストリジウム・テタニＥ８８、クロストリジウム・リツセブレンス、クロストリジウム・サッカロブチリクム、クロストリジウム・ファーフリンジェンス、クロストリジウム・ベイジェリンキー)である。ある実施態様において、宿主細胞は、工業用コリネバクテリウム種(例えば、コリネバクテリウム・グルタミナム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業用エシェリキア種(例えば、大腸菌)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業用エルウィニア種(例えば、エルウィニア・ウレドヴォラ、エルウィニア・カロトヴォラ、エルウィニア・アナナス、エルウィニア・ハービコラ、エルウィニア・パンクタタ、エルウィニア・テレウス)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業用パントエア種(例えば、パントエア・シトレア、パントエア・アグロメランス)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業用シュードモナス種(例えば、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・アエルギノーザ、シュードモナス・メバロニイ)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業用ストレプトコッカス種(例えば、ストレプトコッカス・エキシミレス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ウベリス)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業用ストレプトマイセス種(例えば、ストレプトマイセス・アンボファシエンス、ストレプトマイセス・アクロモゲネス、ストレプトマイセス・アベルミチリス、ストレプトマイセス・コエリコロール、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス、ストレプトマイセス・アウレウス、ストレプトマイセス・フンギシディカス、ストレプトマイセス・グリセウス、ストレプトマイセス・リビダンス)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業用ザイモモナス種(例えば、ザイモモナス・モビリス、ザイモモナス・リポリチカ)である。

【0168】

適当な酵母宿主細胞は、カンジダ、ハンゼヌラ、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ピキア、クリベロマイセスおよびヤロウイアを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、酵母細胞は、大腸菌、ハンゼヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシアエ、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス、サッカロミセス・ジアスタティカス、サッカロミセス・ノルベンシス、サッカロミセス・クルイベリ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コダマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンチアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・ケルクム、ピキア・ピジペリ、ピキア・スティピティス、ピキア・メタノリカ、ピキア・アングスタ、クリベロマイセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンスまたはヤロウイア・リポリチカである。

【0169】

ある実施態様において、酵母株は、工業用倍数体酵母株である。他の真菌細胞の非限定的例は、アスペルギルス種、ペニシリウム種、フサリウム種、リゾプス種、アクレモニウム種、ニューロスポラ種、ソルダリア種、マグナポルテ種、アロマイセス種、ウスチラゴ種、ボツリティス種およびトリコデルマ種から得られる細胞を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、アシュビア・ゴシッピ細胞である。

【0170】

ある実施態様において、宿主細胞は、クラミドモナス(例えば、コナミドリムシ)およびフォルミジウム(フォルミジウム種ＡＴＣＣ２９４０９)などの藻類細胞である。

【0171】

本発明はまた哺乳動物細胞、例えば、ヒト(２９３、ＨｅＬａ、ＷＩ３８、ＰＥＲ.Ｃ６およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞を含む)、マウス(３Ｔ３、ＮＳ０、ＮＳ１、Ｓｐ２／０を含む)、ハムスター(ＣＨＯ、ＢＨＫ)、サル(ＣＯＳ、ＦＲｈＬ、Ｖｅｒｏ)、昆虫細胞、例えばツマジロクサヨトウ(Ｓｆ９およびＳｆ２１を含む)、カイコガ(ＢｍＮを含む)、キャベツルーパー(ＢＴＩ－Ｔｎ－５Ｂ１－４を含む)およびキイロショウジョウバエ(Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２を含む)およびハイブリドーマ細胞株を含む、多様な動物細胞型での使用にも適する。

【0172】

種々の実施態様において、本発明の実施に際して使用し得る株は、原核生物株および真核生物株の両方を含み、American Type Culture Collection(ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH(DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)およびAgricultural Research Service Patent Culture Collection、Northern Regional Research Center(NRRL)などの多数の微生物株保存機関から容易に入手可能である。

【0173】

本明細書で使用する用語「細胞」は、単一細胞または同じ細胞株または株に属する細胞の集団などの細胞の集団をいう。単数での用語「細胞」は、細胞の集団ではなく、単一細胞であることを明示的にいうと解釈されてはならない。宿主細胞は、野生型対応物と比較して、遺伝子修飾を含み得る

【0174】

宿主細胞培養
本明細書に開示する細胞の何れも、核酸との接触および／または組込み前、間および／または後に、あらゆるタイプ(富または最小)およびあらゆる組成の培地で培養され得る。培養条件または培養過程は、当業者により理解されるとおり、日常的実験により最適化され得る。ある実施態様において、選択した培地に、種々の成分を補い得る。ある実施態様において、補足的成分の濃度および量を最適化する。ある実施態様において、培地および成長条件(例えば、ｐＨ、温度など)の他の態様を日常的実験により最適化する。ある実施態様において、培地に１以上の補足的成分を補う頻度および細胞を培養する時間を最適化する。

【0175】

本明細書に記載する細胞の培養を、当分野で知られ、使用される培養容器で実施できる。ある実施態様において、通気反応槽(例えば、撹拌装置付きタンクリアクター)を、細胞の培養に使用する。ある実施態様において、バイオリアクターまたは発酵槽を、細胞の培養に使用する。故に、ある実施態様において、細胞を発酵で使用する。本明細書で使用する用語「バイオリアクター」および「発酵槽」は、相互交換可能に使用され、生存生物、生存生物の一部および／または単離もしくは精製酵素が関与する生物学的、生物化学的および／または化学的反応が行われる、囲いまたは部分的囲いをいう。「大規模バイオリアクター」または「工業規模バイオリアクター」は、商業的または準商業的規模での生成物産生に使用するバイオリアクターである。大規模バイオリアクターは、概して数リットル、数百リットル、数千リットルまたはそれ以上の範囲の体積を有する。

【0176】

バイオリアクターの非限定的例は、撹拌タンク発酵槽、混合デバイス回転により撹拌するバイオリアクター、ケモスタット、デバイス振盪により撹拌するバイオリアクター、エアリフト発酵槽、充填層反応器、固定床反応器、流動床バイオリアクター、波誘発撹拌を用いるバイオリアクター、渦動バイオリアクター、ローラーボトルおよび中空ファイババイオリアクター、ローラー装置(例えばベンチトップ、トラック式および／または自動化種類)、垂直積層プレート、スピナーフラスコ、撹拌またはロッキングフラスコ、振盪多ウェルプレート、ＭＤボトル、Ｔフラスコ、Ｒｏｕｘボトル、多表面組織培養プロパゲータ、修飾発酵槽および被覆ビーズ(例えば、細胞付着を阻止するため血清タンパク質、ニトロセルロースまたはカルボキシメチルセルロースで被覆されたビーズ)を含む。

【0177】

ある実施態様において、バイオリアクターは、宿主細胞が移動している液体および／または気泡と接触する、細胞培養系を含む。ある実施態様において、細胞または細胞培養物を、懸濁液で増殖させる。他の実施態様において、細胞または細胞培養物を固相担体に付着させる。担体系の非限定的例はマイクロ担体(例えば、多孔性でも非多孔性でもよいポリマー球体、マイクロビーズおよびマイクロディスク)、特異的化学基(例えば、３級アミン基)で荷電されている架橋ビーズ(例えば、デキストラン)、非多孔性ポリマー繊維に捕捉された細胞を含む２Ｄマイクロ担体、３Ｄ担体(例えば、担体繊維、中空繊維、多カートリッジリアクターおよび多孔性繊維を含み得る半透膜)、イオン交換能が低減されたマイクロ担体、封入セル、キャピラリーおよび凝集体を含む。ある実施態様において、担体は、デキストラン、ゼラチン、ガラスまたはセルロースなどの材料で作られる。

【0178】

ある実施態様において産業規模過程を、連続的、半連続的または非連続的モードで操作する。操作モードの非限定的例は、バッチ、流加バッチ、拡張バッチ、反復的バッチ、吸引／充填、回転壁、回転フラスコおよび／または灌流モードの操作である。ある実施態様において、バイオリアクターは、基質ストック、例えば炭水化物源の連続的または半連続的補給および／またはバイオリアクターからの生成物の連続的または半連続的分離を可能とする。

【0179】

ある実施態様において、バイオリアクターまたは発酵槽は、反応パラメータを測定および／または調節するための、センサーおよび／または制御系を含む。反応パラメータの非限定的例は、生物学的パラメータ(例えば、成長速度、細胞サイズ、細胞数、細胞密度、細胞型または細胞状態など)、化学パラメータ(例えば、ｐＨ、酸化還元電位、反応基質および／または生成物濃度、酸素濃度およびＣＯ_２濃度などの溶解ガス濃度、栄養素濃度、代謝生成物濃度、オリゴペプチド濃度、アミノ酸濃度、ビタミン濃度、ホルモン濃度、添加物濃度、血清濃度、イオン強度、イオン濃度、相対湿度、モル濃度、浸透圧、他の化学物質濃度、例えば緩衝剤、アジュバントまたは反応副生成物)、物理的／機械的パラメータ(例えば、密度、伝導率、撹拌、圧力および流速の程度、剪断ストレス、剪断速度、粘性、色、濁度、光吸収、混合速度、変換速度ならびに温度、光強度／品質などの熱力学パラメータなど)を含む。本明細書に記載するパラメータを測定するためのセンサーは関係する機械および電気分野の当業者には周知である。本明細書に記載するセンサーからのインプットに基づきバイオリアクターのパラメータを調節する制御系は、バイオリアクター工学の当業者に周知である。

【0180】

ある実施態様において、方法は、バッチ発酵(例えば、振盪フラスコ発酵)を含む。バッチ発酵(例えば、振盪フラスコ発酵)における一般的考察は、酸素およびグルコースのレベルを含む。例えば、バッチ発酵(例えば、振盪フラスコ発酵)は、酸素およびグルコース限定的であり、よって、ある実施態様において、株がよく計画された流加バッチ発酵で実施する能力が少なく見積もられる。

【0181】

ある実施態様において、本発明の細胞は、インビボでヒスチジンまたはヒスチジン前駆体を産生するのに適する。ある実施態様において、細胞はヒスチジンを分泌するのに適する。

【0182】

精製およびさらなる処理
ある実施態様において、本明細書に記載する方法のいずれも、産生された(例えば、バイオリアクターで産生された)ヒスチジンおよび／またはヒスチジン前駆体の単離および／または精製を含み得る。例えば、単離および／または精製は、細胞溶解、遠心分離、抽出、カラムクロマトグラフィー、蒸留、結晶化および凍結乾燥の１以上を含み得る。

【0183】

本明細書に開示する組み換え細胞の何れかまたは本明細書に記載するインビトロ方法の何れかにより産生されたヒスチジンまたはヒスチジン前駆体を、当分野で知られる何れかの方法を使用して、同定および抽出し得る。マススペクトロメトリー(例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ)は、同定方法の非限定的例であり、目的の化合物の抽出に使用し得る。

【0184】

本発明を、限定的と解釈してはならない次の実施例でさらに説明する。本明細書を通して引用する引用文献(参考文献、公開特許、公開特許出願および同時継続特許出願を含む)を、引用により明示的に本明細書に包含させる。本明細書に包含させる引用文献が、本開示において定義した用語と調和しないまたは矛盾する同用語の定義を含むならば、本開示に記載する用語が支配する。本明細書で引用するあらゆる参考文献、論説、刊行物、特許、特許公報および特許出願は、それらが有効な先行技術を構築するまたは当業者の一般的技術常識のいびつを形成することを認めるまたは示唆するものではなく、かつそう解釈されてはならない。

【実施例】

【0185】

本明細書に記載する本発明がより完全に理解され得るように、次に実施例を示す。本明細書に記載する実施例は、本明細書に提供される系および方法の説明を提供するものであり、その範囲に限定されると解釈してはならない。

【0186】

実施例１：大腸菌ヒスチジン産生株の作成
大腸菌ヒスチジン産生株を開発するために、大腸菌ＷＧ１株を、まずＦ－プラスミド(ΔＦ’)および溶原性ラムダ(Δλ)で処置した。次のさらなる修飾を、該株に付した：ｈｉｓオペロン欠失(Δｈｉｓ－オペロン)；ｐｕｒＲ遺伝子欠失(ΔｐｕｒＲ)；および大腸菌ヒスチジンインポーターサブユニット欠失(ΔｈｉｓＪ)。

【0187】

第二の大腸菌ヒスチジン産生株を、大腸菌ＭＧ１６５５株バックグラウンドで産生した。株を、ｈｉｓオペロン欠失(Δｈｉｓ－オペロン)およびｐｕｒＲ遺伝子欠失(ΔｐｕｒＲ)によりさらに修飾した。

【0188】

ヒスチジン産生株からのヒスチジンの産生を増加させることが可能であるか否かを決定するために、複数のプロモーターおよびＲＢＳを、種々の組み合わせで、ｈｉｓオペロン遺伝子(ｈｉｓＧ^{Ｅ２７１Ｋ}ＤＣＢＨＡＦＩ)の発現を駆動する能力について試験した。最初に、２３個の異なるプロモーターおよび３個の異なるＲＢＳを、プラスミド発現構築物を使用して試験した。しかしながら、得られた構築物の毒性のため、計６９個のプラスミド構築物中、３３個しか合成されることができず、得られた形質転換体は、遺伝的に不安定であった。

【0189】

毒性および不安定性の問題が、染色体組込みにより対処できるかを決定するために、４４個のｄｓＤＮＡ組込みカセットを含む染色体修飾を使用して、１０個の異なるプロモーターおよび４個の異なるＲＢＳから選択したプロモーターおよびＲＢＳの複数の異なる組み合わせの制御下、ヒスチジンオペロン遺伝子(ｈｉｓＧ^{Ｅ２７１Ｋ}ＤＣＢＨＡＦＩ)を発現させた。４４個のｄｓＤＮＡ組込みカセットを使用して、表２に示すとおり、３４個の修飾が成功した株が得られた(１７個の修飾ＷＧ１株および１７個の修飾ＭＧ１６５５株)。

【表2】

【0190】

複数の異なる組み合わせのプロモーターおよびＲＢＳの制御下にヒスチジンオペロン遺伝子(ｈｉｓＧ^{Ｅ２７１Ｋ}ＤＣＢＨＡＦＩ)を発現するＷＧ１およびＭＧ１６５５宿主細胞によるヒスチジン産生を試験した。細胞を、振盪フラスコ培地(２０ｇ／Ｌ Ｇｌｃ、３ｇ／Ｌ (ＮＨ_４)_２ＳＯ_４、０.６ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／Ｌ ＹＥ、８０mM ＭＯＰＳ、ｐＨ＝７.４、０.１mg／Ｌ チアミン－ＨＣｌ、０.１ｇ／Ｌアデノシン、微量金属)で増殖させ、１mM ＩＰＴＧで誘導し、２４時間または４８時間に細胞外ヒスチジンを試験した。図３は、種々のプロモーター－ＲＢＳ組み合わせを含むＷＧ１株(図３Ａ)および種々のプロモーター－ＲＢＳ組み合わせを含むＭＧ１６５５株(図３Ｂ)による２４時間および４８時間のヒスチジン産生を示す。ＷＧ１株ｔ３３３１３９およびｔ３３３１４４は、他の１５個の修飾ＷＧ１株および１７個の修飾ＭＧ１６５５株のどれよりも、ヒスチジン産生について実質的により活性であった。

【0191】

従って、合成的に誘導したヒスチジンオペロンの発現に付随する相当な毒性および不安定性にも拘わらず、図３に提供するデータは、特異的プロモーターおよびプロモーター－ＲＢＳ組み合わせが、ヒスチジンオペロンからのヒスチジン産生を増加できることを示す。以前のアプローチとは対照的に、このアプローチは、ヒスチジン産生に影響する多数の個々の遺伝子を操作する必要がなく、ヒスチジン産生を増加させることを可能とする。

【0192】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表3-6】

【表3-7】

【表3-8】

【0193】

実施例２：新規ｐｒｓ変異体の同定
ｐｒｓ変異体のライブラリーを設計および合成するために、ＲＰＰＫのＡＤＰアロステリック結合ループの部位特異的変異誘発を実施した(図４)。残基５２、１１５、１２９、１３０、１３２、１３３、１８２および１９０にアミノ酸置換を有するＲＰＰＫタンパク質をコードする約１００個のｐｒｓ変異体のライブラリーを産生した。約５８個のｐｒｓ変異体を合成し、大腸菌ベースの株に形質転換した。ｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｓ}を陽性対照として使用し、天然ｐｒｓを陰性対照として使用した。

【0194】

プラスミド上にｐｒｓ変異体を発現する宿主細胞によるヒスチジン産生を試験した。細胞を振盪フラスコ培地(２０ｇ／Ｌ Ｇｌｃ、３ｇ／Ｌ (ＮＨ_４)_２ＳＯ_４、２ｇ／Ｌ ＹＥ、６７mM ＭＯＰＳ、ｐＨ＝７.４、０.１mg／Ｌ チアミン－ＨＣｌ)で増殖させ、１mM ＩＰＴＧで誘導し、２４時間で細胞外ヒスチジンを試験した。

【0195】

この分析により、対照と比較してヒスチジン産生が改善した、４個の新規ｐｒｓ変異体の発見に至った：ｐｒｓ^{Ａ１３２Ｃ}、ｐｒｓ^{Ａ１３２Ｑ}、ｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｉ}およびｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｍ}(図５)。これら新規ｐｒｓ変異体の同定は、変異残基が最近公開された結晶構造に基づき、活性部位またはアロステリック部位と関与すると報告されている残基に対応しなかったため、驚きであった。Zhou et al. (2019) BMC Structural Biology 19(1), https://doi.org/10.1186/s12900-019-0100-4。

【0196】

この分析により、ＲＰＰＫの残基Ｄ１１５の変異が、ｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｓ}、ｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｌ}、ｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｍ}およびｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｖ}を含む、対照と比較してヒスチジン産生を改善することも確認された。

【0197】

実施例３：プラスミド発現されたおよび染色体に組み込まれたｐｒｓフィードバック耐性変異体の比較
合成プロモーターおよびＲＢＳ制御下に染色体に組み込まれたフィードバック耐性ｐｒｓ変異(図６で「ｔ３３３１４４＋ｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｓ}(一コピー)」、「ｔ３３３１３９＋ｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｍ}(一コピー)」または「ｔ３３３１３９＋ｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｍ}(二コピー)と称する」)を発現する株を製造した。組み込み株は、一コピーまたは二コピーのｐｒｓ変異を発現した。染色体組込みは、構成的ｐｒｓ発現をもたらした。これら株のヒスチジン産生および成長を対照株(図６で「ｔ３３３１４４＋ｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｓ}(プラスミド、約１５コピー)と称する」)と比較した。対照株は、誘導型ｐｒｓ発現を伴うプロモーターＩＰＴＧの制御下に、約１５プラスミドコピー数／細胞でプラスミド上にｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｓ}変異を発現した。

【0198】

２コピーのｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｍ}変異を有する染色体に組み込まれた株は、プラスミドベースの過発現を有する株と同等レベルの成長およびヒスチジン産生を示した(図６)。染色体に組み込まれたｐｒｓ変異体株を有するヒスチジンの産生は、プラスミドベースの過発現を超えるいくつかの利点をもたらした：１)抗生物質選択の必要性がなくなった；２)構築物は、プラスミド上で発現されるときと比較して、ゲノムに組み込まれたとき安定性が増加した；および３)ｐｒｓは、染色体に統合されたとき、構成的に発現された。

【0199】

実施例４：ＭＴＨＦＤＣの発現が増加した大腸菌ヒスチジン産生株によるヒスチジン産生増強
合成プロモーターの制御下、ＭＴＨＦＤＣ酵素によりコードされる天然大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子の過発現が、高力価のヒスチジンを分泌するよう先に操作された株におけるヒスチジン産生を増大できるかを調査した。

【0200】

複数の合成ＩＰＴＧ誘導性プロモーター(表４)制御下に、約１～５プラスミドコピー数／細胞でプラスミド上に大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子を発現する(図８)宿主細胞によるヒスチジン産生を評価した。細胞を振盪フラスコ培地(２０ｇ／Ｌ Ｇｌｃ、３ｇ／Ｌ (ＮＨ_４)_２ＳＯ_４、０.６ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／Ｌ ＹＥ、８０mM ＭＯＰＳ、ｐＨ＝７.４、０.１mg／Ｌ チアミン－ＨＣｌ、０.１ｇ／Ｌアデノシン、微量金属)で増殖させ、１mM ＩＰＴＧで誘導した。株によるヒスチジン分泌を、０時間～５０時間の間の種々の時点で細胞外ヒスチジン力価(ｇヒスチジン／Ｌ)、速度(ｇヒスチジン／Ｌ・ｈ)および収量(ｇヒスチジン／ｇグルコース)について評価した(図９)。

【0201】

ｆｏｌＤ発現株を、ｆｏｌＤを発現するプラスミドを含まない対照株(表４に「ｔ５８９７９７」として記載され、図９に「対照」として示される)と比較した。比較成長プロファイルおよびヒスチジン分泌計量を、グルコース上の流加バッチ発酵で集めた。対照と比較して、プラスミド上にｆｏｌＤを発現する株は、ヒスチジン力価、速度および収量の増加により証明されるとおり、ヒスチジン産生の増加を示した(表４および図９)。

【0202】

【表4】

【0203】

実施例５：プラスミド発現および染色体に組み込まれたｆｏｌＤの比較
合成プロモーターの制御下にｆｏｌＤ遺伝子が染色体に組み込まれた株を産生した。株７５０３４０は、図１０に示すとおり、染色体に組み込まれたコピーのｆｏｌＤ遺伝子を、プロモーターａｐＦＡＢ４６の制御下に発現し、それは構成的ｆｏｌＤ発現をもたらした。この株はまた内因性コピーのｆｏｌＤ遺伝子を、その天然プロモーターの制御下にも発現する。

【0204】

株７５０３４０のヒスチジン産生および成長を、対照株と比較した(図１０でそれぞれ株「５８９７９７」および「７３１３７４」と称する)。対照株ｔ５８９７９７は、内因性コピーのｆｏｌＤのみ発現した。対照株ｔ７３１３７４は内因性コピーのｆｏｌＤを発現し、またＩＰＴＧを使用して誘導した、誘導型プロモーターの制御下に、約５プラスミドコピー数／細胞でプラスミド上にｆｏｌＤを発現した。染色体に組み込まれた株(株７５０３４０)は、プラスミド上にｆｏｌＤを発現する株(株７３１３７４)と同等レベルの成長およびヒスチジン産生を示した(図１０)。

【0205】

染色体に組み込まれたｆｏｌＤ株でのヒスチジンの産生は、プラスミドベースの過発現を超えるいくつかの利点をもたらした：１)抗生物質選択の必要性がなくなった；２)構築物は、プラスミド上で発現されるときと比較して、ゲノムに組み込まれたとき安定性が増加した；および３)ｆｏｌＤは、染色体に統合されたとき、構成的に発現された。

【0206】

実施例６：ＭＴＨＦＤＣの発現が増加した大腸菌株によるプリン経路代謝生成物の産生増強
合成プロモーターの制御下の、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子の過発現も、ヒスチジン以外の生成物および代謝生成物の産生増加をもたらし得る。このような生成物は、イノシン、グアノシン、キサントシン、アデノシン、ヒポキサンチン、グアニン、キサンチン、アデニン、イノシン一リン酸(ＩＭＰ)、キサントシン一リン酸(ＸＭＰ)、グアノシンリン酸(例えば、ＧＭＰ、ＧＤＰおよびＧＴＰ)およびアデノシンリン酸(例えば、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ｄＡＭＰ、ｄＡＤＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＭＰ、ｄＧＤＰおよびｄＧＴＰ)などのプリン経路代謝生成物を含む。このような生成物はまたＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｔＲＮＡ)およびＤＮＡ(例えば、プラスミドＤＮＡおよび人工非環状ＤＮＡ)などのプリン経路代謝生成物由来のポリマーも含む。ｆｏｌＤの過発現はまた生合成の出発物質としてこれら代謝生成物を利用する生成物も増加させ得る。例えば、ｆｏｌＤの過発現は、ＧＴＰからリボフラビンへの変換増加および／またはフラボノイド補因子フラビンモノヌクレオチド(ＦＭＮ)および／またはフラビンアデニンジヌクレオチド(ＦＡＤ)の産生増加に至り得る。ｆｏｌＤの過発現はまたキサンチンから尿酸への変換増加にも至り得る。

【0207】

上記実施例に記載した合成プロモーターの制御下に１以上の異種コピーのｆｏｌＤ遺伝子を含む枯草菌、バチルス・アミロリケファシエンス、大腸菌、アシュビア・ゴシッピ、セラチア・マルセッセンスおよび／またはコリネバクテリウム・グルタミクム細胞などの宿主細胞を産生する。

【0208】

プラスミド上にまたは細胞のゲノムに組み込まれた大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子を発現する宿主細胞によるヒスチジン以外の生成物および代謝生成物の産生を評価する。例えば、ｆｏｌＤ遺伝子を、プラスミド上に、約１～５プラスミドコピー数／細胞で発現させ得る。ｆｏｌＤ遺伝子を、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターなどの合成プロモーターの制御下に発現させ得る。細胞を、振盪フラスコ培地(例えば、２０ｇ／Ｌ Ｇｌｃ、３ｇ／Ｌ (ＮＨ_４)_２ＳＯ_４、０.６ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／Ｌ ＹＥ、８０mM ＭＯＰＳ、ｐＨ＝７.４、０.１mg／Ｌ チアミン－ＨＣｌ、０.１ｇ／Ｌアデノシン、微量金属)で増殖させ、１mM ＩＰＴＧで誘導し得る。株により産生されたヒスチジン以外の生成物および代謝生成物を、０時間～８０時間の間の種々の時点で細胞外生成物力価(ｇ生成物／Ｌ)、速度(ｇ生成物／Ｌ・ｈ)および収量(ｇ生成物／ｇグルコース)について評価する。株により産生されたリン酸化ヒスチジン以外の生成物および代謝生成物を、マススペクトロメトリーと組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ－ＭＳ)方法により評価し得る。株により産生され得るある生成物(例えば、リボフラビン、ＦＭＮおよびＦＡＤ標的)を、ＵＶ－Ｖｉｓおよび／または蛍光スペクトロメトリーにより評価する。株により産生され得る他の生成物(例えば、ＡＴＰおよびＧＴＰ)を、酵素連動アッセイにより評価し得る。生成物および代謝生成物の産生の評価について当業者に知られる他の方法も意図される。

【0209】

ｆｏｌＤを過発現する株を、ｆｏｌＤを過発現しない対照株と比較し得る。比較成長プロファイルおよび種々の生成物計量を、例えば、グルコース上の流加バッチ発酵で集め得る。対照株と比較して、ｆｏｌＤを過発現する株は、生成物および／または代謝生成物の力価、速度および／または収量の増加により証明されるとおり、ヒスチジン以外の生成物および代謝生成物の産生の増大を示し得る。

【0210】

実施例７：ＭＴＨＦＤＣの発現が増加した大腸菌株によるプラスミドＤＮＡ産生の増大
合成プロモーターの制御下の、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子の過発現は、プラスミドＤＮＡ(ｐＤＮＡ)の産生も増加させ得る。ｐＤＮＡ産生に必要な開始プリン代謝生成物の２種(アデニンおよびグアニン)は、ＭＴＨＦＤＣ酵素をコードする大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子の過発現により増加し得るイノシン一リン酸に由来する。アデニンおよびグアニンなどのプリン代謝生成物の産生も、プリン転写リプレッサーｐｕｒＲ不活性化および／またはｐｕｒＡ、ｐｕｒＢ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＤ、ｐｕｒＥ、ｐｕｒＦ、ｐｕｒＨ、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＴ、ｇｕａＡ、ｇｕａＢおよびａｄｋなどのデノボプリン生合成遺伝子の過発現により増加させ得る。

【0211】

ピリミジン代謝生成物(例えば、オロト酸、シトシンおよびウラシル)のプールの増加も、ｐＤＮＡ生合成のさらなる出発代謝生成物の供給により、ｐＤＮＡ産生を支持し得る。オロト酸、シトシンおよびウラシル産生は、アルギニン応答性転写リプレッサーａｒｇＲ不活性化および／またはｃａｒＡＢ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、ｐｙｒＥ、ｐｙｒＦ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒＨおよびｐｙｒＩなどのデノボピリミジン生合成酵素過発現により、改善し得る。

【0212】

ｐＤＮＡの産生は、プリンおよびピリミジン代謝生成物に至る前駆体代謝生成物の産生増加によりさらに支持され得る。例えば、前駆体代謝生成物ホスホリボシルピロリン酸(ＰＲＰＰ)産生は、大腸菌酵素リボースリン酸ピロホスホキナーゼ(ＲＰＰＫ)をコードする遺伝子ｐｒｓの過発現により改善し得る。ＰＲＰＰ産生は、Ｄ１１５、Ｌ１３０およびＡ１３２の１か所以上にアミノ酸修飾を含むＲＰＰＫバリアントなどのＲＰＰＫのフィードバック耐性バリアントの発現により、さらに増加し得る。ある実施態様において、ＲＰＰＫは、野生型大腸菌ＲＰＰＫ(配列番号２８)に対して、Ｄ１１５Ｓ、Ｌ１３０Ｍ、Ｌ１３０Ｉ、Ａ１３２ＣまたはＡ１３２Ｑに対応する１以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、本発明で同定された新規ｐｒｓ変異体ｐｒｓ^{Ａ１３２Ｃ}、ｐｒｓ^{Ａ１３２Ｑ}、ｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｉ}およびｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｍ}の１以上を発現する。

【0213】

ｐＤＮＡの産生および品質は、炭素取り込みおよび利用またはプラスミド産生および修復に関与する遺伝子の修飾によりさらに改善し得る。このような修飾は、細胞溶解後、プラスミド分解を阻止するための大腸菌エンドヌクレアーゼコード化遺伝子ｅｎｄＡ１の発現減少；ｐＤＮＡの意図しない遺伝子組み換えおよび喪失もしくは分解を阻止するためのｒｅｃＡ発現減少；プラスミド複製機構の十分な存在を確実にするためのＤＮＡポリメラーゼIIIおよびＤｎａＢヘリカーゼの過発現；またはプラスミド増幅速度を改善するための遺伝子ｐｒｉＡの過発現の１以上を含み得る。

【0214】

中心的炭素代謝への遺伝子変化および制御は、緊縮性／飢餓応答を低減し、ｐＤＮＡ収量を改善するためのｓｐｏＴおよびｒｅｌＡ遺伝子の発現減少；中心的炭素代謝への異化制御応答を減少するための遺伝子ｆｒｕＲの発現減少；ヌクレオチド前駆体産生のためのペントースリン酸経路に向けた流動を改善するためのｚｗｆまたはｒｐｉＡ両者の過発現およびｐｇｉ、ｐｙｋＡまたはｐｙｋＦの減弱；またはｐＤＮＡ前駆体代謝生成物への流動再指示のための酢酸産生を減少させるためのａｃｋＡ、ｅｕｔＤ、ｐｔａまたはｐｏｘＢの不活性化を含み得る。

【0215】

炭素輸送のエネルギー効率を増加するまたは細胞の成長速度を減少する遺伝子修飾(例えば、遺伝子ｐｔｓＧまたはｐｔｓＨの不活性化またはｇａｌＰまたはｍｇｌＢＡＣなどのＰＥＰ非依存性糖パーミアーゼ過発現)もｐＤＮＡの収量および生産性を改善し得る。

【0216】

補因子再生酵素(例えば、アンモニア輸送体(ａｍｔ)、グルタミンシンターゼ(ｇｌｎＡ)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(ｇｄｈＡ)およびグルタミン酸シンターゼ(ｇｌｔＤＢ)などの窒素輸送および同化に関与する遺伝子の上方制御もｐＤＮＡ産生および収量を増加させ得る。ｐＤＮＡ収量は、ＮＡＤＰ＋プールを増加さえるためのＮＡＤＰＨ再生または大腸菌ＮＡＤキナーゼ(ｎａｄＫ)共発現を改善するために、天然大腸菌ｇａｐＡ遺伝子をバチルス種(例えば枯草菌またはバチルス・アミロリケファシエンス)からのｇａｐＢで置き換えることにより、さらに改善し得る。枯草菌からのＮＡＤＨ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素の過発現は、ｐＤＮＡ産生および収量改善のための補因子平衡度も改善し得る。

【0217】

ある実施態様において、ｐＤＮＡの産生に使用する株は、大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子を過発現し、ｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｍ}またはｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｓ}を発現し、ΔｒｅｌＡ、ΔｅｎｄＡ、ΔｒｅｃＡおよびΔｐｕｒＲの１以上をさらに含む。

【0218】

ｆｏｌＤ遺伝子の過発現は、合成プロモーター制御下の該遺伝子の発現および／または多コピー染色体組込みを含む染色体組込みを介する１コピー以上のｆｏｌＤ遺伝子の発現および／または多コピープラスミドを含むプラスミド上への１コピー以上の発現を含み得る。

【0219】

ｐｒｓ^{Ｌ１３０Ｍ}またはｐｒｓ^{Ｄ１１５Ｓ}などのフィードバック耐性バリアントの発現を含む遺伝子ｐｒｓの発現は、合成プロモーター制御下の該遺伝子の発現および／または多コピー染色体組込みを含む染色体組込みを介する１コピー以上のｆｏｌＤ遺伝子の発現および／または多コピープラスミドを含むプラスミド上への１コピー以上の発現を含み得る。

【0220】

上記実施例に記載した合成プロモーターの何れかの制御下に１以上の異種コピーのｆｏｌＤ遺伝子を含む枯草菌、バチルス・アミロリケファシエンス、大腸菌、アシュビア・ゴシッピ、セラチア・マルセッセンスおよび／またはコリネバクテリウム・グルタミクム細胞などの宿主細胞が産生される。

【0221】

プラスミド上または細胞のゲノムに組み込まれた大腸菌ｆｏｌＤ遺伝子を発現する宿主細胞によるｐＤＮＡの産生を評価する。例えば、ｆｏｌＤ遺伝子は、プラスミド上で、約１～５プラスミドコピー数／細胞で発現され得る。ｆｏｌＤ遺伝子は、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターなどの合成プロモーターの制御下に発現され得る。細胞を、振盪フラスコ培地(例えば、２０ｇ／Ｌ Ｇｌｃ、３ｇ／Ｌ (ＮＨ_４)_２ＳＯ_４、０.６ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／Ｌ ＹＥ、８０mM ＭＯＰＳ、ｐＨ＝７.４、０.１mg／Ｌ チアミン－ＨＣｌ、０.１ｇ／Ｌアデノシン、微量金属)で増殖させ、１mM ＩＰＴＧで誘導し得る。株により産生されたｐＤＮＡを、ｐＤＮＡ力価(ｇ ｐＤＮＡ／Ｌ)について評価する。株により産生されたｐＤＮＡを、分光測色法(光学密度)、アガロースゲル電気泳動、定量的ＰＣＲ(ｑＰＣＲ)、ＵＶ検出を用いる高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ－ＵＶ)または蛍光ＤＮＡ結合色素の使用により評価し得る。ｐＤＮＡの産生の評価について当業者に知られる他の方法も意図される。

【0222】

ｆｏｌＤを過発現する株を、ｆｏｌＤを過発現しない対照株と比較し得る。比較成長プロファイルおよび種々の生成物計量を、例えば、成長制限炭素源(例えば、グルコース、グリセロール、グルコン酸、スクロースまたは当分野で知られる他の一般的炭素源)を用いる流加バッチ発酵で集め得る。対照株と比較して、ｆｏｌＤを過発現する株は、ｐＤＮＡの力価、速度および／または収量の増加により証明されるとおり、ｐＤＮＡの産生の増加を示し得る。

【0223】

実施例８：流加バッチ発酵での大腸菌プラスミドＤＮＡ産生
プリン前駆体代謝生成物が増加した株を、大腸菌ｐＢＲ３２２由来複製起点を有するｐＤＮＡを高いレベルで産生する能力について試験した。プロモーターａｐＦＡＢ４６制御下に染色体に組み込まれたコピーのｆｏｌＤ遺伝子および内因性コピーのｆｏｌＤ遺伝子をその天然プロモーターの制御下に発現する株ｔ７５０３４０を、フィードバック阻害ＷＴ ｈｉｓＧ(図１１において「８１６３８５」と称する)でのフィードバック耐性ｈｉｓＧアレルを回復させるためにさらに染色体修飾した。この親株を、天然エンドヌクレアーゼ遺伝子ｅｎｄＡ欠失によりプラスミド産生を改善するためにさらに修飾し、株ｔ８２３０１２をもたらした(図１１で「８２３０１２」と称する)。親株は、天然ｒｅｌＡ遺伝子欠失により別に修飾して、株ｔ８２３０１０を得た(図１１で「８２３０１０」と称する)。ｅｎｄＡおよびｒｅｌＡ変異を発現するｐＤＮＡ産生株大腸菌ＤＨ１０ｂも、同一ｐＢＲ３２２プラスミドで形質転換し(図１１で株「８１６３８６」と称する)、ｔ７５０３４０由来の株と比較するため増殖させた。

【0224】

図１１に示すとおり、４個のｐＤＮＡ産生株を、ｐＤＮＡ力価および生産性を評価するため高光学密度まで流加バッチ発酵で増殖させた。株ｔ８１６３８６は、４０時間後２２８mg／Ｌ ｐＤＮＡを産生し、最大生産性６.６mg／Ｌ／ｈに達した。ｈｉｓ－親操作株ｔ８１６３８５は、好成績の初期徴候を示し、わずか２０時間で２１５mg／Ｌ ｐＤＮＡ力価に達したが(生産性１０.７mg／Ｌ／ｈ)、２０時間を超える発酵でｐＤＮＡの消費または分解が観察された。ｅｎｄＡ欠失変異体株ｔ８２３０１２は、親株ｔ８１６３８５に類似するプロファイルを示したが、全体的生産性は低減した。対照的に、ｒｅｌＡ欠失変異体株ｔ８２３０１０は、発酵時間の長い遅れの後、株ｔ８１６３８６よりわずかに高いｐＤＮＡ力価(２８１mg／Ｌ)で終章したにも関わらず、４個の株で最高の特異的生産性を示した。

【0225】

等価物
当業者は、ここに記載する本発明の特定の実施態様の等価物を認識するかまたは日常を超えない実験で確認できる。このような等価物は、添付する特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【0226】

特許文書を含むすべての引用文献を、全体として引用により本明細書に包含させる。

【0227】

本明細書に開示する配列は、分泌シグナルを伴いまたは伴わずに記載され得ることは、認められるべきである。本明細書に開示される配列は、分泌シグナルを伴うまたは伴わないバージョンを包含する。本明細書に開示するタンパク質配列は、開始コドン(Ｍ)を伴いまたは伴わずに記載され得ることも、認められるべきである。本明細書に開示される配列は、開始コドンを伴うまたは伴わないバージョンを包含する。従って、いくつかの例においてアミノ酸ナンバリングは、開始コドンを含むタンパク質配列に対応してよく、一方他の例において、アミノ酸ナンバリングは、開始コドンを含まないタンパク質配列に対応してよい。本明細書に開示する配列は、停止コドンを伴いまたは伴わずに記載され得ることは、理解されるべきである。本明細書に開示する配列は、停止コドンを伴うまたは伴わないバージョンを包含する。本発明の態様は、本明細書に記載する配列およびそのフラグメントの何れかを含む宿主細胞を包含する。

【図1】

【図2A-1】

【図2A-2】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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【国際調査報告】