特表 2023-506721 賦形剤の高速液体クロマトグラフィー定量法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-20

(54)【発明の名称】賦形剤の高速液体クロマトグラフィー定量法

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20230213BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20230213BHJP

   G01N 30/86 20060101ALI20230213BHJP

   G01N 30/74 20060101ALI20230213BHJP

   G01N 30/64 20060101ALI20230213BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20230213BHJP

   G01N 30/34 20060101ALI20230213BHJP

【ＦＩ】

G01N30/88 N

B01J20/281 X

G01N30/88 H

G01N30/86 J

G01N30/74 Z

G01N30/64 Z

G01N30/26 A

G01N30/34 E

G01N30/26 E

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022532729

(86)(22)【出願日】2020-12-15

(85)【翻訳文提出日】2022-06-01

(86)【国際出願番号】 US2020065162

(87)【国際公開番号】W WO2021126882

(87)【国際公開日】2021-06-24

(31)【優先権主張番号】62/948,357

(32)【優先日】2019-12-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507154181

【氏名又は名称】シージェン インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】リュウ ジン

(72)【発明者】

【氏名】ブリックマン イーサン タイラー

(72)【発明者】

【氏名】コーディー ルーク デイビッド ムニアー

(57)【要約】

本発明は、単一のアッセイにおいて、サンプルにおける２つ以上のバッファーまたは賦形剤を分離し、任意で定量するための分析方法を提供する。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単一のアッセイにおいて、２つ以上のバッファーまたは賦形剤を分析的に分離するための方法であって、
前記２つ以上のバッファーまたは賦形剤を分離するために、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムで、前記２つ以上のバッファーまたは賦形剤を含む試験サンプルについてクロマトグラフィーを実施すること；
ＨＰＬＣカラム流出物における前記２つ以上の分離されたバッファーまたは賦形剤を検出すること；及び
前記分離された２つ以上のバッファーまたは賦形剤に対応するピークを有するクロマトグラムを生成すること
を含む、前記方法。

【請求項2】

前記２つ以上のバッファーまたは賦形剤が、２－ヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン、スクロース、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ヒスチジン、トレハロース、及びマンニトールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記２つ以上のバッファーまたは賦形剤が、糖または糖ベースの分子である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記２つ以上のバッファーまたは賦形剤が、糖である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記２つ以上のバッファーまたは賦形剤が、２－ヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン、スクロース、トレハロース、及びマンニトールからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

同じＨＰＬＣカラムで実行された、前記２つ以上の賦形剤についての標準キャリブレーションクロマトグラフィーデータを得ること；及び
前記クロマトグラムから前記２つ以上のバッファーまたは賦形剤の積分されたピーク面積を決定し、前記得られた標準キャリブレーションクロマトグラフィーデータに基づいて、前記積分された面積を濃度または量に変換することによって、前記試験サンプルにおける前記２つ以上のバッファーまたは賦形剤の濃度または量を計算すること
をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記変換が、前記標準キャリブレーションクロマトグラフィーデータに対する線形回帰フィットを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記２つ以上のバッファーまたは賦形剤が、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を使用して検出される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＥＬＳＤが、４０～７０℃の蒸発温度、３０～７０ｐｓｉの圧力、０．５～２のゲイン、及び０．５～１に設定されたフィルターに設定される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記２つ以上のバッファーまたは賦形剤が、荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）を使用して検出される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記ＣＡＤが、２５～３５℃の蒸発温度、４～６Ｈｚの周波数、４～６秒に設定されたフィルター、ＨＰＬＣの実行の最初の３分の２について１．７８に設定されたパワーファンクション、及び前記ＨＰＬＣの実行の最後の３分の１について１．６８に設定されたパワーファンクションに設定される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＨＰＬＣが、移動相Ａ及び移動相Ｂを使用して実行される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

移動相Ａが、１００％Ｈ_２Ｏ、Ｈ_２Ｏ中のギ酸、及びＨ_２Ｏ中のトリフルオロ酢酸からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

移動相Ａが、Ｈ_２Ｏ中の０．５％ギ酸及びＨ_２Ｏ中の０．０５％トリフルオロ酢酸からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

移動相Ｂが、アセトニトリルを含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

移動相Ｂが、１００％アセトニトリルである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

クロマトグラフィーを実施することが、０．１ｍｌ／分～１．０ｍｌ／分の速度で前記ＨＰＬＣカラムを通る１００％移動相Ａのフローを有する平衡化工程を含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記平衡化工程の流速が、０．２５ｍｌ／分である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記平衡化工程の流速が、０．５ｍｌ／分である、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記平衡化工程が、０．５分～１０分である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記平衡化工程が、３．０分である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記平衡化工程が、４．０分である、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

クロマトグラフィーを実施することが、前記ＨＰＬＣカラムを通る６０％移動相Ａ及び４０％移動相Ｂのグラジエント変化工程フローを含む、請求項１２～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

クロマトグラフィーを実施することが、前記ＨＰＬＣカラムを通る４０％移動相Ａ及び６０％移動相Ｂのグラジエント変化工程フローを含む、請求項１２～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

クロマトグラフィーを実施することが、前記ＨＰＬＣカラムを通る１００％移動相Ａのグラジエント変化工程フローを含む、請求項１２～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記グラジエント変化工程の流速が、０．１ｍｌ／分～１．０ｍｌ／分である、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記グラジエント変化工程の流速が、０．２５ｍｌ／分である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記グラジエント変化工程の流速が、０．５ｍｌ／分である、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

前記グラジエント変化工程が、０．５分～１０分である、請求項２３～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記グラジエント変化工程が、０．５分である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記グラジエント変化工程が、２．０分である、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記グラジエント変化工程が、４．０分である、請求項２９に記載の方法。

【請求項33】

クロマトグラフィーを実施することが、前記ＨＰＬＣカラムを通る４０％移動相Ａ及び６０％移動相Ｂの維持工程フローを含む、請求項１２～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

クロマトグラフィーを実施することが、前記ＨＰＬＣカラムを通る１００％移動相Ａの維持工程フローを含む、請求項１２～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記維持工程の流速が、０．１ｍｌ／分～１．０ｍｌ／分である、請求項３３または３４に記載の方法。

【請求項36】

前記維持工程の流速が、０．５ｍｌ／分である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記維持工程の流速が、１．０ｍｌ／分である、請求項３５に記載の方法。

【請求項38】

前記維持工程が、０．５分～１０分である、請求項３３～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記維持工程が、２．５分である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記維持工程が、４．０分である、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

クロマトグラフィーを実施することが、０．１ｍｌ／分～１．０ｍｌ／分の速度で前記ＨＰＬＣカラムを通る１００％移動相Ａのフローを有する再平衡化工程を含む、請求項１２～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記再平衡化工程の流速が、０．２５ｍｌ／分である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記再平衡化工程が、０．５分～１０分である、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項44】

前記再平衡化工程が、３．０分である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

クロマトグラフィーを実施することが、
（ｉ）０．２５ｍｌ／分の流速で３．０分間の１００％移動相Ａでの平衡化；
（ｉｉ）０．２５ｍｌ／分の流速で０．５分間の６０％移動相Ａ及び４０％移動相Ｂへのグラジエント変化；
（ｉｉｉ）１．０ｍｌ／分の流速で４．０分間の４０％移動相Ａ及び６０％移動相Ｂへのグラジエント変化；
（ｉｖ）１．０ｍｌ／分の流速で２．５分間の４０％移動相Ａ及び６０％移動相Ｂでの維持；
（ｖ）１．０ｍｌ／分の流速で２分間の１００％移動相Ａへのグラジエント変化；ならびに
（ｖｉ）０．２５ｍｌ／分の流速で３．０分間の１００％移動相Ａでの再平衡化
を含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

クロマトグラフィーを実施することが、
（ｉ）０．５ｍｌ／分の流速で４．０分間の１００％移動相Ａでの平衡化；
（ｉｉ）０．５ｍｌ／分の流速で２．０分間の４０％移動相Ａ及び６０％移動相Ｂへのグラジエント変化；
（ｉｉｉ）０．５ｍｌ／分の流速で２．０分間の１００％移動相Ａへのグラジエント変化；ならびに
（ｉｖ）０．５ｍｌ／分の流速で４分間の１００％移動相Ａでの維持
を含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

クロマトグラフィーを実施することが、
（ｉ）０．５ｍｌ／分の流速で４．０分間の１００％移動相Ａでの平衡化；
（ｉｉ）０．５ｍｌ／分の流速で２．０分間の４０％移動相Ａ及び６０％移動相Ｂへのグラジエント変化；
（ｉｉｉ）０．５ｍｌ／分の流速で２．０分間の１００％移動相Ａへのグラジエント変化；ならびに
（ｉｖ）０．５ｍｌ／分の流速で４分間の１００％移動相Ａでの維持
を含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

１μｌ～１００μｌの前記試験サンプルが前記ＨＰＬＣカラムに注入される、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

１０μｌの前記試験サンプルが前記ＨＰＬＣカラムに注入される、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

４μｌの前記試験サンプルが前記ＨＰＬＣカラムに注入される、請求項４８に記載の方法。

【請求項51】

前記ＰＦＰ ＨＰＬＣカラムが、２．６μｍ １５０×４．６ｍｍカラムである、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月１６日に出願された米国仮特許出願番号６２／９４８，３５７の利益及び優先権を主張し、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

背景
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、液体サンプル成分の分離及び定量のために一般的に使用される分析方法である。ＨＰＬＣカラムから溶出したサンプル成分は、検出セルを通過し、紫外線検出、質量分析、屈折率検出、蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）、荷電化粒子検出（ＣＡＤ）、及び凝縮核形成（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）光散乱検出（ＣＮＬＳＤ）を含むがこれらに限定されない任意の１つまたは複数の方法を使用して検出される。

【0003】

薬学的製剤は、複数の生理的に許容可能な賦形剤及び／または担体と組み合わせて１つまたは複数の活性成分を慣用的に含む。これらの賦形剤及び／または担体は、安定化、希釈または増量の改善、吸収の促進、粘度の低下、及び／または活性成分の溶解性の向上に寄与し得る。前臨床及び臨床的研究はしばしば、薬学的製剤調製物の物理化学的特性の分析を必要とし、これには、それに使用される賦形剤及び／または担体の定量が常に含まれる。構成要素の賦形剤の物理化学的特性は広く異なり得るので、異なる固定相が充填された多重カラムを使用するＨＰＬＣによる多重分析が頻繁に用いられる。

【0004】

改善された方法が単一の固定相カラムを使用して単一のＨＰＬＣの実行において２つ以上の賦形剤を分解及び検出することができるように、異なる物理化学的特性を有する薬学的製剤における２つ以上の賦形剤を分離、検出、及び定量する改善された方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

本発明は概して、単一のＨＰＬＣアッセイにおいて２つ以上のバッファーまたは賦形剤を分析的に分離し、任意で定量するための方法に関する。

【0006】

一態様では、本発明の方法は、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムで、２つ以上のバッファーまたは賦形剤を含む試験サンプルについてクロマトグラフィーを実施して、２つ以上のバッファーまたは賦形剤を分離すること；ＨＰＬＣカラム流出物における２つ以上の分離されたバッファーまたは賦形剤を検出すること；及び分離された２つ以上のバッファーまたは賦形剤に対応するピークを有するクロマトグラムを生成することを含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、試験サンプルに存在する２つ以上のバッファーまたは賦形剤は、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ヒスチジン、及び糖または糖ベースの分子から選択される。例えば、いくつかの実施形態では、糖または糖ベースの分子は、２－ヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン（ｈｐβＣＤ）、スクロース、トレハロース、及びマンニトールから選択される。

【0008】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、同じＨＰＬＣカラムで実行された、２つ以上の賦形剤についての標準キャリブレーションクロマトグラフィーデータを得ること；及びクロマトグラムから２つ以上のバッファーまたは賦形剤の積分されたピーク面積を決定し、得られた標準キャリブレーションクロマトグラフィーデータに基づいて、積分された面積を濃度または量に変換することによって、試験サンプルにおける２つ以上のバッファーまたは賦形剤の濃度または量を計算することをさらに含む。所定の実施形態では、変換は、標準キャリブレーションクロマトグラフィーデータに対する線形回帰フィットを含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、試験サンプルにおける２つ以上のバッファーまたは賦形剤は、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を使用して検出される。所定の実施形態では、ＥＬＳＤは、４０～７０℃の蒸発温度、３０～７０ｐｓｉの圧力、０．５～２のゲイン、及び０．５～１に設定されたフィルターに設定される。

【0010】

他の実施形態では、試験サンプルにおける２つ以上のバッファーまたは賦形剤は、荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）を使用して検出される。所定の実施形態では、ＣＡＤは、２５～３５℃の蒸発温度、４～６Ｈｚの周波数、４～６秒に設定されたフィルター、ＨＰＬＣの実行の最初の３分の２について１．７８に設定されたパワーファンクション、及びＨＰＬＣの実行の最後の３分の１について１．６８に設定されたパワーファンクションに設定される。

【0011】

本発明のいくつかの実施形態では、ＨＰＬＣは、２つの移動相：移動相Ａ及び移動相Ｂを使用して実行される。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、１００％Ｈ_２Ｏである。他の実施形態では、移動相Ａは、Ｈ_２Ｏ及びギ酸を含む。さらに他の実施形態では、移動相Ａは、Ｈ_２Ｏ、及びトリフルオロ酢酸を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、アセトニトリルを含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、移動相Ａは、Ｈ_２Ｏ及び０．５％ギ酸である。他の実施形態では、移動相Ａは、Ｈ_２Ｏ及び０．０５％トリフルオロ酢酸を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、１００％アセトニトリルである。

【0013】

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーを実施することは、０．１ｍｌ／分～１．０ｍｌ／分の速度でＨＰＬＣカラムを通る１００％移動相Ａのフローを有する平衡化工程を含む。いくつかの実施形態では、平衡化工程の流速は、０．２５ｍｌ／分または０．５ｍｌ／分である。いくつかの実施形態では、平衡化工程は、０．５分～１０分である。所定の実施形態では、平衡化工程は、３．０分または４．０分である。

【0014】

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーを実施することは、ＨＰＬＣカラムを通る６０％移動相Ａ及び４０％移動相Ｂのグラジエント変化フローを含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーを実施することは、ＨＰＬＣカラムを通る４０％移動相Ａ及び６０％移動相Ｂのグラジエント変化フローを含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーを実施することは、ＨＰＬＣカラムを通る１００％移動相Ａのグラジエント変化フローを含む。いくつかの実施形態では、グラジエント変化の流速は、０．１ｍｌ／分～１．０ｍｌ／分である。所定の実施形態では、グラジエント変化の流速は、０．２５ｍｌ／分または０．５ｍｌ／分である。いくつかの実施形態では、グラジエント変化は、０．５分～１０分である。所定の実施形態では、グラジエント変化は、０．５分、２．０分、または４．０分である。

【0015】

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーを実施することは、ＨＰＬＣカラムを通る４０％移動相Ａ及び６０％移動相Ｂの維持工程フローを含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーを実施することは、ＨＰＬＣカラムを通る１００％移動相Ａの維持工程フローを含む。いくつかの実施形態では、維持工程の流速は、０．１ｍｌ／分～１．０ｍｌ／分である。所定の実施形態では、維持工程の流速は、０．５ｍｌ／分または１．０ｍｌ／分である。いくつかの実施形態では、維持工程は、０．５分～１０分である。所定の実施形態では、維持工程は、２．５分または４．０分である。

【0016】

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーを実施することは、０．１ｍｌ／分～１．０ｍｌ／分の速度でＨＰＬＣカラムを通る１００％移動相Ａのフローを有する再平衡化工程を含む。所定の実施形態では、再平衡化の流速は、０．２５ｍｌ／分または０．５ｍｌ／分である。いくつかの実施形態では、再平衡化工程は、０．５分～１０分である。所定の実施形態では、再平衡化工程は、３．０分である。

【0017】

本発明のいくつかの実施形態では、クロマトグラフィーを実施することは、（ｉ）０．２５ｍｌ／分の流速で３．０分間の１００％移動相Ａでの平衡化；（ｉｉ）０．２５ｍｌ／分の流速で０．５分間の６０％移動相Ａ及び４０％移動相Ｂへのグラジエント変化；（ｉｉｉ）１．０ｍｌ／分の流速で４．０分間の４０％移動相Ａ及び６０％移動相Ｂへのグラジエント変化；（ｉｖ）１．０ｍｌ／分の流速で２．５分間の４０％移動相Ａ及び６０％移動相Ｂでの維持；（ｖ）１．０ｍｌ／分の流速で２分間の１００％移動相Ａへのグラジエント変化；及び（ｖｉ）０．２５ｍｌ／分の流速で３．０分間の１００％移動相Ａでの再平衡化を含む。

【0018】

本発明の他の実施形態では、クロマトグラフィーを実施することは、（ｉ）０．５ｍｌ／分の流速で４．０分間の１００％移動相Ａでの平衡化；（ｉｉ）０．５ｍｌ／分の流速で２．０分間の４０％移動相Ａ及び６０％移動相Ｂへのグラジエント変化；（ｉｉｉ）０．５ｍｌ／分の流速で２．０分間の１００％移動相Ａへのグラジエント変化；及び（ｉｖ）０．５ｍｌ／分の流速で４分間の１００％移動相Ａでの維持を含む。

【0019】

本発明の他の実施形態では、クロマトグラフィーを実施することは、（ｉ）０．５ｍｌ／分の流速で４．０分間の１００％移動相Ａでの平衡化；（ｉｉ）０．５ｍｌ／分の流速で２．０分間の４０％移動相Ａ及び６０％移動相Ｂへのグラジエント変化；（ｉｉｉ）０．５ｍｌ／分の流速で２．０分間の１００％移動相Ａへのグラジエント変化；及び（ｉｖ）０．５ｍｌ／分の流速で４分間の１００％移動相Ａでの維持を含む。

【0020】

本発明のいくつかの実施形態では、１μｌ～１００μｌの試験サンプルがＨＰＬＣカラムに注入される。所定の実施形態では、１０μｌまたは４μｌの試験サンプルがＨＰＬＣカラムに注入される。

【0021】

本発明の所定の実施形態では、ＰＦＰ ＨＰＬＣカラムは、２．６μｍ １５０×４．６ｍｍカラムである。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１Ａは、Ｃ１８カラムで分解されたヒスチジン、スクロース及びマンニトールを含む製剤バッファーのクロマトグラムを示している。図１Ｂは、Ｃ１８カラムでクロマトグラフィーがされたトリス、スクロース、及びヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（ｈｐβＣＤ）を含む製剤バッファーのクロマトグラムを示している。

【図2】図２Ａは、陰イオン交換カラムでクロマトグラフィーされたヒスチジン、スクロース及びマンニトールを含む製剤バッファーのクロマトグラムを示している。図２Ｂは、陰イオン交換カラムで分解されたトリス、スクロース、及びｈｐβＣＤを含む製剤バッファーのクロマトグラムを示している。

【図3】ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）カラムで分解されたｈｐβＣＤ及びスクロースを含む製剤バッファーのクロマトグラムを示している。

【図4】ＰＦＰカラムで分解されたトリスを含む製剤バッファーのクロマトグラムを示している。

【図5】ＰＦＰカラムで分解されたリン酸ナトリウム（Ａ）、クエン酸ナトリウム（Ｂ）、リン酸カリウム（Ｃ）、ヒスチジン（Ｄ）、及びトレハロース（Ｅ）を含む製剤バッファーのクロマトグラムを示している。

【図6】ＰＦＰカラムで分解されたマンニトール、スクロース及びヒスチジンを含む製剤バッファーのクロマトグラムを示している。

【発明を実施するための形態】

【0023】

詳細な説明
本明細書では、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムを使用する単一のアッセイにおいて、サンプルにおける２つ以上のバッファーまたは賦形剤を分析的に分離し、任意で定量するための方法が開示される。この方法は、サンプルにおける２つ以上のバッファーまたは賦形剤を分解するその能力について、当該技術分野で知られている従来の方法が、溶媒干渉及び／または準最適なカラム保持時間及びピーク形状のため、分解することができないであろうという点で有利である。

【0024】

本発明の理解を容易化するために、多数の用語及び語句が以下に定義される。

【0025】

「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という用語は、本明細書で使用される場合、「１つ以上」を意味し、文脈が適切でない限り複数を含む。

【0026】

「約」という用語は、本明細書で使用される場合、記述された量またはそれに近い値を意味する。例えば、「約」は、±５％以下、例えば、±２％以下、例えば、±１％以下、例えば、±０．５％以下、例えば、±０．２％以下、例えば、±０．１％以下、または例えば、±０．０５％以下を指し得る。

【0027】

「分析物」という用語は、本明細書で使用される場合、同定及び／または測定されている物質または化学的構成要素を意味する。

【0028】

「標準キャリブレーションサンプルのシリーズ」という用語は、本明細書で使用される場合、２つ以上のサンプルであって、各サンプルが分析物の異なる既知の濃度を有し、異なるサンプルの濃度の範囲が試験サンプルにおける分析物の予測される濃度を包含し、またはそれに近い、２つ以上のサンプルを意味する。

【0029】

「キャリブレーション曲線」という用語は、本明細書で使用される場合、標準キャリブレーションサンプルのシリーズを含むサンプルの各々の既知の濃度についてＨＰＬＣ装置によって検出及び測定された分析物シグナルに基づくプロットを意味する。

【0030】

「線形回帰フィット」という用語は、本明細書で使用される場合、直線をプロットする数学的アルゴリズムであって、シグナルデータのセットがその直線から最小の測定値を有するものを意味する。線形回帰フィットから得られるプロットは、傾き、ｙ切片、及びシグナルデータが直線にどのくらい良好にフィットするかの指標である決定係数を有する。

【0031】

「積分ピーク面積」という用語は、本明細書で使用される場合、試験サンプルにおける分析物の検出された分析物シグナルに対応するクロマトグラフィーピーク下の定量された面積を意味する。

【0032】

「移動相」という用語は、本明細書で使用される場合、クロマトグラフィー装置を通って流れる液体または気体を意味し、その液体または気体は、固定相にわたって異なる速度でサンプルにおける１つまたは複数の分析物を移動させる。

【0033】

パーセント（または％）という用語は、移動相の記載に関連して使用される場合、文脈が別段明らかに示さない限り、体積パーセンテージとして表される。

【0034】

「固定相」という用語は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の分析物が分離され、または選択的に吸着されるクロマトグラフィー装置内の固体または液体を意味する。

【0035】

バッファー及び賦形剤
本発明は、単一のアッセイにおいて、サンプルにおける２つ以上のバッファーまたは賦形剤を定量するための分析方法を提供する。いくつかの実施形態では、サンプルは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に記載される有効量の活性成分で製剤化された２つ以上のバッファーまたは賦形剤を含む薬学的組成物であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、２つ以上のバッファーまたは賦形剤は、限定されないが、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロース、フルクトース、マルトース、セロビオース、ラクトース、デオキシリボース、ヘキソース）；糖ベースの分子（例えば、マンニトール、ソルビトール、エチレングリコール、グリセロール、エリスリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、ガラクチロール、フシトール、イジトール、イノシトール、ボレミトール、ラクチトール、イソマルト、マルチトール、マルトトリイトール、及びポリグリシトール）；シクロデキストリン（例えば、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（ｈｐβＣＤ）、及びスルホブチルエーテルβシクロデキストリン）；脂質（例えば、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、マルガリン酸（１７：０）、ヘプタデセン酸（１７：１）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、リノレン酸（１８：３）、オクタデカテトラエン酸（１８：４）、アラキジン酸（２０：０）、エイコセン酸（２０：１）、エイコサジエン酸（２０：２）、エイコサテトラエン酸（２０：４）、エイコサペンタエン酸（２０：５）（ＥＰＡ）、ドコサン酸（２２：０）、ドコセン酸（２２：１）、ドコサペンタエン酸（２２：５）、ドコサヘキサエン酸（２２：６）（ＤＨＡ）、及びテトラコサン酸（２４：０））；鉱物（例えば、塩化物、ナトリウム、カルシウム、鉄、クロム、銅、ヨウ素、亜鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、及びセレン）；ビタミン（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＤ、ビタミンＢ６、葉酸、ピリドキシン、チアミン、パントテン酸、及びビオチン）；緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ヒスチジン、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、及び重炭酸カルシウム）；防腐剤（例えば、アルファ－トコフェロール、アスコルビン酸塩、パラベン、クロロブタノール、及びフェノール）；結合剤（例えば、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ_１２－Ｃ_１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、サッカリド、オリゴ糖）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、水素化植物油、ステロテックス（ｓｔｅｒｏｔｅｘ）、ポリオキシエチレンモノステアレート、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、及び軽油）；分散剤（例えば、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファスシリケート、及び微結晶性セルロース）；崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルファ化及びその改変デンプン、甘味料、粘土、例えば、ベントナイト、微結晶性セルロース、アルギネート、デンプングリコール酸ナトリウム、ゴム、例えば、寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチン、トラガカント、クエン酸と組み合わされた重炭酸ナトリウム、及び酒石酸と組み合わされた重炭酸ナトリウム）；香味剤；甘味料；ならびに着色剤から選択され得る。

【0036】

所定の実施形態では、本発明の分析方法は、スクロース、ｈｐβＣＤ、スクロース、マンニトール、ヒスチジン、スルホブチルエーテルβ－シクロデキストリン、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸カリウム、トレハロース、及びトリスから選択される２つ以上のバッファーまたは賦形剤を定量する。

【0037】

ＨＰＬＣ
本発明の分析方法は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムで２つ以上のバッファーまたは賦形剤を分解することによって、試験サンプルにおける２つ以上のバッファーまたは賦形剤を定量する。例えば、所定の実施形態では、ＨＰＬＣカラムは、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）カラムである。

【0038】

いくつかの実施形態では、ＰＦＰカラムは、低い背圧でサンプル分析物の高速で高分解能の分離を容易化し得る。いくつかの実施形態では、ＰＦＰカラムは、約０．８μｍ～約８．０μｍの直径を有する粒子で充填され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＦＰカラムは、約１．７μｍ、約２．６μｍ、または約５．０μｍの直径を有する粒子で充填され得る。いくつかの実施形態では、ＰＦＰカラムは、約２．４μｍ～約２．６μｍの直径を有する粒子で充填され得る。所定の実施形態では、ＰＦＰカラムは、約２．６μｍの直径を有する粒子で充填され得る。

【0039】

いくつかの実施形態では、ＰＦＰカラムの粒子は、約６０Å～約１２５Åの孔径を有し得る。いくつかの実施形態では、ＰＦＰカラムの粒子は、約８２Å～約１０２Åの孔径を有し得る。特定の実施形態では、ＰＦＰカラムは、約１００Åの孔径を有し得る。

【0040】

本明細書で使用される場合、「サイズ分布」は、粒子径分布の相対的指標を指す。例えば、総サイズ分布の１０％における粒子径及び総サイズ分布の９０％における粒子径の比が、粒子サイズ分布の相対的指標として使用され得る。この比が１の値に近いほど、粒子径分布が均一となる。いくつかの実施形態では、ＰＦＰカラムの粒子は、約１．５以下のサイズ分布を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＦＰカラムの粒子は、約１．４以下、約１．３以下、または約１．２以下のサイズ分布を有し得る。

【0041】

いくつかの実施形態では、ＰＦＰカラムは、約２．０ｍｍ～約５．０ｍｍの直径を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＦＰカラムは、約２．１ｍｍ、約３ｍｍ、または約４．６ｍｍの直径を有し得る。

【0042】

いくつかの実施形態では、ＰＦＰカラムは、約１０ｍｍ～約１５０ｍｍの長さを有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＦＰカラムは、約１０ｍｍ、約３０ｍｍ、約５０ｍｍ、約１００ｍｍ、または約１５０ｍｍの長さを有し得る。

【0043】

本発明のいくつかの実施形態では、２つ以上のバッファーまたは賦形剤は、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を使用して検出される。ＥＬＳＤは、レーザービームを使用して、光電子増倍管に散乱した反射光を測定するものであり、粒子のサイズ／質量が大きいほど、光散乱の程度は大きくなる。

【0044】

いくつかの実施形態では、ＥＬＳＤは、約１０℃～約１００℃の蒸発温度に設定される。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＬＳＤは、約２０℃～約１００℃、約３０℃～約１００℃、約４０℃～約１００℃、約５０℃～約１００℃、約１０℃～約９０℃、約２０℃～約９０℃、約３０℃～約９０℃、約４０℃～約９０℃、約５０℃～約９０℃、約１０℃～約８０℃、約２０℃～約８０℃、約３０℃～約８０℃、約４０℃～約８０℃、約５０℃～約８０℃、約１０℃～約７０℃、約２０℃～約７０℃、約３０℃～約７０℃、約４０℃～約７０℃、約５０℃～約７０℃、約１０℃～約６０℃、約２０℃～約６０℃、約３０℃～約６０℃、約４０℃～約６０℃、または約５０℃～約６０℃の蒸発温度に設定される。所定の実施形態では、ＥＬＳＤは、約５０℃の蒸発温度に設定される。

【0045】

いくつかの実施形態では、ＥＬＳＤは、約１０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉの圧力に設定される。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＬＳＤは、約２０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉの圧力に設定される。所定の実施形態では、ＥＬＳＤは、約５０ｐｓｉの圧力に設定される。

【0046】

いくつかの実施形態では、ＥＬＳＤは、０．１～５のゲインに設定される。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＬＳＤは、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５のゲインに設定される。

【0047】

いくつかの実施形態では、ＥＬＳＤは、０．１～１．０に設定されたフィルターを有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＬＳＤは、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、または１．０に設定されたフィルターを有する。

【0048】

いくつかの実施形態では、ＥＬＳＤは、約１０℃～約１００℃の蒸発温度に設定される。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＬＳＤは、約１５℃～約１００℃、約２０℃～約１００℃、約２５℃～約１００℃、約３０℃～約１００℃、約３５℃～約１００℃、約４０℃～約１００℃、約４５℃～約１００℃、約５０℃～約１００℃、約５５℃～約１００℃、約１０℃～約９０℃、約１５℃～約９０℃、約２０℃～約９０℃、約２５℃～約９０℃、約３０℃～約９０℃、約３５℃～約９０℃、約４０℃～約９０℃、約４５℃～約９０℃、約５０℃～約９０℃、約５５℃～約９０℃、約１０℃～約８０℃、約１５℃～約８０℃、約２０℃～約８０℃、約２５℃～約８０℃、約３０℃～約８０℃、約３５℃～約８０℃、約４０℃～約８０℃、約４５℃～約８０℃、約５０℃～約８０℃、約５５℃～約８０℃、約１０℃～約７０℃、約１５℃～約７０℃、約２０℃～約７０℃、約２５℃～約７０℃、約３０℃～約７０℃、約３５℃～約７０℃、約４０℃～約７０℃、約４５℃～約７０℃、約５０℃～約７０℃、約５５℃～約７０℃、約１０℃～約６０℃、約１５℃～約６０℃、約２０℃～約６０℃、約２５℃～約６０℃、約３０℃～約６０℃、約３５℃～約６０℃、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約６０℃、約５０℃～約６０℃、または約５５℃～約６０℃の蒸発温度に設定される。

【0049】

他の実施形態では、２つ以上のバッファーまたは賦形剤は、荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）を使用して検出される。ＣＡＤは、高電圧コロナニードルを使用して窒素ガスを荷電し、これを分析物粒子と衝突させて荷電粒子を生成する。

【0050】

いくつかの実施形態では、ＣＡＤは、約１Ｈｚ～約１０Ｈｚの周波数に設定される。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＡＤは、約２Ｈｚ～約１０Ｈｚ、約３Ｈｚ～約１０Ｈｚ、約４Ｈｚ～約１０Ｈｚ、約５Ｈｚ～約１０Ｈｚ、約６Ｈｚ～約１０Ｈｚ、約７Ｈｚ～約１０Ｈｚ、約８Ｈｚ～約１０Ｈｚ、約８Ｈｚ～約１０Ｈｚ、約１Ｈｚ～約９Ｈｚ、約２Ｈｚ～約９Ｈｚ、約３Ｈｚ～約９Ｈｚ、約４Ｈｚ～約９Ｈｚ、約５Ｈｚ～約９Ｈｚ、約６Ｈｚ～約９Ｈｚ、約７Ｈｚ～約９Ｈｚ、約８Ｈｚ～約９Ｈｚ、約１Ｈｚ～約８Ｈｚ、約２Ｈｚ～約８Ｈｚ、約３Ｈｚ～約８Ｈｚ、約４Ｈｚ～約８Ｈｚ、約５Ｈｚ～約８Ｈｚ、約６Ｈｚ～約８Ｈｚ、約７Ｈｚ～約８Ｈｚ、約１Ｈｚ～約７Ｈｚ、約２Ｈｚ～約７Ｈｚ、約３Ｈｚ～約７Ｈｚ、約４Ｈｚ～約７Ｈｚ、約５Ｈｚ～約７Ｈｚ、約６Ｈｚ～約７Ｈｚ、約１Ｈｚ～約６Ｈｚ、約２Ｈｚ～約６Ｈｚ、約３Ｈｚ～約６Ｈｚ、約４Ｈｚ～約６Ｈｚ、または約５Ｈｚ～約６Ｈｚの周波数に設定される。

【0051】

いくつかの実施形態では、ＣＡＤは、約１秒～約１０秒に設定されたフィルターを有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＡＤは、約２秒～約１０秒、約３秒～約１０秒、約４秒～約１０秒、約５秒～約１０秒、約６秒～約１０秒、約７秒～約１０秒、約８秒～約１０秒、約８秒～約１０秒、約１秒～約９秒、約２秒～約９秒、約３秒～約９秒、約４秒～約９秒、約５秒～約９秒、約６秒～約９秒、約７秒～約９秒、約８秒～約９秒、約１秒～約８秒、約２秒～約８秒、約３秒～約８秒、約４秒～約８秒、約５秒～約８秒、約６秒～約８秒、約７秒～約８秒、約１秒～約７秒、約２秒～約７秒、約３秒～約７秒、約４秒～約７秒、約５秒～約７秒、約６秒～約７秒、約１秒～約６秒、約２秒～約６秒、約３秒～約６秒、約４秒～約６秒、または約５秒～約６秒に設定されたフィルターを有する。

【0052】

いくつかの実施形態では、ＣＡＤは、約１．０～約２．０に設定されたパワーファンクションを有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＡＤは、約１．１～約２．０、約１．２～約２．０、約１．３～約２．０、約１．４～約２．０、約１．５～約２．０、約１．６～約２．０、約１．０～約１．９、約１．１～約１．９、約１．２～約１．９、約１．３～約１．９、約１．４～約１．９、約１．５～約１．９、約１．６～約１．９、約１．１～約１．８、約１．２～約１．８、約１．３～約１．８、約１．４～約１．８、約１．５～約１．８、または約１．６～約１．８に設定されたパワーファンクションを有する。所定の実施形態では、ＣＡＤは、約１．７８に設定されたパワーファンクションを有する。所定の実施形態では、ＣＡＤは、約１．６８に設定されたパワーファンクションを有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＤは、ＨＰＬＣの実行の最後の３分の１についてのパワーファンクションとは異なるＨＰＬＣの実行の最初の３分の２についてのパワーファンクションに設定されるパワーファンクションを有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＡＤは、ＨＰＬＣの実行の最初の３分の２について、１．７１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、または１．８０に設定されたパワーファンクション、及びＨＰＬＣの実行の最後の３分の１について、１．６０、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、または１．７０に設定されたパワーファンクションを有する。所定の実施形態では、ＣＡＤは、ＨＰＬＣの実行の最初の３分の２について１．７８に設定されたパワーファンクション、及びＨＰＬＣの実行の最後の３分の１について１．６８に設定されたパワーファンクションを有する。

【0053】

さらに他の実施形態では、２つ以上のバッファーまたは賦形剤は、凝縮核形成光散乱検出器（ＣＮＬＳＤ）を使用して検出される。ＣＮＬＳＤは、水凝縮を使用して分析物の粒子サイズを増大させてから、光電子増倍管に散乱した反射光を測定するためのレーザービームを粒子に適用する。

【0054】

いくつかの実施形態では、ＣＮＬＳＤは、約１０℃～約１００℃の蒸発温度に設定される。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＮＬＳＤは、約２０℃～約１００℃、約３０℃～約１００℃、約４０℃～約１００℃、約５０℃～約１００℃、約１０℃～約９０℃、約２０℃～約９０℃、約３０℃～約９０℃、約４０℃～約９０℃、約５０℃～約９０℃、約１０℃～約８０℃、約２０℃～約８０℃、約３０℃～約８０℃、約４０℃～約８０℃、約５０℃～約８０℃、約１０℃～約７０℃、約２０℃～約７０℃、約３０℃～約７０℃、約４０℃～約７０℃、約５０℃～約７０℃、約１０℃～約６０℃、約２０℃～約６０℃、約３０℃～約６０℃、約４０℃～約６０℃、または約５０℃～約６０℃の蒸発温度に設定される。所定の実施形態では、ＣＮＬＳＤは、約５０℃の蒸発温度に設定される。

【0055】

いくつかの実施形態では、ＣＮＬＳＤは、約１０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉの圧力に設定される。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＮＬＳＤは、約２０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約１００ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約８０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約７０ｐｓｉ、約１０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約２０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約３０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約４０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ～約６０ｐｓｉの圧力に設定される。所定の実施形態では、ＣＮＬＳＤは、約５０ｐｓｉの圧力に設定される。

【0056】

いくつかの実施形態では、ＣＮＬＳＤは、０．１～５のゲインに設定される。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＮＬＳＤは、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５のゲインに設定される。

【0057】

いくつかの実施形態では、ＣＮＬＳＤは、０．１～１．０に設定されたフィルターを有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＮＬＳＤは、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、または１．０に設定されたフィルターを有する。

【0058】

いくつかの実施形態では、本発明の分析方法は、１００％Ｈ_２Ｏ、Ｈ_２Ｏ中の０．５％ギ酸、Ｈ_２Ｏ中の０．０５％トリフルオロ酢酸、及び１００％アセトニトリルから選択される移動相を使用してＨＰＬＣによって試験サンプルにおける２つ以上のバッファーまたは賦形剤を定量する。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣ法は、複数の移動相：例えば、１、２、３、４、５、７、８、９、または１０種の移動相を使用する。所定の実施形態では、ＨＰＬＣ法は、２つの移動相：移動相Ａ及び移動相Ｂを使用する。所定の実施形態では、移動相Ａは、１００％Ｈ_２Ｏ、Ｈ_２Ｏ中のギ酸、Ｈ_２Ｏ中のトリフルオロ酢酸、またはそれらの組み合わせから選択され、移動相Ｂは、アセトニトリルを含む。いくつかの実施形態では、ギ酸濃度は、約０．５％～約５％、例えば、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．５％、約２．０％、約２．５％、約３．０％、約３．５％、約４．０％、約４．５％、または約５％である。いくつかの実施形態では、トリフルオロ酢酸濃度は、約０．０５％～約０．５％、例えば、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、または約０．５％である。

【0059】

いくつかの実施形態では、試験サンプルは、約１μｌ～約５０μｌの量でＨＰＬＣカラムに注入される。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣ注入量は、約１μｌ～約４５μｌ、約１μｌ～約４０μｌ、約１μｌ～約３５μｌ、約１μｌ～約３０μｌ、約１μｌ～約２５μｌ、約１μｌ～約２０μｌ、約１μｌ～約１５μｌ、約１μｌ～約１０μｌ、約５μｌ～約５０μｌ、約５μｌ～約４５μｌ、約５μｌ～約４０μｌ、約５μｌ～約３５μｌ、約５μｌ～約３０μｌ、約５μｌ～約２５μｌ、約５μｌ～約２０μｌ、約５μｌ～約１５μｌ、約５μｌ～約１０μｌ、約１０μｌ～約５０μｌ、約１０μｌ～約４５μｌ、約１０μｌ～約４０μｌ、約１０μｌ～約３５μｌ、約１０μｌ～約３０μｌ、約１０μｌ～約２５μｌ、約１０μｌ～約２０μｌ、約１０μｌ～約１５μｌ、約１５μｌ～約５０μｌ、約１５μｌ～約４５μｌ、約１５μｌ～約４０μｌ、約１５μｌ～約３５μｌ、約１５μｌ～約３０μｌ、約１５μｌ～約２５μｌ、約１５μｌ～約２０μｌ、約２０μｌ～約５０μｌ、約２０μｌ～約４５μｌ、約２０μｌ～約４０μｌ、約２０μｌ～約３５μｌ、約２０μｌ～約３０μｌ、約２０μｌ～約２５μｌ、約２５μｌ～約５０μｌ、約２５μｌ～約４５μｌ、約２５μｌ～約４０μｌ、約２５μｌ～約３５μｌ、約２５μｌ～約３０μｌ、約３０μｌ～約５０μｌ、約３０μｌ～約４５μｌ、約３０μｌ～約４０μｌ、約３０μｌ～約３５μｌ、約３５μｌ～約５０μｌ、約３５μｌ～約４５μｌ、約３５μｌ～約４０μｌ、約４０μｌ～約５０μｌ、約４０μｌ～約４５μｌ、または約４５μｌ～約５０μｌである。所定の実施形態では、注入量は、１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、または１０μｌである。

【0060】

いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣ分析は、１つまたは複数の工程を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣ分析は、１、２、３、４、５、６、６、８、９、または１０工程を含む。いくつかの実施形態では、各工程は、約１．０分～約１０分の継続期間である。例えば、いくつかの実施形態では、各工程は、約１．５分～約１０分、約２分～約１０分、約２．５分～約１０分、約３分～約１０分、約３．５分～約１０分、約４分～約１０分、約４．５分～約１０分、約５分～約１０分、約５．５分～約１０分、約６分～約１０分、約６．５分～約１０分、約７分～約１０分、約７．５分～約１０分、約８分～約１０分、約８．５分～約１０分、約９分～約１０分、約９．５分～約１０分、約１．０分～約９分，約１．５分～約９分、約２分～約９分、約２．５分～約９分、約３分～約９分、約３．５分～約９分、約４分～約９分、約４．５分～約９分、約５分～約９分、約５．５分～約９分、約６分～約９分、約６．５分～約９分、約７分～約９分、約７．５分～約９分、約８分～約９分、約８．５分～約９分、約１．０分～約８分、約１．５分～約８分、約２分～約８分、約２．５分～約８分、約３分～約８分、約３．５分～約８分、約４分～約８分、約４．５分～約８分、約５分～約８分、約５．５分～約８分、約６分～約８分、約６．５分～約８分、約７分～約８分、約７．５分～約８分、約１．０分～約７分、約１．５分～約７分、約２分～約７分、約２．５分～約７分、約３分～約７分、約３．５分～約７分、約４分～約７分、約４．５分～約７分、約５分～約７分、約５．５分～約７分、約６分～約７分、約６．５分～約７分、約１．０分～約６分、約１．５分～約６分、約２分～約６分、約２．５分～約６分、約３分～約６分、約３．５分～約６分、約４分～約６分、約４．５分～約６分、約５分～約６分、約５．５分～約６分、約１．０分～約４分、約１．５分～約４分、約２分～約４分、約２．５分～約４分、約３分～約４分、約３．５分～約４分、約１．０分～約３分、約１．５分～約３分、約２分～約３分、約２．５分～約３分、約１．０分～約２分、または約１．５分～約２分の継続期間である。

【0061】

いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣ分析の各工程は、約０．１ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分の流速を有する。例えば、いくつかの実施形態では、各工程は、約０．２５ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分、０．５ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分、０．７５ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分、約１．０ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分、約１．２５ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分、約１．５ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分、約２．０ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分、約２．５ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分、約３．０ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分、約３．５ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分、約４．０ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分、約４．５ｍｌ／分～約５．０ｍｌ／分、約０．１ｍｌ／分～約４．０ｍｌ／分、約０．２５ｍｌ／分～約４．０ｍｌ／分、０．５ｍｌ／分～約４．０ｍｌ／分、０．７５ｍｌ／分～約４．０ｍｌ／分、約１．０ｍｌ／分～約４．０ｍｌ／分、約１．２５ｍｌ／分～約４．０ｍｌ／分、約１．５ｍｌ／分～約４．０ｍｌ／分、約２．０ｍｌ／分～約４．０ｍｌ／分、約２．５ｍｌ／分～約４．０ｍｌ／分、約３．０ｍｌ／分～約４．０ｍｌ／分、約３．５ｍｌ／分～約４．０ｍｌ／分、約０．１ｍｌ／分～約３．０ｍｌ／分、約０．２５ｍｌ／分～約３．０ｍｌ／分、０．５ｍｌ／分～約３．０ｍｌ／分、０．７５ｍｌ／分～約３．０ｍｌ／分、約１．０ｍｌ／分～約３．０ｍｌ／分、約１．２５ｍｌ／分～約３．０ｍｌ／分、約１．５ｍｌ／分～約３．０ｍｌ／分、約２．０ｍｌ／分～約３．０ｍｌ／分、約２．５ｍｌ／分～約３．０ｍｌ／分、約０．１ｍｌ／分～約２．０ｍｌ／分、約０．２５ｍｌ／分～約２．０ｍｌ／分、０．５ｍｌ／分～約２．０ｍｌ／分、０．７５ｍｌ／分～約２．０ｍｌ／分、約１．０ｍｌ／分～約２．０ｍｌ／分、約１．２５ｍｌ／分～約２．０ｍｌ／分、約１．５ｍｌ／分～約２．０ｍｌ／分、または約０．５ｍｌ／分～約１．０ｍｌ／分の流速を有する。

【0062】

いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣ分析の各工程は、平衡化工程；２つ以上の異なる移動相の相対的パーセンテージが調整される、グラジエント変化工程；２つ以上の異なる移動相の相対的パーセンテージが一定に保持される維持工程；または再平衡化工程を含む。

【0063】

実施形態では、ＨＰＬＣ分析が２つの移動相の使用を含む場合、各工程は、１００％移動相Ａ、０％移動相Ｂ；９０％移動相Ａ、１０％移動相Ｂ；８０％移動相Ａ、２０％移動相Ｂ；７０％移動相Ａ、３０％移動相Ｂ；６０％移動相Ａ、４０％移動相Ｂ；５０％移動相Ａ、５０％移動相Ｂ；４０％移動相Ａ、６０％移動相Ｂ；３０％移動相Ａ、７０％移動相Ｂ；２０％移動相Ａ、８０％移動相Ｂ；１０％移動相Ａ、９０％移動相；または０％移動相Ａ、１００％移動相Ｂの相対的パーセンテージを含み得る。

【実施例】

【0064】

一般的に説明されてきた本開示は、以下の実施例への参照によってより容易に理解され、実施例は、本開示の所定の態様及び実施形態の例示の目的のために含まれているにすぎず、本開示の範囲をどのようにも限定することを意図していない。

【0065】

実施例１：Ｃ１８及び陰イオン交換カラムは、単一のサンプルにおける賦形剤及び／またはバッファーを分離することはできない
当業者に知られている標準的なＨＰＬＣベースの方法は、ヒスチジン、スクロース及びマンニトール、またはトリス、スクロース、及びｈｐβＣＤを含むサンプルにおける構成要素の賦形剤及び／またはバッファーを分解することはできない。

【0066】

Ｃ１８カラムＨＰＬＣ及び検出器条件
Ｃ１８カラムＨＰＬＣ条件が以下の表１にまとめられている。簡潔には、サンプルをＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８、５μｍ、４．６×１５０ｍｍカラムにロードした。カラムを９０％移動相Ａ；１０％移動相Ｂで平衡化した。６．０分で、移動相を６０％移動相Ａ；４０％移動相Ｂに１分間変化させた。７．０分から９．０分まで、カラムを６０％移動相Ａ；４０％移動相Ｂで維持した。９．０分で、移動相を９０％移動相Ａ；１０％移動相Ｂに戻るように１分間変化させ、９０％移動相Ａ；１０％移動相Ｂでさらに２分間維持してカラムを再平衡化した。流速は、全体を通して１．０ｍｌ／分で維持した。総サイクル時間は、１回の実行当たり１２分であった。

【0067】

Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を使用して、対象となる賦形剤からの光散乱シグナルを取得した。ＥＬＳＤパラメータも以下の表１にまとめられている。簡潔には、５０ｐｓｉの圧力で蒸発温度を５０℃に設定した。ゲイン及びフィルターは、それぞれ１及び０．５に設定した。

【0068】

【表1】

【0069】

図１に示されているように、Ｃ１８カラムは、ヒスチジン、スクロース、及びマンニトールを含むサンプル（図１Ａ）でも、トリス、スクロース、及びｈｐβＣＤを含むサンプル（図１Ｂ）でも賦形剤及びバッファーピークを分離することができなかった。

【0070】

陰イオン交換カラムＨＰＬＣ及び検出器条件
陰イオン交換カラムＨＰＬＣ条件が以下の表２にまとめられている。簡潔には、サンプルをＷａｔｅｒ Ｏａｓｉｓ ＭＡＸ ２．１ ｘ ２０ｍｍ，３０μｍカラムにロードした。カラムを９０％移動相Ａ；１０％移動相Ｂで１分間平衡化した。１．０分～３．４分において、グラジエントを８０％移動相Ａ；２０％移動相Ｂに変化させた。３．４分～３．５分において、グラジエントを１００％移動相Ｂに変化させ、１分間維持した。４．５分において、グラジエントを９０％移動相Ａ；１０％移動相Ｂに戻るように変化させた。４．６分において、グラジエントを９０％移動相Ａ；１０％移動相Ｂで２分間維持した。流速は、全体を通して１．０ｍｌ／分で維持した。総サイクル時間は、１回の実行当たり６．６分であった。

【0071】

Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を使用して、対象となる賦形剤からの光散乱シグナルを取得した。ＥＬＳＤパラメータも以下の表２にまとめられている。簡潔には、３．５ｂａｒ±０．１の圧力で蒸発温度を８５℃に設定した。ゲイン及びフィルター設定は可変であり、それぞれ公称で４及び４ｓであった。

【0072】

【表2】

【0073】

図２に示されているように、陰イオン交換カラムは、ヒスチジン、スクロース、及びマンニトールを含むサンプル（図２Ａ）でも、トリス、スクロース、及びｈｐβＣＤを含むサンプル（図２Ｂ）でも賦形剤及びバッファーピークを分離することができなかった。

【0074】

実施例２：ＰＦＰカラムを使用するｈｐβＣＤ及びスクロースのＨＰＬＣ定量
単一のアッセイにおいて、試験サンプルにおけるｈｐβＣＤ及びスクロースを分離し、定量するためにＨＰＬＣベースの方法を開発した。

【0075】

ＨＰＬＣ及び検出器条件
ＨＰＬＣ条件が以下の表３にまとめられている。簡潔には、Ｋｉｎｅｔｅｘペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）２．６μｍ １５０×４．６ｍｍカラムを使用して、対象となる賦形剤を分離した。カラムを１００％移動相Ａで平衡化した。３．５分で、移動相グラジエントを６０％移動相Ａ；４０％移動相Ｂに変化させた。３．５分から７．５分まで、グラジエントを４０％移動相Ａ；６０％移動相Ｂに変化させ、次いでこのグラジエントで２．５分間維持した。１２分で、移動相グラジエントを１００％移動相Ａに戻るように変化させた。流速は、０．２５ｍｌ／分で開始し、次いで賦形剤分離中に１．０ｍｌ／分まで上昇させて、バッファー種とスクロースとの間の良好な分離を達成した。スクロース及びｈｐβＣＤは４分～１０分で溶出した。流速を、実行の最後にカラム再平衡化のための移動相中の１００％水で０．２５ｍｇ／ｍＬに低下させた。総サイクル時間は、１回の実行当たり１５分であった。

【0076】

Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を使用して、対象となる賦形剤からの光散乱シグナルを取得した。ＥＬＳＤパラメータも以下の表３にまとめられている。簡潔には、５０ｐｓｉの圧力で蒸発温度を５０℃に設定した。ゲイン及びフィルターは、それぞれ１及び０．５に設定した。

【0077】

【表3】

【0078】

キャリブレーション曲線作成及び試験サンプル調製
賦形剤を定量するために、既知の濃度の賦形剤でキャリブレーション曲線を以下の表４に従って作成した。キャリブレーション曲線範囲を検出器能力に基づいて確立した。

【0079】

【表4】

【0080】

予測される濃度がキャリブレーション曲線濃度の範囲内であった場合、試験サンプルをそのままＨＰＬＣカラムに注入した。試験サンプルが、キャリブレーション曲線の範囲外の濃度で分析物を含有することが予測される場合、試験サンプルを標準曲線内の濃度となるようにＨ_２Ｏで希釈した。

【0081】

ＨＰＬＣデータ分析
各分析物のピークを積分してピーク面積を得た。ピーク面積対濃度について線形回帰フィットを実施してキャリブレーション曲線の傾き（ｍ）及び切片（ｂ）を計算した。以下の方程式を使用して未知のサンプルにおける各分析物の濃度を計算するためにこのキャリブレーション曲線を使用した。

式中、
ｃ＝未知のサンプルにおける賦形剤の濃度
ピーク面積＝未知のサンプルのクロマトグラムにおける賦形剤ピークを積分することによって測定されたピーク面積
ｂ＝キャリブレーション曲線を使用して計算された方程式からのｙ切片
ｍ＝キャリブレーション曲線を使用して計算された方程式からの傾き。

【0082】

図３に示されているように、表３に記載の条件下でＰＦＰカラムを使用したＨＰＬＣの実行は、明確なピークとして単一のサンプルに存在するスクロース及びｈｐβＣＤを分解する。同様に、図４に示されているように、同じ条件下でＰＦＰカラムを使用したＨＰＬＣの実行は、トリスを明確に分解する。

【0083】

実施例３：スクロース、ｈｐβＣＤ、及び他の賦形剤の定量
実施例２に記載の作業に基づいて、類似するＨＰＬＣ条件であるが、荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）を使用して賦形剤を分離し、定量するために一般的なＨＰＬＣ方法を開発した。この方法は、ｈｐβＣＤ及びスクロースならびにいくつかの他の賦形剤を定量するために使用され得る。

【0084】

ＨＰＬＣ及び検出器条件
ＨＰＬＣ条件が以下の表５にまとめられている。簡潔には、Ｋｉｎｅｔｅｘペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）２．６μｍ １５０×４．６ｍｍカラムを使用して、対象となる賦形剤を分離した。０．５％ギ酸（ＦＡ）を有する水からなる１００％移動相Ａでカラムを平衡化した。ＦＡを使用して、バッファー種（例えば、トリスバッファー）のピーク形状を改善させた。４分から６分まで、グラジエントを４０％移動相Ａ；６０％移動相Ｂに徐々に変化させた。次いで６分から８分まで、グラジエントを１００％移動相Ａに徐々に戻した。このグラジエントをさらに４分間維持してカラムを平衡化した。実行の間、流速を０．５ｍｌ／分で維持した。スクロースは約３分で溶出し、ｈｐβＣＤは約９．５分で溶出し、トリスバッファーは約２．８分で溶出した。総サイクル時間は、１回の実行当たり１２分であった。

【0085】

ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃｏｒｏｎａ（商標）Ｖｅｏ（商標）ＲＳ荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）を使用して、対象となる賦形剤からのシグナルを得た。ＣＡＤパラメータも以下の表５にまとめられている。簡潔には、５Ｈｚの周波数及び５秒のフィルターで蒸発温度を３５℃に設定した。パワーファンクションは、最初の８分間は１．７８に、最後の４分間は１．６８にそれぞれ設定した。フローを最初の１．５分間、廃棄物へ直接的に迂回させた。

【0086】

【表5】

【0087】

キャリブレーション曲線作成及び試験サンプル調製
賦形剤を定量するために、既知の濃度の賦形剤でキャリブレーション曲線を以下の表６に従って作成した。キャリブレーション曲線範囲を検出器能力に基づいて確立した。ＣＡＤ検出器は、実施例２におけるＥＬＳＤ検出器と比較してより広い範囲にわたって線形曲線を確立することが可能であった。

【0088】

【表6】

【0089】

予測される濃度がキャリブレーション曲線濃度の範囲内であった場合、試験サンプルをそのままＨＰＬＣカラムに注入した。サンプルが、キャリブレーション曲線の範囲外の濃度で分析物を含有することが予測される場合、試験サンプルを標準曲線内の濃度となるようにＨ_２Ｏで希釈した。

【0090】

データ分析
実施例１に記載されているようにデータ分析を実施した。

【0091】

図５に示されているように、表５に記載の条件下でＰＦＰカラムを使用したＨＰＬＣの実行は、明確なピークとして単一のサンプルに存在するリン酸ナトリウム（図５Ａ）、クエン酸ナトリウム（図５Ｂ）、リン酸カリウム（図５Ｃ）、ヒスチジン（図５Ｄ）、及びトレハロース（図５Ｅ）を分解することが可能であった。

【0092】

実施例４：スクロース及びマンニトールの定量
ヒスチジン、スクロース及びマンニトール含有物を分離し、定量するために実施例２に記載の作業に基づいてＨＰＬＣベースの方法を開発した。

【0093】

ＨＰＬＣ条件が以下の表６にまとめられている。簡潔には、Ｋｉｎｅｔｅｘペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）２．６μｍ １５０×４．６ｍｍカラムを使用して、対象となる賦形剤を分離した。０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を有する水からなる１００％移動相Ａでカラムを平衡化した。ＴＦＡは、マンニトール、スクロース及びヒスチジンの分離を改善するために必要である。４分から６分まで、グラジエントを４０％移動相Ａ；６０％移動相Ｂに徐々に変化させた。次いで６分から８分まで、グラジエントを１００移動相Ａに徐々に戻した。このグラジエントをさらに４分間維持して、カラムを平衡化した。実行の間、流速を０．５ｍｌ／分で維持した。スクロース及びマンニトールは２．５分～３．５分に溶出し、ヒスチジンは３．５分～４．５分に溶出した。総サイクル時間は、１回の実行当たり１２分であった。

【0094】

ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃｏｒｏｎａ（商標）Ｖｅｏ（商標）ＲＳ ＣＡＤを使用して、対象となる賦形剤からのシグナルを得た。ＣＡＤパラメータは実施例２に記載されているとおりである。

【0095】

【表6】

【0096】

キャリブレーション曲線作成及び試験サンプル調製
賦形剤を定量するために、既知の濃度の賦形剤でキャリブレーション曲線を以下の表７に従って作成した。キャリブレーション曲線範囲を検出器能力に基づいて確立した。

【0097】

【表7】

【0098】

予測される濃度がキャリブレーション曲線濃度の範囲内であった場合、試験サンプルをそのままＨＰＬＣカラムに注入した。サンプルが、キャリブレーション曲線の範囲外の濃度で分析物を含有することが予測される場合、試験サンプルを標準曲線内の濃度となるようにＨ_２Ｏで希釈した。

【0099】

データ分析
実施例１に記載されているようにデータ分析を実施した。

【0100】

図６に示されているように、表６に記載の条件下でＰＦＰカラムを使用したＨＰＬＣの実行は、明確なピークとして単一のサンプルに存在するマンニトール、スクロース、及びヒスチジンを分解することが可能であった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】