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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-16
(54)【発明の名称】トマトの葉の光合成を負に調節する遺伝子の用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230209BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20230209BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230209BHJP
A01H 6/82 20180101ALN20230209BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z ZNA
C12N15/09 110
A01H1/00 A
C12N15/113 Z
A01H6/82
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021555846
(86)(22)【出願日】2020-12-30
(85)【翻訳文提出日】2022-09-08
(86)【国際出願番号】 CN2020141385
(87)【国際公開番号】W WO2022062255
(87)【国際公開日】2022-03-31
(31)【優先権主張番号】202011030669.7
(32)【優先日】2020-09-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520465253
【氏名又は名称】浙江師範大学
【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．６８８ Ｙｉｎｇｂｉｎ Ｒｏａｄ， Ｗｕｃｈｅｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｊｉｎｈｕａ， Ｚｅｊｉａｎｇ ３２１００４ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100205936
【弁理士】
【氏名又は名称】崔 海龍
(74)【代理人】
【識別番号】100132805
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 貴之
(72)【発明者】
【氏名】馬 伯軍
(72)【発明者】
【氏名】陳 析豊
(72)【発明者】
【氏名】許 以霊
(72)【発明者】
【氏名】沈 淑容
(72)【発明者】
【氏名】陳 順麗
(72)【発明者】
【氏名】戴 可欣
(72)【発明者】
【氏名】馬 紫程
【テーマコード（参考）】
2B030
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AD20
2B030CA17
2B030CB01
(57)【要約】
本発明は、トマトの葉の光合成を負に調節する遺伝子の使用を開示する。トマト中でＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子をノックアウトすることでトマトの葉の光合成効率を向上でき、遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０のヌクレオチド配列は配列番号１に示される。Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株５２３０－ＫＯの葉におけるクロロフィルａ、クロロフィルｂおよびカロテノイドなどの光合成色素の含有量はいずれも増加し、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株５２３０－ＫＯの葉の純光合成速度、気孔コンダクタンスおよび蒸散作用などの光合成の主な指標はいずれも向上する。
【選択図】図５
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トマトの葉の光合成を負に調節する遺伝子の使用であって、トマト中でＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子をノックアウトすることでトマトの葉の光合成効率を向上させることができ、
前記遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０のヌクレオチド配列は配列番号１に示されることを特徴とする、使用。
【請求項2】
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集されるｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧ－３’を設計し、このｓｇＲＮＡ配列に基づいて、プライマーを人工合成してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体中に構築することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記合成されたプライマーは、上流：５’－ＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧ－３’
下流：５’－ＡＡＡＣＣＴＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＧＡＴＣＡＴＣＡ－３’
であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項4】
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト植物体５２３０－ＫＯを取得することを特徴とする、請求項２または３に記載の使用。
【請求項5】
前記Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト植物体５２３０－ＫＯの葉におけるクロロフィルａ、クロロフィルｂおよびカロテノイドの含有量はいずれも増加し、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト植物体５２３０－ＫＯの葉の純光合成速度、気孔コンダクタンスおよび蒸散作用はいずれも向上することを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項6】
５２３０－ＫＯ植物体におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２に示されることを特徴とする、請求項４または５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、作物分子遺伝学の分野に属し、トマトの葉の光合成効率を向上させる遺伝子およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
光合成は、緑色植物が光エネルギを利用して二酸化炭素と水を有機物に合成して酸素を放出する過程で、植物の乾燥物質の９０％以上が光合成によるもので、作物の収穫量形成の基礎である。地球上で光合成を通じて合成される有機物は年間約２２００億トンであり、地球上で最も重要な化学反応である（張立新ら、２０１６年）。植物による光エネルギの利用がないと、人類社会の生存と持続的な発展は不可能となる。現代分子生物学技術の発展に伴い、光合成の効率を制御するいくつかの新しい遺伝子が迅速に発掘されてきた。例えば、植物ＰＧＲ５とＰＧＲＬ１の２つの遺伝子がコードするタンパク質は瞬間に他の色素タンパク質複合体とスーパータンパク質複合体を形成し、スーパー複合体の内部でエネルギを直接伝達して光エネルギの有効利用を大幅に高めた（Ｍｕｎｅｋａｇｅ ｅｔ ａｌ．２００４；ＤａｌＣｏｒｓｏ ｅｔ ａｌ．２００８）。中国科学院の李振声の研究チームは、強力な光酸化耐性遺伝子を利用して、「小偃８１」などの光合成効率の高い小麦の新品種を選別育成した。Ｌｉら（２０１１）は、稲において葉緑体ロケータタンパク質をコードする新しい遺伝子ＰＨＤ１をクローニングした。この遺伝子は光合成能力を向上させるだけでなく、稲の分けつや千粒重を促進できる。Ｙｕａｎら（２０１８）は、ＳｌＡＲＦ１０がクロロフィルにおいて重要な作用を奏し、この遺伝子を過剰発現することによりトマトの葉と果実の光合成を向上できるとともに、果実における澱粉、果糖、ショ糖の蓄積を増加できることを発見した。Ｚｈａｎｇら（２０１９）は、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼとコリンオキシダーゼをコードする遺伝子をトマトに転換することにより、遺伝子組み換えトマトの光合成および果実の大きさを顕著に向上できることを発見した。以上より、植物の光合成効率の高い新しい遺伝子を十分に発掘し、作物の光エネルギの効率的な利用を促進することは、作物の生産量を増加させる効果的な手段であることが分かる。
【0003】
トマトは栄養が豊富な多果の穂の多いベリーで、適応性が強く、生産量が多く、食感もよく、世界第２位の野菜作物で、消費者に愛されている。葉はトマトの光合成の主要な器官であり、トマトの葉の光合成効率を高めることによって、より良い植物の成長を促進し、果実の収量と品質を高めるため、より高い経済的および社会的利益をもたらすことができる。従って、新しい機能遺伝子を発掘し、遺伝子編集技術を利用して光合成効率の高いトマトの新品種を選んで育成することは比較的速い方法である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、トマトの葉の光合成効率を効果的に向上させ、有機物の合成を促進することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記問題を解決するために、本発明は、トマトの葉の光合成を負に調節する遺伝子の使用を提供する。トマト中でＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子をノックアウトすることでトマトの葉の光合成効率を向上（効果的に向上）させることができる。
上記遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０のヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。
本発明のトマトの葉の光合成を負に調節する遺伝子の使用の改良において、
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集される標的ｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧ－３’を設計し、このｓｇＲＮＡ配列に基づいてプライマーを人工合成してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体中に構築する。
本発明のトマトの葉の光合成を負に調節する遺伝子の使用のさらなる改良において、
上記合成されたプライマーは、
上流：５’－ＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧ－３’
下流：５’－ＡＡＡＣＣＴＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＧＡＴＣＡＴＣＡ－３’
である。
本発明のトマトの葉の光合成を負に調節する遺伝子の使用のさらなる改良において、
遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０がノックアウトされた植物体５２３０－ＫＯを取得する。
上記Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株５２３０－ＫＯの葉におけるクロロフィルａ、クロロフィルｂおよびカロテノイドなどの光合成色素の含有量はいずれも増加（顕著に増加）し、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株５２３０－ＫＯの葉の純光合成速度、気孔コンダクタンスおよび蒸散作用などの光合成の主な指標はいずれも向上（顕著に向上）する。
この５２３０－ＫＯ植物体におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２に示される。
本発明において、トマトの葉光合成を負に調節する遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０は、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列が配列番号１に示される。
上記遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０のヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。
本発明のトマトの葉の光合成を負に調節する遺伝子の使用の改良において、
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集される標的ｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧ－３’を設計し、このｓｇＲＮＡ配列に基づいてプライマーを人工合成してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体中に構築する。
本発明のトマトの葉の光合成を負に調節する遺伝子の使用のさらなる改良において、
上記合成されたプライマーは、
上流：５’－ＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧ－３’
下流：５’－ＡＡＡＣＣＴＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＧＡＴＣＡＴＣＡ－３’
である。
本発明のトマトの葉の光合成を負に調節する遺伝子の使用のさらなる改良において、
遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０がノックアウトされた植物体５２３０－ＫＯを取得する。
上記Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株５２３０－ＫＯの葉におけるクロロフィルａ、クロロフィルｂおよびカロテノイドなどの光合成色素の含有量はいずれも増加（顕著に増加）し、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株５２３０－ＫＯの葉の純光合成速度、気孔コンダクタンスおよび蒸散作用などの光合成の主な指標はいずれも向上（顕著に向上）する。
この５２３０－ＫＯ植物体におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２に示される。
本発明において、トマトの葉光合成を負に調節する遺伝子Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０は、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列が配列番号１に示される。
【0006】
本発明は、トマト中でＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子をノックアウトする方法をさらに提供する。この方法は、以下のステップを含む。
ステップ１）：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術により遺伝子編集の標的ｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧ－３’を設計する。
ステップ２）：ステップ１）で得られた配列に基づいて２本のプライマーを合成し、人工アニーリングした後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体に構築する。
ステップ３）：ステップ２）で得られた担体を野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに形質転換することで、対応する遺伝子組み換え植物体を得る。上記遺伝子組み換えトマト植物体からＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子がノックアウトされた植物体を同定する。
ステップ１）：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術により遺伝子編集の標的ｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧ－３’を設計する。
ステップ２）：ステップ１）で得られた配列に基づいて２本のプライマーを合成し、人工アニーリングした後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体に構築する。
ステップ３）：ステップ２）で得られた担体を野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに形質転換することで、対応する遺伝子組み換え植物体を得る。上記遺伝子組み換えトマト植物体からＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子がノックアウトされた植物体を同定する。
【0007】
本発明の具体的な技術的手段は以下の通りである。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術により、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子におけるタンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）に基づいてＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子を特異的に標的とするｓｇＲＮＡ配列を合成し、対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体に構築し、野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに形質転換することで、ゲノムにおけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子を特異的に編集し、遺伝子組み換え植物体を得る。遺伝子組み換え植物体におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子をＰＣＲ増幅およびシーケンシングし、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト植物体５２３０－ＫＯを得る（図１）。５２３０－ＫＯ植物体におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子の変異配列は配列番号２である。Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト植物体は、対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに比べて緑色がより濃く（図３）、その葉における光合成色素の含有量は対照品種よりも顕著に高く（図４）、葉の光合成効率も対照品種よりも高い（図５）。また、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子が光合成の調節に関与することを検証するために、本発明者は、この遺伝子の過剰発現担体を構築し、遺伝子組み換え植物体を取得し、同定して過剰発現Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子株５２３０－ＯＥ（図２）を取得し、対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに比べ、その植物体が黄変し、葉における光合成色素の含有量が減少し、葉の光合成効率が低下する（図３－５）。これらの結果により、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子がトマトの葉の光合成を負に調節することが十分に証明されている。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術により、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子におけるタンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）に基づいてＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子を特異的に標的とするｓｇＲＮＡ配列を合成し、対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体に構築し、野生型トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに形質転換することで、ゲノムにおけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子を特異的に編集し、遺伝子組み換え植物体を得る。遺伝子組み換え植物体におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子をＰＣＲ増幅およびシーケンシングし、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト植物体５２３０－ＫＯを得る（図１）。５２３０－ＫＯ植物体におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子の変異配列は配列番号２である。Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト植物体は、対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに比べて緑色がより濃く（図３）、その葉における光合成色素の含有量は対照品種よりも顕著に高く（図４）、葉の光合成効率も対照品種よりも高い（図５）。また、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子が光合成の調節に関与することを検証するために、本発明者は、この遺伝子の過剰発現担体を構築し、遺伝子組み換え植物体を取得し、同定して過剰発現Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子株５２３０－ＯＥ（図２）を取得し、対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに比べ、その植物体が黄変し、葉における光合成色素の含有量が減少し、葉の光合成効率が低下する（図３－５）。これらの結果により、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子がトマトの葉の光合成を負に調節することが十分に証明されている。
【発明の効果】
【0008】
光合成を負に調節する新しい機能遺伝子を発見した。遺伝子編集技術により、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のみがノックアウトされた植物体が得られるとともに、トマト植物体の光合成が顕著に向上する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【0010】
【図1】トマトＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト変異体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的のシーケンシング分析を示す。ここで、ＷＴは野生型対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍ、５２３０－ＫＯはＭｉｃｒｏＴｏｍのＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株であり、以下同じである。
【図2】トマトＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子の発現量の分析を示す。ここで、ＷＴは野生型対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍ、５２３０－ＯＥはＭｉｃｒｏＴｏｍのＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子過剰発現株である。
【図3】トマトＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株、過剰発現株およびその野生型対照の植物体の葉の色の比較を示す。
【図4】トマトＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株、過剰発現株およびその野生型対照の葉の光合成色素の含有量の比較を示す。ここで、Ａはクロロフィルａの含有量、Ｂはクロロフィルｂの含有量、Ｃはカロテノイドの含有量である。
【図5】トマトＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株、過剰発現株およびその野生型対照の葉の光合成の比較を示す。ここで、Ａは純光合成速度、Ｂは細胞間隙ＣＯ２濃度、Ｃは気孔コンダクタンス、Ｄは蒸散速度である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、図面を参照しながら本発明の具体的な実施形態をさらに詳しく説明する。
【0012】
＜ステップ１ Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト変異体の構築＞
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のコーディング配列（配列番号１）に基づいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ターゲット解析ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）により改良し、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集されるｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧ－３’（１番目の塩基はもともとＴであったが、遺伝子ノックアウトの効率を向上させるためにＧに置換した）を設計し、この配列に応じて対応する以下のプライマーを合成した。
上流：５’－ＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧ－３’
下流：５’－ＡＡＡＣＣＴＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＧＡＴＣＡＴＣＡ－３’
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９キット（Ｂｉｏｇｌｅ，Ｃｈｉｎａ）により対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体を構築した。構築は製品マニュアルに従って操作した。
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のコーディング配列（配列番号１）に基づいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ターゲット解析ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）により改良し、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集されるｓｇＲＮＡ配列：５’－ＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧ－３’（１番目の塩基はもともとＴであったが、遺伝子ノックアウトの効率を向上させるためにＧに置換した）を設計し、この配列に応じて対応する以下のプライマーを合成した。
上流：５’－ＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧ－３’
下流：５’－ＡＡＡＣＣＴＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＧＡＴＣＡＴＣＡ－３’
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９キット（Ｂｉｏｇｌｅ，Ｃｈｉｎａ）により対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体を構築した。構築は製品マニュアルに従って操作した。
【0013】
＜ステップ２ トマトへのＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト担体の移転的形質転換＞
ステップ１で構築されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体をトマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍへ形質転換し、ゲノムにおけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子を特異的に編集した。遺伝子組み換え方法は、Ｋｉｍｕｒａらによって提出された方法（Ｋｉｍｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ，ＣＨＳ Ｐｒｏｔｏｃ，２００８）により、対応する遺伝子組み換えトマト植物体を得た。
ステップ１で構築されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体をトマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍへ形質転換し、ゲノムにおけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子を特異的に編集した。遺伝子組み換え方法は、Ｋｉｍｕｒａらによって提出された方法（Ｋｉｍｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ，ＣＨＳ Ｐｒｏｔｏｃ，２００８）により、対応する遺伝子組み換えトマト植物体を得た。
【0014】
＜ステップ３ 遺伝子組み換えトマトの葉のゲノムＤＮＡの抽出＞
トマトの葉を０．１ｇ取り、液体窒素で研磨した後、６００μｌ抽出液（１５．７６ｇのＴｒｉｓ－ｃｌ，２９．２２ｇのＮａｃｌ，１５．０ｇのＳＤＳ粉末に１Ｌになるまで超純水を加え、ｐＨ＝８．０に調節した）を加え、６５℃で６０ｍｉｎインキュベートし、２００μｌのＫＡＣ（５ｍｏｌ／Ｌ）を加え、均一に混合した後、氷浴で１０分間冷却した後、５００μｌクロロホルムを加え、均一に混合し、１００００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、５００μｌイソプロパノールを加え、均一に混合し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、７５％エタノールで沈殿を洗浄し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、逆さまにしてＤＮＡを１５分間乾燥させた後、３０μｌ純水を加えてＤＮＡを溶解した。
トマトの葉を０．１ｇ取り、液体窒素で研磨した後、６００μｌ抽出液（１５．７６ｇのＴｒｉｓ－ｃｌ，２９．２２ｇのＮａｃｌ，１５．０ｇのＳＤＳ粉末に１Ｌになるまで超純水を加え、ｐＨ＝８．０に調節した）を加え、６５℃で６０ｍｉｎインキュベートし、２００μｌのＫＡＣ（５ｍｏｌ／Ｌ）を加え、均一に混合した後、氷浴で１０分間冷却した後、５００μｌクロロホルムを加え、均一に混合し、１００００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、５００μｌイソプロパノールを加え、均一に混合し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、７５％エタノールで沈殿を洗浄し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、逆さまにしてＤＮＡを１５分間乾燥させた後、３０μｌ純水を加えてＤＮＡを溶解した。
【0015】
＜ステップ４ Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のノックアウト標的のＰＣＲ増幅およびシーケンシング＞
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子をＰＣＲ増幅したプライマー（上流：５’－ＧＡＡＡＧＣＡＧＡＡＴＣＧＡＡＣＣＣ－３’、下流：５’－ＣＡＴＡＡＴＣＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡＣＡＡ－３’）を合成し、遺伝子組み換えトマト植物体およびその対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ハイフィデリティＴａｑ酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ、日本）を用いてＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子をＰＣＲ増幅した。
Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子をＰＣＲ増幅したプライマー（上流：５’－ＧＡＡＡＧＣＡＧＡＡＴＣＧＡＡＣＣＣ－３’、下流：５’－ＣＡＴＡＡＴＣＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡＣＡＡ－３’）を合成し、遺伝子組み換えトマト植物体およびその対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ハイフィデリティＴａｑ酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ、日本）を用いてＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子をＰＣＲ増幅した。
【0016】
ＰＣＲ増幅システムは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）２５μｌ；上、下流プライマー（１０μＭ）：各１μｌ；テンプレートＤＮＡ：２μｌ（＜２００ｎｇ）；無菌水：２１μｌであった。ＰＣＲ増幅プログラムは、予備変性：９５℃、５ｍｉｎ；変性：９８℃、１０ｓｅｃ；アニーリング：５５℃、１５秒；伸長：７２℃、６０秒；３０×サイクル；伸長：７２℃、５分間であった。
ＰＣＲ生成物をシーケンシング分析した結果、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のノックアウト株５２３０－ＫＯが成功に得られた。つまり、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のコーディング領域に１４個の塩基が欠失することで、この遺伝子にフレームシフト変異が発生した。５２３０－ＫＯ植物体におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号２に示される。
ＰＣＲ生成物をシーケンシング分析した結果、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のノックアウト株５２３０－ＫＯが成功に得られた。つまり、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のコーディング領域に１４個の塩基が欠失することで、この遺伝子にフレームシフト変異が発生した。５２３０－ＫＯ植物体におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号２に示される。
【0017】
＜ステップ５ トマトの葉の総ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ逆転写＞
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ドイツ）により、製品マニュアルに従ってトマト野生型品種ＭｉｃｒｏＴｏｍの葉の総ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ，日本）によりｃＤＮＡに逆転写した。
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ドイツ）により、製品マニュアルに従ってトマト野生型品種ＭｉｃｒｏＴｏｍの葉の総ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ，日本）によりｃＤＮＡに逆転写した。
【0018】
＜ステップ６ Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子のＰＣＲクローニング＞
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ，日本）によりＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子をＰＣＲ増幅した。反応系の配合は製品マニュアルに従って操作する。ステップ５で得られたｃＤＮＡ，ＰＣＲ増幅のプログラムは、予備変性：９５℃、５ｍｉｎ；変性：９８℃、１０ｓｅｃ；アニーリング：５５℃、１５秒；伸長：７２℃、３０秒；３０×サイクル；伸長：７２℃、５分間であった。
ＰＣＲプライマー：
上流プライマー：５’－ｃｇｇｇｇｔａｃｃＡＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＧＴＡＣ－３’
下流プライマー：５’－ａａｃｔｇｃａｇＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＧＴＴＴＣＣＴ－３’
注：下線が引かれた文字は制限酵素の認識配列である。
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ，日本）によりＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子をＰＣＲ増幅した。反応系の配合は製品マニュアルに従って操作する。ステップ５で得られたｃＤＮＡ，ＰＣＲ増幅のプログラムは、予備変性：９５℃、５ｍｉｎ；変性：９８℃、１０ｓｅｃ；アニーリング：５５℃、１５秒；伸長：７２℃、３０秒；３０×サイクル；伸長：７２℃、５分間であった。
ＰＣＲプライマー：
上流プライマー：５’－ｃｇｇｇｇｔａｃｃＡＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＧＴＡＣ－３’
下流プライマー：５’－ａａｃｔｇｃａｇＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＧＴＴＴＣＣＴ－３’
注：下線が引かれた文字は制限酵素の認識配列である。
【0019】
＜ステップ７ Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子の過剰発現担体の構築＞
制限酵素Ｋｐｎ ＩおよびＰｓｔ Ｉ（ＴａＫａＲａ，日本）によりｐＣＡＭＢＩＡ１３００－２×３５Ｓ担体を二重消化した。反応系には、Ｋｐｎ ＩおよびＰｓｔ Ｉ：各１μｌ；４μｌのＢｕｆｆｅｒ（製品付属品）；１５μｌのｐＣＡＭＢＩＡ１３００－２×３５Ｓ担体プラスミドが含まれ、ｄｄＨ２Ｏで４０μｌまで補充し、３７℃で酵素で４ｈ処理した。ＡｘｙＰｒｅｐ ＰＣＲクリーニングキット（Ａｘｙｇｅｎ，米国）を用いて製品マニュアルに従って酵素切断産物を精製した。同じ方法によりＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子の増幅生成物を精製した。Ｐｒｏｍｅｇａ社（米国）製のＴ４リガーゼキットにより、酵素で切断され、精製された担体とＰＣＲ生成物とを接続した。接続系には、酵素で切断された担体プラスミド１μｌ、遺伝子酵素切断断片２μｌ、Ｔ４リガーゼ０．５μｌ、Ｂｕｆｆｅｒ１μｌが含まれ、ｄｄＨ２Ｏで１０μｌまで補充し、４℃で一晩（１２時間）静置した。反応生成物を熱励起によりＪＭ１０９コンピテントセルを変換し、陽性クローンを得た後、担体に挿入された断片の配列（配列番号１）を確認するためにバイオテクノロジー企業にシーケンシング分析してもらい、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子の発現担体を得た。
制限酵素Ｋｐｎ ＩおよびＰｓｔ Ｉ（ＴａＫａＲａ，日本）によりｐＣＡＭＢＩＡ１３００－２×３５Ｓ担体を二重消化した。反応系には、Ｋｐｎ ＩおよびＰｓｔ Ｉ：各１μｌ；４μｌのＢｕｆｆｅｒ（製品付属品）；１５μｌのｐＣＡＭＢＩＡ１３００－２×３５Ｓ担体プラスミドが含まれ、ｄｄＨ２Ｏで４０μｌまで補充し、３７℃で酵素で４ｈ処理した。ＡｘｙＰｒｅｐ ＰＣＲクリーニングキット（Ａｘｙｇｅｎ，米国）を用いて製品マニュアルに従って酵素切断産物を精製した。同じ方法によりＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子の増幅生成物を精製した。Ｐｒｏｍｅｇａ社（米国）製のＴ４リガーゼキットにより、酵素で切断され、精製された担体とＰＣＲ生成物とを接続した。接続系には、酵素で切断された担体プラスミド１μｌ、遺伝子酵素切断断片２μｌ、Ｔ４リガーゼ０．５μｌ、Ｂｕｆｆｅｒ１μｌが含まれ、ｄｄＨ２Ｏで１０μｌまで補充し、４℃で一晩（１２時間）静置した。反応生成物を熱励起によりＪＭ１０９コンピテントセルを変換し、陽性クローンを得た後、担体に挿入された断片の配列（配列番号１）を確認するためにバイオテクノロジー企業にシーケンシング分析してもらい、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子の発現担体を得た。
【0020】
＜ステップ８ Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子過剰発現担体のトマトへの形質転換＞
ステップ７で得られたＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子の発現担体をトマト野生型品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに形質転換した。遺伝子組み換え方法は、Ｋｉｍｕｒａらの方法（Ｋｉｍｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ，ＣＨＳ Ｐｒｏｔｏｃ，２００８）を採用した。対応するこの遺伝子組み換えトマト植物体、すなわち、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子過剰発現植物体５２３０－ＯＥを得た。
ステップ７で得られたＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子の発現担体をトマト野生型品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに形質転換した。遺伝子組み換え方法は、Ｋｉｍｕｒａらの方法（Ｋｉｍｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ，ＣＨＳ Ｐｒｏｔｏｃ，２００８）を採用した。対応するこの遺伝子組み換えトマト植物体、すなわち、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子過剰発現植物体５２３０－ＯＥを得た。
【0021】
＜ステップ９ Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子過剰発現植物体のＲＴ－ＰＣＲ同定＞
ステップ５に記載の方法によりステップ８で得られた遺伝子組み換えトマト（５２３０－ＯＥ）葉の組織の総ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡであるＴＢ ｃＤＮＡに逆転写した。
ＰＣＲプライマーの合成
上流プライマー：５’－ＧＴＧＣＴＴＡＧＴＧＧＴＴＧＧＧＡＴＧＧ－３’
下流プライマー：５’－ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣ－３’
ステップ５に記載の方法によりステップ８で得られた遺伝子組み換えトマト（５２３０－ＯＥ）葉の組織の総ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡであるＴＢ ｃＤＮＡに逆転写した。
ＰＣＲプライマーの合成
上流プライマー：５’－ＧＴＧＣＴＴＡＧＴＧＧＴＴＧＧＧＡＴＧＧ－３’
下流プライマー：５’－ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣ－３’
【0022】
Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ増幅： ＴＢ ＧｒｅｅｎＴＭＰｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭキット（ＴａＫａＲａ）を用いて以下のように操作した。混合系にＴＢ ｃＤＮＡ ２μＬ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ １０μＬ、上下流プライマー（濃度がいずれも１０μＭ）それぞれ１μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ５．６μＬ、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ ０．４μＬを加えた。ＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓＴＭＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ＰＣＲを実行した。実行プログラムは、予備変性：９５℃、３０ｓ；９５℃、５ｓ；６０℃、３０ｓ；４０×サイクルであった。得られたデータに対してｔ検定により有意差の分析を行った。
結果を図２に示す。野生型品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに比べ、過剰発現系５２３０－ＯＥ植物体におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子の発現量は顕著に増加した（アップレギュレーション）。
結果を図２に示す。野生型品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに比べ、過剰発現系５２３０－ＯＥ植物体におけるＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子の発現量は顕著に増加した（アップレギュレーション）。
【0023】
＜ステップ１０ トマトの葉の光合成色素の測定＞
以上得られたＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株５２３０－ＫＯ、過剰発現株５２３０－ＯＥおよびその野生型対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍを２５℃、１６時間照明、８時間暗黒の条件で温室で栽培した。約４５日成長した後、各品種からランダムに６株選択し、各株から３つの葉を選択し、主脈を取り除き、小さく切り、０．１ｇ秤量し、３ｍＬの８０％（ｖ／ｗ）アセトンに浸漬し、２８℃、暗所で４８時間抽出した。抽出溶液を取り、ＵＶ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００Ｃ）により波長６６４ｎｍ、６４７ｎｍ、４７０ｎｍでの数値をそれぞれ測定した。そして、Ａｍｏｎ（１９４９）の方法によりクロロフィルａ、クロロフィルｂおよびカロテノイドの含有量を計算した。算式は以下の通りである。
クロロフィルａ＝（１３．７１×ＯＤ６６４－２．８５×ＯＤ６４７）×Ｖ／Ｗ
クロロフィルｂ＝（２２．３９×ＯＤ６４７－５．４２×ＯＤ６６４）×Ｖ／Ｗ
カロテノイド＝（１０００×ＯＤ４７０－３．２７×クロロフィルａ－１０４×クロロフィルｂ）／２２９
式中、Ｖは抽出液の体積（３ｍＬ）であり、Ｗは葉の質量０．１ｇであり、ＯＤ６６４、ＯＤ６４７およびＯＤ４７０はそれぞれＵＶ分光光度計により波長６６４ｎｍ、６４７ｎｍ、４７０ｎｍで測定した数値（単位：ｍｇ／ｇ）である。測定結果に対してｔ検定により変異体と野生型対照との有意差を分析した。
結果を図４に示す。対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに比べ、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株５２３０－ＫＯの葉のクロロフィルａ、クロロフィルｂおよびカロテノイドはいずれも顕著に増加し、過剰発現株５２３０－ＯＥの葉のクロロフィルａ、クロロフィルｂおよびカロテノイドはいずれも顕著に減少した。
以上得られたＳｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株５２３０－ＫＯ、過剰発現株５２３０－ＯＥおよびその野生型対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍを２５℃、１６時間照明、８時間暗黒の条件で温室で栽培した。約４５日成長した後、各品種からランダムに６株選択し、各株から３つの葉を選択し、主脈を取り除き、小さく切り、０．１ｇ秤量し、３ｍＬの８０％（ｖ／ｗ）アセトンに浸漬し、２８℃、暗所で４８時間抽出した。抽出溶液を取り、ＵＶ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００Ｃ）により波長６６４ｎｍ、６４７ｎｍ、４７０ｎｍでの数値をそれぞれ測定した。そして、Ａｍｏｎ（１９４９）の方法によりクロロフィルａ、クロロフィルｂおよびカロテノイドの含有量を計算した。算式は以下の通りである。
クロロフィルａ＝（１３．７１×ＯＤ６６４－２．８５×ＯＤ６４７）×Ｖ／Ｗ
クロロフィルｂ＝（２２．３９×ＯＤ６４７－５．４２×ＯＤ６６４）×Ｖ／Ｗ
カロテノイド＝（１０００×ＯＤ４７０－３．２７×クロロフィルａ－１０４×クロロフィルｂ）／２２９
式中、Ｖは抽出液の体積（３ｍＬ）であり、Ｗは葉の質量０．１ｇであり、ＯＤ６６４、ＯＤ６４７およびＯＤ４７０はそれぞれＵＶ分光光度計により波長６６４ｎｍ、６４７ｎｍ、４７０ｎｍで測定した数値（単位：ｍｇ／ｇ）である。測定結果に対してｔ検定により変異体と野生型対照との有意差を分析した。
結果を図４に示す。対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに比べ、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株５２３０－ＫＯの葉のクロロフィルａ、クロロフィルｂおよびカロテノイドはいずれも顕著に増加し、過剰発現株５２３０－ＯＥの葉のクロロフィルａ、クロロフィルｂおよびカロテノイドはいずれも顕著に減少した。
【0024】
＜ステップ１１ トマトの葉の光合成測定＞
ステップ１０と同様に栽培し、約４５日成長した後、各品種から６株ランダムに選択し、Ｌｉ－６４００（Ｌｉ－ＣＯＲ，米国）光合成測定器により、その葉の純光合成速度、細胞間隙ＣＯ２濃度、気孔コンダクタンスおよび蒸散作用を測定した。光合成測定器が１５ｍｉｎ自動予熱した後、順に環境オプション、Ｈ２ＯおよびＣＯ２パラメータ、混合ファン、温度、外部光源オプションを設定し、記録ファイルを新規作成し、葉の面積Ｓおよび気孔率Ｋを設定し、トマトの葉を挟み、データが安定した後、純光合成速度、細胞間隙ＣＯ２濃度、気孔コンダクタンスおよび蒸散速度の数値を読みだした。測定結果に対してｔ検定により変異体と野生型対照との有意差を分析した。
結果を図５に示す。対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに比べ、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株５２３０－ＫＯの葉の純光合成速度、気孔コンダクタンスおよび蒸散作用はいずれも顕著に向上し、過剰発現株５２３０－ＯＥの葉の純光合成速度、気孔コンダクタンスおよび蒸散作用はいずれも低下した。
ステップ１０と同様に栽培し、約４５日成長した後、各品種から６株ランダムに選択し、Ｌｉ－６４００（Ｌｉ－ＣＯＲ，米国）光合成測定器により、その葉の純光合成速度、細胞間隙ＣＯ２濃度、気孔コンダクタンスおよび蒸散作用を測定した。光合成測定器が１５ｍｉｎ自動予熱した後、順に環境オプション、Ｈ２ＯおよびＣＯ２パラメータ、混合ファン、温度、外部光源オプションを設定し、記録ファイルを新規作成し、葉の面積Ｓおよび気孔率Ｋを設定し、トマトの葉を挟み、データが安定した後、純光合成速度、細胞間隙ＣＯ２濃度、気孔コンダクタンスおよび蒸散速度の数値を読みだした。測定結果に対してｔ検定により変異体と野生型対照との有意差を分析した。
結果を図５に示す。対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍに比べ、Ｓｏｌｙｃ０５ｇ００５２３０遺伝子ノックアウト株５２３０－ＫＯの葉の純光合成速度、気孔コンダクタンスおよび蒸散作用はいずれも顕著に向上し、過剰発現株５２３０－ＯＥの葉の純光合成速度、気孔コンダクタンスおよび蒸散作用はいずれも低下した。
【0025】
以上の説明は、本発明のいくつかの具体的な実施例に過ぎない。本発明は以上の実施例に限定されず、種々の変形を含む。当業者は、本発明に開示の内容からすべての変形を直接導出または推測することができ、いずれも本発明の保護範囲に含まれるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】