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特表2023-507034ゲノム編集効率を向上させる融合タンパク質及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-20
(54)【発明の名称】ゲノム編集効率を向上させる融合タンパク質及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230213BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230213BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20230213BHJP
C12N 9/78 20060101ALI20230213BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230213BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230213BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20230213BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230213BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230213BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20230213BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20230213BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20230213BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230213BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230213BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20230213BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230213BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20230213BHJP
A61K 35/18 20150101ALI20230213BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230213BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230213BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20230213BHJP
C12N 15/861 20060101ALN20230213BHJP
C12N 15/86 20060101ALN20230213BHJP
C12N 15/869 20060101ALN20230213BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/55
C12N9/78
C12N5/10
C12N5/0783
C12N5/078
C12N15/867 Z
C07K19/00
C07K14/47
A61K38/43
A61P7/06
A61P43/00 105
A61K48/00
A61K31/7105
A61K35/17 Z
A61K35/28
A61K35/18 Z
A61K35/761
A61K35/76
C12N15/113 Z
C12N15/861 Z
C12N15/86 Z
C12N15/869
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022538379
(86)(22)【出願日】2020-12-17
(85)【翻訳文提出日】2022-06-20
(86)【国際出願番号】 CN2020137239
(87)【国際公開番号】W WO2021121321
(87)【国際公開日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】201911310969.8
(32)【優先日】2019-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201911312544.0
(32)【優先日】2019-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201911312537.0
(32)【優先日】2019-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513263765
【氏名又は名称】イースト チャイナ ノーマル ユニバーシティ
(71)【出願人】
【識別番号】522021985
【氏名又は名称】上海邦耀生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＬ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リー、ターリー
(72)【発明者】
【氏名】チャン、シアオホイ
(72)【発明者】
【氏名】リウ、ミンヤオ
(72)【発明者】
【氏名】チュー、ピーユン
(72)【発明者】
【氏名】チェン、リャン
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050DD07
4B050LL01
4B065AA93X
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA21
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA53
4C084DC22
4C084NA14
4C084ZA55
4C084ZB21
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA55
4C086ZB21
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB36
4C087BB37
4C087BB44
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA55
4C087ZB21
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA11
4H045CA40
4H045DA89
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
ゲノム編集効率を向上させる融合タンパク質及びその使用を提供する。前記融合タンパク質は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメイン、ヌクレオシドデアミナーゼ及びヌクレアーゼを含む。ＣＢＥｓによるＣ－Ｇ～Ｔ－Ａ塩基の変換過程において、ヌクレオシドデアミナーゼ、例えばシチジンデアミナーゼは一本鎖ＤＮＡを基質として脱アンモニアを行い、ヌクレオシドデアミナーゼ及びヌクレアーゼの融合タンパク質に一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインを再融合することにより、一本鎖ＤＮＡがヌクレオシドデアミナーゼに暴露する機会を大幅に増加させ、それによって塩基編集効率を明らかに向上させる。単一塩基ゲノム編集技術に対して飛躍的な改良を行い、ゲノム編集、遺伝子治療、細胞治療、動物モデル作製、作物遺伝育種などの面へのその使用を大幅に促進することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム編集効率を向上させる融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメイン、ヌクレオシドデアミナーゼ及びヌクレアーゼを含む、ことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項2】
前記融合タンパク質の接続順は、前記ヌクレオシドデアミナーゼが前記ヌクレアーゼのＮ端又はＣ端に位置し、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインが前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼのＮ端、Ｃ端及び／又は前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼとの間に位置する、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記ヌクレオシドデアミナーゼが前記ヌクレアーゼのＮ端に位置する、ことを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインが前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼとの間に位置する、ことを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及び／又は非配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記非配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＰＡ７０、ＲＰＡ３２、ＢＲＣＡ２、ｈｎＲＮＰＫ、ＰＵＦ６０及びＲａｄ５１のうちのいずれか１つ又は複数から選ばれ、前記配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＴＥＢＰ、Ｔｅｂ１及びＰＯＴ１のうちのいずれか１つ又は複数から選ばれる、ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のＯＢ折り畳み、ＫＨドメイン、ＲＲＭＳ、渦状ドメインという４つのドメインのうちの少なくとも１つ又は４つのドメインのうちの一本鎖ＤＮＡと結合する機能を有する一部ポリペプチドフラグメント及びその任意の組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインは、Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメイン及び／又はＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインを含む、ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示される配列を含み、及び／又は、前記Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメインのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で示される配列を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１で示される配列を含み、及び／又は、前記ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２で示される配列を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
（欠落）
【請求項12】
前記デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記シチジンデアミナーゼは、ラット由来シチジンデアミナーゼを含む、ことを特徴とする請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
前記ラット由来シチジンデアミナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３で示される配列を含み、及び／又は、前記ラット由来シチジンデアミナーゼのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４で示される配列を含む、ことを特徴とする請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
前記シチジンデアミナーゼは、ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａを含む、ことを特徴とする請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項16】
前記ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３で示される配列を含み、及び／又は、前記ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４で示される配列を含む、ことを特徴とする請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項17】
前記シチジンデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａの突然変異体を含み、前記突然変異体は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａの５７番目のアスパラギンをグリシンに突然変異させたものである、ことを特徴とする請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項18】
前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａは、ヒトに由来する、ことを特徴とする請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項19】
前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３で示される配列を含み、及び／又は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４で示される配列を含む、ことを特徴とする請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項20】
前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５で示される配列を含み、及び／又は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６で示される配列を含む、ことを特徴とする請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項21】
前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｃｐｆ１のうちの１つ又はいずれか複数から選ばれる、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項22】
前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、ことを特徴とする請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項23】
前記Ｃａｓ９は、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌又はサーモフィルス菌に由来するＣａｓ９から選ばれる、ことを特徴とする請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項24】
前記Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９突然変異体ＶＱＲ－ｓｐＣａｓ９、ＶＲＥＲ－ｓｐＣａｓ９、又はｓｐＣａｓ９ｎから選ばれる、ことを特徴とする請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項25】
前記ｓｐＣａｓ９ｎのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５で示される配列を含み、及び／又は、前記ｓｐＣａｓ９ｎのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６で示される配列を含む、ことを特徴とする請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項26】
前記融合タンパク質は、ＮＬＳをさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項27】
前記ＮＬＳは、前記融合タンパク質の少なくとも一端に位置する、ことを特徴とする請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項28】
前記ＮＬＳのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７で示される配列を含み、及び／又は、前記ＮＬＳのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８で示される配列を含む、ことを特徴とする請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項29】
前記融合タンパク質は、２つ以上のコピーのＵＧＩをさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項30】
前記ＵＧＩは、前記融合タンパク質の少なくとも一端に位置する、ことを特徴とする請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項31】
前記ＵＧＩのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９で示される配列を含み、及び／又は、前記ＵＧＩのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０で示される配列を含む、ことを特徴とする請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項32】
Ａ）請求項１～３１のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子、Ｂ）Ａ）に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター、
Ｃ）請求項１～３１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有するか、又はＡ）に記載の遺伝子を含有する組み換え細胞又は組み換え体のＡ）～Ｃ）生体材料のうちのいずれか１つ。
【請求項33】
前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞である、ことを特徴とする請求項３２に記載の生体材料。
【請求項34】
細胞内の標的遺伝子に対してゲノム編集を行うｓｇＲＮＡであって、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７～３６のうちの少なくとも１つを含む、ことを特徴とするｓｇＲＮＡ。
【請求項35】
前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞である、ことを特徴とする請求項３４に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項36】
前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である、ことを特徴とする請求項３４に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項37】
単一塩基ゲノム編集システムであって、前記システムは、請求項１～３１のいずれか１項に記載の融合タンパク質、及び／又は請求項３２又は３３に記載の生体材料、及び前記融合タンパク質が目的細胞における標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導するｓｇＲＮＡを含む、ことを特徴とする単一塩基ゲノム編集システム。
【請求項38】
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７～３６のうちの少なくとも１つを含み、及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞であり、
及び／又は、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である、ことを特徴とする請求項３７に記載の単一塩基ゲノム編集システム。
【請求項39】
ゲノム編集製品、疾患治療及び／又は予防製品、動物モデル、又は植物新品種の製造における、請求項１～３１のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項３２又は３３に記載の生体材料、請求項３４～３６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、又は請求項３７又は３８に記載の単一塩基ゲノム編集システムの使用。
【請求項40】
前記疾患は、β異常ヘモグロビン症であり、前記β異常ヘモグロビン症は、β地中海貧血及び／又は鎌状赤血球貧血症を含む、ことを特徴とする請求項３９に記載の応用。
【請求項41】
請求項１～３１のいずれか１項に記載の融合タンパク質とｓｇＲＮＡを用いて細胞に導入し、標的遺伝子に対してゲノム編集を行う工程を含む単一塩基ゲノム編集効率を向上させる方法であって、前記ｓｇＲＮＡは、前記融合タンパク質が前記標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導する、方法。
【請求項42】
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７～３６のうちの少なくとも１つを含み、及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞であり、
及び／又は、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である、ことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
請求項１～３１のいずれか１項に記載の融合タンパク質とｓｇＲＮＡを用いて動物細胞に導入し、標的遺伝子に対してゲノム編集を行う工程を含む、ことを特徴とする疾患動物モデルの構築方法。
【請求項44】
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７～３６のうちの少なくとも１つを含む、ことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６で示される配列を含み、前記標的遺伝子は、ＤＭＤ遺伝子を含む、ことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記動物は、哺乳動物であり、及び／又は、前記細胞は、胚細胞であり、
及び／又は、前記導入の方式は、ベクター形質転換、微量注入、トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヒートショック、エレクトロポレーション、形質導入、遺伝子銃、ＤＥＡＥ－グルカン媒介の転移のうちの１つ又はいずれか幾つかの組み合わせであり、
及び／又は、前記導入は、請求項１～３１のいずれか１項に記載の融合タンパク質のｍＲＮＡと前記ｓｇＲＮＡを用いて行われる、ことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項47】
前記哺乳動物は、ラット又はマウスであり、及び／又は、前記導入の方式が微量注入である場合、前記導入で使用される請求項１～３１のいずれか１項に記載の融合タンパク質のｍＲＮＡの濃度は、１～１０００ｎｇ／μＬである、ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記導入で使用される請求項１～３１のいずれか１項に記載の融合タンパク質のｍＲＮＡと前記導入で使用される前記ｓｇＲＮＡとの濃度比は、１：（５～１）である、ことを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
医薬のスクリーニング、疾患治療効果評価又は疾患治療メカニズム研究における、請求項４３～４８のいずれか１項に記載の方法で得られた動物モデルの使用。
【請求項50】
β異常ヘモグロビン症を治療及び／又は予防するための製品であって、前記製品には、請求項３２のＡ）における前記遺伝子と、ｓｇＲＮＡの送達ベクターとを含み、前記ｓｇＲＮＡは、前記融合タンパク質が目的細胞における標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導し、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である、ことを特徴とする製品。
【請求項51】
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５で示される配列を含み、及び／又は、前記β異常ヘモグロビン症は、β地中海貧血及び／又は鎌状赤血球貧血症を含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞である、ことを特徴とする請求項５０に記載の製品。
【請求項52】
前記送達ベクターは、ウイルスベクター、及び／又は非ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及び／又は腫瘍溶解性ウイルスベクターを含み、前記非ウイルスベクターは、陽イオン高分子ポリマー、及び／又はリポソームを含む、ことを特徴とする請求項５０に記載の製品。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、具体的には、ゲノム編集効率を向上させる融合タンパク質及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
いよいよ２０１３年より、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を代表とする新世代ゲノム編集技術は生物学分野の各実験に導入され、従来の遺伝子操作手段を変えた。２０１６年４月、Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕ実験室は単一塩基ゲノム編集技術について初めて報告し、その後、シチジンデアミナーゼ原理に基づく他のタイプの単一塩基ゲノム編集技術（例えばヤツメウナギとヒト由来シチジンデアミナーゼは異なる方式でｄＣａｓ９又はＣａｓ９ｎと融合する）も相次いで報告される。それはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９において化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｓｐＣａｓ９に由来し、ＮＧＧをＰＡＭ（間隔配列前駆体近傍モチーフ）とし、かつＤＮＡを識別及び特異的に結合し、ＮＧＧの上流でＣ～Ｔ又はＧ～Ａの単一塩基変異を実現する。
【0003】
単一塩基ゲノム編集技術は、ゲノムの遺伝子突然変異又は修復、疾患動物モデルの作製、遺伝子治療を効率的に行うことに用いられるように報告されている。現在、発見された単一塩基ゲノム編集ツールにおいてＢＥ３（塩基エディタ３）が最も幅広く応用される。ＢＥ３は最大３７％の塩基置換効率で、相同組み換えで実現された効率よりはるかに高く、同時に比較的低いオフターゲット効果を保持することで、それがゲノムの単一塩基変異修飾又は単一塩基変異治療に用いられる巨大な潜在力を示す。研究に伴って、追加の２つ以上のコピーされたＵＧＩ（ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ阻害剤）をＢＥ３に導入することにより、その編集効率及び生成物の純度をさらに向上させることができることを発見する。二重分割ＮＬＳ（核局在シグナル）及びコドン化、即ちＢＥ４ｍａｘを導入し、その編集効率がさらに向上される。これらの方法はいずれもある程度の効率を向上させるが、いずれも限られている。
【0004】
β－異常ヘモグロビン症、例えばβ地中海貧血と鎌状赤血球症（ＳＣＤ）はβヘモグロビン遺伝子をコードするＨＢＢ突然変異によるものである。極少数の場合で、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰＦＨ）は良性遺伝性疾患であり、成人患者体内の高発現γ－グロブリンはβヘモグロビンの突然変異による疾患の表現型を緩和することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＨＢＧ１／２のプロモーター領域１３ｂｐを削除することでγ－グロブリンの発現を活性化することができ、さらに地中海貧血疾患を緩和するか又は治療することが報告され、効果的な治療ポリシーである。報告によると、そのうちの１人のＨＰＦＨ患者において、ＨＢＧ１／２プロモーター領域－１１７部位のヘテロ接合点突然変異（Ｇ＞Ａ）は１０－２０％の胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）発現を生成し、そのメカニズムは－１１７Ｇ＞Ａの突然変異が転写抑制因子ＢＣＬ１１Ａの結合部位を破壊することである。
【0005】
従来のゲノム編集技術はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介の相同組み換えを利用して塩基の置換による動物モデルを生成する効率がまだ比較的低い。新規な単一塩基ゲノム編集技術は１００％の効率で疾患動物モデルを生成できることで注目されているが、従来の単一塩基ゲノム編集技術は一般的にＣ３－Ｃ８であり、標的がＰＡＭ領域Ｃに近接することはあまり有効ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
従来技術の欠点に対し、本発明は、ゲノム編集効率を向上させる融合タンパク質及びその応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
一態様では、本発明は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメイン、ヌクレオシドデアミナーゼ及びヌクレアーゼを含むゲノム編集効率を向上させる融合タンパク質を提供する。
【0008】
具体的には、前記融合タンパク質の接続順は、前記ヌクレオシドデアミナーゼが前記ヌクレアーゼのＮ端又はＣ端に位置し、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインが前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼのＮ端、Ｃ端及び／又は前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼとの間に位置し、
好ましくは、前記ヌクレオシドデアミナーゼが前記ヌクレアーゼのＮ端に位置し、
より好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインが前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼとの間に位置する。
好ましくは、前記ヌクレオシドデアミナーゼが前記ヌクレアーゼのＮ端に位置し、
より好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインが前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼとの間に位置する。
【0009】
上記融合タンパク質において、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及び／又は非配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、好ましくは非配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含み、
好ましくは、前記非配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＰＡ７０（ヒト複製タンパク質Ａの７０サブユニット）、ＲＰＡ３２（ヒト複製タンパク質Ａの３２サブユニット）、ＢＲＣＡ２（乳がん２番遺伝子）、ｈｎＲＮＰＫ（ヘテロ核リボ核タンパク質Ｋ）、ＰＵＦ６０（ポリ－Ｕ結合スプライシング因子６０ ＫＤａ）及びＲａｄ５１（相同組み換え修復タンパク質）のうちのいずれか１つ又は複数から選ばれ、
好ましくは、前記配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＴＥＢＰ（テロメア結合タンパク質）、Ｔｅｂ１（テロメラーゼの組成タンパク質）及びＰＯＴ１（ヒトテロメア保護タンパク質１）のうちのいずれか１つ又は複数から選ばれ、
好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のＯＢ折り畳み（オリゴヌクレオチド／オリゴ糖／オリゴペプチド結合折り畳み）、ＫＨドメイン（Ｋホメオドメイン）、ＲＲＭＳ（ＲＮＡ認識モチーフ）、渦状ドメイン（ｗｈｉｒｌｙ ｄｏｍａｉｎｓ）という４つのドメインのうちの少なくとも１つ（いずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ又は全部４つ）、又は４つのドメインのうちの一本鎖ＤＮＡと結合する機能を有する一部ポリペプチドフラグメント及びその任意の組み合わせを含み、
より好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインは、Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含み、より好ましくは、前記Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示される配列を含み、より好ましくは、前記Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメインのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で示される配列を含み、
より好ましくは、前記ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１で示される配列を含み、より好ましくは、前記ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２で示される配列を含む。
好ましくは、前記非配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＰＡ７０（ヒト複製タンパク質Ａの７０サブユニット）、ＲＰＡ３２（ヒト複製タンパク質Ａの３２サブユニット）、ＢＲＣＡ２（乳がん２番遺伝子）、ｈｎＲＮＰＫ（ヘテロ核リボ核タンパク質Ｋ）、ＰＵＦ６０（ポリ－Ｕ結合スプライシング因子６０ ＫＤａ）及びＲａｄ５１（相同組み換え修復タンパク質）のうちのいずれか１つ又は複数から選ばれ、
好ましくは、前記配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＴＥＢＰ（テロメア結合タンパク質）、Ｔｅｂ１（テロメラーゼの組成タンパク質）及びＰＯＴ１（ヒトテロメア保護タンパク質１）のうちのいずれか１つ又は複数から選ばれ、
好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のＯＢ折り畳み（オリゴヌクレオチド／オリゴ糖／オリゴペプチド結合折り畳み）、ＫＨドメイン（Ｋホメオドメイン）、ＲＲＭＳ（ＲＮＡ認識モチーフ）、渦状ドメイン（ｗｈｉｒｌｙ ｄｏｍａｉｎｓ）という４つのドメインのうちの少なくとも１つ（いずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ又は全部４つ）、又は４つのドメインのうちの一本鎖ＤＮＡと結合する機能を有する一部ポリペプチドフラグメント及びその任意の組み合わせを含み、
より好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインは、Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含み、より好ましくは、前記Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示される配列を含み、より好ましくは、前記Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメインのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で示される配列を含み、
より好ましくは、前記ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１で示される配列を含み、より好ましくは、前記ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２で示される配列を含む。
【0010】
上記融合タンパク質において、前記デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ（ＡＰＯＢＥＣ）及び／又はアデノシンデアミナーゼ、好ましくはシチジンデアミナーゼを含み、前記シチジンデアミナーゼは、異なる生命体に由来してもよく、
幾つかの実施形態においては、前記シチジンデアミナーゼは、ラット由来シチジンデアミナーゼを含み、好ましくは、前記ラット由来シチジンデアミナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３で示される配列を含み、より好ましくは、前記ラット由来シチジンデアミナーゼのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４で示される配列を含み、
幾つかの実施形態においては、前記シチジンデアミナーゼは、ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａを含み、好ましくは、前記ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３で示される配列を含み、より好ましくは、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４で示される配列を含み、
幾つかの実施形態においては、前記シチジンデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ突然変異体を含み、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ突然変異体は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａの５７番目（開始コドンから）のアスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）をグリシン（Ｇ又はＧｌｙ）に変異させたものであり、好ましくは、該シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａは、ヒトに由来し、より好ましくは、該シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３で示される配列を含み、より好ましくは、該シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４で示される配列を含み、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５で示される配列を含み、より好ましくは、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６で示される配列を含み、
上記融合タンパク質において、前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｃｐｆ１のうちの１つ又はいずれか複数から選ばれ、好ましくは、前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であり、より好ましくは、前記Ｃａｓ９は、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌又はサーモフィルス菌に由来するＣａｓ９から選ばれ、より好ましくは、前記Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９突然変異体ＶＱＲ－ｓｐＣａｓ９、ＶＲＥＲ－ｓｐＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９ｎ、より好ましくはｓｐＣａｓ９ｎから選ばれ、より好ましくは、前記ｓｐＣａｓ９ｎのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５で示される配列を含み、より好ましくは、前記ｓｐＣａｓ９ｎのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６で示される配列を含む。
幾つかの実施形態においては、前記シチジンデアミナーゼは、ラット由来シチジンデアミナーゼを含み、好ましくは、前記ラット由来シチジンデアミナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３で示される配列を含み、より好ましくは、前記ラット由来シチジンデアミナーゼのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４で示される配列を含み、
幾つかの実施形態においては、前記シチジンデアミナーゼは、ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａを含み、好ましくは、前記ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３で示される配列を含み、より好ましくは、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４で示される配列を含み、
幾つかの実施形態においては、前記シチジンデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ突然変異体を含み、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ突然変異体は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａの５７番目（開始コドンから）のアスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）をグリシン（Ｇ又はＧｌｙ）に変異させたものであり、好ましくは、該シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａは、ヒトに由来し、より好ましくは、該シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３で示される配列を含み、より好ましくは、該シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４で示される配列を含み、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５で示される配列を含み、より好ましくは、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６で示される配列を含み、
上記融合タンパク質において、前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｃｐｆ１のうちの１つ又はいずれか複数から選ばれ、好ましくは、前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であり、より好ましくは、前記Ｃａｓ９は、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌又はサーモフィルス菌に由来するＣａｓ９から選ばれ、より好ましくは、前記Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９突然変異体ＶＱＲ－ｓｐＣａｓ９、ＶＲＥＲ－ｓｐＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９ｎ、より好ましくはｓｐＣａｓ９ｎから選ばれ、より好ましくは、前記ｓｐＣａｓ９ｎのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５で示される配列を含み、より好ましくは、前記ｓｐＣａｓ９ｎのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６で示される配列を含む。
【0011】
上記融合タンパク質において、ＮＬＳ（核局在シグナル）をさらに含み、好ましくは、前記ＮＬＳは、前記融合タンパク質の少なくとも一端（Ｃ端及び／又はＮ端）に位置し、より好ましくは、前記ＮＬＳのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７で示される配列を含み、より好ましくは、前記ＮＬＳのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８で示される配列を含み、
前記融合タンパク質は、ＵＧＩ（ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ阻害剤）をさらに含み、好ましくは、前記ＵＧＩは、前記融合タンパク質の少なくとも一端（Ｃ端及び／又はＮ端）に位置し、より好ましくは、前記ＵＧＩのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９で示される配列を含み、より好ましくは、前記ＵＧＩのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０で示される配列を含み、より好ましくは、前記ＵＧＩは、２つ以上のコピーである。
前記融合タンパク質は、ＵＧＩ（ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ阻害剤）をさらに含み、好ましくは、前記ＵＧＩは、前記融合タンパク質の少なくとも一端（Ｃ端及び／又はＮ端）に位置し、より好ましくは、前記ＵＧＩのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９で示される配列を含み、より好ましくは、前記ＵＧＩのコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０で示される配列を含み、より好ましくは、前記ＵＧＩは、２つ以上のコピーである。
【0012】
別の態様では、本発明は、Ａ）～Ｃ）生体材料のうちのいずれか１つをさらに提供する。
Ａ）上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする遺伝子であって、前記遺伝子はＤＮＡ又はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）である遺伝子、
Ｂ）Ａ）に記載の遺伝子を含有する組み換えベクターであって、前記組み換えベクターはウイルスベクター、及び／又は非ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターはアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及び／又は腫瘍溶解性ウイルスベクターを含み、前記非ウイルスベクターは陽イオン高分子ポリマー、プラスミドベクター及び／又はリポソームを含む組み換えベクター、
Ｃ）上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質を含有するか、又はＡ）に記載の遺伝子を含有する組み換え細胞又は組み換え体であって、前記組み換え体は工学菌であってもよく、前記組み換え細胞は編集対象とすべき目的細胞、例えば免疫細胞（例えばＴ細胞）、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、好ましくは、赤血球前駆細胞又は造血幹細胞であってもよい組み換え細胞又は組み換え体。
Ａ）上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする遺伝子であって、前記遺伝子はＤＮＡ又はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）である遺伝子、
Ｂ）Ａ）に記載の遺伝子を含有する組み換えベクターであって、前記組み換えベクターはウイルスベクター、及び／又は非ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターはアデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及び／又は腫瘍溶解性ウイルスベクターを含み、前記非ウイルスベクターは陽イオン高分子ポリマー、プラスミドベクター及び／又はリポソームを含む組み換えベクター、
Ｃ）上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質を含有するか、又はＡ）に記載の遺伝子を含有する組み換え細胞又は組み換え体であって、前記組み換え体は工学菌であってもよく、前記組み換え細胞は編集対象とすべき目的細胞、例えば免疫細胞（例えばＴ細胞）、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、好ましくは、赤血球前駆細胞又は造血幹細胞であってもよい組み換え細胞又は組み換え体。
【0013】
別の態様では、本発明は、細胞内標的遺伝子に対してゲノム編集を行うｓｇＲＮＡをさらに提供し、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７－３６のうちの少なくとも１つを含み、
好ましくは、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞又は赤血球細胞、より好ましくは、赤血球前駆細胞又は造血幹細胞であり、
好ましくは、前記標的遺伝子はＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域（具体的には、－１１７部位のＧがＡに編集され、－１１７部位のＧ、即ち前記プロモーター領域ＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＡＧＣＣにおける左から１４番目のＧ）である。
好ましくは、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞又は赤血球細胞、より好ましくは、赤血球前駆細胞又は造血幹細胞であり、
好ましくは、前記標的遺伝子はＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域（具体的には、－１１７部位のＧがＡに編集され、－１１７部位のＧ、即ち前記プロモーター領域ＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＡＧＣＣにおける左から１４番目のＧ）である。
【0014】
別の態様では、本発明は、上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質又は記載の生体材料と、ｓｇＲＮＡとを含む単一塩基ゲノム編集システムをさらに提供し、前記ｓｇＲＮＡは、前記融合タンパク質が目的細胞における標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導し、
好ましくは、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７－３６のうちの少なくとも１つを含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞であり、
及び／又は、前記標的遺伝子はＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である。
好ましくは、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７－３６のうちの少なくとも１つを含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞であり、
及び／又は、前記標的遺伝子はＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である。
【0015】
別の態様では、本発明は、ゲノム編集製品、疾患治療及び／又は予防製品、動物モデル、又は植物新品種の製造における、上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質、前記生体材料、前記単一塩基ゲノム編集システムの応用を保護し、
幾つかの実施例においては、前記疾患は、β異常ヘモグロビン症であり、前記β異常ヘモグロビン症は、β地中海貧血及び／又は鎌状赤血球貧血症を含む。
幾つかの実施例においては、前記疾患は、β異常ヘモグロビン症であり、前記β異常ヘモグロビン症は、β地中海貧血及び／又は鎌状赤血球貧血症を含む。
【0016】
別の態様では、本発明は、上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質とｓｇＲＮＡを用いて細胞に導入し、標的遺伝子に対してゲノム編集を行う工程を含む単一塩基ゲノム編集効率を向上させる方法をさらに提供し、前記ｓｇＲＮＡは、前記融合タンパク質が前記標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導する。
【0017】
上記方法においては、好ましくは、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７－３６のうちの少なくとも１つを含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞であり、
及び／又は、前記標的遺伝子はＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である。
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞であり、
及び／又は、前記標的遺伝子はＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である。
【0018】
別の態様では、本発明は、上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質とｓｇＲＮＡを用いて動物細胞に導入し、標的遺伝子に対してゲノム編集を行う工程を含む疾患動物モデルの構築方法をさらに提供し、
好ましくは、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７－３６のうちの少なくとも１つを含み、より好ましくは、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６で示される配列を含み、前記標的遺伝子は、ＤＭＤ遺伝子を含み、
好ましくは、前記動物は、哺乳動物であり、より好ましくは、前記哺乳動物は、ラット又はマウス、より好ましくはマウスであり、
好ましくは、前記細胞は、胚細胞であり、
好ましくは、前記導入の方式は、ベクター形質転換、微量注入、トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヒートショック、エレクトロポレーション、形質導入、遺伝子銃、ＤＥＡＥ－グルカン媒介の転移のうちの１つ又はいずれか複数の組み合わせ、より好ましくは微量注入であり、
好ましくは、前記導入は、上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質のｍＲＮＡと前記ｓｇＲＮＡを用いて行われ、
より好ましくは、前記導入で使用される上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質のｍＲＮＡの濃度は、１－１０００ｎｇ／μＬ、より好ましくは１０－６００ｎｇ／μＬ、より好ましくは５０－１５０ｎｇ／μＬ、より好ましくは１００ｎｇ／μＬであり、前記導入で使用される前記ｓｇＲＮＡの濃度は、１－１０００ｎｇ／μＬ、より好ましくは１０－６００ｎｇ／μＬ、より好ましくは１５０－２５０ｎｇ／μＬ、より好ましくは２００ｎｇ／μＬであり、
より好ましくは、前記導入で使用される上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質のｍＲＮＡと前記導入で使用される前記ｓｇＲＮＡとの濃度比は、１：（５－１）、より好ましくは１：（４－１．５）、より好ましくは１：（３－１．８）、より好ましくは１：２である。
好ましくは、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７－３６のうちの少なくとも１つを含み、より好ましくは、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６で示される配列を含み、前記標的遺伝子は、ＤＭＤ遺伝子を含み、
好ましくは、前記動物は、哺乳動物であり、より好ましくは、前記哺乳動物は、ラット又はマウス、より好ましくはマウスであり、
好ましくは、前記細胞は、胚細胞であり、
好ましくは、前記導入の方式は、ベクター形質転換、微量注入、トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヒートショック、エレクトロポレーション、形質導入、遺伝子銃、ＤＥＡＥ－グルカン媒介の転移のうちの１つ又はいずれか複数の組み合わせ、より好ましくは微量注入であり、
好ましくは、前記導入は、上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質のｍＲＮＡと前記ｓｇＲＮＡを用いて行われ、
より好ましくは、前記導入で使用される上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質のｍＲＮＡの濃度は、１－１０００ｎｇ／μＬ、より好ましくは１０－６００ｎｇ／μＬ、より好ましくは５０－１５０ｎｇ／μＬ、より好ましくは１００ｎｇ／μＬであり、前記導入で使用される前記ｓｇＲＮＡの濃度は、１－１０００ｎｇ／μＬ、より好ましくは１０－６００ｎｇ／μＬ、より好ましくは１５０－２５０ｎｇ／μＬ、より好ましくは２００ｎｇ／μＬであり、
より好ましくは、前記導入で使用される上記のいずれか１つに記載の融合タンパク質のｍＲＮＡと前記導入で使用される前記ｓｇＲＮＡとの濃度比は、１：（５－１）、より好ましくは１：（４－１．５）、より好ましくは１：（３－１．８）、より好ましくは１：２である。
【0019】
本発明は、医薬のスクリーニング、疾患治療効果評価又は疾患治療メカニズム研究における、前記方法で得られた動物モデルの応用を保護する。
【0020】
別の態様では、本発明は、上記Ａ）における前記遺伝子と、ｓｇＲＮＡの送達ベクターとを含むβ異常ヘモグロビン症を治療及び／又は予防するための製品を提供し、
前記ｓｇＲＮＡは、前記融合タンパク質が目的細胞におけるＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域（具体的には、－１１７部位のＧがＡに編集され、－１１７部位のＧ、即ち前記プロモーター領域ＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＡＧＣＣにおける左から１４番目のＧ）に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導し、
好ましくは、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５で示される配列を含み、
好ましくは、前記β異常ヘモグロビン症は、β地中海貧血及び／又は鎌状赤血球貧血症を含み、
好ましくは、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞又は赤血球細胞、より好ましくは赤血球前駆細胞又は造血幹細胞であり、
好ましくは、前記標的遺伝子はＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域（具体的には、－１１７部位のＧがＡに編集され、－１１７部位のＧ、即ち前記プロモーター領域ＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＡＧＣＣにおける左から１４番目のＧ）である。
前記ｓｇＲＮＡは、前記融合タンパク質が目的細胞におけるＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域（具体的には、－１１７部位のＧがＡに編集され、－１１７部位のＧ、即ち前記プロモーター領域ＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＡＧＣＣにおける左から１４番目のＧ）に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導し、
好ましくは、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５で示される配列を含み、
好ましくは、前記β異常ヘモグロビン症は、β地中海貧血及び／又は鎌状赤血球貧血症を含み、
好ましくは、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞又は赤血球細胞、より好ましくは赤血球前駆細胞又は造血幹細胞であり、
好ましくは、前記標的遺伝子はＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域（具体的には、－１１７部位のＧがＡに編集され、－１１７部位のＧ、即ち前記プロモーター領域ＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＡＧＣＣにおける左から１４番目のＧ）である。
【0021】
上記製品において、前記送達ベクターは、ウイルスベクター、及び／又は非ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及び／又は腫瘍溶解性ウイルスベクターを含み、前記非ウイルスベクターは、陽イオン高分子ポリマー、プラスミドベクター及び／又はリポソームを含み、
好ましくは、前記送達ベクターは、レンチウイルスベクターを含む。
好ましくは、前記送達ベクターは、レンチウイルスベクターを含む。
【0022】
上記の「少なくとも１つ」は、その限定された全ての種類のうちのいずれか１つ、いずれか２つの組み合わせ、いずれか３つの組み合わせ、……、又は全ての種類の組み合わせであり、いずれも本願の保護範囲内にある。
【0023】
上記アミノ酸配列又はコード配列のうち、本願に記載の配列との相同性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である配列、及び／又は本願に記載の配列に基づいてアミノ酸残基又はヌクレオチドの置換、削除又は挿入を行った配列であり、かつ本願で使用される配列は、同じ又は近い機能を有する配列であり、いずれも本願の保護範囲内にある。
【発明の効果】
【0024】
本発明の有益な効果は、以下のとおりであり、
本発明は、ＣＢＥｓ（ピリミジン塩基変換技術）によるＣ－Ｇ～Ｔ－Ａ塩基の変換過程において、ヌクレオシドデアミナーゼ、例えばシチジンデアミナーゼが一本鎖ＤＮＡを基質として脱アンモニアを行い、ヌクレオシドデアミナーゼ及びヌクレアーゼの融合タンパク質に一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインを再融合することにより、一本鎖ＤＮＡがヌクレオシドデアミナーゼに暴露する機会を大幅に増加させ、それによって塩基編集効率を明らかに向上させる。
本発明は、ＣＢＥｓ（ピリミジン塩基変換技術）によるＣ－Ｇ～Ｔ－Ａ塩基の変換過程において、ヌクレオシドデアミナーゼ、例えばシチジンデアミナーゼが一本鎖ＤＮＡを基質として脱アンモニアを行い、ヌクレオシドデアミナーゼ及びヌクレアーゼの融合タンパク質に一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインを再融合することにより、一本鎖ＤＮＡがヌクレオシドデアミナーゼに暴露する機会を大幅に増加させ、それによって塩基編集効率を明らかに向上させる。
【0025】
本発明は、１０種類の非配列好みの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の機能ドメインをスクリーニングしてＢＥ４ｍａｘと融合することにより、ヒト由来のＲａｄ５１の１つの一本鎖ＤＮＡ結合機能ドメイン（１－１１４ＡＡ）がＡｐｏｂｅｃ１とＣａｓ９ｎとの間に融合して最も効率的な向上を示すことを見出し、ｈｙＢＥ４ｍａｘと命名する。ｈｙＢＥ４ｍａｘのＣ－Ｇ～Ｔ－Ａの編集効率は、ＢＥ４ｍａｘに対して最大１６倍向上し、特にＰＡＭ領域に近い部位効率は、比較的低いｉｎｄｅｌｓ（挿入又は欠失）を維持しながらより顕著に向上する。
【0026】
本発明は、単一塩基ゲノム編集技術に対して突破性の改善を行い、ゲノム編集、遺伝子治療、細胞治療、動物モデル作製、作物遺伝育種などの面へのその応用を大幅に促進することができる。
【0027】
本発明は、遺伝子治療において、β－異常ヘモグロビン症を例に、ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ、Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘに対して、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘのＨＢＧ１及びＨＢＧ２（以下、ＨＢＧ１／２と略称する）を標的とするプロモーター領域がＰＡＭ領域－１１７部位に近く、より正確に効率的に－１１７を標的としてＧ～Ａの変異を生成することができ、それによってγ－グロブリンの発現を活性化し、β－異常ヘモグロビン症の臨床治療のためにより正確かつ効率的な治療ポリシーを提供する。
【0028】
本発明は、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘをマウス疾患動物モデルの作製に応用し、Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘに対して、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘがＰＡＭ領域に近いＣ～Ｔの突然変異を標的として疾患動物モデルを生成することがより効果的であるため、本発明によれば、異なる動物モデルの生産プロセスを大幅に促進する疾患動物モデルを効率的に作製する新規なプラットフォームを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】異なる一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインがＢＥ４ｍａｘと融合する構造概略図である。ここで、ＮＬＳは核局在シグナル（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７に示され、コード配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８に示される）であり、ｒＡ１はシチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ１（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示され、コード配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示される）であり、ｓｐＣａｓ９ｎは化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９ｎ（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５に示され、コード配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６に示される）であり、ＵＧＩはウラシルＤＮＡグリコシダーゼ阻害剤（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示され、コード配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０に示される）であり、ＳＳＤＢＤは一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインである。
【図2】ｈｙＢＥ４ｍａｘとＢＥ４ｍａｘが２９３Ｔ上の８個の標的で実現されたＣ～Ｔ塩基編集効率（即ち縦座標、単位は％である）対比である。
【図3】ｈｙＢＥ４ｍａｘとＢＥ４ｍａｘが２９３Ｔ上の８個の標的で生成された平均Ｃ～Ｔ塩基編集効率（即ち縦座標、単位は％である）対比である。
【図4】ｈｙＢＥ４ｍａｘとＢＥ４ｍａｘが２９３Ｔ上の８個の標的で生成されたｉｎｄｅｌｓの塩基編集効率（即ち縦座標、単位は％である）対比である。
【図5】融合タンパク質Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの構造概略図である。ここで、ｈＡ３Ａはヒト由来のシチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３に示され、コード配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４に示される）であり、ＮＬＳ、ｓｐＣａｓ９ｎとＵＧＩは図１と同じである。
【図6】ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘが２９３Ｔ上の８個の内因性標的で実現されたＣ～Ｔ塩基編集効率（即ち縦座標、単位は％である）の対比である。 ［図７］ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘが２９３Ｔ上の８個の内因性標的で実現されたＣ～Ｔ塩基編集効率（即ち縦座標、単位は％である）の平均値対比である。 ［図８］ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘが２９３Ｔ上の８個の内因性標的で生成されたｉｎｄｅｌｓの塩基編集効率（即ち縦座標、単位は％である）対比である。 ［図９］融合タンパク質ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの構造概略図である。ここで、Ａ３Ａ Ｎ５７Ｇは図５で使用されるｈＡ３ＡのＮ５７Ｇ突然変異体（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５に示され、コード配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６に示される）であり、ＮＬＳ、ｓｐＣａｓ９ｎとＵＧＩは図１と同じである。 ［図１０］ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘが２９３Ｔ上の１１個の内因性標的で実現されたＣ～Ｔ塩基編集効率（即ち縦座標、単位は％である）の対比である。 ［図１１］ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘが２９３Ｔ上の１１個の内因性標的で実現されたＣ～Ｔ塩基編集効率（即ち縦座標、単位は％である）の平均値対比である。 ［図１２］ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘが２９３Ｔ上の１１個の内因性標的で生成されたｉｎｄｅｌｓの塩基編集効率（即ち縦座標、単位は％である）対比である。 ここで、図２、３、５、６、１１での横座標のＣ及びその後の数字は、Ｔに編集されたＣの相応な標的配列上の位置を表し、例えば、Ｃ５は、相応な標的配列５’端からの５番目のＣがＴに編集される効率を表す。 ［図１３］ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘがＨＢＧ１／２プロモーター領域－１１７Ｇを標的とする概略図である。ここで、－１１７Ｇ＞Ａ突然変異は赤色で表示され、転写因子ＢＣＬ１１Ａ結合部位のコア配列は四角空欄で表示され、ＰＡＭ配列は青色であり、Ｇ＞Ａ転写は転写抑制因子ＢＣＬ１１Ａの結合部位を破壊し、かつＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）におけるＨＢＧ１／２の発現を活性化する。 ［図１４］ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ、ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ、Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＨＢＧ－１１７Ｇ標的を標的とすることで実現されたＣ～Ｔ塩基編集効率（即ち縦座標、単位は％である）対比である。 ［図１５］レンチウイルスベクターＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰとＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ構築概略図である。ここで、ｓｇＲＮＡの標的配列はＨＢＧ－１１７Ｇである。 ［図１６］ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘは、ＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞でＨＢＧ－１１７Ｇ標的を標的とすることで実現されたＣ～Ｔ塩基編集効率（即ち縦座標、単位は％である）対比である。 ［図１７］レンチウイルスに感染したＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰとＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰのＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞分化後のグロブリンｍＲＮＡ発現対比である。ここで、＊＊＊＊は差異有意水準Ｐ＜０．０００１を表す。 ［図１８］ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘがデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子を標的とする動物モデル構築概略図である。 ［図１９］Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの微量注入した後に生成したＦ０ハイスループットのシークエンシング結果の対比である。 ［図２０］Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ注入によるＦ０におけるＴＡＡ終止コドンを含有するＲｅａｄｓ平均割合である。 ［図２１］生成したＦ０マウスを蛍光免疫染色して、ジストロフィン（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）の発現を検出したものである。 ［図２２］ＤＭＤ突然変異マウスの生殖系遺伝（Ｆ０→Ｆ１）である。 ［図２３］ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとＤＭＤ－ｓｇ３の予測オフターゲット部位組合のＦ０世代におけるオフターゲット分析である。
【発明を実施するための形態】
【0030】
一、Ｒａｄ５１ＤＢＤ（１－１１４ａａ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の機能ドメインを融合したＢＥ４ｍａｘ編集効率の向上が最も顕著である
１．１、プラスミド設計及び構築
１．１．１、単一塩基編集技術におけるＣＢＥｓのＡｐｏｂｅｃ１が一本鎖ＤＮＡを基質とする特性に基づいて、ヒト由来の非配列好みの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の異なる機能ドメイン（主にＲＰＡ７０（６３０ａａ）－Ａ、ＲＰＡ７０－Ｂ、ＲＰＡ７０－ＡＢ、ＲＰＡ７０－Ｃ、ＲＰＡ３２－Ｄ、ＢＲＣＡ２－ＯＢ２、ＢＲＣＡ２－ＯＢ３、ＨＮＲＮＰＫ ＫＨドメイン、ＰＵＦ６０ ＲＲＭ、Ｒａｄ５１ ＤＢＤである）（表１）を１０個設計し、報告されている融合タンパク質がＢＥ４ｍａｘ（図１で上から順番に１番目の図）のＣ端に放置して活性がない傾向があるため、上記これらの機能ドメインをＢＥ４ｍａｘのＮ端（図１で上から順番に２番目の図）に融合し、ヒト由来の内因性標的ＥＭＸ１ ｓｉｔｅ１、Ｔｉｍ３－ｓｇ１（配列は表２で示されるとおりである）を２つ同時に設計した。
１．１、プラスミド設計及び構築
１．１．１、単一塩基編集技術におけるＣＢＥｓのＡｐｏｂｅｃ１が一本鎖ＤＮＡを基質とする特性に基づいて、ヒト由来の非配列好みの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の異なる機能ドメイン（主にＲＰＡ７０（６３０ａａ）－Ａ、ＲＰＡ７０－Ｂ、ＲＰＡ７０－ＡＢ、ＲＰＡ７０－Ｃ、ＲＰＡ３２－Ｄ、ＢＲＣＡ２－ＯＢ２、ＢＲＣＡ２－ＯＢ３、ＨＮＲＮＰＫ ＫＨドメイン、ＰＵＦ６０ ＲＲＭ、Ｒａｄ５１ ＤＢＤである）（表１）を１０個設計し、報告されている融合タンパク質がＢＥ４ｍａｘ（図１で上から順番に１番目の図）のＣ端に放置して活性がない傾向があるため、上記これらの機能ドメインをＢＥ４ｍａｘのＮ端（図１で上から順番に２番目の図）に融合し、ヒト由来の内因性標的ＥＭＸ１ ｓｉｔｅ１、Ｔｉｍ３－ｓｇ１（配列は表２で示されるとおりである）を２つ同時に設計した。
【0031】
１．１．２、表１で示されるヒト由来の非配列好みの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の異なる機能ドメインのＤＮＡを１０個人工的に合成し、その後、シームレスクローンを行ってプラスミドｐＣＭＶ－ＢＥ４ｍａｘ（ａｄｄｇｅｎｅ、＃１１２０９３）におけるＢＥ４ｍａｘのＮ端に組み立て、ｐＲＰＡ７０－Ａ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＲＰＡ７０－Ｂ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＲＰＡ７０－ＡＢ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＲＰＡ７０－Ｃ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＲＰＡ３２－Ｄ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＢＲＣＡ２－ＯＢ２－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＢＲＣＡ２－ＯＢ３－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＫＨ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＲＲＭ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＲａｄ５１ＤＢＤ－ＢＥ４ｍａｘという１０個の組み換えプラスミド（図１）をそれぞれ構築した。
【0032】
表２で示されるＥＭＸ１ ｓｉｔｅ１とＴｉｍ３－ｓｇ１を標的とするＤＮＡを人工的に合成し、それぞれｓｇＲＮＡ発現プラスミドＵ６－ｓｇＲＮＡ－ＥＦ１α－ＧＦＰのＢｂｓ Ｉ部位（相応な標的を発現するためのｓｇＲＮＡ）に接続され、組み換えプラスミドｐＥとｐＴを得た。
【0033】
１．１．３、１．１．１と１．１．２で構築したプラスミドをｓａｎｇｅｒでシークエンシングし、完全に正確であることを確保した。
【0034】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【0035】
【表2】
【0036】
１．２、細胞トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ ５×１０５細胞を２４ウェル板に播種し、細胞が７０％－８０％に成長した時、ｐｓｓＤＢＤ－ＢＥ４ｍａｘ：ｐＥ（又はｐＴ）＝７５０ｎｇ：２５０ｎｇに従ってプラスミド組合のトランスフェクションを行い、各プラスミド組合トランスフェクションは、３ウェル複製、各ウェル２×１０５個の細胞を設定した。同時に、いかなるプラスミドをトランスフェクションしないブランクを設定した。
ＨＥＫ２９３Ｔ ５×１０５細胞を２４ウェル板に播種し、細胞が７０％－８０％に成長した時、ｐｓｓＤＢＤ－ＢＥ４ｍａｘ：ｐＥ（又はｐＴ）＝７５０ｎｇ：２５０ｎｇに従ってプラスミド組合のトランスフェクションを行い、各プラスミド組合トランスフェクションは、３ウェル複製、各ウェル２×１０５個の細胞を設定した。同時に、いかなるプラスミドをトランスフェクションしないブランクを設定した。
【0037】
ｐｓｓＤＢＤ－ＢＥ４ｍａｘは、プラスミドｐＲＰＡ７０－Ａ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＲＰＡ７０－Ｂ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＲＰＡ７０－ＡＢ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＲＰＡ７０－Ｃ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＲＰＡ３２－Ｄ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＢＲＣＡ２－ＯＢ２－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＢＲＣＡ２－ＯＢ３－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＫＨ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＲＲＭ－ＢＥ４ｍａｘ、ｐＲａｄ５１ＤＢＤ－ＢＥ４ｍａｘのうちのいずれか１つを代表し、プラスミドｐＣＭＶ－ＢＥ４ｍａｘを陰性対照とした。
【0038】
１．３、ゲノム抽出及び増幅サブライブラリーの用意
トランスフェクション後７２ｈ、細胞ゲノムＤＮＡを天根細胞ゲノム抽出キット（ＤＰ３０４）で抽出した。その後、Ｈｉｔｏｍキットの操作プロセスを用いて、相応な同定プライマー（表３）を設計し、即ち順方向同定プライマー５’端に架橋配列５’－ｇｇａｇｔｇａｇｔａｃｇｇｔｇｔｇｃ－３’を加え、逆方向同定プライマー５’端に架橋配列５’－ｇａｇｔｔｇｇａｔｇｃｔｇｇａｔｇｇ－３’を加えてＰＣＲ生成物を得て、その後、一輪ＰＣＲ生成物を鋳型として二輪ＰＣＲを行い、その後、混合してゲル抽出精製した後、会社に送ってディープシークエンシングを行った。
トランスフェクション後７２ｈ、細胞ゲノムＤＮＡを天根細胞ゲノム抽出キット（ＤＰ３０４）で抽出した。その後、Ｈｉｔｏｍキットの操作プロセスを用いて、相応な同定プライマー（表３）を設計し、即ち順方向同定プライマー５’端に架橋配列５’－ｇｇａｇｔｇａｇｔａｃｇｇｔｇｔｇｃ－３’を加え、逆方向同定プライマー５’端に架橋配列５’－ｇａｇｔｔｇｇａｔｇｃｔｇｇａｔｇｇ－３’を加えてＰＣＲ生成物を得て、その後、一輪ＰＣＲ生成物を鋳型として二輪ＰＣＲを行い、その後、混合してゲル抽出精製した後、会社に送ってディープシークエンシングを行った。
【0039】
【表3】
【0040】
１．４、ディープシークエンシング結果分析及び統計
ＢＥ－ａｎａｌｙｚｅｒサイトを用いて工程１．３のディープシークエンシング結果を解析し、Ｃ～Ｔ、Ｉｎｄｅｌｓの割合を統計し、その結果を表４と表５に示す。
結果にあるように、ＢＥ４ｍａｘに比べて、Ｒａｄ５１一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の機能ドメインを融合したＢＥ４ｍａｘ（Ｒａｄ５１ＤＢＤ－Ｎ－ＢＥ４ｍａｘ又はＲａｄ５１ＤＢＤ－ＢＥ４ｍａｘ）は、標的上のＣ～Ｔに対する編集効率の向上が最も顕著であり、第二に、ＲＰＡ７０－Ｃ一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の機能ドメインを融合したＢＥ４ｍａｘであった。
ＢＥ－ａｎａｌｙｚｅｒサイトを用いて工程１．３のディープシークエンシング結果を解析し、Ｃ～Ｔ、Ｉｎｄｅｌｓの割合を統計し、その結果を表４と表５に示す。
結果にあるように、ＢＥ４ｍａｘに比べて、Ｒａｄ５１一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の機能ドメインを融合したＢＥ４ｍａｘ（Ｒａｄ５１ＤＢＤ－Ｎ－ＢＥ４ｍａｘ又はＲａｄ５１ＤＢＤ－ＢＥ４ｍａｘ）は、標的上のＣ～Ｔに対する編集効率の向上が最も顕著であり、第二に、ＲＰＡ７０－Ｃ一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の機能ドメインを融合したＢＥ４ｍａｘであった。
【0041】
二、ｈｙＢＥ４ｍａｘの編集効率最適
工程一で標的上のＣ～Ｔの編集効率が最大向上であるＲａｄ５１一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインの融合位置をさらにテストするために、Ｒａｄ５１ ＤＢＤをＢＥ４ｍａｘの別の２つの異なる位置に融合し、Ｒａｄ５１ ＤＢＤを融合したＢＥ４ｍａｘ（図１の上から順番に３～５番目の図）、共３種類の組み換えプラスミドをそれぞれ組み換えプラスミドｐＥ又はｐＴと工程一での１．２の方法に従って細胞トランスフェクションを行い、かつ工程一での１．３と１．４の方法に従って編集効率の結果を得た（表４と表５）。
工程一で標的上のＣ～Ｔの編集効率が最大向上であるＲａｄ５１一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインの融合位置をさらにテストするために、Ｒａｄ５１ ＤＢＤをＢＥ４ｍａｘの別の２つの異なる位置に融合し、Ｒａｄ５１ ＤＢＤを融合したＢＥ４ｍａｘ（図１の上から順番に３～５番目の図）、共３種類の組み換えプラスミドをそれぞれ組み換えプラスミドｐＥ又はｐＴと工程一での１．２の方法に従って細胞トランスフェクションを行い、かつ工程一での１．３と１．４の方法に従って編集効率の結果を得た（表４と表５）。
【0042】
図１の上から順番に３～５番目の図で示されるＲａｄ５１ ＤＢＤを融合した３つのＢＥ４ｍａｘは、それぞれ以下のとおりであり、
Ｒａｄ５１ＤＢＤ－Ｎ－ＢＥ４ｍａｘ：ＢＥ４ｍａｘでＮＬＳとｒＡ１との間にＲａｄ５１ ＤＢＤを融合し、即ちＲａｄ５１ ＤＢＤがｒＡ１とｓｐＣａｓ９ｎのＮ端に位置し、
Ｒａｄ５１ＤＢＤ－Ｃ－ＢＥ４ｍａｘ：ＢＥ４ｍａｘでｓｐＣａｓ９ｎとＵＧＩとの間にＲａｄ５１ ＤＢＤを融合し、即ちＲａｄ５１ ＤＢＤがｒＡ１とｓｐＣａｓ９ｎのＣ端に位置し、
ｈｙＢＥ４ｍａｘ：ＢＥ４ｍａｘでｒＡ１とｓｐＣａｓ９ｎとの間にＲａｄ５１ ＤＢＤを融合する。
Ｒａｄ５１ＤＢＤ－Ｎ－ＢＥ４ｍａｘ：ＢＥ４ｍａｘでＮＬＳとｒＡ１との間にＲａｄ５１ ＤＢＤを融合し、即ちＲａｄ５１ ＤＢＤがｒＡ１とｓｐＣａｓ９ｎのＮ端に位置し、
Ｒａｄ５１ＤＢＤ－Ｃ－ＢＥ４ｍａｘ：ＢＥ４ｍａｘでｓｐＣａｓ９ｎとＵＧＩとの間にＲａｄ５１ ＤＢＤを融合し、即ちＲａｄ５１ ＤＢＤがｒＡ１とｓｐＣａｓ９ｎのＣ端に位置し、
ｈｙＢＥ４ｍａｘ：ＢＥ４ｍａｘでｒＡ１とｓｐＣａｓ９ｎとの間にＲａｄ５１ ＤＢＤを融合する。
【0043】
【表4】
【0044】
【表5】
【0045】
表４と表５の結果にあるように、ＢＥ４ｍａｘでＮＬＳとｒＡ１との間にＲａｄ５１ ＤＢＤ（即ちＲａｄ５１ＤＢＤ－Ｎ－ＢＥ４ｍａｘ）を融合することに比べて、ＢＥ４ｍａｘでｒＡ１とｓｐＣａｓ９ｎとの間にＲａｄ５１ ＤＢＤ（即ちｈｙＢＥ４ｍａｘ）を融合すると、標的上のＣ～Ｔに対する編集効率の向上が最も顕著であった。
【0046】
三、ｈｙＢＥ４ｍａｘの動作特性
ｈｙＢＥ４ｍａｘの動作特性をさらに公平に記述するために、他の６個の追加の標的ＶＥＧＦＡ ｓｉｔｅ２、Ｌａｇ３－ｓｇ２、ＨＥＫ３、ＨＥＫ４、ＥＭＸ１－ｓｇ２ｐ、Ｎｍｅ１－ｓｇ１（配列は表２で示されるとおりである）を設計し、プラスミドＵ６－ｓｇＲＮＡ－ＥＦ１α－ＧＦＰのＢｂｓＩ部位に接続され、組み換えプラスミドｐＶ、ｐＬ、ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＥＰとｐＮを得た。プラスミドをｓａｎｇｅｒでシークエンシングし、完全に正確であることを確保した。
ｈｙＢＥ４ｍａｘの動作特性をさらに公平に記述するために、他の６個の追加の標的ＶＥＧＦＡ ｓｉｔｅ２、Ｌａｇ３－ｓｇ２、ＨＥＫ３、ＨＥＫ４、ＥＭＸ１－ｓｇ２ｐ、Ｎｍｅ１－ｓｇ１（配列は表２で示されるとおりである）を設計し、プラスミドＵ６－ｓｇＲＮＡ－ＥＦ１α－ＧＦＰのＢｂｓＩ部位に接続され、組み換えプラスミドｐＶ、ｐＬ、ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＥＰとｐＮを得た。プラスミドをｓａｎｇｅｒでシークエンシングし、完全に正確であることを確保した。
【0047】
工程二でｈｙＢＥ４ｍａｘを含有する組み換えプラスミドを工程一での１．２の方法に従って、それぞれ組み換えプラスミドｐＥ、ｐＴ、ｐＶ、ｐＬ、ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＥＰ又はｐＮと細胞トランスフェクションを行い、工程一での１．３と１．４の方法に従って編集効率の結果を得て、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ８．０で統計的に作図した。
【0048】
この結果を図２と図３に示すように、編集ウィンドウＣ３－Ｃ８では、ｈｙＢＥ４ｍａｘのＣ～Ｔ編集効率は１９－７１％であり、対応するＢＥ４ｍａｘは１３－４７％であった。編集ウィンドウＣ９－Ｃ１２では、ｈｙＢＥ４ｍａｘのＣ～Ｔ編集効率は１９－５５％であり、対応するＢＥ４ｍａｘは１．４－１７％であった。ＢＥ４ｍａｘに対して、編集ウィンドウＣ３－Ｃ８内では、ｈｙＢＥ４ｍａｘ平均Ｃ～Ｔ編集効率はＢＥ４ｍａｘの１．６－２．２倍であり、編集ウィンドウＣ９－Ｃ１２内では、ｈｙＢＥ４ｍａｘ平均Ｃ～Ｔ編集効率はＢＥ４ｍａｘの３．３－１７倍であった。同時に、ｈｙＢＥ４ｍａｘは比較的低いｉｎｄｅｌｓ生成を維持している（図４）。
【0049】
四、異なるシチジンデアミナーゼを含む融合タンパク質の効果
（一）、融合タンパク質ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ動作特性
４．１．１、Ｒａｄ５１－ＤＢＤは表１のコード配列に従って合成され、その後、シームレスクローンを行って発現タンパク質Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ（図５）のプラスミドｐＣＭＶ－Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘにおけるｈＡ３ＡとｓｐＣａｓ９ｎとの間に組み立て、融合タンパク質ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ（図５）を発現する組み換えプラスミドｐＡを構築した。
（一）、融合タンパク質ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ動作特性
４．１．１、Ｒａｄ５１－ＤＢＤは表１のコード配列に従って合成され、その後、シームレスクローンを行って発現タンパク質Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ（図５）のプラスミドｐＣＭＶ－Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘにおけるｈＡ３ＡとｓｐＣａｓ９ｎとの間に組み立て、融合タンパク質ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ（図５）を発現する組み換えプラスミドｐＡを構築した。
【0050】
４．１．２、８種類のヒト内因性標的を順次合成し、ＥＭＸ１ ｓｉｔｅ１、Ｔｉｍ３－ｓｇ１、ＶＥＧＦＡ ｓｉｔｅ２、ＥＭＸ１－ｓｇ２ｐ、Ｎｍｅ１－ｓｇ１の標的配列を表２に示し、ＦＡＮＣＦ ｓｉｔｅ１、ＥＧＦＲ－ｓｇ５、ＥＧＦＲ－ｓｇ２１の標的配列を表６に示し、それぞれｓｇＲＮＡ発現プラスミドｐＵ６－ｓｇＲＮＡ－ＥＦ１α－ＧＦＰのＢｂｓ Ｉ部位に接続され、相応な標的を発現するｓｇＲＮＡの組み換えプラスミドｐＢ１、ｐＢ２、……ｐＢ８を得た。
【0051】
４．１．３、４．１．１と４．１．２で構築されたプラスミドをｓａｎｇｅｒでシークエンシングし、完全に正確であることを確保した。
【0052】
【表6】
【0053】
４．１．４、細胞トランスフェクション
５×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ウェル板に播種し、細胞が７０％－８０％に成長した時、ｐＡ（又はプラスミドｐＣＭＶ－Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ）：ｐＢ１（又はｐＢ２、ｐＢ３、……ｐＢ８）＝７５０ｎｇ：２５０ｎｇに従ってプラスミド組合のトランスフェクションを行い、各プラスミド組合トランスフェクションは、３ウェル複製、各ウェル２×１０５個の細胞を設定した。同時に、いかなるトプラスミドをランスフェクションしないブランクを設定した。
５×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ウェル板に播種し、細胞が７０％－８０％に成長した時、ｐＡ（又はプラスミドｐＣＭＶ－Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ）：ｐＢ１（又はｐＢ２、ｐＢ３、……ｐＢ８）＝７５０ｎｇ：２５０ｎｇに従ってプラスミド組合のトランスフェクションを行い、各プラスミド組合トランスフェクションは、３ウェル複製、各ウェル２×１０５個の細胞を設定した。同時に、いかなるトプラスミドをランスフェクションしないブランクを設定した。
【0054】
４．１．５、ゲノム抽出及び増幅サブライブラリーの用意
工程１．３の方法に従って行い、ここで、ＦＡＮＣＦ ｓｉｔｅ１、ＥＧＦＲ－ｓｇ５、ＥＧＦＲ－ｓｇ２１の標的の同定プライマーを表７に示し、残りの発現同定プライマーを表３に示す。
工程１．３の方法に従って行い、ここで、ＦＡＮＣＦ ｓｉｔｅ１、ＥＧＦＲ－ｓｇ５、ＥＧＦＲ－ｓｇ２１の標的の同定プライマーを表７に示し、残りの発現同定プライマーを表３に示す。
【0055】
【表7】
【0056】
４．１．６、ディープシークエンシング結果分析及び統計
工程１．４の方法に従って行う。
結果にあるように、タンパク質Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘに対して、融合タンパク質ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの各標的の異なる位置（Ｃ３－Ｃ１５）の単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率は明らかに向上した（図６）。ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの高活性ウィンドウは、Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘに対して、元のＣ３－Ｃ１１からＣ３－Ｃ１５まで拡大され、ここで、ＰＡＭ領域から遠く離れたＣ３－Ｃ１１では、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率はＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの１．１－２．３倍であり、ＰＡＭ領域に近いＣ１２－Ｃ１５では、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率はＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの３．１－４．１倍であり、即ちＰＡＭ領域に近いＣ１２－Ｃ１５では、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率の向上はより顕著であった（図７）。かつ、同時にｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘは比較的低いｉｎｄｅｌｓを維持している（図８）。
工程１．４の方法に従って行う。
結果にあるように、タンパク質Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘに対して、融合タンパク質ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの各標的の異なる位置（Ｃ３－Ｃ１５）の単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率は明らかに向上した（図６）。ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの高活性ウィンドウは、Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘに対して、元のＣ３－Ｃ１１からＣ３－Ｃ１５まで拡大され、ここで、ＰＡＭ領域から遠く離れたＣ３－Ｃ１１では、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率はＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの１．１－２．３倍であり、ＰＡＭ領域に近いＣ１２－Ｃ１５では、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率はＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの３．１－４．１倍であり、即ちＰＡＭ領域に近いＣ１２－Ｃ１５では、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率の向上はより顕著であった（図７）。かつ、同時にｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘは比較的低いｉｎｄｅｌｓを維持している（図８）。
【0057】
（二）、融合タンパク質ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ動作特性
４．２．１、作動系プラスミド構築
Ｒａｄ５１－ＤＢＤは表１のコード配列に従って合成され、その後、シームレスクローンを行って発現タンパク質ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ（図９）のプラスミドｐＣＭＶ－ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘにおけるｅＡ３ＡとｓｐＣａｓ９ｎとの間に組み立て、融合タンパク質ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ（図９）を発現する組み換えプラスミドｐＡｅを構築した。
４．２．１、作動系プラスミド構築
Ｒａｄ５１－ＤＢＤは表１のコード配列に従って合成され、その後、シームレスクローンを行って発現タンパク質ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ（図９）のプラスミドｐＣＭＶ－ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘにおけるｅＡ３ＡとｓｐＣａｓ９ｎとの間に組み立て、融合タンパク質ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ（図９）を発現する組み換えプラスミドｐＡｅを構築した。
【0058】
４．２．２、標的プラスミドの構築
１１個のヒト由来の内因性標的を同時に設計して合成し、ＥＭＸ１－ｓｇ２ｐ、ＥＭＸ１ ｓｉｔｅ１、Ｎｍｅ１－ｓｇ１の標的配列を表２に示し、ＥＧＦＲ－ｓｇ２１の標的配列を表６に示し、残りの標的配列を表８に示し、それぞれｓｇＲＮＡ発現プラスミドＵ６－ｓｇＲＮＡ－ＥＦ１α－ＧＦＰのＢｂｓＩ部位に接続され、相応な標的のｓｇＲＮＡを発現するために用いられ、組み換えプラスミドｐＣ１、ｐＣ２、……ｐＣ１１を得た。
１１個のヒト由来の内因性標的を同時に設計して合成し、ＥＭＸ１－ｓｇ２ｐ、ＥＭＸ１ ｓｉｔｅ１、Ｎｍｅ１－ｓｇ１の標的配列を表２に示し、ＥＧＦＲ－ｓｇ２１の標的配列を表６に示し、残りの標的配列を表８に示し、それぞれｓｇＲＮＡ発現プラスミドＵ６－ｓｇＲＮＡ－ＥＦ１α－ＧＦＰのＢｂｓＩ部位に接続され、相応な標的のｓｇＲＮＡを発現するために用いられ、組み換えプラスミドｐＣ１、ｐＣ２、……ｐＣ１１を得た。
【0059】
４．２．３、４．２．１と４．２．２で構築されたプラスミドをｓａｎｇｅｒでシークエンシングし、完全に正確であることを確保した。
【0060】
【表8】
【0061】
４．２．４、細胞トランスフェクション－検証ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ作動系
５×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ウェル板に播種し、細胞が７０％－８０％に成長した時、ｐＡ（又はプラスミドｐＣＭＶ－ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ）：ｐＣ１（又はｐＣ２、ｐＣ３、……ｐＣ１１）＝７５０ｎｇ：２５０ｎｇに従ってプラスミド組合のトランスフェクションを行い、各プラスミド組合トランスフェクションは、３ウェル複製、各ウェル２×１０５個の細胞を設定した。同時に、いかなるトプラスミドをランスフェクションしないブランクを設定した。
５×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ウェル板に播種し、細胞が７０％－８０％に成長した時、ｐＡ（又はプラスミドｐＣＭＶ－ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ）：ｐＣ１（又はｐＣ２、ｐＣ３、……ｐＣ１１）＝７５０ｎｇ：２５０ｎｇに従ってプラスミド組合のトランスフェクションを行い、各プラスミド組合トランスフェクションは、３ウェル複製、各ウェル２×１０５個の細胞を設定した。同時に、いかなるトプラスミドをランスフェクションしないブランクを設定した。
【0062】
４．２．５、ゲノム抽出及び増幅サブライブラリーの用意
工程１．３の方法に従って行い、ここで、ＥＭＸ１－ｓｇ２ｐ、ＥＭＸ１ ｓｉｔｅ１、Ｎｍｅ１－ｓｇ１の同定プライマーを表３に示し、ＥＧＦＲ－ｓｇ２１の同定プライマーを表７に示し、残りの標的配列を表９に示す。
工程１．３の方法に従って行い、ここで、ＥＭＸ１－ｓｇ２ｐ、ＥＭＸ１ ｓｉｔｅ１、Ｎｍｅ１－ｓｇ１の同定プライマーを表３に示し、ＥＧＦＲ－ｓｇ２１の同定プライマーを表７に示し、残りの標的配列を表９に示す。
【0063】
【表9】
【0064】
４．２．６、ディープシークエンシング結果分析及び統計
工程１．４の方法に従って行う。
結果にあるように、タンパク質ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘに対して、融合タンパク質ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの各標的の異なる位置（Ｃ３－Ｃ１５）の単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率の大部分は明らかに向上し、かつ高活性ウィンドウは、元のＣ３－Ｃ１１からＣ３－Ｃ１５まで拡大され、ＴＣ ｍｏｔｉｆにおける単一塩基Ｃを特異的に標的としてＣ～Ｔの変換を実現できる（図１０）。ここで、ＰＡＭ領域から遠く離れたＣ３－Ｃ１１では、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率はｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの１．６－２．８倍であり、ＰＡＭ領域に近いＣ１２－Ｃ１５では、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率はｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの４．５－３１．９倍であり、即ちＰＡＭ領域に近いＣ１２－Ｃ１５では、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率の向上はより顕著であった（図１１）。同時にｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘは比較的低いｉｎｄｅｌｓを維持している（図１２）。
工程１．４の方法に従って行う。
結果にあるように、タンパク質ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘに対して、融合タンパク質ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの各標的の異なる位置（Ｃ３－Ｃ１５）の単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率の大部分は明らかに向上し、かつ高活性ウィンドウは、元のＣ３－Ｃ１１からＣ３－Ｃ１５まで拡大され、ＴＣ ｍｏｔｉｆにおける単一塩基Ｃを特異的に標的としてＣ～Ｔの変換を実現できる（図１０）。ここで、ＰＡＭ領域から遠く離れたＣ３－Ｃ１１では、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率はｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの１．６－２．８倍であり、ＰＡＭ領域に近いＣ１２－Ｃ１５では、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率はｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの４．５－３１．９倍であり、即ちＰＡＭ領域に近いＣ１２－Ｃ１５では、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの単一塩基Ｃ～Ｔに対する編集効率の向上はより顕著であった（図１１）。同時にｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘは比較的低いｉｎｄｅｌｓを維持している（図１２）。
【0065】
五、融合タンパク質ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘを用いた遺伝子治療
５．１、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘがＨＢＧ－１１７Ｇ部位を標的とするＨＥＫ２９３Ｔ細胞上の編集効率のテスト
４．２．４の細胞トランスフェクション方法に従って、ｐＡ（又はプラスミドｐＣＭＶ－Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ、又はｐＡｅ、又はｐＣＭＶ－ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ）：ｐＣ１２＝７５０ｎｇ：２５０ｎｇで、プラスミド組合でＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、４．２．６の方法に従ってディープシークエンシング及び統計分析を行った。
５．１、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘがＨＢＧ－１１７Ｇ部位を標的とするＨＥＫ２９３Ｔ細胞上の編集効率のテスト
４．２．４の細胞トランスフェクション方法に従って、ｐＡ（又はプラスミドｐＣＭＶ－Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ、又はｐＡｅ、又はｐＣＭＶ－ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ）：ｐＣ１２＝７５０ｎｇ：２５０ｎｇで、プラスミド組合でＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、４．２．６の方法に従ってディープシークエンシング及び統計分析を行った。
【0066】
上記組み換えプラスミドｐＣ１２の構築方法は以下のとおりである。ＨＢＧ－１１７ＧのｓｇＲＮＡ標的配列（ＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５）をｓｇＲＮＡ発現プラスミドＵ６－ｓｇＲＮＡ－ＥＦ１α－ＧＦＰのＢｂｓＩ部位に接続され、相応な標的のｓｇＲＮＡを発現するために用いられ、組み換えプラスミドｐＣ１２を得た。
【0067】
上記ディープシークエンシング標的ＨＢＧ－１１７Ｇで使用される同定プライマーは以下のとおりであり、
ＨＢＧ－１１７Ｇ Ｆ：ＡＧＴＧＡＧＴＡＣＧＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＣＧＧＡＡＣＡＡＧＧＣ、
ＨＢＧ－１１７Ｇ Ｒ：ＧＴＴＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＴＣＴＡＡＧＡＣＴ。
ＨＢＧ－１１７Ｇ Ｆ：ＡＧＴＧＡＧＴＡＣＧＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＣＧＧＡＡＣＡＡＧＧＣ、
ＨＢＧ－１１７Ｇ Ｒ：ＧＴＴＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＴＣＴＡＡＧＡＣＴ。
【0068】
結果：図１４に示すように、Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘはＨＢＧ１／２プロモーター領域の－１１７Ｇ＞Ａ（Ｃ１１）突然変異を標的とすることができることに加えて、－１０９Ｇ＞Ａ（Ｃ３）、－１２２Ｇ＞Ａ（Ｃ１６）「傍観者」突然変異を産生することができる。ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの場合、ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘは、－１１７上のＧ～Ａ変換（即ち相補鎖Ｃ～Ｔ変換）を正確に編集して「傍観者」突然変異を引き起こすことはないが、効率は非常に低く、ｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘに比べて、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘは６．６倍のＧ～Ａ変換効率を向上させ、そして－１０９と－１２２部に検出可能な「傍観者」突然変異は生じない。結果にあるように、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘはＨＢＧ１／２プロモーター領域－１１７Ｇを正確かつ効率的に標的とする特性を示した（作用機序のまとめを図１３に示す）。
【0069】
５．２、レンチウイルスベクターの構築及びウイルスパッケージ
５．２．１、レンチウイルスベクターの構築
ｐＬｅｎｔｉ－ＢＥ３－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１１０８３８）を骨格ベクターとし、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘのコード配列を、シームレスクローンを介して骨格ベクター上のＢＥ３を置き換えてレンチウイルスベクターＬｅｎｔｉ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰを得た。
５．２．１、レンチウイルスベクターの構築
ｐＬｅｎｔｉ－ＢＥ３－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１１０８３８）を骨格ベクターとし、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘのコード配列を、シームレスクローンを介して骨格ベクター上のＢＥ３を置き換えてレンチウイルスベクターＬｅｎｔｉ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰを得た。
【0070】
ｐＬｅｎｔｉ－ＢＥ３－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１１０８３８）を骨格ベクターとし、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘのコード配列を、シームレスクローンを介して骨格ベクター上のＢＥ３を置き換えてレンチウイルスベクターＬｅｎｔｉ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰを得た。
【0071】
５．２におけるＨＢＧ－１１７Ｇ標的配列を上記２つのレンチウイルスベクターのｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ又はｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの上流（図１５の上図）にそれぞれ接続され、組み換えプラスミドＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰと組み換えプラスミドＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（図１５の下図）を得た。
【0072】
５．２．２、レンチウイルスパッケージ
５．２．２．１、トランスフェクション
１日目、生育状態が良好であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を消化した後に１０ｃｍの皿に播種し、ウイルス１あたり約３０皿であった。２日目、集密度が８０％－９０％になった時、Ｌｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（又はＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）：ＰＳＰＡＸ２：ＰＭＤ２．Ｇ＝１０ｕｇ：１０ｕｇ：１０ｕｇでプラスミドトランスフェクションを行った。
５．２．２．１、トランスフェクション
１日目、生育状態が良好であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を消化した後に１０ｃｍの皿に播種し、ウイルス１あたり約３０皿であった。２日目、集密度が８０％－９０％になった時、Ｌｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（又はＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）：ＰＳＰＡＸ２：ＰＭＤ２．Ｇ＝１０ｕｇ：１０ｕｇ：１０ｕｇでプラスミドトランスフェクションを行った。
【0073】
５．２．２．２、ウイルスの収集と精製
ウイルス上澄みをトランスフェクション後４８ｈ（トランスフェクションは０時間として計算できる）、７２ｈのＨＥＫ２９３Ｔ細胞上澄みに収集した。４℃、４０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、細胞破砕片を除去した後、上澄み液を０．４５μｍのフィルターで４０ｍＬの限外濾過遠心分離管に濾過し、レンチウイルス粗抽出液を濾過カップに加え、４℃、２５０００ｇで２．５時間遠心分離した。遠心分離終了後、遠心分離装置を取り出し、濾過カップと下方の濾過液収集カップを分離した。試料収集カップ中の液体はウイルス濃縮液（レンチウイルスＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ又はレンチウイルスＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰを含有する）である。ウイルス濃縮液を移出し、文注後、ウイルス管に保存し、－８０℃で長期間保存した。
ウイルス上澄みをトランスフェクション後４８ｈ（トランスフェクションは０時間として計算できる）、７２ｈのＨＥＫ２９３Ｔ細胞上澄みに収集した。４℃、４０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、細胞破砕片を除去した後、上澄み液を０．４５μｍのフィルターで４０ｍＬの限外濾過遠心分離管に濾過し、レンチウイルス粗抽出液を濾過カップに加え、４℃、２５０００ｇで２．５時間遠心分離した。遠心分離終了後、遠心分離装置を取り出し、濾過カップと下方の濾過液収集カップを分離した。試料収集カップ中の液体はウイルス濃縮液（レンチウイルスＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ又はレンチウイルスＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰを含有する）である。ウイルス濃縮液を移出し、文注後、ウイルス管に保存し、－８０℃で長期間保存した。
【0074】
５．３、遺伝子治療
５．３．１、ＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞感染ウイルス
９６ウェル板に５×１０４のＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞を３個のウェル播種し、総体積が１００ｕｌである培地は、それぞれレンチウイルスＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰとＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰに等力価量で感染し、感染系は以下のとおりである。
５．３．１、ＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞感染ウイルス
９６ウェル板に５×１０４のＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞を３個のウェル播種し、総体積が１００ｕｌである培地は、それぞれレンチウイルスＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰとＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰに等力価量で感染し、感染系は以下のとおりである。
【表9-2】
【0075】
５．３．２、編集効率検出
レンチウイルスＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ又はＬｅｎｔｉ －１１７Ｇ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰに感染したＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞をフローサイトメトリーによりＧＦＰ陽性細胞を選別し、細胞数が５×１０４より大きいまで培養した後、細胞を採取し、ゲノムＤＮＡを抽出し、工程５．１の方法に従ってディープシークエンシングと分析を行った。
レンチウイルスＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ又はＬｅｎｔｉ －１１７Ｇ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰに感染したＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞をフローサイトメトリーによりＧＦＰ陽性細胞を選別し、細胞数が５×１０４より大きいまで培養した後、細胞を採取し、ゲノムＤＮＡを抽出し、工程５．１の方法に従ってディープシークエンシングと分析を行った。
【0076】
結果：ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘに比べて、ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘはＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞における正確な－１１７Ｇ＞Ａ変異を効果的に標的とし、かつより高い活性を示した（図１６）。
【0077】
５．３．３分化及びγグロブリン発現の検出
レンチウイルスＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ又はＬｅｎｔｉ －１１７Ｇ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰに感染したＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞をフローサイトメトリーによりＧＦＰ陽性細胞を選別し、細胞数が５×１０４より大きいまで培養し、約５－７日後、ＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞を収集して分化発現を行った。分化過程は以下のとおりであり、
計数後、１×１０５個のＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞の分化を赤血球分化培地（ＩＭＤＭ）で行うとともに、２％ヒト血ＡＢ型血漿（血清）（Ｇｅｍｉｎｉ、１００－５１２）、１％Ｌ－グルタミン、２ＩＵ／ｍＬヘパリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ、３ＩＵ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、３３０μｇ／ｍＬ Ｈｏｌｏ－ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、２％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、１０μｇ／ｍｌ組み換えヒトインスリンを補充し、８日間分化させた。
レンチウイルスＬｅｎｔｉ－１１７Ｇ－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ又はＬｅｎｔｉ －１１７Ｇ－ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰに感染したＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞をフローサイトメトリーによりＧＦＰ陽性細胞を選別し、細胞数が５×１０４より大きいまで培養し、約５－７日後、ＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞を収集して分化発現を行った。分化過程は以下のとおりであり、
計数後、１×１０５個のＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞の分化を赤血球分化培地（ＩＭＤＭ）で行うとともに、２％ヒト血ＡＢ型血漿（血清）（Ｇｅｍｉｎｉ、１００－５１２）、１％Ｌ－グルタミン、２ＩＵ／ｍＬヘパリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ、３ＩＵ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、３３０μｇ／ｍＬ Ｈｏｌｏ－ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、２％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、１０μｇ／ｍｌ組み換えヒトインスリンを補充し、８日間分化させた。
【0078】
γグロブリン発現検出：８日間分化させた後、細胞を採取してフェノールクロロホルム抽出法で総ｍＲＮＡを抽出した。分離されたｍＲＮＡをＨｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｑ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｖａｚｙｍｅ）で逆転写し、ＱｕａｎｔｉＳｔｕｄｉｏ ３リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）上でｑＰＣＲを行い、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ｑＰＣＲを介してＨＢＧとＨＢＢ ｍＲＮＡに対して定量を行った。プライマー（５’－３’）は以下のとおりであり、
ＨＢＧ－ＱＰＣＲ－Ｆ：ＧＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＴＣＣＴＡＧＴＣＣ、
ＨＢＧ－ＱＰＣＲ－Ｒ：ＡＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡ、
ＨＢＢ－ＱＰＣＲ－Ｆ：ＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧＴＴＡＣ、
ＨＢＢ－ＱＰＣＲ－Ｆ：ＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡ。
ＨＢＧ－ＱＰＣＲ－Ｆ：ＧＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＴＣＣＴＡＧＴＣＣ、
ＨＢＧ－ＱＰＣＲ－Ｒ：ＡＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡ、
ＨＢＢ－ＱＰＣＲ－Ｆ：ＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧＴＴＡＣ、
ＨＢＢ－ＱＰＣＲ－Ｆ：ＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡ。
【0079】
結果：ＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）のＷＴ細胞に比べて、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘは、ＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞におけるγ－グロブリンｍＲＮＡのレベルを著しく高めることができる。ｈｙｅＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘのＨＵＤＥＰ－２（ΔＧγ）細胞におけるγ－グロブリンｍＲＮＡに対するレベル向上程度はｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘの３倍であった（図１７）。
【0080】
六、融合タンパク質ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘを用いたＤＭＤ疾患動物モデルの構築
以下に使用されるマウスは、Ｃ５７／ＢＬ６マウスである。
以下に使用されるマウスは、Ｃ５７／ＢＬ６マウスである。
【0081】
６．１、作動系ｍＲＮＡ及び標的ｓｇＲＮＡ転写鋳型の構築
ＮＣＢＩからマウス関連遺伝子配列をダウンロードし、図１８に示すように、目的部位（ジストロフィン遺伝子、即ちＤＭＤ遺伝子１２番目のエクソンにおける矩形枠の部位）にｓｇＲＮＡ（ＤＭＤ－ｓｇ３標的配列：ＡＣＡＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＧＧ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６）を設計し、Ｏｌｉｇｏプライマーを発注し、アニールにより形成されたｓｇＲＮＡをＴ７ベクター骨格にクローニングし、プライマー対ＩＶＴ－ＰＣＲ－ＦとＩＶＴ－ＰＣＲ－Ｒ（表１０）を用いてＴ７プロモーターを含むＤＭＤ－ｓｇ３鋳型を体外転写法（ＩＶＴ）で増幅し、プライマー対ＩＶＴ－Ｔ７－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－ＦとＩＶＴ－Ｔ７－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｒ（表１０）を用いて、Ｔ７プロモーターをｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ又はＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘのｍＲＮＡ鋳型にＰＣＲにより導入した。
ＮＣＢＩからマウス関連遺伝子配列をダウンロードし、図１８に示すように、目的部位（ジストロフィン遺伝子、即ちＤＭＤ遺伝子１２番目のエクソンにおける矩形枠の部位）にｓｇＲＮＡ（ＤＭＤ－ｓｇ３標的配列：ＡＣＡＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＧＧ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６）を設計し、Ｏｌｉｇｏプライマーを発注し、アニールにより形成されたｓｇＲＮＡをＴ７ベクター骨格にクローニングし、プライマー対ＩＶＴ－ＰＣＲ－ＦとＩＶＴ－ＰＣＲ－Ｒ（表１０）を用いてＴ７プロモーターを含むＤＭＤ－ｓｇ３鋳型を体外転写法（ＩＶＴ）で増幅し、プライマー対ＩＶＴ－Ｔ７－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－ＦとＩＶＴ－Ｔ７－ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ－Ｒ（表１０）を用いて、Ｔ７プロモーターをｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ又はＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘのｍＲＮＡ鋳型にＰＣＲにより導入した。
【0082】
【表10】
【0083】
６．２、ｓｇＲＮＡ（ＤＭＤ－ｓｇ３）体外転写
６．１のＰＣＲ生成物を通常のＤＮＡ生成物精製キットで精製し、精製した後のＰＣＲ生成物を線形化ＤＮＡ鋳型とし、Ｔ７体外転写キット（ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔＴＭ Ｋｉｔ）を用いて体外転写を行い、転写したｓｇＲＮＡを塩化リチウム沈殿法で精製した。
６．１のＰＣＲ生成物を通常のＤＮＡ生成物精製キットで精製し、精製した後のＰＣＲ生成物を線形化ＤＮＡ鋳型とし、Ｔ７体外転写キット（ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔＴＭ Ｋｉｔ）を用いて体外転写を行い、転写したｓｇＲＮＡを塩化リチウム沈殿法で精製した。
【0084】
６．３、作動系ｍＲＮＡ（Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ）の転写
それぞれＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘのＴ７鋳型を体外ＲＮＡ転写キット（ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ）で体外転写して作動系ｍＲＮＡを得て、それを精製した。
それぞれＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘのＴ７鋳型を体外ＲＮＡ転写キット（ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ）で体外転写して作動系ｍＲＮＡを得て、それを精製した。
【0085】
６．４、微量注入混合物の調製
注射混合物をヌクレアーゼフリーの水で調合し、総体積２０μＬ、最終濃度１００ｎｇ／μＬの作動系ｍＲＮＡ（Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘを含有するｍＲＮＡ又はｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘを含有するｍＲＮＡ）と最終濃度２００ｎｇ／μＬのｓｇＲＮＡ（ＤＭＤ－ｓｇ３）との混合液を得た。
注射混合物をヌクレアーゼフリーの水で調合し、総体積２０μＬ、最終濃度１００ｎｇ／μＬの作動系ｍＲＮＡ（Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘを含有するｍＲＮＡ又はｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘを含有するｍＲＮＡ）と最終濃度２００ｎｇ／μＬのｓｇＲＮＡ（ＤＭＤ－ｓｇ３）との混合液を得た。
【0086】
６．５、一細胞期胎芽の収集
（１）１日目：１００μＬ（５ＩＵ）のＰＭＳＧ作動液を午後１－２時の間に６－８週齢のドナー母マウスに腹腔内注射した。
（２）３日目：１００μＬ（５ＩＵ）のｈＣＧ作動液を午後２－４時の間にＰＭＳＧを投与した母マウスに腹腔内注射し、投与した後、ホルモンで処理された後の母マウスと１０－１４週齢の雄マウスとを一対一に同篭した。同時に、発情期にホルモンで処理されていない雌マウスと卵管を結紮した雄マウスを午後４時前後に交配させて偽妊娠母マウスの準備に用いられた。
（３）４日目：朝９点前に、結紮した雄マウスと同篭した受容体母マウスに妊娠栓があるか否かを確認し、妊娠栓のある母マウスを新たな篭内に集中させて午後の胚移植実験に用いられた。
（４）超排卵のドナー母マウスを二酸化炭素窒息法により屠殺し、卵管を取り出し、シャーレに置き、シャーレに予熱されたＭ２培地を加えた。
（５）卵管を別の新たなシャーレに置き、シャーレ内に予熱されたＭ２培地とヒアルロン酸を加え、Ｍ２培地とヒアルロン酸との体積比は９：１であった。実体型顕微鏡下で、卵管の膨大部を摂子で牽引し、卵管からシャーレに胎芽を放出させた。胎芽を卵丘細胞が落ちるまでヒアルロン酸があるＭ２培地にて常にインキュベートした。卵丘細胞を除去した後、胎芽を新たなシャーレに移し、シャーレ内にヒアルロン酸無しのＭ２培地を加え、胎芽をＭ２培地で繰り返し洗浄してヒアルロン酸と卵丘細胞をいずれもきれいに洗浄させた。
（６）きれいに洗浄された胎芽を新たなシャーレに移し、シャーレ内にまず数滴のＫＳＯＭ培地を分散加え、次いで、シャーレに徐々に鉱物油を加え、ＫＳＯＭ培地を鉱物油で分離して被覆させた。一般的に、３５ミリメートルのシャーレに、６個の点のＫＳＯＭ培地を加えることができ、各点は５０μＬとした。５０個の胎芽を一組として、まず中央のＫＳＯＭ培地点に置いて洗浄し、その後、１つの新たな培地点に転移した。微量注入する前に、取り出した胎芽を細胞培養箱のＭ２培地にてインキュベートした。
（１）１日目：１００μＬ（５ＩＵ）のＰＭＳＧ作動液を午後１－２時の間に６－８週齢のドナー母マウスに腹腔内注射した。
（２）３日目：１００μＬ（５ＩＵ）のｈＣＧ作動液を午後２－４時の間にＰＭＳＧを投与した母マウスに腹腔内注射し、投与した後、ホルモンで処理された後の母マウスと１０－１４週齢の雄マウスとを一対一に同篭した。同時に、発情期にホルモンで処理されていない雌マウスと卵管を結紮した雄マウスを午後４時前後に交配させて偽妊娠母マウスの準備に用いられた。
（３）４日目：朝９点前に、結紮した雄マウスと同篭した受容体母マウスに妊娠栓があるか否かを確認し、妊娠栓のある母マウスを新たな篭内に集中させて午後の胚移植実験に用いられた。
（４）超排卵のドナー母マウスを二酸化炭素窒息法により屠殺し、卵管を取り出し、シャーレに置き、シャーレに予熱されたＭ２培地を加えた。
（５）卵管を別の新たなシャーレに置き、シャーレ内に予熱されたＭ２培地とヒアルロン酸を加え、Ｍ２培地とヒアルロン酸との体積比は９：１であった。実体型顕微鏡下で、卵管の膨大部を摂子で牽引し、卵管からシャーレに胎芽を放出させた。胎芽を卵丘細胞が落ちるまでヒアルロン酸があるＭ２培地にて常にインキュベートした。卵丘細胞を除去した後、胎芽を新たなシャーレに移し、シャーレ内にヒアルロン酸無しのＭ２培地を加え、胎芽をＭ２培地で繰り返し洗浄してヒアルロン酸と卵丘細胞をいずれもきれいに洗浄させた。
（６）きれいに洗浄された胎芽を新たなシャーレに移し、シャーレ内にまず数滴のＫＳＯＭ培地を分散加え、次いで、シャーレに徐々に鉱物油を加え、ＫＳＯＭ培地を鉱物油で分離して被覆させた。一般的に、３５ミリメートルのシャーレに、６個の点のＫＳＯＭ培地を加えることができ、各点は５０μＬとした。５０個の胎芽を一組として、まず中央のＫＳＯＭ培地点に置いて洗浄し、その後、１つの新たな培地点に転移した。微量注入する前に、取り出した胎芽を細胞培養箱のＭ２培地にてインキュベートした。
【0087】
６．６、微量注入及び胎芽移植
（１）固定針、注射針及びケイ化ガラススライドガラスを用意し、スライドガラスの中央に鉱油で被覆されたＭ２培地を１滴滴下した。
（２）注射針を毛細管作用によって自動的に吸入させ、かつ工程２．４で調製された微量注入混合液を満たし、注射針を顕微注射器の固定ハンドルに搭載した。
（３）５０個の胎芽をスライドガラスのＭ２培地内に転移させ、固定針を胎芽に接近するように移動させ、胎芽を負圧作用によって固定針に固定させた。胎芽が固定された後に、高倍鏡下で細胞質を見つけ、注射針の先端を透明ベルト、細胞膜を貫通させるように押し、混合液を胎芽の細胞質に注入した。
（４）注射された胎芽細胞を新たなＭ２培地点に転移させた。全ての胎芽が射出されるまで工程（３）及び（４）を繰り返した。一組の実験群を注射した後、胎芽を新たなＫＳＯＭ培地に転移し、胎芽を細胞培養箱に置いて１－２時間又は一夜培養した。全ての胎芽が注射された後、機械力損傷による死亡した胎芽を排除し、健康な胎芽を新たなＫＳＯＭ培地に転移させた。
（５）偽妊娠母マウスに６００μＬのアベルチンを腹腔内注射し、偽妊娠母マウスを麻酔した。剃毛器を用いて母マウスの背部の毛を剃った。毛を剃った後の皮膚を７０％のエタノールで拭いた。
（６）卵巣部に小さな口を切り離し、卵巣の脂肪パッドを鈍頭摂子で牽引して卵巣を引き出し、同時に卵巣を止血鉗子で外側に固定し、鈍頭摂子を用いて卵巣の下側に位置する卵管の漏斗状口を見つけた。
（７）転移針にＭ２培地、２つの小気泡、約１５個の胎芽を順次に吸入させ、気泡は転移針での胎芽の位置を観察しやすいようにした。
（８）卵巣の嚢胞を軽く切り開き、卵巣の漏斗状口を轅で位置決めし、転移針を卵巣の開口部に伸ばし、次いで、転移針内の胎芽を打ち出し、転移針を軽く引き戻した。
（９）卵巣の脂肪パッドを固定した止血鉗子を解放し、卵巣を元の空洞に戻し、それぞれ筋肉開口部及び皮膚開口部を縫合糸で縫合した。
（１０）術後のマウスを恒温３７℃の保温台上に置き、マウス知覚回復を待った後、飼育篭に移して飼育し、分娩まで胎芽の発育を待った。一般的には、移植に成功した母マウスは３週間後にマウス赤ちゃんを生み出す。
（１）固定針、注射針及びケイ化ガラススライドガラスを用意し、スライドガラスの中央に鉱油で被覆されたＭ２培地を１滴滴下した。
（２）注射針を毛細管作用によって自動的に吸入させ、かつ工程２．４で調製された微量注入混合液を満たし、注射針を顕微注射器の固定ハンドルに搭載した。
（３）５０個の胎芽をスライドガラスのＭ２培地内に転移させ、固定針を胎芽に接近するように移動させ、胎芽を負圧作用によって固定針に固定させた。胎芽が固定された後に、高倍鏡下で細胞質を見つけ、注射針の先端を透明ベルト、細胞膜を貫通させるように押し、混合液を胎芽の細胞質に注入した。
（４）注射された胎芽細胞を新たなＭ２培地点に転移させた。全ての胎芽が射出されるまで工程（３）及び（４）を繰り返した。一組の実験群を注射した後、胎芽を新たなＫＳＯＭ培地に転移し、胎芽を細胞培養箱に置いて１－２時間又は一夜培養した。全ての胎芽が注射された後、機械力損傷による死亡した胎芽を排除し、健康な胎芽を新たなＫＳＯＭ培地に転移させた。
（５）偽妊娠母マウスに６００μＬのアベルチンを腹腔内注射し、偽妊娠母マウスを麻酔した。剃毛器を用いて母マウスの背部の毛を剃った。毛を剃った後の皮膚を７０％のエタノールで拭いた。
（６）卵巣部に小さな口を切り離し、卵巣の脂肪パッドを鈍頭摂子で牽引して卵巣を引き出し、同時に卵巣を止血鉗子で外側に固定し、鈍頭摂子を用いて卵巣の下側に位置する卵管の漏斗状口を見つけた。
（７）転移針にＭ２培地、２つの小気泡、約１５個の胎芽を順次に吸入させ、気泡は転移針での胎芽の位置を観察しやすいようにした。
（８）卵巣の嚢胞を軽く切り開き、卵巣の漏斗状口を轅で位置決めし、転移針を卵巣の開口部に伸ばし、次いで、転移針内の胎芽を打ち出し、転移針を軽く引き戻した。
（９）卵巣の脂肪パッドを固定した止血鉗子を解放し、卵巣を元の空洞に戻し、それぞれ筋肉開口部及び皮膚開口部を縫合糸で縫合した。
（１０）術後のマウスを恒温３７℃の保温台上に置き、マウス知覚回復を待った後、飼育篭に移して飼育し、分娩まで胎芽の発育を待った。一般的には、移植に成功した母マウスは３週間後にマウス赤ちゃんを生み出す。
【0088】
６．７、マウスゲノム同定
工程６．６で生み出した１０－１５日程度のマウスを取り、その足の指をせん断してゲノムの同定を行い、具体的な工程は以下のとおりであり、
６．７．１ゲノム抽出
（１）その足の指を１．５ｍＬの遠心分離管に入れ、各管に５００μＬのプロテアーゼＫ：組織溶解液＝１：５００の割合に応じて調製された足の指消化液を加え、５５℃で一夜水浴した。
（２）一夜消化した足の指を取り出し、室温で１０－１５分間放置し、十分に転倒して均一に混合し、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
（３）各管から４００μＬの上澄みを吸い出し、等体積のクロロホルムを加え、ＤＮＡ析出まで十分に均一に混合した後、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
（４）各管に－２０℃の冷蔵庫で事前に予冷された７５％のアルコール２００μＬを加え、軽く均一に混合し、１２０００ｒｐｍで、４℃で５ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨て、清潔な作業台で乾燥させた。
（５）ＤＮＡの量に応じて５０～１００μＬの脱イオン超純水を加え、５５℃で２時間溶解すれば、ＰＣＲ鋳型とすることができる。
６．７．２ゲノムの同定
標的ＤＭＡ－ｓｇ３のプライマー対Ｆ／Ｒ（表１１）を用いて標的を含有するＤＮＡ断片を取得し、まず一世代のシークエンシングによりダブルピークの出現を確認し、その後、ハイスループットのディープシークエンシングを行うことで編集効率を得た。ハイスループットの結果によると、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ処理群で突然変異が生じた１０匹のＦ０のうち、６匹のホモ接合型ＣＡＡからＴＡＡまでの終止ナンセンス突然変異があり（図１９下図で番号が＃ＢＤ０３、＃ＢＤ０５、＃ＢＤ０７、＃ＢＤ１２、＃ＢＤ１５、＃ＢＤ１６であるマウス）、一方、Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ処理群Ｆ０のうち、ＣＡＡからＴＡＡまでの終止ナンセンス突然変異は認められなかった（図１９上図）。ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ処理群のマウスがホモ接合を経た変異に終止コドンＴＡＡを含有するＲｅａｄｓ（ハイスループットのシークエンシング断片）の数が総Ｒｅａｄｓに占める割合は、Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ処理群よりも高い（図２０）。
工程６．６で生み出した１０－１５日程度のマウスを取り、その足の指をせん断してゲノムの同定を行い、具体的な工程は以下のとおりであり、
６．７．１ゲノム抽出
（１）その足の指を１．５ｍＬの遠心分離管に入れ、各管に５００μＬのプロテアーゼＫ：組織溶解液＝１：５００の割合に応じて調製された足の指消化液を加え、５５℃で一夜水浴した。
（２）一夜消化した足の指を取り出し、室温で１０－１５分間放置し、十分に転倒して均一に混合し、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
（３）各管から４００μＬの上澄みを吸い出し、等体積のクロロホルムを加え、ＤＮＡ析出まで十分に均一に混合した後、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
（４）各管に－２０℃の冷蔵庫で事前に予冷された７５％のアルコール２００μＬを加え、軽く均一に混合し、１２０００ｒｐｍで、４℃で５ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨て、清潔な作業台で乾燥させた。
（５）ＤＮＡの量に応じて５０～１００μＬの脱イオン超純水を加え、５５℃で２時間溶解すれば、ＰＣＲ鋳型とすることができる。
６．７．２ゲノムの同定
標的ＤＭＡ－ｓｇ３のプライマー対Ｆ／Ｒ（表１１）を用いて標的を含有するＤＮＡ断片を取得し、まず一世代のシークエンシングによりダブルピークの出現を確認し、その後、ハイスループットのディープシークエンシングを行うことで編集効率を得た。ハイスループットの結果によると、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ処理群で突然変異が生じた１０匹のＦ０のうち、６匹のホモ接合型ＣＡＡからＴＡＡまでの終止ナンセンス突然変異があり（図１９下図で番号が＃ＢＤ０３、＃ＢＤ０５、＃ＢＤ０７、＃ＢＤ１２、＃ＢＤ１５、＃ＢＤ１６であるマウス）、一方、Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ処理群Ｆ０のうち、ＣＡＡからＴＡＡまでの終止ナンセンス突然変異は認められなかった（図１９上図）。ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ処理群のマウスがホモ接合を経た変異に終止コドンＴＡＡを含有するＲｅａｄｓ（ハイスループットのシークエンシング断片）の数が総Ｒｅａｄｓに占める割合は、Ａ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ処理群よりも高い（図２０）。
【0089】
【表11】
【0090】
６．８、ＤＭＤ遺伝子の表現型同定
５週齢の野生型マウス（ブランク）及び２．７．２で同定されたＤＭＤ遺伝子突然変異マウスを採取し、以下の方法に従って免疫組織化学検出を行った。
マウスの脛骨前筋を採取し、アルコール、ＰＢＳで洗浄した。これを、ＯＴＣ膠を敷いた小さな正方体箱に入れ、イソベンタンビーカーに置き、液体窒素で冷凍し、約３０ｓ後に取り出し、－２０℃で保存し、その後、凍結切片を行った。作製した切片をＰＢＳＴで３回／５ｍｉｎ洗浄し、組織位置に合わせて油輪を描き、ブロッキング液を加えてブロッキングし、１ｈブロッキングした後、それぞれラミニン（Ｌａｍｉｎｉｎ）一次抗体又はジストロフィン（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）一次抗体（１：５００で希釈した一次抗体ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１５７５）又は一次抗体ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５２７７））を用いて一夜インキュベートした。ＰＢＳＴで３回／５ｍｉｎ洗浄し、次いで、１：１０００の抗体ウサギ希釈液で２ｈ二次抗体培養し、ＰＢＳＴで３回／５ｍｉｎ洗浄した後、１：１００で希釈したＤＡＰＩを加えて１０ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳＴで３回／５ｍｉｎ洗浄し、消光防止剤を滴下し、カバーガラスを加え、マニキュアで封止し、最後に蛍光顕微鏡を用いて切片の蛍光を観察した。
５週齢の野生型マウス（ブランク）及び２．７．２で同定されたＤＭＤ遺伝子突然変異マウスを採取し、以下の方法に従って免疫組織化学検出を行った。
マウスの脛骨前筋を採取し、アルコール、ＰＢＳで洗浄した。これを、ＯＴＣ膠を敷いた小さな正方体箱に入れ、イソベンタンビーカーに置き、液体窒素で冷凍し、約３０ｓ後に取り出し、－２０℃で保存し、その後、凍結切片を行った。作製した切片をＰＢＳＴで３回／５ｍｉｎ洗浄し、組織位置に合わせて油輪を描き、ブロッキング液を加えてブロッキングし、１ｈブロッキングした後、それぞれラミニン（Ｌａｍｉｎｉｎ）一次抗体又はジストロフィン（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）一次抗体（１：５００で希釈した一次抗体ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１５７５）又は一次抗体ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５２７７））を用いて一夜インキュベートした。ＰＢＳＴで３回／５ｍｉｎ洗浄し、次いで、１：１０００の抗体ウサギ希釈液で２ｈ二次抗体培養し、ＰＢＳＴで３回／５ｍｉｎ洗浄した後、１：１００で希釈したＤＡＰＩを加えて１０ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳＴで３回／５ｍｉｎ洗浄し、消光防止剤を滴下し、カバーガラスを加え、マニキュアで封止し、最後に蛍光顕微鏡を用いて切片の蛍光を観察した。
【0091】
結果にあるように、ＷＴ（＋／＋）とＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ処理群マウス（例えば＃ＡＤ２６）に比べて、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ処理群マウスでＤＭＡ－ｓｇ３標的配列の１０番目のＣ～Ｔホモ接合ナンセンス突然変異を引き起こした６匹のＦ０世代マウス（例えば、図２１の＃ＢＤ０３）のうちのＤＭＤのみが蛋白発現が得られず（図２１）、これもＤＭＤ動物疾患モデルの構築に成功したことを証明した。
【0092】
蛍光観察結果によると、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘとＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ編集後に生成したＦ０世代マウスのまとめを同時に得て、まとめを表１２に示す。
【表12】
【0093】
６．９、ＤＭＤ突然変異マウスの生殖系遺伝分析（Ｆ０→Ｆ１）
雌ホモ接合のＤＭＤ表現型を有する＃ＢＤ１２（Ｆ０）を雄野生型マウスと交配し、８匹のホモ接合のＦ１を得て、生まれたＦ１に対して遺伝子型同定を行い、ｓａｎｇｅｒシークエンシング結果から、１匹あたりＦ１のナンセンス突然変異発生のＲｅａｄｓ頻度は、いずれも９６％を超え、即ちこのようなナンセンス突然変異は、Ｆ１世代に安定遺伝できることを発見した（図２２）。
雌ホモ接合のＤＭＤ表現型を有する＃ＢＤ１２（Ｆ０）を雄野生型マウスと交配し、８匹のホモ接合のＦ１を得て、生まれたＦ１に対して遺伝子型同定を行い、ｓａｎｇｅｒシークエンシング結果から、１匹あたりＦ１のナンセンス突然変異発生のＲｅａｄｓ頻度は、いずれも９６％を超え、即ちこのようなナンセンス突然変異は、Ｆ１世代に安定遺伝できることを発見した（図２２）。
【0094】
６．１０、オフターゲット検出
ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）のＣａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ機能を利用してオフターゲットプライマー（表１３）を設計した。まず、試験ツールのＰＡＭのタイプ及び試験対象種タイプ（例えば、マウスはＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ｍｍ１０）－Ｍｏｕｓｅとする）を選択し、設計したｓｇＲＮＡ配列のＰＡＭ除去部分をＱｕｅｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓの四角空欄に記入し、ミスマッチ塩基を３個以内に選択し、形成されたＤＮＡ Ｂｕｌｇｅ Ｓｉｚｅを１以内とし、そして、提出して相応なオフターゲットプライマーを得た。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）のＣａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ機能を利用してオフターゲットプライマー（表１３）を設計した。まず、試験ツールのＰＡＭのタイプ及び試験対象種タイプ（例えば、マウスはＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ｍｍ１０）－Ｍｏｕｓｅとする）を選択し、設計したｓｇＲＮＡ配列のＰＡＭ除去部分をＱｕｅｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓの四角空欄に記入し、ミスマッチ塩基を３個以内に選択し、形成されたＤＮＡ Ｂｕｌｇｅ Ｓｉｚｅを１以内とし、そして、提出して相応なオフターゲットプライマーを得た。
【0095】
上記オフターゲットプライマーを用いて、ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘで編集されたＦ０マウスゲノムＤＮＡ（ＷＴをブランクとする）に対してＰＣＲをそれぞれ行った後に、生成物に対してハイスループットのディープシークエンシングを行い、オフターゲット効率結果（図２３）を得た。
【0096】
【表13】
【0097】
図２３の結果にあるように、ブランクに比べて、融合タンパク質ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ及びＤＭＤ－ｓｇ３は、表１３の１５個のＤＭＤ－ｓｇ３標的と類似する部位（即ち、オフターゲット部位）に対してＣ～Ｔの編集がほとんど起こらず、即ち、本願の融合タンパク質ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ及びＤＭＤ－ｓｇ３は、オフターゲット効果がほとんど生じない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-09-02
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0097】
図２３の結果にあるように、ブランクに比べて、融合タンパク質ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ及びＤＭＤ－ｓｇ３は、表１３の１５個のＤＭＤ－ｓｇ３標的と類似する部位（即ち、オフターゲット部位）に対してＣ～Ｔの編集がほとんど起こらず、即ち、本願の融合タンパク質ｈｙＡ３Ａ－ＢＥ４ｍａｘ及びＤＭＤ－ｓｇ３は、オフターゲット効果がほとんど生じない。
本願発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
ゲノム編集効率を向上させる融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメイン、ヌクレオシドデアミナーゼ及びヌクレアーゼを含む、ことを特徴とする融合タンパク質。
＜２＞
前記融合タンパク質の接続順は、前記ヌクレオシドデアミナーゼが前記ヌクレアーゼのＮ端又はＣ端に位置し、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインが前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼのＮ端、Ｃ端及び／又は前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼとの間に位置する、ことを特徴とする＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜３＞
前記ヌクレオシドデアミナーゼが前記ヌクレアーゼのＮ端に位置する、ことを特徴とする＜２＞に記載の融合タンパク質。
＜４＞
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインが前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼとの間に位置する、ことを特徴とする＜３＞に記載の融合タンパク質。
＜５＞
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及び／又は非配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む、ことを特徴とする＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜６＞
前記非配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＰＡ７０、ＲＰＡ３２、ＢＲＣＡ２、ｈｎＲＮＰＫ、ＰＵＦ６０及びＲａｄ５１のうちのいずれか１つ又は複数から選ばれ、
前記配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＴＥＢＰ、Ｔｅｂ１及びＰＯＴ１のうちのいずれか１つ又は複数から選ばれる、ことを特徴とする＜５＞に記載の融合タンパク質。
＜７＞
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のＯＢ折り畳み、ＫＨドメイン、ＲＲＭＳ、渦状ドメインという４つのドメインのうちの少なくとも１つ又は４つのドメインのうちの一本鎖ＤＮＡと結合する機能を有する一部ポリペプチドフラグメント及びその任意の組み合わせを含む、ことを特徴とする＜５＞に記載の融合タンパク質。
＜８＞
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインは、Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメイン及び／又はＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインを含む、ことを特徴とする＜５＞に記載の融合タンパク質。
＜９＞
前記Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１で示される配列を含み、
及び／又は、前記Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメインのコード配列は、配列番号２で示される配列を含む、ことを特徴とする＜８＞に記載の融合タンパク質。
＜１０＞
前記ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１１で示される配列を含み、
及び／又は、前記ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのコード配列は、配列番号１２で示される配列を含む、ことを特徴とする＜８＞に記載の融合タンパク質。
＜１１＞
（欠落）
＜１２＞
前記デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼを含む、ことを特徴とする＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜１３＞
前記シチジンデアミナーゼは、ラット由来シチジンデアミナーゼを含む、ことを特徴とする＜１２＞に記載の融合タンパク質。
＜１４＞
前記ラット由来シチジンデアミナーゼのアミノ酸配列は、配列番号３で示される配列を含み、
及び／又は、前記ラット由来シチジンデアミナーゼのコード配列は、配列番号４で示される配列を含む、ことを特徴とする＜１３＞に記載の融合タンパク質。
＜１５＞
前記シチジンデアミナーゼは、ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａを含む、ことを特徴とする＜１２＞に記載の融合タンパク質。
＜１６＞
前記ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、配列番号１３で示される配列を含み、
及び／又は、前記ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、配列番号１４で示される配列を含む、ことを特徴とする＜１５＞に記載の融合タンパク質。
＜１７＞
前記シチジンデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａの突然変異体を含み、前記突然変異体は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａの５７番目のアスパラギンをグリシンに突然変異させたものである、ことを特徴とする＜１２＞に記載の融合タンパク質。
＜１８＞
前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａは、ヒトに由来する、ことを特徴とする＜１７＞に記載の融合タンパク質。
＜１９＞
前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、配列番号１３で示される配列を含み、
及び／又は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、配列番号１４で示される配列を含む、ことを特徴とする＜１８＞に記載の融合タンパク質。
＜２０＞
前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号１５で示される配列を含み、
及び／又は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、配列番号１６で示される配列を含む、ことを特徴とする＜１７＞に記載の融合タンパク質。
＜２１＞
前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｃｐｆ１のうちの１つ又はいずれか複数から選ばれる、ことを特徴とする＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜２２＞
前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、ことを特徴とする＜２１＞に記載の融合タンパク質。
＜２３＞
前記Ｃａｓ９は、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌又はサーモフィルス菌に由来するＣａｓ９から選ばれる、ことを特徴とする＜２２＞に記載の融合タンパク質。
＜２４＞
前記Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９突然変異体ＶＱＲ－ｓｐＣａｓ９、ＶＲＥＲ－ｓｐＣａｓ９、又はｓｐＣａｓ９ｎから選ばれる、ことを特徴とする＜２２＞に記載の融合タンパク質。
＜２５＞
前記ｓｐＣａｓ９ｎのアミノ酸配列は、配列番号５で示される配列を含み、
及び／又は、前記ｓｐＣａｓ９ｎのコード配列は、配列番号６で示される配列を含む、ことを特徴とする＜２４＞に記載の融合タンパク質。
＜２６＞
前記融合タンパク質は、ＮＬＳをさらに含む、ことを特徴とする＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜２７＞
前記ＮＬＳは、前記融合タンパク質の少なくとも一端に位置する、ことを特徴とする＜２６＞に記載の融合タンパク質。
＜２８＞
前記ＮＬＳのアミノ酸配列は、配列番号７で示される配列を含み、
及び／又は、前記ＮＬＳのコード配列は、配列番号８で示される配列を含む、ことを特徴とする＜２６＞に記載の融合タンパク質。
＜２９＞
前記融合タンパク質は、２つ以上のコピーのＵＧＩをさらに含む、ことを特徴とする＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜３０＞
前記ＵＧＩは、前記融合タンパク質の少なくとも一端に位置する、ことを特徴とする＜２９＞に記載の融合タンパク質。
＜３１＞
前記ＵＧＩのアミノ酸配列は、配列番号９で示される配列を含み、
及び／又は、前記ＵＧＩのコード配列は、配列番号１０で示される配列を含む、ことを特徴とする＜２９＞に記載の融合タンパク質。
＜３２＞
Ａ）＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする遺伝子、
Ｂ）Ａ）に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター、
Ｃ）＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質を含有するか、又はＡ）に記載の遺伝子を含有する組み換え細胞又は組み換え体のＡ）～Ｃ）生体材料のうちのいずれか１つ。
＜３３＞
前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞である、ことを特徴とする＜３２＞に記載の生体材料。
＜３４＞
細胞内の標的遺伝子に対してゲノム編集を行うｓｇＲＮＡであって、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７～３６のうちの少なくとも１つを含む、ことを特徴とするｓｇＲＮＡ。
＜３５＞
前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞である、ことを特徴とする＜３４＞に記載のｓｇＲＮＡ。
＜３６＞
前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である、ことを特徴とする＜３４＞に記載のｓｇＲＮＡ。
＜３７＞
単一塩基ゲノム編集システムであって、前記システムは、＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質、及び／又は＜３２＞又は＜３３＞に記載の生体材料、及び前記融合タンパク質が目的細胞における標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導するｓｇＲＮＡを含む、ことを特徴とする単一塩基ゲノム編集システム。
＜３８＞
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７～３６のうちの少なくとも１つを含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞であり、
及び／又は、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である、ことを特徴とする＜３７＞に記載の単一塩基ゲノム編集システム。
＜３９＞
ゲノム編集製品、疾患治療及び／又は予防製品、動物モデル、又は植物新品種の製造における、＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質、＜３２＞又は＜３３＞に記載の生体材料、＜３４＞～＜３６＞のいずれか１つに記載のｓｇＲＮＡ、又は＜３７＞又は＜３８＞に記載の単一塩基ゲノム編集システムの使用。
＜４０＞
前記疾患は、β異常ヘモグロビン症であり、前記β異常ヘモグロビン症は、β地中海貧血及び／又は鎌状赤血球貧血症を含む、ことを特徴とする＜３９＞に記載の応用。
＜４１＞
＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質とｓｇＲＮＡを用いて細胞に導入し、標的遺伝子に対してゲノム編集を行う工程を含む単一塩基ゲノム編集効率を向上させる方法であって、前記ｓｇＲＮＡは、前記融合タンパク質が前記標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導する、方法。
＜４２＞
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７～３６のうちの少なくとも１つを含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞であり、
及び／又は、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である、ことを特徴とする＜４１＞に記載の方法。
＜４３＞
＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質とｓｇＲＮＡを用いて動物細胞に導入し、標的遺伝子に対してゲノム編集を行う工程を含む、ことを特徴とする疾患動物モデルの構築方法。
＜４４＞
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７～３６のうちの少なくとも１つを含む、ことを特徴とする＜４３＞に記載の方法。
＜４５＞
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号３６で示される配列を含み、前記標的遺伝子は、ＤＭＤ遺伝子を含む、ことを特徴とする＜４４＞に記載の方法。
＜４６＞
前記動物は、哺乳動物であり、
及び／又は、前記細胞は、胚細胞であり、
及び／又は、前記導入の方式は、ベクター形質転換、微量注入、トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヒートショック、エレクトロポレーション、形質導入、遺伝子銃、ＤＥＡＥ－グルカン媒介の転移のうちの１つ又はいずれか幾つかの組み合わせであり、
及び／又は、前記導入は、＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質のｍＲＮＡと前記ｓｇＲＮＡを用いて行われる、ことを特徴とする＜４３＞に記載の方法。
＜４７＞
前記哺乳動物は、ラット又はマウスであり、
及び／又は、前記導入の方式が微量注入である場合、前記導入で使用される＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質のｍＲＮＡの濃度は、１～１０００ｎｇ／μＬである、ことを特徴とする＜４６＞に記載の方法。
＜４８＞
前記導入で使用される＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質のｍＲＮＡと前記導入で使用される前記ｓｇＲＮＡとの濃度比は、１：（５～１）である、ことを特徴とする＜４７＞に記載の方法。
＜４９＞
医薬のスクリーニング、疾患治療効果評価又は疾患治療メカニズム研究における、＜４３＞～＜４８＞のいずれか１つに記載の方法で得られた動物モデルの使用。
＜５０＞
β異常ヘモグロビン症を治療及び／又は予防するための製品であって、前記製品には、＜３２＞のＡ）における前記遺伝子と、ｓｇＲＮＡの送達ベクターとを含み、
前記ｓｇＲＮＡは、前記融合タンパク質が目的細胞における標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導し、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である、ことを特徴とする製品。
＜５１＞
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号３５で示される配列を含み、
及び／又は、前記β異常ヘモグロビン症は、β地中海貧血及び／又は鎌状赤血球貧血症を含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞である、ことを特徴とする＜５０＞に記載の製品。
＜５２＞
前記送達ベクターは、ウイルスベクター、及び／又は非ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及び／又は腫瘍溶解性ウイルスベクターを含み、前記非ウイルスベクターは、陽イオン高分子ポリマー、及び／又はリポソームを含む、ことを特徴とする＜５０＞に記載の製品。
本願発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
ゲノム編集効率を向上させる融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメイン、ヌクレオシドデアミナーゼ及びヌクレアーゼを含む、ことを特徴とする融合タンパク質。
＜２＞
前記融合タンパク質の接続順は、前記ヌクレオシドデアミナーゼが前記ヌクレアーゼのＮ端又はＣ端に位置し、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインが前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼのＮ端、Ｃ端及び／又は前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼとの間に位置する、ことを特徴とする＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜３＞
前記ヌクレオシドデアミナーゼが前記ヌクレアーゼのＮ端に位置する、ことを特徴とする＜２＞に記載の融合タンパク質。
＜４＞
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインが前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼとの間に位置する、ことを特徴とする＜３＞に記載の融合タンパク質。
＜５＞
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及び／又は非配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む、ことを特徴とする＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜６＞
前記非配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＰＡ７０、ＲＰＡ３２、ＢＲＣＡ２、ｈｎＲＮＰＫ、ＰＵＦ６０及びＲａｄ５１のうちのいずれか１つ又は複数から選ばれ、
前記配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＴＥＢＰ、Ｔｅｂ１及びＰＯＴ１のうちのいずれか１つ又は複数から選ばれる、ことを特徴とする＜５＞に記載の融合タンパク質。
＜７＞
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のＯＢ折り畳み、ＫＨドメイン、ＲＲＭＳ、渦状ドメインという４つのドメインのうちの少なくとも１つ又は４つのドメインのうちの一本鎖ＤＮＡと結合する機能を有する一部ポリペプチドフラグメント及びその任意の組み合わせを含む、ことを特徴とする＜５＞に記載の融合タンパク質。
＜８＞
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインは、Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメイン及び／又はＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインを含む、ことを特徴とする＜５＞に記載の融合タンパク質。
＜９＞
前記Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１で示される配列を含み、
及び／又は、前記Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメインのコード配列は、配列番号２で示される配列を含む、ことを特徴とする＜８＞に記載の融合タンパク質。
＜１０＞
前記ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１１で示される配列を含み、
及び／又は、前記ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのコード配列は、配列番号１２で示される配列を含む、ことを特徴とする＜８＞に記載の融合タンパク質。
＜１１＞
（欠落）
＜１２＞
前記デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼを含む、ことを特徴とする＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜１３＞
前記シチジンデアミナーゼは、ラット由来シチジンデアミナーゼを含む、ことを特徴とする＜１２＞に記載の融合タンパク質。
＜１４＞
前記ラット由来シチジンデアミナーゼのアミノ酸配列は、配列番号３で示される配列を含み、
及び／又は、前記ラット由来シチジンデアミナーゼのコード配列は、配列番号４で示される配列を含む、ことを特徴とする＜１３＞に記載の融合タンパク質。
＜１５＞
前記シチジンデアミナーゼは、ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａを含む、ことを特徴とする＜１２＞に記載の融合タンパク質。
＜１６＞
前記ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、配列番号１３で示される配列を含み、
及び／又は、前記ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、配列番号１４で示される配列を含む、ことを特徴とする＜１５＞に記載の融合タンパク質。
＜１７＞
前記シチジンデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａの突然変異体を含み、前記突然変異体は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａの５７番目のアスパラギンをグリシンに突然変異させたものである、ことを特徴とする＜１２＞に記載の融合タンパク質。
＜１８＞
前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａは、ヒトに由来する、ことを特徴とする＜１７＞に記載の融合タンパク質。
＜１９＞
前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、配列番号１３で示される配列を含み、
及び／又は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、配列番号１４で示される配列を含む、ことを特徴とする＜１８＞に記載の融合タンパク質。
＜２０＞
前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号１５で示される配列を含み、
及び／又は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、配列番号１６で示される配列を含む、ことを特徴とする＜１７＞に記載の融合タンパク質。
＜２１＞
前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｃｐｆ１のうちの１つ又はいずれか複数から選ばれる、ことを特徴とする＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜２２＞
前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、ことを特徴とする＜２１＞に記載の融合タンパク質。
＜２３＞
前記Ｃａｓ９は、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌又はサーモフィルス菌に由来するＣａｓ９から選ばれる、ことを特徴とする＜２２＞に記載の融合タンパク質。
＜２４＞
前記Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９突然変異体ＶＱＲ－ｓｐＣａｓ９、ＶＲＥＲ－ｓｐＣａｓ９、又はｓｐＣａｓ９ｎから選ばれる、ことを特徴とする＜２２＞に記載の融合タンパク質。
＜２５＞
前記ｓｐＣａｓ９ｎのアミノ酸配列は、配列番号５で示される配列を含み、
及び／又は、前記ｓｐＣａｓ９ｎのコード配列は、配列番号６で示される配列を含む、ことを特徴とする＜２４＞に記載の融合タンパク質。
＜２６＞
前記融合タンパク質は、ＮＬＳをさらに含む、ことを特徴とする＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜２７＞
前記ＮＬＳは、前記融合タンパク質の少なくとも一端に位置する、ことを特徴とする＜２６＞に記載の融合タンパク質。
＜２８＞
前記ＮＬＳのアミノ酸配列は、配列番号７で示される配列を含み、
及び／又は、前記ＮＬＳのコード配列は、配列番号８で示される配列を含む、ことを特徴とする＜２６＞に記載の融合タンパク質。
＜２９＞
前記融合タンパク質は、２つ以上のコピーのＵＧＩをさらに含む、ことを特徴とする＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜３０＞
前記ＵＧＩは、前記融合タンパク質の少なくとも一端に位置する、ことを特徴とする＜２９＞に記載の融合タンパク質。
＜３１＞
前記ＵＧＩのアミノ酸配列は、配列番号９で示される配列を含み、
及び／又は、前記ＵＧＩのコード配列は、配列番号１０で示される配列を含む、ことを特徴とする＜２９＞に記載の融合タンパク質。
＜３２＞
Ａ）＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする遺伝子、
Ｂ）Ａ）に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター、
Ｃ）＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質を含有するか、又はＡ）に記載の遺伝子を含有する組み換え細胞又は組み換え体のＡ）～Ｃ）生体材料のうちのいずれか１つ。
＜３３＞
前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞である、ことを特徴とする＜３２＞に記載の生体材料。
＜３４＞
細胞内の標的遺伝子に対してゲノム編集を行うｓｇＲＮＡであって、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７～３６のうちの少なくとも１つを含む、ことを特徴とするｓｇＲＮＡ。
＜３５＞
前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞である、ことを特徴とする＜３４＞に記載のｓｇＲＮＡ。
＜３６＞
前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である、ことを特徴とする＜３４＞に記載のｓｇＲＮＡ。
＜３７＞
単一塩基ゲノム編集システムであって、前記システムは、＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質、及び／又は＜３２＞又は＜３３＞に記載の生体材料、及び前記融合タンパク質が目的細胞における標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導するｓｇＲＮＡを含む、ことを特徴とする単一塩基ゲノム編集システム。
＜３８＞
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７～３６のうちの少なくとも１つを含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞であり、
及び／又は、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である、ことを特徴とする＜３７＞に記載の単一塩基ゲノム編集システム。
＜３９＞
ゲノム編集製品、疾患治療及び／又は予防製品、動物モデル、又は植物新品種の製造における、＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質、＜３２＞又は＜３３＞に記載の生体材料、＜３４＞～＜３６＞のいずれか１つに記載のｓｇＲＮＡ、又は＜３７＞又は＜３８＞に記載の単一塩基ゲノム編集システムの使用。
＜４０＞
前記疾患は、β異常ヘモグロビン症であり、前記β異常ヘモグロビン症は、β地中海貧血及び／又は鎌状赤血球貧血症を含む、ことを特徴とする＜３９＞に記載の応用。
＜４１＞
＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質とｓｇＲＮＡを用いて細胞に導入し、標的遺伝子に対してゲノム編集を行う工程を含む単一塩基ゲノム編集効率を向上させる方法であって、前記ｓｇＲＮＡは、前記融合タンパク質が前記標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導する、方法。
＜４２＞
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７～３６のうちの少なくとも１つを含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞であり、
及び／又は、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である、ことを特徴とする＜４１＞に記載の方法。
＜４３＞
＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質とｓｇＲＮＡを用いて動物細胞に導入し、標的遺伝子に対してゲノム編集を行う工程を含む、ことを特徴とする疾患動物モデルの構築方法。
＜４４＞
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７～３６のうちの少なくとも１つを含む、ことを特徴とする＜４３＞に記載の方法。
＜４５＞
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号３６で示される配列を含み、前記標的遺伝子は、ＤＭＤ遺伝子を含む、ことを特徴とする＜４４＞に記載の方法。
＜４６＞
前記動物は、哺乳動物であり、
及び／又は、前記細胞は、胚細胞であり、
及び／又は、前記導入の方式は、ベクター形質転換、微量注入、トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヒートショック、エレクトロポレーション、形質導入、遺伝子銃、ＤＥＡＥ－グルカン媒介の転移のうちの１つ又はいずれか幾つかの組み合わせであり、
及び／又は、前記導入は、＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質のｍＲＮＡと前記ｓｇＲＮＡを用いて行われる、ことを特徴とする＜４３＞に記載の方法。
＜４７＞
前記哺乳動物は、ラット又はマウスであり、
及び／又は、前記導入の方式が微量注入である場合、前記導入で使用される＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質のｍＲＮＡの濃度は、１～１０００ｎｇ／μＬである、ことを特徴とする＜４６＞に記載の方法。
＜４８＞
前記導入で使用される＜１＞～＜３１＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質のｍＲＮＡと前記導入で使用される前記ｓｇＲＮＡとの濃度比は、１：（５～１）である、ことを特徴とする＜４７＞に記載の方法。
＜４９＞
医薬のスクリーニング、疾患治療効果評価又は疾患治療メカニズム研究における、＜４３＞～＜４８＞のいずれか１つに記載の方法で得られた動物モデルの使用。
＜５０＞
β異常ヘモグロビン症を治療及び／又は予防するための製品であって、前記製品には、＜３２＞のＡ）における前記遺伝子と、ｓｇＲＮＡの送達ベクターとを含み、
前記ｓｇＲＮＡは、前記融合タンパク質が目的細胞における標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導し、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１とＨＢＧ２プロモーター領域である、ことを特徴とする製品。
＜５１＞
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号３５で示される配列を含み、
及び／又は、前記β異常ヘモグロビン症は、β地中海貧血及び／又は鎌状赤血球貧血症を含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞である、ことを特徴とする＜５０＞に記載の製品。
＜５２＞
前記送達ベクターは、ウイルスベクター、及び／又は非ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及び／又は腫瘍溶解性ウイルスベクターを含み、前記非ウイルスベクターは、陽イオン高分子ポリマー、及び／又はリポソームを含む、ことを特徴とする＜５０＞に記載の製品。
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム編集効率を向上させる融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメイン、ヌクレオシドデアミナーゼ及びヌクレアーゼを含む、ことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項2】
前記融合タンパク質の接続順は、前記ヌクレオシドデアミナーゼが前記ヌクレアーゼのＮ端又はＣ端に位置し、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインが前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼのＮ端、Ｃ端及び／又は前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼとの間に位置する、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質であって、
好ましくは、前記ヌクレオシドデアミナーゼが前記ヌクレアーゼのＮ端に位置し、
より好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインが前記ヌクレオシドデアミナーゼと前記ヌクレアーゼとの間に位置する、
融合タンパク質。
【請求項3】
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及び／又は非配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質であって、
好ましくは、前記非配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＰＡ７０、ＲＰＡ３２、ＢＲＣＡ２、ｈｎＲＮＰＫ、ＰＵＦ６０及びＲａｄ５１のうちから選ばれるいずれか１つ又は複数であり、前記配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＴＥＢＰ、Ｔｅｂ１及びＰＯＴ１のうちから選ばれるいずれか１つ又は複数であり、
より好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のＯＢ折り畳み、ＫＨドメイン、ＲＲＭＳ、渦状ドメインという４つのドメインのうちの少なくとも１つ又は４つのドメインのうちの一本鎖ＤＮＡと結合する機能を有する一部ポリペプチドフラグメント及びその任意の組み合わせを含み、
さらに好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質機能ドメインは、Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメイン及び／又はＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインを含む、
融合タンパク質。
【請求項4】
前記Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１で示される配列を含み、及び／又は、前記Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合ドメインのコード配列は、配列番号２で示される配列を含む、又は、前記ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１１で示される配列を含み、及び／又は、前記ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのコード配列は、配列番号１２で示される配列を含む
ことを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質であって、
好ましくは、前記シチジンデアミナーゼは、ラット由来シチジンデアミナーゼ又はヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａを含む、
融合タンパク質。
【請求項6】
前記ラット由来シチジンデアミナーゼのアミノ酸配列は、配列番号３で示される配列を含み、及び／又は、前記ラット由来シチジンデアミナーゼのコード配列は、配列番号４で示される配列を含む、又は、前記ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、配列番号１３で示される配列を含む、
及び／又は、前記ヒト由来シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、配列番号１４で示される配列を含む
ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記シチジンデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａの突然変異体を含み、前記突然変異体は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａの５７番目のアスパラギンをグリシンに突然変異させたものである、ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質であって、
好ましくは、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａは、ヒトに由来する
融合タンパク質。
【請求項8】
前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのアミノ酸配列は、配列番号１３で示される配列を含み、及び／又は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、配列番号１４で示される配列を含む、又は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号１５で示される配列を含み、及び／又は、前記シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ａのコード配列は、配列番号１６で示される配列を含む
ことを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｃｐｆ１のうちの１つ又はいずれか複数から選ばれる、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質であって、
好ましくは、前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であり、
より好ましくは、前記Ｃａｓ９は、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌若しくはサーモフィルス菌に由来するＣａｓ９から選ばれ、又は前記Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９突然変異体ＶＱＲ－ｓｐＣａｓ９、ＶＲＥＲ－ｓｐＣａｓ９、若しくはｓｐＣａｓ９ｎから選ばれ、
さらに好ましくは、前記ｓｐＣａｓ９ｎのアミノ酸配列は、配列番号５で示される配列を含み、及び／又は、前記ｓｐＣａｓ９ｎのコード配列は、配列番号６で示される配列を含む
融合タンパク質。
【請求項10】
前記融合タンパク質は、ＮＬＳをさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質であって、
好ましくは、
前記ＮＬＳは、前記融合タンパク質の少なくとも一端に位置する、
又は、前記ＮＬＳのアミノ酸配列は、配列番号７で示される配列を含み、及び／又は、前記ＮＬＳのコード配列は、配列番号８で示される配列を含む、
融合タンパク質。
【請求項11】
前記融合タンパク質は、２つ以上のコピーのＵＧＩをさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質であって、
好ましくは、
前記ＵＧＩは、前記融合タンパク質の少なくとも一端に位置する、
又は、前記ＵＧＩのアミノ酸配列は、配列番号９で示される配列を含み、及び／又は、前記ＵＧＩのコード配列は、配列番号１０で示される配列を含む、
融合タンパク質。
【請求項12】
Ａ）請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子、Ｂ）Ａ）に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター、
Ｃ）請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有するか、又はＡ）に記載の遺伝子を含有する組み換え細胞又は組み換え体
である生体材料のうちのいずれか１つであって、
好ましくは、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞である。
【請求項13】
細胞内の標的遺伝子に対してゲノム編集を行うｓｇＲＮＡであって、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７～３６のうちの少なくとも１つを含む、ことを特徴とするｓｇＲＮＡであって、
好ましくは、
前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞である、
又は、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１プロモーター領域又はＨＢＧ２プロモーター領域にある、
ｓｇＲＮＡ。
【請求項14】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質、及び／又は請求項１２に記載の生体材料、及び前記融合タンパク質が目的細胞における標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導するｓｇＲＮＡを含む、ことを特徴とする単一塩基ゲノム編集システムであって、
好ましくは、
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７～３６のうちの少なくとも１つを含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞であり、
及び／又は、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１プロモーター領域又はＨＢＧ２プロモーター領域にある、
単一塩基ゲノム編集システム。
【請求項15】
ゲノム編集製品、疾患治療及び／又は予防製品、動物モデル、又は植物新品種の製造に使用するための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１２に記載の生体材料、請求項１３に記載のｓｇＲＮＡ、又は請求項１４に記載の単一塩基ゲノム編集システム、
好ましくは、前記疾患はβ異常ヘモグロビン症であり、前記β異常ヘモグロビン症はβ地中海貧血及び／又は鎌状赤血球貧血症を含む。
【請求項16】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質とｓｇＲＮＡを用いて細胞に導入し、標的遺伝子に対してゲノム編集を行う工程を含む単一塩基ゲノム編集効率を向上させる方法であって、前記ｓｇＲＮＡは、前記融合タンパク質が標的細胞中において前記標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導し、前記標的細胞は非ヒト細胞であり、
好ましくは、
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７～３６のうちの少なくとも１つを含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞であり、
及び／又は、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１プロモーター領域又はＨＢＧ２プロモーター領域にある、
方法。
【請求項17】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質とｓｇＲＮＡを用いて動物細胞に導入し、標的遺伝子に対してゲノム編集を行う工程を含む、ことを特徴とする疾患動物モデルの構築方法であって、前記動物モデルは非ヒト動物モデルであり、
好ましくは、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７～３６のうちの少なくとも１つを含み、
より好ましくは、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号３６で示される配列を含み、前記標的遺伝子は、ＤＭＤ遺伝子を含む、
方法。
【請求項18】
前記動物は、ヒト以外の哺乳動物であり、及び／又は、前記細胞は、非ヒト細胞である胚細胞であり、
及び／又は、前記導入の方式は、ベクター形質転換、微量注入、トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヒートショック、エレクトロポレーション、形質導入、遺伝子銃、ＤＥＡＥ－グルカン媒介の転移のうちの１つ又はいずれか幾つかの組み合わせであり、
及び／又は、前記導入は、請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質のｍＲＮＡと前記ｓｇＲＮＡを用いて行われる、ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記哺乳動物は、ラット又はマウスであり、及び／又は、前記導入の方式が微量注入である場合、前記導入で使用される請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質のｍＲＮＡの濃度は、１～１０００ｎｇ／μＬである、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法であって、
好ましくは、前記導入で使用される前記ｓｇＲＮＡの濃度に対しての、請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質のｍＲＮＡの濃度の比は、１：（５～１）である、
方法。
【請求項20】
医薬のスクリーニング、疾患治療効果評価又は疾患治療メカニズム研究における、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法で得られた、非ヒト動物モデルである動物モデル。
【請求項21】
β異常ヘモグロビン症を治療及び／又は予防するための製品であって、前記製品には、請求項１２のＡ）における前記遺伝子と、ｓｇＲＮＡの送達ベクターとを含み、前記ｓｇＲＮＡは、前記融合タンパク質が目的細胞における標的遺伝子に対して単一塩基ゲノム編集を行うように誘導し、前記標的遺伝子は、ＨＢＧ１プロモーター領域又はＨＢＧ２プロモーター領域にある、ことを特徴とする製品であって、
好ましくは、
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列番号３５で示される配列を含み、
及び／又は、前記β異常ヘモグロビン症は、β地中海貧血及び／又は鎌状赤血球貧血症を含み、
及び／又は、前記細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、赤血球細胞、又は赤血球前駆細胞である、
製品。
【請求項22】
前記送達ベクターは、ウイルスベクター、及び／又は非ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及び／又は腫瘍溶解性ウイルスベクターを含み、前記非ウイルスベクターは、陽イオン高分子ポリマー、及び／又はリポソームを含む、ことを特徴とする請求項２１に記載の製品。【手続補正3】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図7】
【手続補正4】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図8】
【手続補正5】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図9】
【手続補正6】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図10】
【手続補正7】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図11】
【手続補正8】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図12】
【手続補正9】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図13】
【手続補正10】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図14】
【手続補正11】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図15】
【手続補正12】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図16】
【手続補正13】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図17】
【手続補正14】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図18】
【手続補正15】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図19】
【手続補正16】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図20】
【手続補正17】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２１
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図21】
【手続補正18】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図22】
【手続補正19】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２３
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図23】
【国際調査報告】