特表 2023-506734 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の産生のためのプロセス及びそれを使用する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-20

(54)【発明の名称】腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の産生のためのプロセス及びそれを使用する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20230213BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022535062

(86)(22)【出願日】2020-12-08

(85)【翻訳文提出日】2022-08-04

(86)【国際出願番号】 US2020063767

(87)【国際公開番号】W WO2021118990

(87)【国際公開日】2021-06-17

(31)【優先権主張番号】62/946,620

(32)【優先日】2019-12-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519006377

【氏名又は名称】アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】シャルティエ－クルト，セシル

(72)【発明者】

【氏名】ワーデル，セス

(72)【発明者】

【氏名】モレーノ，マリッツァ リーンラフ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065BC01

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、長い第１の拡大培養プロセスと、より短い第２の拡大培養プロセスとを使用して、腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養する方法に関する。ＴＩＬを拡大培養する方法は、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること、４－１ＢＢアゴニスト、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、約２１日間～約３５日間の期間にわたって第１の拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生すること、及び第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に抗原提示細胞（ＡＰＣ）並びに追加の４－１ＢＢアゴニスト、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を補充し、及び培養することにより、約７日間～約１０日間の期間にわたって第２の拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、産生することを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）４－１ＢＢアゴニスト、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、約２１日間～約３５日間の期間にわたって第１の拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生すること；及び
（ｃ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に抗原提示細胞（ＡＰＣ）並びに追加の４－１ＢＢアゴニスト、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を補充し、及び培養することにより、約７日間～約１０日間の期間にわたって第２の拡大培養を実施して、治療用ＴＩＬ集団である第３のＴＩＬ集団を産生すること、
を含む方法。

【請求項2】

（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収すること；及び
（ｅ）ステップ（ｄ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと
を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で前記培養ステップ（ｂ）を実施することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ＡＰＣが、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記第２の拡大培養におけるＡＰＣの数と、前記第１の拡大培養におけるＡＰＣの数との比が、約１．５：１～約２０：１の範囲である、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記比が、約２：１である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記第２のＴＩＬ集団が、凍結保存される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記第１の拡大培養が、約２１～２８日間の期間にわたって実施され、及び前記第２の拡大培養は、約７日間～９日間の期間にわたって実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記第１の拡大培養が、約２８日間～３５日間の期間にわたって実施され、及び前記第２の拡大培養は、約７日間～９日間の期間にわたって実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の拡大培養が、約２１日間の期間にわたって実施され、及び前記第２の拡大培養は、約７日間～９日間の期間にわたって実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方が、前記第１又は第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方が、ＢＴＬＡ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ及びＴＩＭ３の１つ以上を発現する細胞の増加したサブ集団を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方が、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋及びＣＤ１０３＋ＣＤ６９－の１つ以上を発現する細胞の減少したサブ集団を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方が、ＣＤ４５＋細胞の増加したサブ集団を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方が、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の増加したサブ集団を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方が、ＣＤ８＋細胞の増加したサブ集団を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方が、ＣＤ４＋細胞の減少したサブ集団を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記腫瘍は、甲状腺癌、黒色腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、結腸癌及び結腸直腸癌からなる群から選択される癌タイプのものである、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記第２のＴＩＬ集団が、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍大きい、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記第２のＴＩＬ集団が、少なくとも４×１０^７細胞である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記４－１ＢＢアゴニストが、ウトミルマブ又はウレルマブである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
[001] 本願は、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，６２０号に対する優先権及びその利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
[002] 本発明は、腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を産生する方法及び癌の処置においてそのようなＴＩＬを使用する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
[003] 急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）によってエキソビボで培養したＴＩＬを利用する養子細胞療法は、黒色腫患者において宿主免疫抑制後の養子細胞療法の成功をもたらしている。現行の注入適合パラメータは、ＴＩＬの組成（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８又はＣＤ４陽性）の読み取り並びにＲＥＰ産物の拡大倍率及び生存率の数値に依存している。

【0004】

[004] 現行のＲＥＰプロトコルは、患者に注入されることになるＴＩＬの健康に関して見識をほとんど与えない。Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞からエフェクターＴ細胞へのその成熟の過程で顕著な代謝シフトを起こす（Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364（全体として本明細書に明示的に組み込まれる）並びに特に嫌気的及び好気的代謝の考察及びマーカーについて参照されたい）。例えば、ナイーブＴ細胞は、ＡＴＰの産生をミトコンドリア呼吸に依存する一方、ＴＩＬなどの成熟した健康なエフェクターＴ細胞は、高度に解糖性であり、それが増殖、遊走、活性化及び抗腫瘍有効性に必要とするバイオエナジェティクス基質の供給を好気的解糖に依存している。

【0005】

[005] 先行論文の報告によれば、重度に解糖に依存する細胞は、養子移入時に栄養枯渇を被り、その結果、移入細胞の大部分が死滅することになるため、移入前にＴＩＬの解糖を制限し、ミトコンドリア代謝を促進することが望ましい。従って、当技術分野では、ミトコンドリア代謝を促進することでインビボ寿命が促進される可能性があることが教示されており、実際、免疫応答の誘導前に解糖の阻害薬を使用することが提案されている。Chang et al.（Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17(364), 574-582）を参照されたい。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

[006] 本発明は、好ましい態様において、新鮮に採取したＴＩＬ又は再刺激ＴＩＬ（本明細書において「ｒｅＴＩＬ」と称される場合もある）のための解凍した凍結保存ＴＩＬと比較したとき、驚くべきことに、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^＋）又はエフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^－）表現型を含むメモリーＴ細胞サブセットの拡大につながり、及び／又は解糖系呼吸の著しい亢進につながる、本明細書において「再刺激急速拡大培養プロトコル」又は「ｒｅＲＥＰ」と称されることもある追加的な再刺激プロトコルでＲＥＰを増強する新規な方法に関する。即ち、凍結保存ＴＩＬに対してｒｅＲＥＰ手順（即ち第１の拡大培養及び第２の拡大培養を含む手順）を用いることにより、患者は、高度に代謝的に活性で健康なＴＩＬを受け取ることができ、より良好な転帰につながり得る。

【0007】

[007] 本発明は、一部の実施形態において、この代謝的健康の増加を判定及び定量化する方法に更に関する。従って、本発明は、限定されないが、解糖の速度及び量、酸化的リン酸化、予備呼吸能（ＳＲＣ）並びに解糖予備能を含む１つ以上の一般的な代謝判定を用いて、ＴＩＬ集団の相対的健康をアッセイする方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

図の簡単な説明

【図1】[008]本発明による拡大培養方法のフローチャートを示す。

【図2】[009]子宮内膜癌及び甲状腺癌サンプルのＴＩＬ細胞増殖の成功を示す。

【図3A】[0010]子宮内膜癌腫瘍サンプルにおける正常、腫瘍及び凍結プレＲＥＰ ＴＩＬにおけるＣＤ４５＋細胞の割合を示す。ＣＤ４５＋細胞の割合は、正常組織及び腫瘍組織と比較して、プレＲＥＰ ＴＩＬで増加する。

【図3B】[0010]子宮内膜癌腫瘍サンプルにおける正常、腫瘍及び凍結プレＲＥＰ ＴＩＬにおけるＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の割合を示す。ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の割合は、正常組織及び腫瘍組織と比較して、プレＲＥＰのＴＩＬで増加する。

【図4A】[0011]正常な子宮内膜組織及び子宮内膜癌腫瘍サンプルからのＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞におけるＣＤ４５＋ＣＤ３＋の割合を示す。正常サンプルと腫瘍サンプルとは、同様の結果を示す。

【図4B】[0011]子宮内膜癌腫瘍サンプル及び凍結サンプルでのプレＲＥＰ ＴＩＬからのＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞におけるＣＤ４５＋ＣＤ３＋の割合を示す。ＣＤ４５＋ＣＤ３＋の割合は、腫瘍組織と比較して、プレＲＥＰ ＴＩＬのＣＤ４＋細胞で減少し、ＣＤ８＋細胞で増加する。

【図5A】[0012]子宮内膜癌サンプルにおけるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬサブセット表現型を示す。以下のマーカーについて、正常（左）及び腫瘍（右）組織におけるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬの割合を示す。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９－、ＴＩＧＩＴ及びＴＩＭ３。可能な限り、比較サンプルは、同じ患者からのものであり、即ち、各患者は、凍結サンプルで正常、腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。

【図5B】[0012]子宮内膜癌サンプルにおけるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬサブセット表現型を示す。同じマーカーについて腫瘍におけるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬ（左）及び凍結プレＲＥＰ ＴＩＬ（右）の割合を示す。可能な限り、比較サンプルは、同じ患者からのものであり、即ち、各患者は、凍結サンプルで正常、腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。

【図6】[0013]以下のマーカーの正常（左）及び腫瘍（右）子宮内膜組織サンプルにおけるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋サブセット表現型決定を示す。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ及びＴＩＭ３。可能な限り、比較サンプルは、同じ患者からのものであり、即ち、各患者は、凍結サンプルで腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。

【図7A】[0014]子宮内膜癌サンプルにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＩＬサブセット表現型を示す。以下のマーカーについて、正常（左）及び腫瘍（右）組織におけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＩＬの割合を示す。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９－、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３及びＴ_ｒｅｇ。可能な限り、比較サンプルは、同じ患者からのものであり、即ち、各患者は、凍結サンプルで正常、腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。

【図7B】[0014]子宮内膜癌サンプルにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＩＬサブセット表現型を示す。同じマーカーについて腫瘍におけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＩＬ（左）及び凍結プレＲＥＰ ＴＩＬ（右）の割合を示す。可能な限り、比較サンプルは、同じ患者からのものであり、即ち、各患者は、凍結サンプルで正常、腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。

【図8】[0015]以下のマーカーの正常（左）及び腫瘍（右）子宮内膜組織サンプルにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋サブセット表現型決定を示す。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ及びＴＩＭ３。可能な限り、比較サンプルは、同じ患者からのものであり、即ち、各患者は、凍結サンプルで腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。

【図9A】[0016]未分化甲状腺癌サンプルにおける正常、腫瘍及び凍結プレＲＥＰ ＴＩＬにおけるＣＤ４５＋細胞の割合を示す。ＣＤ４５＋細胞の割合は、正常組織及び腫瘍組織と比較して、プレＲＥＰのＴＩＬで増加する。

【図9B】[0016]未分化甲状腺癌サンプルにおける正常、腫瘍及び凍結プレＲＥＰ ＴＩＬにおけるＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の割合を示す。ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の割合は、正常組織及び腫瘍組織と比較して、プレＲＥＰのＴＩＬで増加する。

【図10A】[0017]正常な子宮内膜組織及び未分化甲状腺癌サンプルからのＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞におけるＣＤ４５＋ＣＤ３＋の割合を示す。正常サンプルと腫瘍サンプルとは、同様の結果を示す。

【図10B】[0017]未分化甲状腺癌サンプル及び凍結サンプルでのプレＲＥＰ ＴＩＬからのＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞におけるＣＤ４５＋ＣＤ３＋の割合を示す。ＣＤ４５＋ＣＤ３＋の割合は、腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬのＣＤ４＋サブセットとＣＤ８＋サブセットとの両方で類似しているようである。

【図11A】[0018]未分化甲状腺癌サンプルにおけるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬサブセット表現型を示す。以下のマーカーについて、正常（左）及び腫瘍（右）組織におけるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬの割合を示す。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９－、ＴＩＧＩＴ及びＴＩＭ３。可能な限り、比較サンプルは、同じ患者からのものであり、即ち、各患者は、凍結サンプルで正常、腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。

【図11B】[0018]未分化甲状腺癌サンプルにおけるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬサブセット表現型を示す。同じマーカーについて腫瘍におけるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬ（左）及び凍結プレＲＥＰ ＴＩＬ（右）の割合を示す。可能な限り、比較サンプルは、同じ患者からのものであり、即ち、各患者は、凍結サンプルで正常、腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。

【図12】[0019]以下のマーカーの正常（左）及び腫瘍（右）子宮内膜組織サンプルにおけるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋サブセット表現型決定を示す。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ及びＴＩＭ３。可能な限り、比較サンプルは、同じ患者からのものであり、即ち、各患者は、凍結サンプルで腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。

【図13A】[0020]未分化甲状腺癌サンプルにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＩＬサブセット表現型を示す。以下のマーカーについて、正常（左）及び腫瘍（右）組織におけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＩＬの割合を示す。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９－、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３及びＴ_ｒｅｇ。可能な限り、比較サンプルは、同じ患者からのものであり、即ち、各患者は、凍結サンプルで正常、腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。

【図13B】[0020]未分化甲状腺癌サンプルにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＩＬサブセット表現型を示す。同じマーカーについて腫瘍におけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＩＬ（左）及び凍結プレＲＥＰ ＴＩＬ（右）の割合を示す。可能な限り、比較サンプルは、同じ患者からのものであり、即ち、各患者は、凍結サンプルで正常、腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。

【図14】[0021]以下のマーカーの正常（左）及び腫瘍（右）子宮内膜組織サンプルにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋サブセット表現型決定を示す。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ及びＴＩＭ３。可能な限り、比較サンプルは、同じ患者からのものであり、即ち、各患者は、凍結サンプルで腫瘍及びプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。

【図15】[0022]構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂを示し、円柱は、個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂは、例えば、４－１ＢＢＬ又は４－１ＢＢに結合する抗体に由来する、３つの直鎖状に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これは、折り畳まれて三価タンパク質を形成し、次いでＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｃ_Ｈ３及びＣ_Ｈ２ドメインを含む）を介して第２の三価タンパク質に連結され、次いで、これは、ジスルフィド結合（小さい細長い楕円形）を介して２つの三価タンパク質を連結するために使用され、構造を安定化し、６つの受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン及びシグナル伝達タンパク質を合わせてシグナル伝達複合体を形成できるアゴニストを提供する。円柱として示されるＴＮＦＲＳＦ結合ドメインは、例えば、親水性残基並びに柔軟性のためのＧｌｙ及びＳｅｒ配列並びに溶解性のためのＧｌｕ及びＬｙｓを含み得るリンカーにより接続されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ鎖を含むｓｃＦｖドメインであり得る。

【発明を実施するための形態】

【0009】

発明の概要
[0023] 本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；４－１ＢＢ、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、約２１日間～約３５日間の期間にわたって第１の拡大培養を実施して、第２のＴＩＬ集団を産生すること；及び第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に抗原提示細胞（ＡＰＣ）並びに追加の４－１ＢＢ、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を補充し、及び培養することにより、約６日間～約１２日間の期間にわたって第２の拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団であって、治療用ＴＩＬ集団である第３のＴＩＬ集団を産生することを含む方法を記載する。

【0010】

[0024] 本発明の一実施形態において、方法は、第２の拡大培養ステップから得られた治療用ＴＩＬ集団を回収すること；及び回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことを更に含む。

【0011】

[0025] 一部の実施形態において、方法は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で第１の拡大培養ステップを実施することを含む。一実施形態において、ＡＰＣは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態において、第２の拡大培養におけるＡＰＣの数と、第１の拡大培養におけるＡＰＣの数との比は、約１．５：１～約２０：１の範囲である。一部の実施形態において、この比は、約２：１である。

【0012】

[0026] 一実施形態において、ＴＩＬは、第１又は第２の拡大培養プロセス中のある時点で凍結保存され得る。一実施形態において、第２のＴＩＬ集団は、凍結保存される。

【0013】

[0027] 本発明の一部の実施形態において、第１の拡大培養は、約２１日間の期間にわたって実施され、及び第２の拡大培養は、約６～１０日間の期間にわたって実施される。一部の実施形態において、第１の拡大培養は、約３５日間の期間にわたって実施され、及び第２の拡大培養は、約６～１０日間の期間にわたって実施される。一部の実施形態において、第１の拡大培養は、約２８日間の期間にわたって実施され、及び第２の拡大培養は、約７～１０日間の期間にわたって実施される。

【0014】

[0028] 一部の実施形態において、第２又は第３のＴＩＬ集団は、Ｔ細胞機能を示す特定のマーカーの発現が増加し、特定の枯渇マーカーの発現が減少した細胞のサブ集団を含む。一実施形態において、第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方は、第１又は第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含む。別の実施形態において、第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方は、ＢＴＬＡ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ及びＴＩＭ３の１つ以上を発現する細胞の増加したサブ集団を含む。別の実施形態において、第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方は、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋及びＣＤ１０３＋ＣＤ６９－の１つ以上を発現する細胞の減少したサブ集団を含む。一実施形態において、第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方は、ＣＤ４５＋細胞の増加したサブ集団を含む。一実施形態において、第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の増加したサブ集団を含む。一実施形態において、第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方は、ＣＤ８＋細胞の増加したサブ集団を含む。一実施形態において、第２又は第３のＴＩＬ集団の一方又は両方は、ＣＤ４＋細胞の減少したサブ集団を含む。

【0015】

[0029] 一部の実施形態において、腫瘍は、甲状腺癌、黒色腫（ブドウ膜黒色腫及び皮膚黒色腫を含む）、子宮頸癌、子宮内膜癌、結腸癌及び結腸直腸癌からなる群から選択される癌タイプのものである。

【0016】

[0030] 一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍大きい。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団は、少なくとも４×１０^７細胞である。

【0017】

詳細な説明
定義
[0031] 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0018】

[0032] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。

【0019】

[0033] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。

【0020】

[0034] 用語「エキソビボ」は、対象の体から摘出された細胞、組織及び／又は臓器の処置又は処置の実施を含む事象を指す。適切には、細胞、組織及び／又は臓器は、手術又は処置の方法で対象の体に戻され得る。

【0021】

[0035] 用語「第２の拡大培養」は、１週間の期間にわたって少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍若しくは９倍）、より好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍若しくは９０倍）又は最も好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬの数の増加を意味する。複数の第２の拡大培養プロトコルを以下に概説する。

【0022】

[0036] 本明細書において、「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定されないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬは、初代及び二次ＴＩＬの両方を含む。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから得られるものであり（「新鮮に回収された」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定されないが、本明細書で考察するバルクＴＩＬ、拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」）及び「ｒｅＲＥＰ ＴＩＬ」を含めて、本明細書で考察する通り拡大培養された又は成長した任意のＴＩＬ細胞集団である。ＴＩＬ細胞集団は、遺伝子修飾ＴＩＬを含み得る。

【0023】

[0037] ＴＩＬは、一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤し、処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカーの１つ以上を発現することによって分類することができる。ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１及びＣＤ２５。加えて及び代わりに、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、効力によって特徴付けられ更に得る － 例えば、ＴＩＬは、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）遊離が約５０ｐｇ／ｍＬより高い、約１００ｐｇ／ｍＬより高い、約１５０ｐｇ／ｍＬより高い又は約２００ｐｇ／ｍＬより高い場合に効力があると見なすことができる。インターフェロンは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を含み得る。

【0024】

[0038] 本明細書において、「凍結保存ＴＩＬ」とは、初代、バルク又は拡大培養（ＲＥＰ ＴＩＬ）のいずれかのＴＩＬが約－１５０℃～－６０℃の範囲で処理及び保存されることを意味する。一般的な凍結保存方法は、実施例を含めて本明細書の他の部分にも記載される。明確にするために言えば、「凍結保存ＴＩＬ」は、初代ＴＩＬの供給源として用いられ得る凍結組織サンプルと区別可能なものである。

【0025】

[0039] 本明細書において、「解凍した凍結保存ＴＩＬ」とは、かつて凍結保存されていたが、次に処理により、限定されないが、細胞培養温度又はＴＩＬを患者に投与し得る温度を含めて、室温以上に戻されたＴＩＬ集団を意味する。

【0026】

[0040] 本明細書において、「細胞集団」（ＴＩＬを含む）は、共通の形質を共有する多数の細胞を意味する。一般に、集団は、概して、数が１×１０^６～１×１０^１０個の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は、異なる数を含む。例えば、ＩＬ－２の存在下での初代ＴＩＬの初期成長は、およそ１×１０^８個の細胞のバルクＴＩＬ集団をもたらす。ＲＥＰ拡大培養は、概して、１．５×１０^９～１．５×１０^１０個の注入のための細胞集団が提供されるように行われる。

【0027】

[0041] 一般に、ＴＩＬは、最初に患者腫瘍サンプルから得られ（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団に拡大培養され、任意選択で凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、及び任意選択でＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。

【0028】

[0042] 一般に、回収された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に回収した」細胞集団と呼ばれる。

【0029】

[0043] 一般に、本明細書で考察する通り、ＴＩＬは、最初に、本明細書で考察する通り患者から切除された腫瘍から初代ＴＩＬ集団を得ることにより調製される（「初代細胞集団」又は「第１の細胞集団」）。これに続き、細胞をＩＬ－２と培養することを利用した初期バルク拡大培養が行われ、第２の細胞集団が形成される（本明細書において「バルクＴＩＬ集団」又は「第２の集団」と称されることもある）。

【0030】

[0044] 用語「細胞傷害性リンパ球」には、細胞傷害性Ｔ（ＣＴＬ）細胞（ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球及びＣＤ４^＋Ｔ－ヘルパーリンパ球を含む）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。細胞傷害性リンパ球には、例えば、末梢血由来α／βＴＣＲ陽性Ｔ細胞又は腫瘍関連抗原によって活性化され、及び／又は腫瘍特異的キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体で形質導入されたα／βＴＣＲ陽性Ｔ細胞及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が含まれ得る。

【0031】

[0045] 用語「セントラルメモリーＴ細胞」は、ヒトではＣＤ４５ＲＯ＋であり、ＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ－６Ｂ、ＭＢＤ２及びＢＭＩＩが含まれる。セントラルメモリーＴ細胞はＴＣＲ惹起後にエフェクター分子としてＩＬ－２及びＣＤ４０Ｌを主に分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ４区画において優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺において比例的に濃縮されている。

【0032】

[0046] 用語「エフェクターメモリーＴ細胞」は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現が欠損しており（ＣＣＲ７ｌｏ）、及びＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるか又は低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒト又は哺乳類Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＬＩＭＰ１が含まれる。エフェクターメモリーＴ細胞は、抗原刺激後、インターフェロン－γ、ＩＬ－４及びＩＬ－５を含む、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ８区画において優勢であり、ヒトでは肺、肝臓及び腸において比例的に濃縮されている。ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は多量のパーフォリンを有する。用語「閉鎖系」は、外部環境に対して閉鎖されている系を指す。本発明の方法では、細胞培養方法に適切な任意の閉鎖系を用いることができる。閉鎖系としては、例えば、限定されないが、閉鎖型Ｇコンテナが挙げられる。閉鎖系に腫瘍セグメントが加えられた後、ＴＩＬの患者への投与直前までこの系は外部環境に対して開放されない。

【0033】

[0047] 用語「末梢血単核球」及び「ＰＢＭＣ」は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含む、円形の核を有する末梢血細胞を指す。好ましくは、末梢血単核球は、照射された同種異系末梢血単核球である。

【0034】

[0048] 「急速拡大培養」という用語は、１週間の期間にわたって少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍若しくは９倍）、より好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍若しくは９０倍）又は最も好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬの数の増加を意味する。いくつかの急速拡大培養プロトコルが本明細書に記載されている。

【0035】

[0049] 一部の実施形態において、本開示の方法は、腫瘍組織又は腫瘍組織からの細胞を標準的な実験用培地（限定なしに、ＲＰＭＩを含む）で成長させて、照射フィーダー細胞及び抗ＣＤ３抗体などの試薬で処理することにより、ＴＩＬ数の増加及び／又は所望の細胞表面マーカー又は他の構造的、生化学的若しくは機能的特徴を含む細胞に関する集団のエンリッチメントなど、所望の効果を実現する「プレＲＥＰ」段階を更に含む。プレＲＥＰ段階は、ＴＩＬ産生を改善するための代替戦略を取り入れ易くなるように、実験グレードの試薬を（実験グレードの試薬が後のＲＥＰ段階中に希釈されるという仮定の下で）利用し得る。従って、一部の実施形態において、プレＲＥＰ段階中、培養培地中には、開示されるＴＬＲアゴニスト及び／又はペプチド又はペプチドミメティクスが含まれ得る。プレＲＥＰ培養は、一部の実施形態において、ＩＬ－２を含み得る。

【0036】

[0050] 本発明は、好ましい態様において、新鮮に採取したＴＩＬ又は再刺激ＴＩＬ（本明細書において「ｒｅＴＩＬ」と称される場合もある）のための解凍した凍結保存ＴＩＬと比較したとき意外にもメモリーエフェクターＴ細胞サブセットを含むメモリーＴ細胞サブセットの拡大につながり、及び／又は解糖系呼吸の著しい亢進につながる、本明細書において「再刺激急速拡大培養プロトコル」又は「ｒｅＲＥＰ」と称されることもある追加的な再刺激プロトコルでＲＥＰを増強する新規な方法に関する。即ち、凍結保存ＴＩＬに対してｒｅＲＥＰ手順を用いることにより、患者は高度に代謝的に活性で健康なＴＩＬを受け取ることができ、より良好な転帰につながり得る。本明細書で細胞集団の更なる「拡大培養」とも称されるそのような再刺激プロトコルは、本明細書で更に詳細に説明される。

【0037】

[0051] 腫瘍を破砕するプロセスを説明するために本明細書で使用される「断片化」、「断片」及び「断片化された」という用語には、腫瘍組織の破砕、スライス、分割及び細切並びに腫瘍組織の物理的構造を破砕する他の方法などの機械的断片化方法が含まれる。用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。

【0038】

[0052] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。

【0039】

[0053] 用語「抗ＣＤ３抗体」は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体であって、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むものを指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ－３及びＵＨＣＴ－１が含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビジリズマブが含まれる。

【0040】

[0054] 用語「ＯＫＴ－３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体中のＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含む、モノクローナル抗体若しくはバイオシミラー又はその変異体を指し、ＯＫＴ－３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA）及びムロモナブ又はそれらの変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム若しくはバイオシミラーなどの市販の形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に示す（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマは、American Type Culture Collectionに寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマもEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。

【0041】

【表1】

【0042】

[0055] 用語「ＩＬ－２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）は、インターロイキン－２として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ－２を含む。ＩＬ－２は、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－２のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号３）。例えば、ＩＬ－２という用語は、アルデスロイキン（PROLEUKIN、１つの単回使用バイアルあたり２２００万ＩＵで複数の供給元から市販されている）並びにCellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA（CELLGRO GMP）又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２０９－ｂ）から市販で供給される組換えＩＬ－２の形態及び他の販売業者からの他の市販の同等物などのＩＬ－２のヒト組換え型を包含する。アルデスロイキン（デス－アラニル－１、セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は、分子量およそ１５ｋＤａの非グリコシル化ヒト組換え型ＩＬ－２である。本発明における使用に適したアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に示す（配列番号４）。ＩＬ－２という用語は、本明細書に記載されているように、Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグＮＫＴＲ－２１４を含む、ペグ化形態のＩＬ－２も包含する。本発明での使用に好適なＮＫＴＲ－２１４及びペグ化ＩＬ－２が米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１ Ａ１号及び国際公開第２０１２／０６５０８６ Ａ１号（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明での使用に適したコンジュゲートＩＬ－２の代替形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号及び同第４９０２，５０２号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適したＩＬ－２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0043】

【表2】

【0044】

[0056] 用語「ＩＬ－４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）は、インターロイキン４として知られるサイトカインを指し、これは、Ｔｈ２ Ｔ細胞により、及び好酸球、好塩基球及び肥満細胞により産生される。ＩＬ－４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）からＴｈ２ Ｔ細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70。ＩＬ－４によって活性化されると、Ｔｈ２ Ｔ細胞は続いてポジティブフィードバックループにおいて、更なるＩＬ－４を産生する。ＩＬ－４はまた、Ｂ細胞拡大培養及びクラスＩＩ ＭＨＣ発現を刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－４は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２１１）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＣＴＰ００４３）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－４のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号５）。

【0045】

[0057] 用語「ＩＬ－７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）は、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは間質及び上皮細胞並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。ＩＬ－７は、Ｔ細胞の発生を刺激することができる。ＩＬ－７は、胸腺内のＴ細胞発生及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルにおいて、ＩＬ－７受容体アルファ及び一般的なガンマ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ－７受容体に結合する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－４は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２５４）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＰＨＣ００７１）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－７のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号６）。

【0046】

[0058] 用語「ＩＬ－１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）は、インターロイキン－１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ－２を含む。ＩＬ－１５は、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－１５は、β及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ－２と共有する。組換えヒトＩＬ－１５は、分子量１２．８ｋＤａの１１４個のアミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－１５は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２３０－ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号３４－８１５９－８２）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号７）。

【0047】

[0059] 用語「ＩＬ－２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）は、インターロイキン－２１として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ－２１を含む。ＩＬ－２１は、例えば、Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２１は、主にナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ－２１は、分子量１５．４ｋＤａの１３２個のアミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－２１は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－４０８－ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－２１組換えタンパク質、カタログ番号１４－８２１９－８０）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－２１のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号８）。

【0048】

[0060] 「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」又は「治療量」が指示されるとき、本発明の組成物の正確な投与量は、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して医師が決定することができる。一般的に、本明細書に記載される遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球を含む医薬組成物は１０^４～１０^１１細胞／ｋｇ体重（例えば、１０^５～１０^６、１０^５～１０^１０、１０^５～１０^１１、１０^６～１０^１０、１０^６～１０^１１，１０^７～１０^１１、１０^７～１０^１０、１０^８～１０^１１、１０^８～１０^１０、１０^９～１０^１１又は１０^９～１０^１０細胞／ｋｇ体重）（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の投薬量で投与され得ると言うことができる。遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球組成物は、これらの投薬量で複数回でも投与され得る。遺伝子改変された細胞傷害性リンパ球は、免疫療法で一般に公知の注入技法を用いることにより投与し得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng.J.of Med.319: 1676, 1988を参照されたい）。特定の患者に対する最適な投与量及び処置レジメンは、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて処置を調整することにより、医学の当業者によって容易に決定され得る。

【0049】

[0061] 「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織を含むがこれらに限定されない、哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液性腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。

【0050】

[0062] 「固形腫瘍」という用語は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌などの肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。

【0051】

[0063] 「液性腫瘍」という用語は、本来流動性である異常な細胞塊を指す。液性腫瘍癌としては、白血病、骨髄腫及びリンパ腫並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。液性腫瘍から得られたＴＩＬは、本明細書では骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも称される。

【0052】

[0064] 本明細書で使用される「微小環境」という用語は、全体としての固形又は血液腫瘍微小環境又は微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載されているように、「新生物性形質転換を促進し、腫瘍の成長及び浸潤をサポートし、腫瘍を宿主の免疫から保護し、治療抵抗性を培い、優勢な転移を成功させるニッチを提供する、細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス及び機械的手がかり」の複合的な混合物を指す。腫瘍はＴ細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、免疫系による腫瘍の排除は、微小環境による免疫抑制のため、希少である。

【0053】

[0065] ある実施形態において、本発明は、ｒＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、患者は、本発明によるｒＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一部の実施形態において、ｒＴＩＬ集団は、ｅＴｉＬ集団と共に提供され得、患者は、本発明に係るｒＴＩＬ及びｅＴｉｌの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ｒＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ｒＴＩＬ注入の２７～２３日前）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ^２／日である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本発明に係るｒＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２の静脈内注入を受ける。

【0054】

[0066] 実験的知見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のｒＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。

【0055】

[0067] 本明細書で使用される「共投与」、「共投与すること」、「～と組み合わせて投与される」、「～と組み合わせて投与すること」、「同時（simultaneous）」及び「同時（concurrent）」という用語は、両方の活性医薬成分及び／又はそれらの代謝産物が同時に対象内に存在するための、２つ以上の活性医薬成分（本発明の好ましい実施形態において、例えば、複数のＴＩＬと組み合わせた少なくとも１つのカリウムチャネルアゴニスト）の対象への投与を包含する。共投与には、別々の組成物中での同時投与、別々の組成物中での異なる時点における投与又は２つ以上の活性医薬成分が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。

【0056】

[0068] 用語「有効量」又は「治療有効量」は、疾患処置を含むがこれに限定されない、意図された用途を達成するのに十分な、本明細書に記載の化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途（インビトロ若しくはインビボ）又は処置されている対象及び疾患状態（例えば、対象の体重、年齢及び性別）、疾患状態の重症度又は投与方法によって変動し得る。この用語は、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板接着及び／又は細胞遊走の減少）を誘発する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織及び化合物が運ばれる物理的送達システムによって変動する。

【0057】

[0069] 用語「治療」、「治療している」、「治療する」などは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を達成することを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に防ぐという意味で予防的であり得、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用を部分的に又は完全に治癒するという意味で治療的であり得る。「処置」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、依然としてそれを有すると診断されてない対象において疾患の発生を防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害すること、即ちその発症又は進行を止めること；及び（ｃ）疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を生じさせること及び／又は１つ以上の疾患症状を軽減することが含まれる。「治療」は、疾患又は病態がない場合でも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含することも意図される。例えば、「治療」は、例えば、ワクチンの場合、疾患状態がない中で免疫応答を誘発するか又は免疫を付与することができる組成物の送達を包含する。

【0058】

[0070] 核酸又はタンパク質の部分に関して使用される場合の「異種」という用語は、その核酸又はタンパク質が、天然に互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え的に産生され、新しい機能性核酸を作成するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列、例えば、１つの供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコーディング領域又は異なる供給源からのコーディング領域を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然に互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。

【0059】

[0071] ２つ以上の核酸又はポリペプチドに関連して、「配列同一性」、「パーセント同一性」及び「配列パーセント同一性」という用語（又はその類似語、例えば「９９％同一の」）は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大限の対応について比較し、整合させた場合に（必要であればギャップを導入する）、同じであるか、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する、２つ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用するか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用することができる様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当技術分野で公知である。パーセント配列同一性を決定するための適切なプログラムには、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式が含まれる。２つの配列間の比較は、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用される一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。ALIGN、ALIGN-2（Genentech, South San Francisco, California）又はDNASTARから入手可能なMegAlignは、配列を整合するために使用することができる、公に入手可能な更なるソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。

【0060】

[0072] 本明細書で使用される「変異体」という用語は、参照抗体のアミノ酸配列内又はそれに隣接する特定の位置での１つ以上の置換、欠失及び／又は付加により、参照抗体のアミノ酸配列と異なる、アミノ酸配列を含む抗体又は融合タンパク質を包含するが、これに限定されない。変異体は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列中に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電又は非荷電であるアミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。変異体という用語は、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。

【0061】

[0073] 用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。

【0062】

[0074] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。

【0063】

[0075] 「急速拡大培養」という用語は、１週間の期間にわたって少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍若しくは９倍）、より好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍若しくは９０倍）又は最も好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬの数の増加を意味する。いくつかの急速拡大培養プロトコルを以下に概説する。

【0064】

[0076] ＴＩＬ製造プロセスの実施形態

【0065】

[0077] 以下の「ステップ」の名称Ａ、Ｂ、Ｃ等は、例示であり、ステップの任意の組み合わせ又は順序並びに追加的なステップ、ステップの繰り返し及び／又はステップの省略は、本願及び本明細書に開示される方法によって企図される。

【0066】

ステップＡ：患者の腫瘍サンプルを入手
[0078] 一般に、ＴＩＬは、最初に患者腫瘍サンプルから得られ（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団に拡大培養され、任意選択で凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、及び任意選択でＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。

【0067】

[0079] 患者腫瘍サンプルは、当技術分野で公知の方法を用いて、概して外科的切除、針生検又はその他の、腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含むサンプルを得るための手段によって得られ得る。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含む任意の固形腫瘍からであり得る。腫瘍サンプルは、血液悪性腫瘍から得られた腫瘍など、液性腫瘍でもあり得る。固形腫瘍は、限定されないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌及び皮膚癌（限定されないが、扁平上皮癌、基底細胞癌及び黒色腫を含む）を含む任意の癌型のものであり得る。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されていることに伴い悪性黒色腫腫瘍から得られる。

【0068】

[0080] 入手後、腫瘍サンプルは、一般的に、鋭的な切離を用いて１～約８ｍｍ^３の小片に断片化され、約２～３ｍｍ^３が特に有用である。ＴＩＬは酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。そのような腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Roswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）1640緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて機械的分離（例えば、組織分離剤を使用）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約１分間機械的に分離した後、続いて５％ＣＯ_２下３７℃で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片のみが存在するまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製され得る。このプロセスの終わりに、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号に記載されているものなど、当技術分野で公知の代替的方法を使用し得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の任意の方法は、ＴＩＬを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。

【0069】

[0081] 一部の実施形態において、断片化は、例えば、切離並びに消化を含む物理的断片化を含む。一部の実施形態において、断片化は物理的断片化である。一部の実施形態において、断片化は切離である。一部の実施形態において、断片化は消化による。一部の実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から得られた酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。

【0070】

[0082] 一部の実施形態において、腫瘍が固形腫瘍である場合、腫瘍サンプルの入手後、腫瘍は、物理的断片化を受ける。一部の実施形態において、断片化は凍結保存前に行われる。一部の実施形態において、断片化は凍結保存後に行われる。一部の実施形態において、断片化は、腫瘍の入手後、いかなる凍結保存もなしに行われる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養のための各容器に２、３又は４個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養のための各容器に３又は４個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養のための各容器に４個の断片又は小片が置かれる。

【0071】

[0083] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍断片から得られる。一部の実施形態において、腫瘍断片は鋭的な切離によって得られる。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ^３～１０ｍｍ^３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ^３～８ｍｍ^３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ^３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約２ｍｍ^３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約３ｍｍ^３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約４ｍｍ^３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約５ｍｍ^３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約６ｍｍ^３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約７ｍｍ^３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約８ｍｍ^３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約９ｍｍ^３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１０ｍｍ^３である。

【0072】

１．コア／小生検由来のＴＩＬ
[0084] 一部の実施形態において、ＴＩＬは、最初にコア生検又は類似の手順で得られた患者腫瘍サンプルから得られ（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団に拡大培養され、任意選択で凍結保存され、及び任意選択で表現型及び代謝パラメータについて評価される。

【0073】

[0085] 一部の実施形態において、患者腫瘍サンプルは、当技術分野で公知の方法を用いて、一般的に小生検、コア生検、針生検又はその他の、腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含むサンプルを得るための手段によって得られ得る。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含む任意の固形腫瘍からのものであり得る。腫瘍サンプルは、血液悪性腫瘍から得られた腫瘍など、液性腫瘍でもあり得る。一部の実施形態において、サンプルは、複数の小さい腫瘍サンプル又は生検からのものであり得る。一部の実施形態において、サンプルは、同じ患者からの単一の腫瘍からの複数の腫瘍サンプルを含み得る。一部の実施形態において、サンプルは、同じ患者からの複数の腫瘍からの１つ、２つ、３つ又は４つの腫瘍サンプルを含み得る。一部の実施形態において、サンプルは、同じ患者からの複数の腫瘍からの複数の腫瘍サンプルを含み得る。固形腫瘍は、限定されないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌及び皮膚癌（限定されないが、扁平上皮癌、基底細胞癌及び黒色腫を含む）を含む任意の癌型のものであり得る。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫（ＧＢＭ）、胃腸癌、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）から選択される。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されていることに伴って悪性黒色腫腫瘍から得られる。

【0074】

[0086] 一般に、腫瘍コア又は断片から得られた細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に入手した」若しくは「新鮮に分離した」細胞集団と呼ばれる。特定の実施形態において、新鮮に入手したＴＩＬの細胞集団は、抗原提示細胞、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地に曝露される。

【0075】

[0087] 一部の実施形態において、腫瘍が転移性であり、過去に原発病変が効率的に処置／除去されている場合、転移性病変の１つの除去が必要になり得る。一部の実施形態において、最も侵襲性の低いアプローチは、利用可能な場合、皮膚病変又は首若しくは腋窩領域のリンパ節を除去することである。一部の実施形態において、皮膚病変が除去されるか又はその小生検が除去される。一部の実施形態において、リンパ節又はその小生検が除去される。一部の実施形態において、肺若しくは肝臓の転移性病変又は腹腔内若しくは胸部リンパ節又はその小生検を利用することができる。

【0076】

[0088] 一部の実施形態において、腫瘍は黒色腫である。一部の実施形態において、黒色腫の小生検は、黒子又はその一部を含む。

【0077】

[0089] 一部の実施形態において、小生検は、パンチ生検である。一部の実施形態において、パンチ生検は、皮膚に押し込まれた円形ブレードを用いて取得される。一部の実施形態において、パンチ生検は、疑わしい黒子の周りの皮膚に押し込まれた円形ブレードを用いて取得される。一部の実施形態において、パンチ生検は、疑わしい黒子の周りの皮膚に押し込まれた円形ブレードを用いて取得され、皮膚の円形片が除去される。一部の実施形態において、小生検は、パンチ生検であり、腫瘍の丸い部分が除去される。

【0078】

[0090] 一部の実施形態において、小生検は、切除生検である。一部の実施形態において、小生検は切除生検であり、黒子又は腫瘍全体が除去される。一部の実施形態において、小生検は切除生検であり、正常な外観を有する小さい辺縁と共に、黒子又は腫瘍全体が除去される。

【0079】

[0091] 一部の実施形態において、小生検は、切開生検である。一部の実施形態において、小生検は切開生検であり、黒子又は腫瘍の最も不規則な部分のみが採取される。一部の実施形態において、小生検は切開生検であり、切開生検は、疑わしい黒子が非常に大きい場合など、他の技法を完了できない場合に使用される。

【0080】

[0092] 一部の実施形態において、小生検は、肺生検である。一部の実施形態において、小生検は、気管支鏡により取得される。一般に、気管支鏡では、患者は麻酔下に置かれ、小さい道具が鼻又は口を通り、喉を下って気管支に進み、ここで、いくつかの組織を除去するために小さい道具が使用される。一部の実施形態において、気管支鏡を介して腫瘍又は増殖物に到達できない場合、経胸腔針生検を利用することができる。一般に、経胸腔針生検では、患者も麻酔下にあり、針を皮膚から直接疑わしい箇所に挿入して、組織の小さいサンプルを除去する。一部の実施形態において、経胸腔針生検は、介入的画像診断（例えば、針を誘導するためのＸ線又はＣＴスキャンの使用）を必要とする場合がある。一部の実施形態において、小生検は、針生検により取得される。一部の実施形態において、小生検は、超音波内視鏡（例えば、ライトを備えた内視鏡であり、口を通して食道内に配置される）で取得される。一部の実施形態において、小生検は、外科的に取得される。

【0081】

[0093] 一部の実施形態において、小生検は、頭頸部生検である。一部の実施形態において、小生検は、切開生検である。一部の実施形態において、小生検は切開生検であり、組織の小片が異常に見える領域から切り取られる。一部の実施形態において、異常な領域が容易にアクセスされる場合、入院することなくサンプルが採取され得る。一部の実施形態において、腫瘍が口又は喉の内部のより深い位置にある場合、生検は、全身麻酔を伴い、手術室で行われる必要がある場合がある。一部の実施形態において、小生検は、切除生検である。一部の実施形態において、小生検は切除生検であり、領域全体が除去される。一部の実施形態において、小生検は、細針吸引（ＦＮＡ）である。一部の実施形態において、小生検は、細針吸引（ＦＮＡ）であり、腫瘍又はしこりから細胞を抽出（吸引）するために、シリンジに取り付けられた非常に細い針が使用される。一部の実施形態において、小生検は、パンチ生検である。一部の実施形態において、小生検はパンチ生検であり、疑わしい領域の一片を除去するために、パンチ鉗子が使用される。

【0082】

[0094] 一部の実施形態において、小生検は、子宮頸部生検である。一部の実施形態において、小生検は、コルポスコピーにより取得される。一般に、コルポスコピー法では、拡大双眼鏡に取り付けられた照明付き拡大鏡（コルポスコープ）の使用が採用され、子宮頸部の表面の小さい部分の生検に使用される。一部の実施形態において、小生検は、円錐切除／錐体生検である。一部の実施形態において、小生検は円錐切除／錐体生検であり、子宮頸部からより大きい組織片を除去するために外来手術が必要になる場合がある。一部の実施形態において、コーン生検は、診断の確認を助けることに加えて、コーン生検が初期処置として役立ち得る。

【0083】

[0095] 一部の実施形態において、腫瘍からのサンプルは、細針吸引（ＦＮＡ）、コア生検、小生検（例えば、パンチ生検を含む）として取得される。一部の実施形態において、サンプルは最初にG-Rex 10に入れられる。一部の実施形態において、１つ又は２つのコア生検及び／又は小生検サンプルがある場合、サンプルは最初にG-Rex 10に入れられる。一部の実施形態において、３つ、４つ、５つ、６つ、８つ、９つ又は１０個のコア生検及び／又は小生検サンプルがある場合、サンプルは最初にG-Rex 100に入れられる。一部の実施形態において、３つ、４つ、５つ、６つ、８つ、９つ又は１０個のコア生検及び／又は小生検サンプルがある場合、サンプルは最初にG-Rex 500に入れられる。

【0084】

[0096] ＦＮＡは、肺、黒色腫、頭頸部、子宮頸部、卵巣、膵臓、神経膠芽腫、結腸直腸及び肉腫からなる群から選択される腫瘍から取得され得る。一部の実施形態において、ＦＮＡは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者からの肺腫瘍などの肺腫瘍から取得される。一部の場合、ＮＳＣＬＣを有する患者は、以前に外科的処置を受けたことがある。

【0085】

[0097] 本明細書に記載されるＴＩＬは、ＦＮＡサンプルから得ることができる。一部の場合、ＦＮＡサンプルは、１８ゲージ針～２５ゲージ針の範囲のハイゲージの針を使用して患者から取得又は分離される。ハイゲージの針は、１８ゲージ、１９ゲージ、２０ゲージ、２１ゲージ、２２ゲージ、２３ゲージ、２４ゲージ又は２５ゲージとすることができる。一部の実施形態において、患者からのＦＮＡサンプルは、少なくとも４００，０００個のＴＩＬ、例えば、４００，０００個のＴＩＬ、４５０，０００個のＴＩＬ、５００，０００個のＴＩＬ、５５０，０００個のＴＩＬ、６００，０００個のＴＩＬ、６５０，０００個のＴＩＬ、７００，０００個のＴＩＬ、７５０，０００個のＴＩＬ、８００，０００個のＴＩＬ、８５０，０００個のＴＩＬ、９００，０００個のＴＩＬ、９５０，０００個のＴＩＬ又はそれを超える数のＴＩＬを含み得る。

【0086】

[0098] 一部の場合、本明細書に記載されるＴＩＬは、コア生検サンプルから得られる。一部の場合、コア生検サンプルは、１１ゲージ針～１６ゲージ針の範囲の外科用又は医療用の針を使用して患者から取得又は分離される。針は、１１ゲージ、１２ゲージ、１３ゲージ、１４ゲージ、１５ゲージ又は１６ゲージとすることができる。一部の実施形態において、患者からのコア生検サンプルは、少なくとも４００，０００個のＴＩＬ、例えば、４００，０００個のＴＩＬ、４５０，０００個のＴＩＬ、５００，０００個のＴＩＬ、５５０，０００個のＴＩＬ、６００，０００個のＴＩＬ、６５０，０００個のＴＩＬ、７００，０００個のＴＩＬ、７５０，０００個のＴＩＬ、８００，０００個のＴＩＬ、８５０，０００個のＴＩＬ、９００，０００個のＴＩＬ、９５０，０００個のＴＩＬ又はそれを超える数のＴＩＬを含み得る。

【0087】

[0099] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から得られる。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば、限定されないが、ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ GlutaMAX、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって作成した。腫瘍を酵素培地に置いた後、腫瘍を約１分間機械的に分離し得る。次に溶液を５％ＣＯ_２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再び約１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ_２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３度目に約１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ_２下３７℃での更に３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。

【0088】

[00100] 一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップ前の回収された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に回収した」細胞集団と呼ばれる。

【0089】

[00101] 一部の実施形態において、細胞は、以下に更に詳細に記載するステップＢに進む前に任意選択でサンプル回収後に凍結され、凍結貯蔵され得る。

【0090】

Ｂ．ステップＢ：第１の拡大培養
[00102] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第１の拡大培養（第１の拡大培養又は第１のＴＩＬ拡大培養とも称される）は、下記及び本明細書に記載される初期バルクＴＩＬ拡大培養ステップ（例えば、第１の拡大培養ステップ；これは、プレＲＥＰと称される拡大培養ステップを含み得る）、続いて、下記及び本明細書に記載される第２の拡大培養ステップ（例えば、急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるもの）、続いて、任意選択の凍結保存、続いて、下記及び本明細書に記載される更なる第２の拡大培養（例えば、再刺激ＲＥＰステップと称されることがあるもの）を使用して実施され得る。このプロセスによって入手したＴＩＬは、任意選択で、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられ得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは、第１の拡大培養後に凍結（即ち凍結保存）され、選択のために表現型決定されるまで保存され、次いで解凍された後、１回以上の第２の拡大培養ステップに進む。

【0091】

[00103] 腫瘍サンプルから入手した後に細胞が凍結される一部の実施形態において、細胞は、第１の拡大培養前に解凍される。

【0092】

[00104] 実施形態において、ＴＩＬ培養が２４ウェルプレートで、例えばCostar２４ウェル細胞培養クラスター、平底（Corning Incorporated、Corning, NYを使用して開始される場合、各ウェルには、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp.、Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０^６個の腫瘍消化物細胞又は１個の腫瘍断片を播種することができる。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ^３～１０ｍｍ^３である。

【0093】

[00105] 腫瘍断片の調製後、得られた細胞（即ち断片）は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び４－１ＢＢアゴニストにおいて培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と共に含む培地中で（又はある場合には本明細書に概説される通りａＡＰＣ細胞集団の存在下で）インキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して２１～３５日の期間にわたって培養され、それにより第２のＴＩＬ集団が得られる。一部の実施形態において、第１の拡大培養中の成長培地は、ＩＬ－２又はその変異体を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルについて２０～３０×１０^６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルについて２０×１０^６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルについて２５×１０^６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルについて３０×１０^６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は４～８×１０^６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は５～７×１０^６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は６×１０^６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は実施例４に記載される通り調製される。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬ間のＩＬ－２を含む。

【0094】

[00106] 一部の実施形態において、第１の拡大培養の培養培地は、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil, Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech, Auburn, CAから市販）又はＵＨＣＴ－１（BioLegend, San Diego, CA, USAから市販）である、ＯＫＴ－３などの抗ＣＤ３抗体を含む。一部の実施形態において、抗ＣＤ３抗体、例えば、ＯＫＴ－３は、約２０ｎｇ／ｍｌ～約８０ｎｇ／ｍｌの量で存在する。一部の実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、約２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５５ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、６５ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、８５ｎｇ／ｍｌ又は９０ｎｇ／ｍｌの量で存在する。一部の実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、約３０ｎｇ／ｍｌの量で存在する。一部の実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、約４５ｎｇ／ｍｌの量で存在する。一部の実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、約６０ｎｇ／ｍｌの量で存在する。

【0095】

[00107] 一部の実施形態において、第１の拡大培養細胞培養培地は、１つ以上の腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質及びその断片、誘導体、変異体、バイオシミラー並びに組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な量で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、５μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、約５μｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、約１０μｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、約１５μｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、約２０μｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、約２５μｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、約３０μｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、約３５μｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、約４０μｇ／ｍＬの濃度で存在する。

【0096】

[00108] 一部の実施形態において、第１の拡大培養は、抗原提示細胞又はＡＰＣとも呼ばれる、フィーダー細胞の存在下で起こり得る。

【0097】

[00109] 一実施形態において、本明細書に記載の第１の拡大培養手順は、ＴＩＬ拡大培養の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を要する。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、同種異系健常供血者からの標準的な全血ユニットから得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて得られる。一部の実施形態において、２．５×１０^８個のフィーダー細胞が第１の拡大培養中に用いられる。一部の実施形態において、１容器あたり２．５×１０^８個のフィーダー細胞が第１の拡大培養中に用いられる。一部の実施形態において、１つのGREX-10あたり２．５×１０^８個のフィーダー細胞が第１の拡大培養中に用いられる。一部の実施形態において、１つのGREX-100あたり２．５×１０^８個のフィーダー細胞が第１の拡大培養中に用いられる。

【0098】

[00110] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、同種異系ＰＢＭＣの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。

【0099】

[00111] 一部の実施形態において、１４日目の生細胞の総数が、第１の拡大培養の０日目に培養物に入れられた初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。

【0100】

[00112] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞はＰＢＭＣである。一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態において、第１の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００又は約１対５００である。一実施形態において、第１の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対５０～１対３００である。一実施形態において、第１の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対１００～１対２００である。

【0101】

[00113] 一実施形態において、本明細書に記載の第１の拡大培養手順は、約２．５×１０^８個のフィーダー細胞と約１００×１０^６個のＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第１の拡大培養手順は、約２．５×１０^８個のフィーダー細胞と約５０×１０^６個のＴＩＬの比を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第１の拡大培養は、約２．５×１０^８個のフィーダー細胞と約２５×１０^６個のＴＩＬを必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第１の拡大培養は、約２．５×１０^８個のフィーダー細胞を必要とする。更に別の実施形態において、第１の拡大培養は、第２の拡大培養で使用されるフィーダー細胞の数の４分の１、３分の１、１２分の５又は半分を必要とする。

【0102】

[00114] 一実施形態において、本明細書に記載の第１の拡大培養手順は、第１の拡大培養中に、ＴＩＬに対して過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、同種異系健常供血者からの標準的な全血ユニットから得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて得られる。一実施形態において、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。

【0103】

[00115] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。

【0104】

[00116] ある実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として又はそれと組み合わせて、第１の拡大培養で使用される。

【0105】

[00117] 一部の実施形態において、７又は１４日目の生細胞の総数が、第１の拡大培養の０日目（即ち第１の拡大培養の開始日）に培養物に入れられた初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。

【0106】

[00118] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３、４－１ＢＢアゴニスト及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、第１の拡大培養の０日目（即ち第１の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められ得る。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、１０ｕｇ／ｍｌの抗４－１ＢＢ抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、１０ｕｇ／ｍｌの抗４－１ＢＢ抗体及び６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、１０ｕｇ／ｍｌの抗４－１ＢＢ抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、１０ｕｇ／ｍｌの抗４－１ＢＢ抗体及び６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。

【0107】

[00119] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３、４－１ＢＢアゴニスト及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、第１の拡大培養の０日目（即ち第１の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められ得る。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、５～４０μｇ／ｍＬの４－１ＢＢアゴニスト及び１０００～６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、５～４０μｇ／ｍＬの４－１ＢＢアゴニスト及び２０００～５０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、５～４０μｇ／ｍＬの４－１ＢＢアゴニスト及び２０００～４０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、５～４０μｇ／ｍＬの４－１ＢＢアゴニスト及び２５００～３５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、５～４０μｇ／ｍＬの４－１ＢＢアゴニスト及び６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。

【0108】

[00120] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、これはＣＭ１（培養培地１）と称される。一部の実施形態において、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ １６４０からなる。培養が４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ^２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態において、各フラスコに、１０～４０ｍＬのＩＬ－２含有ＣＭ中の１０～４０×１０^６個の腫瘍消化物生細胞又は５～３０個の腫瘍断片をロードする。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ_２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ－２を補充し、５日目以降は２～３日毎に培地の半分を交換する。一部の実施形態において、第１の拡大培養は初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地中で行われる。一部の実施形態において、初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地はＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び４－１ＢＢアゴニストを含む。

【0109】

[00121] 一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日又は２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日間～２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１２日間～２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１３日間～２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１４日間～２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１５日間～２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１６日間～２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１７日間～２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１８日間～２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１９日間～２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２０日間～２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は最大２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間又は３５日間続行され得る。

【0110】

[00122] 一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養の開始の４又は５日後、培養物に、ＩＬ－２を補充した追加の培養培地を再供給する。他の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養の開始の４又は５日後、培養物に、ＩＬ－２を補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半量を、ＩＬ－２を補充した等量の新鮮な培養培地と交換する。

【0111】

[00123] 一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養の開始の４又は５日後、培養物に、ＩＬ－２及び４－１ＢＢアゴニストを補充した追加の培養培地を再供給する。他の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養の開始の４又は５日後、培養物に、ＩＬ－２及び４－１ＢＢアゴニストを補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半量を、ＩＬ－２を補充した等量の新鮮な培養培地と交換する。他の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養の開始の４又は５日後、培養物に、ＩＬ－２及び４－１ＢＢアゴニストを補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半量を、ＩＬ－２及び４－１ＢＢアゴニストを補充した等量の新鮮な培養培地と交換する。

【0112】

[00124] 一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養の開始の４又は５日後、培養物に、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を補充した追加の培養培地を再供給する。他の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養の開始の４又は５日後、培養物に、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半量を、ＩＬ－２を補充した等量の新鮮な培養培地と交換する。他の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養の開始の４又は５日後、培養物に、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半量を、ＩＬ－２及び４－１ＢＢアゴニストを補充した等量の新鮮な培養培地と交換する。他の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養の開始の４又は５日後、培養物に、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半量を、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を補充した等量の新鮮な培養培地と交換する。

【0113】

Ｃ．ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行
[00125] 一部の実施形態において、第１の拡大培養から得られたＴＩＬは、選択のための表現型決定まで保存される。一部の実施形態において、第１の拡大培養から得られたＴＩＬは、第１の拡大培養後、第２の拡大培養前に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行の一部として凍結保存される。例えば、一部の実施形態において、ＴＩＬは、ステップＢ後、ステップＤ前に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行の一部として凍結保存及び解凍される。例えば、一部の実施形態において、ＴＩＬは、ステップＢ後に凍結保存され、次いでステップＤに進む前に解凍される。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、腫瘍断片化が行われたときから約２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日又は３０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約２２日～３０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約２４日～３０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約２６日～３０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約２８日～３０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約３０日の時点で行われる。

【0114】

Ｄ．ステップＤ：第２の拡大培養
[00126] 一部の実施形態において、ＴＩＬ細胞集団は、ステップＡ及びステップＢ並びにステップＣと称される移行後、回収及び第１の拡大培養後、数が更に増加する。この更なる増加は、本明細書では第２の拡大培養と称され、これは、当技術分野で一般に急速拡大培養法と称される拡大培養プロセス（急速拡大培養プロトコル又はＲＥＰ）を含み得る。第２の拡大培養は、一般に、フィーダー細胞、サイトカイン源、抗ＣＤ３抗体及びＴＮＦＲＳＦアゴニストを含むいくつかの成分の１つ以上を含む、ガス透過性容器又は他の閉鎖系内の培養培地を使用して達成することができる。一部の実施形態において、第２の拡大培養の開始後１日、２日、３日又は４日で、ＴＩＬは、より大きい容量の容器に移される。

【0115】

[00127] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養（これはＲＥＰと称されることもある拡大培養を含み得る）は、当業者に公知の任意のＴＩＬフラスコ又は容器を使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又は１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約１日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約２日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約３日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約４日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約５日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約６日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約７日間～約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約１日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約２日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約３日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約５日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約６日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約７日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約８日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約９日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約１０日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約１１日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約１２日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約１３日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、第２の拡大培養の開始後、約１４日間続行し得る。

【0116】

[00128] 本発明の一実施形態において、第２の拡大培養ステップは、第１の拡大培養ステップについて上記した濃度のＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び４１－ＢＢアゴニストの１つ以上の存在下で実施することができる。一実施形態において、第２の拡大培養ステップの開始時の細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２及び１０μｇ／ｍｌの４－１ＢＢアゴニストを含む。

【0117】

[00129] ある実施形態において、第２の拡大培養は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと称される拡大培養を含む）を使用して、ガス透過性容器内で実施することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、フィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）の存在下において第２の拡大培養で拡大培養される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、フィーダー細胞の存在下において第２の拡大培養で拡大培養され、フィーダー細胞は、第１の拡大培養で存在するフィーダー細胞の濃度の２倍、２．４倍、２．５倍、３倍、３．５倍又は４倍である最終濃度まで添加される。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）又はインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）又はＵＨＣＴ－１（BioLegend、San Diego, CA, USAから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、任意選択で３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２又はＩＬ－１５など、Ｔ細胞成長因子の存在下において、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば０．３μΜ ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）など、任意選択でベクターから発現させることができる、１つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含む癌の１つ以上の抗原を第２の拡大培養中に含めることにより、インビトロでのＴＩＬの更なる刺激を誘発するように拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２及びＶＥＧＦＲ２又はその抗原性部分を挙げることができる。ＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ１つ又は複数の抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、ＴＩＬは、例えば、照射自己リンパ球又は照射ＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２によって更に再刺激することができる。一部の実施形態において、再刺激は、第２の拡大培養の一部として生じる。一部の実施形態において、照射された自己リンパ球の存在下において又は照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種リンパ球及びＩＬ－２と共に第２の拡大培養が発生する。

【0118】

[00130] 一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬ間のＩＬ－２を含む。

【0119】

[00131] 一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、３０ｎｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は約６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、ＯＫＴ－３抗体はムロモナブである。

【0120】

[00132] 一部の実施形態において、第２の拡大培養における培地は、ＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、培地は６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養における培地は、１容器あたり７．５×１０^８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養における培地は、ＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、１容器あたり５００ｍＬの培養培地及び３０μｇのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、第２の拡大培養における培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び７．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり、５００ｍＬの培養培地及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０μｇのＯＫＴ－３及び７．５×１０^８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。

【0121】

[00133] 一部の実施形態において、第２の拡大培養における培地は、ＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、培地は６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、培地は、１容器あたり５×１０^８～７．５×１０^８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養における培地は、ＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養における培地は、１容器あたり５００ｍＬの培養培地及び３０μｇのＯＫＴ－３を含む。一部の実施形態において、容器はGREX100 MCSフラスコである。一部の実施形態において、第２の拡大培養における培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３及び５×１０^８～７．５×１０^８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養における培地は、１容器あたり、５００ｍＬの培養培地及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０μｇのＯＫＴ－３及び５×１０^８～７．５×１０^８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。

【0122】

[00134] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質並びにそれらの断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。

【0123】

[00135] 一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を更に含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。

【0124】

[00136] 一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１の組み合わせが第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、本明細書に記載るようなステップＤプロセス中を含む、第２の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の組み合わせが第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１並びにそれらの任意の組み合わせは、本明細書に記載のように、ステップＤプロセス中に含められ得る。

【0125】

[00137] 一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、４－１ＢＢアゴニスト又は他のＴＮＦＲＳＦアゴニスト及び任意選択で抗原提示フィーダー細胞を含む添加細胞培養培地で実施され得る。

【0126】

[00138] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－１５を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。

【0127】

[00139] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２１を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。

【0128】

[00140] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。一実施形態において、拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣ及び／又は抗原提示細胞との比は、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約１：４５、約１：５０、約１：７５、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００又は約１：５００である。一実施形態において、拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：５０～１：３００である。一実施形態において、拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：１００～１：２００である。

【0129】

[00141] 一実施形態において、第２の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞（ここで、フィーダー細胞の濃度は、第１の拡大培養におけるフィーダー細胞濃度の少なくとも１．１倍（１．１×）、１．２×、１．３×、１．４×、１．５×、１．６×、１．７×、１．８×、１．８×、２×、２．１×、２．２×、２．３×、２．４×、２．５×、２．６×、２．７×、２．８×、２．９×、３．０×、３．１×、３．２×、３．３×、３．４×、３．５×、３．６×、３．７×、３．８×、３．９×又は４．０×）、３０ｍｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体、１０μｇ／ｍＬの抗４－１ＢＢ抗体アゴニスト及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバに移すまで培地補充が行われる（一般的に、使用済み培地の２／３の吸引及び等しい体積の新鮮培地での置換による、２／３の培地補充）。別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。

【0130】

[00142] 一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で考察されるように、７～９日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は７日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は８日間である。一部の実施形態において、第２の拡大培養は９日間である。

【0131】

[00143] 一実施形態において、第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養；並びにステップＤに参照されるものを含み得る）は、１００ｃｍガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量ガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている）において実施され得、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で５×１０^６又は１０×１０^６個のＴＩＬをＰＢＭＣと培養し得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ_２下３７℃でインキュベートし得る。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。５％ヒトＡＢ血清、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のGREX-100フラスコに戻し加え得る。GREX-100フラスコでＴＩＬを連続的に拡大培養する場合、１０又は１１日目に、ＴＩＬは、GREX-500などのより大きいフラスコに移動され得る。細胞は、培養１４日目に回収し得る。細胞は、培養１５日目に回収し得る。細胞は、培養１６日目に回収し得る。一部の実施形態において、細胞が別の成長チャンバに移されるまで培地交換が行われる。一部の実施形態において、培地の２／３は、使用済み培地の吸引及び等しい体積の新鮮培地での置換によって置き換えられる。一部の実施形態において、別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察する通りのGREXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。

【0132】

[00144] 一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）が実施され、これは、優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップを更に含む。

【0133】

[00145] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察する通り、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、４－１ＢＢアゴニストの１つ以上及び抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察する通り、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｕｇ／フラスコのＯＫＴ－３、１０μｇ／ｍＬの４－１ＢＢアゴニスト及び７．５×１０^８個の抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察する通り、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、４－１ＢＢアゴニスト及び抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察する通り、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｕｇ／フラスコのＯＫＴ－３、１０μｇ／ｍＬの４－１ＢＢアゴニスト及び５×１０^８個の抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。

【0134】

[00146] 一部の実施形態において、第２の拡大培養、例えば、ステップＤは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが容器として用いられる。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、例えば、G-REX-100又はG-REX-500である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-100である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-500である。

【0135】

[00147] 一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）が実施され、これは、優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップを更に含む。当技術分野で公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号に記載されている方法は、優れた腫瘍反応性に関するＴＩＬの選択に使用され得る。

【0136】

Ｅ．ステップＥ：ＴＩＬの回収
[00148] 第２の拡大培養ステップ後、細胞は、回収することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１、２、３、４回又はそれ以上の拡大培養ステップ後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、２回の拡大培養ステップ後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、２つの拡大培養ステップ、１つの第１の拡大培養及び１つの第２の拡大培養後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１つの拡大培養ステップ、第１の拡大培養ステップ後に回収される。

【0137】

[00149] ＴＩＬは、例えば、遠心によることを含めて、任意の適切な及び無菌の方法で回収することができる。ＴＩＬ回収方法は、当技術分野で周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、自動化系を使用して回収される。

【0138】

[00150] セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、例えば、Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及びInotech Biosystems International, Inc.を含む様々な供給源から市販されている。任意選択の細胞ベースのハーベスターを本方法で使用することができる。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、膜ベースの細胞ハーベスターである。一部の実施形態において、細胞回収は、LOVO系（Fresenius Kabi製）などの細胞処理系を介して行われる。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び／又は閉鎖系環境で、回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せず上清又は細胞培養培地を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された機器又は装置も指す。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。

【0139】

[00151] 一部の実施形態において、第２の拡大培養、例えば、ステップＤは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、バイオリアクターが容器として用いられる。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、例えば、G-REX-100又はG-REX-500である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-100である。一部の実施形態において、用いられるバイオリアクターは、G-REX-500である。

【0140】

[00152] 一部の実施形態において、ステップＥは、本明細書に記載のプロセスに従って実施される。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような閉鎖系が使用される。

【0141】

[00153] 一部の実施形態において、本明細書に記載された方法に従ってＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような方法を使用して、１４日目～１６日目のＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような方法を使用して、１４日目にＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような方法を使用して、１５日目にＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような方法を使用して、１６日目にＴＩＬが回収される。

【0142】

Ｆ．ステップＦ：最終的な製剤化／輸注バッグへの移動
[00154] 上記及び本明細書に詳細に概説され、例示的な順序で提供されるステップＡ～Ｅが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のＴＩＬが得られると、ＴＩＬは患者への投与における使用のため容器に移される。

【0143】

[00155] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したＴＩＬは医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本明細書に開示されるように拡大培養したＴＩＬは、当技術分野で公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくはおよそ３０～６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ内が挙げられる。

【0144】

フィーダー細胞及び抗原提示細胞
[00156] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順（例えば、図１のステップＤに記載された拡大培養及びＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＲＥＰ ＴＩＬ拡大培養中及び／又は第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて得られる。一実施形態において、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。

【0145】

[00157] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。

【0146】

[00158] ある実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として又はそれと組み合わせて、第２の拡大培養で使用される。

【0147】

[00159] 一部の実施形態において、７又は１４日目の生細胞の総数がＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目に培養（即ち第２の拡大培養の開始日）に移行した初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が許容可能である。

【0148】

[00160] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められ得る。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。

【0149】

[00161] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められ得る。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、１０ｕｇ／ｍｌの抗４－１ＢＢ抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、１０ｕｇ／ｍｌの抗４－１ＢＢ抗体及び６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、１０ｕｇ／ｍｌの抗４－１ＢＢ抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、１０ｕｇ／ｍｌの抗４－１ＢＢ抗体及び６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。

【0150】

[00162] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３、４－１ＢＢアゴニスト及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められ得る。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、５～４０μｇ／ｍｌの４－１ＢＢアゴニスト及び１０００～６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、５～４０μｇ／ｍｌの４－１ＢＢアゴニスト及び２０００～５０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、５～４０μｇ／ｍｌの４－１ＢＢアゴニスト及び２０００～４０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、５～４０μｇ／ｍｌの４－１ＢＢアゴニスト及び２５００～３５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体、５～４０μｇ／ｍｌの４－１ＢＢアゴニスト及び６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。

【0151】

[00163] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞はＰＢＭＣである。一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１対１０、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００又は約１対５００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対５０～１対３００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対１００～１対２００である。

【0152】

[00164] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約５×１０^８個のフィーダー細胞と約１００×１０^６個のＴＩＬの比を必要とする。一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約７．５×１０^８個のフィーダー細胞と約１００×１０^６個のＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約５×１０^８個のフィーダー細胞と約５０×１０^６個のＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約７．５×１０^８個のフィーダー細胞と約５０×１０^６個のＴＩＬの比を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約５×１０^８個のフィーダー細胞から約２５×１０^６個のＴＩＬを必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約７．５×１０^８個のフィーダー細胞と約２５×１０^６個のＴＩＬを必要とする。更に別の実施形態において、第２の拡大培養は、第１の拡大培養の２倍の数のフィーダー細胞を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第１の拡大培養が約２．５×１０^８個のフィーダー細胞を必要とする場合、第２の拡大培養は、約５×１０^８個のフィーダー細胞を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第１の拡大培養が約２．５×１０^８個のフィーダー細胞を必要とする場合、第２の拡大培養は、約７．５×１０^８個のフィーダー細胞を必要とする。更に別の実施形態において、第２の拡大培養は、第１の拡大培養の２倍（２．０×）、２．５×、３．０×、３．５×又は４．０×の数のフィーダー細胞を必要とする。

【0153】

[00165] ある実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、同種異系健常供血者からの標準的な全血ユニットから得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて得られる。一実施形態において、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、第１の拡大培養に添加されたＰＢＭＣの濃度の２倍で第２の拡大培養に添加される。

【0154】

[00166] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。

【0155】

[00167] ある実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として又はそれと組み合わせて、第２の拡大培養で使用される。

【0156】

ＰＢＭＣフィーダー細胞比
[00168] 一実施形態において、ＰＢＭＣフィーダー層の数は、以下のように計算される：
[00169] Ａ．Ｔ細胞の容積（直径１０μｍ）：Ｖ＝（４／３）πｒ^３＝５２３．６μｍ^３
[00170] Ｂ．高さ４０μｍ（４細胞）のG-Rex 100（Ｍ）の円柱フラスコ：Ｖ＝（４／３）πｒ^３＝４×１０^１２μｍ^３
[00171] Ｃ．円柱フラスコＢを満たすために必要な細胞数：４×１０^１２μｍ^３／５２３．６μｍ^３＝７．６×１０^８μｍ^３＊０．６４＝４．８６×１０^８
[00172] Ｄ．４Ｄ空間で最適に活性化できる細胞数：４．８６×１０^８／２４＝２０．２５×１０^６
[00173] Ｅ．G-Rex 500に外挿されたフィーダー及びＴＩＬの数：ＴＩＬ：１００×１０^６及びフィーダー：２．５×１０^９

【0157】

[00174] この計算では、１００ｃｍ^２ベースのシリンダー内でＴＩＬを活性化するための正二十面体ジオメトリを提供するために必要な単核細胞の数の概算が使用される。この計算は、ＮＣＩの実験データを厳密に反映したＴ細胞の閾値活性化の約５×１０^８の実験結果を導き出す。^（１）（Ｃ）乗数（０．６４）は、１９９２年にJaeger及びNagelによって計算された等価球のランダムデータ密度である^（２）。（Ｄ）除数２４は、４次元空間の「ニュートン数」^（３）で同様のオブジェクトに接触する可能性のある等価球の数である。

【0158】

[00175] ⁽¹⁾ Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (ＴＩＬ) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment.J Immunother.2012 Apr; 35(3):283-
292。

【0159】

[00176] ⁽²⁾ Jaeger HM, Nagel SR.Physics of the granular state.Science.1992 Mar 20;255(5051):1523-31。

【0160】

[00177] ⁽³⁾ O. R.Musin (2003).“The problem of the twenty-five spheres”.Russ.Math.Surv.58 (4):794-795。

【0161】

[00178] 一実施形態において、第１の拡大培養中に外因的に供給された抗原提示フィーダー細胞の数は、第２の拡大培養中に外因的に供給された抗原提示フィーダー細胞の数のおよそ半分である。特定の実施形態において、方法は、第２の拡大培養の細胞培養培地と比較して、およそ５０％少ない抗原提示細胞を含む細胞培養培地において、第１の拡大培養を実施することを含む。

【0162】

[00179] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給された抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）の数は、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数より大きい。

【0163】

[00180] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２０：１又は約２０：１の範囲から選択される。

【0164】

[00181] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～１０：１又は約１０：１の範囲から選択される。

【0165】

[00182] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～９：１又は約９：１の範囲から選択される。

【0166】

[00183] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～８：１又は約８：１の範囲から選択される。

【0167】

[00184] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～７：１又は約７：１の範囲から選択される。

【0168】

[00185] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～６：１又は約６：１の範囲から選択される。

【0169】

[00186] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～５：１又は約５：１の範囲から選択される。

【0170】

[00187] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～４：１又は約４：１の範囲から選択される。

【0171】

[00188] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～３：１又は約３：１の範囲から選択される。

【0172】

[00189] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．９：１又は約２．９：１の範囲から選択される。

【0173】

[00190] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．８：１又は約２．８：１の範囲から選択される。

【0174】

[00191] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．７：１又は約２．７：１の範囲から選択される。

【0175】

[00192] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．６：１又は約２．６：１の範囲から選択される。

【0176】

[00193] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．５：１又は約２．５：１の範囲から選択される。

【0177】

[00194] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．４：１又は約２．４：１の範囲から選択される。

【0178】

[00195] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．３：１又は約２．３：１の範囲から選択される。

【0179】

[00196] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．２：１又は約２．２：１の範囲から選択される。

【0180】

[00197] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．１：１又は約２．１：１の範囲から選択される。

【0181】

[00198] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２：１又は約２：１の範囲から選択される。

【0182】

[00199] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～１０：１又は約１０：１の範囲から選択される。

【0183】

[00200] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～５：１又は約５：１の範囲から選択される。

【0184】

[00201] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～４：１又は約４：１の範囲から選択される。

【0185】

[00202] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～３：１又は約３：１の範囲から選択される。

【0186】

[00203] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．９：１又は約２．９：１の範囲から選択される。

【0187】

[00204] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．８：１又は約２．８：１の範囲から選択される。

【0188】

[00205] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．７：１又は約２．７：１の範囲から選択される。

【0189】

[00206] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．６：１又は約２．６：１の範囲から選択される。

【0190】

[00207] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．５：１又は約２．５：１の範囲から選択される。

【0191】

[00208] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．４：１又は約２．４：１の範囲から選択される。

【0192】

[00209] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．３：１又は約２．３：１の範囲から選択される。

【0193】

[00210] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．２：１又は約２．２：１の範囲から選択される。

【0194】

[00211] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１～２．１：１又は約２．１：１の範囲から選択される。

【0195】

[00212] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、２：１又は約２：１である。

【0196】

[00213] 別の実施形態において、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数と、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数との比は、１．１：１若しくは約１．１：１、１．２：１若しくは約１．２：１、１．３：１若しくは約１．３：１、１．４：１若しくは約１．４：１、１．５：１若しくは約１．５：１、１．６：１若しくは約１．６：１、１．７：１若しくは約１．７：１、１．８：１若しくは約１．８：１、１．９：１若しくは約１．９：１、２：１若しくは約２：１、２．１：１若しくは約２．１：１、２．２：１若しくは約２．２：１、２．３：１若しくは約２．３：１、２．４：１若しくは約２．４：１、２．５：１若しくは約２．５：１、２．６：１若しくは約２．６：１、２．７：１若しくは約２．７：１、２．８：１若しくは約２．８：１、２．９：１若しくは約２．９：１、３：１若しくは約３：１、３．１：１若しくは約３．１：１、３．２：１若しくは約３．２：１、３．３：１若しくは約３．３：１、３．４：１若しくは約３．４：１、３．５：１若しくは約３．５：１、３．６：１若しくは約３．６：１、３．７：１若しくは約３．７：１、３．８：１若しくは約３．８：１、３．９：１若しくは約３．９：１、４：１若しくは約４：１、４．１：１若しくは約４．１：１、４．２：１若しくは約４．２：１、４．３：１若しくは約４．３：１、４．４：１若しくは約４．４：１、４．５：１若しくは約４．５：１、４．６：１若しくは約４．６：１、４．７：１若しくは約４．７：１、４．８：１若しくは約４．８：１、４．９：１若しくは約４．９：１又は５：１若しくは約５：１である。

【0197】

[00214] 別の実施形態において、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、１×１０^８若しくは約１×１０^８、１．１×１０^８若しくは約１．１×１０^８、１．２×１０^８若しくは約１．２×１０^８、１．３×１０^８若しくは約１．３×１０^８、１．４×１０^８若しくは約１．４×１０^８、１．５×１０^８若しくは約１．５×１０^８、１．６×１０^８若しくは約１．６×１０^８、１．７×１０^８若しくは約１．７×１０^８、１．８×１０^８若しくは約１．８×１０^８、１．９×１０^８若しくは約１．９×１０^８、２×１０^８若しくは約２×１０^８、２．１×１０^８若しくは約２．１×１０^８、２．２×１０^８若しくは約２．２×１０^８、２．３×１０^８若しくは約２．３×１０^８、２．４×１０^８若しくは約２．４×１０^８、２．５×１０^８若しくは約２．５×１０^８、２．６×１０^８若しくは約２．６×１０^８、２．７×１０^８若しくは約２．７×１０^８、２．８×１０^８若しくは約２．８×１０^８、２．９×１０^８若しくは約２．９×１０^８、３×１０^８若しくは約３×１０^８、３．１×１０^８若しくは約３．１×１０^８、３．２×１０^８若しくは約３．２×１０^８、３．３×１０^８若しくは約３．３×１０^８、３．４×１０^８若しくは約３．４×１０^８又は３．５×１０^８若しくは約３．５×１０^８ＡＰＣであり、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、３．５×１０^８若しくは約３．５×１０^８、３．６×１０^８若しくは約３．６×１０^８、３．７×１０^８若しくは約３．７×１０^８、３．８×１０^８若しくは約３．８×１０^８、３．９×１０^８若しくは約３．９×１０^８、４×１０^８若しくは約４×１０^８、４．１×１０^８若しくは約４．１×１０^８、４．２×１０^８若しくは約４．２×１０^８、４．３×１０^８若しくは約４．３×１０^８、４．４×１０^８若しくは約４．４×１０^８、４．５×１０^８若しくは約４．５×１０^８、４．６×１０^８若しくは約４．６×１０^８、４．７×１０^８若しくは約４．７×１０^８、４．８×１０^８若しくは約４．８×１０^８、４．９×１０^８若しくは約４．９×１０^８、５×１０^８若しくは約５×１０^８、５．１×１０^８若しくは約５．１×１０^８、５．２×１０^８若しくは約５．２×１０^８、５．３×１０^８若しくは約５．３×１０^８、５．４×１０^８若しくは約５．４×１０^８、５．５×１０^８若しくは約５．５×１０^８、５．６×１０^８若しくは約５．６×１０^８、５．７×１０^８若しくは約５．７×１０^８、５．８×１０^８若しくは約５．８×１０^８、５．９×１０^８若しくは約５．９×１０^８、６×１０^８若しくは約６×１０^８、６．１×１０^８若しくは約６．１×１０^８、６．２×１０^８若しくは約６．２×１０^８、６．３×１０^８若しくは約６．３×１０^８、６．４×１０^８若しくは約６．４×１０^８、６．５×１０^８若しくは約６．５×１０^８、６．６×１０^８若しくは約６．６×１０^８、６．７×１０^８若しくは約６．７×１０^８、６．８×１０^８若しくは約６．８×１０^８、６．９×１０^８若しくは約６．９×１０^８、７×１０^８若しくは約７×１０^８、７．１×１０^８若しくは約７．１×１０^８、７．２×１０^８若しくは約７．２×１０^８、７．３×１０^８若しくは約７．３×１０^８、７．４×１０^８若しくは約７．４×１０^８、７．５×１０^８若しくは約７．５×１０^８、７．６×１０^８若しくは約７．６×１０^８、７．７×１０^８若しくは約７．７×１０^８、７．８×１０^８若しくは約７．８×１０^８、７．９×１０^８若しくは約７．９×１０^８、８×１０^８若しくは約８×１０^８、８．１×１０^８若しくは約８．１×１０^８、８．２×１０^８若しくは約８．２×１０^８、８．３×１０^８若しくは約８．３×１０^８、８．４×１０^８若しくは約８．４×１０^８、８．５×１０^８若しくは約８．５×１０^８、８．６×１０^８若しくは約８．６×１０^８、８．７×１０^８若しくは約８．７×１０^８、８．８×１０^８若しくは約８．８×１０^８、８．９×１０^８若しくは約８．９×１０^８、９×１０^８若しくは約９×１０^８、９．１×１０^８若しくは約９．１×１０^８、９．２×１０^８若しくは約９．２×１０^８、９．３×１０^８若しくは約９．３×１０^８、９．４×１０^８若しくは約９．４×１０^８、９．５×１０^８若しくは約９．５×１０^８、９．６×１０^８若しくは約９．６×１０^８、９．７×１０^８若しくは約９．７×１０^８、９．８×１０^８若しくは約９．８×１０^８、９．９×１０^８若しくは約９．９×１０^８又は１×１０^９若しくは約１×１０^９ＡＰＣである。

【0198】

[00215] 別の実施形態において、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、１．５×１０^８又は約１．５×１０^８ＡＰＣ～３×１０^８又は約３×１０^８ＡＰＣの範囲から選択され、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、４×１０^８又は約４×１０^８ＡＰＣ～７．５×１０^８又は約７．５×１０^８ＡＰＣの範囲から選択される。

【0199】

[00216] 別の実施形態において、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、２×１０^８又は約２×１０^８ＡＰＣ～２．５×１０^８又は約２．５×１０^８ＡＰＣの範囲から選択され、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、４．５×１０^８又は約４．５×１０^８ＡＰＣ～５．５×１０^８又は約５．５×１０^８ＡＰＣの範囲から選択される。

【0200】

[00217] 別の実施形態において、第１の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、２．５×１０^８又は約２．５×１０^８ＡＰＣであり、第２の拡大培養中に外因的に供給されたＡＰＣの数は、５×１０^８又は約５×１０^８ＡＰＣである。

【0201】

[00218] 別の実施形態において、第１の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、１．０×１０^６又は約１．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～４．５×１０^６又は約４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

【0202】

[00219] 別の実施形態において、第１の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、１．５×１０^６又は約１．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～３．５×１０^６又は約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

【0203】

[00220] 別の実施形態において、第１の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２×１０^６又は約２×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～３×１０^６又は約３×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

【0204】

[00221] 別の実施形態において、第１の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２×１０^６又は約２×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で培養フラスコに播種される。

【0205】

[00222] 別の実施形態において、第１の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、１．０×１０^６若しくは約１．０×１０^６、１．１×１０^６若しくは約１．１×１０^６、１．２×１０^６若しくは約１．２×１０^６、１．３×１０^６若しくは約１．３×１０^６、１．４×１０^６若しくは約１．４×１０^６、１．５×１０^６若しくは約１．５×１０^６、１．６×１０^６若しくは約１．６×１０^６、１．７×１０^６若しくは約１．７×１０^６、１．８×１０^６若しくは約１．８×１０^６、１．９×１０^６若しくは約１．９×１０^６、２×１０^６若しくは約２×１０^６、２．１×１０^６若しくは約２．１×１０^６、２．２×１０^６若しくは約２．２×１０^６、２．３×１０^６若しくは約２．３×１０^６、２．４×１０^６若しくは約２．４×１０^６、２．５×１０^６若しくは約２．５×１０^６、２．６×１０^６若しくは約２．６×１０^６、２．７×１０^６若しくは約２．７×１０^６、２．８×１０^６若しくは約２．８×１０^６、２．９×１０^６若しくは約２．９×１０^６、３×１０^６若しくは約３×１０^６、３．１×１０^６若しくは約３．１×１０^６、３．２×１０^６若しくは約３．２×１０^６、３．３×１０^６若しくは約３．３×１０^６、３．４×１０^６若しくは約３．４×１０^６、３．５×１０^６若しくは約３．５×１０^６、３．６×１０^６若しくは約３．６×１０^６、３．７×１０^６若しくは約３．７×１０^６、３．８×１０^６若しくは約３．８×１０^６、３．９×１０^６若しくは約３．９×１０^６、４×１０^６若しくは約４×１０^６、４．１×１０^６若しくは約４．１×１０^６、４．２×１０^６若しくは約４．２×１０^６、４．３×１０^６若しくは約４．３×１０^６、４．４×１０^６若しくは約４．４×１０^６又は４．５×１０^６若しくは約４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で培養フラスコに播種される。

【0206】

[00223] 別の実施形態において、第２の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２．５×１０^６又は約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～７．５×１０^６又は約７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

【0207】

[00224] 別の実施形態において、第２の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、３．５×１０^６又は約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約６．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

【0208】

[00225] 別の実施形態において、第２の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、４．０×１０^６又は約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約５．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

【0209】

[00226] 別の実施形態において、第２の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、４．０×１０^６又は約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

【0210】

[00227] 別の実施形態において、第２の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２．５×１０^６若しくは約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２、２．６×１０^６若しくは約２．６×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２、２．７×１０^６若しくは約２．７×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２、２．８×１０^６若しくは約２．８×１０^６、２．９×１０^６若しくは約２．９×１０^６、３×１０^６若しくは約３×１０^６、３．１×１０^６若しくは約３．１×１０^６、３．２×１０^６若しくは約３．２×１０^６、３．３×１０^６若しくは約３．３×１０^６、３．４×１０^６若しくは約３．４×１０^６、３．５×１０^６若しくは約３．５×１０^６、３．６×１０^６若しくは約３．６×１０^６、３．７×１０^６若しくは約３．７×１０^６、３．８×１０^６若しくは約３．８×１０^６、３．９×１０^６若しくは約３．９×１０^６、４×１０^６若しくは約４×１０^６、４．１×１０^６若しくは約４．１×１０^６、４．２×１０^６若しくは約４．２×１０^６、４．３×１０^６若しくは約４．３×１０^６、４．４×１０^６若しくは約４．４×１０^６、４．５×１０^６若しくは約４．５×１０^６、４．６×１０^６若しくは約４．６×１０^６、４．７×１０^６若しくは約４．７×１０^６、４．８×１０^６若しくは約４．８×１０^６、４．９×１０^６若しくは約４．９×１０^６、５×１０^６若しくは約５×１０^６、５．１×１０^６若しくは約５．１×１０^６、５．２×１０^６若しくは約５．２×１０^６、５．３×１０^６若しくは約５．３×１０^６、５．４×１０^６若しくは約５．４×１０^６、５．５×１０^６若しくは約５．５×１０^６、５．６×１０^６若しくは約５．６×１０^６、５．７×１０^６若しくは約５．７×１０^６、５．８×１０^６若しくは約５．８×１０^６、５．９×１０^６若しくは約５．９×１０^６、６×１０^６若しくは約６×１０^６、６．１×１０^６若しくは約６．１×１０^６、６．２×１０^６若しくは約６．２×１０^６、６．３×１０^６若しくは約６．３×１０^６、６．４×１０^６若しくは約６．４×１０^６、６．５×１０^６若しくは約６．５×１０^６、６．６×１０^６若しくは約６．６×１０^６、６．７×１０^６若しくは約６．７×１０^６、６．８×１０^６若しくは約６．８×１０^６、６．９×１０^６若しくは約６．９×１０^６、７×１０^６若しくは約７×１０^６、７．１×１０^６若しくは約７．１×１０^６、７．２×１０^６若しくは約７．２×１０^６、７．３×１０^６若しくは約７．３×１０^６、７．４×１０^６若しくは約７．４×１０^６又は７．５×１０^６若しくは約７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で培養フラスコに播種される。

【0211】

[00228] 別の実施形態において、第１の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、１．０×１０^６若しくは約１．０×１０^６、１．１×１０^６若しくは約１．１×１０^６、１．２×１０^６若しくは約１．２×１０^６、１．３×１０^６若しくは約１．３×１０^６、１．４×１０^６若しくは約１．４×１０^６、１．５×１０^６若しくは約１．５×１０^６、１．６×１０^６若しくは約１．６×１０^６、１．７×１０^６若しくは約１．７×１０^６、１．８×１０^６若しくは約１．８×１０^６、１．９×１０^６若しくは約１．９×１０^６、２×１０^６若しくは約２×１０^６、２．１×１０^６若しくは約２．１×１０^６、２．２×１０^６若しくは約２．２×１０^６、２．３×１０^６若しくは約２．３×１０^６、２．４×１０^６若しくは約２．４×１０^６、２．５×１０^６若しくは約２．５×１０^６、２．６×１０^６若しくは約２．６×１０^６、２．７×１０^６若しくは約２．７×１０^６、２．８×１０^６若しくは約２．８×１０^６、２．９×１０^６若しくは約２．９×１０^６、３×１０^６若しくは約３×１０^６、３．１×１０^６若しくは約３．１×１０^６、３．２×１０^６若しくは約３．２×１０^６、３．３×１０^６若しくは約３．３×１０^６、３．４×１０^６若しくは約３．４×１０^６、３．５×１０^６若しくは約３．５×１０^６、３．６×１０^６若しくは約３．６×１０^６、３．７×１０^６若しくは約３．７×１０^６、３．８×１０^６若しくは約３．８×１０^６、３．９×１０^６若しくは約３．９×１０^６、４×１０^６若しくは約４×１０^６、４．１×１０^６若しくは約４．１×１０^６、４．２×１０^６若しくは約４．２×１０^６、４．３×１０^６若しくは約４．３×１０^６、４．４×１０^６若しくは約４．４×１０^６又は４．５×１０^６若しくは約４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で培養フラスコに播種され、第２の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２．５×１０^６若しくは約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２、２．６×１０^６若しくは約２．６×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２、２．７×１０^６若しくは約２．７×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２、２．８×１０^６若しくは約２．８×１０^６、２．９×１０^６若しくは約２．９×１０^６、３×１０^６若しくは約３×１０^６、３．１×１０^６若しくは約３．１×１０^６、３．２×１０^６若しくは約３．２×１０^６、３．３×１０^６若しくは約３．３×１０^６、３．４×１０^６若しくは約３．４×１０^６、３．５×１０^６若しくは約３．５×１０^６、３．６×１０^６若しくは約３．６×１０^６、３．７×１０^６若しくは約３．７×１０^６、３．８×１０^６若しくは約３．８×１０^６、３．９×１０^６若しくは約３．９×１０^６、４×１０^６若しくは約４×１０^６、４．１×１０^６若しくは約４．１×１０^６、４．２×１０^６若しくは約４．２×１０^６、４．３×１０^６若しくは約４．３×１０^６、４．４×１０^６若しくは約４．４×１０^６、４．５×１０^６若しくは約４．５×１０^６、４．６×１０^６若しくは約４．６×１０^６、４．７×１０^６若しくは約４．７×１０^６、４．８×１０^６若しくは約４．８×１０^６、４．９×１０^６若しくは約４．９×１０^６、５×１０^６若しくは約５×１０^６、５．１×１０^６若しくは約５．１×１０^６、５．２×１０^６若しくは約５．２×１０^６、５．３×１０^６若しくは約５．３×１０^６、５．４×１０^６若しくは約５．４×１０^６、５．５×１０^６若しくは約５．５×１０^６、５．６×１０^６若しくは約５．６×１０^６、５．７×１０^６若しくは約５．７×１０^６、５．８×１０^６若しくは約５．８×１０^６、５．９×１０^６若しくは約５．９×１０^６、６×１０^６若しくは約６×１０^６、６．１×１０^６若しくは約６．１×１０^６、６．２×１０^６若しくは約６．２×１０^６、６．３×１０^６若しくは約６．３×１０^６、６．４×１０^６若しくは約６．４×１０^６、６．５×１０^６若しくは約６．５×１０^６、６．６×１０^６若しくは約６．６×１０^６、６．７×１０^６若しくは約６．７×１０^６、６．８×１０^６若しくは約６．８×１０^６、６．９×１０^６若しくは約６．９×１０^６、７×１０^６若しくは約７×１０^６、７．１×１０^６若しくは約７．１×１０^６、７．２×１０^６若しくは約７．２×１０^６、７．３×１０^６若しくは約７．３×１０^６、７．４×１０^６若しくは約７．４×１０^６又は７．５×１０^６若しくは約７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で培養フラスコに播種される。

【0212】

[00229] 別の実施形態において、第１の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、１．０×１０^６又は約１．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～４．５×１０^６又は約４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲である密度で培養フラスコに播種され、第２の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２．５×１０^６又は約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～７．５×１０^６又は約７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲である密度で培養フラスコに播種される。

【0213】

[00230] 別の実施形態において、第１の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、１．５×１０^６又は約１．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～３．５×１０^６又は約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲である密度で培養フラスコに播種され、第２の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、３．５×１０^６又は約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～６×１０^６又は約６×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲である密度で培養フラスコに播種される。

【0214】

[00231] 別の実施形態において、第１の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２×１０^６又は約２×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～３×１０^６又は約３×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲である密度で培養フラスコに播種され、第２の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、４×１０^６又は約４×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～５．５×１０^６又は約５．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲である密度で培養フラスコに播種される。

【0215】

[00232] 別の実施形態において、第１の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、２×１０^６又は約２×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で培養フラスコに播種され、第２の拡大培養で外因的に供給されたＡＰＣは、４×１０^６又は約４×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で培養フラスコに播種される。

【0216】

[00233] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＰＢＭＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２０：１又は約２０：１の範囲である。

【0217】

[00234] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＰＢＭＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～１０：１又は約１０：１の範囲である。

【0218】

[00235] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＰＢＭＣの数との比は、１．１：１又は約１．１：１～９：１又は約９：１の範囲である。

【0219】

[00236] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～８：１又は約８：１の範囲である。

【0220】

[00237] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～７：１又は約７：１の範囲である。

【0221】

[00238] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～６：１又は約６：１の範囲である。

【0222】

[00239] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～５：１又は約５：１の範囲である。

【0223】

[00240] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～４：１又は約４：１の範囲である。

【0224】

[00241] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～３：１又は約３：１の範囲である。

【0225】

[00242] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．９：１又は約２．９：１の範囲である。

【0226】

[00243] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．８：１又は約２．８：１の範囲である。

【0227】

[00244] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．７：１又は約２．７：１の範囲である。

【0228】

[00245] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．６：１又は約２．６：１の範囲である。

【0229】

[00246] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．５：１又は約２．５：１の範囲である。

【0230】

[00247] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．４：１又は約２．４：１の範囲である。

【0231】

[00248] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．３：１又は約２．３：１の範囲である。

【0232】

[00249] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．２：１又は約２．２：１の範囲である。

【0233】

[00250] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２．１：１又は約２．１：１の範囲である。

【0234】

[00251] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１又は約１．１：１～２：１又は約２：１の範囲である。

【0235】

[00252] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～１０：１又は約１０：１の範囲である。

【0236】

[00253] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～５：１又は約５：１の範囲である。

【0237】

[00254] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～４：１又は約４：１の範囲である。

【0238】

[00255] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～３：１又は約３：１の範囲である。

【0239】

[00256] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．９：１又は約２．９：１の範囲である。

【0240】

[00257] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．８：１又は約２．８：１の範囲である。

【0241】

[00258] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．７：１又は約２．７：１の範囲である。

【0242】

[00259] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．６：１又は約２．６：１の範囲から選択される。

【0243】

[00260] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．５：１又は約２．５：１の範囲である。

【0244】

[00261] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．４：１又は約２．４：１の範囲である。

【0245】

[00262] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．３：１又は約２．３：１の範囲である。

【0246】

[00263] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．２：１又は約２．２：１の範囲である。

【0247】

[00264] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１～２．１：１又は約２．１：１の範囲である。

【0248】

[00265] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、２：１又は約２：１である。

【0249】

[00266] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数と、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数との比は、１．１：１若しくは約１．１：１、１．２：１若しくは約１．２：１、１．３：１若しくは約１．３：１、１．４：１若しくは約１．４：１、１．５：１若しくは約１．５：１、１．６：１若しくは約１．６：１、１．７：１若しくは約１．７：１、１．８：１若しくは約１．８：１、１．９：１若しくは約１．９：１、２：１若しくは約２：１、２．１：１若しくは約２．１：１、２．２：１若しくは約２．２：１、２．３：１若しくは約２．３：１、２．４：１若しくは約２．４：１、２．５：１若しくは約２．５：１、２．６：１若しくは約２．６：１、２．７：１若しくは約２．７：１、２．８：１若しくは約２．８：１、２．９：１若しくは約２．９：１、３：１若しくは約３：１、３．１：１若しくは約３．１：１、３．２：１若しくは約３．２：１、３．３：１若しくは約３．３：１、３．４：１若しくは約３．４：１、３．５：１若しくは約３．５：１、３．６：１若しくは約３．６：１、３．７：１若しくは約３．７：１、３．８：１若しくは約３．８：１、３．９：１若しくは約３．９：１、４：１若しくは約４：１、４．１：１若しくは約４．１：１、４．２：１若しくは約４．２：１、４．３：１若しくは約４．３：１、４．４：１若しくは約４．４：１、４．５：１若しくは約４．５：１、４．６：１若しくは約４．６：１、４．７：１若しくは約４．７：１、４．８：１若しくは約４．８：１、４．９：１若しくは約４．９：１又は５：１若しくは約５：１である。

【0250】

[00267] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、１×１０^８若しくは約１×１０^８、１．１×１０^８若しくは約１．１×１０^８、１．２×１０^８若しくは約１．２×１０^８、１．３×１０^８若しくは約１．３×１０^８、１．４×１０^８若しくは約１．４×１０^８、１．５×１０^８若しくは約１．５×１０^８、１．６×１０^８若しくは約１．６×１０^８、１．７×１０^８若しくは約１．７×１０^８、１．８×１０^８若しくは約１．８×１０^８、１．９×１０^８若しくは約１．９×１０^８、２×１０^８若しくは約２×１０^８、２．１×１０^８若しくは約２．１×１０^８、２．２×１０^８若しくは約２．２×１０^８、２．３×１０^８若しくは約２．３×１０^８、２．４×１０^８若しくは約２．４×１０^８、２．５×１０^８若しくは約２．５×１０^８、２．６×１０^８若しくは約２．６×１０^８、２．７×１０^８若しくは約２．７×１０^８、２．８×１０^８若しくは約２．８×１０^８、２．９×１０^８若しくは約２．９×１０^８、３×１０^８若しくは約３×１０^８、３．１×１０^８若しくは約３．１×１０^８、３．２×１０^８若しくは約３．２×１０^８、３．３×１０^８若しくは約３．３×１０^８、３．４×１０^８若しくは約３．４×１０^８又は３．５×１０^８若しくは約３．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）であり、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、３．５×１０^８若しくは約３．５×１０^８、３．６×１０^８若しくは約３．６×１０^８、３．７×１０^８若しくは約３．７×１０^８、３．８×１０^８若しくは約３．８×１０^８、３．９×１０^８若しくは約３．９×１０^８、４×１０^８若しくは約４×１０^８、４．１×１０^８若しくは約４．１×１０^８、４．２×１０^８若しくは約４．２×１０^８、４．３×１０^８若しくは約４．３×１０^８、４．４×１０^８若しくは約４．４×１０^８、４．５×１０^８若しくは約４．５×１０^８、４．６×１０^８若しくは約４．６×１０^８、４．７×１０^８若しくは約４．７×１０^８、４．８×１０^８若しくは約４．８×１０^８、４．９×１０^８若しくは約４．９×１０^８、５×１０^８若しくは約５×１０^８、５．１×１０^８若しくは約５．１×１０^８、５．２×１０^８若しくは約５．２×１０^８、５．３×１０^８若しくは約５．３×１０^８、５．４×１０^８若しくは約５．４×１０^８、５．５×１０^８若しくは約５．５×１０^８、５．６×１０^８若しくは約５．６×１０^８、５．７×１０^８若しくは約５．７×１０^８、５．８×１０^８若しくは約５．８×１０^８、５．９×１０^８若しくは約５．９×１０^８、６×１０^８若しくは約６×１０^８、６．１×１０^８若しくは約６．１×１０^８、６．２×１０^８若しくは約６．２×１０^８、６．３×１０^８若しくは約６．３×１０^８、６．４×１０^８若しくは約６．４×１０^８、６．５×１０^８若しくは約６．５×１０^８、６．６×１０^８若しくは約６．６×１０^８、６．７×１０^８若しくは約６．７×１０^８、６．８×１０^８若しくは約６．８×１０^８、６．９×１０^８若しくは約６．９×１０^８、７×１０^８若しくは約７×１０^８、７．１×１０^８若しくは約７．１×１０^８、７．２×１０^８若しくは約７．２×１０^８、７．３×１０^８若しくは約７．３×１０^８、７．４×１０^８若しくは約７．４×１０^８、７．５×１０^８若しくは約７．５×１０^８、７．６×１０^８若しくは約７．６×１０^８、７．７×１０^８若しくは約７．７×１０^８、７．８×１０^８若しくは約７．８×１０^８、７．９×１０^８若しくは約７．９×１０^８、８×１０^８若しくは約８×１０^８、８．１×１０^８若しくは約８．１×１０^８、８．２×１０^８若しくは約８．２×１０^８、８．３×１０^８若しくは約８．３×１０^８、８．４×１０^８若しくは約８．４×１０^８、８．５×１０^８若しくは約８．５×１０^８、８．６×１０^８若しくは約８．６×１０^８、８．７×１０^８若しくは約８．７×１０^８、８．８×１０^８若しくは約８．８×１０^８、８．９×１０^８若しくは約８．９×１０^８、９×１０^８若しくは約９×１０^８、９．１×１０^８若しくは約９．１×１０^８、９．２×１０^８若しくは約９．２×１０^８、９．３×１０^８若しくは約９．３×１０^８、９．４×１０^８若しくは約９．４×１０^８、９．５×１０^８若しくは約９．５×１０^８、９．６×１０^８若しくは約９．６×１０^８、９．７×１０^８若しくは約９．７×１０^８、９．８×１０^８若しくは約９．８×１０^８、９．９×１０^８若しくは約９．９×１０^８又は１×１０^９若しくは約１×１０^９ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）である。

【0251】

[00268] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、１×１０^８又は約１×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～３．５×１０^８又は約３．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲であり、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、３．５×１０^８又は約３．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～１×１０^９又は約１×１０^９ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲である。

【0252】

[00269] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、１．５×１０^８又は約１．５×１０^８ＡＰＣ～３×１０^８又は約３×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲であり、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、４×１０^８又は約４×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～７．５×１０^８又は約７．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲である。

【0253】

[00270] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、２×１０^８又は約２×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～２．５×１０^８又は約２．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲であり、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、４．５×１０^８又は約４．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～５．５×１０^８又は約５．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲である。

【0254】

[00271] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、２．５×１０^８又は約２．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）であり、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、５×１０^８又は約５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）である。

【0255】

[00272] 一実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）に添加されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の層数は、第２の拡大培養の０日目（開始時）に添加されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の層数のおよそ半分である。一定の実施形態において、方法は、第１のＴＩＬ集団に第１の拡大培養の０日目（開始時）に抗原提示細胞層を追加すること及び第２のＴＩＬ集団に第２の拡大培養の０日目（開始時）に抗原提示細胞層を追加することを含み、第１のＴＩＬ集団に添加された抗原提示細胞層の数は、第２のＴＩＬ集団に添加された抗原提示細胞層の数のおよそ５０％である。

【0256】

[00273] 別の実施形態において、第２の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の層の数は、第１の拡大培養の０日目（開始時）に外因的に供給されたＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の層の数より大きい。

【0257】

[00274] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、２又は約２細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、４又は約４細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。

【0258】

[00275] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、１又は約１細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、３又は約３細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。

【0259】

[00276] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、１．５又は約１．５細胞層～２．５又は約２．５細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、３又は約３細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。

【0260】

[00277] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、１又は約１細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、２又は約２細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。

【0261】

[00278] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、１若しくは約１、１．１若しくは約１．１、１．２若しくは約１．２、１．３若しくは約１．３、１．４若しくは約１．４、１．５若しくは約１．５、１．６若しくは約１．６、１．７若しくは約１．７、１．８若しくは約１．８、１．９若しくは約１．９、２若しくは約２、２．１若しくは約２．１、２．２若しくは約２．２、２．３若しくは約２．３、２．４若しくは約２．４、２．５若しくは約２．５、２．６若しくは約２．６、２．７若しくは約２．７、２．８若しくは約２．８、２．９若しくは約２．９又は３若しくは約３細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、３．１若しくは約３．１、３．２若しくは約３．２、３．３若しくは約３．３、３．４若しくは約３．４、３．５若しくは約３．５、３．６若しくは約３．６、３．７若しくは約３．７、３．８若しくは約３．８、３．９若しくは約３．９、４若しくは約４、４．１若しくは約４．１、４．２若しくは約４．２、４．３若しくは約４．３、４．４若しくは約４．４、４．５若しくは約４．５、４．６若しくは約４．６、４．７若しくは約４．７、４．８若しくは約４．８、４．９若しくは約４．９、５若しくは約５、５．１若しくは約５．１、５．２若しくは約５．２、５．３若しくは約５．３、５．４若しくは約５．４、５．５若しくは約５．５、５．６若しくは約５．６、５．７若しくは約５．７、５．８若しくは約５．８、５．９若しくは約５．９、６若しくは約６、６．１若しくは約６．１、６．２若しくは約６．２、６．３若しくは約６．３、６．４若しくは約６．４、６．５若しくは約６．５、６．６若しくは約６．６、６．７若しくは約６．７、６．８若しくは約６．８、６．９若しくは約６．９、７若しくは約７、７．１若しくは約７．１、７．２若しくは約７．２、７．３若しくは約７．３、７．４若しくは約７．４、７．５若しくは約７．５、７．６若しくは約７．６、７．７若しくは約７．７、７．８若しくは約７．８、７．９若しくは約７．９又は８若しくは約８細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。

【0262】

[00279] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、１又は約１細胞層～２又は約２細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、３又は約３細胞層～１０又は約１０細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。

【0263】

[00280] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、２又は約２細胞層～３又は約３細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、４又は約４細胞層～８又は約８細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。

【0264】

[00281] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、２又は約２細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、４又は約４細胞層～８又は約８細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。

【0265】

[00282] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、１若しくは約１、２若しくは約２又は３若しくは約３細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９又は１０若しくは約１０細胞層の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われる。

【0266】

[00283] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：１０又は約１：１０の範囲である。

【0267】

[00284] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：８又は約１：８の範囲である。

【0268】

[00285] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：７又は約１：７の範囲である。

【0269】

[00286] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：６又は約１：６の範囲である。

【0270】

[00287] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：５又は約１：５の範囲である。

【0271】

[00288] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：４又は約１：４の範囲である。

【0272】

[00289] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：３又は約１：３の範囲である。

【0273】

[00290] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：２又は約１：２の範囲である。

【0274】

[00291] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．２又は約１：１．２～１：８又は約１：８の範囲である。

【0275】

[00292] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．３又は約１：１．３～１：７又は約１：７の範囲である。

【0276】

[00293] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の７日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．４又は約１：１．４～１：６又は約１：６の範囲である。

【0277】

[00294] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．５又は約１：１．５～１：５又は約１：５の範囲である。

【0278】

[00295] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．６又は約１：１．６～１：４又は約１：４の範囲である。

【0279】

[00296] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．７又は約１：１．７～１：３．５又は約１：３．５の範囲である。

【0280】

[00297] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．８又は約１：１．８～１：３又は約１：３の範囲である。

【0281】

[00298] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．９又は約１：１．９～１：２．５又は約１：２．５の範囲である。

【0282】

[00299] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：２又は約１：２である。

【0283】

[00300] 別の実施形態において、第１の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と等しい第１の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、第２の拡大培養の０日目（開始時）は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数と等しい第２の厚さ平均を有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で行われ、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層数と、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層数との比は、１：１．１若しくは約１：１．１、１：１．２若しくは約１：１．２、１：１．３若しくは約１：１．３、１：１．４若しくは約１：１．４、１：１．５若しくは約１：１．５、１：１．６若しくは約１：１．６、１：１．７若しくは約１：１．７、１：１．８若しくは約１：１．８、１：１．９若しくは約１：１．９、１：２若しくは約１：２、１：２．１若しくは約１：２．１、１：２．２若しくは約１：２．２、１：２．３若しくは約１：２．３、１：２．４若しくは約１：２．４、１：２．５若しくは約１：２．５、１：２．６若しくは約１：２．６、１：２．７若しくは約１：２．７、１：２．８若しくは約１：２．８、１：２．９若しくは約１：２．９、１：３若しくは約１：３、１：３．１若しくは約１：３．１、１：３．２若しくは約１：３．２、１：３．３若しくは約１：３．３、１：３．４若しくは約１：３．４、１：３．５若しくは約１：３．５、１：３．６若しくは約１：３．６、１：３．７若しくは約１：３．７、１：３．８若しくは約１：３．８、１：３．９若しくは約１：３．９、１：４若しくは約１：４、１：４．１若しくは約１：４．１、１：４．２若しくは約１：４．２、１：４．３若しくは約１：４．３、１：４．４若しくは約１：４．４、１：４．５若しくは約１：４．５、１：４．６若しくは約１：４．６、１：４．７若しくは約１：４．７、１：４．８若しくは約１：４．８、１：４．９若しくは約１：４．９、１：５若しくは約１：５、１：５．１若しくは約１：５．１、１：５．２若しくは約１：５．２、１：５．３若しくは約１：５．３、１：５．４若しくは約１：５．４、１：５．５若しくは約１：５．５、１：５．６若しくは約１：５．６、１：５．７若しくは約１：５．７、１：５．８若しくは約１：５．８、１：５．９若しくは約１：５．９、１：６若しくは約１：６、１：６．１若しくは約１：６．１、１：６．２若しくは約１：６．２、１：６．３若しくは約１：６．３、１：６．４若しくは約１：６．４、１：６．５若しくは約１：６．５、１：６．６若しくは約１：６．６、１：６．７若しくは約１：６．７、１：６．８若しくは約１：６．８、１：６．９若しくは約１：６．９、１：７若しくは約１：７、１：７．１若しくは約１：７．１、１：７．２若しくは約１：７．２、１：７．３若しくは約１：７．３、１：７．４若しくは約１：７．４、１：７．５若しくは約１：７．５、１：７．６若しくは約１：７．６、１：７．７若しくは約１：７．７、１：７．８若しくは約１：７．８、１：７．９若しくは約１：７．９、１：８若しくは約１：８、１：８．１若しくは約１：８．１、１：８．２若しくは約１：８．２、１：８．３若しくは約１：８．３、１：８．４若しくは約１：８．４、１：８．５若しくは約１：８．５、１：８．６若しくは約１：８．６、１：８．７若しくは約１：８．７、１：８．８若しくは約１：８．８、１：８．９若しくは約１：８．９、１：９若しくは約１：９、１：９．１若しくは約１：９．１、１：９．２若しくは約１：９．２、１：９．３若しくは約１：９．３、１：９．４若しくは約１：９．４、１：９．５若しくは約１：９．５、１：９．６若しくは約１：９．６、１：９．７若しくは約１：９．７、１：９．８若しくは約１：９．８、１：９．９若しくは約１：９．９又は１：１０若しくは約１：１０から選択される。

【0284】

[00301] 一部の実施形態において、第１の拡大培養におけるＡＰＣの数は、約１．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲であり、第２の拡大培養におけるＡＰＣの数は、約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲である。

【0285】

[00302] 一部の実施形態において、第１の拡大培養におけるＡＰＣの数は、約１．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲であり、第２の拡大培養におけるＡＰＣの数は、約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約６．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲である。

【0286】

[00303] 一部の実施形態において、第１の拡大培養におけるＡＰＣの数は、約２．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約３．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲であり、第２の拡大培養におけるＡＰＣの数は、約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約５．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲である。

【0287】

[00304] 一部の実施形態において、ＴＩＬ製造プロセスは、少なくとも１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間又は３５日間の第１の拡大培養ステップ（又はプレＲＥＰ）及び少なくとも３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又は１４日間の第２の拡大培養ステップ（又はＲＥＰ）を含む。

【0288】

[00305] 一部の実施形態において、ＴＩＬ製造プロセスは、約２１～３５日間の第１の拡大培養ステップ及び約６～１２日間の第２の拡大培養ステップを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬ製造プロセスは、約２１～２５日間の第１の拡大培養ステップ及び約７～１１日間の第２の拡大培養ステップを含む。

【0289】

[00306] 以下のステップは、本明細書に開示される任意のＴＩＬ製造実施形態に適用される。

【0290】

Ｇ．任意選択の細胞生存率分析
[00307] 任意選択で、第１又は第２の拡大培養後、当技術分野で公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、ＴＩＬのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは、死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定されないが、アラマーブルーアッセイ；及びＭＴＴアッセイを挙げることができる。一部の実施形態において、Cellometer K2自動細胞カウンター（Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA）を使用してＴＩＬサンプルをカウントし、生存率を決定することができる。一部の実施形態において、生存率は、標準的なCellometer K2 Image Cytometer自動細胞カウンタープロトコルに従い決定される。

【0291】

[00308] 一部の実施形態において、細胞数及び／又は生存率が測定される。限定されないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５及びＣＤ５６などのマーカー並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば、限定されないが、FACSCanto（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）を使用してBD Bio-sciences（BD Biosciences、San Jose, CA）から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤（VWR、Batavia, IL）を使用して手動でカウントすることができ、及び生存率は、限定されないが、トリパンブルー染色を含めて、当技術分野で公知の任意の方法を用いて評価することができる。

【0292】

[00309] 一部の実施形態において、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４（ＣＴＬＡ－４；ＣＤ１５２とも呼ばれる）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、Ｋｉ６７（ＭＫＩ６７とも呼ばれる）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３；ＣＤ２２３とも呼ばれる）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、インテグリン、アルファＥ（ＩＴＧＡＥ；ＣＤ１０３としても知られる）、ＣＤ６９、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）並びにＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有－３（ＴＩＭ３；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）としても知られる）が測定される。これらのマーカーの発現は、第１の拡大培養、第２の拡大培養又は第３のＴＩＬ集団の回収後を含む、本明細書に開示されるプロセス中の任意の時点で測定され得る。

【0293】

[00310] ある場合には、第２のＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。代わりに、第２のＴＩＬ集団は、以下で考察する通り、ＲＥＰに供し、次に凍結保存することができる。同様に、療法において遺伝子修飾ＴＩＬが使用されることになる場合、第２又は第３のＴＩＬ集団を好適な処置のための遺伝子修飾に供し得る。

【0294】

[00311] 当技術分野で公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号に記載されている方法は、優れた腫瘍反応性に関するＴＩＬの選択に使用され得る。

【0295】

[00312] Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが、多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメントＶ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）及びＣ（定数）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性の増加を示すＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第１又は第２の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ちＴＣＲα／β）の発現が増加する。

【0296】

本発明において有用な細胞培養材料及び方法
[00313] 本発明の一実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、約５，０００ｍＬ～約２５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ～約１０，０００ｍＬの細胞培地又は約５，８００ｍＬ～約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。一実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えば、ＡＩＭ－Ｖ細胞培地（Ｌ－グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。一実施形態において、ＴＩＬ数の拡大は、２日又は３日ごとに以下の頻度で細胞に新鮮細胞培養培地を加える（細胞をフィードするとも称される）ことを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。

【0297】

[00314] 一部の実施形態において、本明細書に開示される拡大培養プロセスで使用される培養培地は、無血清培地又は限定培地である。一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、基礎細胞培地及び血清補充物及び／又は血清代替物を含む。一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、部分的に血清含有培地のロット間の変動に起因する実験的変動を防止及び／又は減少させるために使用される。

【0298】

[00315] 一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、基礎細胞培地及び血清補充物及び／又は血清代替物を含む。いくつかの実施形態において、基礎細胞培地は、これらに限定されないが、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖基礎培地、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖ＳＦＭ、CTS（商標）ＡＩＭ－Ｖ培地、CST（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、LymphoONE（商標）Ｔ細胞増殖異種フリー培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ増殖培地、イスコーブの改良ダルベッコ培地を含む。

【0299】

[00316] 一部の実施形態において、血清補充物又は血清代替物は、これらに限定されないが、１つ以上のCTS（商標）OpTmizerＴ細胞拡大培養血清補充物、CTS（商標）免疫細胞血清代替物、１つ以上のアルブミン又はアルブミン代替物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリン又はインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の抗生物質及び１つ以上の微量元素を含む。いくつかの実施形態において、限定培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸、鉄飽和トランスフェリン、インスリン並びに微量元素部分Ａｇ^＋、Ａｌ^３＋、Ｂａ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｒ^３”、Ｇｅ^４＋、Ｓｅ^４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ^２＋、Ｐ、Ｓｉ^４＋、Ｖ^５＋、Ｍｏ^６＋、Ｎｉ^２＋、Ｒｂ^＋、Ｓｎ^２＋及びＺｒ^４＋を含む化合物からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む。一部の実施形態において、限定培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム及び／又は２－メルカプトエタノールを更に含む。

【0300】

[00317] 一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞免疫細胞血清代替物は、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖基礎培地、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖ＳＦＭ、CTS（商標）ＡＩＭ－Ｖ培地、CST（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、LymphoONE（商標）Ｔ細胞増殖異種フリー培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ増殖培地、イスコーブの改良ダルベッコ培地を含むがこれらに限定されない従来の増殖培地と共に使用される。

【0301】

[00318] 一部の実施形態において、無血清又は限定培地中の総血清代替物濃度（体積％）は、無血清又は限定培地全体の体積の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％以上である。一部の実施形態において、総血清代替物濃度は、無血清又は限定培地の総体積の約３％である。一部の実施形態において、総血清代替物濃度は、無血清又は限定培地の総体積の約５％である。一部の実施形態において、総血清代替物濃度は、無血清又は限定培地の総体積の約１０％である。

【0302】

[00319] 一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭ（ThermoFisher Scientific）である。CTS（商標）OpTmizer（商標）の任意の製剤は、本発明において有用である。CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、１ＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養基礎培地と２６ｍＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養補充剤を組み合わせたものであり、使用前に混合される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールと共に、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充され、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

【0303】

[00320] 一部の実施形態において、限定培地は、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭ（ThermoFisher Scientific）である。CTS（商標）OpTmizer（商標）の任意の製剤は、本発明において有用である。CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、１ＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養基礎培地と２６ｍＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養補充剤を組み合わせたものであり、使用前に混合される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールと共に、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充され、更に、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充され、更に、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充され、更に、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールで補充され、更に、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールで補充され、更に、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールで補充され、更に、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び約２ｍＭのグルタミンで補充され、更に、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び約２ｍＭのグルタミンで補充され、更に、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び約２ｍＭのグルタミンで補充され、更に、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充され、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

【0304】

[00321] 一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．５ｍＭ～約９ｍＭ、１ｍＭ～約８ｍＭ、２ｍＭ～約７ｍＭ、３ｍＭ～約６ｍＭ又は４ｍＭ～約５ｍＭの濃度のグルタミン（即ちGlutaMAX（登録商標））が補充される。一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、約２ｍＭの濃度のグルタミン（即ちGlutaMAX（登録商標））が補充される。

【0305】

[00322] 一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、約５ｍＭ～約１５０ｍＭ、１０ｍＭ～約１４０ｍＭ、１５ｍＭ～約１３０ｍＭ、２０ｍＭ～約１２０ｍＭ、２５ｍＭ～約１１０ｍＭ、３０ｍＭ～約１００ｍＭ、３５ｍＭ～約９５ｍＭ、４０ｍＭ～約９０ｍＭ、４５ｍＭ～約８５ｍＭ、５０ｍＭ～約８０ｍＭ、５５ｍＭ～約７５ｍＭ、６０ｍＭ～約７０ｍＭ又は約６５ｍＭの濃度の２－メルカプトエタノールが補充される。一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、約５５ｍＭの濃度の２－メルカプトエタノールが補充される。

【0306】

[00323] 一部の実施形態において、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第１９９８／０３０６７９号に記載されている限定培地は、本発明において有用である。その刊行物には、無血清真核細胞培養培地が記載されている。無血清真核細胞培養培地には、無血清培養での細胞の増殖をサポートすることができる無血清補充物が補充された基礎細胞培養培地が含まれる。無血清真核細胞培養培地補充物は、１つ以上のアルブミン又はアルブミン代替物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリン又はインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の微量元素及び１つ以上の抗生物質からなる群から選択される１つ以上の成分を含むか、又はそれらを組み合わせることによって得られる。一部の実施形態において、限定培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム及び／又はβ－メルカプトエタノールを更に含む。いくつかの実施形態において、限定培地は、アルブミン又はアルブミン代替物と、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリン又はインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体及び１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む。いくつかの実施形態において、限定培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸、鉄飽和トランスフェリン、インスリン並びに微量元素部分Ａｇ^＋、Ａｌ^３＋、Ｂａ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｒ^３”、Ｇｅ^４＋、Ｓｅ^４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ^２＋、Ｐ、Ｓｉ^４＋、Ｖ^５＋、Ｍｏ^６＋、Ｎｉ^２＋、Ｒｂ^＋、Ｓｎ^２＋及びＺｒ^４＋を含む化合物からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む。一部の実施形態において、基礎細胞培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ増殖培地、イスコーブの改良ダルベッコ培地からなる群から選択される。

【0307】

[00324] 一部の実施形態において、限定培地中のグリシンの濃度は約５～２００ｍｇ／Ｌの範囲であり、Ｌ－ヒスチジンの濃度は約５～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－イソロイシンの濃度は約５～３００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－メチオニンの濃度は約５～２００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－フェニルアラニンの濃度は約５～４００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－プロリンの濃度は約１～１０００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－ヒドロキシプロリンの濃度は約１～４５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－セリンの濃度は約１～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－スレオニンの濃度は約１０～５００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－トリプトファンの濃度は約２～１１０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－チロシンの濃度は約３～１７５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－バリンの濃度は約５～５００ｍｇ／Ｌであり、チアミンの濃度は約１～２０ｍｇ／Ｌであり、還元型グルタチオンの濃度は約１～２０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸の濃度は約１～２００ｍｇ／Ｌであり、鉄飽和トランスフェリンの濃度は約１～５０ｍｇ／Ｌであり、インスリンの濃度は約１～１００ｍｇ／Ｌであり、亜セレン酸ナトリウムの濃度は約０．０００００１～０．０００１ｍｇ／Ｌであり、アルブミン（AlbuMAX（登録商標）Iなど）の濃度は約５０００～５０，０００ｍｇ／Ｌである。

【0308】

[00325] 一部の実施形態において、限定培地中の非微量元素部分成分は、以下の表Ａの「１×培地における濃度範囲」という見出しの下の欄に列挙された濃度範囲に存在する。他の実施形態において、限定培地中の非微量元素部分成分は、以下の表Ａの「１×培地における好ましい実施形態」という見出しの下の欄に列挙された最終濃度に存在する。他の実施形態において、限定培地は、無血清補充物を含む基礎細胞培地である。これらの実施形態の一部において、無血清補充物は、以下の表Ａの「補充物の好ましい実施形態」という見出しの下の欄に列挙されたタイプ及び濃度の非微量部分成分を含む。

【0309】

【表3】

【0310】

[00326] 一部の実施形態において、限定培地の容積オスモル濃度は、約２６０～３５０ｍＯｓｍｏｌである。一部の実施形態において、容積オスモル濃度は、約２８０～３１０ｍＯｓｍｏｌである。一部の実施形態において、限定培地は、最大約３．７ｇ／Ｌ又は約２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムで補充される。限定培地には、Ｌ－グルタミン（最終濃度約２ｍＭ）、１つ以上の抗生物質、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；最終濃度約１００μＭ）、２－メルカプトエタノール（最終濃度約１００μＭ）を更に補充できる。

【0311】

[00327] 一部の実施形態において、Smith, et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement,” Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)に記載されている限定培地は、本発明において有用である。簡単に説明すると、ＲＰＭＩ又はCTS（商標）OpTmizer（商標）を基礎細胞培地として使用し、０、２％、５％又は１０％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物を補充した。

【0312】

[00328] 一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は、濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ又はβＭＥ；２－メルカプトエタノール、ＣＡＳ６０－２４－２としても知られる）を欠いている。

【0313】

[00329] 一実施形態において、細胞培地は、濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、細胞培地は、ベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）を欠く。

【0314】

[00330] 一実施形態において、本明細書に記載の方法の期間は、約２７～約５０日間である。別の実施形態において、期間は約２８日～約４６日である。別の実施形態において、期間は約３０日～約４２日である。本発明の一実施形態において、第１の拡大培養の開始から第２の拡大培養の終了までの方法の期間は約３１日間である。本発明の一実施形態において、第１の拡大培養の開始から第２の拡大培養の終了までの方法の期間は約３５日間である。

【0315】

[00331] 一実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養する。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含めて、当技術分野で公知の方法、組成物及び装置を用いたＴＩＬの拡大培養に用いられている。一実施形態において、ＴＩＬは、ガス透過性バッグ内で拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、ＴＩＬはG-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。かかる実施形態は、細胞集団を約５×１０^５細胞／ｃｍ^２から１０×１０^６～３０×１０^６細胞／ｃｍ^２に拡大培養することを可能にする。一実施形態において、この拡大培養は、細胞に新鮮な細胞培養培地を加える（細胞をフィードするとも称される）ことなく行われる。一実施形態において、これは、GRexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィーディングなしである。一実施形態において、これにフィーディングはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。かかる容器、装置及び方法は、当技術分野で公知であり、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７ Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８ Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０ Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８ Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３ Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５ Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０ Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスは、Jin et al., J.Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている。

【0316】

ａ．抗ＣＤ３抗体
[00332] 一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養培地は、抗ＣＤ３抗体を含む。抗ＣＤ３抗体をＩＬ－２と併用すると、ＴＩＬ集団においてＴ細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は完全長抗体並びにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が一般的に好ましい；例えば、Tsoukas et al., J.Immunol.1985, 135, 1719（参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0317】

[00333] 当業者は理解するであろう通り、本発明において使用が見出される好適な抗ヒトＣＤ３抗体は、限定されないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット及びイヌ科動物抗体を含む様々な哺乳類からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含めて、いくつも存在する。詳細な実施形態において、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体が使用される（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）。

【0318】

【表4】

【0319】

ｂ．ＴＮＦＲＳＦアゴニスト（４－１ＢＢ（ＣＤ１３７））
[00334] 一実施形態において、第１の拡大培養及び／又は第２の拡大培養の細胞培養培地は、ＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストである。４－１ＢＢアゴニストは、当技術分野で公知の任意の４－１ＢＢ結合分子であり得る。４－１ＢＢ結合分子は、ヒト又は哺乳類４－１ＢＢに結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。４－１ＢＢアゴニスト又は４－１ＢＢ結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。４－１ＢＢアゴニスト又は４－１ＢＢ結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及び４－１ＢＢに結合する抗体の操作された形態、例えばｓｃＦｖ分子も含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のための４－１ＢＢアゴニストは、抗４－１ＢＢ抗体、ヒト抗４－１ＢＢ抗体、マウス抗４－１ＢＢ抗体、哺乳動物抗４－１ＢＢ抗体、モノクローナル抗４－１ＢＢ抗体、ポリクローナル抗４－１ＢＢ抗体、キメラ抗４－１ＢＢ抗体、抗４－１ＢＢアドネクチン、抗４－１ＢＢドメイン抗体、単鎖抗４－１ＢＢ断片、重鎖抗４－１ＢＢ断片、軽鎖抗４－１ＢＢ断片、抗４－１ＢＢ融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーを含む。アゴニスト性抗４－１ＢＢ抗体は、強い免疫応答を誘導することが知られている。Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677。好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、アゴニスト性、抗４－１ＢＢヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体（即ち単一細胞株に由来する抗体）である。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ＥＵ－１０１（Eutilex Co. Ltd.）、ウトミルマブ若しくはウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。好ましい一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブ若しくはウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。

【0320】

[00335] 好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニスト又は４－１ＢＢ結合分子は、融合タンパク質でもあり得る。好ましい実施形態において、三量体又は六量体４－１ＢＢアゴニスト（３つ又は６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体４－１ＢＢアゴニストは、典型的には２つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（４－１ＢＢＬ）のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１－Ｆｃを含み、任意選択でこれらの融合タンパク質の２つ以上を更に連結する、三量体（三価）又は六量体（又は六価）又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。

【0321】

[00336] アゴニスト性４－１ＢＢ抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘導することが知られている。好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法で４－１ＢＢ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、例えばＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性４－１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制する、アゴニスト性４－１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を抑制する、アゴニスト性４－１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制する、アゴニスト性４－１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。

【0322】

[00337] 一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒト４－１ＢＢ（配列番号９）に結合することを特徴とする。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ヒト４－１ＢＢ（配列番号９）に結合する結合分子である。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、マウス４－１ＢＢ（配列番号１０）に結合する結合分子である。４－１ＢＢアゴニスト又は結合分子が結合する４－１ＢＢ抗原のアミノ酸配列を表６に概括する。

【0323】

【表5】

【0324】

[00338] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約９０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約８０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約７０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約６０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約５０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約４０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約３０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。

【0325】

[00339] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約７．５×１０^５ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約７．５×１０^５ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約８×１０^５ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約８．５×１０^５ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約９×１０^５ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約９．５×１０^５ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約１×１０^６ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。

【0326】

[00340] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約２×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．１×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．２×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．３×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．４×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．５×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．６×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約２．７×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．８×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．９×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約３×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。

【0327】

[00341] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約９ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約８ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約７ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約６ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約５ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約４ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約３ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。

【0328】

[00342] 好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ＰＦ－０５０８２５６６又はＭＯＲ－７４８０としても知られるウトミルマブ又はその断片、誘導体、変異体若しくはバイオシミラーである。ウトミルマブはPfizer, Inc.から入手できる。ウトミルマブは、免疫グロブリンＧ２－ラムダ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー９、４－１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ヒト（Homo sapiens）（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウトミルマブのアミノ酸配列を表７に示す。ウトミルマブは、Ａｓｎ５９及びＡｓｎ２９２のグリコシル化部位；位置２２－９６（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）、１４３－１９９（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｌ）、２５６－３１６（Ｃ_Ｈ２）及び３６２－４２０（Ｃ_Ｈ３）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２２’－８７’（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）及び１３６’－１９５’（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｌ）の軽鎖内ジスルフィド架橋；ＩｇＧ２Ａアイソフォーム位置２１８－２１８、２１９－２１９、２２２－２２２及び２２５－２２５、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム位置２１８－１３０、２１９－２１９、２２２－２２２及び２２５－２２５並びにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム位置２１９－１３０（２）、２２２－２２２及び２２５－２２５の鎖内重鎖－重鎖ジスルフィド架橋；ＩｇＧ２Ａアイソフォーム位置１３０－２１３’（２）、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム位置２１８－２１３’及び１３０－２１３’並びにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム位置２１８－２１３’（２）の鎖内重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウトミルマブ並びにその変異体及び断片の調製並びに特性は、米国特許第８，８２１，８６７号；同第８，３３７，８５０号；及び同第９，４６８，６７８号並びに国際公開第２０１２／０３２４３３ Ａ１号に記載され、これらのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ウトミルマブの前臨床的特徴は、Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61, 1721-33に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウトミルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０２４４４７９３、ＮＣＴ０１３０７２６７、ＮＣＴ０２３１５０６６及びＮＣＴ０２５５４８１２が含まれる。

【0329】

[00343] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号１１で示される重鎖及び配列番号１２で示される軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

【0330】

[00344] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は配列番号１３に示される配列を含み、４－１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は配列番号１４に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。

【0331】

[00345] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換と、それぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにそれらの保存的アミノ酸置換とを含む。

【0332】

[00346] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブに関して薬物規制当局によって承認された４－１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む４－１ＢＢ抗体を含み、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出された４－１ＢＢアゴニスト抗体であり、４－１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。４－１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。

【0333】

【表6】

【0334】

【表7】

【0335】

【表8】

【0336】

[00348] 好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ＢＭＳ－６６３５１３及び２０Ｈ４．９．ｈ４ａとしても知られるモノクローナル抗体ウレルマブ又はその断片、誘導体、変異体若しくはバイオシミラーである。ウレルマブは、Bristol-Myers Squibb, Inc.及びCreative Biolabs, Inc.から入手できる。ウレルマブは、免疫グロブリンＧ４－カッパ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９、４－１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ヒト（Homo sapiens）（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウレルマブのアミノ酸配列を表ＥＥに示す。ウレルマブは、位置２９８（及び２９８’’）のＮ－グリコシル化部位；位置２２－９５（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）、１４８－２０４（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｌ）、２６２－３２２（Ｃ_Ｈ２）及び３６８－４２６（Ｃ_Ｈ３）（並びに位置２２’’－９５’’、１４８’’－２０４’’、２６２’’－３２２’’及び３６８’’－４２６’’）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２３’－８８’（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）及び１３６’－１９６’（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｌ）（並びに位置２３’’’－８８’’’及び１３６’’’－１９６’’’）の軽鎖内ジスルフィド架橋；位置２２７－２２７’’及び２３０－２３０’’の鎖内重鎖－重鎖ジスルフィド架橋；並びに位置１３５－２１６’及び１３５’’－２１６’’’の鎖内重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウレルマブ並びにその変異体及び断片の調製及び特性は、米国特許第７，２８８，６３８号及び同第８，９６２，８０４号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ウレルマブの前臨床的及び臨床的特徴は、http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272で入手可能なSegal, et al., Clin.Cancer Res. 2016に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウレルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０１７７５６３１、ＮＣＴ０２１１００８２、ＮＣＴ０２２５３９９２及びＮＣＴ０１４７１２１０が含まれる。

【0337】

[00349] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号２１で示される重鎖及び配列番号２２で示される軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

【0338】

[00350] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は配列番号２３に示される配列を含み、４－１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は配列番号２４に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。

【0339】

[00351] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換と、それぞれ配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換とを含む。

【0340】

[00352] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブに関して薬物規制当局によって承認された４－１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む４－１ＢＢ抗体を含み、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出された４－１ＢＢアゴニスト抗体であり、４－１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。４－１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。

【0341】

【表9】

【0342】

【表10】

【0343】

[00354] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、１Ｄ８、３Ｅｌｏｒ、４Ｂ４（BioLegend 309809）、Ｈ４－１ＢＢ－Ｍ１２７（BD Pharmingen 552532）、ＢＢＫ２（Thermo Fisher MS621PABX）、１４５５０１（Leinco Technologies B591）、ＡＴＣＣ番号ＨＢ－１１２４８として寄託され、米国特許第６，９７４，８６３号に開示されている細胞株によって産生される抗体、５Ｆ４（BioLegend 31 1503）、Ｃ６５－４８５（BD Pharmingen 559446）、米国特許出願公開第２００５／００９５２４４号に開示されている抗体、米国特許第７，２８８，６３８号に開示されている抗体（２０Ｈ４．９－ＩｇＧｌ（ＢＭＳ－６６３０３１）など）、同第６，８８７，６７３号に開示されている抗体（４Ｅ９又はＢＭＳ－５５４２７１など）、同第７，２１４，４９３号に開示されている抗体、同第６，３０３，１２１号に開示されている抗体、同第６，５６９，９９７号に開示されている抗体、同第６，９０５，６８５号に開示されている抗体（４Ｅ９又はＢＭＳ－５５４２７１など）、同第６，３６２，３２５号に開示されている抗体（１Ｄ８又はＢＭＳ－４６９４９２；３Ｈ３又はＢＭＳ－４６９４９７；又は３Ｅｌなど）、同第６，９７４，８６３号に開示されている抗体（５３Ａ２など）；同第６，２１０，６６９号に開示されている抗体（１Ｄ８、３Ｂ８又は３Ｅ１など）、同第５，９２８，８９３号に記載されている抗体、同第６，３０３，１２１号に開示されている抗体、同第６，５６９，９９７号に開示されている抗体、国際公開第２０１２／１７７７８８号、同第２０１５／１１９９２３号及び同第２０１０／０４２４３３号に開示されている抗体並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体又はバイオシミラーからなる群から選択され、前述の特許又は特許出願公開のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0344】

[00355] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、国際公開第２００８／０２５５１６ Ａ１号、同第２００９／００７１２０ Ａ１号、同第２０１０／００３７６６ Ａ１号、同第２０１０／０１００５１ Ａ１号及び同第２０１０／０７８９６６ Ａ１号；米国特許出願公開第２０１１／００２７２１８ Ａ１号、同第２０１５／０１２６７０９ Ａ１号、同第２０１１／０１１１４９４ Ａ１号、同第２０１５／０１１０７３４ Ａ１号及び同第２０１５／０１２６７１０ Ａ１号；並びに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号及び同第８，４５０，４６０号に記載されている４－１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質であり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0345】

[00356] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、図１５の構造Ｉ－Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）又は構造Ｉ－Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示される４－１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。

【0346】

[00357] 構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂにおいて、円柱は個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂは、例えば、４－１ＢＢＬ又は４－１ＢＢに結合する抗体に由来する、３つの直鎖状に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これは折り畳まれて三価タンパク質を形成し、次いでＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｃ_Ｈ３及びＣ_Ｈ２ドメインを含む）を介して第２の三価タンパク質に連結され、次いで、これは、ジスルフィド結合（小さい細長い楕円形）を介して２つの三価タンパク質を連結するために使用され、構造を安定化し、６つの受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン及びシグナル伝達タンパク質を合わせてシグナル伝達複合体を形成できるアゴニストを提供する。円柱として示されるＴＮＦＲＳＦ結合ドメインは、例えば、親水性残基並びに柔軟性のためのＧｌｙ及びＳｅｒ配列並びに溶解性のためのＧｌｕ及びＬｙｓを含み得るリンカーにより接続されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ鎖を含むｓｃＦｖドメインであり得る。de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44；Ahmad, et al., Clin. & Dev.Immunol. 2012, 980250；Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208；又は本明細書の別の箇所に組み込まれた参考文献に記載されているものなどの任意のｓｃＦｖドメイン設計が使用され得る。この形態の融合タンパク質構造は、米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号及び同第８，４５０，４６０号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0347】

[00358] 構造Ｉ－Ａの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表９に示す。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン（配列番号３１のアミノ酸１７～２３０）、完全ヒンジドメイン（配列番号３１のアミノ酸１～１６）又はヒンジドメインの一部（例えば、配列番号３１のアミノ酸４～１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号３２～配列番号４１に示される実施形態から選択され得る。

【0348】

【表11】

【0349】

[00360] 構造Ｉ－Ｂの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表１０に示す。構造Ｉ－ＢのようにＦｃ抗体断片がＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は、好ましくは、配列番号４２に示されるものであり、リンカー配列は、好ましくは、配列番号４３～配列番号４５に示される実施形態から選択される。

【0350】

【表12】

【0351】

[00362] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウレルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、表１０に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。

【0352】

[00363] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、４－１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号４６による配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、可溶性４－１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号４７による配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。

【0353】

[00364] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、表１１に示されるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって接続されている。

【0354】

【表13】

【0355】

【表14】

【0356】

[00366] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４－１ＢＢ結合ドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインである。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４－１ＢＢ結合ドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインであり、可溶性４－１ＢＢドメインのそれぞれは、ストーク領域（三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、４－１ＢＢ結合ドメインの一部ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３～８アミノ酸長を有する。

【0357】

[00367] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３～８アミノ酸長を有し、各ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは４－１ＢＢ結合ドメインである。

【0358】

[00368] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、前述のＶ_Ｌドメインのいずれかに連結された前述のＶ_Ｈドメインのいずれかを含む４－１ＢＢアゴニスト性ｓｃＦｖ抗体である。

【0359】

[00369] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、BPS Bioscience４－１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号７９０９７－２であり、これはBPS Bioscience, San Diego, CA, USAから市販されている。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、Creative Biolabs４－１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号ＭＯＭ－１８１７９であり、これはCreative Biolabs, Shirley, NY, USAから市販されている。

【0360】

ｃ．ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニスト
[00370] 一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニストである。ＯＸ４０アゴニストは、当技術分野で公知の任意のＯＸ４０結合分子であり得る。ＯＸ４０結合分子は、ヒト又は哺乳類ＯＸ４０に結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及びＯＸ４０に結合する抗体の操作された形態、例えばｓｃＦｖ分子も含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のためのＯＸ４０アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体、ヒト抗ＯＸ４０抗体、マウス抗ＯＸ４０抗体、哺乳動物抗ＯＸ４０抗体、モノクローナル抗ＯＸ４０抗体、ポリクローナル抗ＯＸ４０抗体、キメラ抗ＯＸ４０抗体、抗ＯＸ４０アドネクチン、抗ＯＸ４０ドメイン抗体、単鎖抗ＯＸ４０断片、重鎖抗ＯＸ４０断片、軽鎖抗ＯＸ４０断片、抗ＯＸ４０融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーを含む。好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、アゴニスト性、抗ＯＸ４０ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体（即ち単一細胞株に由来する抗体）である。

【0361】

[00371] 好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、融合タンパク質でもあり得る。ＯＸ４０Ｌに融合したＦｃドメインを含むＯＸ４０融合タンパク質は、例えば、Sadun, et al., J. Immunother. 2009, 182, 1481-89に記載されている。好ましい実施形態において、三量体又は六量体ＯＸ４０アゴニスト（３つ又は６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体ＯＸ４０アゴニストは、典型的には２つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（ＯＸ４０Ｌ）のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１－Ｆｃを含み、任意選択でこれらの融合タンパク質の２つ以上を更に連結する、三量体（三価）又は六量体（又は六価）又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。

【0362】

[00372] アゴニスト性ＯＸ４０抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘発することが知られている。Curti, et al., Cancer Res. 2013, 73, 7189-98。好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法でＯＸ４０抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、例えばＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。

【0363】

[00373] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒトＯＸ４０（配列番号５４）に結合することを特徴とする。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ヒトＯＸ４０（配列番号５４）に結合する結合分子である。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、マウスＯＸ４０（配列番号５５）に結合する結合分子である。ＯＸ４０アゴニスト又は結合分子が結合するＯＸ４０抗原のアミノ酸配列を表１２に概括する。

【0364】

【表15】

【0365】

[00375] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約６０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約５０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約４０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約３０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。

【0366】

[00376] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約７．５×１０^５ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７．５×１０^５ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８×１０^５ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８．５×１０^５ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９×１０^５ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９．５×１０^５ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約１×１０^６ １／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。

【0367】

[00377] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約２×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．１×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．２×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．３×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．４×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．５×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．６×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約２．７×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．８×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．９×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約３×１０^－５ １／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}でヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。

【0368】

[00378] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約６ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約５ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約４ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約３ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ_５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。

【0369】

[00379] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ＭＥＤＩ０５６２又はＭＥＤＩ－０５６２としても知られるタボリキシズマブである。タボリキシズマブは、AstraZeneca, Incの子会社MedImmuneから入手できる。タボリキシズマブは、免疫グロブリンＧ１－カッパ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ４（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー４、ＯＸ４０、ＣＤ１３４）］、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体である。タボリキシズマブのアミノ酸配列を表１３に示す。タボリキシズマブは、フコシル化複合二分岐ＣＨＯ型グリカンを伴い位置３０１及び３０１’’のＮ－グリコシル化部位；位置２２－９５（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）、１４８－２０４（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｌ）、２６５－３２５（Ｃ_Ｈ２）及び３７１－４２９（Ｃ_Ｈ３）（並びに位置２２’’－９５’’、１４８’’－２０４’’、２６５’’－３２５’’及び３７１’’－４２９’’）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２３’－８８’（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）及び１３４’－１９４’（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｌ）（並びに位置２３’’’－８８’’’及び１３４’’’－１９４’’’）の軽鎖内ジスルフィド架橋；位置２３０－２３０’’及び２３３－２３３’’の鎖内重鎖－重鎖ジスルフィド架橋；並びに位置２２４－２１４’及び２２４’’－２１４’’’の鎖内重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。様々な固形腫瘍の適応症におけるタボリキシズマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０２３１８３９４及びＮＣＴ０２７０５４８２が含まれる。

【0370】

[00380] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号５６で示される重鎖及び配列番号５７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

【0371】

[00381] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は配列番号５８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は配列番号５９に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。

【0372】

[00382] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６０、配列番号６１及び配列番号６２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換と、それぞれ配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換とを含む。

【0373】

[00383] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブに関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。

【0374】

【表16】

【0375】

【表17】

【0376】

【表18】

【0377】

[00385] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは１１Ｄ４であり、これはPfizer, Inc.から入手可能な完全ヒト抗体である。１１Ｄ４の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号；同第８，２３６，９３０号；及び同第９，０２８，８２４号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。１１Ｄ４のアミノ酸配列を表１４に示す。

【0378】

[00386] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号６６で示される重鎖及び配列番号６７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

【0379】

[00387] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は配列番号６８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は配列番号６９に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。

【0380】

[00388] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号７３、配列番号７４及び配列番号７５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。

【0381】

[00389] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。

【0382】

【表19】

【0383】

【表20】

【0384】

【表21】

【0385】

[00391] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは１８Ｄ８であり、これはPfizer, Inc.から入手可能な完全ヒト抗体である。１８Ｄ８の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号；同第８，２３６，９３０号；及び同第９，０２８，８２４号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。１８Ｄ８のアミノ酸配列を表１５に示す。

【0386】

[00392] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号７６で示される重鎖及び配列番号７７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

【0387】

[00393] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は配列番号７８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は配列番号７９に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。

【0388】

[00394] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換と、それぞれ配列番号８３、配列番号８４及び配列番号８５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換とを含む。

【0389】

[00395] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。

【0390】

【表22】

【0391】

【表23】

【0392】

[00397] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＨｕ１１９－１２２であり、これはGlaxoSmithKline plc.から入手可能なヒト化抗体である。Ｈｕ１１９－１２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号並びに国際公開第２０１２／０２７３２８号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｈｕ１１９－１２２のアミノ酸配列を表１６に示す。

【0393】

[00398] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９－１２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は配列番号８６に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は配列番号８７に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。

【0394】

[00399] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換と、それぞれ配列番号９１、配列番号９２及び配列番号９３に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換とを含む。

【0395】

[00400] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９－１２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９－１２２である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９－１２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９－１２２である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９－１２２である。

【0396】

【表24】

【0397】

[00402] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＨｕ１０６－２２２であり、これはGlaxoSmithKline plc.から入手可能なヒト化抗体である。Ｈｕ１０６－２２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号並びに国際公開第２０１２／０２７３２８号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｈｕ１０６－２２２のアミノ酸配列を表１７に示す。

【0398】

[00403] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６－２２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は配列番号９４に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は配列番号９５に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。

【0399】

[00404] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９６、配列番号９７及び配列番号９８に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換と、それぞれ配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換とを含む。

【0400】

[00405] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６－２２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６－２２２である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６－２２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６－２２２である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同じであるか又は異なり、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６－２２２である。

【0401】

【表25】

【0402】

【表26】

【0403】

[00407] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト抗体はＭＥＤＩ６４６９（９Ｂ１２とも称される）である。ＭＥＤＩ６４６９はマウスモノクローナル抗体である。Weinberg, et al., J. Immunother. 2006, 29, 575-585。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Weinberg, et al., J. Immunother. 2006, 29, 575-585に記載されているように、Biovest Inc.（Malvern, MA, USA）に寄託された、９Ｂ１２ハイブリドーマによって産生される抗体であり、その開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９のＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。

【0404】

[00408] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｌ１０６ ＢＤ（Pharmingen製品番号３４０４２０）である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（BD Pharmingen製品番号３４０４２０）のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（BD Pharmingen製品番号３４０４２０）の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、マウスモノクローナル抗体抗ｍＣＤ１３４／ｍＯＸ４０（クローンＯＸ８６）であり、InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NHから市販されている。

【0405】

[00409] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、国際公開第９５／１２６７３号、同第９５／２１９２５号、同第２００６／１２１８１０号、同第２０１２／０２７３２８号、同第２０１３／０２８２３１号、同第２０１３／０３８１９１号及び同第２０１４／１４８８９５号；欧州特許第０６７２１４１号；米国特許出願公開第２０１０／１３６０３０号、同第２０１４／３７７２８４号、同第２０１５／１９０５０６号及び同第２０１５／１３２２８８号；並びに米国特許第７，５０４，１０１号、同第７，５５０，１４０号、同第７，６２２，４４４号、同第７，６９６，１７５号、同第７，９６０，５１５号、同第７，９６１，５１５号、同第８，１３３，９８３号、同第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号（２０Ｅ５及び１２Ｈ３を含む）に記載されるＯＸ４０アゴニストから選択され、それぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0406】

[00410] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、構造Ｉ－Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）又は構造Ｉ－Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示されるＯＸ４０アゴニスト性融合タンパク質又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂの特性は、上記並びに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号及び同第８，４５０，４６０号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。構造Ｉ－Ａのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表９に示す。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン（配列番号３１のアミノ酸１７～２３０）、完全ヒンジドメイン（配列番号３１のアミノ酸１～１６）又はヒンジドメインの一部（例えば、配列番号３１のアミノ酸４～１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号３２～配列番号４１に示される実施形態から選択され得る。同様に、構造Ｉ－Ｂのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表１０に示す。構造Ｉ－ＢのようにＦｃ抗体断片がＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は、好ましくは、配列番号４２に示されるものであり、リンカー配列は、好ましくは、配列番号４３～配列番号４５に示される実施形態から選択される。

【0407】

[00411] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、タボリキシズマブの可変重鎖及び可変軽鎖、１１Ｄ４の可変重鎖及び可変軽鎖、１８Ｄ８の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１１９－１２２の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１０６－２２２の可変重鎖及び可変軽鎖、表１７に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。

【0408】

[00412] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０２による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、可溶性ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０３による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０４による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。

【0409】

[00413] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、表１４に示されるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって接続されている。

【0410】

【表27】

【0411】

【表28】

【0412】

【表29】

【0413】

【表30】

【0414】

[00415] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインである。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインであり、可溶性ＯＸ４０結合ドメインのそれぞれは、ストーク領域（三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、ＯＸ４０結合ドメインの一部ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３～８アミノ酸長を有する。

【0415】

[00416] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３～８アミノ酸長を有し、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインはＯＸ４０結合ドメインである。

【0416】

[00417] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＭＥＤＩ６３８３である。ＭＥＤＩ６３８３はＯＸ４０アゴニスト性融合タンパク質であり、米国特許第６，３１２，７００号に記載されているように調製することができ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0417】

[00418] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、前述のＶ_Ｌドメインのいずれかに連結された前述のＶ_Ｈドメインのいずれかを含むＯＸ４０アゴニスト性ｓｃＦｖ抗体である。

【0418】

[00419] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Creative BiolabsＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体ＭＯＭ－１８４５５であり、これはCreative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USAから市販されている。

【0419】

[00420] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、BioLegend, Inc., San Diego, CA, USAから市販されているＯＸ４０アゴニスト性抗体クローンＢｅｒ－ＡＣＴ３５である。

【0420】

ｄ．サイトカイン
[00421] 本明細書に記載の第１及び第２の拡大培養方法は、一般に、当技術分野で公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。

【0421】

[00422] 代わりに、ＴＩＬの第２の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の２つ以上の組み合わせについては、一般的に国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（参照により全体として明示的に本明細書に組み込まれる）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－２１、ＩＬ－１５とＩＬ－２１及びＩＬ－２とＩＬ－１５とＩＬ－２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。

【0422】

拡大培養したＴＩＬの表現型特徴
[00423] 一部の実施形態において、ＴＩＬは拡大培養後、本明細書及び実施例に記載されるものを含む多数の表現型マーカーの発現に関して分析される。一実施形態において、１つ以上の表現型マーカーの発現が調べられる。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＢの第１の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＣの移行中に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＣに係る移行中及び凍結保存後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＤに係る第２の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＤに係る２回以上の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、マーカーは、ＴＣＲａｂ、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６、ＣＤ８ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８及びＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される。一部の実施形態において、マーカーは、ＴＣＲａｂ、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６及びＣＤ８ａからなる群から選択される。ある実施形態において、マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８及びＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個のマーカーの発現が調べられる。一部の実施形態では、各群からの１つ以上のマーカーからの発現が調べられる。一部の実施形態では、解凍ＴＩＬと比較したとき新鮮ＴＩＬにおいてＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ３８及びＣＤ６９発現の１つ以上が維持される（即ち統計的に有意な差を呈しない）。一部の実施形態では、解凍ＴＩＬにおいてＴＩＬの活性化状態が維持される。

【0423】

[00424] 一実施形態において、１つ以上の調節マーカーの発現が測定される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、ＬＡＧ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ１、ＴＩＭ－３、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１及びＣＤ１５４からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、ＬＡＧ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ１及びＴＩＭ－３からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１及びＣＤ１５４からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節分子発現は新鮮ＴＩＬと比較したとき解凍ＴＩＬにおいて低下する。一部の実施形態において、調節分子ＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３の発現は新鮮ＴＩＬと比較したとき解凍ＴＩＬにおいて低下する。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現に有意な差はない。一部の実施形態において、解凍ＴＩＬと比較したとき新鮮ＴＩＬにおいてＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現及び／又はメモリーマーカーに有意な差はない。

【0424】

[00425] 一部の実施形態において、メモリーマーカーは、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌからなる群から選択される。

【0425】

[00426] 一部の実施形態において、解凍ＴＩＬと比較したときの新鮮ＴＩＬの生存率は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％である。一部の実施形態において、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方の生存率が７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超又は９８％超である。一部の実施形態において、新鮮産物及び解凍産物の両方の生存率が８０％超、８１％超、８２％超、８３％超、８４％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超又は９０％超である。一部の実施形態において、新鮮産物及び解凍産物の両方の生存率が８６％超である。

【0426】

[00427] 一実施形態において、再刺激ＴＩＬは、サイトカイン遊離アッセイを用いてサイトカイン遊離に関して判定することもできる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、ＯＫＴ３か又は自己腫瘍消化物との共培養かのいずれかによる刺激に応答したインターフェロン－７（ＩＦＮ－７）分泌に関して判定することができる。例えば、ＯＫＴ３刺激を用いる実施形態では、ＴＩＬを広範に洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した０．１又は１．０μｇ／ｍＬのＯＫＴ３をプレコートした９６ウェル平底プレートに０．２ｍＬ ＣＭ中１×１０^５細胞でデュプリケートウェルを調製する。一晩インキュベートした後、上清を回収し、上清中のＩＦＮ－ガンマをＥＬＩＳＡ（Pierce/Endogen、Woburn, MA）によって測定する。共培養アッセイについては、１×１０^５個のＴＩＬ細胞を９６ウェルプレートに自己腫瘍細胞と共に置く。（１：１の比率）。２４時間のインキュベーション後、上清を回収し、ＩＦＮ－ガンマ遊離を例えばＥＬＩＳＡによって定量化することができる。

【0427】

[00428] 細胞表面バイオマーカーのフローサイトメトリー分析：細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析のために、ＴＩＬサンプルを分注した。

【0428】

[00429] 一部の実施形態において、ＴＩＬは、様々な調節マーカーについて評価されている。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＴＣＲα／β、ＣＤ５６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１及びＣＤ１２２からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＴＣＲα／βである。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ５６である。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ２７である。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ２８である。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ５７である。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ４５ＲＡである。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ４５ＲＯである。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ２５である。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１２７である。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ９５である。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＩＬ－２Ｒである。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＣＲ７である。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ６２Ｌである。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＫＬＲＧ１である。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１２２である。

【0429】

[00430] 追加のプロセスの実施形態
[00431] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、（ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；（ｂ）ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために、約２１～３５日間にわたって実施され、ＴＩＬの第２の集団は、ＴＩＬの第１の集団よりも数において大きいこと；（ｃ）第２のＴＩＬ集団をＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３及び外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地と接触させることにより第２の拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約６日間～１０日間にわたり実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、産生すること；及び（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することを含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ内の小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、次いで（２）第２のＴＩＬ集団を小スケール培養物から第１の容器よりも大きい第２の容器、例えばG-REX 500MCSコンテナに移すことにより、培養物のスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、第２の容器において、小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団は、より大きいスケールの培養物中で、約４～８日間の期間にわたり培養される。一部の実施形態において、拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、第１の小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器と同じである、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウトを達成するために複数のステップに分割され、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～８日間の期間にわたり、第２の小スケール培養物中で培養される。一部の実施形態において、第２の拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、各第２の容器において、小スケール培養物からそのような第２の容器へ移された第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～８日間の期間にわたり、より大きいスケールの培養物中で培養される。一部の実施形態において、第２の拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、各第２の容器において、小スケール培養物からそのような第２の容器へ移された第２のＴＩＬ集団の一部は、約５～７日間の期間にわたり、より大きいスケールの培養物中で培養される。

【0430】

[00432] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、（ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；（ｂ）ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために、約２１～３５日間にわたって実施され、ＴＩＬの第２の集団は、ＴＩＬの第１の集団よりも数において大きいこと；（ｃ）第２のＴＩＬ集団をＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３及び外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地と接触させることにより第２の拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７日間～１２日間にわたり実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、産生すること；及び（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することを含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ内の小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、次いで（２）第２のＴＩＬ集団を小スケール培養物から第１の容器よりも大きい第２の容器、例えばG-REX 500MCSコンテナに移すことにより、培養物のスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、第２の容器において、小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団は、より大きいスケールの培養物中で、約４～８日間の期間にわたり培養される。一部の実施形態において、第２の拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、第１の小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器と同じである、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウトを達成するために複数のステップに分割され、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～８日間の期間にわたり、第２の小スケール培養物中で培養される。一部の実施形態において、第２の拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約２～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、各第２の容器において、小スケール培養物からそのような第２の容器へ移された第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～８日間の期間にわたり、より大きいスケールの培養物中で培養される。一部の実施形態において、第２の拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、各第２の容器において、小スケール培養物からそのような第２の容器へ移された第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～８日間の期間にわたり、より大きいスケールの培養物中で培養される。

【0431】

[00433] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、（ａ）対象から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；（ｂ）ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために、約２１～３５日間にわたって実施され、ＴＩＬの第２の集団は、ＴＩＬの第１の集団よりも数において大きいこと；（ｃ）第２のＴＩＬ集団をＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３及び外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地と接触させることにより第２の拡大培養を実施して、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約１日間～１１日間にわたり実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、産生すること；及び（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することを含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ内の小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、次いで（２）第２のＴＩＬ集団を小スケール培養物から第１の容器よりも大きい第２の容器、例えばG-REX 500MCSコンテナに移すことにより、培養物のスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、第２の容器において、小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団は、より大きいスケールの培養物中で、約４～７日間の期間にわたり培養される。一部の実施形態において、第２の拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、第１の小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器と同じである、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウトを達成するために複数のステップに分割され、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～７日間の期間にわたり、第２の小スケール培養物中で培養される。一部の実施形態において、第２の拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約３～４日間の期間にわたり培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、各第２の容器において、小スケール培養物からそのような第２の容器へ移された第２のＴＩＬ集団の一部は、約４～７日間の期間にわたり、より大きいスケールの培養物中で培養される。一部の実施形態において、第２の拡大培養のステップは、（１）第２のＴＩＬ集団を第１の容器、例えばG-REX 100MCSコンテナ中、小スケール培養物中で約４日間の期間にわたり培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、次いで（２）第１の小スケール培養物からの第２のＴＩＬ集団を、サイズが第１の容器（例えば、G-REX 500MCSコンテナ）よりも大きい２、３又は４個の第２の容器に移し、配分することにより、培養物のスケールアウト及びスケールアップを達成するために複数のステップに分割され、各第２の容器において、小スケール培養物からそのような第２の容器へ移された第２のＴＩＬ集団の一部は、約５日間の期間にわたり、より大きいスケールの培養物中で培養される。

【0432】

[00434] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に追加の培養培地を再供給するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0433】

[00435] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半量を等量の新鮮な培養培地と置換するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0434】

[00436] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に、ＩＬ－２を補充した追加の培養培地を再供給するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0435】

[00437] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に、ＩＬ－２を補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半量を等量の新鮮な培養培地と置換するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0436】

[00438] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に、ＩＬ－２を補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半量を、ＩＬ－２を補充した等量の新鮮な培養培地と置換するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0437】

[00439] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に、ＩＬ－２及び４－１ＢＢアゴニストを補充した追加の培養培地を再供給するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0438】

[00440] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に、ＩＬ－２及び４－１ＢＢアゴニストを補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半量を等量の新鮮な培養培地と置換するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0439】

[00441] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に、ＩＬ－２及び４－１ＢＢアゴニストを補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半量を、ＩＬ－２を補充した等量の新鮮な培養培地と置換するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0440】

[00442] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に、ＩＬ－２及び４－１ＢＢアゴニストを補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半量を、ＩＬ－２及び４－１ＢＢアゴニストを補充した等量の新鮮な培養培地と置換するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0441】

[00443] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を補充した追加の培養培地を再供給するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0442】

[00444] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半分を等量の新鮮な培養培地と置換するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0443】

[00445] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半分を、ＩＬ－２を補充した等量の新鮮な培養培地と置換するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0444】

[00446] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半分を、ＩＬ－２及び４－１ＢＢアゴニストを補充した等量の新鮮な培養培地と置換するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0445】

[00447] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の開始の４又は５日後、第１のＴＩＬ集団の培養物に、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を補充した追加の培養培地を再供給し、その後、第１の拡大培養が終了するまで３日又は４日ごとに、培養培地の半分を、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト及びＯＫＴ－３を補充した等量の新鮮な培養培地と置換するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0446】

[00448] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養の４又は５日目に追加の培養培地を再供給して、再供給直前の培養物中の培養培地の量より少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％又は２００％多い、培養物中の培養培地の総量を得るように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0447】

[00449] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が、第１のＴＩＬ集団を、外因性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を更に含む培養培地に接触させることにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）の培養培地中のＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）の培養培地中のＡＰＣの数よりも大きい。

【0448】

[00450] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において培養培地に追加の外因性のＡＰＣが補充されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0449】

[00451] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～２０：１又は約２０：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0450】

[00452] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～１０：１又は約１０：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0451】

[00453] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～９：１又は約９：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0452】

[00454] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～８：１又は約８：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0453】

[00455] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～７：１又は約７：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0454】

[00456] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～６：１又は約６：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0455】

[00457] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～５：１又は約５：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0456】

[00458] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～４：１又は約４：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0457】

[00459] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～３：１又は約３：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0458】

[00460] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～２．９：１又は約２．９：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0459】

[00461] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～２．８：１又は約２．８：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0460】

[00462] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～２．７：１又は約２．７：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0461】

[00463] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～２．６：１又は約２．６：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0462】

[00464] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～２．５：１又は約２．５：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0463】

[00465] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～２．４：１又は約２．４：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0464】

[00466] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～２．３：１又は約２．３：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0465】

[00467] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～２．２：１又は約２．２：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0466】

[00468] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～２．１：１又は約２．１：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0467】

[00469] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１又は約１．１：１～２：１又は約２：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0468】

[00470] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～１０：１又は約１０：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0469】

[00471] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～５：１又は約５：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0470】

[00472] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～４：１又は約４：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0471】

[00473] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～３：１又は約３：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0472】

[00474] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～２．９：１又は約２．９：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0473】

[00475] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～２．８：１又は約２．８：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0474】

[00476] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～２．７：１又は約２．７：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0475】

[00477] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～２．６：１又は約２．６：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0476】

[00478] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～２．５：１又は約２．５：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0477】

[00479] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～２．４：１又は約２．４：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0478】

[00480] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～２．３：１又は約２．３：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0479】

[00481] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～２．２：１又は約２．２：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0480】

[00482] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１～２．１：１又は約２．１：１の範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0481】

[00483] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が２：１又は約２：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0482】

[00484] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップで添加されたＡＰＣの数と、ステップ（ｂ）で添加されたＡＰＣの数との比が１．１：１若しくは約１．１：１、１．２：１若しくは約１．２：１、１．３：１若しくは約１．３：１、１．４：１若しくは約１．４：１、１．５：１若しくは約１．５：１、１．６：１若しくは約１．６：１、１．７：１若しくは約１．７：１、１．８：１若しくは約１．８：１、１．９：１若しくは約１．９：１、２：１若しくは約２：１、２．１：１若しくは約２．１：１、２．２：１若しくは約２．２：１、２．３：１若しくは約２．３：１、２．４：１若しくは約２．４：１、２．５：１若しくは約２．５：１、２．６：１若しくは約２．６：１、２．７：１若しくは約２．７：１、２．８：１若しくは約２．８：１、２．９：１若しくは約２．９：１、３：１若しくは約３：１、３．１：１若しくは約３．１：１、３．２：１若しくは約３．２：１、３．３：１若しくは約３．３：１、３．４：１若しくは約３．４：１、３．５：１若しくは約３．５：１、３．６：１若しくは約３．６：１、３．７：１若しくは約３．７：１、３．８：１若しくは約３．８：１、３．９：１若しくは約３．９：１、４：１若しくは約４：１、４．１：１若しくは約４．１：１、４．２：１若しくは約４．２：１、４．３：１若しくは約４．３：１、４．４：１若しくは約４．４：１、４．５：１若しくは約４．５：１、４．６：１若しくは約４．６：１、４．７：１若しくは約４．７：１、４．８：１若しくは約４．８：１、４．９：１若しくは約４．９：１又は５：１若しくは５：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0483】

[00485] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養で添加されたＡＰＣの数が１×１０^８若しくは約１×１０^８、１．１×１０^８若しくは約１．１×１０^８、１．２×１０^８若しくは約１．２×１０^８、１．３×１０^８若しくは約１．３×１０^８、１．４×１０^８若しくは約１．４×１０^８、１．５×１０^８若しくは約１．５×１０^８、１．６×１０^８若しくは約１．６×１０^８、１．７×１０^８若しくは約１．７×１０^８、１．８×１０^８若しくは約１．８×１０^８、１．９×１０^８若しくは約１．９×１０^８、２×１０^８若しくは約２×１０^８、２．１×１０^８若しくは約２．１×１０^８、２．２×１０^８若しくは約２．２×１０^８、２．３×１０^８若しくは約２．３×１０^８、２．４×１０^８若しくは約２．４×１０^８、２．５×１０^８若しくは約２．５×１０^８、２．６×１０^８若しくは約２．６×１０^８、２．７×１０^８若しくは約２．７×１０^８、２．８×１０^８若しくは約２．８×１０^８、２．９×１０^８若しくは約２．９×１０^８、３×１０^８若しくは約３×１０^８、３．１×１０^８若しくは約３．１×１０^８、３．２×１０^８若しくは約３．２×１０^８、３．３×１０^８若しくは約３．３×１０^８、３．４×１０^８若しくは約３．４×１０^８又は３．５×１０^８若しくは約３．５×１０^８ＡＰＣであり、第２の拡大培養で添加されたＡＰＣの数が３．５×１０^８若しくは約３．５×１０^８、３．６×１０^８若しくは約３．６×１０^８、３．７×１０^８若しくは約３．７×１０^８、３．８×１０^８若しくは約３．８×１０^８、３．９×１０^８若しくは約３．９×１０^８、４×１０^８若しくは約４×１０^８、４．１×１０^８若しくは約４．１×１０^８、４．２×１０^８若しくは約４．２×１０^８、４．３×１０^８若しくは約４．３×１０^８、４．４×１０^８若しくは約４．４×１０^８、４．５×１０^８若しくは約４．５×１０^８、４．６×１０^８若しくは約４．６×１０^８、４．７×１０^８若しくは約４．７×１０^８、４．８×１０^８若しくは約４．８×１０^８、４．９×１０^８若しくは約４．９×１０^８、５×１０^８若しくは約５×１０^８、５．１×１０^８若しくは約５．１×１０^８、５．２×１０^８若しくは約５．２×１０^８、５．３×１０^８若しくは約５．３×１０^８、５．４×１０^８若しくは約５．４×１０^８、５．５×１０^８若しくは約５．５×１０^８、５．６×１０^８若しくは約５．６×１０^８、５．７×１０^８若しくは約５．７×１０^８、５．８×１０^８若しくは約５．８×１０^８、５．９×１０^８若しくは約５．９×１０^８、６×１０^８若しくは約６×１０^８、６．１×１０^８若しくは約６．１×１０^８、６．２×１０^８若しくは約６．２×１０^８、６．３×１０^８若しくは約６．３×１０^８、６．４×１０^８若しくは約６．４×１０^８、６．５×１０^８若しくは約６．５×１０^８、６．６×１０^８若しくは約６．６×１０^８、６．７×１０^８若しくは約６．７×１０^８、６．８×１０^８若しくは約６．８×１０^８、６．９×１０^８若しくは約６．９×１０^８、７×１０^８若しくは約７×１０^８、７．１×１０^８若しくは約７．１×１０^８、７．２×１０^８若しくは約７．２×１０^８、７．３×１０^８若しくは約７．３×１０^８、７．４×１０^８若しくは約７．４×１０^８、７．５×１０^８若しくは約７．５×１０^８、７．６×１０^８若しくは約７．６×１０^８、７．７×１０^８若しくは約７．７×１０^８、７．８×１０^８若しくは約７．８×１０^８、７．９×１０^８若しくは約７．９×１０^８、８×１０^８若しくは約８×１０^８、８．１×１０^８若しくは約８．１×１０^８、８．２×１０^８若しくは約８．２×１０^８、８．３×１０^８若しくは約８．３×１０^８、８．４×１０^８若しくは約８．４×１０^８、８．５×１０^８若しくは約８．５×１０^８、８．６×１０^８若しくは約８．６×１０^８、８．７×１０^８若しくは約８．７×１０^８、８．８×１０^８若しくは約８．８×１０^８、８．９×１０^８若しくは約８．９×１０^８、９×１０^８若しくは約９×１０^８、９．１×１０^８若しくは約９．１×１０^８、９．２×１０^８若しくは約９．２×１０^８、９．３×１０^８若しくは約９．３×１０^８、９．４×１０^８若しくは約９．４×１０^８、９．５×１０^８若しくは約９．５×１０^８、９．６×１０^８若しくは約９．６×１０^８、９．７×１０^８若しくは約９．７×１０^８、９．８×１０^８若しくは約９．８×１０^８、９．９×１０^８若しくは約９．９×１０^８又は１×１０^９若しくは約１×１０^９ＡＰＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0484】

[00486] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養で添加されたＡＰＣの数が１×１０^８又は約１×１０^８ＡＰＣ～３．５×１０^８又は約３．５×１０^８ＡＰＣの範囲であり、第２の拡大培養で添加されたＡＰＣの数が３．５×１０^８又は約３．５×１０^８ＡＰＣ～１×１０^９又は約１×１０^９ＡＰＣの範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0485】

[00487] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養で添加されたＡＰＣの数が１．５×１０^８又は約１．５×１０^８ＡＰＣ～３×１０^８又は約３×１０^８ＡＰＣの範囲であり、第２の拡大培養で添加されたＡＰＣの数が４×１０^８又は約４×１０^８ＡＰＣ～７．５×１０^８又は約７．５×１０^８ＡＰＣの範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0486】

[00488] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養で添加されたＡＰＣの数が２×１０^８又は約２×１０^８ＡＰＣ～２．５×１０^８又は約２．５×１０^８ＡＰＣの範囲であり、第２の拡大培養で添加されたＡＰＣの数が４．５×１０^８又は約４．５×１０^８ＡＰＣ～５．５×１０^８又は約５．５×１０^８ＡＰＣの範囲であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0487】

[00489] 別の実施形態において、本発明は、２．５×１０^８又は約２．５×１０^８個のＡＰＣが第１の拡大培養に添加され、５×１０^８又は約５×１０^８個のＡＰＣが第２の拡大培養に添加されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0488】

[00490] 別の実施形態において、本発明は、抗原提示細胞が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0489】

[00491] 別の実施形態において、本発明は、複数の腫瘍断片が複数の別個の容器に分配され、そのそれぞれの別個の容器において第１のＴＩＬ集団がステップ（ａ）で得られ、第１のＴＩＬ集団がステップ（ａ）で得られ、第２のＴＩＬ集団がステップ（ｂ）で得られ、第３のＴＩＬ集団がステップ（ｃ）で得られ、ステップ（ｃ）の複数の容器からの治療用ＴＩＬ集団を併せて、ステップ（ｄ）から回収されるＴＩＬ集団が得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0490】

[00492] 別の実施形態において、本発明は、複数の腫瘍が複数の別個の容器に均一に分配されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0491】

[00493] 別の実施形態において、本発明は、複数の別個の容器が少なくとも２個の別個の容器を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0492】

[00494] 別の実施形態において、本発明は、複数の別個の容器が２～２０個の別個の容器を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0493】

[00495] 別の実施形態において、本発明は、複数の別個の容器が２～１５個の別個の容器を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0494】

[00496] 別の実施形態において、本発明は、複数の別個の容器が２～１０個の別個の容器を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0495】

[00497] 別の実施形態において、本発明は、複数の別個の容器が２～５個の別個の容器を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0496】

[00498] 別の実施形態において、本発明は、複数の別個の容器が２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個の別個の容器を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0497】

[00499] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）で第１のＴＩＬ集団に対して第１の拡大培養が実施される各容器について、ステップ（ｃ）の第２の拡大培養が、そのような第１のＴＩＬ集団から産生された第２のＴＩＬ集団に対して同じ容器で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0498】

[00500] 別の実施形態において、本発明は、別個の容器がそれぞれ第１のガス透過性表面積を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0499】

[00501] 別の実施形態において、本発明は、複数の腫瘍断片が単一の容器に分配されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0500】

[00502] 別の実施形態において、本発明は、単一の容器が第１のガス透過性表面積を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0501】

[00503] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に、１又は約１の細胞層～３又は約３の細胞層の厚さ平均で積層される。

【0502】

[00504] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に１．５又は約１．５の細胞層～２．５又は約２．５の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0503】

[00505] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に２又は約２の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0504】

[00506] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に１若しくは約１、１．１若しくは約１．１、１．２若しくは約１．２、１．３若しくは約１．３、１．４若しくは約１．４、１．５若しくは約１．５、１．６若しくは約１．６、１．７若しくは約１．７、１．８若しくは約１．８、１．９若しくは約１．９、２若しくは約２、２．１若しくは約２．１、２．２若しくは約２．２、２．３若しくは約２．３、２．４若しくは約２．４、２．５若しくは約２．５、２．６若しくは約２．６、２．７若しくは約２．７、２．８若しくは約２．８、２．９若しくは約２．９又は３若しくは約３の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0505】

[00507] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に３又は約３の細胞層～１０又は約１０の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0506】

[00508] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に４又は約４の細胞層～８又は約８の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0507】

[00509] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９又は１０若しくは約１０の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0508】

[00510] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に４若しくは約４、４．１若しくは約４．１、４．２若しくは約４．２、４．３若しくは約４．３、４．４若しくは約４．４、４．５若しくは約４．５、４．６若しくは約４．６、４．７若しくは約４．７、４．８若しくは約４．８、４．９若しくは約４．９、５若しくは約５、５．１若しくは約５．１、５．２若しくは約５．２、５．３若しくは約５．３、５．４若しくは約５．４、５．５若しくは約５．５、５．６若しくは約５．６、５．７若しくは約５．７、５．８若しくは約５．８、５．９若しくは約５．９、６若しくは約６、６．１若しくは約６．１、６．２若しくは約６．２、６．３若しくは約６．３、６．４若しくは約６．４、６．５若しくは約６．５、６．６若しくは約６．６、６．７若しくは約６．７、６．８若しくは約６．８、６．９若しくは約６．９、７若しくは約７、７．１若しくは約７．１、７．２若しくは約７．２、７．３若しくは約７．３、７．４若しくは約７．４、７．５若しくは約７．５、７．６若しくは約７．６、７．７若しくは約７．７、７．８若しくは約７．８、７．９若しくは約７．９又は８若しくは約８の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0509】

[00511] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が、第１のガス透過性表面積を含む第１の容器内で実施され、ステップ（ｃ）において、第２の拡大培養が、第２のガス透過性表面積を含む第２の容器内で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0510】

[00512] 別の実施形態において、本発明は、第２の容器が第１の容器よりも大きくなるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0511】

[00513] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に、１又は約１の細胞層～３又は約３の細胞層の厚さ平均で積層される。

【0512】

[00514] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に１．５又は約１．５の細胞層～２．５又は約２．５の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0513】

[00515] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に２又は約２の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0514】

[00516] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に１若しくは約１、１．１若しくは約１．１、１．２若しくは約１．２、１．３若しくは約１．３、１．４若しくは約１．４、１．５若しくは約１．５、１．６若しくは約１．６、１．７若しくは約１．７、１．８若しくは約１．８、１．９若しくは約１．９、２若しくは約２、２．１若しくは約２．１、２．２若しくは約２．２、２．３若しくは約２．３、２．４若しくは約２．４、２．５若しくは約２．５、２．６若しくは約２．６、２．７若しくは約２．７、２．８若しくは約２．８、２．９若しくは約２．９又は３若しくは約３の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0515】

[00517] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが第２のガス透過性表面積上に３又は約３の細胞層～１０又は約１０の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0516】

[00518] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが第２のガス透過性表面積上に４又は約４の細胞層～８又は約８の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0517】

[00519] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが第２のガス透過性表面積上に３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９又は１０若しくは約１０の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0518】

[00520] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが第２のガス透過性表面積上に４若しくは約４、４．１若しくは約４．１、４．２若しくは約４．２、４．３若しくは約４．３、４．４若しくは約４．４、４．５若しくは約４．５、４．６若しくは約４．６、４．７若しくは約４．７、４．８若しくは約４．８、４．９若しくは約４．９、５若しくは約５、５．１若しくは約５．１、５．２若しくは約５．２、５．３若しくは約５．３、５．４若しくは約５．４、５．５若しくは約５．５、５．６若しくは約５．６、５．７若しくは約５．７、５．８若しくは約５．８、５．９若しくは約５．９、６若しくは約６、６．１若しくは約６．１、６．２若しくは約６．２、６．３若しくは約６．３、６．４若しくは約６．４、６．５若しくは約６．５、６．６若しくは約６．６、６．７若しくは約６．７、６．８若しくは約６．８、６．９若しくは約６．９、７若しくは約７、７．１若しくは約７．１、７．２若しくは約７．２、７．３若しくは約７．３、７．４若しくは約７．４、７．５若しくは約７．５、７．６若しくは約７．６、７．７若しくは約７．７、７．８若しくは約７．８、７．９若しくは約７．９又は８若しくは約８の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0519】

[00521] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が、第１のガス透過性表面積を含む第１の容器内で実施され、ステップ（ｃ）において、第２の拡大培養が第１の容器内で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0520】

[00522] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣは、第１のガス透過性表面積上に、１又は約１の細胞層～３又は約３の細胞層の厚さ平均で積層される。

【0521】

[00523] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に１．５又は約１．５の細胞層～２．５又は約２．５の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0522】

[00524] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に２又は約２の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0523】

[00525] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に１若しくは約１、１．１若しくは約１．１、１．２若しくは約１．２、１．３若しくは約１．３、１．４若しくは約１．４、１．５若しくは約１．５、１．６若しくは約１．６、１．７若しくは約１．７、１．８若しくは約１．８、１．９若しくは約１．９、２若しくは約２、２．１若しくは約２．１、２．２若しくは約２．２、２．３若しくは約２．３、２．４若しくは約２．４、２．５若しくは約２．５、２．６若しくは約２．６、２．７若しくは約２．７、２．８若しくは約２．８、２．９若しくは約２．９又は３若しくは約３の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0524】

[00526] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に３又は約３の細胞層～１０又は約１０の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0525】

[00527] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に４又は約４の細胞層～８又は約８の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0526】

[00528] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９又は１０若しくは約１０の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0527】

[00529] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが第１のガス透過性表面積上に４若しくは約４、４．１若しくは約４．１、４．２若しくは約４．２、４．３若しくは約４．３、４．４若しくは約４．４、４．５若しくは約４．５、４．６若しくは約４．６、４．７若しくは約４．７、４．８若しくは約４．８、４．９若しくは約４．９、５若しくは約５、５．１若しくは約５．１、５．２若しくは約５．２、５．３若しくは約５．３、５．４若しくは約５．４、５．５若しくは約５．５、５．６若しくは約５．６、５．７若しくは約５．７、５．８若しくは約５．８、５．９若しくは約５．９、６若しくは約６、６．１若しくは約６．１、６．２若しくは約６．２、６．３若しくは約６．３、６．４若しくは約６．４、６．５若しくは約６．５、６．６若しくは約６．６、６．７若しくは約６．７、６．８若しくは約６．８、６．９若しくは約６．９、７若しくは約７、７．１若しくは約７．１、７．２若しくは約７．２、７．３若しくは約７．３、７．４若しくは約７．４、７．５若しくは約７．５、７．６若しくは約７．６、７．７若しくは約７．７、７．８若しくは約７．８、７．９若しくは約７．９又は８若しくは約８の細胞層の厚さ平均で積層されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0528】

[00530] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：１０又は約１：１０の範囲である。

【0529】

[00531] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：９又は約１：９の範囲である。

【0530】

[00532] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：８又は約１：８の範囲である。

【0531】

[00533] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：７又は約１：７の範囲である。

【0532】

[00534] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：６又は約１：６の範囲である。

【0533】

[00535] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：５又は約１：５の範囲である。

【0534】

[00536] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：４又は約１：４の範囲である。

【0535】

[00537] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：３又は約１：３の範囲である。

【0536】

[00538] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．１又は約１：１．１～１：２又は約１：２の範囲である。

【0537】

[00539] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．２又は約１：１．２～１：８又は約１：８の範囲である。

【0538】

[00540] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．３又は約１：１．３～１：７又は約１：７の範囲である。

【0539】

[00541] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．４又は約１：１．４～１：６又は約１：６の範囲である。

【0540】

[00542] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．５又は約１：１．５～１：５又は約１：５の範囲である。

【0541】

[00543] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．６又は約１：１．６～１：４又は約１：４の範囲である。

【0542】

[00544] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．７又は約１：１．７～１：３．５又は約１：３．５の範囲である。

【0543】

[00545] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．８又は約１：１．８～１：３又は約１：３の範囲である。

【0544】

[00546] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．９又は約１：１．９～１：２．５又は約１：２．５の範囲である。

【0545】

[00547] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：２又は約１：２の範囲である。

【0546】

[00548] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１の拡大培養が第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供し、ステップ（ｃ）で添加されたＡＰＣの数は、ステップ（ｂ）で追加されたＡＰＣの数よりも大きく、ステップ（ｂ）で積層されたＡＰＣの平均層数と、ステップ（ｃ）で積層されたＡＰＣの平均層数との比は、１：１．１若しくは約１：１．１、１：１．２若しくは約１：１．２、１：１．３若しくは約１：１．３、１：１．４若しくは約１：１．４、１：１．５若しくは約１：１．５、１：１．６若しくは約１：１．６、１：１．７若しくは約１：１．７、１：１．８若しくは約１：１．８、１：１．９若しくは約１：１．９、１：２若しくは約１：２、１：２．１若しくは約１：２．１、１：２．２若しくは約１：２．２、１：２．３若しくは約１：２．３、１：２．４若しくは約１：２．４、１：２．５若しくは約１：２．５、１：２．６若しくは約１：２．６、１：２．７若しくは約１：２．７、１：２．８若しくは約１：２．８、１：２．９若しくは約１：２．９、１：３若しくは約１：３、１：３．１若しくは約１：３．１、１：３．２若しくは約１：３．２、１：３．３若しくは約１：３．３、１：３．４若しくは約１：３．４、１：３．５若しくは約１：３．５、１：３．６若しくは約１：３．６、１：３．７若しくは約１：３．７、１：３．８若しくは約１：３．８、１：３．９若しくは約１：３．９、１：４若しくは約１：４、１：４．１若しくは約１：４．１、１：４．２若しくは約１：４．２、１：４．３若しくは約１：４．３、１：４．４若しくは約１：４．４、１：４．５若しくは約１：４．５、１：４．６若しくは約１：４．６、１：４．７若しくは約１：４．７、１：４．８若しくは約１：４．８、１：４．９若しくは約１：４．９、１：５若しくは約１：５、１：５．１若しくは約１：５．１、１：５．２若しくは約１：５．２、１：５．３若しくは約１：５．３、１：５．４若しくは約１：５．４、１：５．５若しくは約１：５．５、１：５．６若しくは約１：５．６、１：５．７若しくは約１：５．７、１：５．８若しくは約１：５．８、１：５．９若しくは約１：５．９、１：６若しくは約１：６、１：６．１若しくは約１：６．１、１：６．２若しくは約１：６．２、１：６．３若しくは約１：６．３、１：６．４若しくは約１：６．４、１：６．５若しくは約１：６．５、１：６．６若しくは約１：６．６、１：６．７若しくは約１：６．７、１：６．８若しくは約１：６．８、１：６．９若しくは約１：６．９、１：７若しくは約１：７、１：７．１若しくは約１：７．１、１：７．２若しくは約１：７．２、１：７．３若しくは約１：７．３、１：７．４若しくは約１：７．４、１：７．５若しくは約１：７．５、１：７．６若しくは約１：７．６、１：７．７若しくは約１：７．７、１：７．８若しくは約１：７．８、１：７．９若しくは約１：７．９、１：８若しくは約１：８、１：８．１若しくは約１：８．１、１：８．２若しくは約１：８．２、１：８．３若しくは約１：８．３、１：８．４若しくは約１：８．４、１：８．５若しくは約１：８．５、１：８．６若しくは約１：８．６、１：８．７若しくは約１：８．７、１：８．８若しくは約１：８．８、１：８．９若しくは約１：８．９、１：９若しくは約１：９、１：９．１若しくは約１：９．１、１：９．２若しくは約１：９．２、１：９．３若しくは約１：９．３、１：９．４若しくは約１：９．４、１：９．５若しくは約１：９．５、１：９．６若しくは約１：９．６、１：９．７若しくは約１：９．７、１：９．８若しくは約１：９．８、１：９．９若しくは約１：９．９又は１：１０若しくは約１：１０から選択される。

【0547】

[00549] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団のＴＩＬ数との比が１．５：１又は約１．５：１～１００：１又は約１００：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0548】

[00550] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団のＴＩＬ数との比が５０：１又は約５０：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0549】

[00551] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団のＴＩＬ数との比が２５：１又は約２５：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0550】

[00552] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団のＴＩＬ数との比が２０：１又は約２０：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0551】

[00553] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団のＴＩＬ数との比が１０：１又は約１０：１であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0552】

[00554] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍又は約５０倍大きくなるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0553】

[00555] 別の実施形態において、本発明は、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも１倍若しくは約１倍、２倍若しくは約２倍、３倍若しくは約３倍、４倍若しくは約４倍、５倍若しくは約５倍、６倍若しくは約６倍、７倍若しくは約７倍、８倍若しくは約８倍、９倍若しくは約９倍、１０倍若しくは約１０倍、１１倍若しくは約１１倍、１２倍若しくは約１２倍、１３倍若しくは約１３倍、１４倍若しくは約１４倍、１５倍若しくは約１５倍、１６倍若しくは約１６倍、１７倍若しくは約１７倍、１８倍若しくは約１８倍、１９倍若しくは約１９倍、２０倍若しくは約２０倍、２１倍若しくは約２１倍、２２倍若しくは約２２倍、２３倍若しくは約２３倍、２４倍若しくは約２４倍、２５倍若しくは約２５倍、２６倍若しくは約２６倍、２７倍若しくは約２７倍、２８倍若しくは約２８倍、２９倍若しくは約２９倍、３０倍若しくは約３０倍、３１倍若しくは約３１倍、３２倍若しくは約３２倍、３３倍若しくは約３３倍、３４倍若しくは約３４倍、３５倍若しくは約３５倍、３６倍若しくは約３６倍、３７倍若しくは約３７倍、３８倍若しくは約３８倍、３９倍若しくは約３９倍、４０倍若しくは約４０倍、４１倍若しくは約４１倍、４２倍若しくは約４２倍、４３倍若しくは約４３倍、４４倍若しくは約４４倍、４５倍若しくは約４５倍、４６倍若しくは約４６倍、４７倍若しくは約４７倍、４８倍若しくは約４８倍、４９倍若しくは約４９倍又は５０倍若しくは約５０倍大きくなるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0554】

[00556] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｄ）の回収されたＴＩＬ集団を凍結保存するステップを更に含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0555】

[00557] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｄ）後に追加のステップ、（ｅ）ステップ（ｄ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグ（任意選択でHypothermosolを含有する）に移すことを実施することを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0556】

[00558] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｅ）の回収されたＴＩＬ集団を含む輸液バッグを凍結保存するステップを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0557】

[00559] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存プロセスが、回収したＴＩＬ集団と凍結保存培地との比は、比率１：１を使用して実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0558】

[00560] 別の実施形態において、本発明は、抗原提示細胞が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0559】

[00561] 別の実施形態において、本発明は、ＰＢＭＣが照射され、及び同種異系であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0560】

[00562] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）で細胞培養物に添加されるＡＰＣの総数が２．５×１０^８であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0561】

[00563] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）で細胞培養物に添加されるＡＰＣの総数が５×１０^８であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0562】

[00564] 別の実施形態において、本発明は、ＡＰＣがＰＢＭＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0563】

[00565] 別の実施形態において、本発明は、ＰＢＭＣが照射され、及び同種異系であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0564】

[00566] 別の実施形態において、本発明は、抗原提示細胞が人工抗原提示細胞であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0565】

[00567] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｄ）の回収が膜ベースの細胞プロセスシステムを使用して実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0566】

[00568] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｄ）の回収がＬＯＶＯ細胞プロセスシステムを使用して実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0567】

[00569] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器あたり５又は約５～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0568】

[00570] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器あたり１０又は約１０～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0569】

[00571] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器あたり１５又は約１５～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0570】

[00572] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器あたり２０又は約２０～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0571】

[00573] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器あたり２５又は約２５～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0572】

[00574] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器あたり３０又は約３０～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0573】

[00575] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器あたり３５又は約３５～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0574】

[00576] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器あたり４０又は約４０～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0575】

[00577] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器あたり４５又は約４５～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0576】

[00578] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器あたり５０又は約５０～６０又は約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0577】

[00579] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器あたり２若しくは約２、３若しくは約３、４若しくは約４、５若しくは約５、６若しくは約６、７若しくは約７、８若しくは約８、９若しくは約９、１０若しくは約１０、１１若しくは約１１、１２若しくは約１２、１３若しくは約１３、１４若しくは約１４、１５若しくは約１５、１６若しくは約１６、１７若しくは約１７、１８若しくは約１８、１９若しくは約１９、２０若しくは約２０、２１若しくは約２１、２２若しくは約２２、２３若しくは約２３、２４若しくは約２４、２５若しくは約２５、２６若しくは約２６、２７若しくは約２７、２８若しくは約２８、２９若しくは約２９、３０若しくは約３０、３１若しくは約３１、３２若しくは約３２、３３若しくは約３３、３４若しくは約３４、３５若しくは約３５、３６若しくは約３６、３７若しくは約３７、３８若しくは約３８、３９若しくは約３９、４０若しくは約４０、４１若しくは約４１、４２若しくは約４２、４３若しくは約４３、４４若しくは約４４、４５若しくは約４５、４６若しくは約４６、４７若しくは約４７、４８若しくは約４８、４９若しくは約４９、５０若しくは約５０、５１若しくは約５１、５２若しくは約５２、５３若しくは約５３、５４若しくは約５４、５５若しくは約５５、５６若しくは約５６、５７若しくは約５７、５８若しくは約５８、５９若しくは約５９又は６０若しくは約６０の断片を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0578】

[00580] 別の実施形態において、本発明は、各断片が２７ｍｍ^３又は約２７ｍｍ^３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0579】

[00581] 別の実施形態において、本発明は、各断片が２０ｍｍ^３又は約２０ｍｍ^３～５０ｍｍ^３又は約５０ｍｍ^３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0580】

[00582] 別の実施形態において、本発明は、各断片が２１ｍｍ^３又は約２１ｍｍ^３～３０ｍｍ^３又は約３０ｍｍ^３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0581】

[00583] 別の実施形態において、本発明は、各断片が２２ｍｍ^３又は約２２ｍｍ^３～２９．５ｍｍ^３又は約２９．５ｍｍ^３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0582】

[00584] 別の実施形態において、本発明は、各断片が２３ｍｍ^３又は約２３ｍｍ^３～２９ｍｍ^３又は約２９ｍｍ^３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0583】

[00585] 別の実施形態において、本発明は、各断片が２４ｍｍ^３又は約２４ｍｍ^３～２８．５ｍｍ^３又は約２８．５ｍｍ^３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0584】

[00586] 別の実施形態において、本発明は、各断片が２５ｍｍ^３又は約２５ｍｍ^３～２８ｍｍ^３又は約２８ｍｍ^３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0585】

[00587] 別の実施形態において、本発明は、各断片が２６．５ｍｍ^３又は約２６．５ｍｍ^３～２７．５ｍｍ^３又は約２７．５ｍｍ^３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0586】

[00588] 別の実施形態において、本発明は、各断片が２１ｍｍ^３若しくは約２１ｍｍ^３、２２ｍｍ^３若しくは約２２ｍｍ^３、２３ｍｍ^３若しくは約２３ｍｍ^３、２４ｍｍ^３若しくは約２４ｍｍ^３、２５ｍｍ^３若しくは約２５ｍｍ^３、２６ｍｍ^３若しくは約２６ｍｍ^３、２７ｍｍ^３若しくは約２７ｍｍ^３、２８ｍｍ^３若しくは約２８ｍｍ^３、２９ｍｍ^３若しくは約２９ｍｍ^３、３０ｍｍ^３若しくは約３０ｍｍ^３、３１ｍｍ^３若しくは約３１ｍｍ^３、３２ｍｍ^３若しくは約３２ｍｍ^３、３３ｍｍ^３若しくは約３３ｍｍ^３、３４ｍｍ^３若しくは約３４ｍｍ^３、３５ｍｍ^３若しくは約３５ｍｍ^３、３６ｍｍ^３若しくは約３６ｍｍ^３、３７ｍｍ^３若しくは約３７ｍｍ^３、３８ｍｍ^３若しくは約３８ｍｍ^３、３９ｍｍ^３若しくは約３９ｍｍ^３、４０ｍｍ^３若しくは約４０ｍｍ^３、４１ｍｍ^３若しくは約４１ｍｍ^３、４２ｍｍ^３若しくは約４２ｍｍ^３、４３ｍｍ^３若しくは約４３ｍｍ^３、４４ｍｍ^３若しくは約４４ｍｍ^３、４５ｍｍ^３若しくは約４５ｍｍ^３、４６ｍｍ^３若しくは約４６ｍｍ^３、４７ｍｍ^３若しくは約４７ｍｍ^３、４８ｍｍ^３若しくは約４８ｍｍ^３、４９ｍｍ^３若しくは約４９ｍｍ^３又は５０ｍｍ^３若しくは約５０ｍｍ^３の体積を有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0587】

[00589] 別の実施形態において、本発明は、複数の断片が３０又は約３０～６０又は約６０の断片を含み、総体積が１３００ｍｍ^３又は約１３００ｍｍ^３～１５００ｍｍ^３又は約１５００ｍｍ^３であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0588】

[00590] 別の実施形態において、本発明は、複数の断片が１容器あたり５０又は約５０の断片を含み、総体積が１３５０ｍｍ^３又は約１３５０ｍｍ^３であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0589】

[00591] 別の実施形態において、本発明は、複数の断片が１容器あたり５０又は約５０の断片を含み、総重量が１ｇ又は約１ｇ～１．５ｇ又は約１．５ｇであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0590】

[00592] 別の実施形態において、本発明は、腫瘍断片が小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引物であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0591】

[00593] 別の実施形態において、本発明は、腫瘍断片がコア生検であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0592】

[00594] 別の実施形態において、本発明は、腫瘍断片が細針吸引物であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0593】

[00595] 別の実施形態において、本発明は、腫瘍断片が小生検（例えば、パンチ生検を含む）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0594】

[00596] 別の実施形態において、本発明は、腫瘍断片がコア針生検であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0595】

[00597] 別の実施形態において、本発明は、（ｉ）方法が、対象からの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引物から第１のＴＩＬ集団を得ることを含み、（ｉｉ）方法が、第１の拡大培養のステップを実施する前の約３日間にわたってＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養するステップを実施することを含み、（ｉｉｉ）方法が、約２１～３５日間にわたって第１の拡大培養を実施することを含み、（ｉｖ）方法が、約６～１２日間にわたって第２の拡大培養を実施することを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。前述の実施形態の一部において、方法のステップは、約３０～５０日で完了する。

【0596】

[00598] 別の実施形態において、本発明は、（ｉ）方法が、対象からの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引物から第１のＴＩＬ集団を得ることを含み、（ｉｉ）方法が、第１の拡大培養のステップを実施する前の約３日間にわたってＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養するステップを実施することを含み、（ｉｉｉ）方法が、約２１～３５日間にわたって第１の拡大培養を実施することを含み、（ｉｖ）方法が、約５日間にわたって第２のＴＩＬ集団の培養物を培養することによって第２の拡大培養を実施すること、培養物を最大５つの継代培養物に分割すること及び継代培養物を約６日間にわたって培養することを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。前述の実施形態の一部において、最大５つの継代培養物は、それぞれ、第２の拡大培養で第２のＴＩＬ集団の培養が開始される容器と同じかそれよりも大きい容器で培養される。前述の実施形態の一部において、第２のＴＩＬ集団の培養物は、最大で５つの継代培養物間で均等に分割される。前述の実施形態の一部において、方法のステップは、約３５～５０日で完了する。

【0597】

[00599] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１～約２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引物から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0598】

[00600] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１～約１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引物から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0599】

[00601] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引物から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0600】

[00602] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検又は細針吸引物から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0601】

[00603] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１～約２０個のコア生検から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0602】

[00604] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0603】

[00605] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のコア生検から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0604】

[00606] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のコア生検から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0605】

[00607] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１～約２０個の細針吸引物から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0606】

[00608] 第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１～約１０個の細針吸引物から得られるように変更された、上記の該当する段落である。

【0607】

[00609] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の細針吸引物から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0608】

[00610] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の細針吸引物から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0609】

[00611] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１～約２０個のコア針生検から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0610】

[00612] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア針生検から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0611】

[00613] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のコア針生検から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0612】

[00614] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のコア針生検から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0613】

[00615] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１～約２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0614】

[00616] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１～約１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0615】

[00617] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0616】

[00618] 別の実施形態において、本発明は、第１のＴＩＬ集団が対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0617】

[00619] 別の実施形態において、本発明は、（ｉ）方法が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から第１のＴＩＬ集団を得ることを含み、（ｉｉ）方法が、第１の拡大培養のステップを実施する前の約３日間にわたってＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養するステップを実施することを含み、（ｉｉｉ）方法が、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約２１～３５日間にわたって培養することにより、第１の拡大培養ステップを実施して、第２のＴＩＬ集団を得ることを含み、（ｉｖ）方法が、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む培養培地中で第２のＴＩＬ集団を約１１日間にわたって培養することにより、第２の拡大培養ステップを実施することを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。前述の実施形態の一部において、方法のステップは、約３５～５０日で完了する。

【0618】

[00620] 別の実施形態において、本発明は、（ｉ）方法が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から第１のＴＩＬ集団を得ることを含み、（ｉｉ）方法が、第１の拡大培養のステップを実施する前の約３日間にわたってＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養するステップを実施することを含み、（ｉｉｉ）方法が、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約２１～３５日間にわたって培養することにより、第１の拡大培養ステップを実施して、第２のＴＩＬ集団を得ることを含み、（ｉｖ）方法が、ＩＬ－２、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む培養培地中で第２のＴＩＬ集団の培養物を約５日間にわたって培養することにより、第２の拡大培養を実施すること、培養物を最大５つの継代培養物に分割すること及びＩＬ－２を含む培養培地中で各継代培養物を約６日間にわたって培養することを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。前述の実施形態の一部において、最大５つの継代培養物は、それぞれ、第２の拡大培養で第２のＴＩＬ集団の培養が開始される容器と同じかそれよりも大きい容器で培養される。前述の実施形態の一部において、第２のＴＩＬ集団の培養物は、最大で５つの継代培養物間で均等に分割される。前述の実施形態の一部において、方法のステップは、約３５～５０日で完了する。

【0619】

[00621] 別の実施形態において、本発明は、（ｉ）方法が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から第１のＴＩＬ集団を得ることを含み、（ｉｉ）方法が、第１の拡大培養のステップを実施する前の約３日間にわたってG-Rex 100Mフラスコ中の６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含む細胞培養培地中及び０．５ＬのＣＭ１培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養するステップを実施することを含み、（ｉｉｉ）方法が、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、１０μｇ／ｍＬの抗４－１ＢＢ抗体アゴニスト、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３及び約１０^８個のフィーダー細胞を含有する０．５ＬのＣＭ１培養培地の添加により第１の拡大培養を実施すること及び約２１～３５日間にわたって培養することを含み、（ｉｖ）方法が、（ａ）第２のＴＩＬ集団を３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、１０μｇ／ｍＬの抗４－１ＢＢ抗体アゴニスト、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３及び５×１０^９個のフィーダー細胞を含む５ＬのＣＭ２培養培地を含有するG-Rex 500MCSフラスコに移すこと及び約５日間にわたって培養すること、（ｂ）１０^９個のＴＩＬを、それぞれ３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含む５ＬのＡＩＭ－Ｖ培地を含む最大５個のG-Rex 500MCSフラスコに移すことにより、培養物を最大５つの継代培養物に分割すること及び継代培養物を約６日間にわたって培養することにより、第２の拡大培養を実施することを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。前述の実施形態の一部において、方法のステップは、約３５～５０日で完了する。

【0620】

[00622] 別の実施形態において、本発明は、細胞培養培地が、Ｇコンテナ又はXuri細胞培養バッグである容器内に提供されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0621】

[00623] 別の実施形態において、本発明は、細胞培養培地中のＩＬ－２濃度が約１０，０００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0622】

[00624] 別の実施形態において、本発明は、細胞培養培地中のＩＬ－２濃度が約６，０００ＩＵ／ｍＬであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0623】

[00625] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存培地がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0624】

[00626] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存培地が７％～１０％のＤＭＳＯを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0625】

[00627] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）の第１の拡大培養が２１日間若しくは約２１日間、２２日間若しくは約２２日間、２３日間若しくは約２３日間、２４日間若しくは約２４日間、２５日間若しくは約２５日間、２６日間若しくは約２６日間、２７日間若しくは約２７日間、２８日間若しくは約２８日間、２９日間若しくは約２９日間、３０日間若しくは約３０日間、３１日間若しくは約３１日間、３２日間若しくは約３２日間、３３日間若しくは約３３日間、３４日間若しくは約３４日間又は３５日間若しくは約３５日間の期間内で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0626】

[00628] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）の第２の拡大培養が１日間若しくは約１日間、２日間若しくは約２日間、３日間若しくは約３日間、４日間若しくは約４日間、５日間若しくは約５日間、６日間若しくは約６日間、７日間若しくは約７日間、８日間若しくは約８日間、９日間若しくは約９日間、１０日間若しくは約１０日間、１１日間若しくは約１１日間又は１２日間若しくは約１２日間の期間内で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0627】

[00629] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計２７日又は約２７日～４７日又は約４７日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0628】

[00630] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計２８日又は約２８日～４６日又は約４６日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0629】

[00631] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計２９日又は約２９日～４５日又は約４５日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0630】

[00632] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３０日又は約３０日～４４日又は約４４日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0631】

[00633] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３１日又は約３１日～４３日又は約４３日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0632】

[00634] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３２日又は約３２日～４２日又は約４２日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0633】

[00635] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３３日又は約３３日～４１日又は約４１日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0634】

[00636] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３４日又は約３４日～４０日又は約４０日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0635】

[00637] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３５日又は約３５日～３９日又は約３９日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0636】

[00638] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３６日又は約３６日～３８日又は約３８日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0637】

[00639] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計２７日若しくは約２７日、２８日若しくは約２８日、２９日若しくは約２９日、３０日若しくは約３０日、３１日若しくは約３１日、３２日若しくは約３２日、３３日若しくは約３３日、３４日若しくは約３４日、３５日若しくは約３５日、３６日若しくは約３６日、３７日若しくは約３７日、３８日若しくは約３８日、３９日若しくは約３９日、４０日若しくは約４０日、４１日若しくは約４１日、４２日若しくは約４２日、４３日若しくは約４３日、４４日若しくは約４４日、４５日若しくは約４５日、４６日若しくは約４６日又は４７日若しくは約４７日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0638】

[00640] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計２７日又は約２７日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0639】

[00641] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計２８日又は約２８日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0640】

[00642] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計２９日又は約２９日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0641】

[00643] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３０日又は約３０日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0642】

[00644] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３１日又は約３１日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0643】

[00645] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３２日又は約３２日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0644】

[00646] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３３日又は約３３日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0645】

[00647] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３４日又は約３４日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0646】

[00648] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３５日又は約３５日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0647】

[00649] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３６日又は約３６日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0648】

[00650] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３７日又は約３７日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0649】

[00651] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３８日又は約３８日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0650】

[00652] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３９日又は約３９日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0651】

[00653] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４０日又は約４０日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0652】

[00654] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４１日又は約４１日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0653】

[00655] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４２日又は約４２日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0654】

[00656] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４３日又は約４３日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0655】

[00657] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４４日又は約４４日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0656】

[00658] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４５日又は約４５日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0657】

[00659] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４６日又は約４６日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0658】

[00660] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４７日又は約４７日で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0659】

[00661] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計２７日又は約２７日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0660】

[00662] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計２８日又は約２８日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0661】

[00663] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計２９日又は約２９日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0662】

[00664] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３０日又は約３０日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0663】

[00665] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３１日又は約３１日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0664】

[00666] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３２日又は約３２日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0665】

[00667] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３３日又は約３３日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0666】

[00668] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３４日又は約３４日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0667】

[00669] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３５日又は約３５日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0668】

[00670] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３６日又は約３６日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0669】

[00671] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３７日又は約３７日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0670】

[00672] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３８日又は約３８日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0671】

[00673] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計３９日又は約３９日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0672】

[00674] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４０日又は約４０日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0673】

[00675] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４１日又は約４１日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0674】

[00676] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４２日又は約４２日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0675】

[00677] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４３日又は約４３日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0676】

[00678] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４４日又は約４４日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0677】

[00679] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４５日又は約４５日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0678】

[00680] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４６日又は約４６日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0679】

[00681] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計４７日又は約４７日以下で実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0680】

[00682] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップが最大８日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0681】

[00683] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップが最大９日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0682】

[00684] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップが最大１０日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0683】

[00685] 別の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養ステップが最大１１日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0684】

[00686] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養ステップが２１～３５日間の期間中に実施され、及び第２の拡大培養ステップが最大９日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0685】

[00687] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養ステップが２１～３５日間の期間中に実施され、及び第２の拡大培養ステップが最大１０日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0686】

[00688] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養ステップが２５～３１日間の期間中に実施され、及び第２の拡大培養ステップが最大９日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0687】

[00689] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養ステップが２５～３１日間の期間中に実施され、及び第２の拡大培養ステップが最大１０日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0688】

[00690] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養ステップが２８日間の期間中に実施され、及び第２の拡大培養ステップが最大９日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0689】

[00691] 別の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養ステップが２８日間の期間中に実施され、及び第２の拡大培養ステップが最大８日間の期間中に実施されるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0690】

[00692] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｄ）からの回収された治療用ＴＩＬ集団中が、治療有効投与量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0691】

[00693] 別の実施形態において、本発明は、治療有効投与量となるのに十分なＴＩＬの数が２．３×１０^１０又は約２．３×１０^１０～１３．７×１０^１０又は約１３．７×１０^１０個であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0692】

[00694] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）の第３のＴＩＬ集団が有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0693】

[00695] 別の実施形態において、本発明は、ステップ（ｃ）の第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞が、ステップ（ｂ）の第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ８及びＣＤ２８発現の増加を呈するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0694】

[00696] 別の実施形態において、本発明は、本方法で列挙される各容器が閉鎖容器であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0695】

[00697] 別の実施形態において、本発明は、本方法で列挙される各容器がＧ－コンテナであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0696】

[00698] 別の実施形態において、本発明は、本方法で列挙される各容器がGREX-10であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0697】

[00699] 別の実施形態において、本発明は、本方法で列挙される各容器がGREX-100であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0698】

[00700] 別の実施形態において、本発明は、本方法で列挙される各容器がGREX-500であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法を提供する。

【0699】

[00701] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された方法によって作製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療用集団を提供する。

【0700】

[00702] 別の実施形態において、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療用集団を提供し、治療用ＴＩＬ集団は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）又はＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供する。

【0701】

[00703] 別の実施形態において、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療用集団を提供し、治療用ＴＩＬ集団は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供する。

【0702】

[00704] 別の実施形態において、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療用集団を提供し、治療用ＴＩＬ集団は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供する。

【0703】

[00705] 別の実施形態において、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療用集団を提供し、治療用ＴＩＬ集団は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せず、及びＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加及び／又はポリクローナル性の増加を提供する。

【0704】

[00706] 別の実施形態において、本発明は、インターフェロンガンマ産生の増加を提供する、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。

【0705】

[00707] 別の実施形態において、本発明は、ポリクローナル性の増加を提供する、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。

【0706】

[00708] 別の実施形態において、本発明は、有効性の増加を提供する、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。

【0707】

[00709] 別の実施形態において、本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療用集団を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載される、例えば、該当する先の段落のいずれかに記載された方法のステップ（ａ）～（ｄ）に記載されるか、又は図１に示されるステップＡ～Ｆに従う、拡大培養プロセスにより、少なくとも１倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能となる。

【0708】

[00710] 別の実施形態において、本発明は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療用集団を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載される、例えば、該当する先の段落のいずれかに記載された方法のステップ（ａ）～（ｄ）に記載されるか、又は図１に示されるステップＡ～Ｆに従う、拡大培養プロセスにより、少なくとも１倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能となる。

【0709】

[00711] 別の実施形態において、本発明は、ＡＰＣを添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載される、例えば、該当する先の段落のいずれかに記載された方法のステップ（ａ）～（ｄ）に記載されるか、又は図１に示されるステップＡ～Ｆに従う、拡大培養プロセスにより、少なくとも２倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能となる。

【0710】

[00712] 別の実施形態において、本発明は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載される、例えば、該当する先の段落のいずれかに記載された方法のステップ（ａ）～（ｄ）に記載されるか、又は図１に示されるステップＡ～Ｆに従う、拡大培養プロセスにより、少なくとも２倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能となる。

【0711】

[00713] 別の実施形態において、本発明は、ＡＰＣを添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載される、例えば、該当する先の段落のいずれかに記載された方法のステップ（ａ）～（ｄ）に記載されるか、又は図１に示されるステップＡ～Ｆに従う、拡大培養プロセスにより、少なくとも１倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能となる。

【0712】

[00714] 別の実施形態において、本発明は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡大培養を実施するプロセスにより調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である、治療用ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載される、例えば、該当する先の段落のいずれかに記載された方法のステップ（ａ）～（ｄ）に記載されるか、又は図１に示されるステップＡ～Ｆに従う、拡大培養プロセスにより、少なくとも３倍多くのインターフェロンガンマ産生が可能となる。

【0713】

医薬組成物、投薬量及び投与レジメン
[00715] 一実施形態において、本開示のＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当技術分野で公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０～６０分間継続される。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が含まれる。

【0714】

[00716] 任意の適切な用量のＴＩＬを投与することができる。一部の実施形態において、好適な投薬量には、治療上十分な数のＴＩＬが必要である。一部の実施形態において、特に癌が黒色腫である場合、平均が約７．８×１０^１０ＴＩＬである約２．３×１０^１０～約１３．７×１０^１０ＴＩＬが投与される。一実施形態において、約１．２×１０^１０～約４．３×１０^１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約３×１０^１０～約１２×１０^１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約４×１０^１０～約１０×１０^１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約５×１０^１０～約８×１０^１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約６×１０^１０～約８×１０^１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約７×１０^１０～約８×１０^１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約２．３×１０^１０～約１３．７×１０^１０個である。一部の実施形態において、特に、癌が黒色腫である場合、治療有効投与量は約７．８×１０^１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約１．２×１０^１０～約４．３×１０^１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約３×１０^１０～約１２×１０^１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約４×１０^１０～約１０×１０^１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約５×１０^１０～約８×１０^１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約６×１０^１０～約８×１０^１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約７×１０^１０～約８×１０^１０個のＴＩＬである。

【0715】

[00717] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３及び９×１０^１３個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１×１０^６～５×１０^６、５×１０^６～１×１０^７、１×１０^７～５×１０^７、５×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～５×１０^８、５×１０^８～１×１０^９、１×１０^９～５×１０^９、５×１０^９～１×１０^１０、１×１０^１０～５×１０^１０、５×１０^１０～１×１０^１１、５×１０^１１～１×１０^１２、１×１０^１２～５×１０^１２及び５×１０^１２～１×１０^１３の範囲内である。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３及び９×１０^１３個である。

【0716】

[00718] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより低い。

【0717】

[00719] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより高い。

【0718】

[00720] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％又は約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。

【0719】

[00721] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。

【0720】

[00722] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ又は０．０００１ｇ以下である。

【0721】

[00723] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ又は１０ｇ超である。

【0722】

[00724] 本発明の医薬組成物において提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されるべき対象の性別及び年齢、処置されるべき対象の体重並びに担当医の選好及び経験に依存するであろう。臨床的に確立されたＴＩＬの投与量も適切な場合に使用され得る。ＴＩＬの投与量など、本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、処置されるヒト又は哺乳動物、疾患又は状態の重症度、投与速度、活性医薬成分の性質及び処方医の裁量に依存するであろう。

【0723】

[00725] 一部の実施形態において、ＴＩＬは、単回投与で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは、複数回投与で投与され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回を超え得る。投与は、月に１回、２週間に１回、週に１回又は隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は、必要な限り継続され得る。

【0724】

[00726] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３及び９×１０^１３個である。一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、１×１０^６～５×１０^６、５×１０^６～１×１０^７、１×１０^７～５×１０^７、５×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～５×１０^８、５×１０^８～１×１０^９、１×１０^９～５×１０^９、５×１０^９～１×１０^１０、１×１０^１０～５×１０^１０、５×１０^１０～１×１０^１１、５×１０^１１～１×１０^１２、１×１０^１２～５×１０^１２及び５×１０^１２～１×１０^１３の範囲内である。

【0725】

[00727] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇｍｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。

【0726】

[00728] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ又は約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ又は約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。

【0727】

[00729] 有効量のＴＩＬは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射によること、静脈内、腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること又は吸入によることを含めて、同様の有用性を有する薬剤について一般に認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれでも投与され得る。

【0728】

[00730] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団を含む輸液バッグを提供する。

【0729】

[00731] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載される治療用ＴＩＬ集団及び薬学的に許容される担体を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。

【0730】

[00732] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を含む輸液バッグを提供する。

【0731】

[00733] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団の凍結保存調製物を提供する。

【0732】

[00734] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載される治療用ＴＩＬ集団及び凍結保存培地を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。

【0733】

[00735] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存培地がＤＭＳＯを含有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0734】

[00736] 別の実施形態において、本発明は、凍結保存培地が７～１０％のＤＭＳＯを含有するように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0735】

[00737] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の凍結保存調製物を提供する。

【0736】

[00738] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載される治療用ＴＩＬ集団及び上記の該当する先の段落のいずれかに記載される任意の限定培地又は無血清培地を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。

【0737】

患者の処置方法
[00739] 処置方法は、最初のＴＩＬ収集及びＴＩＬの培養から始まる。そのような方法は、両方とも当技術分野において例えばJin et al.（J.Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292）（全体として参照により本明細書に援用される）により記載されている。

【0738】

[00740] 本発明は、以前に記載されていないＴＩＬ生成のための新規な方法を提供する。上記のステップＡ～Ｆに従って産生されたか、又は本明細書に記載されるように他の方法で産生された、拡大培養ＴＩＬは、癌を有する患者の処置において特定の用途が見出される。癌の処置にＴＩＬを使用する一般的な方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239及びその補足内容に記載されている。同様に、本発明に従って産生されたＴＩＬは、癌の処置に使用することもできる。一部の実施形態では、ＴＩＬは、先述の通り、転移性黒色腫の寄託切除物から成長させた（Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342を参照されたい；全体として参照により本明細書に援用される）。新鮮腫瘍は無菌条件下で剥離し得る。正式な病理解析のため、代表試料を収集し得る。２ｍｍ^３～３ｍｍ^３の単一の断片。一部の実施形態において、患者１人あたり５、１０、１５、２０、２５又は３０の試料が得られる。一部の実施形態において、患者１人あたり２０、２５又は３０の試料が得られる。一部の実施形態において、患者１人あたり２０、２２、２４、２６又は２８の試料が得られる。一部の実施形態において、患者１人あたり２４の試料が得られる。試料を２４ウェルプレートの個々のウェルに置き、高用量ＩＬ－２（６，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む成長培地中に維持し、腫瘍の破壊及び／又はＴＩＬの増殖に関してモニタリングし得る。処理後に生細胞が残っている任意の腫瘍を酵素消化して単一細胞懸濁液にし、本明細書に記載される通り凍結保存し得る。

【0739】

[00741] 一部の実施形態において、表現型分析（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ５６）のため、拡大培養したＴＩＬをサンプリングし、利用可能な場合には自己腫瘍に対して試験し得る。ＴＩＬは、一晩の共培養によりインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）レベル＞２００ｐｇ／ｍＬ及びバックグラウンドの２倍となった場合に応答性であると見なすことができる。（Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847；全体として参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態において、自己応答性又は十分な成長パターンのエビデンスを有する培養物が、急速拡大培養（ＲＥＰ）と称されることもある第２の拡大培養を含む第２の拡大培養（例えば、ステップＤに従って提供されるような第２の拡大培養）に選択され得る。一部の実施形態において、高い自己応答性（例えば、第２の拡大培養中の高い増殖）を有する拡大培養ＴＩＬが追加の第２の拡大培養に選択される。一部の実施形態において、自己応答性（例えば、ステップＤに提供されるような第２の拡大培養中の高い増殖）を有するＴＩＬがステップＤによる追加の第２の拡大培養に選択される。

【0740】

[00742] 一部の実施形態において、患者はＡＣＴ（養子細胞移入）に直接移されず、例えば、一部の実施形態において、腫瘍採取後及び／又は第１の拡大培養後、細胞はすぐには利用されない。そのような実施形態において、ＴＩＬを凍結保存し、第２の拡大培養ステップの２日前（例えば、一部の実施形態において、ＲＥＰステップと称されるステップの２日前）に解凍することができる。そのような実施形態において、ＴＩＬを凍結保存し、第２の拡大培養ステップの２日前（例えば、一部の実施形態において、ステップＤの２日前）に解凍することができる。本願を通して様々な実施形態で説明されるように、第２の拡大培養（ＲＥＰと称されるプロセスを含む）では、照射フィーダー細胞（可能な場合には自己）の存在下、１００：１の比率で、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３）抗体（Miltenyi Biotech, San Diego, CA）及びＩＬ－２（３，０００ＩＵ／ｍＬ；Prometheus, San Diego, CA）を使用した（Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342を参照；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、第２の拡大培養ステップの５日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、第２の拡大培養ステップの４日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、第２の拡大培養ステップの３日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、第２の拡大培養ステップの２日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、第２の拡大培養ステップの１日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、第２の拡大培養ステップの直前に解凍することができる。

【0741】

[00743] 輸注バッグＴＩＬの凍結保存サンプルの細胞表現型は、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡ（BD BioSciences）に関するフローサイトメトリー（FlowJo）並びに本明細書に記載される方法のいずれかによって分析することができる。血清サイトカインは標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ法を用いることにより測定した。血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、１００ｐｇ／ｍＬ超であり、血清ＩＦＮ－ｇのベースラインレベルの４倍超又は少なくとも３倍又は少なくとも２倍又は少なくとも１倍大きいと定義された。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、１０００ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、２００ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、２５０ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、３００ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、３５０ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、４００ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、４５０ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、５００ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、５５０ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、６００ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、６５０ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、７００ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、７５０ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、８００ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、８５０ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、９００ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、９５０ｐｇ／ｍＬ超として定義される。一部の実施形態において、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、１０００ｐｇ／ｍＬ超として定義される。

【0742】

[00744] 有効性の尺度は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されるように、疾患制御率（ＤＣＲ）及び全奏効率（ＯＲＲ）を含み得る。

【0743】

１．癌及び他の疾患の処置方法
[00745] 本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患の処置方法で使用することができる。一実施形態において、それらは過剰成長性障害の処置に使用するためのものである。それらは、本明細書及び以下の段落に記載されている通り、他の障害の処置にも使用され得る。

【0744】

[00746] 一部の実施形態において、過剰成長性障害は癌である。一部の実施形態において、過剰成長性障害は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、胃腸癌、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、過剰成長性障害は血液学的悪性腫瘍である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。

【0745】

[00747] 一部の実施形態において、癌は、高頻度変異癌表現型である。高頻度変異癌は、Campbell, et al.に広く記載されている（Cell, 171:1042-1056 (2017)；全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態において、高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり９～１０個の変異を含む。一部の実施形態において、小児の高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり９．９１個の変異を含む。一部の実施形態において、成人の高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり９個の変異を含む。一部の実施形態において、増強された高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり１０～１００個の変異を含む。一部の実施形態において、増強された小児の高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり１０～１００個の変異を含む。一部の実施形態において、増強された成人の高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり１０～１００個の変異を含む。一部の実施形態において、超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり１００個を超える変異を含む。一部の実施形態において、小児の超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり１００個を超える変異を含む。一部の実施形態において、成人の超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）あたり１００個を超える変異を含む。

【0746】

[00748] 一部の実施形態において、高頻度変異腫瘍は、複製修復経路に変異を有する。一部の実施形態において、高頻度変異腫瘍は、複製修復関連ＤＮＡポリメラーゼに変異を有する。一部の実施形態において、高頻度変異腫瘍はマイクロサテライト不安定性を有する。一部の実施形態において、超高頻度変異腫瘍は、複製修復関連ＤＮＡポリメラーゼに変異を有し、マイクロサテライト不安定性を有する。一部の実施形態において、腫瘍の高頻度変異は、免疫チェックポイント阻害剤に対する応答と相関している。一部の実施形態において、高頻度変異腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤による処置に耐性である。一部の実施形態において、高頻度変異腫瘍は、本発明のＴＩＬを使用して処置することができる。一部の実施形態において、腫瘍の高頻度変異は、環境要因（外因性曝露）によって引き起こされる。例えば、ＵＶ光線は、悪性黒色腫における多数の変異の主な原因であり得る（例えば、Pfeifer, G.P., You, Y.H., and Besaratinia, A.(2005).Mutat.Res.571, 19-31.；Sage, E.(1993).Photochem.Photobiol.57, 163-174を参照されたい）。一部の実施形態において、腫瘍の高頻度変異は、直接の変異誘発物質への曝露により、肺及び喉頭の腫瘍並びに他の腫瘍について、タバコ煙中の６０を超える発癌物質によって引き起こされ得る（例えば、Pleasance, E.D., Stephens, P.J., O’Meara, S., McBride, D.J., Meynert, A., Jones, D., Lin, M.L., Beare, D., Lau, K.W., Greenman, C., et al.(2010).Nature 463, 184-190を参照されたい）。一部の実施形態において、腫瘍における高頻度変異は、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーメンバーの調節不全によって引き起こされ、これは、広範な癌においてＣからＴへの移行のレベルの増加をもたらすことが示されている（例えば、Roberts, S.A., Lawrence, M.S., Klimczak, L.J., Grimm, S.A., Fargo, D., Stojanov, P., Kiezun, A., Kryukov, G.V., Carter, S.L., Saksena, G., et al.(2013).Nat.Genet.45, 970-976を参照されたい）。一部の実施形態において、腫瘍の高頻度変異は、主要な複製酵素であるＰｏｌ３及びＰｏｌｄ１によって実行される、プルーフリーディングを損なう変異による欠陥のあるＤＮＡ複製修復によって引き起こされる。一部の実施形態において、腫瘍の高頻度変異は、結腸直腸癌、子宮内膜癌及び他の癌の高頻度変異に関連するＤＮＡミスマッチ修復の欠陥によって引き起こされる（例えば、Kandoth, C., Schultz, N., Cherniack, A.D., Akbani, R., Liu, Y., Shen, H., Robertson, A.G., Pashtan, I., Shen, R., Benz, C.C., et al.; (2013).Nature 497, 67-73.；Muzny, D.M., Bainbridge, M.N., Chang, K., Dinh, H.H., Drummond, J.A., Fowler, G., Kovar, C.L., Lewis, L.R., Morgan, M.B., Newsham, I.F., et al.; (2012).Nature 487, 330-337を参照されたい）。一部の実施形態において、ＤＮＡ複製修復変異は、体質性又は両アレル性のミスマッチ修復欠損症（ＣＭＭＲＤ）、リンチ症候群及びポリメラーゼプルーフリーディング関連ポリポーシス（ＰＰＡＰ）などの癌素因症候群にも見られる。

【0747】

[00749] 一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団を用いて癌を処置する方法を含み、癌は、高頻度変異癌である。一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団を用いて癌を処置する方法を含み、癌は、増強された高頻度変異癌である。一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団を用いて癌を処置する方法を含み、癌は、超高頻度変異癌である。

【0748】

[00750] ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、患者は、本開示によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入前２７～２３日目）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ^２／日である。一実施形態において、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的許容量まで８時間ごとに７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ－２の静脈内注入を受ける。

【0749】

[00751] 示された疾患又は障害の処置、予防及び／又は管理における本明細書に記載の化合物及び化合物の組み合わせの有効性は、ヒト疾患の処置のためのガイダンスを提供する、当技術分野で公知の様々なモデルを使用して試験することができる。例えば、卵巣癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92;及びFong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12に記載がある。膵臓癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294に記載がある。乳癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212に記載がある。黒色腫の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res.2010, 23, 853-859に記載がある。肺癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664に記載がある。肺癌処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Kim, Clin.Exp.Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60;及びSano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32に記載がある。

【0750】

２．任意選択での患者のリンパ球枯渇プレコンディショニング
[00752] ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、患者は、本開示によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、本発明は、骨髄非破壊的化学療法で前処置された患者の癌処置に使用するためのＴＩＬの集団を含む。ある実施形態において、ＴＩＬの集団は注入による投与用である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入前２７～２３日目）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ^２／日である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示によるＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２（アルデスロイキン、PROLEUKINとして市販）の静脈内注入を受ける。特定の実施形態では、ＴＩＬの集団は、ＩＬ－２と組み合わせて癌を処置するのに使用され、ＩＬ－２はＴＩＬの集団の後に投与される。

【0751】

[00753] 実験的知見から、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合エレメント（「サイトカインシンク」）の除去により、処置有効性の増強において重要な役割を果たすことが指摘される。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明の第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含めて、ステップＤに記載されるものなど）を導入する前に患者に対してリンパ枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。

【0752】

[00754] 一般的に、リンパ球枯渇はフルダラビン及び／又はシクロホスファミド（活性型はマホスファミドと称される）及びその組み合わせを使用して行われる。そのような方法については、Gassner, et al.（Cancer Immunol Immunother.2011, 60(1):75-85、Muranski, et al., Nat Clin Pract Oncol., 2006 3(12):668-681、Dudley, et al., J Clin Oncol 2008, 26:5233-5239及びDudley, et al., J Clin Oncol.2005, 23(10):2346-2357（これらは全て、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0753】

[00755] 一部の実施形態において、フルダラビンは、０．５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌフルダラビン（Sigma-Aldrich, MO, USA）の濃度である。一部の実施形態において、フルダラビンは、１μｇ／ｍｌフルダラビン（Sigma-Aldrich, MO, USA）の濃度である。一部の実施形態において、フルダラビン処置は１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日間又はそれ以上にわたる。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日又は４５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間にわたる。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間にわたる。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、２５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間にわたる。

【0754】

[00756] 一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、０．５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、１μｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日以上にわたって行われる。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ^２／日、１５０ｍｇ／ｍ^２／日、１７５ｍｇ／ｍ^２／日、２００ｍｇ／ｍ^２／日、２２５ｍｇ／ｍ^２／日、２５０ｍｇ／ｍ^２／日、２７５ｍｇ／ｍ^２／日又は３００ｍｇ／ｍ^２／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内（即ちｉ．ｖ．）投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間にわたる。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ^２／日 ｉ．ｖ．で４～５日間にわたる。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ^２／日 ｉ．ｖ．で４日間にわたる。

【0755】

[00757] 一部の実施形態において、フルダラビン及びシクロホスファミドは、一緒に患者に投与される。一部の実施形態において、４日間にわたってフルダラビンは２５ｍｇ／ｍ^２／日、ｉ．ｖ．で投与され、シクロホスファミドは２５０ｍｇ／ｍ^２／日、ｉ．ｖ．で投与される。

【0756】

[00758] このプロトコルには、フルダラビン（２５ｍｇ／ｍ^２／日 ｉ．ｖ．）及びシクロホスファミド（２５０ｍｇ／ｍ^２／日 ｉ．ｖ．）の４日間にわたる投与が含まれる。

【0757】

３．共投与方法
[00759] 一部の実施形態において、本明細書のステップＡからＦ記載されるように作製されるＴＩＬは、以下に記載する抗体など、１つ以上の免疫チェックポイント調節因子と併用して投与することができる。例えば、ＰＤ－１を標的とし、及び本発明のＴＩＬと共投与し得る抗体としては、例えば、限定されないが、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Bristol-Myers Squibb；Opdivo（登録商標））、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５又はＭＫ－３４７５、Merck；Keytruda（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１（ShangHai JunShi）、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２（Tesaro, Inc.）、ピジリズマブ（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Medivation）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７（BeiGene）及び／又は抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０（ShangHai HengRui）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Regeneron）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６（Bristol-Myers Squibb）及び／又はヒト化抗ＰＤ１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Novartis）が挙げられる。一部の実施形態において、ＰＤ－１抗体は、クローン：ＲＭＰ１－１４（ラットＩｇＧ）－BioXcellカタログ番号BP0146からのものである。本明細書に記載される通りのステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、米国特許第８，００８，４４９号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される抗ＰＤ－１抗体である。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－１とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ－Ｌ１に結合してＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を破壊し、及び抗腫瘍免疫応答を刺激する、当技術分野で公知の任意の抗体は、本明細書に記載される通りのステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適である。例えば、ＰＤ－Ｌ１を標的とする臨床試験中の抗体としては、ＢＭＳ－９３６５５９（Bristol-Myers Squibb）及びＭＰＤＬ３２８０Ａ（Genentech）が挙げられる。ＰＤ－Ｌ１を標的とする他の好適な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される。当業者は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を破壊し、及び抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適であることを理解するであろう。一部の実施形態において、ステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬの組み合わせを投与される対象は、患者が抗ＰＤ－１抗体単独の投与に抵抗性の癌型を有するとき抗ＰＤ－１抗体と共投与される。一部の実施形態において、患者が抵抗性黒色腫を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ－１と併用して投与される。一部の実施形態において、患者が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ－１と併用して投与される。

【0758】

４．ＩＬ－２レジメン
[00760] 一実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、治療有効部分の投与の翌日から静脈内投与される高用量ＩＬ－２レジメンを含み、治療用ＴＩＬ集団の治療有効部分を投与した１日後から静脈に内投与され始め、高用量ＩＬ－２レジメンはアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくはそれらの変異体を含み、アルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体が忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入を使用して、最大１４用量で、０．０３７ｍｇ／ｋｇ又は０．０４４ｍｇ／ｋｇ ＩＵ／ｋｇ（患者の体重）の用量で投与される。９日間の休息後、このスケジュールを更に１４回、合計で最大２８回まで繰り返し得る。

【0759】

[00761] 一実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、漸減性ＩＬ－２レジメンを含む。漸減性ＩＬ－２レジメンは、O’Day, et al., J. Clin.Oncol. 1999, 17, 2752-61及びEton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、漸減性ＩＬ－２レジメンは、１８×１０^６ ＩＵ／ｍ^２の６時間にわたる静脈内投、それに続く１８×１０^６ ＩＵ／ｍ^２の１２時間にわたる静脈内投与、その後、１８×１０^６ ＩＵ／ｍ^２の２４時間にわたる静脈内投与、その後、４．５×１０^６ ＩＵ／ｍ^２の７２時間にわたる静脈内投与を含む。この処置サイクルは、最大４サイクル、２８日毎に繰り返され得る。一実施形態において、漸減性ＩＬ－２レジメンは、１日目の１８，０００，０００ＩＵ／ｍ^２、２日目の９，０００，０００ＩＵ／ｍ^２、３日目及び４日目の４，５００，０００ＩＵ／ｍ^２を含む。

【0760】

[00762] 一実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量で、１、２、４、６、７、１４又は２１日毎にペグ化ＩＬ－２を投与することを含む。

【0761】

５．養子細胞移入
[00763] 養子細胞移入（ＡＣＴ）は、非常に有効な形態の免疫療法であり、抗腫瘍活性を有する免疫細胞を癌患者に移入することを含む。ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロ同定、それらの細胞の数を増やすインビトロ拡大培養及び癌担持宿主へのその注入を伴う治療手法である。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍の間質に由来し得る（腫瘍浸潤リンパ球又はＴＩＬ）。ＡＣＴのためのＴＩＬは、本明細書に記載される通り調製することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図面に記載される通りの方法により調製される。ＴＩＬはまた、抗腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている場合、血液から誘導され得るか、混合リンパ球腫瘍細胞培養物（ＭＬＴＣ）でエンリッチされ得るか、又は自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされ得る。注入しようとする癌担持宿主にリンパ球が由来するＡＣＴは、自己ＡＣＴと称される。米国特許出願公開第２０１１／００５２５３０号は、主に転移性黒色腫に罹患している患者の治療に向けた、癌退縮を促進するため養子細胞療法を実施する方法に関する（これらの方法に関して全体として参照により組み込まれる）。

【0762】

[00764] 一部の実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載される通り投与することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは単回用量で投与することができる。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球は、複数回用量で投与され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回を超え得る。投与は、月に１回、２週間に１回、週に１回又は隔日に１回であり得る。ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球の投与は、必要な限り継続され得る。

【0763】

６．更なる処置方法
[00765] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれか１つに記載された治療有効投与量の治療用ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0764】

[00766] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療有効投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0765】

[00767] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団の治療有効投与量又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の治療有効投与量を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されているように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0766】

[00768] 別の実施形態において、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間フルダラビンを投与するステップを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0767】

[00769] 別の実施形態において、本発明は、対象にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンで対象を処置するステップを更に含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0768】

[00770] 別の実施形態において、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0769】

[00771] 別の実施形態において、本発明は、癌が固形腫瘍であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0770】

[00772] 別の実施形態において、本発明は、癌が、ブドウ膜黒色腫及び皮膚黒色腫を含む黒色腫、甲状腺癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、結腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌又は腎細胞癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0771】

[00773] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0772】

[00774] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0773】

[00775] 別の実施形態において、本発明は、癌が甲状腺癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0774】

[00776] 別の実施形態において、本発明は、癌が子宮内膜癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0775】

[00777] 別の実施形態において、本発明は、癌が結腸直腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0776】

[00778] 別の実施形態において、本発明は、癌が結腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0777】

[00779] 別の実施形態において、本発明は、癌がブドウ膜黒色腫であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0778】

[00780] 別の実施形態において、本発明は、癌が皮膚黒色腫であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0779】

[00781] 別の実施形態において、本発明は、癌がＨＮＳＣＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0780】

[00782] 別の実施形態において、本発明は、癌が子宮頸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0781】

[00783] 別の実施形態において、本発明は、癌がＮＳＣＬＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0782】

[00784] 別の実施形態において、本発明は、癌が神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0783】

[00785] 別の実施形態において、本発明は、癌が胃腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0784】

[00786] 別の実施形態において、本発明は、癌が高頻度変異癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0785】

[00787] 別の実施形態において、本発明は、癌が小児高頻度変異癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された癌を有する対象を処置する方法を提供する。

【0786】

[00788] 別の実施形態において、本発明は、治療有効投与量の治療用ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法における使用のための、上記の該当する先の段落のいずれか１つに記載された治療用ＴＩＬ集団を提供する。

【0787】

[00789] 別の実施形態において、本発明は、治療有効投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法における使用のための、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0788】

[00790] 別の実施形態において、本発明は、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の治療有効投与量を対象に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されているように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0789】

[00791] 別の実施形態において、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間フルダラビンを投与するステップを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。

【0790】

[00792] 別の実施形態において、本発明は、患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンで患者を処置するステップを更に含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0791】

[00793] 別の実施形態において、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。

【0792】

[00794] 別の実施形態において、本発明は、癌が固形腫瘍であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0793】

[00795] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌又は腎細胞癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0794】

[00796] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0795】

[00797] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0796】

[00798] 別の実施形態において、本発明は、癌が甲状腺癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0797】

[00799] 別の実施形態において、本発明は、癌が子宮内膜癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0798】

[00800] 別の実施形態において、本発明は、癌が結腸直腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0799】

[00801] 別の実施形態において、本発明は、癌が結腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0800】

[00802] 別の実施形態において、本発明は、癌がブドウ膜黒色腫であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0801】

[00803] 別の実施形態において、本発明は、癌が皮膚黒色腫であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物を提供する。

【0802】

[00804] 別の実施形態において、本発明は、癌がＨＮＳＣＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。

【0803】

[00805] 別の実施形態において、本発明は、癌が子宮頸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。

【0804】

[00806] 別の実施形態において、本発明は、癌がＮＳＣＬＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。

【0805】

[00807] 別の実施形態において、本発明は、癌が神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。

【0806】

[00808] 別の実施形態において、本発明は、癌が胃腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。

【0807】

[00809] 別の実施形態において、本発明は、癌が高頻度変異癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。

【0808】

[00810] 別の実施形態において、本発明は、癌が小児高頻度変異癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物を提供する。

【0809】

[00811] 別の実施形態において、本発明は、治療有効投与量の治療用ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、対象における癌を処置する方法における、上記の該当する先の段落のいずれか１つに記載された治療用ＴＩＬ集団の使用を提供する。

【0810】

[00812] 別の実施形態において、本発明は、治療有効投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、対象における癌を処置する方法における、上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0811】

[00813] 別の実施形態において、本発明は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンを対象に投与すること、次いで上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団の治療有効投与量又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の治療有効投与量を対象に投与することを含む、対象における癌を処置する方法における、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0812】

[00814] 別の実施形態において、本発明は、治療有効投与量の治療用ＴＩＬ集団又は治療有効投与量のＴＩＬ組成物の治療有効量を対象に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されているように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0813】

[00815] 別の実施形態において、本発明は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間フルダラビンを投与するステップを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0814】

[00816] 別の実施形態において、本発明は、患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ－２レジメンで患者を処置するステップを更に含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団の使用又は上記の該当する先の段落のいずれかに記載されたＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0815】

[00817] 別の実施形態において、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0816】

[00818] 別の実施形態において、本発明は、癌が固形腫瘍であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0817】

[00819] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌又は腎細胞癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0818】

[00820] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）及び胃腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0819】

[00821] 別の実施形態において、本発明は、癌が黒色腫であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0820】

[00822] 別の実施形態において、本発明は、癌が甲状腺癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0821】

[00823] 別の実施形態において、本発明は、癌が子宮内膜癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0822】

[00824] 別の実施形態において、本発明は、癌が結腸直腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0823】

[00825] 別の実施形態において、本発明は、癌が結腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0824】

[00826] 別の実施形態において、本発明は、癌がブドウ膜黒色腫であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0825】

[00827] 別の実施形態において、本発明は、癌が皮膚黒色腫であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0826】

[00828] 別の実施形態において、本発明は、癌がＨＮＳＣＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0827】

[00829] 別の実施形態において、本発明は、癌が子宮頸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0828】

[00830] 別の実施形態において、本発明は、癌がＮＳＣＬＣであるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0829】

[00831] 別の実施形態において、本発明は、癌が神経膠芽腫（ＧＢＭを含む）であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0830】

[00832] 別の実施形態において、本発明は、癌が胃腸癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0831】

[00833] 別の実施形態において、本発明は、癌が高頻度変異癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0832】

[00834] 別の実施形態において、本発明は、癌が小児高頻度変異癌であるように変更された、上記の該当する先の段落のいずれかに記載された治療用ＴＩＬ集団又はＴＩＬ組成物の使用を提供する。

【0833】

任意選択のＴＩＬ遺伝子改変
[00835] 一部の実施形態において、以下により完全に記載されるように、ＴＩＬは、任意選択で、限定されないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含めて、追加的な機能性を含むように遺伝子改変される。

【0834】

[00836] 一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたＴＩＬは、拡大培養ステップ前、その間又はその後に更に操作され、これは、一過性の態様でタンパク質発現を変化させるために、それぞれが本明細書で提供される、閉鎖滅菌製造プロセス中を含む。一部の実施形態において、一過性に変化したタンパク質発現は、一過性の遺伝子編集によるものである。一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたＴＩＬは、転写因子（ＴＦ）及び／又はＴＩＬにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子で処置される。一部の実施形態において、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の発現の変化及び／又はＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する。

【0835】

[00837] 特定の実施形態において、方法は、ＴＩＬ集団を遺伝的に編集することを含む。特定の実施形態において、方法は、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団及び／又は第３のＴＩＬ集団を遺伝子編集することを含む。

【0836】

[00838] 一部の実施形態において、本発明は、１つ以上のタンパク質の発現の促進又は１つ以上のタンパク質の発現の阻害及び１セットのタンパク質の促進と、別のセットのタンパク質の阻害との両方の同時の組み合わせのための、ＴＩＬ集団への、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又は小分子（短鎖）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の挿入を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）挿入などのヌクレオチド挿入による遺伝子編集を含む。

【0837】

[00839] 一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたＴＩＬは、タンパク質発現の一過性の変化を受ける。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、第１の拡大培養前に、例えば、例えばステップＡから得られる、ＴＩＬ集団におけるものを含む、バルクＴＩＬ集団で発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えばステップＢで拡大培養されるＴＩＬ集団におけるものを含む、第１の拡大培養中に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、第１及び第２の拡大培養間の移行中のＴＩＬ集団（例えば、本明細書に記載の第２のＴＩＬ集団）、例えばステップＢから取得され、ステップＣに含まれるＴＩＬ集団におけるものを含む、第１の拡大培養後に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えばステップＣから得られる、ＴＩＬ集団におけるものを含む、第２の拡大培養前及びステップＤにおけるその拡大培養前にバルクＴＩＬ集団で発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えばステップＤで、拡大培養されるＴＩＬ集団（例えば、第３のＴＩＬ集団）におけるものを含む、第２の拡大培養中に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えばステップＤにおける、拡大培養から得られるＴＩＬ集団におけるものを含む、第２の拡大培養後に発生する。

【0838】

[00840] 一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、エレクトロポレーションのステップを含む。エレクトロポレーション法は、当技術分野で公知であり、例えば、Tsong, Biophys.J.1991, 60, 297-306及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７ Ａ１号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションのステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング及びエンドサイトーシス）は、当技術分野で公知であり、例えば、Graham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467；Wigler, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.1979, 76, 1373-1376；並びにChen及びOkayarea, Mol.Cell.Biol.1987, 7, 2745-2752；並びに米国特許第５，５９３，８７５号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、リポソームトランスフェクションのステップを含む。濾過水中のカチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスフォチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を使用する方法などのリポソームトランスフェクション法は、当技術分野で公知であり、例えば、Rose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525及びFelgner, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1987, 84, 7413-7417並びに米国特許第５，２７９，８３３号；同第５，９０８，６３５号；同第６，０５６，９３８号；同第６，１１０，４９０号；同第６，５３４，４８４号；及び同第７，６８７，０７０号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、米国特許第５，７６６，９０２号；同第６，０２５，３３７号；同第６，４１０，５１７号；同第６，４７５，９９４号；及び同第７，１８９，７０５号（そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法を使用したトランスフェクションのステップを含む。

【0839】

[00841] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、幹細胞様メモリーＴ細胞の増加をもたらす（ＴＳＣＭ）。ＴＳＣＭは、抗原を経験したセントラルメモリーＴ細胞の初期前駆細胞である。ＴＳＣＭは、一般的に、幹細胞を定義する長期生存、自己再生及び多分化能を示し、効果的なＴＩＬ産物の生成について一般的に望ましい。ＴＳＣＭは、養子細胞移植のマウスモデルにおいて、他のＴ細胞サブセットと比較して抗腫瘍活性の増強を示している（Gattinoni et al.Nat Med 2009, 2011；Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012；Cieri et al.Blood 2013）。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、高い割合のＴＳＣＭを含む組成物を伴うＴＩＬ集団をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のＴＳＣＭの割合の増加をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＬ集団において、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍又は１０倍のＴＳＣＭの増加をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のＴＳＣＭを伴うＴＩＬ集団をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のＴＳＣＭを伴う治療的ＴＩＬ集団をもたらす。

【0840】

[00842] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、抗原を経験したＴ細胞の幼若化をもたらす。一部の実施形態において、幼若化には、例えば、増殖の増加、Ｔ細胞活性化の増加及び／又は抗原認識の増加が含まれる。

【0841】

[00843] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを保存するために、Ｔ細胞の大部分における発現を変化させる。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを変化させない。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを維持する。

【0842】

[00844] 一部の実施形態において、タンパク質の一過性の変化は、特定の遺伝子の変化した発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１（ＰＤＣＤ１又はＣＣ２７９とも称される）、ＴＧＦＢＲ２、ＣＣＲ４／５、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１及び／又はｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を含むがこれらに限定されない遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＣＲ４／５、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１及び／又はｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）からなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦＢＲ２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ４／５を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－１２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－１５を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－２１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＧＩＴを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦβを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ４を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ５を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＲ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＲ２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＳＣＲ３を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＬ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＬ８を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ２２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ１７を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＶＨＬを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＤ４４を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＩＫ３ＣＤを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＳＯＣＳ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を標的とする。

【0843】

[00845] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ケモカイン受容体の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、一過性のタンパク質発現によって過剰発現されるケモカイン受容体は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２及び／又はＣＣＬ１７を含むがこれに限定されないリガンドを有する受容体を含む。

【0844】

[00846] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲ２及び／又はＴＧＦβの減少及び／又は発現低下をもたらす（例えば、ＴＧＦβ経路の遮断をもたらすことを含む）。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ－Ｂ）の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨの減少及び／又は発現低下をもたらす。

【0845】

[00847] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、腫瘍部位へのＴＩＬの輸送又は移動を改善するために、ケモカイン受容体の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２及び／又はＣＳＣＲ３からなる群から選択されるケモカイン受容体の増加及び／又は過剰発現をもたらす。

【0846】

[00848] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、インターロイキンの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１からなる群から選択されるインターロイキンの増加及び／又は過剰発現をもたらす。

【0847】

[00849] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＶＨＬの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＤ４４の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＩＫ３ＣＤの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＳＯＣＳ１の増加及び／又は過剰発現をもたらす。

【0848】

[00850] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の減少及び／又は発現低下をもたらす。

【0849】

[00851] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びその組み合わせからなる群から選択される１つの分子の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）からなる群から選択される２つの分子及びそれらの組み合わせの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性変化は、ＰＤ－１と、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）からなる群から選択される１つの分子及びそれらの組み合わせとの、減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１と、ＬＡＧ－３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びその組み合わせの１つとの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＬＡＧ３の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＣＩＳＨの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＣＩＳＨの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＰＤ－１の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＣＩＳＨの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現低下をもたらす。

【0850】

[00852] 一部の実施形態において、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス法により、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団又は回収されたＴＩＬ集団に挿入される（例えば、接着分子の発現が増加する）。

【0851】

[00853] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びその組み合わせからなる群から選択される１つの分子の減少及び／又は発現低下並びにＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びその組み合わせの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ及びその組み合わせからなる群から選択される１つの分子の減少及び／又は発現低下並びにＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びその組み合わせの増加及び／又は過剰発現をもたらす。

【0852】

[00854] 一部の実施形態において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９９％の発現の低下が存在する。

【0853】

[00855] 一部の実施形態において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９９％の発現の増加が存在する。

【0854】

[00856] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、転写因子（ＴＦ）及び／又はＴＩＬにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子でのＴＩＬの処置によって誘導される。一部の実施形態において、ＳＱＺベクターフリーのマイクロ流体プラットフォームは、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子の細胞内送達のために利用される。転写因子を含むタンパク質を、Ｔ細胞を含む様々な初代ヒト細胞に送達する能力を実証するそのような方法（Sharei et al.PNAS 2013並びにSharei et al., PLOS ONE 2015及びGreisbeck et al., J. Immunology vol. 195, 2015）が説明されている。例えば、国際公開第２０１３／０５９３４３Ａ１号、国際公開第２０１７／００８０６３Ａ１号及び国際公開第２０１７／１２３６６３Ａ１号（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。国際公開第２０１３／０５９３４３Ａ１号、国際公開第２０１７／００８０６３Ａ１号及び国際公開第２０１７／１２３６６３Ａ１号に記載されるそのような方法は、転写因子（ＴＦ）及び／又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子にＴＩＬ集団を曝露するために、本発明と共に使用することができ、前記ＴＦ及び／又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子は、腫瘍抗原の発現の増加及び／又はＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供し、従って、ＴＩＬ集団の再プログラミング及び再プログラミングされたＴＩＬ集団の治療効果の再プログラミングされていないＴＩＬ集団と比較した増加をもたらす。一部の実施形態において、再プログラミングは、本明細書に記載されるように、ＴＩＬの開始集団又は前の（即ち再プログラミング前の）集団と比較して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団をもたらす。

【0855】

[00857] 一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ＴＣＦ－１、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ及び／又はＭＹＢを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ＴＣＦ－１である。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）はＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤである。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）はＭＹＢである。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、追加のＴＩＬ初期化を誘導するために、市販のKNOCKOUT Serum Replacement（Gibco／ThermoFisher）などの人工多能性幹細胞培養物（ｉＰＳＣ）と共に投与される。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、追加のＴＩＬ初期化を誘導するためにｉＰＳＣカクテルと共に投与される。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ｉＰＳＣカクテルなしで投与される。一部の実施形態において、初期化は、ＴＳＣＭの割合の増加をもたらす。一部の実施形態において、初期化により、ＴＳＣＭの割合において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％のＴＳＣＭ増加が生じる。

【0856】

[00858] 一部の実施形態において、上記のように一過性に変化するタンパク質発現の方法は、ＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法と組み合わせ得、１つ以上のタンパク質の産生のための遺伝子の安定した組み込みのステップを含む。特定の実施形態において、方法は、ＴＩＬ集団を遺伝子改変するステップを含む。特定の実施形態において、方法は、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団及び／又は第３のＴＩＬ集団を遺伝子改変することを含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レトロウイルス形質導入のステップを含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レンチウイルス形質導入のステップを含む。レンチウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えば、Levine, et al., Proc.Nat’l Acad.Sci.2006, 103, 17372-77；Zufferey, et al., Nat.Biotechnol.1997, 15, 871-75；Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71及び米国特許第６，６２７，４４２号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入のステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えば、Cepko and Pear, Cur.Prot.Mol.Biol.1996, 9.9.1-9.9.16に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子導入のステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子導入システムは、当技術分野で公知であり、トランスポサーゼの長期発現がトランスジェニック細胞では発生しないように、トランスポサーゼがＤＮＡ発現ベクターとして又は発現可能なＲＮＡ若しくはタンパク質として提供されるシステム、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、キャップとポリＡテールを含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポサーゼを含む。ＳＢ１０、ＳＢ１１、ＳＢ１００ｘなどのサケ科のＴｅｌ様トランスポサーゼ（ＳＢ又はSleeping Beautyトランスポサーゼ）を含む適切なトランスポゾン媒介遺伝子導入システム及び酵素活性が向上した人工酵素は、例えば、Hackett, et al., Mol.Therapy 2010, 18, 674-83及び米国特許第６，４８９，４５８号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。

【0857】

[00859] 一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、自己送達ＲＮＡ干渉（ｓｄＲＮＡ）によって誘導される発現の低下であり、これは、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを使用してその３’末端でコレステロールにコンジュゲートした２０ヌクレオチドのアンチセンス（ガイド）鎖及び１３～１５塩基のセンス（パッセンジャー）鎖を含む、２’－ＯＨ置換（典型的にはフッ素又は－ＯＣＨ_３）の高いパーセンテージを有する化学合成された非対称ｓｉＲＮＡ二重鎖である。一部の実施形態において、方法は、自己送達ＲＮＡ干渉（ｓｄＲＮＡ）の使用を含む、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現の一過性の変化を含み、これは、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを使用してその３’末端でコレステロールにコンジュゲートした２０ヌクレオチドのアンチセンス（ガイド）鎖及び１３～１５塩基のセンス（パッセンジャー）鎖を含む、２’－ＯＨ置換（典型的にはフッ素又は－ＯＣＨ_３）の高いパーセンテージを有する化学合成された非対称ｓｉＲＮＡ二重鎖である。ｓｄＲＮＡの使用方法は、Khvorova and Watts, Nat.Biotechnol.2017, 35, 238-248；Byrne, et al., J. Ocul.Pharmacol.Ther.2013, 29, 855-864；及びLigtenberg, et al., Mol.Therapy, 2018（近刊）に記載され、その開示は、参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、エレクトロポレーション、ＳＱＺ又は他の方法を使用せずに達成され、代わりに、ＴＩＬ集団が培地中１μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される、１～３日の期間を使用する。特定の実施形態において、方法は、ＴＩＬ集団を、培地中１μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で、ｓｄＲＮＡに１～３日の期間曝露することを含む、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達を含む。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中１０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される、１～３日の期間を使用して達成される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される、１～３日の期間を使用して達成される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中０．１μＭ／１０，０００ＴＩＬ～５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される、１～３日の期間を使用して達成される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中０．１μＭ／１０，０００ＴＩＬ～５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される、１～３日の期間を使用して達成され、ｓｄＲＮＡへの曝露は、培地に新鮮なｓｄＲＮＡを添加することにより、２、３、４又は５回行われる。他の適切なプロセスは、例えば、米国特許出願公開第２０１１／００３９９１４ Ａ１号、同第２０１３／０１３１１４１ Ａ１号及び同第２０１３／０１３１１４２ Ａ１号並びに米国特許第９，０８０，１７１号に記載され、その開示は、参照により本明細書に援用される。

【0858】

[00860] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは製造中にＴＩＬの集団に挿入される。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４ ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＴＧＦＢＲ２、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、ＢＡＦＦ ＢＲ３、ＣＩＳＨ及び／又はＣＢＬＢに干渉するＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、発現の減少は、例えば、フローサイトメトリー及び／又はｑＰＣＲによって評価されるような遺伝子サイレンシングのパーセンテージに基づいて決定される。一部の実施形態において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９９％の発現の低下が存在する。

【0859】

[00861] 本明細書に記載されるように、ｓｉＲＮＡの化学修飾に基づく自己送達可能なＲＮＡｉ技術を本発明の方法と共に使用して、ｓｄＲＮＡを問題なくＴＩＬに送達することができる。骨格修飾と非対称ｓｉＲＮＡ構造及び疎水性リガンドの組み合わせ（例えば、Ligtenberg, et al., Mol.Therapy, 2018及び米国特許出願公開第２０１６０３０４８７３号公報を参照されたい）は、ｓｄＲＮＡのヌクレアーゼ安定性を利用して、培養培地に単純に添加することにより、追加の製剤や及び方法なしで、ｓｄＲＮＡを培養した哺乳動物細胞に浸透させることを可能にする。この安定性は、単に培地中のｓｄＲＮＡの活性濃度を維持することで、ＲＮＡｉを介した標的遺伝子活性の一定レベルの低下のサポートを可能にする。理論に拘束されるものではないが、ｓｄＲＮＡのバックボーン安定化は、非分裂細胞において数ヶ月間にわたり続き得る遺伝子発現効果の大幅な低下を提供する。

【0860】

[00862] 一部の実施形態において、９５％を超えるＴＩＬのトランスフェクション効率及び様々な特定のｓｄＲＮＡによる標的の発現の低下が生じる。一部の実施形態において、いくつかの未修飾リボース残基を含有するｓｄＲＮＡを完全に修飾された配列で置換して、ＲＮＡｉ効果の効力及び／又は寿命を増加させた。一部の実施形態において、発現効果の低下は、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、５日間、６日間、７日間若しくは８日間又はそれを超えて維持される。一部の実施形態において、発現効果の低下は、ＴＩＬのｓｄＲＮＡ処置後、１０日以上で減少する。一部の実施形態において、標的発現の発現において７０％を超える低下が維持される。一部の実施形態において、標的発現の発現において７０％を超える低下は維持されたＴＩＬである。一部の実施形態において、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路における発現の減少により、ＴＩＬがより強力なインビボ効果を示すことが可能となり、これは、一部の実施形態において、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の抑制効果の回避による。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡによるＰＤ－１の発現の低下は、ＴＩＬ増殖の増加をもたらす。

【0861】

[00863] 低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、短鎖干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとしても知られる場合があり、一般的には長さが１９～２５塩基対の、二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）で使用され、相補的なヌクレオチド配列を持つ特定の遺伝子の発現に干渉する。

【0862】

[00864] 二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、一般的にセンス（パッセンジャー）及びアンチセンス（ガイド）鎖である、ＲＮＡの相補鎖の対を含む任意の分子を定義するために一般的に使用することができ、これは一本鎖オーバーハング領域を含み得る。ｓｉＲＮＡと対比されるｄｓＲＮＡという用語は、一般的に、ダイサーを含む切断酵素システムの作用により、より大きいｄｓＲＮＡ分子から放出されるｓｉＲＮＡ分子の配列を含む前駆体分子を指す。

【0863】

[00865] ｓｄＲＮＡ（自己送達可能なＲＮＡ）は、細胞に侵入するのに送達ビヒクルを必要とせず、従来のｓｉＲＮＡと比較して向上した薬理を有する、共有結合的に修飾されたＲＮＡｉ化合物の新しいクラスである。「自己送達可能なＲＮＡ」又は「ｓｄＲＮＡ」は、疎水性修飾されたＲＮＡ干渉アンチセンスハイブリッドであり、初代細胞ではインビトロで、局所投与ではインビボで非常に効果的であることが実証されている。毒性のない強力な取り込み及び／又はサイレンシングが実証されている。ｓｄＲＮＡは、一般的に、最小限の二本鎖領域を有する、化学的に修飾された非対称の核酸分子である。ｓｄＲＮＡ分子は、典型的には、一本鎖領域及び二本鎖領域を含有し、分子の一本鎖領域及び二本鎖領域の両方に様々な化学修飾を含有し得る。更に、ｓｄＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、従来の及び先端的なステロール型分子などの疎水性結合に付着させることができる。ｓｄＲＮＡ及びそのようなｓｄＲＮＡを作製するための関連する方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１６０３０４８７３号、国際公開第２０１００３３２４６号、国際公開第２０１７０７０１５１号、国際公開第２００９１０２４２７号、国際公開第２０１１１１９８８７号、国際公開第２０１００３３２４７Ａ２号、国際公開第２００９０４５４５７号、国際公開第２０１１１１９８５２号にも記載され、これら全ては、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。ｓｄＲＮＡの構造、化学、標的位置、配列の優先度などを最適化するために、独自のアルゴリズムが開発され、ｓｄＲＮＡの効力予測に利用されている（例えば、米国特許出願公開第２０１６０３０４８７３号を参照されたい）。これらの分析に基づいて、機能的なｓｄＲＮＡ配列は、一般的に、４０％を超える確率で、１μＭの濃度での発現において７０％を超える低下を有するものとして定義されている。

【0864】

[00866] 一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の７０％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の７５％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の８０％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の８５％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の９０％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の９５％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の９９％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ～約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。

【0865】

[00867] 一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、治療剤の安定性及び／又は有効性を増加させ、処置される細胞又は組織へのオリゴヌクレオチドの効率的な送達を果たすための１つ以上の修飾を含む。そのような修飾には、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－フルオロ修飾、ジホスホロチオエート修飾、２’Ｆ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾及び／又は２’デオキシヌクレオチドが含まれ得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、ステロール、コレステロール、ビタミンＤ、ナフチル、イソブチル、ベンジル、インドール、トリプトファン及び／又はフェニルを含む１つ以上の疎水性修飾を含むように修飾される。更なる特定の実施形態において、化学的に修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチル、２’デオキシ、疎水性修飾及びホスホロチオエートの組み合わせである。一部の実施形態において、糖は修飾することができ、修飾された糖は、Ｄ－リボース、２’－Ｏ－アルキル（２’－Ｏ－メチル及び２’－Ｏ－エチルを含む）、即ち２’－アルコキシ、２’－アミノ、２’－Ｓ－アルキル、２’－ハロ（２’－フルオロを含む）、Ｔ－メトキシエトキシ、２’－アリルオキシ（－ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’－プロパルギル、２’－プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル及びシアノなどを含み得るが、これらに限定されない。一実施形態において、糖部分は、ヘキソースであり得、記載されるように、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る（Augustyns, K, et al., Nucl.Acids.Res.18:4711 (1992)）。

【0866】

[00868] 一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖であり、即ち分子のいずれかの末端に突出する一本鎖配列がない、即ち平滑末端である。一部の実施形態において、個々の核酸分子は、異なる長さであり得る。換言すれば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖ではない。例えば、２つの別個の核酸分子が使用される場合、分子の１つ、例えば、アンチセンス配列を含む第１の分子は、それにハイブリダイズする第２の分子より長いものであり得る（分子の一部が一本鎖のまま残る）。一部の実施形態において、単一の核酸分子が使用される場合、いずれかの末端の分子の一部は一本鎖のままであり得る。

【0867】

[00869] 一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスマッチ及び／又はループ又はバルジを含有するが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたって二本鎖である。別の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０％～９５％にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９６％～９８％にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも又は最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のミスマッチを含有する。

【0868】

[00870] 一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、３’又は５’結合を修飾することにより、ヌクレアーゼから実質的に保護することができる（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号及び国際公開第９８／１３５２６号）。例えば、オリゴヌクレオチドは、「ブロッキング基」を含めることによって耐性とすることができる。本明細書で使用される「ブロッキング基」という用語は、合成のための保護基又はカップリング基のいずれかとして、オリゴヌクレオチド又はヌクレオモノマーに結合することができる置換基（例えば、ＯＨ基以外）を指す（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_３）、グリコール（－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－）リン酸（ＰＯ_３ ^２’’）、ホスホン酸水素又はホスホルアミダイト）。「ブロッキング基」は、修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造を含む、オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端を保護する「末端ブロッキング基」又は「エキソヌクレアーゼブロッキング基」も含み得る。

【0869】

[00871] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ内の隣接するポリヌクレオチドの少なくとも一部は、置換結合、例えば、ホスホロチオエート結合によって結合される。

【0870】

[00872] 一部の実施形態において、化学修飾は、少なくとも、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００の細胞取り込みの増強を導く。一部の実施形態において、Ｃ又はＵ残基の少なくとも１つは、疎水性修飾を含む。一部の実施形態において、複数のＣ及びＵが疎水性修飾を含有する。一部の実施形態において、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％ ６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は少なくとも９５％のＣ及びＵは、疎水性修飾を含有し得る。一部の実施形態において、Ｃ及びＵの全てが疎水性修飾を含有する。

【0871】

[00873] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ又はｓｄ－ｒｘＲＮＡは、プロトン化可能なアミンの組み込みにより、ｓｄ－ｒｘＲＮＡ分子のエンドソーム放出の増強を示す。一部の実施形態において、プロトン化可能なアミンは、センス鎖に組み込まれる（ＲＩＳＣローディング後に切り捨てられる分子の部分において）。一部の実施形態において、本発明のｓｄＲＮＡ化合物は、二重鎖領域（１０～１５塩基長の効率的なＲＩＳＣエントリーに必要）及び４～１２ヌクレオチド長の一本鎖領域を、１３ヌクレオチドの二本鎖と共に含む、非対称化合物を含む。一部の実施形態において、６ヌクレオチドの一本鎖領域が利用される。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡの一本鎖領域は、２～１２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート修飾と称される）を含む。一部の実施形態において、６～８個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合が利用される。一部の実施形態において、本発明のｓｄＲＮＡ化合物は、安定性を提供し、ＲＩＳＣエントリーと適合性である特有の化学修飾パターンも含む。

【0872】

[00874] 例えば、ガイド鎖は、ＲＩＳＣエントリーに干渉することなく安定性を確認する任意の化学修飾によっても修飾され得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の化学修飾パターンは、Ｃ及びＵヌクレオチドの大部分が２’Ｆ修飾されており、５’末端がリン酸化されていることを含む。

【0873】

[00875] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ又はｓｄ－ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％が修飾されている。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ又はｓｄ－ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が修飾されている。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ又はｓｄ－ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの１００％が修飾されている。

【0874】

[00876] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ分子は最小の二本鎖領域を有する。一部の実施形態において、二本鎖である分子の領域は、８～１５ヌクレオチド長の範囲である。一部の実施形態において、二本鎖である分子の領域は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、二本鎖領域は１３ヌクレオチド長である。ガイド鎖とパッセンジャー鎖は１００％相補性であり得るか、又はガイド鎖とパッセンジャー鎖との間で１つ以上のミスマッチがあり得る。一部の実施形態において、二本鎖分子の一端で、分子は平滑末端であるか、又は１ヌクレオチドのオーバーハングを有する。分子の一本鎖領域は、一部の実施形態において、４～１２ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、一本鎖領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、一本鎖領域は、４ヌクレオチド長未満又は１２ヌクレオチド長超でもあり得る。特定の実施形態において、一本鎖領域は、６又は７ヌクレオチド長である。

【0875】

[00877] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ分子は増加した安定性を有する。一部の例において、化学修飾されたｓｄＲＮＡ又はｓｄ－ｒｘＲＮＡ分子は、任意の中間値を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間より長いか、又は２４時間を超える培地中での半減期を有する。一部の実施形態において、ｓｄ－ｒｘＲＮＡは、１２時間より長い培地中での半減期を有する。

【0876】

[00878] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、効力の増大及び／又は毒性の低下について最適化される。一部の実施形態において、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖のヌクレオチド長及び／又はガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖におけるホスホロチオエート修飾の数は、一部の態様においてＲＮＡ分子の効力に影響し得、２’－フルオロ（２’Ｆ）修飾の２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾での置換は、一部の態様において分子の毒性に影響し得る。一部の実施形態において、分子の２’Ｆ含有量の低下は、分子の毒性を低下させると予測される。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子におけるホスホロチオエート修飾の数は、細胞への分子の取り込み、例えば、細胞への分子の受動的取り込みの効率に影響し得る。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは２’Ｆ修飾を有しないが、細胞取り込み及び組織浸透における同等の効力を特徴とする。

【0877】

[00879] 一部の実施形態において、ガイド鎖は、長さがおよそ１８～１９ヌクレオチドであり、およそ２～１４のリン酸修飾を有する。例えば、ガイド鎖は、リン酸修飾された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１４を超えるヌクレオチドを含有し得る。ガイド鎖は、ＲＩＳＣエントリーに干渉することなく安定性の増加を付与する１つ以上の修飾を含有し得る。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドなどのリン酸修飾ヌクレオチドは、３’末端、５’末端にあるか、又はガイド鎖全体に広がっている。一部の実施形態において、ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含有する。ガイド鎖は、分子全体に位置し得る、２’Ｆ及び／又は２’ＯＭｅ修飾も含有し得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の１位のヌクレオチド（ガイド鎖の最も５’位のヌクレオチド）は、２’ＯＭｅ修飾及び／又はリン酸化されている。ガイド鎖内のＣ及びＵヌクレオチドは２’Ｆ修飾され得る。例えば、１９ｎｔのガイド鎖の２～１０位（又は異なる長さのガイド鎖の対応する位置）のＣ及びＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾され得る。ガイド鎖内のＣ及びＵヌクレオチドはまた、２’ＯＭｅ修飾され得る。例えば、１９ｎｔガイド鎖の１１～１８位（又は異なる長さのガイド鎖の対応する位置）のＣ及びＵヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾され得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の最も３’末端のヌクレオチドは修飾されていない。特定の実施形態において、ガイド鎖内のＣ及びＵの大部分は２’Ｆ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の実施形態において、１位及び１１～１８位のＣ又はＵは２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の実施形態において、１位及び１１～１８位のＣ又はＵは２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されており、２～１０位のＣ又はＵは２’Ｆ修飾されている。

【0878】

[00880] 自己送達可能なＲＮＡｉ技術は、追加の製剤又は技術を必要とすることなく、ＲＮＡｉ剤で細胞を直接トランスフェクトする方法を提供する。トランスフェクションが困難な細胞株をトランスフェクトする能力、高いインビボ活性及び使用の単純さは、従来のｓｉＲＮＡベースの手法に比べて有意な機能的利点を提供する組成物及び方法の特徴であり、従って、ｓｄＲＮＡ法は、本発明のＴＩＬにおける標的遺伝子の発現を低下させる方法に関するいくつかの実施形態において使用される。ｓｄＲＮＡｉ法により、化学合成された化合物を、エクスビボ及びインビボの両方で、広範な初代細胞及び組織に直接送達することが可能となる。本明細書の本発明の一部の実施形態に記載されているｓｄＲＮＡは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。

【0879】

[00881] ｓｄＲＮＡは、疎水的に修飾されたｓｉＲＮＡ－アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッド構造として形成され、例えば、全体として参照により本明細書に援用されるByrne et al., December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10):855-864に開示される。

【0880】

[00882] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、無菌エレクトロポレーションを使用して、本明細書に記載されるＴＩＬに送達することができる。特定の実施形態において、方法は、ｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達するためのＴＩＬ集団の無菌エレクトロポレーションを含む。

【0881】

[00883] 一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、膜貫通送達システムと組み合わせて細胞に送達することができる。一部の実施形態において、この膜貫通送達システムは、脂質、ウイルスベクターなどを含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、いかなる送達剤も必要としない自己送達ＲＮＡｉ剤である。特定の実施形態において、方法は、ｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドをＴＩＬ集団に送達するための膜貫通送達システムの使用を含む。

【0882】

[00884] オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド組成物は、本明細書に記載のＴＩＬと接触し（例えば、接触させ、本明細書では投与又は送達とも称される）、ＴＩＬにより取り込まれる（ＴＩＬによる受動的取り込みを含む）。ｓｄＲＮＡは、第１の拡大培養中、例えばステップＢ、第１の拡大培養後、例えば、ステップＣ中、第２の拡大培養前又はその間、例えばステップＤ前又はその間、ステップＤ後及びステップＥにおける回収前、ステップＦの回収間又はその後、ステップＦの最終的な製剤化及び／又は輸注バッグへの移動前又はその間及びステップＦのいずれかの任意選択の凍結保存ステップ前に、本明細書に記載されるようにＴＩＬに添加することができる。更に、ｓｄＲＮＡは、ステップＦでの任意の凍結保存ステップから解凍した後に追加され得る。一実施形態において、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄＲＮＡは、１００ｎＭ～２０ｍＭ、２００ｎＭ～１０ｍＭ、５００ｎｍ～１ｍＭ、１μＭ～１００μＭ、１μＭ～１００μＭからなる群から選択される濃度で、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄＲＮＡは、０．１μＭｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬｓ／１００μＬ培地、０．５μＭｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬｓ／１００μＬ培地、０．７５μＭｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬｓ／１００μＬ培地、１μＭｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬｓ／１００μＬ培地、１．２５μＭｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬｓ／１００μＬ培地、１．５μＭｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬｓ／１００μＬ培地、２μＭｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬｓ／１００μＬ培地、５μＭｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬｓ／１００μＬ培地又は１０μＭｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬｓ／１００μＬ培地からなる群から選択される量で、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄＲＮＡは、プレＲＥＰ又はＲＥＰ段階中、１日２回、１日１回、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと又は７日ごとに、ＴＩＬ培養物に添加され得る。

【0883】

[00885] ｓｄＲＮＡを含む本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、例えば、細胞培養培地中に高濃度でｓｄＲＮＡを溶解し、受動的取り込みが発生するのに十分な時間を与えることにより、拡大培養プロセス中に本明細書に記載されるようにＴＩＬと接触させることができる。特定の実施形態において、本発明の方法は、ＴＩＬ集団を本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチド組成物と接触させることを含む。特定の実施形態において、方法は、オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｄＲＮＡを、細胞培養培地に溶解すること及び細胞培養培地をＴＩＬ集団と接触させることを含む。ＴＩＬは、本明細書に記載されるように、第１の集団、第２の集団及び／又は第３の集団であり得る。

【0884】

[00886] 一部の実施形態において、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達は、リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ、グリセロール又はデキストラン、エレクトロポレーションを含む、当技術分野で認められた適切な方法により、又はトランスフェクション、例えば当技術分野で公知の方法を使用するカチオン性、アニオン性若しくは中性脂質組成物又はリポソームを使用するトランスフェクションにより増強され得る（例えば、国際公開第９０／１４０７４号；国際公開第９１／１６０２４号；国際公開第９１／１７４２４号；米国特許第４，８９７，３５５号；Bergan et a 1993.Nucleic Acids Research.21 :3567を参照されたい）。

【0885】

[00887] 一部の実施形態において、標的遺伝子の発現を低下させるために１つを超えるｓｄＲＮＡが使用される。一部の実施形態において、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨ標的化ｓｄＲＮＡの１つ以上が一緒に使用される。一部の実施形態において、ＰＤ－１ ｓｄＲＮＡは、１つを超える遺伝子標的の発現を低下させるために、ＴＩＭ－３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨの１つ以上と共に使用される。一部の実施形態において、ＬＡＧ３ ｓｄＲＮＡは、両方の標的の遺伝子発現を減少させるために、ＣＩＳＨ標的化ｓｄＲＮＡと組み合わせて使用される。一部の実施形態において、本明細書のＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨの１つ以上を標的とするｓｄＲＮＡは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。

【0886】

[00888] 一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、別のｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）からなる群から選択される遺伝子及びそれらの組み合わせを標的とする。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１と、ＬＡＧ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせの１つとから選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＣＩＳＨを標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ－１を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＢＬＢを標的とする。

【0887】

[00889] 上記のように、本発明の実施形態は、それらの治療効果を増強するために遺伝子編集を介して遺伝子改変されている腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を提供する。本発明の実施形態は、１つ以上のタンパク質の発現の促進及び１つ以上のタンパク質の発現の阻害並びにそれらの組み合わせの両方のための、ＴＩＬ集団へのヌクレオチド挿入（ＲＮＡ又はＤＮＡ）による遺伝子編集を包含する。本発明の実施形態は、ＴＩＬを治療用集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、ＴＩＬを遺伝子編集することを含む。本発明に従う使用に適した、ＴＩＬ集団を遺伝子改変するために使用され得るいくつかの遺伝子編集技術が存在する。

【0888】

[00890] 一部の実施形態において、方法は、１つ以上のタンパク質の産生のための遺伝子の安定した組み込みのステップを含むＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法を含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レトロウイルス形質導入のステップを含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レンチウイルス形質導入のステップを含む。レンチウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えば、Levine, et al., Proc.Nat’l Acad.Sci.2006, 103, 17372-77；Zufferey, et al., Nat.Biotechnol.1997, 15, 871-75；Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71及び米国特許第６，６２７，４４２号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入のステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えば、Cepko and Pear, Cur.Prot.Mol.Biol.1996, 9.9.1-9.9.16に記載され、その開示は、参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子導入のステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子導入システムは、当技術分野で公知であり、トランスポサーゼの長期発現がトランスジェニック細胞では発生しないように、トランスポサーゼがＤＮＡ発現ベクターとして又は発現可能なＲＮＡ若しくはタンパク質として提供されるシステム、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、キャップとポリＡテールを含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポサーゼを含む。ＳＢ１０、ＳＢ１１、ＳＢ１００ｘなどのサケ科のＴｅｌ様トランスポサーゼ（ＳＢ又はSleeping Beautyトランスポサーゼ）を含む適切なトランスポゾン媒介遺伝子導入システム及び酵素活性が向上した人工酵素は、例えば、Hackett, et al., Mol.Therapy 2010, 18, 674-83及び米国特許第６，４８９，４５８号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。

【0889】

[00891] 一実施形態において、方法は、ＴＩＬ集団、例えば、本明細書に記載されるように、第１の集団、第２の集団及び／又は第３の集団を遺伝子改変する方法を含む。一実施形態において、ＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法は、１つ以上のタンパク質の産生又は阻害（例えば、サイレンシング）のための遺伝子の安定した組み込みのステップを含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、エレクトロポレーションのステップを含む。エレクトロポレーション法は、当技術分野で公知であり、例えば、Tsong, Biophys.J.1991, 60, 297-306及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７ Ａ１号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。米国特許第５，０１９，０３４号；同第５，１２８，２５７号；同第５，１３７，８１７号；同第５，１７３，１５８号；同第５，２３２，８５６号；同第５，２７３，５２５号；同第５，３０４，１２０号；同第５，３１８，５１４号；同第６，０１０，６１３号及び同第６，０７８，４９０号（これらの開示は、参照により本明細書に援用される）に記載のものなど、他の当技術分野で公知のエレクトロポレーション法を使用し得る。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、滅菌エレクトロポレーション法である。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルスエレクトロポレーション法である。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルス電場でＴＩＬを処置して、ＴＩＬの定義され、制御された恒久的又は一過性の変化を、変更、操作又は引き起こすステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電場強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーター制御の独立してプログラムされた一連のＤＣ電気パルスをＴＩＬに適用するステップを含み、一連の少なくとも３つのＤＣ電気パルスは、以下の特徴の１つ、２つ又は３つを有する。（１）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる；（２）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる：及び（３）少なくとも３つのパルスの２つの第１のセットの第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスの２つの第２のセットの第２のパルス間隔と異なる。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルス電場でＴＩＬを処置して、ＴＩＬの定義され、制御された恒久的又は一過性の変化を、変更、操作又は引き起こすステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電場強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーター制御の独立してプログラムされた一連のＤＣ電気パルスをＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルス電場でＴＩＬを処置して、ＴＩＬの定義され、制御された恒久的又は一過性の変化を、変更、操作又は引き起こすステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電場強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーター制御の独立してプログラムされた一連のＤＣ電気パルスをＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルス電場でＴＩＬを処置して、ＴＩＬの定義され、制御された恒久的又は一過性の変化を、変更、操作又は引き起こすステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電場強度を有する、少なくとも３つの単一のオペレーター制御の独立してプログラムされた一連のＤＣ電気パルスをＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスの２つの第１のセットの第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスの２つの第２のセットの第２のパルス間隔と異なる。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルス電場でＴＩＬを処置して、ＴＩＬにおける孔形成を誘導するステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電場強度を有する、少なくとも３つの一連のＤＣ電気パルスをＴＩＬに適用するステップを含み、一連の少なくとも３つのＤＣ電気パルスは、誘導された細孔が比較的長期間持続するように、及びＴＩＬの生存率が維持されるように、以下の特徴の１つ、２つ又は３つを有する。（１）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる；（２）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる：及び（３）少なくとも３つのパルスの２つの第１のセットの第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスの２つの第２のセットの第２のパルス間隔と異なる。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションのステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング及びエンドサイトーシス）は、当技術分野で公知であり、例えば、Graham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467；Wigler, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.1979, 76, 1373-1376；並びにChen及びOkayarea, Mol.Cell.Biol.1987, 7, 2745-2752；並びに米国特許第５，５９３，８７５号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、リポソームトランスフェクションのステップを含む。濾過水中のカチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスフォチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を使用する方法などのリポソームトランスフェクション法は、当技術分野で公知であり、例えば、Rose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525及びFelgner, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1987, 84, 7413-7417並びに米国特許第５，２７９，８３３号；同第５，９０８，６３５号；同第６，０５６，９３８号；同第６，１１０，４９０号；同第６，５３４，４８４号；及び同第７，６８７，０７０号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。一実施形態において、ＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法は、米国特許第５，７６６，９０２号；同第６，０２５，３３７号；同第６，４１０，５１７号；同第６，４７５，９９４号；及び同第７，１８９，７０５号（そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に援用される）に記載される方法を使用したトランスフェクションのステップを含む。ＴＩＬは、本明細書に記載されるように、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団及び／又は第３のＴＩＬ集団であり得る。

【0890】

[00892] 一実施形態によると、遺伝子編集プロセスは、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子における二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能なヌクレアーゼの使用を含み得る。このようなプログラム可能なヌクレアーゼは、特定のゲノム遺伝子座に切断を導入することにより、正確なゲノム編集を可能にする。即ち、それらは、ゲノム内の特定のＤＮＡ配列の認識に依存して、ヌクレアーゼドメインをこの位置に標的化し、標的配列での二本鎖切断の生成を媒介する。ＤＮＡにおける二本鎖切断は、その後、内因性修復機構を切断部位に動員して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同性指向修復（ＨＤＲ）によるゲノム編集を媒介する。従って、切断の修復は、標的遺伝子産物を破壊（例えば、サイレンシング、抑制又は増強）する、挿入／欠失変異の導入をもたらし得る。

【0891】

[00893] 部位特異的なゲノム編集を可能にするために開発されたヌクレアーゼの主要なクラスには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が含まれる。これらのヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡ認識のモードに基づいて、大きく２つのカテゴリに分類できる。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮはタンパク質－ＤＮＡ相互作用を介して特定のＤＮＡ結合を達成し、その一方で、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲシステムは、標的ＤＮＡと直接塩基対を形成する短鎖ＲＮＡガイド分子及びタンパク質－ＤＮＡ相互作用によって特定のＤＮＡ配列に標的化される。例えば、Cox et al., Nature Medicine, 2015, Vol. 21, No. 2を参照されたい。

【0892】

[00894] 本発明のＴＩＬ拡大培養方法に従って使用され得る遺伝子編集方法の非限定的な例には、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法及びＺＦＮ法が含まれ、これらは以下により詳細に記載される。一実施形態によると、ＴＩＬを治療用集団に拡大培養する方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、ＧＥＮ３プロセス）に従って又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８６１０号、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６０５号若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されているように実施され得、方法は、強化された治療効果を提供することができるＴＩＬを生成するために、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法又はＺＦＮ法の１つ以上によってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することを更に含む。一実施形態によると、遺伝子編集されたＴＩＬは、それらをインビトロで改変されていないＴＩＬと比較することにより、例えば、インビトロエフェクター機能、サイトカインプロファイルなどを未改変のＴＩＬと比較して評価することにより、改善された治療効果について評価され得る。特定の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥ及び／又はＺＦＮ法を使用して、ＴＩＬ集団を遺伝子編集することを含む。

【0893】

[00895] 本発明の一部の実施形態において、エレクトロポレーションは、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮシステムなどの遺伝子編集システムの送達に使用される。本発明の一部の実施形態において、エレクトロポレーションシステムは、フローエレクトロポレーションシステムである。本発明の一部の実施形態での使用に適した適切なフローエレクトロポレーションシステムの例は、市販のMaxCyte STXシステムである。BTX-Harvard Apparatusから市販のAgilePulseシステム若しくはECM 830、Cellaxess Elektra (Cellectricon)、Nucleofector（Lonza/Amaxa）、GenePulser MXcell（BIORAD）、iPorator-96（Primax）又はsiPORTer96（Ambion）など、本発明での使用に適している可能性のあるいくつかの代替の市販のエレクトロポレーション機器が存在する。本発明の一部の実施形態において、エレクトロポレーションシステムは、ＴＩＬ拡大培養方法の残部を備えた閉鎖滅菌システムを形成する。本発明の一部の実施形態において、エレクトロポレーションシステムは、本明細書に記載のパルスエレクトロポレーションシステムであり、ＴＩＬ拡大培養方法の残部を備えた閉鎖滅菌システムを形成する。

【0894】

[00896] ＴＩＬを治療用集団に拡大培養する方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、プロセスＧＥＮ３）に従って又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８６１０号、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６０５号若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されているように実施され得、方法は、ＣＲＩＳＰＲ法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）によってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することを更に含む。特定の実施形態によると、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のＣＲＩＳＰＲ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現の、治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部におけるサイレンシング又は低下を引き起こす。代わりに、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のＣＲＩＳＰＲ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現の、治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部における増強を引き起こす。

【0895】

[00897] ＣＲＩＳＰＲは、「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」を表す。遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲシステムを使用する方法は、本明細書ではＣＲＩＳＰＲ法とも称される。ＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を組み込んでおり、本発明に従って使用され得る３つのタイプのＣＲＩＳＰＲシステム：タイプＩ、ＩＩ及びＩＩＩが存在する。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９により例示される）は、最もよく特徴付けられたシステムの１つである。

【0896】

[00898] ＣＲＩＳＰＲ技術は、細菌及び古細菌（単細胞微生物のドメイン）の天然の防御メカニズムから適応された。これらの生物は、ＣＲＩＳＰＲ由来のＲＮＡ及びＣａｓ９を含む様々なＣａｓタンパク質を使用して、外来の侵入者のＤＮＡを切り刻んで破壊することにより、ウイルス及び他の異物による攻撃を阻止する。ＣＲＩＳＰＲは、ヌクレオチド反復及びスペーサーの存在という２つの異なる特徴を持つＤＮＡの特殊な領域である。ヌクレオチドの反復配列はＣＲＩＳＰＲ領域全体に分布し、外来ＤＮＡ（スペーサー）の短いセグメントが反復配列間に散在している。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサーがＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座内に統合され、転写されて短いＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に処理される。これらのｃｒＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニーリングし、Ｃａｓタンパク質による病原性ＤＮＡの配列特異的な切断及びサイレンシングを指示する。Ｃａｓ９タンパク質による標的認識には、ｃｒＲＮＡ内の「シード」配列及びｃｒＲＮＡ結合領域の上流の保存されたジヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を要する。これにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ｃｒＲＮＡを再設計することにより、実質的にあらゆるＤＮＡ配列を切断するために再標的化され得る。天然のシステムにおけるｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、遺伝子工学における使用のために、およそ１００ヌクレオチドの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に単純化することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと必要なｃｒＲＮＡ成分とを発現するプラスミドの共送達により、ヒト細胞へ直接移植できる。ターゲティングの制限を減少させるために、Ｃａｓタンパク質の異なるバリアントを使用し得る（例えば、Ｃｐｆ１などのＣａｓ９のオルソログ）。

【0897】

[00899] ＣＲＩＳＰＲ法を介してＴＩＬを恒久的に遺伝子編集することによりサイレンシング又は阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ－３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３が含まれる。

【0898】

[00900] ＣＲＩＳＰＲ法を介してＴＩＬを恒久的に遺伝子編集することにより強化され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１が含まれる。

【0899】

[00901] ＣＲＩＳＰＲ法により標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法及び組成物の例は、参照により本明細書に援用される米国特許第８，６９７，３５９号；同第８，９９３，２３３号；同第８，７９５，９６５号；同第８，７７１，９４５号；同第８，８８９，３５６号；同第８，８６５，４０６号；同第８，９９９，６４１号；同第８，９４５，８３９号；同第８，９３２，８１４号；同第８，８７１，４４５号；同第８，９０６，６１６号；及び同第８，８９５，３０８号に記載される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１を発現するためのプラスミドなど、ＣＲＩＳＰＲ法を実行するための資源は、GenScriptなどの企業から市販されている。

【0900】

[00902] 一実施形態において、本明細書に記載されているようなＴＩＬ集団の遺伝子改変は、その開示が参照により本明細書に援用される米国特許第９７９０４９０号に記載されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを使用して実施され得る。

【0901】

[00903] ＴＩＬを治療用集団に拡大培養する方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、プロセス２Ａ）に従って又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８６１０号、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６０５号若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されているように実施され得、方法は、ＴＡＬＥ法によってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することを更に含む。特定の実施形態によると、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のＴＡＬＥ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現の、治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部におけるサイレンシング又は低下を引き起こす。代わりに、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のＴＡＬＥ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現の、治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部における増強を引き起こす。

【0902】

[00904] ＴＡＬＥは、ＴＡＬＥＮ（「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」）を含む、「転写活性化因子様エフェクター」タンパク質を表す。遺伝子編集のためにＴＡＬＥシステムを使用する方法は、本明細書ではＴＡＬＥ法とも称され得る。ＴＡＬＥは、植物病原菌キサントモナス（Xanthomonas）属からの天然に存在するタンパク質であり、それぞれが単一の塩基対を認識する一連の３３～３５アミノ酸の反復ドメインで構成されるＤＮＡ結合ドメインを含有する。ＴＡＬＥの特異性は、反復可変二残基（ＲＶＤ）として知られる２つの超可変アミノ酸によって決定される。モジュラーＴＡＬＥ反復は、隣接するＤＮＡ配列を認識するために連結されている。ＤＮＡ結合ドメインにおける特定のＲＶＤは、標的遺伝子座の塩基を認識し、予測可能なＤＮＡ結合ドメインを組み立てるための構造的特徴を提供する。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、ＩＩＳ型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合されて、標的化可能なＴＡＬＥヌクレアーゼが作製される。部位特異的変異を誘導するために、１４～２０塩基対のスペーサー領域で分離された２つの個別のＴＡＬＥＮアームがＦｏｋＩモノマーを近接させて、二量体化して標的化された二本鎖切断を生成する。

【0903】

[00905] 様々な組み立て方法を利用したいくつかの大規模で体系的な研究により、ＴＡＬＥ反復を組み合わせて、事実上あらゆるユーザー定義の配列を認識することができることが示されている。カスタム設計のＴＡＬＥアレイは、Cellectis Bioresearch（Paris, France）、Transposagen Biopharmaceuticals（Lexington, KY, USA）及びLife Technologies（Grand Island, NY, USA）からも市販されている。本発明における使用に適したＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮ法は、米国特許出願公開第２０１１／０２０１１１８ Ａ１号；同第２０１３／０１１７８６９ Ａ１号；同第２０１３／０３１５８８４ Ａ１号；同第２０１５／０２０３８７１ Ａ１号及び同第２０１６／０１２０９０６ Ａ１号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に援用される。

【0904】

[00906] ＴＡＬＥ法を介してＴＩＬを恒久的に遺伝子編集することによりサイレンシング又は阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ－３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３が含まれる。

【0905】

[00907] ＴＡＬＥ法を介してＴＩＬを恒久的に遺伝子編集することにより強化され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１が含まれる。

【0906】

[00908] 本発明の実施形態に従って使用され得る、ＴＡＬＥ法による標的遺伝子配列の発現を変化させるためのシステム、方法及び組成物の例は、米国特許第８，５８６，５２６号に記載され、これは、参照により本明細書に援用される。

【0907】

[00909] ＴＩＬを治療用集団に拡大培養する方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、プロセスＧＥＮ３）に従って又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８６１０号、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６０５号若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されているように実施され得、方法は、ジンクフィンガー又はジンクフィンガーヌクレアーゼ法によってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することを更に含む。特定の実施形態によると、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のジンクフィンガー法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現の、治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部におけるサイレンシング又は低下を引き起こす。代わりに、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のジンクフィンガー法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現の、治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部における増強を引き起こす。

【0908】

[00910] 個々のジンクフィンガーには、保存されたββα構成でおよそ３０アミノ酸が含有される。α－ヘリックスの表面上のいくつかのアミノ酸は、典型的には、様々な選択性のレベルで、ＤＮＡの主要な溝の３ｂｐに接触する。ジンクフィンガーは２つのタンパク質ドメインを有する。第１のドメインは、真核生物の転写因子を含み、ジンクフィンガーを含有するＤＮＡ結合ドメインである。第２のドメインは、ヌクレアーゼドメインであり、ＦｏｋＩ制限酵素を含み、ＤＮＡの触媒的切断の原因である。

【0909】

[00911] 個別のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には３～６個のジンクフィンガー反復を含有し、それぞれ９～１８塩基対を認識できる。ジンクフィンガードメインが目的の標的部位に特異的である場合、合計１８塩基対を認識する１組の３フィンガーＺＦＮでも、理論的には哺乳動物ゲノムの単一の遺伝子座を標的とすることができる。新しいジンクフィンガーアレイを生成する方法の１つは、既知の特異性を有する小さいジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的なモジュラー組み立てプロセスは、３塩基対のＤＮＡ配列をそれぞれ認識できる３つの別個のジンクフィンガーを組み合わせて、９塩基対の標的部位を認識できる３フィンガーアレイを生成することを含む。代わりに、オリゴマー化プールエンジニアリング（ＯＰＥＮ）などの選択ベースのアプローチを使用して、隣接するフィンガー間の状況依存的な相互作用を考慮した無作為化ライブラリーから新しいジンクフィンガーアレイを選択できる。操作されたジンクフィンガーは市販されている。Sangamo Biosciences（Richmond, CA, USA）は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）と協力して、ジンクフィンガー構築のための適切なプラットフォーム（CompoZr（登録商標））を開発した。

【0910】

[00912] ジンクフィンガー法を介してＴＩＬを恒久的に遺伝子編集することによりサイレンシング又は阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ－３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３が含まれる。

【0911】

[00913] ジンクフィンガー法を介してＴＩＬを恒久的に遺伝子編集することにより強化され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１が含まれる。

【0912】

[00914] 本発明の実施形態に従って使用され得る、ジンクフィンガー法による標的遺伝子配列の発現を変化させるためのシステム、方法及び組成物の例は、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，７４６，８３８号、同第６，７９４，１３６号、同第６，８２４，９７８号、同第６，８６６，９９７号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、同第７，０３０，２１５号、同第７，２２０，７１９号、同第７，２４１，５７３号、同第７，２４１，５７４号、同第７，５８５，８４９号、同第７，５９５，３７６号、同第６，９０３，１８５号及び同第６，４７９，６２６号に記載され、これらは、参照により本明細書に援用される。

【0913】

[00915] ジンクフィンガー法により標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法及び組成物の他の例は、Beane, et al., Mol.Therapy, 2015, 23 1380-1390に記載され、その開示は、参照により本明細書に援用される。

【0914】

[00916] 一部の実施形態において、ＴＩＬは、任意選択で、限定されないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えばＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えば、ＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含めて、追加的な機能性を含むように遺伝子改変される。特定の実施形態において、方法は、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えばＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えば、ＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴＩＬ集団を遺伝子改変することを含む。適切には、ＴＩＬ集団は、本明細書に記載されるように、第１の集団、第２の集団及び／又は第３の集団であり得る。

【実施例】

【0915】

実施例
[00917] 実施例１：子宮内膜癌からのＴＩＬの拡大培養
[00918] 子宮内膜癌腫瘍サンプルを患者から入手した。ＴＩＬは、Tavera et al.（J. Immunother., 41(9):399-405, 2018）に記載されている方法を使用して拡大培養した。腫瘍サンプルを１～３ｍｍ^３の断片に切断し、５つの断片を、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、１０μｇ／ｍＬの４－１ＢＢ抗体アゴニスト及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む、２０ｍＬの完全ＴＩＬ培地（ＴＩＬ－ＣＭ）中、G-Rex 10フラスコに入れた。培養開始から４～５日後、更に２０ｍＬのＴＩＬ－ＣＭ及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を培養フラスコに加えた。培地の半分を交換し、細胞増殖物がフラスコの底を覆うまで、合計培養時間約３～４週間、３～４日ごとに６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をフラスコに加えた。

【0916】

[00919] 次に、ＴＩＬは表現型によって特徴付けられた。各患者は、更なる特性評価のために、可能な限り、正常サンプル、腫瘍サンプル及び凍結サンプルでのプレＲＥＰ ＴＩＬを提供した。図３Ａ及び３Ｂは、凍結プレＲＥＰ ＴＩＬが、正常組織又は腫瘍組織のいずれよりもＣＤ４５＋細胞及びＣＤ３＋細胞の割合が高いことを示す。図４Ａ及び４Ｂは、正常サンプルと腫瘍サンプルとがＣＤ４５＋ＣＤ３＋コンパートメントに類似のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブ集団を有するのに対し、腫瘍組織と比較して凍結プレＲＥＰ ＴＩＬは、ＣＤ４＋サブ集団の割合が低く、ＣＤ８＋サブ集団の割合が高いようであることを示す。

【0917】

[00920] 更に、ＣＤ８＋サブセットの表現型決定も完了した。以下のマーカーのＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬ陽性率を、正常組織と腫瘍組織で比較した。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９－、ＴＩＧＩＴ及びＴＩＭ３。図５Ａは、比較データを示す。ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋を除くほとんど全ての場合において、データは、各マーカーの正常サンプル及び腫瘍サンプルで同様のＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬパーセンテージを示す。図５Ｂは、腫瘍と凍結プレＲＥＰ ＴＩＬの比較データを示す。これらのデータは、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬとＫｉ６７マーカー及びＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋の違いを示す。図６は、腫瘍サンプル及び凍結サンプルでのプレＲＥＰ ＴＩＬの各マーカーを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋ＴＩＬの割合について収集されたデータを示す。Ｋｉ６７、ＬＡＧ３及びＴＩＭ３では違いが見られる。

【0918】

[00921] ＣＤ４＋サブセットの表現型決定も完了した。図７Ａ及び７Ｂは、以下の各マーカーを発現するＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＩＬの割合を示す。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９－、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３及びＴ_ｒｅｇ。図７Ａは、正常対腫瘍サンプルのデータを示し、図７Ｂは、腫瘍と凍結プレＲＥＰ ＴＩＬからのデータを示す。正常サンプルと腫瘍サンプルとは、各マーカーで同様のパーセンテージを示す。腫瘍と凍結プレＲＥＰ ＴＩＬは、腫瘍サンプルに対し発現の増加を示すＫｉ６７と、腫瘍サンプルに対し発現の減少を示すＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋を除き、同様の割合を示す。図８は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋ＴＩＬの割合を示し、Ｋｉ６７及びＴＩＭ３の凍結サンプルでのプレＲＥＰ ＴＩＬの割合の増加を示す。

【0919】

[00922] 実施例２：未分化甲状腺癌からのＴＩＬの拡大培養
[00923] ＴＩＬは上記のプロセスを使用して拡大培養され、得られたＴＩＬは上記のように表現型決定された。

【0920】

[00924] 図９Ａ及び９Ｂは、凍結プレＲＥＰ ＴＩＬが、正常組織又は腫瘍組織のいずれよりもＣＤ４５＋細胞及びＣＤ３＋細胞の割合が高いことを示す。図１０Ａ及び１０Ｂは、正常サンプルと腫瘍サンプルとが類似のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブ集団を有するのに対し、腫瘍組織と比較して凍結プレＲＥＰ ＴＩＬは、ＣＤ４＋サブ集団の割合が低いが、ＣＤ８＋サブ集団の割合が高いようであることを示す。

【0921】

[00925] ＣＤ８＋サブセットの表現型決定も完了した。以下のマーカーのＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬ陽性率を、正常組織と腫瘍組織で比較した。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９－、ＴＩＧＩＴ及びＴＩＭ３。図１１Ａは、比較データを示す。ＢＴＬＡ及びＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋を除くほとんど全ての場合において、データは、各マーカーの正常サンプル及び腫瘍サンプルでＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬパーセンテージの違いを示す。図１１Ｂは、腫瘍と凍結プレＲＥＰ ＴＩＬの比較データを示す。これらのデータも、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ及び程度は少ないが、ＴＩＭ－３を除いてほとんどのマーカーでＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬの違いを示す。図１２は、腫瘍サンプル及び凍結サンプルでのプレＲＥＰ ＴＩＬの各マーカーを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋ＴＩＬの割合について収集されたデータを示す。ＣＴＬＡ－４、Ｋｉ６７、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３では違いが見られる。

【0922】

[00926] ＣＤ４＋サブセットの表現型決定も完了した。図１３Ａ及び１３Ｂは、以下の各マーカーを発現するＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＩＬの割合を示す。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９－、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３及びＴ_ｒｅｇ。図１３Ａは、正常対腫瘍サンプルのデータを示し、図１３Ｂは、腫瘍と凍結プレＲＥＰ ＴＩＬからのデータを示す。正常サンプルと腫瘍サンプルとは、ＩＣＯＳ及びＬＡＧ３を除く各マーカーで同様の割合を示す。腫瘍と凍結プレＲＥＰ ＴＩＬは、凍結プレＲＥＰ ＴＩＬでの発現が腫瘍サンプルに対し増加するＫｉ６７と、腫瘍ＴＩＬと比較してプレＲＥＰ ＴＩＬでの発現が減少するＰＤ１を除き、同様の割合を示す。図１４は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋ＴＩＬの割合を示し、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、Ｋｉ６７及びＴＩＭ３の腫瘍ＴＩＬと比較して、凍結サンプルでのプレＲＥＰ ＴＩＬの割合の増加を示す。

【0923】

[00927] 実施例１及び２からの結果の考察：
[00928] エクスビボでのプレＲＥＰ拡大培養産物は、主にＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞（即ちＴ細胞）で構成されていた。拡大培養の方法により、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の歪みが生じた。エクスビボでのプレＲＥＰ拡大培養によりＴＩＬへの高レベルの増殖が回復した。

【0924】

[00929] ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋子宮内膜ＴＩＬは、おそらく腫瘍組織に組織常在性のメモリーＴ細胞（Ｔ_ＲＭ）が存在するため、通常及び拡大培養プレＲＥＰサンプルと比較して、腫瘍組織に濃縮されていた。驚くべきことに、これは甲状腺ＴＩＬでは観察されなかった。

【0925】

[00930] 実施例３：ＲＥＰによるＴＩＬの拡大培養
[00931] 腫瘍サンプルは患者から収集される。ＴＩＬは、上記の実施例１に記載したように平均３～４週間又は以前にTavera et al.に記載されたように３～５週間にわたって拡大培養された、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＴＩＬ完全培地（ＴＩＬ－ＣＭ）で１～５ｍｍ^３の腫瘍断片から拡大培養される。次に、ＴＩＬは、抗ＣＤ３（ＯＫＴ－３）及びプールされた同種異系照射ＰＢＭＣフィーダー細胞を、１ＴＩＬ対２００フィーダー細胞の比率でＲＥＰによって更に増殖させる。ＲＥＰ全体は、G-Rex 100Mフラスコ（Wilson Wolf Mfg.）で１４日間実施される。

【0926】

[00932] 各患者は、ＴＩＬ注入（０日目に発生）の１週間（７日）前に始まる骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法のコースで処置される。投与される化学療法剤は、２日間にわたって毎日６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドであり、その後、週の残りは毎日２５ｍｇ／ｍ^２のフルダラビンである。自己ＴＩＬは０日目に静脈内注入によって投与され、７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２は、１日目に８時間ごとに許容範囲内まで投与される（最大１５回の投与）。２１日目に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２を再び投与する。

【0927】

[00933] 実施例４：ＲＥＰによるＴＩＬの拡大培養
[00934] 腫瘍サンプルは患者から収集される。ＴＩＬは、上記の実施例１に記載したように平均３～４週間又は以前にTavera et al.に記載されたように３～５週間にわたって、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＴＩＬ完全培地（ＴＩＬ－ＣＭ）で１～５ｍｍ^３の腫瘍断片から拡大培養される。次に、ＴＩＬは、更なる抗ＣＤ３（ＯＫＴ－３）、抗４－１ＢＢ抗体アゴニスト及びＩＬ－２並びに同種異系照射ＰＢＭＣフィーダー細胞を１ＴＩＬ対２００フィーダー細胞の比率でＲＥＰによって更に増殖させる。ＲＥＰ全体は、G-Rex 100Mフラスコ（Wilson Wolf Mfg.）で７日間実施される。

【0928】

[00935] 各患者は、ＴＩＬ注入（０日目に発生）の１週間（７日）前に始まる骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法のコースで処置される。投与される化学療法剤は、２日間にわたって毎日６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドであり、その後、週の残りは毎日２５ｍｇ／ｍ^２のフルダラビンである。自己ＴＩＬは０日目に静脈内注入によって投与され、７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２が、１日目に８時間ごとに許容範囲内まで投与される（最大１５回の投与）。２１日目に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２を再び投与する。

【0929】

[00936] 上記に示す例は、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態をどのように作成及び使用し得るかについて当業者に詳細な開示及び説明を付与するために提供され、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図されない。当業者に明らかな本発明を実施するための上述の態様の変形形態は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。本明細書において言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が関係する技術分野の当業者の技能水準の指標である。

【0930】

[00937] 全ての見出し及びセクション表示は、明確にするために及びあくまでも参考として使用され、決して限定するものと考えられてはならない。例えば、当業者は、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を、本明細書に記載される本発明の趣旨及び範囲に従って適宜組み合わせることの有用性を理解するであろう。

【0931】

[00938] 本明細書に引用する全ての参考文献は、それぞれの個別の刊行物、又は特許、又は特許出願があらゆる目的のために全体として参照により援用されると具体的及び個別的に指示されたものと見なすのと同程度に、本明細書によって全体として及びあらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。

【0932】

[00939] 当業者に明らかであろう通り、本願の多くの改良形態及び変形態形は、その趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に記載される具体的な実施形態及び例は、単に例として提供され、本願は、特許請求の範囲に認められる均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【配列表】

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【国際調査報告】