特表 2023-506707 細胞を抗原提示に有能な樹状細胞２型に初期化するための組成物、その方法及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-20

(54)【発明の名称】細胞を抗原提示に有能な樹状細胞２型に初期化するための組成物、その方法及び使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20230213BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230213BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20230213BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20230213BHJP

   C12N 15/863 20060101ALI20230213BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230213BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230213BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20230213BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230213BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20230213BHJP

   C12N 15/20 20060101ALI20230213BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230213BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230213BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230213BHJP

   A61P 29/02 20060101ALI20230213BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230213BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230213BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230213BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20230213BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230213BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230213BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20230213BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230213BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230213BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20230213BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20230213BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20230213BHJP

   A61K 35/13 20150101ALI20230213BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230213BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

C12N15/863 Z

C12N15/867 Z

C12N15/864 100Z

C12N5/0784

C12N5/10

C12N15/24

C12N15/20

C12N15/113 120Z

A61K45/00

A61P31/12

A61P29/02

A61P35/00

A61P31/04

A61P9/00

A61P31/00

A61P37/02

A61P37/04

A61K39/00 H

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/15 Z

A61K35/28

A61K35/13

A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2022530281

(86)(22)【出願日】2020-11-25

(85)【翻訳文提出日】2022-06-15

(86)【国際出願番号】 EP2020083400

(87)【国際公開番号】W WO2021105234

(87)【国際公開日】2021-06-03

(31)【優先権主張番号】115933

(32)【優先日】2019-11-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT

(31)【優先権主張番号】20190159.2

(32)【優先日】2020-08-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522142442

【氏名又は名称】アスガード セラピューティクス エービー

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】リベイロ レモス ペレイラ，カルロス，フィリぺ

(72)【発明者】

【氏名】フェレイラ，ピレス，クリスティアーナ

(72)【発明者】

【氏名】フィウザ，ローザ，ファビオ

(72)【発明者】

【氏名】オリヴェイラ，ルイス，フィリペ，ヘンリケス

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA91X

4B065AA91Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA02

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA082

4C084ZA362

4C084ZB071

4C084ZB072

4C084ZB112

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB311

4C084ZB332

4C084ZC751

4C085AA03

4C085EE03

4C085GG01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA02

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB07

4C087ZB26

4C087ZB31

4C087ZB33

4C087ZB35

4C087ZC75

(57)【要約】

本開示は、細胞を通常型樹状細胞（ｃＤＣ）、特に、ｃＤＣ２型（以下、「ｃＤＣ２」又は「ＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞」という）に初期化するための組成物、その方法及び使用に関する。本開示は、単離した／合成の転写因子を導入及び発現させることにより、分化幹細胞、多分化能幹細胞又は多能性幹細胞から抗原提示能を有する通常型樹状細胞を作製する方法の開発に関する。より特には、本開示は、特異的転写因子の驚くべき組み合わせの使用により直接細胞を初期化することによって、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）、特にｃＤＣ２型又はＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞を取得する方法を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

幹細胞若しくは分化細胞、又はそれらの混合物を通常型樹状細胞２型（ｃＤＣ２）若しくはＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞に初期化する際に使用するための少なくとも３つの単離された又は合成の転写因子の組み合わせを含む組成物であって、第１及び第２の転写因子が、それぞれ（ＰＵ．１）配列番号３又は配列番号６及び（ＩＲＦ４）配列番号９又は配列番号１２の配列と少なくとも９０％同一である単離された又は合成のＰＵ．１及びＩＲＦ４転写因子であり、第３の転写因子が、ＰＲＤＭ１（配列番号１５、配列番号１８）、ＩＲＦ２（配列番号２１、配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２７、配列番号３０）、ＴＧＩＦ１（配列番号３３、配列番号３６）、ＲＢＰＪ（配列番号４５、配列番号４８）、及びＲＥＬＢ（配列番号３９、配列番号４２）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である単離された又は合成の転写因子である組成物。

【請求項2】

前記転写因子が個々に以下の配列：ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）、及びＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドによってコードされる、前述の請求項のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項3】

前記転写因子が個々に以下の配列：ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）、及びＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）と少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチドによってコードされるか、又は前記単離された若しくは合成の転写因子が個々に以下の配列：ＰＵ．１（配列番号３、配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号９、配列番号１２）、ＰＲＤＭ１（配列番号１５、配列番号１８）、ＩＲＦ２（配列番号２１、配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２７、配列番号３０）、ＴＧＩＦ１（配列番号３３、配列番号３６）、ＲＢＰＪ（配列番号４５、配列番号４８）、ＲＥＬＢ（配列番号３９、配列番号４２）と少なくとも９５％同一である、請求項１～２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項4】

前記転写因子の組み合わせが以下の組み合わせ：
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＩＲＦ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＯＵ２Ｆ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＴＧＩＦ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＢＰＪ；及び
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＥＬＢ
から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項5】

前記転写因子の組み合わせが、ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１又はＰＵ．１、ＩＲＦ４とＩＲＦ２である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記細胞が、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、分化細胞、腫瘍細胞、癌細胞及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の転写因子の組み合わせをコードする構築物又はベクター。

【請求項8】

コードされる転写因子の組み合わせが、以下の５'から３'の配列順：
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＩＲＦ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＯＵ２Ｆ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＴＧＩＦ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＢＰＪ；又は
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＥＬＢ
にある、請求項７に記載の構築物又はベクター。

【請求項9】

前記ベクターが、ウイルスベクター、特にレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項７～８に記載の構築物又はベクター。

【請求項10】

前記ベクター又は構築物が、合成ｍＲＮＡ、ネイキッドアルファウイルスＲＮＡレプリコン又はネイキッドフラビウイルスＲＮＡレプリコンである、請求項７～９に記載の構築物又はベクター。

【請求項11】

幹細胞又は分化細胞を通常型樹状細胞２型（ｃＤＣ２）又はＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞に初期化する際に使用するための少なくとも３つの転写因子をコードする少なくとも３つのポリヌクレオチド配列を含む１以上のベクターであって、前記第１及び第２の転写因子がＰＵ．１及びＩＲＦ４であり、前記第３の転写因子が、ＰＲＤＭ１、ＩＲＦ２、ＰＯＵ２Ｆ２、ＲＢＰＪ、ＲＥＬＢ及びＴＧＩＦ１からなる群から選択される１以上のベクター。

【請求項12】

前記転写因子が、個々に以下の配列：ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）及びＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１１に記載の１以上のベクター。

【請求項13】

前記コードされる転写因子の組み合わせが以下の組み合わせ：
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＩＲＦ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＯＵ２Ｆ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＴＧＩＦ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＢＰＪ；及び
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＥＬＢ
から選択される、請求項１１～１２に記載の１以上ベクター。

【請求項14】

少なくとも３つの転写因子をコードする少なくとも３つのポリヌクレオチド配列を含む１以上のベクターであって、前記転写因子がＰＵ．１、ＩＲＦ４及びＰＲＤＭ１である１以上のベクター。

【請求項15】

前記１以上のベクターが、ウイルスベクター、特にレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス又はアデノ随伴ウイルスのベクターである、請求項１１～１３に記載の１以上ベクター。

【請求項16】

前記１以上のベクター又は構築物が、合成ｍＲＮＡ、ネイキッドアルファウイルスＲＮＡレプリコン又はネイキッドフラビウイルスＲＮＡレプリコンである、請求項１１～１５に記載の１以上ベクター。

【請求項17】

前記細胞が、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、分化細胞、腫瘍細胞、癌細胞及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１１～１６に記載の１以上ベクター。

【請求項18】

獣医学又はヒト医学において、特に免疫療法において、又は神経変性疾患の治療若しくは療法において、又は自己免疫疾患、免疫不全において、又は癌の治療若しくは療法において、又は感染症の治療若しくは療法；皮内及び経皮療法；免疫療法において、又は神経変性疾患若しくは老化疾患において、又は癌若しくは感染症において、薬物スクリーニングとして使用するため；又は中枢神経系及び末梢神経系障害、新生物、特に癌、すなわち固形腫瘍又は血液腫瘍、免疫疾患、特に自己免疫疾患、過敏症、又は免疫不全；真菌性、ウイルス性、クラミジア性、細菌性、ナノ細菌性又は寄生虫性感染症の；ＨＩＶ、ＳＡＲＳコロナウイルス、アジアインフルエンザウイルスによる感染、単純ヘルペス、帯状疱疹、肝炎、又はウイルス性肝炎の治療、療法又は診断に使用するための、請求項１１～１７に記載の１以上のベクター。

【請求項19】

幹細胞又は分化細胞を通常型樹状細胞２型に初期化又は誘導するインビトロ又はエキソビボ方法であって、以下の工程：
前記第１及び第２の転写因子がＰＵ．１及びＩＲＦ４であり、前記第３の転写因子がＰＲＤＭ１、ＩＲＦ２、ＰＯＵ２Ｆ２、ＴＧＩＦ１、ＲＥＬＢ及びＲＢＰＪからなる群から選択される少なくとも３つの転写因子をコードする１以上のベクターで、幹細胞又は分化細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される細胞を形質導入する工程；
前記形質導入細胞を樹状細胞又は抗原提示細胞の増殖を支持する細胞培地中で培養する工程、
を含む方法。

【請求項20】

前記形質導入細胞を少なくとも２日間、好ましくは少なくとも５日間、より好ましくは少なくとも８日間、さらにより好ましくは少なくとも９日間、さらに好ましくは少なくとも１０日間培養する、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記細胞が、哺乳動物細胞、非ヒト細胞又はヒト細胞、マウス細胞、ヒト若しくはマウス線維芽細胞、哺乳動物の臍帯血幹細胞、多能性幹細胞又は多分化能幹細胞、分化細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択され、前記多能性幹細胞、多分化能幹細胞、又は分化細胞が、内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、又は外胚葉由来細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、腸幹細胞、多能性幹細胞を含む多分化能幹細胞及び細胞株からなる群から選択される、請求項１９～２０に記載の方法。

【請求項22】

前記形質導入工程が、ＩＬ－１２をコードする核酸配列；ＩＬ－４をコードする核酸配列；ＩＦＮ－αをコードする核酸配列；ＩＦＮ－βをコードする核酸配列；ＩＦＮ－γをコードする核酸配列；ＴＮＦをコードする核酸配列；ＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸配列；ＩＬ－１０ ＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡをコードする核酸配列、及びそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種のベクターをさらに含み、好ましくは免疫刺激性サイトカインをコードする核酸を含む、請求項１９～２１に記載の方法。

【請求項23】

請求項７～１０に記載の構築物若しくはベクター、又は請求項１１～１７に記載の１以上のベクターで形質導入された誘導樹状細胞。

【請求項24】

治療有効量の請求項２３に記載の誘導樹状細胞、又はそれらの混合物を含み、さらに、医薬として許容される賦形剤、好ましくは抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法剤、抗生物質、利尿剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、若しくは滑剤又はそれらの混合物を含む組成物。

【請求項25】

獣医学又はヒト医学において、特に免疫療法において、又は神経変性疾患の治療若しくは療法において、又は自己免疫疾患、免疫不全において、又は癌の治療若しくは療法において、又は感染症の治療若しくは療法において；皮内及び経皮療法；免疫療法において、又は神経変性疾患若しくは老化疾患において、又は癌若しくは感染症において、薬物スクリーニングとして使用するため；又は中枢神経系及び末梢神経系障害、癌の新生物、特に固形腫瘍又は血液腫瘍、免疫疾患、すなわち自己免疫疾患、過敏症、又は免疫不全；真菌性、ウイルス性、クラミジア性、細菌性、ナノ細菌性又は寄生虫性感染症の；ＨＩＶ、ＳＡＲＳコロナウイルス、アジアインフルエンザウイルスによる感染、単純ヘルペス、帯状疱疹、肝炎、又はウイルス性肝炎の治療、療法又は診断に使用するための、請求項１～６及び２４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項26】

請求項１～６及び２４～２５に記載の組成物、又は請求項２３に記載の誘導樹状細胞、又はそれらの混合物を含む、癌用のワクチン又は注射用製剤、特にインサイツ注射剤。

【請求項27】

以下の成分：
請求項２３に記載の誘導樹状細胞；
請求項１～６及び２４～２５のいずれか一項に記載の組成物；
請求項７～１７に記載のベクター若しくは構築物；
又はそれらの混合物
のうちの少なくとも１つを含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本開示は、細胞を通常型樹状細胞（ｃＤＣ）、特に、ｃＤＣ２型（以下、「ｃＤＣ２」又は「ＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞」という）に初期化するための組成物、その方法及び使用に関する。

【0002】

本開示は、単離した／合成の転写因子を導入及び発現させることにより、分化幹細胞、多分化能幹細胞又は多能性幹細胞から抗原提示能を有する通常型樹状細胞を作製する方法の開発に関する。より特には、本開示は、特異的転写因子の驚くべき組み合わせの使用により直接細胞を初期化することによって、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）、特にｃＤＣ２型又はＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞を取得する方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

背景
細胞初期化は、ある細胞状態のエピジェネティックな転写ネットワークを異なる細胞型のそれに再配線することに依存する。転写因子（ＴＦ）過剰発現実験は、成体の体細胞又は分化細胞の可塑性を強調し、任意の所望の細胞型を生成するための新しい技術を提供する。ＴＦの強制発現を通じて、体細胞又は分化細胞を、胚性幹細胞と著しく類似した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に初期化することが可能である（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ＆ Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）。あるいは、体細胞を別の特殊な細胞型に直接変換することもできる（Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ，＆Ｍｏｏｒｅ、２０１２）。直接系統変換は、標的細胞の素性を特定するＴＦを用いて、マウス及びヒトの線維芽細胞をニューロン、心筋細胞及び肝細胞などのいくつかの細胞型に初期化することに成功したことを証明した（Ｘｕ，Ｄｕ，＆Ｄｅｎｇ，２０１５）。直接細胞変換は造血系でも実証され、ＴＦの強制発現がＢ細胞及び線維芽細胞においてマクロファージの運命を誘導し（Ｘｉｅ，Ｙｅ，Ｆｅｎｇ，＆Ｇｒａｆ，２００４）、マウス線維芽細胞のクローン形成造血前駆細胞への直接初期化が、Ｇａｔａ２、Ｇｆｉ１ｂ、ｃＦｏｓ及びＥｔｖ６を用いて達成された（Ｐｅｒｅｉｒａら，２０１３）。これらの４つのＴＦは、内皮様中間体を介して進行する動的で多段階の造血プロセスを誘導し、インビトロで造血発生を再現する（Ｐｅｒｅｉｒａら，２０１６）。

【0004】

初期化された細胞は、再生医療のための非常に有望な治療ツールであり、ｉＰＳＣの分化によって取得される細胞は、既に臨床研究において試験されている。

【0005】

細胞初期化計画は、体細胞を多能性に変換するために細胞型特異的ＴＦを使用する可能性を有する細胞運命の柔軟性を強調している。１つの分化した細胞型から別の細胞型への直接系統変換も、細胞生物学のメカニズムの解明や再生医療の目的で実証され、探求されている。最近、抗原提示樹状細胞は、ＴＦの少しの組み合わせによって、無関係な細胞型から初期化され得ることが実証された。古典的には、骨髄系ＤＣコミット前駆細胞は、機能的に異なるＤＣサブセット：プロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）である通常型ＤＣ（ｃＤＣ）及び形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）を生じさせると言われている。ｃＤＣは抗原特異的免疫応答を促進するが、ｐＤＣはウイルス感染中のＩ型インターフェロンの専門生産者である。しかし、ＤＣ発生中の異なるサブセットの分岐を調整するタイミングと正確なメカニズムはまだ確立されていない。

【0006】

ＤＣは、リンパ骨髄系造血から生じる骨髄由来細胞のクラスであり、生物を病原体についてスキャンし、自然免疫系と適応免疫の活性化との間に本質的な境界を形成する。ＤＣは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と複合体化したペプチド抗原を、必要な全ての可溶性及び膜結合共刺激分子とともに表面に提示することによって、Ｔ細胞応答を活性化できるプロフェッショナルＡＰＣとして作用する。ＤＣは、一次免疫応答を誘導し、以前にプライミングされたＴリンパ球のエフェクター機能を増強し、自然免疫と適応免疫の間の伝達を調整する。ＤＣはほとんどの組織に見られ、抗原環境を継続的にサンプリングし、いくつかの種類の受容体を使用して病原体の侵入を監視する。定常状態で、及び病原体の検出時の増加速度で、非リンパ組織中のセンチネルＤＣはリンパ系器官に移動し、そこで収集及び処理した抗原をＴ細胞に提示する。Ｔ細胞によって獲得される表現型は、抗原提示の状況に依存する。抗原が病原体に由来するか又は自己損傷した場合には、ＤＣは危険信号を受け取り、活性化され、続いてＴ細胞を刺激し、防御免疫を提供するのに必要なエフェクターになる。

【0007】

免疫応答の制御の重要な態様は、いくつかの異なる種類のＤＣの存在であり、それぞれが特定の病原体に応答し、Ｔ細胞の特異的サブセットと相互作用することに特化している。この状況では、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）、骨髄系／通常型ＤＣ１（ｃＤＣ１）及び骨髄系／通常型ＤＣ２（ｃＤＣ２）の３つの主要なＤＣサブセットが生じる。これにより、免疫系の柔軟性が拡大し、広範囲の異なる病原体及び危険信号に適切に反応する。

【0008】

ｃＤＣ２は、ＣＤ１１ｂ表面発現によって特徴付けられ、ナイーブＣＤ４^＋ Ｔ細胞極性化がヘルパーＴｈ２及びＴｈ１７に向かうように導くＭＨＣ－ＩＩ提示に特化している（Ｐｌａｎｔｉｎｇａら，２０１３）。Ｔｈ２関連サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９及びＩＬ－１３）は、細胞外寄生虫に対する保護に関連する応答を媒介し（Ｍｏｓｍａｎｎ ＆ Ｃｏｆｆｍａｎ，１９８９）、アレルギー及び過敏反応を誘導する（Ｋｏｐｆら，１９９３；Ｚｈｕ＆Ｐａｕｌ，２００８）一方で、Ｔｈ１７は、細胞外細菌及び真菌に対する免疫応答と関連しており、多くの自己免疫疾患も誘導する（Ｗｅａｖｅｒ，Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｎｇａｎ，Ｇａｖｒｉｅｌｉ，＆Ｍｕｒｐｈｙ，２００６）。腫瘍において、ｃＤＣ２は、腫瘍流入領域リンパ節においてＭＨＣ－ＩＩ上でのＣＤ４^＋ Ｔ細胞への抗原提示に関与することによってｃＤＣ１を補完することが知られている（Ｍｅｒａｄ，Ｓａｔｈｅ，Ｈｅｌｆｔ，Ｍｉｌｌｅｒ，＆Ｍｏｒｔｈａ，２０１３）。ある研究では、腫瘍由来ｃＤＣ２の抗原提示が、Ｔｈ１７依存性物質上の抗腫瘍表現型への腫瘍関連マクロファージの変換を促進することが証明された（Ｌａｏｕｉら，２０１６）。ｃＤＣ２はまた、自己反応性ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を破壊し（Ｍｅｒａｄら，２０１３）、免疫応答を負に調節する（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，２００４）ことによって自己寛容の維持に不可欠な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）をプライミングすることによってエフェクターＴ細胞の下方制御に寄与する。

【0009】

さらなるｃＤＣ２の特徴的マーカーには、ＣＤ１１ｂ、Ｓｉｒｐα、ＣＤ４、及びＥＳＡＭが含まれる。ｃＤＣ２固有の不均一性のために、いくつかの特異的表面マーカーは特定のサブセットを特徴付ける。最近の知見は、異なる転写調節因子及び別個の免疫学的機能によって定義されるｃＤＣ２の２つの異なるサブセットを同定した（Ｂｒｏｗｎら，２０１９）。ｃＤＣ２ＡはＴｂｅｔ依存性として定義され、Ｅｓａｍ及びＣｌｅｃ４ａ４の表面発現によって特徴付けられる抗炎症サブセットであるが、ｃＤＣ２Ｂは、Ｃｌｅｃ１０ａ及びＣｌｅｃ１２ａマーカーを発現するかなり炎症誘発性のＲＯＲγｔ定義サブセットからなる。

【0010】

適応免疫を誘導するＤＣの能力は、細菌性、ウイルス性及び寄生性病原体に対するＤＣワクチン計画、並びにすなわち癌における免疫療法に関する研究を後押しした。実際、固形腫瘍及び血液腫瘍を含むいくつかの腫瘍型に対してＤＣ媒介性免疫療法を利用している臨床試験が進行中である（Ｄａｔｔａら、２０１４）。しかし、臨床転帰は一貫しておらず、おそらくインビトロ生成ＤＣの変わりやすい効率と関連付けられる。自己単球はインビトロで効率の低いＤＣに分化し得、造血前駆細胞は非常に少数しか単離されない。加えて、これらの前駆細胞は、担癌患者において一般的に損なわれ、機能不全ＤＣの生成をもたらす（Ｄａｔｔａら，２０１４；Ｓｕｂｋｌｅｗｅら，２０１４）。癌回避メカニズムにも、ＤＣベースの免疫療法における一貫した治療上の利点の欠如が根底にある可能性がある。腫瘍進行中に、癌細胞は免疫監視から逃れるためにいくつかの免疫学的プロセスを利用する。これらの適応は、癌抗原の不均一性とともに免疫系による腫瘍抗原の認識を妨げ、その結果、腫瘍細胞の免疫原性の低下及び現在の免疫療法に関与している。

【0011】

直接初期化によるＡＰＣの生成は、ＤＣの特定化及び細胞同一性をよりよく理解する新たな機会を開き、自己操作された細胞を用いた免疫応答のより効率的な制御に寄与する。

【0012】

文献ＥＰ３３８５３７３は、部分的には、分化した若しくは未分化の細胞をＤＣ又はＡＰＣに誘導又は初期化するのを可能にするＴＦの新規使用及び組み合わせの驚くべき効果に基づく、細胞をＤＣ状態若しくはＡＰＣ状態に誘導又は初期化するための組成物、核酸構築物、その方法及びキットに関する。

【0013】

文献ＥＰ３３８５３７３に記載の生成された初期化細胞は、主にＤＣのｃＤＣ１サブセットの表面マーカー発現、抗原提示、サイトカイン放出及びＴ細胞活性化特徴を特異的に再現する。他のＤＣサブセットの表現型の特徴については記載されていなかった。

【0014】

抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞などのあるリンパ球による認識のために抗原を処理及び提示することによって細胞性免疫応答を媒介する免疫細胞の不均一なグループである。古典的ＡＰＣには、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞及びＢ細胞が含まれる。

【0015】

ＤＣは、抗原を捕捉し、処理し、Ｔ細胞に提示し、それらを異なる種類の免疫応答に標的化するか、又は寛容応答を誘導する能力を介して、外部環境と適応免疫系との間の重要なつながりを提供する。

【0016】

表現型基準は、マウスＤＣを別個の表面マーカーの発現によって特徴付けられる異なる亜集団に分類することを可能にする。リンパ組織における通常型ＤＣ（ｃＤＣ）は、伝統的にｃＤＣ１及びｃＤＣ２亜集団に細分される。異なるＤＣサブセットは、ある病原体の特異的認識に関与し、かつ／又は異なる免疫応答を調節する。ｃＤＣ１は、腫瘍クリアランスを促進するのに重要であるＴｈ１応答のプライミングと関連付けられるが、ｃＤＣ２サブセットはＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７（免疫）及びＴｒｅｇ（寛容）応答と関連付けられた。

【0017】

文献ＥＰ３３８５３７３は、部分的には、分化した若しくは未分化の細胞をＤＣ又はＡＰＣ、より具体的にはｃＤＣ１に誘導又は初期化するのを可能にするＴＦの新規使用及び組み合わせの驚くべき効果に基づく、細胞をＤＣ状態若しくはＡＰＣ状態に誘導又は初期化するための組成物、核酸構築物、その方法及びキットに関する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

現在、ＤＣベースの免疫療法は、効率の低いＤＣの産生に関連付けられる単球、又は非常に少ない数で単離される造血前駆細胞のいずれかの自己ＤＣ前駆体に依存している。さらに、これらの前駆細胞は、担癌患者において一般的に損なわれ、機能不全ＤＣの生成をもたらす。一方で、線維芽細胞などの非造血細胞型は、通常、影響を受けない。自然免疫系と適応免疫系をつなぐＡＰＣとしてのＤＣの基本的な役割を考えると、抗原特異的免疫応答をプライムする機能的ＤＣを生成するための代替計画を見つける臨床的必要性が依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0019】

本開示の直接初期化によって生成された誘導性ＤＣ又はＡＰＣは、驚くべきことに、ＤＣのｃＤＣ２サブセットのＭＨＣ－ＩＩ分子において表面マーカー発現、サイトカイン分泌及び抗原提示に関する表現型を再現する。

【0020】

これらの事実は、本開示によって対処される技術的問題を説明するために開示される。

【0021】

本主題は、驚くべきことに、分化細胞、多分化能幹細胞又は多能性幹細胞を抗原提示樹状細胞、より具体的にはｃＤＣ２にインビトロ、エキソビボ若しくはインビボで初期化又は誘導するいくつかの単離された又は合成のＴＦを同定する。

【発明の効果】

【0022】

一態様では、本開示は、幹細胞若しくは分化細胞、又はそれらの混合物を通常型樹状細胞２型（ｃＤＣ２）又はＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞に初期化するためのＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）からなるリストと少なくとも９０％同一で、リストから選択される単離されるか若しくは合成の配列によってコードされる少なくとも２つの転写因子；又はＰＵ．１（配列番号３、配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号９、配列番号１２）、ＰＲＤＭ１（配列番号１５、配列番号１８）、ＩＲＦ２（配列番号２１、配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２７、配列番号３０）、ＴＧＩＦ１（配列番号３３、配列番号３６）からなるリストから選択される配列と少なくとも９０％同一である少なくとも２つの単離された又は合成の転写因子の組み合わせ、並びにそれらの混合物を含む組成物を含む。

【0023】

一態様では、本開示は、幹細胞若しくは分化細胞、又はそれらの混合物を通常型樹状細胞２型（ｃＤＣ２）又はＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞に初期化する際に使用するための少なくとも３つの単離された又は合成の転写因子の組み合わせを含む組成物を含み、第１及び第２の転写因子は、ＰＵ．１（配列番号３、配列番号６）及びＩＲＦ４（配列番号９、配列番号１２）の配列と少なくとも９０％同一である単離された及び合成のＰＵ．１並びにＩＲＦ４転写因子であり、第３の転写因子は、ＰＲＤＭ１（配列番号１５、配列番号１８）、ＩＲＦ２（配列番号２１、配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２７、配列番号３０）、ＴＧＩＦ１（配列番号３３、配列番号３６）、ＲＢＰＪ（配列番号４５、配列番号４８）及びＲＥＬＢ（配列番号３９、配列番号４２）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である単離された又は合成の転写因子である。

【0024】

本明細書で使用される変異体は、本開示のＤＮＡコード配列と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％の全体的な配列同一性を有する配列を意味する。

【0025】

さらなる実施形態では、本開示は、幹細胞若しくは分化細胞、又はそれらの混合物を通常型樹状細胞２型（ｃＤＣ２）に初期化する際に使用するためのＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）と少なくとも９０％同一で、それらからなる群から選択される単離された又は合成の配列によってコードされる少なくとも２つの転写因子、又はＰＵ．１（配列番号３、配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号９、配列番号１２）、ＰＲＤＭ１（配列番号１５、配列番号１８）、ＩＲＦ２（配列番号２１、配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２７、配列番号３０）、ＴＧＩＦ１（配列番号３３、配列番号３６）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である少なくとも２つの単離された又は合成の転写因子、並びにそれらの混合物を含む組成物を含み、ただし、ＰＵ．１（配列番号１～配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７～配列番号１２）からなる少なくとも２つの単離された又は合成の転写因子の組み合わせを除く。

【0026】

一実施形態では、本開示は、幹細胞若しくは分化細胞を通常型樹状細胞２型（ｃＤＣ２）又はＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞に初期化する際に使用するためのＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）及びＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）と少なくとも９０％同一で、それらからなる群から選択される単離された又は合成の配列によってコードされる少なくとも２つの転写因子、又はＰＵ．１（配列番号３、配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号９、配列番号１２）、ＰＲＤＭ１（配列番号１５、配列番号１８）、ＩＲＦ２（配列番号２１、配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２７、配列番号３０）、ＴＧＩＦ１（配列番号３３、配列番号３６）、ＲＢＰＪ（配列番号４５、配列番号４８）及びＲＥＬＢ（配列番号３９、配列番号４２）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である少なくとも２つの単離された又は合成の転写因子、並びにそれらの混合物を含む組成物を含む。

【0027】

一実施形態では、本開示は、本明細書に先に記載した使用のための組成物を含み、該転写因子は、個々に以下の配列：ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）及びＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドによってコードされる。

【0028】

一実施形態では、本開示は、ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）からなるリストと少なくとも９５％同一で、それらから選択される単離された又は合成の配列によってコードされる少なくとも２つの転写因子、又はＰＵ．１（配列番号３、配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号９、配列番号１２）、ＰＲＤＭ１（配列番号１５、配列番号１８）、ＩＲＦ２（配列番号２１、配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２７、配列番号３０）、ＴＧＩＦ１（配列番号３３、配列番号３６）からなるリストから選択される配列と少なくとも９５％同一である少なくとも２つの単離された若しくは合成の転写因子の組み合わせ、及びそれらの混合物を含む。

【0029】

一実施形態では、本開示は、本明細書に先に記載した使用のための組成物を含み、該転写因子は、個々に以下の配列：ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）、及びＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）と少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチドによってコードされるか、又は単離された若しくは合成の転写因子は、個々に以下の配列：ＰＵ．１（配列番号３、配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号９、配列番号１２）、ＰＲＤＭ１（配列番号１５、配列番号１８）、ＩＲＦ２（配列番号２１、配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２７、配列番号３０）、ＴＧＩＦ１（配列番号３３、配列番号３６）、ＲＢＰＪ（配列番号４５、配列番号４８）、ＲＥＬＢ（配列番号３９、配列番号４２）と少なくとも９５％同一である。

【0030】

さらなる実施形態では、本開示は、以下の単離若しくは合成のコードされる組み合わせから、又は以下のタンパク質：
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）及びＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）及びＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）；
ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）及びＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）及びＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）及びＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）及びＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；
ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）及びＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）；
ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）及びＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）；
ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）及びＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；
ＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）及びＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）；
ＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）及びＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）；
ＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）及びＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）及びＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）；
ＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）及びＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）；
ＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）及びＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）及びＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）；
ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）及びＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）及びＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）、ＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）及びＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）及びＲＢＰＪ（配列番号４３－配列番号４８）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）及びＲＥＬＢ（配列番号３７－配列番号４２）；
又はそれらの混合物
から選択される少なくとも２つの転写因子の組み合わせを含む。

【0031】

一実施形態では、本開示は、先に記載したような使用のための組成物を含み、転写因子の組み合わせは、以下の組み合わせ：
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＩＲＦ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＯＵ２Ｆ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＴＧＩＦ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＢＰＪ；及び
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＥＬＢ
から選択される。

【0032】

一実施形態では、本開示の組成物は、以下のタンパク質からなる群から又は以下のタンパク質：
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）、ＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）及びそれらの混合物から選択される配列と少なくとも９０％同一である単離された又は合成の配列によってコードされる少なくとも３つの転写因子を含み得る。

【0033】

一実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組成物に関し、該転写因子の組み合わせは、ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１又はＰＵ．１、ＩＲＦ４とＩＲＦ２である。

【0034】

さらなる実施形態では、本開示の組成物は、以下の単離された若しくは合成のタンパク質から、又は以下の単離された若しくは合成のコードされる組み合わせ：
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）；
ＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）とＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）ＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）、ＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）とＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＲＢＰＪ（配列番号４３－配列番号４８）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＲＥＬＢ（配列番号３７－配列番号４２）；
又はそれらの混合物
から選択される転写因子の組み合わせを含み得る。

【0035】

一実施形態では、単離された又は合成の転写因子の組み合わせは、ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）及びＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）である。

【0036】

一実施形態では、単離された又は合成の転写因子の組み合わせは、ＰＵ．１、ＩＲＦ４及びＰＲＤＭ１である。

【0037】

さらなる実施形態では、単離された又は合成の転写因子の組み合わせは、ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号１２）とＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）又はＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）である。

【0038】

別の実施形態では、単離された又は合成の転写因子の組み合わせは、ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１又はＰＵ．１、ＩＲＦ４とＩＲＦ２である。

【0039】

一実施形態では、本開示の組成物は、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、分化細胞、線維芽細胞、腫瘍細胞、癌細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される幹細胞又は分化細胞を含み得る。

【0040】

一実施形態では、細胞は、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、分化細胞、線維芽細胞、腫瘍細胞、癌細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択され得る。

【0041】

さらなる実施形態では、該細胞は、腫瘍細胞、癌細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択され得る。

【0042】

一実施形態では、抗原は、癌抗原、自己抗原、アレルゲン、病原性及び／又は感染性生物由来の抗原であり得る。

【0043】

一実施形態では、本開示の組成物は、獣医学又はヒト医学において、特に免疫療法において、又は自己免疫疾患、免疫不全において、又は神経変性若しくは老化疾患において、癌若しくは感染症において、又は薬物スクリーニングとして使用され得る。

【0044】

さらなる実施形態では、多能性幹細胞、多分化能幹細胞又は分化細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞、多分化能幹細胞又は分化細胞、特にマウス又はヒトの細胞である。

【0045】

本開示の一態様は、本開示の少なくとも２つの単離された又は合成の転写因子の組み合わせ、好ましくは３つの転写因子のコードされる単離された又は合成の組み合わせをコードする構築物又はベクターに関する。

【0046】

本開示の別の態様は、本明細書に記載の転写因子の組み合わせをコードする構築物又はベクターに関する。

【0047】

さらなる実施形態では、本開示は、構築物又はベクターを含み、３つの単離された又は合成の転写因子の組み合わせは、以下の５'から３'の配列順にある：
ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）とＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）；ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）とＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）
ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）とＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）；
ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）とＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）；
ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）とＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）；
ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）とＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）；
ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）とＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）。

【0048】

さらなる実施形態では、本開示は、構築物又はベクターを含み、コードされる転写因子の組み合わせは、以下の５'から３'の配列順にある：
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＩＲＦ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＯＵ２Ｆ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＴＧＩＦ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＢＰＪ；又は
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＥＬＢ。

【0049】

さらなる実施形態では、本開示はベクターを含み、該ベクターは、ウイルスベクター、特にレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、又はアデノ随伴ウイルスベクターである。

【0050】

一実施形態では、該ベクター又は構築物は、合成ｍＲＮＡ、ネイキッドアルファウイルスＲＮＡレプリコン又はネイキッドフラビウイルスＲＮＡレプリコンである。

【0051】

本開示の一態様では、本開示は、幹細胞又は分化細胞を通常型樹状細胞２型（ｃＤＣ２）又はＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞に初期化する際に使用するための少なくとも３つの転写因子をコードする少なくとも３つのポリヌクレオチド配列を含む１以上のベクターに関し、第１及び第２の転写因子はＰＵ．１及びＩＲＦ４であり、第３の転写因子は、ＰＲＤＭ１、ＩＲＦ２、ＰＯＵ２Ｆ２、ＲＢＰＪ、ＲＥＬＢ及びＴＧＩＦ１からなる群から選択される。

【0052】

一実施形態では、本開示は、１以上のベクターに関し、該転写因子は、個々にＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）及びＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドによってコードされる。

【0053】

さらなる実施形態では、本開示は１以上のベクターを含み、コードされる転写因子の組み合わせは以下の組み合わせ：
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＩＲＦ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＯＵ２Ｆ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＴＧＩＦ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＢＰＪ；又は
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＥＬＢ
から選択される。

【0054】

一態様では、本開示は、少なくとも３つの転写因子をコードする少なくとも３つのポリヌクレオチド配列を含む１以上のベクターに関し、該転写因子は、ＰＵ．１、ＩＲＦ４及びＰＲＤＭ１である。

【0055】

一実施形態では、本開示は１以上のベクターを含み、該１以上のベクターは、ウイルスベクター、特にレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターである。

【0056】

一実施形態では、本開示は１以上のベクターを含み、該１以上のベクターは、合成ｍＲＮＡ、ネイキッドアルファウイルスＲＮＡレプリコン又はネイキッドフラビウイルスＲＮＡレプリコンである。

【0057】

一実施形態では、本開示は１以上のベクターを含み、該細胞は、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、分化細胞、腫瘍細胞、癌細胞及びそれらの混合物からなる群から選択される。

【0058】

一実施形態では、本開示は、獣医学又はヒト医学において、特に免疫療法において、又は神経変性疾患、若しくは自己免疫疾患、免疫不全の治療若しくは療法において、又は癌の治療若しくは療法において、又は感染症の治療若しくは療法において；皮内及び経皮療法において；免疫療法において、又は神経変性疾患若しくは老化疾患において、又は癌若しくは感染症において、薬物スクリーニングとして使用するため；又は中枢神経系及び末梢神経系障害、新生物、特に癌、すなわち固形腫瘍又は血液腫瘍、免疫疾患、特に自己免疫疾患、過敏症、又は免疫不全；真菌性、ウイルス性、クラミジア性、細菌性、ナノ細菌性又は寄生虫性感染症の；ＨＩＶ、ＳＡＲＳコロナウイルス、アジアインフルエンザウイルスによる感染、単純ヘルペス、帯状疱疹、肝炎、又はウイルス性肝炎の治療、療法又は診断に使用するための１以上のベクターを含む。

【0059】

本開示の別の態様は、幹細胞又は分化細胞を通常型樹状細胞２型に初期化又は誘導する方法であって、以下の工程：
幹細胞又は分化細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される細胞に、ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）、及びＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）、及びそれらの混合物からなる群からの配列と少なくとも９０％同一、好ましくは少なくとも９５％同一である配列をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む１以上のベクターで形質導入する工程；
該形質導入細胞を樹状細胞又は抗原提示細胞の増殖を支持する細胞培地中で培養する工程、を含む方法に関する。

【0060】

本開示の別の態様は、幹細胞又は分化細胞を通常型樹状細胞２型に初期化又は誘導する方法であって、以下の工程：
第１及び第２の転写因子がＰＵ．１及びＩＲＦ４であり、第３の転写因子がＰＲＤＭ１、ＩＲＦ２、ＰＯＵ２Ｆ２、ＴＧＩＦ１、ＲＥＬＢ及びＲＢＰＪからなる群から選択される少なくとも３つの転写因子をコードする１以上のベクター及びそれらの混合物で幹細胞又は分化細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される細胞に形質導入する工程；
形質導入細胞を樹状細胞又は抗原提示細胞の増殖を支持する細胞培地中で培養する工程、を含む方法に関する。

【0061】

一実施形態では、本開示は、本明細書に記載の方法に関し、該形質導入細胞は、少なくとも２日間、好ましくは少なくとも５日間、より好ましくは少なくとも８日間、さらにより好ましくは少なくとも９日間、さらに好ましくは少なくとも１０日間培養される。

【0062】

さらなる実施形態では、配列の組み合わせは、
ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）とＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）；
ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）とＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）；
ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）とＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）；
ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）とＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）；
ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）とＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）；
ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）とＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）
であり得る。

【0063】

一実施形態では、本開示は、本開示の構築物又はベクターを含み、前記群から選択される配列は、ＰＵ．１とＩＲＦ４の組み合わせである。

【0064】

一態様では、本開示は、幹細胞又は分化細胞を通常型樹状細胞２型に初期化又は誘導する方法であって、以下の工程：幹細胞又は分化細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される細胞に、ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）、及びＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）；及びそれらの混合物からなる群からの配列と少なくとも９０％同一、好ましくは少なくとも９５％同一である配列をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む１以上のベクターで形質導入する工程；該形質導入細胞を樹状細胞又は抗原提示細胞の増殖を支持する細胞培地中で培養する工程、を含む方法を含む。

【0065】

一実施形態では、３つの単離された及び合成の転写因子の組み合わせは、以下の５’から３’の配列順：ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）にある。本方法は、少なくとも２日間、好ましくは少なくとも５日間、より好ましくは少なくとも８日間、さらにより好ましくは少なくとも９日間、さらにより好ましくは少なくとも１０日間、複数の単離された及び合成の転写因子で形質導入された細胞を培養する工程を含むが、これに限定されない。

【0066】

さらなる実施形態では、本開示は、形質導入工程が、ＩＬ－１２をコードする核酸配列；ＩＬ－４をコードする核酸配列；ＩＦＮ－αをコードする核酸配列であって；ＩＦＮ－βをコードする核酸配列；ＩＦＮ－γをコードする核酸配列；ＴＮＦをコードする核酸配列；ＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸配列；ＩＬ－１０ＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡをコードする核酸配列、及びそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのベクターをさらに含む方法を含む。

【0067】

一実施形態では、本開示は、形質導入工程が、免疫刺激性サイトカインをコードする核酸を含む少なくとも１つのベクターをさらに含む方法を含む。

【0068】

さらなる実施形態では、本開示は、細胞が、多能性幹細胞、又は多分化能幹細胞、又は分化細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される方法を含む。

【0069】

さらなる実施形態では、本開示は、細胞が哺乳動物細胞である方法を含む。

【0070】

さらなる実施形態では、本開示は、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、又は分化細胞が、内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、又は外胚葉由来細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、腸幹細胞、多能性幹細胞を含む多分化能幹細胞及び細胞株からなる群から選択される方法を含む。

【0071】

一実施形態では、本開示は、細胞が非ヒト細胞である方法を含む。

【0072】

さらなる実施形態では、本開示は、細胞がマウス細胞である方法を含む。

【0073】

一実施形態では、本開示は、細胞がヒト細胞である方法を含む。

【0074】

さらなる実施形態では、本開示は、細胞がヒト若しくはマウス線維芽細胞、又は哺乳動物の臍帯血幹細胞である方法を含む。

【0075】

本開示の別の態様は、本開示の方法によって得られる誘導樹状細胞に関する。

【0076】

本開示の別の態様は、本明細書に記載の構築物若しくはベクター、又は本明細書に記載の１以上のベクターで形質導入された誘導樹状細胞に関する。

【0077】

さらなる実施形態では、本開示は、本開示の方法によって得られる治療有効量の誘導樹状細胞、及び医薬として許容される賦形剤に関する。

【0078】

さらなる実施形態では、本開示は、獣医学又はヒト医学における使用方法を含む。

【0079】

さらなる実施形態では、本開示は、免疫療法において、又は神経変性疾患、若しくは自己免疫疾患、免疫不全の治療若しくは療法において、又は癌の治療若しくは療法において、又は感染症の治療若しくは療法において使用する方法を含む。

【0080】

一実施形態では、本開示は、抗ウイルス薬、鎮痛薬、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、抗生物質、利尿薬、又はそれらの混合物をさらに含む方法を含む。

【0081】

さらなる実施形態では、本開示は、充填剤、結合剤、崩壊剤、若しくは滑剤、又はそれらの混合物をさらに含む組成物を含む。

【0082】

さらなる実施形態では、本開示は、皮内及び経皮療法に使用するための組成物を含む。

【0083】

さらなる実施形態では、本開示は、注射用製剤、特にインサイツ注射を含む。

【0084】

一実施形態では、本開示は、獣医学又はヒト医学において、特に免疫療法において、又は神経変性若しくは老化疾患において、又は癌若しくは感染症において、薬物スクリーニングとして使用するための組成物を含む。

【0085】

さらなる実施形態では、本開示は、中枢神経系及び末梢神経系の障害の治療、療法又は診断に使用するための組成物を含む。

【0086】

さらなる実施形態では、本開示は、新生物、特に癌、すなわち固形腫瘍又は血液腫瘍の治療、療法又は診断に使用するための組成物を含む。

【0087】

さらなる実施形態では、本開示は、癌若しくは免疫疾患、すなわち自己免疫疾患、過敏症、若しくは免疫不全症の治療、診断又は療法に使用するための組成物を含む。

【0088】

一実施形態では、本開示は、真菌性、ウイルス性、クラミジア性、細菌性、ナノ細菌性若しくは寄生虫性感染症の治療、療法又は診断に使用するための組成物を含む。

【0089】

さらなる実施形態では、本開示は、ＨＩＶ、ＳＡＲＳコロナウイルス、アジアインフルエンザウイルスによる感染、単純ヘルペス、帯状疱疹、肝炎、若しくはウイルス性肝炎の治療、療法又は診断に使用するための組成物を含む。

【0090】

さらなる実施形態では、本開示は、前の請求項のいずれか一項に記載の組成物、又は本開示の誘導樹状細胞、又はそれらの混合物を含む癌のためのワクチンを含む。

【0091】

一態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物、又は本明細書に記載の誘導樹状細胞、又はそれらの混合物を含む癌に対するワクチン若しくは注射用製剤、特にインサイツ注射に関する。

【0092】

さらなる実施形態では、本開示は、以下の成分：
本開示の誘導樹状細胞；
本開示に記載の組成物；
本開示のベクター若しくは構築物；
又はそれらの混合物
のうちの少なくとも１つを含むキットを含む。

【0093】

驚くべきことに、本開示に記載の初期化によって生成された誘導ＤＣは、通常型樹状細胞２型（ＣＤ１１ｂ）の内因性表面マーカー表現型、並びにサイトカイン分泌及びＭＨＣ－ＩＩ分子における抗原提示を示す。

【0094】

本開示は、幹細胞若しくは分化細胞、又はそれらの混合物からなる群から選択される細胞の初期化又は誘導因子としてのＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）、ＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）からなる群からの配列と９０％同一である配列によってコードされる少なくとも２つの単離された転写因子の組み合わせを含む組成物に関する。

【0095】

参照配列（配列番号１～３６）によってコードされる参照ポリペプチドと同じ又は類似の活性を有するポリペプチド変異体又はファミリーメンバーは、本明細書に記載の組成物、方法、及びキットにおいて使用することができる。一般に、本明細書に記載の組成物、方法、及びキットにおいて使用するためのＤＣ誘導因子をコードする特定のポリペプチドの変異体は、本明細書に記載の配列アラインメントアルゴリズム及びパラメータによって決定され、当業者に公知であるその特定の参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又はそれ以上の配列同一性を有する。

【0096】

比較のための配列アラインメントの方法には、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡが含まれる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（（１９７０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３－４５３）のアルゴリズムを使用して、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小限に抑える２つの配列のグローバルな（配列全体にわたる）アラインメントを見つける。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－１０）は、パーセント配列同一性を計算し、２つの配列間の類似性の統計分析を実行する。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）を通じて公開されている。類似性及び同一性のグローバルなパーセンテージはまた、ＭａｔＧＡＴソフトウェアパッケージ（Ｃａｍｐａｎｅｌｌａら，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００３ Ｊｕｌ １０；４：２９．ＭａｔＧＡＴ：タンパク質又はＤＮＡ配列を使用して類似性／同一性行列を生成するアプリケーション）で利用可能な方法の１つを用いて決定され得る。少数の手動編集は、当業者に明らかなように、保存されたモチーフ間のアライメントを最適化するために行われ得る。本主題においてパーセンテージとして示される配列同一性の値を、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴを用いてアミノ酸配列全体にわたって決定した。

【0097】

一実施形態では、本開示のＤＮＡコード配列のいずれかは、１以上の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６個の異なるデオキシリボヌクレオチド塩基を含むように改変、置換、又は変更することができる。

【0098】

一実施形態では、本開示は、Ｃｌｅｃ９ａレポーターマウスにおいて、このモデルをｃＤＣ２誘導因子のスクリーニングに適するようにするために、ｃＤＣ２の大部分がｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質で標識されていることを検証した。ＰＵ．１はＤＣ発生において重要な役割を果たすと説明され、ＩＲＦ４は、ｃＤＣ２仕様を保証すると説明されている。さらに、ＰＵ．１とＩＲＦ４の両方は、ｃＤＣ２サブセット上で高発現している。したがって、本開示は、ＰＵ．１及びＩＲＦ４を追加の３３個のｃＤＣ２誘導候補と組み合わせ、Ｃｌｅｃ９ａレポーターマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において追加のスクリーニングを実施した。

【0099】

一実施形態では、ＩＲＦ４及びＰＲＤＭ１と組み合わせたＰＵ．１は、Ｃｌｅｃ９ａレポーター活性化及びｃＤＣ２表面マーカーＣＤ１１ｂの表面発現を誘導するのに十分である。さらに、ＤＣ機能にとって重要な主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子の発現は、ＩＲＦ４及びＰＲＤＭ１と組み合わせたＰＵ．１によって誘導される。

【0100】

ＰＵ．１に続いてＩＲＦ４及びＰＲＤＭ１をコードするポリシストロニック構築物は、Ｃｌｅｃ９ａレポーター活性化の効率を増加させる。結果として生成されるｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞は、ＴＬＲ刺激時に炎症誘発性ＴＮＦ－αを分泌し、ＭＨＣ－ＩＩ上に負荷された抗原をＣＤ４^＋ Ｔ細胞に提示し、それらの増殖及び活性化を誘導する能力を示す。

【0101】

一実施形態では、ＩＲＦ４及びＩＲＦ２と組み合わせたＰＵ．１は、顕著なレポーター活性化を誘導する。さらに、ＩＲＦ４及びＩＲＦ２と組み合わせたＰＵ．１は、ｔｄＴ＋ＣＤ１１ｂ＋二重陽性細胞集団の増加をもたらす。

【0102】

一実施形態では、ＩＲＦ４及びＰＯＵ２Ｆ２と組み合わせたＰＵ．１又はＩＲＦ４及びＴＧＩＦ１と組み合わせたＰＵ．１は、ｃＤＣ２特異的表面マーカーであるＣＤ１１ｂの発現増加をもたらす。

【0103】

一実施形態では、ＩＲＦ４及びＲＢＰＪと組み合わせたＰＵ．１又はＩＲＦ４及びＲＥＬＢと組み合わせたＰＵ．１は、ｃＤＣ２特異的表面マーカーであるＣＤ１１ｂの発現増加をもたらす。

【0104】

要約すると、発明者らは、ＰＵ．１及びＩＲＦ４をＰＲＤＭ１、ＩＲＦ２、ＲＢＰＪ、ＲＥＬＢ、ＰＯＵ２Ｆ２又はＴＧＩＦ１と組み合わせると、線維芽細胞においてｃＤＣ２表現型が誘導されることを示す。これらの知見は、ｃＤＣ２の不均一性仕様に関する洞察を提供する。直接初期化による次世代のｃＤＣ２は、自己操作された細胞を用いて免疫促進及び免疫寛容原性応答を誘導する可能性を開く。

【0105】

一実施形態では、単離された転写因子の組み合わせは、
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）；
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）；
又はＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）；
又はＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；
又はＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＲＢＰＪ（配列番号４３－配列番号４８）；
又はＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＲＥＬＢ（配列番号３７－配列番号４２）であり得る。

【0106】

本開示の別の態様は、ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）、ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）、ＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）とＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）からなる群からの少なくとも２つの配列の組み合わせの使用である。単離された転写因子は、以下の組み合わせ：
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）とＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）；又は
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）とＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）；又は
ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）；又は
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）とＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）；又は
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）とＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）；又は
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）とＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；又は
ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）；又は
ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）；又は
ＩＲＦ４（配列番号７－配列番号１２）とＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；又は
ＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）とＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）；又は
ＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）とＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）；又は
ＰＲＤＭ１（配列番号１３－配列番号１８）とＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；又は
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）とＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）；又は
ＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）とＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）；又は
ＩＲＦ２（配列番号１９－配列番号２４）とＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；又は
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）とＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）；又は
ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５－配列番号３０）とＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）；又は
ＰＵ．１（配列番号１－配列番号６）とＴＧＩＦ１（配列番号３１－配列番号３６）
を含み得る。

【0107】

より良い結果のための一実施形態では、細胞は、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、分化細胞、腫瘍細胞、癌細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択され得る。特に哺乳動物細胞、より特にはマウス又はヒトの細胞。

【0108】

一実施形態では、本開示の単離された転写因子は、獣医学又はヒトの医学的用途のため、特に感染症、又はウイルス性疾患、又はウイルス誘発性疾患、又は神経変性疾患において、又は癌において、又は糖尿病において、又は免疫療法において、又は自己免疫疾患において、又は過敏症において使用され得る。

【0109】

より良い結果のための一実施形態では、本開示の単離された転写因子は、多能性幹細胞、又は多分化能幹細胞、又は分化細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される細胞の樹状細胞又はインターフェロン産生細胞への初期化因子又は誘導因子として使用され得る。

【0110】

以下の図は、本開示を説明するための好ましい実施形態を提供し、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0111】

【図1】図１－３つの主要なＤＣサブセットの個体発生。ＤＣは、骨髄中の一般的なＤＣ前駆体（ＣＤＰ）から出現し、異なるＤＣサブセット：主にＴｈ１応答及び細胞傷害性Ｔ細胞応答を促進する抗原交差提示を行うｃＤＣ１；ウイルス感染時にインターフェロンＩ型産生細胞として作用するｐＤＣ；主にＭＨＣ－ＩＩ抗原提示を行い、Ｔｈ２、Ｔｈ１７及びＴｒｅｇ応答を促進するｃＤＣ２に発達することができる。

【図2】図２－直接初期化されるｃＤＣ２のアプリケーションの概略図。患者から得られた線維芽細胞は、個別化免疫療法に適用できるｃＤＣ２細胞に初期化される。誘導されたｃＤＣ２は、寄生虫に対する免疫、細胞外病原体に対する免疫を誘導し、抗腫瘍応答を促進するため、又は自己免疫又は過敏症の状況における自己抗原に対する免疫寛容を誘導するために使用することができる。

【図3】図３－脾臓ｃＤＣ２は、Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターによって促進される高レベルのｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質を発現する。（Ａ）Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスから単離した脾臓ｃＤＣ１（ＭＨＣ－ＩＩ^＋ ＣＤ１１ｃ^＋ ＣＤ８ａ^＋）及びｃＤＣ２（ＭＨＣ－ＩＩ^＋ ＣＤ１１ｃ^＋ ＣＤ１１ｂ^＋）集団におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現のフローサイトメトリー解析。（Ｂ）ｃＤＣ１（ＣＤ８α^＋）及びｃＤＣ２（ＣＤ８α^－ＣＤ１１ｂ^＋）におけるｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞の定量。

【図4】図４－Ｃｌｅｃ９ａ－レポーター活性化及び遺伝子発現パターンは、ｃＤＣ２指示のための因子を同定するのに驚くほど適している。（Ａ）ｃＤＣ２誘導性転写因子（ＴＦ）をスクリーニングする実験計画。ＰＵ．１、ＩＲＦ８及びＢＡＴＦ３（ＰＩＢ）の組み合わせは、Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ（Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴ）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）のｃＤＣ１様誘導細胞への初期化を誘導する。この組み合わせは、ｃＤＣの基本的ＴＦを保持し、ｃＤＣ２初期化の組み合わせを識別するように変更される。（Ｂ）ｃＤＣ１及びｃＤＣ２におけるＳｐｉ１、Ｉｒｆ８及びＢａｔｆ３の発現の比較（ＧＳＥ１５９０７）。遺伝子発現の倍数変化を括弧内に示す。（Ｃ及びＤ）ＰＵ．１＋ＢＡＴＦ３とＩＲＦファミリーの異なるメンバー（ＩＲＦ１～ＩＲＦ９）、又はＰＵ．１＋ＩＲＦ４の組み合わせでの形質導入後６日目のｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞の定量。（Ｅ）ｃＤＣ１及びｃＤＣ２におけるＩｒｆ遺伝子ファミリーの発現（ＧＳＥ１５９０７）。倍数変化を括弧内に示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．００００１、対応なしｔ検定及び一元配置ＡＮＯＶＡ。

【図5】図５－ｃＤＣ２誘導性転写因子を同定するための計画。（Ａ）ｃＤＣ２初期化の組み合わせについてのスクリーニング計画の概略図。ＰＵ．１及びＩＲＦ４を追加の個々の候補ＴＦと共に過剰発現させた。Ｃｌｅｃ９ａレポーター活性化及びｃＤＣ２表面マーカーＣＤ１１ｂの発現を初期化の６日目に評価した。（Ｂ）候補ＴＦは、ｃＤＣ１及びｐＤＣ集団と比較すると、ｃＤＣ２において高度に富化されている。ｃＤＣ１、ｃＤＣ２及びｐＤＣ集団におけるＰＵ．１、ＩＲＦ４及び３３個の候補の発現のヒートマップ（ＧＳＥ１５９０７）。

【図6】図６－ｃＤＣ２誘導性ＴＦについてのＣｌｅｃ９ａレポーターベースのスクリーニングは、ｃＤＣ２初期化の新規調節因子を同定する。個々の追加候補と組み合わせたＰＵ．１＋ＩＲＦ４でのＣｌｅｃ９ａレポーターＭＥＦの形質導入後６日目におけるフローサイトメトリー分析の代表的なプロット（Ａ）及びｔｄＴｏｍａｔｏ陽性（ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋）（Ｂ）細胞の定量（平均±ＳＤ；条件ごとに２～７反復のスクリーニングデータ及び統計）。Ｍ２ｒｔＴＡ、ＰＵ．１＋ＩＲＦ８＋ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＢＡＴＦ３で形質導入したＭＥＦを対照として含めた。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ。

【図7】図７－ｃＤＣ２誘導性ＴＦについてのＣＤ１１ｂ発現ベースのスクリーニングは、ｃＤＣ２初期化の新たな調節因子を同定する。個々の追加候補と組み合わせたＰＵ．１＋ＩＲＦ４でのＣｌｅｃ９ａレポーターＭＥＦの形質導入後６日目におけるフローサイトメトリー分析の代表的なプロット（Ａ）及びＣＤ１１ｂ＋（Ｂ）細胞の定量（平均±ＳＤ；条件ごとに２～７反復のスクリーニングデータ及び統計）。Ｍ２ｒｔＴＡ、ＰＵ．１＋ＩＲＦ８＋ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＢＡＴＦ３で形質導入したＭＥＦを対照として含めた。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ。

【図8】図８－３つの転写因子の組み合わせによるマウス線維芽細胞からのｃＤＣ２様細胞の誘導。個々の追加候補と組み合わせたＰＵ．１＋ＩＲＦ４での形質導入後６日目におけるフローサイトメトリー分析の代表的なプロット（Ａ）及び二重陽性ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋ＣＤ１１ｂ^＋（Ｂ）細胞の定量（平均±ＳＤ、条件ごとに２反復からなるスクリーニングデータ）。Ｍ２ｒｔＴＡ形質導入ＭＥＦを対照として含めた。

【図9】図９－ＰＵ．１、ＩＲＦ４及びＰＲＤＭ１は、ｃＤＣ２の初期化に十分であり、必要である。ＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＰＲＤＭ１の形質導入及び６日目の３ＴＦプールからのＴＦの個々の除去又は個々のＴＦ発現後のｔｄＴ^＋細胞（Ａ）及びｔｄＴ^＋集団内でゲーティングしたＣＤ１１ｂ^＋細胞（Ｂ）の定量（ｎ＝２、平均±ＳＤ）。Ｍ２ｒｔＴＡ形質導入ＭＥＦを対照として含めた。

【図10】図１０－ＰＵ．１、ＩＲＦ４及びＰＲＤＭ１はｃＤＣ２細胞において富化されている。（Ａ）ＤＣ集団（ｐＤＣ、ｃＤＣ１及びｃＤＣ２）におけるＳｐｉ１、Ｉｒｆ４及びＰｒｄｍ１の遺伝子発現。Ｓｐｉ１、Ｉｒｆ４及びＰｒｄｍ１はｃＤＣ２内でより多く発現し、Ｐｒｄｍ１はｃＤＣ２内で特異的により多く発現する。（Ｂ）Ｓｐｉ１、Ｉｒｆ４とＰｒｄｍ１の組み合わせは、９６のマウス組織及び細胞型の中でＣＤ８ａ－ＤＣにおいて主に富化されている。遺伝子発現データ（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０）をログ変換し、各遺伝子について０～１の範囲に正規化し、その後、Ｓｐｉ１＋Ｉｒｆ４＋Ｐｒｄｍ１について最高の平均発現を調べた。

【図11】図１１－ＰＵ．１、ＩＲＦ４及びＰＲＤＭ１は、ＣＤ４５及びＭＨＣ－ＩＩ表面発現を誘導する。６日目のＭ２ｒｔＴＡ、ＰＵ．１＋ＩＲＦ８＋ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＰＲＤＭ１形質導入ＭＥＦの（Ａ）代表的なフローサイトメトリープロット及び（Ｂ）ＭＨＣ－ＩＩ^＋細胞の定量（ｎ＝２、平均±ＳＤ）。（Ｃ）６日目のＭ２ｒｔＴＡ、ＰＵ．１＋ＩＲＦ８＋ＢＡＴＦ３及びＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＰＲＤＭ１形質導入ＭＥＦにおけるｔｄＴ^＋内のＭＨＣ－ＩＩ^＋細胞の定量（ｎ＝２、平均±ＳＤ）。（Ｄ）９日目のＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＰＲＤＭ１形質導入ＭＥＦにおけるｔｄＴ^－及びｔｄＴ^＋集団内でのＣＤ４５及びＭＨＣ－ＩＩ発現。

【図12】図１２－ＰＵ．１及びＩＲＦ４の組み合わせは、Ｃｌｅｃ９ａレポーター活性化に十分である。個々の追加の候補と組み合わせたＰＵ．１でのＣｌｅｃ９ａレポーターＭＥＦの形質導入後６日目におけるｔｄＴｏｍａｔｏ陽性（ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋）細胞の定量（平均±ＳＤ；条件ごとに２反復のスクリーニングデータ）。Ｍ２ｒｔＴＡ形質導入ＭＥＦを対照として含めた。

【図13】図１３－ＤＣ２誘導性ＴＦの組み合わせは、漸進的なＣｌｅｃ９ａレポーター活性化を誘導する。ＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＰＲＤＭ１（Ｐ＋Ｉ４＋Ｐ）とＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＩＲＦ２（Ｐ＋Ｉ４＋Ｉ２）の組み合わせに対するＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター活性化の動態。Ｍ２ｒｔＴＡ形質導入ＭＥＦを対照として含めた。

【図14】図１４－ＰＵ．１、ＩＲＦ４及びＩＲＦ２は、ＰＲＤＭ１から独立したＤＣ表現型を誘導する最小かつ十分な組み合わせである。（Ａ）ＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＩＲＦ２による形質導入及び６日目の３ＴＦプールからのＴＦの個々の除去又は個々のＴＦ発現後のｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞の定量化（ｎ＝２、平均±ＳＤ）。（Ｂ）Ｓｐｉ１、Ｉｒｆ４とＩｒｆ２の組み合わせは、９６のマウス組織及び細胞型の中でＣＤ８ａ－ＤＣにおいて主に富化されている。遺伝子発現データ（ＧｅｎｅＡｔｌａｓ ＭＯＥ４３０）をログ変換し、各遺伝子について０～１の範囲に正規化し、その後、Ｓｐｉ１＋Ｉｒｆ４＋Ｉｒｆ２について最高の平均発現を調べた。（Ｃ）初期化の６日目にＰＲＤＭ１、ＩＲＦ２又はＰＲＤＭ１＋ＩＲＦ２と組み合わせたＰＵ．１＋ＩＲＦ４での形質導入後のＴｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞の定量。（Ｄ）ｐＦＵＷ－ＴｅｔＯプラスミド（ＰＩ_４Ｉ_２ポリ）内の自己切断ペプチドＰ２Ａ及びＴ２Ａによって分離された、Ｓｐｉ１に続いてＩｒｆ４及びＩｒｆ２をコードするポリシストロニック構築物の概略図。（Ｅ）初期化の６日目にＭ２ｒｔＴＡ、個々のＰＵ．１、ＩＲＦ４及びＩＲＦ２因子（Ｐ＋Ｉ_４＋Ｉ_２）並びにＰＩ_４Ｉ_２ポリ構築物での形質導入後のＴｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞の定量。

【図15】図１５－ポリシストロニックＰＩ_４Ｐベクター（ＰＩ_４Ｐ_ポリ）は、初期化効率を向上させる。（Ａ）ｐＦＵＷ－ＴｅｔＯプラスミド（ＰＩ_４Ｐ_ポリ）に挿入された自己切断ペプチドＰ２Ａ及びＴ２Ａによって分離された、Ｓｐｉ１に続いてＩｒｆ４及びＰｒｄｍ１をコードするポリシストロニック構築物の概略図。初期化の６日目に個々のベクター（Ｐ＋Ｉ_４＋Ｐ）によってコードされるＭ２ｒｔＴＡ、ＰＵ．１、ＩＲＦ４及びＰＲＤＭ１、ポリシストロニックＰＵ．１、ＩＲＦ８とＢＡＴＦ３の組み合わせ（ＰＩ_８Ｂ_ポリ）及びポリシストロニックＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１（ＰＩ_４Ｐ_ポリ）構築物で形質導入した後のＴｄＴ^＋細胞の（Ｂ）代表的なフローサイトメトリープロット及び（Ｃ）定量（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。（Ｄ）初期化の９日目にＭ２ｒｔＴＡ、ＰＩ_８Ｂ_ポリ及びＰＩ_４Ｐ_ポリで形質導入し、ｔｄＴ^＋細胞形態を表すＭＥＦの蛍光顕微鏡による比較（白矢印）。

【図16】図１６－ＰＩＰ誘導細胞は、ＴＮＦ－α炎症誘発性サイトカインを分泌する。ＬＰＳ、ポリＩ：Ｃ（ＰｉＣ）、Ｒ８４８及びＣｐＧ ＯＤＮ１５８５による一晩のＴＬＲ刺激の前（－）又は後のＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１ポリシストロニックベクター（ＰＩ_４Ｐ_ポリ）によって誘導された初期化の９日目におけるＦＡＣＳ選別ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の上清中のＴＮＦ－α及びＩＬ－１０濃度の定量。

【図17】図１７－ＰＩＰ発現は、抗原特異的にＭＨＣ－ＩＩ分子中の抗原をＣＤ４^＋ Ｔ細胞に提示する能力を誘導する。ＯＶＡペプチド（３２３－３３９）を予め負荷した又はしていないＭＥＦ、選別したＰＩＰ－ＴｄＴ^＋細胞（９日目）及び骨髄ＤＣ（ＢＭ－ＤＣ）の異なる刺激条件：刺激なし（－）、ＬＰＳ、ＰｉＣ、Ｒ８４８及びＣｐＧ ＯＤＮ１５８５での共培養後のＯＶＡ特異的ＯＴ－ＩＩ Ｒａｇ２ＫＯ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞（ＣＤ４^＋ ＴＣＲｂ^＋）のＣＴＶ希釈の定量。

【発明を実施するための形態】

【0112】

詳細な説明
本開示は、細胞を通常型樹状細胞、特に通常型樹状細胞２型（ｃＤＣ２）に初期化するための組成物、核酸構築物、その方法及びキット、特に単離／合成転写因子を導入し、発現させることにより、分化幹細胞、多分化能幹細胞又は多能性幹細胞からｃＤＣ、特にｃＤＣ２に生成する方法の開発に関する。より特には、本開示は、特異的転写因子の組み合わせの驚くほど有益な使用を伴う直接細胞初期化によって、ｃＤＣ、特にｃＤＣ２を得るための方法を提供する。そのような組成物、核酸構築物、方法及びキットは、インビトロ、エキソビボ、又はインビボで樹状細胞を誘導するために使用することができ、これらの誘導性ＤＣ又はＡＰＣは、免疫療法用途に使用することができる。

【0113】

天然ＤＣは、全ての組織に播種される骨髄由来細胞である。ＤＣは、環境をサンプリングし、収集された情報を適応免疫系の細胞（Ｔ細胞及びＢ細胞）に伝達する態勢を整えている。抗原が飲み込まれると、ＤＣは、ペプチド主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子複合体の形態のプロセシングされた抗原をリンパ組織中のナイーブ（すなわち、抗原無経験の）Ｔ細胞に提示することによって免疫応答を開始する。活性化後、ＤＣは典型的には、多くのＴ及びＢリンパ球応答の開始並びに／又は増強に関与する様々なサイトカイン、すなわちＩ型インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２及びＩＬ－６を分泌することに加えて、共刺激性及びＭＨＣ分子を過剰発現する。そのため、ＤＣは一般に、主要組織適合性複合体クラスＩＩ分子（ＭＨＣ－ＩＩ）、ＣＤ８０／８６及びＣＤ４０などの共刺激分子、並びにインテグリンＣＤ１１ｃの高発現、並びに炎症性サイトカインを分泌し、非リンパ系からリンパ系器官に移行し、ナイーブＴ細胞を刺激するそれらの優れた能力によって識別される。マウス及びヒトでは、ＤＣの別々のサブセットは、表現型、個体発生、及び機能によって可変的に定義され得る（図１）。それらは、ＭＨＣクラスＩ上の交差提示の能力を示し、感染性病原体又は腫瘍に対するＣＴＬ応答を誘導するリンパ系器官に見られる通常型ＤＣサブセット１（ｃＤＣ１、ＣＤ８α^＋ＤＣサブセットとしても知られる）を含む。ｐＤＣは、ウイルス感染に応答して大量のＩ型インターフェロンを産生することによって作用する。一方、ｃＤＣ２は、Ｔｈ２及びＴｈ１７ Ｔ細胞応答につながるＭＨＣ－ＩＩ提示に優れている。Ｔ細胞のプライミングに加えて、ｃＤＣ２は、Ｔｒｅｇをプライミングすることによって、又は胸腺における自己反応性Ｔ細胞のネガティブ選択に寄与することによって、抗原に対する自己寛容の確立に関与している。ＣＬＥＣ９Ａとしても知られているＤＮＧＲ－１は、マウスの死細胞関連抗原に対するＣＴＬのクロスプライミングを支持する壊死細胞の受容体である。ＤＮＧＲ－１は、マウスｃＤＣ１ ＤＣ、ｃＤＣ２ ＤＣ及びｐＤＣによって高レベルで選択的に発現する。最近、Ｃｌｅｃ９ａの発現は、リンパ組織における通常型又は形質細胞様のＤＣ系統及び複数の系統並びにそれらの子孫になるＤＣ前駆体（ＣＤＰ）の識別を可能にすることが示された。

【0114】

本明細書に記載の分化細胞を誘導性ＤＣ、具体的にはｃＤＣ２に初期化することができるＤＣ誘導因子の識別の成功は、多くの方法でｃＤＣ２の生物学及び不均一性に関する発明者らの基本的な理解を深めることができる。この研究は、ｃＤＣ２転写ネットワークに関する徹底的な洞察を提供する。加えて、ＤＣ誘導因子を識別することで、ＤＣの状態がどのように確立され、重要な規制機構がどのように配置されているかを理解する前例のない機会が得られる。

【0115】

転写因子は、発生中の全ての細胞型の仕様において重要な役割を果たす。転写因子媒介性初期化を用いた直接初期化計画の成功は、多能性ＥＳ／ｉＰＳ細胞又は多分化能幹細胞の分化を、そのような因子を用いて特定の運命に誘導することも同様に妥当であることを示している。したがって、本明細書で識別されたＤＣ誘導因子を用いて、ＤＣ富化転写因子の発現によるＥＳ／ｉＰＳ細胞の最終的なＤＣ運命への指向性分化を達成することができる。さらに、本明細書で識別されたＤＣ誘導因子を用いて、ＤＣ富化転写因子の発現による多分化能造血幹細胞及び前駆細胞の最終的なＤＣ運命への指向性分化を達成することができる。

【0116】

本開示の態様は、自己抗原を提示して、寛容応答を生じさせることができる細胞を生成するためのＴＦの使用又はＴＦの組み合わせの使用である。本方法は、自己免疫障害及び過敏症障害の状況における免疫寛容原性免疫療法のための実行可能な計画を表す。

【0117】

線維芽細胞をヒト源から取得し、次いで、免疫調節目的のためにｃＤＣ２に初期化することができる（図２）。ｃＤＣ２の既知の免疫の役割によれば、これらの生成されたｃＤＣ２は、抗寄生虫免疫、細胞外病原体に対する免疫、自己免疫又は過敏症の状況における自己抗原に対する免疫寛容を促進するため、又はｃＤＣ１と組み合わせた場合には抗腫瘍免疫を促進することにも適用することができる。

【0118】

ＤＣ誘導因子をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はその構築物を、ウイルスベクターを用いて、又はウイルスベクターなしで、１回又は繰り返しトランスフェクションにより細胞に導入し、遺伝子産物の発現及び／又はＲＮＡ分子の翻訳を、本明細書に記載のｃＤＣ２に形態学的、生化学的、及び機能的に類似した細胞内で生じさせる。これらの誘導性ｃＤＣ２は、ｃＤＣ２表面マーカーＣＤ１１ｂを発現する。

【0119】

一実施形態では、細胞初期化によるｃＤＣ２誘導ＴＦ及びｃＤＣ２誘導ＴＦ組み合わせの効果をスクリーニングするために、ＤＣ特異的レポーター（Ｃｌｅｃ９ａ－Ｃｒｅ Ｘ Ｒ２６－ｓｔｏｐ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）を保有するマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用して、そこでＤＣ２誘導ＴＦを示すためにレポーターの活性化を使用した。Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｏｍａｔｏレポーターマウスにおいて、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質は、ＣＤＰ、プレＤＣ、ｃＤＣ及びｐＤＣによって排他的に発現する。培養中のマクロファージ、他の免疫系統又は単球由来ＤＣはＣｌｅｃ９ａを発現せず、したがってｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質も発現しない。Ｃｌｅｃ９ａレポーターマウスから単離した脾臓細胞を分析し、ｃＤＣ２細胞（ＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣ－ＩＩ^＋ＣＤ８ａ^－ＣＤ１１ｂ^＋でゲーティングした）の７８.９％がｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質を発現していることを確認した（図３）。

【0120】

二重トランスジェニックＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターＭＥＦを、Ｅ１３．５胚から単離し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の使用により、既に造血系統になることが決まっている可能性のある任意の混入ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋又はＣＤ４５^＋細胞から除外した。

【0121】

ｃＤＣ１様細胞への線維芽細胞の初期化が、ＰＵ．１、ＩＲＦ８とＢＡＴＦ３（ＰＩＢ）の組み合わせ過剰発現を通じて最近実証された。この組み合わせは、ｃＤＣ１、ｃＤＣ２及びｐＤＣで発現しているＣｌｅｃ９ａ－Ｃｒｅ Ｘ Ｒ２６－ｓｔｏｐ－ｔｄＴ（Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴ）マウスを用いたスクリーニングによって特定された（Ｒｏｓａら、２０１８）。この同じＤＣレポーターを用いて、報告されたＴＦの組み合わせを変更することによって、ｃＤＣ２系統を指示するｃＤＣ２転写因子を特定した（図４Ａ）。

【0122】

ｃＤＣ集団間でＳｐｉ１、Ｉｒｆ８及びＢａｔｆ３の発現を比較することにより、Ｓｐｉ１がｃＤＣ２において高発現していることが示される一方で、Ｉｒｆ８及びＢａｔｆ３は、ｃＤＣ１と比較して発現が低かった（図４Ｂ）。さらに、機能欠失の研究によると、ＰＵ．１欠失はＤＣ系統全体の仕様を損ない、ＤＣ発生が継続して必要とされることを示唆している。まとめると、これらのデータは、ｃＤＣ２初期化のためのＰＵ．１維持を支持し、ＩＲＦ８とＢＡＴＦ３を他のＴＦで置き換えることができることを示唆している。

【0123】

ＴＦのＩＲＦファミリーはＤＣ発生、成熟及び機能的役割に重要であることが知られているので（Ｇａｂｒｉｅｌｅ ＆ Ｏｚａｔｏ，２００７）、ＰＵ．１及びＢＡＴＦ３と組み合わせた他のＩＲＦタンパク質によるＩＲＦ８の置換をＣｌｅｃ９ａレポーターの活性化について試験した。ＩＲＦ４は顕著なｔｄＴ発現をもたらし（図４Ｃ）、ＩＲＦ４がＤＣ初期化においてＩＲＦ８と置き換えることができることを示唆している。ＩＲＦ４は、ｃＤＣ２発生に必要であると考えられている。一方、ＩＲＦ８とＢＡＴＦ３は、ｃＤＣ１発生にのみ重要であると考えられており、ｃＤＣ２の初期化には無視できることを示唆している。しかし、ＰＵ．１とＩＲＦ４の組み合わせ過剰発現は、顕著なＣｌｅｃ９ａレポーター活性化をもたらさなかった（０.２１％、図４Ｃ及びＤ）ことは、これら２つのＴＦがｃＤＣ２初期化を誘導するのに必要かもしれないが、十分ではないことを示唆している。また、ｃＤＣ１集団とｃＤＣ２集団の間で全てのＩｒｆ遺伝子ファミリーメンバーの発現を比較すると、Ｉｒｆ４は、ｃＤＣ２において顕著により多く発現しており（図４Ｅ）、ｃＤＣ２初期化にとっての重要性をさらに証明している。実際、ＩＲＦファミリー全体から、Ｉｒｆ４のみ（２.６倍）及びより低い程度のＩｒｆ２（１.３倍）がｃＤＣ２細胞において過剰に存在している。

【0124】

一実施形態では、ｃＤＣ２初期化ＴＦ組み合わせをスクリーニングするために、候補ＴＦをＰＵ．１及びＩＲＦ４と個々に組み合わせ、Ｃｌｅｃ９ａレポーター活性化及びｃＤＣ２表面マーカーＣＤ１１ｂの発現について評価した（図５Ａ）。

【0125】

一実施形態では、３３個のｃＤＣ２誘導候補ＴＦを、ｃＤＣ１及びｐＤＣと比較した場合にｃＤＣ２におけるそれらの特異的に富化された遺伝子発現により選択した（図５Ｂ）。これらの３３個の候補ＴＦを、ＰＵ．１及びＩＲＦ４と共に、初期化実績のあるドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性レンチウイルスベクターで個別にクローニングした。

【0126】

一実施形態では、ｃＤＣ２初期化ＴＦ組み合わせについてスクリーニングするために、候補ＴＦを、最初にＰＵ．１と個々に組み合わせ、Ｃｌｅｃ９ａレポーター活性化について評価した（図１２）。このスクリーニングから、ＰＵ．１＋ＩＲＦ４の組み合わせのみが顕著な割合のＴｄＴ^＋細胞をもたらし、この組み合わせをさらなるｃＤＣ２誘導性組み合わせのベースラインとして固めた。

【0127】

一実施形態では、候補ＴＦのスクリーニングは、ＰＲＤＭ１又はＩＲＦ２をＰＵ．１及びＩＲＦ４と組み合わせると、顕著なＣｌｅｃ９ａレポーター活性化（図６）及びｔｄＴ^＋ＣＤ１１ｂ^＋二重集団の増加（図８）が生じることを特定した。ＰＲＤＭ１をＰＵ．１及びＩＲＦ４と組み合わせても、ｃＤＣ２表面マーカーＣＤ１１ｂの発現増加が生じた。

【0128】

一実施形態では、ＰＲＤＭ１、ＲＢＰＪ、ＲＥＬＢ、ＰＯＵ２Ｆ２又はＴＧＩＦ１を、ＰＵ．１及びＩＲＦ４と組み合わせると、ｃＤＣ２表面マーカーＣＤ１１ｂの発現増加が生じる（図７）。集合的に、これらのデータは、ＰＲＤＭ１、ＲＢＰＪ、ＲＥＬＢ、ＰＯＵ２Ｆ２及びＴＧＩＦ１を、ｃＤＣ２サブセット内の固有の多様性を反映する異なるｃＤＣ２細胞状態の誘導を示す可能性がある追加のｃＤＣ２指示ＴＦとして特定する。

【0129】

一実施形態では、ＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＰＲＤＭ１が初期化のための最小ネットワークを表すかどうかを評価するために、因子の各々を、３つのＴＦプールから個々に除去した。これらの個々のＴＦの各々を除去すると、Ｃｌｅｃ９ａレポーター活性化及びＣＤ１１ｂ発現を減少させ、各ＴＦの個々の発現がｔｄＴ及びＣＤ１１ｂの低発現をもたらした（図９Ａ及びＢ）。集合的に、このデータは、Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴレポーター活性化及びＣＤ１１ｂ表面発現に十分なＴＦ組み合わせとしてＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＰＲＤＭ１を暗示する。

【0130】

Ｓｐｉ１、Ｉｒｆ４及びＰｒｄｍ１の個々の発現を比較すると、ｃＤＣ２におけるこれら３つのＴＦの全てが富化していることが明らかになり、他のＤＣ集団と比較した場合に、ＰＲＤＭ１がｃＤＣ２において最高の発現を示す（図１０Ａ）。Ｓｐｉ１、Ｉｒｆ４及びＰｒｄｍ１の組み合わせ発現も、ＣＤ８ａ^－ ＤＣと高度に関連付けられる（図１０Ｂ）。

【0131】

細胞表面マーカー発現をさらに分析すると、ＰＵ．１＋ＩＲＦ８＋ＢＡＴＦ３生成ＤＣにおける発現の１４.４３％と比較して、ＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＰＲＤＭ１形質導入細胞の１３.６２％がＭＨＣ－ＩＩを発現させた（図１１Ａ及びＢ）。ｔｄＴ^＋コンパートメント内では、ＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＰＲＤＭ１誘導細胞の３５.５８％が表面ＭＨＣ－ＩＩを発現した（図１１Ｃ）。さらに、ｔｄＴ^＋細胞の２０.１０％が表面ＭＨＣ－ＩＩとＣＤ４５を共発現させる一方で、細胞のわずか１.３６％がｔｄＴ^－コンパートメント内でＭＨＣ－ＩＩ^＋ＣＤ４５^＋であった（図１１Ｄ）。これらのデータはさらに、ＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＰＲＤＭ１が造血及びＡＰＣ表現型及び抗原提示機構の獲得を誘導することを支持する。

【0132】

ＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＩＲＦ２の組み合わせも、ＤＣ初期化におけるその役割についてさらに評価した。個々のＴＦの各々の除去はＣｌｅｃ９ａレポーター活性化消失させ、各ＴＦの個々の発現は低いＴｄＴ発現をもたらした（図１４Ａ）。Ｓｐｉ１、Ｉｒｆ４及びＩｒｆ２の組み合わせ発現も、ＣＤ８ａ－ＤＣと高度に関連付けられる（図１４Ｂ）。ＰＲＤＭ１及びＩＲＦ２をＰＵ．１及びＩＲＦ４に個別に加えると、生産的なＣｌｅｃ９ａレポーター活性化がもたらされることを考慮して、潜在的な相乗効果に対処するために、これら４つのＴＦの共発現を調査した。しかし、ＰＵ．１、ＩＲＦ４、ＩＲＦ２及びＰＲＤＭ１の過剰発現はＣｌｅｃ９ａレポーター活性化を消失させ、ＤＣ初期化におけるＰＲＤＭ１とＩＲＦ２の交差阻害的役割を示唆する（図１４Ｃ）。集合的に、このデータは、ＰＲＤＭ１から独立したＤＣ表現型を誘導するための最小かつ十分な組み合わせとしてＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＩＲＦ２を暗示し、ｃＤＣ２の異なるサブセットの誘導を示唆している。

【0133】

ＰＵ．１、ＩＲＦ４及びＰＲＤＭ１又はＰＵ．１、ＩＲＦ４及びＩＲＦ２での形質導入時に、Ｃｌｅｃ９ａレポーターの活性化は、両方の組み合わせについて２日目に検出され始める。９日目（ＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＩＲＦ２）と１０日目（ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１）の間でＴｄＴ発現がピークに達する（図１３）。

【0134】

転写因子の組み合わせをコードするポリシストロニック構築物が、初期化の効率を高めるために用いられてきた。Ｓｐｉ１に続いてＩｒｆ４及びＩｒｆ２をコードするポリシストロニック構築物（ＰＩ_４Ｉ_２ポリ）によるＭＥＦの形質導入（図１４Ｄ）は、個々の発現（Ｐ＋Ｉ_４＋Ｉ_２）と比較した場合、初期化効率の増加をもたらした（図１４Ｅ）。さらに、自己切断ペプチドＰ２Ａ及びＴ２Ａによって分離される、Ｓｐｉ１に続いてＩｒｆ４及びＰｒｄｍ１をコードするポリシストロニック構築物（ＰＩ_４Ｐ_ポリ）を生成した（図１５Ａ）。個々の発現（Ｐ＋Ｉ_４＋Ｐ）と比較すると、ＰＩ_４Ｐ_ポリは、ｃＤＣ１様初期化のための前記ポリシストロニック構築物ＰＵ．１＋ＩＲＦ８＋ＢＡＴＦ３（ＰＩ_８Ｂ_ポリ）に匹敵するパーセンテージの１２.２０％に達する初期化効率の増加をもたらした（図１５Ｂ及び１５Ｃ）。蛍光顕微鏡は、ＰＩ_８Ｂ_ポリとＰＩ_４Ｐ_ポリの両方の組み合わせから生じるｔｄＴ^＋細胞の樹状細胞形態を強調する（図１５Ｃ）。

【0135】

ＤＣの典型的な免疫調節的特徴は、サイトカインを分泌する能力による。炎症誘発性ｃＤＣ２は、ＴＬＲ刺激に応答してＴＮＦ－αを分泌すると説明されている。一方、抗炎症性ｃＤＣ２は、ＩＬ－１０の分泌によって特徴付けられ、これはさらにそれらの免疫調節機能を媒介する。選別したＰＩ_４Ｐ_ポリ生成ＴｄＴ^＋細胞のサイトカイン分泌を、ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ３（ＰｉＣ－ポリイノシン酸：ポリシチジル酸）、ＴＬＲ４（ＬＰＳ－リポ多糖）、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８（Ｒ８４８－レシキモド）及びＴＬＲ９（ＣｐＧ ＯＤＮ１５８５）の刺激時に行った。ＰＵ．１、ＩＲＦ８及びＰＲＤＭ１の過剰発現は、炎症誘発性腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）を分泌する能力を誘導し、これはＬＰＳ負荷後に２.２倍増加する（図１６）。対照的に、抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０は検出されない。これらの結果は、ＰＩ_４Ｐが細胞に炎症誘発性ＤＣ２を誘導することを示唆している。

【0136】

ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の抗原特異的増殖を促進する生成細胞の機能的能力を特徴付けるために、９日目に選別したＰＩ_４Ｐ_ポリ生成ＴｄＴ^＋細胞、ＭＥＦ及び骨髄由来ＤＣ（ＢＭ－ＤＣ）を、ＭＨＣ－ＩＩ分子の状況で提示されるオボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチド３２３－３２９に特異的なＴ細胞受容体を発現するＯＴ－ＩＩ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞と共培養した（図１６）。ＯＶＡペプチド３２３－３３９を予め負荷した場合に、ＰＩＰ誘導細胞は、１０.６７±１.１６％ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の増殖（ＣＴＶｌｏｗ）を誘導する能力を獲得した。ＬＰＳ及びＲ８４８の存在下で、ＰＩＰ誘導細胞は、ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞のわずかにより高い増殖、それぞれ１２.１４±１.３３％及び１２.２３±０.５４％を誘導する。これらのデータは、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞応答を促進する、ＭＨＣ－ＩＩ分子上に抗原をロードして提示するＰＩ_４Ｐ誘導細胞の能力を支持する（図１７）。

【0137】

ＤＣ不均一性に関する最近の更新により、異なる転写調節因子及び別々の抗炎症機能及び炎症誘発性機能によって定義されるｃＤＣ２の２つの異なるサブセットが同定された（Ｂｒｏｗｎら，２０１９）。偶然にも、この報告では、これらの新たに同定されたサブセットの各々について上位を定義するＴＦ遺伝子についての解析は、その炎症誘発性表現型によって特徴付けられるサブセットであるｃＤＣ２Ｂに関連付けられる上位ＴＦとしてＰＲＤＭ１を強調する。したがって、これらのデータは、本開示で報告されるＰＵ．１＋ＩＲＦ４＋ＰＲＤＭ１によって生成されたＤＣの炎症誘発性表現型をさらに支持し、したがってｃＤＣ２Ｂ表現型に類似している。

【0138】

いくつかの実施形態では、配列リストに提供される配列によってコードされる参照ポリペプチドと同一又は類似の活性を有するポリペプチド変異体又はファミリーメンバーは、本明細書に記載の組成物、方法、及びキットにおいて使用され得る。一般に、本明細書に記載の組成物、方法、及びキットにおいて使用するためのｃＤＣ２誘導因子をコードする特定のポリペプチドの変異体は、本明細書に記載の配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定され、当業者に公知である、その特定の参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％以上の配列同一性を有するであろう。

【0139】

一実施形態では、ヒトＰＵ．１転写因子（ＰＵ．１）、ｍＲＮＡ（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）及びコドン最適化された、又は同じアミノ酸をコードする異なるコドンが、本明細書に記載の核酸への言及によって包含されることも当然企図される。

【0140】

一実施形態では、ヒトインターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、ｍＲＮＡ（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）及びコドン最適化された、又は同じアミノ酸をコードする異なるコドンが、本明細書に記載の核酸への言及によって包含されることも当然企図される。

【0141】

一実施形態では、ヒトＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１（ＰＲＤＭ１）、ｍＲＮＡ（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）及びコドン最適化された、又は同じアミノ酸をコードする異なるコドンが、本明細書に記載の核酸への言及によって包含されることも当然企図される。

【0142】

一実施形態では、ヒトインターフェロン調節因子２（ＩＲＦ２）、ｍＲＮＡ（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）及びコドン最適化された、又は同じアミノ酸をコードする異なるコドンも、本明細書に記載の核酸への言及によって包含されることも当然企図される。

【0143】

一実施形態では、ヒトＰＯＵクラス２ホメオボックス２（ＰＯＵ２Ｆ２）、ｍＲＮＡ（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）及びコドン最適化された、又は同じアミノ酸をコードする異なるコドンが、本明細書に記載の核酸への言及によって包含されることも当然企図される。

【0144】

一実施形態では、ヒトホメオボックスタンパク質ＴＧＩＦ１（ＴＧＩＦ１）、ｍＲＮＡ（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）及びコドン最適化された、又は同じアミノ酸をコードする異なるコドンが、本明細書に記載の核酸への言及によって包含されることも当然企図される。

【0145】

一実施形態では、ヒト組み換え結合タンパク質サプレッサーオブヘアレス（ＲＢＰＪ）、ｍＲＮＡ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）及びコドン最適化された、又は同じアミノ酸をコードする異なるコドンが、本明細書に記載の核酸への言及によって包含されることも当然企図される。

【0146】

一実施形態では、ヒト転写因子ＲｅｌＢ（ＲＥＬＢ）、ｍＲＮＡ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）及びコドン最適化された、又は同じアミノ酸をコードする異なるコドンも、本明細書に記載の核酸への言及によって包含されることも当然企図される。

【0147】

本明細書に提供される組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、線維芽細胞又は造血系統細胞、多分化能幹細胞、誘導多能性幹細胞、癌又は腫瘍細胞などの出発体細胞から誘導されるｃＤＣ２を生成するために使用又は選択されるｃＤＣ２誘導因子の数は、少なくとも２個である。いくつかの実施形態では、使用又は選択されるｃＤＣ２誘導因子の数は、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又はそれ以上である。

【0148】

本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、ＰＵ．１、ＩＲＦ４、ＰＲＤＭ１、ＩＲＦ２、ＲＢＰＪ、ＲＥＬＢ、ＰＯＵ２Ｆ２及びＴＧＩＦ１などのｃＤＣ２誘導因子（複数可）をコードする核酸配列又は構築物は、標準的な分子生物学技術を用いた細胞のトランスフェクションに適切な発現ベクターに挿入又は作動可能に連結される。本明細書で使用する「ベクター」は、本明細書に記載の核酸構築物又は置換カセットなどの挿入ヌクレオチド配列に有用な生物学的又は生化学的特性を提供するｄｓＤＮＡ分子などの核酸分子を指す。例としては、プラスミド、ファージ、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、及びインビトロで若しくは宿主細胞内で複製する又は複製される、又は所望の核酸セグメントを宿主細胞内の所望の場所に伝達することができる他の配列が挙げられる。ベクターは、ベクターの本質的な生物学的機能を失うことなく決定可能な方法で配列を切断することができ、その複製及びクローニングをもたらすために核酸断片をスプライシング又は挿入することができる１以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｉ、ＩＩ又はＩＩｓ型であるか）を有することができる。ベクターはまた、２つの核酸分子間の核酸配列の交換を可能にする１以上の組換え部位を含むことができる。ベクターはさらに、例えば、ＰＣＲ用のプライマー部位、転写及び／又は翻訳開始及び／又は調節部位、組換えシグナル、レプリコン、追加の選択マーカーなどを提供することができる。ベクターは、さらに、該ベクターで形質転換された細胞の識別で使用するのに適する１以上の選択マーカーを含むことができる。

【0149】

本明細書に記載の組成物、方法、構築物、ベクター及びキットのいくつかの実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかのウイルス媒介発現方法は、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを採用し、そのような発現方法が遺伝子送達で使用され、当技術分野において周知である。

【0150】

本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスである。レトロウイルスは、遺伝子送達に便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子をベクターに挿入し、当技術分野で公知の技術を用いてレトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、インビボ又はエキソビボのいずれかで対象の標的細胞に送達することができる。多数のレトロウイルス系が記載されている。例えば、米国特許第５,２１９,７４０号；Ｍｉｌｌｅｒ及びＲｏｓｍａｎ（１９８９） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０－９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５－１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４９－５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３－３７；Ｂｏｒｉｓ－Ｌａｗｒｉｅ及びＴｅｍｉｎ （１９９３） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２－０９を参照されたい。本明細書に記載の組成物、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、レトロウイルスは複製欠損である。レトロウイルスベクターシステムは、ウイルス構造タンパク質がパッケージング細胞株においてトランスで供給されることを条件として、５'及び３'ＬＴＲ及びパッケージングシグナルを含む最小ベクターがベクターパッケージング、感染及び標的細胞への組み込みを可能にするのに十分であるという事実を利用する。遺伝子導入のためのレトロウイルスベクターの基本的な利点には、ほとんどの細胞型における効率的な感染及び遺伝子発現、標的細胞染色体ＤＮＡへの正確な単一コピーベクター組み込み、及びレトロウイルスゲノムの操作の容易さが含まれる。

【0151】

本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベースの発現ベクターである。宿主ゲノムに組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外に存続するため、挿入変異誘発に関連付けられるリスクが最小限に抑えられる（Ｈａｊ－Ａｈｍａｄ及びＧｒａｈａｍ（１９８６） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７－７４；Ｂｅｔｔら（１９９３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１－２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７－２９；Ｓｅｔｈら（１９９４） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３－４０；Ｂａｒｒら（１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１－５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６－２９；並びにＲｉｃｈら（１９９３） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１－７６）。アデノウイルスベクターは、多種多様な細胞に感染し、広い宿主範囲を有し、高効率の感染力を示し、異種遺伝子を高レベルで直接発現し、インビボでそれらの遺伝子の長期発現を達成する。このウイルスは無細胞ビリオンとして完全に感染性であるため、産生細胞株の注入は必要ではない。安全性に関しては、アデノウイルスは重篤なヒト病態と関連付けられず、ウイルス由来の組換えベクターは、ウイルスゲノムの初期領域１（「Ｅ１」）の欠失によって複製欠損にさせることができる。アデノウイルスはまた、比較的容易に大量に生成することができる。本明細書に記載の組成物、方法、及びキットにおいて使用するためのアデノウイルスベクターは、血清型２、５、１２、４０、及び４１などのアデノウイルスの４０以上の血清型株のいずれかを含むがこれらに限定されない様々なアデノウイルス血清型のいずれかに由来し得る。本明細書で使用されるアデノウイルスベクターは、好ましくは複製欠損であり、適切なプロモーターに作動可能に連結された目的のｃＤＣ２誘導因子を含有する。

【0152】

本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、ＰＵ．１、ＩＲＦ４、ＰＲＤＭ１、ＩＲＦ２、ＲＢＰＪ、ＲＥＬＢ、ＰＯＵ２Ｆ２及びＴＧＩＦ１などのｃＤＣ２誘導因子（複数可）をコードする核酸配列は、１以上の誘導性レンチウイルスベクターを用いて導入又は送達される。１以上の誘導性レンチウイルスベクターを用いて送達されるｃＤＣ２誘導因子の発現の制御は、いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの制御下で、又は誘導性プロモーターに作動可能に連結された発現ベクター中の少なくとも１つのＤＣ誘導因子を有する細胞を、調節剤（例えば、ドキシサイクリン）又は他の誘導剤と接触させることによって達成することができる。いくつかの種類の誘導性レンチウイルスベクターを使用する場合、そのような細胞と誘導剤との接触はｃＤＣ２誘導因子の発現を誘導するが、調節剤の退薬は発現を阻害する。他の種類の誘導性レンチウイルスベクターを使用する場合、調節剤の存在は発現を阻害するが、調節剤の除去は発現を可能にする。本明細書で使用する用語「発現の誘導」は、例えば、誘導剤の存在下で、又は細胞内で遺伝子の内因性発現を引き起こす１以上の薬剤又は因子の存在下での誘導可能なウイルスベクターによってコードされるｃＤＣ２誘導因子などの遺伝子の発現を指す。

【0153】

本明細書に記載の態様のいくつかの実施形態では、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性レンチウイルスシステムが使用される。レトロウイルスとは異なり、レンチウイルスは、より多様な造血細胞型の形質導入に適させる静止細胞に形質導入することができる。例えば、ｐＦＵＷ－ｔｅｔＯレンチウイルスシステムは、初代造血前駆細胞に高効率で形質導入することが示されている。

【0154】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）及びＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）などのｃＤＣ２誘導因子（複数可）をコードする核酸配列は、非組み込みベクター（例えば、アデノウイルス）を用いて導入又は送達される。レトロウイルスベクターなどの組み込みベクターは宿主細胞ゲノムに取り込まれ、正常な遺伝子機能を潜在的に破壊する可能性があるが、非組み込みベクターは染色体外転写によって遺伝子産物の発現を制御する。非組み込みベクターは宿主ゲノムの一部にならないので、非組み込みベクターは細胞集団内で核酸を一過的に発現する傾向がある。これは、非組み込みベクターが複製欠失にされる場合が多い事実に部分的に起因している。そのため、非組み込みベクターは、（１）宿主ゲノムの破壊なし、及び（２）一過性発現、及び（３）ウイルス組み込み産物の残存なしを含むがこれらに限定されない、レトロウイルスベクターを上回るいくつかの利点を有する。本明細書に記載の方法と共に使用するための非組み込みベクターのいくつかの非限定的な例としては、アデノウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、ピコルナウイルス、及びワクシニアウイルスが挙げられる。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、非組み込みウイルスベクターはアデノウイルスである。非組み込みウイルスベクターの他の利点には、高力価でそれらを生産する能力、インビボでのそれらの安定性、及び宿主細胞へのそれらの効率的な感染が含まれる。

【0155】

本明細書に記載の組成物、方法、及びキット中の誘導性ｃＤＣ２を生成する際に使用するための核酸構築物及びベクターは、さらに、いくつかの実施形態では、細胞の陽性及び陰性選択のための選択マーカーをコードする１以上の配列を含むことができる。そのような選択マーカー配列は、典型的には、核酸構築物の導入の非存在下で細胞内に通常見出されない抗生物質に対する耐性又は感受性の特性を提供することができる。選択マーカーを抗生物質などの選択剤と組み合わせて使用して、挿入された核酸構築物を発現する細胞について培養物中で選択することができる。陽性選択マーカーをコードする配列は、典型的には、抗生物質耐性をもたらし、すなわち、陽性選択マーカー配列が細胞のゲノム中に存在する場合には、細胞は抗生物質又は薬剤に対して感受性である。陰性選択マーカーをコードする配列は、典型的には、抗生物質又は薬剤に対する感受性をもたらし、すなわち、陰性選択マーカーが細胞のゲノム中に存在する場合には、細胞は抗生物質又は薬剤に対して感受性である。

【0156】

本明細書に記載の組成物、方法、及びそのキット中の誘導性ｃＤＣ２を作製する際に使用するための核酸構築物及びベクターは、いくつかの実施形態では、構築物又は他のベクターの遺伝子エレメント、例えば、当業者に公知のプロモーター、エンハンサー、ＴＡＴＡボックス、リボソーム結合部位、ＩＲＥＳの調節、発現、安定化のための他の核酸エレメントをさらに含むことができる。

【0157】

本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）及びＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）などのＤＣ誘導因子（複数可）は、内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２－００４６３４６－Ａ１号に記載の合成修飾ＲＮＡとして提供されるか、又は合成修飾ＲＮＡとして細胞に導入若しくは送達される。合成修飾ＲＮＡが本明細書に記載の方法に従って細胞を誘導性ｃＤＣ２に初期化するために使用されるそれらの実施形態では、本方法は、細胞の反復接触を伴うか、又はＤＣ誘導因子をコードする合成修飾ＲＮＡの、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、又はそれ以上のトランスフェクションなどの反復トランスフェクションを伴うことができる。

【0158】

１以上の修飾ヌクレオシドに加えて、本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットにおいて使用するための修飾ｍＲＮＡは、当業者に公知の、かつ米国特許公開第２０１２／００４６３４６Ａ１号及び同第２０１２／０２５１６１８Ａ１号、並びにＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０１９１６８に記載の任意の追加の修飾を含むことができる。そのような他の成分には、例えば、５'キャップ（例えば、１つのグアニンがＮ７メチル基及び３'－Ｏ－メチル基を含む５'－５'－三リン酸グアニン－グアニン結合を含むアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップ；グアニンがＮ７メチル化を含み、最終の５'－ヌクレオチドがＣａｐ１構造を生成する２'－Ｏ－メチルを含む、ｍＲＮＡの５'のほとんどのヌクレオチドとグアニンヌクレオチドとの間に標準的な５'－５'－三リン酸結合を作り出すことができる組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組換え２'－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素を使用して作成されたキャップ）；ポリ（Ａ）テール（例えば、３０超のヌクレオチド長、３５超のヌクレオチド長、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも４５ヌクレオチド、少なくとも５５ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも９０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、又はそれ以上のポリＡテール）；コザック配列；３'非翻訳領域（３’ＵＴＲ）；５'非翻訳領域（５’ＵＴＲ）；核酸から切り出すことができる１以上のイントロンヌクレオチド配列、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0159】

一実施形態では、本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットにおいて使用するための修飾ｍＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含むことができる。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として作用することができるか、又はｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして機能することができる。２以上の機能的リボソーム結合部位を含むｍＲＮＡは、本明細書に記載のｃＤＣ２誘導因子などの、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチド又はポリペプチドをコードすることができる（「マルチシストロニックｍＲＮＡ」）。核酸がＩＲＥＳと共に提供される場合、さらに任意選択で第２の翻訳可能領域が提供される。本開示に従って使用することができるＩＲＥＳ配列の例としては、限定されないが、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、古典的豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＷ）又はクリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。

【0160】

本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、合成修飾ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。本明細書に記載の組成物、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、合成修飾ＲＮＡ分子は、少なくとも２つの修飾ヌクレオシドを含む。

【0161】

本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、プソイドウリジン、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２’ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリエチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、及びイノシン（Ｉ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、プソイドウラシル、又はそれらの組み合わせである。

【0162】

修飾ｍＲＮＡは、分子の全長に沿って均一に修飾される必要はない。異なるヌクレオチド修飾及び／又は骨格構造は、核酸中の様々な位置に存在し得る。当業者なら、ヌクレオチド類似体又は他の修飾（複数可）を、核酸の機能が実質的に低下しないように核酸の任意の位置（複数可）に配置することができることを理解するであろう。修飾はまた、５'又は３'末端修飾であり得る。核酸は、最小で１つ及び最大で１００％修飾ヌクレオチド、又は少なくとも５０％修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％修飾ヌクレオチド、若しくは少なくとも９０％修飾ヌクレオチドなどの任意のその間のパーセンテージで含むことができる。

【0163】

いくつかの実施形態では、分子中の所与のヌクレオシドの各存在が修飾されていることが好ましいが、絶対に必要ではない（例えば、各シトシンは修飾シトシン、例えば、５－メチルシトシンであり、各ウラシルは修飾ウラシル、例えば、プソイドウラシルなどである）。例えば、修飾ｍＲＮＡは、ウラシル又はシトシンなどの修飾ピリミジンを含むことができる。いくつかの実施形態では、核酸中のウラシルの少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％が修飾ウラシルで置換される。同じヌクレオシドの異なる存在が、所与の合成修飾ＲＮＡ分子において異なる方法で修飾され得ることも企図される。修飾ウラシルは、単一の特有の構造を有する化合物によって置換することができるか、又は異なる構造（例えば、２、３、４又はそれ以上の特有の構造）を有する複数の化合物によって置換され得る。いくつかの実施形態では、核酸中のシトシンの少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％が修飾シトシンで置換されてもよい。修飾シトシンは、単一の特有の構造を有する化合物で置換することができるか、又は異なる構造（例えば、２、３、４又はそれ以上の特有の構造）を有する複数の化合物で置換することができる（例えば、５ｍＣとして修飾されたシトシンもあれば、２'－Ｏ－メチルシトシン又は他のシトシン類似体として修飾されたシトシンもある）。そのような多修飾合成ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子が合成されているときに、所望の修飾ヌクレオシドのみがｃＤＣ２誘導因子をコードする生じたＲＮＡ分子に組み込まれるように、リボヌクレオシドブレンド又は所望の修飾ヌクレオシドを全て含む混合物を用いて生成することができる。

【0164】

ある実施形態では、例えば、タンパク質産生の正確なタイミングが望まれる場合、細胞内に導入される修飾核酸を細胞内で分解することが望ましい。そのため、本明細書に記載の組成物、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、細胞内で指示される様式で作用できる分解ドメインを含む修飾核酸が本明細書に提供される。

【0165】

誘導性ｃＤＣ２は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はアミノ酸配列の形態のｃＤＣ２誘導因子の送達によって生成され得ることが理解されるが、本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、誘導性ｃＤＣ２は、例えば、１以上のｃＤＣ２誘導因子の発現を誘導する小分子又は小分子のカクテルなどの薬剤による細胞の処理などによる他の方法を用いて誘導することができる。

【0166】

本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットを用いて細胞に導入された又は細胞集団において誘導されたｃＤＣ２誘導因子の発現の検出は、例えば、ウェスタンブロット分析、免疫細胞化学、及び蛍光媒介性検出を含む当業者に公知のいくつかの技術のいずれかによって達成することができる。

【0167】

ＤＣ誘導因子の所与の組み合わせが誘導性ｃＤＣ２を生成したかどうかを区別するために、いくつかの実施形態では、表面抗原の差次的発現などの１以上のＤＣ活性又はパラメータを測定することができる。本明細書に記載の組成物、方法、及びキットを用いた誘導性ＤＣの生成により、好ましくは、例えば、ＣＤ４５、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ１１ｂ、Ｓｉｒｐａ、ＣＤ４、ＥＳＡＭ、Ｃｌｅｃ４ａ４、Ｃｌｅｃ１０ａ、Ｃｌｅｃ１２ａ及びＭｇｌ２などの内因性ｃＤＣ２に特徴的な細胞表面表現型が出現する。

【0168】

ＤＣは、その機能的挙動によって他の免疫細胞と最も確実に区別される。ｃＤＣ２表現型の機能的態様、又はサイトカインを分泌する誘導性ｃＤＣ２の能力などのｃＤＣ２活性は、当技術分野で公知の日常的な方法を用いて当業者によって容易に決定することができる。本明細書に記載の態様のいくつかの実施形態では、初期化因子を識別するための機能的アッセイを使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、サイトカイン分泌を用いて、本明細書に記載の組成物、構築物、ベクター、方法、及びキットを用いて生成される誘導性ｃＤＣ２の免疫調節特性を確認することができる。

【0169】

本明細書で使用する「細胞パラメータ」、「ＤＣパラメータ」又は「サイトカイン分泌」は、内因性若しくは天然のＤＣの測定可能な成分又は質、特に正確に測定することができる成分を指す。細胞パラメータは、細胞の表現型、機能、又は挙動に関連する任意の測定可能なパラメータであり得る。そのような細胞パラメータには、生存率の変化、細胞増殖、立体構造又は翻訳後修飾を含む受容体、タンパク質などの細胞表面決定基などの１以上のマーカー又はマーカーの組み合わせの発現、脂質、炭水化物、有機又は無機分子、核酸、例えばｍＲＮＡ、ＤＮＡ、グローバル遺伝子発現パターンなどを含むがこれらに限定されないＤＣ又はＤＣ集団の特性及びマーカーの変化が含まれる。そのような細胞パラメータは、当業者に公知の様々なアッセイのいずれかを用いて測定することができる。例えば、生存率及び細胞増殖は、トリパンブルー排除、ＣＦＳＥ希釈、及び３Ｈ－チミジン取り込みなどのアッセイによって測定することができる。タンパク質又はポリペプチドマーカーの発現は、例えば、フローサイトメトリーアッセイ、ウェスタンブロット技術、又は顕微鏡法を用いて測定することができる。遺伝子発現プロファイルは、例えば、ＲＮＡシーケンシング方法及び定量的又は半定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを用いてアッセイすることができる。細胞パラメータはまた、機能的パラメータ又は機能的活性を指すことができる。ほとんどの細胞パラメータは定量的な読み出しを提供するが、場合によっては半定量的又は定性的な結果が許容され得る。読み出し情報は、単一の決定された値を含むことができるか、又は平均、中央値又は分散などを含むことができる。特徴的には、パラメータ読み出し値の範囲は、多数の同じアッセイから各パラメータについて得ることができる。変動性が予想され、テストパラメータのセットの各々についての値の範囲は、単一の値を提供するために使用される共通の統計方法と共に標準的な統計方法を使用して取得される。

【0170】

本明細書に記載の組成物、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、さらなる因子及び薬剤を用いて、誘導性ｃＤＣ２の初期化を増強することができる。例えば、エピジェネティック経路を変更する因子及び薬剤は、誘導性ｃＤＣ２への初期化を促進するために使用することができる。

【0171】

本願に記載の組成物、方法、及びキットに従って誘導性ｃＤＣ２を生成するか又は体細胞を誘導性ｃＤＣ２に初期化するために、基本的に任意の初代体細胞型を使用することができる。そのような初代体細胞型には、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞を含む他の幹細胞型；他の多分化能幹細胞；分化が限定された（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）幹細胞；及び単能性幹細胞も含まれる。本明細書に記載の方法の様々な態様及び実施形態で有用な初代体細胞のいくつかの非限定的な例としては、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ニューロン細胞、脂肪細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、造血又は免疫細胞、肝臓細胞、脾臓細胞、肺細胞、循環血液細胞、胃腸細胞、腎臓細胞、骨髄細胞、及び膵臓細胞、並びにそれらの細胞が由来する幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、脾臓、骨髄、血液、脳、肝臓、肺、腸、胃、腸管、脂肪、筋肉、子宮、皮膚、脾臓、内分泌器官、骨などを含むがこれらに限定されない任意の体細胞組織から単離された初代細胞であり得る。用語「体細胞」はさらに、いくつかの実施形態では、培養中に増殖した初代細胞を包含するが、ただし、体細胞は不死化されていない。細胞がインビトロ条件下で維持される場合、従来の組織培養の条件及び方法が使用でき、当業者に公知である。様々な初代体細胞の単離及び培養方法は、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0172】

本明細書に記載のこれらの態様及び全てのそのような態様のいくつかの実施形態では、体細胞は線維芽細胞である。

【0173】

本明細書に記載のこれらの態様及び全てのそのような態様のいくつかの実施形態では、体細胞は造血系統細胞であり得る。

【0174】

本明細書に記載のこれらの態様及び全てのそのような態様のいくつかの実施形態では、体細胞は、癌細胞又は腫瘍細胞であり得る。

【0175】

本明細書に記載の組成物、方法、及びキットのいくつかの実施形態では、初期化されるか、又は誘導性ｃＤＣ２細胞にされる体細胞は、造血起源の細胞である。本明細書で使用する用語「造血由来細胞」、「造血由来分化細胞」、「造血系統細胞」及び「造血起源の細胞」は、多分化能造血幹細胞（ＨＳＣ）から誘導又は分化した細胞を指す。したがって、本明細書に記載の組成物、方法、及びキットと共に使用するための造血系統細胞には、多分化能、分化が限定された、及び系統制限された造血前駆細胞、顆粒球（例えば、前骨髄細胞、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血栓細胞（例えば、巨核芽細胞、血小板産生巨核球、血小板）、単球（例えば、単球、マクロファージ）、樹状細胞、及びリンパ球（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を保有するＴリンパ球、免疫グロブリンを発現し、抗体を産生するＢリンパ球又はＢ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及び先天性リンパ球）が含まれる。本明細書で使用する用語「造血前駆細胞」は、顆粒球、単球、赤血球、巨核球、及びリンパ球Ｂ細胞及びＴ細胞を含むが、これらに限定されない造血系の２以上の細胞型に分化することができる多分化能、分化が限定された、及び系統制限された造血細胞を指す。造血前駆細胞は、多分化能前駆細胞（ＭＰＰ）、共通骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）、共通リンパ系前駆細胞（ＣＬＰ）、顆粒球－単球前駆細胞（ＧＭＰ）、及び前巨核球－赤血球前駆細胞を包含する。系統制限された造血前駆細胞には、巨核球－赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、ＰｒｏＢ細胞、ＰｒｅＢ細胞、ＰｒｅＰｒｏＢ細胞、ＰｒｏＴ細胞、二重陰性Ｔ細胞、プロＮＫ細胞、プレ顆粒球／マクロファージ細胞、顆粒球／マクロファージ前駆（ＧＭＰ）細胞、及びプロマスト細胞（ＰｒｏＭＣ）が含まれる。

【0176】

本明細書に記載の組成物、方法、及びキットにおいて使用するための造血起源の細胞は、胎児組織、臍帯血、骨髄、末梢血、動員末梢血、脾臓、肝臓、胸腺、リンパなどのこれらの細胞を含むことが知られている任意の供給源から取得することができる。これらの源から得られた細胞は、本明細書に記載の誘導性ｃＤＣ２を作製するための組成物、方法、及びキットと共に使用する前に当業者に受け入れられる任意の方法を用いてエクスビボで増殖させることができる。例えば、細胞は、特定の細胞型を除去するために選別、分画、処理するか、又はそうでなければ当業者に受け入れられる任意の手順を用いて、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団を取得するために操作することができる。単核リンパ球は、例えば、米国特許第４，６９０，９１５号に記載されているような連続フローセルセパレーターを用いるリンパ球交換療法の反復によって収集されるか、又はサイトメーターを用いるフローサイトメトリー、抗体又はタンパク質コーティングビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、又は特異的タンパク質若しくは特異的種類のタンパク質の発現若しくは発現の欠如による細胞が基板上に保持される固体支持体アフィニティー分離などのＣＬＰ法のアフィニティー精製工程、又は目的の細胞型が特異的に発現する１以上の表面抗原に対する１以上の抗体を用いるバッチ精製を用いて単離され得る。造血起源の細胞は、末梢血から取得することもできる。末梢血から細胞を採取する前に、対象を、例えば顆粒球コロニー刺激因子などのサイトカインで処理して、骨髄から血液区画への細胞移動を促進し、かつ／又は目的の集団の活性化及び／若しくは増殖を促進することができる。例えば、表面タンパク質を識別するのに適する任意の方法を用いて、異種の集団起源の造血細胞を単離することができる。いくつかの実施形態では、リンパ球などの造血起源の細胞のクローン集団が得られる。いくつかの実施形態では、造血起源の細胞はクローン集団ではない。

【0177】

さらに、本明細書に記載の組成物、方法、及びキットの様々な態様及び実施形態に関して、体細胞は、任意の哺乳動物種から取得することができ、非限定的な例としては、マウス、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、又はヒト細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、体細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒト哺乳動物などの非ヒト生物由来である。

【0178】

一般的に、本明細書に記載の誘導性ｃＤＣ２を作製する方法は、造血起源の細胞などの体細胞を、利用可能で、当業者に周知の任意の培地中で培養又は増殖させることを含む。そのような培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（登録商標）（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ Ｆ１２培地（登録商標）、イーグル最小必須培地（登録商標）、Ｆ－１２Ｋ培地（登録商標）、イスコーブ改変ダルベッコ培地（登録商標）、ＲＰＭＩ－１６４０培地（登録商標）、並びにＤＣの培養及び増殖のための無血清培地が含まれるが、これらに限定されない。多くの培地はまた、ナトリウムを含有する又は含有しない低グルコース製剤として入手可能である。本明細書に記載の方法と共に使用される培地は、いくつかの実施形態では、１以上の免疫刺激性サイトカインを補充することができる。一般的に使用される成長因子には、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－３、Ｆｌｔ－３リガンド及びキットリガンドが含まれるが、これらに限定されない。加えて、好ましい実施形態では、免疫刺激性サイトカインは、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｆｌｔ－３リガンド及びキットリガンドからなる群から選択される。

【0179】

培養中の細胞は、浮遊状態、又は例えば、細胞外マトリックス成分又はフィーダー細胞上へ播種などの固体支持体への接着のいずれかで維持することができる。本明細書に記載の方法で使用される細胞は、いくつかの実施形態では、Ｉ型及びＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、「スーパーフィブロネクチン」及びフィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ポリＤ及びポリ－Ｌ－リジン、トロンボスポンジン及びビトロネクチンなどの、固体支持体へのそれらの接着を促す追加の因子を必要とし得る。いくつかの実施形態では、細胞は浮遊培養での増殖に適する。浮遊能のある宿主細胞は、一般的に、単分散であるか、又は実質的に凝集せずに緩やかな凝集体で増殖する。浮遊能のある宿主細胞には、適応又は操作を伴わない浮遊培養に適する細胞（例えば、リンパ系細胞などの造血起源の細胞）及び接着依存性細胞（例えば、上皮細胞、線維芽細胞）の改変若しくは適応によって浮遊能を有するようになった細胞が含まれる。

【0180】

本明細書に記載のこれらの態様及び全てのそのような態様のいくつかの実施形態では、単離された誘導性ｃＤＣ２は、必要とする対象に投与するための医薬として許容される担体をさらに含む。

【0181】

いくつかの態様では、ｃＤＣ２誘導組成物及び本明細書に記載の誘導性ｃＤＣ２を調製する方法を用いて、又はＤＣ誘導因子の組み合わせ、ＤＣ誘導性組成物、若しくは本明細書に記載の誘導性ｃＤＣ２を調製する方法のいずれかを用いて生成される単離された誘導性ｃＤＣ２及びその細胞クローンを用いて、癌細胞若しくは感染性病原体を排除するために抗原特異的免疫応答を誘導するか、又は自己抗原に対する免疫寛容を生じさせる治療を必要とする対象を治療する方法も本明細書に提供される。そのような治療方法において、線維芽細胞又は造血系統細胞などの体細胞を最初に対象から単離し、単離細胞は、本明細書に記載のように、それぞれ発現ベクター又は合成ｍＲＮＡを含むＤＣ誘導組成物で形質導入又はトランスフェクトすることができる。次に、ｃＤＣ２誘導因子の組み合わせ、ｃＤＣ２誘導組成物、又は本明細書に記載の誘導性ｃＤＣ２を調製する方法のいずれかを用いて生成され、単離された誘導性ｃＤＣ２を、対象への誘導性ｃＤＣ２の全身注射などを介して対象に投与することができる。

【0182】

いくつかの態様では、ｃＤＣ２誘導組成物及び本明細書に記載のｃＤＣ２誘導因子の組み合わせのいずれかを用いて、癌細胞又は感染性病原体を排除する抗原特異的免疫応答を誘導する治療を必要とする対象を治療する方法も本明細書に提供される。そのような治療方法において、癌細胞は、本明細書に記載のように、発現ベクターを含むｃＤＣ２誘導組成物で形質導入される。癌細胞を最初に対象から単離し、発現ベクターを含むｃＤＣ２誘導組成物で形質導入し、次いで、全身注射などを介して対象に投与することができる。あるいは、癌細胞は、ウイルス発現ベクターを含むｃＤＣ２誘導組成物でインサイツ又はインビボ形質導入することができる。

【0183】

本明細書に記載の組成物、方法、及びキットを用いて作製され、初期化された誘導性ｃＤＣ２を、本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態で、直接使用するか、又は免疫療法を必要とする対象に投与することができる。したがって、本明細書に記載の方法の様々な実施形態は、本明細書に記載の組成物、方法、及びキットのいずれかを用いて作製された、有効量の誘導性ｃＤＣ２又は誘導性ｃＤＣ２の集団を、細胞療法を必要とする個人又は対象に投与することを含む。投与される細胞又は細胞の集団は、自己集団であり得るか、又は１以上の異種供給源に由来するものであり得る。さらに、そのような誘導性ｃＤＣ２は、それらがリンパ節に移動し、エフェクターＴ細胞を活性化することを可能にする様式で投与することができる。

【0184】

本明細書に記載の組成物、方法、及びキットを用いて作製され、初期化された誘導性ｃＤＣ２は、本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態では、直接使用するか、又は自己免疫若しくは過敏症の障害に罹患している対象に投与することができる。したがって、本明細書に記載の方法の様々な実施形態は、本明細書に記載の組成物、方法、及びキットのいずれかを用いて作製された有効量の誘導性ｃＤＣ２又は誘導性ｃＤＣ２の集団を、細胞療法を必要とする個人又は対象に投与することを含む。投与される細胞又は細胞の集団は、自己集団であり得るか、又は１以上の異種供給源に由来するものであり得る。さらに、そのような誘導性ｃＤＣ２は、胸腺を遊走し、自己反応性Ｔ細胞の陰性選択を促進し、リンパ節に移動し、エフェクターＴ細胞を制限するか、又はＴｒｅｇ分化を促進することを可能にする方法で自己抗原を負荷し、投与することができる。

【0185】

対象に細胞を投与するための様々な手段は、当業者に公知である。そのような方法は、全身注射、例えば、ｉ．ｖ．注射、又は対象の標的部位への細胞の移植を含むことができる。細胞は、対象への注射又は移植による導入を促進する送達装置に挿入され得る。そのような送達装置は、レシピエント対象の体内に細胞及び流体を注入するためのチューブ、例えば、カテーテルを含むことができる。１つの好ましい実施形態では、チューブは、例えば、それを通して、細胞を所望の位置で対象に導入することができる針をさらに有する。様々な異なる形態での送達のための細胞を調製することができる。例えば、そのような送達装置に含まれる場合には、細胞を溶液又はゲルに浮遊させるか、又は支持マトリックスに包埋することができる。細胞は、細胞が生存可能なまま医薬として許容される担体又は希釈剤と混合することができる。

【0186】

したがって、本明細書に記載の方法によって生成された細胞は、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、リンパ腫、皮膚癌、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳癌、原発性脳癌、頭頸部癌、神経膠腫、膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド癌腫、絨毛癌、菌状息肉症、悪性高カルシウム血症、頸部過形成、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、骨形成性肉腫、原発性マクログロブリン血症、及び網膜芽細胞腫などを含むが、これらに限定されないいくつかの癌及び腫瘍を治療又は軽減するための細胞を調製するために使用することができる。

【0187】

上記に加えて、本開示の方法は、ある種の癌の素因となることが知られている病原体による感染を予防又は排除するために使用することができる。本明細書に提供される癌ワクチンにおいて使用するために特に関心のある病原体には、Ｂ型肝炎ウイルス（肝細胞癌）、Ｃ型肝炎ウイルス（肝細胞種）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）（バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌、免疫抑制個人におけるＰＴＬＤ）、ＨＴＬＶＬ（成人Ｔ細胞白血病）、発癌性ヒト乳頭腫ウイルス１６型、１８型、３３型、４５型（成人子宮頸癌）、及び細菌ヘリコバクターピロリ（Ｂ細胞胃リンパ腫）が含まれる。哺乳動物、より特にはヒトにおいて抗原として働き得る他の医学的に関連する微生物は、文献、例えば、Ｃ．Ｇ．Ａ Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ Ｔｉｎｄａｌｌ，（１９８３）に詳細に記載されている。

【0188】

上記に加えて、本開示の方法を、ウイルス感染に用いることができる。例示的なウイルス病原体には、哺乳動物、より特にはヒトに感染する感染性ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。感染性ウイルスの例としては、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ－Ｉ（ＨＴＬＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶ又はＨＴＬＶ－ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ－ＩＩＩとも呼ばれる；及びＨＩＶ－ＬＰなどの他の分離株など）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルスなどのコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（例えば、ハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；単純ヘルペスウイルス科ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；Ｐ．ｏｘｙｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、痘瘡ウイルス）；及びイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）；並びに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ型肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥のある付随体であると考えられている）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部に伝達される；クラス２＝非経口的に伝達される（すなわちＣ型肝炎）；ノーウォーク及び関連するウイルス、並びにアストロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0189】

上記に加えて、本開示の方法は、脊椎動物におけるグラム陰性及びグラム陽性細菌を標的とするために使用することができる。そのようなグラム陽性細菌には、パスツレラ属、ブドウ球菌属、及びストレプトコッカス属が含まれるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌には、大腸菌、シュードモナス属、及びサルモネラ属が含まれるが、これらに限定されない。感染性細菌の具体例としては、ヘリコバクター・ピロリ、ライム病ボレリア、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリア属（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトジェネス、化膿連鎖球菌（グループＡストレプトコッカス）、ストレプトコッカス・アガラクチア（グループＢストレプトコッカス）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）、大便連鎖球菌、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム種、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・エロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ・マルトシダ、バクテロイデス種、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバチルス・モニリフォルミス、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ、リケッチア、及びアクチノミセス・イスラエリが挙げられるが、これらに限定されない。

【0190】

上記に加えて、本開示の方法は、哺乳動物、より特にはヒトに感染する感染性真菌及び寄生虫を含むが、これらに限定されない病原体を標的とするために使用することができる。感染性真菌の例としては、クリプトコッカス・ネオホルマンス、ヒストプラズマカプスラーツム、コクシジオイデス・イミチス、ブラストマイセス・デルマチチディス、クラミジア・トラコマティス、及びカンジダ・アルビカンスが挙げられるが、これらに限定されない。

【0191】

上記に加えて、本開示の方法は、細胞内寄生虫及び偏性細胞内寄生虫などの寄生虫を標的とするために使用することができる。寄生虫の例としては、熱帯熱マラリア原虫、楕円形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、多型バベシア、クルーズトリパノソーマ、トキソプラズマ・ゴンディイ、旋毛虫、リーシュマニア・メジャー、リーシュマニア・ドノヴァニ、リーシュマニア・ブラジリエンシス、リーシュマニア・トロピカ、トリパノソーマ・ガンビエンセ、トリパノソーマ・ローデシエンセ、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ブルギア・チモリ、アスカリス・ルンブリコイデス、オンコセルカ・ボルブルス及びマンソン住血吸虫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0192】

改変した誘導性ｃＤＣ２は、１以上の標的抗原に対する将来の又は既存の免疫応答の抑制を含む寛容性応答を誘導するために使用され得る。そのため、誘導性ｃＤＣ２は、例えば、移植拒絶反応、移植片対宿主病、アレルギー、寄生虫性疾患、炎症性疾患及び自己免疫疾患を含む望ましくない免疫応答を治療又は予防するのに有用である。本開示に従って治療又は予防することができる移植拒絶反応の例としては、骨髄移植、及び心臓、肝臓、膵臓、腎臓、肺、眼、皮膚などの臓器の移植に関連付けられる拒絶反応が挙げられる。アレルギーの例としては、季節性呼吸器アレルギー、花粉症などのエアロアレルゲンに対するアレルギー；血清ＩｇＥ及び好酸球増加症を減少させることによって治療可能なアレルギー；喘息；湿疹；動物アレルギー、食物アレルギー；ラテックスアレルギー；皮膚炎；又はアレルギー性脱感作によって治療可能なアレルギーが挙げられる。本開示によって治療又は予防することができる自己免疫疾患には、例えば、乾癬、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、全身硬直症候群、甲状腺炎、シデナム舞踏病、関節リウマチ、糖尿病及び多発性硬化症が含まれる。炎症性疾患の例としては、クローン病、慢性炎症性眼疾患、慢性炎症性肺疾患及び慢性炎症性肝疾患、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、潰瘍性大腸炎、皮膚筋炎、強皮症、混合結合組織疾患、過敏性腸症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、重症筋無力症、ギランバレー症候群（抗リン脂質症候群）、原発性粘液浮腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、シェーグレン症候群、関節リウマチ、交感性眼炎、橋本病／甲状腺機能低下症、セリアック病／疱疹状皮膚炎、及び脱髄性疾患、原発性胆汁性肝硬変、混合性結合組織疾患、慢性活動性肝炎、バセドウ病／甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性特発性血小板減少性紫斑病、糖尿病性神経障害及び敗血症性ショックが挙げられる。

【0193】

医薬として許容される担体及び希釈剤には、生理食塩水、水性緩衝液、溶媒及び／又は分散媒が含まれる。そのような担体及び希釈剤の使用は、当技術分野で周知である。溶液は、好ましくは無菌の流体である。好ましくは、細胞の導入に先立って、溶液は、製造及び保存の条件下で安定であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用を通じて細菌及び真菌などの微生物の混入作用に対して保存される。

【0194】

細胞投与の様式は、例えば、静脈内注射、吸入による肺送達、局所投与、又は鼻腔内投与による比較的非侵襲的であることが好ましい。しかし、細胞投与の経路は、治療される組織に依存し、移植を含み得る。細胞送達の方法は、当業者に公知であり、本明細書に記載の方法及び組成物と共に使用することは医学の当業者によって推定され得る。

【0195】

いくつかの態様では、誘導性ｃＤＣ２を作製するためのキットであって、本明細書に記載の１以上の発現ベクター成分を含むＤＣ誘導組成物のいずれかを含むキットも本明細書に提供される。

【0196】

いくつかの態様では、本明細書に記載の誘導性ｃＤＣ２を作製する方法のための成分として本明細書に記載のｃＤＣ２誘導因子のうちの１以上を含むキットも本明細書に提供される。

【0197】

したがって、いくつかの態様では、以下の成分：（ａ）ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＩＲＦ２（配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）、ＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）、ＲＥＬＢ（配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１）から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のｃＤＣ２誘導因子をコードする１以上の発現ベクター並びに（Ｂ）パッケージ化及びその説明書を含む誘導性樹状細胞を調製するためのキットが本明細書に提供される。

【0198】

本明細書に記載のキットは、いくつかの実施形態では、ＤＣ誘導因子をコードする合成ｍＲＮＡ又は１以上の発現ベクターを混合して、又は別々のアリコートとしてさらに提供することができる。

【0199】

いくつかの実施形態では、該キットは、初期化の効率を増強する薬剤をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、該キットは、ｃＤＣ２状態に誘導された細胞を識別するための細胞型特異的マーカーを検出するための１以上の抗体又はプライマー試薬をさらに含むことができる。

【0200】

いくつかの実施形態では、該キットは、緩衝液をさらに含むことができる。いくつかのそのような実施形態では、緩衝液は、ｐＨ７.０のＲＮａｓｅ非含有ＴＥ緩衝液である。いくつかの実施形態では、該キットは、細胞培地を有する容器をさらに含む。

【0201】

本明細書に記載の全てのキットは、緩衝液、細胞培地、形質導入又はトランスフェクション培地及び／又は培地サプリメントをさらに含むことができる。好ましい実施形態では、緩衝液、細胞培地、トランスフェクション培地、及び／又は培地サプリメントは、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含まない。いくつかの実施形態では、キットに提供される合成修飾ＲＮＡは、エンドユーザが、成分を所望の濃度、例えば１００ｎｇ／μｌにするために適切な量の緩衝液又は培地を添加するような凍結乾燥粉末形態などの特定の量又は質量、例えば、２０μｇの非溶液形態であり得る。

【0202】

本明細書に記載の全てのキットは、非移植性送達装置、例えば、針、注射器、ペン装置、又は移植可能な送達装置、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば、静脈内、腹腔内、大槽内若しくは嚢内）、又はリザーバーなどの、本明細書に記載のキット成分を用いて生成される細胞の単回投与又は反復若しくは頻繁な注入を促進する装置を含むことができる。いくつかのそのような実施形態では、送達装置は、誘導性ｃＤＣ２を含む医薬組成物の単位用量を分注する機構を含むことができる。いくつかの実施形態では、該装置は、組成物を連続的に、例えば、拡散によって放出する。いくつかの実施形態では、該装置は、対象内のパラメータを監視するセンサーを含むことができる。例えば、該装置は、例えばポンプ、及び任意選択で関連付けられる電子機器を含むことができる。

【0203】

一実施形態では、誘導性ｃＤＣ２は、人の手によって、例えば、体細胞、多能性細胞、前駆細胞若しくは幹細胞の本明細書に開示される因子の少なくとも１つの遺伝子発現を変更することによって、又はこれらの細胞型のいずれか１つを、本明細書に開示される少なくとも１つのタンパク質を生成する少なくとも１つのタンパク質又はＲＮＡに曝露することによって作製される。該細胞はさらに、本明細書に開示される因子の少なくとも１つをオンにする小分子にそれらを曝露することによって作製することができる。いくつかの態様では、誘導性ｃＤＣ２を作製するために、少なくとも２、３、４、５、６つの因子が使用される。

【0204】

一実施形態では、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を以下の方法で単離及び精製した：Ｃｌｅｃ９ａＣｒｅ／Ｃｒｅ動物（Ｓｃｈｒａｍｌら、２０１３）をＲｏｓａ２６－ｓｔｏｐｆｌｏｘ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と交配させ、二重ホモ接合型Ｃｌｅｃ９ａＣｒｅ／Ｃｒｅ ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／ｔｄＴｏｍａｔｏ（Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）マウスを生成した。全ての動物を制御された温度（２３±２℃）下で飼育し、固定した１２時間の明暗サイクルに供し、食物及び水に自由にアクセスできる状態にした。

【0205】

一実施形態では、ＭＥＦの初代培養物を、Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ又はＣ５７ＢＬ／６マウスのＥ１３．５胚から単離した。頭部、胎児肝臓及び全ての内部臓器を摘出し、残りの組織を機械的に解離させた。解剖した組織を０.１２％トリプシン／０.１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（胚あたり３ｍＬ）を用いて酵素消化し、３７℃で１５分間インキュベートした。胚当たりに同じ溶液をさらに３ｍＬ添加し、続いてさらに１５分間インキュベートした。単一細胞懸濁液を取得して、０.１％ゼラチンコーティング１０ｃｍ組織培養皿中の増殖培地に播種した。細胞をコンフルエントになるまで２～３日間増殖させ、Ｔｒｙｐｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓで解離させ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で凍結させた。レンチウイルス形質導入のためのプレーティングの前に、ＭＥＦを選別して、造血能を有する細胞を表す可能性のある残留ＣＤ４５^＋及びｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞を除去した。スクリーニング及び以下の実験に使用したＭＥＦは、純度９９％を超えるｔｄＴｏｍａｔｏ－ＣＤ４５^－であり、４継代まで増殖させた。

【0206】

一実施形態では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＭＥＦは、増殖培地［１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン及び抗生物質（１０μｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）]で維持した。全ての細胞を３７℃及び５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で維持した。全ての組織培養試薬は、特に断りのない限り、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のものであった。

【0207】

一実施形態では、ウイルス形質導入及び初期化実験を以下の方法で実施した：Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦを、０.１％ゼラチンコーティング６ウェルプレート上に、ウェル当たり４０，０００細胞の密度で播種した。細胞を、８μｇ／ｍＬポリブレンを補充した増殖培地中で、１：１のＦＵＷ－ＴｅｔＯ－ＴＦ及びＦＵＷ－Ｍ２ｒｔＴＡレンチウイルス粒子の比率で一晩インキュベートした。ＴＦの組み合わせを試験する際に、個々のウイルス粒子の等しいＭＯＩを適用した。細胞を連続した日に２回形質導入し、一晩のインキュベーション後、培地を新鮮な増殖培地に交換した。２回目の形質導入後、増殖培地にドキシサイクリン（１μｇ／ｍＬ）を補充した－０日目。培地は、培養の期間中、２～３日ごとに交換した。出現したｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞を形質導入後５～９日目に分析した。

【0208】

一実施形態では、フローサイトメトリー分析を以下の方法で実施した：形質導入したＣｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦをＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで解離させ、２００μＬのＰＢＳ ５％ＦＢＳに再懸濁し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での分析前に４℃で保持した。ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ４５及びＣＤ１１ｂ細胞表面マーカー発現の分析のために、解離した細胞をＡＰＣコンジュゲートラット抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ、抗マウスＣＤ４５及び抗マウスＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とそれぞれインキュベートし、ラット血清（１／１００、ＧｅｎｅＴｅｘ）の存在下で、４℃で３０分間、ＰＢＳ ５％ＦＢＳで希釈し、非特異的結合を阻止した。細胞をＰＢＳ ５％ ＦＢＳで洗浄し、ＰＢＳ ５％ ＦＢＳに再懸濁し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６で分析した。フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ，ＬＬＣ、バージョン７.６）を用いて分析した。

【0209】

一実施形態では、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を以下の方法で実施した：Ｃｌｅｃ９ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ ＭＥＦを精製するために、細胞をＰＢＳ ５％ＦＢＳで希釈したＡＰＣ－Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と４℃で３０分間インキュベートした。続いて、ＭＥＦをＰＢＳ ５％ＦＢＳで洗浄し、ＰＢＳ ５％ＦＢＳに再懸濁し、ｔｄＴｏｍａｔｏ－ＣＤ４５－ＭＥＦをＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。

【0210】

一実施形態では、サイトカイン分泌分析を以下の方法で実施した：ＰＩ４Ｐ過剰発現によって生成したｔｄＴ^＋細胞を、初期化の９日目にＦＡＣＳ選別した。翌日、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＰｉＣ（１μｇ／ｍＬ）、Ｒ８４８（１μｇ／ｍＬ）又はＣｐＧ ＯＤＮ１５８５（０.５μＭ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を培地に添加して一晩刺激を行った。次いで、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）マウスＴｈサイトカインパネル（１３－ｐｌｅｘ）キットによる製造業者の指示に従って、さらなる分析のために培養上清を収集した。取得をＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６で行い、次いで、データをＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標） ｖ８.０ソフトウェア（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて分析した。

【0211】

一実施形態では、骨髄をＣ５７ＢＬ６マウスから単離し、骨髄由来樹状細胞を生成するために使用した。簡単に説明すると、全骨髄（ＢＭ）細胞を、乳棒及び乳鉢で粉砕することによって長骨（脛骨及び大腿骨）から採取した。細胞を、２％ＦＢＳを補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に収集し、７０μｍのセルストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で濾過した。赤血球をＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて室温で８分間溶解した。２％ＦＢＳを有するＰＢＳを５容量以上添加することによって溶解を停止した。総ＢＭ細胞をシャーレの中のＦｌｔ３ｌ（２００ｎｇ／ｍｌ）及びＧＭ－ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ完全培地に播種した（１０ｃｍプレートあたり１５×１０^６個の細胞）。５日間の培養後、５ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地を添加し、９日目に３×１０^６個の細胞を、Ｆｌｔ３ｌ及びＧＭ－ＣＳＦを有する１０ｍｌの新鮮な培地に再播種した。ＢＭ－ＤＣを培養１５日後に使用した。

【0212】

一実施形態では、抗原提示アッセイを以下の方法で実施した：ＯＴ－ＩＩマウスの脾臓を摘出し、続いてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを用いてＭＡＣＳ精製することによってＣＤ４＋Ｔ細胞を取得した。精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を５ｍＭのＣＴＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で標識し、室温で２０分間洗浄し、計数した。ＦＡＣＳ選別したｔｄＴ^＋ ＰＩＰ生成細胞、ＭＥＦ又はＢＭ－ＤＣを、事前にＯＶＡ ３２３－３３９ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）と一晩培養した。しっかり洗浄した後、２０，０００個のｔｄＴ^＋ ＰＩＰ生成細胞、ＭＥＦ又はＢＭ－ＤＣを、ＴＬＲ刺激ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＰｉＣ（１μｇ／ｍＬ）、Ｒ８４８（１μｇ／ｍＬ）又はＣｐＧ ＯＤＮ１５８５（０.５μＭ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）の存在下又は非存在下で、９６ウェルＵ底培養プレート中１００，０００個のＣＴＶ標識ＣＤ４＋ Ｔ細胞と共培養した。５日間の培養後、Ｔ細胞を収集し、染色し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）で分析した。Ｔ細胞増殖を、ライフシングルＴＣＲβ^＋ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞でゲーティングすることによって決定した。

【0213】

当業者は、日常的な実験以上のことを用いることなく、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態と等価な多くの物を認めるか、又は確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ特許請求の範囲に記載したとおりである。

【0214】

要素又は特徴の単数形が特許請求の範囲の詳述で使用される場合、複数形も含まれ、特に除外されなければその逆も同様である。例えば、用語「１つの転写因子」又は「その転写因子」は、複数形の「転写因子」又は「それらの転写因子」も含み、その逆も同様である。特許請求の範囲において、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」などの冠詞は、文脈が反対のことを示さないか、又は文脈から特に明白でない限り、１又は２以上を意味し得る。グループの１以上のメンバーを含む「又は」その間のグループのメンバーを含む特許請求又は説明は、文脈が反対のことを示さないか、又は文脈から特に明白でない限り、１、２以上、又は全てのグループメンバーが、所与の生成物若しくはプロセスに存在するか、それに用いられるか、又はそうでなければそれと関連する場合に満たされているとみなされる。本発明は、グループの正確に１つのメンバーが、所与の生成物若しくはプロセスに存在するか、それに用いられるか、又はそうでなければそれと関連する実施形態を含む。本発明はまた、グループメンバーの２以上又は全てが、所与の生成物若しくはプロセスに存在するか、それに用いられるか、又はそうでなければそれと関連する実施形態を含む。

【0215】

さらに、本発明が、１以上の請求項から、又は説明の関連部分から１以上の制限、要素、節、記述用語などが別の請求項に導入される全ての変形、組み合わせ、及び順列を包含することは理解されるべきである。例えば、別の請求項に依存する請求項はいずれも、同じ基本となる請求項に依存する任意の他の請求項に見出される１以上の制限を含むように変更することができる。

【0216】

さらに、請求項が組成物を記載する場合、特に示されない限り、又は矛盾若しくは不一致が生じることを当業者に明らかでない限り、本明細書に開示される目的のいずれかのために組成物を使用する方法が含まれ、かつ本明細書に開示される製造方法又は当技術分野で公知の他の方法のいずれかに従って組成物を製造する方法が含まれることは理解されるべきである。

【0217】

範囲が指定されている場合、端点が含まれる。さらに、文脈及び／若しくは当業者の理解から特に指示されないか、又は特に明白でない限り、範囲として表される値は、文脈が特に明確に指示しない限り、本発明の異なる実施形態で既定の範囲内の任意の特定の値を、範囲の下限の単位の１０分の１まで仮定することができる。また、文脈及び／若しくは当業者の理解から特に指示されないか、又は特に明白でない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意の部分範囲を仮定することができ、部分範囲のエンドポイントは、範囲の下限の単位の１０分の１と同じ程度の精度まで表されることも理解されるべきである。

【0218】

本開示は、記載の実施形態に何ら限定されるものではなく、当業者はその変更に対する多くの可能性を予見するであろう。

【0219】

上記の実施形態は、組み合わせ可能である。

【0220】

以下の特許請求の範囲は、本開示の特定の実施形態をさらに詳しく説明する。

【0221】

実施例
この組成物中の記載の誘導細胞及び真正なＤＣサブセットとのそれらの類似性をさらに特徴付けるために、集団レベルでｍＲＮＡシーケンシングを行うことができる。集団ＲＮＡ－ｓｅｑは、通常、以下の方法で行われる：全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬で抽出し、ｃＤＮＡを特定のＲＮＡキット（例えば、Ｔａｋａｒａ ＳＭＡＲＴＳｅｑ Ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ ｋｉｔ）によって生成し、さらに増幅する。次いで、得られたｃＤＮＡを、適切な試薬（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ ｋｉｔ）を用いて分析する。得られたライブラリー調製に続いて、ｃＤＮＡタグメンテーション、ＰＣＲによるフォワード及びリバースインデックスの付加、及び適切な装置（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００）にて配列決定する。次いで、得られたデータを、差次的発現解析、ＤＣ２特異的遺伝子濃縮について解析し、既存の公開データセットと統合することができる。あるいは、単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）が、本明細書に記載の生成細胞の表現型及び細胞状態のより良い定義に理想的な個々の細胞の発現プロファイルを提供することによってこの分析を補完する可能性がある。

参考文献
Brown, C. C., Gudjonson, H., Pritykin, Y., Deep, D., Lavalle’ e, V. P., Mendoza, A., Fromme, R., Mazutis, L., Ariyan, C., Leslie, C., Pe'er, D., & Rudensky, A. Y. (2019). Transcriptional Basis of Mouse and Human Dendritic Cell Heterogeneity. Cell, 179(4), 846－863.e24. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.09.035
Datta, J., Terhune, J. H., Lowenfeld, L., Cintolo, J. A., Xu, S., Roses, R. E., & Czerniecki, B. J. (2014). Optimizing dendritic cellbased approaches for cancer immunotherapy. The Yale Journal of Biology and Medicine, 87(4), 491－518. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25506283
Gabriele, L., & Ozato, K. (2007). The role of the interferon regulatory factor (IRF) family in dendritic cell development and function. Cytokine & Growth Factor Reviews, 18(5－6), 503－510. https://doi.org/10.1016/j.cytogfr.2007.06.008
Kopf, M., Gros, G. Le, Bachmann, M., Lamers, M. C., Bluethmann, H., & Koehler, G. (1993). Disruption of the murine IL－4 gene blocks Th2 cytokine responses. Nature, 362(6417), 245－248. https://doi.org/10.1038/362245a0
Laoui, D., Keirsse, J., Morias, Y., Van Overmeire, E., Geeraerts, X., Elkrim, Y., … Van Ginderachter, J. A. (2016). The tumour microenvironment harbours ontogenically distinct dendritic cell populations with opposing effects on tumour immunity. Nature Communications, 7, 13720. https://doi.org/10.1038/ncomms13720
Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., & Mortha, A. (2013). The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual Review of Immunology, 31, 563－604. https://doi.org/10.1146/annurev－immunol－020711－074950
Mosmann, T. R., & Coffman, R. L. (1989). TH1 and TH2 Cells: Different Patterns of Lymphokine Secretion Lead to Different Functional Properties. Annual Review of Immunology, 7(1), 145－173. https://doi.org/10.1146/annurev.iy.07.040189.001045
Pereira, C. －F., Chang, B., Gomes, A., Bernitz, J., Papatsenko, D., Niu, X., … Moore, K. A. (2016). Hematopoietic Reprogramming In Vitro Informs In Vivo Identification of Hemogenic Precursors to Definitive Hematopoietic Stem Cells. Developmental Cell, 36(5), 525－539. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2016.02.011
Pereira, C. －F., Chang, B., Qiu, J., Niu, X., Papatsenko, D., Hendry, C. E., … Moore, K. (2013). Induction of a Hemogenic Program in Mouse Fibroblasts. Cell Stem Cell, 13(2), 205－218. https://doi.org/10.1016/j.stem.2013.05.024
Pereira, C. －F., Lemischka, I. R., & Moore, K. (2012). Reprogramming cell fates: insights from combinatorial approaches. Annals of the New York Academy of Sciences, 1266(1), 7－17. https://doi.org/10.1111/j.1749－6632.2012.06508.x
Plantinga, M., Guilliams, M., Vanheerswynghels, M., Deswarte, K., Branco－Madeira, F., Toussaint, W., … Lambrecht, B. N. (2013). Conventional and Monocyte－Derived CD11b+ Dendritic Cells Initiate and Maintain T Helper 2 Cel－Mediated Immunity to House Dust Mite Allergen. Immunity, 38(2), 322－335. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2012.10.016
Rosa, F. F., Pires, C. F., Kurochkin, I., Ferreira, A. G., Gomes, A. M., Palma, L. G., … Pereira, C. －F. (2018). Direct reprogramming of fibroblasts into antigen－presenting dendritic cells. Science Immunology, 3(30), eaau4292. https://doi.org/10.1126/sciimmunol.aau4292
Sakaguchi, S. (2004). N aturally A rising CD4 + R egulatory T C ells for I mmunologic S elf －T olerance and N egative C ontrol of I mmune R esponses. Annual Review of Immunology, 22(1), 531－562. https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.21.120601.141122
Schraml, B. U., van Blijswijk, J., Zelenay, S., Whitney, P. G., Filby, A., Acton, S. E., … Reis e Sousa, C. (2013). Genetic tracing via DNGR－1 expression history defines dendritic cells as a hematopoietic lineage. Cell, 154(4), 843－858. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.07.014
Subklewe, M., Geiger, C., Lichtenegger, F. S., Javorovic, M., Kvalheim, G., Schendel, D. J., & Bigalke, I. (2014). New generation dendritic cell vaccine for immunotherapy of acute myeloid leukemia. Cancer Immunology, Immunotherapy：CII, 63(10), 1093－1103. https://doi.org/10.1007/s00262－014－1600－5
Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., & Yamanaka, S. (2007). Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell, 131(5), 861－872. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.11.019
Takahashi, K., & Yamanaka, S. (2006). Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell, 126(4), 663－676. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.07.024
Weaver, C. T., Harrington, L. E., Mangan, P. R., Gavrieli, M., & Murphy, K. M. (2006). Th17: An Effector CD4 T Cell Lineage with Regulatory T Cell Ties. Immunity, 24(6), 677－688. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2006.06.002
Xie, H., Ye, M., Feng, R., & Graf, T. (2004). Stepwise reprogramming of B cells into macrophages. Cell, 117(5), 663－676. https://doi.org/10.1016/s0092－8674(04)00419－2
Xu, J., Du, Y., & Deng, H. (2015). Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell, 16(2), 119－134. https://doi.org/10.1016/j.stem.2015.01.013
Zhu, J., & Paul, W. E. (2008). CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood, 112(5), 1557－1569. https://doi.org/10.1182/blood－2008－05－078154

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16】

【図17】

【配列表】

2023506707000001.app

【手続補正書】

【提出日】2021-12-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも３つの転写因子の組み合わせをコードする構築物又はベクターであって、前記コードされる転写因子の組み合わせが
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＯＵ２Ｆ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＴＧＩＦ１；及び
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＢＰＪ
からなる群から選択され、前記転写因子が、（ＰＵ．１）配列番号３又は配列番号６、（ＩＲＦ４）配列番号９又は配列番号１２、（ＰＲＤＭ１）配列番号１５、配列番号１８、（ＰＯＵ２Ｆ２）配列番号２７、配列番号３０、（ＴＧＩＦ１）配列番号３３、配列番号３６、及び（ＲＢＰＪ）配列番号４５、配列番号４８の配列と少なくとも９０％同一である構築物又はベクター。

【請求項2】

前記コードされる転写因子の組み合わせが、以下の５'から３'の配列順：
ＰＵ．１、ＩＲＦ４及びＰＲＤＭ１にある、請求項１に記載の構築物又はベクター。

【請求項3】

前記ベクターが、ウイルスベクター、特にレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１～２のいずれか一項に記載の構築物又はベクター。

【請求項4】

前記ベクター又は構築物が、合成ｍＲＮＡ、ネイキッドアルファウイルスＲＮＡレプリコン又はネイキッドフラビウイルスＲＮＡレプリコンである、請求項１～２のいずれか一項に記載の構築物又はベクター。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載の１以上のベクターを含む組成物。

【請求項6】

前記転写因子が個々に以下の配列：ＰＵ．１（配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５）、ＩＲＦ４（配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）、ＰＲＤＭ１（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７）、ＰＯＵ２Ｆ２（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９）、ＴＧＩＦ１（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５）及びＲＢＰＪ（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７）と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記コードされる転写因子の組み合わせが、以下の組み合わせ：
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＯＵ２Ｆ２；
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＴＧＩＦ１；及び
ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＲＢＰＪ
から選択される、請求項５～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記コードされる転写因子の組み合わせが、ＰＵ．１、ＩＲＦ４とＰＲＤＭ１である、請求項５～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記１以上のベクターが、ウイルスベクター、特にレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス又はアデノ随伴ウイルスのベクターである、請求項５～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記１以上のベクター又は構築物が、合成ｍＲＮＡ、ネイキッドアルファウイルスＲＮＡレプリコン又はネイキッドフラビウイルスＲＮＡレプリコンである、請求項５～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記細胞が、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、分化細胞、腫瘍細胞、癌細胞及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５～１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

獣医学又はヒト医学において使用するための、請求項５～１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

癌、感染症又は自己免疫疾患の治療において使用するための、請求項５～１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

幹細胞又は分化細胞を通常型樹状細胞２型に初期化又は誘導するインビトロ又はエキソビボ方法であって、以下の工程：
前記第１及び第２の転写因子がＰＵ．１及びＩＲＦ４であり、前記第３の転写因子がＰＲＤＭ１、ＰＯＵ２Ｆ２、ＴＧＩＦ１及びＲＢＰＪからなる群から選択される少なくとも３つの転写因子をコードする１以上のベクターで、幹細胞又は分化細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される細胞を形質導入する工程；
前記形質導入細胞を樹状細胞又は抗原提示細胞の増殖を支持する細胞培地中で培養する工程、
を含む方法。

【請求項15】

前記形質導入細胞を少なくとも２日間、好ましくは少なくとも５日間、より好ましくは少なくとも８日間、さらにより好ましくは少なくとも９日間、より好ましくは少なくとも１０日間培養する、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記細胞が、哺乳動物細胞、非ヒト細胞又はヒト細胞、マウス細胞、ヒト若しくはマウス線維芽細胞、哺乳動物の臍帯血幹細胞、多能性幹細胞又は多分化能幹細胞、分化細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択され、前記多能性幹細胞、多分化能幹細胞、又は分化細胞が、内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、又は外胚葉由来細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、腸幹細胞、多能性幹細胞を含む多分化能幹細胞及び細胞株からなる群から選択される、請求項１４～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記形質導入工程が、ＩＬ－１２をコードする核酸配列；ＩＬ－４をコードする核酸配列；ＩＦＮ－αをコードする核酸配列；ＩＦＮ－βをコードする核酸配列；ＩＦＮ－γをコードする核酸配列；ＴＮＦをコードする核酸配列；ＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸配列；ＩＬ－１０ ＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡをコードする核酸配列、及びそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種のベクターをさらに含み、好ましくは免疫刺激性サイトカインをコードする核酸を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

請求項１～４のいずれか一項に記載の構築物若しくはベクター、又は請求項５～１１に記載の組成物を含む誘導樹状細胞。

【請求項19】

治療有効量の請求項１８に記載の誘導樹状細胞、又はそれらの混合物を含み、さらに、医薬として許容される賦形剤、好ましくは抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法剤、抗生物質、利尿剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、若しくは滑剤又はそれらの混合物を含む組成物。

【請求項20】

獣医学又はヒト医学において使用するための、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

癌、感染症又は自己免疫疾患の治療において使用するための、請求項１９に記載の組成物。

【請求項22】

請求項１９～２１のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１８に記載の誘導樹状細胞、又はそれらの混合物を含む、癌用のワクチン又は注射用製剤、特にインサイツ注射剤。

【請求項23】

以下の成分：
請求項１８に記載の誘導樹状細胞；
請求項１９～２１のいずれか一項に記載の組成物；
請求項１～４のいずれか一項に記載のベクター若しくは構築物；
請求項５～１１のいずれか一項に記載の組成物
又はそれらの混合物
のうちの少なくとも１つを含むキット。

【手続補正書】

【提出日】2022-08-19

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2023506707000001.app

【国際調査報告】