▶ フンダシオ インスティトゥト ディンベスティガシオ ビオメディカ デ ベイビジャ（イ デ イ ベ エ エレ エレ）の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-20
(54)【発明の名称】免疫調節のための化合物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230213BHJP
C07K 14/46 20060101ALI20230213BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20230213BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230213BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230213BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230213BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230213BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230213BHJP
C12N 5/0784 20100101ALI20230213BHJP
C12N 5/0786 20100101ALI20230213BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20230213BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230213BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230213BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230213BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230213BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20230213BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230213BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C07K14/46
C07K14/47
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12N1/21
C12N1/15
C12N5/10
C12N5/0784
C12N5/0786
A61K38/02
A61K31/7088
A61K35/12
A61K48/00
A61P37/06
A61K35/15 A
A61K38/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022523140
(86)(22)【出願日】2020-10-19
(85)【翻訳文提出日】2022-06-09
(86)【国際出願番号】 EP2020079374
(87)【国際公開番号】W WO2021074449
(87)【国際公開日】2021-04-22
(31)【優先権主張番号】19382910.8
(32)【優先日】2019-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515040737
【氏名又は名称】フンダシオ インスティトゥト ディンベスティガシオ ビオメディカ デ ベイビジャ（イ デ イ ベ エ エレ エレ）
【氏名又は名称原語表記】ＦＵＮＤＡＣＩＯ ＩＮＳＴＩＴＵＴ Ｄ’ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡ ＤＥ ＢＥＬＬＶＩＴＧＥ （ＩＤＩＢＥＬＬ）
(74)【代理人】
【識別番号】100091487
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 行孝
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】ホセプ、エメ．アラン、ペラモン
(72)【発明者】
【氏名】アナ、ルケ、ゴメス
(72)【発明者】
【氏名】インマクラーダ、セラーノ、サンタクルス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC12
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB19
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084BA03
4C084NA13
4C084ZB08
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB08
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZB08
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA05
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA22
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、免疫学的疾患の予防および／または治療における使用のための、Ｃ４ＢＰのＣＣＰ６領域の組換え型およびオリゴマー化ドメインに基づく化合物に関する。さらに、本発明は、本発明の化合物を用いて寛容原性樹状細胞および寛容原性マクロファージを得るための方法、ならびにこれらの方法によって得られる細胞およびそれらの治療的使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に同等の変異体、およびオリゴマー化ドメインを含む組換えポリペプチドであって、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４、ＣＣＰ５、ＣＣＰ７およびＣＣＰ８ドメインのいずれも含まない、前記組換えポリペプチド。
【請求項2】
前記Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインが配列番号１である、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項3】
前記オリゴマー化ドメインが配列番号２またはその機能的に同等の変異体であり、好ましくは配列番号２である、請求項１または２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項4】
前記ポリペプチドが配列番号３またはその機能的に同等の変異体からなり、好ましくは配列番号３からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項5】
前記ポリペプチドが配列番号５、配列番号７およびそれらの機能的に同等の変異体からなる群から選択される配列からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項6】
前記ポリペプチドが配列番号６またはその機能的に同等の変異体からなり、好ましくは配列番号６からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の少なくとも６つの組換えポリペプチドのホモオリゴマー。
【請求項8】
前記ホモオリゴマーが、請求項１～６のいずれか一項に記載の７つの組換えポリペプチドによって形成される、請求項７に記載のホモオリゴマー。
【請求項9】
前記ポリペプチドが配列番号６からなるポリペプチドである、請求項７または８に記載のホモオリゴマー。
【請求項10】
医薬における使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド、請求項７～９のいずれか一項に記載のホモオリゴマー、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む宿主細胞、または前記組換えポリペプチド、前記ホモオリゴマー、前記ポリヌクレオチド、前記ベクターもしくは前記宿主細胞と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項11】
免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防および／または治療における使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド、請求項７～９のいずれか一項に記載のホモオリゴマー、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む宿主細胞、または前記組換えポリペプチド、前記ホモオリゴマー、前記ポリヌクレオチド、前記ベクターもしくは前記宿主細胞と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項12】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで寛容原性樹状細胞の集団を生成するための方法であって、（ｉ）未成熟樹状細胞の集団の形成に適切な条件下で樹状前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟樹状細胞の形成に適切な条件下で、前記工程（ｉ）で得られた未成熟樹状細胞の集団をインキュベートする工程
を含み、
前記工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド、
（ｂ）請求項７～９のいずれか一項に記載のホモオリゴマー、
（ｃ）請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｄ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドを含むベクター
からなる群から選択される物質を含む組成物の存在下で行われる、前記方法。
【請求項13】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで寛容原性マクロファージの集団を生成するための方法であって、（ｉ）未成熟マクロファージの集団の形成に適切な条件下でマクロファージ前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟マクロファージの形成に適切な条件下で、前記工程（ｉ）で得られた未成熟マクロファージの集団をインキュベートする工程
を含み、
前記工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド、
（ｂ）請求項７～９のいずれかに記載のホモオリゴマー、
（ｃ）請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｄ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドを含むベクター
からなる群から選択される物質を含む組成物の存在下で行われる、前記方法。
【請求項14】
請求項１２に記載の方法によって得られる寛容原性樹状細胞、または請求項１３に記載の方法によって得られる寛容原性マクロファージであって、好ましくはＦＰＲ２ｈｉｇｈ、Ｐ２ＲＹ２ｈｉｇｈおよび／またはＳ１ＰＲ１ｈｉｇｈである前記寛容原性樹状細胞、またはＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈ、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよび／またはＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである前記マクロファージ。
【請求項15】
免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防および／または治療における使用のための、請求項１４に記載の寛容原性樹状細胞または寛容原性マクロファージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫学の分野、より具体的には、単核食細胞において寛容原性状態を誘導することができるＣ４ＢＰのＣＣＰ６領域の組換え型に基づく化合物、ならびに免疫系の望ましくない活性化を特徴とする疾患の予防および／または治療のためのその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
単核食細胞系（ＭＰＳ）は、特にケモカインおよびサイトカインメディエーターを分泌し、免疫細胞および非免疫細胞の移動と活性化ならびに自身の移動をもたらす能力を含む、多くの機能的特徴を共有する骨髄細胞のネットワークを指す。ＭＰＳは、樹状細胞、マクロファージおよび単球により構成されている。
【0003】
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫系の専門的なＡＰＣである。未成熟な段階において、ＤＣは食作用または飲作用によって細胞外抗原を取り込み、エンドソームやファゴソーム等のエンドサイトーシス区画内で抗原をペプチドに処理し、ペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。それらはまた、外因性タンパク質からＭＨＣクラスＩ提示経路（「交差提示」と呼ばれるプロセス）にペプチドを供給する独自の能力を有している。適切な分化シグナル（微生物生成物等）が供給されると、未成熟ＤＣは、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞の両方を活性化する能力を備える免疫原性ＤＣに発達し得る。一方の領域では、未成熟ＤＣは寛容原性表現型に分化し得、これは末梢性寛容の維持に重要な役割を果たすと考えられている（Steinman, Ann. Rev. Immunol. 2003, 21: 685-711; Morelli, Immunol Rev 2003: 125-146）。
【0004】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで寛容原性ＤＣを生成するための多数のプロトコルが説明されている（Xiao et al., J. lmmunother. 2006 (29) 465-471）。最もよく特徴付けられている方法は、薬理学的メディエーター（ビタミンＤ３アナログ、グルココルチコイド、エストロゲンを含む免疫抑制薬等）、サイトカインおよび成長因子（ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＩＬ－４およびＩＦＮ－γ等）または遺伝子工学を用いるものであり、Ｔ細胞共刺激分子（ＣＤ８６やＣＤ４０等）の発現を抑制するか、Ｔ細胞阻害分子（ＣＴＬＡ－４やインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ等）の発現を増強する。
【0005】
近年、補体調節因子であるＣ４ｂ結合タンパク質の生理学的アイソフォームα７β０が、樹状細胞において半成熟の抗炎症状態を誘導することが示された（Olivar R. et al. 2013. J. Immunol., 190:2857-2872）。
【0006】
一方、他の化合物の中でも、デキサメタゾン、ＩＬ－１０もしくはＴＧＦ－β等の糖質コルチコイド、またはＭ－ＣＳＦ＋ＩＦＮγもしくはＭ－ＣＳＦ＋ＬＰＳの組み合わせの使用を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの寛容原性または調節性マクロファージの生成のためのいくつかのプロトコルが説明されている（Mosser DM and Edwards JP. 2008. Nat. Rev. Immunol. 8:958-969；Zheng G. et al. 2013. Eur. J. Immunol. 43:219-227；Navarro-Barriuso J. et al. 2018. Front. Immunol. 9:2062；Foey AD. 2014. Immune response activation, Chapter 5: Macrophages: masters of immune activation, suppression and deviation, Publisher: InTech, Editors: Guy Huynh Thien Duc, pp.121-149）。
【0007】
現在、自己免疫疾患に関して米国ＦＤＡによって承認された治療法の大部分は、免疫炎症活性の全身的阻害に焦点を合わせたものである。非特異的免疫抑制は自己反応性免疫細胞機能の阻害に部分的に効果的であるものの、免疫応答を抑制するために用いられる薬剤には多くの副作用があり、継続的な治療は被治療者の長期の生存につながるものではない。したがって、感染を除去する免疫系の能力を維持しながら、自己反応性免疫細胞機能の有害な影響を特異的に遮断することを可能にする自己抗原特異的治療（auto-antigen-specific treatment）を開発することが望ましい。したがって、抗原特異的免疫寛容を効率的に誘導することができる、適切な装備を有するＤＣを生成する方法が強く求められている。
【0008】
さらに、ｅｘ ｖｉｖｏで生成された適切な寛容原性機能を有するＤＣは、アレルギーの治療および移植寛容の誘導のための治療ワクチンとしても実施することができる。自己免疫疾患の免疫療法と同様に、有害な免疫応答の効率的な抑制には、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の寛容誘導が関与している。したがって、ｅｘ ｖｉｖｏで生成された寛容原性ＤＣは、自己免疫疾患やアレルギーの治療、および移植片拒絶の予防について同じ特性を有するはずであると期待される。
【0009】
しかしながら、明確な寛容原性表現型を有し、寛容原性決定因子の発現を有する寛容原性の樹状細胞およびマクロファージを産生するための新たな代替方法は、常にこの分野における研究の継続的な目標である。
【発明の概要】
【0010】
第１の態様において、本発明は、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に同等の変異体、およびオリゴマー化ドメインを含む組換えポリペプチドであって、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４、ＣＣＰ５、ＣＣＰ７およびＣＣＰ８ドメインのいずれも含まない前記組換えポリペプチドに関する。
【0011】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の少なくとも６つの組換えポリペプチドのホモオリゴマーに関する。
【0012】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【0013】
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【0014】
第５の態様において、本発明は、本発明の第４の態様のベクターを含む宿主細胞に関する。
【0015】
第６の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の組換えポリペプチド、本発明の第２の態様のホモオリゴマー、本発明の第３の態様のポリヌクレオチド、本発明の第４の態様のベクター、または本発明の第５の態様の宿主細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。
【0016】
さらなる態様において、本発明は、医薬における使用のため、特に免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防および／または治療における使用のための、本発明の組換えポリペプチド、ホモオリゴマー、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または医薬組成物に関する。
【0017】
別の態様において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで寛容原性樹状細胞の集団を生成するための方法であって、
（ｉ）未成熟樹状細胞の集団の形成に適切な条件下で樹状前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟樹状細胞の形成に適切な条件下で、前記工程（ｉ）で得られた未成熟樹状細胞の集団をインキュベートする工程
を含み、
前記工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）本発明のポリペプチド、
（ｂ）本発明のホモオリゴマー、
（ｃ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｄ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質を含む組成物の存在下で行われる前記方法に関する。
（ｉ）未成熟樹状細胞の集団の形成に適切な条件下で樹状前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟樹状細胞の形成に適切な条件下で、前記工程（ｉ）で得られた未成熟樹状細胞の集団をインキュベートする工程
を含み、
前記工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）本発明のポリペプチド、
（ｂ）本発明のホモオリゴマー、
（ｃ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｄ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質を含む組成物の存在下で行われる前記方法に関する。
【0018】
別の態様において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで寛容原性マクロファージの集団を生成するための方法であって、
（ｉ）未成熟マクロファージの集団の形成に適切な条件下でマクロファージ前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟マクロファージの形成に適切な条件下で、前記工程（ｉ）で得られた未成熟マクロファージの集団をインキュベートする工程
を含み、
前記工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）本発明のポリペプチド、
（ｂ）本発明のホモオリゴマー、
（ｃ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｄ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質を含む組成物の存在下で行われる前記方法に関する。
（ｉ）未成熟マクロファージの集団の形成に適切な条件下でマクロファージ前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟マクロファージの形成に適切な条件下で、前記工程（ｉ）で得られた未成熟マクロファージの集団をインキュベートする工程
を含み、
前記工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）本発明のポリペプチド、
（ｂ）本発明のホモオリゴマー、
（ｃ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｄ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質を含む組成物の存在下で行われる前記方法に関する。
【0019】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の方法によって得られる寛容原性樹状細胞または寛容原性マクロファージ、それらの細胞を少なくとも８０％含む細胞集団、本発明の細胞または集団を含む医薬組成物、および医薬、特に免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防および／または治療のための医薬における本発明の細胞の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＮＯの未成熟配列。（Ａ）ＰＲＰ６－ＨＯ７のペプチドおよびＤＮＡの未成熟配列。本図は、シグナルペプチド、ヒスチジンタグ、ＣＣＰ６ドメインおよびオリゴマー化ドメインの配列を示す。予測されるＰＲＰ６－ＨＯ７の分子量は１９．６ｋＤａであり、シグナルペプチドなしで１４．３ｋＤａである。（Ｂ）ＰＲＰ６－ＮＯのペプチドおよびＤＮＡの未成熟配列。本図は、シグナルペプチド、ヒスチジンタグ、ＣＣＰ６ドメインおよびオリゴマー化ドメインの配列を示す。ＰＲＰ６－ＮＯでは、元のオリゴマー化配列が、２つのシステイン残基をアラニンで置換し（太字）、Ｃ末端の最後の１３個のアミノ酸を除去することにより改変されている。予測されるＰＲＰ６－ＮＯの分子量は１８ｋＤａであり、シグナルペプチドなしで１２．７ｋＤａである。
【図2】ＰＲＰ６－ＨＯ７の分子モデリング。ＧａｌａｘｙＨｏｍｏｍｅｒサーバー（http://galaxy.seoklab.org/homomer）を用いたモノマー配列／構造からのＰＲＰ６－ＨＯ７ホモオリゴマーの構造予測（Baek et al. (2017) Nucleic Acids Res. 45: W320-W324）。
【図3】ＰＡＧＥによるＰＲＰ６－ＨＯ７タンパク質およびＰＲＰ６－ＮＯタンパク質の可視化。（Ａ）還元条件下（Ｒ）（モノマー、それぞれ１４．３ｋＤａおよび１２．７ｋＤａ）および非還元条件下（ＮＲ）（オリゴマー、１００ｋＤａ）における精製されたＰＲＰ６－ＨＯ７タンパク質およびＰＲＰ６－ＮＯタンパク質の１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析およびＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色。（Ｂ）非還元条件下（ＮＲ；左）で抗Ｈｉｓ ＭｏＡｂでプローブした場合、および還元条件下（Ｒ；右）で抗Ｃ４ＢＰα鎖ポリクローナル抗体でプローブした場合における、精製されたＰＲＰ６－ＨＯ７タンパク質およびＰＲＰ６－ＮＯタンパク質のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ４～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタン分析。
【図4】ＰＲＰ６－ＮＯではなくＰＲＰ６－ＨＯ７によって、ＬＰＳにより活性化されたＤＣにおけるＣＤ８３およびＣＤ８６の発現が下方調節される。ヒトＭｏ－ＤＣは、その分化プロセス全体を通じて、いずれも１２ｎＭのＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＥ８（Ｃ４ＢＰ（β＋）、ＰＲＰ（Ｃ４ＢＰ）の不活性アイソフォームに対応する）、ＰＲＰ６－ＨＯ７（３２ｎＭ）およびＰＲＰ６－ＮＯ（３２ｎＭおよび２２４ｎＭ）と共にインキュベートされた。ＤＣの成熟は、ＬＰＳ処理によって達成された（詳細は、材料と方法を参照されたい。）。次いで、細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによって活性化マーカーＣＤ８３および共刺激分子ＣＤ８６の細胞表面発現を分析した。ＭＦＩは様々な表面マーカーの蛍光強度の中央値である。ＬＰＳはリポ多糖である。ｉＤＣは未処理の未成熟ＤＣであり；ｍＤＣは未処理のＬＰＳで成熟させたＤＣである。示される結果は、６回の独立した実験に基づく平均±ＳＤである（ｍＤＣに対して＊＊はｐ＜０．０１であり；＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である。）。
【図5】ＰＲＰ６－ＮＯではなくＰＲＰ６－ＨＯ７による処理によって、ヒトｉＤＣのエンドサイトーシス活性が増大する。ｉＤＣのエンドサイトーシス活性は、分化段階において蛍光ＤＱ－ＯＶＡの内部移行およびプロセシング（受容体を介したエンドサイトーシス）を測定して、フローサイトメトリーによって評価された。単球は、未処理のまま（ｉＤＣ）、またはＰＲＰ－ＨＥ８およびＰＲＰ－ＨＯ７（いずれも１２ｎＭ）、ならびにＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＮＯ（いずれも３２ｎＭ）で処理して分化させた。ＭＦＩは蛍光強度の中央値である。ｉＤＣは未処理の未成熟ＤＣである。示されるデータは、５回の独立した実験に基づく平均ＭＦＩ±ＳＤである（ｉＤＣに対して＊はｐ＜０．０５である。）。
【図6】ＰＲＰ６－ＮＯではなくＰＲＰ６－ＨＯ７によって、ＬＰＳにより活性化されたＤＣにおける炎症性サイトカイン産生が調節される。様々なＰＲＰベースタンパク質：ＰＲＰ－ＨＥ８、ＰＲＰ－ＨＯ７（いずれも１２ｎＭ；５μｇ／ｍｌ）、およびＰＲＰ６－ＨＯ７、ＰＲＰ６－ＮＯ（いずれも３２ｎＭ；３μｇ／ｍｌ）で処理されたＭｏ－ＤＣをＬＰＳで成熟させ、それぞれの上清におけるＩＬ－１２ｐ７０およびＴＮＦ－αの濃度をＥＬＩＳＡによって分析した。示される結果は、重複して行われた５回の独立した実験の平均±ＳＤである。ＬＰＳはリポ多糖であり；ｉＤＣは未処理の未成熟ＤＣであり；ｍＤＣは未処理のＬＰＳで成熟させたＤＣである（ｍＤＣに対して＊はｐ＜０．０５であり；＊＊はｐ＜０．０１であり；＊＊＊はｐ＜０．００１である。）。
【図7】ＰＲＰ６－ＨＯ７には補体阻害活性がない。（Ａ）第Ｉ因子を介したＣ４ｂの切断に対するＰＲＰ－ＨＥ８およびＰＲＰ－ＨＯ７の補因子活性の概略図。第Ｉ因子によるＣ４ｂの切断には、特定の補因子、この場合はＰＲＰ－ＨＥ８／ＰＲＰ－ＨＯ７の存在が必要である。第Ｉ因子は、矢印で示される２つの部位でＣ４ｂのα’鎖を切断する。２つの部位のいずれか１つで切断されると、α３－Ｃ４ｄ（７０ｋＤａ）およびα４（１４ｋＤａ）、またはα３（２５ｋＤａ）およびＣ４ｄ－α４（５９ｋＤａ）の断片が生成され、これらは還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥの後に見られる。Ｃ４ｂのα’鎖をさらに切断することにより、大きな可溶性のＣ４ｃ（１４６ｋＤａ）断片、および標的との結合を維持する小さなＣ４ｄ（４５ｋＤａ）断片が生成される。（Ｂ）補因子活性のアッセイ。示された濃度のＰＲＰ－ＨＥ８、ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７（レーン３～７）を、Ｃ４ｂ（８．９μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、次いで第Ｉ因子（４．４μｇ／ｍｌ）を添加した。反応対照には、Ｃ４ｂのみ、およびＣ４ｂ＋ＦＩが含まれていた。３０分後にＳＤＳ還元サンプルバッファーですべての反応を停止させた。Ｃ４ｂ切断断片を還元条件下の４～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、次いで抗Ｃ４ｄＭｏＡｂを用いてウエスタンブロッティングを行った。Ｃ４ｂ断片はゲルの左側に表示されている。補因子活性は、α３－Ｃ４ｄ（７０ｋＤａ）またはＣ４ｄ（４５ｋＤａ）の出現によって確認された。ＦＩは第Ｉ因子である。結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図8】ＰＲＰ６－ＨＯ７で処理され、ＬＰＳにより活性化されたＤＣにおける表面マーカーの発現。ヒトＭｏ－ＤＣは、その分化プロセス全体を通じて、いずれも１２ｎＭのＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＥ８、ならびにＰＲＰ６－ＨＯ７（３２ｎＭ）と共にインキュベートされた。ＤＣの成熟は、ＬＰＳ処理によって達成された。次いで、細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによってＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ１４の細胞表面発現を分析した。ＭＦＩは様々な表面マーカーの蛍光強度の中央値である。ＬＰＳはリポ多糖である。ｉＤＣは未処理の未成熟ＤＣであり；ｍＤＣは未処理のＬＰＳで成熟させたＤＣである。示される結果は、５回の独立した実験に基づく平均±ＳＤである（ｍＤＣに対して＊はｐ＜０．０５であり；＊＊はｐ＜０．０１であり；＊＊＊はｐ＜０．００１である。）。
【図9】ＰＲＰ６－ＨＯ７によって、５０％ヒト血清で増殖したＬＰＳにより活性化されたＤＣにおけるＣＤ８３およびＣＤ８６の発現が下方調節される。ヒトＭｏ－ＤＣは、５０％熱不活化ヒト血清を添加したＲＰＭＩ１６４０細胞培養培地中で、その分化プロセス全体を通して、いずれも１２ｎＭのＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＥ８、ならびに所定の濃度のＰＲＰ６－ＨＯ７と共にインキュベートされた。ＤＣの成熟は、ＬＰＳ処理によって達成された。次いで、細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによってＣＤ８３およびＣＤ８６の細胞表面発現を分析した。ＭＦＩは様々な表面マーカーの蛍光強度の中央値である。ＬＰＳはリポ多糖である。ｉＤＣは未処理の未成熟ＤＣであり；ｍＤＣは未処理のＬＰＳで成熟させたＤＣである。示される結果は、５回の独立した実験に基づく平均±ＳＤである（ｍＤＣに対して＊はｐ＜０．０５であり；＊＊はｐ＜０．０１である。）。
【図10】ＰＲＰ６－ＨＯ７により、Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄにより活性化された（gardiquimod-activated）ＤＣにおけるＣＤ８３およびＣＤ８６表面マーカーの発現が下方調節される。ヒトＭｏ－ＤＣは、その分化プロセス全体を通じて、いずれも１２ｎＭのＰＲＰ－ＨＥ８およびＰＲＰ－ＨＯ７、ならびにＰＲＰ６－ＨＯ７（３２ｎＭ）と共にインキュベートされた。ＤＣの成熟は、Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ（ＴＬＲ７アゴニスト）処理によって達成された（詳細は、材料と方法を参照されたい。）。次いで、細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによってＣＤ８３およびＣＤ８６の細胞表面発現を分析した。ＭＦＩは様々な表面マーカーの蛍光強度の中央値である。ｉＤＣは未処理の未成熟ＤＣであり；ｍＤＣは未処理のＧａｒｄｉｑｕｉｍｏｄによって成熟させた（gardiquimod-matured）ＤＣである。示される結果は、５回の独立した実験に基づく平均±ＳＤである（ｍＤＣに対して＊はｐ＜０．０５であり；＊＊はｐ＜０．０１である。）。
【図11】ＰＲＰ６－ＨＯ７により、ループス腎炎患者から分離されたＬＰＳおよびＧａｒｄｉｑｕｉｍｏｄの両方により活性化されたＤＣにおける表面マーカーの発現が下方調節される。ループス腎炎患者のヒトＭｏ－ＤＣは、その分化プロセス全体を通して、いずれも１２ｎＭのＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＥ８、ならびにＰＲＰ６－ＨＯ７（３２ｎＭ）と共にインキュベートされた。ＤＣの成熟は、（Ａ）ＬＰＳ処理または（Ｂ）Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ処理のいずれかによって達成された。次いで、細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによってＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０およびＣＤ８０の細胞表面発現を分析した。ＭＦＩは様々な表面マーカーの蛍光強度の中央値である。ＬＰＳはリポ多糖である。ｉＤＣは未処理の未成熟ＤＣであり；ｍＤＣは未処理のＬＰＳまたはＧａｒｄｉｑｕｉｍｏｄによって成熟させたＤＣである。示される結果は、４回の独立した実験に基づく平均±ＳＤである（ｍＤＣに対して＊はｐ＜０．０５であり；＊＊はｐ＜０．０１である。）。
【図12】ＰＲＰ６－ＨＯ７により、ＣＣＲ７の発現が下方調節され、ヒトＤＣの走化性が変化する。（Ａ）翻訳レベルでのＤＣのＣＣＲ７発現分析。ＰＲＰベースタンパク質によって処理し、ＬＰＳによって成熟させたＤＣにおけるＣＣＲ７の表面発現。ＣＣＲ７の細胞表面発現のＭＦＩが示される。示される結果は、７回の独立した実験に基づく平均±ＳＤである。（ｍＤＣに対して＊＊はｐ＜０．０１である。）。（Ｂ）未処理のＤＣ、ＰＲＰ－ＨＥ８（１２ｎＭ）によって処理されたＤＣ、ＰＲＰ－ＨＯ７（１２ｎＭ）によって処理されたＤＣ、およびＰＲＰ６－ＨＯ７（３２ｎＭ）によって処理されたＤＣの、ＬＰＳによる成熟後のケモカインＣＣＬ２１への移動がトランスウェルアッセイで評価された。示されるのは、２時間のインキュベーション後にＣＣＬ２１を含む下部チャンバーに向かって移動した、ＬＰＳによって成熟されたＤＣ（ｍＤＣ）の絶対数である（黒色のカラム）。ＣＣＬ２１を含まない下部チャンバーへのＤＣの自発的移動も評価された（灰色のカラム）。結果は、重複して行われた７つの独立した実験に基づく平均±ＳＤである。ＭＦＩはＣＣＲ７表面マーカーの蛍光強度の中央値である。ＬＰＳはリポ多糖ある。ｉＤＣは未処理の未成熟ＤＣであり；ｍＤＣは未処理のＬＰＳによって成熟させたＤＣであり；ＰＲＰ－ＨＥ８、ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７はＰＲＰベースタンパク質によって処理された、ＬＰＳよって成熟させたＤＣである。（ｍＤＣに対して＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である。）。
【図13】ＰＲＰ６－ＨＯ７に曝露されたヒトＤＣにより、分化時にＰＴＧＥＲ３およびＥＧＬＮ３が下方調節される。分化の４日目および５日目における未処理の未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）と比較した、ＰＲＰ－ＨＥ８により処理されたＤＣ、ＰＲＰ－ＨＯ７により処理されたＤＣ、またはＰＲＰ６－ＨＯ７により処理されたＤＣのＰＴＧＥＲ３およびＥＧＬＮ３の転写産物の発現（ｎ＝１）。遺伝子発現データはＬｏｇ２ＦＣ（ＦＣは倍率変化である。）として表される。特定された遺伝子の相対的な発現データは、トータルＲＮＡ抽出およびＴａｑＭａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ検証により得られた。Ｌｏｇ２ＦＣ値は、未処理のｉＤＣと比較した平均＋ＳＤ（２つの技術的再現／サンプル（2 technical replicates/sample）として表される。
【図14】ＰＲＰ６－ＨＯ７に曝露されたヒトＤＣにより、分化時に嗅覚受容体が上方調節される。分化の５日目における未処理の未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）と比較した、ＰＲＰ－ＨＥ８により処理されたＤＣ、ＰＲＰ－ＨＯ７により処理されたＤＣ、またはＰＲＰ６－ＨＯ７により処理されたＤＣの「ｆｉｎｄ ｍｅ」または嗅覚受容体ＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＦＰＲ２、ＧＰＲ１３２、Ｐ２ＲＹ２およびＳ１ＰＲ１の転写産物の発現。遺伝子発現データはＬｏｇ２ＦＣ（ＦＣは倍率変化である。）として表される。特定された遺伝子の相対的な発現データは、トータルＲＮＡ抽出およびＴａｑＭａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ検証により得られた。Ｌｏｇ２ＦＣ値は、４回の独立した実験に基づく平均＋ＳＤとして表される（未処理のｉＤＣに対して＊はｐ＜０．０５である。）。
【図15】ＰＲＰ６－ＨＯ７により、ヒトマクロファージのＭ１およびＭ２の分極が妨げられる。（Ａ）Ｍ１マーカーの発現。（Ｂ）Ｍ２マーカーの発現。ヒト単球は、未分化の（uncommitted）マクロファージ（Ｍ０）への分化、炎症性マクロファージ（Ｍ１）または活性化マクロファージ（Ｍ２）へのさらなる分極の全体を通して、いずれも１２ｎｍのＰＲＰ－ＨＥ８およびＰＲＰ－ＨＯ７、ならびにＰＲＰ６－ＨＯ７（３２ｎＭ）と共にインキュベートされた（詳細は、材料と方法を参照されたい。）。次いで、細胞を収集し、洗浄し、フローサイトメトリーによってＣＤ６４およびＣＤ８０（Ｍ１マーカー）、またはＣＤ２０９およびＣＤ１１ｂ（Ｍ２マーカー）の細胞表面発現を分析した。ＭＦＩは様々な表面マーカーの蛍光強度の中央値である。Ｍ０は未処理の未分化のマクロファージであり；Ｍ１／Ｍ２は、未処理のＭ１またはＭ２に分極したマクロファージである。示される結果は、５回の独立した実験に基づく平均±ＳＤである（Ｍ１／Ｍ２に対して＊はｐ＜０．０５であり；＊＊はｐ＜０．０１であり；＊＊＊はｐ＜０．００１である。）。
【図16】ＰＲＰ６－ＨＯ７に曝露されたヒトＭ０マクロファージにより、分化時にＡＬＣＡＭ、ＳＬＣ１６Ａ１およびＬＭＮＢ１が下方調節される。分化の１日目、２日目、４日目および６日目における未処理の未分化の（Ｍ０）マクロファージと比較した、ＰＲＰ－ＨＥ８により処理された分化マクロファージ、ＰＲＰ－ＨＯ７により処理された分化マクロファージ、またはＰＲＰ６－ＨＯ７により処理された分化マクロファージのＡＬＣＡＭ、ＬＭＮＢ１およびＳＬＣ１６Ａ１転写産物の発現。遺伝子発現データはＬｏｇ２ＦＣ（ＦＣは倍率変化である。）として表される。特定された遺伝子の相対的な発現データは、トータルＲＮＡ抽出およびＴａｑＭａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲの個別検証により得られた。Ｌｏｇ２ＦＣ値は、５回の独立した実験に基づく平均＋ＳＤとして表される（未処理のＭ０マクロファージに対して＊はｐ＜０．０５であり、＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊はｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である。）。
【図17】ＰＲＰ６－ＨＯ７に曝露された分化したヒトＭ０マクロファージにより、嗅覚受容体が上方調節される。分化の６日目における未処理の未分化マクロファージ（Ｍ０）と比較した、ＰＲＰ－ＨＥ８により処理された未分化マクロファージ、ＰＲＰ－ＨＯ７により処理された未分化マクロファージ、またはＰＲＰ６－ＨＯ７により処理された未分化マクロファージの「ｆｉｎｄ ｍｅ」または嗅覚受容体ＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＦＰＲ２、ＧＰＲ１３２、Ｐ２ＲＹ２およびＳ１ＰＲ１の転写産物の発現。遺伝子発現データはＬｏｇ２ＦＣ（ＦＣは倍率変化である。）として表される。特定された遺伝子の相対的な発現データは、トータルＲＮＡ抽出およびＴａｑＭａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ検証により得られた。Ｌｏｇ２ＦＣ値は、４回の独立した実験に基づく平均＋ＳＤとして表される（未処理のＭ０マクロファージに対して＊はｐ＜０．０５であり；＊＊＊はｐ＜０．００１である。）。
【図18】ＰＲＰ－ＨＯ７によって処理されたＭ１マクロファージおよびＰＲＰ６－ＨＯ７で処理されたＭ１マクロファージのサイトカインプロファイルの比較。未処理のＭ１マクロファージ（Ｍ１）、ＰＲＰ－ＨＯ７によって処理されたＭ１マクロファージ、およびＰＲＰ６－ＨＯ７によって処理されたＭ１マクロファージの細胞培養上清を、製造元のガイドラインに従ってＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓの「Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙ Ｋｉｔ」でインキュベートした。各ドットの濃度はＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（登録商標）ソフトウェアで定量化され、関連する各サイトカインおよび治療について正規化された平均ピクセル濃度として表示される。
【図19】ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）におけるＰＲＰ６－ＨＯ７タンパク質の産生と精製。ニッケルアフィニティークロマトグラフィー（Ｈｉｓタグ）で精製した後の、ＰＲＰ６－ＨＯ７を可視化するクーマシーブルーで染色した１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。溶出画分プールは、還元条件下（Ｒ）および非還元条件下（ＮＲ）で行われた。
【図20】Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＲＰ６－ＨＯ７タンパク質の産生と精製。ニッケルアフィニティークロマトグラフィー（Ｈｉｓタグ）で精製した後の、還元条件下（Ｒ）でＰＲＰ６－ＨＯ７を可視化するクーマシーブルーで染色した１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはウエスタン分析。ウエスタンブロットは抗ＨｉｓＭｏＡｂでプローブされた。
【図21】マウスのデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）大腸炎モデルの実験計画および治療投与計画。投与経路：ミノサイクリン（参照化合物、標準治療）、強制経口投与；ＰＲＰ－ＨＯ７、ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＤＰＢＳ（対照）、皮下注射。
【図22】Δ体重（０日目に対する％体重減少）。ＤＳＳ誘発大腸炎マウスモデルの体重の変化におけるＰＲＰ－ＨＯ７、ＰＲＰ６－ＨＯ７およびミノサイクリンの効果。結果は平均±ＳＥＭとして表される。２％ＤＳＳ－対照群に対して＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊はｐ＜０．００１である（２元配置分散分析）。
【図23】ＤＳＳ誘発大腸炎マウスの大腸炎臨床スコアの進展におけるＰＲＰ－ＨＯ７、ＰＲＰ６－ＨＯ７およびミノサイクリンの影響。表５で提案された基準に基づく９日間の実験期間にわたるＤＡＩ値。結果は平均±ＳＥＭとして表される。２％ＤＳＳ－対照群に対して＊はｐ＜０．０５であり、＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である（２元配置分散分析）。
【発明の詳細な説明】
【0021】
本発明者らは、驚くべきことに、Ｃ４ＢＰのＣＣＰ６ドメインが、Ｃ４ＢＰα鎖の寛容原性および免疫調節活性を維持するのに十分であり、Ｃ４ＢＰα鎖の他のＣＣＰドメインのいずれも必要としないことを見出した。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、ＣＣＰ６のオリゴマー化が免疫調節活性を維持するために不可欠であることを見出した。本発明の実施例１～１１に示されるように、ＣＣＰ６ドメインおよびＰＲＰ６－ＨＯ７と呼ばれるＣ４ＢＰのオリゴマー化ドメインを含む７つの組換えポリペプチドによって形成されるホモオリゴマーは、遺伝子発現実験（図１３、１４、１６、１７および１８）、および調節性マクロファージまたは寛容原性マクロファージへの変換（図１５）に示されるように、ＰＲＰ－ＨＯ７と呼ばれるβ鎖を欠くＣ４ＢＰの生理学的アイソフォームＣ４ＢＰ（β－）よりもさらに寛容原性活性を有する。本発明者らは、真核生物ＨＥＫ（Ｅｘｐｉ２９３）細胞、酵母ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）（実施例１２および図１９）および細菌細胞（実施例１３および図２０）においてＰＲＰ６－ＨＯ７を首尾よく発現させ、精製して、この化合物が成熟刺激の存在下で樹状細胞の成熟を阻害できること、および寛容原性樹状細胞の特徴を示す樹状細胞の生成を促進できることを示すために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験を行った。特に、ＰＲＰ６－ＨＯ７は、ヒトＭｏ－ＤＣの活性化マーカー（実施例２、４、５および６；図４、８、９、１０、１１および１２）、ＬＰＳによって成熟したヒトＭｏ－ＤＣによる炎症性サイトカインの放出（実施例２および図６）およびＭｏ－ＤＣの炎症性分子サイン（inflammatory molecular signature）に一致する重要な転写産物の放出（実施例８および図１３）を下方調節することができる。さらに、ＰＲＰ６－ＨＯ７はヒトＭｏ－ＤＣの走化性を低下させ（実施例７および図１２）、転写レベルで「ｆｉｎｄ ｍｅ」受容体を上方調節する（実施例８および図１４）。
【0022】
一方、本発明者らは、ＰＲＰ６－ＨＯ７がマクロファージの成熟を阻害し、寛容原性細胞の特徴を示すマクロファージの生成を促進できることも示した。特に、ＰＲＰ６－ＨＯ７は、ヒトＭ１およびＭ２の活性化マーカーの発現（実施例９および図１５）、Ｍ１マクロファージによる炎症性サイトカインの放出（実施例１１および図１８）および単球由来マクロファージの分化の分子サイン（molecular signature）にする分子に一致する重要な転写産物の放出（実施例１０および図１６）を下方調節することができる。さらに、ＰＲＰ６－ＨＯ７は転写レベルでＭ０マクロファージの「ｆｉｎｄ ｍｅ」受容体を上方調節する（実施例１０および図１７）。
【0023】
本発明者らは、免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患、特に潰瘍性大腸炎の治療において、ＰＲＰ６－ＨＯ７が、ＰＲＰ－ＨＯ７と呼ばれるβ鎖を欠くＣ４ＢＰの生理学的アイソフォームＣ４ＢＰ（β－）よりも効果的であることを示した（実施例１４）。
【0024】
本発明のホモオリゴマーは、補体阻害活性を欠く（実施例３および図７）；抗体よりもサイズが小さい（１００ｋＤａ）（図２）；体液中の抗体よりも優れた安定性（血漿半減期の延長）を有する；低ナノモル範囲のＫｄを有する潜在的な表面受容体との高いアビディティ相互作用を有し；Ｃ末端のオリゴマー化足場は分子間ジスルフィド結合と静電相互作用の層とによって安定化されるため、高い熱力学的安定性が得られる等の優れた効果を有します。さらに、ＰＲＰ６－ＨＯ７は、その前駆体であるＰＲＰ－ＨＯ７とは異なり、グリコシル化されていないため、様々な発現系（真核細胞、酵母または細菌細胞）での産生とさらなる精製が可能である。最後に、ＣＣＰ６ドメインのみを含む単純化された構造のため、ＰＲＰ６－ＨＯ７の投与は、ＰＲＰ－ＨＯ７と比較して感染感受性を増加させない。
【0025】
本発明の組換えポリペプチド
本発明者らは、Ｃ４ＢＰのＣＣＰ６ドメインおよびオリゴマー化ドメインを含む組換えポリペプチドが、β鎖を欠くＣ４ＢＰの生理学的アイソフォームＣ４ＢＰ（β－）よりも寛容原性の高いホモオリゴマーを形成できることを示した。
本発明者らは、Ｃ４ＢＰのＣＣＰ６ドメインおよびオリゴマー化ドメインを含む組換えポリペプチドが、β鎖を欠くＣ４ＢＰの生理学的アイソフォームＣ４ＢＰ（β－）よりも寛容原性の高いホモオリゴマーを形成できることを示した。
【0026】
したがって、第１の態様において、本発明は、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に同等の変異体、オリゴマー化ドメインを含む組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４、ＣＣＰ５、ＣＣＰ７およびＣＣＰ８ドメインのいずれも含まない組換えポリペプチドに関する。
【0027】
「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」という表現は、本明細書では互換的に使用され、Ｃ４ＢＰのＣＣＰ６ドメインと、組換えポリヌクレオチドの発現時に組換えＤＮＡ法によって得られるオリゴマー化ドメインとが融合したポリペプチドまたはタンパク質を指す。本明細書で用いられる「組換え」とは、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはベクターが、天然のシステムで見られる内因性の核酸と区別され得る構造的コード配列を有する構築物をもたらす、クローニング、制限（restriction）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびライゲーションの工程の様々な組み合わせの産物であることを意味する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片または一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てられ、細胞または無細胞転写および翻訳システムに含まれる組換え転写ユニットから発現できる合成核酸を提供することができる。関連する配列を含むゲノムＤＮＡは、組換え遺伝子または転写ユニットの形成にも用いられ得る。したがって、「組換え」核酸という用語は、天然に存在しないものを指し、例えば、ヒトの介入による、他の方法で分離された２つの配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製される。この人工的な組み合わせは、化学合成手段によって、または所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合して所望の機能の組み合わせを生成するために、核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば遺伝子工学技術によってしばしば達成される。本発明の組換えポリペプチドは、Ｃ４ＢＰの完全なＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４、ＣＣＰ５、ＣＣＰ７およびＣＣＰ８ドメインを欠失させることによって得られる欠失変異体ではない。
【0028】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、直鎖を形成するペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基のポリマーを指す。鎖の一方の末端（アミノ末端）の末端アミノ酸は遊離アミノ基を有し、鎖のもう一方の末端（カルボキシ末端）の末端アミノ酸は遊離カルボキシル基を有する。本明細書で用いられる「アミノ末端」（Ｎ末端と略される）という用語は、ポリペプチドのアミノ末端のアミノ酸上の遊離アミノ基、またはペプチド内の他の任意の位置のアミノ酸のペプチド結合に関与する場合のアミノ基を指す。同様に、「カルボキシ末端」という用語は、ポリペプチドのカルボキシ末端上の遊離カルボキシル基、またはペプチド内の他の任意の位置のアミノ酸のカルボキシル基を指す。一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、１０００個未満のアミノ酸、９００個未満のアミノ酸、８００個未満のアミノ酸、７００個未満のアミノ酸、６００個未満のアミノ酸、５００個のアミノ酸未満のアミノ酸、４７５個未満のアミノ酸、４５０個未満のアミノ酸、４２５個未満のアミノ酸、４００個のアミノ酸未満、３７５個未満のアミノ酸、３５０個未満のアミノ酸、３２５個未満のアミノ酸、３００個未満のアミノ酸、２７５個未満のアミノ酸、２５０個未満のアミノ酸、２２５個未満のアミノ酸、２００個未満のアミノ酸または１７５個未満のアミノ酸を有する。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、１００～２００個のアミノ酸、好ましくは１１５～１７５個のアミノ酸、より好ましくは１１９～１７３個のアミノ酸、より一層好ましくは１１９～１２５個のアミノ酸を有する。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは１１９個のアミノ酸を有する。
【0029】
本明細書で用いられる「アミノ酸残基」とは、天然に存在する任意のアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または当技術分野で知られている任意のアミノ酸模倣体（amino acid mimic）を指す。特定の実施形態において、ポリペプチドの残基は連続的であり、非アミノ酸がアミノ酸残基の配列を中断することはない。他の実施形態において、配列は、１つ以上の非アミノ酸部分を含み得る。特定の実施形態において、ポリペプチドの残基の配列は、１つ以上の非アミノ酸部分によって中断され得る（Li et al. 2013. Molecules, 18(8):9797-981を参照のこと）。
【0030】
本明細書で用いられる「Ｃ４ＢＰ」または「Ｃ４ｂ結合タンパク質」という用語は、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂの第Ｉ因子依存性分解の補因子として作用し、古典的経路Ｃ３／Ｃ５－転換酵素の崩壊を促進する、肝細胞によって主に合成される古典的経路の調節成分を指す。Ｃ４ＢＰは３つのアイソフォームとして血漿中を循環し、その割合はＣ４ＢＰα（７０ｋＤａ）鎖およびＣ４ＢＰβ（４５ｋＤａ）鎖の相対レベルに依存する。Ｃ４ＢＰの主要なアイソフォームは、７つの同一のα鎖および１つのβ鎖（α７β１）で構成され、Ｃ４ＢＰ（α７β１）またはＣ４ＢＰ（β＋）と呼ばれる。炎症を起こすと、通常は存在量の少ないアイソフォームが上方調節され、α鎖（α７β０）のみで構成され、Ｃ４ＢＰ（α７β０）またはＣ４ＢＰ（β－）と呼ばれる。さらに、真核細胞におけるα鎖の組換え発現は、６つのα鎖（α６β０）を含むオリゴマーをもたらし得る。
【0031】
本明細書で用いられる「Ｃ４ＢＰα鎖」という用語は、ＰＲＰまたはプロリンリッチタンパク質としても知られ、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１９年７月３１日リリース）で定義されるヒトポリペプチドの成熟プロセシングされた形態を指し、４９～５９７のアミノ酸を含む。Ｃ４ＢＰα鎖という用語は、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０８６０７（２０１９年７月３１日リリース）に示されるポリペプチドの成熟型に対応するマウスＣ４ＢＰα鎖（５７～４６９のアミノ酸）、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｑ６３５１４（２０１９年５月８日リリース）に示されるポリペプチドの成熟型に対応するＣ４ＢＰα鎖（１４～５５８のアミノ酸）、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｑ２８０６５（２０１９年５月８日リリース）に示されるポリペプチドの成熟型に対応するウシＣ４ＢＰα鎖（４９～６１０のアミノ酸）等のヒトＣ４ＢＰα鎖のオーソログを指す場合にも用いられる。
【0032】
Ｃ４ＢＰα鎖は、４つのシステイン残基が１～３ ２～４の配列でジスルフィド結合し、長さが６０アミノ酸残基である８つの補体制御タンパク質ドメイン（ＣＣＰ）と、ほぼ不変のトリプトファン残基の周りに構築された疎水性コアを含む。したがって、本明細書で用いられる「ＣＣＰドメイン」という用語は、Ｃ４ＢＰα鎖に見られる補体制御ドメインの１つを指す。
【0033】
本明細書で用いられる「ＣＣＰ６ドメイン」という表現は、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１９年７月３１日リリース）で提供される配列で定義されるヒトＣ４ＢＰα鎖に関して３６３位のアミノ酸と４２４位のアミノ酸との間に見られる領域（配列番号１）に対応し、これは以下の配列に対応する：
ＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤ（配列番号１）。
ＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤ（配列番号１）。
【0034】
したがって、好ましい実施形態において、ＣＣＰ６ドメインは、ヒトＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインであり、より好ましくは配列番号１である。一つの実施形態において、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインは配列番号１を含む。別の実施形態において、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインは配列番号１からなる。
【0035】
本明細書で用いられる「ＣＣＰ６ドメイン」という用語はまた、例えば、下記の表１に示すＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｇ１Ｔ７Ａ２（２０１９年１０月１６日リリース）で提供される配列に関してウサギＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン（４１０～４６０位のアミノ酸）（配列番号１２）、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｑ６３５１４（２０１９年５月８日リリース）で提供される配列に関してラットＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン（３２７～３８８位のアミノ酸）（配列番号１３）、またはＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｑ２８０６５（２０１９年５月８日リリース）で提供される配列に関してウシＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン（３６５～４２７位のアミノ酸）（配列番号１４）等の、ヒトＣ４ＢＰ鎖の任意のオーソログのＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを指す。
【0036】
【表1】
【0037】
本明細書において、「ＣＣＰ６ドメイン」という用語は、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失から生じ、オリゴマー形成時に元のポリペプチドの寛容原性表現型を誘導する能力が実質的に保存されている、上記で定義された天然に存在するＣＣＰ６ドメインの機能的に同等の変異体を指すためにも用いられる。
【0038】
好ましい実施形態において、ＣＣＰ６ドメインの機能的に同等の変異体は、置換（例えば、保存的アミノ酸置換）および／または挿入（例えば、小さな単一のアミノ酸挿入、または２、３、４、５、１０、１５、２０個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含む挿入）および／または欠失（例えば、小さな単一のアミノ酸欠失、または２、３、４、５、１０、１５、２０個またはそれ以上の連続したアミノ酸の欠失）による上記配列のいずれかの改変により生じる。したがって、特定の実施形態において、本来の配列の変異体は、（ｉ）１つ以上（例えば、２、３、４、５、６個またはそれ以上）の保存的アミノ酸置換、（ｉｉ）１つ以上（例えば、２、３、４、５、６個またはそれ以上）のアミノ酸欠失、（ｉｉｉ）１つ以上（例えば、２、３、４、５、６個またはそれ以上）のアミノ酸挿入、または（ｉｖ）それらの組み合わせによって天然に存在する配列とは異なるものである。欠失または挿入されたアミノ酸は、隣接していてもよく隣接していなくてもよい。
【0039】
特定のアミノ酸が同様の疎水性インデックスまたは疎水性スコアを有する他のアミノ酸に置換されることで同様の生物学的活性を有するポリペプチドがもたらされることが知られているので、そのような変更を行う際にはアミノ酸の疎水性インデックスが考慮される。例えば、アミノ酸残基の相対的な疎水性特性は、結果として生じるポリペプチドの二次および三次構造に影響を及ぼし、それによってポリペプチドと酵素、基質、受容体、抗体、抗原等の他の分子との相互作用が規定される。すでに概説したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づくものである。上述した様々な特性を考慮した置換の例は当業者に公知であり、以下の表２に示される。
【0040】
【表2】
【0041】
一つの実施形態において、機能的に同等の変異体は、ＣＣＰ６ドメインの配列のＮ末端、Ｃ末端または両端に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個のアミノ酸の付加を含む。一つの実施形態において、機能的に同等の変異体は、２０個未満、１５個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個のアミノ酸の付加を含む。別の実施形態において、機能的に同等の変異体は、ＣＣＰ６ドメインの配列のＮ末端、Ｃ末端または両端に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個のアミノ酸の欠失を含む。別の実施形態において、機能的に同等の変異体は、２０個未満、１５個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個のアミノ酸の欠失を含む。別の実施形態において、機能的に同等の変異体は、ＣＣＰ６ドメインの配列中に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個のアミノ酸の置換を有する。別の実施形態において、機能的に同等の変異体は、２０個未満、１５個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個のアミノ酸の置換を有する。好ましい実施形態において、機能的に同等の変異体は、ＣＣＰ６ドメインのＮ末端に１個のアミノ酸の付加、好ましくはメチオニンの付加を有する変異体である。
【0042】
別の実施形態において、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインの機能的に同等の変異体は、配列番号１の２位のシステイン、配列番号１の３位のシステイン、配列番号１の４位のプロリン、配列番号１の６位のプロリン、配列番号１の１３位のイソロイシン、配列番号１の１６位のヒスチジン、配列番号１の２５位のシステイン、配列番号１の２７位のチロシン、配列番号１の３０位のグリシン、配列番号１の３１位のアスパラギン酸、配列番号１の３７位のシステイン、配列番号１の４７位のシステイン、配列番号１の５１位のグリシン、配列番号１の５２位のスレオニン、配列番号１の５３位のトリプトファン、配列番号１の５５位のプロリン、配列番号１の５７位のスレオニン、配列番号１の５８位のプロリン、および配列番号１の６０位のシステインと同等の１個以上の残基を含む。好ましくは、これらの残基のすべてを含む。より好ましい実施形態において、変異体では、これらの残基間の相対的な間隔が保持される。
【0043】
Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインの機能的に同等の変異体には、限定されることなく、天然に存在する多型変異体（すなわち、対立遺伝子変異体）、および組換え操作または改変された変異体が含まれる。本発明における使用に適したＣＣＰ６ドメイン変異体には、限定されることなく、上記で定義された天然に存在するＣＣＰ６ドメイン、特に天然に存在するヒト起源のＣＣＰ６と少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％、少なくとも４８％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％の配列同一性を有する。
【0044】
上記のアミノ酸配列に対するＣＣＰ６ドメイン変異体のアミノ酸配列の同一性の割合は、配列比較によって当業者によって容易に決定され得る。本明細書で用いられる場合、２つのアミノ酸配列を最大限に対応するよう整列させた時に該２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が同じである場合、２つのアミノ酸配列は１００パーセントのアミノ酸配列同一性を有する。ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の配列比較は、当業者に公知のコンピューターアルゴリズムを用いる方法等の任意の方法を用いて行うことができる。そのようなアルゴリズムとしては、ＡｌｉｇｎまたはＢＬＡＳＴアルゴリズムが挙げられ（例えば、Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991; Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照のこと）、これらはＮＣＢＩのウェブサイトで入手できる（［オンライン］インターネットncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLASTを参照のこと）。デフォルトのパラメータを用いることができる。さらに、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ bioinformatics computing suite（DNASTAR, Inc., Madison, Wis.）；CLUSTALW program（Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-80 (1991)）；および「ＧｅｎｅＤｏｃ」（Nicholas et al., EMBNEW News 4:14 (1991)）に含まれているもの等の、標準的なソフトウェアプログラムを利用することができる。最適なアラインメントを決定することによって２つのアミノ酸配列を比較する他の方法は、当業者によって実践されている（例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997)；Wu et al. (eds.), “Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins,” in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997)；およびBishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Ed. (Academic Press, Inc. 1998)を参照のこと）。
【0045】
本明細書で用いられる「オリゴマー形成時に元のポリペプチドの寛容原性表現型を誘導する能力を実質的に保存されている」という表現は、例えば、ＣＣＰ６変異体がオリゴマー化ドメイン、好ましくは配列番号２のオリゴマー化ドメインに融合される場合の本発明の実施例１～１１のいずれかにおいて規定されるように、樹状細胞および／またはマクロファージの成熟を阻害することができるポリペプチドを指す。特に、機能的に同等の変異体は、未成熟樹状細胞への分化段階中の単球細胞に添加される場合、および／または成熟樹状細胞への成熟段階中の未成熟樹状細胞に添加される場合、寛容原性樹状細胞を生成する能力を示す。寛容原性樹状細胞の生成を促進する変異体の能力は、例えば、該変異体の存在下で成熟した樹状細胞においてＣＤ８３、ＣＤ８６および／またはＣＤ８０等の成熟マーカーの樹状細胞における発現レベルを測定することによって決定することができる（本発明の実施例４）。したがって、ポリペプチドは、オリゴマー化ドメイン、特に配列番号２のオリゴマー化ドメインと融合した場合にヒトＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインの活性の少なくとも１００％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％を示す場合に、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインの機能的に同等の変異体と見なされる。
【0046】
本明細書で用いられる「オリゴマー化ドメイン」という用語は、該ドメインを含むポリペプチドが凝集してオリゴマーを形成する特性を有するポリペプチドドメインを指し、すなわち、モノマー間のオリゴマー化に関与する領域である。オリゴマー化ドメインは、別のモノマーの領域のアミノ酸と相互作用してモノマーのオリゴマー化を可能にすることができるあるモノマーの領域にアミノ酸を含む。適切なオリゴマー化ドメインは当技術分野において公知である。好ましい実施形態において、オリゴマー化ドメインは、Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインである。別の実施形態において、オリゴマー化ドメインは、Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体である。本明細書で用いられる「Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメイン」という表現は、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１９年７月３１日リリース）で提供される配列で定義されるヒトＣ４ＢＰα鎖に関して５４１位のアミノ酸と５９７位のアミノ酸との間に見出される領域（配列番号２）に対応し、これは以下の配列に対応する：
ＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号２）。
ＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号２）。
【0047】
したがって、好ましい実施形態において、オリゴマー化ドメインは、ヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインまたはその機能的に同等の変異体であり；より好ましくは配列番号２またはその機能的に同等の変異体であり；より一層好ましくは配列番号２である。一つの実施形態において、オリゴマー化ドメインは配列番号２またはその機能的に同等の変異体、好ましくは配列番号２を含む。別の実施形態において、オリゴマー化ドメインは配列番号２またはその機能的に同等の変異体、好ましくは配列番号２からなる。
【0048】
本明細書で用いられる「Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメイン」という用語はまた、例えば、下記の表３に示すＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０８６０７（２０１９年７月３１日リリース）で提供される配列に関するマウスＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメイン（４１６～４６９位のアミノ酸）（配列番号１５）、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｑ６３５１４（２０１９年５月８日リリース）で提供される配列に関するラットＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメイン（５０４～５５８位のアミノ酸）（配列番号１６）、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｑ２８０６５（２０１９年５月８日リリース）で提供される配列に関するウシＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメイン（５４４～６１０位のアミノ酸）（配列番号１７）等の、ヒトＣ４ＢＰα鎖の任意のオーソログのオリゴマー化ドメインを指す。本発明において有用な他の哺乳動物オーソログのＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインは、表３に示す配列番号１８～３３である。本発明において有用なヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体は配列番号３４～４１である。ＰＣＴ特許出願ＷＯ２００７／０６２８１９に記載される鳥類オーソログのオリゴマー化ドメインはニワトリＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメイン（配列番号４２）またはキンカチョウの鳥類相同体（配列番号４３）等も含まれる。ＷＯ２００７／０６２８１９の表１に開示されるＣ４ＢＰのオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体も含まれる（配列番号４４～５５）。
【0049】
【表3】
【0050】
好ましい実施形態において、オリゴマー化ドメインは、哺乳動物のＣ４ＢＰα鎖、より好ましくはヒト、マウスまたはラットのＣ４ＢＰα鎖、最も好ましくはヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインである。
【0051】
好ましい実施形態において、オリゴマー化ドメインは、配列番号２および配列番号１５～５５のいずれか１つからなる群から選択されるオリゴマー化ドメインであり；好ましくは配列番号２および配列番号１５～４１のいずれか１つからなる群から選択されるオリゴマー化ドメインであり；より好ましくは配列番号２および配列番号１５～３３のいずれか１つからなる群から選択されるオリゴマー化ドメインであり；より一層好ましくは配列番号２および配列番号１５～３２のいずれか１つからなる群から選択されるオリゴマー化ドメインであり；さらにより一層好ましくは配列番号２および配列番号１５～１７のいずれか１つからなる群から選択されるオリゴマー化ドメインであり；さらにより一層好ましくは配列番号２のオリゴマー化ドメインである。
【0052】
Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインには、これらの配列の他の哺乳類および非哺乳類の相同体も含まれる。そのような相同体を得るための手段は、当業者が利用できる日常的な技術である。本質的に、そのような技術は、他の種のＣ４ＢＰ相同体の配列を回収および決定するためのプローブとして、本発明のオリゴマー化ドメインの配列のいずれかまたはその断片をコードする核酸を用いることを含む。これには、多種多様な技術が利用可能であり、例えば、適切なｍＲＮＡ源（例えば、胚または活発に分裂している分化細胞または腫瘍細胞からのもの）を用いた相同体のＰＣＲ増幅およびクローニング、または動物からのｃＤＮＡライブラリー、例えば、上記の供給源の１つからのｃＤＮＡライブラリーを得ること、ストリンジェントな条件下で本発明のオリゴマー化ドメインのいずれかをコードする核酸で前記ライブラリーをプローブすること、およびその動物の相同体を全てまたは部分的にコードするｃＤＮＡを回収することを含む方法である。ここで、部分的なｃＤＮＡが得られ、完全長のコード配列はプライマー伸長技術によって決定され得る。あるいは、動物のゲノム配列の全部または一部が利用可能である場合、本発明の配列を用いた相同性検索を用いて適切な相同体を決定することができる。
【0053】
本明細書で用いられる「Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメイン」という用語はまた、１個以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失による、上記で定義されたＣ４ＢＰα鎖の天然に存在するオリゴマー化ドメインの任意の機能的に同等の変異体であって、本発明の組換えポリペプチドの一部を形成する時に、元のポリペプチドのオリゴマーを形成する能力を実質的に保持するものを指す。
【0054】
したがって、機能的に同等の変異体は、オリゴマー化能力に関与しないアミノ酸が欠失されているが、オリゴマー化に関与するアミノ酸が保存されているオリゴマー化ドメインの断片、またはオリゴマー化に関与しないアミノ酸が変異している変異体であり得る。
【0055】
好ましい実施形態において、Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体は、上述した配列のいずれかを置換（例えば、保存的アミノ酸置換）および／または挿入（例えば、小さな単一のアミノ酸挿入、または２、３、４、５、１０、１５、２０個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含む挿入）および／または欠失（例えば、小さな単一のアミノ酸の欠失、または２、３、４、５、１０、１５、２０個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含む欠失）により改変することによりもたらされる。したがって、特定の実施形態において、天然配列の変異体は、（ｉ）１個以上（例えば、２、３、４、５、６個またはそれ以上）の保存的アミノ酸置換、（ｉｉ）１個以上（例えば、２、３、４、５、６個またはそれ以上）のアミノ酸の欠失、（ｉｉｉ）１個以上（例えば、２、３、４、５、６個またはそれ以上）のアミノ酸の挿入、または（ｉｖ）それらの組み合わせによって天然に存在する配列とは異なるものである。欠失または挿入されたアミノ酸は、隣接していてもよく隣接していなくてもよい。
【0056】
ＣＣＰ６ドメインの機能的に同等の変異体について説明したように、そのような変更を行う際にはアミノ酸の疎水性インデックスが考慮される。置換の例を示す表２は、Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体にも適用可能である。
【0057】
一つの実施形態において、機能的に同等の変異体は、オリゴマー化ドメインの配列のＮ末端、Ｃ末端または両端において、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個のアミノ酸の付加を含む。一つの実施形態において、機能的に同等の変異体は、２０個未満、１５個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個のアミノ酸の付加を含む。別の実施形態において、機能的に同等の変異体は、オリゴマー化ドメインの配列のＮ末端、Ｃ末端または両端において、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個のアミノ酸の欠失を含む。別の実施形態において、機能的に同等の変異体は、２０個未満、１５個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個のアミノ酸の欠失を含む。別の実施形態において、機能的に同等の変異体は、オリゴマー化ドメインの配列において、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個のアミノ酸の置換を有する。別の実施形態において、機能的に同等の変異体は、２０個未満、１５個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個のアミノ酸の置換を有する。好ましい実施形態において、機能的に同等の変異体は、オリゴマー化ドメインのＮ末端に１個のアミノ酸が付加を有し、好ましくはメチオニンが付加を有する変異体である。
【0058】
一つの実施形態において、オリゴマーを形成することができるＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインの断片は、少なくとも４７個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含み得る。
【0059】
別の実施形態において、Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインの変異体は、配列番号２の１位のグルタミン酸、配列番号２の１２位のグリシン、配列番号２の１７位のグルタミン、配列番号２の２５位のバリン、配列番号２の２６位のリジン、配列番号２の２８位のアラニン、配列番号２の２９位のロイシン、配列番号２の３０位のグルタミン酸、配列番号２の３２位のチロシン、配列番号２の３３位のリジン、配列番号２の３４位のロイシン、配列番号２の３６位のロイシン、配列番号２の３７位のグルタミン酸、および配列番号２の４１位のロイシンと同等の１個以上の残基を含む。好ましくは、変異体はこれらの残基のすべてを含む。より好ましくは、変異体では、これらの残基間の相対的な間隔が保持される。
【0060】
好ましい実施形態において、変異体は、配列番号２の１２位のグリシンと同等の残基、配列番号２の２８位のアラニン、配列番号２の２９位、３４位、３６位および４１位のロイシン、配列番号２の３２位のチロシン、および配列番号２の３３位のリジンを含む。好ましくは、変異体では、これらの残基間の相対的な間隔が保持される。
【0061】
別の好ましい実施形態において、Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインの変異体は、配列番号２の１２位のグリシン、配列番号２の２８位のアラニン、配列番号２の２９位、３４位、３６位および４１位のロイシン、配列番号２の３２位のチロシン、配列番号２の３３位のリジン、および配列番号２の６位および１８位の２つのシステイン残基と同等の残基を含む。好ましくは、変異体では、これらの残基間の相対的な間隔が保持される。
【0062】
本発明において用いられるＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体には、限定されることなく、天然に存在する多型変異体（すなわち、対立遺伝子変異体）および組換え操作または改変された変異体が含まれる。本発明における使用に適したオリゴマー化ドメインの変異体としては、限定されることなく、上記で定義された天然に存在するオリゴマー化ドメイン、特に天然に存在するヒト起源のＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインと少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％の配列同一性を有する、
【0063】
オリゴマー化ドメインの変異体のアミノ酸配列の同一性の割合を決定するための方法は、ＣＣＰ６ドメインについて上記で説明されたものである。
【0064】
本明細書で用いられる「本発明の組換えポリペプチドの一部を形成する時に、元のポリペプチドのオリゴマーを形成する能力を実質的に保存する」という表現は、例えば、オリゴマー化ドメイン変異体がＣＣＰ６ドメイン、好ましくは配列番号１のＣＣＰ６ドメインに融合される場合の本発明の実施例１および図３に示されるように、オリゴマーを形成することができるポリペプチドを指す。オリゴマーを形成することができるポリペプチドであるかどうかを決定するための方法は当業者に利用可能であり、例えば、Blom et al.（J.Biol.Chem. 2001, 276: 27136-27144）によって記載された、真核細胞（例えば、２９３細胞）における変異型α鎖の組換え発現によって得られる精製Ｃ４ＢＰの天然条件（native condition）下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析、およびそれに続くＣＣＰ６領域に特異的な抗体を用いたアフィニティー精製に基づく方法が挙げられる。あるいは、オリゴマー化ドメインの変異体がオリゴマーを形成する能力は、本発明において原核生物または真核生物の宿主細胞で変異体を発現させ、還元条件下および非還元条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシーブルー染色（すなわち、還元剤β－メルカプトエタノールの存在下および非存在下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上での変異体の挙動の比較）によって回収された変異体を分析することによって、または実施例１または図３で説明されるように、還元条件下または非還元条件下で抗タグ抗体または抗Ｃ４ＢＰα鎖でプローブするウエスタンブロットを行うことによって試験することができる。あるいは、オリゴマー化ドメインの変異体がオリゴマーを形成する能力は、本発明において原核生物宿主細胞で変異体を発現させ、ヒトＣ４ＢＰα鎖の完全な５７アミノ酸のオリゴマー化ドメインのオリゴマー化をもたらす条件下で変異体を回収し、変異体がオリゴマーを形成するかどうかを例えばゲル濾過によって決定することによって試験することができる。
【0065】
したがって、ポリペプチドは、ＣＣＰ６ドメイン、特に配列番号１のＣＣＰ６ドメインと融合した場合にヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインのオリゴマーを形成する能力の少なくとも１００％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％を示す場合に、Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体と見なされる。
【0066】
ヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体は、好ましくは：（ａ）ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１９年７月３１日リリース）で定義される未成熟型の５４６位のアミノ酸に対応する、成熟型のヒトＣ４ＢＰα鎖（すなわち、シグナルペプチドを欠くヒトＣ４ＢＰα鎖の形態）の４９８位のシステイン残基と同等のシステイン残基；（ｂ）ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１９年７月３１日リリース）で定義される未成熟型の５５８位のアミノ酸に対応する、成熟型のヒトＣ４ＢＰα鎖の５１０位のシステイン残基と同等のシステイン残基；および／または（ｃ）Ｃ末端の両親媒性のα－ヘリックス領域、より好ましくはＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３で定義される未成熟形の５８５～５９７位のアミノ酸に対応する、成熟型のヒトＣ４ＢＰα鎖５３７～５４９位の残基と同等の最後の１３残基が維持される。分子の細胞内オリゴマー化のために、機能的に同等の変異体は好ましくは（ｃ）を維持する必要があり；機能的に同等の変異体はより好ましくは（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を維持する必要がある。
【0067】
Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む本発明の組換えポリペプチドは、Ｃ４ＢＰα鎖に見られる他のＣＣＰドメインのいずれも含まない。したがって、本発明のポリペプチドは、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４、ＣＣＰ５、ＣＣＰ７およびＣＣＰ８ドメインを含まない。ヒトＣ４ＢＰα鎖に言及する場合、ＣＣＰ１ドメインはＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１９年７月３１日リリース）に示されるポリペプチドの４９～１１０位のアミノ酸に対応し、ＣＣＰ２ドメインはＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１９年７月３１日リリース）に示されるポリペプチドの１１１～１７２位のアミノ酸に対応し、ＣＣＰ３ドメインはＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１９年７月３１日リリース）に示されるポリペプチドの１７３～２３６位のアミノ酸に対応し、ＣＣＰ４ドメインはＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１９年７月３１日リリース）に示されるポリペプチドの２３７～２９６位のアミノ酸に対応し、ＣＣＰ５ドメインはＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１９年７月３１日リリース）に示されるポリペプチドの２９７～３６２位のアミノ酸に対応し、ＣＣＰ７ドメインはＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１９年７月３１日リリース）に示されるポリペプチドの４２５～４８２位のアミノ酸に対応し、ＣＣＰ８ドメインはＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１９年７月３１日リリース）に示されるポリペプチドの４８３～５４０位のアミノ酸に対応する。当業者であれば、他のＣ４ＢＰα鎖におけるヒトＣ４ＢＰα鎖と同等のＣＣＰを決定する方法を知っている。
【0068】
一つの実施形態において、組換えポリペプチドは、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に同等の変異体およびオリゴマー化ドメインからなり；好ましくは、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインおよびＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインからなり；より好ましくは、ヒトＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインおよびヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインからなる。両方のドメインは任意の順序にすることができる。
【0069】
本発明のポリペプチドの好ましい実施形態において、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインおよびオリゴマー化ドメイン、好ましくはＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインは、同じ種に関係するものである。
【0070】
別の実施形態において、組換えポリペプチドは、（ａ）メチオニン、（ｂ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に同等の変異体、および（ｃ）オリゴマー化ドメインからなり；好ましくは、（ａ）メチオニン、（ｂ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、および（ｃ）Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインからなり；より好ましくは、（ａ）メチオニン、（ｂ）ヒトＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、および（ｃ）ヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインからなる。メチオニンは組換えポリペプチドのＮ末端にあり、ドメインは任意の順序にすることができる。
【0071】
好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、配列番号３またはその機能的に同等の変異体を含み、好ましくは配列番号３を含む。より好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、配列番号３またはその機能的に同等の変異体からなり、好ましくは配列番号３からなる。
ＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号３）
ＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号３）
【0072】
別の実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、配列番号３の配列およびポリペプチドのＮ末端にある追加のメチオニンからなる。
【0073】
一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含まない。例えば、本発明のポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の一部を形成する領域を含む融合タンパク質であってはならない。
【0074】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｃ４ＢＰの一部を形成しないポリペプチドを含む。Ｃ４ＢＰの一部を形成しないポリペプチドは、異種ポリペプチド、すなわち、Ｃ４ＢＰをコードするものとは異なる遺伝子に由来するポリペプチドと見なされる。
【0075】
本発明の組換えポリペプチドは、ＣＣＰ６ドメインおよびオリゴマー化ドメインを任意の順序で含み得る。本発明の組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、および（ｂ）オリゴマー化ドメインを含む領域を含み得る。あるいは、本発明の組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）オリゴマー化ドメインを含む領域、および（ｂ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域を含み得る。当業者であれば、本発明の組換えポリペプチドが、ＣＣＰ６ドメインとオリゴマー化ドメインとの間に追加のアミノ酸を含み得ることを理解するであろう。好ましい実施形態において、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインのＣ末端は、オリゴマー化ドメインのＮ末端に直接融合されており、すなわち、両方のドメイン間に追加のアミノ酸またはリンカーは存在しない。別の実施形態において、オリゴマー化ドメインのＣ末端は、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインのＮ末端に直接融合されている。別の実施形態において、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインのＣ末端は、追加のアミノ酸、すなわち、由来となる天然に存在するドメインに存在しないアミノ酸によって、オリゴマー化ドメインのＮ末端から分離されている。別の実施形態において、オリゴマー化ドメインのＣ末端は、追加のアミノ酸によって、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインのＮ末端から分離されている。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）メチオニン、（ｂ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、および（ｃ）オリゴマー化ドメインを含む領域を含む。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）メチオニン、（ｂ）オリゴマー化ドメインを含む領域、および（ｃ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域を含む。別の実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に向けて、（ａ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、および（ｂ）Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインからなる。別の実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端への方向に向けて、（ａ）Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメイン、および（ｂ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインからなる。これらの実施形態はすべて、本発明のポリペプチドが、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインの機能的に同等の変異体および／またはオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体によって形成される場合に等しく適用される。
【0076】
本発明の組換えポリペプチドは前駆体の形態であり得る。「前駆体」という用語は、一旦処理されると、ポリペプチドの成熟形態を生じさせることができるポリペプチドを指す。前駆体は、宿主細胞が真核細胞である場合にポリペプチドを細胞外培地に輸送するためのシグナルペプチドを含むポリペプチドである。
【0077】
別の実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、シグナルペプチドをさらに含む。本明細書で用いられる「シグナルペプチド」という表現は、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナル配列を指す。本明細書で用いられる場合、「シグナルペプチド」または「シグナル配列」または「分泌シグナルペプチド」または「分泌シグナル配列」という用語は、細胞内で合成されるタンパク質を分泌経路に向かって誘導する、比較的短い、一般に５～３０個のアミノ酸残基のペプチドを指す。シグナルペプチドは通常、二次αヘリックス構造を有する一連の疎水性アミノ酸を含む。さらに、多くのペプチドには、タンパク質がその転座に適したトポロジーを採るのに寄与することができる正に帯電した一連のアミノ酸を含む。シグナルペプチドは、そのカルボキシル末端にペプチダーゼによる認識のためのモチーフを有する傾向があり、これは、シグナルペプチドを加水分解して、遊離のシグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生じさせることができる。目的のタンパク質が適切な位置に到達すると、シグナルペプチドは切断され得る。本発明では、任意のシグナルペプチドを用いることができる。シグナル配列は、形質転換された同じ種の生物に由来する場合もあれば、異なる種に由来する場合もある。例示的な非限定的な例として、クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）の炭酸脱水酵素（ＣＡＨ１）からのシグナルペプチド、クラミドモナス・ラインハルディのペリプラズムアリールスルファターゼ（ＡＲＳ１）からのシグナルペプチド、またはクラミドモナス・ラインハルディのガメトリシンＭ１１からのシグナルペプチドを用いることができる。細菌における発現に有用なシグナルペプチドは、ＳｅｃシグナルペプチドまたはＴａｔシグナルペプチドであり得る。特に酵母における発現のためのシグナルペプチドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα－接合因子）（α-mating factor）プレプロペプチド（prepro peptide）からのシグナルペプチド、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの酸ホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ１）からのシグナルペプチド、および細胞外タンパク質Ｘ（ＥＰＸ１）であり得る。好ましい実施形態において、シグナルペプチドは、α因子接合ペプチド（α-factor mating peptide）からの
シグナルペプチド、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からのα因子接合ペプチドである。哺乳動物真核細胞における発現に有用なシグナルペプチドは、限定されることなく、ヒトＯＳＭ、ＶＳＶ－Ｇ、マウスＩｇκ、ヒトＩｇＧ２ Ｈ、ＢＭ４０、セクレコン、ヒトＩｇＫＶＩＩＩ、ＣＤ３３、ｔＰＡ、ヒトキモトリプシノーゲン、ヒトトリプシノーゲン－２、ヒトＩＬ－２、ｇａｕｓｓｉａ ｌｕｃ、アルブミン（ＨＳＡ）、インフルエンザ血球凝集素、ヒトインスリンまたはカイコフィブロインＬＣからのシグナルペプチドである。
シグナルペプチド、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からのα因子接合ペプチドである。哺乳動物真核細胞における発現に有用なシグナルペプチドは、限定されることなく、ヒトＯＳＭ、ＶＳＶ－Ｇ、マウスＩｇκ、ヒトＩｇＧ２ Ｈ、ＢＭ４０、セクレコン、ヒトＩｇＫＶＩＩＩ、ＣＤ３３、ｔＰＡ、ヒトキモトリプシノーゲン、ヒトトリプシノーゲン－２、ヒトＩＬ－２、ｇａｕｓｓｉａ ｌｕｃ、アルブミン（ＨＳＡ）、インフルエンザ血球凝集素、ヒトインスリンまたはカイコフィブロインＬＣからのシグナルペプチドである。
【0078】
好ましい実施形態において、シグナルペプチドは、ヒトシグナルペプチドである。好ましい実施形態において、シグナルペプチドは、Ｃ４ＢＰα鎖、好ましくはヒトＣ４ＢＰα鎖のシグナルペプチドであり、より好ましくは配列番号４またはその機能的に同等の変異体であり；より好ましくは配列番号４である。
ＭＨＰＰＫＴＰＳＧＡＬＨＲＫＲＫＭＡＡＷＰＦＳＲＬＷＫＶＳＤＰＩＬＦＱＭＴＬＩＡＡＬＬＰＡＶＬＧ（配列番号４）
ＭＨＰＰＫＴＰＳＧＡＬＨＲＫＲＫＭＡＡＷＰＦＳＲＬＷＫＶＳＤＰＩＬＦＱＭＴＬＩＡＡＬＬＰＡＶＬＧ（配列番号４）
【0079】
したがって、一つの実施形態において、シグナルペプチドは配列番号４を含む。別の実施形態において、シグナルペプチドは配列番号４からなる。
【0080】
シグナルペプチドとポリペプチドとを融合させることにより、融合タンパク質が培地に分泌され、これは、細胞外培地からの容易かつ効率的な精製を可能にするため、好ましい戦略である。
【0081】
一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、および（ｃ）オリゴマー化ドメインを含む領域を含む融合タンパク質である。あるいは、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）オリゴマー化ドメインを含む領域、および（ｃ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域を含む融合タンパク質である。これらの実施形態はすべて、本発明のポリペプチドがシグナルペプチド、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインからなる領域、およびオリゴマー化ドメインからなる領域からなる場合に等しく適用され得る。これらの実施形態はすべて、本発明のポリペプチドが、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインの機能的に同等の変異体および／またはオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体によって形成される場合に等しく適用される。
【0082】
一つの実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、配列番号５またはその機能的に同等の変異体を含み、好ましくは配列番号５を含む。別の実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、配列番号５または機能的にその同等の変異体からなり、好ましくは配列番号５からなる。
ＭＨＰＰＫＴＰＳＧＡＬＨＲＫＲＫＭＡＡＷＰＦＳＲＬＷＫＶＳＤＰＩＬＦＱＭＴＬＩＡＡＬＬＰＡＶＬＧＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号５）
ＭＨＰＰＫＴＰＳＧＡＬＨＲＫＲＫＭＡＡＷＰＦＳＲＬＷＫＶＳＤＰＩＬＦＱＭＴＬＩＡＡＬＬＰＡＶＬＧＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号５）
【0083】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドはシグナルペプチドを含まない。
【0084】
別の実施形態において、組換えポリペプチドはＣ４ＢＰα鎖の一部ではないペプチドをさらに含む。
【0085】
一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、オリゴマー化ドメインを含む領域、およびＣ４ＢＰの一部を形成しない配列を含む１つ以上の領域を含む融合タンパク質である。これらの領域はいずれも相互に任意の順序にすることができる。
【0086】
Ｃ４ＢＰα鎖の一部ではないペプチドを含む組換えポリペプチドの例は、例えば、薬物動態学的特性を改善する融合タンパク質であり得る。
【0087】
本発明の組換えポリペプチドは、受容体に対する親和性を調節し、循環半減期を調節し、治療半減期を調節し、ポリペプチドの安定性を調節し、プロテアーゼによる切断を調節し、用量を調節し、放出または生物学的利用能を調節し、精製を容易にし、または特定の投与経路を改善または変更するために改変され得る。同様に、ポリペプチドは、プロテアーゼ切断配列、反応性基、またはポリペプチドの検出、精製または他の特性を改善する他の分子を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、プロテアーゼによって切断されるＭＢＰ配列またはＡＦＶ、ｓｌｙＤ、ｔｓｆ、ＳＵＭＯ、ＢｌａまたはＧＳＴ配列を含む。
【0088】
好ましい実施形態において、Ｃ４ＢＰα鎖の一部ではないペプチドは、タグペプチドである。
【0089】
本明細書で用いられる「タグペプチド」という表現は、組換えポリペプチドの検出、単離および／または精製に適したペプチドを指す。タグの非限定的な例としては、ポリヒスチジン［ｐｏｌｙ（Ｈｉｓ）］配列等のアフィニティー精製タグ；得られる融合タンパク質を免疫親和性クロマトグラフィーによって精製するために用いることができる抗体によって認識され得るペプチド配列、例えば、熱ウイルスの血球凝集素に由来するエピトープ、ｃ－ｍｙｃ－ｔａｇ（抗ｃ－ｍｙｃ抗体によって認識される）；ストレプトアビジン結合ペプチドタグまたはＳＢＰタグ；Ｓ－タグ；カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）；セルロース結合ドメイン；キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）；グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ－タグ；マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）；３×ＨＡタグまたは血球凝集素タグ；ＮｕｓＡ；ＴｒｘＡ；ＤｓｂＡ；Ａｖｉ－タグ；Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ；アルギニンタグ（Ａｒｇ－ｔａｇ）；ＦＬＡＧ－タグ等（Zhao et al. 2013. J. Anal. Methods Chemistry, 2013:581093; Terpe K. 2003. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60(5):523-533）が挙げられる。前記アフィニティー精製タグは、直列的に直接モノマーポリペプチドと融合するか、あるいは、切断可能なリンカー、すなわち、酵素的または化学的手段によって特異的に切断されるアミノ酸配列を含むペプチドセグメント（すなわち、認識／切断部位）を介してモノマーポリペプチドと融合し得る。特定の実施形態において、前記切断可能なリンカーは、タンパク質が翻訳されると、プロテアーゼ（またはプロテアーゼ認識部位）によって切断可能なアミノ酸配列を含む。例えば、切断可能なリンカーは、エンテロキナーゼ、Ａｒｇ Ｃエンドプロテアーゼ、Ｇｌｕ Ｃエンドプロテアーゼ、Ｌｙｓ Ｃエンドプロテアーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ソルターゼＡ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（Zhao et al. 2013. J. Anal. Methods Chem. 2013:581093）、ＳＵＭＯプロテアーゼ（Butt TR. et al. 2005. Protein Expr. Purif. 43(1):1-9）等のプロテアーゼによって切断可能なアミノ酸配列であり得；あるいは、別の特定の実施形態において、前記切断可能なリンカーは、例えば、メチオニン残基を切断する臭化シアン等の化学試薬、または任意の他の適切な化学試薬によって切断可能なアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、切断可能なリンカーはインテインである。好ましい実施形態において、切断可能なリンカーは、エンテロキナーゼによって切断可能なアミノ酸配列であり、好ましくは配列ＤＤＤＤＫ（配列番号５９）である。切断可能なリンカーは、アフィニティー精製タグのその後の除去が望ましい場合に有用である。タグは、モノマーの任意の位置、特にＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインおよびオリゴマー化ドメインのＣ末端またはＮ末端に配置され得る。より好ましい実施形態において、タグペプチドは、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインのＮ末端に連結されている。好ましい実施形態において、タグは、ＴＥＶプロテアーゼによって切断可能なリンカーを介してポリペプチドに連結される。別の実施形態において、タグは、エンテロキナーゼによって切断可能なリンカーを介してポリペプチドに連結される。別の実施形態において、タグは、ポリペプチドと直列的に直接融合される。より好ましい実施形態において、タグはポリ（Ｈｉｓ）タグであり、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個または２０個を超えるヒスチジンを有するポリ（Ｈｉｓ）タグである。好ましい実施形態において、タグはヘキサヒスチジンタグまたはＨｉｓ６－タグである。別の実施形態において、ポリ（Ｈｉｓ）タグは、少なくとも２個のヒスチジン、好ましくは少なくとも５個のヒスチジン、より好ましくは少なくとも６個のヒスチジンを有する。
【0090】
好ましくは、タグはポリ（Ｈｉｓ）タグ、より好ましくはＨｉｓ６－タグであり、タグは、ＴＥＶプロテアーゼによって切断可能なリンカーを介してポリペプチドに連結される。
【0091】
別の実施形態において、タグは、配列番号６０のＳｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩペプチドである。
ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号６０）
ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号６０）
【0092】
当業者であれば、本発明のポリペプチドが２個以上のタグを含み得ることを理解するであろう。したがって、本発明の組換えポリペプチドは、１、２、３、４、５、６個またはそれ以上のタグを有し得、好ましくは２個のタグを有し、より好ましくは１つのタグを有する。好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、ポリ（Ｈｉｓ）タグおよびＳｔｒｅｐタグＩＩを有する。
【0093】
一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、オリゴマー化ドメインを含む領域、および１個以上のタグペプチドを含む融合タンパク質である。これらの領域はいずれも、相互に任意の順序にすることができる。したがって、一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）少なくとも１個のタグペプチド、（ｂ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、および（ｃ）オリゴマー化ドメインを含む領域を含む融合タンパク質である。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、（ｂ）オリゴマー化ドメインを含む領域、および（ｃ）少なくとも１個のタグペプチドを含む融合タンパク質である。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、（ｂ）少なくとも１個のタグペプチド、および（ｃ）オリゴマー化ドメインを含む領域を含む融合タンパク質である。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に（ａ）少なくとも１個のタグペプチド、（ｂ）オリゴマー化ドメインを含む領域、および（ｃ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域を含む融合タンパク質である。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）オリゴマー化ドメインを含む領域、および（ｂ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、および（ｃ）少なくとも１個のタグペプチドを含む融合タンパク質である。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）オリゴマー化ドメインを含む領域、（ｂ）少なくとも１個のタグペプチド、および（ｃ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域を含む融合タンパク質である。当業者であれば、本明細書で用いられる「タグペプチド」への言及は、切断可能なリンカーを含むタグ、または組換えポリペプチドに直接融合されたタグの両方を指すことを理解するであろう。当業者であれば、「少なくとも１個のタグペプチド」という表現は、組換えポリペプチドのタグペプチドが１、２、３、４、５、６個またはそれ以上のタグペプチド、好ましくは２個のタグペプチド、より好ましくは１個のタグペプチドであり得ることを意味することを理解するであろう。当業者であれば、これらの実施形態はすべて、ポリペプチドのＮ末端に追加のメチオニンを含み得ることを理解するであろう。これらの実施形態はすべて、本発明のポリペプチドが、少なくとも１個のタグペプチド、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインからなる領域、およびオリゴマー化ドメインからなる領域からなる場合に等しく適用され得る。これらの実施形態はすべて、本発明のポリペプチドが、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインの機能的に同等の変異体および／またはオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体によって形成される場合に等しく適用される。
【0094】
一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、オリゴマー化ドメインを含む領域、少なくとも１個のタグペプチドおよびシグナルペプチドを含む融合タンパク質である。これらの領域はいずれも、相互に任意の順序にすることができる。一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）少なくとも１個のタグペプチド、（ｃ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、および（ｄ）オリゴマー化ドメインを含む領域を含む融合タンパク質である。一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）少なくとも１個のタグペプチド、（ｃ）オリゴマー化ドメインを含む領域、および（ｄ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域を含む融合タンパク質である。一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）オリゴマー化ドメインを含む領域、（ｃ）少なくとも１個のタグペプチド、および（ｄ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域を含む融合タンパク質である。一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、（ｃ）少なくとも１個のタグペプチド、および（ｄ）オリゴマー化ドメインを含む領域を含む融合タンパク質である。一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、（ｃ）オリゴマー化ドメインを含む領域、および（ｄ）少なくとも１個のタグペプチドを含む融合タンパク質である。一つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）オリゴマー化ドメインを含む領域、（ｃ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含む領域、および（ｄ）少なくとも１個のタグペプチドを含む融合タンパク質である。当業者であれば、本明細書で用いられる「タグペプチド」への言及は、切断可能なリンカーを含むか、または組換えポリペプチドに直接融合されたタグペプチドの両方を指すことを理解するであろう。当業者であれば、「少なくとも１個のタグペプチド」という表現は、組換えポリペプチドのタグペプチドが１、２、３、４、５、６個またはそれ以上のタグペプチド、好ましくは２個のタグペプチド、より好ましくは１個のタグペプチドであり得ることを意味することを理解するであろう。これらの実施形態はすべて、本発明のポリペプチドがシグナルペプチド、少なくとも１個のタグペプチド、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインからなる領域、およびオリゴマー化ドメインからなる領域からなる場合に等しく適用され得る。これらの実施形態はすべて、本発明のポリペプチドが、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインの機能的に同等の変異体および／またはオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体によって形成される場合に等しく適用される。
【0095】
好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、配列番号６またはその機能的に同等の変異体を含み、好ましくは配列番号６を含む。好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、配列番号６またはその機能的に同等の変異体からなり；より好ましくは配列番号６からなる。
ＨＨＨＨＨＨＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号６）
ＨＨＨＨＨＨＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号６）
【0096】
別の実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、配列番号６の配列およびポリペプチドのＮ末端にある追加のメチオニンからなる。
【0097】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号７またはその機能的に同等の変異体を含み、好ましくは配列番号７を含む。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号７または機能的にその同等の変異体からなり；より好ましくは配列番号７からなる。
ＭＨＰＰＫＴＰＳＧＡＬＨＲＫＲＫＭＡＡＷＰＦＳＲＬＷＫＶＳＤＰＩＬＦＱＭＴＬＩＡＡＬＬＰＡＶＬＧＨＨＨＨＨＨＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号７）
ＭＨＰＰＫＴＰＳＧＡＬＨＲＫＲＫＭＡＡＷＰＦＳＲＬＷＫＶＳＤＰＩＬＦＱＭＴＬＩＡＡＬＬＰＡＶＬＧＨＨＨＨＨＨＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号７）
【0098】
別の実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、タグペプチドを含まず；好ましくはタグペプチドおよびシグナルペプチドを含まない。
【0099】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）少なくとも１個のタグペプチド、（ｃ）切断可能なリンカー、（ｄ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、および（ｅ）オリゴマー化ドメインを含むかまたはそれらからなり、好ましくはそれからなる。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）１個のタグペプチド、（ｃ）切断可能なリンカー、（ｄ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、および（ｅ）オリゴマー化ドメインを含むかまたはそれらからなり、好ましくはそれからなる。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）ＣＢ４Ｐα鎖のシグナルペプチド、（ｂ）ポリ（Ｈｉｓ）タグ、（ｃ）ＴＥＶによって切断可能なリンカー、（ｄ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、および（ｅ）Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインを含むかまたはそれからなり、好ましくはそれからなる。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号５６を含むかまたはそれからなり、好ましくはそれからなる。
ＭＨＰＰＫＴＰＳＧＡＬＨＲＫＲＫＭＡＡＷＰＦＳＲＬＷＫＶＳＤＰＩＬＦＱＭＴＬＩＡＡＬＬＰＡＶＬＧＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱＧＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号５６）
ＭＨＰＰＫＴＰＳＧＡＬＨＲＫＲＫＭＡＡＷＰＦＳＲＬＷＫＶＳＤＰＩＬＦＱＭＴＬＩＡＡＬＬＰＡＶＬＧＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱＧＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号５６）
【0100】
別の好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）少なくとも１個のタグペプチド、（ｂ）切断可能なリンカー、（ｃ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、および（ｄ）オリゴマー化ドメインを含むかまたはそれらからなり、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）１個のタグペプチド、（ｂ）切断可能なリンカー、（ｃ）Ｃ４ＢＰα鎖のドメインのＣＣＰ６ドメイン、および（ｄ）オリゴマー化ドメインを含むかまたはそれらからなり、好ましくはそれからなる。好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端方向に、（ａ）ポリ（Ｈｉｓ）タグ、（ｂ）ＴＥＶによって切断可能なリンカー、（ｃ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、および（ｄ）Ｃ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインを含むかまたはそれらからなり、好ましくはそれからなる。当業者であれば、これらの実施形態はすべて、Ｎ末端にメチオニンを有する組換えポリペプチドに適用され得ることを理解するであろう。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号５７を含むかまたはそれからなり、好ましくはそれからなる。
ＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱＧＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号５７）
ＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱＧＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号５７）
【0101】
別の実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、配列番号５７の配列およびポリペプチドのＮ末端にある追加のメチオニンからなる。
【0102】
別の好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）グリシン残基、（ｂ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、（ｃ）オリゴマー化ドメイン、好ましくはＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインを含むかまたはそれからなり、好ましくはそれからなる。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号５８を含むかまたはそれからなり、好ましくはそれからなる。
ＧＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号５８）
ＧＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号５８）
【0103】
好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）メチオニンまたはシグナルペプチド、（ｂ）２個のタグペプチド、（ｃ）切断可能なリンカー、（ｄ）Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、および（ｅ）オリゴマー化ドメインを含むかまたはそれからなり、好ましくはそれからなる。より好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）メチオニンまたはシグナルペプチド、（ｂ）Ｈｉｓ６－タグ、（ｃ）Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ、（ｄ）エンテロキナーゼによって切断可能なリンカー、（ｅ）ヒトＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、および（ｆ）ヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインを含むかまたはそれからなり、好ましくはそれからなる。好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）メチオニン、（ｂ）Ｈｉｓ６－タグ、（ｃ）配列番号６０のＳｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ、（ｄ）エンテロキナーゼによって切断可能な配列番号５９のリンカー、（ｅ）ヒトＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、および（ｆ）ヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインを含むかまたはそれからなり、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）Ｈｉｓ６－タグ、（ｃ）配列番号６０のＳｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ、（ｄ）エンテロキナーゼによって切断可能な配列番号５９のリンカー、（ｅ）ヒトＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、および（ｆ）ヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインを含むかまたはそれからなり、好ましくはそれからなる。好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは配列番号６１を含む。より好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは配列番号６１からなる。
ＭＨＨＨＨＨＨＷＳＨＰＱＦＥＫＤＤＤＤＫＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号６１）
ＭＨＨＨＨＨＨＷＳＨＰＱＦＥＫＤＤＤＤＫＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号６１）
【0104】
好ましくは、本発明の組換えポリペプチドは、７５～１０００個のアミノ酸、より好ましくは１００～８００個のアミノ酸、より好ましくは１００～６００個のアミノ酸、より好ましくは１１０～５５０個のアミノ酸、より一層好ましくは１１５～５５０個のアミノ酸、より一層好ましくは１１９～５５０個のアミノ酸のサイズを有する。一つの実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、好ましくは、少なくとも９０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１１０個のアミノ酸、少なくとも１１５個のアミノ酸、少なくとも１１９個のアミノ酸、少なくとも１２０個のアミノ酸、少なくとも１３０個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸を有する。好ましい実施形態において、本発明の組換えポリペプチドは、１１５～６５０個のアミノ酸、好ましくは１１９～５５０個のアミノ酸のサイズを有する。
【0105】
好ましい実施形態において、挿入が行われる場合、ポリペプチドのサイズは、好ましくは、Ｃ４ＢＰα鎖の野生型配列の長さに対して２０個のアミノ酸を超えず、好ましくは１５個のアミノ酸を超えず、より好ましくは１０個のアミノ酸を超えない。したがって、例えば、挿入によって改変される場合、ヒトＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインを含むタンパク質は、望ましくは６１７個以下のアミノ酸である。
【0106】
当業者であれば、本発明の組換えポリペプチドの異なるドメインがスペーサーによって連結され得ることを理解するであろう。本明細書に開示されるように、スペーサーは、適切な長さおよび特性のペプチドを接続または連結する挿入物（insert）である。一般に、上記スペーサーは上記ドメイン間のヒンジ領域として機能し、個々のドメインの三次元形態を維持しながら、それらが互いに独立して移動することを可能にする。この意味で、好ましいスペーサーは、この動きを可能にする構造的延性または可撓性によって特徴付けられるヒンジ領域であり得る。スペーサーの長さは様々である。典型的には、スペーサー中のアミノ酸の数は、１００個以下のアミノ酸、好ましくは５０個以下のアミノ酸、より好ましくは４０個以下のアミノ酸、より一層好ましくは３０個以下のアミノ酸、さらにより一層好ましくは２０個以下のアミノ酸である。
【0107】
あるいは、適切なスペーサーは、コイルドコイルによる二量体化抗体の産生に用いられ、本発明におけるスペーサーペプチドとして有用であり得るマウスＩｇＧ３の上部ヒンジ領域の１０個のアミノ酸残基の配列をベースとし得る（Pack P. and Pluckthum, A., 1992, Biochemistry 31:1579-1584）。それはまた、ヒトＩｇＧ３または他のヒトＩｇサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＭおよびＩｇＡ）の上部ヒンジ領域の対応する配列であり得る。ヒトＩｇの配列は、ヒトにおいて免疫原性であるとは予測されていない。本発明で用いられ得る追加のスペーサーとしては、アミノ酸配列ＧＡＰ、ＡＡＡのペプチドが挙げられる。
【0108】
特定の実施形態において、上記スペーサーは、構造的可撓性を有するペプチド（すなわち、可撓性連結ペプチドまたは「可撓性リンカー」）である。一般に、そのようなリンカーは、長さが１～２０個のアミノ酸、例えば、長さが２～１０個のアミノ酸のような数アミノ酸の長さである。これらのアミノ酸は、グリシン、セリン、アラニン、スレオニンからなる群から選択される。別の特定の実施形態において、可撓性リンカーは、アミノ酸残基、特にＧｌｙおよびＳｅｒの繰り返し、またはアミノ酸残基の他の任意の適切な繰り返しを含むペプチドである。本発明によれば、実質的に任意の可撓性リンカーをスペーサーとして用いることができる。そのようなリンカーの１つは（Ｇｌｙｍ－Ｓｅｒ）ｎリンカーであり、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１～４である。これらは、タンパク質ドメインを互いに付着させるために当技術分野で用要られている。したがって、第１の構成要素は、そのようなリンカーによって第２の構成要素と連結され得る。
【0109】
好ましい実施形態において、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインとオリゴマー化ドメインとは直接連結されている。別の実施形態において、それらは可撓性リンカーを介して連結されている。より好ましい実施形態において、可撓性リンカーは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の残基である。
【0110】
タンパク質の発現に適したアミノ酸の配列を組み込む必要がある場合があることが理解されよう。これには、少なくともＮ末端メチオニンが含まれる。Ｎ末端配列は、配列の全部または一部を化学的または酵素的に除去するための切断部位を含み得る。
【0111】
本発明の組換えポリペプチドは、公知の様々な化学基または分子のいずれかを含むように改変することができる。そのような改変としては、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、ポリエチレングリコールへの共有結合（例えば、ＰＥＧ化）、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、エステル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ユビキチン化、脂肪酸による修飾、アルギニル化等のタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加等が挙げられる。アミノ酸の類似体（非天然アミノ酸を含む）および置換された結合を有するペプチドも含まれる。
【0112】
本発明の組換えポリペプチドは、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術によって得ることができる。簡単に説明すると、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインおよびオリゴマー化ドメインをコードする組換え核酸が真核細胞または原核細胞で発現され、生成物が回収される。
【0113】
ポリペプチドの発現は、シグナル配列の切断および／またはタグペプチドの切断等の翻訳後修飾を伴うことが多いことを理解されたい。
【0114】
当業者であれば、本発明の組換えポリペプチドが全体として、Ｃ４ＢＰα鎖の元のＣＣＰ６ドメインの寛容原性表現型を誘導する能力および元のオリゴマー化ドメインのオリゴマーを形成する能力、具体的には、ヒトＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインの寛容原性表現型を誘導する能力およびＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインのオリゴマーを形成する能力、より具体的には、寛容原性表現型を誘導する能力および配列番号６の組換えポリペプチドのオリゴマーを形成する能力を実質的に保存する必要があることを理解するであろう。
【0115】
Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインまたはオリゴマー化ドメインに言及するすべての実施形態は、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインの機能的に同等の変異体およびオリゴマー化ドメインの機能的に同等の変異体に等しく適用される。
【0116】
本発明のホモオリゴマー
本発明らは、本発明の組換えポリペプチドがオリゴマー化して、７つの同一のモノマーのホモオリゴマー、すなわち本発明の７つの組換えポリペプチドを形成することを見出した。遺伝子発現実験（図１３、１４、１６、１７および１８）および調節性または寛容原性マクロファージへの変換（図１５）に示されるように、本発明のホモオリゴマーが、Ｃ４ＢＰの生理学的アイソフォーム（Ｃ４ＢＰ（β－））と比較して、単核食細胞、主に樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージの成熟を高い特異性および優れた効率で調節することができるため、本発明者らは、本発明のホモオリゴマーが医薬活性原理として潜在的に非常に魅力的であることを見出した。
本発明らは、本発明の組換えポリペプチドがオリゴマー化して、７つの同一のモノマーのホモオリゴマー、すなわち本発明の７つの組換えポリペプチドを形成することを見出した。遺伝子発現実験（図１３、１４、１６、１７および１８）および調節性または寛容原性マクロファージへの変換（図１５）に示されるように、本発明のホモオリゴマーが、Ｃ４ＢＰの生理学的アイソフォーム（Ｃ４ＢＰ（β－））と比較して、単核食細胞、主に樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージの成熟を高い特異性および優れた効率で調節することができるため、本発明者らは、本発明のホモオリゴマーが医薬活性原理として潜在的に非常に魅力的であることを見出した。
【0117】
したがって、一つの態様において、本発明は、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に同等の変異体およびオリゴマー化ドメインを含む少なくとも６つの組換えポリペプチドのホモオリゴマーに関し、このポリペプチドはＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４、ＣＣＰ５、ＣＣＰ７およびＣＣＰ８ドメインを含まない。
【0118】
本明細書で用いられる「ホモオリゴマー」という表現は、同一のモノマーによって形成されるオリゴマーを指す。本明細書で用いられるオリゴマーは、いくつかの繰り返し単位からなるタンパク質またはポリペプチドの非共有結合によって形成される高分子複合体である。各繰り返し単位はモノマーである。特に、本発明のホモオリゴマーは、それぞれ６個または７個のモノマーから構成される六量体または七量体である。本発明のホモオリゴマーの各モノマーは、本発明の組換えポリペプチドである。
【0119】
したがって、本発明において有用であるホモオリゴマーは、本発明の複数の組換えポリペプチドの会合によって生じ、β鎖を欠く任意のホモオリゴマーを含む。例えば、本発明のホモオリゴマーは、少なくとも６個、少なくとも７個、または少なくとも８個のモノマー、すなわち、本発明の組換えポリペプチドを含み得る。一つの実施形態において、ホモオリゴマーは、本発明の７個の組換えポリペプチドによって形成される。
【0120】
一つの実施形態において、本発明のホモオリゴマーは、本発明の少なくとも６個の組換えポリペプチドを含み；具体的には、本発明の６、７または８個のポリペプチドを含み；具体的には、本発明の６または７個のポリペプチドを含み、より具体的には本発明の７個のポリペプチドを含む。
【0121】
好ましい実施形態において、本発明のホモオリゴマーは、本発明の６、７または８個のポリペプチドからなる。より好ましい実施形態において、本発明のホモオリゴマーは、本発明の６または７個のポリペプチドからなる。
【0122】
一つの実施形態において、本発明のホモオリゴマーは、６個のモノマー鎖からなり、すなわち、本発明の６個の組換えポリペプチドからなる。
【0123】
好ましい実施形態において、本発明のホモオリゴマーは、７個のモノマー鎖からなり、すなわち、本発明の７個のポリペプチドからなる。
【0124】
一つの実施形態において、ホモオリゴマーは、本発明の７個の組換えポリペプチドからなり、各組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に同等の変異体およびオリゴマー化ドメインを含む。好ましい実施形態において、ホモオリゴマーは、本発明の７個の組換えポリペプチドからなり、各組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に向けて、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインおよびＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインからなる。より好ましい実施形態において、ホモオリゴマーは、本発明の７個の組換えポリペプチドからなり、各組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に向けて、ヒトＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインおよびヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインからなる。この最後の実施形態において、ＣＣＰ６ドメインおよびオリゴマー化ドメインは直接連結されている。
【0125】
好ましい実施形態において、ホモオリゴマーを形成するポリペプチドは、配列番号６またはその機能的に同等の変異体からなるポリペプチドであり、具体的には配列番号６からなるポリペプチドである。
【0126】
本発明の組換えポリペプチドについてすでに記載されたすべての用語および実施形態は、本発明のホモオリゴマーに等しく適用され得る。
【0127】
ホモオリゴマーを得るためには、例えば、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメイン、およびＣＣＰ６ドメインをコードするＤＮＡ配列の３’末端がオリゴマー化ドメインをコードするＤＮＡ配列の５’末端にライゲーションされたオリゴマー化ドメインをコードする組換え配列の作製が含まれる。適切な宿主で発現することにより、このハイブリッドＤＮＡ配列は、オリゴマー、具体的にはホモオリゴマー、より具体的には７個の同一の組換えポリペプチドによって形成される七量体に組み立てられる本発明の組換えポリペプチドを生成する。
【0128】
好ましい実施形態において、本発明のホモオリゴマーを形成する組換えポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含まない。例えば、本発明のポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の一部を形成する領域を含む融合タンパク質であってはならない。
【0129】
当業者であれば、本発明のホモオリゴマーが、通常、本発明の組換えポリペプチドの成熟形態によって形成されること、すなわち、本発明の組換えポリペプチドのシグナルペプチドが、通常、分泌される前に切断されることを理解するであろう。したがって、好ましい実施形態において、本発明のホモオリゴマーは、シグナルポリペプチドを含まない組換えポリペプチドによって形成される。
【0130】
一方、本発明のホモオリゴマーは、タグペプチドを維持する組換えポリペプチドによって形成することができる。これは、通常は削除する必要がないＨｉｓ（６）タグ、ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩ、ＣＢＰ等の小さなサイズのタグの場合である。したがって、一つの実施形態において、本発明のホモオリゴマーは、少なくとも１個のタグペプチドを含む組換えポリペプチドによって形成される。
【0131】
しかしながら、場合によっては、タグペプチドを除去することが好ましい場合がある。好ましくは、タグペプチドは、ホモオリゴマーを形成する組換えポリペプチドの成熟形態において切断される。したがって、別の実施形態において、本発明のホモオリゴマーは、タグペプチドを含まない組換えポリペプチドによって形成される。例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグとＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインとがＴＥＶプロテアーゼによって切断可能なリンカーによって融合されており、プロテアーゼによって認識される配列がＥＮＬＹＦＱ／Ｇ（配列番号５９）である場合、ＴＥＶプロテアーゼはＱ残基とＧ残基との間で切断するので、本発明のホモオリゴマーを形成する本発明の組換えポリペプチドの成熟型はＮ末端にグリシン残基を有し得る。このグリシン残基は、本発明の組換えポリペプチドの活性に影響を及ぼさない。したがって、本発明のホモオリゴマーを形成する本発明の組換えポリペプチドは、その活性に影響を及ぼさない、または細菌におけるその発現を可能にするために添加される切断可能なリンカーの切断の結果として、そのＮ末端に追加のアミノ酸（例えば、追加のメチオニン）を有し得る。
【0132】
したがって、一つの実施形態において、本発明のホモオリゴマーの組換えポリペプチドは、そのＮ末端に追加のアミノ酸を有する。
【0133】
一つの実施形態において、本発明のホモオリゴマーの組換えポリペプチドは、シグナルペプチドおよびタグペプチドを含まない。
【0134】
本発明のホモオリゴマーは、用いられる組換え発現系において自発的に会合する。複合体が本発明のホモオリゴマーであるかどうかを評価する方法は、オリゴマー化ドメインの変異体との関連でこれまでに開示されている。
【0135】
本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。したがって、別の態様において、本発明は、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に同等の変異体およびオリゴマー化ドメインを含む組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、上記ポリペプチドはＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４、ＣＣＰ５、ＣＣＰ７およびＣＣＰ８ドメインを含まない。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。したがって、別の態様において、本発明は、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に同等の変異体およびオリゴマー化ドメインを含む組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、上記ポリペプチドはＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４、ＣＣＰ５、ＣＣＰ７およびＣＣＰ８ドメインを含まない。
【0136】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は互換的に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知または未知の任意の機能を発揮し得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、一本鎖、二本鎖および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離された任意の配列のＤＮＡ、単離された任意の配列のＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーを含む。天然の核酸分子に加えて、本発明の核酸分子は、改変された核酸分子をも含み得る。本明細書で用いられる場合、ｍＲＮＡとは、細胞内で翻訳され得るＲＮＡを指す。
【0137】
本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターが、ポリペプチドが発現される細胞と適合性であるという条件で、本発明のポリペプチドをコードする領域の転写を調節する単一のプロモーター領域をさらに含み得る。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それ自体で単離されているか、またはベクターの一部を形成して、適切な宿主細胞におけるポリヌクレオチドの増殖を可能にすることが見出され得る。
【0138】
したがって、別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【0139】
発現ベクターの選択は、ホストの選択に依存する。ポリヌクレオチドの挿入に適したベクターは、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびその誘導体、ｐＥＴおよびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、Ｃｏ１Ｅ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８等の「シャトル」ベクター、２ミクロンプラスミドのタイプのベクター等の酵母における発現ベクター、組み込みプラスミド、ＹＥＰベクター、ｐＢＧＺαベクター、セントロメアプラスミド等、ｐＡＣシリーズのベクターおよびｐＶＬベクター等の昆虫細胞における発現ベクター、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズ等の植物における発現ベクター、および市販のバキュロウイルスシステムを用いた昆虫細胞のトランスフェクションに適したバキュロウイルスを含む真核細胞における発現ベクターである。真核生物細胞用のベクターとしては、好ましくはウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、特にレンチウイルス）、ならびにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１－ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＭＣＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦＩ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ－ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびＰＫＳＶ－１０、ｐＢＰＶ－１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１等の非ウイルスベクターが挙げられる。好ましい実施形態において、ベクターはｐｃＤＮＡ３．１である。
【0140】
ベクターはまた、ベクターと接触させた後にベクターに組み込まれた細胞を同定することを可能にするレポーター遺伝子またはマーカー遺伝子を含み得る。本発明において有用なレポーター遺伝子としては、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ＧＦＰ等が挙げられる。本発明において有用なマーカー遺伝子としては、例えば、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を付与するネオマイシン耐性遺伝子；ハイグロマイシンへの耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；オルニチンデカルボキシラーゼ（２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン（ＤＦＭＯ））の阻害剤に対する耐性を付与するＯＤＣ遺伝子；メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子；ピューロマイシンに対する耐性を付与するピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ遺伝子；ゼオシンに対する耐性を付与するｂｌｅ遺伝子；９－β－Ｄ－キシロフラノースアデニンに対する耐性を付与するアデノシンデアミナーゼ遺伝子；Ｎ－（ホスホンアセチル）－Ｌ－アスパラギン酸の存在下で細胞を成長させるシトシンデアミナーゼ遺伝子；アミノプテリンの存在下で細胞を成長させるチミジンキナーゼ；キサンチンの存在下およびグアニンの非存在下で細胞を成長させるキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子；トリプトファンではなくインドールの存在下で細胞を成長させるＥ．ｃｏｌｉのｔｒｐＢ遺伝子；細胞がヒスチジンではなくヒスチジノールを利用できるようにするＥ．ｃｏｌｉのｈｉｓＤ遺伝子が挙げられる。選択遺伝子は、真核生物細胞における遺伝子発現に適したプロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーター）、最適化された翻訳開始部位（例えば、いわゆるコザックルールまたはＩＲＥＳに従う部位）、例えばＳＶ４０ポリアデニル化またはホスホグリセリン酸キナーゼ部位等のポリアデニル化部位、例えばβグロブリン遺伝子イントロン等のイントロンをさらに含み得るプラスミドに組み込まれる。あるいは、同じベクターにおいてレポーター遺伝子およびマーカー遺伝子の両方を同時に用いることも可能である。
【0141】
本発明のポリヌクレオチドが作動可能に連結され得るプロモーターおよびクローニング部位の両方を含むベクターもまた、本発明により提供される。このようなベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することがでる。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変更して、発現を転写または翻訳のレベルで干渉または低減し得る、余分で潜在的な不適切な代替翻訳開始コドンまたは他の配列を除去する必要があり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位が開始コドンの５’の直近に挿入されて発現を増強し得る。遺伝子送達媒体には、ＤＮＡ／リポソーム複合体、および標的ウイルスタンパク質－ＤＮＡ複合体を含むいくつかの非ウイルスベクターも含まれる。標的化抗体またはその断片も含むリポソームを、本発明の方法で用いることができる。細胞への送達を増強するために、本発明の核酸またはタンパク質を、細胞表面抗原に結合する抗体またはその結合断片に結合させることができる。
【0142】
当技術分野で公知であるように、本発明のＤＮＡ配列の発現のために、ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター中の発現制御配列に作動可能に連結され、適切な単細胞宿主を形質転換するためにその発現ベクターで用いられるべきである。もちろん、本発明のＤＮＡ配列の発現制御配列へのそのような作動可能な連結は、ＤＮＡ配列の上流の正しいリーディングフレームにおける翻訳開始シグナルの提供を含む。発現する特定のＤＮＡ配列がメチオニンで始まらない場合、開始シグナルにより、生成物のＮ末端に追加のアミノ酸（メチオニン）が配置される。そのようなメチオニル含有生成物は本発明の方法において直接用いられ得るが、通常、使用前にメチオニンを除去することがより望ましい。それらと共に発現されるポリペプチドからそのようなＮ末端メチオニンを除去するための方法は、当業者に公知である。例えば、特定の宿主および発酵条件は、ｉｎ ｖｉｖｏで実質的にすべてのＮ末端メチオニンの除去を可能にする。他の宿主は、Ｎ末端メチオニンのｉｎ ｖｉｔｒｏ除去を必要とする。しかしながら、そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの方法は、当技術分野において公知である。
【0143】
別の態様において、本発明は、上述のようなベクターを含む宿主細胞に関する。「宿主細胞」という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代（progeny）または潜在的な後代を指すものとして用いられる。突然変異または環境の影響のいずれかにより特定の改変が次世代で発生する可能性があるため、そのような後代は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で用いられる用語の範囲内に含まれる。
【0144】
本発明の組換えポリペプチドは、公知の組換えポリペプチド産生システムのいずれかで発現させることができる。
【0145】
多種多様な単細胞宿主細胞もまた、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに有用である。好ましい実施形態において、宿主細胞は、細菌、酵母、および哺乳動物の真核細胞から選択される。これらの宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、シュードモナス（Pseudomonas）、バチルス（Bacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、サーモフィルス（Thermophilus）、サルモネラ（Salmonella）、エンテロバクテリアセア（Enterobacteriaceae）またはストレプトマイセス（Streptomyces）の株、酵母等の真菌、およびＣＨＯおよびマウス細胞等の動物細胞、ｃｏｓ－１、ＣＯＳ－７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０等のアフリカグリーンモンキー（African green monkey）の細胞、昆虫細胞、ならび組織培養におけるにヒト細胞および植物細胞等の公知の真核生物および原核生物の宿主が挙げられる。動物細胞の発現には、ＣＨＯ、ＣＯＳ－７細胞、ＨＥＫ２９３細胞が好ましく、ＨＥＫ２９３細胞がより好ましい。
【0146】
例えば、本発明の方法においてエシェリヒア（Escherichia）属のＥ．ｃｏｌｉが用いられる場合、用いられるこの細菌の好ましい菌株としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、およびＣ４１（ＤＥ３）、Ｃ４３（ＤＥ３）またはＣ０２１４（ＤＥ３）、Ｃ３０３０Ｈを含むその誘導体、または組換えタンパク質発現の毒性に耐性を有する他の株が挙げられる。より一層好ましくは、プロモーターがＴ７プロモーターでない場合、プロファージＤＥ３を欠くこれらの株の誘導体を用いることができる。
【0147】
好ましい実施形態において、発現カセットは、同一のオープンリーディングフレームの５’から３’に、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインをコードするヌクレオチド配列およびオリゴマー化ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書で用いられる「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」という用語は、ＡＴＧまたはＡＵＧ等の翻訳開始シグナルまたは開始コドン、および終止コドンを含むＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸の長さを意味し、ポリペプチド配列に翻訳される可能性がある。上記のＤＮＡ配列は、内部終止コドンを含まず、一般にペプチドに翻訳することができる。
【0148】
好ましい実施形態において、発現カセットは、５’から３’に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のタグをコードするヌクレオチド配列、選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列、第２のタグをコードするヌクレオチド配列、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインをコードするヌクレオチド配列およびオリゴマー化ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、発現カセットは、５’から３’に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のタグをコードするヌクレオチド配列、第２のタグをコードするヌクレオチド配列、切断可能なリンカーをコードするヌクレオチド配列、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインをコードするヌクレオチド配列およびオリゴマー化ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、発現カセットは、５’から３’に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、タグをコードするヌクレオチド配列、切断可能なリンカーをコードするヌクレオチド配列、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインをコードするヌクレオチド配列およびオリゴマー化ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、発現カセットは、５’から３’に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、タグをコードするヌクレオチド配列、Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインをコードするヌクレオチド配列およびオリゴマー化ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。より好ましい実施形態において、すべての要素が同一のオープンリーディングフレーム内にある。より一層好ましい実施形態において、すべての要素は、調節ヌクレオチド配列の操作制御下にある。好ましい実施形態において、第１のタグは第２のタグとは異なる。
【0149】
好ましい実施形態において、配列番号７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号９のポリヌクレオチドである。
【0150】
ヌクレオチド配列をベクターにクローニングし、本発明の組換えポリペプチドを発現および精製するための方法は、当技術分野において公知である。発現および精製のための例示的な条件は、本発明の実施例の材料および方法のセクションに示されている。
【0151】
本発明の組換えポリペプチドおよび本発明のホモオリゴマーについてすでに記載されたすべての用語および実施形態は、本発明のヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞に等しく適用され得る。
【0152】
本発明の医薬組成物
本発明のさらなる態様は、本発明の組換えポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の寛容原性樹状細胞、本発明の寛容原性マクロファージまたは本発明の細胞集団と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。
本発明のさらなる態様は、本発明の組換えポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の寛容原性樹状細胞、本発明の寛容原性マクロファージまたは本発明の細胞集団と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。
【0153】
本発明の治療方法は、これらの組成物を用いて薬学的に許容可能な方法で患者を治療する工程を含む。これらの組成物は、ヒトを含む任意の哺乳動物を治療するために用いることができる。
【0154】
本発明の医薬組成物は、様々な形態を採り得る。そのような形態としては、例えば、錠剤、丸薬、粉末、液体溶液または懸濁液、リポソーム、坐剤、注射可能な溶液および注入可能な溶液、ならびに徐放性形態等の固体、半固体および液体の剤形が挙げられる。一般に、本発明の医薬組成物は、例えば、αインターフェロン等の薬学的に重要なポリペプチドについて用いられるのと同様の方法および組成物を用いて製剤化および投与することができる。したがって、本発明の組換えタンパク質は、凍結乾燥形態で保存され、投与直前に滅菌水で再構成され、非経口、皮下、静脈内、筋肉内または病巣内の経路等の従来の投与経路によって投与され得る。好ましい実施形態において、本発明の化合物は皮下投与される。
【0155】
組成物は、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液または乳濁液である医薬組成物であり得、生理学的に許容可能または適切な担体をさらに含む。薬学的に許容可能または適切な担体としては、賦形剤（すなわち、有効成分の活性を妨害しない非毒性物質）および／または希釈剤が挙げられ得る（または言及され得る）。そのような組成物は、固体、液体または気体（エアロゾル）の形態であり得る。あるいは、本明細書に記載の組成物は、凍結乾燥物として製剤化されてもよく、または化合物は、当技術分野において公知の技術を用いてリポソーム内にカプセル化されてもよい。医薬組成物はまた、生物学的に活性または不活性な他の成分を含み得る。このような成分としては、限定されないが、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストランス）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、またはグリシン等のアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオン等のキレート剤、安定化剤、染料、香味剤ならびに懸濁剤および／または保存剤が挙げられる。
【0156】
医薬組成物において用いるための当業者に公知の任意の適切な賦形剤または担体を、本明細書に記載の組成物に用いることができる。治療に用いるための賦形剤は公知であり、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro ed. 1985)に記載されている。一般に、賦形剤の種類は、投与方法に基づいて選択される。医薬組成物は、例えば、局所、経口、鼻腔内、髄腔内、直腸、膣、眼内、結膜下、舌下または非経口投与、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内（intrasternal）、海綿体内（intracavernous）、管内（intrameatal）または尿道内への注射または注入を含む任意の適切な投与方法のために製剤化することができる。非経口投与の場合、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与の場合、上記の賦形剤のいずれか、またはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、グルコース、スクロースおよび／または炭酸マグネシウム等の固体の賦形剤または担体を用いることができる。
【0157】
医薬組成物（例えば、経口投与または注射による送達用）は、液体の形態であり得る。液体の医薬組成物は、例えば、以下のうちの１種以上を含んでもよい：注射用水、生理食塩水（saline solution）、好ましくは生理食塩水（physiological saline）、リンガー液、等張塩化ナトリウム、溶媒または懸濁化剤として機能し得る固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒等の滅菌希釈剤；抗菌剤；抗酸化剤；キレート剤；塩化ナトリウムおよびデキストロース等の張性（tonicity）を調節するための緩衝液および試薬。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与バイアルに入れることができる。生理食塩水を用いることが好ましく、注射可能な医薬組成物は好ましくは無菌である。
【0158】
ポリペプチド、ホモオリゴマー、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、寛容原性樹状細胞または寛容原性マクロファージを含む本明細書に記載の薬剤は、持続放出性または徐放性として製剤化されてもよい。そのような組成物は、一般に、公知の技術を用いて調製され、例えば、経口、直腸または皮下移植によって、または所望の標的部位への移植によって投与され得る。徐放性製剤は、担体マトリックスに分散され、かつ／または速度制御膜に囲まれたリザーバー内に含まれる薬剤を含み得る。そのような製剤内で用いるための賦形剤は生体適合性であり、生分解性でもあり得；好ましくは、製剤は、比較的一定レベルの活性成分放出を提供する。徐放性製剤に含まれる活性化合物の量は、移植部位、放出の速度と期待される期間、および治療または予防される状態の性質に依存する。
【0159】
医薬組成物は、医学技術の当業者によって決定されるように、治療される（または予防される）疾患に適切な方法で投与され得る。適切な用量ならびに適切な投与の期間および頻度は、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度、有効成分の特定の形態、および投与方法等の要因によって決定される。一般に、適切な用量および治療レジメンは、治療的および／または予防的利益（例えば、より頻繁な完全または部分的寛解、またはより長い無病および／または全生存期間、または症状の重症度の軽減）を提供するのに十分な量の組成物を提供する。予防的使用の場合、免疫学的疾患または障害に関連する疾患の予防、発症の遅延、または重症度の軽減に十分な用量とすべきである。
【0160】
最適用量は、一般に、実験モデルおよび／または臨床試験を用いて決定することができる。最適用量は、患者の質量（mass）、体重または血液量によって異なる。一般に、ある用量で存在する、またはある用量で存在するＤＮＡによってその場で産生されるポリペプチドの量は、宿主１ｋｇあたり約０．０１～約１０００μｇの範囲である。通常、効果的な治療を提供するのに十分な最小投与量の使用が好ましい。患者は、一般に、治療または予防されている状態に適したアッセイを用いて、治療または予防の有効性についてモニターされ、このアッセイは、当業者によく知られているであろう。液体の形態で投与される場合、適切な用量サイズは患者のサイズによって異なるが、通常、１０～６０ｋｇの対象に対して約１～５００ｍｌ（１ｋｇあたり約０．０１～約１０００μｇを含む）の範囲である。
【0161】
好ましい実施形態において、医薬組成物は、本発明のホモオリゴマーを０．４５～１８．９０ｍｇ、より好ましくは０．４５～９．４５ｍｇ、より好ましくは０．５６～８．５１ｍｇ、より好ましくは０．７５～８．１３ｍｇ、より一層好ましくは０．７９～８．０５ｍｇ含む。好ましい実施形態において、用量は０．７９ｍｇである。別の好ましい実施形態において、用量は０．８ｍｇである。別の好ましい実施形態において、用量は８ｍｇである。別の好ましい実施形態において、用量は８．０５ｍｇである。
【0162】
一つの実施形態において、医薬組成物は、本発明の化合物を７．５６～１８．９０ｍｇ、好ましくは９．４５～１５．１３ｍｇ、好ましくは１１．３５～１５．１３ｍｇ、好ましくは１３．２４～１５．１３ｍｇ含む。
【0163】
一つの実施形態において、医薬組成物は、本発明の化合物を１．８９～１７．０２ｍｇ、好ましくは３．７８～１５．１３ｍｇ、好ましくは５．６７～１３．２４ｍｇ、より好ましくは７．５６～１１．３５ｍｇ含む。
【0164】
一つの実施形態において、医薬組成物は、本発明の化合物を０．５～９ｍｇ、より好ましくは０．７５～８．５ｍｇ含む。別の実施形態において、組成物は、本発明の化合物を７～１８．９０ｍｇ、より好ましくは７．５～１８ｍｇ、より好ましくは９～１５ｍｇ、より好ましくは１１～１５ｍｇ、より一層好ましくは１３～１５ｍｇ含む。別の実施形態において、医薬組成物は、本発明の化合物を１～１７ｍｇ、好ましくは３～１５ｍｇ、好ましくは５～１３ｍｇ、より好ましくは７～１１ｍｇ含む。
【0165】
アプタマーを含む核酸分子である薬剤を含む医薬組成物の場合、核酸分子は、核酸、ならびに、例えば本明細書で提供されるような組換え発現構築物等の細菌、ウイルスおよび哺乳動物の発現系を含む当業者に公知の様々な送達システム中に存在し得る。ＤＮＡをそのような発現系に組み込むための技術は当業者に公知である。ＤＮＡは、例えば、Ulmer et al., Science 259:1745-49, 1993 and reviewed by Cohen, Science 259:1691-1692, 1993によってレビューされているように、「裸（naked）」であってもよい。裸のＤＮＡの取り込みは、細胞内に効率的に輸送される生分解性ビーズにコーティングすることにより増加する。
【0166】
核酸分子は、当技術分野において記載されているいくつかの方法のいずれか１つによって細胞に送達することができる（例えば、Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2:139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., Mol. Membr. Biol. 16:129-40 (1999); Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol. 137:165-92 (1999); Lee et al., ACS Symp. Ser. 752:184-92 (2000); 米国特許第6,395,713号; 国際公開第WO 94/02595号); Selbo et al., Int. J. Cancer 87:853-59 (2000); Selbo et al., Tumour Biol. 23:103-12 (2002); 米国特許出願公開第2001/0007666号および同第2003/077829号を参照のこと）。当業者に公知のそのような送達方法としては、限定されないが、リポソームへのカプセル化、イオン導入（iontophoresis）、または生分解性ポリマー；ハイドロゲル；シクロデキストリン（例えば、Gonzalez et al., Bioconjug. Chem. 10: 1068-74 (1999); Wang et al., International Application Publication Nos. WO 03/47518およびWO 03/46185を参照のこと）；ポリ（乳酸－コ－グリコール）酸（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフェア（ペプチドおよびポリペプチドおよび他の物質の送達にも有用）（例えば、米国特許第6,447,796号; 米国特許出願公開第2002/130430号を参照）；生分解性ナノカプセル；および生体接着性ミクロスフェア、またはタンパク質性ベクター（国際公開第WO00/53722号）等の他の媒体への組み込みによるものが挙げられる。別の実施形態において、免疫細胞における免疫応答を変化させる（抑制または増強する）ため、および免疫学的疾患または障害を治療するために用いる核酸分子はまた、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、例えば、ポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＧＡＬ）誘導体またはポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－トリ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ｔｒｉＧＡＬ）誘導体（例えば、米国特許出願公開第2003/0077829号も参照されたい）と共に製剤化されるかまたは複合化（complexed）されてもよい。
【0167】
本発明の医薬組成物／医薬品は、上述したような、例えば有効成分、例えば抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ１５４抗体、抗ＣＤ１３４Ｌ抗体等の他の免疫調節抗体、または、限定されないが、ｒＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ｒＯＸ４０（ＣＤ１３４）等の組換えタンパク質、または抗炎症剤、または、限定されないが、シクロスポリンＡ、ＦＴＹ７２０、ＲＡＤ、ラパマイシン、ＦＫ５０６、１５－デオキシスペルグアリン、ステロイド等の免疫調節化合物をさらに含んでもよい。
【0168】
さらに、本発明の組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、体細胞遺伝子治療において用いることができる。これには、例えば、ヒト体細胞の感染に適したレトロウイルスベースのベクターへのＤＮＡ配列の挿入が含まれる（A. Kasid et al. 1990. “Human Gene Transfer: Characterization of human tumor-infiltrating lymphocytes as vehicles for retroviral-mediated gene transfer”, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:473-477）。例えば、免疫炎症性疾患の患者は以下のように治療することができる。まず、本発明の組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を特徴とするレトロウイルスを調製する。次いで、患者から細胞を分離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでレトロウイルスに感染させる。次いで、これらの細胞を患者に再導入し、それによりベクターが発現し、細胞が本発明の組換えポリペプチドを分泌し、これが接合して本発明のホモオリゴマーを形成する。
【0169】
本発明の残りの態様について説明されるすべての用語および実施形態は、本発明の医薬組成物に等しく適用され得る。
【0170】
本発明のポリペプチド、ホモオリゴマー、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞および医薬組成物の治療的使用
したがって、別の態様において、本発明は、医薬における使用のための本発明の組換えポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、または本発明の医薬組成物に関する。
したがって、別の態様において、本発明は、医薬における使用のための本発明の組換えポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、または本発明の医薬組成物に関する。
【0171】
別の態様において、本発明は、医薬の製造のための本発明の組換えポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、または本発明の医薬組成物の使用に関する。
【0172】
別の態様において、本発明は、免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防および／または治療における使用のための本発明の組換えポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、または本発明の医薬組成物に関する。
【0173】
別の態様において、本発明は、免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防および／または治療のための医薬の製造のための本発明の組換えポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、または本発明の医薬組成物の使用に関する。
【0174】
別の態様において、本発明は、それを必要とする対象において免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患を予防および／または治療する方法であって、本発明の組換えポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞または本発明の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法に関する。
【0175】
別の態様において、本発明は、それを必要とする対象において寛容原性樹状細胞集団および／または寛容原性マクロファージ集団を増加させるための方法であって、本発明のポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞または本発明の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法に関する。
【0176】
本明細書で用いられる「予防」という用語は、疾患の初期または早期の段階における本発明の化合物の投与、またはその発症を予防するための本発明の化合物の投与を指す。
【0177】
「治療」という用語は、臨床的兆候が現れる前または後に疾患の進行を制御するための本発明の化合物の投与を示すために用いられる。疾患の進行の制御は、限定されないが、症状の軽減、疾患の期間の短縮、病的状態の安定化（特に追加の障害の回避）、疾患の進行の遅延、病的状態の改善および寛解（部分的および完全の両方）を含む、有益なまたは望ましい臨床結果と理解される。疾患の進行の制御はまた、治療が適用されなかった場合に予想される生存と比較した場合の生存の延長を伴う。
【0178】
本明細書で用いられる「免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患」という表現は、先天性または適応性免疫系ならびに体液性または細胞性の免疫系を含む、免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる任意の疾患を指す。好ましくは、本発明における免疫学的疾患は、同種抗原または自己抗原に応答して免疫系が活性化される疾患である。したがって、免疫系が抑制されている免疫学的疾患は、本発明に含まれない。
【0179】
好ましい実施形態において、免疫学的疾患は、免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患からなる群から選択される。
【0180】
本明細書で用いられる「免疫炎症性疾患」という用語は、免疫細胞および／またはサイトカインが疾患または障害の病態生理学に関与する炎症性の疾患および障害を指す。免疫炎症性疾患の例としては、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、急性呼吸窮迫症候群および喘息等の状態が挙げられる。免疫炎症性疾患という用語には、急性および慢性の両方の炎症性疾患が含まれる。「急性炎症性障害」という用語は、炎症反応に関連する症状の急速な発症および比較的短期間の症状を特徴とする障害および障害エピソードを含むことを意図し、一方、「慢性炎症性障害」は、炎症反応および進行中の症状の持続期間に関連する症状の継続的な存在を特徴とする障害を含むことを意図する。本発明の方法により治療することができる免疫炎症性疾患としては、限定されないが、梗塞または脳卒中、アテローム性動脈硬化症、肺線維症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、急性呼吸窮迫症候群、喘息および癌等の心血管疾患が挙げられる。本発明により治療することができる免疫炎症性疾患には、子癇前症および子癇等の妊娠中に現れる疾患も含まれる。子癇前症は、高血圧、タンパク尿および浮腫を特徴とする妊娠関連疾患である。子癇前症は、胎盤機能不全、子宮内胎児発育遅延、早期流産、早産、子宮内死および子癇を含む子癇前症障害の範囲に包含され、かつ属するものと本明細書で理解されかつ定義されるものである。
【0181】
本明細書で用いられる「敗血症」という用語は、感染の主要部位から離れた末端器官の機能不全を特徴とする、元々無菌の組織における微生物に対する全身性の宿主応答を指す。敗血症と見なされるには、感染が疑われるか証明されるか（培養、染色またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって）、または感染の病因となる臨床症候群が存在する必要がある。感染の具体的な証拠としては、通常無菌である液体（尿や脳脊髄液（ＣＳＦ）等）のＷＢＣ、穿孔された内臓の証拠（腹部Ｘ線またはＣＴスキャンのフリーエア（free air）、急性腹膜炎の兆候）、肺炎（限局性混濁を伴う）に整合する異常な胸部Ｘ線（胸部レントゲン）、または点状出血、紫斑病、または電撃性紫斑病が挙げられる。敗血症のより重要なサブセットは、重度の敗血症（急性臓器不全を伴う敗血症）および敗血症性ショック（難治性動脈低血圧を伴う敗血症）である。あるいは、感染の証拠がなく全身性炎症反応症候群の基準の２つ以上が満たされた場合、患者は単に「ＳＩＲＳ」と診断される場合がある。ＳＩＲＳおよび急性臓器不全のある患者は「重度のＳＩＲＳ」と呼ばれる場合がある。患者が敗血症に加えて全身性循環不全の兆候：末端臓器不全または４ｍｍｏｌ／ｄＬを超える血清乳酸塩を示す場合、患者は「重度の敗血症」を有すると定義される。その他の兆候としては、点状出血および精神状態の変化が挙げられる。積極的な輸液蘇生後に敗血症および低血圧（通常、６リットル以上または４０ｍｌ／ｋｇの晶質）が生じた場合、患者は敗血症性ショックを有すると定義される。末端臓器不全の例としては、急性肺損傷または急性呼吸窮迫症候群、脳症、または肝臓（タンパク質合成機能および代謝機能の障害）、腎臓（乏尿症および無尿症、電解質異常、体液量過剰）、および心臓（収縮性および拡張性の心不全）に影響を与える機能不全が挙げられる。
【0182】
本発明の化合物により治療することができる適切な敗血症の症状としては、限定されないが、重症敗血症および敗血症性ショックが挙げられる。一つの実施形態において、敗血症症候群に関連する症状は、臓器不全、好ましくは腎臓不全または肝臓不全、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）、急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）および播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）からなる群から選択される。
【0183】
敗血症は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌からなる群から選択される１種の細菌または複数種の細菌によって誘発され得る。好ましくは、グラム陰性菌は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、クレブシエラ（Klebsiella）種、セラチア（Serratia）種、エンテロバクター（Enterobacter）種、プロテウス（Proteus）種、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、ハエモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、ナイセリア（Neisseria）種およびリステリア（Listeria）種からなる群から選択される。また、グラム陽性菌は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumoniae）、凝固酵素陰性ブドウ球菌（coagulase-negative Staphylococci）、エンテロコッカス（Enterococcus）種、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）およびストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridans）からなる群から選択される。一つの実施形態において、敗血症症候群はＬＰＳによって誘発される。さらに別の実施形態において、敗血症は、嫌気性細菌、真菌、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、スピロヘータおよびウイルスからなる群から選択される１種の微生物または複数種の微生物によって誘発される。
【0184】
好ましい実施形態において、免疫学的疾患は自己免疫疾患である。
【0185】
本明細書を通じて、「自己免疫疾患」、「免疫機能不全／調節不全に関連する疾患」または「免疫炎症性疾患」という用語は、患者の免疫系が自己抗原（自己免疫）または外来抗原（免疫機能障害／調節不全または免疫炎症性疾患）に起因する疾患をもたらす病的状態を指すために用いられる。自己免疫は、すべての人にある程度存在する。それは通常は無害であり、おそらく脊椎動物の生命の普遍的な現象である。しかしながら、自己免疫は、自己免疫疾患として知られる広範囲の人間の病気の原因となる可能性がある。人間の病気の原因としてのこの自己免疫の概念は比較的新しいものであり、１９５０年代および１９６０年代までは医学的思考の主流としては受け入れられていなかった。したがって、自己免疫疾患は、良性自己免疫から病原性自己免疫への進行が起こった時に定義される。この進行は、遺伝的影響および環境トリガーの両方によって決定される。（結果または無害な付随物ではなく）人間の病気の実際の原因としての自己免疫の概念は、自己免疫疾患として疾患を定義する基準を確立するために用いられ得る。本発明によって治療され得る自己免疫疾患、または免疫機能不全または調節不全に関連することを特徴とする疾患（免疫炎症性疾患）としては、他の様々な疾患の中でも、疾患全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、中枢神経系（ＣＮＳ）ループス、真性糖尿病（Ｉ型）、喘息、潰瘍性大腸炎、クローン病、グレイブ病、関節リウマチおよび骨関節炎を含む関節炎、悪性貧血、炎症性腸疾患および多発性硬化症が挙げられる。本発明の方法を用いて、他の疾患の中でも、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、アンキロス性脊椎炎を含む自己免疫性血液疾患；多発性筋炎および皮膚筋炎を含む筋肉組織の自己免疫疾患；自己免疫性難聴およびメニエール症候群を含む耳の自己免疫疾患；ムーレン病、ライター症候群およびフォークト－小柳－原田病を含む自己免疫性眼疾患；糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症およびループス腎炎を含む腎臓の自己免疫疾患；糖尿病（Ｉ型）；尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、紅斑性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、白斑、後天性表皮水疱症、乾癬および脱毛症等の天疱瘡（自己免疫性水疱性疾患）を含む自己免疫性皮膚疾患；自己免疫性心筋炎を含む心血管自己免疫疾患、チャーグ・ストラウス症候群、巨細胞性動脈炎、川崎病、結節性多発動脈炎、高安動脈炎およびウェゲナー肉芽腫症を含む血管炎；アディソン病、自己免疫性副甲状腺機能低下症、自己免疫性下垂体炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、グレイブ病、橋本甲状腺炎、多腺性自己免疫症候群１型（ＰＡＳ－１）、多腺性自己免疫性症候群２型（ＰＡＳ－２）、および多腺性腺自己免疫症候群３型（ＰＡＳ－３）を含む内分泌自己免疫疾患；自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、腹腔疾患、クローン病を含む自己免疫性胃腸疾患；多発性硬化症、重症筋無力症、ギランバレー症候群および慢性炎症性脱髄性ニューロパチーを含む自己免疫性神経疾患；ならびに全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus）、抗リン脂質症候群、自己免疫性リンパ増殖性疾患、自己免疫性多発性内分泌障害、ベーチェット病、グッドパスチャー病を含む全身性自己免疫性疾患、関節リウマチ、変形性関節症および敗血症性関節炎、サルコイドーシス、強皮症およびシェーグレン症候群および乾癬を含む関節炎を含む多くの自己免疫疾患を治療することができる。
【0186】
一つの実施形態において、自己免疫疾患はエリテマトーデスである。本明細書で用いられる「エリテマトーデス」という表現は、関節、皮膚、腎臓、血球、心臓および肺に影響を与える一般的な症状を有する一群の自己免疫疾患に付けられた名前を指す。エリテマトーデスは、全身性疾患として現れることもあれば、不完全なエリテマトーデスとしても知られる純粋な皮膚型として現れることもある。ループス（lupus）には、全身性、円板状、薬物誘発性、新生児性の４つの主要な型がある。本発明に関して「エリテマトーデス」という用語は、限定されないが、急性皮膚エリテマトーデス、亜急性皮膚エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス（慢性皮膚）、小児円板状エリテマトーデス、一般化円板状エリテマトーデス、限局性円板状エリテマトーデス、凍瘡状エリテマトーデス（ハッチンソン）、エリテマトーデス－苔癬平面重複症候群、エリテマトーデス脂肪織炎（エリテマトーデス深部ループス）、腫張性エリテマトーデス（tumid lupus erythematosus）、疣贅性エリテマトーデス（verrucous lupus erythematosus）（肥厚性エリテマトーデス（hypertrophic lupus erythematosus））、皮膚ループスムチン症（cutaneous lupus mucinosis）、補体欠損症候群、薬剤誘発性エリテマトーデス、新生児エリテマトーデスおよび全身性エリテマトーデスを含む。最も一般的な重症型は全身性エリテマトーデスである。
【0187】
好ましい実施形態において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患および潰瘍性大腸炎からなる群から選択され；より好ましくは全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、炎症性腸疾患および関節リウマチからなる群から選択され；より好ましくは全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および関節リウマチからなる群から選択される。好ましい実施形態において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデスおよびループス腎炎からなる群から選択される。
【0188】
好ましい実施形態において、自己免疫疾患は全身性エリテマトーデスである。
【0189】
本明細書で用いられる「全身性エリテマトーデス」または「ＳＬＥ」という表現は、体の免疫系が体の多くの部分の健康な組織を誤って攻撃する全身性自己免疫疾患を指す。症状は人によって異なり、軽度から重度の場合がある。共通する症状としては、関節の痛みや腫れ、発熱、胸痛、脱毛、口内炎、リンパ節の腫れ、疲労感、および顔に最もよく見られる赤い発疹等が挙げられる。多くの場合、フレアと呼ばれる病気の期間と、症状がほとんどない寛解の期間がある。ＳＬＥのほとんどすべての人において関節の痛みと腫れがある。関節炎を発症する人もいる。ＳＬＥは、指、手、手首および膝の関節に影響を与えることがよくある。ＳＬＥにおける腎疾患は、重大な罹患率と死亡率をもたらす。急性または慢性腎機能障害は、ループス腎炎を伴って発症し、急性または末期の腎不全を引き起こす可能性がある。
【0190】
好ましい実施形態において、自己免疫疾患はループス腎炎である。
【0191】
ＳＬＥ腎炎としても知られている「ループス腎炎」または「ＬＮ」という表現は、全身性エリテマトーデスによって引き起こされる腎臓の炎症である。これは糸球体が炎症を起こす糸球体腎炎の一種である。ＳＬＥの結果として、糸球体腎炎の原因は二次的であると言われており、腎臓に起因する主な原因を伴う状態とは異なるパターンと結果を示す。ループス腎炎の一般的な症状としては、発熱、浮腫、高血圧、関節痛、筋肉痛、頬部紅斑および泡状尿等が挙げられる。
【0192】
別の好ましい実施形態において、自己免疫疾患は、炎症性腸疾患、より好ましくは潰瘍性大腸炎である。
【0193】
本明細書で用いられる「炎症性腸疾患」という表現は、結腸および小腸の炎症状態の群を指す。クローン病および潰瘍性大腸炎は、炎症性腸疾患の主な種類である。クローン病は、小腸および大腸、さらには口、食道、胃および肛門に影響を及ぼし；一方で、潰瘍性大腸炎は主に結腸および直腸に影響を及ぼす。症状は、腹痛、下痢、直腸出血、骨盤領域における重度の内部けいれん／筋肉けいれん、および体重減少等である。
【0194】
別の好ましい実施形態において、自己免疫疾患は関節リウマチである。
【0195】
本明細書で用いられる「関節リウマチ」または「ＲＡ」という表現は、関節の慢性的な炎症およびそれに続く軟骨および骨の破壊により特徴付けられる長期の全身性自己免疫障害を指す。通常、関節が熱をもって腫れ、痛みを伴う。痛みおよびこわばりは、休息後に悪化することがよくある。最も一般的には、手首および手において起こり、通常、体の両側の同じ関節において起こる。この疾患は体の他の部分にも影響を与える可能性がある。これにより、赤血球数が減少し、肺の周囲に炎症が起こり、心臓の周囲に炎症が生じる可能性がある。発熱および活力の低下も生じる可能性がある。多くの場合、症状は数週間から数ヶ月かけて徐々に現れる。ＲＡは主に持続的な細胞活性化の状態として始まり、それが現れる関節および他の臓器の両方において自己免疫および免疫複合体をもたらす。疾患の最初の部位は滑膜であり、そこでは腫れおよび鬱血により免疫細胞による浸潤を引き起こされる。ＲＡの進行の様々な段階は：
・非特異的炎症による開始段階
・Ｔ細胞の活性化による増幅段階
・サイトカインＩＬ－１、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６による組織損傷を伴う慢性炎症期
である。
・非特異的炎症による開始段階
・Ｔ細胞の活性化による増幅段階
・サイトカインＩＬ－１、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６による組織損傷を伴う慢性炎症期
である。
【0196】
本明細書で用いられる「移植片拒絶」という表現は、移植された細胞、組織または器官が移植レシピエントの体によって受け入れられない免疫状態を指す。発現移植拒絶は、急性および慢性の両方の移植拒絶を包含する。
【0197】
「急性拒絶反応」または「ＡＲ」は、移植された組織が免疫学的に外来性である場合の、組織移植レシピエントの免疫系による拒絶反応である。急性拒絶反応は、レシピエントの免疫細胞による移植組織の浸潤により特徴付けられ、エフェクター機能を実行し、移植組織を破壊する。急性拒絶反応の開始は急速であり、一般的に移植手術後数週間以内にヒトで発生する。
【0198】
「慢性移植拒絶反応」または「ＣＲ」は、一般に、急性拒絶反応の免疫抑制が成功している場合でも、移植後数ヶ月から数年以内にヒトで発生する。線維症は、すべての種類の臓器移植の慢性拒絶反応の一般的な要因である。慢性拒絶反応は、通常、特定の臓器に特徴的な一連の特定の障害によって説明することができる。例えば、肺移植においては、このような障害として気道の線維増殖性破壊（閉塞性細気管支炎）が挙げられ；弁置換術等の心臓移植または心臓組織の移植においては、このような障害として線維性アテローム性動脈硬化症が挙げられ；腎移植においては、このような障害として閉塞性腎症、腎硬化症、尿細管間質性腎症が挙げられ；肝移植においては、このような障害として胆管消失症候群が挙げられる。慢性拒絶反応はまた、虚血性発作、移植組織の除神経、高脂血症、および免疫抑制薬に関連する高血圧によって特徴付けることができる。
【0199】
移植分野で公知であるように、移植する臓器、組織または細胞は、移植片が同種移植片または異種移植片であり得るように、同種異系または異種であり得る。対象の方法によって検出または同定される移植片耐性表現型の特徴は、それが免疫抑制療法なしで発生する表現型であり、すなわち、免疫抑制剤が宿主に投与されず、免疫抑制療法を受けていない宿主において表現型が存在することである。移植移植片は任意の固形臓器および皮膚移植であり得る。本明細書に記載される方法により治療できる臓器移植の例としては、限定されないが、腎臓移植、膵臓移植、肝臓移植、心臓移植、肺移植、腸移植、腎臓移植後の膵臓、および膵臓と腎臓との同時移植が挙げられる。
【0200】
本発明の方法はまた、虚血性再灌流傷害に起因する移植片機能発現遅延（ＤＧＦ）の予防および／または治療にも適している。本明細書で用いられる「移植片機能発現遅延」という用語は、移植後の乏尿、同種移植片の免疫原性の増大および急性拒絶エピソードのリスク、ならびに長期生存の減少をもたらす急性腎不全の一形態を指す。ＤＧＦは、ドナーに関連する様々な要因、およびレシピエントに関連する腎前、腎または腎後の移植因子によって引き起こされる可能性がある。しかしながら、移植片機能発現遅延の主な原因は、低体温保存後の虚血性損傷腎臓における虚血および血流の回復である。
【0201】
本明細書で用いられる「移植片対宿主病」またはＧＶＨＤという用語は、ドナー組織に存在するＴ細胞が移植細胞または組織の宿主またはレシピエントを攻撃する時に発生する状態を指す。急性ＧＶＨＤおよび慢性ＧＶＨＤを含む任意のタイプのＧＶＨＤを本発明の治療薬によって治療することができる。
【0202】
「過敏性疾患」という用語は、対象が、アレルゲンとして知られる無害な薬剤に対して異常な感受性を有する状態を指す。過敏性疾患は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型の４種類に分類される。Ｉ型は、ＩｇＥ感作好塩基球およびマスト細胞からのメディエーターの放出に起因するアトピー性またはアナフィラキシー性として説明される。ＩＩ型は、細胞溶解または抗体依存性細胞毒性を伴う補体結合抗体を含む細胞毒性として説明される。ＩＩＩ型は、可溶性抗原－抗体複合体に関連する免疫複合体媒介性として説明される。ＩＶ型は、抗原との接触後の感作Ｔリンパ球によるリンホカインの放出に起因する細胞性媒介性または遅延型の過敏症として説明される。
【0203】
好ましい実施形態において、免疫学的疾患は炎症性腸疾患であり、より好ましくは潰瘍性大腸炎である。別の実施形態において、免疫学的疾患はクローン病である。
【0204】
免疫学的疾患の予防および／または治療は、寛容原性樹状細胞および／または寛容原性マクロファージ集団の増大を通じて達成される。
【0205】
「寛容原性樹状細胞集団および／または寛容原性マクロファージ集団の増加」という表現は、本発明のポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリペプチドまたはホモオリゴマーをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、またはそれらを含む医薬組成物の投与によって、未治療の対象に対して、寛容原性樹状細胞および／または寛容原性マクロファージの数の増大をもたらすことを意味することが理解される。寛容原性樹状細胞集団および／または寛容原性マクロファージ集団は、未治療の被験者と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％増大する。寛容原性樹状細胞集団および／または寛容原性マクロファージ集団を増大させる本発明の化合物の能力は、例えば、実施例１～１１に記載されるように決定することができる。
【0206】
好ましい実施形態において、本発明の化合物は皮下投与される。別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、複数回の投与を含み、化合物が週に１回以下投与されるレジメンで投与される。より好ましい実施形態において、本発明の化合物は、複数回の投与を含み、化合物が週に１回以下投与されるレジメンで皮下投与される。
【0207】
複数回の投与とは、少なくとも２回の投与を意味する。したがって、好ましい実施形態において、レジメンは、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも３０回、少なくとも５０回、少なくとも１００以上回またはそれ以上の投与を含む。好ましくは、化合物は長期間投与される。好ましくは、化合物は、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも５年間またはそれ以上の期間投与される。
【0208】
「化合物が週に１回以下投与される」という表現は、１週間の間の最大投与回数が１回であることを意味する。これは、化合物が１日目に投与された場合、それに続く投与が２、３、４、５、６または７日目にはできないことを意味する。しかしながら、例えば、化合物は２週間に１回投与されることもあるため、「化合物が週に１回以下投与される」という表現には、１週間の間に投与がされない可能性が含まれる。したがって、本発明によれば、１回の投与は、別の投与から少なくとも７日隔てられている。したがって、好ましい実施形態において、各投与は、別の投与から少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日、少なくとも２１日、少なくとも２２日、少なくとも２３日、少なくとも２４日、少なくとも２５日、少なくとも２６日、少なくとも２７日、少なくとも２８日、少なくとも２９日、少なくとも３０日、少なくとも３１日、少なくとも３２日、少なくとも３３日、少なくとも３４日、少なくとも３５日、少なくとも３６日、少なくとも３７日、少なくとも３８日、少なくとも３９日、少なくとも４０日、少なくとも４１日、少なくとも４２日、少なくとも４３日、少なくとも４４日、少なくとも４５日、少なくとも４６日、少なくとも４７日、少なくとも４８日、少なくとも４９日、少なくとも５０日、少なくとも５１日、少なくとも５２日、少なくとも５３日、少なくとも５４日、少なくとも５５日、少なくとも５６日、少なくとも５７日、少なくとも５８日、少なくとも５９日、少なくとも６０日以上またはそれ以上隔てられている。
【0209】
好ましい実施形態において、化合物は週に１回投与される。別の好ましい実施形態において、化合物は２週間に１回投与される。別の実施形態において、化合物は３週間に１回投与される。別の実施形態において、化合物は４週間に１回投与される。別の実施形態において、化合物は５週間に１回投与される。別の実施形態において、化合物は６週間に１回投与される。別の実施形態において、化合物は７週間に１回投与される。別の実施形態において、化合物は８週間に１回投与される。別の実施形態において、化合物は９週間に１回投与される。別の実施形態において、化合物は１０週間に１回投与される。別の実施形態において、化合物は１１週間に１回投与される。別の実施形態において、化合物は１２週間に１回投与される。一つの実施形態において、化合物は毎月投与される。別の実施形態において、化合物は２ヶ月に１回投与される。
【0210】
本発明の化合物は、低用量で有効性を有する。したがって、好ましい実施形態において、各投与の用量は０．２４～９．９９ｍｇ／ｍ２の範囲である。より好ましい実施形態において、各投与の用量は０．２４～５ｍｇ／ｍ２の範囲、好ましくは０．３～４．５ｍｇ／ｍ２の範囲、好ましくは０．４～４．３ｍｇ／ｍ２の範囲、より一層好ましくは０．４２～４．２６ｍｇ／ｍ２の範囲である。好ましい実施形態において、用量は０．４２ｍｇ／ｍ２である。別の好ましい実施形態において、用量は４．２６ｍｇ／ｍ２である。
【0211】
一つの実施形態において、各投与の用量は４～９．９９ｍｇ／ｍ２の範囲、好ましくは５～８ｍｇ／ｍ２の範囲、好ましくは６～８ｍｇ／ｍ２の範囲、好ましくは７～８ｍｇ／ｍ２の範囲である。
【0212】
一つの実施形態において、各投与の用量は、１～９ｍｇ／ｍ２の範囲、好ましくは２～８ｍｇ／ｍ２の範囲、好ましくは３～７ｍｇ／ｍ２の範囲、より好ましくは４～６ｍｇ／ｍ２の範囲である。
【0213】
別の実施形態において、化合物は、０．２４μｇ／ｍ２～０．２４ｍｇ／ｍ２、好ましくは１μｇ／ｍ２～０．２４ｍｇ／ｍ２、好ましくは１０μｇ／ｍ２～０．２４ｍｇ／ｍ２、好ましくは５０μｇ／ｍ２～０．２４ｍｇ／ｍ２、より好ましくは１００μｇ／ｍ２～０．２４ｍｇ／ｍ２、より好ましくは１５０μｇ／ｍ２～０．２４ｍｇ／ｍ２、より好ましくは２００μｇ／ｍ２～０．２４ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【0214】
しかしながら、本発明には、より高い用量での化合物の投与も包含される。
【0215】
そのような治療を必要とする対象はヒトであり得、または免疫学的疾患の症状を発症しているか、または免疫学的疾患を発症するリスクがある非ヒト霊長類または他の動物（すなわち、獣医学的使用）であり得る。非ヒト霊長類および他の動物の例としては、限定されないが、家畜、ペットおよび動物園の動物（例えば、馬、牛、水牛、ラマ、ヤギ、ウサギ、猫、犬、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、サル、象、クマ、大型猫等）が挙げられる。好ましい実施形態において、化合物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。
【0216】
本発明の治療はまた、その後の投与から７日隔てる必要のない事前投与工程を含んでもよい。特定のケースにおいて、この工程は誘導工程と見なすことができる。したがって、一つの実施形態において、投与は、その後の投与から７日未満隔てられた化合物の皮下投与の事前工程をさらに含む。好ましくは、事前工程は、それに続く投与から６日未満、より好ましくは５日未満、より好ましくは４日未満、より好ましくは３日未満、より好ましくは２日未満、好ましくは１日未満隔てられている。
【0217】
より好ましい実施形態において、皮下投与の事前工程は、それに続く工程から２日隔てられている。好ましくは、関節リウマチの治療の場合の事前工程は、それに続く工程から３日未満、好ましくは２日、好ましくは２日未満、好ましくは１日、好ましくは１日未満隔てられている。
【0218】
好ましい実施形態において、事前工程で投与される用量と、それに続く各投与で投与される用量とは同じである。
【0219】
別の好ましい実施形態において、事前工程で投与される用量は、それ続く各投与で投与される用量よりも多い。好ましい実施形態において、前記用量は４０～４５ｍｇ／ｍ２であり、好ましくは４２．８４ｍｇ／ｍ２である。好ましくは、前記用量は、関節リウマチの治療において投与される。別の好ましい実施形態において、前記用量は、全身性エリテマトーデスまたはループス腎炎の治療において投与される。
【0220】
別の実施形態において、化合物は、免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の治療に有用な１種以上の治療薬と組み合わせて投与され、好ましくは、前記治療薬は、シクロスポリンＡ、タクロリムス、メトトレキサート、チオプリン、抗ＴＮＦ剤、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、エタネルセプト、リツキシマブ、エプラツズマブ、ベリムマブ、ラパマイシン、抗インターフェロン抗体、トシリズマブ、ラキニモド、タバルマブ、オファツムマブ、イキセキズマブ、ブロダルマブ、ブリアキヌマブ、サリルマブ、リロナセプト、アニフロルマブ、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、抗カルシネウリニクス、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビタミンＤ、血管作用性腸ペプチド、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、オクレリズマブ、アタシセプト、アバタセプト、アレムツズマブ、シルクマブ、エクリズマブおよびＴ細胞ワクチンからなる群から選択される。
【0221】
本発明の態様についてこれまでに開示されたすべての実施形態は、この態様にも適用され得る。
【0222】
本発明のポリペプチド、ホモオリゴマー、ポリヌクレオチドまたはベクターを用いて得られる寛容原性樹状細胞の集団を生成するための方法
本発明者らは、本発明のポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターのいずれかと接触した樹状細胞が寛容原性表現型を示すことを観察した。
本発明者らは、本発明のポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターのいずれかと接触した樹状細胞が寛容原性表現型を示すことを観察した。
【0223】
したがって、別の態様において、本発明は、寛容原性樹状細胞の集団を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって：
（ｉ）未成熟樹状細胞の集団の形成に適切な条件下で樹状前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟樹状細胞の形成に適切な条件下で、上記工程（ｉ）で得られた未成熟樹状細胞の集団をインキュベートする工程
を含み、
上記工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）本発明のポリペプチド、
（ｂ）本発明のホモオリゴマー、
（ｃ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｄ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる方法に関する。
（ｉ）未成熟樹状細胞の集団の形成に適切な条件下で樹状前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟樹状細胞の形成に適切な条件下で、上記工程（ｉ）で得られた未成熟樹状細胞の集団をインキュベートする工程
を含み、
上記工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）本発明のポリペプチド、
（ｂ）本発明のホモオリゴマー、
（ｃ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｄ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる方法に関する。
【0224】
したがって、本発明のポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターは、分化段階の間（すなわち、樹状前駆細胞が未成熟樹状細胞に分化するまでの間）、成熟段階の間（すなわち、未成熟樹状細胞が樹状細胞に成熟するまでの間）または両方の段階の間に細胞と接触させることができる。
【0225】
本明細書で用いられる「樹状細胞」という用語は、リンパ組織または非リンパ組織に見られる形態学的に類似した細胞型の多様な集団の任意のメンバーを指す。樹状細胞は「専門的な（professional）」抗原提示細胞の一種であり、ＭＨＣ制限Ｔ細胞を感作する高い能力を有する。樹状細胞は、機能によって、または表現型によって、特に細胞表面の表現型によって認識され得る。これらの細胞は、その独特の形態、表面ＭＨＣクラスＩＩの中から高レベルの発現、およびＴ細胞、特にナイーブＴ細胞に抗原を提示する能力により特徴付けられる（Steinman et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271；そのような細胞についての記載が参照により本明細書に組み込まれる）。本発明の方法によって影響を受ける樹状細胞は、未成熟または成熟樹状細胞であるように選択され得る。
【0226】
樹状細胞としては、体内の様々な組織や器官に分布している樹状形態を有する骨髄由来細胞の群、サイトカインを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ分化により得られるか、または骨髄もしくは血液由来の幹細胞および同等の細胞から得られる、体内の様々な器官や組織に分布している樹状形態を有する細胞の群が挙げられる。具体的には、樹状細胞としては、例えば、リンパ球樹状細胞（Ｔｈ２または免疫寛容を誘導する細胞を含む）、骨髄樹状細胞（未成熟および成熟樹状細胞を含む一般的に用いられる樹状細胞）、ランゲルハンス細胞（皮膚における抗原提示細胞として重要な樹状細胞）、指状突起細胞（リンパ節および脾臓のＴ細胞領域に分布し、Ｔ細胞への抗原提示において機能すると考えられている）、および濾胞樹状細胞（Ｂ細胞の抗原提示細胞として重要）が挙げられる。樹状細胞の細胞表面は平坦ではなく、特徴的なベールのような突起を有し、細胞表面マーカーＣＤ１ａ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８６＋またはＨＬＡ－ＤＲ＋の発現を特徴とする。成熟樹状細胞は通常ＣＤ１１ｃ＋であるが、樹状細胞の前駆細胞にはＣＤ１１ｃ－、ＩＬ－３Ｒαｌｏｗの表現型を有するもの；ＣＤ１１ｃ－ＩＬ－３Ｒαｈｉｇｈの表現型を有するものが含まれる。ｉｎ ｖｉｖｏでのＧＭ－ＣＳＦによる処理は、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、ＣＤ１１ｃｈｉｇｈＤＣを優先的に拡大し、Ｆｌｔ－３リガンドはＣＤ１１ｃ＋ＩＬ－３ＲαｌｏｗＤＣおよびＣＤ１１ｃ－ＩＬ－３ＲαｈｉｇｈＤＣ前駆体を拡大することが示されている。
【0227】
「寛容原性樹状細胞」とは、分化刺激に曝された未成熟樹状細胞に由来する樹状細胞を意味し、分化刺激はサイトカイン、ホルモン、ビタミンおよび他の生物学的因子の組み合わせであり得、それによって樹状細胞は寛容を誘導する能力を獲得する。寛容原性樹状細胞は、エフェクターＴ細胞を活性化する能力は低いが、制御性Ｔ細胞を誘導および活性化する能力は高い。寛容原性樹状細胞は、炎症誘発性シグナルの存在下であっても維持される安定した表現型を有する「未成熟ＤＣ」として機能する成熟抵抗性細胞と見なすことができる。寛容原性樹状細胞は抗炎症性サイトカインを分泌する。
【0228】
第１工程において、寛容原性樹状細胞の集団を得るための方法は、未成熟樹状細胞の集団の形成に適切な条件下で樹状前駆細胞の集団をインキュベートすることを含む。
【0229】
本明細書で用いられる「樹状細胞前駆体」という用語は、適切なサイトカイン（具体的には、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＳＣＦ（ｃ－ｋｉｔリガンド）、Ｆｌｔ－３リガンドまたはそれらの組み合わせ）の存在下で未成熟樹状細胞に分化できる任意の細胞を指し、好ましくは４週間以内、より好ましくは２０日以内、より一層好ましくは１８日以内、さらにより一層好ましくは１６日以内に未成熟樹状細胞に分化できる細胞である。樹状前駆細胞の例としては、限定されないが、骨髄性樹状前駆細胞、リンパ性樹状前駆細胞および形質細胞様樹状前駆細胞が挙げられる。樹状前駆細胞の様々なサブセットによって発現される表現型表面マーカーは当技術分野において公知であり、例えば、フローサイトメトリーによって、または免疫組織化学的技術を用いることによって同定の目的で用いることができる。
【0230】
好ましい実施形態において、樹状前駆細胞の集団は、単球樹状前駆細胞の集団である。本明細書で用いられる「単球樹状細胞前駆体」は、それらの表面にＧＭ－ＣＳＦ受容体を有する単球、およびＧＭ－ＣＳＦに応答する他の骨髄前駆細胞を含む。細胞は、それらが存在する任意の組織、特に脾臓、骨髄、リンパ節および胸腺等のリンパ組織から得ることができる。単球樹状細胞前駆体はまた、循環系から単離することもできる。末梢血は、容易にアクセスすることができる単球樹状細胞前駆体の供給源である。臍帯血は、単球樹状細胞前駆体のもう１つの供給源である。
【0231】
単球樹状細胞前駆体は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得ることができ、緩衝生理食塩水で１：１に希釈した全血から、または白血球濃縮物（「バフィーコート」画分、ＭＳＫＣＣ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ）から、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（エンドトキシンフリー、＃１７－１４４０－０３、Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）を用いた標準的な遠心分離によって得ることができる。ＭｏＤＣ前駆体は、組織培養プラスチック接着性（＃３５－３００３；Falcon, Becton-Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ）のＰＢＭＣであり、記載されているように、２日ごとに補充されるＧＭ－ＣＳＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ－４（５００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で１％正常ヒト血清（ＮＨＳ）を含む完全ＲＰＭＩ１６４０で培養することができる（Thurner B et al., 1999, J. Immunol. Meth. 223:1-15 and Ratzinger G. et al., 2004, J. Immunol. 173:2780-2791）。
【0232】
一般に、単球樹状細胞前駆体は、ＣＤ１３およびＣＤ３３等のマーカーの発現によって同定することができる。骨髄性樹状前駆体は、ＣＤ１４またはＣＤ１ａ経路を介して樹状細胞に分化する可能性がある。したがって、本発明の樹状前駆細胞は、ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ－樹状前駆細胞またはＣＤ１４－ＣＤ１ａ＋樹状前駆細胞であり得る。本発明の特定の実施形態において、骨髄性樹状前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３３＋ＣＤ７－ＣＤ１０－の表現型によって特徴付けられ得る。好ましい実施形態において、骨髄性樹状前駆細胞は、ＣＤ１４＋の単球である。ＣＤ１４＋の単球はＧＭ－ＣＳＦ受容体も発現する可能性がある。
【0233】
本発明の方法の出発物質として用いられる樹状前駆細胞は、治療される対象に対して自家であり得る。他の実施形態において、本発明の方法の出発物質として用いられる樹状細胞は、異種の樹状細胞である。例えば、移植片対宿主病を治療する場合、出発物質として用いられる樹状細胞は、ドナーから得られる樹状細胞である。対象は、例えば、マウス、ラット、イヌ、ニワトリ、ウマ、ヤギ、ロバまたは霊長類であり得る。最も好ましくは、対象はヒトである。
【0234】
本明細書で用いられる「未成熟樹状細胞の集団の形成に適切な条件」という表現は、樹状前駆細胞の未成熟前駆細胞への分化をもたらす条件を指す。適切な条件としては、例えば、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍｌ）およびＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で約３日間培養した後、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ－４（２５０Ｕ／ｍｌ）およびＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、より好ましくはＧＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、またはＧＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下での培養が挙げられる。好ましい実施形態において、細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ（８００ＵＩ／ｍｌ）およびＩＬ－４（５００ＵＩ／ｍｌ）の存在下で培養される。
【0235】
この処理により、未成熟樹状細胞が生成される。「未成熟樹状細胞」とは、成熟状態と比較して有意に低いＴ細胞活性化能力を有する樹状細胞を指す。具体的には、未成熟樹状細胞は、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を添加し、２日間培養することによって成熟が誘導された樹状細胞の１／２未満、好ましくは１／４未満の抗原提示能力を有し得る。抗原提示能力は、例えば、アロＴ細胞活性化能力を用いて定量化することができる（混合リンパ球試験：アロＴ細胞および樹状細胞を、樹状細胞：Ｔ細胞の比が１：１０、１：４０、１：８０、１：１６０；好ましくは樹状細胞：Ｔ細胞の比が１：４０、１：８０または１：１６０となるように共培養し；培養終了の８時間前に３Ｈ－チミジンを添加し、Ｔ細胞増殖能をＴ細胞のＤＮＡに組み込まれた３Ｈ－チミジンの量に基づいて評価する（GeneTherapy 7; 249-254(2000)を参照のこと））。あるいは、ペプチドを用いて特定の細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する能力をテストすることによって評価することもでき、ここでは特定の抗原の既知のクラスＩ制限ペプチドが樹状細胞に添加され；樹状細胞が、樹状細胞が収集されたのと同じ健康なドナーの末梢血から得られたＴ細胞と共培養される（３日目以降に２５Ｕ／ｍｌまたは好ましくは１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２と共に）。Ｔ細胞は、好ましくは２１日間に３回樹状細胞で刺激され、より好ましくは１４日間に２回樹状細胞で刺激される。得られたエフェクター細胞を、５１Ｃｒ標識された標的細胞（ペプチド制限クラスＩ陽性腫瘍細胞）と１００：１～２．５：１（１００：１、５０：１、２５：１、２０：１、１２．５：１、１０：１、５：１または２．５：１）の比率、好ましくは１０：１の比率で４時間共培養し；標的細胞から放出された５１Ｃｒを定量化する（Arch Dermatol Res 292:325-332 (2000)を参照のこと）。さらに、未成熟樹状細胞は、好ましくは抗原に対する食作用能力を有し、より好ましくはＴ細胞活性化の共刺激を誘導する受容体の低い（例えば、上述したＬＰＳによって誘導される成熟ＤＣと比較して有意に低い）発現、または負の発現を示す。
【0236】
好ましい実施形態において、本方法の第１工程は、
（ｉ）本発明のポリペプチド、
（ｉｉ）本発明のホモオリゴマー、
（ｉｉｉ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる。
（ｉ）本発明のポリペプチド、
（ｉｉ）本発明のホモオリゴマー、
（ｉｉｉ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる。
【0237】
より好ましい実施形態において、物質の組成物は、本発明の方法の第１工程の間には存在するが、第２工程の間には存在しない。好ましくは、物質の組成物は、本発明のホモオリゴマーである。
【0238】
「本発明のポリペプチド」、「本発明のホモオリゴマー」、「本発明のポリヌクレオチド」および「本発明のベクター」という用語は、上記で詳細に説明されている。
【0239】
本発明のポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、前記分子をコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターの存在下で行われる工程は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われ得る。一般的に、これらの方法において、未成熟樹状細胞は：培地１ｍｌあたりの下限が０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、５０または１００μｇ；かつ培地１ｍｌあたりの上限が０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、５０、１００または２００μｇの範囲の本発明のポリペプチドまたはホモオリゴマーに曝露され得る。最も好ましくは、ＤＣは、１～１０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは３、５および１０μｇ／ｍｌ、特に最も好ましくは３μｇ／ｍｌの本発明のホモオリゴマーの存在下で成熟する。
【0240】
次いで、第２工程において、第１工程において単離された未成熟樹状細胞を、未成熟樹状細胞が寛容原性成熟樹状細胞に成熟するのに適切な条件下でインキュベートする。寛容原性樹状細胞が高度に濃縮された組成物が、この方法により達成される。
【0241】
成熟ヒト樹状細胞は、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡクラスＩＩの発現が陽性の細胞である。未成熟樹状細胞は、例えば、ＣＤ８３およびＣＤ８６からなる群から選択されるマーカーに基づいて、成熟樹状細胞と区別することができる。未成熟樹状細胞はマーカーＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６について弱く陽性であるか、好ましくは陰性であるのに対して、成熟樹状細胞は陽性である。
【0242】
成熟ＤＣは抗原を取り込む能力を失い、細胞は上方調節された共刺激細胞表面分子の発現を示し、様々なサイトカインを分泌する。具体的には、成熟ＤＣは通常、高レベルのＭＨＣクラスＩおよびＩＩ抗原を発現し、一般にＣＤ８０＋、ＣＤ８３＋およびＣＤ８６＋として同定される。より高いＭＨＣ発現はＤＣ表面の抗原密度の増大につながり、共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６の上方調節はＴ細胞上においてＣＤ２８等の共刺激分子の対応物を介してＴ細胞活性化シグナルを強化する。
【0243】
本明細書で用いられる「未成熟樹状細胞が寛容原性成熟樹状細胞に成熟するのに適切な条件」という表現は、未成熟樹状細胞が寛容原性成熟樹状細胞に成熟するのを可能にする方法を指す。成熟樹状細胞は、有効な量または濃度の未成熟樹状細胞と樹状細胞成熟剤とを接触させることによって調製（すなわち、成熟）することができる。樹状細胞成熟剤としては、例えば、ＢＣＧ；ＩＦＮγ；ＬＰＳ等のＴＬＲ４リガンド；ＴＮＦα；またはＧａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ等のＴＬＲ７リガンド等が挙げられる。好ましい実施形態において、樹状細胞成熟剤はＴＬＲ４リガンドであり、好ましくはＬＰＳである。別の実施形態において、樹状細胞成熟剤はＴＬＲ７リガンドであり、好ましくはＧａｒｄｉｑｕｉｍｏｄである。ＢＣＧの有効量は、通常、組織培養液１ｍｌあたり約１０５～１０７ｃｆｕの範囲である。ＩＦＮγの有効量は、通常、組織培養培地１ｍｌあたり約１００～１０００Ｕの範囲である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）は、Ｍ．ｂｏｖｉｓの非病原性菌株である。本明細書で用いられる場合、ＢＣＧは、ＢＣＧ全体、ならびに細胞壁成分、ＢＣＧ由来のリポアラビドマンナン、および２型免疫応答の誘導に関連する他のＢＣＧ成分を指す。ＢＣＧは、熱不活化ＢＣＧ、ホルマリン処理ＢＣＧ等のように、任意に不活化される。好ましい実施形態において、ＬＰＳは５μｇ／ｍｌで組織培養培地に添加される。別の実施形態において、Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄは、１０μｇ／ｍｌで組織培養培地に添加される。
【0244】
未成熟なＤＣは、通常、有効量のＢＣＧおよびＩＦＮγに、またはＬＰＳに、またはＧａｒｄｉｑｕｉｍｏｄに、約１時間～約４８時間接触させられる。未成熟樹状細胞は、適切な成熟培養条件で培養および成熟させることができる。適切な組織培養培地としては、ＡＩＭ－Ｖ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５（商標）等が挙げられる。組織培養培地には、細胞の成熟を促進するために、アミノ酸、ビタミン、ＧＭ－ＣＳＦ等のサイトカイン、二価カチオン等を補充することができる。通常、約５００ユニット／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦが用いられる。
【0245】
好ましい実施形態において、本方法の第２工程は：
（ｉ）本発明のポリペプチド、
（ｉｉ）本発明のホモオリゴマー、
（ｉｉｉ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる。
（ｉ）本発明のポリペプチド、
（ｉｉ）本発明のホモオリゴマー、
（ｉｉｉ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる。
【0246】
樹状細胞の成熟は、樹状細胞について当技術分野において公知の方法によってモニターすることができる。細胞表面マーカーは、フローサイトメトリー、免疫組織化学等の当技術分野で公知のアッセイにより検出することができる。細胞はまた、サイトカイン産生についてモニターすることができる（例えば、ＥＬＩＳＡ、他の免疫アッセイによって、またはオリゴヌクレオチドアレイの使用によって）。本発明の成熟ＤＣはまた、抗原を取り込む能力を失い、これは、当業者に公知の取り込みアッセイによって分析することができる。
【0247】
「成熟樹状細胞」という用語は、未成熟状態と比較して、Ｔ細胞等に対して有意に強い抗原提示能力を有する樹状細胞を指す。具体的には、成熟樹状細胞は、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を添加して２日間培養することにより成熟が誘導された樹状細胞の抗原提示能力の半分以上、好ましくは同等またはそれ以上の抗原提示能力を有し得る。さらに、成熟樹状細胞は、好ましくは抗原に対する食作用能力が弱いかまたは全く有さず、より好ましくはＴ細胞活性化の共刺激を誘導する受容体の発現に対して陽性である。樹状細胞の活性化とは、未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞への移行を指し；活性化樹状細胞は成熟樹状細胞および移行過程の樹状細胞を含み、共刺激シグナルを誘導するＣＤ８０およびＣＤ８６の発現は活性化刺激によって上昇する。
【0248】
寛容原性細胞の集団は、約５０％以上の細胞組成物を含み得、好ましくは約７５％以上の細胞組成物であり得、９０％以上であり得る。目的の細胞は、表面表現型、耐性を誘導する能力等によって同定される。濃縮された細胞集団はすぐに用いてもよく、または液体窒素温度で凍結して長期間保存し、解凍して再利用してもよい。細胞は通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％ＦＣＳ、４０％ＲＰＭＩ１６４０培地で保存される。寛容原性樹状細胞が濃縮された細胞の集団は、以下に説明するように、様々なスクリーニングアッセイおよび培養に用いることができる。
【0249】
ＤＣは、ＤＣマーカーに対する抗体を用いて蛍光標識細胞を選別することにより、任意にさらに精製することができる。ＤＣはまた、ＤＣに対する抗体を用いて単離してもよく、抗体は磁気ビーズに連結されている。特定の実施形態において、ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂを共発現するＤＣは、ＦＡＣＳを用いて単離される。
【0250】
分離された細胞は、細胞の生存能力を維持する任意の適切な培地に収集することができ、通常、収集チューブの底に血清のクッションを有する。様々な培地が市販されており、細胞の性質に応じて用いることができる。培地は、液体または半固体であり得、例えば、寒天、メチルセルロース等を含む。細胞集団は、通常はウシ胎児血清（約５～１０％）、Ｌ－グルタミン、チオール、特に２－メルカプトエタノール、および抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンが補充された、イスコフ改変ｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イスコフ培地、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０等の適切な栄養培地に適宜懸濁することができる。
【0251】
任意に、形態学的観察および免疫化学的染色等の標準的な手法を用いて、樹状細胞の存在を確認することができる。例えば、樹状細胞の純度は、１種以上の特徴的な細胞表面マーカーに対する蛍光色素標識抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価することができる。
【0252】
いくつかの実施形態において、寛容原性樹状細胞は、制御性Ｔ細胞を産生するために用いられる（例えば、米国特許出願第10/661,804号を参照のこと）。簡単に言えば、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む集団から産生され得る。これらのＴ細胞集団は、対象から単離され得るか、または培養され得る。Ｔ細胞の亜集団、例えば、特定の細胞が濃縮された集団（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞）を含むように細胞表面マーカーによって選別された集団等も用いられ得る。次いで、Ｔ細胞は、本発明の寛容原性樹状細胞と共に培養またはインキュベートされる。制御性Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される場合、寛容原性樹状細胞はＴ細胞と同種であるかまたは同系であり得る。いくつかの実施形態において、寛容原性ＤＣには抗原が充填される（例えば、抗原で刺激されるか、または抗原をコードするＲＮＡでトランスフェクトされる）。そのような実施形態において、寛容原性ＤＣは、Ｔ細胞に抗原を提示し得る。制御性Ｔ細胞の産生中、Ｔ細胞は１回または２回以上寛容原性ＤＣに曝露され、かつ／または寛容原性ＤＣと共に培養され得る。例えば、Ｔ細胞はＤＣと共に数日または数週間培養することができ；混合培養のＤＣは、必要に応じて補充され得る。いくつかの実施形態において、培養は、治療量の制御性Ｔ細胞が得られるまで継続される。得られる結果を改善するために、他の培養技術および／または添加剤を用いることができ；例えば、培地はＩＬ－２等のサイトカインを含んでもよい。
【0253】
一般的に、制御性Ｔ細胞はＩＬ－１０および／またはＴＧＦ－βを分泌し（例えば、Walsh et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1398-1403を参照のこと）；これらのサイトカインの分泌を確認するためのアッセイは当技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、制御性Ｔ細胞は、混合リンパ球反応を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、９０％、９５％または１００％阻害する。混合リンパ球反応アッセイは当技術分野において公知である。本発明における制御性Ｔ細胞は抗原特異的であり得る。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は一般的に、ＣＤ４およびＣＤ２５を含む特徴的な細胞表面マーカー、およびＦｏｘｐ３等の特定の細胞内マーカーを発現し；細胞表面および細胞内のマーカーのアッセイは当技術分野において公知である。
【0254】
本発明の態様についてこれまでに開示されたすべての実施形態は、この態様にも適用され得る。
【0255】
本発明のポリペプチド、ホモオリゴマー、ポリヌクレオチドまたはベクターを用いて得られる寛容原性マクロファージの集団を生成するための方法
本発明らは、本発明のポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターのいずれかと接触したマクロファージが寛容原性表現型を示すことを観察した。
本発明らは、本発明のポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターのいずれかと接触したマクロファージが寛容原性表現型を示すことを観察した。
【0256】
したがって、別の態様において、本発明は、寛容原性マクロファージの集団を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって：
（ｉ）未成熟マクロファージの集団の形成に適切な条件下でマクロファージ前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟マクロファージの形成に適切な条件下で、上記工程（ｉ）で得られた未成熟マクロファージの集団をインキュベートする工程
を含み、
上記工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）本発明のポリペプチド、
（ｂ）本発明のホモオリゴマー、
（ｃ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｄ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる方法に関する。
（ｉ）未成熟マクロファージの集団の形成に適切な条件下でマクロファージ前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟マクロファージの形成に適切な条件下で、上記工程（ｉ）で得られた未成熟マクロファージの集団をインキュベートする工程
を含み、
上記工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）本発明のポリペプチド、
（ｂ）本発明のホモオリゴマー、
（ｃ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｄ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる方法に関する。
【0257】
したがって、本発明のポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターは、分化段階の間（すなわち、マクロファージ前駆細胞が未成熟マクロファージに分化するまでの間）、成熟段階の間（すなわち、未成熟マクロファージが成熟マクロファージに成熟するまでの間）または両方の段階の間に細胞と接触させることができる。
【0258】
本明細書で用いられる「マクロファージ」という用語は、食作用と呼ばれるプロセスにおいて細胞破片、異物、微生物、癌細胞等を飲み込んで消化する免疫系の白血球の一種である単核食作用細胞を指す。これらの巨大食細胞は、実質的にすべての組織に見られる。それらは、体全体で様々な名前を伴う様々な形態を有する（例えば、組織球、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、肺胞マクロファージ、ミクログリア等）が、すべては単核食細胞系の一部である。本明細書で用いられるマクロファージという用語には、既知の任意のタイプのマクロファージが包含される。食作用に加えて、それらは非特異的防御（自然免疫）において重要な役割を果たし、リンパ球等の他の免疫細胞を動員することによって特定の防御メカニズム（適応免疫）を開始するのにも役立つ。マクロファージはまた、重要な抗炎症の役割を果たし、サイトカインの放出を通じて免疫反応を低下させる可能性がある。マクロファージは、「専門的な」抗原提示細胞の一種である。マクロファージは、機能によって、または表現型によって、特に細胞表面の表現型によって認識され得る。本発明の方法によって影響を受けるマクロファージは、未成熟または成熟マクロファージであるように選択され得る。
【0259】
マクロファージとしては、サイトカイン等を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の結果として生じるか、または骨髄もしくは血液由来の幹細胞および同等の細胞から得られる、体内の様々な組織および器官に分布している細胞の群が挙げられる。各タイプのマクロファージは、その場所によって決定される特定の名前を有する。具体的には、マクロファージとしては、例えば、脂肪組織マクロファージ、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞（肝臓に位置する）、洞組織球（リンパ節に位置する）、肺胞マクロファージ（肺の肺胞に位置する）、巨大細胞（結合組織に位置する）をもたらす組織マクロファージ（組織細胞）、ミクログリア（中枢神経系に位置する）、Ｈｏｆｂａｕｅｒ細胞（胎盤に位置する）、糸球体内メサンギウム細胞（腎臓に位置する）、破骨細胞（骨に位置する）、類上皮細胞（肉芽腫に位置する）、赤脾髄マクロファージ（脾臓の赤髄に位置する）、白髄マクロファージ（脾臓の白髄に位置する）、辺縁帯マクロファージおよび好金属性マクロファージ（脾臓の領域に位置する）、腹膜マクロファージ（腹腔内に位置する）ならびにＬｙｓｏＭａｃ（パイエル板に位置する）が挙げられる。ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ７１、ＣＣＲ５等の共通して用いられるマクロファージマーカーが多数存在し；用いられる正確なマーカーは、マクロファージのサブセットおよびそれらの局所環境の状態によって異なる。成熟Ｍ１マクロファージは、通常、マーカーＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ６８、ＭＨＣＩＩ、ＩＬ－１Ｒ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ｉＮＯＳおよび／またはＳＯＣＳ３によって識別される。Ｍ２マクロファージ、特にＩＬ－４によって活性化されるＭ２マクロファージは、通常、マーカーＣＤ１６３、ＭＨＣＩＩ、ＳＲ、ＭＭＲ／ＣＤ２０６、ＣＤ２００Ｒ、ＴＧＭ２、ＤｅｃｏｙＲおよび／またはＩＬ－１ＲＩＩによって識別される。マクロファージの前駆体には、表現型ＩＬ３ＲａｌｏｗＣＤ１１ｂ－ＣＤ３４＋ｃ－ＫＩＴ＋ＦＬＴ３＋およびＩＬ３ＲａｈｉｇｈＣＤ１１ｂ－ＣＤ３４＋ｃ－ＫＩＴ＋ＦＬＴ３＋を有するものが含まれる（Xiao et al. (2015) Stem Cell Reports 4: 984-994）。
【0260】
本明細書で用いられる「寛容原性マクロファージ」という用語は、「調節性マクロファージ」または「Ｍｒｅｇ」および「非活性化マクロファージ」と互換的に用いられる。寛容原性、調節性または不活性化マクロファージは、サイトカイン、ホルモン、ビタミンおよび他の生物学的因子の組み合わせである分化刺激に曝露された未成熟マクロファージに由来するマクロファージであり、分化刺激よってマクロファージは寛容を誘導する能力を獲得する。寛容原性マクロファージは、エフェクターＴ細胞を活性化する能力は低いが、制御性Ｔ細胞を誘導および活性化する能力は高い。寛容原性マクロファージは、炎症誘発性シグナルの存在下であっても維持される安定した表現型を有する「未成熟マクロファージ」として機能する成熟抵抗性細胞と見なすことができる。寛容原性マクロファージは、ＩＬ－１０の産生、およびＩＬ－１２の分泌の制限または欠如を通じて、調節性ＴＨ２応答に向けて免疫系を調節することができる。さらに、寛容原性マクロファージは、ＨＬＡクラスＩＩおよびＢ７共刺激分子の発現が増大し、抗原提示機能が向上する。
【0261】
第１工程において、寛容原性マクロファージの集団を得るための方法は、未成熟マクロファージの集団の形成に適切な条件下でマクロファージ前駆細胞の集団をインキュベートすることを含む。
【0262】
本明細書で用いられる「マクロファージ前駆細胞」という用語は、適切なサイトカイン（具体的には、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＳＣＦ（ｃ－ｋｉｔリガンド）、Ｆｌｔ－３リガンドまたはそれらの組み合わせ）の存在下で未成熟マクロファージに分化できる任意の細胞を指し、好ましくは４週間以内、より好ましくは２０日以内、より一層好ましくは１８日以内、さらにより一層好ましくは１６日以内に未成熟マクロファージに分化できる細胞である。マクロファージ前駆細胞の例としては、限定されないが、骨髄単球－マクロファージ前駆細胞；またはＧＭ－ＣＳＦもしくはＦｌｔ３Ｌを添加した培地中で、骨髄前駆細胞でＨｏｘｂ８を過剰発現させることにより得られる、増殖性の条件付き発達停止一次マクロファージ前駆細胞（proliferative, conditional developmentally-arrested, primary macrophage progenitor）が挙げられる。マクロファージ前駆細胞の様々なサブセットによって発現される表現型表面マーカーは当技術分野において公知であり、例えば、フローサイトメトリーによって、または免疫組織化学的技術を用いることによって同定の目的で用いることができる。
【0263】
好ましい実施形態において、マクロファージ前駆細胞の集団は、単球マクロファージ前駆細胞の集団である。本明細書で用いられる「単球マクロファージ前駆細胞」は、それらの表面にＧＭ－ＣＳＦ受容体を有する単球、およびＧＭ－ＣＳＦに応答する他の骨髄前駆細胞を含む。細胞は、それらが存在する任意の組織、特に脾臓、骨髄、リンパ節、胸腺等のリンパ組織から得ることができる。単球マクロファージ前駆細胞はまた、循環器系から単離することもできる。末梢血は、容易にアクセスすることができる単球マクロファージ前駆細胞の供給源である。臍帯血は、単球マクロファージ前駆細胞のもう１つの供給源である。
【0264】
単球マクロファージ前駆細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得ることができ、緩衝生理食塩水で１：１に希釈した全血から、または白血球濃縮物（「バフィーコート」画分、ＭＳＫＣＣ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ）から、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（エンドトキシンフリー、＃１７－１４４０－０３、Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）を用いた標準的な遠心分離によって得ることができる。単球マクロファージ前駆体は、組織培養プラスチック付着性（＃３５－３００３；Falcon, Becton-Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ）のＰＢＭＣであり、記載されているように、２日ごとに補充されるＧＭ－ＣＳＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ－４（５００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で１％正常ヒト血清（ＮＨＳ）を含む完全ＲＰＭＩ１６４０で培養することができる（Thurner B et al., 1999, J. Immunol. Meth. 223:1-15 and Ratzinger G. et al., 2004, J. Immunol. 173:2780-2791）。
【0265】
一般に、単球マクロファージ前駆細胞は、ＣＤ１３およびＣＤ３３等のマーカーの発現によって同定することができる。骨髄性マクロファージ前駆体は、ＣＤ１４またはＣＤ１６経路を介してマクロファージ細胞に分化する可能性がある。したがって、本発明のマクロファージ前駆体細胞は、ＣＤ１４＋ＣＤ１６－マクロファージ前駆体細胞、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋マクロファージ前駆体細胞またはＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋マクロファージ前駆体細胞であり得る。本発明の特定の実施形態において、骨髄性マクロファージ前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３３＋ＣＤ７－ＣＤ１０－の表現型によって特徴付けられ得る。好ましい実施形態において、骨髄性マクロファージ前駆細胞は、ＣＤ１４＋の単球である。ＣＤ１４＋の単球はＧＭ－ＣＳＦ受容体も発現する可能性がある。
【0266】
本発明の方法の出発物質として用いられるマクロファージ前駆細胞は、治療される対象に対して自家であり得る。他の実施形態において、本発明の方法の出発物質として用いられるマクロファージ前駆細胞は、異種のマクロファージ細胞である。例えば、移植片対宿主病を治療する場合、出発物質として用いられるマクロファージ細胞は、ドナーから得られるマクロファージ細胞である。対象は、例えば、マウス、ラット、イヌ、ニワトリ、ウマ、ヤギ、ロバまたは霊長類であり得る。最も好ましくは、対象はヒトである。
【0267】
本明細書で用いられる「未成熟マクロファージの集団の形成に適切な条件」という表現は、マクロファージ前駆細胞の未成熟マクロファージへの分化をもたらす条件を指す。適切な条件としては、例えば、任意にＩＬ－３を含むＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦの存在下での約６日間の培養が挙げられる。好ましい実施形態において、細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養される。
【0268】
この処理により、未熟マクロファージが生成される。本明細書で用いられる「未成熟マクロファージ」という用語は、「分化していないマクロファージ」、「ナイーブマクロファージ」または「Ｍ０」という用語と互換的である。未成熟マクロファージ、または分化していないマクロファージ、またはナイーブマクロファージまたはＭ０とは、成熟状態と比較して有意に低いＴ細胞活性化能力を有するマクロファージを指す。具体的には、未成熟マクロファージは、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を添加し、２日間培養することによって成熟が誘導されたマクロファージの１／２未満、好ましくは１／４未満の抗原提示能力を有し得る。抗原提示能力は、例えば、アロＴ細胞活性化能力を用いて定量化することができる（混合リンパ球試験：アロＴ細胞およびマクロファージを、マクロファージ：Ｔ細胞の比が１：１０、１：４０、１：８０、１：１６０；好ましくはマクロファージ：Ｔ細胞の比が１：４０、１：８０、１：１６０となるように共培養し；培養終了の８時間前に３Ｈ－チミジンを添加し、Ｔ細胞増殖能をＴ細胞のＤＮＡに組み込まれた３Ｈ－チミジンの量に基づいて評価する（Gene Therapy 7; 249-254 (2000)を参照のこと）。あるいは、ペプチドを用いて特定の細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する能力をテストすることによって評価することもでき、ここでは特定の抗原の既知のクラスＩ制限ペプチドがマクロファージに添加され；マクロファージが、マクロファージが収集されたのと同じ健康なドナーの末梢血から得られたＴ細胞と共培養される（３日目以降に２５Ｕ／ｍｌまたは好ましくは１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２と共に）。Ｔ細胞は、好ましくは２１日間に３回マクロファージで刺激され、より好ましくは１４日間に２回マクロファージで刺激される。得られたエフェクター細胞を、５１Ｃｒ標識された標的細胞（ペプチド制限クラスＩ陽性腫瘍細胞）と１００：１～２．５：１（１００：１、５０：１、２５：１、２０：１、１２．５：１、１０：１、５：１または２．５：１））の比率で、好ましくは１０：１の比率で４時間共培養し；標的細胞から放出された５１Ｃｒを定量化する（Arch Dermatol Res 292:325-332 (2000)を参照のこと）。さらに、未成熟マクロファージは、好ましくは抗原に対する食作用能力を有
し、より好ましくはＴ細胞活性化の共刺激を誘導する受容体の低い（例えば、上述したＬＰＳによって誘導される成熟マクロファージと比較して有意に低い）発現、または負の発現を示す。
し、より好ましくはＴ細胞活性化の共刺激を誘導する受容体の低い（例えば、上述したＬＰＳによって誘導される成熟マクロファージと比較して有意に低い）発現、または負の発現を示す。
【0269】
好ましい実施形態において、本方法の第１工程は、
（ｉ）本発明のポリペプチド、
（ｉｉ）本発明のホモオリゴマー、
（ｉｉｉ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる。
（ｉ）本発明のポリペプチド、
（ｉｉ）本発明のホモオリゴマー、
（ｉｉｉ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる。
【0270】
「本発明のポリペプチド」、「本発明のホモオリゴマー」、「本発明のポリヌクレオチド」および「本発明のベクター」という用語は、上記で詳細に説明されている。
【0271】
本発明のポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、前記分子をコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターの存在下で行われる工程は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われ得る。一般的に、これらの方法において、未成熟マクロファージは、培地１ｍｌあたりの下限が０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、５０または１００μｇ；かつ培地１ｍｌあたりの上限が０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、５０、１００または２００μｇの範囲の本発明のホモオリゴマーに曝露され得る。最も好ましくは、マクロファージは、１～１０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは３、５および１０μｇ／ｍｌ、特に最も好ましくは３μｇ／ｍｌの本発明のホモオリゴマーの存在下で成熟する。
【0272】
次いで、第２工程において、第１工程において単離された未成熟マクロファージを、未成熟マクロファージが寛容原性成熟マクロファージに成熟するのに適切な条件下でインキュベートする。寛容原性マクロファージが高度に濃縮された組成物が、この方法により達成される。
【0273】
成熟ヒトマクロファージは、マクロファージの特定のタイプに応じて、これらのマーカー：ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ６８、ＭＨＣＩＩ、ＩＬ－１Ｒ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ｉＮＯＳ、ＳＯＣＳ３、ＣＤ１６３、ＳＲ、ＭＭＲ／ＣＤ２０６、ＣＤ２００Ｒ、ＴＧＭ２、ＤｅｃｏｙＲ、ＩＬ－１ＲＩＩ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ８および／またはＶＥＧＦの１種以上の発現が陽性の細胞である。未成熟マクロファージは、これらのマーカーの発現が中程度であるかまたは低く、好ましくはこれらのマーカーについて弱く陽性であるのに対して、成熟マクロファージ細胞は陽性である。Ｍ１およびＭ２に分化するとその発現はＣＤ６４ｌｏｗとなり、寛容原性マクロファージにおいては発現がＣＤ６４－となるため、好ましい実施形態においては未成熟マクロファージのマーカーはＣＤ６４ｈｉｇｈである。好ましい実施形態において、未成熟マクロファージはＣＤ６４ｈｉｇｈ、ＣＤ８０－、ＣＤ２０９－、ＣＤ１１ｂ＋である。好ましい実施形態において、Ｍ１はＣＤ６４ｌｏｗ、ＣＤ８０＋である。好ましい実施形態において、Ｍ２はＣＤ２０９＋、ＣＤ１１ｂ＋である。
【0274】
「成熟マクロファージ」という用語は、限定されないが、古典的に活性化されたマクロファージ（Ｍ１）、および代替的に活性化されたマクロファージ（Ｍ２）の両方を含む。
【0275】
Ｍ１は、本明細書では「古典的活性化マクロファージ」と呼ばれ、「炎症性マクロファージ」または「炎症誘発性マクロファージ」としても知られている。Ｍ１は、トール様受容体（ＴＬＲ）とＩＦＮγ、例えばＬＰＳとＩＦＮγとによって活性化され、高レベルのＩＬ－１２と低レベルのＩＬ－１０を分泌する。Ｍ１マクロファージは、炎症誘発性、抗菌性（細胞内病原体に対する耐性を媒介する）、組織破壊性、抗腫瘍性および食作用性の機能的表現型を示す。活性化されると、これらのＭ１マクロファージは、炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３）、ケモカイン（ＣＸＣＬ－１、２、３、５、８、９、１０、ＣＣＬ－２、３、４、５、１１、１７および２２）、プロテアーゼおよびＲＯＳ／ＲＮＳ）を大量に発現する。したがって、Ｍ１は、先天性応答だけでなく、適応性のある抗原特異的応答においても極めて重要な役割を果たす。Ｍ１マクロファージは、ＣＤ６４およびＣＤ８０の発現が陽性の細胞である。
【0276】
Ｍ２は、本明細書では「代替活性化マクロファージ」と呼ばれ、「抗炎症性マクロファージ」または「創傷治癒マクロファージ（wound-healing macrophage）」としても知られている。Ｍ１はＩＬ－４またはＩＬ－１３によって活性化される。Ｍ２は、Ｍ１とは機能的に異なる表現型を示す。Ｍ２の機能は、一般に、抗炎症性サイトカインを産生することによる抗炎症性表現型として説明され、組織のリモデリングおよび修復、ならびに寄生虫に対する抵抗性も仲介する。Ｍ２マクロファージは、高レベルのＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、および低レベルのＩＬ－１２を産生する。Ｍ２マクロファージは、ＣＤ２０９およびＣＤ１１ｂマーカーの発現が陽性の細胞である。Ｍ２は、ＨＬＡ発現が低いため、抗原特異的応答を誘導する能力が限られている。
【0277】
成熟マクロファージは抗原を取り込む能力を失い、細胞は上方調節された共刺激細胞表面分子の発現を示し、様々なサイトカインを分泌する。
【0278】
本明細書で用いられる「未成熟マクロファージが寛容原性成熟マクロファージに成熟するのに適切な条件」という表現は、未成熟マクロファージが寛容原性成熟マクロファージに成熟するのを可能にする方法を指す。成熟マクロファージは、有効な量または濃度の未成熟マクロファージとマクロファージ成熟剤とを接触させることによって調製（すなわち、成熟）することができる。マクロファージ成熟剤は、得られる成熟マクロファージ（Ｍ１またはＭ２）によって異なる。Ｍ０からＭ１を得るためのマクロファージ成熟剤としては、例えば、ＬＰＳおよびＴＮＦα等の炎症性刺激と組み合わせたＩＦＮγ；またはＧＭ－ＣＳＦならびに無酸素環境、β－ケモカインおよびホルボールミリステート酢酸（ＰＭＡ）等のさらなる分極シグナル（Foey A.D. Chapter 5: Macrophages: Masters of immune activation, suppression and deviation. In book: Immune response activation. Publisher: InTech, Editors: Guy Huynh Thien Duc, pp. 121-149）；またはＴＮＦおよびＩＦＮβの両方を誘導する特定のＴＬＲアゴニスト（Mosser D.M. and Edwards J.P. 2008. Nat Rev Immunol, 8(12):958-969）が挙げられる。好ましい実施形態において、Ｍ１のためのマクロファージ成熟剤はＬＰＳであり、好ましくは組織培養培地において４０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳである。より好ましい実施形態において、Ｍ１のためのマクロファージ成熟剤は、ＬＰＳおよびＩＦＮγの組み合わせ、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳおよび４０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγの組み合わせである。Ｍ０からＭ２を得るためのマクロファージ成熟剤は、限定されないが、ＩＬ－４／ＩＬ－１３、またはＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１４である。好ましい実施形態において、Ｍ２のためのマクロファージ成熟剤はＩＬ－４であり、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４である。
【0279】
未成熟マクロファージは、通常、有効量のマクロファージ成熟剤と約１時間～約４８時間接触させられる。未成熟マクロファージは、適切な成熟培養条件で培養および成熟させることができる。適切な組織培養培地としては、ＡＩＭ－Ｖ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５（商標）等が挙げられる。組織培養培地には、細胞の成熟を促進するために、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、二価カチオン等を補充することができる。
【0280】
好ましい実施形態において、本方法の第２工程：
（ｉ）本発明のポリペプチド、
（ｉｉ）本発明のホモオリゴマー、
（ｉｉｉ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる。
（ｉ）本発明のポリペプチド、
（ｉｉ）本発明のホモオリゴマー、
（ｉｉｉ）本発明のポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）本発明のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる。
【0281】
マクロファージの成熟は、マクロファージについて当技術分野において公知の方法によってモニターすることができる。細胞表面マーカーは、フローサイトメトリー、免疫組織化学等の当技術分野で公知のアッセイにより検出することができる。細胞はまた、サイトカイン産生についてモニターすることができる（例えば、ＥＬＩＳＡ、他の免疫アッセイによって、またはオリゴヌクレオチドアレイの使用によって）。本発明の成熟マクロファージはまた、抗原を取り込む能力を失い、これは、当業者に公知の取り込みアッセイによって分析することができる。
【0282】
「成熟マクロファージ」という用語は、未成熟状態と比較して、Ｔ細胞等に対して有意に強い抗原提示能力を有するマクロファージを指す。具体的には、成熟マクロファージは、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を添加して２分間培養することにより成熟が誘導されたマクロファージの抗原提示能力の半分、好ましくは同等の抗原提示能力を有し得る。さらに、成熟マクロファージは、好ましくは抗原に対する食作用能力が弱いかまたは全く有さず、より好ましくはＴ細胞活性化の共刺激を誘導する受容体の発現に対して陽性である。マクロファージの活性化とは、未成熟マクロファージから成熟マクロファージへの移行を指し；活性化マクロファージは成熟マクロファージおよび移行過程のマクロファージを含む。
【0283】
寛容原性マクロファージの集団は、約５０％以上の細胞組成物を含み得、好ましくは約７５％以上の細胞組成物であり得、９０％以上であり得る。目的の細胞は、表面表現型、耐性を誘導する能力等によって同定される。濃縮された細胞集団はすぐに用いてもよく、または液体窒素温度で凍結して長期間保存し、解凍して再利用してもよい。細胞は通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％ＦＣＳ、４０％ＲＰＭＩ１６４０培地で保存される。寛容原性マクロファージが濃縮された細胞の集団は、以下に説明するように、様々なスクリーニングアッセイおよび培養に用いることができる。
【0284】
マクロファージは、マクロファージマーカーに対する抗体を用いて蛍光標識細胞を選別することにより、任意にさらに精製することができる。マクロファージはまた、マクロファージに対する抗体を用いて単離してもよく、抗体は磁気ビーズに連結されている。
【0285】
分離された細胞は、細胞の生存能力を維持する任意の適切な培地に収集することができ、通常、収集チューブの底に血清のクッションを有する。様々な培地が市販されており、細胞の性質に応じて用いることができる。培地は、液体または半固体であり得、例えば、寒天、メチルセルロース等を含む。細胞集団は、通常はウシ胎児血清（約５～１０％）、Ｌ－グルタミン、チオール、特に２－メルカプトエタノール、および抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンが補充された、イスコフ改変ｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イスコフ培地、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０等の適切な栄養培地に適宜懸濁することができる。
【0286】
任意に、形態学的観察および免疫化学的染色等の標準的な手法を用いて、マクロファージの存在を確認することができる。例えば、マクロファージの純度は、１種以上の特徴的な細胞表面マーカーに対する蛍光色素標識抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価することができる。
【0287】
本発明の態様についてこれまでに開示されたすべての実施形態は、この態様にも適用され得る。
【0288】
本発明のポリペプチド、ホモオリゴマー、ポリヌクレオチドおよびベクターを用いて得られる本発明の寛容原性樹状細胞
寛容原性樹状細胞のトランスクリプトームプロファイルは、それらを生成するために用いられるアプローチに応じて大きく変化することが知られている（Navarro-Barriuso et al. 2018. Frontiers in Immunology, 9: 2062）。
寛容原性樹状細胞のトランスクリプトームプロファイルは、それらを生成するために用いられるアプローチに応じて大きく変化することが知られている（Navarro-Barriuso et al. 2018. Frontiers in Immunology, 9: 2062）。
【0289】
したがって、別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、該ポリペプチドまたはホモオリゴマーのいずれかをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含むベクターの存在下で、本発明の方法によって樹状細胞を分化および／または成熟させることによって得られる本発明の寛容原性樹状細胞に関する。好ましくは、本発明のホモオリゴマー、該ホモオリゴマーをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含むベクターの存在下、好ましくは本発明のホモオリゴマーの存在下で、本発明の方法によって得られる本発明の寛容原性樹状細胞に関する。
【0290】
本発明の寛容原性樹状細胞は、以下の特徴の１つ以上を示すことを特徴とする：
－細胞がＣＤ８３－、ＣＤ８６－、ＣＤ８０－、ＣＤ４０－および／またはＣＣＲ７－である。「陰性」という用語は、所与のマーカーに適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性ＤＣにおける特定の細胞表面マーカーの発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟、好ましくはＬＰＳ成熟を介して得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）における同じ細胞表面マーカーの発現レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。
－未成熟の場合に、未成熟樹状細胞と比較して、細胞が抗原内在化能力またはエンドサイトーシス活性の増大を示す。本明細書で用いられる「抗原内在化能力の増大」または「エンドサイトーシス活性の増大」という用語は、本発明の方法によって産生される未成熟寛容原性ＤＣの抗原内在化またはエンドサイトーシス活性のレベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の未成熟ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して得られた未成熟ＤＣ）の抗原内在化能力またはエンドサイトーシス活性のレベルと比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％またはそれ以上増大していることを示す。寛容原性樹状細胞の抗原内在化能力またはエンドサイトーシス活性は、例えば、本発明の材料および方法、実施例２および図５に記載されるように、分化段階での蛍光ＤＱ－ＯＶＡ内在化およびプロセシングを測定することによって決定することができる。
－細胞が、成熟樹状細胞と比較して、ＩＬ－１２ｐ７０および／またはＴＮＦ－α等の炎症性サイトカインを分泌しないか、減少した量を分泌する。「減少した量を分泌する」という用語は、所与のサイトカインに適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性ＤＣにおける特定のサイトカインの分泌レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟、好ましくはＬＰＳ成熟を介して得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）における同じサイトカインの分泌レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。
－細胞がＨＬＡ－ＤＲ＋および／またはＣＤ１４＋である。所与のマーカーに適用される場合の「陽性」という用語は、本発明の方法によって産生される寛容原性ＤＣにおける特定の細胞表面マーカーの発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟、好ましくはＬＰＳ成熟を介して得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）と実質的に同等であることを示す。
－細胞が、成熟樹状細胞と比較して、ＣＣＬ２１に対して低下した走化性挙動を示す。本明細書で用いられる「低下した走化性挙動」という用語は、本発明の方法によって産生される寛容原性ＤＣのＣＣＬ２１に対する走化性のレベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟、好ましくはＬＰＳ成熟を介して得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）における同じサイトカインに対する走化性のレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。ＣＣＬ２１に対する寛容原性樹状細胞の走化性挙動は、例えば、本発明の材料および方法、実施例７および図１２に記載されているように決定することができる。
－未成熟の場合に、未成熟ＤＣと比較して、細胞がＰＴＧＥＲ３および／またはＥＧＬＮ３の転写レベルで発現の低下を示す。「発現の低下」という用語は、所与の遺伝子に適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性未成熟ＤＣにおける特定の遺伝子の発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の未成熟ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して得られた未成熟ＤＣ）における同じ遺伝子の発現レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。遺伝子の発現レベルは、例えば、本発明の材料および方法、実施例８および図１３に記載されているように決定することができる。好ましい実施形態において、発現は、分化の４日目または５日目に測定される。
－未成熟の場合に、未成熟樹状細胞と比較して、細胞が、「ｆｉｎｄ ｍｅ」、またはＦＰＲ２、Ｐ２ＲＹ２および／またはＳ１ＰＲ１等の嗅覚受容体の転写レベルでの発現の増大を示す。「発現の増大」という用語は、所与の遺伝子に適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性未成熟ＤＣにおける特定の遺伝子の発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の未成熟ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して得られた未成熟ＤＣ）における同じ遺伝子の発現レベルと比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％またはそれ以上増大していることを示す。遺伝子の発現レベルは、例えば、本発明の材料および方法、実施例８および図１４に記載されているように決定することができる。好ましい実施形態において、発現は、分化の５日目に測定される。
ならびに／または
－細胞が分化／成熟プロセス後も生存可能であり続け、すなわちアポトーシスを起こさない。本明細書で用いられる「生存可能」という用語は、成熟刺激（例えば、ＬＰＳ）による処理後に、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満がアポトーシスを起こす集団を指す。アポトーシスは、アネキシンＶ／７－ＡＤＤ染色、カスパーゼ－３活性化アッセイ、ＴＵＮＥＬおよびＤＮＡ断片化アッセイ、ミトコンドリア膜電位の測定等の当技術分野において公知の任意の方法で測定することができる。細胞の生存率は、例えば、本発明の材料および方法、ならびに実施例２に記載されているように決定することができる。
－細胞がＣＤ８３－、ＣＤ８６－、ＣＤ８０－、ＣＤ４０－および／またはＣＣＲ７－である。「陰性」という用語は、所与のマーカーに適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性ＤＣにおける特定の細胞表面マーカーの発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟、好ましくはＬＰＳ成熟を介して得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）における同じ細胞表面マーカーの発現レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。
－未成熟の場合に、未成熟樹状細胞と比較して、細胞が抗原内在化能力またはエンドサイトーシス活性の増大を示す。本明細書で用いられる「抗原内在化能力の増大」または「エンドサイトーシス活性の増大」という用語は、本発明の方法によって産生される未成熟寛容原性ＤＣの抗原内在化またはエンドサイトーシス活性のレベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の未成熟ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して得られた未成熟ＤＣ）の抗原内在化能力またはエンドサイトーシス活性のレベルと比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％またはそれ以上増大していることを示す。寛容原性樹状細胞の抗原内在化能力またはエンドサイトーシス活性は、例えば、本発明の材料および方法、実施例２および図５に記載されるように、分化段階での蛍光ＤＱ－ＯＶＡ内在化およびプロセシングを測定することによって決定することができる。
－細胞が、成熟樹状細胞と比較して、ＩＬ－１２ｐ７０および／またはＴＮＦ－α等の炎症性サイトカインを分泌しないか、減少した量を分泌する。「減少した量を分泌する」という用語は、所与のサイトカインに適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性ＤＣにおける特定のサイトカインの分泌レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟、好ましくはＬＰＳ成熟を介して得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）における同じサイトカインの分泌レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。
－細胞がＨＬＡ－ＤＲ＋および／またはＣＤ１４＋である。所与のマーカーに適用される場合の「陽性」という用語は、本発明の方法によって産生される寛容原性ＤＣにおける特定の細胞表面マーカーの発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟、好ましくはＬＰＳ成熟を介して得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）と実質的に同等であることを示す。
－細胞が、成熟樹状細胞と比較して、ＣＣＬ２１に対して低下した走化性挙動を示す。本明細書で用いられる「低下した走化性挙動」という用語は、本発明の方法によって産生される寛容原性ＤＣのＣＣＬ２１に対する走化性のレベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟免疫刺激性ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟、好ましくはＬＰＳ成熟を介して得られた成熟免疫刺激性ＤＣ）における同じサイトカインに対する走化性のレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。ＣＣＬ２１に対する寛容原性樹状細胞の走化性挙動は、例えば、本発明の材料および方法、実施例７および図１２に記載されているように決定することができる。
－未成熟の場合に、未成熟ＤＣと比較して、細胞がＰＴＧＥＲ３および／またはＥＧＬＮ３の転写レベルで発現の低下を示す。「発現の低下」という用語は、所与の遺伝子に適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性未成熟ＤＣにおける特定の遺伝子の発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の未成熟ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して得られた未成熟ＤＣ）における同じ遺伝子の発現レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。遺伝子の発現レベルは、例えば、本発明の材料および方法、実施例８および図１３に記載されているように決定することができる。好ましい実施形態において、発現は、分化の４日目または５日目に測定される。
－未成熟の場合に、未成熟樹状細胞と比較して、細胞が、「ｆｉｎｄ ｍｅ」、またはＦＰＲ２、Ｐ２ＲＹ２および／またはＳ１ＰＲ１等の嗅覚受容体の転写レベルでの発現の増大を示す。「発現の増大」という用語は、所与の遺伝子に適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性未成熟ＤＣにおける特定の遺伝子の発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の未成熟ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して得られた未成熟ＤＣ）における同じ遺伝子の発現レベルと比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％またはそれ以上増大していることを示す。遺伝子の発現レベルは、例えば、本発明の材料および方法、実施例８および図１４に記載されているように決定することができる。好ましい実施形態において、発現は、分化の５日目に測定される。
ならびに／または
－細胞が分化／成熟プロセス後も生存可能であり続け、すなわちアポトーシスを起こさない。本明細書で用いられる「生存可能」という用語は、成熟刺激（例えば、ＬＰＳ）による処理後に、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満がアポトーシスを起こす集団を指す。アポトーシスは、アネキシンＶ／７－ＡＤＤ染色、カスパーゼ－３活性化アッセイ、ＴＵＮＥＬおよびＤＮＡ断片化アッセイ、ミトコンドリア膜電位の測定等の当技術分野において公知の任意の方法で測定することができる。細胞の生存率は、例えば、本発明の材料および方法、ならびに実施例２に記載されているように決定することができる。
【0291】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の寛容原性樹状細胞は、上述した特徴のうちの１つ以上を示すことによって特徴付けられる。
【0292】
本発明者らは、いくつかの「ｆｉｎｄ ｍｅ」受容体、特にＦＰＲ２、Ｐ２ＲＹ２、およびＳ１ＰＲ１が、未成熟樹状細胞に関して本発明の方法によって得られた未成熟寛容原性樹状細胞において転写レベルで発現を増加させることを見出した。しかしながら、寛容原性樹状細胞が他の方法、例えば、７つのα鎖によって形成されβ鎖を欠くＣ４ＢＰの生理学的アイソフォーム（Ｃ４ＢＰ（α７β０））（ＰＲＰ－ＨＯ７と名付けられた）とのインキュベーションによって得られる場合、上記遺伝子は過剰発現されない（図１４を参照のこと）。
【0293】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の寛容原性樹状細胞は、未成熟樹状細胞と比較した場合に、遺伝子ＦＰＲ２、Ｐ２ＲＹ２および／またはＳ１ＰＲ１のうちの１種以上の過剰発現を示すことによって特徴付けられる。
【0294】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の寛容原性樹状細胞は、ＦＰＲ２ｈｉｇｈ、Ｐ２ＲＹ２ｈｉｇｈおよび／またはＳ１ＰＲ１ｈｉｇｈである。一つの実施形態において、本発明の寛容原性樹状細胞はＦＰＲ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性樹状細胞はＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性樹状細胞はＳ１ＰＲ１ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性樹状細胞は、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性樹状細胞は、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよびＳ１ＰＲ１ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性樹状細胞は、Ｐ２ＲＹ２ｈｉｇｈおよびＳ１ＰＲ１ｈｉｇｈである。より好ましい実施形態において、本発明の寛容原性樹状細胞は、ＦＰＲ２ｈｉｇｈ、Ｐ２ＲＹ２ｈｉｇｈおよびＳ１ＰＲ１ｈｉｇｈである。
【0295】
所与の遺伝子に適用される場合の「ｈｉｇｈ」という用語は、本発明の方法によって産生される寛容原性ＤＣにおける特定の遺伝子の発現レベルが、適切な対照細胞（すなわち、天然の未成熟ＤＣ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して得られた未成熟ＤＣ）における同じ遺伝子の発現レベルと比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％以上増大していること；すなわち遺伝子が未成熟ＤＣと比較して過剰発現されていることを示す。
【0296】
別の実施形態において、本発明は、本発明の寛容原性樹状細胞を含む細胞集団に関する。好ましい実施形態において、細胞集団は、本発明の寛容原性樹状細胞を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％含む。好ましい実施形態において、細胞集団は、本発明の寛容原性樹状細胞を少なくとも８０％含む。
【0297】
本発明の態様についてこれまでに開示されたすべての実施形態は、この態様にも適用され得る。
【0298】
本発明のポリペプチド、ホモオリゴマー、ポリヌクレオチドおよびベクターを用いて得られた本発明の寛容原性マクロファージ
寛容原性マクロファージのトランスクリプトームプロファイルは、それらを生成するために用いられるアプローチに応じて大きく変化することが知られている（Navarro-Barriuso et al. 2018. Frontiers in Immunology, 9: 2062）。
寛容原性マクロファージのトランスクリプトームプロファイルは、それらを生成するために用いられるアプローチに応じて大きく変化することが知られている（Navarro-Barriuso et al. 2018. Frontiers in Immunology, 9: 2062）。
【0299】
したがって、別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のホモオリゴマー、該ポリペプチドまたはホモオリゴマーのいずれかをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含むベクターの存在下で、本発明の方法によってマクロファージを分化および／または成熟させることによって得られる本発明の寛容原性マクロファージに関する。好ましくは、本発明のホモオリゴマー、該ホモオリゴマーをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含むベクターの存在下、好ましくは本発明のホモオリゴマーの存在下で、本発明の方法によって得られる本発明の寛容原性マクロファージに関する。
【0300】
本発明による寛容原性マクロファージは、以下の特徴のうちの１つ以上を示すことを特徴とする：
－細胞がＣＤ６４－および／またはＣＤ８０－である。「陰性」という用語は、ＣＤ６４およびＣＤ８０マーカーに適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性マクロファージにおけるこれらの特定の細胞表面マーカーの発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟Ｍ１マクロファージ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟を介して得られた成熟Ｍ１マクロファージ）における同じ細胞表面マーカーの発現レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。
－細胞がＣＤ２０９－および／またはＣＤ１１ｂ－である。「陰性」という用語は、ＣＤ２０９およびＣＤ１１ｂマーカーに適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性マクロファージにおけるこれらの特定の細胞表面マーカーの発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟Ｍ２マクロファージ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟を介して得られた成熟Ｍ２マクロファージ）における同じ細胞表面マーカーの発現レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。
－未成熟の場合に、未成熟マクロファージＭ０と比較して、細胞がＡＬＣＡＭ、ＳＬＣ１６Ａ１および／またはＬＭＮＢ１の転写レベルで発現の低下を示す。「発現の低下」という用語は、所与の遺伝子に適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性マクロファージにおける特定の遺伝子の発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の未成熟Ｍ０マクロファージ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して得られた未成熟Ｍ０マクロファージ）における同じ遺伝子の発現レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。遺伝子の発現レベルは、例えば、材料および方法、実施例１０および図１６に記載されているように決定することができる。好ましい実施形態において、発現は、分化の２、４または６日目に測定される。
－未成熟の場合に、未成熟マクロファージＭ０と比較して、細胞が「ｆｉｎｄ ｍｅ」、またはＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＦＰＲ２および／またはＰ２ＲＹ２等の嗅覚受容体の転写レベルでの発現の増大を示す。「発現の増大」という用語は、所与の遺伝子に適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性マクロファージにおける特定の遺伝子の発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の未成熟Ｍ０マクロファージ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して得られた未成熟Ｍ０マクロファージ）における同じ遺伝子の発現レベルと比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％または以上増大していることを示す。遺伝子の発現レベルは、例えば、材料および方法、実施例１０および図１７に記載されているように決定することができる。好ましい実施形態において、発現は、分化の６日目に測定される。
－細胞が、成熟Ｍ１マクロファージと比較して、炎症性サイトカイン、およびＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＭＩＰ－１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＩＬ－６および／またはＴＮＦ－α等のケモカインについて減少した量を分泌する。所与のサイトカイン、ケモカインまたは急性期タンパク質に適用される場合、「減少した量を分泌する」という用語は、本発明の方法によって産生される寛容原性マクロファージにおける特定のサイトカインまたはケモカインの分泌レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟Ｍ１マクロファージ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟を介して得られた成熟Ｍ１マクロファージ）における同じサイトカインまたはケモカインの分泌レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。
－細胞がＣＤ６４－および／またはＣＤ８０－である。「陰性」という用語は、ＣＤ６４およびＣＤ８０マーカーに適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性マクロファージにおけるこれらの特定の細胞表面マーカーの発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟Ｍ１マクロファージ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟を介して得られた成熟Ｍ１マクロファージ）における同じ細胞表面マーカーの発現レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。
－細胞がＣＤ２０９－および／またはＣＤ１１ｂ－である。「陰性」という用語は、ＣＤ２０９およびＣＤ１１ｂマーカーに適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性マクロファージにおけるこれらの特定の細胞表面マーカーの発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟Ｍ２マクロファージ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟を介して得られた成熟Ｍ２マクロファージ）における同じ細胞表面マーカーの発現レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。
－未成熟の場合に、未成熟マクロファージＭ０と比較して、細胞がＡＬＣＡＭ、ＳＬＣ１６Ａ１および／またはＬＭＮＢ１の転写レベルで発現の低下を示す。「発現の低下」という用語は、所与の遺伝子に適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性マクロファージにおける特定の遺伝子の発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の未成熟Ｍ０マクロファージ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して得られた未成熟Ｍ０マクロファージ）における同じ遺伝子の発現レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。遺伝子の発現レベルは、例えば、材料および方法、実施例１０および図１６に記載されているように決定することができる。好ましい実施形態において、発現は、分化の２、４または６日目に測定される。
－未成熟の場合に、未成熟マクロファージＭ０と比較して、細胞が「ｆｉｎｄ ｍｅ」、またはＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＦＰＲ２および／またはＰ２ＲＹ２等の嗅覚受容体の転写レベルでの発現の増大を示す。「発現の増大」という用語は、所与の遺伝子に適用される場合、本発明の方法によって産生される寛容原性マクロファージにおける特定の遺伝子の発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の未成熟Ｍ０マクロファージ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して得られた未成熟Ｍ０マクロファージ）における同じ遺伝子の発現レベルと比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％または以上増大していることを示す。遺伝子の発現レベルは、例えば、材料および方法、実施例１０および図１７に記載されているように決定することができる。好ましい実施形態において、発現は、分化の６日目に測定される。
－細胞が、成熟Ｍ１マクロファージと比較して、炎症性サイトカイン、およびＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＭＩＰ－１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＩＬ－６および／またはＴＮＦ－α等のケモカインについて減少した量を分泌する。所与のサイトカイン、ケモカインまたは急性期タンパク質に適用される場合、「減少した量を分泌する」という用語は、本発明の方法によって産生される寛容原性マクロファージにおける特定のサイトカインまたはケモカインの分泌レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の成熟Ｍ１マクロファージ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟を介して得られた成熟Ｍ１マクロファージ）における同じサイトカインまたはケモカインの分泌レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少しているか、または検出できないことを示す。
【0301】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、上述した特徴のうちの１つ以上を示すことによって特徴付けられる。
【0302】
好ましい実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、未成熟マクロファージＭ０と比較して、ＡＬＣＡＭ、ＳＬＣ１６Ａ１および／またはＬＭＮＢ１の転写レベルでの発現の低下を示す。より好ましい実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、未成熟マクロファージＭ０と比較して、好ましくは分化の２、４または６日目、より好ましくは分化の２日目に、ＡＬＣＡＭの転写レベルでの発現の低下を示す。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、未成熟マクロファージＭ０と比較して、好ましくは分化の４または６日目に、ＳＬＣ１６Ａ１の転写レベルでの発現の低下を示す。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、未成熟マクロファージＭ０に対して、好ましくは分化の２または４日目に、ＬＭＮＢ１の転写レベルでの発現の低下を示す。
【0303】
好ましい実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージはＣＤ６４－および／またはＣＤ８０－である。好ましい実施形態において、本発明のホモオリゴマーの存在下で単球をＭ０に分化させ、さらにＭ０をＬＰＳおよびＩＦＮγで成熟させることによって得られる寛容原性マクロファージは、ＣＤ６４－および／またはＣＤ８０－である。別の好ましい実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、成熟Ｍ１マクロファージと比較して、減少した量のＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＭＩＰ－１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＩＬ－６および／またはＴＮＦ－αを分泌する。好ましい実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、減少した量のＣＣＬ１、ＣＣＬ２および／またはＭＩＰ－１を分泌する。より好ましい実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、成熟Ｍ１マクロファージと比較して減少した量のＣＣＬ２を分泌する。
【0304】
好ましい実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＤ２０９－および／またはＣＤ１１ｂ－である。好ましい実施形態において、本発明のホモオリゴマーの存在下で単球をＭ０に分化させ、さらにＭ０をＩＬ－４で成熟させることによって得られる寛容原性マクロファージは、ＣＤ２０９－および／またはＣＤ１１ｂ－である。
【0305】
寛容原性マクロファージが生理学的アイソフォームＣ４ＢＰ（α７β０）による処理によって得られる場合よりも、寛容原性マクロファージが本発明の方法によって得られる場合には、ＣＤ６４およびＣＤ１１ｂ細胞表面マーカーはさらに過少発現される（図１５を参照のこと）。したがって、一つの実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージはＣＤ６４－であり、好ましくはＣＤ６４の発現レベルは、Ｍ１マクロファージにおける発現レベルと比較して２５％に減少している。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージはＣＤ１１ｂ－であり、好ましくはＣＤ１１ｂの発現レベルは、Ｍ２マクロファージにおける発現レベルと比較して１８％に減少している。
【0306】
本発明の寛容原性マクロファージは、寛容原性マクロファージが生理学的アイソフォームＣ４ＢＰ（α７β０）による処理によって得られる場合よりもさらに少ないＣＣＬ１およびＭＩＰ－１を分泌する（図１８を参照のこと）。したがって、一つの実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、成熟Ｍ１マクロファージと比較して減少した量のＣＣＬ１を分泌し、好ましくはＣＣＬ１の発現レベルは、Ｍ１マクロファージにおける発現レベルと比較して７０％に減少している。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、成熟Ｍ１マクロファージと比較して減少した量のＭＩＰ－１を分泌し、好ましくはＭＩＰ－１の発現レベルは、Ｍ１マクロファージにおける発現レベルと比較して６３％に減少している。
【0307】
本発明者らは、いくつかの「ｆｉｎｄ ｍｅ」受容体、特にＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＦＰＲ２およびＰ２ＲＹ２が、未成熟Ｍ０マクロファージに関して本発明の方法によって得られる寛容原性マクロファージにおいて転写レベルで発現を増大させることを見出した。しかしながら、寛容原性マクロファージが他の方法、例えば、７つのα鎖によって形成されβ鎖を欠くＣ４ＢＰの生理学的アイソフォーム（Ｃ４ＢＰ（α７β０））（ＰＲＰ－ＨＯ７と名付けられた）（ＰＲＰ－ＨＯ７と名付けられた）とのインキュベーションによって得られる場合、上記遺伝子は過剰発現されない（図１７を参照のこと）。
【0308】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、未成熟マクロファージＭ０と比較した場合に、遺伝子ＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＦＰＲ２および／またはＰ２ＲＹ２のうちの１種以上の過剰発現を示すことによって特徴付けられる。
【0309】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈ、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよび／またはＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。一つの実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージはＣＣＲ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージはＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージはＣＸＣＲ１ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージはＦＰＲ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージはＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈおよびＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈおよびＣＸＣＲ１ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈおよびＦＰＲ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈおよびＣＸＣＲ１ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈおよびＦＰＲ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈおよびＦＰＲ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈおよびＦＰＲ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈ、ＦＰＲ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよび／またはＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈおよびＦＰＲ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈ、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈおよびＦＰＲ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈ、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。別の実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。より好ましい実施形態において、本発明の寛容原性マクロファージは、ＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈ、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよびＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである。
【0310】
所与の遺伝子に適用される場合の「ｈｉｇｈ」という用語は、本発明の方法によって産生される寛容原性マクロファージにおける特定の遺伝子の発現レベルが、適切な対照細胞（例えば、天然の未成熟Ｍ０マクロファージ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して得られた未成熟Ｍ０マクロファージ）における同じ遺伝子の発現レベルと比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％以上増大していること、すなわち遺伝子が未成熟Ｍ０マクロファージと比較して過剰発現されていることを示す。
【0311】
別の実施形態において、本発明は、本発明の寛容原性マクロファージを含む細胞集団に関する。好ましい実施形態において、細胞集団は、本発明の寛容原性マクロファージを少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％含む。好ましい実施形態において、細胞集団は、本発明の寛容原性マクロファージを少なくとも８０％含む。
【0312】
本発明の態様についてこれまでに開示されたすべての実施形態は、この態様にも適用され得る。
【0313】
本発明の寛容原性樹状細胞および寛容原性マクロファージの治療的使用
寛容原性樹状細胞および寛容原性マクロファージは、免疫学的疾患の患者の治療、特にＩ型糖尿病、関節リウマチおよびクローン病等の自己免疫疾患の治療、ならびに腎臓移植において有用である（Navarro-Barriuso et al. 2018. Frontiers in Immunology, 9: 2062）。
寛容原性樹状細胞および寛容原性マクロファージは、免疫学的疾患の患者の治療、特にＩ型糖尿病、関節リウマチおよびクローン病等の自己免疫疾患の治療、ならびに腎臓移植において有用である（Navarro-Barriuso et al. 2018. Frontiers in Immunology, 9: 2062）。
【0314】
したがって、別の態様において、本発明は、本発明の寛容原性樹状細胞、または本発明の寛容原性マクロファージ、または本発明の細胞集団と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。
【0315】
本発明の態様についてこれまでに開示されたすべての実施形態、特に本発明の医薬組成物について開示されたすべての実施形態および定義は、この態様にも適用され得る。
【0316】
別の態様において、本発明は、医学における使用のための本発明の寛容原性樹状細胞、本発明の寛容原性マクロファージ、本発明の細胞集団、またはそれらを含む医薬組成物に関する。
【0317】
別の態様において、本発明は、医薬の製造のための本発明の寛容原性樹状細胞、本発明の寛容原性マクロファージ、本発明の細胞集団、またはそれらを含む医薬組成物の使用に関する。
【0318】
別の態様において、本発明は、免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防および／または治療における使用のための本発明の寛容原性樹状細胞、本発明の寛容原性マクロファージ、本発明の細胞集団、またはそれらを含む医薬組成物に関する。
【0319】
別の態様において、本発明は、免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防または治療のための医薬の製造のための本発明の寛容原性樹状細胞、本発明の寛容原性マクロファージ、本発明の細胞集団、またはそれらを含む医薬組成物の使用に関する。
【0320】
別の態様において、本発明は、それを必要とする対象において免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防および／または治療する方法であって、本発明の寛容原性樹状細胞、本発明の寛容原性マクロファージ、本発明の細胞集団、またはそれらを含む医薬組成物を前記対象への投与を含む方法に関する。
【0321】
好ましい実施形態において、免疫学的疾患は、免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患からなる群から選択される。
【0322】
免疫学的疾患または障害を治療するための組成物の用量は、医学分野における当業者によって理解されるパラメーターに従って決定され得る。したがって、適切な用量は、患者（例えば、ヒト）の状態、すなわち、疾患の病期、通常の健康状態、ならびに年齢、性別および体重、ならびに医学分野における当業者に公知の他の要因に依存し得る。
【0323】
「治療」、「予防」、「対象」、「免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患」、「免疫炎症性疾患」、「敗血症」、「自己免疫疾患」、「移植片拒絶」、「移植片－対宿主病」および「過敏性疾患」は、上記で詳細に説明されており、本発明の治療方法について同じ意味で用いられる。
【0324】
本発明の態様についてこれまでに開示されたすべての実施形態、特に本発明の治療方法について開示されたすべての実施形態および定義は、この態様にも適用され得る。
【0325】
本発明はまた、以下に関する：
［１］Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に同等の変異体、およびオリゴマー化ドメインを含む組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４、ＣＣＰ５、ＣＣＰ７およびＣＣＰ８ドメインのいずれも含まない。
［２］ＣＣＰ６ドメインがヒトＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインである、［１］に記載の組換えポリペプチド。
［３］Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインが配列番号１である、［１］または［２］のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
［４］オリゴマー化ドメインがＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインまたはその機能的に同等の変異体である、［１］～［３］のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
［５］オリゴマー化ドメインがヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインまたはその機能的に同等の変異体である、［１］～［４］のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
［６］オリゴマー化ドメインが配列番号２またはその機能的に同等の変異体であり、好ましくは配列番号２である、［１］～［５］のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載の組換えポリペプチドであって、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）ＣＣＰ６ドメイン、および（ｂ）オリゴマー化ドメインを含む、組換えポリペプチド。
［８］ポリペプチドが配列番号３またはその機能的に同等の変異体からなり、好ましくは配列番号３からなる、［１］～［７］のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
［９］ポリペプチドがシグナルペプチドをさらに含む、［１］～［８］のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
［１０］シグナルペプチドがＣ４ＢＰα鎖のシグナルペプチド、好ましくは配列番号４のペプチドまたはその機能的に同等の変異体、好ましくは配列番号４である、［９］に記載の組換えポリペプチド。
［１１］ポリペプチドが配列番号５またはその機能的に同等の変異体からなり、好ましくは配列番号５からなる、［１０］に記載の組換えポリペプチド。
［１２］［１］～［１１］のいずれかに記載の組換えポリペプチドであって、Ｃ４ＢＰα鎖の一部ではないペプチド、好ましくはタグペプチドをさらに含む、組換えポリペプチド。
［１３］タグペプチドがＣＣＰ６ドメインのＮ末端に連結されている、［１２］に記載の組換えポリペプチド。
［１４］タグペプチドがポリヒスチジンタグである、［１２］または［１３］に記載の組換えポリペプチド。
［１５］ポリペプチドが配列番号６またはその機能的に同等の変異体からなり、好ましくは配列番号６からなる、［１４］に記載の組換えポリペプチド。
［１６］ポリペプチドが配列番号７またはその機能的に同等の変異体からなり、好ましくは配列番号７からなる、［１４］に記載の組換えポリペプチド。
［１７］［１］～［１６］のいずれかに記載の少なくとも６つの組換えポリペプチドのホモオリゴマー。
［１８］ホモオリゴマーが、［１］～［１６］のいずれかに記載の７つの組換えポリペプチドによって形成される、［１７］に記載のホモオリゴマー。
［１９］ホモオリゴマーが、［１］～［１６］のいずれかに記載の７つの組換えポリペプチドからなる、［１７］に記載のホモオリゴマー。
［２０］ポリペプチドが［１５］に記載のポリペプチドである、［１７］～［１９］のいずれかに記載のホモオリゴマー。
［２１］［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
［２２］［２１］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［２３］［２２］に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［２４］［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリペプチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、または［２３］に記載の宿主細胞と、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
［２５］医薬における使用のための、［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリペプチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、［２３］に記載の宿主細胞、または［２４］に記載の医薬組成物。
［２６］免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防および／または治療における使用のための、［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリヌクレオチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、［２３］に記載の宿主細胞、または［２４］に記載の医薬組成物。
［２７］免疫学的疾患が、免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患からなる群から選択される、［２６］に記載の使用のための、［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリペプチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、［２３］に記載の宿主細胞、または［２４］による医薬組成物。
［２８］自己免疫疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患および関節リウマチからなる群から選択される、［２７］に記載の使用のための、［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリペプチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、［２３］に記載の宿主細胞、または［２４］に記載の医薬組成物。
［２９］自己免疫疾患が炎症性腸疾患である、［２８］に記載の使用のための、［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリペプチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、宿主細胞［２３］に記載の、または［２４］に記載の医薬組成物。
［３０］ｉｎ ｖｉｔｒｏで寛容原性樹状細胞の集団を生成するための方法であって：
（ｉ）未成熟樹状細胞の集団の形成に適切な条件下で樹状前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟樹状細胞の形成に適切な条件下で、工程（ｉ）で得られた未成熟樹状細胞の集団をインキュベートする工程
を含み、
工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）［１］～［１６］のいずれかに記載のポリペプチド、
（ｂ）［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、
（ｃ）［２１］に記載のポリヌクレオチド、および
（ｄ）［２２］に記載のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる、方法。
［３１］樹状前駆細胞の集団が単球集団である、［３０］に記載の方法。
［３２］ｉｎ ｖｉｔｒｏで寛容原性マクロファージの集団を生成するための方法であって：
（ｉ）未成熟マクロファージの集団の形成に適切な条件下でマクロファージ前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟マクロファージの形成に適切な条件下で、工程（ｉ）で得られた未成熟マクロファージの集団をインキュベートする工程
を含み、
工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）［１］～［１６］のいずれかに記載のポリペプチド、
（ｂ）［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、
（ｃ）［２１］に記載のポリヌクレオチド、および
（ｄ）［２２］に記載のベクトル
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる、方法。
［３３］マクロファージ前駆細胞の集団が単球集団である、［３２］に記載の方法。
［３４］［３０］または［３１］のいずれかに記載の方法によって得られる寛容原性樹状細胞、または［３２］または［３３］のいずれかに記載の方法によって得られる寛容原性マクロファージ。
［３５］［３４］に記載の寛容原性樹状細胞であって、前記細胞がＦＰＲ２ｈｉｇｈ、Ｐ２ＲＹ２ｈｉｇｈおよび／またはＳ１ＰＲ１ｈｉｇｈである、寛容原性樹状細胞。
［３６］［３４］に記載の寛容原性マクロファージであって、前記マクロファージがＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈ、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよび／またはＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである、寛容原性マクロファージ。
［３７］［３４］または［３５］に記載の寛容原性樹状細胞を少なくとも８０％、または［３４］または［３６］に記載の寛容原性マクロファージを少なくとも８０％含む、細胞集団。
［３８］［３４］または［３５］に記載の寛容原性樹状細胞、［３４］または［３６］に記載の寛容原性マクロファージ、または［３７］に記載の細胞集団と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
［３９］医薬における使用のための、［３４］または［３５］に記載の寛容原性樹状細胞、［３４］または［３６］に記載の寛容原性マクロファージ、［３７］に記載の細胞集団、または［３８］に記載の医薬組成物。
［４０］免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防におよび／または治療における使用のための、［３４］または［３５］に記載の寛容原性樹状細胞、［３４］または［３６］に記載の寛容原性マクロファージ、［３７］に記載の細胞集団、または［３８］に記載の医薬組成物。
［４１］免疫学的疾患が、免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主疾患および過敏性疾患からなる群から選択される、［４１］に記載の使用のための、［３４］または［３５］に記載の寛容原性樹状細胞、［３４］または［３６］に記載の寛容原性マクロファージ、［３７］に記載の細胞集団、または［３８］に記載の医薬組成物。
［４２］それを必要とする対象において寛容原性樹状細胞集団および／または寛容原性マクロファージ集団を増加させるための方法であって、［１］～［１６］のいずれかに記載のポリペプチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、［２３］に記載の宿主細胞、または［２４］に記載の医薬組成物、またはそれらの組み合わせを前記対象に投与することを含む、方法。
［１］Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインまたはその機能的に同等の変異体、およびオリゴマー化ドメインを含む組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４、ＣＣＰ５、ＣＣＰ７およびＣＣＰ８ドメインのいずれも含まない。
［２］ＣＣＰ６ドメインがヒトＣ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインである、［１］に記載の組換えポリペプチド。
［３］Ｃ４ＢＰα鎖のＣＣＰ６ドメインが配列番号１である、［１］または［２］のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
［４］オリゴマー化ドメインがＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインまたはその機能的に同等の変異体である、［１］～［３］のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
［５］オリゴマー化ドメインがヒトＣ４ＢＰα鎖のオリゴマー化ドメインまたはその機能的に同等の変異体である、［１］～［４］のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
［６］オリゴマー化ドメインが配列番号２またはその機能的に同等の変異体であり、好ましくは配列番号２である、［１］～［５］のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載の組換えポリペプチドであって、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、（ａ）ＣＣＰ６ドメイン、および（ｂ）オリゴマー化ドメインを含む、組換えポリペプチド。
［８］ポリペプチドが配列番号３またはその機能的に同等の変異体からなり、好ましくは配列番号３からなる、［１］～［７］のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
［９］ポリペプチドがシグナルペプチドをさらに含む、［１］～［８］のいずれかに記載の組換えポリペプチド。
［１０］シグナルペプチドがＣ４ＢＰα鎖のシグナルペプチド、好ましくは配列番号４のペプチドまたはその機能的に同等の変異体、好ましくは配列番号４である、［９］に記載の組換えポリペプチド。
［１１］ポリペプチドが配列番号５またはその機能的に同等の変異体からなり、好ましくは配列番号５からなる、［１０］に記載の組換えポリペプチド。
［１２］［１］～［１１］のいずれかに記載の組換えポリペプチドであって、Ｃ４ＢＰα鎖の一部ではないペプチド、好ましくはタグペプチドをさらに含む、組換えポリペプチド。
［１３］タグペプチドがＣＣＰ６ドメインのＮ末端に連結されている、［１２］に記載の組換えポリペプチド。
［１４］タグペプチドがポリヒスチジンタグである、［１２］または［１３］に記載の組換えポリペプチド。
［１５］ポリペプチドが配列番号６またはその機能的に同等の変異体からなり、好ましくは配列番号６からなる、［１４］に記載の組換えポリペプチド。
［１６］ポリペプチドが配列番号７またはその機能的に同等の変異体からなり、好ましくは配列番号７からなる、［１４］に記載の組換えポリペプチド。
［１７］［１］～［１６］のいずれかに記載の少なくとも６つの組換えポリペプチドのホモオリゴマー。
［１８］ホモオリゴマーが、［１］～［１６］のいずれかに記載の７つの組換えポリペプチドによって形成される、［１７］に記載のホモオリゴマー。
［１９］ホモオリゴマーが、［１］～［１６］のいずれかに記載の７つの組換えポリペプチドからなる、［１７］に記載のホモオリゴマー。
［２０］ポリペプチドが［１５］に記載のポリペプチドである、［１７］～［１９］のいずれかに記載のホモオリゴマー。
［２１］［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
［２２］［２１］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［２３］［２２］に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［２４］［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリペプチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、または［２３］に記載の宿主細胞と、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
［２５］医薬における使用のための、［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリペプチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、［２３］に記載の宿主細胞、または［２４］に記載の医薬組成物。
［２６］免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防および／または治療における使用のための、［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリヌクレオチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、［２３］に記載の宿主細胞、または［２４］に記載の医薬組成物。
［２７］免疫学的疾患が、免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患からなる群から選択される、［２６］に記載の使用のための、［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリペプチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、［２３］に記載の宿主細胞、または［２４］による医薬組成物。
［２８］自己免疫疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患および関節リウマチからなる群から選択される、［２７］に記載の使用のための、［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリペプチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、［２３］に記載の宿主細胞、または［２４］に記載の医薬組成物。
［２９］自己免疫疾患が炎症性腸疾患である、［２８］に記載の使用のための、［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えポリペプチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、宿主細胞［２３］に記載の、または［２４］に記載の医薬組成物。
［３０］ｉｎ ｖｉｔｒｏで寛容原性樹状細胞の集団を生成するための方法であって：
（ｉ）未成熟樹状細胞の集団の形成に適切な条件下で樹状前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟樹状細胞の形成に適切な条件下で、工程（ｉ）で得られた未成熟樹状細胞の集団をインキュベートする工程
を含み、
工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）［１］～［１６］のいずれかに記載のポリペプチド、
（ｂ）［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、
（ｃ）［２１］に記載のポリヌクレオチド、および
（ｄ）［２２］に記載のベクター
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる、方法。
［３１］樹状前駆細胞の集団が単球集団である、［３０］に記載の方法。
［３２］ｉｎ ｖｉｔｒｏで寛容原性マクロファージの集団を生成するための方法であって：
（ｉ）未成熟マクロファージの集団の形成に適切な条件下でマクロファージ前駆細胞の集団をインキュベートする工程、および
（ｉｉ）成熟マクロファージの形成に適切な条件下で、工程（ｉ）で得られた未成熟マクロファージの集団をインキュベートする工程
を含み、
工程（ｉ）および／または（ｉｉ）が、
（ａ）［１］～［１６］のいずれかに記載のポリペプチド、
（ｂ）［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、
（ｃ）［２１］に記載のポリヌクレオチド、および
（ｄ）［２２］に記載のベクトル
からなる群から選択される物質の組成物の存在下で行われる、方法。
［３３］マクロファージ前駆細胞の集団が単球集団である、［３２］に記載の方法。
［３４］［３０］または［３１］のいずれかに記載の方法によって得られる寛容原性樹状細胞、または［３２］または［３３］のいずれかに記載の方法によって得られる寛容原性マクロファージ。
［３５］［３４］に記載の寛容原性樹状細胞であって、前記細胞がＦＰＲ２ｈｉｇｈ、Ｐ２ＲＹ２ｈｉｇｈおよび／またはＳ１ＰＲ１ｈｉｇｈである、寛容原性樹状細胞。
［３６］［３４］に記載の寛容原性マクロファージであって、前記マクロファージがＣＣＲ２ｈｉｇｈ、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ１ｈｉｇｈ、ＦＰＲ２ｈｉｇｈおよび／またはＰ２ＲＹ２ｈｉｇｈである、寛容原性マクロファージ。
［３７］［３４］または［３５］に記載の寛容原性樹状細胞を少なくとも８０％、または［３４］または［３６］に記載の寛容原性マクロファージを少なくとも８０％含む、細胞集団。
［３８］［３４］または［３５］に記載の寛容原性樹状細胞、［３４］または［３６］に記載の寛容原性マクロファージ、または［３７］に記載の細胞集団と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
［３９］医薬における使用のための、［３４］または［３５］に記載の寛容原性樹状細胞、［３４］または［３６］に記載の寛容原性マクロファージ、［３７］に記載の細胞集団、または［３８］に記載の医薬組成物。
［４０］免疫系の望ましくない活性化によって引き起こされる免疫学的疾患の予防におよび／または治療における使用のための、［３４］または［３５］に記載の寛容原性樹状細胞、［３４］または［３６］に記載の寛容原性マクロファージ、［３７］に記載の細胞集団、または［３８］に記載の医薬組成物。
［４１］免疫学的疾患が、免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主疾患および過敏性疾患からなる群から選択される、［４１］に記載の使用のための、［３４］または［３５］に記載の寛容原性樹状細胞、［３４］または［３６］に記載の寛容原性マクロファージ、［３７］に記載の細胞集団、または［３８］に記載の医薬組成物。
［４２］それを必要とする対象において寛容原性樹状細胞集団および／または寛容原性マクロファージ集団を増加させるための方法であって、［１］～［１６］のいずれかに記載のポリペプチド、［１７］～［２０］のいずれかに記載のホモオリゴマー、［２１］に記載のポリヌクレオチド、［２２］に記載のベクター、［２３］に記載の宿主細胞、または［２４］に記載の医薬組成物、またはそれらの組み合わせを前記対象に投与することを含む、方法。
【実施例】
【0326】
本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、単なる例示と見なされるべきである。
【0327】
実施例１－１３
材料および方法
ＰＲＰ－ＨＥ８、ＰＲＰ－ＨＯ７、ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＮＯの取得および精製
ＰＲＰ－ＨＥ８は、ヒト血漿から精製された７個のα鎖と１個のβ鎖とによって形成される生理学的アイソフォーム（Ｃ４ＢＰ（β＋））に対応し、Ｃ４ＢＰ（α７β１）とも呼ばれる（Olivar et al. 2013. J Immunol, 190(6): 2857-2872）。
材料および方法
ＰＲＰ－ＨＥ８、ＰＲＰ－ＨＯ７、ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＮＯの取得および精製
ＰＲＰ－ＨＥ８は、ヒト血漿から精製された７個のα鎖と１個のβ鎖とによって形成される生理学的アイソフォーム（Ｃ４ＢＰ（β＋））に対応し、Ｃ４ＢＰ（α７β１）とも呼ばれる（Olivar et al. 2013. J Immunol, 190(6): 2857-2872）。
【0328】
ＰＲＰ－ＨＯ７は、ヒト血漿から精製された７個のα鎖によって形成されるがβ鎖を欠いている生理学的アイソフォーム（Ｃ４ＢＰ（β－））に対応し、Ｃ４ＢＰ（α７β０）とも呼ばれる（Olivar et al. 2013. J Immunol, 190(6): 2857-2872）。
【0329】
ＰＲＰ６－ＨＯ７は、７個の組換えポリペプチドのホモオリゴマーであり、それらのそれぞれは、Ｃ４ＢＰ（β－）のＣＣＰ６ドメインと、そのＣ末端に本発明者らによって操作されたＣ４ＢＰ（β－）の完全なオリゴマー化ドメインとを融合することによって形成された。ＰＲＰ６－ＨＯ７を形成する組換えポリペプチドの未成熟形態の配列は配列番号７であり、図１Ａに示されている。ＰＲＰ６－ＨＯ７を形成する組換えポリペプチドの未成熟形態はまた、成熟形態で排除されるＣ４ＢＰのシグナルペプチドを含んでいた。成熟型のＰＲＰ６－ＨＯ７の配列は配列番号６であり、理論上のｐＩが５．８１であり、理論上のＭｗが１４，２８７．９８Ｄａである。配列番号６の配列を以下に示すが、最初の６個のアミノ酸には下線が引かれ、ヒスチジンタグに対応し、その後にＣ４ＢＰ（β－）の完全なオリゴマー化ドメインと融合したＣ４ＢＰ（β－）のＣＣＰ６ドメインの配列が続き、これは二重下線で示されている。
ＨＨＨＨＨＨＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号６）
ＨＨＨＨＨＨＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号６）
【0330】
ＰＲＰ６－ＮＯは、Ｃ４ＢＰ（β－）のＣＣＰ６ドメインと、そのＣ末端に、２つのシステイン残基をアラニンで置換し、最後の１３個のＣ末端アミノ酸（Δ５３７－５４９／Ｃ４９８Ａ／Ｃ５１０Ａ）を欠失させることによってオリゴマー化することができない変異体Ｃ４ＢＰ（β－）のオリゴマー化ドメインとを融合することによって形成された組換えポリペプチドである（Kask et al. 2002. Biochemistry, 41:9349-9357）。この組換えポリペプチドは、本発明者らによって操作されたものである。未成熟型のＰＲＰ６－ＮＯの配列は配列番号１０であり、図１Ｂに示されている。未成熟型のＰＲＰ６－ＮＯはまた、成熟型で排除されるＣ４ＢＰのシグナルペプチドを含んでいた。成熟型のＰＲＰ６－ＮＯの配列は配列番号８であり、理論上のｐＩが５．８０であり、理論上のＭｗが１２，７２３．２３Ｄａである。配列番号８の配列を以下に示すが、最初の６個のアミノ酸には下線が引かれ、ヒスチジンタグに対応し、その後にＣ４ＢＰ（β－）の切断型変異体に融合したＣ４ＢＰ（β－）のＣＣＰ６ドメインの配列が続き、これは二重下線で示されている。アラニンに変異したオリゴマー化ドメインの２つの残基は太字で示されている。
【0331】
ＭＨＰＰＫＴＰＳＧＡＬＨＲＫＲＫＭＡＡＷＰＦＳＲＬＷＫＶＳＤＰＩＬＦＱＭＴＬＩＡＡＬＬＰＡＶＬＧＨＨＨＨＨＨＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＡＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＡＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱ（配列番号１０）
【0332】
好ましい実施形態において、配列番号１０をコードするポリヌクレオチドは配列番号１１である。
【0333】
ＨＨＨＨＨＨＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＡＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＡＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱ（配列番号８）
【0334】
ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＮＯのＮ末端に６つのヒスチジンタグを追加して、精製および検出を改善した。それらの生成は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびペプチドマッピング分析（質量分析）によって確認された。
【0335】
地元の血液バンクから供給されたプールされたヒト血漿からのＰＲＰ－ＨＥ８（Ｃ４ＢＰ（β＋））およびＰＲＰ－ＨＯ７（Ｃ４ＢＰ（β－））精製には、ＢａＣｌ２沈殿が含まれており（Dahlback. (1983) Biochem. J. 209: 847-856；Blom et al. (2009) Ann. Rheum. Dis. 68: 136-142）、続いてヘパリンクロマトグラフィー、疎水性相互作用（ブチル）クロマトグラフィー、陰イオン交換（Ｑセファロース）クロマトグラフィー、および最後にサイズ排除（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）クロマトグラフィーを含む４種類の連続したクロマトグラフィー工程を行った。血漿精製されたＰＲＰ－ＨＥ８およびＰＲＰ－ＨＯ７の両方を、濃縮し、透析し、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中に収集した。６μｇタンパク質／レーンでのＴｒｉｓ－酢酸３～８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（NuPAGE precast protein gels; ThermoFisher, Waltham, MA, USA）およびさらなるさらにクーマシーブルー染色により評価したところ、いずれの糖タンパク質の純度も８５％を超えていた。
【0336】
ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＮＯの各ＤＮＡ（それぞれ、配列番号９および１１）を、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターにクローン化した。Ｑｉａｇｅｎ社のＱｉａｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭｅｇａＫｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを増幅および精製した。Ｅｘｐｉ２９３細胞は、２．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度および９８％の生存率で目的の容量に達するまで浮遊培養により増殖させた。培養液１リットルあたり１ｍｇのＤＮＡを細胞に一過性にトランスフェクトした後、３７℃で７日間インキュベートし、１２５ｒｐｍで振とうし、８％のＣＯ２を供給した。最後に、培地を収集し、４℃、６０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を、標準的な手順に従ったニッケルアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ）によるタンパク質精製に供した。両方の組換えポリペプチドを濃縮し、透析し、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液に回収した。純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色によって評価した。
【0337】
ＡＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＴＣＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡＣＣＴＴＧＡＴＣＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＴＡＴＧＴＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＡＡＧＣＴＡＡＡＴＡＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＣＧＴＣＣＴＧＣＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣＴＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＴＧＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＣＣＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＡＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＣＡＡＧＴＧＣＴＣＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＡＣＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＣＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＣＧＣＡＡＧＡＣＡＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＧＡＡＣＴＡＴＡＡ（配列番号９）
【0338】
ＡＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＴＣＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡＣＣＴＴＧＡＴＣＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＴＡＴＧＴＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＡＡＧＣＴＡＡＡＴＡＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＣＧＴＣＣＴＧＣＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣＴＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＴＧＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＣＣＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＡＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＧＣＴＣＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＡＣＴＣＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＡＣＡＧＴＡＡ（配列番号１１）
【0339】
細胞培養とＰＲＰベースの治療
健康なドナーからの総血液をＢｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ（スペイン、バルセロナ）で取得し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度遠心分離（GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden）をした後にＰＢＭＣを分離した。Ｂｅｌｌｖｉｔｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの腎臓病棟に由来する炎症（flare）を経験したループス腎炎患者は、入院時に採血を受け、健康なドナーについて説明したようにＰＢＭＣを得た。この研究は、施設のガイドラインとヘルシンキ宣言に従ってＩＤＩＢＥＬＬの倫理委員会によって承認され、患者の書面によるインフォームドコンセントを得た。
健康なドナーからの総血液をＢｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ（スペイン、バルセロナ）で取得し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度遠心分離（GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden）をした後にＰＢＭＣを分離した。Ｂｅｌｌｖｉｔｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの腎臓病棟に由来する炎症（flare）を経験したループス腎炎患者は、入院時に採血を受け、健康なドナーについて説明したようにＰＢＭＣを得た。この研究は、施設のガイドラインとヘルシンキ宣言に従ってＩＤＩＢＥＬＬの倫理委員会によって承認され、患者の書面によるインフォームドコンセントを得た。
【0340】
単球（Ｍｏ）を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１４抗体（ＭＡＣＳ, Miltenyi Biotec社製, Auburn, CAまたはＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ, StemCell Technologies社製, Grenoble, France）と結合したコロイド状超常磁性マイクロビーズを用いて精製し、Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｃｏｕｎｔ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ(Cytognos SL社製, Salamanca, Spain)を用いてカウントした。ＣＤ１４＋細胞の純度は、ＣＤ１４染色およびフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＤｉｖａ ソフトウェア（Becton Dickinson社製, Franklin Lakes, NJ）を備えたＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター）によって試験され、ＰＢＭＣの数および総ＣＤ１４＋細胞の数が評価された（＞９０％ＣＤ１４＋）。
【0341】
単球を、３７℃、５％のＣＯ２下で、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、２ｍＭのＬ－グルタミン（すべてInvitrogen社製, Carlsbad, CA）および１０％熱不活化ＦＢＳ（Life technologies社製, ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ, Carlsbad, CA）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Gibco社製, ThermoFisher, Waltham, MA, USA）（完全培地）中で２４ウェル培養プレート（Jet Biofil社製, Guangzhou, China）に１×１０６細胞／５００μｌで播種した。単球由来ＤＣ（ＭｏＤＣ）は、ベルギーのカンペンハウトにあるＧｅｎｔａｕｒ社の完全ＲＰＭＩ１６４０培地とＧＭ－ＣＳＦ（８００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ－４（５００ＩＵ／ｍｌ）とで単球培養物を補って生成された。単球由来の分化していないマクロファージ（Ｍ０）は、ＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｔａｕｒ社製）またはＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）（MACS社製, Miltenyi Biotec, Auburn, CA）と共に６日間インキュベーションすることによって生成された。
【0342】
ＰＲＰベースのタンパク質は、０日目に、示された濃度で分化中の単球に添加された。ＤＣ成熟の場合、未処理またはＰＲＰベースの分子で処理したｉＤＣを、５μｇ／ｍｌのＬＰＳ（エシェリヒア・コリ０５５．Ｂ５、Sigma Aldrich社製, Merck, Darmstadt, Germany）または１０μｇ／ｍｌのＧａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ（イミダゾキノリン化合物；ＴＬＲ７リガンド）（Invivogen社製, San Diego, CA）で５日目にさらに４８時間刺激した。Ｍ１（古典的活性化）およびＭ２（代替活性化）マクロファージ分極の場合、６日目のＭ０細胞をＬＰＳ（４０ｎｇ／ｍｌ）（Sigma-Aldrich社製）およびγ－ＩＦＮ（４０ｎｇ／ｍｌ）（Invitrogen社製, Carlsbad, CA）と共に（Ｍ１）、またはＩＬ－４（４０ｎｇ／ｍｌ）（Invitrogen社製）と共に（Ｍ２）、２日間さらにインキュベートした。
【0343】
さらに、ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７免疫調節活性におけるヒト血清の影響を評価するために、ヒトＭｏＤＣを、示されたそれぞれの濃度のＰＲＰベースタンパク質で処理し、それらの分化と成熟の過程を通して５０％の熱不活化ヒト血清と共培養した（５６℃、１時間）。
【0344】
抗体およびフローサイトメトリー
細胞表面の表現型を、以下のｍＡｂを用いて分析した：ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ－ＤＲ（Ｉｍｍｕ－３５７）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８３（ＨＢ１５ａ）（Becton Dickinson社製, Franklin Lakes, NJ）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１４（ＴＵＫ４）、ＰＥ結合抗ＣＤ４０（ＨＢ１４）、ＰＥ結合抗ＣＤ８０（２Ｄ１０）、ＰＥ結合抗ＣＤ８６（ＦＭ９５）、ＰＥ結合抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０．１５．１１．５）、ＡＰＣ－コンジュゲート抗ＣＤ６４（１０．１．１）およびＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ２０９（ＲＥＡ６１７）（Miltenyi Biotec社製, Bergisch Gladbach, Germany）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗ＣＣＲ７（Ｇ０４３Ｈ７）（Biolegend社製, San Diego, CA）。ＦＩＴＣ結合抗ＩｇＧ１（ＩＳ５－２１Ｆ５）、ＦＩＴＣ結合抗ＩｇＧ２ｂ（ＩＳ６－１１Ｅ５．１１）、ＦＩＴＣ結合抗ＩｇＧ２ａ（Ｓ４３．１０）、ＰＥ結合抗ＩｇＧ２ｂ（ＩＳ６－１１Ｅ５．１１）およびＡＰＣ結合ＩｇＧ１（ＩＳ５－２１Ｆ５）（Miltenyi Biotec社製）、ＰＥ結合抗ＩｇＧ１（ＰＰＶ－０６）（EuroBioSciences GmbH製, Friesoythe, Germany）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合抗ＩｇＧ２ａκ（ＭＯＰＣ－１７３）（Biolegend社製）をそれぞれのアイソタイプコントロールとして用いた。
細胞表面の表現型を、以下のｍＡｂを用いて分析した：ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ－ＤＲ（Ｉｍｍｕ－３５７）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８３（ＨＢ１５ａ）（Becton Dickinson社製, Franklin Lakes, NJ）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１４（ＴＵＫ４）、ＰＥ結合抗ＣＤ４０（ＨＢ１４）、ＰＥ結合抗ＣＤ８０（２Ｄ１０）、ＰＥ結合抗ＣＤ８６（ＦＭ９５）、ＰＥ結合抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０．１５．１１．５）、ＡＰＣ－コンジュゲート抗ＣＤ６４（１０．１．１）およびＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ２０９（ＲＥＡ６１７）（Miltenyi Biotec社製, Bergisch Gladbach, Germany）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗ＣＣＲ７（Ｇ０４３Ｈ７）（Biolegend社製, San Diego, CA）。ＦＩＴＣ結合抗ＩｇＧ１（ＩＳ５－２１Ｆ５）、ＦＩＴＣ結合抗ＩｇＧ２ｂ（ＩＳ６－１１Ｅ５．１１）、ＦＩＴＣ結合抗ＩｇＧ２ａ（Ｓ４３．１０）、ＰＥ結合抗ＩｇＧ２ｂ（ＩＳ６－１１Ｅ５．１１）およびＡＰＣ結合ＩｇＧ１（ＩＳ５－２１Ｆ５）（Miltenyi Biotec社製）、ＰＥ結合抗ＩｇＧ１（ＰＰＶ－０６）（EuroBioSciences GmbH製, Friesoythe, Germany）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合抗ＩｇＧ２ａκ（ＭＯＰＣ－１７３）（Biolegend社製）をそれぞれのアイソタイプコントロールとして用いた。
【0345】
ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１００ｍｌのＦＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中の３μｌのＭｏＡｂ／１０５細胞を用いて室温で１５分間染色した。破片を除くために、前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）パラメーターに従ってセルをゲート制御した。７－アミノアクチノマイシンＤ（ThermoFischer社製, Carlsbad, CA）による染色も行われ、それらの生存状態が評価された。染色された細胞は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（BectonDickinson社製）を用いて分析された。その後の分析では、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Flowjo LLC製, Ashland, OR）を用いた。
【0346】
エンドサイトーシス活性
ｉＤＣのエンドサイトーシスを測定するために、２×１０５細胞／ｍｌを１００μｌのＰＢＳに再懸濁し、４μｌのＢＯＤＩＰＹ ＦＬ結合ＤＱ－オボアルブミン（１ｍｇ／ｍｌ、ＤＱ－ＯＶＡ、Molecular Probes社製, Leiden, Netherlands）と共に３７℃または０℃で３０分間インキュベートした（受容体依存性エンドサイトーシス）。１ｍｌの冷却ＦＡＣＳバッファーを添加することによりインキュベーションを停止させた。細胞を冷却ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、フローサイトメトリーを用いてそれらの蛍光を分析した。
ｉＤＣのエンドサイトーシスを測定するために、２×１０５細胞／ｍｌを１００μｌのＰＢＳに再懸濁し、４μｌのＢＯＤＩＰＹ ＦＬ結合ＤＱ－オボアルブミン（１ｍｇ／ｍｌ、ＤＱ－ＯＶＡ、Molecular Probes社製, Leiden, Netherlands）と共に３７℃または０℃で３０分間インキュベートした（受容体依存性エンドサイトーシス）。１ｍｌの冷却ＦＡＣＳバッファーを添加することによりインキュベーションを停止させた。細胞を冷却ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、フローサイトメトリーを用いてそれらの蛍光を分析した。
【0347】
走化性
ＰＲＰ－ＨＥ８、ＰＲＰ－ＨＯ７またはＰＲＰ６－ＨＯ７の存在下で分化および成熟（ＬＰＳで４８時間）したＤＣを、トランスウェルアッセイを用いて、ＣＣＬ２１ケモカインへの移動（migration）について試験した。簡単に説明すると、トランスウェルプレート（孔径８．０μｍのポリカーボネートフィルター；Costar社製, Corning, NY）の下部チャンバーに、ＣＣＬ２１（２００ｎｇ／ｍｌ）を含むかまたは含まない完全ＲＰＭＩ１６４０培地４００μｌを充填した。１００μｌの完全ＲＰＭＩ１６４０培地中の合計１．６×１０４個のＤＣを上部チャンバーに入れ、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。下部チャンバーに移動した細胞を回収し、フローサイトメーターでカウントし、１．５分の一定期間のイベントを取得した。すべての刺激条件の移動アッセイを、２つのウェルで行った。値は、移行されたセルの総数として示される。
ＰＲＰ－ＨＥ８、ＰＲＰ－ＨＯ７またはＰＲＰ６－ＨＯ７の存在下で分化および成熟（ＬＰＳで４８時間）したＤＣを、トランスウェルアッセイを用いて、ＣＣＬ２１ケモカインへの移動（migration）について試験した。簡単に説明すると、トランスウェルプレート（孔径８．０μｍのポリカーボネートフィルター；Costar社製, Corning, NY）の下部チャンバーに、ＣＣＬ２１（２００ｎｇ／ｍｌ）を含むかまたは含まない完全ＲＰＭＩ１６４０培地４００μｌを充填した。１００μｌの完全ＲＰＭＩ１６４０培地中の合計１．６×１０４個のＤＣを上部チャンバーに入れ、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。下部チャンバーに移動した細胞を回収し、フローサイトメーターでカウントし、１．５分の一定期間のイベントを取得した。すべての刺激条件の移動アッセイを、２つのウェルで行った。値は、移行されたセルの総数として示される。
【0348】
差次的遺伝子発現分析
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製Hilden, Germany）を用いて、未処理ならびにＰＲＰ－ＨＥ８処理、ＰＲＰ－ＨＯ７処理およびＰＲＰ６－ＨＯ７処理したｉＤＣ／Ｍ０マクロファージからのトータルＲＮＡを抽出した。高容量ｃＤＮＡアーカイブキット（Applied BioSystems社製, Carlsbad, CA）を用いて逆転写を行った。選択された遺伝子転写物は、リストに記載された（inventoried）対応するＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ BioSystems社製）を用いたＲＴ－ｑＰＣＲによって個々のサンプルで分析された。定量化は、ΔΔＣｔ法によって行われた。ｍＲＮＡ存在量の相対的な倍率変化は、内因性参照転写物としてＰＰＩＡを用いた式２－ΔΔＣｔを用いて計算した。
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製Hilden, Germany）を用いて、未処理ならびにＰＲＰ－ＨＥ８処理、ＰＲＰ－ＨＯ７処理およびＰＲＰ６－ＨＯ７処理したｉＤＣ／Ｍ０マクロファージからのトータルＲＮＡを抽出した。高容量ｃＤＮＡアーカイブキット（Applied BioSystems社製, Carlsbad, CA）を用いて逆転写を行った。選択された遺伝子転写物は、リストに記載された（inventoried）対応するＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ BioSystems社製）を用いたＲＴ－ｑＰＣＲによって個々のサンプルで分析された。定量化は、ΔΔＣｔ法によって行われた。ｍＲＮＡ存在量の相対的な倍率変化は、内因性参照転写物としてＰＰＩＡを用いた式２－ΔΔＣｔを用いて計算した。
【0349】
ＤＣサイトカイン分泌
ヒトのＩＬ－１２ｐ７０およびＴＮＦ－αの濃度は、Ｃ４ＢＰアイソフォームまたはＰＲＰベースタンパク質で処理されたＤＣ上清から、それぞれのＤｕｏＳｅｔ Ｅｌｉｓａキット（R&D Systems社製, Minneapolis, MN, USA）を製造元の指示に従って用いて決定された。
ヒトのＩＬ－１２ｐ７０およびＴＮＦ－αの濃度は、Ｃ４ＢＰアイソフォームまたはＰＲＰベースタンパク質で処理されたＤＣ上清から、それぞれのＤｕｏＳｅｔ Ｅｌｉｓａキット（R&D Systems社製, Minneapolis, MN, USA）を製造元の指示に従って用いて決定された。
【0350】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析
ＰＲＰベースタンパク質は、還元条件下および非還元条件下で１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離された。ゲルをＢｌｕｅ Ｓａｆｅ（NZYTech社製, Lisboa, Portugal）に１５分間浸し、水で脱色した。
ＰＲＰベースタンパク質は、還元条件下および非還元条件下で１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離された。ゲルをＢｌｕｅ Ｓａｆｅ（NZYTech社製, Lisboa, Portugal）に１５分間浸し、水で脱色した。
【0351】
ウエスタンブロット分析では、ＰＲＰベースのタンパク質を４～１２％勾配のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ４～１２％ Ｍｉｎｉ Ｇｅｌｓ、Invitrogen社製）で還元条件下および非還元条件下で分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。ブロッキング後、メンブレンを一次抗体でプローブした：１：２０００希釈したポリクローナルＰＫ９００８ウサギ抗Ｃ４ＢＰ（Ａｎｎａ Ｂｌｏｍから譲受）、および１：４０００希釈した６×Ｈｉｓモノクローナル抗体（Clontech社製, Mountain View, CA, USA）、次いで１：２０００希釈したポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧＨＲＰ（Ｐ０４４８、Dako社製, Agilent, Santa Clara, CA, USA）および１：２０００希釈したポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（P0447, Dako社製, Agilent, Santa Clara, CA, USA）をそれぞれ添加した。検出は、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｅｒ（Bio-Rad社製, Hercules, CA, USA）を用いて、強化化学発光（ＥＣＬ）（Pierce社製, ThermoFischer, Carlsbad, CA, USA）により行われた。
【0352】
Ｃ４ｂ補因子活性アッセイ
補体Ｃ４ｂ（８．９μｇ／ｍｌ）および第Ｉ因子（４．４μｇ／ｍｌ）（Merck社製, Darmstadt, Germany）を、総量６０μｌの低塩緩衝液（ｐＨ７．４および２５ｍＭ ＮａＣｌの２５ｍＭリン酸緩衝液）中のＣ４ＢＰアイソフォーム（０．６ｎＭまたは６ｎＭ）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。還元ＳＤＳサンプルバッファーを添加し、Ｃ４ｂ断片を４～１２％勾配のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ４～１２％Ｍｉｎｉ Ｇｅｌｓ, Invitrogen, ThermoFischer, Carlsbad, CA, USA）で分離し、１：２０００希釈した抗ヒトＣ４ｄ ＭｏＡｂ（Quidel社製, San Diego, CA, USA）、およびそれに続く１：２０００希釈したポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（Dako社製, Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いて、０．０５％のＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ、１％のＢＳＡ、０．０２の％ＮａＮ３中でＣ４ｂ断片のウエスタンブロット分析を行った。
補体Ｃ４ｂ（８．９μｇ／ｍｌ）および第Ｉ因子（４．４μｇ／ｍｌ）（Merck社製, Darmstadt, Germany）を、総量６０μｌの低塩緩衝液（ｐＨ７．４および２５ｍＭ ＮａＣｌの２５ｍＭリン酸緩衝液）中のＣ４ＢＰアイソフォーム（０．６ｎＭまたは６ｎＭ）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。還元ＳＤＳサンプルバッファーを添加し、Ｃ４ｂ断片を４～１２％勾配のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ４～１２％Ｍｉｎｉ Ｇｅｌｓ, Invitrogen, ThermoFischer, Carlsbad, CA, USA）で分離し、１：２０００希釈した抗ヒトＣ４ｄ ＭｏＡｂ（Quidel社製, San Diego, CA, USA）、およびそれに続く１：２０００希釈したポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（Dako社製, Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いて、０．０５％のＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ、１％のＢＳＡ、０．０２の％ＮａＮ３中でＣ４ｂ断片のウエスタンブロット分析を行った。
【0353】
サイトカインアレイ
未処理、ＰＲＰ－ＨＯ７処理およびＰＲＰ６－ＨＯ７処理したＭ１マクロファージ（１００μｌの細胞上清）の代表的なサンプルを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｒｒａｙ「Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙ Ｐａｎｅｌ Ａ」キット（R&D Systems社製）を用いて、製造元の指示に従って分析し、３６種のサイトカイン、ケモカインおよび急性期タンパク質の相対レベルを決定した。各ドットの密度はＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（登録商標）ソフトウェアで定量化され、関連する各サイトカインと治療の正規化された平均ピクセル密度として表示された。
未処理、ＰＲＰ－ＨＯ７処理およびＰＲＰ６－ＨＯ７処理したＭ１マクロファージ（１００μｌの細胞上清）の代表的なサンプルを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｒｒａｙ「Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙ Ｐａｎｅｌ Ａ」キット（R&D Systems社製）を用いて、製造元の指示に従って分析し、３６種のサイトカイン、ケモカインおよび急性期タンパク質の相対レベルを決定した。各ドットの密度はＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（登録商標）ソフトウェアで定量化され、関連する各サイトカインと治療の正規化された平均ピクセル密度として表示された。
【0354】
統計分析
統計分析および科学的グラフ化は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（GraphPad software, Inc製, La Jolla, CA）を用いて行った。Ｄｕｎｎｅｔｔ法を用いて複数の比較のために修正された反復測定一元配置分散分析を行って、参照条件に対して異なる実験条件下でＭＦＩと細胞数のデータを対比した。サイトカインレベルを比較するために、対応のあるｔ検定を行った。処理された細胞と処理されていない細胞との間の相対的な遺伝子発現レベルは、１サンプルのｔ検定を用いて分析された。Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ法を用いて多重比較を補正した二元配置分散分析を適用して、時間経過実験を評価した。データは平均値＋ＳＤとして表される。すべての場合において、Ｐ値＜０．０５が有意であると見なされる。
統計分析および科学的グラフ化は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（GraphPad software, Inc製, La Jolla, CA）を用いて行った。Ｄｕｎｎｅｔｔ法を用いて複数の比較のために修正された反復測定一元配置分散分析を行って、参照条件に対して異なる実験条件下でＭＦＩと細胞数のデータを対比した。サイトカインレベルを比較するために、対応のあるｔ検定を行った。処理された細胞と処理されていない細胞との間の相対的な遺伝子発現レベルは、１サンプルのｔ検定を用いて分析された。Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ法を用いて多重比較を補正した二元配置分散分析を適用して、時間経過実験を評価した。データは平均値＋ＳＤとして表される。すべての場合において、Ｐ値＜０．０５が有意であると見なされる。
【0355】
実施例１：ＰＲＰ６－ＨＯ７の物理化学的特徴
ＰＲＰ６－ＨＯ７は、生理学的タンパク質ＰＲＰ－ＨＯ７に由来し、可溶性補体調節因子であるヒトＣ４ＢＰのマイナーアイソフォームであり、ＰＲＰ－ＨＯ７と同様の空間配置でα鎖のＣＣＰ６ドメインをオリゴマー化ドメインと結合する（図１および２）。これにより、この新規組換えタンパク質のサイズが小さくなり（Ｃ末端でＣ４ＢＰオリゴマー化ドメインに結合し、抗体よりも小さい放射状のクモ状のホモオリゴマーを形成する７個のＣＣＰ６ドメイン鎖で構成される１００ｋＤａのコンパクトな対称ユニット）、体液中の抗体と類似またはさらに優れた安定性（血漿半減期の延長）がもたらされ；かつＩｇＭタイプおよびＩｇＡタイプの抗体と同様に、免疫調節シグナル伝達のための特定の受容体のナノクラスタリングと関係すると考えられている、低ナノモル範囲（データは示していない）のＫｄを有する潜在的な表面受容体との協調的で高親和性の相互作用が可能となる。Ｃ末端のオリゴマー化足場は、分子間ジスルフィド結合と、複合体の並外れた熱力学的安定性に寄与する静電相互作用の層によって安定化される（Hofmeyer et al. (2013) J. Mol. Biol. 425: 1302-1317）。さらに、ＰＲＰ６－ＨＯ７は、その前駆体であるＰＲＰ－ＨＯ７とは異なり、グリコシル化されていないため、真核細胞（以下に示す）から酵母または細菌細胞（データは示していない）に至るまで、様々な発現系での産生とさらなる精製が可能である。
ＰＲＰ６－ＨＯ７は、生理学的タンパク質ＰＲＰ－ＨＯ７に由来し、可溶性補体調節因子であるヒトＣ４ＢＰのマイナーアイソフォームであり、ＰＲＰ－ＨＯ７と同様の空間配置でα鎖のＣＣＰ６ドメインをオリゴマー化ドメインと結合する（図１および２）。これにより、この新規組換えタンパク質のサイズが小さくなり（Ｃ末端でＣ４ＢＰオリゴマー化ドメインに結合し、抗体よりも小さい放射状のクモ状のホモオリゴマーを形成する７個のＣＣＰ６ドメイン鎖で構成される１００ｋＤａのコンパクトな対称ユニット）、体液中の抗体と類似またはさらに優れた安定性（血漿半減期の延長）がもたらされ；かつＩｇＭタイプおよびＩｇＡタイプの抗体と同様に、免疫調節シグナル伝達のための特定の受容体のナノクラスタリングと関係すると考えられている、低ナノモル範囲（データは示していない）のＫｄを有する潜在的な表面受容体との協調的で高親和性の相互作用が可能となる。Ｃ末端のオリゴマー化足場は、分子間ジスルフィド結合と、複合体の並外れた熱力学的安定性に寄与する静電相互作用の層によって安定化される（Hofmeyer et al. (2013) J. Mol. Biol. 425: 1302-1317）。さらに、ＰＲＰ６－ＨＯ７は、その前駆体であるＰＲＰ－ＨＯ７とは異なり、グリコシル化されていないため、真核細胞（以下に示す）から酵母または細菌細胞（データは示していない）に至るまで、様々な発現系での産生とさらなる精製が可能である。
【0356】
最後に、ＣＣＰ６ドメインのみを含む単純化された構造のため、ＰＲＰ－ＨＯ７と比較して、ＰＲＰ６－ＨＯ７の投与によっては感染感受性が増加しない。ＰＲＰ－ＨＯ７α鎖は様々な細菌性病原体の表面タンパク質に結合し（Blom et al. (2004) Mol. Immunol. 40: 1333-1346）、宿主の補体調節因子を乗っ取り、その後補体活性化を下方調節する。したがって、ＰＲＰ－ＨＯ７が、細菌の病原性因子として、（主にＣＣＰ１～ＣＣＰ４を介して）病原体に結合する（Blom et al. (2004) Mol. Immunol. 40: 1333-1346）、および（ＣＣＰ８を介して）プラスミノーゲンに結合する（Agarwal et al. (2015) J. Biol. Chem. 290: 18333-18342）という事実の本質的側面は、自己免疫疾患の免疫調節剤として補体阻害剤を用いることを計画している間、それを考慮しなければならないということにある。
【0357】
この点に関して、また、Ｃ４ＢＰのＣＣＰ６ドメインをモノマーとして単独で、または逆に、その生理学的起源に類似した７量体のオリゴマー化形態で、ＰＲＰ－ＨＯ７に起因する抗炎症および免疫調節活性を維持するかどうかを評価（Olivar et al. (2013) J. Immunol. 190: 2857-2872）するために、ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＮＯがＨＥＫ２９３細胞で産生され、その上清から精製された（図３）。予想された通り、ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色とウエスタンブロット分析との両方で示されるように、ＰＲＰ６－ＨＯ７は、１４．３ｋＤａの７個のモノマー鎖からなる１００ｋＤａのホモオリゴマー構造に折りたたまれており、Ｃ４ＢＰのＣＣＰ６ドメインおよびＣ末端オリゴマー化ドメインを含んでいた。一方、ＰＲＰ６－ＮＯは、非還元条件下ではオリゴマー化できず、２つの必須フォールディングＣｙｓ残基（Ｃ４９８Ａ／Ｃ５１０Ａ）の置換と、Ｃ４ＢＰオリゴマー化ドメインのＣ末端からの１３個のＣ末端アミノ酸の切断により、１２．７ｋＤａの単一モノマーとして残存した（Kask et al. (2002) Biochemistry 41: 9349-9357）。
【0358】
実施例２：ＰＲＰ６－ＨＯ７はＤＣの活性化表現型を下方調節する
ＰＲＰ－ＨＥ８およびＰＲＰ６－ＮＯはどちらも、ＬＰＳ成熟ＤＣにおけるＤＣ活性化マーカーＣＤ８３およびＤＣ共刺激分子ＣＤ８６の発現に影響を与えなかった。逆に、ＰＲＰ－ＨＯ７と同様に、ＰＲＰ６－ＨＯ７はこれらのマーカーを大幅に下方調節した（図４）。
ＰＲＰ－ＨＥ８およびＰＲＰ６－ＮＯはどちらも、ＬＰＳ成熟ＤＣにおけるＤＣ活性化マーカーＣＤ８３およびＤＣ共刺激分子ＣＤ８６の発現に影響を与えなかった。逆に、ＰＲＰ－ＨＯ７と同様に、ＰＲＰ６－ＨＯ７はこれらのマーカーを大幅に下方調節した（図４）。
【0359】
一方で、ＤＣの抗原内在化能力が、両方の自己消光ＤＱ－ＯＶＡ（マンノース受容体媒介エンドサイトーシスマーカー）のフローサイトメトリーによって評価された。したがって、ｉＤＣのエンドサイトーシス活性は、ＰＲＰ－ＨＯ７またはＰＲＰ６－ＨＯ７のいずれかで処理することによって有意に増加したが（図５）、単量体のＰＲＰ６－ＮＯによっても、不活性分子ＰＲＰ－ＨＥ８によっても増加しなかった。
【0360】
次いで、本発明者らは、ＤＣ表現型に対する異なるＰＲＰタンパク質の効果が、サイトカイン（ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１２ｐ７０）のそれらの放出の変化を伴うかどうかを評価した。未処理のｉＤＣと比較して、炎症性サイトカインのそれぞれの分泌は、ｉＤＣがＬＰＳで成熟した時に上方調節された。ＰＲＰ－ＨＥ８およびＰＲＰ６－ＮＯの両方で前処理されたＤＣは、成熟時に未処理のＤＣと同じレベルのサイトカインを分泌した。対照的に、ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７の両方で前処理すると、ＩＬ－１２ｐ７０の放出が阻害され、ＴＮＦ－αの放出が有意に減少した（図６）。したがって、ＬＰＳ媒介ＤＣ刺激によるＴｈ１炎症誘発性サイトカインの産生は、ＰＲＰ６－ＨＯ７で処理したＤＣによって有意に減少した。
【0361】
異なるＰＲＰ分子で処理されたＤＣは、アネキシンＶ／７－ＡＤＤ染色によって評価されるように、分化／成熟プロセス全体を通じて高い生存率を維持し、ＬＰＳ媒介ＤＣ成熟の４８時間後に１０％未満のアポトーシス細胞の証明された（データは示していない）。
【0362】
まとめると、これらのデータは、単量体のＰＲＰ６－ＮＯではなくオリゴマーのＰＲＰ６－ＨＯ７が、抗炎症性および寛容原性の表現型に向けて炎症誘発性ＤＣの分化／成熟を改変する可能性があることを示す証拠である。
【0363】
実施例３：ＰＲＰ６－ＨＯ７は補体阻害活性を欠く
Ｃ４ＢＰの主要な調節機能の１つは、セリンプロテアーゼ第Ｉ因子がＣ４ｂを不活性化するための補因子として機能することであり、これは補因子活性とも呼ばれる。ＰＲＰ６－ＨＯ７が、ＰＲＰ－ＨＯ７α鎖のＣＣＰ１～ＣＰＰ３ドメインに割り当てられる補体阻害活性を効果的に欠いていることを確認するために、本発明者らは、溶液中でのＣ４ｂの第Ｉ因子媒介性切断に対するその寄与を評価する比較Ｃ４ＢＰ補因子活性アッセイを行った。したがって、ＰＲＰ６－ＨＯ７ではなく、ＰＲＰ－ＨＥ８およびＰＲＰ－ＨＯ７の両方が、テストされた濃度のいずれにおいてもＣ４ｂのα’鎖の第Ｉ因子切断を促進し、７０ｋＤａの部分切断断片であるα３－Ｃ４ｄおよび小さな断片Ｃ４ｄ（４５ｋＤａ）を生成した。（図７）。
Ｃ４ＢＰの主要な調節機能の１つは、セリンプロテアーゼ第Ｉ因子がＣ４ｂを不活性化するための補因子として機能することであり、これは補因子活性とも呼ばれる。ＰＲＰ６－ＨＯ７が、ＰＲＰ－ＨＯ７α鎖のＣＣＰ１～ＣＰＰ３ドメインに割り当てられる補体阻害活性を効果的に欠いていることを確認するために、本発明者らは、溶液中でのＣ４ｂの第Ｉ因子媒介性切断に対するその寄与を評価する比較Ｃ４ＢＰ補因子活性アッセイを行った。したがって、ＰＲＰ６－ＨＯ７ではなく、ＰＲＰ－ＨＥ８およびＰＲＰ－ＨＯ７の両方が、テストされた濃度のいずれにおいてもＣ４ｂのα’鎖の第Ｉ因子切断を促進し、７０ｋＤａの部分切断断片であるα３－Ｃ４ｄおよび小さな断片Ｃ４ｄ（４５ｋＤａ）を生成した。（図７）。
【0364】
実施例４：ＰＲＰ６－ＨＯ７はＤＣにおける表面活性化マーカーの発現に影響を与える
本発明者らは、ＰＲＰ６－ＨＯ７が、ＣＤ１４、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６を含む、異なる単球およびＤＣ表面マーカーの発現に影響を与えることができるかどうかを評価した。ＰＲＰ－ＨＥ８はＬＰＳ成熟ＤＣにおいて上記マーカーの発現に影響を与えなかったのに対し、ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７はいずれも、上述のようにＣＤ８３およびＣＤ８６だけでなく、共刺激分子であるＣＤ８０およびＣＤ４０も有意に下方調節した。。逆に、ＤＣにおけるＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ１４の発現は、ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７の両方の処理によって有意に変化しなかった（図８）。
本発明者らは、ＰＲＰ６－ＨＯ７が、ＣＤ１４、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６を含む、異なる単球およびＤＣ表面マーカーの発現に影響を与えることができるかどうかを評価した。ＰＲＰ－ＨＥ８はＬＰＳ成熟ＤＣにおいて上記マーカーの発現に影響を与えなかったのに対し、ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７はいずれも、上述のようにＣＤ８３およびＣＤ８６だけでなく、共刺激分子であるＣＤ８０およびＣＤ４０も有意に下方調節した。。逆に、ＤＣにおけるＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ１４の発現は、ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７の両方の処理によって有意に変化しなかった（図８）。
【0365】
これらのデータは、ＰＲＰ６－ＨＯ７が、様々な細胞表面マーカーの発現パターンによって判断されるように、炎症誘発性ＤＣの分化／成熟を改変する可能性があることを裏付けるものである。対照的に、５～７日目（成熟）までインキュベートしたＰＲＰ６－ＨＯ７単独もＰＲＰ６－ＨＯ７およびＬＰＳも、ＤＣ表面マーカーの発現に影響を与えなかった、すなわちＤＣが分化していた（データは示していない）。
【0366】
実施例５：ヒト血清はＰＲＰ６－ＨＯ７の免疫調節活性を阻害しない
より複雑な環境におけるＰＲＰ６－ＨＯ７の挙動を推測するために、本発明者らは、５０％ヒト血清の存在下で分化およびＬＰＳ成熟したＤＣにおけるＣＤ８３およびＣＤ８６表面マーカー発現を分析した。ＰＲＰ－ＨＯ７と同様に、ＰＲＰ６－ＨＯ７は、用量依存的に上記のマーカーを有意に下方調節することができた（図９）。したがって、ほぼ生理学的な条件下で、ＰＲＰ６－ＨＯ７は、免疫調節に関して、その生理学的対応物であるＰＲＰ－ＨＯ７と少なくとも同じくらい活性であった。
より複雑な環境におけるＰＲＰ６－ＨＯ７の挙動を推測するために、本発明者らは、５０％ヒト血清の存在下で分化およびＬＰＳ成熟したＤＣにおけるＣＤ８３およびＣＤ８６表面マーカー発現を分析した。ＰＲＰ－ＨＯ７と同様に、ＰＲＰ６－ＨＯ７は、用量依存的に上記のマーカーを有意に下方調節することができた（図９）。したがって、ほぼ生理学的な条件下で、ＰＲＰ６－ＨＯ７は、免疫調節に関して、その生理学的対応物であるＰＲＰ－ＨＯ７と少なくとも同じくらい活性であった。
【0367】
実施例６：ＰＲＰ６－ＨＯ７は正常な個体およびループス腎炎患者の両方のＤＣにおけるＴＬＲの発現を調節する
ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７の両方で処理されたＤＣがＧａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ（ＴＬＲ７アナログ）曝露によって成熟した場合、ＤＣＴＬＲ４リガンドＬＰＳとインキュベートしたＤＣでの類似の細胞表面マーカーの挙動（例えば、有意なＣＤ８３およびＣＤ８６の下方調節）が観察された（図１０）。ＴＬＲ７は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の疾患の加速に重要な役割を果たす。重要なことに、ループス腎炎の発赤を経験しているＳＬＥ患者から分離されたＤＣを用いても同じ傾向が認識されたが、一部のＤＣマーカーでは、利用可能なサンプル数が限られているため、統計的有意性を達成できなかった（図１１）。まとめると、これらのデータから、ＰＲＰ６－ＨＯ７が正常な個体と活性疾患のＳＬＥ患者との両方におけるＴＬＲ４およびＴＬＲ７の発現を積極的に調節していることが示唆される。
ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７の両方で処理されたＤＣがＧａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ（ＴＬＲ７アナログ）曝露によって成熟した場合、ＤＣＴＬＲ４リガンドＬＰＳとインキュベートしたＤＣでの類似の細胞表面マーカーの挙動（例えば、有意なＣＤ８３およびＣＤ８６の下方調節）が観察された（図１０）。ＴＬＲ７は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の疾患の加速に重要な役割を果たす。重要なことに、ループス腎炎の発赤を経験しているＳＬＥ患者から分離されたＤＣを用いても同じ傾向が認識されたが、一部のＤＣマーカーでは、利用可能なサンプル数が限られているため、統計的有意性を達成できなかった（図１１）。まとめると、これらのデータから、ＰＲＰ６－ＨＯ７が正常な個体と活性疾患のＳＬＥ患者との両方におけるＴＬＲ４およびＴＬＲ７の発現を積極的に調節していることが示唆される。
【0368】
実施例７：ＰＲＰ６－ＨＯ７はＤＣの走化性を変化させる
成熟シグナルは、リンパ節指向ケモカインへの移動等の、別個のＤＣ機能の発現を決定する。ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７の両方による治療は、ケモカイン受容体ＣＣＲ７の発現を下方調節した。次いで、表面ＣＣＲ７の発現が減少すると、ＬＰＳで成熟したＤＣのケモカインＣＣＬ２１への移動が大幅に減少した（図１２）。対照的に、未処理およびＰＲＰ－ＨＥ８で処理されたＤＣの両方のＬＰＳ成熟により、ＣＣＬ２１に応答して最大の移動が誘発された。
成熟シグナルは、リンパ節指向ケモカインへの移動等の、別個のＤＣ機能の発現を決定する。ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７の両方による治療は、ケモカイン受容体ＣＣＲ７の発現を下方調節した。次いで、表面ＣＣＲ７の発現が減少すると、ＬＰＳで成熟したＤＣのケモカインＣＣＬ２１への移動が大幅に減少した（図１２）。対照的に、未処理およびＰＲＰ－ＨＥ８で処理されたＤＣの両方のＬＰＳ成熟により、ＣＣＬ２１に応答して最大の移動が誘発された。
【0369】
実施例８：ＰＲＰ６－ＨＯ７に曝露されたＤＣは転写レベルでの「ｆｉｎｄ ｍｅ」受容体を上方調節し、ＰＴＧＥＲ３およびＥＧＬＮ３を下方調節する
炎症性単球由来ｉＤＣの分子シグネチャーに一致するいくつかの重要な転写物に対するＰＲＰ６－ＨＯ７の効果をさらに評価するために、本発明者らは、急性炎症の重要なメディエーターであるＰＧＥ２受容体（ＥＰ３；ＰＴＧＥＲ３）をコードする遺伝子（Kawahara et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta 1851: 414-421）；およびプロリルヒドロキシラーゼ３（ＥＧＬＮ３；ＰＨＤ３）の発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。最近、骨髄細胞におけるＰＨＤ３の喪失が炎症反応を弱めることが示された（Beneke et al. (2017) Cell Death Dis. 8: e2976）。したがって、ＰＴＧＥＲ３およびＥＧＬＮ３の両方の転写産物は、ＰＲＰ６－ＨＯ７によって優先的に下方調節された（図１３）。対照的に、ｉＤＣのすべての既知の「ｆｉｎｄ ｍｅ」受容体の転写プロファイリングは、ＰＲＰ６－ＨＯ７ではなくＰＲＰ６－ＨＯ７による処理下でのＦＰＲ２、Ｐ２ＲＹ２およびＳ１ＰＲ１の有意な上方調節を明らかにし、それによりＰＲＰ６－ＨＯ７で処理されたＤＣからの耐性応答を媒介するエフェロサイトーシス能力の増大が示唆された（Kolb et al. (2017) Trends Immunol. 38: 705-718）（図１４）。
炎症性単球由来ｉＤＣの分子シグネチャーに一致するいくつかの重要な転写物に対するＰＲＰ６－ＨＯ７の効果をさらに評価するために、本発明者らは、急性炎症の重要なメディエーターであるＰＧＥ２受容体（ＥＰ３；ＰＴＧＥＲ３）をコードする遺伝子（Kawahara et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta 1851: 414-421）；およびプロリルヒドロキシラーゼ３（ＥＧＬＮ３；ＰＨＤ３）の発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。最近、骨髄細胞におけるＰＨＤ３の喪失が炎症反応を弱めることが示された（Beneke et al. (2017) Cell Death Dis. 8: e2976）。したがって、ＰＴＧＥＲ３およびＥＧＬＮ３の両方の転写産物は、ＰＲＰ６－ＨＯ７によって優先的に下方調節された（図１３）。対照的に、ｉＤＣのすべての既知の「ｆｉｎｄ ｍｅ」受容体の転写プロファイリングは、ＰＲＰ６－ＨＯ７ではなくＰＲＰ６－ＨＯ７による処理下でのＦＰＲ２、Ｐ２ＲＹ２およびＳ１ＰＲ１の有意な上方調節を明らかにし、それによりＰＲＰ６－ＨＯ７で処理されたＤＣからの耐性応答を媒介するエフェロサイトーシス能力の増大が示唆された（Kolb et al. (2017) Trends Immunol. 38: 705-718）（図１４）。
【0370】
実施例９：ＰＲＰ６－ＨＯ７は単球由来マクロファージの分極表現型を下方調節する
マクロファージは広く分布している先天性免疫細胞であり、侵入する病原体に対する宿主の防御、ならびに免疫恒常性の維持、炎症への寄与、創傷治癒および組織修復の促進に中心的な役割を果たす。これらは、局所的な微小環境からのシグナルの影響下で成熟する動的細胞である。
マクロファージは広く分布している先天性免疫細胞であり、侵入する病原体に対する宿主の防御、ならびに免疫恒常性の維持、炎症への寄与、創傷治癒および組織修復の促進に中心的な役割を果たす。これらは、局所的な微小環境からのシグナルの影響下で成熟する動的細胞である。
【0371】
本発明者らは、ヒト末梢血単球を分化していないマクロファージ（Ｍ０）に分化させ、次いで、それらをＬＰＳおよびＩＦＮ－γを用いてＭ１（古典的活性化マクロファージ）に、そしてＩＬ－４を用いてＭ２（代替活性化マクロファージ）に極性化した。Ｍ１およびＭ２マクロファージは、フローサイトメトリーによってそれぞれＣＤ８０＋ＣＤ６４＋およびＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０９＋として識別される。ＰＲＰ－ＨＯ７、特にＰＲＰ６－ＨＯ７のプレインキュベーションによって、Ｍ１（ＣＤ８０およびＣＤ６４）およびＭ２（ＣＤ１１ｂおよびＣＤ２０９）の両方の分極マーカーの発現を有意に下方調節することができた（図１５）。したがって、マクロファージの未分化様の表現型の維持をもたらす、Ｍ１またはＭ２表現型に対するマクロファージの極性化／活性化の阻害は、ＰＲＰ６－ＨＯ７の免疫調節活性によって引き起こされ、またＰＲＰ－ＨＯ７免疫調節活性によってはほとんど引き起こされず、ＰＲＰ－ＨＥ８免疫調節活性によっては引き起こされなかった。
【0372】
実施例１０：ＰＲＰ６－ＨＯ７はＭ０非分化マクロファージにおける「ｆｉｎｄ ｍｅ」受容体を上方調節し、ＡＬＣＡＭ、ＳＬＣ１６Ａ１およびＬＭＮＢ１の発現を下方調節する
ＤＣの場合と同様に、Ｍ０に向けて分化する単球由来マクロファージの分子シグネチャーに一致するいくつかの重要な転写産物に対するＰＲＰ６－ＨＯ７の影響を調べるために、本発明者らは、活性化単球において上方調節される活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ；ＣＤ１６６）（Levesque et al. (1998) Arthritis Rheum. 41: 2221-2229）；オートファジーによって誘導される乳酸トランスポーターであるＳＬＣ１６Ａ１（Bao et al. (2017) Theriogenology 87: 339-348）；および核オートファジータンパク質ＬＣ３と相互作用する核ラミナの重要な成分であるＬＭＮＢ１（Dou et al. (2015) Nature 527: 105-109）をそれぞれコードする遺伝子の発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって順次分析を行う経時的アッセイを行った。これらの３つの転写産物は、主にＰＲＰ６－ＨＯ７の作用により、単球からマクロファージへの分化プロセスを通じて有意に下方調節されていることが分かった（図１６）。したがって、ＳＬＣ１６Ａ１およびＬＭＮＢ１の両方の下方調節によって、ＰＲＰ６－ＨＯ７によって媒介されるオートファジーが阻害されることが示唆される。対照的に、Ｍ０マクロファージにおけるすべての既知の「ｆｉｎｄ ｍｅ」受容体または嗅覚受容体の転写プロファイリングは、ＰＲＰ６－ＨＯ７処理下でＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＦＰＲ２およびＰ２ＲＹ２を有意に上方調節するが、ＰＲＰ－ＨＯ７またはＰＲＰ－ＨＥ８処理ではしないことが明らかにされた（図１７）。最近の研究では、オートファジーおよび食作用をもたらす経路間の別の相互作用が明らかにされた。ＡＴＧ７欠損マクロファージは、ｐ６２の蓄積により、クラスＡスカベンジャー受容体のレベルが上昇していることが分かった（Cadwell and Philips (2013) Immunity 39: 425-427）。これらの受容体の上方調節は、食作用の取り込み率の増大および細菌の取り込みの増大をもたらし、オートファジーの喪失が食作用を増大する可能性があることを明らかにした（Bonilla et al. (2013) Immunity 39: 537-547）。
ＤＣの場合と同様に、Ｍ０に向けて分化する単球由来マクロファージの分子シグネチャーに一致するいくつかの重要な転写産物に対するＰＲＰ６－ＨＯ７の影響を調べるために、本発明者らは、活性化単球において上方調節される活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ；ＣＤ１６６）（Levesque et al. (1998) Arthritis Rheum. 41: 2221-2229）；オートファジーによって誘導される乳酸トランスポーターであるＳＬＣ１６Ａ１（Bao et al. (2017) Theriogenology 87: 339-348）；および核オートファジータンパク質ＬＣ３と相互作用する核ラミナの重要な成分であるＬＭＮＢ１（Dou et al. (2015) Nature 527: 105-109）をそれぞれコードする遺伝子の発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって順次分析を行う経時的アッセイを行った。これらの３つの転写産物は、主にＰＲＰ６－ＨＯ７の作用により、単球からマクロファージへの分化プロセスを通じて有意に下方調節されていることが分かった（図１６）。したがって、ＳＬＣ１６Ａ１およびＬＭＮＢ１の両方の下方調節によって、ＰＲＰ６－ＨＯ７によって媒介されるオートファジーが阻害されることが示唆される。対照的に、Ｍ０マクロファージにおけるすべての既知の「ｆｉｎｄ ｍｅ」受容体または嗅覚受容体の転写プロファイリングは、ＰＲＰ６－ＨＯ７処理下でＣＣＲ２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＦＰＲ２およびＰ２ＲＹ２を有意に上方調節するが、ＰＲＰ－ＨＯ７またはＰＲＰ－ＨＥ８処理ではしないことが明らかにされた（図１７）。最近の研究では、オートファジーおよび食作用をもたらす経路間の別の相互作用が明らかにされた。ＡＴＧ７欠損マクロファージは、ｐ６２の蓄積により、クラスＡスカベンジャー受容体のレベルが上昇していることが分かった（Cadwell and Philips (2013) Immunity 39: 425-427）。これらの受容体の上方調節は、食作用の取り込み率の増大および細菌の取り込みの増大をもたらし、オートファジーの喪失が食作用を増大する可能性があることを明らかにした（Bonilla et al. (2013) Immunity 39: 537-547）。
【0373】
実施例１１：ＰＲＰ６－ＨＯ７はＭ１炎症性マクロファージのサイトカインシグネチャーを調節する
最後に、本発明者らは、Ｍ０からＭ１へのマクロファージ分極時の細胞上清におけるサイトカインの誘導、およびＭ１マクロファージによって放出される炎症性サイトカインのプロファイルに対するＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７処理の結果を調べた。注目すべきことに、３６種のサイトカイン、ケモカインおよび急性期タンパク質を含むサイトカインアレイによって、未処理のＭ１細胞に関してＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７の作用を介してＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＭＩＰ－１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αの異なる下方調節が示された。さらに、ＣＣＬ１およびＭＩＰ－１は、ＰＲＰ６－ＨＯ７の存在下でより強い下方調節を示した（図１８）。したがって、Ｍ１マクロファージの極性化時のこれらの炎症性ケモカインの上方調節（Sokol and Luster (2015) Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7: a016303）は、ＰＲＰ６－ＨＯ７処理によって阻害されるが、ＰＲＰ－ＨＯ７処理によってはほとんど阻害されない。
最後に、本発明者らは、Ｍ０からＭ１へのマクロファージ分極時の細胞上清におけるサイトカインの誘導、およびＭ１マクロファージによって放出される炎症性サイトカインのプロファイルに対するＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７処理の結果を調べた。注目すべきことに、３６種のサイトカイン、ケモカインおよび急性期タンパク質を含むサイトカインアレイによって、未処理のＭ１細胞に関してＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７の作用を介してＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＭＩＰ－１、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αの異なる下方調節が示された。さらに、ＣＣＬ１およびＭＩＰ－１は、ＰＲＰ６－ＨＯ７の存在下でより強い下方調節を示した（図１８）。したがって、Ｍ１マクロファージの極性化時のこれらの炎症性ケモカインの上方調節（Sokol and Luster (2015) Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7: a016303）は、ＰＲＰ６－ＨＯ７処理によって阻害されるが、ＰＲＰ－ＨＯ７処理によってはほとんど阻害されない。
【0374】
実施例１２：ＰＲＰ６－ＨＯ７の酵母精製
ＰＲＰ６－ＨＯ７の対応するＤＮＡ配列は、P. pastorisに対してコドン最適化された。合成遺伝子は、ＢｓａＩクローニングサイトを用いて、ｐＢＧＺαベクター（Bioingenium, Barcelona Science Park, Baldiri Reixac, 15-21 (Helix building) 08028 Barcelona）にクローニングされた。発現ベクターｐＢＧＺαには、ＧＡＰプロモーターおよびＡＯＸ転写ターミネーターが含まれていた。さらに、クローン選択用のゼオシン耐性カセットをコード化し、必要に応じて将来の耐性表現型復帰のためにｌｏｘＰ部位に隣接させた。さらに、ベクターは、プラスミド選択および大腸菌における増殖のために、それぞれアンピシリン耐性遺伝子およびｐＵＣ複製起点を有していた。最後に、プロモーターと遺伝子コード配列との間のS. cerevisiaeのα交配因子分泌シグナルにより、分泌経路に向けてタンパク質を発現することを可能とした。
ＰＲＰ６－ＨＯ７の対応するＤＮＡ配列は、P. pastorisに対してコドン最適化された。合成遺伝子は、ＢｓａＩクローニングサイトを用いて、ｐＢＧＺαベクター（Bioingenium, Barcelona Science Park, Baldiri Reixac, 15-21 (Helix building) 08028 Barcelona）にクローニングされた。発現ベクターｐＢＧＺαには、ＧＡＰプロモーターおよびＡＯＸ転写ターミネーターが含まれていた。さらに、クローン選択用のゼオシン耐性カセットをコード化し、必要に応じて将来の耐性表現型復帰のためにｌｏｘＰ部位に隣接させた。さらに、ベクターは、プラスミド選択および大腸菌における増殖のために、それぞれアンピシリン耐性遺伝子およびｐＵＣ複製起点を有していた。最後に、プロモーターと遺伝子コード配列との間のS. cerevisiaeのα交配因子分泌シグナルにより、分泌経路に向けてタンパク質を発現することを可能とした。
【0375】
工業規模での最終的な生産プロセスにおけるメタノールの使用を回避することを目的として、構成的ＧＡＰプロモーターの下で遺伝子発現を制御することが決定された。異種タンパク質を分泌するP. pastorisの能力を利用して、目的の遺伝子をS. cerevisiaeのα－交配因子（配列番号６２）をインフレームでクローン化した。
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＬＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＤＫＲＥＡＥＡ（配列番号６２）
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【0376】
シグナルペプチドを含む組換えポリペプチドの配列は配列番号６３であった。
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＬＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＤＫＲＥＡＥＡＨＨＨＨＨＨＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号６３）
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＬＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＤＫＲＥＡＥＡＨＨＨＨＨＨＬＣＣＰＥＰＫＬＮＮＧＥＩＴＱＨＲＫＳＲＰＡＮＨＣＶＹＦＹＧＤＥＩＳＦＳＣＨＥＴＳＲＦＳＡＩＣＱＧＤＧＴＷＳＰＲＴＰＳＣＧＤＥＴＰＥＧＣＥＱＶＬＴＧＫＲＬＭＱＣＬＰＮＰＥＤＶＫＭＡＬＥＶＹＫＬＳＬＥＩＥＱＬＥＬＱＲＤＳＡＲＱＳＴＬＤＫＥＬ（配列番号６３）
【0377】
次いで、酵母を培養し、ピキア・パストリスからタンパク質を精製した。培養パラメーターは表４に示す通りである。図１９は、可視化された精製タンパク質を示す。
【0378】
【表4】
【0379】
実施例１３：細菌によるＰＲＰ６－ＨＯ７の生産
ＰＲＰ６－ＨＯ７のヌクレオチド配列は、E.coliにおける発現のためにコドン最適化され、ｐＵＣ５７プラスミドにサブクローン化され、発現ベクターｐＥＴ３２ａにクローン化された。配列番号６１の配列はＢＬ－２１（Ｄ３）株で発現された。図２０は、視覚化された精製タンパク質を示す。
ＰＲＰ６－ＨＯ７のヌクレオチド配列は、E.coliにおける発現のためにコドン最適化され、ｐＵＣ５７プラスミドにサブクローン化され、発現ベクターｐＥＴ３２ａにクローン化された。配列番号６１の配列はＢＬ－２１（Ｄ３）株で発現された。図２０は、視覚化された精製タンパク質を示す。
【0380】
実施例１４
古典的に、化学的に誘発されたＤＳＳ大腸炎マウスモデルＣ５７ＢＬ／６Ｊにおいては、大腸炎を誘発するために、分子量３５～５０ｋＤａの２～５％ＤＳＳ（ｗ／ｖ）ポリマーがマウスの飲料水に５～８日間溶解された。９日目以降、動物を屠殺し、様々なパラメーターに基づいて評価を行った。
古典的に、化学的に誘発されたＤＳＳ大腸炎マウスモデルＣ５７ＢＬ／６Ｊにおいては、大腸炎を誘発するために、分子量３５～５０ｋＤａの２～５％ＤＳＳ（ｗ／ｖ）ポリマーがマウスの飲料水に５～８日間溶解された。９日目以降、動物を屠殺し、様々なパラメーターに基づいて評価を行った。
【0381】
評価は、疾患活動性指標（ＤＡＩ）によって行われた。ＤＡＩは、体重減少、直腸出血、便の硬さを定量化するための潰瘍性大腸炎の累積指標である。
【0382】
ＤＳＳマウスにおけるこれらすべての観察結果は、ヒトの炎症性腸疾患にも見られる。
【0383】
材料および方法
動物
体重約２０ｇの８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウス２６匹が、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Sant Cugat del Valles, Barcelona, Spain）から供給された。
動物
体重約２０ｇの８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウス２６匹が、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Sant Cugat del Valles, Barcelona, Spain）から供給された。
【0384】
実験手順の間、動物は耳パンチ(ear punching)によって識別された。
【0385】
環境と管理
到着時に、動物をケージあたり３～４匹のグループに収容した。それらは、１２時間の明暗サイクルで、環境制御された部屋（換気、温度２２±２℃および湿度３５～６５％）に保管された。それらは到着日から手順の開始までの間に５日間の順応期間を経た。この期間中、動物の一般的な健康状態を確認するために動物を観察した。維持低脂肪齧歯動物用飼料を動物に自由に与えた。水道水を自由に供給した。
到着時に、動物をケージあたり３～４匹のグループに収容した。それらは、１２時間の明暗サイクルで、環境制御された部屋（換気、温度２２±２℃および湿度３５～６５％）に保管された。それらは到着日から手順の開始までの間に５日間の順応期間を経た。この期間中、動物の一般的な健康状態を確認するために動物を観察した。維持低脂肪齧歯動物用飼料を動物に自由に与えた。水道水を自由に供給した。
【0386】
動物福祉
動物は、Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (86/609/EU)の７月３０日の政令２１４／１９９７に従って維持された。
動物は、Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (86/609/EU)の７月３０日の政令２１４／１９９７に従って維持された。
【0387】
すべての実験手順は、ＩＤＩＢＥＬＬのEthical Committee on human and animal experimentation (CEEA)（手続番号：１９００３）およびAnimal Experimentation Commission of the Generalitat de Catalunya（カタロニア政府）のＤＡＡＭ：１０５６１によって承認された。
【0388】
試験物質の識別および準備
ＰＲＰ６－ＨＯ７は、上述したようにして細菌発現系から精製され、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で１．０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、１ｍＬバイアル中で－８０℃で保存した。
ＰＲＰ６－ＨＯ７は、上述したようにして細菌発現系から精製され、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で１．０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、１ｍＬバイアル中で－８０℃で保存した。
【0389】
ＰＲＰ－ＨＯ７はヒト血漿から精製され、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で６．２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、１ｍＬバイアル中で－８０℃で保存した。
【0390】
注射の準備：
ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＯ７の溶液は、それぞれのストック溶液からＤＰＢＳで希釈することにより、所望の濃度０．４ｍｇ／ｍＬ（６０μｇ用量／マウス）に調製した。製剤は投与直前に調製した。
ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＯ７の溶液は、それぞれのストック溶液からＤＰＢＳで希釈することにより、所望の濃度０．４ｍｇ／ｍＬ（６０μｇ用量／マウス）に調製した。製剤は投与直前に調製した。
【0391】
参照物質の識別および準備
ミノサイクリンを０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０＋カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（水中０．５％ｗ／ｖ）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。
ミノサイクリンを０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０＋カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（水中０．５％ｗ／ｖ）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。
【0392】
製剤は投与直前に調製した。
【0393】
実験手順
－大腸炎プロトコル（０～９日目）（図２１）：
大腸炎は、通常の飲料水に２％の濃度でＤＳＳ（ｗ／ｖ）を添加することによって誘発され、マウスに自由に与えられた。３日目に、ＤＳＳ溶液は新しい２％ＤＳＳ溶液に置き換えられた。
－大腸炎プロトコル（０～９日目）（図２１）：
大腸炎は、通常の飲料水に２％の濃度でＤＳＳ（ｗ／ｖ）を添加することによって誘発され、マウスに自由に与えられた。３日目に、ＤＳＳ溶液は新しい２％ＤＳＳ溶液に置き換えられた。
【0394】
５日目に、ＤＳＳ溶液は９日目まで水道水に置き換えられた。
－ブランク動物（非大腸炎グループ）は、研究全体を通して定期的に水を与えられた（ｎ＝４）。
－媒体処理（ｎ＝４）：ＤＰＢＳが、４、６および８日目に対照（ＤＳＳ－大腸炎グループ）の動物に０．１５ｍＬの量で皮下注射された。
－ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＯ７処理：０．１５ｍＬのＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＯ７（６０μｇ／各）が、この投与スケジュールで動物に皮下注射された。
・グループＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＯ７（ｎ＝６／各）：４、６および８日目に投与された。
－参照化合物処理（ｎ＝６）（０～８日目）：
ミノサイクリン（５０ｍｇ／ｋｇ）が、１０ｍＬ／ｋｇの量で動物に強制経口投与（ＰＯ）によって毎日投与された。
－ブランク動物（非大腸炎グループ）は、研究全体を通して定期的に水を与えられた（ｎ＝４）。
－媒体処理（ｎ＝４）：ＤＰＢＳが、４、６および８日目に対照（ＤＳＳ－大腸炎グループ）の動物に０．１５ｍＬの量で皮下注射された。
－ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＯ７処理：０．１５ｍＬのＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＯ７（６０μｇ／各）が、この投与スケジュールで動物に皮下注射された。
・グループＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＯ７（ｎ＝６／各）：４、６および８日目に投与された。
－参照化合物処理（ｎ＝６）（０～８日目）：
ミノサイクリン（５０ｍｇ／ｋｇ）が、１０ｍＬ／ｋｇの量で動物に強制経口投与（ＰＯ）によって毎日投与された。
【0395】
動物の体重、便中に存在する総血液および便の硬さを各マウスについて毎日記録した。これらのパラメーターにはそれぞれスコアが割り当てられ、各動物の１日の平均疾患活動性指標（ＤＡＩ）を計算するために用いられた（表５）（Melgar et al. 2005. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 288:1328-38）。９日目に、動物を２％イソフルランで麻酔し、頸椎脱臼により安楽死させた。
【0396】
【表5】
【0397】
統計分析
統計分析および科学的グラフ化は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行われた。体重および臨床スコアデータ（ＤＡＩ）は、二元配置分散分析（２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）およびそれに続くボンフェローニの事後検定を用いて分析された。データは平均値±ＳＥＭとして表される。すべての場合において、Ｐ値＜０．０５が有意であると見なされた。
統計分析および科学的グラフ化は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行われた。体重および臨床スコアデータ（ＤＡＩ）は、二元配置分散分析（２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）およびそれに続くボンフェローニの事後検定を用いて分析された。データは平均値±ＳＥＭとして表される。すべての場合において、Ｐ値＜０．０５が有意であると見なされた。
【0398】
実施例１４：ＤＳＳ誘発性大腸炎のマウスモデルにおけるＰＲＰ６－ＨＯ７の治療効果
この比較研究の目的は、ＰＲＰ６－ＨＯ７処理が、野生型分子ＰＲＰ－ＨＯ７と比較して、ＤＳＳ誘発性大腸炎モデルにおいて誘発された腸の炎症を軽減できるかどうかを評価することであった。したがって、ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＯ７の両方が、６０μｇ／マウスに皮下投与された。この研究では、抗生物質および化学免疫調節剤のミノサイクリン（Garrido-Mesa et al. 2011. Pharmacol Res. 63:308-19；Garrido-Mesa et al. 2011. Biochem Pharmacol. 82: 1891-1900）を対照参照処理に用いた。
この比較研究の目的は、ＰＲＰ６－ＨＯ７処理が、野生型分子ＰＲＰ－ＨＯ７と比較して、ＤＳＳ誘発性大腸炎モデルにおいて誘発された腸の炎症を軽減できるかどうかを評価することであった。したがって、ＰＲＰ６－ＨＯ７およびＰＲＰ－ＨＯ７の両方が、６０μｇ／マウスに皮下投与された。この研究では、抗生物質および化学免疫調節剤のミノサイクリン（Garrido-Mesa et al. 2011. Pharmacol Res. 63:308-19；Garrido-Mesa et al. 2011. Biochem Pharmacol. 82: 1891-1900）を対照参照処理に用いた。
【0399】
実験中、各マウスについて、動物の体重、下痢の発生および便中に存在する総血液等の臨床パラメーターを評価および収集して、疾患進行スコアまたはＤＡＩを算出した。
【0400】
大腸炎が完全に確立した後、４、６および８日目に６０μｇの用量で反復的に皮下投与されたＰＲＰ６－ＨＯ７によって、ＤＳＳ大腸炎マウスの炎症性病変を回避／軽減することができた。
【0401】
ＤＳＳを２％（ｗ／ｖ）の濃度で５日間投与することにより、すでに説明したのと同様に結腸の炎症状態が誘発された（Melgar et al. 2005. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 288:1328-38；Garrido-Mesa et al. 2011. Pharmacol Res. 63:308-19；Randhawa et al. 2014. Korean J Physiol Pharmacol. 18: 279-88）。ＤＳＳによって誘発された結腸の炎症過程は、ＤＳＳ投与後６日目から明らかに観察可能な非大腸炎マウス（ブランクグループ）と比較した場合、ほぼ確実に大腸炎対照グループの動物における食欲不振および下痢の発生に起因して、マウスの体重の減少に関連していた。これらの違いは、実験の５日目と６日目との間に始まり、実験の過程で徐々に増大し、炎症および大腸炎の進行の重症度と相関していた（図２２）。
【0402】
体重減少と一致して、ＤＡＩスコアも研究期間を通して対照大腸炎マウスで漸進的に増大した（図２３）。
【0403】
すべてのＤＳＳ治療マウスが、実験の最初の５日間において中等度の便秘を経験した。この期間の後、ほとんどのＤＤＳ治療動物において、便は硬さを失い、下痢が続いた。
【0404】
この実験プロトコルでミノサイクリンを毎日投与した後に得られた結果により、この化合物が腸の抗炎症効果を示したことが明らかになったが、８日目において統計的に有意ではなかった。対照的に、ＤＳＳ投与マウスにおいて腸の損傷がすでに明らかである場合、大腸炎誘発の４日目から開始される皮下に対するＰＲＰ－ＨＯ７またはＰＲＰ６－ＨＯ７の３回投与による処理によって、体重減少を有意に阻害し、便の硬さを維持することができた。重要なことに、ＰＲＰ６－ＨＯ７はＰＲＰ－ＨＯ７よりもさらに効果的であり、これは、未処理の大腸炎マウスとの比較において、最初のＰＲＰ６－ＨＯ７処理の４８時間後にＤＡＩの有意な減少が観察され、それが研究の終わり（８日目および９日目）に非常に有意になったことからも証明され（図２３）、主に体重減少の抑制および便の硬さの向上に関連している。実際、ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７のグループでは、対照グループと比較して炎症反応が有意に減少しており、体重減少の抑制およびＤＡＩの値の目に見える減少を示した（図２２および図２３）。
【0405】
統計的差異は、ＰＲＰ－ＨＯ７およびＰＲＰ６－ＨＯ７の両方を対照大腸炎動物と比較した場合の体重減少のパーセンテージ（８日目および９日目対０日目）でも証明された。したがって、ＰＲＰ６－ＨＯ７の治療的投与は、大腸炎の重症度を軽減する有意な能力を示した。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A)】
【図15B)】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
【国際調査報告】