特表 2023-507243 シナプス形成を決定するための方法およびシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-22

(54)【発明の名称】シナプス形成を決定するための方法およびシステム

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/50 20060101AFI20230215BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230215BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20230215BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230215BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20230215BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230215BHJP

   C07K 14/82 20060101ALI20230215BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20230215BHJP

【ＦＩ】

G01N33/50 Z

G01N33/53 D

G01N33/574 A

C07K16/46

C07K14/725

C12N5/10

C07K14/82

C12Q1/06

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021519543

(86)(22)【出願日】2019-10-11

(85)【翻訳文提出日】2021-06-04

(86)【国際出願番号】 US2019055949

(87)【国際公開番号】W WO2020077271

(87)【国際公開日】2020-04-16

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】カメン， リン

(72)【発明者】

【氏名】ベンダー， ブレンダン

(72)【発明者】

【氏名】チェン， シャン－チョン

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA24

2G045AA40

2G045CB01

2G045DA36

4B063QA20

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ13

4B063QR48

4B063QS32

4B063QS33

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045CA41

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA50

(57)【要約】

本開示の主題は、シナプス形成、例えば、Ｔ細胞依存性二重特異性抗体などの多重特異性抗体の活性に関連するシナプス形成を決定するための方法および組成物に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞シナプス形成を検出する方法であって、
（ａ）第１の抗原および第２の抗原に結合可能な多重特異性抗体を、前記第１の抗原を発現する第１の細胞および前記第２の抗原を発現する第２の細胞に接触させることであって、前記多重特異性抗体が前記第１の抗原および前記第２の抗原に結合すると、細胞シナプスが、前記第１の細胞と前記第２の細胞との間に形成される、ことと、
（ｂ）前記第１の細胞の活性化を測定することであって、前記第１の細胞の活性化が、細胞シナプス形成を示す、ことと、を含む、方法。

【請求項2】

細胞シナプス形成を誘導可能な多重特異性抗体の活性を決定する方法であって、
（ａ）第１の抗原および第２の抗原に結合する多重特異性抗体を、前記第１の抗原を発現する第１の細胞および前記第２の抗原を発現する第２の細胞に接触させることであって、前記多重特異性抗体が前記第１の抗原および前記第２の抗原に結合すると、細胞シナプスが、前記第１の細胞と前記第２の細胞との間に形成される、ことと、
（ｂ）前記細胞シナプスによる前記第１の細胞の活性化を測定することであって、前記第１の細胞の検出可能な活性化が、前記多重特異性抗体が細胞シナプス形成を誘導可能であることを示す、ことと、を含む、方法。

【請求項3】

前記第１の細胞の活性化を測定することが、活性化を示す少なくとも１つのバイオマーカーを測定することを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記少なくとも１つのバイオマーカーが、細胞表面分子である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記少なくとも１つのバイオマーカーが、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記少なくとも１つのバイオマーカーが、ＣＤ６２Ｌの発現である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の抗原が、ＣＤ３である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記第１の細胞が、Ｔ細胞またはＴ細胞に由来する細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記第１の細胞が、活性化時に細胞溶解的に不全である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の細胞が、Ｊｕｒｋａｔ細胞である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記第２の抗原が、腫瘍抗原である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記腫瘍抗原が、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、ＴｅｎＢ２、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記第２の細胞が、Ｂ細胞である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記腫瘍抗原が、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記第１の細胞の活性化を測定することが、前記第１の細胞の前記活性化時に誘導されるレポーターを検出することを含む、請求項１、２、および７～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記レポーターが、蛍光分子または発光分子である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第１の細胞の前記第２の細胞に対する比が、約１：１０～約５０：１である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記第１の細胞の前記第２の細胞に対する前記比が、約１：１０～約１０：１である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記第２の細胞上での前記第２の抗原の平均発現が、細胞１個当たり少なくとも約１，０００分子である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記第２の細胞上での前記第２の抗原の前記平均発現が、細胞１個当たり少なくとも約１０，０００分子である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記第１の細胞と前記第２の細胞との間の平均距離が、約０．３ｍｍ以下である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記第１の細胞と前記第２の細胞との間の前記平均距離が、約０．１ｍｍ以下である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

第１の抗原および第２の抗原に結合する多重特異性抗体の細胞シナプス形成を決定するためのキットであって、
（ａ）前記第１の抗原を発現する第１の細胞と、
（ｂ）前記第２の抗原を発現する第２の細胞と、
（ｃ）前記第１の細胞の活性化を測定するための手段と、を含む、キット。

【請求項25】

二重特異性抗体が前記第１の抗原および前記第２の抗原に結合すると、細胞シナプスが、前記第１の細胞と前記第２の細胞との間に形成される、請求項２４に記載のキット。

【請求項26】

前記細胞シナプス形成が、前記第１の細胞を活性化する、請求項２５に記載のキット。

【請求項27】

前記第１の細胞の活性化を測定するための前記手段が、活性化を示す少なくとも１つのバイオマーカーを測定することを含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項28】

前記少なくとも１つのバイオマーカーが、細胞表面分子である、請求項２７に記載のキット。

【請求項29】

前記少なくとも１つのバイオマーカーが、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、およびそれらの組み合わせの発現からなる群から選択される、請求項２８に記載のキット。

【請求項30】

前記少なくとも１つのバイオマーカーが、ＣＤ６２Ｌの発現を含む、請求項２９に記載のキット。

【請求項31】

前記第１の抗原が、ＣＤ３である、請求項２４～２９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項32】

前記第１の細胞が、Ｔ細胞またはＴ細胞に由来する細胞である、請求項２４～２９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項33】

前記第１の細胞が、活性化時に細胞溶解的に不全である、請求項３２に記載のキット。

【請求項34】

前記第１の細胞が、Ｊｕｒｋａｔ細胞である、請求項３３に記載のキット。

【請求項35】

前記第２の抗原が、腫瘍抗原である、請求項２３～３３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項36】

前記腫瘍抗原が、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、ＴｅｎＢ２、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される、請求項３５に記載のキット。

【請求項37】

前記第２の細胞が、Ｂ細胞である、請求項２４～３６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項38】

前記腫瘍抗原が、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される、請求項３７に記載のキット。

【請求項39】

前記第１の細胞の活性化を測定するための前記手段が、前記第１の細胞内のレポーター遺伝子を含み、前記レポーター遺伝子の発現が、前記第１の細胞の前記活性化時に誘導される、請求項２４～２６および３１～３８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項40】

前記レポーター遺伝子が、蛍光分子または発光分子を発現する、請求項３９に記載のキット。

【請求項41】

前記第１の細胞の前記第２の細胞に対する比が、約１：１０～約５０：１である、請求項２４～４０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項42】

前記第１の細胞の前記第２の細胞に対する前記比が、約１：１０～約１０：１である、請求項４１に記載のキット。

【請求項43】

前記第２の細胞上での前記第２の抗原の平均発現が、細胞１個当たり少なくとも約１，０００分子である、請求項２４～４２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項44】

前記第２の細胞上での前記第２の抗原の前記平均発現が、細胞１個当たり少なくとも約１０，０００分子である、請求項４３に記載のキット。

【請求項45】

前記第１の細胞と前記第２の細胞との間の平均距離が、約０．３ｍｍ以下である、請求項２４～４４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項46】

前記第１の細胞と前記第２の細胞との間の前記平均距離が、約０．１ｍｍ以下である、請求項４５に記載のキット。

【請求項47】

前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項２４～４６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項48】

第１の抗原および第２の抗原に結合する多重特異性抗体の細胞シナプス形成を決定するためのシステムであって、
（ａ）前記第１の抗原を発現する第１の細胞と、
（ｂ）前記第２の抗原を発現する第２の細胞と、
（ｃ）前記第１の細胞の活性化を測定するための手段と、を含む、システム。

【請求項49】

前記多重特異性抗体が前記第１の抗原および前記第２の抗原に結合すると、細胞シナプスが、前記第１の細胞と前記第２の細胞との間に形成される、請求項４８に記載のシステム。

【請求項50】

前記細胞シナプス形成が、前記第１の細胞を活性化する、請求項４９に記載のシステム。

【請求項51】

前記第１の細胞の活性化を測定するための前記手段が、活性化を示す少なくとも１つのバイオマーカーを含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項52】

前記少なくとも１つのバイオマーカーが、細胞表面分子である、請求項５１に記載のシステム。

【請求項53】

前記少なくとも１つのバイオマーカーが、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、およびそれらの組み合わせの発現からなる群から選択される、請求項５２に記載のシステム。

【請求項54】

前記少なくとも１つのバイオマーカーが、ＣＤ６２Ｌの発現を含む、請求項５３に記載のシステム。

【請求項55】

前記第１の抗原が、ＣＤ３である、請求項４８～５４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項56】

前記第１の細胞が、Ｔ細胞またはＴ細胞に由来する細胞である、請求項４８～５５のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項57】

前記第１の細胞が、活性化時に細胞溶解的に不全である、請求項５６に記載のシステム。

【請求項58】

前記第１の細胞が、Ｊｕｒｋａｔ細胞である、請求項５７に記載のシステム。

【請求項59】

前記第２の抗原が、腫瘍抗原である、請求項４８～５８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項60】

前記腫瘍抗原が、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、ＴｅｎＢ２、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される、請求項５９に記載のシステム。

【請求項61】

前記第２の細胞が、Ｂ細胞である、請求項４８～６０のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項62】

前記腫瘍抗原が、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される、請求項６１に記載のシステム。

【請求項63】

前記第１の細胞の活性化を測定するための前記手段が、前記第１の細胞内のレポーター遺伝子を含み、前記レポーター遺伝子の発現が、前記第１の細胞の前記活性化時に誘導される、請求項４８～５０および６１～６２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項64】

前記レポーター遺伝子が、蛍光分子または発光分子を発現する、請求項６３に記載のシステム。

【請求項65】

前記第１の細胞の前記第２の細胞に対する比が、約１：１０～約５０：１である、請求項４８～６４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項66】

前記第１の細胞の前記第２の細胞に対する前記比が、約１：１０～約１０：１である、請求項６５に記載のシステム。

【請求項67】

前記第２の細胞上での前記第２の抗原の平均発現が、細胞１個当たり少なくとも約１，０００分子である、請求項４８～６６のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項68】

前記第２の細胞上での前記第２の抗原の前記平均発現が、細胞１個当たり少なくとも約１０，０００分子である、請求項６７に記載のシステム。

【請求項69】

前記第１の細胞と前記第２の細胞との間の平均距離が、約０．３ｍｍ以下である、請求項４８～６８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項70】

前記第１の細胞と前記第２の細胞との間の前記平均距離が、約０．１ｍｍ以下である、請求項６９に記載のシステム。

【請求項71】

前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項４８～７０のいずれか一項に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月９日に出願された米国特許仮出願第６２／７４３，１５３号に対する優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

【0002】

本開示の主題は、シナプス形成、例えば、Ｔ細胞依存性二重特異性抗体などの多重特異性抗体の活性に関連するシナプス形成を決定するための方法およびシステムに関する。

【背景技術】

【0003】

二重特異性抗体などの多重特異性抗体は、研究ツール、診断ツール、および治療法として重要である。これは、主に、そのような抗体が２つ以上の抗原または抗原上に存在する２つ以上のエピトープに高い特異性および親和性で結合するために選択することができるという事実に起因する。例えば、がん療法の場合、多重特異性抗体は、例えば、がん細胞上に存在する抗原に結合することによってがん細胞を標的化し、免疫細胞に免疫応答を引き起こすために使用することができる。加えて、多重特異性抗体は、ヘテロ二量体受容体用のリガンドとして使用することができ、ヘテロ二量体受容体は、多重特異性抗体が受容体に結合し、受容体の構成要素間の相互作用を促進するとき、通常、受容体の類似したリガンドによって活性化される。

【0004】

治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）または抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）を用いて腫瘍関連細胞表面抗原を標的化することは、悪性の血液腫瘍および固形腫瘍の治療に非常に効果的であることが示されてきた。これらの分子は、多くの場合、腫瘍細胞を殺傷するために以下の作用機序（ＭＯＡ）、すなわち、抗体依存性細胞介在細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、受容体遮断、もしくは複合化細胞傷害薬の内部移行および細胞内放出のうちの１つまたはそれらの組み合わせに依拠する。ＭＯＡにおける違いにもかかわらず、治療用分子の薬物動態特性の考慮と共に標的関与を最大化／最適化することは、用量／レジメン決定のための重要な要因であった。したがって、がんを治療するためにｍＡｂおよびＡＤＣを最大化／最適化するための方法およびシステムが必要とされている。

【0005】

Ｔ細胞依存性二重特異性分子（例えば、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）およびＴ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＢＤ））は、多重特異性抗体のサブセットとして、がんの治療のための新たに出現した有望な治療用分子の種類を代表する。ブリナツモマブ、ＣＤ３×ＣＤ１９ ＢｉＴＥは、珍しい型の急性リンパ芽球性白血病の治療に有効であることが証明され、最近、ＦＤＡによる迅速承認を受けている（Ｂａｒｇｏｕ，Ｒ．，Ｅ．Ｌｅｏ，ｅｔ ａｌ．（２００８）“Ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａ Ｔ ｃｅｌｌ－ｅｎｇａｇｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２１：９７４－９７７）。複数の新規Ｔ細胞依存性二重特異性物（bispecifics）はまた、臨床開発中であり、有望な前臨床結果を示している。したがって、治療使用のための新規多重特異性分子を開発かつスクリーニングするための方法およびシステムが必要とされている。複数の新規Ｔ細胞依存性二重特異性物はまた、臨床開発中であり、有望な前臨床結果を示している。（Ｂｕｄｄｅ，Ｌ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）“Ｍｏｓｕｎｅｔｕｚｕｍａｂ，ａ Ｆｕｌｌ－Ｌｅｎｇｔｈ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ２０／ＣＤ３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｄｉｓｐｌａｙｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｒｅｌａｐｓｅｄ／Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＮＨＬ）：Ｉｎｔｅｒｉｍ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ Ｐｈａｓｅ １ Ｓｔｕｄｙ“，Ｂｌｏｏｄ １３２：３９９）。

【発明の概要】

【0006】

本開示の主題は、シナプス形成を、例えば、多重特異性抗体（Ｔ細胞依存性二重特異性（ＴＤＢ）抗体など）をスクリーニングすることによって決定するための方法およびシステムを提供する。ある特定の実施形態では、方法は、細胞シナプス形成を誘導可能である多重特異性抗体、例えば、Ｔ細胞依存性二重特異性抗体のスクリーニングに関する。ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）第１の抗原および第２の抗原に結合する多重特異性抗体を、第１の抗原を発現する第１の細胞および第２の抗原を発現する第２の細胞に接触させることであって、多重特異性抗体が第１の抗原および第２の抗原に結合すると、細胞シナプスが、第１の細胞と第２の細胞との間に形成される、ことと、（ｂ）細胞シナプスによる第１の細胞の活性化を測定することと、を含み、第１の細胞の検出可能な活性化は、多重特異性抗体が細胞シナプス形成を誘導可能であることを示す。

【0007】

本開示の主題は、細胞シナプス形成を検出する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）第１の抗原および第２の抗原に結合する多重特異性抗体を、第１の抗原を発現する第１の細胞および第２の抗原を発現する第２の細胞に接触させることであって、多重特異性抗体が第１の抗原および第２の抗原に結合すると、細胞シナプスが、第１の細胞と第２の細胞との間に形成される、ことと、（ｂ）細胞シナプスによる第１の細胞の活性化を測定することであって、第１の細胞の検出可能な活性化は、細胞シナプス形成を示す、ことと、を含む。

【0008】

ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、第１の細胞の活性化を測定することは、活性化を示すバイオマーカーにおいて測定することを含む。ある特定の実施形態では、バイオマーカーは、細胞表面分子である。ある特定の実施形態では、バイオマーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ１５４、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、バイオマーカーは、ＣＤ６２Ｌの発現である。ある特定の実施形態では、第１の細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞に由来する細胞である。ある特定の実施形態では、第１の細胞は、活性化時に細胞溶解的に不全である。ある特定の実施形態では、第１の細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞である。ある特定の実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ３である。

【0009】

ある特定の実施形態では、第２の抗原は、腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、ＴｅｎＢ２、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、第２の細胞は、Ｂ細胞である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される。

【0010】

ある特定の実施形態では、第１の細胞の活性化を測定することは、第１の細胞の活性化時に誘導されるレポーターを検出することを含む。ある特定の実施形態では、レポーターは、蛍光分子または発光分子である。

【0011】

ある特定の実施形態では、第１の細胞の第２の細胞に対する比は、約１：１０～約５０：１である。ある特定の実施形態では、第１の細胞の第２の細胞に対する比は、約１：１０～約１０：１である。ある特定の実施形態では、第２の細胞上での第２の抗原の平均発現は、細胞１個当たり少なくとも約１，０００分子である。ある特定の実施形態では、第２の細胞上での第２の抗原の平均発現は、細胞１個当たり少なくとも約１００，０００分子である。ある特定の実施形態では、第１の細胞と第２の細胞との間の平均距離は、約０．３ｍｍ以下である。ある特定の実施形態では、第１の細胞と第２の細胞との間の平均距離は、約０．１ｍｍ以下である。

【0012】

本開示の主題はまた、細胞シナプス形成、例えば、第１の抗原および第２の抗原に結合する多重特異性抗体によって誘導される細胞シナプス形成を決定するためのキットであって、第１の抗原は、第１の細胞によって発現され、第２の抗原は、第２の細胞によって発現される、キット、に関する。ある特定の実施形態では、本開示のキットは、（ａ）第１の抗原を発現する第１の細胞と、（ｂ）第２の抗原を発現する第２の細胞と、（ｃ）第１の細胞の活性化を測定するための手段と、を含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体が第１の抗原および第２の抗原に結合すると、細胞シナプスは、第１の細胞と第２の細胞との間に形成される。ある特定の実施形態では、細胞シナプス形成は、第１の細胞を活性化する。

【0013】

本開示の主題は、細胞シナプス形成を決定するためのシステムをさらに提供し、システムは、（ａ）第１の抗原を発現する第１の細胞と、（ｂ）第２の抗原を発現する第２の細胞と、（ｃ）第１の細胞の活性化を測定するための手段と、を含む。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】Ｔ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ）のＢリンパ腫細胞およびＴ細胞に対する結合、ならびに細胞シナプスの形成を説明する、細胞シナプスモデルの構造を示す図である。

【図2A】Ｔ細胞活性化のバイオマーカーとしてのＣＤ６９およびＣＤ６２Ｌの使用を示す図である。

【図2B】Ｔ細胞活性化のバイオマーカーとしてのＣＤ６９およびＣＤ６２Ｌの使用を示す図である。図２Ａは、ＢＪＡＢ Ｂ細胞およびＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢと共にインキュベートした、ＣＤ６９およびＣＤ６２Ｌの発現について染色したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を示す。図２Ｂは、増加したＣＤ６９または減少したＣＤ６２Ｌを有するＴ細胞の割合を使用してＴＤＢ濃度に対するＴ細胞活性化％を計算した図である。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図3A】Ｔ細胞活性化の検出を示す図である。

【図3B】Ｔ細胞活性化の検出を示す図である。図３Ａは、２４時間の経時変化にわたる、ＢＪＡＢ Ｂ細胞およびＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢと共にインキュベートしたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を示す。ＣＤ６９増加またはＣ６２Ｌ減少で表示したように活性化の割合を計算し、プロットした。図３Ｂは、４時間の経時変化にわたる、ＢＪＡＢ Ｂ細胞およびＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢと共にインキュベートしたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の濃度滴定を示す。ＣＤ６２Ｌ発現の減少を使用してＴ細胞活性化の割合を計算した。Ｔ細胞活性化をＴＤＢ濃度に対してプロットした。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図4】ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の活性化の検出を示す図である。ヒトＰＭＢＣは、ＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢと共に４時間インキュベートした。Ｃ６２Ｌ減少によって測定されたＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の活性化の割合を計算し、プロットした。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図5】細胞シナプスの予測値および観測値を示す図である。黒円は、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比およびＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢ濃度における観測された細胞シナプスの割合（Ｔ細胞の総数に対して正規化されたＣＤ６２Ｌ Ｔ細胞活性化マーカーを有するＴ細胞の数）を表す。灰色円は、モデルで予測された細胞シナプスの割合を表す。

【図6】Ｂ細胞が抗原ＣＤ２０のより高い発現レベルを有した場合にＴ細胞がより活性化されやすいことを示す図である。Ｂ細胞Ｒは、ＣＤ２０であり、発現レベルは、試験サンプルにおいて細胞１個当たり１，２００、細胞１個当たり１，４００、または細胞１個当たり１２２，０００である。

【図7】１μＬ中の５００個のＴ細胞および５００個のＢ細胞のシミュレーションの図である。

【図8】Ｔ細胞とＢ細胞との間の細胞内距離のシミュレーションの図である。

【図9-1】異なるＢ細胞抗原発現（細胞１個当たり１，２００、細胞１個当たり１，４００、または細胞１個当たり１２２，０００）およびＴ細胞とＢ細胞との間の細胞内距離（距離（Ｄｘ）０．０４ｍｍ～０．３０ｍｍ）の条件におけるＴ細胞活性化を示す図である。

【図9-2】異なるＢ細胞抗原発現（細胞１個当たり１，２００、細胞１個当たり１，４００、または細胞１個当たり１２２，０００）およびＴ細胞とＢ細胞との間の細胞内距離（距離（Ｄｘ）０．０４ｍｍ～０．３０ｍｍ）の条件におけるＴ細胞活性化を示す図である。

【図9-3】異なるＢ細胞抗原発現（細胞１個当たり１，２００、細胞１個当たり１，４００、または細胞１個当たり１２２，０００）およびＴ細胞とＢ細胞との間の細胞内距離（距離（Ｄｘ）０．０４ｍｍ～０．３０ｍｍ）の条件におけるＴ細胞活性化を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

１．定義

【0016】

本明細書での用語「抗体」とは、最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体およびＴＤＢ抗体）、および抗体断片を含めた、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。

【0017】

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ分子である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）_２分子である。

【0018】

用語「全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」とは、本明細書では相互に交換可能に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。

【0019】

「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、これに３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。

【0020】

抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。抗体の５種類の主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、またはμと呼ばれる。

【0021】

「単離された」抗体または抗体断片は、その自然環境の構成成分から分離された抗体である。抗体または抗体断片は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリ電気泳動）、またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超または９９％超の純度まで精製することができる。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えばＦｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。

【0022】

用語「エピトープ」とは、本明細書で使用される場合、抗体に特異的に結合可能なタンパク質決定因子を指す。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面集団からなり、通常、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。立体構造エピトープおよび非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で、立体構造エピトープに対する結合が失われるが、非立体構造エピトープに対する結合は失われないことから区別される。

【0023】

「単離された」核酸とは、その自然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。

【0024】

用語「ベクター」とは、本明細書で使用される場合、連結している別の核酸を増殖することができる核酸分子を指す。本用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、およびベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。

【0025】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、同義で使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞としては、初代形質転換細胞、および継代の数にかかわらずそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一である可能性がある、または変異を含んでいる可能性がある。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるかまたは選択されるのと同じ機能または生物活性を有する突然変異体の後代は、本発明に含まれる。

【0026】

「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびにげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。

【0027】

本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」とは、当業者によって決定される特定の値の許容できる誤差範囲を意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での１実施当たり３つまたは３つよりも多くの標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、更により好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。

【0028】

本明細書で使用される場合、任意の濃度範囲、割合範囲、比率範囲、または整数範囲は、特に記載がない限り、列挙された範囲内のあらゆる整数、および適切な場合、それらの分数（整数の１０分の１および１００分の１など）の値を含むと理解すべきである。

【0029】

２．抗体

【0030】

本開示の主題は、本明細書に記載のスクリーニング方法によって評価することができる多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体およびＴＤＢ抗体を提供する。本開示の多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる結合特異性を有する。例えば、米国特許第５，９２２，８４５号および同５，８３７，２４３号；Ｚｅｉｌｄｅｒ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１２４６－１２５２；Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ（１９９９）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ９：４７－５４；Ｋｅｌｅｒ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４００８－４０１４を参照されたい。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、単一の抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに結合することができる、または抗原上で重複する少なくとも２つのエピトープに結合することができる、例えば、二重エピトープ性抗体を本開示により包含する。あるいは、ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に結合することができる。本開示の多重特異性抗体は、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体であり得る。

【0031】

ある特定の実施形態では、本明細書に開示された多重特異性抗体の少なくとも１つの抗原結合ドメインは、１つ以上の腫瘍抗原に結合する。任意の腫瘍抗原を本発明に開示された腫瘍関連実施形態において使用することができる。抗原は、例えば、ペプチドとしてまたはインタクトなタンパク質もしくはその部分として発現され得る。インタクトなタンパク質またはその部分は、天然または変異誘発されてもよい。腫瘍抗原の非限定的な例には、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、ＴｅｎＢ２、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂが挙げられる。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、Ｂ細胞性リンパ腫内に含まれる。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂである。

【0032】

ある特定の実施形態では、多重特異性抗体の少なくとも１つの抗原結合ドメインは、細胞上に発現された１つ以上のタンパク質に結合し、その結合は、細胞を活性化する。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞に由来する細胞である。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、Ｔ細胞またはＴ細胞に由来する細胞の受容体に結合し、その結合は細胞を活性化することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する。

【0033】

ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、第１の抗原および第２の抗原に結合し、第１の抗原および第２の抗原に対する多重特異性抗体の結合は、細胞を活性化する。ある特定の実施形態では、第１の抗原は、腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ３であり、第２の抗原は、ＣＤ２０である。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２０１５／０９５３９２号に開示された二重特異性抗体である。

【0034】

ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体および／またはＴＤＢ抗体は、１つ以上の抗原結合ポリペプチドを含む。例えば、限定するものではないが、本開示の多重特異性抗体は、第１の抗原結合ポリペプチドおよび第２の抗原結合ポリペプチドを含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドおよび第２の抗原結合ポリペプチドは、異なる結合特異性を有する。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドは、第１の抗原に結合することができ、第２の抗原結合ポリペプチドは、第２の抗原に結合することができる。

【0035】

ある特定の実施形態では、例えば、本開示の多重特異性抗体が第１の抗原結合ポリペプチドおよび第２の抗原結合ポリペプチドを含む場合、第１の抗原結合ポリペプチドおよび第２の抗原結合ポリペプチドは、１つ以上のジスルフィド架橋により相互作用することができる。例えば、限定するものではないが、ある特定の実施形態では、第１および第２の抗原結合ポリペプチドのヒンジ領域は、１つ以上のジスルフィド架橋、例えば、２つのジスルフィド架橋により相互作用することができる。

【0036】

ある特定の実施形態では、多重特異性、例えば、二重特異性の抗体は、本明細書に開示されるように、抗体の抗原結合ポリペプチドのそれぞれの内部にヘテロ二量化ドメインを含む。ある特定の実施形態では、開示された多重特異性抗体の第１および第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインを変更して、第１および第２の抗原結合ポリペプチドのヘテロ二量化を促進することができる。例えば、限定するものではないが、第１の抗原結合ポリペプチドおよび／または第２の抗原結合ポリペプチドは、ノブインホール技術を使用する１つ以上のヘテロ二量化ドメイン（例えば、それらの全内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，７３１，１６８号および同８，２１６，８０５号を参照されたい）を含み、第１の抗原結合ポリペプチドと第２の抗原結合ポリペプチドとの間の会合および／または相互作用を促進することができる。

【0037】

ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含まない。あるいは、本明細書に開示された多重特異性抗体は、１つ以上のＣＬドメインを含むことができる。本開示の主題は、アンタゴニスト抗体およびアゴニスト抗体をさらに提供する。

【0038】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、および以下に説明する他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３））を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説には、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈuｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および同第５，５８７，４５８号も参照されたい。

【0039】

ダイアボディとは、二価または二重特異性であってもよい、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）においても説明されている。

【0040】

抗体断片の追加の非限定的な例には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、Ｆｖ断片、およびｓｃＦｖ断片が挙げられる。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む、抗体断片である。ある特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６（Ｂ１）号を参照されたい）である。

【0041】

サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）_２断片の議論には、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。

【0042】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供される多重特異性抗体および二重特異性抗体は、キメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来の可変領域）、およびヒト定常領域を含む。ある特定の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体であり得る。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

【0043】

ある特定の実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化することができる。ヒト化抗体は、超可変領域（ＨＶＲ）、例えば、ＣＤＲまたはその一部が非ヒト抗体に由来し、ＦＲまたはその一部がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含むことができる。任意選択で、ヒト化抗体はまた、ヒト定常領域の少なくとも一部を含むことができる。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元または改善するように、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。

【0044】

ヒト化抗体およびヒト化抗体を製造する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に概説され、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、および同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフト接合を記載する）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載する）；ならびに、Ｏｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：６１－６８（２００５）、およびＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド付き選択」手法を記載する）にさらに記載されている。

【0045】

ヒト化に使用されてもよいヒトフレームワーク領域には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。「ベストフィット」法を用いて選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）；軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）；およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）。

【0046】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供される多重特異性抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生され得る。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）で記載されている。

【0047】

抗原投与に対して応答するヒト可変領域を有するインタクトなヒト抗体またはインタクトな抗体を産生するために修飾してあるトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより、ヒト抗体を調製することができる。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有する。このようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説として、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号、Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術）を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。かかる動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに修飾することができる。

【0048】

ある特定の実施形態では、ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によっても製造することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫およびマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）にも記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）、およびＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載する）を含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）およびＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。

【0049】

ある特定の実施形態では、ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することができる。その後、かかる可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせられ得る。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技法が以下に記載されている。

【0050】

本開示の主題はまた、化学療法剤もしくは薬物、増殖阻害剤、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体などの１つ以上の細胞毒性薬にコンジュゲートされた、本明細書に記載された、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体を含む免疫複合体を提供する。例えば、開示された主題の抗体または抗原結合部分は、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣物などの１つ以上の他の結合分子に機能的に結合され得る（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合、または他の方法による）。

【0051】

３．抗体をスクリーニングするための方法およびシステム

【0052】

本開示の主題の多重特異性抗体は、本明細書に提供される方法およびシステムによって同定することができる、スクリーニングすることができる、またはそれらの物理的性質／化学的性質および／もしくは生物活性を特定することができる。

【0053】

Ｔ細胞依存性多重特異性抗体は、例えば、エフェクターＴ細胞を活性化することができ、その細胞溶解活性を標的腫瘍細胞に対して標的化する。Ｔ細胞依存性多重特異性抗体、例えば、ＴＤＢ抗体の作用機序は、細胞シナプスの形成に依存する。したがって、ある特定の実施形態では、そのような多重特異性抗体の選択は、細胞シナプス形成を誘導する抗体の能力を検出するシステムおよび／または方法に基づくことができる。

【0054】

ある特定の実施形態では、スクリーニング方法は、（ａ）第１の抗原および第２の抗原に結合する多重特異性抗体を、第１の抗原を発現する第１の細胞（例えば、エフェクター細胞）および第２の抗原を発現する第２の細胞（例えば、標的細胞）に接触させることであって、多重特異性抗体が第１の抗原および第２の抗原に結合すると、細胞シナプスが、第１の細胞と第２の細胞との間に形成される、ことと、（ｂ）細胞シナプスによる第１の細胞の活性化を測定することと、を含み、第１の細胞の検出可能な活性化は、多重特異性抗体が細胞シナプス形成を誘導可能であることを示す。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

【0055】

ある特定の実施形態では、第１の細胞（例えば、エフェクター細胞）は、Ｔ細胞またはＴ細胞に由来する細胞である。Ｔ細胞の非限定的な例には、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または幹様メモリーＴ細胞）、ならびに２種類のエフェクターメモリーＴ細胞、例えば、Ｔ_ＥＭ細胞およびＴ_ＥＭＲＡ細胞、制御Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞としても既知）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、およびγδＴ細胞が挙げられる。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬまたはキラーＴ細胞）は、感染体細胞または腫瘍細胞の死滅を誘導可能であるＴリンパ球のサブセットである。

【0056】

ある特定の実施形態では、第１の細胞は、活性化時に細胞溶解的に不全であるように遺伝子操作されている。そのような遺伝子操作の非限定的な例には、細胞溶解活性、例えば、パーフォリンおよびグランザイム、任意の抗腫瘍サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα）に関与する１つ以上の遺伝子および／またはこれらの遺伝子の発現に必要な１つ以上の遺伝子の欠失および破壊が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、第１の細胞は、不死化細胞である。ある特定の実施形態では、第１の細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞である。

【0057】

ある特定の実施形態では、第１の細胞は、第１の抗原を発現する。ある特定の実施形態では、第１の抗原に対する多重特異性抗体の結合は、第１の細胞を活性化可能である。ある特定の実施形態では、抗原は、受容体である。ある特定の実施形態では、抗原は、生体複合体である。例えば、限定するものではないが、受容体は、生体複合体内部、例えば、１つ以上の共受容体および／またはタンパク質との複合体内に存在する。ある特定の実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ３受容体の構成要素である。

【0058】

ある特定の実施形態では、第１の細胞の活性化を測定することは、活性化を示すバイオマーカーを測定することを含む。ある特定の実施形態では、バイオマーカーは、細胞表面分子であり、その量は、第１の細胞の活性化時に変化する。細胞表面分子の変化は、当該技術分野で既知の、または本明細書に開示された任意のアッセイによって決定することができる。例えば、限定するものではないが、細胞表面分子は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、またはフローサイトメトリー、例えば、細胞表面分子を標的とする抗体を用いる蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定することができる。ある特定の実施形態では、バイオマーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、バイオマーカーは、ＣＤ６２Ｌの発現である。

【0059】

ある特定の実施形態では、第２の細胞（例えば、標的細胞）は、腫瘍細胞または腫瘍抗原を発現する細胞である。ある特定の実施形態では、第２の抗原は、腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、ＴｅｎＢ２、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、第２の抗原は、第２の細胞に対して内在性である。ある特定の実施形態では、第２の細胞は、Ｂ細胞である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される。

【0060】

細胞の遺伝子改変（例えば、第１の細胞および／または第２の細胞の改変）は、実質的に均一な細胞組成に組換えＤＮＡ構築物を形質導入することによって達成することができる。ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクター（ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスのいずれか）は、細胞内へのＤＮＡ構築物の導入のために用いられる。例えば、抗原認識受容体をコードするポリヌクレオチドは、レトロウイルスベクターにクローン化することができ、発現は、レトロウイルスベクターの内因性プロモーターにより、レトロウイルス末端反復配列により、または対象の標的細胞型に特異的なプロモーターにより促進することができる。非ウイルス性ベクターも同様に使用することができる。

【0061】

ある特定の実施形態では、第１の細胞の活性化は、シグナル伝達経路が第１の細胞の活性化に関連するかどうかを分析することによって決定することができる。ある特定の実施形態では、第１の細胞の活性化を測定することは、第１の細胞の活性化時に誘導されるレポーターを検出することを含む。例えば、限定するものではないが、活性化は、インビトロレポーターベースのアッセイ、例えば、ルシフェラーゼアッセイを使用することによって決定することができ、第１の抗原、例えば、受容体の活性化は、レポーター、例えば、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰもしくはＲＦＰの発現をもたらす。ある特定の実施形態では、レポーターは、第１の細胞の活性化時に活性化されるプロモーターを含む構築物から発現される。プロモーターの非限定的な例には、ＣＤ６９プロモーターおよびＩＬ－２プロモーターが挙げられる。

【0062】

ある特定の実施形態では、細胞シナプスの形成および／または第１の細胞の活性化は、第１の細胞と第２の細胞との間の比によって影響を受ける。ある特定の実施形態では、第１の細胞の第２の細胞に対する比は、約１：１０００～約１０００：１、約１：５００～約５００：１、約１：２００～約２００：１、約１：１００～約１００：１、約１：５０～約５０：１、約１：４０～約４０：１、約１：３０～約３０：１、約１：２０～約２０：１、約１：１０～約１０：１、約１：５～約５：１、約１：４～約４：１、約１：３～約３：１、または約１：２～約２：１である。ある特定の実施形態では、第１の細胞の第２の細胞に対する比は、約１：１０～約５０：１である。ある特定の実施形態では、第１の細胞の第２の細胞に対する比は、約１：１０～約１０：１である。ある特定の実施形態では、第１の細胞の第２の細胞に対する比は、約１：１０００、約１：５００、約１：４００、約１：３００、約１：２００、約１：１００、約１：５０、約１：４０、約１：３０、約１：２０、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２０：１、約３０：１、約４０：１、約５０：１、約１００：１、約２００：１、約３００：１、約４００：１、約５００：１、または約１０００：１である。

【0063】

ある特定の実施形態では、細胞シナプスの形成および／または第１の細胞の活性化は、第２の細胞上の第２の抗原の発現によって影響を受ける。ある特定の実施形態では、第２の細胞上の第２の抗原の平均発現は、細胞１個当たり少なくとも約１０分子、細胞１個当たり少なくとも約１００分子、細胞１個当たり少なくとも約１，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約２，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約３，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約４，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約５，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約６，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約７，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約８，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約９，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約１０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約１５，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約２０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約３０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約４０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約５０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約６０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約７０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約８０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約９０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約１００，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約１１０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約１２０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約１３０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約１４０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約１５０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約１６０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約１７０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約１８０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約１９０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約２００，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約３００，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約４００，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約３０，０００分子、細胞１個当たり少なくとも約５００，０００分子、または細胞１個当たり少なくとも約１０００，０００分子である。ある特定の実施形態では、第２の細胞上の第２の抗原の平均発現は、細胞１個当たり約１０～約１００分子、細胞１個当たり約１００～約１，０００分子、細胞１個当たり約１００～約１０，０００分子、細胞１個当たり約１，０００～約１００，０００分子、細胞１個当たり約１，０００～約２００，０００分子、細胞１個当たり約１０００～約３００，００分子、細胞１個当たり約１０，０００～約１００，０００分子、細胞１個当たり約１０，０００～約２００，０００分子、または細胞１個当たり約１０，０００～約５００，０００分子である。

【0064】

ある特定の実施形態では、細胞シナプスの形成および／または第１の細胞の活性化は、第１の細胞と第２の細胞の密度または第１の細胞と第２の細胞との間の平均距離によって影響を受ける。

【0065】

細胞内距離は、当該技術分野で既知の任意の方法により決定することができる。例えば、第１の細胞と第２の細胞との間の距離を計算するための方法は、例えば、１μＬ（１ｍｍ^３）のサイズを有する立方体内部のランダムｘ，ｙ，ｚ座標を有する実験的細胞数をシミュレートするためにソフトウェアを使用することと、それぞれの細胞と近接する６個の細胞との間の平均距離を決定することと、最終平均距離値に到達するように全平均距離を決定することと、を含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の細胞と第２の細胞との間の平均距離は、約１０ｍｍ以下、約１ｍｍ以下、約０．９ｍｍ以下、約０．８ｍｍ以下、約０．７ｍｍ以下、約０．６ｍｍ以下、約０．５ｍｍ以下、約０．４ｍｍ以下、約０．３ｍｍ以下、約０．２ｍｍ以下、約０．１ｍｍ以下、約０．０９ｍｍ以下、約０．０８ｍｍ以下、約０．０７ｍｍ以下、約０．０６ｍｍ以下、約０．０５ｍｍ以下、約０．０４ｍｍ以下、約０．０３ｍｍ以下、約０．０２ｍｍ以下、約０．０１ｍｍ以下、約０．００５ｍｍ以下、約０．００１ｍｍ以下、約０．０００５ｍｍ以下、約０．０００１ｍｍ以下である。ある特定の実施形態では、第１の細胞と第２の細胞との間の平均距離は、約０．０００１ｍｍ～約１００ｍｍ、約０．００１ｍｍ～約１０ｍｍ、約０．００５ｍｍ～約５ｍｍ、約０．０１ｍｍ～約１ｍｍ、約０．０２ｍｍ～約１ｍｍ、約０．０３ｍｍ～約１ｍｍ、約０．０４ｍｍ～約１ｍｍ、約０．０５ｍｍ～約１ｍｍ、または約０．０１ｍｍ～約０．５ｍｍである。

【0066】

４．システムおよびキット。

【0067】

本開示の主題は、システムおよびキットにさらに関する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されたシステム／キットは、第１の抗原および第２の抗原に結合する多重特異性抗体の細胞シナプス形成を決定するために使用することができる。ある特定の実施形態では、システム／キットは、（ａ）第１の抗原を発現する第１の細胞と、（ｂ）第２の抗原を発現する第２の細胞と、（ｃ）第１の細胞の活性化を測定するための手段と、を含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体が第１の抗原および第２の抗原に結合すると、細胞シナプスは、第１の細胞と第２の細胞との間に形成される。ある特定の実施形態では、細胞シナプス形成は、第１の細胞を活性化する。

【0068】

ある特定の実施形態では、システム／キットは、容器、および容器についてのまたは容器に関連するラベルまたは添付文書を含んでもよい。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、組成物を単独で、または他の組成物との組み合わせで保持することができる。

【0069】

必要に応じて、システム／キットは、本明細書に開示された任意の方法のための指示書と共に提供することができる。指示書は、一般に、本方法を実施するための組成物の使用に関する情報を含むことができる。指示書は、（存在している場合）容器上に直接印刷されてもよい、または容器に貼付されたラベルであってもよい、または、容器内もしくは容器と共に供給される別個のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダであってもよい。

【0070】

以下の実施例は、本開示の主題の単なる例示であり、いかなる意味においても制限とみなすべきではない。

【0071】

５．例示的な非限定的実施形態。

【0072】

Ａ。細胞シナプス形成を検出する方法であって、第１の抗原および第２の抗原に結合可能な多重特異性抗体を、第１の抗原を発現する第１の細胞および第２の抗原を発現する第２の細胞に接触させることであって、多重特異性抗体が第１の抗原および第２の抗原に結合すると、細胞シナプスが、第１の細胞と第２の細胞との間に形成される、ことと、第１の細胞の活性化を測定することであって、第１の細胞の活性化は、細胞シナプス形成を示す、ことと、を含む、方法。

【0073】

Ａ１。 細胞シナプス形成を誘導可能である多重特異性抗体の活性を決定する方法であって、第１の抗原および第２の抗原に結合する多重特異性抗体を、第１の抗原を発現する第１の細胞および第２の抗原を発現する第２の細胞に接触させることであって、多重特異性抗体が第１の抗原および第２の抗原に結合すると、細胞シナプスが、第１の細胞と第２の細胞との間に形成される、ことと、細胞シナプスによる第１の細胞の活性化を測定することであって、第１の細胞の検出可能な活性化は、多重特異性抗体が細胞シナプス形成を誘導可能であることを示す、ことと、を含む、方法。

【0074】

Ａ２。第１の細胞の活性化を測定することは、活性化を示す少なくとも１つのバイオマーカーを測定することを含む、ＡまたはＡ１に記載の方法。

【0075】

Ａ３。少なくとも１つのバイオマーカーは、細胞表面分子である、Ａ２に記載の方法。

【0076】

Ａ４。少なくとも１つのバイオマーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、Ａ３に記載の方法。

【0077】

Ａ５。少なくとも１つのバイオマーカーは、ＣＤ６２Ｌの発現である、Ａ４に記載の方法。

【0078】

Ａ６。第１の抗原は、ＣＤ３である、Ａ～Ａ５のいずれか１つに記載の方法。

【0079】

Ａ７。第１の細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞に由来する細胞である、Ａ～Ａ６のいずれか１つに記載の方法。

【0080】

Ａ８。第１の細胞は、活性化時に細胞溶解的に不全である、Ａ７に記載の方法。

【0081】

Ａ９。第１の細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞である、Ａ８に記載の方法。

【0082】

Ａ１０。第２の抗原は、腫瘍抗原である、Ａ～Ａ９のいずれか１つに記載の方法。

【0083】

Ａ１１。腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、ＴｅｎＢ２、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される、Ａ１０に記載の方法。

【0084】

Ａ１２。第２の細胞は、Ｂ細胞である、Ａ～Ａ１１のいずれか１つに記載の方法。

【0085】

Ａ１３。腫瘍抗原は、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される、Ａ１２に記載の方法。

【0086】

Ａ１４。第１の細胞の活性化を測定することは、第１の細胞の活性化時に誘導されるレポーターを検出することを含む、Ａ、Ａ１、 、およびＡ６～Ａ１３のいずれか１つに記載の方法。

【0087】

Ａ１５。レポーターは、蛍光分子または発光分子である、Ａ１４に記載の方法。

【0088】

Ａ１６。第１の細胞の第２の細胞に対する比は、約１：１０～約５０：１である、Ａ～Ａ１５のいずれかに記載の方法。

【0089】

Ａ１７。第１の細胞の第２の細胞に対する比は、約１：１０～約１０：１である、Ａ１６に記載の方法。

【0090】

Ａ１８。第２の細胞上での第２の抗原の平均発現は、細胞１個当たり少なくとも約１，０００分子である、Ａ～Ａ１７のいずれか１つに記載の方法。

【0091】

Ａ１９。第２の細胞上での第２の抗原の平均発現は、細胞１個当たり少なくとも約１０，０００分子である、Ａ１８に記載の方法。

【0092】

Ａ２０。第１の細胞と第２の細胞との間の平均距離は、約０．３ｍｍ以下である、Ａ～Ａ１９のいずれか１つに記載の方法。

【0093】

Ａ２１。第１の細胞と第２の細胞との間の平均距離は、約０．１ｍｍ以下である、Ａ２０に記載の方法。

【0094】

Ａ２２。多重特異性抗体は、二重特異性抗体である、Ａ～Ａ２１のいずれか１つに記載の方法。

【0095】

Ｂ。第１の抗原および第２の抗原に結合する多重特異性抗体の細胞シナプス形成を決定するためのキットであって、第１の抗原を発現する第１の細胞と、第２の抗原を発現する第２の細胞と、第１の細胞の活性化を測定するための手段と、を含む、キット。

【0096】

Ｂ１。細胞シナプスは、二重特異性抗体が第１の抗原および第２の抗原に結合すると、第１の細胞と第２の細胞との間に形成される、Ｂに記載のキット。

【0097】

Ｂ２。細胞シナプス形成は、第１の細胞を活性化する、Ｂ１に記載のキット。

【0098】

Ｂ３。第１の細胞の活性化を測定するための手段は、活性化を示す少なくとも１つのバイオマーカーを測定することを含む、Ｂ～Ｂ２のいずれか１つに記載のキット。

【0099】

Ｂ４。少なくとも１つのバイオマーカーは、細胞表面分子である、Ｂ３に記載のキット。

【0100】

Ｂ５。少なくとも１つのバイオマーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、およびそれらの組み合わせの発現からなる群から選択される、Ｂ４に記載のキット。

【0101】

Ｂ６。少なくとも１つのバイオマーカーは、ＣＤ６２Ｌの発現を含む、Ｂ５に記載のキット。

【0102】

Ｂ７。第１の抗原は、ＣＤ３である、Ｂ～Ｂ５のいずれか１つに記載のキット。

【0103】

Ｂ８。第１の細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞に由来する細胞である、Ｂ～Ｂ５のいずれか１つに記載のキット。

【0104】

Ｂ９。第１の細胞は、活性化時に細胞溶解的に不全である、Ｂ８に記載のキット。

【0105】

Ｂ１０。第１の細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞である、Ｂ９に記載のキット。

【0106】

Ｂ１１。第２の抗原は、腫瘍抗原である、Ｂ～Ｂ９のいずれか１つに記載のキット。

【0107】

Ｂ１２。腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、ＴｅｎＢ２、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される、Ｂ１１に記載のキット。

【0108】

Ｂ１３。第２の細胞は、Ｂ細胞である、Ｂ～Ｂ１２のいずれか１つに記載のキット。

【0109】

Ｂ１４。腫瘍抗原は、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される、Ｂ１３に記載のキット。

【0110】

Ｂ１５。第１の細胞の活性化を測定するための手段は、第１の細胞内のレポーター遺伝子を含み、レポーター遺伝子の発現は、第１の細胞の活性化時に誘導される、Ｂ～Ｂ２およびＢ７～Ｂ１４のいずれか１つに記載のキット。

【0111】

Ｂ１６。レポーター遺伝子は、蛍光分子または発光分子を発現する、Ｂ１５に記載のキット。

【0112】

Ｂ１７。第１の細胞の第２の細胞に対する比は、約１：１０～約５０：１である、請求項Ｂ～Ｂ１６のいずれか１つに記載のキット。

【0113】

Ｂ１８。第１の細胞の第２の細胞に対する比は、約１：１０～約１０：１である、Ｂ１７に記載のキット。

【0114】

Ｂ１９。第２の細胞上での第２の抗原の平均発現は、細胞１個当たり少なくとも約１，０００分子である、Ｂ～Ｂ１８のいずれか１つに記載のキット。

【0115】

Ｂ２０。第２の細胞上での第２の抗原の平均発現は、細胞１個当たり少なくとも約１０，０００分子である、Ｂ１９に記載のキット。

【0116】

Ｂ２１。第１の細胞と第２の細胞との間の平均距離は、約０．３ｍｍ以下である、Ｂ～Ｂ２０のいずれか１つに記載のキット。

【0117】

Ｂ２２。第１の細胞と第２の細胞との間の平均距離は、約０．１ｍｍ以下である、Ｂ２１に記載のキット。

【0118】

Ｂ２３。多重特異性抗体は、二重特異性抗体である、Ｂ～Ｂ２２のいずれか１つに記載のキット。

【0119】

Ｃ。第１の抗原および第２の抗原に結合する多重特異性抗体の細胞シナプス形成を決定するためのシステムであって、第１の抗原を発現する第１の細胞と、第２の抗原を発現する第２の細胞と、第１の細胞の活性化を測定するための手段と、を含む、システム。

【0120】

Ｃ１。細胞シナプスは、多重特異性抗体が第１の抗原および第２の抗原に結合すると、第１の細胞と第２の細胞との間に形成される、Ｃに記載のシステム。

【0121】

Ｃ２。細胞シナプス形成は、第１の細胞を活性化する、Ｃ１に記載のシステム。

【0122】

Ｃ３。第１の細胞の活性化を測定するための手段は、活性化を示す少なくとも１つのバイオマーカーを含む、Ｃ～Ｃ２のいずれか１つに記載のシステム。

【0123】

Ｃ４。少なくとも１つのバイオマーカーは、細胞表面分子である、Ｃ３に記載のシステム。

【0124】

Ｃ５。少なくとも１つのバイオマーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、およびそれらの組み合わせの発現からなる群から選択される、Ｃ４に記載のシステム。

【0125】

Ｃ６。少なくとも１つのバイオマーカーは、ＣＤ６２Ｌの発現を含む、Ｃ５に記載のシステム。

【0126】

Ｃ７。第１の抗原は、ＣＤ３である、Ｃ～Ｃ６のいずれか１つに記載のシステム。

【0127】

Ｃ８。第１の細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞に由来する細胞である、Ｃ～Ｃ７のいずれか１つに記載のシステム。

【0128】

Ｃ９。第１の細胞は、活性化時に細胞溶解的に不全である、Ｃ８に記載のシステム。

【0129】

Ｃ１０。第１の細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞である、Ｃ９に記載のシステム。

【0130】

Ｃ１１。第２の抗原は、腫瘍抗原である、Ｃ～Ｃ１０のいずれか１つに記載のシステム。

【0131】

Ｃ１２。腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、ＴｅｎＢ２、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される、Ｃ１１に記載のシステム。

【0132】

Ｃ１３。第２の細胞は、Ｂ細胞である、Ｃ～Ｃ１２のいずれか１つに記載のシステム。

【0133】

Ｃ１４。腫瘍抗原は、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、およびＣＤ７９Ｂからなる群から選択される、Ｃ１３に記載のシステム。

【0134】

Ｃ１５。第１の細胞の活性化を測定するための手段は、第１の細胞内のレポーター遺伝子を含み、レポーター遺伝子の発現は、第１の細胞の活性化時に誘導される、Ｃ～Ｃ２およびＣ１３～Ｃ１４のいずれか１つに記載のシステム。

【0135】

Ｃ１６。レポーター遺伝子は、蛍光分子または発光分子を発現する、Ｃ１５に記載のシステム。

【0136】

Ｃ１７。第１の細胞の第２の細胞に対する比は、約１：１０～約５０：１である、Ｃ～Ｃ１６のいずれか１つに記載のシステム。

【0137】

Ｃ１８。第１の細胞の第２の細胞に対する比は、約１：１０～約１０：１である、Ｃ１７に記載のシステム。

【0138】

Ｃ１９。第２の細胞上での第２の抗原の平均発現は、細胞１個当たり少なくとも約１，０００分子である、Ｃ～Ｃ１８のいずれか１つに記載のシステム。

【0139】

Ｃ２０。第２の細胞上での第２の抗原の平均発現は、細胞１個当たり少なくとも約１０，０００分子である、Ｃ１９に記載のシステム。

【0140】

Ｃ２１。第１の細胞と第２の細胞との間の平均距離は、約０．３ｍｍ以下である、Ｃ～Ｃ２０のいずれか１つに記載のシステム。

【0141】

Ｃ２２。第１の細胞と第２の細胞との間の平均距離は、約０．１ｍｍ以下である、Ｃ２１に記載のシステム。

【0142】

Ｃ２３。多重特異性抗体は、二重特異性抗体である、Ｃ～Ｃ２２のいずれか１つに記載のシステム。

【実施例】

【0143】

以下は、本開示の方法および組成物の実施例である。先に与えた一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態を実施することができることが理解される。

【0144】

実施例１－Ｔ細胞依存性二重特異性分子による細胞シナプス形成のためのモデルおよびインビトロアッセイシステムの開発

【0145】

典型的な治療用ｍＡｂまたはＡＤＣのＭＯＡとは異なり、Ｔ細胞依存性二重特異性分子は、エフェクターＴ細胞を活性化し、それらの細胞溶解活性を標的腫瘍細胞に標的化することによって作用する（Ｓｔａｅｒｚ，Ｕ．Ｄ．，Ｏ．Ｋａｎａｇａｗａ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ．（１９８５）“Ｈｙｂｒｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｃａｎ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ａｔｔａｃｈ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．”Ｎａｔｕｒｅ ３１４：６２８－６３１）。二重特異性分子のＭＯＡは、腫瘍細胞およびＣＤ３発現Ｔ細胞の両方の同時会合に依存する（Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．，Ｃ．Ｒｅｉｈａｒｄｔ，ａｎｄ ＫｕｆｅｒＰ．（２００８）“ＢｉＴＥ：ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｒｕｉｔ Ｔ－ｃｅｌｌｓ．”Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ３３（２）：１３７－１４７）。両方の細胞の共会合は、細胞シナプスの形成をもたらし、次いで、細胞シナプスは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を通じたＴ細胞のポリクローナル活性化と、標的腫瘍細胞の溶解のためのパーフォリンおよびグランザイムの放出を誘導する（Ｂａｕｅｒｌｅ，２００８，Ｃｈｅｎ，２０１６）。いくつかの要因が細胞シナプスの形成に潜在的に影響を及ぼす場合があり、Ｔ細胞依存性二重特異性分子の濃度、標的腫瘍細胞の細胞密度、ＣＤ３発現Ｔ細胞の細胞密度、標的およびＣＤ３に対する結合親和性、ならびに標的およびＣＤ３の発現レベルが挙げられる。細胞シナプス形成における特有のＭＯＡおよび多重決定因子は、多様な要因の個別の効果を系統的に評価するために、統合的分析および機構モデルを使用して評価することができる。

【0146】

本実施例では、インビトロアッセイは、細胞シナプス形成用のサロゲートとしてＴ細胞活性化の初期マーカーを使用して確立された。インビトロアッセイに由来するデータは、細胞シナプス形成における多様な要因の効果を同時に評価するように、機序に基づくモデルを開発するために使用された。モデル化フレームワークは、Ｔ細胞依存性二重特異性分子、およびより一般的には他の多重特異性抗体の合理的設計および開発を導くことができる。

【0147】

材料および方法

【0148】

試薬：細胞および試験抗体

【0149】

ＢＪＡＢ、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、およびＳＵＤＨＬ－８を含むＢリンパ腫細胞株、ならびに急性リンパ性白血病に由来するヒトリンパ芽球細胞株であるＪｕｒｋａｔは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。これらの細胞株は、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）中、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充して維持された。

【0150】

抗ＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢは、ヒト化全長ＩｇＧ１ノブインホール二重特異性抗体（Ｓｐｅｉｓｓ，２０１３）である。全ての抗体は、遺伝子操作チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株からＧｅｎｅｎｔｈｅｃ，Ｉｎｃ．において作製された。

【0151】

Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞を用いた細胞シナプスアッセイ

【0152】

エフェクターＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）をＣＤ２０発現標的細胞（ＢＪＡＢ／Ｐｆｅｉｆｆｅｒ／ＳＵＤＨＬ８）と共に５０：１、１０：１、１：１、または１：１０のエフェクター対標的比でインキュベートした。エフェクター細胞および標的細胞をアッセイ培地（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で希釈した。試験濃度のそれぞれの細胞種５０μＬを９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に播種した。ＴＤＢ試験抗体をアッセイ培地で希釈し、１ｍｇ／ｍＬから開始して、続いて１０回、７．５倍連続希釈し、細胞に加えた。反応を０～２４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを氷に移して反応を停止した。細胞を２００μＬのＦＡＣｓ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．０２％アジド）を用いて１２００ＲＰＭで５分間、４℃での遠心分離により３回洗浄して、未結合の抗体を除去した。

【0153】

細胞をＢ細胞上でのＣＤ１９発現（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１９，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＴ細胞活性化マーカーＣＤ６２ＬおよびＣＤ６９（ＰＥ抗ヒトＣＤ６２Ｌ，ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ６９，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）について氷上で３０分間染色した。染色後、細胞を２００μＬのＦＡＣ緩衝液で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で１０分間固定した。細胞をフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＶＤ１０，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。ＣＤ１９陽性細胞は、標的細胞としてゲートされ、ＣＤ１９陰性細胞は、エフェクター細胞としてゲートされた。

【0154】

蛍光ＣＤ６２ＬまたはＣＤ６９エフェクター細胞の平均数は、Ｆｌｏｗ Ｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて分析した。ベースライン比率は、対照（ＴＤＢ抗体なし）条件を使用して決定した。ＣＤ６２Ｌ陽性またはＣＤ６９陽性Ｔ細胞の比率の変化をＴＤＢ試験抗体濃度に対してプロットした（ＧｒａｐＰａｄ Ｐｒｉｓｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。

【0155】

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いた細胞シナプスアッセイ

【0156】

ＰＢＭＣを製造者の指示書に従ってＵｎｉ－Ｓｅｐ血液分離チューブ（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を使用する密度勾配遠心分離によって健康なドナーの新鮮な血液から単離した。界面からの単核細胞を回収し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で２回洗浄した。細胞の生理的計数を維持するために、ＰＢＭＣをアッセイ培地で、ＰＢＭＣが単離された血液と同じ体積に希釈した。１００μＬのＰＢＭＣを９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の各ウェルに播種した。ＴＤＢ試験抗体をアッセイ培地で希釈し、１ｍｇ／ｍＬから開始して、続いて１０回、５倍連続希釈し、細胞に加えた。ＰＢＭＣを抗体と共に４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを氷に移して反応を停止した。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．０２％アジド）を用いて１２００ＲＰＭで５分間、４℃での遠心分離により３回洗浄して、未結合の抗体を除去した。細胞を、Ｂ細胞表面抗原（ＣＤ１９、ＣＤ４０）、Ｔ細胞表面抗原（ＣＤ４、ＣＤ８）、およびＴ細胞活性化マーカー（ＣＤ６２Ｌ）について以下の抗体、ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ１９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０抗ヒトＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、およびＰＥ抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて氷上で３０分間染色した。染色後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．０２％アジド）で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で１０分間固定した。

【0157】

細胞をフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＶＤ１０，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。ＣＤ１９陽性細胞は、Ｂ細胞としてゲートされ、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞は、Ｔ細胞としてゲートされた。Ｔ細胞の活性化は、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）のシェディングを引き起こす。Ｔ細胞上のＣＤ６２Ｌ蛍光は、Ｆｌｏｗ Ｊｏを使用して計算された。ベースライン蛍光は、対照（抗体なし）集団においてゲートすることにより決定し、複数回実験にわたって正規化した。用量反応曲線をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）でプロットした。

【0158】

モデル開発

【0159】

ＴＤＢシナプスの形成を説明するために、一連の常微分方程式に基づいた数学的モデルを開発し（図１）、これはＴ細胞におけるＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢと、腫瘍抗原ＣＤ２０と、ＣＤ３受容体との間の逐次結合を説明する。ＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢの結合親和性（ＫＤ）値は、ＣＤ２０に対しては６８ｎＭ、ＣＤ３に対しては４０ｎＭであった。現在のモデリング作業において、ＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢのＣＤ２０またはＣＤ３に対するＫｏｆｆ値は、式ｋｏｆｆ＝ＫＤ＊ｋｏｎを用いて、結合平衡が実験条件下で達成されるであろうことを確かにするために、ｋｏｎ値が０．００１ １／（ｎＭ×秒）であったという仮定の下で誘導された。

【0160】

シナプス形成は、以下の仮定および段階的近似を用いて提案された。１）細胞結合したＣＤ２０およびＣＤ３の総数は、十分に撹拌された系内で均一に分散されている。２）ＴＤＢは、最初にＣＤ２０またはＣＤ３に１：１の比で結合し、その結合は、独立した事象である（式１～５）。３）次いで、ＴＤＢ結合ＣＤ２０が未結合のＣＤ３と結合し、ＴＤＢ結合ＣＤ３が未結合のＣＤ２０と結合し、三分子シナプスを形成する（式６～１０）。４）三分子シナプスと細胞シナプスとの間の関係性は、Ｅｍａｘモデルにより記述される（式１１）。５）最も近い６個の標的細胞（すなわち、Ｂリンパ腫細胞）のそれぞれのＴ細胞に対する平均距離は、Ｔ細胞に対する標的細胞の間の細胞密度および相対細胞密度の細胞シナプス形成への影響を考慮して誘導される（次のセクションを参照されたい）。

【0161】

ｄ（Ｄｒｕｇ＿ｆｒｅｅ）／ｄｔ＝－ｋｏｎＣＤ２０＊ＣＤ２０＿ｆｒｅｅ＊Ｄｒｕｇ＿ｆｒｅｅ－ｋｏｎＣＤ３＊ＣＤ３＿ｆｒｅｅ＊
Ｄｒｕｇ＿ｆｒｅｅ＋ｋｏｆｆＣＤ２０＊ＤｒｕｇＣＤ２０＋ｋｏｆｆＣＤ３＊ＤｒｕｇＣＤ３ （１）

【0162】

ｄ（ＣＤ２０＿ｆｒｅｅ）／ｄｔ＝－ｋｏｎＣＤ２０＊ＣＤ２０＿ｆｒｅｅ＊Ｄｒｕｇ＿ｆｒｅｅ＋ｋｏｆｆＣＤ２０＊ＤｒｕｇＣＤ２０ （２）

【0163】

ｄ（ＣＤ３＿ｆｒｅｅ）／ｄｔ＝－ｋｏｎＣＤ３＊ＣＤ３＿ｆｒｅｅ＊Ｄｒｕｇ＿ｆｒｅｅ＋ｋｏｆｆＣＤ３＊ＤｒｕｇＣＤ３ （３）

【0164】

ｄ（ＤｒｕｇＣＤ２０）／ｄｔ＝ｋｏｎＣＤ２０＊ＣＤ２０＿ｆｒｅｅ＊Ｄｒｕｇ＿ｆｒｅｅ－ｋｏｆｆＣＤ２０＊ＤｒｕｇＣＤ２０ （４）

【0165】

ｄ（ＤｒｕｇＣＤ３）／ｄｔ＝ｋｏｎＣＤ３＊ＣＤ３＿ｆｒｅｅ＊Ｄｒｕｇ＿ｆｒｅｅ－ｋｏｆｆＣＤ３＊ＤｒｕｇＣＤ３ （５）

【0166】

Ｄｒｕｇ＿ｆｒｅｅ、ＣＤ２０＿ｆｒｅｅ、およびＣＤ３＿ｆｒｅｅは、それぞれ未結合の（または遊離の）ＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢ、ＣＤ２０、およびＣＤ３を表す。ＤｒｕｇＣＤ２０は、ＴＤＢ結合ＣＤ２０を表し、ＤｒｕｇＣＤ３は、ＴＤＢ結合ＣＤ３を表す。

【0167】

ＣＤ２０＿ＦＰＣ＝（ＣＤ２０＿ｆｒｅｅ／ＣＤ２０Ｂ０）＊ＣＤ２０＿ＫＣｅｌｌ （６）

【0168】

ＣＤ２０＿ＢＰＣ＝（ＤＣＤ２０／ＣＤ２０Ｂ０）＊ＣＤ２０＿ＫＣｅｌｌ （７）

【0169】

ＣＤ３＿ＦＰＣ＝（ＣＤ３Ｆ／ＣＤ３Ｔ０）＊ＣＤ３＿ＫＣｅｌｌ （８）

【0170】

ＣＤ３＿ＢＰＣ＝（ＤＣＤ３／ＣＤ３Ｔ０）＊ＣＤ３＿ＫＣｅｌｌ （９）

【0171】

Ｓｙｎａｐｓｅ_Ｍ＝ＣＤ２０＿ＦＰＣ＊ＣＤ３＿ＢＰＣ／（α１＊ＫＤＣＤ２０）＋ＣＤ２０＿ＢＰＣ＊ＣＤ３＿ＦＰＣ／（α２＊ＫＤＣＤ３） （１０）

【0172】

ＣＤ２０＿ＦＰＣは、遊離ＣＤ２０受容体／Ｂ細胞を表し、ＣＤ２０＿ＢＰＣは、ＴＤＢ結合ＣＤ２０受容体／Ｂ細胞を表す。ＣＤ３＿ＦＰＣは、遊離ＣＤ３受容体／Ｔ細胞を表し、ＣＤ３＿ＢＰＣは、ＴＤＢ結合ＣＤ３受容体／Ｔ細胞を表す。ＳｙｎａｐｓｅＭは、三分子シナプスを表す。αは、ＫＤの倍率を表す。

【0173】

Ｓｙｎａｐｓｅ_Ｃ＝Ｅｍａｘ＊Ｓｙｎａｐｓｅ_Ｍ／（ＥＣ５０＋Ｓｙｎａｐｓｅ_Ｍ） （１１）

【0174】

Ｓｙｎａｐｓｅ_Ｃは、細胞シナプスを表す。

【0175】

Ｔ細胞とＢリンパ腫細胞との間の細胞間距離の計算

【0176】

サイズが１ｍｍ^３（または１μＬ）の立方体内部のＴ細胞およびＢリンパ腫細胞の位置を、実験条件（表１）に従ってランダムＸ座標、Ｙ座標、およびＺ座標を用いてシミュレートした（Ｒバージョン３．５．１ソフトウェア）。立方体内のそれぞれのＴ細胞（ｎ＝５００～２０００）について、最も近い６個の標的細胞（すなわち、Ｂリンパ腫細胞）の平均距離を計算してから、立方体内のすべてのＴ細胞について距離を平均した（表２）。

【0177】

【0178】

【0179】

次いで、この全平均距離（ＤＸ、ｍｍ）を式１１に導入し、細胞濃度および標的細胞のＴ細胞に対する比率の細胞シナプス形成への影響を考慮した（式１２～１５）。最終モデルのパラメータ推定値を表３に示した。

【0180】

Ｓｙｎａｐｓｅ_Ｃ＝Ｅｍａｘ＊Ｓｙｎａｐｓｅ_Ｍ／（ＥＣ５０＋Ｓｙｎａｐｓｅ_Ｍ） （１１） Ｅｍａｘ＝Ｅｍａｘ_ＤＸ－Ｅｍａｘ_ＤＸ＊ＤＸ＾ＧＡＭ_{ＥｍａｘＤＸ}／（ＥＣ５０_{ＥｍａｘＤＸ}＾ＧＡＭ_{ＥｍａｘＤＸ}＋ＤＸ＾ＧＡＭ_{ＥｍａｘＤＸ}） （１２）

【0181】

Ｅｍａｘ_ＤＸ＝Ｅｍａｘ_{ＥｍａｘＤＸ，ＣＤ２０}＊ＣＤ２０＿Ｋｃｅｌｌ／（ＥＣ５０_{ＥｍａｘＤＸ，ＣＤ２０}＋ＣＤ２０＿Ｋｃｅｌｌ） （１３）

【0182】

ＥＣ５０＝Ｅｍａｘ_{ＥＣ５０ＤＸ}＊ＤＸ／（ＥＣ５０_{ＥＣ５０ＤＸ}＋ＤＸ） （１４）

【0183】

Ｅｍａｘ_{ＥＣ５０ＤＸ}＝Ｅｍａｘ_{ＥＣ５０ＤＸ，ＣＤ２０}＊ＣＤ２０＿Ｋｃｅｌｌ＾ＧＡＭ_{ＥＣ５０ＤＸ，ＣＤ２０}／（ＥＣ５０_{ＥＣ５０ＤＸ，ＣＤ２０}＾ＧＡＭ_{ＥＣ５０ＤＸ，ＣＤ２０}＋ＣＤ２０＿Ｋｃｅｌｌ＾ＧＡＭ_{ＥＣ５０ＤＸ，ＣＤ２０}） （１５）

【0184】

ＣＤ２０＿Ｋｃｅｌｌは、細胞１個当たりのＣＤ２０発現レベル（細胞１個当たりの受容体）を表す。

【0185】

【0186】

結果

【0187】

Ｔ細胞依存性二重特異性分子の作用機序は、十分に定義されてきた（Ｓｕｎ，２０１５）。標的抗原に特異的なアームは、がん細胞に会合し、他のアームは、同時にＴ細胞に会合し、ポリクローナルＴ細胞活性化を誘導する。Ｔ細胞の活性化は、がん細胞を溶解させるパーフォリンおよびグランザイムの放出をもたらす。したがって、ＴＤＢの作用機序（ＭＯＡ）における駆動ステップは、標的およびエフェクターＴ細胞の両方へのＴＤＢ分子の結合であり、細胞シナプスを形成する（Ｓｔａｅｒｚ，１９８５）。Ｔ細胞活性化は、細胞シナプス形成に続く最も近接した事象であり、したがって、Ｔ細胞活性化マーカーを使用してシナプス形成を見積もることができる。

【0188】

ＴＤＢ依存性シナプス形成を検出するようにインビトロアッセイを開発するために、標的細胞とエフェクター細胞との平衡を一定に保つことが有用であり得る。したがって、標的細胞を活性化するが溶解しないエフェクター細胞を使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用して代替Ｔ細胞源としてのインビトロシステムを開発した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、一次Ｔ細胞と同様に活性化するが、パーフォリンおよびグランザイムを放出しない。ＣＤ２０発現ＢＪＡＢ Ｂリンパ腫細胞を標的細胞として使用した。初期アッセイ開発のために、細胞を１：１のエフェクター対標的比で混ぜ合わせ、ＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢの存在下で一緒に４時間、３７℃でインキュベートした。

【0189】

インキュベーション後、細胞をＣＤ１９、ＣＤ６９、およびＣＤ６２Ｌの発現について染色した。ＣＤ１９発現を使用して、標的細胞およびＣＤ３ Ｔ細胞を区別した。Ｔ細胞の表面からのＣＤ６２ＬシェディングおよびＣＤ６９アップレギュレーションは、既知のＴ細胞活性化マーカーである（Ｃｈａｏ，Ｃ．，Ｒ．Ｊｅｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｌ－Ｓｅｌｅｃｔｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．”Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１５９：１６８６－１６９４；およびＳｈｉｐｋｏｖａ，Ｍ．，Ｅ．Ｗｉｅｌａｎｄ．（２０１２）“Ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．”Ｃｌｉｎｉｃ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ４１３：１３３８－１３４９）。したがって、活性化Ｔ細胞は、ＣＤ６９陽性またはＣＤ６２Ｌ陰性として測定された（図２Ａ）。活性化Ｔ細胞の比率を計算し、ＴＤＢ濃度に対してプロットした（図２Ｂ）。ＣＤ６２ＬおよびＣＤ６９の両方は、類似のパターンの活性化を示した（図２Ｂ）。ＴＤＢ依存性ＣＤ６９活性化は、１．２２ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０であったが、ＴＤＢ依存性ＣＤ６２Ｌ減少は、４．９５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０であった。

【0190】

初期シナプス形成を正確にモデル化するために、Ｔ細胞活性化の最も早いマーカーを見出すことが有用であり得る。Ｔ細胞活性化の最も早い読み取りについて確認するために、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＢＪＡＢ標的細胞およびＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢと共に２４時間にわたりインキュベートした。ＣＤ６９およびＣＤ６２Ｌの発現によって検出されるような細胞活性化を様々な時点で測定した（図３Ａ）。ＣＤ６９発現によって示されるようなＴ細胞活性化は、１時間で検出可能であり、ＣＤ３／ＣＤ２０ ＴＤＢの添加後２４時間まで連続して増加した。対照的に、ＣＤ６２Ｌシェディングは、ＴＤＢおよび標的細胞との１時間インキュベーション後、最大のレベル低下に達した（図３Ａ）。ＣＤ６２Ｌは、ＴＤＢの添加後早ければ５分で発現におけるシフトを示した（図３Ｂ）。したがって、ＣＤ６２Ｌシェディングは、Ｔ細胞シナプス形成をモデル化するために使用される早期Ｔ細胞活性化マーカーとして選択された。

【0191】

細胞株を利用するインビトロシステムがＴ細胞と標的細胞との間の生理的細胞シナプス形成の正確な測定手段であることを確認するために、ＰＢＭＣをヒトドナーから単離し、シナプスアッセイで試験した。ＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢをＰＢＭＣに添加して４時間インキュベートした。ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の両方をＴ細胞活性化についてＣＤ６２Ｌ発現をマーカーとして使用して分析した。

【0192】

Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞による活性化と同様に、ＣＤ８ Ｔ細胞、および比較的程度は低いがＣＤ４ Ｔ細胞は、ＴＤＢ依存性活性化を示したが、これはＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を用いるインビトロアッセイシステムが一次ヒトＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞によるインビボ設定を反映していることを示唆する。

【0193】

ＣＤ６２Ｌ発現を細胞シナプス形成のサロゲートマーカーとして使用するビトロアッセイシステムの確立後、細胞シナプスに潜在的に影響を及ぼす要因を評価した。様々な量のＣＤ２０を発現する３種類のＢリンパ腫細胞株を、最高レベルのＣＤ２０を発現する（細胞１個当たり１２２Ｋコピー）ＢＪＡＢ細胞、中間量のＣＤ２０を発現する（細胞１個当たり１４Ｋコピー）Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞、および最低量のＣＤ２０を発現する（細胞１個当たり１．２Ｋコピー）ＳＵＤＨＬ－８と共に使用した。加えて、広範囲のエフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）を（１：１０～５０：１）の範囲で評価した。図５に示すように、細胞シナプスは、標的発現依存性の様式で形成された。最高レベルのＣＤ２０を発現するＢＪＡＢ細胞は、最も多い量の細胞シナプスを示したが、ＣＤ２０の発現がほぼ１０倍少ないＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞およびほぼ１００倍少ないＳＵＤＨＬ８細胞では、細胞シナプス形成が低減された。標的発現レベル依存性細胞シナプス形成は、Ｅ：Ｔ比に関係なく示された。

【0194】

細胞シナプスの形成はまた、エフェクター細胞および標的細胞の相対細胞密度（Ｅ：Ｔ比）に依存した。エフェクター細胞の細胞密度が標的細胞よりも５０倍高い場合、最小の細胞シナプス形成が観察された。標的細胞の細胞密度が増加するにつれて、細胞シナプスの量が上昇した（図５）。

【0195】

細胞シナプス形成モデルの開発

【0196】

提案された細胞シナプス形成モデルの概略図を図１に示す。細胞シナプスモデルは、ＴＤＢに関する既知の結合反応速度論に基づいて開発された。すなわち、標的およびＴ細胞の表面上での三分子シナプス複合体（すなわち、ＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢ－ＣＤ２０－ＣＤ３）の形成は、Ｔ細胞活性化マーカーにより見積もられた細胞シナプスの形成を必要とした。標的（すなわち、ＣＤ２０）およびＣＤ３は、独立した事象としてＴＤＢに対する結合を有する遊離抗原および可溶抗原として処理され、結合親和性（すなわち、ＫＤ）によって決定された。ｍＡｂの結合親和性は、結合アームのうちの１つが結合されたときに影響を受ける可能性があることが示されており、したがって、予備的用語のαが結合親和性の変化を考慮して導入された。次いで、細胞シナプスの形成は、三分子シナプス複合体の量、標的とＴ細胞との間の距離、および細胞１個当たりの標的発現レベルによって影響される。

【0197】

細胞シナプスの形成を特徴づけかつ予測するためのモデルの能力は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞によるインビトロＴ細胞活性化データを使用して評価された。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の細胞殺傷機能が活性化後であっても損なわれていたため、細胞株は、細胞シナプス形成の評価に理想的であった。したがって、標的細胞の量は、細胞シナプスの定量を可能にするように一定である。多様なＴＤＢ濃度、エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比、および細胞１個当たりの標的発現レベルは、モデルパラメータの推定を可能にするようにこのデータセットに含まれた。

【0198】

図５に示すように、モデルは、形成される細胞シナプスの量を定量的に把握することができる。ＴＤＢに対する作用機序に基づいて、細胞シナプスの形成のみが所望の下流活性（例えば、細胞殺傷）を引き起こすことができるが、ＴＤＢの標的細胞またはエフェクター細胞のいずれかのみに対する結合ではできない。したがって、モデルを使用して、細胞シナプスの形成に影響を及ぼしてもよい主要な要因の統合的分析を提供することによってＴＤＢの設計を支援することができる。

【0199】

考察

【0200】

Ｔ細胞依存性二重特異性分子は、がん治療のための新規かつ有望な種類の分子である。その分子は、ＣＤ３介在Ｔ細胞リクルートを用いる腫瘍標的認識を組み合わせた、特有のＭＯＡを有する。抗腫瘍活性における分子特性および標的発現の効果を探索するために多大な努力が払われてきた（例えば、２：１標的：ＣＤ３結合二重特異性分子、同一の標的に対する医薬および前治療に使用される医薬との標的結合競合）。しかしながら、合理的分子設計、標的選択、および用量／レジメン選択は、下流の薬理作用の駆動力である細胞シナプス形成の定量的理解が不足しているため困難であった。

【0201】

最初の難関は、細胞シナプスの形成自体を測定することであった。シナプス形成をモデル化する１つのアプローチは、Ｔ細胞／腫瘍細胞複合体を画像化することであろう。しかしながら、アッセイが細胞培養皿内で行われるため、Ｔ細胞および腫瘍細胞は、それらの近接性に起因してのみ互いに複合しているように見える場合がある。代替的アプローチは、複合体の増加を測定するためのＦＳＣ測定およびＳＳＣ測定を使用するフローサイトメーターで細胞複合体を測定することであろう。しかしながら、細胞撮像装置を用いた場合と同様に、Ｔ細胞／腫瘍細胞複合体は、ＴＤＢ濃度とは無関係に検出された（データは示さない）。

【0202】

Ｔ細胞／腫瘍細胞複合体を直接測定するのではなく、ＴＤＢのＴ細胞および腫瘍細胞標的に対する結合に続く近接事象を測定することによって細胞シナプス形成を測定することが可能である。従来のインビトロアッセイでは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、および他の細胞表面活性化マーカーにより測定した場合のＴ細胞活性化を測定していた（Ｓｕｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｄ．Ｅｌｌｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ａｎｔｉ－ＣＤ２０／ＣＤ３ Ｔ ｃｅｌｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ７（２８７）：２８７ｒａ７０；Ｊｕｎｔｔｉｌａ，Ｔ．Ｔ．，Ｊ．Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）“Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔｓ ＨＥＲ２ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ．”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ７４（１９）：５５６１－７１；およびＢｒｉｓｃｈｗｅｉｎ，Ｋ．，Ｂ．Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００６）“ＭＴ１１０：Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｅｒａｄｉｃａｔｉｎｇ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４３：１１２９－１１４３）。ＣＤ６９およびＣＤ６２Ｌの両方は、用量依存性様式でＴＤＢに曝露させた後にＴ細胞上での発現が変化する（図２）。しかしながら、ＣＤ６２Ｌは、ＴＤＢの添加から５分以内にＴ細胞の表面から失われ、シェディングが２時間以内に最大の度合いで生じる。これは、ＣＤ６９では対照的に、ＴＤＢ添加後２４時間まで発現が連続して増加する。両方のマーカーがＴＤＢに対して同様の感度を示すが（図２）、ＣＤ６２Ｌ発現の変化は、ＴＤＢ添加にはるかに近接し、したがって、細胞シナプス形成のより直接的な読み出しである。

【0203】

シナプスの形成および下流薬理作用への連結は、以前の研究において調査されてきた（Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ，Ｋ．，Ｂ．Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００６）“ＭＴ１１０：Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｅｒａｄｉｃａｔｉｎｇ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４３：１１２９－１１４３；Ｓｐｅｉｓｓ，Ｃ．，Ｍ．Ｍｅｒｃｈａｎｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｎａｔｕｒａｌ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｈａｌｆ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３１：７５３－７５８；およびＣｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－Ｈｕｍａｎ Ｄｏｓｅ ｆｏｒ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ ＬＰ－ＤＡＲＴ：Ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＰＫ／ＰＤ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．１００（３）：２３２－４１）。これらの研究では、シナプスの形成は、定量化することができず、いくつかの仮定、すなわち、１）固定された標的発現レベル、２）固定されたＣＤ３発現レベル、３）細胞結合した標的およびＣＤ３の計算総量は、遊離可溶分子として十分に撹拌された系内で均一に分布していること、を用いて分子レベルでモデル化された。次いで、モデル予測された分子シナプスを使用して、下流薬理作用（例えば、細胞殺傷およびＴ細胞ダイナミクス）を行わせた。このモデル化戦略は、ＭＡＢＥＬ用量選択の支援、ならびにインビトロおよびインビボでのＰＫ－ＰＤ関係の説明において価値を示したが、いくつかの限界が指摘されている。

【0204】

第一に、モデル予測された分子シナプスと薬理効果との間の関係は、細胞１個当たりの標的またはＣＤ３の発現レベルに応じて異なるかもしれない。例えば、標的の総量は、ｉ）標的発現が高い細胞の低細胞密度対ｉｉ）標的発現が低い細胞の高細胞密度の条件下で同じ可能性がある。二重特異性分子のある特定の濃度で、モデル予測された分子シナプスの量は同一となるが、観察される薬理効果は、異なる細胞密度に起因して異なる可能性がある。第二に、分子シナプス形成を予測するために使用されたモデルは、標的およびＣＤ３を遊離可溶分子として推測した。しかしながら、二重特異性分子が遊離可溶分子と比較して細胞結合分子に対して異なる近接性を有するであろうことが見込まれて、したがって、細胞密度を考慮に入れる必要がある。さらに、Ｔ細胞依存性二重特異性分子の薬理効果がＴ細胞活性化によって引き起こされる場合、標的細胞とエフェクター細胞との間の相対細胞密度もまた考慮に入れる必要がある。第三に、分子シナプスの代わりに、細胞シナプス構造（すなわち、二重特異性分子－標的細胞－Ｔ細胞）の形成が下流薬理作用を引き起こす。細胞表面上での分子シナプス（すなわち、二重特異性分子－細胞結合標的分子－細胞結合ＣＤ３分子）の形成が必須であるが、細胞シナプス構造に必要な分子シナプスの最小量は不確かなままである。

【0205】

最新のモデル化作業の目的は、上述のようにインビトロアッセイによって見積もられた細胞シナプス形成を説明するための包括的モデルを開発することである。生成されたデータセットは、細胞シナプス形成に潜在的に影響を及ぼす広範な要因を網羅し、１）標的発現レベル（細胞１個当たり１，２００コピー～細胞１個当たり１２２，０００コピー）、２）エフェクター対標的細胞比（１：１０～１：０．０１）、３）総細胞密度（１～１１×１０^６／ｍＬ）を含む。図５に示すように、本明細書で開発された機序に基づくモデルは、単一の均一モデル構造を使用して、複数の相関する要因および細胞シナプス形成へのそれらの影響を説明した。統合的分析を通して、本モデルは、分子設計および候補選択などの、Ｔ細胞依存性二重特異性分子の発見および開発を支援するためのフレームワークを提供することができる。腫瘍標的発現レベルおよび腫瘍細胞と正常細胞との間で異なる発現のダイナミックレンジの情報もまた組み込まれて、腫瘍標的の適合性評価および対応するＴ細胞依存性二重特異性分子の合理的分子設計を導くことができる。実行することを通して、治療濃度域は、作用部位における腫瘍細胞殺傷を最大化し、正常細胞に対する所望しない免疫反応および細胞傷害性を最小化することによって、期待通りならば拡張することができる。

【0206】

実施例２－機序に基づくモデルによる二重特異性抗体のＭＯＡの解明

【0207】

本実施例は、インビトロでのＴ細胞活性化を測定し、予測するための方法論を開示する。インビトロでのＴ細胞活性化は、Ｂ細胞密度およびＴ細胞密度（すなわち、細胞内距離）、細胞１個当たりのＢ細胞標的受容体（ＣＤ２０）発現レベル、および標的抗原に対する二重特異性抗体親和性（ＫＤ）の関数であると仮定した。

【0208】

図６は、Ｂ細胞が抗原ＣＤ２０のより高い発現レベルを有した場合にＴ細胞がより活性化されやすいことを示す。

【0209】

Ｂ細胞により近いＴ細胞が二重特異性Ａｂの存在下でより「活性化され」やすいため、細胞内距離は、モデル化に有用である。細胞内距離をシミュレーションにより計算した。Ｂ細胞とＴ細胞との間の距離を計算するための方法は、１μＬ（１ｍｍ^３）のサイズを有する立方体内部でランダムｘ，ｙ，ｚ座標を有する実験的細胞数をシミュレートするためにＲソフトウェアを使用することと、細胞がＢ細胞またはＴ細胞であったかをランダムに割り当てることと、を含んだ。図７は、１μＬ中の５００個のＴ細胞および５００個のＢ細胞のシミュレーションを示す。それぞれのＴ細胞（ｎ＝５００）について、最も近い６個のＢ細胞の平均距離（ｄｘ）を決定した。さらに、前工程からの全平均距離（Ｄｘ、ｍｍ単位）は、最終平均距離値に到達するように決定された。図８は、Ｔ細胞とＢ細胞との間の細胞内距離のシミュレーションの図である。図９は、Ｂ細胞により近いＴ細胞がより活性化されやすいことを示す。

【0210】

要約すると、より高いＢ細胞標的発現レベルおよびＴ細胞とＢ細胞との間のより短い細胞内距離は両方とも、Ｔ細胞活性化の増加をもたらす。

【0211】

描写され、特許請求される様々な実施形態に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組合せを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わせられても良い。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例証および説明目的のために提示されている。包括的であるようにも本開示の主題を開示される実施形態に限定するようにも意図されていない。

【0212】

本開示の主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、本開示の主題の組成物および方法に様々な修正および変形を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示の主題が添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内の修正および変形を含むよう意図されている。様々な刊行物、特許、および特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【国際調査報告】