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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-21
(54)【発明の名称】タンパク質分解の調節
(51)【国際特許分類】
G01N 33/15 20060101AFI20230214BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230214BHJP
C12Q 1/25 20060101ALI20230214BHJP
A61K 31/454 20060101ALI20230214BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20230214BHJP
A61K 31/505 20060101ALI20230214BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230214BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20230214BHJP
【ＦＩ】
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
C12Q1/25
A61K31/454
A61K31/5377
A61K31/505
A61P43/00
A61K47/55
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022537121
(86)(22)【出願日】2020-12-15
(85)【翻訳文提出日】2022-07-27
(86)【国際出願番号】 US2020065022
(87)【国際公開番号】W WO2021126805
(87)【国際公開日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】62/949,021
(32)【優先日】2019-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521437068
【氏名又は名称】オリオニス バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】518268352
【氏名又は名称】オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】クレイ，ニコライ
(72)【発明者】
【氏名】リーヴェンス，サムエル
(72)【発明者】
【氏名】サバティーニ，リカルド
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ36
4B063QR20
4B063QS28
4B063QX02
4C076CC41
4C076CC50
4C086AA02
4C086BC10
4C086BC22
4C086BC42
4C086BC73
4C086GA07
4C086GA09
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZC41
(57)【要約】
薬剤が、アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解を引き起こす、または阻害するかどうかを決定することを含む、疾患または障害の治療における薬剤の有効性を評価する方法が提供される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
候補化合物を同定するための方法であって：（ａ）セレブロン（ＣＲＢＮ）に結合する能力を有する試験化合物を得ること；
（ｂ）アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）の存在下で前記試験化合物をＣＲＢＮと接触させること；
（ｃ）ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解についてアッセイすること；ならびに
（ｄ）ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解の低減、低下、または実質的にないことが検出される場合に候補化合物として前記試験化合物を分類すること
を含む、方法。
【請求項2】
治療用組成物を製造するための方法であって：（ａ）
（ｉ）セレブロン（ＣＲＢＮ）に結合する能力を有する試験化合物を得ること；
（ｉｉ）アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）の存在下で前記試験化合物をＣＲＢＮと接触させること；
（ｉｉｉ）ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解についてアッセイすること；
（ｉｖ）ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解の低減、低下、または実質的にないことが検出される場合に候補化合物として前記試験化合物を分類すること
により候補化合物を同定すること；ならびに
（ｂ）治療における使用のために前記候補化合物を製剤化すること
を含む、方法。
【請求項3】
ＡＳＳ１の前記リクルートメントが、ＣＲＢＮへのＡＳＳ１の直接結合である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解についてアッセイすることをさらに含み、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの前記基質および／またはネオ基質が、場合によっては：（ｉ）デグロンモチーフ、
（ｉｉ）場合によっては、ターンの頂点に３つの骨格水素結合受容体の配置を有し、グリシン残基が続く表面β－ヘアピンループ、および／または
（ｉｉｉ）保存されたＣｙｓ２－Ｈｉｓ２（Ｃ２Ｈ２）モチーフ
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの前記基質および／またはネオ基質が、イカロス（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（ＩＫＺＦ３）、イオス（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（ＩＫＺＦ５）、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、およびＺＦＰ９１から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解の前記低減、低下、または実質的にないことが、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの前記基質および／またはネオ基質の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解の量に関連している、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
前記分類が、ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解の、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの前記基質および／またはネオ基質の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解に対する比率をシフトさせる前記試験化合物の能力に基づく、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記分類が、ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解の比率を、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの前記基質および／またはネオ基質の前記直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解を支持するＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの前記基質および／またはネオ基質の直接的または間接的なリクルートメントおよび／または分解にシフトさせる前記試験化合物の能力に基づく、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記試験化合物が、ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解と比較してＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの前記基質および／またはネオ基質の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解を支持する能力に基づいて候補化合物として分類される、請求項４から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解の前記低減、低下、または実質的にないことが、前記試験化合物がない参照試料中でのＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解の量および／または基底レベルに関連している、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記候補化合物が、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドの１つと比べて前記候補化合物を受け取る被験者における低減した副作用を示す、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記副作用が、肝機能の低下もしくは不全を含む、および／または腎機能の低下もしくは不全、および／またはＴ細胞機能の低下もしくは不全を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記試験化合物または候補化合物が、ＣＲＢＮを結合するが、ＡＳＳ１に弱く結合するか、実質的に結合しない、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記試験化合物または候補化合物が、ＣＲＢＮを結合するが、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの前記基質および／またはネオ基質に弱く結合するか、実質的に結合しない、請求項４から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記試験化合物または候補化合物が、約１μＭまたはそれより高い親和性でＣＲＢＮを結合する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記試験化合物または候補化合物が、約５００ｎＭ、または約３００ｎＭ、約１００ｎＭ、約３０ｎＭ、約１０ｎＭ、または約１ｎＭの親和性でＣＲＢＮを結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記試験化合物または候補化合物が、分子糊である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記試験化合物または候補化合物が、グルタルイミド環およびフタルイミド環を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記フタルイミド環が化学的に修飾されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記試験化合物または候補化合物の前記グルタルイミド環が、ＣＲＢＮにおける３つのトリプトファン残基のケージと水素結合することができる、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
前記試験化合物または候補化合物が、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質との相互作用を可能にするＣＲＢＮの疎水性表面の曝露を誘導する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
ＣＲＢＮの疎水性表面の前記曝露が、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質との相互作用を可能にする、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記試験化合物または候補化合物が、免疫調節剤または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）、またはそれらの医薬適合性のある塩、溶媒和物、水和物、共結晶、クラスレート、または多形である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記試験化合物または候補化合物が、ＣＲＢＮを結合し、ＡＳＳ１を結合しない、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記試験化合物または候補化合物が、ＣＲＢＮならびにＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの前記基質および／またはネオ基質を結合する、請求項４から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記試験化合物または候補化合物が、ヘテロ二官能性である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項27】
前記試験化合物または候補化合物が、同時にＣＲＢＮならびにＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質を結合することができる、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記試験化合物または候補化合物が、タンパク質分解誘導キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）である、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記ＰＲＯＴＡＣについて、前記試験化合物または候補化合物が、ＰＲＯＴＡＣの成分である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記ＰＲＯＴＡＣが、リンカーをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記ＰＲＯＴＡＣが、標的タンパク質を結合することができる部分をさらに含み、前記標的タンパク質が、場合によってはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質である、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記ＰＲＯＴＡＣが、（ｉ）ＣＲＢＮを結合する試験化合物または候補化合物ならびに（ｉｉ）前記リンカーに共有結合し、標的タンパク質を結合することができる部分を含み、前記標的タンパク質が、場合によってはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記試験化合物または候補化合物が、ヘテロ二官能性であり、クリックケミストリーを介して共役することができる、請求項２４から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記試験化合物または候補化合物が、細胞内クリック形成タンパク質分解誘導キメラ（ＣＬＩＰＴＡＣ）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記分解が、ユビキチン依存性である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記候補化合物が、場合によっては血液悪性腫瘍から選択され、さらに場合によっては多発性骨髄腫および５ｑ欠失関連骨髄異形成症候群（ｄｅｌ（５ｑ）ＭＤＳ）から選択される、癌を処置する際の使用に適している、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
候補化合物を同定するための方法であって：（ａ）セレブロン（ＣＲＢＮ）に結合する能力を有する試験化合物を得ること：
（ｂ）アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）の存在下で前記試験化合物をＣＲＢＮと接触させること；
（ｃ）ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解をアッセイすること；ならびに
（ｄ）ＡＳＳ１の高いまたは増加した直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解が検出される場合に候補化合物として前記試験化合物を分類すること
を含む、方法。
【請求項38】
治療用組成物を製造するための方法であって：（ａ）
（ｉ）セレブロン（ＣＲＢＮ）に結合する能力を有する試験化合物を得ること；
（ｉｉ）アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）の存在下で前記試験化合物をＣＲＢＮと接触させること；
（ｉｉｉ）ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解についてアッセイすること；ならびに
（ｉｖ）ＡＳＳ１の高いまたは増加した直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解が検出される場合に候補化合物として前記試験化合物を分類すること
により候補化合物を同定すること；ならびに
（ｂ）治療における使用のために前記候補化合物を製剤化すること
を含む、方法。
【請求項39】
前記試験化合物と接触させるＣＲＢＮの存在下で、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの前記基質および／またはネオ基質がイカロス（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（ＩＫＺＦ３）、イオス（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（ＩＫＺＦ５）、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、およびＺＦＰ９１から選択される場合、ＡＳＳ１の前記高いまたは増加した直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解が、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解に関連している、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項40】
ＡＳＳ１の前記高いまたは増加した直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解が、前記試験化合物がない参照試料中でのＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解の量に関連している、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項41】
前記候補化合物が、癌を処置する際の使用に適している、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記癌が、ＡＳＳ１に依存している、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記癌が、胃癌または結腸直腸癌である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記候補化合物が、治療用化合物である、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
候補化合物を同定するための方法であって：（ａ）セレブロン（ＣＲＢＮ）に結合する能力を有する試験化合物を得ること；
（ｂ）アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）の存在下で前記試験化合物をＣＲＢＮと接触させること；
（ｃ）ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解についてアッセイすること；ならびに
（ｄ）ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解の低減、低下、または実質的にないことが検出される場合に候補化合物として前記試験化合物を分類すること
を含み、
ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解についてアッセイすることをさらに含み、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの前記基質および／またはネオ基質が、イカロス（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（ＩＫＺＦ３）、イオス（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（ＩＫＺＦ５）、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、およびＺＦＰ９１から選択され；そして
前記分類が、ＡＳＳ１の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解の、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの前記基質および／またはネオ基質の直接的または間接的なリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解に対する比率をシフトさせる前記試験化合物の能力に基づく、方法。
【請求項46】
前記試験化合物または候補化合物が、ＣＲＢＮを結合するが、ＡＳＳ１に弱く結合するか、実質的に結合しない、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記試験化合物または候補化合物が、約１μＭまたはそれより高い親和性でＣＲＢＮを結合する、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
化合物をスクリーニングするおよび／または疾患もしくは障害の処置における化合物の有効性を評価する方法は、セレブロン（ＣＲＢＮ）の有無、またはアルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）との相互作用のレベルに基づいて提供される。
【0002】
関連する出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月１７日に出願された米国仮出願第６２／９４９，０２１号の利益を主張し、その内容全体は、本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１２月１７日に出願された米国仮出願第６２／９４９，０２１号の利益を主張し、その内容全体は、本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
プロテアソームにルーティングすることにより細胞内で標的タンパク質を排除する方法による標的化タンパク質分解、または高次タンパク質複合体に標的タンパク質をトラップする方法による標的化タンパク質阻害は、創薬における魅力的な新規領域である。タンパク質分解の分子糊および二価誘導物質（タンパク質分解誘導キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）としても既知である）は、従来の阻害剤を使用することでは不可能である方法で、化学量論以下の濃度を含めて、以前は新薬開発に繋がらなかった、標的を阻害および／または分解する潜在力を有するので、治療における魅力的な新規方法を表す。分子糊およびＰＲＯＴＡＣは、細胞内部のある特定のタンパク質に結合して、疾患標的タンパク質を阻害または分解する分子複合体の形成を誘導する。
【0004】
これらの薬剤の潜在力は大きいが、治療的に関連する標的（オフターゲット）ではない標的と係合し、その係合が、薬物副作用および毒性の危険性のいずれかを保持する、ならびに／または治療的に関連する（例えば、任意のオフターゲットの競合的係合のために）標的の効果的な係合を低減する、薬剤などのある特定の傾向性により妨害される。そのような傾向性がない薬剤の開発の必要性が残っている。
【発明の概要】
【0005】
したがって、種々の態様において、本発明は、小分子タンパク質（または小分子タンパク質複合体）の相互作用を促進、誘導、強化、および／もしくは安定化する、ならびに／または標的の傾向性を欠くまたは実質的に低下している治療剤の発見を提供する。本発明は、種々の実施形態において、無関係であるか、リスクがあるか、有害であるもの、例えばオフターゲットとの交差反応および逸脱、相互作用なしで、疾患関連標的のより選択的な調節のためにより効果的であるおよび／または疾患処置に許容される化合物を同定するための方法を提供する。
【0006】
態様において、本発明は、アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）との直接的もしくは間接的な相互作用および／または直接的もしくは間接的な相互作用を誘導することにより負担がない化合物を同定する方法に関する。例えば、本発明は、実施形態において、タンパク質複合体へのＡＳＳ１のリクルートメントを誘導、誘発、強化または安定化する活性または能力が低減しているか、低下しているか、実質的にない、および／または、結果として、ＡＳＳ１を阻害するおよび／またはＡＳＳ１のユビキチン化および／または分解を促進する化合物の選択を提供する。実施形態において、本発明は、ＡＳＳ１のＣＲＢＮとの直接的な結合を誘導、誘発、強化または安定化する活性または能力が低減しているか、低下しているか、実質的にない化合物の選択を提供する。
【0007】
種々の態様において、本発明は、セレブロン（ＣＲＢＮ）に結合する能力を有する試験化合物を得ること、ＡＳＳ１の存在下で試験化合物をＣＲＢＮと接触させること、ＣＲＢＮへのＡＳＳ１のリクルートメント、ＣＲＢＮ／試験薬剤複合体へのＡＳＳ１の強化された結合、ＡＳＳ１のユビキチン化および／またはＡＳＳ１の分解の１つまたは複数についてアッセイすること、ならびにＣＲＢＮへのＡＳＳ１のリクルートメントの低減、低下、または実質的にないこと、ＣＲＢＮ／試験薬剤複合体への強化された結合、および／またはＡＳＳ１のユビキチン化および／またはＡＳＳ１の分解が検出される場合に候補化合物として試験化合物を分類することにより候補化合物を同定するための方法に関する。
【0008】
種々の態様において、本発明は、セレブロン（ＣＲＢＮ）に結合する能力を有する試験化合物を得ること、ＡＳＳ１の存在下で試験化合物をＣＲＢＮと接触させること、ＡＳＳ１およびＣＲＢＮの直接的な結合についてアッセイすること、ならびにＣＲＢＮへのＡＳＳ１の直接結合の低減、低下、または実質的にないことが検出される場合に候補化合物として試験化合物を分類することにより候補化合物を同定するための方法に関する。
【0009】
他の態様において、本発明は、候補化合物を同定することおよび治療における使用のための候補組成物を製剤化することにより候補組成物を製造するための方法に関し、候補化合物の同定は、ＣＲＢＮに結合する能力を有する試験化合物を得ること；ＡＳＳ１の存在下で試験化合物をＣＲＢＮと接触させること；ＣＲＢＮ／試験薬剤複合体へのＡＳＳ１のリクルートメント、強化された結合、ＡＳＳ１のユビキチン化および／または分解についてアッセイすること；ならびにリクルートメント、ＣＲＢＮ／試験薬剤複合体へのＡＳＳ１の強化された結合、および／またはＡＳＳ１のユビキチン化および／または分解の低減、低下、または実質的にないことが検出される場合に候補化合物として試験化合物を分類することによる。
【0010】
他の態様において、本発明は、候補化合物を同定することおよび治療における使用のための候補組成物を製剤化することにより候補組成物を製造するための方法に関し、候補化合物の同定は、ＣＲＢＮに結合する能力を有する試験化合物を得ること；ＡＳＳ１の存在下で試験化合物をＣＲＢＮと接触させること；ＣＲＢＮ／試験薬剤複合体へのＡＳＳ１の直接結合をアッセイすること；ならびにＣＲＢＮ／試験薬剤複合体へのＡＳＳ１の結合の低減、低下、または実質的にないことが検出される場合に候補化合物として試験化合物を分類することによる。
【0011】
実施形態において、方法は、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質またはネオ基質（例えば、限定されないが、デグロンモチーフ、例えば、限定されないが、イカロス（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（ＩＫＺＦ３）、イオス（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（ＩＫＺＦ５）、ＳＡＬＬ４、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、および／またはＺＦＰ９１を含むもの）のリクルートメント、ユビキチン化、および／または分解についてアッセイするステップをさらに含む。
【0012】
実施形態において、分類は、ＡＳＳ１のリクルートメント、ＣＲＢＮへの結合、ユビキチン化、および／または分解の、ＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質のリクルートメント、ＣＲＢＮへの結合、ユビキチン化、および／または分解に対する比率をシフトさせる試験化合物の能力に基づく。
【0013】
実施形態において、候補化合物は、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドの１つと比べて候補化合物を受け取る被験者における低減した副作用を示す。
【0014】
種々の実施形態において、試験化合物または候補化合物は、タンパク質分解誘導キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）の成分である。種々の実施形態において、ＰＲＯＴＡＣは、（ｉ）本明細書で記載されるような試験化合物または候補化合物、例えば、上述した分子糊化合物を含む、ＣＲＢＮバインダ、および（ｉｉ）試験化合物により結合したタンパク質とは異なる標的タンパク質（例えば、試験化合物／ＣＲＢＮ複合体へのリクルートメントによりネオ基質になるであろうＣＲＢＮ基質またはタンパク質）に結合することができる化合物を含み、（ｉ）および（ｉｉ）は、リンカーを介して共有結合している。
【0015】
種々の実施形態において、試験化合物または候補化合物は、治療用化合物である。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】分子糊誘導ＣＲＢＮネオ基質としての組換えＡＳＳ１の同定。ＡＳＳ１は、以前説明された（Ｌｅｍｍｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．「ＭＡＰＰＩＴ，ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１２７８：４４７－５５およびＬｉｅｖｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．「Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ：ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００９ Ｆｅｂ；８（２）：８７７－８６、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）および実施例１において、より詳細に概説されている、ツーハイブリッド技術システムの変形、ＭＡＰＰＩＴを使用して、ＣＣ２２０、既知のＩＭｉＤ薬物およびＣＲＢＮリガンドに応答してＣＲＢＮにリクルートされた標的についてヒトＯＲＦ（ｅｏｍｅ）ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより同定された。細胞におけるタンパク質相互作用は、アレイ形式で表示された細胞クラスター内でアッセイされた。細胞マイクロアレイ中の各スポットは、ＣＲＢＮとのリガンド誘導（この場合には、ＣＣ２２０誘導）相互作用について試験されている単一ＯＲＦ／タンパク質候補物を発現するそのような細胞クラスターに対応した。正の相互作用は、細胞蛍光の増加として読み取られた。示されているのは、多数の個々のＯＲＦ／標的タンパク質候補物にわたる／そのための細胞マイクロアレイスクリーンからの蛍光強度データのドットプロットである。Ｘ軸は、粒子数を示し、Ｙ軸は、マイクロアレイにおける各細胞クラスターについての積分強度を示す。示されるように、また示唆されるように、ＡＳＳ１ ＯＲＦを表す細胞アレイ座標でシグナルの有意な誘導が観察される。ＩＫＺＦ１、既知のＣＣ２２０誘導ＣＲＢＮ相互作用物質についてのシグナルの誘導も、参照のために示される。
【図2】分子糊誘導ＣＲＢＮネオ基質としての内因性ＡＳＳ１の同定。ＶｉｒｏＴｒａｐとして既知であり、以前説明された（Ｅｙｃｋｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．「Ｔｒａｐｐｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７：１１４１６（２０１６）、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）および実施例２において、より詳細に概説されている「タンパク質トラップ」技術を使用して、ＣＲＢＮのレナリドミド誘導相互作用物質として、内因性ＡＳＳ１を同定した。レナリドミドに応答したＡＳＳ１のＣＲＢＮへの結合は、粒子出芽プロセス中にそのような粒子（任意の会合タンパク質または複数のタンパク質を含む）にリクルートされたウイルス様粒子含有細胞ＣＲＢＮからＡＳＳ１トリプシンペプチドを同定することにより検出された。したがって、示されるものは、（ＬＥＮ誘導ＣＲＢＮ相互作用物質を同定するために）ＶｉｒｏＴｒａｐ手順を用いてレナリドミド（ＬＥＮ）およびＤＭＳＯ対照媒質に曝露された細胞から単離されたウイルス様粒子を含むＣＲＢＮから単離されたペプチドのためのトリプシンペプチド同一性のボルケーノプロットである。ＡＳＳ１に対応するトリプシンペプチドシグナル（ｌｏｇ１０ ｐ値）、およびレナリドミド（ＬＥＮ）またはＤＭＳＯ対照媒質の存在下でのＡＳＳ１トリプシンペプチドシグナル（Ｘ軸）における相対倍率変化は、ＬＥＮ誘導ＣＲＢＮ相互作用物質として内因性ＡＳＳ１を同定する。
【図3A-B】共免疫沈降分析により評価されたような、生細胞におけるリガンド誘導ＣＲＢＮ－ＡＳＳ１相互作用。この研究において、我々は、ＣＲＢＮ ｌＭｉＤリガンドＣＣ２２０の存在下または不在下で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における各コンストラクトのトランスフェクションおよび発現時に生細胞において相互作用する、Ｆｌａｇタグ付きＡＳＳ１（または図１において説明されたアッセイにおいて同定されたような、Ｆｌａｇタグ付きｇｐ１３０－ＡＳＳ１融合タンパク質）およびＨＡタグ付きＣＲＢＮの能力を検査した。ＣＣ２２０に応答して既知のＣＲＢＮネオ基質ＩＫＺＦ３と相互作用する、ＨＡタグ付きＣＲＢＮの能力も（Ｆｌａｇタグ付きＩＫＺＦ３融合タンパク質として発現されたＩＫＺＦ３を用いて）調査した。図３Ａは、抗Ｆｌａｇ抗体を用いる共免疫沈降、それに続く免疫沈降試料のウェスタンブロット分析、およびＦｌａｇペプチドを使用するビーズからの溶出から得られた結果を示す。各試料（ＣＣ２２０曝露に応じて変化すると予想される）において免疫沈降したＣＲＢＮの程度を測定するために抗ＨＡ抗体を用いて、および、各試料（同じであると予想される）において免疫沈降したＦｌａｇ－ＡＳＳ１、Ｆｌａｇ－ｇｐ１３０－ＡＳＳ１またはＦｌａｇ－ＩＫＺＦ３の程度を決定するために抗Ｆｌａｇ抗体を用いて、ウェスタン解析を実行した。図３Ａ（上パネル）に示すように、ＨＡ－ＣＲＢＮは、ＣＣ２２０の存在下でのみＡＳＳ１免疫沈降物において認められ、ＡＳＳ１がＣＲＢＮのリガンド誘導ネオ基質－すなわちＣＲＢＮに結合するＣＣ２２０に応答してＣＲＢＮにリクルートされる標的であるという、図１および図２において概説される知見と一致している。図３Ａ（下パネル）は、同じ量のＦｌａｇタグ付きＡＳＳ１またはＦｌａｇタグ付きＩＫＺＦ３が、関連する試料全体で抗Ｆｌａｇ共免疫沈降物にあったことを示す。図３Ｂは、図３Ａに示す免疫沈降分析に供されたすべての試料において、ＨＡ－ＣＲＢＮについては上パネルで、Ｆｌａｇ－ＡＳＳ１、Ｆｌａｇ－ｇｐ１３０－ＡＳＳ１またはＦｌａｇ－ＩＫＺＦ３については下パネルで示すように、種々のコンストラクトでトランスフェクトされた細胞から得られた種々の試料全体で各タンパク質の相対的発現が類似していたことを示す。結果は、図３Ａ（下パネル）に示される結果と一致している。
【図4】ＣＲＢＮへのＡＳＳ１のリガンド誘導リクルートメントは、生細胞におけるＡＳＳ１の分解に関連付けられている。この研究において、我々は、ＣＲＢＮへのＡＳＳ１のリガンド誘導リクルートメントが後に続くＡＳＳ１分解（ＣＲＢＮ Ｅ３リガーゼとの相互作用により誘発されるように）をもたらす可能性があるかどうかを検査した。Ｆｌａｇタグ付きＡＳＳ１およびＨＡタグ付きＣＲＢＮをコードするｃＤＮＡコンストラクトでＨＥＫ２９３細胞を同時トランスフェクトし、ＣＣ２２０の濃度増加に２４時間曝露した。ウェスタンブロット分析のために試料を生成し、抗Ｆｌａｇ抗体を使用して評価された異なる実験条件にわたってＡＳＳ１の定常状態のレベルを決定した。示されるように、ＣＣ２２０曝露に特異的に反応して、そして用量依存的様式で、ＡＳＳ１発現（アクチンコントロールタンパク質発現ではなく）の喪失を観察した。これらの結果は、ＡＳＳ１がＣＲＢＮのネオ基質であり、ＩＫＺＦ１／３などのいくらかの他の既知のＣＲＢＮネオ基質について観察されたように、ＣＲＢＮとのリガンド誘導相互作用がそのプロテアソーム分解を誘発することを示す。
【図5A-L】ＣＲＢＮに結合するが既知のＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド、例えばレナリドミド／ＬＥＮおよびＣＣ２２０、または他のＣＲＢＮリガンドと比較してＣＲＢＮネオ基質ＡＳＳ１を効果的にリクルートしない化合物の発見および特徴づけ（左側のローマ数字の名前）。この研究において、我々は、競合実験により示唆されるようにＩＭｉＤリガンド結合ポケット内でも高い効力でＣＲＢＮに結合するＣＲＢＮリガンドを同定することができるが、ＡＳＳ１をリクルートしないことを示す。以下の実験設定を使用して、生細胞内の化合物のＣＲＢＮ結合効率を最初に評価した：図１ならびに実施例１および実施例５の関連する方法のセクションで説明されるような、また導入遺伝子をコードする（ＤＨＦＲおよびＣＲＢＮ融合タンパク質をコードする）適切なｃＤＮＡでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトしたＭＡＰＰＩＴ様アッセイを使用して、ＤＨＦＲ融合タンパク質、トリメトプリム－レナリドミドハイブリッドリガンド（トリメトプリムはＤＨＦＲのリガンドである）、およびＣＲＢＮ－ｇｐ１３０融合タンパク質（ＣＲＢＮはリガンドレナリドミドを結合する）を含む三元タンパク質／化合物複合体形成－したがって、ＤＨＦＲ－Ｔｒｉｍ－Ｌｅｎ－ＣＲＢＮ複合体形成の結果として、正のアッセイシグナルを生成した。複合体の形成は、結果として、ＳＴＡＴ反応性ルシフェラーゼレポータ遺伝子の活性化となる。 図５Ａ～図５Ｃにおいて、そのシグナルは、１００％ルシフェラーゼ活性として設定されている。別の試料設定において、同じ方法で細胞を調製したが、さらにＣＲＢＮとの相互作用が調査されている試験化合物とコインキュベートした。ＣＲＢＮ融合タンパク質への結合は、ハイブリッドリガンドの同じＣＲＢＮタンパク質への結合と競合し、したがって、アッセイシグナルを生成するために必要とされる三元複合体形成の防止によりアッセイシグナルを阻害する。試験化合物の濃度の増加を評価して、生細胞におけるこのタイプのリガンド競合実験で決定されたようにＣＲＢＮ結合効率を決定した。示されるように、既知のＩＭｉＤ化合物（レナリドミド／ＬＥＮ、ＣＣ２２０）は、ＣＲＢＮへの結合に関してレナリドミドハイブリッドリガンドと効率的に競合した（ＣＲＢＮ関連アッセイシグナル阻害についての用量反応曲線）。同様に、一連の他の化合物は、効果的に競合する。シグナル阻害の特異性は、ハイブリッドリガンドの不在下でＤＨＦＲ融合タンパク質に直接結合する（すなわち、タンパク質の直接相互作用）対照のｇｐ１３０融合タンパク質（ＣＴＲＬ）により生成したシグナルの阻害について試験化合物の効果が評価される並行実験設定により評価される。要約すると、図５Ａ～図５Ｃに示される結果は、種々の化合物を強力なＣＲＢＮバインダとして認定する。 図５Ｄ～図５Ｇおよび図５Ｈ～図５Ｌにおいて、我々は、これらのＣＲＢＮ結合化合物のどれが効果的なＩＫＺＦ１および／またはＡＳＳ１ネオ基質リクルータ（それぞれ）であるかを決定した。この実験設定において、ＣＲＢＮ融合タンパク質およびＩＫＺＦ１またはＡＳＳ１融合タンパク質をコードするコンストラクトで細胞をトランスフェクトした。ＣＲＢＮリガンド誘導タンパク質相互作用を促進する能力－すなわち、ＩＫＺＦ１またはＡＳＳ１ネオ基質のリクルートメントを監視するため、試験化合物の濃度の増加で試験化合物の活性を評価した（用量反応研究）。示されるように、既知のＩＭｉＤ化合物（ＬＥＮ、ＣＣ２２０）は、いくらかの他の化合物と同様に、ＩＫＺＦ１（図５Ｄ～図５Ｇ）およびＡＳＳ１（図５Ｈ～図５Ｌ）の両方のリクルートメントを促進する。対照的に、他の化合物と同程度にＣＲＢＮ結合に効果的である（図５Ａ～図５Ｃ、競合曲線）、ここに示す２つの化合物（ｖ、ｖｉ）は、ＩＫＺＦ１（図５Ｄ～図５Ｇ）およびＡＳＳ１（図５Ｈ～図５Ｌ）をリクルートしない。これは、ＡＳＳ１ネオ基質のリクルートメント活性がないＣＲＢＮリガンドが、それらの差別的なタンパク質リクルートメント活性について同定および特徴づけすることができることを示す。ＬＥＮおよびＣＣ２２０と比較して、他の基質（例えばＩＫＺＦ１）に対してＡＳＳ１をリクルートする能力が低下した化合物もまた、観察されている。
【図6】図６は、分子糊誘導ＣＲＢＮ－ＡＳＳ１相互作用を、ＤＤＢ１受容体融合を適用する代替ＭＡＰＰＩＴアッセイ構成を使用して検出することができることを示す。ＤＤＢ１をＭＡＰＰＩＴキメラ受容体コンストラクト（ｐＳＥＬ－ＤＤＢ１）に融合させ、未融合のＣＲＢＮベイトタンパク質を、ＩＫＺＦ１（ｇｐ１３０－ＩＫＺＦ１）またはＡＳＳ１（ｇｐ１３０－ＡＳＳ１）のいずれかの基質ｇｐ１３０融合タンパク質とともに同時発現させた、代替のＣＲＢＮ基質結合アッセイを試験した。ＣＲＢＮ同時発現の不在下で（「ＣＲＢＮがない」）、レナリドミド（ＬＥＮ）誘導シグナルを観察することができなかった。しかし、未融合ＣＲＢＮ発現コンストラクトが同時トランスフェクトされた場合、ＬＥＮ依存シグナルは、ＩＫＺＦ１およびＡＳＳ１相互作用の両方で得られた。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明は、特定のＣＲＢＮ結合化合物がまた、ＣＲＢＮおよびＡＳＳ１の結合をリクルート、促進、強化、および／もしくは安定化する、ならびに／またはＣＲＢＮへのＡＳＳ１のリクルートメント、ＡＳＳ１のユビキチン化および／またはＡＳＳ１の分解を引き起こすという発見に部分的に基づいている。理論に縛られることを望むことなく、ＣＲＢＮ結合化合物のＡＳＳ１とのこれらの相互作用は、ＣＲＢＮのより治療的に関連する基質またはネオ基質とのＣＲＢＮベースの相互作用を媒介するＣＲＢＮ結合化合物の能力を低減するか枯渇させるオフターゲットの傾向性を表す可能性がある。したがって、種々の態様において、本発明は、ＡＳＳ１媒介効果が実質的にないＣＲＢＮ結合化合物を同定する方法を提供する。
【0018】
種々の実施形態において、本方法は、治療効果および種々の化合物のＡＳＳ１または他の標的関連の傾向性ついての潜在力を強調する相互作用のＣＲＢＮベースネットワークにおける洞察を可能にし、そのため、疾患の治療のための現在販売されている薬物であるサリドマイド、レナリドミドおよびポマリドミドなどのＩＭｉＤに共通する交差反応性および傾向性を示さないか、低減したそれらを示す、新規または改善された化合物の発見および構築を可能にする。
【0019】
化合物を同定および／またはスクリーニングする方法
実施形態において、疾患または障害の処置における化合物をスクリーニングする、および／またはＣＲＢＮ結合化合物の有効性を評価する方法は、ＡＳＳ１との直接的または間接的な相互作用の有無またはそのレベルに基づいて提供される。実施形態において、疾患または障害の処置における化合物をスクリーニングする、および／またはＣＲＢＮ結合化合物の有効性を評価する方法は、ＡＳＳ１との直接的な相互作用の有無またはそのレベルに基づいて提供される。種々の実施形態において、ＣＲＢＮに結合するか、それと相互作用するが、また、ＣＲＢＮへのＡＳＳの直接的または間接的なリクルートメントを引き起こさない、誘導しない、強化しない、および／もしくは安定化させない、ならびに／またはＡＳＳ１のユビキチン化および／もしくはＡＳＳ１の分解を引き起こさない薬剤を発見する方法が提供される。
実施形態において、疾患または障害の処置における化合物をスクリーニングする、および／またはＣＲＢＮ結合化合物の有効性を評価する方法は、ＡＳＳ１との直接的または間接的な相互作用の有無またはそのレベルに基づいて提供される。実施形態において、疾患または障害の処置における化合物をスクリーニングする、および／またはＣＲＢＮ結合化合物の有効性を評価する方法は、ＡＳＳ１との直接的な相互作用の有無またはそのレベルに基づいて提供される。種々の実施形態において、ＣＲＢＮに結合するか、それと相互作用するが、また、ＣＲＢＮへのＡＳＳの直接的または間接的なリクルートメントを引き起こさない、誘導しない、強化しない、および／もしくは安定化させない、ならびに／またはＡＳＳ１のユビキチン化および／もしくはＡＳＳ１の分解を引き起こさない薬剤を発見する方法が提供される。
【0020】
種々の態様において、本発明は、ＣＲＢＮに結合する能力を有する試験化合物を得ること、ＡＳＳ１の存在下で試験化合物をＣＲＢＮと接触させること、ＣＲＢＮへのリクルートメント、ＣＲＢＮ／試験薬剤複合体へのＡＳＳ１の強化された結合、ＡＳＳ１のユビキチン化および／またはＡＳＳ１の分解の１つまたは複数についてアッセイすること、ならびにＣＲＢＮへのリクルートメント、ＣＲＢＮ／試験薬剤複合体へのＡＳＳ１の結合、ＡＳＳ１のユビキチン化および／またはＡＳＳ１の分解における低減、低下、または実質的に変化がないことが検出される場合に候補化合物として試験化合物を分類することによる候補化合物を同定するための方法に関する。
【0021】
種々の態様において、本発明は、ＣＲＢＮに結合する能力を有する試験化合物を得ること、ＡＳＳ１の存在下で試験化合物をＣＲＢＮと接触させること、ＣＲＢＮ／試験薬剤複合体へのＡＳＳ１の直接結合についてアッセイすること、ならびにＣＲＢＮ／試験薬剤複合体へのＡＳＳ１の直接結合における低減、低下、または実質的に変化がないことが検出される場合に候補化合物として試験化合物を分類することによる候補化合物を同定するための方法に関する。
【0022】
他の態様において、本発明は、候補化合物を同定することおよび治療における使用のための候補組成物を製剤化することにより候補組成物を製造するための方法に関し、候補化合物の同定は、ＣＲＢＮに結合する能力を有する試験化合物を得ること；ＡＳＳ１の存在下で試験化合物をＣＲＢＮと接触させること；ＣＲＢＮへのＡＳＳ１のリクルートメント、ＣＲＢＮ／試験薬剤複合体へのＡＳＳ１の強化された結合、ＡＳＳ１のユビキチン化および／またはＡＳＳ１の分解の１つまたは複数についてアッセイすること；ならびにＣＲＢＮへのリクルートメント、ＣＲＢＮ／試験薬剤複合体へのＡＳＳ１の強化された結合、ＡＳＳ１のユビキチン化および／またはＡＳＳ１の分解の低減、低下、または実質的にないことが検出される場合に候補化合物として試験化合物を分類することによる。
【0023】
他の態様において、本発明は、候補化合物を同定することおよび治療における使用のための候補組成物を製剤化することにより候補組成物を製造するための方法に関し、候補化合物の同定は、ＣＲＢＮに結合する能力を有する試験化合物を得ること；ＡＳＳ１の存在下で試験化合物をＣＲＢＮと接触させること；ＣＲＢＮ／試験薬剤複合体へのＡＳＳ１の直接結合についてアッセイすること；ならびにＣＲＢＮ／標的薬剤複合体へのＡＳＳ１の直接結合の低減、低下、または実質的にないことが検出される場合に候補化合物として試験化合物を分類することによる。
【0024】
実施形態において、本発明は、タンパク質複合体形成、ユビキチン化および／または分解に影響を与える薬剤を開発するための方法に関する。例えば、種々の実施形態において、本発明は、例えば治療に関連するＣＲＢＮ基質またはネオ基質（例えば、限定されないが、デグロンモチーフ、例えば、限定されないが、イカロス（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（ＩＫＺＦ３）、イオス（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（ＩＫＺＦ５）、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、および／またはＺＦＰ９１を含むもの）のリクルートメントおよび／もしくは分解を支持する治療経路に向けて、ならびに、例えばＡＳＳ１および／または他のオフターゲットタンパク質、例えば、限定されないが、ＳＡＬＬ４のリクルートメントおよび／または分解を支持しない非治療経路から離れて（例えばオフターゲット）、ＣＲＢＮの活性および／または影響をシフトすることにより、タンパク質複合体形成、ならびに／または、分解に影響を与える薬剤を開発するための方法に関する。
【0025】
いくらかの実施形態において、ＡＳＳ１および／もしくはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質もしくはネオ基質のリクルートメントならびに／またはユビキチン化、ならびに／または分解は、ＡＳＳ１および／またはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質またはネオ基質のタンパク質または核酸のレベル（例えばＲＮＡレベル）を測定することにより評価される。いくらかの実施形態において、ＡＳＳ１および／もしくはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質もしくはネオ基質のリクルートメントならびに／またはユビキチン化、ならびに／または分解は、参照（および／または互いに）対して評価される。実施形態において、相対的なＡＳＳ１のリクルートメント、および／またはユビキチン化、および／または分解における減少は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％である。実施形態において、相対的なＡＳＳ１のリクルートメント、および／またはユビキチン化、および／または分解における相対的な減少は、少なくとも２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または７倍、または１０倍、または１５倍、または２０倍である。実施形態において、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮ基質またはネオ基質のリクルートメント、および／またはユビキチン化、および／または分解における相対的な増加は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％である。実施形態において、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮ基質またはネオ基質のリクルートメント、および／またはユビキチン化、および／または分解における相対的な増加は、少なくとも２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または７倍、または１０倍、または１５倍、または２０倍である。
【0026】
いくらかの実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ＣＲＢＮに結合し、ＣＲＢＮとＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質との間の結合または相互作用を許可し、ＣＲＢＮとＡＳＳ１との間の実質的な結合または相互作用を許可しない。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ＣＲＢＮとＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質との結合または相互作用を媒介し、ＣＲＢＮとＡＳＳ１との間の結合または相互作用を実質的に媒介しない。
【0027】
種々の実施形態において、ＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化、および／または分解は、ＡＳＳ１よりも約５倍、１０倍、または約１００倍、または約１，０００倍、または約１０，０００倍、または約１００，０００倍高い。種々の実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物により媒介される、ＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化、および／またはリクルートおよび／または分解は、ＡＳＳ１よりも約５倍、１０倍、または約１００倍、または約１，０００倍、または約１０，０００倍、または約１００，０００倍高い。
【0028】
種々の実施形態において、ＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化、および／または分解は、ＡＳＳ１の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解よりも、約５倍から１０倍、または約５倍から約２５倍、または約５倍から約５０倍、または約５倍から約１００倍、または約５倍から約２５０倍、または約５倍から約５００倍、または約５倍から約１,０００倍、または約５倍から約３,０００倍、または約５倍から約５，０００倍、または約５倍から約１０，０００倍、または約５倍から約３０，０００倍、または約５倍から約５０，０００倍、または約５倍から約１００，０００倍、または１０倍から約５０倍、または約１０倍から約１００倍、または約１０倍から約２５０倍、または約１０倍から約５００倍、または約１０倍から約１，０００倍、または約１０倍から約３，０００倍、または約１０倍から約５，０００倍、または約１０倍から約１０，０００倍、または約１０倍から約３０，０００倍、または約１０倍から約５０，０００倍、または約１０倍から約１００，０００倍、または約１００倍から約１，０００倍、または約１００倍から約３，０００倍、または約１００倍から約５，０００倍、または約１００倍から約１０，０００倍、または約１００倍から約３０，０００倍、または約１００倍から約５０，０００倍、または約１００倍から約１００，０００倍、または約１，０００倍から約１０，０００倍、または約１，０００倍から約３０，０００倍、または約１，０００倍から約５０，０００倍、または約１，０００倍から約１００，０００倍高い。
【0029】
種々の実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物により媒介される、ＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解は、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物により媒介される、ＡＳＳ１の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解よりも、約１０倍から約５０倍、または約１０倍から約１００倍、または約１０倍から約２５０倍、または約１０倍から約５００倍、または約１０倍から約１，０００倍、または約１０倍から約３，０００倍、または約１０倍から約５，０００倍、または約１０倍から約１０，０００倍、または約１０倍から約３０，０００倍、または約１０倍から約５０，０００倍、または約１０倍から約１００，０００倍、または約１００倍から約１，０００倍、または約１００倍から約３，０００倍、または約１００倍から約５，０００倍、または約１００倍から約１０，０００倍、または約１００倍から約３０，０００倍、または約１００倍から約５０，０００倍、または約１００倍から約１００，０００倍、または約１，０００倍から約１０，０００倍、または約１，０００倍から約３０，０００倍、または約１，０００倍から約５０，０００倍、または約１，０００倍から約１００，０００倍高い。
【0030】
いくらかの実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物により媒介される、ＡＳＳ１の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解は、参照化合物によるＡＳＳ１の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解に対してアッセイされる。
【0031】
種々の実施形態において、参照化合物は、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ＣＣ－２２０、またはＣＣ－１２２である。
【0032】
いくらかの実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物により媒介される、ＡＳＳ１の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解は、基底状態にあるＡＳＳ１の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解に対してアッセイされる。
【0033】
いくらかの実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物により媒介される、ＡＳＳ１の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解は、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物により媒介される、ＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解に対してアッセイされる。
【0034】
いくらかの実施形態において、本方法は、（ａ）化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物により媒介される、ＡＳＳ１の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解を、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物により媒介される、ＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解に対してアッセイすること、ならびに（ｂ）参照化合物により媒介される、ＡＳＳ１の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解を、参照化合物により媒介される、ＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解に対して比較することを提供する。
【0035】
種々の実施形態において、参照化合物は、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ＣＣ－２２０、またはＣＣ－１２２である。
【0036】
いくらかの実施形態において、本方法は、（ａ）化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物により媒介される、ＡＳＳ１の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解を、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物により媒介される、ＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解に対してアッセイすること、ならびに（ｂ）レナリドミドにより媒介される、ＡＳＳ１の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解を、レナリドミドにより媒介される、ＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質の親和性（ＣＲＢＮについて）および／またはリクルートメント（ＣＲＢＮによる）および／またはユビキチン化および／または分解に対して比較することを提供する。
【0037】
いくらかの実施形態において、細胞を、ＣＲＢＮを発現する細胞を用いてＣＲＢＮに結合する能力を有する試験化合物と接触させること；ＡＳＳ１のリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解についてアッセイすること；ならびにＡＳＳ１のリクルートメント、および／またはユビキチン化および／または分解の低減、低下、または実質的にないことが検出される場合に候補化合物として試験化合物を分類することを含む、候補化合物を同定する方法が提供される。実施形態において、細胞は、ＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質のリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解についてさらにアッセイされる。
【0038】
実施形態において、本明細書に記載の方法は、ＡＳＳ１および／またはＡＳＳ１以外のＣＲＢＮの基質またはネオ基質のリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解についてアッセイすることをさらに含む。
【0039】
実施形態において、分解アッセイ、ユビキチン化アッセイ、またはプロテオミクス実験を使用して、リクルートメント、ユビキチン化、または分解をアッセイする。例えば、参照によりその全体が組み込まれる、Ｋｉｍ，Ｓｕｎｇ Ａｈ，ｅｔ ａｌ．「Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｅｒｅｂｌｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６６（２０１９）：６５－７４；米国特許出願公開第２０１９／００１７９９８号明細書を参照されたい。
【0040】
セレブロン（ＣＲＢＮ）
実施形態において、ＣＲＢＮは、ヒトＣＲＢＮタンパク質（例えば、ヒトＣＲＢＮアイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０５７３８６）；またはヒトＣＲＢＮアイソフォーム２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１１６６９５３）、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、およびそのＳＮＰ変異型を含む関連ポリペプチドなどの任意のＣＲＢＮのアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。関連ＣＲＢＮポリペプチドは、対立遺伝子変異型（例えば、ＳＮＰ変異型）；スプライス変異型；フラグメント；誘導体；置換、欠失、および挿入の変異型；融合ポリペプチド；ならびに種間ホモログを含み、特定の実施形態において、ＣＲＢＮ活性を保持する、および／または抗ＣＲＢＮ免疫応答を生成するのに充分である。
実施形態において、ＣＲＢＮは、ヒトＣＲＢＮタンパク質（例えば、ヒトＣＲＢＮアイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０５７３８６）；またはヒトＣＲＢＮアイソフォーム２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１１６６９５３）、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、およびそのＳＮＰ変異型を含む関連ポリペプチドなどの任意のＣＲＢＮのアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。関連ＣＲＢＮポリペプチドは、対立遺伝子変異型（例えば、ＳＮＰ変異型）；スプライス変異型；フラグメント；誘導体；置換、欠失、および挿入の変異型；融合ポリペプチド；ならびに種間ホモログを含み、特定の実施形態において、ＣＲＢＮ活性を保持する、および／または抗ＣＲＢＮ免疫応答を生成するのに充分である。
【0041】
実施形態において、本発明は、ＣＲＢＮを結合する化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物に関する。実施形態において、本発明は、ＣＲＢＮ配座の変化（例えば、ＣＲＢＮの結合ポケット内で）を誘導するか、そうでなければＣＲＢＮ表面（例えば、タンパク質の隣接領域上）の特性を変更する化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物に関し、上記ＣＲＢＮ配座の変化または変更は、結果としてネオ基質のユビキチン化となる。
【0042】
ＡＳＳ１
実施形態において、ＡＳＳ１は、ヒトＡＳＳ１タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ２１６７６．１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、およびそのＳＮＰ変異型を含む関連ポリペプチドなどの任意のＡＳＳ１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。関連ＡＳＳ１ポリペプチドは、対立遺伝子変異型（例えば、ＳＮＰ変異型）；スプライス変異型；フラグメント；誘導体；置換、欠失、および挿入の変異型；融合ポリペプチド；ならびに種間ホモログを含み、特定の実施形態において、ＡＳＳ１活性を保持する。
実施形態において、ＡＳＳ１は、ヒトＡＳＳ１タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ２１６７６．１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、およびそのＳＮＰ変異型を含む関連ポリペプチドなどの任意のＡＳＳ１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。関連ＡＳＳ１ポリペプチドは、対立遺伝子変異型（例えば、ＳＮＰ変異型）；スプライス変異型；フラグメント；誘導体；置換、欠失、および挿入の変異型；融合ポリペプチド；ならびに種間ホモログを含み、特定の実施形態において、ＡＳＳ１活性を保持する。
【0043】
ＡＳＳ１は、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）の助けを借りて、シトルリンをアルギニンに変換することにより、アルギニン生合成経路の律速段階を提示する尿素サイクル酵素である。より具体的には、ＡＳＳ１は、シトルリンおよびアスパラギン酸の縮合を触媒してアルギニノコハク酸、アルギニンの直接の前駆体を形成する。ＡＳＳ１は、尿素サイクルの一部として肝臓で広く見られ、他の組織においても遍在する酵素として認識されている。Ｈａｉｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，「Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ａｔ ｔｈｅ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２．１（２０１１）：８－２３。
【0044】
ＡＳＳ１は、種々の組織において遍在して発現され、肝臓および腎臓において最も豊富に発現する。Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ａｎｄ ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｌｙａｓｅ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５ Ｍａｙ；１１７（５）：９５２－７。
【0045】
ＡＳＳ１欠乏は、異常なＴ細胞分化および機能に関連し、結果として、原発性免疫機能障害となる。ＡＳＳ１欠乏は、異常なＴ細胞分化および機能に関連している。
【0046】
化合物および／または治療用化合物および／または候補化合物および／または試験化合物
実施形態において、本発明は、ＣＲＢＮを結合する化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物に関する。実施形態において、本発明は、ＣＲＢＮ配座の変化（例えば、ＣＲＢＮの結合ポケット内で）を誘導するか、そうでなければＣＲＢＮ表面（例えば、タンパク質の隣接領域上）の特性を変更する化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物に関する。実施形態において、本発明は、ＣＲＢＮ配座の変化（例えば、ＣＲＢＮの結合ポケット内で）を誘導するか、そうでなければＣＲＢＮ表面（例えば、タンパク質の隣接領域上）の特性を変更する化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物に関し、上記ＣＲＢＮ配座の変化または変更は、ＣＲＢＮおよびＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質の結合となる、ならびに／またはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／もしくはネオ基質のユビキチン化および／もしくはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／もしくはネオ基質の分解を引き起こす。
実施形態において、本発明は、ＣＲＢＮを結合する化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物に関する。実施形態において、本発明は、ＣＲＢＮ配座の変化（例えば、ＣＲＢＮの結合ポケット内で）を誘導するか、そうでなければＣＲＢＮ表面（例えば、タンパク質の隣接領域上）の特性を変更する化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物に関する。実施形態において、本発明は、ＣＲＢＮ配座の変化（例えば、ＣＲＢＮの結合ポケット内で）を誘導するか、そうでなければＣＲＢＮ表面（例えば、タンパク質の隣接領域上）の特性を変更する化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物に関し、上記ＣＲＢＮ配座の変化または変更は、ＣＲＢＮおよびＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質の結合となる、ならびに／またはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／もしくはネオ基質のユビキチン化および／もしくはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／もしくはネオ基質の分解を引き起こす。
【0047】
実施形態において、本発明は、ＣＲＢＮを結合するが、ＡＳＳ１に弱く結合するか、実質的に結合しない化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物に関する。実施形態において、本発明は、ＣＲＢＮ配座の変化（例えば、ＣＲＢＮのＣＭＡ結合ポケット内で）を誘導するか、そうでなければＣＲＢＮ表面（例えば、タンパク質の隣接領域上）の特性を変更する化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物に関し、上記ＣＲＢＮ配座の変化または変更は、結果としてＡＳＳ１ではないがＡＳＳ１に弱く結合するか、実質的に結合しないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のユビキチン化および／または分解となる。
【0048】
実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ＣＲＢＮを結合するが、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質に弱く結合するか、実質的に結合しない。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、約１μＭの親和性、またはより高い親和性でＣＲＢＮを結合する。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、約５００ｎＭ、または約３００ｎＭ、約１００ｎＭ、約３０ｎＭ、約１０ｎＭ、または約１ｎＭの親和性でＣＲＢＮを結合する。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、約５００ｎＭ、または約３００ｎＭ、約１００ｎＭ、約３０ｎＭ、約１０ｎＭ、または約１ｎＭの親和性でＣＲＢＮを結合するが、少なくとも１μＭ、または少なくとも３μＭ、または少なくとも１０μＭ、または少なくとも３０μＭ、または少なくとも１００μＭ、または少なくとも３００μＭ、または少なくとも１０００μＭの親和性でＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質を結合する。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ＡＳＳ１に弱く結合するか、実質的に結合しない。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、少なくとも１μＭ、または少なくとも３μＭ、または少なくとも１０μＭ、または少なくとも３０μＭ、または少なくとも１００μＭ、または少なくとも３００μＭ、または少なくとも１０００μＭの親和性でＡＳＳ１を結合する。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、少なくとも１μＭ、または少なくとも３μＭ、または少なくとも１０μＭ、または少なくとも３０μＭ、または少なくとも１００μＭ、または少なくとも３００μＭ、または少なくとも１０００μＭの親和性でＡＳＳ１を結合するが、約５００ｎＭ、または約３００ｎＭ、約１００ｎＭ、約３０ｎＭ、約１０ｎＭ、または約１ｎＭの親和性でＣＲＢＮを結合する。
【0049】
種々の実施形態において、ＣＲＢＮについての化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物の結合ＫＤまたはＥＣ５０は、ＡＳＳ１についての化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物の結合ＫＤまたはＥＣ５０よりも実質的に低い（すなわち、ＣＲＢＮの結合は、ＡＳＳ１についての結合よりも実質的に堅い）。
【0050】
種々の実施形態において、ＣＲＢＮについての化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物の親和性は、ＡＳＳ１についての化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物の親和性よりも約１０倍、または約１００倍、または約１，０００倍、または約１０，０００倍、または約１００，０００倍高い。
【0051】
種々の実施形態において、ＣＲＢＮについての化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物の親和性は、ＡＳＳ１についての化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物の親和性よりも、約１０倍から約５０倍、または約１０倍から約１００倍、または約１０倍から約２５０倍、または約１０倍から約５００倍、または約１０倍から約１，０００倍、または約１０倍から約３，０００倍、または約１０倍から約５，０００倍、または約１０倍から約１０，０００倍、または約１０倍から約３０，０００倍、または約１０倍から約５０，０００倍、または約１０倍から約１００，０００倍、または約１００倍から約１，０００倍、または約１００倍から約３，０００倍、または約１００倍から約５，０００倍、または約１００倍から約１０，０００倍、または約１００倍から約３０，０００倍、または約１００倍から約５０，０００倍、または約１００倍から約１００，０００倍、または約１，０００倍から約１０，０００倍、または約１，０００倍から約３０，０００倍、または約１，０００倍から約５０，０００倍、または約１，０００倍から約１００，０００倍低い。
【0052】
種々の実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ＡＳＳ１を結合するよりも約１０倍、または約１００倍、または約１，０００倍、または約１０，０００倍、または約１００，０００倍堅くＣＲＢＮを結合する。
【0053】
種々の実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物がＡＳＳ１を結合するよりも、約１０倍から約５０倍、または約１０倍から約１００倍、または約１０倍から約２５０倍、または約１０倍から約５００倍、または約１０倍から約１，０００倍、または約１０倍から約３，０００倍、または約１０倍から約５，０００倍、または約１０倍から約１０，０００倍、または約１０倍から約３０，０００倍、または約１０倍から約５０，０００倍、または約１０倍から約１００，０００倍、または約１００倍から約１，０００倍、または約１００倍から約３，０００倍、または約１００倍から約５，０００倍、または約１００倍から約１０，０００倍、または約１００倍から約３０，０００倍、または約１００倍から約５０，０００倍、または約１００倍から約１００，０００倍、または約１，０００倍から約１０，０００倍、または約１，０００倍から約３０，０００倍、または約１，０００倍から約５０，０００倍、または約１，０００倍から約１００，０００倍堅くＣＲＢＮに結合する。
【0054】
実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、分子糊である。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、グルタルイミド環およびフタルイミド環を含み、そのいずれかまたは両方は、場合によっては化学的に修飾されている。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物のグルタルイミド環は、ＣＲＢＮにおける３つのトリプトファン残基のケージと水素結合することができる。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ネオ基質との相互作用を可能にするＣＲＢＮの疎水性表面の曝露を誘導する。
【0055】
実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、免疫調節剤または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）である。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ＩＭｉＤ様グルタルイミド環を含む化合物であるが、そうでなければ、化学構造が異なり、ＣＲＢＮにおけるグルタルイミド－ＩＭｉＤと同じ小分子結合ポケット（ＣＲＢＮにおけるＩＭｉＤ結合ポケット）に結合する。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、グルタルイミド環を含まず、ＩＭｉＤポケット内のＣＲＢＮを結合することができる化合物である。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ＣＲＢＮを結合するが、ＩＭｉＤポケット内ではない化合物である。
【0056】
免疫調節剤（ＩＭｉＤ）として既知であるサリドマイド、およびその類似誘導体のレナリドミドおよびポマリドミドを使用して、多発性骨髄腫、リンパ腫および他の血液病などの多様な臨床状態を処置する。任意の特定の理論に制限されることなく、本発明において使用される免疫調節剤は、Ｔ細胞の強力な共刺激剤であり得、用量依存的様式で細胞増殖を高める。本発明の免疫調節剤はまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットに対してよりもＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットに対してより大きい共刺激効果を有する可能性がある。加えて、免疫調節剤は、抗炎症特性を有し、Ｔ細胞を共刺激する。
【0057】
実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ＣＲＢＮを結合するが、ＡＳＳ１を結合しない。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ＣＲＢＮならびにＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質を結合する。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ＣＲＢＮならびにＡＳＳ１およびＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質の１つまたは複数を同時に結合することができる。
【0058】
実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ヘテロ二機能性であるか、ヘテロ二機能性化合物の成分である。
【0059】
実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、タンパク質分解誘導キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）である。種々の実施形態において、試験化合物または候補化合物は、タンパク質分解誘導キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）の成分である。
【0060】
種々の実施形態において、本発明は、例えば、ＣＲＢＮを結合することができるが、ＡＳＳ１に弱く結合するか、実質的に結合しない特徴を有することにより、ＰＲＯＴＡＣ内の包含に適している化合物（例えばＰＲＯＴＡＣの成分として）の発見または同定に関する。
【0061】
種々の実施形態において、本発明は、例えば、ＣＲＢＮを結合することができるが、ＡＳＳ１ならびに／またはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／もしくはネオ基質に弱く結合するか、実質的に結合しない特徴を有することにより、ＰＲＯＴＡＣ内の包含に適している化合物（例えばＰＲＯＴＡＣの成分として）の発見または同定に関する。
【0062】
実施形態において、ＰＲＯＴＡＣは、標的タンパク質およびユビキチン化機構をまとめ、それによって目的のタンパク質のユビキチン化およびそれに続くプロテアソームにおける分解を誘発するのに適切な長さのリンカーにより結合されている、細胞内標的タンパク質ならびにＥ３ユビキチンリガーゼリクルート基のためのリガンドを組み込む。
【0063】
種々の実施形態において、ＰＲＯＴＡＣは、（ｉ）本明細書に記載されるような試験化合物または候補化合物、例えば、上述した分子糊化合物を含む、ＣＲＢＮバインダ、および（ｉｉ）試験化合物により結合したタンパク質とは異なる標的タンパク質（例えば、試験化合物／ＣＲＢＮ複合体へのリクルートメントによりネオ基質になるであろうＣＲＢＮ基質またはタンパク質）に結合することができる化合物を含み、（ｉ）および（ｉｉ）は、リンカーを介して共有結合している。
【0064】
実施形態において、ＰＲＯＴＡＣは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質を結合することができる部分をさらに含む。
【0065】
実施形態において、ＰＲＯＴＡＣは、リンカーをさらに含む。実施形態において、リンカーは、標的タンパク質（例えば、ＡＳＳ１ならびに／またはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／もしくはネオ基質）およびユビキチン化機構をまとめ、それによって目的のタンパク質のユビキチン化およびそれに続くプロテアソームにおける分解を誘発するのに適切な長さのものである。
【0066】
実施形態において、ＰＲＯＴＡＣは、（ｉ）化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物ならびに（ｉｉ）リンカーに共有結合した、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質を結合することができる部分を含む。
【0067】
種々の実施形態において、本発明は、（ａ）ＣＲＢＮを結合するが、ＡＳＳ１に弱く結合するか、実質的に結合しない化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物、ならびに（ｂ）ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質を結合する化合物を含む、ＰＲＯＴＡＣに関する。
【0068】
実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、（ｉ）ＣＲＢＮを結合する化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物、ならびに（ｉｉ）リンカーに共有結合した、ＡＳＳ１ならびに／またはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／もしくはネオ基質を結合することができる部分を含む。
【0069】
実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、ヘテロ二機能性であり、クリックケミストリーを介して共役することができる。クリックケミストリーは、高収率で、範囲が広く、クロマトグラフィなしで除去することができる副産物のみを生成し、立体特異的で、実行が単純であり、容易に除去可能であるか温和な溶媒で実行することができる反応を説明する（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ａ Ｓｔｅｐｗｉｓｅ Ｈｕｉｓｇｅｎ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ：Ｃｏｐｐｅｒ（ｌ）－Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ”Ｌｉｇａｔｉｏｎ” ｏｆ Ａｚｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ａｌｋｙｎｅｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６－２５９９）。クリックケミストリーは、多くの異なる形態で実施されており、化学および生物学の両方で幅広い用途がある。クリック反応のサブクラスは、周囲の生物学的環境に対して不活性である反応物質を含む。そのようなクリック反応は、バイオ直交型と呼ばれる（Ｓｌｅｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｆｉｓｈｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａ Ｓｅａ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４８：６９７４－６９９８）。バイオ直交型クリックケミストリーに適したバイオ直交型の反応物質対は、以下の特性を有する分子群である：（１）それらは、相互に反応するが、細胞内環境で細胞生化学システムと有意に交差反応しないか、相互作用しない；（２）それらならびにそれらの産物および副産物は、生理学的設定において安定であり、非毒性である；ならびに（３）それらの反応は、高度に特異的であり、迅速である。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物はヘテロ二機能性であり、バイオ直交型クリックケミストリーを介して共役することができる。
【0070】
実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、クリック可能なタンパク質分解誘導キメラ（ＣＬＩＰＴＡＣ）である。そのようなＣＬＩＰＴＡＣは、実施形態において、（ａ）細胞内標的タンパク質（例えば、ＡＳＳ１ならびに／またはＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／もしくはネオ基質）のためのリガンドを含む第１の部分；（ｂ）Ｅ３ユビキチンリガーゼのためのリガンドを含む第２の部分；ならびに（ｃ）第１の部分および第２の部分を共有的にカップリングしているリンカー部分を含み、リンカーは、反応性部分の互換性のある対間のバイオ直交型クリック反応により生産された共有結合を含む。
【0071】
実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、細胞内クリック形成タンパク質分解誘導キメラ（ＣＬＩＰＴＡＣ）である。
【0072】
他の基質／比率の決定
実施形態において、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、例えばＣＲＢＮを含むＥ３ユビキチンリガーゼ複合体のタンパク質基質、またはその下流の基質である。
実施形態において、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、例えばＣＲＢＮを含むＥ３ユビキチンリガーゼ複合体のタンパク質基質、またはその下流の基質である。
【0073】
実施形態において、本明細書に記載の方法は、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のリクルートメントおよび／またはユビキチン化および／または分解についてアッセイすることをさらに含む。実施形態において、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、デグロンモチーフを含む。
【0074】
実施形態において、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、ｉの側鎖とｉ＋３の骨格ＮＨとの間およびｉの骨格カルボニル酸素とｉ＋４の骨格ＮＨとの間の水素結合を有するＡｓｘまたはＳＴモチーフなどの水素結合アクセプタを有する側鎖を保持するｉ残基を有するｂヘアピンａターンを含む。実施形態において、ｉ＋４の残基は、グリシンである（非限定例には、ＧＳＰＴ１、ＣＫ１ａが含まれる）。
【0075】
実施形態において、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、残基ｉおよびシステインであるｉ＋３およびグリシンであるｉ＋４の残基を有するｂヘアピンａターンを有する。２つのＣｙｓ残基は、亜鉛イオンに結合してターンの形状を強固にする（非限定例には、ＩＫＺＦ１、ＺｎＦ６９２および参照によりその全体が組み込まれた「Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｃ２Ｈ２ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｅｇｒｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｙ ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＲＢＮ」，Ｓｉｅｖｅｒｓ ｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．３６２，Ｉｓｓｕｅ ６４１４，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｔ０５７２（２０１８）に報告されているすべての基質が含まれる）。
【0076】
実施形態において、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、ｉ＋３の位置にグリシンを保持する「擬似ループ」、ｂヘアピンｂターンを有する。ターン構造は、ｉ－１の側鎖の水素結合アクセプタとｉ＋３のグリシンのカルボニルとの間の水素結合により強固にされている可能性がある（非限定例には、ＣＤＣ７が含まれる）。
【0077】
実施形態において、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、イカロス（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（ＩＫＺＦ３）、イオス（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（ＩＫＺＦ５）、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、およびＺＦＰ９１から選択される。
【0078】
実施形態において、本明細書に記載の方法は、ＡＳＳ１のリクルートメントおよび／または分解についてアッセイすることをさらに含む。
【0079】
種々の実施形態において、本方法は、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質と比較したＡＳＳ１のレベルの決定を可能にする。種々の実施形態において、本方法は、ＡＳＳ１と比較したＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のレベルの決定を可能にする。
【0080】
種々の実施形態において、ＡＳＳ１のリクルートメントおよび／または分解の低減、低下または実質的にないことは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のリクルートメントおよび／または分解の量に関連する。
【0081】
実施形態において、本明細書に記載の分類は、ＣＲＢＮによるリクルートメント、ＣＲＢＮへの結合、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの異なる基質および／またはネオ基質のユビキチン化、および／または分解に対して、リクルートメント、ＣＲＢＮへの結合、ＡＳＳ１のユビキチン化、および／またはＡＳＳ１の分解の比率をシフトさせる試験化合物の能力に基づく。
【0082】
例えば、一実施形態において、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮ基質および／またはＣＲＢＮのネオ基質のリクルートメントに対するＡＳＳ１のリクルートメントの比率におけるものであるか、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のＣＲＢＮへの結合に対するＡＳＳ１のリクルートメントの比率におけるものであるか、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のユビキチン化に対するＡＳＳ１のリクルートメントの比率におけるものであるか、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質の分解に対するＡＳＳ１のリクルートメントの比率におけるものである。
【0083】
例えば、一実施形態において、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のリクルートメントに対するＡＳＳ１のＣＲＢＮへの結合の比率におけるものであるか、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のＣＲＢＮへの結合に対するＡＳＳ１のＣＲＢＮへの結合の比率におけるものであるか、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のユビキチン化に対するＡＳＳ１のＣＲＢＮへの結合の比率におけるものであるか、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質の分解に対するＡＳＳ１のＣＲＢＮへの結合の比率におけるものである。
【0084】
別の例として、一実施形態において、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のリクルートメントに対するＡＳＳ１のユビキチン化の比率におけるものであるか、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のＣＲＢＮへの結合に対するＡＳＳ１のユビキチン化の比率におけるものであるか、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のユビキチン化に対するＡＳＳ１のユビキチン化の比率におけるものであるか、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質の分解に対するＡＳＳ１のユビキチン化の比率におけるものである。
【0085】
さらなる例として、一実施形態におい、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のリクルートメントに対するＡＳＳ１の分解の比率におけるものであるか、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のＣＲＢＮへの結合に対するＡＳＳ１の分解の比率におけるものであるか、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のユビキチン化に対するＡＳＳ１の分解の比率におけるものであるか、シフトは、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質の分解に対するＡＳＳ１の分解の比率におけるものである。
【0086】
種々の実施形態において、化合物または試験化合物は、ＡＳＳ１のリクルートメント、ユビキチン化、および／または分解と比較して、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のリクルートメント、ユビキチン化、および／または分解を支持する能力に基づいて候補化合物または治療用化合物として分類される。
【0087】
種々の実施形態において、ＡＳＳ１のリクルートメントおよび／または分解の低減、低下または実質的にないことは、化合物または試験化合物を欠く参照試料におけるＡＳＳ１のリクルートメント、ユビキチン化および／または分解の量に関連する。
【0088】
種々の実施形態において、ＡＳＳ１のリクルートメントおよび／または分解の低減、低下または実質的にないことは、基底状態でのＡＳＳ１のリクルートメント、ユビキチン化および／または分解の量に関連する。
【0089】
実施形態において、分解は、ユビキチン依存性である。
【0090】
実例となる疾患
本開示による化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、種々のタイプの癌の処置のために製剤化することができる。
本開示による化合物、試験化合物、候補化合物、または治療用化合物は、種々のタイプの癌の処置のために製剤化することができる。
【0091】
実施形態において、ＣＲＢＮに結合する能力を有する試験化合物を得ること、ＡＳＳ１の存在下で試験化合物をＣＲＢＮと接触させること、ＡＳＳ１のリクルートメントおよび／または分解についてアッセイすること、ならびにＡＳＳ１のリクルートメントおよび／または分解の低減、低下、または実質的にないことが検出され、癌における使用のために候補化合物を製剤化する場合に候補化合物として試験化合物を分類することによって候補化合物を同定することによる癌療法のための候補化合物を製造するための方法が提供される。
【0092】
実施形態において、治療用化合物を同定することおよび治療における使用のための治療用組成物を製剤化することにより癌療法のための治療用化合物を製造する方法が提供され、治療用化合物の同定は、ＣＲＢＮに結合する能力を有する試験化合物を得ること；ＡＳＳ１の存在下で試験化合物をＣＲＢＮと接触させること；ＡＳＳ１のリクルートメントおよび／または分解についてアッセイすること；ならびにＡＳＳ１のリクルートメントおよび／または分解の低減、低下、または実質的にないことが検出され、癌における使用のための治療用化合物を製剤化する場合に治療用化合物として試験化合物を分類することによる。
【0093】
実施形態において、癌は、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳および中枢神経系の癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸および直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌（胃腸癌を含む）；神経膠芽腫；肝癌；肝細胞腫；上皮内腫瘍；腎臓癌または腎癌；咽頭癌；白血病；肝癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌）；メラノーマ；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（唇、舌、口、および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮または子宮内膜癌；泌尿器系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫ならびにＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫（低悪性度／濾胞性の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性のＮＨＬ；中悪性度のびまん性ＮＨＬ；高悪性度の免疫芽細胞ＮＨＬ；高悪性度のリンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度の小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに他の癌腫および肉腫；および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、およびメーグス症候群から選択される。
【0094】
いくらかの実施形態において、癌は、白血病またはリンパ腫である。実例となる白血病またはリンパ腫には、限定されないが、低悪性度および中悪性度の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、再発したホジキン病、抵抗性ホジキン病高悪性度、ホジキンリンパ腫のリンパ球優勢サブタイプ、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、低悪性度、中悪性度および高悪性度の濾胞性リンパ腫（ＦＬ）を含むＦＬ、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴタイプの辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、および未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を含むＢ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）から選択される白血病またはリンパ腫が含まれる。
【0095】
実施形態において、癌は、血液悪性腫瘍であり、場合によっては、多発性骨髄腫および５ｑ欠失関連骨髄異形成症候群（ｄｅｌ（５ｑ）ＭＤＳ）から選択される。
【0096】
いくらかの実施形態において、癌は、多発性骨髄腫である。
【0097】
副作用プロファイリングおよび／または低減
種々の実施形態において、本方法は、種々の副作用、例えばＩＭｉＤ、例えばレナリドミドに関連するものを低減または防止するのに役立つ可能性がある改善された化合物の同定を可能にする。薬物誘発性肝損傷は、多くの薬物の使用後に発症する可能性がある既知の深刻な問題である。薬物誘発性肝損傷は、処方薬に曝露された１０，０００人から１００，０００人あたり毎年１０から１５の間で発生すると推定された。Ｓｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００２；３６（２）：４５１を参照されたい。ＡＳＳ１が免疫組織およびＴ細胞に存在しており、Ｔ細胞機能において役割を果たすことが示唆されている。Ｔａｒａｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；９７（２）：２７３－２７８を参照されたい。研究は、Ｔ細胞中のＡＳＳ１酵素における欠陥が異常なＴ細胞分化および機能に関連しており、結果として原発性免疫不全となることを示した。
種々の実施形態において、本方法は、種々の副作用、例えばＩＭｉＤ、例えばレナリドミドに関連するものを低減または防止するのに役立つ可能性がある改善された化合物の同定を可能にする。薬物誘発性肝損傷は、多くの薬物の使用後に発症する可能性がある既知の深刻な問題である。薬物誘発性肝損傷は、処方薬に曝露された１０，０００人から１００，０００人あたり毎年１０から１５の間で発生すると推定された。Ｓｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００２；３６（２）：４５１を参照されたい。ＡＳＳ１が免疫組織およびＴ細胞に存在しており、Ｔ細胞機能において役割を果たすことが示唆されている。Ｔａｒａｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；９７（２）：２７３－２７８を参照されたい。研究は、Ｔ細胞中のＡＳＳ１酵素における欠陥が異常なＴ細胞分化および機能に関連しており、結果として原発性免疫不全となることを示した。
【0098】
それらの治療上の利益にもかかわらず、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドは、例えば、腎臓および肝臓の毒性などの合併症に関連していることが知られている。サリドマイドおよびレナリドミドは両方とも、重度である可能性があり、急性肝不全による死につながる可能性がある急性肝損傷の事例に関係している。例えば、腎不全は、多発性骨髄腫におけるレナリドミド療法の深刻な潜在的合併症である。Ｋｒｅｉｎｉｚ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ａｃｕｔｅ Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ：Ａ Ｒａｒｅ Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ？Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３６（６）：２８８９－２８９２を参照されたい。１つの研究において、ＡＬアミロイドーシスを有する患者の６６％は、レナリドミド処置中の腎機能の悪化を示し、腎機能障害は、患者の３２％で重度であった。Ｓｐｅｃｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｋｉｄｎｅｙ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ＡＬ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２６（３）：８８１－８８６。多発性骨髄腫患者および他の癌患者について報告されている腎毒性は、レナリドミドおよびポマリドミド処置の潜在的な合併症として現在認識されている。Ｗａｎｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｒｅｎａｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ：ＣＪＡＳＮ，１２（１）：１７６－１８９。
【0099】
実施形態において、本発明は、薬剤の潜在的な副作用を低減または排除する方法で、候補化合物および／または治療用化合物を製造する方法に関する。実施形態において、候補化合物および／または治療用化合物は、ＣＲＢＮの副作用誘導の下流の活性に対するＣＲＢＮの治療的に関連する下流の活性の比率を変化させるために化合物がＣＲＢＮに結合するか、それと相互作用するかどうかを決定することにより同定され、ＣＲＢＮの治療的に関連する下流の活性は、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質（例えば、デグロンモチーフを含むもの、例えばイカロス（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（ＩＫＺＦ３）、イオス（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（ＩＫＺＦ５）、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、および／またはＺＦＰ９１）のリクルートメントおよび／または分解を含み、ＣＲＢＮの副作用誘導の下流の活性は、ＡＳＳ１の切除されたリクルートメントおよび／または分解の低減を含む。つまり、薬剤は、ＣＲＢＮの治療的な下流の効果を支持し、ＣＲＢＮの非治療的な下流の効果を支持しない。
【0100】
いくらかの実施形態において、本方法は、化合物が安全性の懸念、例えば腎臓または肝臓の安全性の懸念、またはＴ細胞に対する効果（例えば、限定されないが、Ｔ細胞機能の不全）を有するかどうかの指標としてのＡＳＳ１の照合を含む。例えば、ＡＳＳ１の分解の検出は、化合物が安全性の懸念に悩まされていることを示唆する可能性がある。
【0101】
いくらかの実施形態において、本方法は、副作用が少ないかない方法での疾患の処置に関する。例えば、処置方法は、実施形態において、副作用が少ないことを支持するＡＳＳ１プロファイル（例えば、ＡＳＳ１の切除されたリクルートメントおよび／または分解の低減）に基づいて治療用のＣＲＢＮ結合化合物を選択することを含む。
【0102】
実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、および／または治療用化合物は、他のＣＲＢＮ結合化合物と比べて化合物、試験化合物、候補化合物、および／または治療用化合物を受けた被験者における副作用の低減を示す。実施形態において、化合物、試験化合物、候補化合物、および／または治療用化合物は、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドミドの１つと比べて化合物、試験化合物、候補化合物、および／または治療用化合物を受けた被験者における副作用の低減を示す。
【0103】
実施形態において、副作用には、肝機能の低下または不全が含まれる、および／または腎機能の低下または不全が含まれる。実施形態において、副作用には、Ｔ細胞効果（例えば、限定されないがＴ細胞機能の不全）が含まれる。
【0104】
ＡＳＳ１の分解の促進／ＡＳＳ１依存性癌
ＡＳＳ１は、肺癌、結腸癌、胃癌および卵巣癌を含む種々のヒトの癌において過剰発現している。Ｄｅｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １２６（１２）：２７６２－２７７２。例えば、近年、ＡＳＳ１が原発性ヒト結腸直腸腫瘍においてアップレギュレートされた標的であり、ＡＳＳ１の薬理学的阻害または遺伝的切除が、結腸直腸癌の病原性を損なうことが示されている。Ｂａｔｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ １ ｉｓ ａ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１２（４）：９０５－９１１。したがって、結腸直腸癌の処置には、ＡＳＳ１の阻害を含むことができる。
ＡＳＳ１は、肺癌、結腸癌、胃癌および卵巣癌を含む種々のヒトの癌において過剰発現している。Ｄｅｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １２６（１２）：２７６２－２７７２。例えば、近年、ＡＳＳ１が原発性ヒト結腸直腸腫瘍においてアップレギュレートされた標的であり、ＡＳＳ１の薬理学的阻害または遺伝的切除が、結腸直腸癌の病原性を損なうことが示されている。Ｂａｔｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ １ ｉｓ ａ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１２（４）：９０５－９１１。したがって、結腸直腸癌の処置には、ＡＳＳ１の阻害を含むことができる。
【0105】
理論に縛られることを望むことなく、ＡＳＳ１は、オートファジーを調節することにより胃癌の浸潤および進行に寄与する。さらにＡＳＳ１は、結腸直腸癌の病原性の代謝調節因子である。したがって、種々の実施形態において、本発明は、ＡＳＳ１のリクルートメントおよび／または分解を促進する化合物の同定に関する。
【0106】
種々の実施形態において、本発明は、ＣＲＢＮに結合する能力を有する試験化合物を得ること；ＡＳＳ１の存在下で試験化合物をＣＲＢＮと接触させること；ＡＳＳ１のリクルートメントおよび／または分解をアッセイすること；ならびにＡＳＳ１の高いまたは増加したリクルートメントおよび／または分解が検出される場合に候補化合物として試験化合物を分類することにより、候補化合物を同定するための方法に関する。
【0107】
種々の実施形態において、本発明は、候補化合物を同定することおよび治療における使用のための候補組成物を製剤化することを含む、候補組成物を製造するための方法に関し、同定は、ＣＲＢＮに結合する能力を有する試験化合物を得ること、ＡＳＳ１の存在下で試験化合物をＣＲＢＮと接触させること、ＡＳＳ１のリクルートメントおよび／または分解についてアッセイすること、ならびにＡＳＳ１の高いまたは増加したリクルートメントおよび／または分解が検出される場合に候補化合物として試験化合物を分類することによる。
【0108】
実施形態において、ＡＳＳ１の高いまたは増加したリクルートメントおよび／または分解は、試験化合物と接触されるＣＲＢＮの存在下で、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質がイカロス（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（ＩＫＺＦ３）、イオス（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（ＩＫＺＦ５）、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、およびＺＦＰ９１から選択される場合、ＡＳＳ１ではないＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質のリクルートメントおよび／または分解に関連している。
【0109】
実施形態において、ＡＳＳ１の高いまたは増加したリクルートメントおよび／または分解は、試験化合物がない参照試料中でのＡＳＳ１のリクルートメントおよび／または分解の量に関連している。
【0110】
実施形態において、ＡＳＳ１の高いまたは増加したリクルートメントおよび／または分解が検出される場合に同定された候補化合物は、例えば癌が例えば胃癌または結腸直腸癌など、ＡＳＳ１に依存している癌を処置する際の使用に適している。
【0111】
実施例
実施例１：分子糊によるセレブロンに直接リクルートされた基質／ネオ基質としての組換えアルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）の発見
リガンド誘導ＣＲＢＮ基質、またはネオ基質を同定するために、ＭＡＰＰＩＴ細胞マイクロアレイスクリーンは、Ｌｉｅｖｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｂｉｎａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １５．１２（２０１６）：３６２４－３６３９に記載の手順を使用して実行された。従来のＭＡＰＰＩＴアッセイは、タンパク質－タンパク質相互作用を監視するために使用されている。ベイトタンパク質（プロテインＡ）は、それ自体がエリスロポエチン（Ｅｐｏ）受容体の細胞外ドメインに融合しているレプチン受容体の操作された細胞内受容体ドメインに遺伝的に融合している融合タンパク質として発現される。ＥｐｏリガンドのＥｐｏＲ成分への結合は、結果として、受容体関連細胞内ＪＡＫ２の活性化となる。しかし、活性化されたＪＡＫ２は、通常は活性化されたＪＡＫ２によりリン酸化されたそのチロシン残基が突然変異されているので、ＳＴＡＴ３結合およびそのリン酸化を誘発するためにレプチン受容体を活性化することができない。ＪＡＫ２リン酸化可能なＳＴＡＴ３ドッキン部位の再構成は、代わりにプロテインＢのプロテインＡとの相互作用を通じて作成され、それによって、プロテインＢは、ｇｐ１３０受容体（現在、活性化されたＪＡＫ２キナーゼにより認識される適切なチロシン残基を保持する）の細胞質ドメインに融合される。したがって、プロテインＡのプロテインＢとの物理的相互作用は再構成し、ＥＰＯは、ＪＡＫ２－ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路の活性化を誘発した。ＳＴＡＴ３の活性化は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、またはＧＦＰもしくはいくらかのその他の種類の蛍光タンパク質（ＥＧＦＰなど）などの蛍光マーカーをコードする遺伝子を含むＳＴＡＴ３反応性レポータ遺伝子の導入により監視することができる。このように、ＭＡＰＰＩＴアッセイは、無傷の細胞におけるそのような組換えタンパク質－タンパク質相互作用を評価するための用途の広いアッセイを提供する。プロテインＢ融合タンパク質（すなわち、プロテインＢ－ｇｐ１３０融合タンパク質）をコードするｃＤＮＡライブラリを、この方法を用いてスクリーニングし、プロテインＡベイト（ＥｐｏＲ－ＬｅｐＲ融合タンパク質に融合）と相互作用することができる任意のタンパク質を同定することができる。
実施例１：分子糊によるセレブロンに直接リクルートされた基質／ネオ基質としての組換えアルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）の発見
リガンド誘導ＣＲＢＮ基質、またはネオ基質を同定するために、ＭＡＰＰＩＴ細胞マイクロアレイスクリーンは、Ｌｉｅｖｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｂｉｎａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １５．１２（２０１６）：３６２４－３６３９に記載の手順を使用して実行された。従来のＭＡＰＰＩＴアッセイは、タンパク質－タンパク質相互作用を監視するために使用されている。ベイトタンパク質（プロテインＡ）は、それ自体がエリスロポエチン（Ｅｐｏ）受容体の細胞外ドメインに融合しているレプチン受容体の操作された細胞内受容体ドメインに遺伝的に融合している融合タンパク質として発現される。ＥｐｏリガンドのＥｐｏＲ成分への結合は、結果として、受容体関連細胞内ＪＡＫ２の活性化となる。しかし、活性化されたＪＡＫ２は、通常は活性化されたＪＡＫ２によりリン酸化されたそのチロシン残基が突然変異されているので、ＳＴＡＴ３結合およびそのリン酸化を誘発するためにレプチン受容体を活性化することができない。ＪＡＫ２リン酸化可能なＳＴＡＴ３ドッキン部位の再構成は、代わりにプロテインＢのプロテインＡとの相互作用を通じて作成され、それによって、プロテインＢは、ｇｐ１３０受容体（現在、活性化されたＪＡＫ２キナーゼにより認識される適切なチロシン残基を保持する）の細胞質ドメインに融合される。したがって、プロテインＡのプロテインＢとの物理的相互作用は再構成し、ＥＰＯは、ＪＡＫ２－ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路の活性化を誘発した。ＳＴＡＴ３の活性化は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、またはＧＦＰもしくはいくらかのその他の種類の蛍光タンパク質（ＥＧＦＰなど）などの蛍光マーカーをコードする遺伝子を含むＳＴＡＴ３反応性レポータ遺伝子の導入により監視することができる。このように、ＭＡＰＰＩＴアッセイは、無傷の細胞におけるそのような組換えタンパク質－タンパク質相互作用を評価するための用途の広いアッセイを提供する。プロテインＢ融合タンパク質（すなわち、プロテインＢ－ｇｐ１３０融合タンパク質）をコードするｃＤＮＡライブラリを、この方法を用いてスクリーニングし、プロテインＡベイト（ＥｐｏＲ－ＬｅｐＲ融合タンパク質に融合）と相互作用することができる任意のタンパク質を同定することができる。
【0112】
この実施例１において、我々は、ＣＲＢＮリガンド誘導タンパク質相互作用を決定する際に使用する、すなわち、特異的ＣＲＢＮベイトタンパク質（この系において突然変異レプチン受容体に融合された）を使用して、プロテインＢ融合タンパク質（プロテインＢ－ｇｐ１３０融合タンパク質）を含む、タンパク質複合体形成のリガンド依存性誘導についてアッセイするために我々が特別に開発したＭＡＰＰＩＴアッセイの派生物を使用した。このように、我々は、リガンド依存性候補ＣＲＢＮネオ基質についてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることができた。このアッセイはまた、この文書における他の実施例（実施例５）におけるそのような相互作用（またはその欠如）の特徴づけにも使用されている。
【0113】
簡潔に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＣＲＢＮベイト発現プラスミド（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）でトランスフェクトし、１５Ｋ ＯＲＦをカバーするｐｒｅｙ発現プラスミドコレクションを含むマイクロアレイスクリーニングプレートに加えた。トランスフェクションの２４時間後、ＣＲＢＮリガンドＣＣ－２２０（１０μＭ）の有無にかかわらず、細胞をエリスロポエチンで差次的に刺激し、レポータシグナル（ＧＦＰ様蛍光レポータ）を４８時間後に読み取った。蛍光強度データを以前報告されたように分析し、図１に示すドットプロットを作成した。上のランクのヒットは、イカロス（ＩＫＺＦ１）、既知のＣＣ－２２０誘導ＣＲＢＮ基質を含んでいた。この研究において、示されるように、我々はまた、アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）を新規ＣＣ２２０誘導ＣＲＢＮネオ基質として同定した。ＡＳＳ１はまた、レナリドミド、ＣＲＢＮに結合する別のタイプのＩＭｉＤ（周知の抗癌剤であるＲｅｖｌｉｍｉｄ（商標）として商業的に既知である）などの化合物でもこのように同定された。
【0114】
実施例２：分子糊によるセレブロンにリクルートされた基質／ネオ基質としての内因性アルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ１）の発見
この研究において、我々は、レナリドミドなどのＩＭｉＤが内因性ＡＳＳ１のＣＲＢＮへのリクルートメントを誘導することができることを確認するために着手した。この目的のため、我々は、ＶｉｒｏＴｒａｐ（Ｔｉｔｅｃａ，ｅｔ ａｌ．「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｒａｐｐｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ Ｖｉｒｏｔｒａｐ ａｎｄ ＳＦＩＮＸ」．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １２．５（２０１７）：８８１）として既知である以前説明された方法を使用した。この方法を用いて、ＣＲＢＮは、ウイルスタンパク質ＨＩＶ－ＧＡＧとの融合タンパク質として発現される。ＨＩＶ－ＧＡＧは、ＨＥＫ２９３などの細胞内で発現した場合、細胞から発芽するウイルス様粒子の形成を誘発することができる。粒子内で、ＨＩＶ－ＧＡＧタンパク質は、粒子の中心に向けられている。ＣＲＢＮに融合した場合、ＣＲＢＮは、粒子の内部コアにも呈示される。そのイベントにおいて、ＧＡＧ－ＣＲＢＮ融合体は、細胞内のタンパク質と相互作用し、そのようなタンパク質は、ＧＡＧ－ＣＲＢＮとともにウイルス様粒子に引き込まれる／捕捉される。このように、ＣＲＢＮリガンドの存在下または不在下で、ＣＲＢＮと相互作用する内因性タンパク質を同定することができる。これは、粒子の溶解および試料のトリプシン消化の標準の質量分析により達成される。その後、サブトラクティブ分析により、レナリドミドなどのＣＲＢＮリガンドに応答して粒子と特異的に会合するタンパク質が同定される。この方法を使用して、我々は、レナリドミドが内因性ＡＳＳ１のＣＲＢＮとの会合を誘導すること、すなわち、ＡＳＳ１トリプシン消化物が、レナリドミドに依存してウイルス粒子にリクルートされたタンパク質としてＡＳＳ１を同定したことを発見した。要するに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｇａｇ－ＣＲＢＮベイト発現プラスミドおよびＦｌａｇ－ＶＳＶ－Ｇコードプラスミドで同時トランスフェクトし（細胞培地からの粒子精製のため）、２４時間インキュベートした。次に、細胞を１０μＭレナリドミドまたは陰性対照としてのＤＭＳＯで処理した。化合物添加の２４時間後、抗Ｆｌａｇがコートされた磁気ビーズを使用してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を細胞上清から単離した。Ｆｌａｇペプチドを使用してビーズから溶出させた後、精製されたＶＬＰを溶解し、タンパク質内容物をトリプシンで一晩消化した。ペプチド試料をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析し、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアパッケージを使用して３連の試料からのデータを処理し、Ｐｅｒｓｅｕｓツールを用いてボルケーノプロット（図２）を生成した。レナリドミド対ＤＭＳＯ対照試料について高いシグナル比を示し、低ｐ値のトップヒットの中でＡＳＳ１を同定した。
この研究において、我々は、レナリドミドなどのＩＭｉＤが内因性ＡＳＳ１のＣＲＢＮへのリクルートメントを誘導することができることを確認するために着手した。この目的のため、我々は、ＶｉｒｏＴｒａｐ（Ｔｉｔｅｃａ，ｅｔ ａｌ．「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｒａｐｐｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ Ｖｉｒｏｔｒａｐ ａｎｄ ＳＦＩＮＸ」．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １２．５（２０１７）：８８１）として既知である以前説明された方法を使用した。この方法を用いて、ＣＲＢＮは、ウイルスタンパク質ＨＩＶ－ＧＡＧとの融合タンパク質として発現される。ＨＩＶ－ＧＡＧは、ＨＥＫ２９３などの細胞内で発現した場合、細胞から発芽するウイルス様粒子の形成を誘発することができる。粒子内で、ＨＩＶ－ＧＡＧタンパク質は、粒子の中心に向けられている。ＣＲＢＮに融合した場合、ＣＲＢＮは、粒子の内部コアにも呈示される。そのイベントにおいて、ＧＡＧ－ＣＲＢＮ融合体は、細胞内のタンパク質と相互作用し、そのようなタンパク質は、ＧＡＧ－ＣＲＢＮとともにウイルス様粒子に引き込まれる／捕捉される。このように、ＣＲＢＮリガンドの存在下または不在下で、ＣＲＢＮと相互作用する内因性タンパク質を同定することができる。これは、粒子の溶解および試料のトリプシン消化の標準の質量分析により達成される。その後、サブトラクティブ分析により、レナリドミドなどのＣＲＢＮリガンドに応答して粒子と特異的に会合するタンパク質が同定される。この方法を使用して、我々は、レナリドミドが内因性ＡＳＳ１のＣＲＢＮとの会合を誘導すること、すなわち、ＡＳＳ１トリプシン消化物が、レナリドミドに依存してウイルス粒子にリクルートされたタンパク質としてＡＳＳ１を同定したことを発見した。要するに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｇａｇ－ＣＲＢＮベイト発現プラスミドおよびＦｌａｇ－ＶＳＶ－Ｇコードプラスミドで同時トランスフェクトし（細胞培地からの粒子精製のため）、２４時間インキュベートした。次に、細胞を１０μＭレナリドミドまたは陰性対照としてのＤＭＳＯで処理した。化合物添加の２４時間後、抗Ｆｌａｇがコートされた磁気ビーズを使用してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を細胞上清から単離した。Ｆｌａｇペプチドを使用してビーズから溶出させた後、精製されたＶＬＰを溶解し、タンパク質内容物をトリプシンで一晩消化した。ペプチド試料をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析し、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアパッケージを使用して３連の試料からのデータを処理し、Ｐｅｒｓｅｕｓツールを用いてボルケーノプロット（図２）を生成した。レナリドミド対ＤＭＳＯ対照試料について高いシグナル比を示し、低ｐ値のトップヒットの中でＡＳＳ１を同定した。
【0115】
実施例３：生細胞におけるリガンド誘導ＣＲＢＮ－ＡＳＳ１相互作用－共免疫沈降分析による評価として
この研究において、我々は、タンパク質複合体の共免疫沈降を介して、ＨＥＫ２９３細胞で発現した場合のＡＳＳ１との相互作用を誘導するＣＲＢＮリガンドＣＣ２２０の能力を評価した。実施例１および２における知見と一致して、この代替アプローチは、ＣＣ２２０がＡＳＳ１のＣＲＢＮ－ＣＣ２２０複合体へのリクルートメントを特異的に誘導することを示した。同様の観察は、陽性対照として並んでいる既知のＣＲＢＮネオ基質ＩＫＺＦ３についてもなされた。簡潔に、（ｉ）ＦＬＡＧタグ付きｇｐ１３０－ＡＳＳ１（実施例１におけるＭＡＰＰＩＴアッセイで使用されたバージョン）、（ｉｉ）ＦＬＡＧタグ付きＡＳＳ１、または（ｉｉｉ）ＦＬＡＧタグ付きＩＫＺＦ３をコードするプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＨＡタグ付き－ＣＲＢＮと一時的に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を異なる用量（０μＭ、１μＭ、および３μＭ）のＣＣ－２２０でさらに２４時間処理した。翌日、細胞を溶解し、溶解物の１／１０をＦＬＡＧタグ付き融合タンパク質およびＨＡタグ付きＣＲＢＮの発現分析（図３Ｂに示す）のために保管した。抗ＦＬＡＧ Ａｂ（シグマ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓストレプトアビジンＴ１（インビトロジェン）を用いるＣｏ－ＩＰは、溶解物の残りの９／１０で実行された（図３Ａ）。免疫沈降後、結合したＦＬＡＧタンパク質、および任意の会合したタンパク質をＦＬＡＧペプチド（シグマ）を用いる溶出によりビーズから溶出させた。ＨＡ－ＣＲＢＮの存在（図３Ａ、上パネル）、すなわちＦＬＡＧ－ＡＳＳ１免疫沈降物へのそのリクルートメントを、抗ＨＡ Ａｂ（ロシュ）を使用する溶出試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を介して調査した。ＦＬＡＧ Ａｂ（シグマ）を使用して、それぞれＦＬＡＧタグ付きＡＳＳ１を検出した（図３Ａ、下パネル）。細胞溶解物中のすべてのタンパク質の発現を、図３Ｂに示すように、抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡ Ａｂ（シグマまたはロシュ、それぞれ）を用いる発現溶解物のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を介して調査した。
この研究において、我々は、タンパク質複合体の共免疫沈降を介して、ＨＥＫ２９３細胞で発現した場合のＡＳＳ１との相互作用を誘導するＣＲＢＮリガンドＣＣ２２０の能力を評価した。実施例１および２における知見と一致して、この代替アプローチは、ＣＣ２２０がＡＳＳ１のＣＲＢＮ－ＣＣ２２０複合体へのリクルートメントを特異的に誘導することを示した。同様の観察は、陽性対照として並んでいる既知のＣＲＢＮネオ基質ＩＫＺＦ３についてもなされた。簡潔に、（ｉ）ＦＬＡＧタグ付きｇｐ１３０－ＡＳＳ１（実施例１におけるＭＡＰＰＩＴアッセイで使用されたバージョン）、（ｉｉ）ＦＬＡＧタグ付きＡＳＳ１、または（ｉｉｉ）ＦＬＡＧタグ付きＩＫＺＦ３をコードするプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＨＡタグ付き－ＣＲＢＮと一時的に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を異なる用量（０μＭ、１μＭ、および３μＭ）のＣＣ－２２０でさらに２４時間処理した。翌日、細胞を溶解し、溶解物の１／１０をＦＬＡＧタグ付き融合タンパク質およびＨＡタグ付きＣＲＢＮの発現分析（図３Ｂに示す）のために保管した。抗ＦＬＡＧ Ａｂ（シグマ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓストレプトアビジンＴ１（インビトロジェン）を用いるＣｏ－ＩＰは、溶解物の残りの９／１０で実行された（図３Ａ）。免疫沈降後、結合したＦＬＡＧタンパク質、および任意の会合したタンパク質をＦＬＡＧペプチド（シグマ）を用いる溶出によりビーズから溶出させた。ＨＡ－ＣＲＢＮの存在（図３Ａ、上パネル）、すなわちＦＬＡＧ－ＡＳＳ１免疫沈降物へのそのリクルートメントを、抗ＨＡ Ａｂ（ロシュ）を使用する溶出試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を介して調査した。ＦＬＡＧ Ａｂ（シグマ）を使用して、それぞれＦＬＡＧタグ付きＡＳＳ１を検出した（図３Ａ、下パネル）。細胞溶解物中のすべてのタンパク質の発現を、図３Ｂに示すように、抗ＦＬＡＧおよび抗ＨＡ Ａｂ（シグマまたはロシュ、それぞれ）を用いる発現溶解物のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を介して調査した。
【0116】
実施例４：ＡＳＳ１のＣＲＢＮへのリガンド誘導リクルートメントは、生細胞におけるＡＳＳ１の分解と関連している。
この研究において、我々は、ＡＳＳ１のＣＲＢＮへのＣＣ－２２０ ＣＲＢＮリガンド誘導リクルートメントが、その後のＡＳＳ１分解（ＣＲＢＮ Ｅ３リガーゼとの相互反応により誘発される）をもたらすことができるかどうかを調べた。この分析のため、細胞をＦＬＡＧタグ付きＡＳＳ１およびＨＡタグ付きＣＲＢＮコードコンストラクトでトランスフェクトし、指定された時間のＣＣ２２０との細胞のインキュベーションに応答したＡＳＳ１の定常状態レベルにおける任意の変化を、ウェスタンブロット分析により評価した。研究により、ＡＳＳ１のＡＳＳ１定常状態レベルがＣＣ２２０に応答して用量応答的様式で確かに減少し、ＡＳＳ１のＣＲＢＮへのリガンド誘導リクルートメントがＡＳＳ１タンパク質分解を誘発することを確認することが示される。簡潔に、ＦＬＡＧ－ＡＳＳ１およびＨＡ－ＣＲＢＮをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を未処理のまま放置するか、異なる用量（０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭまたは３０μＭ）のＣＣ－２２０でさらに２４時間処理した。次に、細胞を溶解し、溶解物の画分を、抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ）を用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を介して分析した。ローディング対照として、抗アクチン抗体（シグマ）を用いてウェスタンブロット分析を実行した。
この研究において、我々は、ＡＳＳ１のＣＲＢＮへのＣＣ－２２０ ＣＲＢＮリガンド誘導リクルートメントが、その後のＡＳＳ１分解（ＣＲＢＮ Ｅ３リガーゼとの相互反応により誘発される）をもたらすことができるかどうかを調べた。この分析のため、細胞をＦＬＡＧタグ付きＡＳＳ１およびＨＡタグ付きＣＲＢＮコードコンストラクトでトランスフェクトし、指定された時間のＣＣ２２０との細胞のインキュベーションに応答したＡＳＳ１の定常状態レベルにおける任意の変化を、ウェスタンブロット分析により評価した。研究により、ＡＳＳ１のＡＳＳ１定常状態レベルがＣＣ２２０に応答して用量応答的様式で確かに減少し、ＡＳＳ１のＣＲＢＮへのリガンド誘導リクルートメントがＡＳＳ１タンパク質分解を誘発することを確認することが示される。簡潔に、ＦＬＡＧ－ＡＳＳ１およびＨＡ－ＣＲＢＮをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を未処理のまま放置するか、異なる用量（０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭまたは３０μＭ）のＣＣ－２２０でさらに２４時間処理した。次に、細胞を溶解し、溶解物の画分を、抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ）を用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を介して分析した。ローディング対照として、抗アクチン抗体（シグマ）を用いてウェスタンブロット分析を実行した。
【0117】
実施例５：ＣＲＢＮに結合するが、レナリドミド／ＬＥＮおよびＣＣ２２０、または他のＣＲＢＮリガンドなどの既知のＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンドと比較してＣＲＢＮネオ基質ＡＳＳ１を効果的にリクルートしない化合物の発見および特徴づけ
この研究において、我々は、ＣＲＢＮに結合する一連の化合物、およびＡＳＳ１ネオ基質を差次的にリクルートするそれらの能力について比較研究を実行した。我々は、レナリドミドおよびＣＣ２２０などの既知のＩＭｉＤ（実施例１～４を参照されたい）がすべて、ＡＳＳ１のＣＲＢＮへのリクルートメントを誘導すること、ならびにこれが細胞におけるＡＳＳ１の分解と関連していること（実施例４）を我々の研究で認めた。ＡＳＳ１が重要な細胞タンパク質であり、その発現の喪失が、免疫系のＴ細胞などの細胞代謝および生存における欠陥に関連していることが示されていることを考慮すると、我々は、ＣＲＢＮを結合するが、ＡＳＳ１をリクルートしない化合物を同定および特徴づけることが可能であったかどうかについて疑問を提示した。要約すると、この研究は、我々がレナリドミドのＣＲＢＮへの結合について競合するＣＲＢＮバインダが細胞内で強力な（レナリドミドと同等またはさらに強力な）ＣＲＢＮのバインダであるが、レナリドミドとは対照的にＡＳＳ１のリクルートメントを誘導しないことを確かに発見することができたことを示す。これは、ＡＳＳ１リクルートメントの傾向性を回避するＣＲＢＮリガンドの開発における差次的なスクリーニングおよび特徴づけの機会を強調する。研究の詳細を図５Ａ～図５Ｌに示し、その中で、我々は、ａ）細胞内でのＣＲＢＮへの結合、ｂ）ＡＳＳ１またはＩＫＺＦ１のＣＲＢＮへのリクルートメントの誘導における化合物の潜在力を認定する。
この研究において、我々は、ＣＲＢＮに結合する一連の化合物、およびＡＳＳ１ネオ基質を差次的にリクルートするそれらの能力について比較研究を実行した。我々は、レナリドミドおよびＣＣ２２０などの既知のＩＭｉＤ（実施例１～４を参照されたい）がすべて、ＡＳＳ１のＣＲＢＮへのリクルートメントを誘導すること、ならびにこれが細胞におけるＡＳＳ１の分解と関連していること（実施例４）を我々の研究で認めた。ＡＳＳ１が重要な細胞タンパク質であり、その発現の喪失が、免疫系のＴ細胞などの細胞代謝および生存における欠陥に関連していることが示されていることを考慮すると、我々は、ＣＲＢＮを結合するが、ＡＳＳ１をリクルートしない化合物を同定および特徴づけることが可能であったかどうかについて疑問を提示した。要約すると、この研究は、我々がレナリドミドのＣＲＢＮへの結合について競合するＣＲＢＮバインダが細胞内で強力な（レナリドミドと同等またはさらに強力な）ＣＲＢＮのバインダであるが、レナリドミドとは対照的にＡＳＳ１のリクルートメントを誘導しないことを確かに発見することができたことを示す。これは、ＡＳＳ１リクルートメントの傾向性を回避するＣＲＢＮリガンドの開発における差次的なスクリーニングおよび特徴づけの機会を強調する。研究の詳細を図５Ａ～図５Ｌに示し、その中で、我々は、ａ）細胞内でのＣＲＢＮへの結合、ｂ）ＡＳＳ１またはＩＫＺＦ１のＣＲＢＮへのリクルートメントの誘導における化合物の潜在力を認定する。
【0118】
ＣＲＢＮ結合は、実施例１に記載のＭＡＰＰＩＴ様アッセイを用いて－細胞内でのＣＲＢＮへの結合についてレナリドミドハイブリッドリガンドと競合する試験化合物の能力を決定することにより評価された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養し、３７℃、８％ＣＯ２でインキュベートした。突然変異したレプチン受容体の細胞質ドメインのテールに融合した大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするプラスミド（ｐＣＬＧ－ｅＤＨＦＲ）、ｇｐ１３０細胞質ドメインに融合したＣＲＢＮ ｐｒｅｙをコードするプラスミド（ｐＭＧ１－ＣＲＢＮ）またはＤＨＦＲ融合タンパク質のレプチン受容体と直接相互作用することができるＲＥＭ対照ｐｒｅｙをコードするプラスミド（ｐＭＧ１－ＲＥＭ２）、ならびにＳＴＡＴ３反応性ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータプラスミドで、記載されるように（Ｌｉｅｖｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．「Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ：ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２（２００９）：８７７－８８６）標準トランスフェクション法を使用して、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をレプチンで処理してレプチン受容体融合タンパク質を活性化し、示された用量の試験化合物がない、または含む状態で、３００ｎＭトリメトプリム－レナリドミド融合化合物（ハイブリッドリガンド、トリメトプリムは、ＤＨＦＲと相互作用し、レナリドミドはＣＲＢＮと相互作用する）を添加した。ＤＨＦＲ－トリメトプリム－レナリドミド－ＣＲＢＮを含む三元複合体の形成により誘導されるルシフェラーゼ活性およびその結果として生じるＳＴＡＴ３シグナル伝達の活性化を、Ｅｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（パーキンエルマーライフサイエンス、ウォルサム、ＭＡ）を用いるルシフェラーゼアッセイシステムキット（プロメガ、マジソン、ＷＩ）を使用して化合物処理の２４時間後に測定した。図５Ａ～図５Ｃのデータポイントは、レプチン（ＣＴＲＬ）またはレプチン＋ハイブリッドリガンド（ＣＲＢＮ）のみで処理された試料と比べて、ＲＥＭ２対照（ＣＴＲＬ）のためのレプチン＋試験化合物で処理された細胞またはレプチン＋ハイブリッドリガンド＋試験化合物（ＣＲＢＮ）で処理された細胞に由来する３連の試料の平均ルシフェラーゼ活性を表す（両方の場合について、添加された試験化合物がない状態で得られたシグナルをｙ軸でのルシフェラーゼ活性の１００％に設定する）。エラーバーは、標準偏差を表す。ＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウェアにおける４パラメータ非線形回帰を使用して曲線をフィットさせた。図５Ａ～図５Ｃに示すように、レナリドミドおよびＣＣ２２０などの既知のＩＭｉＤ化合物は、用量依存的様式でハイブリッドリガンド誘導ルシフェラーゼレポータ活性化を特異的に阻害する。これは、ＣＲＢＮへの結合についての効果的な競合およびＣＲＢＮへのハイブリッドリガンドの結合の防止（したがって、アッセイシグナルの阻害）を反映する。
【0119】
図５Ｄ～図５Ｇおよび図５Ｈ～図５Ｌは、図５Ａ～図５Ｃにおいて特徴づけられた任意の試験化合物が、細胞内でＣＲＢＮに効果的に結合するか、分子糊として作用するか、およびＡＳＳ１またはＩＫＺＦのＣＲＢＮへのリクルートメントを誘導するかの疑問に対処する。この分析のため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養し、３７℃、８％ＣＯ２でインキュベートした。それ自体がエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体の細胞外ドメインに融合しているレプチン受容体の細胞質ドメインに融合したＣＲＢＮベイトをコードするプラスミド（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）で細胞をトランスフェクトした。細胞外ＥＰＯ受容体ドメインは、受容体／受容体関連ＪＡＫ２活性化（それぞれＥＰＯまたはレプチンを用いる）を促進するために、（図５Ａ～図５Ｃにおいて使用されるように）細胞外レプチン受容体ドメインと交換可能に使用することができる。加えて、ｇｐ１３０細胞質ドメインに融合したＩＫＺＦ１（アイソフォーム７）をコードするプラスミド（ｐＭＧ１－ＩＫＺＦ１（ｉｓｏ７））またはｇｐ１３０の細胞質ドメインに融合したＡＳＳ１をコードするプラスミド（ｐＭＧ１－ＡＳＳ１）、およびＳＴＡＴ３反応性ルシフェラーゼコードレポータプラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータプラスミド）で、記載されるように（Ｌｉｅｖｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．「Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ：ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２（２００９）：８７７－８８６）細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、示された用量の試験化合物がない、または含む状態で、細胞をエリスロポエチン（ＥＰＯ）で処理した。ルシフェラーゼ活性を、Ｅｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（パーキンエルマーライフサイエンス、ウォルサム、ＭＡ）を用いるルシフェラーゼアッセイシステムキット（プロメガ、マジソン、ＷＩ）を使用して化合物処理の２４時間後に測定した。データポイントは、ＥＰＯ＋試験化合物処理細胞対ＥＰＯのみの処理細胞からの３連の試料の平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。ＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウェアにおける４パラメータ非線形回帰を使用して曲線をフィットさせた。図５Ｄ～図５Ｇおよび図５Ｈ～図５Ｌの両方に示すように、我々は、ＣＲＢＮに効果的に結合するにもかかわらず、レナリドミドおよびＣＣ２２０を含む既知のＩＭｉＤと比較してＡＳＳ１のリクルートメントを誘導しなかった化合物を同定することができた。
【0120】
表１は、図５Ａ～図５Ｌの結果を要約する。図５Ａ～図５Ｃ（用量応答曲線）における競合分析に由来するＩＣ５０として計算されたＣＲＢＮに結合する化合物の効力／有効性が示される。また、ＩＫＺＦ１またはＡＳＳ１リクルートメント試験の場合のいずれかの任意の用量で達成された最大ルシフェラーゼレポータ誘導も示される。ＬＥＮと同程度に強力なＣＲＢＮバインダである化合物「ｖ」および「ｖｉ」は、ＡＳＳ１（またはＩＫＺＦ１）標的を３０マイクロモル濃度の高濃度でリクルートしない。示されるように、リクルートメントの異なるパターンを観察することができ、ＡＳＳ１リクルートメントの不足は、ダイヤルアウトされた標的リクルートメントの傾向性（すなわち、ＡＳＳ１リクルートメント）を有する化合物の進化のための競合分析において選択的に監視された。
【0121】
【表1】
【0122】
実施例６：ＤＤＢ１ ＭＡＰＰＩＴ受容体融合コンストラクトを使用する化合物誘導ＣＲＢＮ－ＡＳＳ１相互作用の検出
未融合バージョンのＣＲＢＮベイトを使用する化合物誘導ＣＲＢＮ－基質相互作用を試験することが有利な場合があるので、我々は、ＤＤＢ１をＣＲＢＮよりもＭＡＰＰＩＴキメラ受容体コンストラクトに融合するＭＡＰＰＩＴ派生アッセイを開発した。ＤＤＢ１は、ＣＲＢＮをコアＥ３ユビキチンリガーゼ複合体足場サブユニットＣＵＬ４ＡまたはＣＵＬ４Ｂ（カリン４Ａまたはカリン４Ｂ）に接続するアダプタータンパク質である。ＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴ受容体融合体に係留したＤＤＢ１をコードするプラスミド（ｐＳＥＬ－ＤＤＢ１）、部分ｇｐ１３０ドメインに融合したＣＲＢＮ基質タンパク質（ＩＫＺＦ１アイソフォーム７またはＡＳＳ１）をコードするプラスミドおよびＳＴＡＴ３反応性ルシフェラーゼコードレポータプラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータプラスミド）で、記載されるように（Ｌｉｅｖｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．「Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ：ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２（２００９）：８７７－８８６）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。加えて、細胞はまた、異なる量の未融合ＣＲＢＮ発現コンストラクトで同時トランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、示された用量のレナリドミド（ＬＥＮ）がない、または含む状態で、細胞をＥＰＯで処理した。ルシフェラーゼ活性を、Ｅｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（パーキンエルマーライフサイエンス、ウォルサム、ＭＡ）を用いるルシフェラーゼアッセイシステムキット（プロメガ、マジソン、ＷＩ）を使用して化合物処理の２４時間後に測定した。データポイントは、ＥＰＯ＋試験化合物処理細胞対ＥＰＯのみの処理細胞からの３連の試料の平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。図６に示すように、強力なレナリドミド依存性ＭＡＰＰＩＴシグナルは、ＩＫＺＦ１およびＡＳＳ１の相互作用の両方で得られるが、同時発現させた未融合ＣＲＢＮの存在下でのみ、シグナルが基質ｇｐ１３０融合タンパク質のＣＲＢＮへの結合により媒介されることを示す。
未融合バージョンのＣＲＢＮベイトを使用する化合物誘導ＣＲＢＮ－基質相互作用を試験することが有利な場合があるので、我々は、ＤＤＢ１をＣＲＢＮよりもＭＡＰＰＩＴキメラ受容体コンストラクトに融合するＭＡＰＰＩＴ派生アッセイを開発した。ＤＤＢ１は、ＣＲＢＮをコアＥ３ユビキチンリガーゼ複合体足場サブユニットＣＵＬ４ＡまたはＣＵＬ４Ｂ（カリン４Ａまたはカリン４Ｂ）に接続するアダプタータンパク質である。ＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴ受容体融合体に係留したＤＤＢ１をコードするプラスミド（ｐＳＥＬ－ＤＤＢ１）、部分ｇｐ１３０ドメインに融合したＣＲＢＮ基質タンパク質（ＩＫＺＦ１アイソフォーム７またはＡＳＳ１）をコードするプラスミドおよびＳＴＡＴ３反応性ルシフェラーゼコードレポータプラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータプラスミド）で、記載されるように（Ｌｉｅｖｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．「Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ：ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２（２００９）：８７７－８８６）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。加えて、細胞はまた、異なる量の未融合ＣＲＢＮ発現コンストラクトで同時トランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、示された用量のレナリドミド（ＬＥＮ）がない、または含む状態で、細胞をＥＰＯで処理した。ルシフェラーゼ活性を、Ｅｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（パーキンエルマーライフサイエンス、ウォルサム、ＭＡ）を用いるルシフェラーゼアッセイシステムキット（プロメガ、マジソン、ＷＩ）を使用して化合物処理の２４時間後に測定した。データポイントは、ＥＰＯ＋試験化合物処理細胞対ＥＰＯのみの処理細胞からの３連の試料の平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。図６に示すように、強力なレナリドミド依存性ＭＡＰＰＩＴシグナルは、ＩＫＺＦ１およびＡＳＳ１の相互作用の両方で得られるが、同時発現させた未融合ＣＲＢＮの存在下でのみ、シグナルが基質ｇｐ１３０融合タンパク質のＣＲＢＮへの結合により媒介されることを示す。
【0123】
等価物
本発明がその特定の実施形態に関連して説明されているが、さらなる修正が可能であり、本出願が、一般に、本発明の原理に従い、本発明が関係する当技術分野の中で既知であるか慣習的な実行の範囲内にあるような本開示からのそのような逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、または適合をカバーすることを意図しており、添付の特許請求の範囲に記載され、その範囲において、前述された本質的な特徴に適用することができることが理解されるであろう。
本発明がその特定の実施形態に関連して説明されているが、さらなる修正が可能であり、本出願が、一般に、本発明の原理に従い、本発明が関係する当技術分野の中で既知であるか慣習的な実行の範囲内にあるような本開示からのそのような逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、または適合をカバーすることを意図しており、添付の特許請求の範囲に記載され、その範囲において、前述された本質的な特徴に適用することができることが理解されるであろう。
【0124】
当業者は、日常的な実験だけを使用して、本明細書に具体的に記載された特定の実施形態に対して多数の等価物を認識する、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図している。
【0125】
参照による組み込み
本明細書に参照されたすべての特許および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に参照されたすべての特許および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0126】
本明細書で議論された刊行物は、本出願の出願日の前にそれらの開示のためだけに提供されている。本明細書のいかなるものも、本発明が先行発明の理由によりそのような刊行物に先行する権利を与えないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【0127】
本明細書で使用されるように、すべての見出しは、単に組織化のためであり、いかなる方法でも本開示を制限することを意図するものではない。あらゆる個々のセクションの内容は、すべてのセクションに等しく適用可能である可能性がある。
【図1】
【図2】
【図3A-B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図5I】
【図5J】
【図5K】
【図5L】
【図6】
【国際調査報告】