2023-506441 医薬組成物及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-16

(54)【発明の名称】医薬組成物及びその用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/245 20060101AFI20230209BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20230209BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20230209BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230209BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20230209BHJP

   C07K 14/03 20060101ALN20230209BHJP

   C12N 15/117 20100101ALN20230209BHJP

   C12N 15/38 20060101ALN20230209BHJP

【ＦＩ】

A61K39/245

A61K39/39

A61P31/22

A61P37/04

A61P25/04

C07K14/03 ZNA

C12N15/117 Z

C12N15/38

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022535203

(86)(22)【出願日】2020-12-11

(85)【翻訳文提出日】2022-08-05

(86)【国際出願番号】 CN2020135571

(87)【国際公開番号】W WO2021115409

(87)【国際公開日】2021-06-17

(31)【優先権主張番号】201911279536.0

(32)【優先日】2019-12-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521271680

【氏名又は名称】遠大賽威信生命科学（南京）有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＧＲＡＮＤ ＴＨＥＲＡＶＡＣ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ （ＮＡＮＪＩＮＧ） ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３０， Ｎｏ． ６９９－１８， Ｘｕａｎｗｕ Ａｖｅｎｕｅ， Ｘｕａｎｗｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｎａｎｊｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１００４２ ＣＨＩＮＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100197642

【弁理士】

【氏名又は名称】南瀬 透

(74)【代理人】

【識別番号】100099508

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 久

(74)【代理人】

【識別番号】100182567

【弁理士】

【氏名又は名称】遠坂 啓太

(74)【代理人】

【識別番号】100219483

【弁理士】

【氏名又は名称】宇野 智也

(72)【発明者】

【氏名】葛君

(72)【発明者】

【氏名】李建強

(72)【発明者】

【氏名】孫嬌嬌

(72)【発明者】

【氏名】任蘇林

(72)【発明者】

【氏名】周童

(72)【発明者】

【氏名】王世偉

(72)【発明者】

【氏名】王曉東

(72)【発明者】

【氏名】黄精俸

(72)【発明者】

【氏名】陳悦

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA03

4C085AA38

4C085BA79

4C085BB11

4C085BB23

4C085CC21

4C085EE06

4C085FF14

4C085FF18

4H045AA11

4H045CA03

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

医薬組成物であって、ｉ）ヘルペスｇＥタンパク質、前記タンパク質の活性フラグメント、前記タンパク質の変異体、又はそれらの少なくとも２つの混合物と、ｉｉ）サポニンとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとを含み、又はサポニンを含むアジュバントとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとからなる免疫刺激性組成物とを含む。水痘・帯状疱疹ウイルス感染及び／又は水痘・帯状疱疹ウイルス媒介性疾患を予防及び／又は治療するための薬物の製造における前記医薬組成物の用途を提供する。医薬組成物は、予期しなかった技術的効果を得、より強い免疫応答を媒介することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ）ヘルペスｇＥタンパク質、前記タンパク質の活性フラグメント、前記タンパク質の変異体、又はそれらの少なくとも２つの混合物と、
ｉｉ）サポニンとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとを含み、又はサポニンを含むアジュバントとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとからなり、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列は２つ又は２つ以上のコピーの５’－ＴＴＣＧＴＴ－３’モチーフ又は５’－ＴＣＧＴＣＧＴＣＧ－３’モチーフを有する免疫刺激性組成物とを含む、医薬組成物。

【請求項2】

前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの配列は、ＣｐＧ Ｔ１：ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ（配列番号２）、ＣｐＧ Ｔ２：ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ Ｔ（配列番号３）、ＣｐＧ Ｔ３：ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ（配列番号４）から選ばれるいずれか１つであり、
好ましくは、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの配列はＣｐＧ Ｔ１：ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ（配列番号２）である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記サポニンはキラヤサポニン、ギンセノシド、プラチコジン、アストラガロシド、ノトギンセノシド、グリチルリチン、ジュリブロシド、オフィオポゴニン、サイコシド又はチクセツサポニンから選ばれる１つ又は複数である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記キラヤサポニンはＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８又はＱＳ－２１であり、好ましくは、前記サポニンはＱＳ－２１であり、前記ギンセノシドはギンセノシドＲｇ１、ギンセノシドＲｇ３、ギンセノシドＲｂ１又はギンセノシドＲｅであり、前記プラチコジンはプラチコジンＤ、プラチコジンＤ２又はその両方の混合物であり、前記アストラガロシドはアストラガロシドＡ、アストラガロシドＩ、アストラガロシドＩＩ又はそれらの２つ若しくは２つ以上のサポニンモノマーの混合物であり、前記ノトギンセノシドはノトギンセノシドＲ１であり、前記オフィオポゴニンはオフィオポゴニンＤであり、前記サイコシドはサイコシドａ、サイコシドｄ又はその両方の混合物であり、前記ジュリブロシドはゴウカンヒの総サポニンであり、前記グリチルリチンはカンゾウの総サポニンであり、前記チクセツサポニンはチクセツニンジンの総サポニンである、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

サポニンを含む前記アジュバントはＩｓｃｏｍアジュバントである、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはホスホロチオエート結合を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはチオオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはペルチオオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとサポニンの重量比は１～４０：０．１～２であり、好ましくは、２～４０：０．１～２である、請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとサポニンの重量比は２：１である、請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記医薬組成物は、ｉｉｉ）薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記ヘルペスｇＥタンパク質は配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、又はそれからなる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記ヘルペスｇＥタンパク質の活性フラグメントは配列番号１における１位～Ｘ位の連続のアミノ酸を含み、又はそれからなり、Ｘは５０７～５１８との間の整数である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記成分ｉ）とｉｉ）の重量比は１：１．１～４２であり、好ましくは、１：２．１～４２である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記成分ｉ）とｉｉ）の重量比は１：３である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、帯状疱疹ワクチン又は水痘ワクチン。

【請求項17】

水痘・帯状疱疹ウイルス感染及び／又は水痘・帯状疱疹ウイルス媒介性疾患を予防及び／又は治療するための薬物の製造における請求項１～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物の用途。

【請求項18】

前記水痘・帯状疱疹ウイルス感染及び／又は水痘・帯状疱疹ウイルス媒介性疾患は水痘、帯状疱疹、帯状疱疹後神経痛から選ばれる、請求項１７に記載の用途。

【請求項19】

対象において水痘・帯状疱疹ウイルスに対する体液性免疫及び／又は細胞性免疫応答を産生させるための薬物の製造における請求項１～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物の用途。

【請求項20】

前記薬物は帯状疱疹ワクチン又は水痘ワクチンである、請求項１９に記載の用途。

【請求項21】

それを必要とする被験者に有効量の請求項１～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、水痘・帯状疱疹ウイルス感染及び／又は水痘・帯状疱疹ウイルス媒介性疾患を予防及び／又は治療する方法。

【請求項22】

前記水痘・帯状疱疹ウイルス感染及び／又は水痘・帯状疱疹ウイルス媒介性疾患は水痘、帯状疱疹、帯状疱疹後神経痛から選ばれる、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

それを必要とする被験者に有効量の請求項１～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、対象において水痘・帯状疱疹ウイルスに対する体液性免疫及び／又は細胞性免疫応答を産生させる方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオ医薬品分野に属する。具体的には、本発明は、ヘルペスｇＥタンパク質と、免疫刺激性組成物とを含む医薬組成物に関する。前記免疫刺激性組成物はサポニンとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとを含み、又は前記免疫刺激性組成物は、サポニンを含むアジュバントとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとからなり、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列は２つ又は２つ以上のコピーの５’－ＴＴＣＧＴＴ－３’モチーフ又は５’－ＴＣＧＴＣＧＴＣＧ－３’モチーフを有する。本発明は、さらに、帯状疱疹、水痘又は帯状疱疹後神経痛を予防するための前記医薬組成物の用途に関する。

【背景技術】

【0002】

帯状疱疹は、水痘・帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ－ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）が引き起こすウイルス性皮膚疾患である。ＶＺＶの一次感染時は、呼吸器粘膜上皮を介して局所リンパ節に入って複製し、その後、ウイルスに感染したリンパ球がリンパ循環を介して血液循環に入り末梢血単核白血球に感染し、ウイルスが血流に流されて皮膚に到達し、臨床では水痘として発症する。水痘が完治した後、ウイルスが脳神経節に潜伏して複製し、末梢神経に沿って皮膚に到達し、臨床では帯状疱疹として発症する。帯状疱疹の主な合併症は帯状疱疹後神経痛（ｐｏｓｔ－ｈｅｒｐｅｔｉｃ ｎｅｕｒａｌｇｉａ、ＰＨＮ）で、５０歳以上の成人では約２０％にＰＨＮが発症し、しかも年齢の増加につれて、ＰＨＮが発生する可能性が高くなり、痛みが数か月から数年間続く。

【0003】

帯状疱疹ワクチンの接種は帯状疱疹を予防し、ＰＨＮなどの合併症を軽減する効果的な手段である。現在販売されている帯状疱疹ワクチンは、主にメルクのゾスタバックス（Ｚｏｓｔａｖａｘ）、グラクソ・スミスクラインのシングリックス（Ｓｈｉｎｇｒｉｘ）である。その中で、ゾスタバックスは弱毒生ワクチンで２００６年より発売され、シングリックスは組換え帯状疱疹ワクチンで２０１７年１０月より発売された。

【0004】

本発明者は従来の技術について踏み入った研究を行ったところ、アジュバントが帯状疱疹ワクチンの治療効果に重要な役割を果たすことを見出した。アジュバントとしてのオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）は近年発見された新規な免疫刺激薬であり、その化学的本質がシトシングアニンジヌクレオチドを含むオリゴデオキシヌクレオチドで、天然のＣｐＧパターン認識受容体と似ている免疫応答を有し、細胞膜におけるＴｏｌｌ様受容体と結合して、ＴＬＲ９シグナル伝達経路を介して哺乳類において効果的に免疫応答を誘発することができる。ＣｐＧが引き起こす免疫応答はＴｈ１型を主とし、Ｔｈ２型免疫応答のＴｈ１への変換を誘導して、細胞性免疫を生じさせることができる。Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などの免疫活性細胞を活性化することにより、種々のサイトカインを産生させて、身体の特異的・非特異的免疫効果を強化させ、自然免疫と獲得免疫をつなげる重要な一環である。

【0005】

サポニンは、トリテルペン又はスピロステラン系化合物をアグリコンとするグリコシドで、植物由来のアジュバントに属する。現在よく使用されるサポニンアジュバントとしては、キラヤから抽出されるサポニンであるＱＳシリーズがあり、当該シリーズで最もよく用使用されるのはＱＳ－２１アジュバントであるが、細胞の溶血を誘発する可能性があり、全身的・局所的な毒性副作用がある。Ａｌｖｉｎｇら（ＡＬＶＩＮＧ ＣＲ，ＭＡＴＹＡＳ Ｇ，ＢＥＣＫ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖｕｅ Ｒｏｕｍａｉｎｅ ｄｅ Ｃｈｉｍｉｅ，２０１６，６１（８）：６３１－６３５．）の研究により、ＡＬＦリポソームがアジュバントとしてＭＰＬＡとＱＳ－２１と結合してＨＩＶｇｐ１４０タンパク質に対抗する場合に血清中の抗体価を効果的に高められることが分かった。

【0006】

従来の技術（ＷＯ２００１０５１０８３Ａ３）にはサポニンとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとを含む免疫刺激性組成物が報告され、そのなか、ＣｐＧアジュバントは主にＣｐＧ１８２６、ＣｐＧ７９０９である。しかし、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの構造の多様性により、異なる配列のＣｐＧアジュバントは効果が大きく異なる。

【0007】

したがって、今は免疫効果のより強いアジュバントと薬物が要望される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明者は従来技術の欠点について、多くの研究を行ったところ、免疫効果のより強い免疫刺激性組成物、前記免疫刺激性組成物を含む医薬組成物を発見した。本発明に係る医薬組成物は二重アジュバントを含み、且つその中のサポニンとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが効率的な相乗効果を表すため、より強い免疫応答を媒介することができる。本発明は、さらに、水痘、帯状疱疹又は帯状疱疹後神経痛を予防及び／又は治療するための前記医薬組成物の用途を提供する。従来の技術と比べ、本願に係る医薬組成物は優れた免疫予防と治療効果を表している。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の目的は下記の技術的解決手段により達成される。
本発明は、一態様において、
ｉ）ヘルペスｇＥタンパク質、前記タンパク質の活性フラグメント、前記タンパク質の変異体、又はそれらの少なくとも２つの混合物と、
ｉｉ）サポニンとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとを含み、又はサポニンを含むアジュバントとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとからなり、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列は２つ又は２つ以上のコピーの５’－ＴＴＣＧＴＴ－３’モチーフ又は５’－ＴＣＧＴＣＧＴＣＧ－３’モチーフを有する免疫刺激性組成物とを含む、医薬組成物を提供する。

【0010】

本発明に係る医薬組成物において、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの配列は、ＣｐＧ Ｔ１：ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ（配列番号２）、ＣｐＧ Ｔ２：ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ Ｔ（配列番号３）、ＣｐＧ Ｔ３：ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ（配列番号４）から選ばれるいずれか１つであり、
好ましくは、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの配列はＣｐＧ Ｔ１：ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ（配列番号２）である。

【0011】

本発明に係る医薬組成物において、前記サポニンはキラヤサポニン、ギンセノシド、プラチコジン、アストラガロシド、ノトギンセノシド、グリチルリチン、ジュリブロシド、オフィオポゴニン、サイコシド又はチクセツサポニンから選ばれる１つ又は複数であり、好ましくは、前記サポニンはキラヤサポニン、ギンセノシド、プラチコジン又はアストラガロシドＡであり、より好ましくは、前記キラヤサポニンはＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８又はＱＳ－２１であり、さらに好ましくは、前記キラヤサポニンはＱＳ－２１であり、前記ギンセノシドはギンセノシドＲｇ１、ギンセノシドＲｇ３、ギンセノシドＲｂ１又はギンセノシドＲｅであってもよく、前記プラチコジンはプラチコジンＤ、プラチコジンＤ２又はその両方の混合物であってもよく、前記アストラガロシドはアストラガロシドＡ（アストラガロシドＩＶ）、アストラガロシドＩ、アストラガロシドＩＩなどのモノマー又はそれらの２つの若しくは２つ以上のサポニンモノマーの混合物であってもよく、前記ノトギンセノシドはノトギンセノシドＲ１であってもよく、前記オフィオポゴニンはオフィオポゴニンＤなどであってもよく、前記サイコシドはサイコシドａ、サイコシドｄ又はその両方の混合物であってもよく、前記ジュリブロシドはゴウカンヒの総サポニンなどであってもよく、前記グリチルリチンはカンゾウの総サポニンであってもよく、前記チクセツサポニンはチクセツニンジンの総サポニンであってもよい。

【0012】

本発明に係る医薬組成物において、サポニンを含む前記アジュバントは免疫刺激性複合体アジュバント（Ｉｓｃｏｍアジュバント）である。

【0013】

本発明に係る医薬組成物において、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはホスホロチオエート結合を含み、好ましくは、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはチオオリゴデオキシヌクレオチドであり、より好ましくは、ペルチオオリゴデオキシヌクレオチドである。

【0014】

本発明に係る医薬組成物において、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドと前記サポニンの重量比は１～４０：０．１～２であり、好ましくは、２～４０：０．１～２である。

【0015】

本発明に係る医薬組成物において、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドと前記サポニンの重量比は２：１である。

【0016】

本発明に係る医薬組成物において、ｉｉｉ）薬学的に許容される担体をさらに含む。

【0017】

本発明に係る医薬組成物において、前記ヘルペスｇＥタンパク質は配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、又はそれからなり、好ましくは、前記ヘルペスｇＥタンパク質の活性フラグメントは配列番号１における１位～Ｘ位の連続のアミノ酸を含み、又はそれからなり、Ｘは５０７～５１８との間の整数である。

【0018】

本発明に係る医薬組成物において、前記医薬組成物の成分ｉ）とｉｉ）の重量比は１：１．１～４２であり、好ましくは、１：２．１～４２である。

【0019】

本発明に係る医薬組成物において、前記医薬組成物の成分ｉ）とｉｉ）の重量比は１：３である。

【0020】

本発明は、別の態様において、前記医薬組成物を含む帯状疱疹ワクチン又は水痘ワクチンを提供する。

【0021】

本発明は、更なる態様において、水痘・帯状疱疹ウイルス感染及び／又は水痘・帯状疱疹ウイルス媒介性疾患を予防及び／又は治療するための薬物の製造における前記医薬組成物の用途を提供し、好ましくは、前記水痘・帯状疱疹ウイルス感染及び／又は水痘・帯状疱疹ウイルス媒介性疾患は水痘、帯状疱疹又は帯状疱疹後神経痛から選ばれる。

【0022】

本発明は、更なる態様において、対象において水痘・帯状疱疹ウイルスに対する体液性免疫及び／又は細胞性免疫応答を産生させるための薬物の製造における前記医薬組成物の用途を提供する。前記薬物は帯状疱疹ワクチン又は水痘ワクチンであり、好ましくは、帯状疱疹ワクチンである。

【0023】

本発明は、更なる態様において、それを必要とする被験者に予防及び／又は治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、水痘・帯状疱疹ウイルス感染及び／又は水痘・帯状疱疹ウイルス媒介性疾患を予防及び／又は治療する方法を提供し、好ましくは、前記水痘・帯状疱疹ウイルス感染及び／又は水痘・帯状疱疹ウイルス媒介性疾患は水痘、帯状疱疹又は帯状疱疹後神経痛から選ばれる。

【0024】

本発明は、更なる態様において、それを必要とする被験者に有効量の医薬組成物を投与することを含む、対象において水痘・帯状疱疹ウイルスに対する体液性免疫及び／又は細胞性免疫応答を産生させる方法を提供する。

【発明の効果】

【0025】

本発明に係る免疫刺激性組成物は予期しなかった技術的効果を得、より強い免疫応答を媒介することができる。ＣｐＧ Ｔ１、ＣｐＧ Ｔ２、ＣｐＧ Ｔ３単独使用の免疫刺激効果はＣｐＧ１０１８、ＣｐＧ７９０９、ＣｐＧ１８２６などより弱いが、ＱＳ-２１と併用すると、前記免疫刺激性組成物は予期しなかった相乗効果を表し、免疫効果が明らかに増強する。

【0026】

ＣｐＧ Ｔ１、ＣｐＧ Ｔ２、ＣｐＧ Ｔ３に対する初歩的な実験検証により、帯状疱疹抗原において同等な使用効果が確認された。ＣｐＧ Ｔ１、ＣｐＧ Ｔ２が同じモチーフの５’－ＴＴＣＧＴＴ－３’を含有し、ＣｐＧ Ｔ３の方は他の抗原（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原など）を用いる実験において、ＣｐＧ Ｔ１、ＣｐＧ Ｔ２と同等な免疫効果が確認された。

【0027】

従来の技術と比べ、本発明に係る免疫刺激剤を含む帯状疱疹ワクチンは優れた免疫刺激効果を有し、細胞性免疫実験で当該ワクチンは強いヘルペスｇＥタンパク質特異的ＩＦＮ－γレベルを誘導産生できることが証明され、タンパク質による免疫効果が明らかに単独のアジュバントより優れている。体液性免疫実験からも当該ワクチンは高いヘルペスｇＥタンパク質特異的ＩｇＧ／ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体レベルを産生できることが証明され、しかも効果が単独のアジュバントより優れ、他のＣＰＧアジュバントとＱＳ２１の組み合わせより明らかに優れている。

【図面の簡単な説明】

【0028】

以下、各図を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。

【図1】異なるＣＰＧオリゴデオキシヌクレオチドのヘルペスｇＥ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。

【図2】異なる免疫刺激性組成物の用量のヘルペスｇＥ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。

【図3】本発明に係る帯状疱疹ワクチンのヘルペスｇＥ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。

【図4】本発明に係る帯状疱疹ワクチンのマウス血清中の抗原特異的ＩｇＧ抗体とそのサブタイプレベルに対する影響を示す。 図中、パネルＡは各群のマウスの血清ＩｇＧレベルである。パネルＢは各群のマウスの血清ＩｇＧ１レベルである。パネルＣは各群のマウスの血清ＩｇＧ２ａレベルである。パネルＤは各群のマウスの血清ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１の比の値である。

【図5】異なるサポニンのヘルペスｇＥ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルに対する影響を示す。

【0029】

「定義」
特に定義がない限りは、本明細書で使用する全ての技術用語は当業者が理解しているのと同じ意味である。本分野の定義と用語に関して、当業者はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照することができる。アミノ酸残基の略号は本分野で通常の２０のＬ－アミノ酸の１つを指す標準的な３文字及び／又は１文字コードである。

【0030】

本発明において広い範囲で数値範囲とパラメータの近似値を示しているが、具体例で数値はなるべく正確に記載する。しかし、いずれの数値もその測定に標準偏差があるため、程度の差こそあれ必ず誤差がある。また、本明細書において開示される範囲はいずれも、その中に含まれる任意の又は全ての部分範囲をカバーしていると理解される。例えば、「２～４０」と記載される範囲は最小値２と最大値４０の間（端点を含む）の任意の又は全ての部分範囲であって、つまり、全ての、最小値２又はそれより大きい数値から始まる部分範囲（例えば、２～６．１）、最大値４０又はそれより小さい数値で終わる部分範囲（例えば、５．５～４０）を含むと見なされる。また、参照文献が「本明細書に組み込まれる」とは、全体として組み込まれると理解される。

【0031】

なお、本明細書で使用する単数形は、１つの指示対象との明確な限定がない限りは、指示対象の複数形を含む。用語「又は」は、文脈において明示がない限り、用語「及び／又は」と入れ替えて使用される。

【0032】

本明細書で用語「医薬組成物」、「組み合わせ薬物」と「薬物組み合わせ」は、組み合わせて特定の目的を達成する少なくとも１つの薬物と任意選択で薬学的に許容される賦形剤又は添加物との組み合わせを表すように入れ替えて使用される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、共に機能して本発明の目的を達成できるものであれば、時間的及び／又は空間的に分離した組み合わせを含む。例えば、前記医薬組成物に含まれる成分（例えば、ｇＥタンパク質、ＱＳ－２１、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）は全体として対象に投与されてもよいし、又は別々に対象に投与されてもよい。前記医薬組成物に含まれる成分が別々に対象に投与される場合に、前記成分は同時に又は順次対象に投与されることができる。

【0033】

本明細書で使用する用語「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド」又は「ＣｐＧ－ＯＤＮ」とは、１つ又はそれ以上の「ＣｐＧ」単位を含む、短い一本鎖合成ＤＮＡ分子を指し、ここでＣはシトシンを、Ｇはグアニンを、ｐはホスホジエステル結合を表す。特に、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはメチル化されていない。一部の実施形態において、前記ＣｐＧ－ＯＤＮはホスホロチオエート結合又はホスホロチオエート骨格を含む。つまり、一部の実施形態において、前記ＣｐＧ－ＯＤＮはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（即ちチオオリゴデオキシヌクレオチド）である。好ましくは、前記ＣｐＧ－ＯＤＮにおいてヌクレオチド同士の結合は全てホスホロチオエート結合であり、つまり前記ＣｐＧ－ＯＤＮはペルチオオリゴデオキシヌクレオチドである。他の一部の実施形態において、前記ＣｐＧ－ＯＤＮは２つ又は２つ以上のコピーの５’－ＴＴＣＧＴＴ－３’モチーフ又は５’－ＴＣＧＴＣＧＴＣＧ－３’モチーフを含む。特に、前記ＣｐＧ－ＯＤＮは、ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ（配列番号２）、ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ Ｔ（配列番号３）、ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ（配列番号４）から選ばれる配列を有し、好ましくは、ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ（配列番号２）である。

【0034】

本明細書で使用する「ギンセノシド、プラチコジン、アストラガロシド、ノトギンセノシド、グリチルリチン、ジュリブロシド、オフィオポゴニン、サイコシド又はチクセツサポニン」とは対応の植物に存在する活性成分を指し、例えば、ギンセノシドは主にジンセン属生薬に存在するステロール化合物であり、ジンセンにおける活性成分である。一部の実施形態において、前記ギンセノシドは、ギンセノシドＲｇ１、ギンセノシドＲｇ３、ギンセノシドＲｂ１、ギンセノシドＲｅなどのモノマー又はそれらの２つ若しくは２つ以上のサポニンモノマーの混合物であることが好ましく、プラチコジンはプラチコジンＤ、プラチコジンＤ２又はその両方の混合物であることが好ましく、アストラガロシドはアストラガロシドＡ（アストラガロシドＩＶ）、アストラガロシドＩ、アストラガロシドＩＩなどのモノマー又はそれらの２つ若しくは２つ以上のサポニンモノマーの混合物であることが好ましく、ノトギンセノシドはノトギンセノシドＲ１などであることが好ましく、オフィオポゴニンはオフィオポゴニンＤなどであることが好ましく、サイコシドはサイコシドａ、サイコシドｄ又はその両方の混合物であることが好ましく、ジュリブロシドはゴウカンヒの総サポニンなどであることが好ましく、グリチルリチンはカンゾウの総サポニンなどであることが好ましく、チクセツサポニンはチクセツニンジンの総サポニンなどであることが好ましい。

【0035】

本明細書で使用される「Ｉｓｃｏｍアジュバント」は免疫刺激性複合体アジュバントであり、具体的には、抗原を含まないＩｓｃｏｍマトリックス（ＩＳＣＯＭ ＭＡＴＲＩＸ）で、リン脂質、サポニン、コレステロールからなるケージ様構造のアジュバントである。

【0036】

本明細書で使用する「治療及び／又は予防有効量」又は「有効量」とは、投与対象にメリットを表すのに十分な用量を指す。投与に係る実際の用量、投与速度と持続時間は治療対象自身の状況と疾患の程度により決定される。治療処方（例えば、用量の決定など）は最終的には一般開業医又は他の医師が責任を持って決定を下し、一般に考慮するのは治療の対象疾患、患者個体の状況、送達部位、投与方法、医師にとって既知の他の要因である。

【0037】

本明細書で使用する用語「哺乳類」とはヒトを指し、他の動物、例えば、野生動物（例えば、アオサギ、コウノトリ、ツルなど）、家畜（例えば、アヒル、ガチョウなど）又は実験動物（例えば、オランウータン、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、マーモット、ジリスなど）であってもよい。

【0038】

他の一部の実施形態において、本発明に係る組成物は薬学的に許容される担体又は添加物など他の添加物を含んでもよく、特に、薬物製剤として存在する場合はそうである。

【0039】

医薬担体として特に好ましいのは水、水系緩衝液であり、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）などの等張塩溶液、グルコース、マンニトール、デキストロース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール、又はポリアルキレングリコール（例えばポリプロピレングリコール）、トリグリセリドなどが好ましい。使用される医薬担体のタイプは、特に、本発明に係る組成物が経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内投与用に製剤化されるかどうかにより決定される。本発明に係る組成物は、湿潤剤、乳化剤又は液体緩衝物質を添加物として含んでもよい。

【0040】

本発明に係る医薬組成物、ワクチン又は薬物製剤は、任意の適切な経路投与により、例えば、経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内にて投与されることができる。

【0041】

以下、各図を参照して具体的な実施形態で本発明をさらに説明するが、これは本発明への限定ではない。当業者は本発明の趣旨に基づいて、様々な修正又は改善を行うことができ、本発明の趣旨から逸脱していなければ、本発明の範囲に含まれる。

【発明を実施するための形態】

【0042】

以下、特定の実施例を用いて本発明を説明する。これらの実施例が本発明を説明するものに過ぎず、何らかの形で本発明の範囲を限定するものではないことは、当業者にとって理解できるであろう。

【0043】

下記の実施例における実験方法は、特段の説明がない限り、いずれも従来の方法である。下記の実施例で使用する原料、試薬材料などは、特段の説明がない限り、いずれも市販品である。

【0044】

実施例１：組換え帯状疱疹ワクチン組成物の調製方法
１．１ ヘルペスｇＥタンパク質の調製：アミノ酸配列は配列番号１に示すとおりである。

【0045】

文献「『Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ』２０１１，ｖｏｌ１７５，Ｎｏ．１，ｐｐ５３－５９」におけるＴｈｏｍｓｓｏｎ Ｅ，Ｐｅｒｓｓｏｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ．による報告を参照し、ステップの詳細は次のとおりである。
目的タンパク質配列に基づいてその核酸配列を、そのコドンが哺乳類発現系に適合するように最適化し、目的遺伝子を合成した。合成した目的遺伝子を制限酵素消化とライゲーションによりｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドに接続させて、Ｔｏｐ１０コンピテントになるよう形質転換し、陽性シングルクローンをピックアップして、陽性シングルクローンに対し配列決定で検証を行った。シングルクローン菌体を大量に増幅し、内毒素のないプラスミド抽出キットを用いて細胞トランスフェクションに適合するプラスミドを大量に抽出した。一過性トランスフェクションによりプラスミドでＣＨＯ浮遊細胞をトランスフェクションし、ＣＨＯ細胞の活力が７０％未満となり又は発酵時間が７日を超えると、４℃下５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して発酵ブロスの上清を収集した。発酵ブロスを４℃下クロマトグラフィーキャビネットにおいて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールを含む溶液に透析し、透析比は１：１００で、４時間ごとに透析し、合計３回透析した。収集したサンプルをニッケルカラムによって精製し、収集した目的タンパク質のピークサンプルに対しＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行い、比較的純粋な精製液を合わせ、２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液で４℃下クロマトグラフィーキャビネットにおいて２４時間透析し、透析比は１：１００で、８時間ごとに液を交換した。サンプルを０．２２μｍ滅菌フィルターメンブレンで濾過し、４℃の冷蔵庫に保管しておいた。

【0046】

１．２ ＣＰＧオリゴデオキシヌクレオチド原料の調製：
オリゴデオキシヌクレオチドは合成的に調製されたオリゴデオキシヌクレオチド配列フラグメントで、１つ又は複数のＣｐＧモチーフを含み、本実施例で使用するＣＰＧ配列は表１を参照する。

【0047】

【表1】

【0048】

調製方法の詳細は次のとおりである。従来の固相ホスホロアミダイトトリエステル法という化学合成法を用いて調製する。３’末端から開始し、１）脱保護基であって、次のステップの縮合反応への使用に備えるために、最初にトリクロロ酢酸でＣｐＧと結合したヌクレオチドの保護基ＤＭＴ（ジメトキシトリチル基）を除去して、遊離５’ヒドロキシ基を得た。２）活性化であって、ホスホロアミダイトで保護したヌクレオチドモノマーとテトラゾリウム活性化因子とを混合し合成カラムに入れて、ホスホロアミダイトテトラゾール活性中間体を生成し、当該中間体がＣｐＧにおける脱保護されたヌクレオチドと縮合反応する。３）接続であって、ホスホロアミダイトテトラゾール活性中間体がＣｐＧにおける脱保護されたヌクレオチドと遭遇すると、その５’ヒドロキシ基と求核反応を行い、縮合してテトラゾールを除去し、この時にオリゴヌクレオチド鎖が前方に１塩基延長した。４）酸化であって、縮合反応時はヌクレオチドモノマーが亜リン酸エステル結合を介してＣｐＧと結合したオリゴヌクレオチドと接続するが、亜リン酸エステル結合が安定せず、酸又は塩基によって加水分解されやすいので、この場合にチオ試薬を使用してホスホロアミダイトを酸化して硫黄－リン二重結合リン酸トリエステルを得て、安定的なオリゴヌクレオチドを得た。５）ブロッキングであって、縮合反応後はＣｐＧと結合した未反応の５’ヒドロキシ基が次の循環反応において伸長されることを防ぐために、一般にアセチル化によって当該末端ヒドロキシ基をブロッキングする。この５つのステップを経て、１つのデオキシヌクレオチドがＣｐＧのヌクレオチドに接続される。上記の脱保護基、活性化、接続、酸化、ブロッキングのプロセスを繰り返すと粗ＤＮＡフラグメントを得ることができる。最後にそれに切断、脱保護基、精製、定量などの合成後処理を行って完了した。

【0049】

実施例２：ＣＰＧオリゴデオキシヌクレオチドのスクリーニング実験
２．１ 実験動物：
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｎ）マウス、雌、５週齢、４２匹、上海斯莱克実験動物有限責任公司より購入。

【0050】

２．２ 試薬材料：
ＰＢＳ溶液（Ｈｙｃｌｏｎｅ社より購入）を使用して実施例１で得たヘルペスｇＥストック溶液をそれぞれ５０μｇ／ｍＬに希釈し、ＰＢＳ溶液を使用して実施例１で得たＣｐＧをそれぞれ１００μｇ／ｍＬに希釈した。

【0051】

２．３ 実験群設定：
表２を参照し、各マウスへの１回の注射量は１００μＬ／匹であり、コントロール群にＰＢＳ溶液を１００μＬ／匹注射した。

【0052】

【表2】

【0053】

２．４ 動物の免疫化：
全ての群は２週間ごとに１回筋肉内注射を行い、接種部位は右後腿で、２回の連続投与として、それぞれ０週目、２週目に注射投与し、４週目に全てのマウスを殺した。

【0054】

２．５ 検出ステップ：
免疫後７日目にマウスから脾臓を摘出し、従来の方法で次のとおりに脾臓リンパ球を用意した。無菌操作による脾臓の摘出であって、滅菌鉗子とはさみで脾臓を取り出して、７０μｍセルストレーナーに入れ、２ｍＬの予冷後の２％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社より購入）－ＰＢＳを含むプレートに置いた。乳棒で脾臓を研磨し、脾臓細胞がメッシュからプレートに入って、細胞懸濁液を得、パスツールピペットで懸濁液を４０μｍセルストレーナーで濾過した（ＢＤ社より購入）５０ｍＬ滅菌遠心管に入れた。５００×ｇで、４℃下５分間遠心分離した。上清を捨て、２ｍＬの１×赤血球破壊剤（ＢＤ社より購入）を加えて細胞を再懸濁し、４℃下で暗所に５分間静置して、赤血球を破砕させた。１０ｍＬの２％ＦＢＳ－ＰＢＳを加えて赤血球破壊反応を停止させた。５００×ｇで、４℃下５分間遠心分離した。上清を捨て、５ｍＬの２％ＦＢＳ－ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁させておいた。

【0055】

刺激剤としてｇＥ特異的ペプチドプールを使用して脾細胞を刺激した。キットの取扱説明書に従って、ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＢＤ社）を使用してｇＥ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルを検出した。ＩｍｍｕｎｏＳＰＯＴ Ｓｅｒｉｅｓ ３エリスポットアナライザーを用いてＥＬＩＳＰＯＴキットで測定したスポット数を読み取った（操作ステップの詳細は中国特許ＣＮ１０４０４３１２０Ｂの実施例７を参照する）。その中、ｇＥ特異的ペプチドプールの配列は配列番号７～２１を参照する。

【0056】

【表3】

【0057】

２．６ 評価指標：
コントロールウェルのスポット数が５ＳＦＣ以下で、サンプルウェルのスポット数が１０ＳＦＣ以上である場合に、陽性とする。コントロールウェルのスポット数が５ＳＦＣを超えていて１０ＳＦＣ以下であり、サンプルウェルのスポット数／コントロールウェルのスポット数が２以上である場合に、陽性とする。コントロールウェルのスポット数が１０ＳＦＣを超えており、サンプルウェルのスポット数／コントロールウェルのスポット数が３以上である場合に、陽性とする。

【0058】

２．７ 実験結果：
ＥＬＩＳＰＯＴスポット結果は図１を参照し、結果に示すように、ＣＰＧアジュバントの異なるワクチン組成物は免疫効果が似ており、ＣｐＧ７９０９は効果がＣｐＧ Ｔ１～Ｔ３よりやや高く最良で、ＣｐＧ１０１８はＣｐＧ Ｔ１～Ｔ３と免疫効果が同等であった。本発明に係る３つの配列において、ＣｐＧ Ｔ１は効果がＣｐＧＴ２、ＣｐＧ Ｔ３より高く最良であった。したがって、後の実験では主にＣｐＧ Ｔ１、ＣｐＧ７９０９で比較した。

【0059】

実施例３：用量の異なる免疫刺激性組成物の組換え帯状疱疹ワクチン組成物の有効性に対する影響
３．１ 実験動物とモデル確立：
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｎ）マウス、雌、５週齢、７２匹、上海斯莱克実験動物有限責任公司より購入。

【0060】

３．２ 試薬材料：
１）ヘルペスｇＥタンパク質、ＣｐＧ Ｔ１、ＣｐＧ ７９０９はいずれも実施例１より調製した。
２）ＱＳ－２１（ＣＡＳ番号Ａ０１０－０２３、ＢＲＥＮＮＴＡＧ社より購入）。
３）次のステップへの使用に備えるために、ＰＢＳ溶液（Ｈｙｃｌｏｎｅ社より購入）を使用してヘルペスｇＥストック溶液を５０μｇ／ｍＬに希釈し、ＰＢＳ溶液を使用してＱＳ－２１をそれぞれ５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬに希釈し、ＰＢＳ溶液を使用してＣｐＧ Ｔ１を溶解しそれぞれ５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＰＢＳ溶液を使用してＣＰＧ７９０９を溶解し１００μｇ／ｍＬに希釈した。

【0061】

３．３ 実験群設定：
表４を参照し、１回の注射量は１００μＬ／匹であった。コントロール群にＰＢＳ溶液を１００μＬ／匹注射した。

【0062】

３．４ 実験ステップ：実施例２．５と同じであった。

【0063】

３．５ 実験結果：
ＥＬＩＳＰＯＴスポット結果は図２を参照し、結果に示すように、ＣｐＧ Ｔ１とＱＳ２１の用量変化はワクチン組成物の治療効果に明らかな影響があり、ヘルペスｇＥタンパク質と免疫刺激性組成物（ＣｐＧ Ｔ１＋ＱＳ－２１）の比が１：２．１より高いワクチン組成物が誘導産生させたヘルペスｇＥタンパク質特異的ＩＦＮ－γのレベルはＣＰＧ７９０９群より明らかに高く、例えば、表４の用量５～用量９の免疫刺激性組成物であった。しかし種間差異により、アジュバント用量がさらに増えると誘導効果には明らかな増加が認められず、その理由としてマウスにおいてはアジュバントの免疫強度が正しく反映されないことが想定される。

【0064】

表４における用量１、２、４がコントロールのＣＰＧ７９０９群の免疫刺激効果と同等であるものの、アジュバントの使用量は同等なＣＰＧ７９０９群より低いため、予期しなかった技術的効果がある。

【0065】

【表4】

【0066】

実施例４：組換え帯状疱疹ワクチン組成物による細胞性免疫の有効性検証
４．１ 実験動物：
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｎ）マウス、雌、５週齢、４８匹、上海斯莱克実験動物有限責任公司より購入。

【0067】

４．２ 試薬材料：
ＰＢＳ溶液（Ｈｙｃｌｏｎｅ社より購入）を使用して実施例１で得たヘルペスｇＥストック溶液をそれぞれ５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬに希釈し、ＰＢＳ溶液を使用してＱＳ－２１（ＢＲＥＮＮＴＡＧ社より購入され、ＣＡＳ番号はＡ０１０－０２３である）をそれぞれ５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬに希釈し、ＰＢＳ溶液を使用して実施例１で得たＣｐＧをそれぞれ１００μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬに希釈した。

【0068】

４．３ 実験群設定：表５を参照し、各マウスへの１回の注射量は１００μＬ／匹であり、Ａ群は陰性コントロールで、ＰＢＳ溶液を１００μＬ／匹注射した。

【0069】

【表5】

【0070】

４．４ 動物の免疫化：全ての群は２週間ごとに１回筋肉内注射を行い、接種部位は右後腿で、２回の連続投与として、それぞれ０週目、２週目に注射投与し、４週目に全てのマウスを殺した。

【0071】

４．５ 検出ステップ：実施例２．５と同じであった。

【0072】

４．６ 評価指標：実施例２．６と同じであった。

【0073】

４．７ 実験結果：各群のマウスの脾細胞のｇＥ特異的ＩＦＮ－γを分泌するＴリンパ球のスポット数レベルを図３に示し、ｇＥ特異的ＩＦＮ－γの陽転率結果を表６に示す。結果から分かるように、高用量免疫のＥ、Ｆ群に対応する脾細胞のｇＥ特異的ＩＦＮ－γを分泌するＴリンパ球のスポット数レベル（４０００ＳＦＣ／１０６脾細胞を超えている）がいずれも低用量のＧ、Ｈ群より明らかに高かった。Ｅ群、Ｇ群（ＣｐＧ Ｔ１＋ＱＳ－２１）に対応する脾細胞のｇＥ特異的ＩＦＮ－γを分泌するＴリンパ球のスポット数レベルは同じ用量のＦ群、Ｈ群（ＣｐＧ７９０９＋ＱＳ－２１）より高く、Ｅ～Ｈ群のＩＦＮ－γの陽転率はいずれも１００％であった。

【0074】

【表6】

【0075】

実施例５：組換え帯状疱疹ワクチン組成物による体液性免疫の有効性検証
５．１ 実験動物：
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｎ）マウス、雌、５週齢、４８匹、上海斯莱克実験動物有限責任公司より購入。

【0076】

５．２ 試薬材料：実施例３．２と同じであった。

【0077】

５．３ 実験群設定：実施例３．３と同じであった。

【0078】

５．４ 動物の免疫化：全ての群は２週間ごとに１回筋肉内注射を行い、接種部位は右後腿で、２回の連続投与として、それぞれ０週目、２週目に注射投与した。

【0079】

５．５ 検出ステップ：免疫後２８日目に採血し、血清の分離（全血を３７℃恒温インキュベーターに４０分間静置し、１２０００ｒｐｍで、４℃下１０分間遠心分離した。上清を吸い取って、－２０℃で冷凍保管しておいた。）を行い、キット取扱説明書に従って、ＥＬＩＳＡキット（上海科華）を使用して、産生されたヘルペスｇＥタンパク質特異的抗体陽転率を検出した。検出ではブランクコントロール、陰性コントロール、被験サンプルを設け、各２つのパラレルウェルとし、そのうち、陰性コントロールは陰性のマウス血清であった。ブランクコントロールを除いて、各ウェルにそれぞれ陰性コントロール又は被験サンプルを加え、そして酵素コンジュゲートを加えて、均一に混合してシールした後、３７℃下３０分間インキュベートした。洗浄液を使用して各ウェルを洗浄し、各ウェルに発色剤のＡ液、発色剤のＢ液を加え、均一に混合してシールした後、３７℃下１５分間インキュベートした。各ウェルに停止液を加えて均一に混合した。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの波長における各ウェルのＯＤ値を読み取った。

【0080】

５．６ 実験結果：ＥＬＩＳＡによるマウス血清中の抗原特異的ＩｇＧ抗体とサブタイプレベルの検出を図４に示し、図中、パネルＡは各群のマウスの血清ＩｇＧレベルである。パネルＢは各群のマウスの血清ＩｇＧ１レベルである。パネルＣは各群のマウスの血清ＩｇＧ２ａレベルである。パネルＤは各群のマウスの血清ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１の比の値である。

【0081】

結果から分かるように、本発明に係る免疫刺激剤を含むＥ群は免疫効果が単独のＣｐＧ群（Ｃ群）、ＱＳ－２１群（Ｄ群）、二重アジュバントコントロール（Ｆ群）より明らかに優れており、しかも対応するＩｇＧとＩｇＧ２ａ抗体レベルは２群と明らかに差があり、つまりＱＳ－２１にＣｐＧを加えると対応する体液性免疫レベルを高めることができる。

【0082】

実施例６：組換え帯状疱疹ワクチン組成物の有効性に対する異なるサポニンの影響
６．１ 実験動物とモデル確立：
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｎ）マウス、雌、５週齢、４８匹、上海斯莱克実験動物有限責任公司より購入。

【0083】

６．２ 試薬材料：
１）ヘルペスｇＥタンパク質、ＣｐＧ Ｔ１、ＣｐＧ ７９０９はいずれも実施例１より調製した。
２）ＱＳ－２１（ＣＡＳ番号Ａ０１０－０２３、ＢＲＥＮＮＴＡＧ社より購入）、ギンセノシドＲｇ１（ＣＡＳ：２２４２７－３９－０、南京春秋生物工程有限公司より購入）、アストラガロシドＡ（ＣＡＳ：８４６８７－４３－４、南京春秋生物工程有限公司より購入）、プラチコジンＤ（ＣＡＳ：５８４７９－６８－８、湖北雲▲ビ▼科技有限公司より購入）、Ｉｓｃｏｍアジュバント（上海熹垣生物科技有限公司より購入）。
３）次のステップへの使用に備えるために、ＰＢＳ溶液（Ｈｙｃｌｏｎｅ社より購入）を使用してヘルペスｇＥストック溶液を５０μｇ／ｍＬに希釈し、ＰＢＳ溶液を使用して各サポニンをそれぞれ５０μｇ／ｍＬに希釈し、ＰＢＳ溶液を使用してＣｐＧ Ｔ１、ＣｐＧ ７９０９をそれぞれ溶解し１００μｇ／ｍＬに希釈した。

【0084】

６．３ 実験群設定：
表７を参照し、１回の注射量は１００μＬ／匹であった。コントロール群にＰＢＳ溶液を１００μＬ／匹注射した。

【0085】

６．４ 実験ステップ：実施例２．５と同じであった。

【0086】

６．５ 実験結果：
ＥＬＩＳＰＯＴスポット結果は図５を参照し、結果に示すように、ＣｐＧ Ｔ１は各サポニンと併用するといずれも効率的な相乗効果が得られ、誘導産生されたｇＥ特異的ＩＦＮ－γレベルは明らかに他のＣｐＧとサポニンの組成物より高く、そのなか、ＱＳ－２１の効果が最も優れている。

【0087】

【表7】

【0088】

以上から分かるように、本発明に係る帯状疱疹ワクチンは優れた免疫刺激効果を有し、細胞性免疫実験で当該ワクチンは強いヘルペスｇＥタンパク質特異的ＩＦＮ－γレベルを誘導産生でき、タンパク質による免疫効果が明らかに単独のアジュバントより優れていることが証明される。

【0089】

上記で本発明を詳細に説明しているが、当業者は、本発明の趣旨と範囲から逸脱しない限り本発明に様々な修正と変更を行うことが可能であると理解するべきである。本発明の保護範囲は上記の詳細な説明に限定されず、前記修正と変更も特許請求の範囲に属する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

2023506441000001.app

【国際調査報告】