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特表2023-506744迅速な沈殿によるＨＭＷ ＤＮＡのキロベースサイズ選択
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-20
(54)【発明の名称】迅速な沈殿によるＨＭＷ ＤＮＡのキロベースサイズ選択
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20230213BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230213BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230213BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 100Z
C12N15/10 110Z
C12N15/11 Z
C12Q1/6869 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022535154
(86)(22)【出願日】2020-12-11
(85)【翻訳文提出日】2022-08-03
(86)【国際出願番号】 US2020064508
(87)【国際公開番号】W WO2021119425
(87)【国際公開日】2021-06-17
(31)【優先権主張番号】62/947,969
(32)【優先日】2019-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522228816
【氏名又は名称】パシフィック バイオサイエンシス オブ カリフォルニア インク
(74)【代理人】
【識別番号】100112737
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 考晴
(74)【代理人】
【識別番号】100136168
【弁理士】
【氏名又は名称】川上 美紀
(74)【代理人】
【識別番号】100196117
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 利恵
(72)【発明者】
【氏名】ケルビン ジェン ファン リュウ
(72)【発明者】
【氏名】ジョン ダンカン キルバーン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QR41
(57)【要約】
本明細書で提供するのは、核酸を含有する試料を精製して所望するサイズ範囲の単離核酸を得る方法および所望するサイズ範囲の核酸を配列決定する方法である。この方法は、ａ）核酸含有試料と沈殿緩衝液を容器内で合わせて沈殿混合物を提供するステップであり、沈殿緩衝液が水、緩衝液、塩、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および／またはＦｉｃｏｌｌを含む、ステップを含む。この方法はまた、沈殿混合物中の核酸を沈殿させて、沈殿した核酸部分および残存する試料部分を提供するステップを含む。沈殿した核酸部分は、選択したサイズカットオフ値を上回る核酸分子を優先的に含み、残存する試料部分は、選択したサイズカットオフ値を下回る核酸分子を優先的に含む。この方法はまた、残存する試料部分から沈殿した核酸部分を分離するステップを含む。関連する組成物およびキットも本明細書で提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸を含有する試料を精製して所望するサイズ範囲の単離核酸を得る方法であって、ａ．核酸含有試料と沈殿緩衝液とを容器内で合わせて沈殿混合物を提供するステップであり、前記沈殿緩衝液が水、緩衝液、塩、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む、ステップと、
ｂ．前記沈殿混合物中の前記核酸を沈殿させて、沈殿した核酸部分および残存する試料部分を提供するステップであり、前記沈殿した核酸部分が選択したサイズカットオフ値を上回る核酸分子を優先的に含み、前記残存する試料部分が選択した前記サイズカットオフ値を下回る核酸分子を優先的に含むステップと、
ｃ．前記残存する試料部分から前記沈殿した核酸部分を分離して、それによって所望するサイズ範囲の前記単離核酸を得るステップと
を含む方法。
【請求項2】
核酸を含有する試料を精製して所望するサイズ範囲の単離核酸を得る方法であって、ａ．核酸含有試料と沈殿緩衝液とを容器内で合わせて沈殿混合物を提供するステップであり、前記沈殿緩衝液が水、緩衝液、塩、およびＦｉｃｏｌｌを含む、ステップと、
ｂ．前記沈殿混合物中の前記核酸を沈殿させて、沈殿した核酸部分および残存する試料部分を提供するステップであり、前記沈殿した核酸部分が選択したサイズカットオフ値を上回る核酸分子を優先的に含み、前記残存する試料部分が選択した前記サイズカットオフ値を下回る核酸分子を優先的に含むステップと、
ｃ．前記残存する試料部分から前記沈殿した核酸部分を分離して、それによって所望するサイズ範囲の前記単離核酸を得るステップと
を含む方法。
【請求項3】
核酸を含有する試料を精製して所望するサイズ範囲の単離核酸を得る方法であって、ａ．核酸含有試料と沈殿緩衝液とを容器内で合わせて沈殿混合物を提供するステップであり、前記沈殿緩衝液が水、緩衝液、塩、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および／またはＦｉｃｏｌｌを含む、ステップと、
ｂ．前記沈殿混合物中の前記核酸を沈殿させて、沈殿した核酸部分および残存する試料部分を提供するステップであり、前記沈殿した核酸部分が選択したサイズカットオフ値を上回る核酸分子を優先的に含み、前記残存する試料部分が選択した前記サイズカットオフ値を下回る核酸分子を優先的に含むステップと、
ｃ．前記残存する試料部分から前記沈殿した核酸部分を分離して、それによって前記所望するサイズ範囲の前記単離核酸を得るステップと
を含む方法。
【請求項4】
所望するサイズ範囲の核酸を配列決定する方法であって、ａ．核酸含有試料と沈殿緩衝液とを容器内で合わせて沈殿混合物を提供するステップであり、前記沈殿緩衝液が水、緩衝液、塩、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および／またはＦｉｃｏｌｌを含む、ステップと、
ｂ．前記沈殿混合物中の前記核酸を沈殿させて、沈殿した核酸部分および残存する試料部分を提供するステップであり、前記沈殿した核酸部分が選択したサイズカットオフ値を上回る核酸分子を優先的に含み、前記残存する試料部分が選択した前記サイズカットオフ値を下回る核酸分子を優先的に含むステップと、
ｃ．前記残存する試料部分から前記沈殿した核酸部分を分離して、それによって前記所望するサイズ範囲の単離核酸を得るステップと、
ｄ．前記所望するサイズ範囲の前記単離核酸を配列決定して、シークエンシングリードを生成し、それによって前記所望するサイズ範囲の前記核酸を配列決定するステップと
を含む方法。
【請求項5】
前記ＰＶＰが、ＭＷ１００００、ＭＷ２９０００、ＭＷ４００００、ＭＷ５５０００、ＭＷ３６００００、および、ＭＷ１３０００００、または、ＭＷ５０００からＭＷ５００００００の間のその他の分子量からなる群から選択される分子量（ＭＷ）を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記Ｆｉｃｏｌｌが、ＭＷ７００００、および、ＭＷ４０００００、または、ＭＷ５０００からＭＷ５００００００の間のその他の分子量からなる群から選択される分子量（ＭＷ）を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記沈殿緩衝液中の前記ＰＶＰの濃度が、０．１％～４０％重量／体積（ｗ／ｖ％）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記沈殿緩衝液中の前記Ｆｉｃｏｌｌの濃度が、０．１％～６０％重量／体積（ｗ／ｖ％）である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
選択された前記サイズカットオフ値が、５０ｂｐ～１０００キロベース（ｋｂ）である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記核酸含有試料中の核酸分子が、約１～２０００ｎｇ／μＬの間の濃度範囲を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記選択されたサイズカットオフ値を決定するために前記沈殿緩衝液の少なくとも１つの条件を調製することを含み、前記条件が、ＰＶＰ濃度、ＰＶＰ分子量、Ｆｉｃｏｌｌ濃度、Ｆｉｃｏｌｌ ＭＷ、カオトロピック塩の有無、一価および／または二価塩の有無、塩の濃度および種類、アルコールの種類および濃度、ポリアミンの有無、変性剤の有無、その他の添加分子の有無、ｐＨ、沈殿／結合時間、沈殿／結合温度、沈殿／結合体積、遠心分離時間、遠心分離温度、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ステップｂ）が前記沈殿混合物を遠心分離することを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ステップｂ）が前記沈殿混合物を室温（ＲＴ）で１００００ｇで３０分間遠心分離することを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記塩が、塩化グアニジニウム、塩酸グアニジニウム、過塩素酸リチウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、およびヨウ化ナトリウムのうちの１つまたは複数を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記残存する試料部分が上清を含み、ステップｃ）が前記容器から前記上清を除去することをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ｅ．核酸ペレットをアルコール溶液で１回または複数回洗浄して、洗浄された核酸ペレットを生成するステップと、ｆ．洗浄された前記核酸ペレットを再懸濁緩衝液に再懸濁して、再懸濁した核酸を生成するステップと
を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記再懸濁緩衝液がＴＥ緩衝液または低ＥＤＴＡ ＴＥ緩衝液を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
ステップａ）の前に、前記核酸含有試料と結合緩衝液とを合わせて結合混合物を提供するステップ、前記結合混合物とナノ膜とを接触させるステップであり、前記ナノ膜が前記結合混合物中の核酸に結合して、結合された核酸を生成するステップ、および結合された前記核酸を、前記結合混合物の残存する成分から分離するステップをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記沈殿物混合物中で前記核酸とナノ膜とを接触させるステップであり、ステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、および／またはｅ）の間に、前記ナノ膜が前記沈殿物混合物中の核酸に結合し、結合された核酸を生成するステップをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
ステップｅ）の間または後に、前記再懸濁した核酸をナノ膜と接触させるステップであり、前記ナノ膜が前記再懸濁緩衝液中の核酸に結合して、結合した核酸を生成するステップ、および前記結合した核酸を、前記再懸濁緩衝液の残存する成分から分離するステップをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ステップｃ）の後で、前記所望するサイズ範囲の前記単離核酸を配列決定して、シークエンシングリードを生成するステップをさらに含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
少なくともステップａ）～ｃ）を実施した後に得られる前記シークエンシングリードのＮ５０が、ステップａ）～ｃ）を実施しない場合に得られるシークエンシングリードのＮ５０に比べて増加している、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
核酸および沈殿緩衝液を含む組成物であって、前記沈殿緩衝液が、水、緩衝液、塩、および、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）ならびに／またはＦｉｃｏｌｌを含み、前記核酸の一部が、選択したサイズカットオフ値を上回る核酸分子を優先的に含む核酸ペレットに存在しており、前記核酸の残存する部分が、前記選択したサイズカットオフ値を下回る核酸分子を優先的に含む上清中に存在している組成物。
【請求項24】
前記ＰＶＰが、ＭＷ１００００、ＭＷ２９０００、ＭＷ４００００、ＭＷ５５０００、ＭＷ３６００００、およびＭＷ１３０００００、または、ＭＷ５０００からＭＷ５００００００の間のその他の分子量からなる群から選択される分子量（ＭＷ）を有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
前記Ｆｉｃｏｌｌが、ＭＷ７００００、およびＭＷ４０００００、または、ＭＷ５０００からＭＷ５００００００の間のその他の分子量からなる群から選択される分子量（ＭＷ）を有する、請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項26】
前記沈殿緩衝液中の前記ＰＶＰの濃度が、０．１％～４０％重量／体積（ｗ／ｖ％）である、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項27】
前記沈殿緩衝液中の前記Ｆｉｃｏｌｌの濃度が、０．１％～６０％重量／体積（ｗ／ｖ％）である、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項28】
前記選択されたサイズカットオフ値が、５０ｂｐ～１０００キロベース（ｋｂ）である、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項29】
核酸を含有する試料を精製して所望するサイズ範囲の単離核酸を得るためのキットであって、１つまたは複数の容器中に入った、緩衝液、塩、および、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）ならびに／またはＦｉｃｏｌｌを含む、キット。
【請求項30】
水、前記緩衝液、前記塩、およびＰＶＰおよび／またはＦｉｃｏｌｌを含む沈殿緩衝液を含む単一の容器を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項31】
ナノ膜をさらに含む、請求項２９または３０に記載のキット。
【請求項32】
１つまたは複数の洗浄緩衝液、および／または、１つもしくは複数の溶出緩衝液をさらに含む、請求項２９から３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項33】
１つまたは複数のシークエンシング試薬をさらに含む、請求項２９から３２のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、全体の開示が参照として本明細書に組み込まれる２０１９年１２月１３日出願の米国特許仮出願第６２／９４７６９６号の利益を主張し、その出願日に依存する。
本出願は、全体の開示が参照として本明細書に組み込まれる２０１９年１２月１３日出願の米国特許仮出願第６２／９４７６９６号の利益を主張し、その出願日に依存する。
【背景技術】
【0002】
近年、第３世代のシークエンシング技術は、ゲノムの構造－機能の理解および参照構築物の精度を激変させた。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）、およびＢｉｏＮａｎｏ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）による変革的な進歩により、最高品質の高分子（ＨＭＷ）ＤＮＡおよび高分子ＤＮＡを効率的に処理するための新技術の必要性が再浮上してきた。しかし、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）、ゲルプラグ抽出、および透析精製等のＨＭＷ ＤＮＡを処理および分析するための技術の大部分は元々、分子生物学の黎明期に開発されたものであり、非常に時間がかかり面倒である。
【0003】
ほとんどのロングリードシークエンシング技術のライブラリー調製は、類似のワークフローに従う。まず、ＨＭＷ ＤＮＡ（５０ｋｂ～Ｍｂ＋）を単離しなければならない。次に、様々な酵素ステップを使用してシークエンシングのためにＤＮＡを調製する。酵素処理中、サイズ選択を使用して所望するライブラリー生成物から小さなバックグラウンド分子を除去する。これは、ほぼＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＭＰＵＲＥ（商標）ビーズのみで行われる。ＡＭＰＵＲＥ（商標）のサイズ選択カットオフ（１００ｂｐ～１０００ｂｐ）は、ほとんどのロングリードライブラリーには小さすぎる。したがって、追跡サイズ選択は、最大分子量のライブラリー生成物のみを単離することによってリード長を延長するＳａｇｅ ＳｃｉｅｎｃｅのＢＬＵＥＰＩＰＰＩＮ（商標）（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）等のＰＦＧＥ装置を使用して実施することが多い。ＢＬＵＥＰＩＰＰＩＮ（商標）は、大きいＤＮＡ（１００ｂｐ～５０ｋｂ）をサイズ選択することができるが、これは時間がかかり（８．５時間）、長いＰＦＧＥ工程の間にＤＮＡも損傷を受け、その後の酵素的修復が必要となる。サイズ選択ステップは全て、比較的高濃度（＞５０ｎｇ／μｌ）で最適に行われなければならず、所望するシークエンシング長が増加するにつれて、一定のモル濃度を維持するためにＤＮＡの質量濃度も増加させなければならない。したがって、１００ｋｂｐから１Ｍｂｐの範囲のリードについては、質量濃度は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングに典型的な３５０～６００ｂｐの断片長を有する同じモル濃度の試料よりも２００～３０００倍高くすることが必要である。ＡＭＰＵＲＥ（商標）およびＢＬＵＥＰＩＰＰＩＮ（商標）両方の回収率は、高濃度では低下する。
【0004】
したがって、ＡＭＰＵＲＥ（商標）およびＰＦＧＥ精製の別々のステップを必要とせず、処理中に核酸に損傷を与えない、１０ｋｂを上回るサイズ範囲の大きな核酸分子の迅速なサイズ選択を可能にする技術が当業界では依然として所望されている。
【発明の概要】
【0005】
一態様では、本開示は、核酸を含有する試料を精製して所望するサイズ範囲の単離核酸を得るための方法を提供する。この方法は、ａ）核酸含有試料と沈殿緩衝液を容器内で合わせて沈殿混合物を提供するステップであり、沈殿緩衝液が水、緩衝液、塩、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および／またはＦｉｃｏｌｌを含む、ステップを含む。この方法はまた、ｂ）核酸を沈殿させて、沈殿した核酸部分および残存する試料部分を提供するステップであり、沈殿した部分が選択したサイズカットオフ値を上回る核酸分子を優先的に含み、残存する試料部分が選択したサイズカットオフ値を下回る核酸分子を優先的に含むステップを含む。さらに、この方法はまた、ｃ）残存する試料部分から沈殿した核酸を分離して、それによって所望するサイズ範囲の単離核酸を得るステップを含む。
【0006】
一態様では、本開示は、所望するサイズ範囲の核酸を配列決定する方法を提供する。この方法は、ａ）核酸含有試料と沈殿緩衝液を容器内で合わせて沈殿混合物を提供するステップであり、沈殿緩衝液が水、緩衝液、塩、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および／またはＦｉｃｏｌｌを含む、ステップを含む。この方法はまた、ｂ）沈殿混合物中の核酸をペレットにして、核酸ペレットおよび残存する試料部分を提供するステップであり、核酸ペレットが選択したサイズカットオフ値を上回る核酸分子を優先的に含み、残存する試料部分が選択したサイズカットオフ値を下回る核酸分子を優先的に含むステップを含む。この方法はまた、ｃ）残存する試料部分から核酸ペレットを分離して、所望するサイズ範囲の単離核酸を生成するステップを含む。さらに、この方法はまた、ｄ）所望するサイズ範囲の単離核酸を配列決定してシークエンシングリードを生成し、それによって所望するサイズ範囲の核酸を配列決定するステップを含む。
【0007】
一態様では、本開示は、所望するサイズ範囲の核酸を配列決定する方法を提供する。この方法は、ａ）核酸含有試料と沈殿緩衝液を容器内で合わせて沈殿混合物を提供するステップであり、沈殿緩衝液が水、緩衝液、塩、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および／またはＦｉｃｏｌｌを含む、ステップを含む。本発明はまた、ｂ）沈殿混合物中の核酸を沈殿させて、沈殿した核酸部分および残存する試料部分を提供するステップであり、沈殿した核酸部分が選択したサイズカットオフ値を上回る核酸分子を優先的に含み、残存する試料部分が選択したサイズカットオフ値を下回る核酸分子を優先的に含むステップを含む。この方法はまた、ｃ）残存する試料部分から核酸ペレットを分離して、所望するサイズ範囲の単離核酸を生成するステップを含む。さらに、この方法はまた、シークエンシングライブラリー調製中の任意のステップで、例えば、エンドプレップ／ｄＡテーリング反応またはアダプターライゲーション反応の後で、ステップａ）～ｃ）を実施することを含む。
【0008】
一部の実施形態では、ＰＶＰは、ＭＷ１００００、ＭＷ２９０００、ＭＷ４００００、ＭＷ５５０００、ＭＷ３６００００、ＭＷ１３０００００、またはＭＷ５０００からＭＷ５００００００の間のその他の分子量からなる群から選択される分子量（ＭＷ）を含む。ある特定の実施形態では、沈殿緩衝液中のＰＶＰの濃度は、０．０１％～４０％重量／体積（ｗ／ｖ％）である。一部の実施形態では、Ｆｉｃｏｌｌは、７００００、４０００００、またはＭＷ５０００からＭＷ５００００００の間のその他の分子量からなる群から選択される分子量（ＭＷ）を含む。ある特定の実施形態では、沈殿緩衝液中のＦｉｃｏｌｌの濃度は、０．０１％～６０％重量／体積（ｗ／ｖ％）である。一部の実施形態では、選択されたサイズカットオフ値は、５０ｂｐ～１０００キロベース（ｋｂ）である。一部の実施形態では、核酸含有試料中の核酸分子は、約１～２０００ｎｇ／μＬの間の濃度範囲を含む。一部の実施形態では、塩は、塩化グアニジニウム、塩酸グアニジニウム、過塩素酸リチウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、およびヨウ化ナトリウムのうちの１つまたは複数を含む。
【0009】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示した方法は、選択されたサイズカットオフ値を決定するために、沈殿緩衝液の少なくとも１つの条件を調整することを含む。これらの実施形態では、条件は、典型的には、ＰＶＰ濃度、ＰＶＰ分子量、Ｆｉｃｏｌｌ濃度、Ｆｉｃｏｌｌ分子量、カオトロピック塩の有無、一価および／または二価塩の有無、塩の濃度および種類、アルコールの種類および濃度、ポリアミンの有無、変性剤の有無、その他の添加分子の有無、ｐＨ、沈殿／結合時間、沈殿／結合温度、沈殿／結合体積、遠心分離時間、遠心分離温度、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0010】
一部の実施形態では、本明細書［０００５］に記載のステップｂ）は、沈殿混合物を遠心分離することを含む。典型的には、ステップｂ）は、室温（ＲＴ）で１００００ｇで３０分間沈殿混合物を遠心分離することを含む。ある特定の実施形態では、残存する試料部分は上清を含み、ステップｃ）は容器から上清を除去することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ｅ）核酸ペレットをアルコール溶液で１回または複数回洗浄して、洗浄した核酸ペレットを生成するステップ、およびｆ）洗浄した核酸ペレットを再懸濁緩衝液に再懸濁して、再懸濁した核酸を生成するステップをさらに含む。一部のこれらの実施形態では、再懸濁緩衝液は、ＴＥ緩衝液または低ＥＤＴＡ ＴＥ緩衝液を含む。
【0011】
一部の実施形態では、この方法は、本明細書［０００５］に記載のステップａ）の前に、核酸含有試料と結合緩衝液を合わせて結合混合物を提供するステップ、結合混合物とナノ膜を接触させるステップであり、ナノ膜が結合混合物中の核酸に結合して、結合した核酸を生成するステップ、および結合した核酸を結合混合物の残存する成分から分離するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、この方法は、沈殿物混合物中で核酸とナノ膜を接触させるステップであり、ナノ膜が沈殿物混合物中の核酸に結合し、結合した核酸を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、本明細書［０００５］に記載のステップｃ）の間または後に、再懸濁した核酸をナノ膜と接触させるステップであり、ナノ膜が再懸濁緩衝液中の核酸に結合して、結合した核酸を生成するステップ、および結合した核酸を再懸濁緩衝液の残存する成分から分離するステップをさらに含む。
【0012】
一部の実施形態では、この方法は、本明細書［０００５］に記載のステップｃ）の後で、所望するサイズ範囲の単離核酸を配列決定して、シークエンシングリードを生成するステップをさらに含む。典型的には、少なくともステップａ）～ｃ）を実施した後に得られるシークエンシングリードのＮ５０は、ステップａ）～ｃ）を実施しない場合に得られるシークエンシングリードのＮ５０に比べて増加している。
【0013】
一態様では、本開示は、全核酸試料からＲＮＡを除去する方法を提供する。この態様では、本明細書［０００５］のステップａ）～ｃ）のための投入核酸は、ＲＮａｓｅ処理を行っていない生体試料から抽出され、したがってＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む。抽出されたＤＮＡおよびＲＮＡのサイズ分布は著しく異なり、ＲＮＡの分布は平均してＤＮＡよりも小さい。したがって、本明細書［０００５］に記載のステップにおけるサイズ選択ではまた、ＲＮＡまたはＤＮＡについて選択する。本明細書［０００５］に記載のステップｂ）のペレットに含有される核酸はＤＮＡ含有量が豊富になり、残存する試料部分に含有される核酸はＲＮＡ含有量が豊富になる。本明細書［０００５］に記載のステップｃ）において残存する試料部分から核酸ペレットを分離することによって、さらなる分析に使用するためのＤＮＡの豊富な画分およびＲＮＡの豊富な画分が得られる。
【0014】
別の態様では、ＤＮＡおよびＲＮＡの分離は、サイズの違いに加えて、２本鎖核酸と１本鎖核酸との間の溶解度の違いを利用することによって実施することができる。
【0015】
一態様では、本開示は、ＤＮＡはそのままで、核酸試料から不純物を除去する方法を提供する。本明細書［０００５］で記載した方法では可溶性不純物は沈殿しないため、沈殿した核酸から残存する試料を除去するとこれらの不純物も除去される。ＵＶ分光法による２６０／２３０比が、サイズ選択後の純粋なＤＮＡで予測される比に近ければ、不純物が除去されたことがわかる。
【0016】
別の態様では、本開示は、核酸および沈殿緩衝液を含む組成物を提供する。沈殿緩衝液は、水、緩衝液、塩、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および／またはＦｉｃｏｌｌを含む。核酸の一部は、選択したサイズカットオフ値を上回る核酸分子を優先的に含む核酸ペレット中に存在しており、核酸の残存する部分は、選択したサイズカットオフ値を下回る核酸分子を優先的に含む上清中に存在している。一部の実施形態では、ＰＶＰは、ＭＷ１００００、ＭＷ２９０００、ＭＷ４００００、ＭＷ５５０００、ＭＷ３６００００、およびＭＷ１３０００００、またはＭＷ５０００からＭＷ５００００００の間のその他の分子量からなる群から選択される分子量（ＭＷ）を含む。ある特定の実施形態では、沈殿緩衝液中のＰＶＰの濃度は、０．１％～４０％重量／体積（ｗ／ｖ％）である。一部の実施形態では、Ｆｉｃｏｌｌは、ＭＷ７００００、およびＭＷ４０００００、またはＭＷ５０００からＭＷ５００００００の間のその他の分子量からなる群から選択される分子量（ＭＷ）を含む。ある特定の実施形態では、沈殿緩衝液中のＦｉｃｏｌｌの濃度は、０．０１％～４０％重量／体積（ｗ／ｖ％）である。一部の実施形態では、選択されたサイズカットオフ値は、１～１００キロベース（ｋｂ）である。
【0017】
別の態様では、本開示は、核酸を含有する試料を精製して所望するサイズ範囲の単離核酸を得るためのキットを提供する。このキットは、１つまたは複数の容器に入った緩衝液、塩、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および／またはＦｉｃｏｌｌを含む。一部の実施形態では、このキットは、水、緩衝液、塩、およびＰＶＰおよび／またはＦｉｃｏｌｌを含む沈殿緩衝液を含む単一の容器を含む。ある特定の実施形態では、このキットはナノ膜をさらに含む。一部の実施形態では、キットは１つまたは複数の洗浄緩衝液および／または１つまたは複数の溶出緩衝液をさらに含む。ある特定の実施形態では、キットは１つまたは複数のシークエンシング試薬をさらに含む。
【0018】
別の態様では、本開示は、異なるサイズ範囲を有する異なるキットと共に、核酸を含有する試料を精製して所望するサイズ範囲の単離核酸を得るための一連のキットを提供する。このキットは、１）５キロベース未満のＤＮＡをほぼ完全に除去し、１０キロベースまでのＤＮＡを徐々に減少させる「ショートリードエリミネーターＸＳ」キット、２）１０キロベース未満のＤＮＡをほぼ完全に除去し、２５キロベースまでのＤＮＡを徐々に減少させる「ショートリードエリミネーター」キット、３）１０キロベース未満のＤＮＡをほぼ完全に除去し、４０キロベースまでのＤＮＡを徐々に減少させる「ショートリードエリミネーターＸＬ」キットを含む。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1A】図１Ａは、本明細書で記載したようなサイズ選択法を使用して、実施例１で記載したような１ｋｂ ｐｌｕｓラダーを添加したλＤＮＡのサイズ選択精製を示した図である。核酸サイズ選択法は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）による沈殿を使用して実施した。ＰＶＰは、核酸沈殿を長さによって調整するための分子クラウダーとして作用する。
【図1B】図１Ｂは、ＰＶＰ濃度を変化させることによって、１０００ｂｐ～１０ｋｂまで調整することができるカットオフサイズ（１０％以下の回収率を有する最高Ｍｗバンドとして定義される）を示す。実施例１を参照のこと。
【図2】高分子（ＨＭＷ）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のサイズ選択の手法例を示した図である。
【図3A】実施例２で記載したように、ショートリードエリミネーター（ＳＲＥ）キットを使用してサイズ選択されたＨＭＷ ｇＤＮＡの１％アガロースゲル分離の画像を示した図である。サイジングカットオフは、添加したラダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ １ｋｂ Ｐｌｕｓ、＃ＳＭ１３３４）を使用して実証した。投入したのは、ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢ ＢｉｇＤＮＡキット＋ラダー２０ｎｇ／μＬを使用してＧＭ１２８７８細胞から抽出したｇＤＮＡ ５０ｎｇ／μＬであった。
【図4】ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢ ＢｉｇＤＮＡキットのみで、または実施例４で記載したように、ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢ ＢｉｇＤＮＡキットをショートリードエリミネーター（ＳＲＥ）キットと組み合わせてＤＮＡ試料を調製した、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮ／ＧｒｉｄＩＯＮシークエンシングの結果を示した図である。ｘ軸はキロベース（ｋｂ）のリード長を示し、一方ｙ軸は正規化したデータを示す。
【図5】Ｑｉａｇｅｎ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキットのみで、または実施例５で記載したように、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキットをショートリードエリミネーター（ＳＲＥ）キットと組み合わせてＤＮＡ試料を調製した、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮシークエンシングの結果を示した図である。ｘ軸はキロベース（ｋｂ）のリード長を示し、一方ｙ軸は正規化したデータを示す。
【図6】実施例６で記載したように、ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９ライブラリー調製における反応をクリーンアップするために、ＡＭＰｕｒｅビーズの代わりにショートリードエリミネーター（ＳＲＥ）キットを使用したＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮシークエンシングの結果を示す図である。ｘ軸はキロベース（ｋｂ）のリード長を示し、一方ｙ軸は正規化したデータを示す。
【図7】実施例７で記載したように、大腸菌細胞から抽出した核酸試料のＤＮＡおよびＲＮＡ画分の回収率％を示す図である。ＳＲＥ ＸＳの場合、ＲＮＡの９４％はペレット化されなかったため、遠心分離後に沈殿緩衝液をペレットから分離すると除去され、ＤＮＡが豊富な画分が残った。
【図8】本明細書［０００５］に記載したような沈殿法を使用して、実施例１３で記載したように１ｋｂ ｐｌｕｓラダーを添加したｇＤＮＡのサイズ選択精製を示した図である。サイズ選択法は、Ｆｉｃｏｌｌによる沈殿を使用して実施した。Ｆｉｃｏｌｌは、核酸沈殿を長さによって調整するための分子クラウダーとして作用する。２０％ＦｉｃｏｌｌおよびＮａＣｌ ０．７５Ｍでの沈殿によって、１．５～３ｋｂを上回るＤＮＡが回収される。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本開示は、ＰＶＰおよび／またはＦｉｃｏｌｌ、塩、および緩衝液を含む沈殿緩衝液を使用した、核酸含有試料からの核酸分子の迅速なサイズ選択の方法を対象とする。
【0021】
次世代のシークエンシング（ＮＧＳ）は、研究および臨床応用の両方によって驚異的な成長を遂げている。第３世代のシークエンシング技術は、ヒト参照ゲノムの品質を継続的に高めながら、増加し続ける植物、動物および微生物の数々のデノボ配列のために使用されている。ＮＧＳはまた、遺伝的多様性、メタゲノム解析、およびエピジェネティクス等の基本的な生物学をより理解するために使用されている。しかし、液体細胞診、非侵襲性出生前検査、および感染症検査等の臨床検査の成熟が、近い将来に主要な原動力になる可能性がある。
【0022】
サイズ選択精製は、多くのＮＧＳライブラリー調製の重要な部分である。サイズ選択ステップは、ライブラリー調製を進める前に、特定のサイズの分子を単離するために使用されることが多い。あるいは、サイズ選択ステップは、シークエンシングの直前に特定のサイズのライブラリー分子のみを単離するために使用することもできる。ロングリードＮＧＳでは、過剰な短いＤＮＡが平均リード長を損ない、アセンブリーの品質または構造変種の同定を低下させる。
【0023】
本明細書で記載したように、ショートリードエリミネーター（ＳＲＥ）キットに含まれる沈殿緩衝液等のＰＶＰおよび／またはＦｉｃｏｌｌを含有する沈殿緩衝液を使用するサイズ選択工程は、１０００ｂｐ～１００ｋｂの間のサイズ範囲の核酸の調整可能なカットオフをもたらす。サイズ選択工程を使用して、カットオフ未満の核酸分子を排除し、例えば、シークエンシングリード長を延長するためのシークエンシングライブラリーを得ることができる。本明細書で以下に記載したように、特定のポリマーを使用して、所望する長いＤＮＡから所望しない短いＤＮＡを分離して、ライブラリー調製のための投入物として使用し、時間がかかる面倒なＰＦＧＥ分離を非常に迅速な沈殿、洗浄、および溶出工程に置き換えることによって、ライブラリー調製全体を加速することができる。特定のポリマーのみを使用して、高いサイズカットオフ、迅速な処理時間、および高い回収率を促進することができる。例えば、１００ｂｐ～２０００ｋｂの範囲に亘る高い精製効率（例えば、＞９９％）は、高ＭＷ ＤＮＡ（例えば、５０ｋｂ～１Ｍｂ＋）を高回収率（例えば、＞９０％）で迅速に、例えば、＜１時間の工程で実現することができる。
【0024】
本明細書でまた記載したように、タンパク質は核酸と共精製することができる。ほとんどの精製方法の目的は、反応混合物を取り出し、これらに限定されないが、酵素、緩衝液、およびｄＮＴＰを含むその他の試薬全てを除去しながら、サイズ選択された核酸画分のみを回収することである。本明細書で記載したように、一部の実施形態では、核酸および酵素の両方が、例えば、共精製において試薬の残部から単離され得るように、方法は核酸およびタンパク質を一緒に精製することを可能にする。サイズカットオフ値は、下回ると核酸分子が効率的に回収されず、上回ると核酸分子が効率的に回収される閾値を示す。カットオフサイズは、回収が低サイズ回収と高サイズ回収の限界挙動の間の半分である核酸のサイズと定義することができる。例えば、低分子量の核酸分子（例えば、１０ｂｐ）が効率０％で回収され、高分子量の核酸分子（例えば、５０ｋｂｐ）が効率１００％で回収される場合、カットオフサイズは、回収率が５０％である分子量である。
【0025】
サイズカットオフ値はまた、上回ると核酸分子が効率的に回収されず、下回ると核酸分子が効率的に回収される閾値を示すことができる。カットオフサイズは、回収が低サイズ回収と高サイズ回収の限界挙動の間の半分である核酸のサイズと定義することができる。例えば、低分子量の核酸分子（例えば、１０ｂｐ）が効率１００％で回収され、高分子量の核酸分子（例えば、５０ｋｂｐ）が効率０％で回収される場合、カットオフサイズは、回収率が５０％である分子量である。
【0026】
本明細書で使用したように、用語「核酸」または「核酸分子」は同義に使用され、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」を含む。この用語は、１本鎖または２本鎖であってもよく、天然材料から合成されるかまたは得られ（例えば、単離および／または精製され）ていてもよく、天然、非天然、または改変されたヌクレオチドを含有することができ、未修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見いだされるリン酸ジエステル結合の代わりに、ホスホロアミデート結合またはホスホロチオエート結合等の天然、非天然、または改変されたヌクレオチド間結合を含有することができる、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡのポリマーをさらに含む。この用語は、これらに限定されないが、蛍光色素、消光剤、メチル化塩基を含むその他の一般的な核酸修飾を有する核酸をさらに含む。処理される核酸は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、環状核酸、無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）として示すことができる。高分子ＤＮＡは、典型的には２０ｋｂ長より大きい、しばしば数百ｋｂ長（最高１００ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、５００ｋｂ等）、時々Ｍｂ長（最高１Ｍｂ、２Ｍｂ、５Ｍｂ＋等）である大きな断片化されていないＤＮＡである。
【0027】
本明細書で使用したように、ＤＮＡサイズに関して使用したとき、用語「所望するサイズ範囲」は、記載した手法のステップまたはサイズ選択工程全体への投入物に含有される一部のＤＮＡサイズである、一連のＤＮＡサイズを示すために使用される。一例として、投入ＤＮＡ試料は、１０ｂｐと５０００００ｂｐとの間の長さのＤＮＡを含有するライブラリー調製生成物であり、試料中には１０ｂｐより短いＤＮＡ分子および５０００００ｂｐより長いＤＮＡ分子は存在していない。その他のサイズは全て、等しい数で表される。この例で所望されるサイズ範囲は、１００００ｂｐのカットオフサイズを上回るＤＮＡ分子全てである。したがって、所望するサイズ範囲は、１００００ｂｐと５０００００ｂｐとの間の長さのＤＮＡを含有する投入分子の一部を含み、所望するサイズ範囲が１００００ｂｐより短いＤＮＡ分子および５０００００ｂｐより長いＤＮＡ分子は存在していない。別の例として、限界は、ＤＮＡサイズより大きいかまたは小さいＤＮＡのパーセンテージ回収を用いて定義される。上記と同じ投入試料、１０ｂｐと５０００００ｂｐとの間の長さのＤＮＡでは、試料中には１０ｂｐより短いＤＮＡ分子および５０００００ｂｐより長いＤＮＡ分子は存在していない。その他のサイズは全て、等しい数で表される。所望するサイズ範囲は、１００００ｂｐを上回る長さのＤＮＡ分子の平均回収率が９０％で、１００００ｂｐより短い長さのＤＮＡ分子の平均回収率が１０％であるような回収を含む。こうして、長いＤＮＡ分子が優先的に回収される。
【0028】
ＤＮＡ含有試料等の核酸含有試料は、様々なサイズ（長さ）のＤＮＡ分子等の核酸を含む。本開示による方法は、１本鎖および２本鎖核酸のサイズ選択を可能にする。典型的には、核酸分子は、直鎖状の２本鎖ＤＮＡ分子である。しかし、核酸分子はまた、１本鎖ＤＮＡ分子、１本鎖ＲＮＡ分子、または２本鎖ＲＮＡ分子であってもよい。核酸含有試料は、核酸処理中に得られる生物学的試料および人工的試料を含む、様々な起源であってもよい。生物学的試料は、血液、血漿、血清、尿、糞便、痰等の体液、頬側スワブ、髪、歯、骨、または培養細胞、組織および固定された組織等のその他の臨床試料を含むことができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、大きなｇＤＮＡから小さなｃｆＤＮＡを含有する体液試料を精製するために使用される。一部の実施形態では、本発明の方法は、大腸菌細菌培養物等の細菌培養物の大きなｇＤＮＡから小さなプラスミドＤＮＡを精製するために使用される。一部の実施形態では、本発明の方法は、様々なサイズのプラスミドを精製するために使用してもよい。一部の実施形態では、本発明の方法は、プラスミド、コスミド、フォスミド、酵母の人工的染色体、および細菌の人工的染色体等の様々なサイズの構築物を精製するために使用してもよい。一部の実施形態によれば、核酸含有試料は、抽出核酸、または、例えば、剪断（ｓｈｅａｒｉｎｇ）もしくは酵素反応によってさらに処理された抽出核酸の試料である。一部の実施形態では、核酸試料は、シークエンシングライブラリー調製物である。一部の実施形態では、本発明の方法は、様々なサイズのＲＮＡ種を含有する全ＲＮＡ試料を精製するために使用される。一部の実施形態では、本発明の方法は、全ＲＮＡ試料から小ＲＮＡ画分を単離するために使用される。一部の実施形態では、本発明の方法は、全ＲＮＡ試料から大きなｒＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離するために使用される。
【0029】
一部の実施形態によれば、核酸含有試料は、ＤＮＡ、例えば、剪断したＤＮＡ等の断片化した核酸を含む。その他の実施形態によれば、核酸含有試料は、剪断されたゲノムＤＮＡまたは剪断されたｃＤＮＡを含む。したがって、一部の実施形態によれば、核酸含有試料は、針剪断、音響剪断、超音波剪断、酵素消化、水力学的剪断、およびトランスポサーゼ媒介断片化等のサイズ剪断手順から得られる溶液である。このような核酸含有試料は、様々なサイズの核酸断片を含む。特定のサイズまたはサイズ範囲のＤＮＡのみを得ることが所望されることもある。前記断片化した核酸は、末端修復して平滑末端を有する核酸断片をもたらすことができる。したがって、一部の実施形態によれば、核酸含有試料は、様々なサイズの直鎖状平滑末端ＤＮＡ断片を含む。
【0030】
ある特定の実施形態によれば、核酸含有試料は酵素反応後に得られる。開示の方法を使用して処理することができる核酸含有試料をもたらす酵素反応の例は、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応、ライゲーション反応、損傷修復、末端修復、ポリ－Ａテーリング、逆転写、ヌクレアーゼ消化、転位、メチル化、転写、ループ媒介等温増幅、本体標識、および末端標識を含む。したがって、一部の実施形態によれば、核酸含有試料は、増幅手順から得られる溶液で、増幅生成物、例えば、ＰＣＲ生成物を含む。ある特定の実施形態によれば、核酸含有試料は、アダプターライゲーションステップの結果として得られるアダプターライゲーション試料である。このような酵素反応では、未使用の反応物、酵素、反応副生成物、および反応緩衝液から所望する酵素反応生成物を精製することが望まれることがある。酵素反応生成物は、反応副生成物および未使用の反応物からサイズによって区別されることが多い。一部の実施形態では、大きなＰＣＲ増幅生成物は、小さなＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、およびプライマー二量体から精製される。その他の実施形態では、大きなライゲーション生成物、例えば、ｇＤＮＡ－アダプターは、小さなライゲーション前の投入物、例えば、ライゲーションしていないアダプターから精製される。
【0031】
一部の実施形態では、酵素反応はシークエンシングのためのライブラリー調製の一連のステップのうちの１つのステップである。シークエンシング反応のための典型的なライブラリー調製は、アダプターライゲーションを含む。典型的な実施形態によれば、アダプターは修飾または非修飾核酸オリゴマーである。アダプターはまた、酵素、その他のタンパク質、または、限定されないが、ビオチンを含むその他の非核酸分子と複合体化することができる。アダプターは、１本鎖、２本鎖であってもよく、ヘアピンを含有していてもよく、平滑末端または５′もしくは３′末端に突出する１つもしくは複数のヌクレオチドを有していてもよい。１本鎖アダプターは、試料核酸の５′または３′末端または５′および３′両末端に連結することができる。ヘアピンを有するものを含む２本鎖アダプターは、平滑末端または付着末端ライゲーションのいずれかによって連結することができる。
【0032】
ある特定の実施形態によれば、ヘアピンアダプターは、ポリメラーゼで促進されるプライマー伸長を利用して試料ＤＮＡ分子に結合することができる。
【0033】
ある特定の実施形態によれば、核酸含有試料は、シークエンシングライブラリーの調製中、特に、第３世代シークエンシングライブラリーの調製中に得られる。典型的な実施形態によれば、試料中の核酸分子は、５′または３′または３′および５′両末端に連結した核酸アダプター（本明細書で定義したアダプター等）を有する。したがって、試料は、連結していない試料核酸分子、連結した試料核酸分子、連結していないアダプター、連結したアダプター二量体、三量体、およびアダプターのその他の組み合わせ、ならびに、限定されないが、緩衝液種および酵素を含むその他の試薬を含んでいてもよい。本開示による方法は、５′および／または３′にアダプターが隣接しているＤＮＡ分子等の２本鎖または１本鎖核酸のサイズ選択的精製、それによるそれぞれの混入物の効率的除去を可能にする。
【0034】
ある特定の実施形態によれば、本開示による方法は、保護核酸分子を残すために未保護核酸分子を消化した後に使用される。消化には、これらに限定されないが、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼＩが含まれる。
【0035】
ある特定の実施形態によれば、この方法は、特定のサイズまたはサイズ範囲のライブラリー分子のみを選択するために、ライブラリー（最終ライブラリー分子）の完成後に使用される。その他の実施形態では、この方法は、特定のサイズまたはサイズ範囲の核酸分子のみがライブラリー調製に投入されるように、核酸開始材料に使用される。その他の実施形態では、サイズ選択はライブラリー調製の増幅ステップ後に実施される。その他の実施形態では、サイズ選択は、これら限定されないが、ライブラリー調製中のポリ－Ａテーリング、末端修復、ヌクレアーゼ消化、損傷修復、アダプターライゲーションおよび／または転位ステップの後に実施される。
【0036】
ショートリードエリミネーターサイズ選択
ある特定の実施形態では、ショートリードエリミネーターキットにおける沈殿緩衝液等の本開示の沈殿緩衝液は、大きな反応生成物（５０ｂｐ（もしくはｎｔ）から１０００ｋｂの範囲）の調整可能なカットオフを実現するために、核酸含有試料から取り出すための大きな核酸断片を選択することができる（ＳＲＥサイズ選択）。ある特定の実施形態では、本発明の方法を使用して得られた核酸の所望するサイズ範囲は、約１０００塩基対（ｂｐ）以上（２本鎖核酸について）もしくは１０００ヌクレオチド（ｎｔ）以上（１本鎖核酸について）、または≧約５０ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧１００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧２００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧３００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧４００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧５００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧６００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧７００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧８００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧９００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧１０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧１５００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧２０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧３０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧５０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧７０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧８０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧９０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧１００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧２００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧３００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧４００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧５００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧６００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧７００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧８００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧９００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧１０００００ｂｐ（もしくはｎｔ）で、≧２０００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧５０００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、または≧１００００００ｂｐ（もしくはｎｔ）である（本明細書では「ＳＲＥサイズ選択」とも称する）。
ある特定の実施形態では、ショートリードエリミネーターキットにおける沈殿緩衝液等の本開示の沈殿緩衝液は、大きな反応生成物（５０ｂｐ（もしくはｎｔ）から１０００ｋｂの範囲）の調整可能なカットオフを実現するために、核酸含有試料から取り出すための大きな核酸断片を選択することができる（ＳＲＥサイズ選択）。ある特定の実施形態では、本発明の方法を使用して得られた核酸の所望するサイズ範囲は、約１０００塩基対（ｂｐ）以上（２本鎖核酸について）もしくは１０００ヌクレオチド（ｎｔ）以上（１本鎖核酸について）、または≧約５０ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧１００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧２００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧３００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧４００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧５００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧６００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧７００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧８００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧９００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧１０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧１５００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧２０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧３０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧５０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧７０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧８０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧９０００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧１００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧２００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧３００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧４００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧５００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧６００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧７００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧８００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧９００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧１０００００ｂｐ（もしくはｎｔ）で、≧２０００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、≧５０００００ｂｐ（もしくはｎｔ）、または≧１００００００ｂｐ（もしくはｎｔ）である（本明細書では「ＳＲＥサイズ選択」とも称する）。
【0037】
一部の実施形態では、ＳＲＥサイズ選択工程にはＰＶＰおよび／またはＦｉｃｏｌｌを組み込む。本発明の方法で使用するために適切なＰＶＰ／Ｆｉｃｏｌｌ分子は、これらに限定されないが、ＰＶＰ（Ｍｗ１００００）、ＰＶＰ（Ｍｗ２９０００）、ＰＶＰ（Ｍｗ４００００）、ＰＶＰ（Ｍｗ５５０００）、ＰＶＰ（Ｍｗ３６００００）、ＰＶＰ（Ｍｗ１３０００００）等のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、および／またはＦｉｃｏｌｌ（Ｍｗ７００００）、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｍｗ４０００００）等のＦｉｃｏｌｌを含む。ＰＶＰのＭＷは、５０００から５００００００であってもよい。ＦｉｃｏｌｌのＭＷは、５０００から５００００００であってもよい。ＰＶＰおよび／またはＦｉｃｏｌｌの濃度は、約０％と約６０％との間で調節することができる。
【0038】
一部の実施形態では、サイズ選択沈殿ステップを使用する。この方法は、以下のように例示することができる：１）これらに限定されないが、水、緩衝液、塩、およびＰＶＰ（Ｍｗ３６００００）を含有する沈殿緩衝液を核酸含有試料に添加するステップ、２）試料緩衝液を室温で１００００ｇで３０分間遠心分離するステップであり、このステップの間に、核酸がチューブの底にペレットになるステップ、３）上清をチューブから除去するステップ、４）７０％アルコールをチューブに添加し、室温で１００００ｇで２分間遠心分離するステップ、５）７０％アルコール上清をチューブから除去し、核酸ペレットを溶出緩衝液に再懸濁するステップ。
【0039】
ある特定の実施形態では、ＳＲＥサイズ選択工程は、本明細書で記載した沈殿ステップにおけるＰＶＰおよび／またはＦｉｃｏｌｌの量（例えば、０．１％～４０％）および／または種類を最適化することによって調整する。ＰＶＰおよびＦｉｃｏｌｌの組み合わせも使用して、サイズ選択特性を微調整することができる。この組み合わせは、異なるＭＷのＰＶＰおよび／または異なるＭＷのＦｉｃｏｌｌの混合物を含むことができる。
【0040】
ある特定の実施形態では、ＳＲＥサイズ選択工程は、例えば、１０ｍＭと４Ｍとの間でＮａＣｌ濃度を最適化することによって調整する。ある特定の実施形態では、ＳＲＥサイズ選択工程は、沈殿結合時間（２～６０分）、温度（４～５０℃）、および／またはそれらの組み合わせを最適化することによって調整する。
【0041】
一部の実施形態では、ＳＲＥ選択工程のカットオフ値は、以下の沈殿条件：ｉ）ｐＨ、ｉｉ）塩濃度、ｉｉｉ）カオトロピック塩の有無、ｉｖ）１価および／または２価塩の有無、ｖ）アルコールの種類および濃度、ｖｉ）分子クラウダーの濃度および分子量、ｖｉｉ）分子クラウダーの種類、ｖｉｉｉ）沈殿時間、ｉｘ）沈殿中の温度、ｘ）変性剤の有無、ｘｉ）その他の分子種の有無、ｘｉｉ）緩衝液体積、ならびにｘｉｉｉ）それらの組み合わせ、の少なくとも１つによって調整する。
【0042】
ある特定の実施形態では、分子クラウダーを使用してサイズ選択のカットオフ値を調整する。分子クラウダーは、分子クラウダーおよび問題の分子種の両方の濃度およびサイズに強く依存するような方法で、分子種の溶液自由エネルギーを変化させる。これによって、核酸のサイズに強く依存されるような方法で、分子クラウダーを使用して核酸の溶解度を調整することができる。例えば、ある特定の実施形態では、高パーセンテージのＰＶＰ等の分子クラウダーは排除体積効果を増大させ、したがって、小さな分子がますます溶液から排出される。別の例では、高分子量の分子クラウダー、例えば、ＰＶＰ３６００００を使用して分子クラウディング効果を高分子に移動させ、優先的に大きなサイズの核酸を沈殿させ、凝集させることができる。
【0043】
高域、低域および帯域精製
ある特定の実施形態では、本発明の方法を使用してサイジングカットオフよりも大きい（すなわち、高域の）所望するサイズ範囲の核酸を回収することができる。例えば、高域方法を本明細書で説明する。
ある特定の実施形態では、本発明の方法を使用してサイジングカットオフよりも大きい（すなわち、高域の）所望するサイズ範囲の核酸を回収することができる。例えば、高域方法を本明細書で説明する。
【0044】
その他の実施形態では、本発明の方法を使用してサイジングカットオフよりも小さい（すなわち、低域）核酸を回収することができる。低域精製は、典型的には、以下の順番に従う：１）これらに限定されないが、水、緩衝液、塩、およびＰＶＰ（Ｍｗ３６００００）を含有する沈殿緩衝液を核酸含有試料に添加するステップ、２）試料緩衝液を室温で１００００×ｇで３０分間遠心分離するステップであり、このステップの間に、カットオフ値を上回るサイズの核酸がチューブの底にペレットになり、カットオフ値を下回るサイズの核酸が上清に残存したままになるステップ、３）上清をチューブから除去するステップ、４）例えば、より低いカットオフで再沈殿するか、またはその他の何らかの方法によってカットオフを上回る核酸を上清から精製することができるステップ。
【0045】
ある特定の実施形態では、本発明の方法の連続適用を使用して、最小と最大の間のＤＮＡサイズのバンド（すなわち、帯域）の選択を可能にすることができる。こうして、カットオフＣ１を上回るサイズの核酸分子をペレットにして、Ｃ１より小さい核酸分子を沈殿緩衝液の溶液中に残すような結合条件を使用する。次に、沈殿緩衝液を別の微量遠心分離管に移し、例えば、ＰＶＰ含量が高いさらなる緩衝液を元の緩衝液に添加する。次に、例えば、１００００×ｇで３０分間遠心分離する。緩衝液条件は、カットオフＣ２を上回るサイズの核酸分子が沈殿してペレットになるようにする。次に、この方法では、本開示の別のところで記載したように、洗浄および溶出が続く。最終的に回収された核酸分子は、Ｃ２の最小値とＣ１の最大値の間の域中で選択される。
【0046】
ある特定の実施形態では、精製は、高域画分および低域画分の両方が回収されるように進めることができる。高域方法は本明細書で記載した通りに従う。カットオフを下回るサイズの核酸を含有する沈殿緩衝液を取り出して、再精製して、カットオフサイズを下回るサイズの核酸分子を含有する核酸ストックを得る。
【0047】
シークエンシングライブラリー
本開示による方法は、シークエンシングライブラリー、例えば、第３世代シークエンシングライブラリーの場合のサイズ選択に特に適切である。第３世代シークエンシングに適切なシークエンシングライブラリーは、例えば、当業界で公知の方法を使用して調製することができる。このようなロングリードシークエンシング技術、例えば、数万またはさらに数十万の塩基対の配列のためのライブラリー調製は、類似のワークフローに従う。典型的には、高ＭＷ（５０ｋｂ～Ｍｂ＋）ＤＮＡを単離する。次に、この明細書に記載したようなＤＮＡサイズ選択を実施して、カットオフ長を下回る分子を除去し、それによって、シークエンシングデータにおけるロングリードの表現が増強される。次に、このサイズ選択されたＤＮＡは、典型的には、ライゲーション、末端修復、および標識等の様々な酵素反応を使用して、シークエンシングのために調製される。酵素処理中に、この明細書に記載されたようなサイズ選択は、ライブラリー生成物からプライマー二量体、酵素、およびアダプターオリゴ等のＤＮＡ分子のサイズ画分（例えば、５０ｎｔもしくはｂｐと１００００００ｎｔもしくはｂｐとの間の調整可能なカットオフ値を有するサイズ画分）を除去するために実施することができる。
本開示による方法は、シークエンシングライブラリー、例えば、第３世代シークエンシングライブラリーの場合のサイズ選択に特に適切である。第３世代シークエンシングに適切なシークエンシングライブラリーは、例えば、当業界で公知の方法を使用して調製することができる。このようなロングリードシークエンシング技術、例えば、数万またはさらに数十万の塩基対の配列のためのライブラリー調製は、類似のワークフローに従う。典型的には、高ＭＷ（５０ｋｂ～Ｍｂ＋）ＤＮＡを単離する。次に、この明細書に記載したようなＤＮＡサイズ選択を実施して、カットオフ長を下回る分子を除去し、それによって、シークエンシングデータにおけるロングリードの表現が増強される。次に、このサイズ選択されたＤＮＡは、典型的には、ライゲーション、末端修復、および標識等の様々な酵素反応を使用して、シークエンシングのために調製される。酵素処理中に、この明細書に記載されたようなサイズ選択は、ライブラリー生成物からプライマー二量体、酵素、およびアダプターオリゴ等のＤＮＡ分子のサイズ画分（例えば、５０ｎｔもしくはｂｐと１００００００ｎｔもしくはｂｐとの間の調整可能なカットオフ値を有するサイズ画分）を除去するために実施することができる。
【0048】
ある特定の実施形態では、シークエンシングライブラリーの調製は、核酸含有試料からの複数の２本鎖直鎖状ＤＮＡ断片作製を含むことが多い。例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等のＤＮＡは、その後のシークエンシングに適切なＤＮＡ断片をもたらすために、音波処理、水力剪断、超音波、噴霧、または酵素的断片化等の剪断によって断片化することができる。断片の長さは、その後シークエンシングのために使用されるシークエンシングプラットフォームのシークエンシング能力に基づいて選択することができる。本開示の一部の実施形態では、大きな核酸分子、例えば、５０ｂｐから１０００ｋｂｐの間の調整可能なカットオフ値を有する核酸分子を選択するために、本明細書で記載した方法を使用してライブラリーの調製中に大きな核酸断片を単離のために選択する。
【実施例】
【0049】
実施例１
この実施例では、１０００から１００００ｂｐの間の調整可能なカットオフサイズを上回る２本鎖ＤＮＡを回収する。カットオフサイズは、１０％以下の回収率を有する最高のＭＷバンドと定義される。この手法は、第３世代のロングリードシークエンシングに有用で、時間および試料を消費するＢＬＵＥ ＰＩＰＰＩＮ（商標）サイズ選択機器の代わりに使用することができる。
この実施例では、１０００から１００００ｂｐの間の調整可能なカットオフサイズを上回る２本鎖ＤＮＡを回収する。カットオフサイズは、１０％以下の回収率を有する最高のＭＷバンドと定義される。この手法は、第３世代のロングリードシークエンシングに有用で、時間および試料を消費するＢＬＵＥ ＰＩＰＰＩＮ（商標）サイズ選択機器の代わりに使用することができる。
【0050】
この実施例では、投入試料は、１ｋｂｐ ｐｌｕｓラダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．製品番号ＳＭ１３３１）１００ｎｇ／μｌおよびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社から購入したバクテリオファージラムダの４８５０２ｂｐ直鎖状ＤＮＡ２００ｎｇ／μｌを含有する混合物２５μｌであった。
【0051】
５Ｍ ＮａＣｌ ７．５μｌおよび２×ＰＶＰ（Ｍｗ＝３６００００）２５μｌの溶液を試料に添加し、タッピングによって混合した。２×ＰＶＰ溶液は、１０、８、６、４、３．５、および３％ｗｔ／ｖｏｌのポリビニルピロリドン（Ｍｗ＝３６００００）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号ＰＶＰ３６０－１００Ｇ）溶液であった。得られた溶液は、室温で８０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を除去すると、ＤＮＡペレットが残った。次に、７０％ＥｔＯＨ ２００μｌをチューブに添加して、室温で８０００ｇで２分間遠心分離した。ＥｔＯＨ上清は除去して、微量遠心分離管を室温で２分間放置することによってＤＮＡペレットを乾燥させた。ペレットを溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝９、ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ）２５μｌに再懸濁し、間歇的にタッピングしながら室温で１０分間インキュベートした。
【0052】
図１から明らかなように、ペレット形成緩衝液のＰＶＰ濃度が変化するにつれて、長さに依存して回収率に顕著な違いが生じる。ＤＮＡカットオフ（１０％以下の回収率を有する最高のＭｗバンドとして定義する）は、緩衝液中のＰＶＰ濃度を５％から１．５％に減少させるにつれて、１０００ｂｐから１００００ｂｐに変化する。
【0053】
高いサイズ選択カットオフは、平均シークエンシングリード長を延長させるために不可欠である。同時に、カットオフを上回る核酸の高い回収効率（＞３０％）および高速処理時間（＜３時間）も望ましい。この組み合わせは、これまでＰＶＰおよび／またはＦｉｃｏｌｌでのみ実現可能だった。
【0054】
実施例２
以下の例示的な手法は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮ／ＧｒｉｄＩＯＮ／ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮのために、ロングリードシークエンシングライブラリーを調製する前のＨＭＷ ｇＤＮＡのサイズ選択の詳細を示している。投入するＨＭＷ ＤＮＡの長さは＞５０ｋｂで、ＱＵＢＩＴ（商標）ＤＮＡ濃度は＞５０ｎｇ／μＬでなければならない。
以下の例示的な手法は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮ／ＧｒｉｄＩＯＮ／ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮのために、ロングリードシークエンシングライブラリーを調製する前のＨＭＷ ｇＤＮＡのサイズ選択の詳細を示している。投入するＨＭＷ ＤＮＡの長さは＞５０ｋｂで、ＱＵＢＩＴ（商標）ＤＮＡ濃度は＞５０ｎｇ／μＬでなければならない。
【0055】
１．ＤＮＡ試料を総量６０μＬおよびＱＵＢＩＴ（商標）ＤＮＡ濃度５０～１５０ｎｇ／μＬに調整する。試料を１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブにピペットで入れる。ＱＵＢＩＴ（商標）ｄｓＤＮＡ広範囲アッセイまたは同等物を使用して、濃度を測定する。ＴＥ緩衝液（ｐＨ８）または緩衝溶出緩衝液（ＥＢ）を使用して試料を希釈する。
【0056】
２．緩衝液ショートリードエリミネーター６０μＬを試料に添加する。チューブを軽くタッピングするか、または穏やかに上下にピペッティングすることによって、十分混合する。図２に示したステップ１を参照のこと。
【0057】
３．ヒンジをローターの外側に向けて、チューブを遠心分離機に装填する。
【0058】
４．室温（ＲＴ）で１００００×ｇで３０分間遠心分離する。温度制御（すなわち、冷却機能）付きの遠心分離機を使用する場合は、温度を２９℃に設定してこの機能を止める。図２に示したステップ２を参照のこと。
【0059】
５．ＤＮＡペレットをかき乱さないように、チューブから上清を除去する。ＤＮＡペレットは、ヒンジ領域の下のチューブの底に形成されることになる。
【0060】
６．７０％ＥｔＯＨ洗浄溶液２００μＬをチューブに添加して、ＲＴで１００００×ｇで２分間遠心分離する。７０％ＥｔＯＨを添加後は、タッピングしたり混合したりしない。チューブを直接遠心分離機に入れる。図２に示したステップ３を参照のこと。
【0061】
７．ＤＮＡペレットをかき乱さないように、チューブから洗浄溶液を除去する。
【0062】
８．ステップ６およびステップ７を繰り返す。
【0063】
９．緩衝溶出緩衝液（ＥＢ）５０～１００μＬをチューブに添加し、５０℃で１時間インキュベートする。緩衝液の体積を調整して、所望する濃度を実現する。
【0064】
１０．インキュベーション後、チューブを軽くタッピングして、確実にＤＮＡを適切に懸濁して混合する。図２に示したステップ４を参照のこと。
【0065】
１１．ＮａｎｏＤｒｏｐおよびＱＵＢＩＴ（商標）によってＤＮＡの回収率および純度を分析する。
【0066】
実施例３
Ｃｉｒｃｕｌｏｍｉｃｓショートリードエリミネーター（ＳＲＥ）キットは、高分子（ＨＭＷ）ＤＮＡの迅速な高域サイズ選択のために使用することができる。この方法では、２５ｋｂまでの長さの短いＤＮＡを徐々に除去することによって、平均リード長を延長することができる。ショートリードエリミネーター（ＳＲＥ）キットを使用してサイズ選択されたＨＭＷ ｇＤＮＡの１％アガロースゲル分離の画像を示す図３Ａを参照のこと。サイジングカットオフは、添加したラダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ １ｋｂ Ｐｌｕｓ、＃ＳＭ１３３４）を使用して実証した。投入したのは、ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢ ＢｉｇＤＮＡキット＋ラダー２０ｎｇ／μＬを使用してＧＭ１２８７８細胞から抽出したｇＤＮＡ５０ｎｇ／μＬであった。リード長Ｎ５０は、試料の品質に応じて１０～２５ｋｂ増加させることができる。Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮ／ＧｒｉｄＩＯＮ／ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮシークエンシングプラットフォームでのキットの使用例は、実施例４および５に示されている。このキットでは、標準的なエタノール沈殿技術と同様の遠心分離手順を使用する。
Ｃｉｒｃｕｌｏｍｉｃｓショートリードエリミネーター（ＳＲＥ）キットは、高分子（ＨＭＷ）ＤＮＡの迅速な高域サイズ選択のために使用することができる。この方法では、２５ｋｂまでの長さの短いＤＮＡを徐々に除去することによって、平均リード長を延長することができる。ショートリードエリミネーター（ＳＲＥ）キットを使用してサイズ選択されたＨＭＷ ｇＤＮＡの１％アガロースゲル分離の画像を示す図３Ａを参照のこと。サイジングカットオフは、添加したラダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ １ｋｂ Ｐｌｕｓ、＃ＳＭ１３３４）を使用して実証した。投入したのは、ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢ ＢｉｇＤＮＡキット＋ラダー２０ｎｇ／μＬを使用してＧＭ１２８７８細胞から抽出したｇＤＮＡ５０ｎｇ／μＬであった。リード長Ｎ５０は、試料の品質に応じて１０～２５ｋｂ増加させることができる。Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮ／ＧｒｉｄＩＯＮ／ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮシークエンシングプラットフォームでのキットの使用例は、実施例４および５に示されている。このキットでは、標準的なエタノール沈殿技術と同様の遠心分離手順を使用する。
【0067】
このサイズ選択方法では、典型的には、５０～１５０ｎｇ／μＬのＱＵＢＩＴ（商標）ＤＮＡ投入濃度を使用する。ＤＮＡ試料濃度はＱＵＢＩＴ（商標）またはＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって測定することを推奨する。低濃度のＤＮＡを使用すると、一般的に回収効率が低下する。ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢ ＢｉｇＤＮＡキットを投入物として使用して、抽出されたＤＮＡでＳＲＥキットを使用した場合の予測収率を表１に示す。
【表1】
【0068】
図３Ｂは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ ４２００を使用して分析した図３Ａの試料のゲル分離の画像を示した図である。アガロースゲルおよびＣＥ分析で見られるように、長さが＜１０ｋｂのＤＮＡはほぼ完全に除去された。１０～２５ｋｂのＤＮＡは徐々に除去された。ＨＭＷ ＤＮＡの回収率は約６０％であった。
【0069】
実施例４
ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢ ＢｉｇＤＮＡキットを使用してＧＭ１２８７８細胞からＨＭＷ ＤＮＡを抽出し、針剪断を５回行い、その後ライゲーションシークエンシングキット（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９）を使用してＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＧｒｉｄＩＯＮ（ＦＬＯ－ＭＩＮ１０６Ｄ）で配列決定した。ショートリードエリミネーターキットを使用するＨＭＷ ＤＮＡのサイズ選択によって、Ｎ５０が２５．５ｋｂから３６ｋｂに増加した。図４を参照のこと。この実施例の結果を表２にさらにまとめて示す。
ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢ ＢｉｇＤＮＡキットを使用してＧＭ１２８７８細胞からＨＭＷ ＤＮＡを抽出し、針剪断を５回行い、その後ライゲーションシークエンシングキット（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９）を使用してＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＧｒｉｄＩＯＮ（ＦＬＯ－ＭＩＮ１０６Ｄ）で配列決定した。ショートリードエリミネーターキットを使用するＨＭＷ ＤＮＡのサイズ選択によって、Ｎ５０が２５．５ｋｂから３６ｋｂに増加した。図４を参照のこと。この実施例の結果を表２にさらにまとめて示す。
【表2】
【0070】
実施例５
Ｑｉａｇｅｎ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキットを使用してＧＭ１２８７８細胞からＨＭＷ ＤＮＡを抽出し、その後ライゲーションシークエンシングキット（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９）を使用してＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮ（ＦＬＯ－ＰＲＯ００２）で配列決定した。ショートリードエリミネーターキットを使用するＨＭＷ ＤＮＡのサイズ選択によって、Ｎ５０が１７．６ｋｂから４０．６ｋｂに増加した。図３を参照のこと。この実施例の結果を表３にさらにまとめて示す。
Ｑｉａｇｅｎ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキットを使用してＧＭ１２８７８細胞からＨＭＷ ＤＮＡを抽出し、その後ライゲーションシークエンシングキット（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９）を使用してＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮ（ＦＬＯ－ＰＲＯ００２）で配列決定した。ショートリードエリミネーターキットを使用するＨＭＷ ＤＮＡのサイズ選択によって、Ｎ５０が１７．６ｋｂから４０．６ｋｂに増加した。図３を参照のこと。この実施例の結果を表３にさらにまとめて示す。
【表3】
【0071】
実施例６
以下の手法は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮ／ＧｒｉｄＩＯＮ／ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮシークエンシングのためのＳＱＫ－ＬＳＫ１０９ライブラリー調製手法における、各反応ステップ後のショートリードエリミネーターキットの使用の詳細を示している。ＨＭＷ ＤＮＡは、ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢ ＢｉｇＤＮＡキットおよび５回の２６Ｇ針剪断を使用して、ＧＭ１２８７８細胞から抽出した。
以下の手法は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮ／ＧｒｉｄＩＯＮ／ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮシークエンシングのためのＳＱＫ－ＬＳＫ１０９ライブラリー調製手法における、各反応ステップ後のショートリードエリミネーターキットの使用の詳細を示している。ＨＭＷ ＤＮＡは、ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢ ＢｉｇＤＮＡキットおよび５回の２６Ｇ針剪断を使用して、ＧＭ１２８７８細胞から抽出した。
【0072】
ＤＮＡ試料は、総体積を４８μＬに、ＱＵＢＩＴ（商標）ＤＮＡ濃度を８３ｎｇ／μＬに調整した。試料は、ピペットで１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブに入れた。
【0073】
ＮＥＢＮｅｘｔ ＦＦＰＥ ＤＮＡ修復緩衝液３．５μＬ、ＮＥＢＮｅｘｔ ＦＦＰＥ ＤＮＡ修復ミックス２μＬ、ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｅｎｄ－ｐｒｅｐ反応緩衝液３．５μＬ、ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ ＩＩＥｎｄ－ｐｒｅｐ酵素ミックス３μＬを試料に添加し、総反応体積を６０μＬにして、試料をタッピングして混合し、沈降させた。
【0074】
反応液は、２０℃で５分間および６５℃で５分間インキュベートした。
【0075】
緩衝液ショートリードエリミネーター（ＳＲＥ）６０μＬを試料に添加し、軽くタッピングすることによって十分に混合した。図２に示したステップ１を参照のこと。
【0076】
チューブは、ヒンジをローターの外側に向けて遠心分離機に装填した。
【0077】
チューブは、室温（ＲＴ）で１００００×ｇで３０分間遠心分離した。図２に示したステップ２を参照のこと。
【0078】
上清は、ＤＮＡペレットをかき乱さないようにチューブから除去した。
【0079】
７０％ＥｔＯＨ洗浄溶液２００μＬをチューブに添加して、ＲＴで１００００×ｇで２分間遠心分離した。図２に示したステップ３を参照のこと。
【0080】
洗浄溶液は、ＤＮＡペレットをかき乱さないようにチューブから除去した。
【0081】
本明細書［００７９］に記載のステップおよび本明細書［００８０］に記載のステップを反復した。
【0082】
ヌクレアーゼを含まない水６１μｌをチューブに添加して、室温で１０分間インキュベートした。
【0083】
インキュベーション後、チューブを軽くタッピングして、確実にＤＮＡを適切に懸濁して混合した。図２に示したステップ４を参照のこと。
【0084】
ＱＵＢＩＴ（商標）ＤＮＡ濃度は、溶出ＤＮＡ溶液１μＬを使用して測定し、２５．６ｎｇ／μＬであることがわかった。
【0085】
Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳＱＫ－ＬＳＫ１０９キットのライゲーション緩衝液（ＬＮＢ）２５μＬ、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｑｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１０μＬ、およびＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳＱＫ－ＬＳＫ１０９キットのアダプターミックス（ＡＭＸ）５μＬを［００８３］に記載のステップからの溶出ＤＮＡ溶液に添加し、総ライゲーション反応体積１００μＬを得た。
【0086】
ライゲーション反応溶液を室温で１０分間インキュベートした。
【0087】
緩衝液ショートリードエリミネーター（ＳＲＥ）１００μＬを試料に添加し、軽くタッピングすることによって十分に混合した。図２に示したステップ１を参照のこと。
【0088】
チューブは、ヒンジをローターの外側に向けて遠心分離機に装填した。
【0089】
チューブは、室温（ＲＴ）で１００００×ｇで３０分間遠心分離した。図２に示したステップ２を参照のこと。
【0090】
上清は、ＤＮＡペレットをかき乱さないようにチューブから除去した。
【0091】
Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９キットのロングフラグメント緩衝液（ＬＦＢ）２５０μＬをチューブに添加して、ＲＴで１００００×ｇで２分間遠心分離した。図２に示したステップ３を参照のこと。
【0092】
ＬＦＢは、ＤＮＡペレットをかき乱さないようにチューブから除去した。
【0093】
本明細書［００９１］に記載のステップおよび本明細書［００９２］に記載のステップを繰り返した。
【0094】
Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９キットの溶出緩衝液（ＥＢ）２０μＬをチューブに添加して、室温で２０分間インキュベートした。
【0095】
インキュベーション後、チューブを軽くタッピングして、確実にＤＮＡを適切に懸濁して混合した。図２に示したステップ４を参照のこと。
【0096】
ＱＵＢＩＴ（商標）ＤＮＡ濃度は、本明細書［００９５］に記載のステップで生成したシークエンシングライブラリー１μＬを使用して測定し、７６．２ｎｇ／μＬであることがわかった。
【0097】
生成したライブラリーは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮ（ＦＬＯ－ＭＩＮ１０６Ｄ）で配列決定し、２５ｋｂのＮ５０が得られた。図６は、このシークエンシング実行で生成されたリード長分布を示している。ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９ライブラリー調製手法のエンドプレップおよびライゲーション反応後のサイズ選択にショートリードエリミネーターを使用することによって、約１５ｋｂ未満のリードがほとんどなくなったことがわかる。
【0098】
実施例７
この実施例は、本明細書で記載した方法を使用して、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸試料からＲＮＡを除去することができることを実証している。全核酸は、培養した大腸菌細胞１０億個からＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢキットを使用して抽出した。ＤＮＡ濃度は９０ｎｇ／μｌで、ＲＮＡ濃度は３３５ｎｇ／μｌであった。この試料６０μＬを小分けして、以下の手法に従った。
この実施例は、本明細書で記載した方法を使用して、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸試料からＲＮＡを除去することができることを実証している。全核酸は、培養した大腸菌細胞１０億個からＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢキットを使用して抽出した。ＤＮＡ濃度は９０ｎｇ／μｌで、ＲＮＡ濃度は３３５ｎｇ／μｌであった。この試料６０μＬを小分けして、以下の手法に従った。
【0099】
１．緩衝液ショートリードエリミネーター６０μＬを試料に添加する。チューブを軽くタッピングするか、または穏やかに上下にピペッティングすることによって、十分混合する。
【0100】
２．ヒンジをローターの外側に向けて、チューブを遠心分離機に装填する。
【0101】
３．室温（ＲＴ）で１００００×ｇで３０分間遠心分離する。温度制御（すなわち、冷却機能）付きの遠心分離機を使用する場合は、温度を２９℃に設定してこの機能を止める。
【0102】
４．ＤＮＡペレットをかき乱さないように、チューブから上清を除去する。ＤＮＡペレットは、ヒンジ領域の下のチューブの底に形成されることになる。
【0103】
５．７０％ＥｔＯＨ洗浄溶液２００μＬをチューブに添加して、ＲＴで１００００×ｇで２分間遠心分離する。７０％ＥｔＯＨを添加後は、タッピングしたり混合したりしない。チューブを遠心分離機に直接入れる。
【0104】
６．核酸ペレットをかき乱さないように、チューブから洗浄溶液を除去する。
【0105】
７．ステップ６およびステップ７を繰り返す。
【0106】
８．緩衝溶出緩衝液（ＥＢ）５０～１００μＬをチューブに添加し、５０℃で１時間インキュベートする。緩衝液の体積を調整して、所望する濃度を実現する。
【0107】
９．インキュベーション後、チューブをタッピングして、確実に核酸を適切に懸濁して混合する。
【0108】
１０．ＮａｎｏＤｒｏｐおよびＱＵＢＩＴ（商標）によってＤＮＡの回収率および純度を分析する。
【0109】
回収された投入ＤＮＡおよびＲＮＡのパーセンテージを図７に示す。例として、ＳＲＥ ＸＳは、ｄｓＤＮＡおよびＲＮＡ ＱＵＢＩＴ（商標）アッセイによって測定すると、投入ＤＮＡの８２％および投入ＲＮＡの６％が回収される。したがって、試料のＤＮＡ含量は高くなる。
【0110】
実施例８
この実施例では、１５００から３０００ｂｐの間の調整可能なカットオフサイズを上回る２本鎖ＤＮＡを回収する。カットオフサイズは、１０％以下の回収率を有する最高のＭｗバンドと定義される。この手法は、第３世代のロングリードシークエンシングに有用で、時間および試料を消費するＢＬＵＥ ＰＩＰＰＩＮ（商標）サイズ選択機器の代わりに使用することができる。
この実施例では、１５００から３０００ｂｐの間の調整可能なカットオフサイズを上回る２本鎖ＤＮＡを回収する。カットオフサイズは、１０％以下の回収率を有する最高のＭｗバンドと定義される。この手法は、第３世代のロングリードシークエンシングに有用で、時間および試料を消費するＢＬＵＥ ＰＩＰＰＩＮ（商標）サイズ選択機器の代わりに使用することができる。
【0111】
この実施例では、投入試料は、１ｋｂｐ ｐｌｕｓラダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．製品番号ＳＭ１３３１）２０ｎｇ／μｌおよびＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢキットを使用して、５ｘ１０６個のＧＭ１２８７８細胞から抽出したゲノムＤＮＡ１００ｎｇ／μｌを含有する混合物４０μｌであった。
【0112】
試料ａ）の場合、ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢキットの溶出緩衝液１０μｌおよびＦｉｃｏｌｌ－４００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｆ４３７５－１０Ｇ）の４０％ｗｔ／ｖｏｌストック５０μｌおよびＮａＣｌ １．５Ｍ溶液を試料に添加した。これによって、Ｆｉｃｏｌｌ－４００の最終濃度は２０％、ＮａＣｌの最終濃度は０．７５Ｍになった。
【0113】
試料ｂ）の場合、３ｍｇ／ｍｌ線状アクリルアミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．製品番号ＡＭ９５２０）５μｌおよび５Ｍ ＮａＣｌ５μｌおよびＦｉｃｏｌｌ－４００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｆ４３７５－１０Ｇ）溶液の４０％ｗｔ／ｖｏｌストック５０μｌを試料に添加した。これによって、Ｆｉｃｏｌｌ－４００の最終濃度は２０％、ＮａＣｌの最終濃度は１Ｍ、および線状アクリルアミドの最終濃度は０．１５ｍｇ／μｌになった。
【0114】
試料ｃ）の場合、３ｍｇ／ｍｌグリコーゲン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．製品番号ＡＭ９５１０）５μｌおよび５Ｍ ＮａＣｌ５μｌおよびＦｉｃｏｌｌ－４００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｆ４３７５－１０Ｇ）溶液の４０％ｗｔ／ｖｏｌストック５０μｌを試料に添加した。これによって、Ｆｉｃｏｌｌ－４００の最終濃度は２０％、ＮａＣｌの最終濃度は１Ｍ、およびグリコーゲンの最終濃度は０．１５ｍｇ／μｌになった。
【0115】
図８から明らかなように、Ｆｉｃｏｌｌ／ＮａＣｌ溶液を使用して、サイズに依存した方法でＤＮＡを沈殿させることができる。試料ａ）のカットオフは約３ｋｂである。沈殿緩衝液に線状アクリルアミドも含まれている試料ｂ）のカットオフは約１．５ｋｂである。沈殿緩衝液にグリコーゲンも含まれている試料ｃ）のカットオフは約１．５ｋｂである。
【0116】
実施例９
ＨＭＷ ＤＮＡは、核単離の代わりに直接植物組織溶解を使用するのに適合した、ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅｉ ＢｉｇＤＮＡキットを使用して、カスミ草植物の葉から抽出した。クリーンアップは、Ｃｉｒｃｕｌｏｍｉｃｓショートリードエリミネーターキットを使用して実施した。抽出したＤＮＡの濃度は５０ｎｇ／μＬで、紫外線吸収の比は２６０ｎｍ／２８０ｎｍ＝１．８３および２６０ｎｍ／２３０ｎｍ＝１．７１であった。クリーンアップ後、濃度は２３．４０ｎｇ／μＬで、紫外線吸収の比は２６０ｎｍ／２８０ｎｍ＝１．９３および２６０ｎｍ／２３０ｎｍ＝２．１６であった。
ＨＭＷ ＤＮＡは、核単離の代わりに直接植物組織溶解を使用するのに適合した、ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅｉ ＢｉｇＤＮＡキットを使用して、カスミ草植物の葉から抽出した。クリーンアップは、Ｃｉｒｃｕｌｏｍｉｃｓショートリードエリミネーターキットを使用して実施した。抽出したＤＮＡの濃度は５０ｎｇ／μＬで、紫外線吸収の比は２６０ｎｍ／２８０ｎｍ＝１．８３および２６０ｎｍ／２３０ｎｍ＝１．７１であった。クリーンアップ後、濃度は２３．４０ｎｇ／μＬで、紫外線吸収の比は２６０ｎｍ／２８０ｎｍ＝１．９３および２６０ｎｍ／２３０ｎｍ＝２．１６であった。
【0117】
実施例１０
ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢ ＢｉｇＤＮＡキットを使用してＧＭ１２８７８細胞からＨＭＷ ＤＮＡを抽出し、針剪断を５回行い、その後ＳＭＲＴｂｅｌｌ発現鋳型調製キット２．０（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製品番号１００－９３８－９００）を使用してＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩで配列決定した。サイズ選択は「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ－Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｇＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＳＭＲＴｂｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ２．０」（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ １０１－６９３－８００ Ｖｅｒｓｉｏｎ １（Ｊａｎｕａｒｙ ２０１９））で詳述されているように、アダプターライゲーションおよびＡＭＰｕｒｅＰＢビーズクリーンアップ後にＣｉｒｃｕｌｏｍｉｃｓショートリードエリミネーターキットを使用して実施した。配列決定の実行により、サブリード長Ｎ５０が２８．５ｋｂの１１９Ｇｂが作製された。
ＮＡＮＯＢＩＮＤ（商標）ＣＢＢ ＢｉｇＤＮＡキットを使用してＧＭ１２８７８細胞からＨＭＷ ＤＮＡを抽出し、針剪断を５回行い、その後ＳＭＲＴｂｅｌｌ発現鋳型調製キット２．０（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製品番号１００－９３８－９００）を使用してＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩで配列決定した。サイズ選択は「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ－Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｇＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＳＭＲＴｂｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ２．０」（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ １０１－６９３－８００ Ｖｅｒｓｉｏｎ １（Ｊａｎｕａｒｙ ２０１９））で詳述されているように、アダプターライゲーションおよびＡＭＰｕｒｅＰＢビーズクリーンアップ後にＣｉｒｃｕｌｏｍｉｃｓショートリードエリミネーターキットを使用して実施した。配列決定の実行により、サブリード長Ｎ５０が２８．５ｋｂの１１９Ｇｂが作製された。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】