知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-16
(54)【発明の名称】イネ白葉枯病高抵抗性遺伝子Ｘａ７及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/29 20060101AFI20230209BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230209BHJP
【ＦＩ】
C12N15/29 ZNA
C12N15/09 110
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021555847
(86)(22)【出願日】2020-12-30
(85)【翻訳文提出日】2022-09-08
(86)【国際出願番号】 CN2020141383
(87)【国際公開番号】W WO2022052380
(87)【国際公開日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】202010943795.5
(32)【優先日】2020-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520465253
【氏名又は名称】浙江師範大学
【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．６８８ Ｙｉｎｇｂｉｎ Ｒｏａｄ， Ｗｕｃｈｅｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｊｉｎｈｕａ， Ｚｅｊｉａｎｇ ３２１００４ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100205936
【弁理士】
【氏名又は名称】崔 海龍
(74)【代理人】
【識別番号】100132805
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 貴之
(72)【発明者】
【氏名】馬 伯軍
(72)【発明者】
【氏名】陳 析豊
(72)【発明者】
【氏名】劉 鵬程
(72)【発明者】
【氏名】梅 樂
(72)【発明者】
【氏名】劉 輝
(72)【発明者】
【氏名】冀 占東
(72)【発明者】
【氏名】陳 龍
(72)【発明者】
【氏名】鄭 茜茜
(72)【発明者】
【氏名】張 裕晨
(57)【要約】
本発明は、イネ白葉枯病高抵抗性遺伝子Ｘａ７の機能及びその使用に関し、植物遺伝学の分野。本発明は、イネ白葉枯病高抵抗性遺伝子Ｘａ７を開示する。遺伝子Ｘａ７のヌクレオチド配列は配列番号１に示される。本発明は、白葉枯病に対するイネの抵抗性を向上させるイネ白葉枯病高抵抗性遺伝子Ｘａ７の使用をさらに提供する。
【選択図】図４
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子Ｘａ７のヌクレオチド配列は配列番号１に示されることを特徴とする、イネ白葉枯病高抵抗性遺伝子Ｘａ７。
【請求項2】
アミノ酸配列は配列番号２に示されることを特徴とする、請求項１に記載のイネ白葉枯病高抵抗性遺伝子Ｘａ７によってコードされるタンパク。
【請求項3】
白葉枯病に対するイネの抵抗性を向上させることを特徴とする、請求項１に記載のイネ白葉枯病高抵抗性遺伝子Ｘａ７の使用。
【請求項4】
Ｘａ７遺伝子の発現担体を構築し、前記Ｘａ７遺伝子の発現担体は配列番号３に示される配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項5】
遺伝子編集された標的配列Ｔａｒｇｅｔ－１：５’－ＣＧＴＡＴＧＣＣＣＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧ－３’を設計し、Ｘａ７遺伝子Ｔａｒｇｅｔ－１ノックアウト担体を得ることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項6】
遺伝子編集された標的配列Ｔａｒｇｅｔ－２：５’－ＣＣＡＧＴＴＣＣＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧ－３’を設計し、Ｘａ７遺伝子Ｔａｒｇｅｔ－２ノックアウト担体を得ることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項7】
異なるタイプのＸａ７遺伝子ノックアウト植物体ｋｏ－１、ｋｏ－２、ｋｏ－３、ｋｏ－４を得ることを特徴とする、請求項５又は６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、イネ白葉枯病高抵抗性遺伝子Ｘａ７の機能及びその使用に関し、植物遺伝学の分野に属する。
【背景技術】
【0002】
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）は、世界で最も重要な食用作物の一つであり、世界の人口の半数以上が主食としてイネを食べている。しかし、稲は生産中にしばしば各種の病原物質による被害を受け、その多収型安定収量と米の品質に深刻な影響を与え、世界とわが国の食糧安全保障を脅かしている。
【0003】
グラム陰性黄色単胞菌のイネ病原性病変種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）によって引き起こされる白葉枯病（ｂａｃｔｉａｌｂｌｉｇｈｔ）は中国イネの生産において最も深刻な細菌性病害の一つであり、いもち病、紋枯病とともにイネの「三大病害」と呼ばれる。２０世紀８０年代前に、枯葉病はしばしば災害を引き起こし、通常、イネの生産量が２０～３０％減少し、深刻な時は５０％に達し、さらには収穫が途絶えた場合もあった（Ｎｉｎｏ－Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２００６）。中国の主要栽培品種にＸａ４、Ｘａ２１などの耐性遺伝子が導入されたため、白葉枯病が効果的に抑制され、発病状況は次第に軽くなった。しかし、地球環境の温暖化に伴い、枯葉病菌の絶え間ない変異により、次々と新型病原菌が出現し、主栽培イネ品種の耐病性が徐々に失われている（章埼，２００９）。近年、イネの枯葉病は年々深刻化する傾向にあり、「老病の新発」問題は日増しに深刻化している。統計によると、２０１７年以来、中国のイネ白葉枯病の発生面積は１０００万ムーを超え（陳功友ら、２０１９年）、生産量の損失は非常に大きく、食糧安全を深刻に脅かしており、新しい白葉枯病菌耐性遺伝子資源の導入が求められている。現在、植物から広範囲かつ持続的な抗病特性を持つ新しい遺伝子を同定し、その抗病分子メカニズムを解析し、育種実践に使用されることは、植物免疫分野の研究ホットスポット及び全世界の作物育種の重要な目標となっている（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．２０１９；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０２０）。
【0004】
Ｘａ７はイネの白葉枯病に対する耐性が高く、スペクトルが広く、持続性が高く、高温に強い優性遺伝子であり、現在国際的に認められている枯れ白葉枯病に対する耐性が最も持続的な「スター遺伝子」であり、育種価値と応用展望を持っている（Ｖｅｒａ－Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ，２００９；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１５）。Ｘａ７遺伝子はバングラデシュのイネ品種ＤＶ８５から初めて報告され（Ｓｉｄｈｕｅｔａｌ．１９７８）、現在から４０年余りが経過している。この遺伝子は非常に独特な抗病作用を示すため、過去数十年間、国内外の多くの研究機関がＸａ７遺伝子のクローン研究を行ってきた。Ｋａｊｉら（１９９５）は、Ｘａ７遺伝子をイネ第６号染色体の１０７．５ｃｍ位置に初めて位置づけ、Ｐｏｒｔｅｒら（２００３）はこの遺伝子を２．７ｃｍ区間にさらに精密に位置づけ、Ｃｈｅｎら（２００８）はこの位置づけ区間を１１８．５ｋｂに縮小した。しかし、まだこの遺伝子のクローニングを成功させることができず、その抗病分子メカニズムという科学的な問題が長い間未解決のまま残っている。本発明者らは２００６年からＸａ７遺伝子の研究を開始し、この遺伝子をイネ第６染色体の２００ｋｂ区間に位置決めした（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明が解決しようとする課題は、イネ抗白葉枯病に対して高抵抗性を有する新しい遺伝子及びその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記課題を解決するために、本発明によれば、イネ白葉枯病高抵抗性遺伝子Ｘａ７が提供される。この遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に示され、そのタンパク質をコードするアミノ酸配列は配列番号２に示される。
【0007】
本発明によれば、白葉枯病に対するイネの抵抗性を顕著に向上させる上記遺伝子の使用がさらに提供される。
【0008】
本発明のイネ白葉枯病高抵抗性遺伝子Ｘａ７の使用の改良として、Ｘａ７遺伝子の発現担体を構築し、上記Ｘａ７遺伝子の発現担体は、配列番号３に示される配列を含む。
【0009】
本発明のイネ白葉枯病高抵抗性遺伝子Ｘａ７の使用の改良として、遺伝子編集された標的配列Ｔａｒｇｅｔ－１：５’－ＣＧＴＡＴＧＣＣＣＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧ－３’を設計し、Ｘａ７遺伝子Ｔａｒｇｅｔ－１ノックアウト担体を得る。
【0010】
本発明のイネ白葉枯病高抵抗性遺伝子Ｘａ７の使用の改良として、遺伝子編集された標的配列Ｔａｒｇｅｔ－２：５’－ＣＣＡＧＴＴＣＣＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧ－３’を設計し、Ｘａ７遺伝子Ｔａｒｇｅｔ－２ノックアウト担体を得る。
【発明の効果】
【0011】
本発明者らは２００６年Ｘａ７遺伝子の研究を開始し、１０年にわたって様々な技術的方法で困難を克服し、ついにＸａ７遺伝子をクローニングした。
【0012】
本発明の技術的手段は以下のとおりである。
本発明者らは、初期に位置決めされた作業に基づいて、マップベースクローニング技術により白葉枯病高抵抗性イネ品種「鎮恢０８４」（Ｘａ７遺伝子を含む）と白葉枯病高感受性イネ品種「成恢４４８」とを交雑し、得られたＦ１を自己交配し、１万本以上の単株を含むＦ２位置決め集団を獲得し、白葉枯病菌株ＰＸＯ８６の接種同定後、この集団中の２０００本以上の感受性単株に対して染色体の遺伝子分析を行い、さらにＸａ７遺伝子を５０ｋｂに位置決めした（イネシーケンシング品種「日本晴」ゲノムを参照）。しかし、位置決め区間では「日本晴」の配列でプライマーを設計し、「鎮恢００８４」、「ＩＲＢＢ７」などＸａ７遺伝子を含むイネ品種をＰＣＲ増幅してもバンドを得ることができず、この領域に多くの未知の配列が存在する可能性があると推測した。したがって、本発明者らは「鎮恢０８４」、「ＩＲＢＢ７」及びその感受性遺伝子系「ＩＲ２４」的ゲノムライブラリーを構築し、各品種のライブラリーからＸａ７遺伝子の位置付け区間をカバーするクロスオーバークローンを選別した。シーケンシングの結果、「鎮恢０８４」及び「ＩＲＢＢ７」の位置決め区間の実際の物理距離は１２０ｋｂであり、大量の繰り返し配列が存在し、かつ両品種の１２０ｋｂ配列は完全に一致し、「ＩＲ２４」のこの区間における物理距離は５０ｋｂであり、「日本晴」の配列とほぼ一致することが分かった。しかし、Ｘａ７遺伝子を含むイネ品種の１２０ｋｂは、「日本晴」、「ＩＲ２４」の５０ｋｂとほとんど相同性がないため、マップベースクローニング技術によりこれ以上位置決め区間を狭めることができない。
本発明者らは、初期に位置決めされた作業に基づいて、マップベースクローニング技術により白葉枯病高抵抗性イネ品種「鎮恢０８４」（Ｘａ７遺伝子を含む）と白葉枯病高感受性イネ品種「成恢４４８」とを交雑し、得られたＦ１を自己交配し、１万本以上の単株を含むＦ２位置決め集団を獲得し、白葉枯病菌株ＰＸＯ８６の接種同定後、この集団中の２０００本以上の感受性単株に対して染色体の遺伝子分析を行い、さらにＸａ７遺伝子を５０ｋｂに位置決めした（イネシーケンシング品種「日本晴」ゲノムを参照）。しかし、位置決め区間では「日本晴」の配列でプライマーを設計し、「鎮恢００８４」、「ＩＲＢＢ７」などＸａ７遺伝子を含むイネ品種をＰＣＲ増幅してもバンドを得ることができず、この領域に多くの未知の配列が存在する可能性があると推測した。したがって、本発明者らは「鎮恢０８４」、「ＩＲＢＢ７」及びその感受性遺伝子系「ＩＲ２４」的ゲノムライブラリーを構築し、各品種のライブラリーからＸａ７遺伝子の位置付け区間をカバーするクロスオーバークローンを選別した。シーケンシングの結果、「鎮恢０８４」及び「ＩＲＢＢ７」の位置決め区間の実際の物理距離は１２０ｋｂであり、大量の繰り返し配列が存在し、かつ両品種の１２０ｋｂ配列は完全に一致し、「ＩＲ２４」のこの区間における物理距離は５０ｋｂであり、「日本晴」の配列とほぼ一致することが分かった。しかし、Ｘａ７遺伝子を含むイネ品種の１２０ｋｂは、「日本晴」、「ＩＲ２４」の５０ｋｂとほとんど相同性がないため、マップベースクローニング技術によりこれ以上位置決め区間を狭めることができない。
【0013】
Ｘａ７遺伝子のクローニングと同時に、本発明者らは「鎮恢０８４」種子に対して放射線変異誘発を行い、２万以上の変異誘発株からＸａ７遺伝子の変異抑制因子をスクリーニングし、白葉枯病高感受性ＰＸＯ８６株の変異体を多数得た。これらの変異体をＸａ７位置決め区間でＰＣＲ増幅することにより、そのうちの１つの変異体ｚｓｍ－２の染色体が欠失したことを発見した。ハイパスシーケンシングにより、欠失断片のサイズは１０６ｋｂであり、Ｘａ７遺伝子を位置決めした１２０ｋｂと２５ｋｂ重なっているため、Ｘａ７遺伝子はさらに２５ｋｂの範囲内に位置決めされた。その上で、本発明者らは２５ｋｂ区間をカバーする４つのサブクローン発現担体を構築し、そしてイネの感受性品種「中花１１」を遺伝的に形質転換して安定した遺伝子組み換え株を獲得した結果、２つのサブクローン断片の組み換え株はＰＸＯ８６高抵抗株であり、重なっている部分には未知機能を有する新しい遺伝子（配列番号１）を１つのみ含み、既知の遺伝子のＤＮＡおよびそのタンパク質をコードするアミノ酸配列と何ら相同性がないことがわかった。この遺伝子の機能を検証するために、本発明者らはＰＣＲ増幅により耐病性品種「鎮恢０８４」からこの遺伝子の配列を取得し、発現担体に構築して白葉枯病高感受性イネ品種「中花１１」に形質転換した結果、遺伝子組み換え陽性植物体が白葉枯病に対して高抵抗性であることが分かった（図３）。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術により耐病性品種「鎮恢０８４」からこの遺伝子をノックアウトした結果、ノックアウト植物体が白葉枯病に対して高感受性であることが分かった（図４）。したがって、本発明では、順遺伝学及び逆遺伝学の両方からこの遺伝子が白葉枯病に対して高抵抗性を有するＸａ７遺伝子であることが証明されている。
【図面の簡単な説明】
【0014】
以下、図面を参照しながら本発明の具体的な実施形態をさらに詳しく説明する。
【0015】
【図1】「中花１１」Ｘａ７遺伝子組み換え陽性植物体のＰＣＲ同定を示す。ＭはＭａｒｋｅｒ ＤＬ５０００である。「鎮恢０８４」は陽性対照である。「中花１１」は陰性対照である。Ｔ－１からＴ－４は遺伝子組み換え陽性植物体である。Ｔ－５及びＴ－６は遺伝子組み換えが成功していない陰性植物体である。
【図2】Ｘａ７遺伝子ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウト標的の配列及び遺伝子組み換えノックアウト植物体の変異タイプを示す。Ａは２つのＸａ７遺伝子ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウト標的Ｔａｒｇｅｔ－１、Ｔａｒｇｅｔ－２の位置及びその配列である。Ｂは標的Ｔａｒｇｅｔ－１ノックアウト担体を用いて得られた２種のＸａ７遺伝子変異植物体である。ＷＴは未編集の野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）配列である。ｋｏ－１ノックアウト植物体のＸａ７遺伝子サイトの１つの染色体に１つの塩基Ｃが挿入され、もう１つの染色体に２つ塩基ＴＴが欠失した。ｋｏ－２ノックアウト植物体のＸａ７遺伝子サイトの１つの染色体に１つの塩基Ｔが挿入され、もう１つの染色体に１４個の塩基が欠失した。Ｃは標的Ｔａｒｇｅｔ－２ノックアウト担体を用いて得られた２種のＸａ７遺伝子変異植物体である。ＷＴは未編集の野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）配列である。ｋｏ－３ノックアウト植物体のＸａ７遺伝子サイトの１つの染色体に１つの塩基Ｃが挿入され、もう１つの染色体に３０個の塩基が欠失した。ｋｏ－４ノックアウト植物体のＸａ７遺伝子サイトの１つの染色体に４つの塩基が欠失し、もう１つの染色体に１つの塩基Ｔが挿入された。
【図3】「中花１１」Ｘａ７遺伝子組み換え陽性植物体の白葉枯病抵抗性同定を示す。「中花１１」は、Ｘａ７遺伝子を含まない感受性対照品種である。Ｔ－１、Ｔ－２、Ｔ－３、Ｔ－４は、Ｘａ７遺伝子組み換え陽性植物体の異なる株である。白葉枯病ＰＸＯ８６のレースを接種した２週間後に観察及び測定する。Ａは接種葉の病斑の長さを示す写真である。Ｂは接種葉の病斑の長さの測定統計である。
【図4】「鎮恢０８４」Ｘａ７遺伝子ノックアウト植物体の白葉枯病抵抗性同定を示す。鎮恢０８４は、Ｘａ７遺伝子を含む耐病性対照品種である。ｋｏ－１、ｋｏ－２、ｋｏ－３、ｋｏ－４は、Ｘａ７遺伝子の異なるタイプのノックアウト植物体である。白葉枯病ＰＸＯ８６のレースを接種した２週間後に観察及び測定する。Ａは接種葉の病斑の長さを示す写真である。Ｂは接種葉の病斑の長さの測定統計である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
＜実施例１ 感受性イネ品種「中花１１」への遺伝子組み換えによるＸａ７遺伝子の導入＞
（１） Ｘａ７遺伝子のＰＣＲ増幅
ＰＣＲプライマー：上流５’－ｃｇｇｃｃａｇｔｇｃｃａａｇｃｔｔＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧ－３’、下流５’－ｔｇａｃｃａｃｃｃｇｇｇｇａｔｃｃＡＡＴＣＡＧＴＴＧＴＧＡＧＧＣＣＧＧＴＴ－３’（下線付きの配列はベクター相同組換え配列である）を設計して合成した。イネ「鎮恢０８４」ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ハイフィデリティＴａｑ酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ、日本）を用いてＸａ７遺伝子に対してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅システムは、５０μｌであり、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）２５μｌ、上、下流プライマー（１０μＭ）それぞれ１μｌ、テンプレートＤＮＡ ２μｌ（＜２００ｎｇ）、滅菌水２１μｌを含む。ＰＣＲ増幅プログラムは、予備変性：９５℃、５ｍｉｎ；変性：９８℃、１０ｓｅｃ；アニーリング：５８℃、１５秒；伸長：７２℃、９０秒；３０×サイクル；伸長：７２℃、５分間であった。Ｘａ７遺伝子（配列番号１）を含む配列番号３に示される配列を得た。
（１） Ｘａ７遺伝子のＰＣＲ増幅
ＰＣＲプライマー：上流５’－ｃｇｇｃｃａｇｔｇｃｃａａｇｃｔｔＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧ－３’、下流５’－ｔｇａｃｃａｃｃｃｇｇｇｇａｔｃｃＡＡＴＣＡＧＴＴＧＴＧＡＧＧＣＣＧＧＴＴ－３’（下線付きの配列はベクター相同組換え配列である）を設計して合成した。イネ「鎮恢０８４」ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ハイフィデリティＴａｑ酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ、日本）を用いてＸａ７遺伝子に対してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅システムは、５０μｌであり、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）２５μｌ、上、下流プライマー（１０μＭ）それぞれ１μｌ、テンプレートＤＮＡ ２μｌ（＜２００ｎｇ）、滅菌水２１μｌを含む。ＰＣＲ増幅プログラムは、予備変性：９５℃、５ｍｉｎ；変性：９８℃、１０ｓｅｃ；アニーリング：５８℃、１５秒；伸長：７２℃、９０秒；３０×サイクル；伸長：７２℃、５分間であった。Ｘａ７遺伝子（配列番号１）を含む配列番号３に示される配列を得た。
【0017】
（２） Ｘａ７遺伝子の発現担体の構築
制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢａｍＨ Ｉ（ＴａＫａＲａ，日本）を用いてｐＣＡＭＢＩＡ－１３００発現担体に対して二重酵素消化を行った。反応系は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢａｍＨ Ｉ：それぞれ１μｌ；４μｌのＢｕｆｆｅｒ（製品付属品）、１５μｌのｐＣＡＭＢＩＡ－１３００発現担体プラスミドが含まれ、ｄｄＨ２Ｏで４０μｌまで補充し、３７℃で酵素で４ｈ処理した。ＡｘｙＰｒｅｐ ＰＣＲクリーニングキット（Ａｘｙｇｅｎ，米国）を用いて製品マニュアルに従って酵素切断産物を精製した。同じ方法によりＸａ７遺伝子の増幅生成物を精製した。さらに、全式金社の相同組換えキット（ｐＥＡＳＹ（登録商標）－Ｕｎｉ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ）を用いてシームレス結合を行った。反応系では、１．２５μｌの担体生成物、３．７５μｌのＰＣＲ生成物、５μｌのＡｓｓｅｍｂｌｙ ｍｉｘが含まれ、５０℃で１５分間反応させた。反応生成物を熱励起によりＪＭ１０９コンピテントセルを変換し、陽性クローンを得た後、担体に挿入された断片の配列（配列番号３）を確認するためにバイオテクノロジー企業にシーケンシング分析してもらい、Ｘａ７遺伝子の発現担体を得た。
制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢａｍＨ Ｉ（ＴａＫａＲａ，日本）を用いてｐＣＡＭＢＩＡ－１３００発現担体に対して二重酵素消化を行った。反応系は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢａｍＨ Ｉ：それぞれ１μｌ；４μｌのＢｕｆｆｅｒ（製品付属品）、１５μｌのｐＣＡＭＢＩＡ－１３００発現担体プラスミドが含まれ、ｄｄＨ２Ｏで４０μｌまで補充し、３７℃で酵素で４ｈ処理した。ＡｘｙＰｒｅｐ ＰＣＲクリーニングキット（Ａｘｙｇｅｎ，米国）を用いて製品マニュアルに従って酵素切断産物を精製した。同じ方法によりＸａ７遺伝子の増幅生成物を精製した。さらに、全式金社の相同組換えキット（ｐＥＡＳＹ（登録商標）－Ｕｎｉ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ）を用いてシームレス結合を行った。反応系では、１．２５μｌの担体生成物、３．７５μｌのＰＣＲ生成物、５μｌのＡｓｓｅｍｂｌｙ ｍｉｘが含まれ、５０℃で１５分間反応させた。反応生成物を熱励起によりＪＭ１０９コンピテントセルを変換し、陽性クローンを得た後、担体に挿入された断片の配列（配列番号３）を確認するためにバイオテクノロジー企業にシーケンシング分析してもらい、Ｘａ７遺伝子の発現担体を得た。
【0018】
（３） イネの形質転換及び陽性植物体の同定
構築されたＸａ７遺伝子の発現担体を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらの方法（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２００６）によりイネ感受性イネ品種「中花１１」に転換し、遺伝子組み換えイネ植物体を得た。
遺伝子組み換え植物体の葉を取り、Ｐａｎａｕｄらの方法（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９９６）によりゲノムＤＮＡを抽出し、プライマー：上流５’－ＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧ－３’、下流５’－ＡＡＴＣＡＧＴＴＧＴＧＡＧＧＣＣＧＧＴＴ－３’を合成し、２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＩＡＮＧＥＮ社）試薬によりＰＣＲ増幅を行った。
ＰＣＲ増幅システムは、２０μｌであり、２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μｌ、上、下流プライマー（１０μＭ）各１μｌ、テンプレートＤＮＡ １μｌ（＜１μｇ）、滅菌水７μｌを含む。ＰＣＲの反応条件は、予備変性：９４℃、５ｍｉｎ；変性：９４℃、３０ｓｅｃ；アニーリング：５８℃、３０秒；伸長：７２℃、９０秒；３５×サイクル；伸長：７２℃、５分間であった。ＰＣＲ生成物を１％（ｗ／ｗ）アガロースゲル中で３０分間電気泳動し、臭化エチジウムで染色した後、紫外線透過機を用いて電気泳動バンドを観察した結果、遺伝子組み換え陽性植物体ではＰＣＲ増幅により１３２５ｂｐ断片（配列番号３）が得られた（例えば、Ｔ－１、Ｔ－２、Ｔ－３、Ｔ－４に示される）一方、非遺伝子組み換え植物体（陰性）ではＰＣＲ生成物が得られなかった（Ｔ－５、Ｔ－６に示される）（図１）。
構築されたＸａ７遺伝子の発現担体を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらの方法（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２００６）によりイネ感受性イネ品種「中花１１」に転換し、遺伝子組み換えイネ植物体を得た。
遺伝子組み換え植物体の葉を取り、Ｐａｎａｕｄらの方法（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９９６）によりゲノムＤＮＡを抽出し、プライマー：上流５’－ＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧ－３’、下流５’－ＡＡＴＣＡＧＴＴＧＴＧＡＧＧＣＣＧＧＴＴ－３’を合成し、２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＩＡＮＧＥＮ社）試薬によりＰＣＲ増幅を行った。
ＰＣＲ増幅システムは、２０μｌであり、２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μｌ、上、下流プライマー（１０μＭ）各１μｌ、テンプレートＤＮＡ １μｌ（＜１μｇ）、滅菌水７μｌを含む。ＰＣＲの反応条件は、予備変性：９４℃、５ｍｉｎ；変性：９４℃、３０ｓｅｃ；アニーリング：５８℃、３０秒；伸長：７２℃、９０秒；３５×サイクル；伸長：７２℃、５分間であった。ＰＣＲ生成物を１％（ｗ／ｗ）アガロースゲル中で３０分間電気泳動し、臭化エチジウムで染色した後、紫外線透過機を用いて電気泳動バンドを観察した結果、遺伝子組み換え陽性植物体ではＰＣＲ増幅により１３２５ｂｐ断片（配列番号３）が得られた（例えば、Ｔ－１、Ｔ－２、Ｔ－３、Ｔ－４に示される）一方、非遺伝子組み換え植物体（陰性）ではＰＣＲ生成物が得られなかった（Ｔ－５、Ｔ－６に示される）（図１）。
【0019】
＜実施例２ 耐病性イネ品種「鎮恢０８４」からの遺伝子組み換えによるＸａ７遺伝子のノックアウト＞
（１） Ｘａ７遺伝子ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウト担体の構築
Ｘａ７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）に応じて、ＣＲＩＳＰＲ標的設計用ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ－ｄｅｓｉｇｎｅｒ／）により、遺伝子編集の標的配列Ｔａｒｇｅｔ－１：５’－ＣＧＴＡＴＧＣＣＣＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧ－３’を設計し、この配列に基づいてプライマー配列Ｔａｒｇｅｔ－１Ｆ：５’－ＧＧＣＡＣＧＴＡＴＧＣＣＣＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣ－３’及びＴａｒｇｅｔ－１Ｒ：５’－ＡＡＡＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＧＧＧＣＡＴＡＣＧ－３’を合成した。Ｔ４ ＰＮＫ酵素（ＮＥＢ，米国）により５’－ヒドロキシル末端のリン酸化を行い、５０μＬ反応系にプライマーＴａｒｇｅｔ－１Ｆ（１０μＭ）１０μＬ、Ｔａｒｇｅｔ－１Ｒ（１０μＭ）１０μＬ，Ｔ４リガーゼ１μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ（製品付属品）５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ２４μＬを加え、３７℃で１ｈ反応させた後、ＮａＣｌ（１Ｍ）２．５μＬを加え、９５℃で５ｓ反応させ、２～３ｈ自然アニーリングし、Ｔａｒｇｅｔ－１アニーリングプローブを得た。
（１） Ｘａ７遺伝子ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウト担体の構築
Ｘａ７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）に応じて、ＣＲＩＳＰＲ標的設計用ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ－ｄｅｓｉｇｎｅｒ／）により、遺伝子編集の標的配列Ｔａｒｇｅｔ－１：５’－ＣＧＴＡＴＧＣＣＣＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧ－３’を設計し、この配列に基づいてプライマー配列Ｔａｒｇｅｔ－１Ｆ：５’－ＧＧＣＡＣＧＴＡＴＧＣＣＣＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣ－３’及びＴａｒｇｅｔ－１Ｒ：５’－ＡＡＡＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＧＧＧＣＡＴＡＣＧ－３’を合成した。Ｔ４ ＰＮＫ酵素（ＮＥＢ，米国）により５’－ヒドロキシル末端のリン酸化を行い、５０μＬ反応系にプライマーＴａｒｇｅｔ－１Ｆ（１０μＭ）１０μＬ、Ｔａｒｇｅｔ－１Ｒ（１０μＭ）１０μＬ，Ｔ４リガーゼ１μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ（製品付属品）５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ２４μＬを加え、３７℃で１ｈ反応させた後、ＮａＣｌ（１Ｍ）２．５μＬを加え、９５℃で５ｓ反応させ、２～３ｈ自然アニーリングし、Ｔａｒｇｅｔ－１アニーリングプローブを得た。
【0020】
Ｂｓａ Ｉ制限酵素（ＮＥＢ，米国）を用いて、製品マニュアルに従ってｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ｐＹＡＯ－ｃａｓ９担体を酵素切断し、線形化担体断片をゲル抽出し、ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡゲル回収キット（Ａｘｙｇｅｎ，米国）により精製した。上記Ｔａｒｇｅｔ－１アニーリングプローブ及び酵素切断担体断片をＴ４リガーゼ試薬（ＮＥＢ，米国）により結合した後、ＤＨ５αコンピテントセルに転換し、陽性クローニングを得た後、バイオテクノロジー企業にシーケンシング分析してもらった。担体に挿入された断片が５’－ＣＧＴＡＴＧＣＣＣＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣ－３’である場合、担体の構築が成功し、Ｘａ７遺伝子Ｔａｒｇｅｔ－１ノックアウト担体が得られた。即ち、このＸａ７遺伝子Ｔａｒｇｅｔ－１ノックアウト担体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によりＸａ７遺伝子（配列番号１）におけるＴａｒｇｅｔ－１位置に対して特異的に編集し、変異を発生させることができる。
【0021】
上記と同様の方法により、Ｘａ７遺伝子の異なる部位に別の遺伝子編集の標的配列Ｔａｒｇｅｔ－２：５’－ＣＣＡＧＴＴＣＣＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧ－３’を設計し、この配列に基づいてプライマー配列Ｔａｒｇｅｔ－２Ｆ：５’－ＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＣＣＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＧ－３’及びＴａｒｇｅｔ－２Ｒ：５’－ＡＡＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＧＧＧＡＡＣＴＧＧ－３’を合成し、Ｘａ７遺伝子Ｔａｒｇｅｔ－２ノックアウト担体を構築した。シーケンシング分析した結果、担体に挿入された断片が５’－ＣＣＡＧＴＴＣＣＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＧ－３’である場合、担体の構築が成功したことを示す。このＸａ７遺伝子Ｔａｒｇｅｔ－２ノックアウト担体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によりＸａ７遺伝子（配列番号１）におけるＴａｒｇｅｔ－２位置に対して特異的に編集し、変異を発生させることができる。
【0022】
（２） イネ形質転換及ノックアウト植物体の同定
構築された上記２つのＸａ７遺伝子ノックアウト担体を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらの方法（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２００６）によりそれぞれイネ耐病性品種「鎮恢０８４」に転換し、対応する遺伝子組み換えイネ植物体を得た。
遺伝子組み換え植物体の葉を取り、Ｐａｎａｕｄらの方法（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９９６）によりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲプライマー：５’－ＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣ－３’及び５’－ＴＴＡＡＴＴＧＣＣＡＣＣＧＡＴＧＡＧＧＴＡＡＴＣ－３’を合成した。ハイフィデリティＴａｑ酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ，日本）を用いて各遺伝子組み換え植物体のＸａ７遺伝子配列（配列番号１）に対してＰＣＲ増幅を行い、この遺伝子におけるＴａｒｇｅｔ－１及びＴａｒｇｅｔ－２部位の変異状況を分析した。ＰＣＲ増幅系は、５０μｌであり、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）２５μｌ、上、下流プライマー（１０μＭ）各１μｌ、テンプレートＤＮＡ ２μｌ（＜２００ｎｇ）、滅菌水２１μｌを含む。ＰＣＲ増幅プログラムは、予備変性：９５℃、５ｍｉｎ；変性：９８℃、１０ｓｅｃ；アニーリング：６０℃、１５秒；伸長：７２℃、３０秒；３０×サイクル；伸長：７２℃、５分間であった。
遺伝子組み換え植物体のＰＣＲ生成物をＴ－Ｖｅｃｔｏｒ ＰＭＤ１８（ＴａＫａＲａ，日本）に結合した。結合系及び反応条件は按製品マニュアルに従う。１０μｌ結合生成物を取り、熱励起によりＪＭ１０９コンピテントセルに転換し、陽性クローニングを得た後、バイオテクノロジー企業にシーケンシング分析してもらった。遺伝子組み換え植物体のＸａ７遺伝子ノックアウト標的位置には、複数の編集タイプが発見され（図２）、いずれもＸａ７遺伝子のフレームシフト変異又は断片欠失を引き起こし、最終的にはＸａ７遺伝子が成功にノックアウトされた４種類の変異植物体－ｋｏ－１ノックアウト植物体、ｋｏ－２ノックアウト植物体、ｋｏ－３ノックアウト植物体、ｋｏ－４ノックアウト植物体が得られた。
構築された上記２つのＸａ７遺伝子ノックアウト担体を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらの方法（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２００６）によりそれぞれイネ耐病性品種「鎮恢０８４」に転換し、対応する遺伝子組み換えイネ植物体を得た。
遺伝子組み換え植物体の葉を取り、Ｐａｎａｕｄらの方法（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９９６）によりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲプライマー：５’－ＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣ－３’及び５’－ＴＴＡＡＴＴＧＣＣＡＣＣＧＡＴＧＡＧＧＴＡＡＴＣ－３’を合成した。ハイフィデリティＴａｑ酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ，日本）を用いて各遺伝子組み換え植物体のＸａ７遺伝子配列（配列番号１）に対してＰＣＲ増幅を行い、この遺伝子におけるＴａｒｇｅｔ－１及びＴａｒｇｅｔ－２部位の変異状況を分析した。ＰＣＲ増幅系は、５０μｌであり、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）２５μｌ、上、下流プライマー（１０μＭ）各１μｌ、テンプレートＤＮＡ ２μｌ（＜２００ｎｇ）、滅菌水２１μｌを含む。ＰＣＲ増幅プログラムは、予備変性：９５℃、５ｍｉｎ；変性：９８℃、１０ｓｅｃ；アニーリング：６０℃、１５秒；伸長：７２℃、３０秒；３０×サイクル；伸長：７２℃、５分間であった。
遺伝子組み換え植物体のＰＣＲ生成物をＴ－Ｖｅｃｔｏｒ ＰＭＤ１８（ＴａＫａＲａ，日本）に結合した。結合系及び反応条件は按製品マニュアルに従う。１０μｌ結合生成物を取り、熱励起によりＪＭ１０９コンピテントセルに転換し、陽性クローニングを得た後、バイオテクノロジー企業にシーケンシング分析してもらった。遺伝子組み換え植物体のＸａ７遺伝子ノックアウト標的位置には、複数の編集タイプが発見され（図２）、いずれもＸａ７遺伝子のフレームシフト変異又は断片欠失を引き起こし、最終的にはＸａ７遺伝子が成功にノックアウトされた４種類の変異植物体－ｋｏ－１ノックアウト植物体、ｋｏ－２ノックアウト植物体、ｋｏ－３ノックアウト植物体、ｋｏ－４ノックアウト植物体が得られた。
【0023】
＜実施例３ ２種類の遺伝子組み換えイネの白葉枯病抵抗性の同定＞
以上得られたＸａ７遺伝子組み換え植物体（実施例１で得られた遺伝子組み換え陽性植物体）及びその対照品種「中花１１」、Ｘａ７遺伝子ノックアウト変異植物体（実施例２で得られたｋｏ－１ノックアウト植物体、ｋｏ－２ノックアウト植物体、ｋｏ－３ノックアウト植物体、ｋｏ－４ノックアウト植物体）及びその対照品種「鎮恢０８４」を畑に植え、気温は２８～３７℃であり、通常の通り水・肥料管理を行い、イネ植物体が分げつ盛期に成長した後、イネ植物体上の完全に展開した新葉を選択し、剪葉法（Ｋａｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ Ｒｅｐ，１９７３）により白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．Ｏｒｙｚａｅ）レースＰＸＯ８６を接種した。このレースは、Ｘａ７遺伝子耐病性を活性化可能な非毒性因子ＡｖｒＸａ７を含み、Ｘａ７遺伝子の耐病性を同定することができる。接種した２週間後、接種葉の切り口から下へ病斑の長さを測定した（（耐病性（≦３．０ｃｍＲ）、中度耐病性（３．１～６．０ｃｍ）、中度感受性（６．１～９．０ｃｍ）、感受性（＞９．０ｃｍ））。
以上得られたＸａ７遺伝子組み換え植物体（実施例１で得られた遺伝子組み換え陽性植物体）及びその対照品種「中花１１」、Ｘａ７遺伝子ノックアウト変異植物体（実施例２で得られたｋｏ－１ノックアウト植物体、ｋｏ－２ノックアウト植物体、ｋｏ－３ノックアウト植物体、ｋｏ－４ノックアウト植物体）及びその対照品種「鎮恢０８４」を畑に植え、気温は２８～３７℃であり、通常の通り水・肥料管理を行い、イネ植物体が分げつ盛期に成長した後、イネ植物体上の完全に展開した新葉を選択し、剪葉法（Ｋａｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ Ｒｅｐ，１９７３）により白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．Ｏｒｙｚａｅ）レースＰＸＯ８６を接種した。このレースは、Ｘａ７遺伝子耐病性を活性化可能な非毒性因子ＡｖｒＸａ７を含み、Ｘａ７遺伝子の耐病性を同定することができる。接種した２週間後、接種葉の切り口から下へ病斑の長さを測定した（（耐病性（≦３．０ｃｍＲ）、中度耐病性（３．１～６．０ｃｍ）、中度感受性（６．１～９．０ｃｍ）、感受性（＞９．０ｃｍ））。
【0024】
同定結果
感受性品種「中花１１」はＰＸＯ８６に対して高感受性である（図３）。「中花１１」にＸａ７遺伝子を導入した遺伝子組み換え陽性植物体はＰＸＯ８６に対して高抵抗性である（図３）。耐病性品種「鎮恢０８４」はＰＸＯ８６に対して高抵抗性である（図４）。「鎮恢０８４」からＸａ７遺伝子をノックアウトした変異植物体はＰＸＯ８６に対して高感受性である（図４）。これらの結果から明らかなように、Ｘａ７遺伝子を自体に含むか又は外部から導入したイネは、白葉枯病に対して高抵抗性を有し、重大な育種応用価値を持っている。
感受性品種「中花１１」はＰＸＯ８６に対して高感受性である（図３）。「中花１１」にＸａ７遺伝子を導入した遺伝子組み換え陽性植物体はＰＸＯ８６に対して高抵抗性である（図３）。耐病性品種「鎮恢０８４」はＰＸＯ８６に対して高抵抗性である（図４）。「鎮恢０８４」からＸａ７遺伝子をノックアウトした変異植物体はＰＸＯ８６に対して高感受性である（図４）。これらの結果から明らかなように、Ｘａ７遺伝子を自体に含むか又は外部から導入したイネは、白葉枯病に対して高抵抗性を有し、重大な育種応用価値を持っている。
【0025】
上述したのは、本発明のいくつかの具体的な実施例にすぎない。本発明は、以上の実施例に限定されず、多くの変形を含む。当業者は、本発明に開示の内容からすべての変形を直接導出又は想到することができ、これらの変形は、いずれも本発明の保護範囲に含まれるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】