特表 2023-507252 パッチ畳み込みニューラルネットワークを用いる癌分類

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-22

(54)【発明の名称】パッチ畳み込みニューラルネットワークを用いる癌分類

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20230215BHJP

   G16B 20/00 20190101ALI20230215BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20230215BHJP

   G16B 40/20 20190101ALI20230215BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALN20230215BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

G16B20/00

C12M1/00 A

G16B40/20

C12Q1/6876 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022530331

(86)(22)【出願日】2020-12-11

(85)【翻訳文提出日】2022-07-07

(86)【国際出願番号】 US2020064577

(87)【国際公開番号】W WO2021119471

(87)【国際公開日】2021-06-17

(31)【優先権主張番号】62/948,129

(32)【優先日】2019-12-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ブルートゥース

２．アンドロイド

(71)【出願人】

【識別番号】522105894

【氏名又は名称】グレイル エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100211395

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 裕貴

(72)【発明者】

【氏名】バージル ニクラ

(72)【発明者】

【氏名】オグンジェン ニコリク

(72)【発明者】

【氏名】齊藤 靖

(72)【発明者】

【氏名】マリウス エリクセン

(72)【発明者】

【氏名】ジョシュ ニューマン

(72)【発明者】

【氏名】ダルヤ フィリッポヴァ

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンダー イープ

(72)【発明者】

【氏名】オリバー クラウデ ヴェン

(72)【発明者】

【氏名】イョルグ ブレドノ

(72)【発明者】

【氏名】キンウェン リウ

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンダー ピー フィールズ

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA27

4B063QA05

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QR55

4B063QS10

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

(57)【要約】

被験体の生物学的試料から核酸のメチル化シーケンシングによって決定される断片のメチル化パターンのデータセットを得ることを含む、種の被験体の疾患状態を決定するための方法が提供される。断片のメチル化パターンは、断片中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含む。パッチによって表される参照ゲノム中のＣｐＧサイトのセットにおけるそれぞれのＣｐＧサイトのメチル化状態のパラメータを備えるチャンネルを含むパッチは、ＣｐＧサイトのセットに並ぶ複数の断片中のそれぞれの断片について、それぞれの断片のメチル化パターンに基づいて複数のパラメータの全部または一部のインスタンスをポピュレーションすることによって構築される。パッチ回帰ニューラルネットワークへのパッチの適用は、被験者の疾患状態を決定する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

種の被験体の癌状態を決定する方法であって、以下を含む方法：
少なくとも１つのプロセッサと、前記少なくとも１つのプロセッサによって実行されるための少なくとも１つのプログラムを記憶するメモリと、を備える、少なくとも１つのプログラム：
Ａ）データセットを得ることは、電子形態であり、ここで、データセットは、複数の断片においてそれぞれの断片の対応するメチル化パターンを含み、ここで、各断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）試験対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、そして（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態を含む；
Ｂ）第１のチャネルを含む第１のパッチを構築し、ここで、第１のパッチは、種の参照ゲノムにおける第１の独立したＣｐＧ部位のセット、参照ゲノムにおける所定の位置に対応する第１の独立したＣｐＧ部位のセットにおける各ＣｐＧ部位を表す：
第１の複数のパラメタの第１のチャネルの複数の例を含み、ここで、第１の複数のパラメタの各例は、第１のパッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含み、構築物Ｂ）は、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ各断片について、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ各断片、それぞれの断片のメチル化パターンに基づく第１の複数のパラメータの全部または一部の例を含む；およびＣ）少なくとも第１のパッチを分類器に適用し、それによって被験体における癌状態を決定することを含む。

【請求項2】

少なくとも１つのプログラムが、Ａ）を得た後および構築物Ｂ）を得る前の指示をさらに含む、請求項１記載の方法：
それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位を横切る対応するメチル化パターンを有する各断片を複数の断片から除去することにより複数の断片を剪定すると、ｐ値閾値を満たさないｐ値を有する。ここで、それぞれの断片のｐ値は、対応する複数のＣｐＧ部位のメチル化パターンの対応する分布に基づく各断片の対応するメチル化パターンの比較に基づいて決定され、ここで、対応する複数の参照断片中の各参照断片のメチル化パターンは、健康な被験者のコホートから得られた生体試料からの核酸のメチル化配列決定によって得られる。

【請求項3】

請求項２記載の方法：
第１の複数のパラメータの各インスタンスに対する第１の複数のパラメータを含み、第２の複数のパラメータの各インスタンスが第１のチャネルと第２のチャネルを含む複数のパラメータを含み、ここで、第２の複数のパラメータの各インスタンスは、第１のパッチに対する第１の独立したＣｐＧ部位の第１のセットにおけるＣｐＧ部位の第１の特徴、ＣｐＧメチル化状態以外のパラメータを含み、構築物Ｂ）は、ＣｐＧ部位の第１の独立したセットに並ぶ各断片について、第１の複数のパラメータの全部または一部、およびそれぞれの断片のメチル化パターンに基づく第２の複数のパラメータの全部または一部のインスタンスを含む、各断片のポピュレーションを含む。

【請求項4】

各々の断片のメチル化パターンが、第１のパッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットにおける各々のＣｐＧ部位を含まず、かつ構築物Ｂ）、複数の断片における各々の断片について、各々の断片に存在するＣｐＧ部位に対応する第１の複数のパラメータのインスタンスへのポピュレーションパラメータを含む、請求項１記載の方法。

【請求項5】

構築物Ｂ）が、複数の断片中のそれぞれの断片について、以下を含む、請求項１に記載の方法：
ｉ）第１チャネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内で、複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が割り当てられていない、それぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを同定する；および、ｉｉ）同定されたパラメータの中で、それぞれの断片の対応するＣｐＧ部位、それぞれの断片の対応するＣｐＧ部位のメチル化状態に整列する、各パラメータについて割り当てる。

【請求項6】

構築物Ｂ）が、複数の断片中のそれぞれの断片について、以下を含む、請求項３記載の方法：
ｉ）複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前割り当てられていない、それぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを、第１チャネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内で同定する；
ｉｉ）同定されたパラメータの中で、それぞれのフラグメントのＣｐＧ部位、それぞれのフラグメントのそれぞれのＣｐＧ部位に整列する、同定されたパラメータの中で、各パラメータのメチル化状態を割り当て；およびｉｉｉ）同定されたパラメータの中で、それぞれのパラメータについて、第１の複数のパラメータのインスタンスの第２の複数のパラメータの中で、それぞれのフラグメントのそれぞれのＣｐＧ部位、それぞれのフラグメントのそれぞれのＣｐＧ部位の第１の特徴に整列する、第２の複数のパラメータの第２のパラメータを割り当てる。

【請求項7】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴が、それぞれのＣｐＧ部位がオンである、それぞれの断片の多重度である、請求項６記載の方法。

【請求項8】

各々のＣｐＧ部位の第一の特徴が、からなる群より選択される、請求項６記載の方法：
健常コホートから導かれたＣｐＧβ値、試験対象から導かれた所定の組織型、５’および３’隣接ＣｐＧ部位のメチル化状態に対するピアソンの相関スコア、Ｊａｃｃａｒｄ距離、Ｍａｎｈａｔｔａｎ距離、正規化されたユークリッド距離、被験者のコホートにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態の最大値、ダイス係数、またはコシン係数、それぞれの断片の断片ｐ値、それぞれのＣｐＧ部位の断片マッピング品質スコア、参照ゲノムにおける５’隣接ＣｐＧ部位までの距離それぞれのＣｐＧ部位の多重性、それぞれのＣｐＧ部位が生物学的経路内にあるそれぞれのＣｐＧ部位は関連しており、それぞれのＣｐＧ部位が関連している遺伝子、それぞれのＣｐＧ部位に対するＣｐＧ遷移インパルス機能の値、それぞれのＣｐＧ部位に対するＣｐＧランレングスコード化の値、およびそれぞれのＣｐＧ部位がオンである断片のリードストランド配向である。

【請求項9】

複数の断片中の１つ以上の断片が、複数の断片が共通のＣｐＧ部位を持たないことを条件に、第１パッチ中の第１のチャネルの第１の複数のパラメータの単一インスタンスに割り当てられる、請求項５または６に記載の方法。

【請求項10】

最初の複数のパラメータの例におけるパラメータがゼロである、請求項４記載の方法。

【請求項11】

ＣｐＧ部位の第１の独立セットが、参照ゲノムのＣｐＧインデックスにある、請求項１記載の方法。

【請求項12】

参照ゲノムのＣｐＧインデックスが、第２のＣｐＧ部位と第１の独立したＣｐＧ部位のセットに存在する第１のＣｐＧ部位と第３のＣｐＧ部位との間の参照ゲノムに位置する、ＣｐＧ部位の第１の独立したセットに存在しない第１のＣｐＧ部位を含む、請求項１１記載の方法。

【請求項13】

請求項１記載の方法：
ＣｐＧ部位の第１の独立セットは、参照ゲノムのＣｐＧインデックスにおいて互いに隣接する第１のＣｐＧ部位および第２のＣｐＧ部位を含み、複数の断片中の第１の断片は第１のＣｐＧ部位を含むが第２のＣｐＧ部位は含まず、複数の断片中の第２の断片は第２のＣｐＧ部位を含むが、第１のＣｐＧ部位は含まない。

【請求項14】

第１の複数のパラメータの例におけるパラメータが、複数の断片中のそれぞれの断片について、以下の通りである、請求項１記載の方法：
メチル化シークエンシングによってそれぞれの断片中の対応するＣｐＧ部位がメチル化された場合にメチル化され、それぞれの断片中の対応するＣｐＧ部位がメチル化されていないと判定された場合にはメチル化され、メチル化シークエンシングによってそれぞれの断片中の対応するＣｐＧ部位がメチル化されていないと判定された場合にはメチル化されず、メチル化されていないかメチル化されていないと判定された場合にはメチル化されない。

【請求項15】

第１チャネルの第１の複数のパラメータの例数が、それぞれのフラグメントを割り当てられておらず、少なくとも１つのプログラムが、フラグメントを割り当てられていない第１チャネルの複数のパラメータの例におけるゼロ充填パラメータの指示をさらに含む、請求項５に記載の方法。

【請求項16】

ｉ）を同定することが、第１チャネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内で、複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないそれぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを同定することができず、少なくとも１つのプログラムがさらにそれぞれの断片を廃棄するための指示を含む、請求項５記載の方法。

【請求項17】

ｉ）を同定することが、第１パッチの第１チャネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内で、複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないそれぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを同定することができない、少なくとも１つのプログラムが、第１パッチの追加インスタンスを作成し、第１パッチの追加インスタンスにそれぞれの断片を割り当てるための指示をさらに含む、請求項５に記載の方法。

【請求項18】

請求項３記載の方法：
複数のチャネルは、少なくとも３つのチャネルを含む
第１の複数のパラメータの各インスタンスに対する第３の複数のチャネルの対応するインスタンスを第３の複数のチャネルに含み、第３の複数のパラメータの各インスタンスは、ＣｐＧ部位の第１の独立したセットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位の第２の特性に対するパラメータを含み、ここで、第２の特性は、以下からなる群から選択される：
健常コホートから導かれたＣｐＧβ値、試験対象から導かれた所定の組織型、５’および３’隣接ＣｐＧ部位のメチル化状態に対するピアソンの相関スコア、Ｊａｃｃａｒｄ距離、Ｍａｎｈａｔｔａｎ距離、正規化されたユークリッド距離、被験者のコホートにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態の最大値、ダイス係数、またはコシン係数、それぞれの断片の断片ｐ値、それぞれのＣｐＧ部位の断片マッピング品質スコア、参照ゲノムにおける５’隣接ＣｐＧ部位までの距離それぞれのＣｐＧ部位の多重性、それぞれのＣｐＧ部位が生物学的経路内にあるそれぞれのＣｐＧ部位は関連しており、それぞれのＣｐＧ部位が関連している遺伝子、それぞれのＣｐＧ部位に対するＣｐＧ遷移インパルス機能の値、それぞれのＣｐＧ部位に対するＣｐＧランレングスコード化の値、およびそれぞれのＣｐＧ部位がオンである断片のリードストランド配向である。

【請求項19】

ＣｐＧ部位の第１の独立セットが、参照ゲノム全体から引き出される、請求項１記載の方法。

【請求項20】

請求項１に記載の方法であって、少なくとも１つのプログラムが以下の指示をさらに含む、方法：
第１の対応する第１のチャネルを構成する第２のパッチ、種の参照ゲノム中の第２の独立したＣｐＧ部位の第２の独立したセットを表す第２のパッチ、参照ゲノム中の第２のＣｐＧ部位の第２の独立したセットに対応する第２のＣｐＧ部位の各第１の複数のチャネルを構成し、ここで、第２のチャネルの各パラメータは、第２のパッチの第２の独立したセットのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含み；そして、ＣｐＧ部位の第２の独立したセットに並ぶ各断片について、第２のパッチのメチル化パターンに基づく第２のパッチの全てまたは第１の複数のパラメータの一部を構成し、第２のパッチを構築する；そして、Ｃを適用することは、さらに、第１のパッチおよび第２のパッチを分類器に適用することを含んでおり、それにより、被験体中の癌状態を決定することを含む、第２のパッチの対応する第１および第２のパッチのメチル化状態に関するパラメータを構成する。

【請求項21】

請求項２０の方法：
第２のパッチは対応する第１のチャネルを含む対応する複数のチャネルを含む；
第２パッチの第２の複数のチャネルの対応する第２の複数のチャネルにおける対応する第２のチャネルの複数のパラメータを含み、ここで、第２のパッチの第２の複数のパラメータの各インスタンスは、第２のパッチの第２の独立したセットのＣｐＧ部位の第１の特徴、ＣｐＧメチル化状態以外のパラメータを含み、かつ、第２の独立したセットのＣｐＧ部位に並ぶ複数の断片中の各断片について、第２のパッチの第２の複数のパラメータのインスタンスの全部または一部を、それぞれの断片のメチル化パターンに基づいてさらにポピュレーションするための指示を含む。

【請求項22】

ＣｐＧ部位の第１の独立セットが、第２の独立セットのＣｐＧ部位と重複しない、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

ＣｐＧ部位の第１の独立セットが、第２の独立セットのＣｐＧ部位と重複する、請求項２０に記載の方法。

【請求項24】

第１のパッチが、第２のパッチと同じ大きさであるが異なる参照ゲノムの部分を表す、請求項２０に記載の方法。

【請求項25】

第１のパッチが参照ゲノムの第１の部分を表し、第２のパッチが参照ゲノムの第２の部分を表し、第１の部分のサイズが第２の部分のサイズとは異なる、請求項２０記載の方法。

【請求項26】

請求項２４または２５記載の方法：
ＣｐＧ部位の第１の独立セットは第１の数のＣｐＧ部位から成り、第２の独立セットのＣｐＧ部位は第２の数のＣｐＧ部位から成り、第１の数のＣｐＧ部位は第２の数のＣｐＧ部位と同じである。

【請求項27】

請求項２４または２５記載の方法：
ＣｐＧ部位の第１の独立セットは第１の数のＣｐＧ部位から成り、第２の独立セットのＣｐＧ部位は第２の数のＣｐＧ部位から成り、第１の数のＣｐＧ部位は第２の数のＣｐＧ部位とは異なる。

【請求項28】

１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定が、ｉ）全ゲノムメチル化配列決定、またはｉｉ）複数の核酸プローブを用いる標的化ＤＮＡメチル化配列決定である、請求項１記載の方法。

【請求項29】

１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定が、複数の核酸プローブを使用し、かつ複数の核酸プローブが１００以上のプローブを含む、請求項２８記載の方法。

【請求項30】

１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定が、それぞれの断片中の１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍＣ）および／または５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出する、請求項１記載の方法。

【請求項31】

１つ以上の核酸サンプルのメチル化配列決定が、対応する１つ以上のウラシルへの、それぞれの断片における１つ以上の非メチル化シトシンまたは１つ以上のメチル化シトシンの変換を含む、請求項１記載の方法。

【請求項32】

１つまたは複数のウラシルが、１つまたは複数の対応するチミンとしてメチル化配列決定の間に検出される、請求項３１記載の方法。

【請求項33】

１つ以上の非メチル化シトシンまたは１つ以上のメチル化シトシンの変換が、化学変換、酵素変換、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３１記載の方法。

【請求項34】

請求項１記載の方法：
少なくとも１つのプログラムはさらに、第１のパッチを含む複数のパッチを構築するための指示を含み、それぞれのパッチは、参照ゲノム中の異なる独立したＣｐＧ部位のセットについてである；
構築Ｂ）第１パッチを含む複数のパッチを構築する；
分類器は、複数の訓練された第１段階モデルおよび第２段階モデルを含む；
少なくとも最初のパッチを分類器に適用すること：
複数の特徴要素を得る特徴ベクトルを含み、ここで、複数の特徴要素における各特徴要素は、対応する訓練された第一段階モデルへの複数のパッチにおけるそれぞれのパッチの適用時に、複数の訓練された第一段階モデルにおける対応する訓練された第一段階モデルの出力であり；そして、特徴ベクトルを第二段階モデルに適用することにより、被験体におけるがん状態を決定する、特徴ベクトルを有する、特徴ベクトルを有する。

【請求項35】

請求項３４記載の方法：
複数のトレーニングされた第一段階モデルにおけるそれぞれのトレーニングされた第一段階モデルは、対応するトレーニングされた回帰ニューラルネットワークであり、第二段階モデルはロジスティック回帰モデルである；そして、第一パッチの第一段階モデルの第一チャネルは、第一次元を形成する第一パッチの第一の複数のパラメータの各複数の例と、第二次元を形成する第一パッチの第一の複数のパラメータのそれぞれの例を有する二次元である。

【請求項36】

複数のパッチが、１０パッチから１００００パッチの間である、請求項３４記載の方法。

【請求項37】

複数のパッチが１００のパッチから３０００のパッチの間である、請求項３４記載の方法。

【請求項38】

請求項１記載の方法：
分類器は、複数の第一段階モデルおよび動的ニューラルネットワークを含む；
少なくとも１つのプログラムはさらに、第１のパッチを含む複数のパッチを構築するための指示を含み、それぞれのパッチは、参照ゲノム中の異なるセットのＣｐＧ部位についてである；
Ｂ）は、１枚目を含む各パッチを構成する；
少なくとも最初のパッチを分類Ｃ）に適用すること：
Ｃ１）前記複数のパッチにおける各それぞれのパッチを、前記複数の第１段階モデルにおける対応する第１段階モデルに適用するステップであって、前記対応する第１段階モデルが備える、ステップ：
ｉ）各々のパッチを受け取るための各々の入力層であって、ここで、各々のパッチは、最初の数の寸法を含む；
ｉｉ）それぞれの完全に連結された包埋層を含み、それぞれの完全に連結された包埋層が直接または間接的にそれぞれの入力層の出力を受け取り、かつそれぞれの包埋層のそれぞれの出力が第１次元数よりも小さい第２次元数である；およびｉｉｉ）それぞれの完全に連結された包埋層から出力を直接または間接的に受け取るそれぞれの出力層；およびＣ２）複数の第１段階モデルにおける各訓練された第１段階モデルのそれぞれの完全に連結された包埋層からのそれぞれの出力の集合を、動的ニューラルネットワークに入力し、それによって被験体における癌状態を決定する。

【請求項39】

前記複数の第１段階モデルにおける各々の第１段階モデルのそれぞれの埋め込み層のそれぞれの出力は、３２～１０４８の値のセットである、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

少なくとも１つのプログラムが、被験者のコホートを用いて、複数の第一段階モデルおよび動的ニューラルネットワークを訓練するための指示をさらに含んでおり、ここで、被験者のコホートは、がん状態についての第一のラベルを有する第一のサブセットの被験者、およびがん状態についての第二のラベルを有する第二のサブセットの被験者を含む、請求項３９記載の方法。

【請求項41】

訓練のための指示が、以下を含む、請求項４０に記載の方法：
ａ）ランダムにベースで、癌の状態、年齢、喫煙状態、または性別の任意の組合せに基づいて、対象のコホートを複数の群に層別化する；
ｂ）複数のモデルおよび動的ニューラルネットワークをトレーニング群に対してトレーニングするための試験群として、トレーニング群として、複数の群における第一の群、および複数の群の残りを使用する；
ｃ）ｂ）を用いて、ｂ）の反復において、複数の群の中の各群が訓練群として使用されるように、複数の群の中の各群について、ｂ）を用いて、ｄ）ａ）を繰り返し、ｂ）を用いて、ｃ）を繰り返して、分類器の性能基準が満たされるまで繰り返した。

【請求項42】

癌状態が起源の組織であり、被験者のコホートにおける各被験体が起源の組織で標識される、請求項４０または４１記載の方法。

【請求項43】

コホートが、肛門直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、肝胆道癌、子宮内膜癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ系新生物、黒色腫、多発性骨髄腫、骨髄性新生物、卵巣癌、非ホジキンリンパ腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、甲状腺癌、上部消化管癌、尿路上皮癌、または子宮癌を含む、請求項４２記載の方法。

【請求項44】

癌状態が特定癌の病期であり、被験者のコホートにおける各被験者が特定癌の病期で標識される、請求項４０記載の方法。

【請求項45】

コホートには、肛門直腸癌の病期、膀胱癌の病期、乳癌の病期、子宮頸癌の病期、大腸癌の病期、頭頸部癌の病期、肝胆道癌の病期、子宮内膜癌の病期、腎癌の病期、白血病の病期、肝癌の病期、肺癌の病期、リンパ系新生物の病期、黒色腫の病期、多発性骨髄腫の病期、骨髄系腫瘍の病期、卵巣癌の病期、非ホジキンリンパ腫の病期、膵癌の病期、前立腺癌の病期、腎癌の病期、甲状腺癌の病期、上部消化管癌の病期、尿路上皮癌の病期、または子宮癌の病期が含まれる、請求項４４記載の方法。

【請求項46】

癌の状態が、被験体が癌を有するか否かであり、層別化ａ）により、複数の群における各群が癌を有し、かつ癌を有さない被験体の数が等しいことを保証する、請求項４１記載の方法。

【請求項47】

トレーニングが、トレーニング中に、複数のパッチ中の各パッチのそれぞれの出力層によって提供される値に基づいて、Ｌ１またはＬ２正規化を用いて、複数のパッチ中の１つ以上のパッチを除去する、請求項４０～４６のいずれか一項記載の方法。

【請求項48】

最初の複数のパラメータの複数の例が２４から２０４８の間である、請求項１記載の方法。

【請求項49】

第１の複数のパラメータの複数の例における多数の例が、複数の断片の予想読み深さに加えて、複数の断片を横切る１つの標準偏差に基づいて決定される、請求項１記載の方法。

【請求項50】

構築物Ｂ）が、さらに、参照ゲノムにおけるそれぞれのｐ値またはそれらの開始位置に基づいて、第１パッチに割り当てられたそれぞれの断片を仕分けることを含む、請求項１記載の方法。

【請求項51】

少なくとも１つのプログラムが、複数の臨床被験体を含む臨床コホートから得られる複数の臨床核酸サンプルから得られる複数の臨床核酸サンプルのメチル化配列決定によって決定される複数のＣｐＧメチル化パターンの評価を通して、第１パッチの第１の独立したセットのＣｐＧ部位を選択するための指示をさらに含んでおり、ここで、複数の臨床被験体は、がん状態に対する第１の適応を有する第１のセットの臨床被験体と、がん状態に対する第２の適応を有する第２のセットの臨床被験体を含む、請求項１～５０のいずれか一項記載の方法。

【請求項52】

選択するための指示が、含む、請求項５１に記載の方法：
臨床被験者の第１セットと第２セットの臨床被験者間の複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態に関するそれぞれの第１の相互情報スコアに基づいて、参照ゲノム中の複数のＣｐＧ部位の第１の順位を決定すること；および順位付けを用いて、第１パッチのＣｐＧ部位の対応する独立セットに対する第１の閾値数のＣｐＧ部位を選択すること。

【請求項53】

請求項５１記載の方法：
複数の臨床被験体は、癌状態に対する第三の適応を有する第三の臨床被験体セット、および癌状態に対する第四の適応を有する第四の臨床被験体セットを含み、選択するための指示は、さらに以下を含む：
第３の臨床被験者セットと第４の臨床被験者セットとの間の複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態について、それぞれの第２の相互情報スコアに基づいて参照ゲノム中の複数のＣｐＧ部位の第２の順位を決定し；第２の順位を用いて、第１のパッチのＣｐＧ部位の第１の独立したセットについて、第２の閾値数のＣｐＧ部位を選択する。

【請求項54】

構築物Ｂ）が、さらに、それぞれの最初の相互情報スコアに基づいて、最初のパッチに割り当てられたそれぞれの断片を仕分けることを含む、請求項５２記載の方法。

【請求項55】

癌状態に対する第１の適応症が第１の癌タイプであり、癌状態に対する第２の適応症が第２の癌タイプである、請求項５１記載の方法。

【請求項56】

第１パッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットに対するＣｐＧ部位の第１閾値数における各ＣｐＧ部位が、ＣｐＧ部位の第１閾値数における全ての他のＣｐＧ部位からの参照ゲノム中に、閾値数の残基によりパッドされる、請求項５２記載の方法。

【請求項57】

選択するための指示がさらに含まれる、請求項５１に記載の方法：
臨床被験者の第１セットと臨床被験者の第２セットとの間の複数の固定長領域における各固定長領域のメチル化状態に関するそれぞれの第１の相互情報スコアに基づいて、参照ゲノム中の複数の固定長領域の第１のランキングを決定すること；および第１ランキングを用いて、複数の固定長領域におけるそれらの固定長領域の中から、第１のパッチの第１の独立したＣｐＧ部位の第１の閾値数のＣｐＧ部位を選択すること。

【請求項58】

請求項５７記載の方法：
複数の臨床被験体は、癌状態に対する第三の適応を有する第三の臨床被験体セット、および癌状態に対する第四の適応を有する第四の臨床被験体セットを含み、選択するための指示は、さらに以下を含む：
臨床被験者の第３セットと臨床被験者の第４セットとの間の複数の固定長領域における各固定長領域のＣｐＧ部位メチル化パターンのメチル化状態に関するそれぞれの第２の相互情報スコアに基づいて、参照ゲノム中の複数の固定長領域の第２のランキングを決定し；第２のランキングを用いて、第１パッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットに対する第２の閾値数のＣｐＧ部位を選択する。

【請求項59】

構築物Ｂ）が、さらに、それぞれの最初の相互情報スコアに基づいて、最初のパッチに割り当てられたそれぞれの断片を仕分けることを含む、請求項５７記載の方法。

【請求項60】

癌状態に対する第１の適応症が第１の癌タイプであり、癌状態に対する第２の適応症が第２の癌タイプである、請求項５７記載の方法。

【請求項61】

第１パッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットに対するＣｐＧ部位の第１閾値数における各ＣｐＧ部位が、ＣｐＧ部位の第１閾値数における全ての他のＣｐＧ部位からの参照ゲノム中に、閾値数の残基によりパッドされる、請求項５７記載の方法。

【請求項62】

１つ以上の核酸サンプルが無細胞核酸サンプルである、請求項１～６１のいずれか一項記載の方法。

【請求項63】

種の被験体の癌状態を決定するためのコンピュータシステムであって、構成されるコンピュータシステム：
少なくとも１つの処理装置、および
少なくとも１つのプロセッサによる実行のための少なくとも１つのプログラムを記憶するメモリであって、前記少なくとも１つのプログラムは、命令を含む、メモリ：
Ａ）データセットを得ることは、電子形態であり、ここで、データセットは、複数の断片においてそれぞれの断片の対応するメチル化パターンを含み、ここで、各断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）試験対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、そして（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態を含む；
Ｂ）第１のチャネルを含む第１のパッチを構築し、ここで、第１のパッチは、種の参照ゲノムにおける第１の独立したＣｐＧ部位のセット、参照ゲノムにおける所定の位置に対応する第１の独立したＣｐＧ部位のセットにおける各ＣｐＧ部位を表す：
第１の複数のパラメタの第１のチャネルの複数の例を含み、ここで、第１の複数のパラメタの各例は、第１のパッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含み、構築物Ｂ）は、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ各断片について、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ各断片、それぞれの断片のメチル化パターンに基づく第１の複数のパラメータの全部または一部の例を含む；およびＣ）少なくとも第１のパッチを分類器に適用し、それによって被験体における癌状態を決定することを含む。

【請求項64】

処理装置によって実行される場合、種の被験体の癌状態を決定する方法を処理装置に実行させる、方法を含む、プログラムコード指示に基づいて保存された、一過性でないコンピュータ読取可能な保存媒体：
Ａ）データセットを得ることは、電子形態であり、ここで、データセットは、複数の断片においてそれぞれの断片の対応するメチル化パターンを含み、ここで、各断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）試験対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、そして（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態を含む；
Ｂ）第１のチャネルを含む第１のパッチを構築し、ここで、第１のパッチは、種の参照ゲノムにおける第１の独立したＣｐＧ部位のセット、参照ゲノムにおける所定の位置に対応する第１の独立したＣｐＧ部位のセットにおける各ＣｐＧ部位を表す：
第１の複数のパラメタの第１のチャネルの複数の例を含み、ここで、第１の複数のパラメタの各例は、第１のパッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含み、構築物Ｂ）は、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ各断片について、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ各断片、それぞれの断片のメチル化パターンに基づく第１の複数のパラメータの全部または一部の例を含む；およびＣ）少なくとも第１のパッチを分類器に適用し、それによって被験体における癌状態を決定することを含む。

【請求項65】

種の被験体の癌状態を決定する方法であって、以下を含む方法：
Ａ）１つまたは複数の処理者を介して、１つまたは複数のトレーニング被験体からトレーニングデータセットを取得し、ここで、トレーニングデータセットは、１つまたは複数のトレーニング被験体から得られた１つまたは複数の生体試料中の複数の断片の１つまたは複数のトレーニングメチル化パターン、および１つまたは複数のトレーニングメチル化パターンに関連する１つまたは複数の所定のがん状態を含む；
Ｂ）１つ以上のプロセサーを介して、トレーニングデータセットに基づく１つ以上のパッチ、１つ以上のチャネルを含み、種の参照ゲノム中の１つ以上のＣｐＧ部位を表す１つ以上のパッチの各パッチ、参照ゲノム中の所定の位置に対応する１つ以上のＣｐＧ部位の各ＣｐＧ部位を構築する；
Ｃ）１つまたは複数の処理機を介したトレーニング、１つまたは複数のパッチおよびトレーニングデータセットに基づく計算モデル；
Ｄ）試験データセットが、試験被験体から得られた１つ以上の生体試料中の複数の断片の１つ以上の試験メチル化パターンを含む、１つ以上の処理者を介して、試験被験データセットを得ること；および；
Ｅ）検査データセットおよび計算モデルに基づいて、１つ以上の処理機を介して、被験体の癌状態を決定する。

【請求項66】

１つ以上のトレーニングメチル化パターン（ｉ）が、１つ以上のトレーニング被験体から得られた１つ以上の生体試料中の複数の断片を含む１つ以上の核酸試料の少なくとも１つのメチル化シークエンシングによって決定される；および（ｉｉ）１つ以上のトレーニング被験体から得られた１つ以上の生体試料中の複数の断片中の各ＣｐＧ部位の少なくとも１つのメチル化状態を含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

１つ以上の試験メチル化パターン（ｉ）が、被験体から得られる１つ以上の生体試料中の複数の断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）被験体から得られる１以上の生体試料中の複数の断片中の各ＣｐＧ部位の少なくとも１つのメチル化状態を含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項68】

計算モデルが、回帰ニューラルネットワークおよび第２段階モデルを含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項69】

工程Ｂに先立って、各断片のそれぞれに対応する複数のＣｐＧ部位を横切る対応するメチル化パターンがｐ値閾値を満たさないｐ値を有する、複数の断片から除去することにより複数の断片を剪定する工程をさらに含む、請求項６５記載の方法。

【請求項70】

健康な被験者のコホートから得られた１以上の生物学的試料からの核酸のメチル化配列決定によって得られた複数の参照断片に関連するメチル化パターンに基づいて、それぞれの断片のｐ値が決定される、請求項６９記載の方法。

【請求項71】

前記１つまたは複数のチャネルは、第１のチャネルを含み、前記第１のチャネルは、第１の複数のパラメータの複数のインスタンスを含み、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスは、前記１つまたは複数のパッチのパッチについてのＣｐＧ部位の第１の独立したセットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項72】

構築物Ｂ）が、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに整列する１つ以上のトレーニング被験体から得られる１つ以上の生物学的サンプルにおいて、各断片が複数の断片に集団を形成することを含み、それぞれの断片のトレーニングメチル化パターンに基づく第１の複数のパラメータの全部または一部のインスタンスを含む、請求項７１記載の方法。

【請求項73】

構築物Ｂ）が、複数の断片中のそれぞれの断片について、以下を含む、請求項７１に記載の方法：
ｉ）第１チャネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内で、複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が割り当てられていない、それぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを同定する；および、ｉｉ）同定されたパラメータの中で、それぞれの断片の対応するＣｐＧ部位、それぞれの断片の対応するＣｐＧ部位のメチル化状態に整列する、各パラメータについて割り当てる。

【請求項74】

１つ以上のチャネルが、第１の複数のパラメータの各インスタンスに対する第２の複数のパラメータの対応するインスタンスを含む第２のチャネルであって、第２の複数のパラメータの各インスタンスが、第１のパッチに対するＣｐＧ部位の第１の独立したセットにおける、ＣｐＧメチル化状態以外の第１の特性に対するパラメータを含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項75】

前記１つ以上のチャネルは、第３のチャネルを含み、前記第３のチャネルは、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスに対する第３の複数のパラメータの対応するインスタンスを含み、前記第３の複数のパラメータの各インスタンスは、ＣｐＧ部位の前記第１の独立したセット内のそれぞれのＣｐＧ部位の第２の特性に対するパラメータを含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴が、それぞれのＣｐＧ部位がオンである、それぞれの断片の多重度である、請求項７４記載の方法。

【請求項77】

それぞれのＣｐＧ部位の第１の特徴が少なくとも１つを含む、請求項７４に記載の方法：
健常コホートから導かれたＣｐＧβ値、試験対象から導かれた所定の組織型、５’および３’隣接ＣｐＧ部位のメチル化状態に対するピアソンの相関スコア、Ｊａｃｃａｒｄ距離、Ｍａｎｈａｔｔａｎ距離、正規化されたユークリッド距離、被験者のコホートにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態の最大値、ダイス係数、またはコシン係数、それぞれの断片の断片ｐ値、それぞれのＣｐＧ部位の断片マッピング品質スコア、参照ゲノムにおける５’隣接ＣｐＧ部位までの距離それぞれのＣｐＧ部位の多重性、それぞれのＣｐＧ部位が生物学的経路内にあるそれぞれのＣｐＧ部位は関連しており、それぞれのＣｐＧ部位が関連している遺伝子、それぞれのＣｐＧ部位に対するＣｐＧ遷移インパルス機能の値、それぞれのＣｐＧ部位に対するＣｐＧランレングスコード化の値、およびそれぞれのＣｐＧ部位がオンである断片のリードストランド配向である。

【請求項78】

請求項６５記載の方法であって、さらに、１つまたは複数の処理装置を介して、癌状態を、被験体のユーザ装置に関連する電子記録に送信することを含む方法。

【請求項79】

癌状態が、癌のレベル、起源の組織、および転移性疾患状態を含む、請求項６５記載の方法。

【請求項80】

脳回神経回路網が、あらかじめ訓練された脳回神経回路網である、請求項６８記載の方法。

【請求項81】

予め訓練された回旋神経回路網が、特注のＶＧＧ－１１回旋神経回路網を含み、ここで、特注のＶＧＧ－１１回旋神経回路網が、特注のフィルターサイズおよび活性化機能を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

１つ以上の生物学的プリアを用いて計算モデルを更新することをさらに含む、請求項６５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願への相互参照】

【0001】

本申請は、米国暫定特許出願第に優先順位を主張する。６２／９４８，１２９２０１９年１２月１３日付けで申請された「パッチコンボリューション・ニューラル・ネットワークを用いたがん分類」については、以下を参考にして取り入れている。

【技術分野】

【0002】

このような被験者からの遺伝子型情報を用いて、癌などの疾患状態の被験者を分類するパッチ回帰ニューラルネットワークを提供する。

【背景技術】

【0003】

がんの早期発見は、がんの転帰を改善する最も人間的な方法の１つである。現状の治療－固形腫瘍に対する手術、化学療法と放射線の併用、または液状腫瘍に対する化学療法と骨髄移植－には、生存率が不十分であるなどの欠点がある。治療はしばしば患者を痛みのままにし、一方で生存期間の不十分な量を提供する。新しい免疫療法にも欠点がある。患者は集中治療室で治療されなければならず、しばしば致死的な副作用がある。このような治療法はいずれも、がんが早期に発見されれば、より効果的である。

【0004】

しかし、現行のスクリーニング検査は満足のいくものではない。マンモグラフィー、大腸内視鏡検査、Ｐａｐスミアおよび前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の検査などのモニタリング法が数十年にわたって使用されてきたが、すべてが一様に成功しているわけではない。一部の病変は進行が非常に遅いため、患者は他の何かで死亡する可能性が高くなるが、危険な腫瘍の中には、治癒するには遅すぎる前に発見できないものもある。そのうえ、現在までのところ、肺癌に関して、とりわけ満足のいくスクリーニング検査は利用できない。

【0005】

本開示は、上記に引用されたこれらの課題の１つまたは複数に対処することを目的とする。ここに示された背景記述は、一般的に開示の状況を提示する目的のためである。本明細書中で特に指示されていない限り、本セクションに記載されている材料は、本出願におけるクレームに対する先行技術ではなく、本セクションに含めることにより、先行技術、または先行技術の提案であることは認められない。

【0006】

本開示は、被験者における癌の早期発見のためのツールを提供することによって、当該技術分野において上記に同定された問題に対処するものである。前述したように、早期がん発見は、より早期の治療を可能にし、そのため生存の可能性を高めることから重要である。その目的に向けて、本開示は、ｃｆＤＮＡ断片のＣｐＧ部位のメチル化状態を分析するためのシステムおよび方法を提供する。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片の配列決定および断片中のシトシンおよびグアニンの種々のジヌクレオチド（ＣｐＧ部位として知られる）のメチル化状態の分析は、被験体が癌を有するかどうかの洞察を提供することができる。

【0007】

本開示は、深層学習分類技術をメチル化フラグメントデータ、特に視覚分類技術に適用することによって、既存の分類技術よりも改良された特異性および感度を提供することができる。例えば、視覚問題に類似した深い学習問題としての再構成癌／非癌および起源組織メチル化断片分類は、顆粒状メチル化配列特徴および高次、交差領域特徴などのデータにおける非線形性に関する鍵情報を提供することができる。

【0008】

開示されたシステムおよび方法は、データファイルからのフラグメントデータよりも、特注で訓練されたパッチコンボリューショナル・ニューラル・ネットワーク（パッチ－ＣＮＮ）を、癌／非癌および組織起源分類に適用することができる。細かい断片配列データと領域局所性情報への可視性の両方をネットワークに提供するために、データをコード化し、直交軸に沿った積み上げ断片リードの第１軸と深さに沿ったＣｐＧ部位と追加チャンネルとしてコード化された補足データを有する２次元「画像」として表現することができる。ＣＮＮアーキテクチャは視覚や画像処理の分野で使用でき、データの広いセクションにわたって共通のパターンや特徴を学習することができる。開示されたシステムおよび方法において、隣接するＣｐＧ部位の位置的文脈を符号化し、異常な配列および断片を認識するためのモデル学習のための入力として使用される画像ピクセルに類似して表現することができる。同様に、ＣｐＧ部位の幅と読みの深さに関してより大きな領域ビューを提供することにより、共局在化した異常フラグメントにわたって高次の特徴を学習する能力をネットワークに提供することができる。

【0009】

主要な懸念領域には、入力された特徴の大きさを含むことができる。そのため、次元低減戦略を採用して、ネットワークトレーニングを実行可能にすることができる。深い学習アプリケーションの間に生じる一般的な障害には、問題を計算的に扱いやすいようにしながら、基礎となるデータ（例えば、フラグメントレベルと領域間の両方で）にできるだけ多くの情報を保存することの困難さが含まれる。例えば、ゲノム中または標的メチル化パネル中の全てのＣｐＧ部位を含む予測モデルは、それぞれ約２８Ｍまたは１ＭのＣｐＧ部位を含むことができる。約３０～１５００の読取深度を用いると、ネットワーク入力は迅速に１０億以上のパラメータに上昇できる。入力パラメータと比較したトレーニング例数のネットワークサイズ、深さ、計算の複雑さ、記憶制約および不均衡は、特に、最大２８ｘ２８画像または３０から５万入力の上で動作する従来のディープラーニングデータベースおよび大型画像分類器に対して、単純に難しいことができる。データをあらかじめフィルタリングし、集計し、ビンに入れてより粗い解像度にするという次元の縮小はあるものの、それらは分類に利用できる情報を減らすことができる。

【0010】

次元減少の１つの選択肢には、入力空間を、統合する前に独立に学習できるより扱いやすい、局在化した領域に細分化することが含まれる。これは、結果を統合する前に独立して領域を探索しようとする限局的で鋭い探索を行うことと同等になりうる。したがって、本開示において本明細書に記載されるように、ＣｐＧ部位のゲノムまたはパネルは、Ｐａｔｃｈ－ＣＮＮに使用するために管理可能な領域にセグメント化された大きな画像として表現され得、疾患予測をより扱いやすい問題に変換する。本開示は、さらに、安定かつ再現性のある分類のために、マトリックスなどのデータ構築物へのフラグメントデータのフレーム化および構造化のためのシステムおよび方法を提供することができる。

【0011】

このように、本開示は、メチル化シークエンシングデータ上の深いニューラルネット（例えば、Ｐａｔｃｈ－ＣＮＮ）を用いて、フラグメント、領域、およびサンプルレベルの分類のためのパフォーマンスゲインを改善するためのシステムおよび方法を提供することができる。さらに、本開示は、微細粒状メチル化配列特徴および粗粒状交差領域パターンを含む、異常なメチル化状態以外の粒状での特徴の評価を改善するためのシステムおよび方法を提供することができる。そのような応用は、予測（例えば、癌／非癌および起源組織）の性能の感度および特異性を改善する一方で、従来の分析ワークフローと比較して最も情報利得を提供する関心のあるＣｐＧ領域を同定することができる。

【0012】

したがって、本開示は、種の被験体の疾患状態を決定するための方法を提供することができる。本開示のそのような局面の１つにおいて、方法は、少なくとも１つの処理装置と、少なくとも１つの処理装置による実行のための少なくとも１つのプログラムを保存する記憶装置とを含むコンピュータシステムで実施される。少なくとも１つのプログラムは、データセットを得るための指示を、電子形態で含むことができ、ここで、データセットは、複数の断片中のそれぞれの断片の対応するメチル化パターンを含む。それぞれの断片の対応するメチル化パターンは、試験対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定することができ、それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態を含む。

【0013】

この局面において、少なくとも１つのプログラムは、第１のチャネルを含む第１のパッチを構築するための指示をさらに含む。最初のパッチは、種の参照ゲノムにおける最初の独立したＣｐＧ部位のセットを表すことができ、ＣｐＧ部位の最初の独立したセットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位は、参照ゲノムにおける所定の位置に対応する。第１のパッチの第１のチャネルは、第１の複数のパラメータの複数の例を含むことができる。最初の複数のパラメータの各インスタンスは、最初のパッチのＣｐＧ部位の最初の独立セットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含み得る。第１のパッチの構築は、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ複数の断片中の各断片について、それぞれの断片のメチル化パターンに基づく第１の複数のパラメータの全部または一部のインスタンスをポピュレーションすることを含むことができる。

【0014】

この局面において、少なくとも１つのプログラムは、分類器に少なくとも最初のパッチを適用するための指示をさらに含むことができ、それにより、被験体中の癌状態を決定する。

【0015】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプログラムは、データセットを得た後、および第１のパッチを構築する前に、複数の断片を剪定するための指示をさらに含む。複数の断片をそれぞれの断片から除去することにより、複数の断片を剪定することができ、その断片の対応する複数のＣｐＧ部位を横切る対応するメチル化パターンは、ｐ値閾値を満たさないｐ値を有する。それぞれの断片のｐ値は、それぞれの断片の対応する複数のＣｐＧ部位を有する対応する複数の参照断片における対応する複数のＣｐＧ部位のメチル化パターンの対応する分布に対するそれぞれの断片の対応するメチル化パターンの比較に基づいて決定することができる。対応する複数の参照断片における各参照断片のメチル化パターンは、１つ以上の共通の特性を有する被験体のコホート（例えば、健康な被験体のコホート、喫煙する健康な被験体のコホート、喫煙しない被験体のコホート、男性被験体のコホート、女性被験体のコホート、閾値年齢を超える被験体のコホート、特定の年齢範囲にある被験体のコホート、特定の遺伝子突然変異のセットを有する被験体のコホート、特定の人種の被験体のコホートなど）から得られる生物学的試料からの核酸のメチル化配列決定によって得ることができる。

【0016】

いくつかの実施形態において、第１のパッチは、第１のチャネルおよび第２のチャネルを含む複数のチャネルを含む。第二のチャネルは、第一の複数のパラメータの各インスタンスに対する第二の複数のパラメータの対応するインスタンスを含むことができる。第２の複数のパラメータの各インスタンスは、第１パッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位の第１の特徴、ＣｐＧメチル化状態以外のパラメータを含み得る。第１のパッチを構築することは、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ複数の断片中の各断片について、第１の複数のパラメータの全部または一部のインスタンス、およびそれぞれの断片のメチル化パターンに基づく第２の複数のパラメータの全部または一部のインスタンスを集団化することを含むことができる。

【0017】

いくつかの実施形態において、それぞれの断片のメチル化パターンは、第１パッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットにおける各ＣｐＧ部位を含まない。第１のパッチを構築することは、複数の断片中のそれぞれの断片について、それぞれの断片中に存在するＣｐＧ部位に対応する第１の複数のパラメータのインスタンス中のパラメータを集団化することを含むことができる。

【0018】

いくつかの実施形態において、第１のパッチを構築することは、複数の断片中のそれぞれの断片について、第１のチャネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内で、複数の断片中の別の断片に基づいて、以前にメチル化状態が割り当てられていないそれぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを同定することを含む。最初のパッチを構築することは、さらに、それぞれの断片の対応するＣｐＧ部位に整列する同定されたパラメータのうちの各パラメータについて、それぞれの断片の対応するＣｐＧ部位のメチル化状態を割り当てることを含むことができる。

【0019】

いくつかの実施形態において、複数の断片中のそれぞれの断片について、第１のパッチを構築することは、第１のチャネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内で、複数の断片中の別の断片に基づいて、以前にメチル化状態が割り当てられていないそれぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを同定することを含む。最初のパッチを構築することは、さらに、各フラグメントのそれぞれのＣｐＧ部位に整列する同定されたパラメータのうちの各パラメータについて、各フラグメントのそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態を割り当てることを含むことができる。第１のパッチを構築することは、さらに、特定されたパラメータの中で、第２の複数のパラメータの第２のパラメータにおいて、それぞれの断片のそれぞれのＣｐＧ部位、それぞれの断片のそれぞれのＣｐＧ部位の第１の特徴に整列する、第２の複数のパラメータの第２のパラメータを割り当てることを含むことができる。いくつかの実施形態において、それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、それぞれのＣｐＧ部位がオンであるそれぞれの断片の多重度である。いくつかの実施形態において、それぞれのＣｐＧ部位の第一の特徴は、本明細書中で記述される１つ以上の一般的な特徴、試験対象から引き出される１つ以上の一般的な特徴、５’および３’隣接ＣｐＧ部位のメチル化状態に対するピアソンの相関スコア、Ｊａｃｃａｒｄ距離、Ｍａｎｈａｔｔａｎ距離、正規化されたユークリッド距離、正規化された最大値、Ｄｉｃｅ係数、または癌コホートにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態のコホートまたは本明細書中で記述される１つ以上の一般的な特徴を有する対象のコホートから引き出されるＣｐＧβ値を含む、それぞれのＣｐＧ部位の断片ｐ値、それぞれの断片の長さは、断片源であるそれぞれのＣｐＧ部位の断片マッピングの質スコアが５まで参照ゲノム中の’隣接ＣｐＧ部位、参照ゲノム中の３’隣接ＣｐＧ部位までの距離、それぞれのＣｐＧ部位が上にあるそれぞれの断片の多重性、それぞれのＣｐＧ部位が内にある遺伝的要素、それぞれのＣｐＧ部位が関連している生物学的経路、それぞれのＣｐＧ部位が関連している遺伝子、それぞれのＣｐＧ部位に対するＣｐＧ遷移インパルス機能の値、それぞれのＣｐＧ部位をコードするＣｐＧランレングスの値、およびそれぞれのＣｐＧ部位が上にある断片のリードストランド配向。いくつかの実施形態において、複数の断片中の１つ以上の断片が、複数の断片が共通のＣｐＧ部位を持たないことを条件に、第１パッチにおける第１のチャネルの第１の複数のパラメータの単一インスタンスに割り当てられる。

【0020】

いくつかの実施形態において、最初の複数のパラメータのインスタンスにおけるパラメータはゼロで満たされる。いくつかの実施形態において、ＣｐＧ部位の第１の独立セットは、参照ゲノムのＣｐＧインデックスにある。いくつかのそのような実施形態において、参照ゲノムのＣｐＧインデックスは、第２のＣｐＧ部位と第１の独立したＣｐＧ部位セットに存在する第１のＣｐＧ部位と第３のＣｐＧ部位との間の参照ゲノムに位置する、第１の独立したＣｐＧ部位セットには存在しない第１のＣｐＧ部位を含む。

【0021】

いくつかの実施形態において、ＣｐＧ部位の第１の独立セットは、参照ゲノムのＣｐＧインデックスにおいて互いに隣接している第１のＣｐＧ部位および第２のＣｐＧ部位を含む。複数の断片中の第一の断片は、第一のＣｐＧ部位を含むことができるが、第二のＣｐＧ部位を含まない。複数の断片中の第２の断片は、第２のＣｐＧ部位を含むことができるが、第１のＣｐＧ部位を含まない。

【0022】

いくつかの実施形態において、第１の複数のパラメータの例におけるパラメータは、複数の断片中のそれぞれの断片について：メチル化配列決定によってそれぞれの断片中の対応するＣｐＧ部位がメチル化されていると決定された場合にメチル化される、それぞれの断片中の対応するＣｐＧ部位がメチル化されていないとメチル化配列決定によって決定された場合にメチル化されない、および／またはメチル化配列決定によってそれぞれの断片中の対応するＣｐＧ部位がメチル化または非メチル化であると決定された場合にメチル化される。

【0023】

いくつかの実施形態において、第１チャネルの第１の複数のパラメータの多数の例は、それぞれのフラグメントを割り当てられておらず、少なくとも１つのプログラムは、フラグメントを割り当てられていない第１チャネルの複数のパラメータの例におけるゼロ充填パラメータの指示をさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプログラムが、第１のチャネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内で、複数の断片中の別の断片に基づいて、以前にメチル化状態が割り当てられていないそれぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを同定することができない場合、少なくとも１つのプログラムは、それぞれの断片を廃棄するための指示をさらに含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプログラムが、第１パッチの第１のチャネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内で、複数の断片中の別の断片に基づいて、以前にメチル化状態が割り当てられていないそれぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを同定することができない場合、少なくとも１つのプログラムは、第１パッチの追加インスタンスを作成し、第１パッチの追加インスタンスにそれぞれの断片を割り当てるための指示をさらに含む。

【0024】

いくつかの実施形態において、複数のチャネルは少なくとも３つのチャネルを含む。第１の複数のチャネルにおける第３のチャネルは、第１の複数のパラメータの各インスタンスに対する第３の複数のパラメータの対応するインスタンスを含むことができる。第３の複数のパラメータの各インスタンスは、第１の独立したＣｐＧ部位セットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位の第２の特徴に関するパラメータを含み得る。第２の特徴は、本明細書中で記述される１つ以上の共通の特徴、試験対象から引き出される１つ以上の共通の特徴、試験対象におけるメチル化状態に対するピアソンの相関スコア、試験対象におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に対するＪａｃｃａｒｄ類似性、または本明細書中で記述される１つ以上の共通の特徴を有する対象のコホートから引き出されるＣｐＧβ値、それぞれの断片の断片のｐ値、それぞれのＣｐＧ部位の断片マッピング品質スコア、参照ゲノムにおける５’隣接ＣｐＧ部位までの距離、を含むことができる各ＣｐＧ部位の多重度それぞれのＣｐＧ部位がオンであり、それぞれのＣｐＧ部位が生物学的経路内であり、それぞれのＣｐＧ部位が関連しており、それぞれのＣｐＧ部位が関連している遺伝子、それぞれのＣｐＧ部位に対するＣｐＧ遷移インパルス機能の値、それぞれのＣｐＧ部位をコードするＣｐＧランレングスの値、およびそれぞれのＣｐＧ部位がオンである断片のリードストランド配向である。

【0025】

いくつかの実施形態において、ＣｐＧ部位の第１の独立セットは、参照ゲノム全体から引き出される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプログラムは、対応する第１のチャネルを含む第２のパッチを構築するための指示をさらに含む。２つ目のパッチは、その種の参照ゲノムにおける２つ目の独立したＣｐＧ部位のセットを表すことができる。ＣｐＧ部位の第２の独立セットにおける各々のＣｐＧ部位は、参照ゲノム中の所定の位置に対応することができる。第２のパッチの対応する第１のチャネルは、第１の複数のパラメータの対応する複数のインスタンスを含むことができる。第２のパッチの第１のチャネルの対応する第１の複数のパラメータの各インスタンスは、第２のパッチのＣｐＧ部位の第２の独立したセットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含むことができる。少なくとも１つのプログラムは、さらに、ＣｐＧ部位の第２の独立セットに並ぶ複数の断片中の各断片について、第２の断片のメチル化パターンに基づいて第２のパッチの第１の複数のパラメータのすべてまたは一部のインスタンスを、それぞれの断片のメチル化パターンに基づいて、第２のパッチを構築するための指示を含むことができる。指示は、さらに、第１および第２のパッチを分類器に適用することを含み、それにより、被験体中の癌状態を決定することができる。いくつかの実施形態において、第２パッチは、対応する第１チャネルを含む対応する複数のチャネルを含むことができる。第２パッチの対応する複数のチャネルにおける対応する第２のチャネルは、第１の複数のパラメータの各インスタンスに対する第２の複数のパラメータの対応するインスタンスを含むことができる。第２のパッチの第２の複数のパラメータの各インスタンスは、第２のパッチのＣｐＧ部位の第２の独立したセットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位の第１の特徴、ＣｐＧメチル化状態以外のパラメータを含み得る。ＣｐＧ部位の第２の独立セットに並ぶ複数の断片中のそれぞれの断片について、それをポピュレーションするための指示は、さらに、それぞれの断片のメチル化パターンに基づいて、第２のパッチの第２の複数のパラメータのインスタンスの全部または部分のインスタンスをポピュレーションすることができる。

【0026】

いくつかの実施形態において、第１の独立したＣｐＧ部位のセットは、第２の独立したＣｐＧ部位のセットと重複しない。いくつかの他のそのような実施形態において、第１の独立したＣｐＧ部位のセットは、第２の独立したＣｐＧ部位のセットと重複する。いくつかの実施形態において、第１のパッチは、第２のパッチと同じ大きさであるが異なる参照ゲノムの部分を表す。いくつかの他のそのような実施形態において、第１のパッチは参照ゲノムの第１の部分を表し、第２のパッチは参照ゲノムの第２の部分を表し、ここで、第１の部分のサイズは第２の部分のサイズとは異なる。いくつかの実施形態において、第１の独立したＣｐＧ部位のセットは第１の数のＣｐＧ部位を含み、第２の独立したＣｐＧ部位のセットは第２の数のＣｐＧ部位を含み、第１の数のＣｐＧ部位は第２の数のＣｐＧ部位と同じである。いくつかの他のそのような実施形態において、第１の独立したＣｐＧ部位のセットは第１の数のＣｐＧ部位を含み、第２の独立したＣｐＧ部位のセットは第２の数のＣｐＧ部位を含み、第１の数のＣｐＧ部位は第２の数のＣｐＧ部位とは異なる。

【0027】

いくつかの実施形態において、１以上の核酸試料のメチル化配列決定は、全ゲノムメチル化配列決定または複数の核酸プローブを用いる標的化ＤＮＡメチル化配列決定である。いくつかのそのような実施形態において、１以上の核酸試料のメチル化配列決定は、複数の核酸プローブを使用する。いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定は、１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍＣ）および／または５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）をそれぞれの断片中で検出する。本明細書に開示されているように、用語「メチル化」分析は、ヒドロキシメチル化を含むがこれに限定されない、メチル基を含む任意のタイプの修飾をカバーすることができる。

【0028】

いくつかの実施形態において、１以上の核酸試料のメチル化配列決定は、１以上の非メチル化シトシンまたは１以上のメチル化シトシンの、それぞれの断片における、対応する１以上のウラシルへの変換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のウラシルは、メチル化配列決定の間に１つまたは複数の対応するチミンとして検出される。いくつかの他のそのような実施形態において、１つ以上の非メチル化シトシンまたは１つ以上のメチル化シトシンの変換は、化学変換、酵素変換、またはそれらの組合せを含む。

【0029】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプログラムは、第１のパッチを含む複数のパッチを構築するための指示をさらに含んでおり、それぞれのパッチは、参照ゲノムにおける異なる独立したＣｐＧ部位のセットについてである。第１パッチを構築することは、さらに、第１パッチを含む複数のパッチを構築することを含むことができる。分類器は、１つ以上の訓練された第１段階モデル（例えば、すべてのパッチのための単一の第１段階モデル、またはそれぞれがパッチに対応する複数の訓練された第１段階モデル）と、第２段階モデルとを含むことができる。少なくとも最初のパッチを分類器に適用することは、複数の特徴要素を含む特徴ベクトルを得ることを含むことができる。複数の特徴要素における各特徴要素は、対応する訓練された第一段階モデルへの複数のパッチにおけるそれぞれのパッチの適用に際して、複数の訓練された第一段階モデルにおける対応する訓練された第一段階モデルの出力であり得る。指示は、さらに、第２段階モデルに特徴ベクトルを適用することを含み、それにより、被験体中の癌状態を決定することができる。いくつかの実施形態において、複数の訓練された第一段階モデルにおけるそれぞれの訓練された第一段階モデルは、対応する訓練された回帰ニューラルネットワークであり、第二段階モデルはロジスティック回帰モデルである。いくつかの実施形態において、第２段階モデルは、２値分類アルゴリズムまたは多項分類アルゴリズム（例えば、起源組織を分類するための）であり得る。いくつかの実施形態において、第２段階分類アルゴリズムは、勾配ブースティングアルゴリズム、決定木アルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、Ｋ近傍アルゴリズム、ガウスＮＢアルゴリズム、深部ニューラルネットワークアルゴリズム、またはそれらの任意の組合せに基づくことができる。

【0030】

第１パッチの第１チャネルは、第１次元を形成する第１パッチの第１の複数のパラメータの複数の例のそれぞれを有する２次元であり、第２次元を形成する第１パッチの第１の複数のパラメータの第１次元であることができる。いくつかの実施形態において、複数のパッチは、１０のパッチから１００００のパッチの間である。いくつかの他のそのような実施形態において、複数のパッチは、１００パッチから３０００パッチの間である。

【0031】

いくつかの実施形態において、分類器は、複数の第一段階モデルおよび動的ニューラルネットワークを含む。少なくとも１つのプログラムは、参照ゲノム中の異なるＣｐＧ部位のセットについてのそれぞれのパッチである、最初のパッチを含む複数のパッチを構築するための指示をさらに含むことができる。複数のパッチを構築すれば、最初のパッチを含むそれぞれのパッチを構築することができる。少なくとも第１のパッチを分類器に適用することは、複数の第１段階モデルにおいて、複数のパッチ中の各パッチを対応する第１段階モデルに適用することを含むことができる。対応する第１段階モデルは、それぞれのパッチを受け取るためのそれぞれの入力層を含むことができ、ここで、それぞれのパッチは最初の数の次元を含む。対応する第一段階モデルは、対応するウェイトのセットを含むそれぞれの完全に連結された包埋層をさらに含むことができる。それぞれの完全に連結された包埋層は、直接または間接的にそれぞれの入力層の出力を受け取ることができる。それぞれの埋め込み層のそれぞれの出力は、第１の寸法数よりも少ない第２の寸法数とすることができる。対応する第一段階モデルは、さらに、それぞれの完全に連結された包埋層から直接または間接的に出力を受け取る、それぞれの出力層を含むことができる。少なくとも第１のパッチを分類器に適用することは、さらに、複数の第１段階モデルにおける各訓練された第１段階モデルのそれぞれの完全に連結された包埋層からのそれぞれの出力の集合を、動的ニューラルネットワークに入力することを含み、それによって、被験体における癌状態を決定することができる。いくつかのそのような実施形態では、複数の第１段階モデルにおける各第１段階モデルのそれぞれの埋め込み層のそれぞれの出力は、３２～１０４８の値のセットを含むことができる。いくつかのさらなる実施形態において、少なくとも１つのプログラムは、被験者のコホートを用いて、複数の第一段階モデルおよび動的ニューラルネットワークを訓練するための指示をさらに含む。いくつかのそのような実施形態において、被験体のコホートは、がん状態についての第一の標識を有する第一の被験体サブセット、およびがん状態についての第二の標識を有する第二の被験体サブセットを含む。いくつかの実施形態において、単一の第一段階モデルは、サンプルのグループを横切ってサンプル当たり複数のパッチ上で訓練される（例えば、サンプルは、既知の癌状態を有する対象を訓練するグループから得られる）。

【0032】

次に、訓練された第一段階モデルを、未知の状態の被験体からの試験サンプルからのデータの配列決定に適用して、各パッチから特徴要素を抽出することができる。例えば、配列決定データは、トレーニングに使用される同じパッチのセットに従って処理することができる（例えば、パッチ５３０－１、パッチ５３０－２、全てパッチ５３０－Ｋを介する）。次に、単一の第一段階モデルを各パッチに適用することができる（例えば、図７Ａの訓練されたモデル１、訓練されたモデル２、・・・、および訓練されたモデルＫは、実際には同じ訓練されたモデルである）。これは、訓練対象のグループからの配列決定データを使用して、それぞれのパッチ（例えば、特徴要素１、特徴要素２、・・・および特徴要素Ｋ）から特徴および／または特徴要素を別々に抽出するためである。いくつかの実施形態において、混合アプローチをとることができる。特に、複数の第一段階モデルを訓練し、さらなるサンプルレベルの分類のための特徴および／または特徴要素を得るために使用することができる。例えば、複数のパッチを使用して、サンプルのグループを横切ってサンプル当たりの共通の第一段階モデルを訓練することができる（例えば、サンプルは既知の癌状態を有する被験者の訓練グループから得られる）。同じ共通の第一段階モデルを、被験体からの試料の配列決定データに基づいて対応するパッチに適用して、被験体から特徴および／または特徴要素を抽出することができる。他の実施形態では、単一の第一段階モデルは、サンプルの群を横切ってサンプル当たり単一のパッチで訓練される（例えば、サンプルは、既知の癌状態を有する対象を訓練する群から得られる）。例えば、データセットが１００００のサンプルを有する場合、サンプル当たり単一パッチについて訓練されたモデルは１００００回訓練され得る。次いで、特定の第１段階モデルを、被験体から特徴および／または特徴要素を抽出するために、被験体からの対応するパッチに適用することができる。次に、この特定の被験体について検査される全てのパッチからの特徴および／または特徴要素を、サンプルレベル分類を行うために使用することができる。例えば、図７Ａに図示されているように、図７Ａの訓練されたモデル１と訓練されたモデル２は同じであり得るが、訓練されたモデルＫはパッチ５３０－Ｋに特異的であり得る）。共有モデルはパッチ５３０－１および５３０－２から特徴要素を抽出するのに使用でき、個別モデルはパッチ５３０－Ｋから特徴要素を抽出するのに使用できる。訓練される第一段階モデルの数にかかわらず、分類のために同じ数の特徴要素を標本レベル分類器に提示することができる。

【0033】

いくつかのさらなる実施形態において、トレーニングのための指示は、被験者のコホートを、癌の状態、年齢、喫煙状態、または性別の任意の組み合わせに基づいて、複数のグループに無作為に層別化することを含む。トレーニングのための指示は、さらに、複数のモデルおよび動的ニューラルネットワークをトレーニング群に対してトレーニングするための試験群として、複数の群の中の第一の群をトレーニング群として、および複数の群の残りを使用することを含むことができる。訓練のための指示は、さらに、複数の群の中の各群が反復において訓練群として使用されるように、訓練群および試験群のための群を、複数の群の中の各群について使用することを繰り返すことを含むことができる。訓練のための指示は、さらに、分類器の性能基準が満たされるまで、層別化、グループを使用すること、および反復を繰り返すことを含むことができる。いくつかのさらなる実施形態において、癌状態は組織起源であり、被験者のコホートにおける各被験体は、起源の組織で標識される。いくつかのさらなる実施形態において、コホートは、直腸肛門癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、肝胆道癌、子宮内膜癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ性新生物、黒色腫、多発性骨髄腫、骨髄性新生物、卵巣癌、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、甲状腺癌、上部消化管癌、尿路上皮癌、または子宮癌を有する被験体を含む。

【0034】

いくつかのさらなる実施形態において、癌状態は、肛門直腸癌の段階、膀胱癌の段階、乳癌の段階、子宮頸癌の段階、結腸直腸癌の段階、結腸直腸癌の段階、頭頸部癌の段階、肝胆道癌の段階、子宮内膜癌の段階、腎臓癌の段階、白血病の段階、肝臓癌の段階、肺癌の段階、リンパ系新生物の段階、メラノーマの段階、多発性骨髄腫の段階、骨髄性新生物の段階、卵巣癌の段階、非ホジキンリンパ腫の段階、膵臓癌の段階、前立腺癌の段階、腎臓癌の段階、甲状腺癌の段階、上部消化管癌の段階、尿路上皮癌の段階、または子宮癌の段階である。そのような実施形態のいくつかでは、がんの状態は、被験体ががんを有するか否かであり、被験体のコホートを層別化することにより、複数のグループにおける各グループが、がんを有し、かつがんを有さない被験体の数が等しいことを保証する。

【0035】

いくつかのこのような実施形態において、トレーニングは、トレーニング中に、複数のパッチ中の各パッチのそれぞれの出力層によって提供される値に基づいて、Ｌ１またはＬ２規則化を用いて、複数のパッチ中の１つ以上のパッチを除去する。いくつかの実施形態において、最初の複数のパラメータの複数の例は、２４から２０４８の間である。いくつかの実施形態において、第１の複数のパラメータの複数の例における多数の例は、複数の断片の予想読取り深さに加えて、複数の断片を横切る１つの標準偏差に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、構築パッチは、それぞれのｐ値または参照ゲノムにおけるそれらの開始位置に基づいて、第１パッチに割り当てられたそれぞれの断片をさらに仕分けることを含む。

【0036】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプログラムは、複数のＣｐＧメチル化パターンの評価を通して、第１パッチの第１の独立したＣｐＧ部位の第１のセットを選択するための指示をさらに含む。複数のＣｐＧメチル化パターンは、複数の臨床被験体を含む臨床コホートから得られた複数の臨床生物学的試料の複数の臨床核酸試料から得られた複数の臨床断片のメチル化配列決定によって決定することができる。複数の臨床被験体は、癌状態に対する第１の適応を有する第１のセットの臨床被験体、および癌状態に対する第２の適応を有する第２のセットの臨床被験体を含むことができる。

【0037】

いくつかのそのような実施形態において、ＣｐＧ部位のセットを選択するための指示は、臨床被験者の第１セットと第２セットの臨床被験者の間の複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態についてのそれぞれの第１の相互情報スコアに基づいて、参照ゲノム中の複数のＣｐＧ部位の第１の順位を決定することを含む。指示書は、ランキングを用いて、最初のパッチについて、対応する独立したＣｐＧ部位のセットについて、第１の閾値数のＣｐＧ部位を選択することをさらに含むことができる。いくつかのさらなる実施形態において、複数の臨床被験体は、癌状態に対する第３の適応を有する第３の臨床被験体セット、および癌状態に対する第４の適応を有する第４の臨床被験体セットを含む。いくつかのこのような実施形態において、選択するための指示は、さらに、臨床被験者の第３のセットと臨床被験者の第４のセットとの間の、複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態について、それぞれの第２の相互情報スコアに基づいて、参照ゲノム中の複数のＣｐＧ部位の第２の順位を決定することを含む。指示書は、第２ランキングを使用して、第１パッチの第１の独立したＣｐＧ部位の第１のセットについて、第２の閾値数のＣｐＧ部位を選択することをさらに含むことができる。いくつかのそのような実施形態において、パッチを構築することは、さらに、それぞれの第１または第２の相互情報スコアに基づいて、第１のパッチに割り当てられたそれぞれの断片を仕分けることを含む。いくつかのそのような実施形態において、癌状態に対する第１の適応は第１の癌タイプであり、癌状態に対する第２の適応は第２の癌タイプである。いくつかのそのような実施形態において、第一パッチの第一の独立したＣｐＧ部位の第一のセットについてのＣｐＧ部位の第一閾値数における各ＣｐＧ部位は、閾値数の残基によるＣｐＧ部位の第一の閾値数における全ての他のＣｐＧ部位からの参照ゲノム中にパッドされる。

【0038】

いくつかのそのような実施形態において、ＣｐＧ部位のセットを選択するための指示は、さらに、臨床被験者の第１セットと臨床被験者の第２セットとの間の複数の固定長領域における各固定長領域のＣｐＧ部位メチル化パターンのメチル化状態に関するそれぞれの第１の相互情報スコアに基づいて、参照ゲノム中の複数の固定長領域の第１ランキングを決定することを含む。選択するための指示は、第１のランキングを用いて、複数の固定長領域におけるそれらの固定長領域から、第１のパッチの第１の独立したＣｐＧ部位の第１の閾値数のＣｐＧ部位を選択することをさらに含むことができる。いくつかのさらなる実施形態において、複数の臨床被験体は、癌状態に対する第３の適応を有する第３の臨床被験体セット、および癌状態に対する第４の適応を有する第４の臨床被験体セットを含む。選択するための指示は、さらに、臨床被験体の第３のセットと臨床被験体の第４のセットとの間の、複数の固定長領域における各固定長領域のＣｐＧ部位メチル化パターンのメチル化状態に関するそれぞれの第２の相互情報スコアに基づいて、参照ゲノム中の複数の固定長領域の第２の順位を決定することを含むことができる。選択のための指示は、さらに、第２のランキングを用いて、第１のパッチの第１の独立したＣｐＧ部位のセットについて、第２の閾値数のＣｐＧ部位を選択することを含むことができる。いくつかのそのような実施形態において、パッチを構築することは、さらに、それぞれの第１または第２の相互情報スコアに基づいて、第１のパッチに割り当てられたそれぞれの断片を仕分けることを含む。いくつかの実施形態において、１以上の核酸試料は無細胞核酸試料である。

【0039】

本開示の別の局面は、種の被験体の癌状態を決定するためのコンピュータシステムを提供する。本明細書に開示されたいずれの方法も、癌状態以外の疾患状態（例えば、遺伝性障害）を決定するために使用することができる。この態様では、コンピュータシステムは、少なくとも１つのプロセッサと、少なくとも１つのプロセッサによる実行のための少なくとも１つのプログラムを記憶するメモリとを備える。少なくとも１つのプログラムは、電子形式でデータセットを取得するための指示を含むことができる。データセットは、複数の断片におけるそれぞれの断片の対応するメチル化パターンを含むことができる。それぞれの断片の対応するメチル化パターンは、試験対象から得られた生物学的試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定することができ、それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位中のそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態を含む。この局面において、少なくとも１つのプログラムは、第１のチャネルを含む第１のパッチを構築するための指示をさらに含む。最初のパッチは、その種の参照ゲノムにおける最初の独立したＣｐＧ部位のセットを表すことができる。ＣｐＧ部位の最初の独立セットにおける各々のＣｐＧ部位は、参照ゲノム中の所定の位置に対応することができる。第１のパッチの第１のチャネルは、第１の複数のパラメータの複数のインスタンスを含むことができ、第１の複数のパラメータの各インスタンスは、第１のパッチのＣｐＧ部位の第１の独立したセットにおける、それぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含む。第１のパッチを構築することは、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ複数の断片中の各断片について、それぞれの断片のメチル化パターンに基づく第１の複数のパラメータの全部または一部のインスタンスをポピュレーションすることを含むことができる。この局面において、少なくとも１つのプログラムは、少なくとも最初のパッチを分類器に適用するための指示をさらに含み、それにより、被験体中の癌状態を決定する。

【0040】

本開示の別の局面は、コード指示を保存するプログラムを非一過性のコンピュータ読取可能な保存媒体を提供し、それは、処理装置によって実行される場合、種の被験体の癌状態を決定する方法を処理装置に引き起こす。この方法は、電子形式でデータセットを得ることを含むことができる。データセットは、複数の断片におけるそれぞれの断片の対応するメチル化パターンを含むことができる。それぞれの断片の対応するメチル化パターンは、試験対象から得られた生物学的試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定することができ、それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位中のそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態を含む。この局面において、この方法は、第一のチャネルを含む第一のパッチをさらに構築することを含む。最初のパッチは、その種の参照ゲノムにおける最初の独立したＣｐＧ部位のセットを表すことができる。ＣｐＧ部位の最初の独立セットにおける各々のＣｐＧ部位は、参照ゲノム中の所定の位置に対応することができる。第１のパッチの第１のチャネルは、第１の複数のパラメータの複数のインスタンスを含むことができ、第１の複数のパラメータの各インスタンスは、第１のパッチのＣｐＧ部位の第１の独立したセットにおける、それぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含む。第１のパッチを構築することは、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ複数の断片中の各断片について、それぞれの断片のメチル化パターンに基づく第１の複数のパラメータの全部または一部のインスタンスをポピュレーションすることを含むことができる。この局面において、この方法はさらに、分類器に少なくとも第１のパッチを適用することを含み、それにより、被験体における癌状態を決定する。

【0041】

本開示の別の局面は、種の被験体の癌状態を決定する方法を提供する。この態様では、本方法は、少なくとも１つのプロセッサと、前記少なくとも１つのプロセッサによって実行されるための少なくとも１つのプログラムを記憶するメモリと、を備えるコンピュータシステムが提供される。少なくとも１つのプログラムは、電子形態でデータセットを得るための指示を含むことができ、ここで、データセットは、複数の断片におけるそれぞれの断片の対応するメチル化パターンを含む。それぞれの断片の対応するメチル化パターンは、試験対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片の１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定することができ、それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態を含むことができる。

【0042】

この局面において、少なくとも１つのプログラムは、複数のパッチを得るための指示をさらに含み、ここで、複数のパッチにおけるそれぞれのパッチは、第１のチャネルを含み、種の参照ゲノムにおける対応する独立したＣｐＧ部位のセットを表す。ＣｐＧ部位の対応する独立セット中の各ＣｐＧ部位は、参照ゲノム中の所定の位置に対応することができる。それぞれのパッチの第一のチャネルは、第一の複数のパラメータの複数の例を含むことができ、ここで、第一の複数のパラメータの各例は、それぞれのパッチに対するＣｐＧ部位の対応する独立セットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含む。

【0043】

この局面において、少なくとも１つのプログラムは、それぞれの断片のＣｐＧ部位と単一のそれぞれのパッチのＣｐＧ部位の対応する独立セットとの一致に基づいて、複数の断片中のそれぞれの断片のすべてまたは一部を、複数のパッチ中のそれぞれのパッチに割り当てるための指示をさらに含むことができる。この局面において、少なくとも１つのプログラムは、さらに、複数のモデルにおいて対応する訓練されたモデルに、複数のパッチ中の各パッチを適用するための指示を含み、それにより、被験体中の癌状態を決定する。

【0044】

本開示の別の局面は、少なくとも１つの処理装置および少なくとも１つの処理装置による実行のための少なくとも１つのプログラムを保存する記憶を含む種の被験体の癌状態を決定するためのコンピュータシステムを提供する。少なくとも１つのプログラムは、データセットを得るための指示を含むことができ、ここで、データセットは、複数の断片においてそれぞれの断片の対応するメチル化パターンを含む。それぞれの断片の対応するメチル化パターンは、試験対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片の１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定することができ、それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態を含むことができる。この局面において、少なくとも１つのプログラムはさらに、複数のパッチを得るための指示を含むことができ、ここで、複数のパッチ中の各パッチは、第１のチャネルを含み、種の参照ゲノム中の対応する独立したＣｐＧ部位のセットを表す。ＣｐＧ部位の対応する独立セット中の各ＣｐＧ部位は、参照ゲノム中の所定の位置に対応することができ、そして、それぞれのパッチの第１のチャネルは、第１の複数のパラメータの複数の例を含むことができる。最初の複数のパラメータの各インスタンスは、それぞれのパッチに対するＣｐＧ部位の対応する独立セットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含むことができる。

【0045】

この局面において、少なくとも１つのプログラムは、それぞれの断片のＣｐＧ部位と単一のそれぞれのパッチのＣｐＧ部位の対応する独立セットとの一致に基づいて、複数の断片中のそれぞれの断片のすべてまたは一部を、複数のパッチ中のそれぞれのパッチに割り当てることをさらに含むことができる。この局面において、少なくとも１つのプログラムは、さらに、複数のモデルにおいて対応する訓練されたモデルに、複数のパッチ内の各パッチを適用することを含み、それにより、被験体における癌状態を決定する。

【0046】

本開示の別の局面は、コード指示を保存するプログラムを非一過性のコンピュータ読取可能な保存媒体を提供し、それは、処理装置によって実行される場合、種の被験体の癌状態を決定する方法を処理装置に引き起こす。この方法は、データセットを電子形式で得ることを含むことができ、そこでは、データセットは、複数の断片においてそれぞれの断片の対応するメチル化パターンを含む。それぞれの断片の対応するメチル化パターンは、試験対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片の１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定することができ、それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態を含む。

【0047】

この局面において、この方法はさらに、複数のパッチを得ることを含み、ここで、複数のパッチにおけるそれぞれのパッチは、第一のチャネルを含み、そして種の参照ゲノムにおける対応する独立したＣｐＧ部位のセットを表す。ＣｐＧ部位の対応する独立セット中の各ＣｐＧ部位は、参照ゲノム中の所定の位置に対応することができる。それぞれのパッチの第一のチャネルは、第一の複数のパラメータの複数のインスタンスを含み得、第一の複数のパラメータの各インスタンスは、それぞれのパッチのＣｐＧ部位の対応する独立セットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含むことができる。

【0048】

この局面において、この方法は、さらに、それぞれの断片のＣｐＧ部位と単一のそれぞれのパッチのＣｐＧ部位の対応する独立セットとの一致に基づいて、複数の断片中のそれぞれの断片のすべてまたは一部を、複数のパッチ中のそれぞれのパッチに割り当てることを含む。この局面において、この方法は、さらに、複数のモデルにおいて対応する訓練されたモデルに、複数のパッチ中のそれぞれのパッチを適用することを含み、それにより、被験体におけるがん状態を決定する。

【0049】

別の局面において、種の被験体のがん状態を決定する方法は、１つ以上のトレーニング被験体から１つ以上のトレーニングデータセットを得ること、トレーニングデータセットは、１つ以上のトレーニング被験体から１つ以上のトレーニング被験体中の複数のトレーニングメチル化パターン、および１つ以上のトレーニングメチル化パターンに関連する１つ以上の所定のがん状態から得られる１つ以上のトレーニングメチル化パターン、および１つ以上のトレーニングメチル化パターンに関連する１つ以上の所定のがん状態から得られる１つ以上のトレーニングメチル化パターン、トレーニングデータセットを経て、トレーニングデータセットを構築すること、トレーニングデータセットを構築すること、トレーニングデータセットは、１つ以上のプロセスを経て、トレーニングデータセットに基づく１つ以上のパッチ、トレーニングデータセットを構築すること、１つ以上のプロセスを経て、１つ以上のチャネルを経て、１つ以上のパッチ、およびトレーニングデータセットが１つ以上の被験体からのテストデータセットを含む被験体から得られた１以上の生物学的試料において複数の断片のメチル化パターンを試験すること；および１以上の処理器を介して、試験データセットおよび計算モデルに基づいて、被験体のがん状態を決定すること。

【0050】

他の実施形態は、本明細書に記載される方法に関連するシステム、携帯消費者装置、およびコンピュータ可読媒体に向けられる。本明細書に開示されているように、適用可能な場合に本明細書に開示される任意の実施形態を任意の局面に適用することができる。

【0051】

本開示のさらなる局面および利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示され、記載される以下の詳細な記述から、当業者に容易に明らかになるであろう。実現されるであろうが、本開示は、他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全て開示から逸脱することなく、様々な明白な点で改変することが可能である。よって、図面は実際の説明のためのものであり、限定するものではない。

【参考品混入】

【0052】

ここに記載されているすべての出版物、特許、特許申請は、その全体の中に参考文献によって組み込まれている。ここに記載する用語と組み込まれた参考文献中の用語との間に対立が生じた場合、ここに記載する用語は制御する。

【図面の簡単な説明】

【0053】

ここに開示された実装は、例によって示されており、限定的なものではないが、添付図の図に示されている。同様の参照番号は、図面のいくつかの図の全体を通じて対応する部分を指す。

【図1】本開示の１以上の実施形態によれば、メチル化状態ベクターを得るために無細胞（ｃｆ）ＤＮＡの断片を配列決定するプロセスを記述する例示的なフローチャートである。

【図2】本開示の１以上の実施形態による、メチル化状態ベクターを得るためにｃｆＤＮＡの断片を配列決定する、図１のプロセスの例である。

【図3】本開示の１以上の実施形態による、ｐ値に基づく複数の断片からそれぞれの断片を除去する例示的な方法を例示する。

【図4】本開示の１以上の実施形態による、分類子を含む例示的なメチル化パターンパイプラインを例示する。

【図5A】本開示の１以上の実施形態による、種の被験体の疾患状態を決定するための例示的なシステムを例示する。

【図5B】本開示の１以上の実施形態による、種の被験体の疾患状態を決定するための例示的な処理システムを例示する。

【図6】図６Ａ～図６Ｎは、本開示の１以上の実施形態による例示的なパッチを例示する。

【図7】図７Ａおよび図７Ｂは、本開示の１以上の実施形態による例示的なパッチ分類子を例示する。

【図8】図８Ａおよび図８Ｂは、本開示の１以上の実施形態による種の被験体の癌状態を決定するための例示的な方法を提供する。

【図9A】本開示の１以上の実施形態による、パッチＣＮＮ分類子に使用される例示的ゲノム領域を例示する。

【図9B】本開示の１以上の実施形態による、パッチＣＮＮ分類子において使用される例示的な癌タイプを例示する。

【図9C】本開示の１以上の実施形態による、パッチＣＮＮ分類器の性能の例を示す。

【図10A】本開示の１以上の実施形態によれば、癌を検出するための９９％の特異性（全ての癌タイプおよびステージにわたって）において５３％の感度（正確度）が達成されたデータセットを用いたパッチＣＮＮ分類器の性能の例を示す。

【図10B】全ての癌タイプにわたるバイナリー設定におけるパッチＣＮＮ分類器の感度の例を示しており、この場合、分類器はｃｆＤＮＡ試料のＣＣＧＡ１トレーニングに関して、９８％の特異度で８８．００％の感度、９９％の特異度で７４．３６％の感度、および９９．５％の特異度で４４．２３％の感度を示す。

【図11】各パッチから包埋値（アクティベーション）を取得し、Ｉｓｏｍａｐクラスタリングを用いてそれらをクラスタリングする例を例示し、異なる癌標識がＩｓｏｍａｐの異なる領域にクラスタリングすることを示し、包埋値が本開示の１つまたは複数の実施形態に従って癌タイプを識別することを示す。

【図12】本開示の１以上の実施形態による、サンプルの集合にわたる分類器の５４４パッチの包埋層の活性化の頻度の例を示す。

【図13】本開示の１以上の実施形態による、サンプルの集合にわたる分類器の上位６つの活性化されたパッチの包埋値（活性化）のｔ－ＳＮＥクラスタリングの例を例示する。図は右端のパッチだけで、いくつかの異なる癌種を識別できることを示している。

【図14】本開示の１以上の実施形態による、サンプルの集合を横切る分類器の上位３つの活性化されたパッチの包埋値（活性化）のｔ－ＳＮＥクラスタリングの例を例示する。

【図15】本開示の１以上の実施形態による、パッチ－ＣＮＮアーキテクチャを用いた分類性能の例示的な結果を例示する。

【図16】各ドットがＣＣＧＡ２からの被験体を表し、分類器が被験体がｙ軸上で指定された癌のタイプを有する確率を提供する、本開示の１以上の実施形態による高信号癌タイプによるパッチベースの分類器の性能の例を例示する。

【図17A】図に例示される各癌タイプの被験体を含む被験体のコホートにおける全４段階にわたってＴＯＯ精度の８０％超を示す、本開示の１以上の実施形態による分類器のための組織のための例示的な混乱マトリックス分析を例示する。不確定状態のサンプルを分析に含める。

【図17B】図に例示される各癌タイプの被験体を含む被験体のコホートにおける全４段階にわたるＴＯＯ正確度のほぼ９０％を示す、本開示の１以上の実施形態による分類器のための組織のための別の例示的な混乱マトリックス分析を例示する。不確定状態のサンプルは分析から除外する。

【図18】本開示の１以上の実施形態によるメチル化パターンに対するｐ値の例示的な計算を例示する。

【図19】本開示の１以上の実施形態によれば、被験体の疾患状態を決定するようにプログラムされているかまたは他の方法で構成されている例示的なコンピュータシステム１９０１を例示する。

【詳細な記述】

【0054】

ここでは、その例を添付の図に図示した実施形態について詳しく言及する。以下の詳細な説明では、本開示に関する十分な理解を提供するために、多数の具体的な詳細が示されている。しかしながら、本開示がこれらの具体的な詳細なしに実施され得ることは、当業者には明らかであろう。他の例では、周知の方法、手順、構成要素、回路、およびネットワークは、実施形態の局面を不必要に不明瞭にしないように詳細に記載されていない。

【0055】

Ｉ．概要

【0056】

標的メチル化アッセイは、生物学的試料の分類のためのコンピュータ処理可能なシステムおよび方法の基礎を提供することができる。例えば、メチル化配列決定（例えば、約２８００万のＣｐＧ部位）を用いて、限定されたサブセットのＤＮＡ配列決定塩基読取り（例えば、ヒト細胞において約３０億）を得ることができる。このようなＣｐＧ部位は、特定の機能を調整する、または生物学的試料中の細胞を特殊化させる（例えば、とりわけ、脳細胞、肺細胞、腎臓細胞、および／または皮膚細胞）バイナリー「スイッチ」として機能し得る。メチル化基の調節は、癌の検出のための分子マーカーとしてさらに特徴づけることができる。さらに、ＣｐＧ部位は細胞の特殊化に役割を果たしているので、それらのメチル化パターンは特定の細胞サンプルおよび／またはＤＮＡ断片の起源（例えば起源の組織）を予測するために用いることができる。したがって、ＣｐＧ部位の使用は、生物学的試料の分類および特徴付けのためのＤＮＡ塩基読取りよりも明確な利点を提供することができる。

【0057】

核酸試料のメチル化配列決定およびパッチ回帰ニューラルネットワークを用いて、被験体の癌状態を検出および分類するためのシステムおよび方法を提供することができる。メチル化配列決定によって決定された断片のメチル化パターンを含むデータセットを得ることができ、ここで、メチル化パターンは、それぞれの断片中の複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態を含む。最初のパッチは、データセットに基づいて構成できる。第１のパッチは、被験体種の参照ゲノムにおけるＣｐＧ部位の第１の独立セットを表すことができ、それぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態についての第１の複数のパラメータの複数の例を含む第１のチャネルを含む。第１のパッチは、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ各々の断片について、断片のメチル化パターンに基づく第１の複数のパラメータの全部または一部のインスタンスをポピュレーションすることによって構築することができる。被験者における癌の状態は、少なくとも最初のパッチを分類器に適用することによって決定することができる。被験体由来のＣｆＤＮＡ断片を処理して、非メチル化シトシンをウラシルに変換し、配列決定し、配列リードを参照ゲノムと比較して、断片内の１以上のＣｐＧ部位におけるメチル化状態を同定することができる。異常にメチル化されたｃｆＤＮＡ断片の同定は、健常被験体と比較して、被験体の癌状態に対する洞察を提供することができる。ＤＮＡメチル化異常は（健常対照者と比較して）異なる影響を引き起こす可能性があり、これががんの一因となっている可能性がある。異常にメチル化されたｃｆＤＮＡ断片の同定には様々な課題が生じうる。第一に、異常にメチル化される１つ以上のｃｆＤＮＡ断片を決定することは、正常にメチル化されていると想定される断片を有する対照被験体群と比較して、重量を保持することができる。さらに、対照被験体群の中で、メチル化状態は変化し得るので、被験体のｃｆＤＮＡが異常にメチル化されているかどうかを評価する際には、これを説明することが困難であり得る。また、ＣｐＧ部位におけるシトシンのメチル化は、後続のＣｐＧ部位におけるメチル化に因果的に影響を及ぼしうる。

【0058】

シトシン塩基のピリミジン環の水素原子がメチル基に変換され、５メチルシトシンが生成すると、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でメチル化が起こりうる。特に、メチル化は、シトシンおよびグアニンのジヌクレオチドにおいて、本明細書で「ＣｐＧ部位」と称されることがある。メチル化は、まれではあるが、ＣｐＧ部位の一部ではないシトシンにおいて、またはシトシンではない別のヌクレオチドにおいて起こり得る。異常なｃｆＤＮＡ断片のメチル化は、さらに、高メチル化または低メチル化として同定されることがあり、その両方が癌の状態を示すことがある。

【0059】

ここに記載の原理は、非シトシンメチル化を含む非ＣｐＧ文脈におけるメチル化の検出に等しく適用可能である。メチル化を検出するために使用されるウェットラボアッセイは、本明細書に記載されているものとは異なる可能性がある。さらに、メチル化状態ベクターは、（それらの部位がＣｐＧ部位でなくても、特異的に）メチル化が起こっているか起こっていない部位のベクターである一般的なエレメントを含み得る。その置換により、本明細書に記載されているプロセスの残りは同じであり得、その結果として、本明細書に記載されている発明の概念は、それらの他の形態のメチル化に適用可能であり得る。

【0060】

ＩＩ．定義

【0061】

本明細書中で使用される場合、用語「約」または「ほぼ」は、当業者によって決定される特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味することができ、これは、値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界に部分的に依存し得る。例えば、「約」は、当該技術分野における実施ごとに、１以上の標準偏差の範囲内であることができる。「約」は、与えられた値の±２０％、±１０％、±５％、または±１％の範囲を意味することができる。「約」または「ほぼ」という用語は、値の１桁以内、５倍以内、または２倍以内を意味することができる。申請書に特定の値を記載する場合、特に記載のない限り、特定の値に対して許容できる誤差範囲内にある意味を「約」とする用語を想定すべきである。用語「約」は、当業者が一般的に理解するような意味を有することができる。用語「約」は±１０％を指すことができる。用語「約」は±５％を指すことができる。

【0062】

本明細書中で使用される「アッセイ」という用語は、物質の特性、例えば核酸、タンパク質、細胞、組織、または器官を決定するための技術を意味する。アッセイ（例えば、第１のアッセイまたは第２のアッセイ）は、試料中の核酸のコピー数変動、試料中の核酸のメチル化状態、試料中の核酸の断片サイズ分布、試料中の核酸の突然変異状態、または試料中の核酸の断片化パターンを決定するための技術を含むことができる。任意のアッセイを用いて、本明細書に言及される核酸の特性のいずれかを検出することができる。核酸の特性は、配列、ゲノム同一性、コピー数、１以上のヌクレオチド位置におけるメチル化状態、核酸のサイズ、１以上のヌクレオチド位置における核酸における突然変異の有無、および核酸の断片化のパターン（例えば、核酸断片が存在するヌクレオチド位置）を含み得る。アッセイまたは方法は、特定の感度および／または特異性を有することができ、診断ツールとしてのそれらの相対的有用性は、ＲＯＣ－ＡＵＣ統計を用いて測定することができる。

【0063】

本明細書中で使用される場合、用語「生物学的試料」、「患者試料」および「試料」は互換的に使用され、被験体に関連する生物学的状態を反映しうる被験体から採取された任意の試料を指す。いくつかの実施形態において、このような試料は、無細胞ＤＮＡなどの無細胞核酸を含む。いくつかの実施形態において、そのようなサンプルは、無細胞核酸以外の核酸を含むか、またはそれに加えている。生物学的試料の例は、限定されるわけではないが、対象の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙液、胸膜液、心膜液、または腹膜液を含む。いくつかの実施形態において、生体試料は、被験体の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙液、胸膜液、心膜液、または腹膜液からなる。このような実施形態では、生物学的試料は、対象の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙液、胸膜液、心膜液、または腹膜液に限定され、対象の他の成分（例えば、固形組織など）を含まない。生体試料は、生きているまたは死んだ被験体に由来する任意の組織または物質を含み得る。生体試料は無細胞試料とすることができる。生物学的試料は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはその断片を含み得る。用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはその任意のハイブリッドもしくは断片を指すことができる。試料中の核酸は、無細胞核酸であり得る。サンプルは、液体サンプルまたは固体サンプル（例えば、細胞または組織サンプル）であり得る。生体試料は、血液、血漿、血清、尿、膣液、陰嚢水腫由来の体液（例えば、精巣の体液）、膣洗浄液、胸水、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、乳頭からの分泌液、身体の異なる部分（例えば、甲状腺、乳房）からの吸引液などの体液であり得る。生体試料は便試料となりうる。様々な実施態様において、無細胞ＤＮＡ（例えば、遠心プロトコルを介して得られた血漿試料）について濃縮されている生物学的試料中のＤＮＡの大部分は、無細胞であり得る（例えば、ＤＮＡの５０％超、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％超は無細胞であり得る）。生物学的試料を処理して、組織または細胞構造を物理的に破壊することができ（例えば、遠心分離および／または細胞溶解）、したがって、分析のための試料の調製に使用できる酵素、緩衝液、塩類、界面活性剤などをさらに含むことができる溶液中に細胞内成分を放出することができる。生物学的試料は、被験体から侵襲的（例えば、外科的手段）または非侵襲的（例えば、採血、スワブ、または排出された試料の収集）に得ることができる。

【0064】

本明細書中で使用される、用語「癌」または「腫瘍」は、腫瘤の成長が正常組織の成長を上回り、かつ協調していない組織の異常な塊を意味する。癌または腫瘍は、形態および機能性を含む細胞分化の程度、成長速度、局所浸潤および転移の特徴に応じて、「良性」または「悪性」と定義することができる。「良性」腫瘍は高分化型であり、悪性腫瘍よりも増殖が遅く、原発部位に限局したままであるのが特徴的である。さらに、良性腫瘍は、遠隔部位への浸潤、浸潤または転移する能力を有していない。「悪性」腫瘍は、低分化（退形成）であり得、特徴的に、周辺組織の進行性浸潤、浸潤、および破壊を伴う急速な成長を有する。さらに、悪性腫瘍は、遠隔部位に転移する能力を有し得る。

【0065】

本明細書中で使用される、ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＣｅｌｌ－ｆｒｅｅＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓまたは「ＣＣＧＡ」は、新たに診断された癌患者由来の血液および組織ならびに癌診断を受けていない被験体由来の血液をプロスペクティブに収集する観察臨床研究として定義される。研究の目的は、癌と非癌を区別し、起源の組織を同定する汎癌分類器を開発することである。実施例１は、ＣＣＧＡ１およびＣＣＧＡ２データセットのさらなる詳細を提供する。

【0066】

本明細書中で使用される「分類」という用語は、試料の特定の特性に関連する任意の数または他の特性を指すことができる。例えば、「＋」記号（または「陽性」という単語）は、サンプルが欠失または増幅を有するものとして分類されることを意味し得る。別の例では、用語「分類」は、被験体および／または試料中の腫瘍組織の量、被験体および／または試料中の腫瘍のサイズ、被験体中の腫瘍の段階、被験体および／または試料中の腫瘍負荷、および被験体中の腫瘍転移の存在を指すことができる。分類は２値（例えば、陽性または陰性）であってもよいし、分類レベルがより高い（例えば、１～１０または０～１の尺度）場合もある。「カットオフ」および「閾値」という用語は、手術において使用される所定の数字を意味することができる。例えば、カットオフサイズは、それ以上のサイズで断片が除外されるサイズを指すことができる。閾値とは、特定の分類が適用される値を超える値、またはそれ以下の値とすることができる。これらの用語のどちらも、これらの文脈のどちらにも用いることができる。

【0067】

本明細書中で使用される場合、用語「核酸」および「核酸分子」は互換的に使用される。用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）など）、および／またはＤＮＡ類似体（例えば、塩基類似体、糖類似体および／または非天然骨格などを含む）などの任意の組成形態の核酸を指し、これらは全て一本鎖または二本鎖の形態であり得る。特に限定されない限り、核酸は、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含むことができ、そのいくつかは、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で機能することができる。核酸は、本明細書においてプロセスを実施するのに有用な任意の形態であり得る（例えば、線状、環状、超らせん、一本鎖、二本鎖など）。いくつかの実施形態における核酸は、単一の染色体またはその断片由来であり得る（例えば、核酸試料は、二倍体生物から得られた試料の１つの染色体由来であってもよい）。ある実施態様において、核酸は、ヌクレオソーム、ヌクレオソームの断片または部分、またはヌクレオソーム様構造を含む。核酸は、時にタンパク質（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質など）を含む。本明細書に記載されるプロセスによって分析される核酸は、実質的に単離されることがあり、タンパク質または他の分子と実質的に関連しない。核酸はまた、一本鎖（「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレームまたは「リバース」リーディングフレーム）および二本鎖ポリヌクレオチドから合成、複製または増幅されたＤＮＡの誘導体、バリアントおよびアナログを含む。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが含まれる。被験体から得られた核酸を鋳型として、核酸を調製することができる。

【0068】

本明細書中で使用される、用語「無細胞核酸」は、被験体の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、汗、涙液、胸膜液、心膜液、または腹腔液などの体液中の細胞外に見出され得る核酸分子を意味する。無細胞核酸は、１つ以上の健康な細胞に由来し、および／または１つ以上の癌細胞に由来し、無細胞核酸は、循環する核酸として互換的に使用される。無細胞核酸の例としては、ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する場合、「無細胞核酸」、「無細胞ＤＮＡ」、および「ｃｆＤＮＡ」という用語は互換的に使用される。本明細書中で使用される、用語「循環腫瘍ＤＮＡ」または「ｃｔＤＮＡ」は、死につつある細胞のアポトーシスまたは壊死などの生物学的プロセスの結果として個体の体（例えば血流）から液体中に放出されるか、または生存腫瘍細胞によって活発に放出されることがある、腫瘍細胞または他のタイプの癌細胞に由来する核酸断片を意味する。

【0069】

本明細書中で使用される場合、用語「断片」は、「核酸断片」（例えば、ＤＮＡ断片）という用語と互換的に使用され、少なくとも連続する３つのヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部を意味する。生物学的試料中に見出される核酸無細胞核酸断片の配列決定との関連において、用語「断片」および「核酸断片」は、生物学的試料中に見出される無細胞核酸分子またはその表現を互換的に意味する。そのような文脈において、配列決定データ（例えば、全ゲノム配列決定からの配列の読み、標的配列決定など）は、このような核酸断片の全部または一部の１つ以上のコピーを誘導するために使用される。このような配列リードは、実際には、元の核酸断片のＰＣＲ重複物の配列決定から得られ得るので、核酸断片を「表す」または「支持する」ことができる。生体試料中の特定の核酸断片（例えば、ＰＣＲ重複物）をそれぞれ表すか、または支持する複数の配列リードが存在し得る。核酸断片は無細胞核酸と考えることができる。いくつかの実施形態において、核酸断片の１つのコピーが、元の無細胞核酸分子を表すために使用される（例えば、ライブラリー調製過程において、無細胞核酸分子に付着した分子識別子を通して複製物が除去される）。いくつかの実施形態において、メチル化配列決定データを用いて、これらの核酸断片をさらに区別することができる。例えば、同一またはほぼ同一の配列を共有する２つの核酸断片は、それぞれが異なるメチル化パターンを有する場合、依然として異なる元の無細胞核酸分子に対応し得る。

【0070】

本明細書中で使用される「健康」とは、良好な健康を有する被験体を意味する。健常被験者は、悪性または非悪性疾患のいずれの欠如を実証することができる。「健康な個人」は、通常「健康である」とは考えられない、アッセイされる状態とは無関係な、他の疾患または状態を有し得る。

【0071】

本明細書中で使用される、用語「癌のレベル」は、癌が存在するかどうか（例えば、存在の有無）、癌のステージ、腫瘍のサイズ、転移の有無、推定腫瘍分画濃度、総腫瘍変異負荷値、身体の総腫瘍負荷量、および／または癌の重症度の他の尺度（例えば、癌の再発）を意味する。がんのレベルは、記号、アルファベット文字、色などの数字またはその他の指標となる。レベルはゼロにできる。がんのレベルには、突然変異または多数の突然変異に関連する前がん状態または前がん状態（状態）も含まれうる。がんのレベルは様々な方法で使用できる。例えば、スクリーニングでは、以前にがんであることが分かっていない人にがんが存在しているかどうかを調べることができる。評価では、がんと診断された人を調査して、長期にわたってがんの進行を監視したり、治療法の有効性を研究したり、予後を判定したりすることができる。予後は、被験体が癌で死亡する可能性、または特定の期間もしくは時間の後に癌が進行する可能性、または癌が転移する可能性として表現され得る。がんを示唆する特徴（例えば、症状または他の陽性検査）を有する誰かががんにかかっているかどうかを調べることは、検出に「スクリーニング」を含むこともあれば、検査を含むこともある。「病理学のレベル」とは、病原体に関連する病理学のレベルを指すことができ、ここで、そのレベルは、癌について上述したようにすることができる。癌が病原体と関連している場合、癌のレベルは病理のレベルの一種となり得る。

【0072】

本明細書中で使用される「メチローム」は、ゲノム中の複数の部位または遺伝子座におけるメチル基（例えば、メチル化またはヒドロキシメチル化修飾）を含むＤＮＡ修飾の量または程度の尺度であり得る。メチロームは、ゲノムのすべてまたは一部、ゲノムのかなりの部分、またはゲノムの比較的小さな部分に対応することができる。ゲノムのかなりの部分のメチル化プロファイルは、メチロームと同等であると考えることができる。興味深いメチロームは、核酸、例えば、ＤＮＡを体液（例えば、脳細胞、骨、肺、心臓、筋肉、腎臓などのメチローム）中に寄与し得る器官のメチロームであり得る。臓器は移植された臓器であり得る。

【0073】

本明細書に開示されるように、用語「メチル化」は、ヒドロキシメチル化を含むがこれに限定されない、メチル基を含む任意のタイプの修飾を含む。ある領域の“メチル化密度“は、メチル化を示す領域内の部位の読取り数を、その領域内の部位をカバーする読取りの総数で割った値とすることができる。部位は特異的な特徴を持ちうる（例えば、部位はＣｐＧ部位であり得る）。領域の「ＣｐＧメチル化密度」は、ＣｐＧメチル化を示す読取りの数を、その領域のＣｐＧ部位をカバーする読取りの総数（例えば、特定のＣｐＧ部位、ＣｐＧアイランド内のＣｐＧ部位、またはより大きな領域）で割ることができる。例えば、ヒトゲノム中の各１００ｋｂのｂｉｎに対するメチル化密度は、１００－ｋｂ領域にマップされた配列リードによってカバーされる全ＣｐＧ部位の割合として、ＣｐＧ部位における未変換シトシン（メチル化シトシンに対応できる）の総数から決定することができる。この分析は、他のビンサイズ、例えば５０－ｋｂまたは１－Ｍｂなどについても行うことができる。領域は、全ゲノムまたは染色体、または染色体の一部（例えば、染色体腕）であり得る。

【0074】

哺乳類ゲノムにおける「ＤＮＡメチル化」とは、ＣｐＧジヌクレオチドの中でシトシンの複素環式環の５位にメチル基を付加すること（例えば、５－メチルシトシンを生成すること）を指すことができる。シトシンのメチル化は、他の配列コンテキスト、例えば５’－ＣＨＧ－３’および５’－ＣＨＨ－３’においてシトシン中で起こることができ、ここでＨはアデニン、シトシンまたはチミンである。シトシンのメチル化は５－ヒドロキシメチルシトシンの形でもよい。ＤＮＡのメチル化には、Ｎ６－メチルアデニンなどの非シトシンヌクレオチドのメチル化が含まれ得る。例えば、異なるゲノム領域からのメチル化データ（例えば、密度、分布、メチル化のパターンまたはレベル）を１つ以上のベクターセットに変換し、本明細書に開示されている方法およびシステムによって分析することができる。

【0075】

本明細書中で使用される、用語「突然変異」は、１つ以上の細胞の遺伝物質における検出可能な変化を意味する。特定の例では、１つまたは複数の突然変異が癌細胞中に見出され、そしてそれを同定することができる（例えば、ドライバー突然変異およびパッセンジャー突然変異）。突然変異は外見上の細胞から娘細胞に伝えられる。当業者は、親細胞における遺伝子突然変異（例えば、ドライバー突然変異）が、娘細胞においてさらなる異なる突然変異（例えば、パッセンジャー突然変異）を誘導し得ることを認識するであろう。突然変異は一般的に核酸で起こる。特定の例において、突然変異は、１以上のデオキシリボ核酸またはその断片における検出可能な変化であり得る。突然変異とは、一般に、核酸中の新たな位置に付加、欠失、置換、逆位、または転位されるヌクレオチドをいう。突然変異は、自然突然変異であっても、実験的に誘発された突然変異であってもよい。特定の組織の塩基配列の変異は“組織特異的な対立遺伝子“の例である。たとえば、腫瘍は正常細胞では起こらない遺伝子座に対立遺伝子を生じるような変異をもつことがある。「組織特異的対立遺伝子」の別の例は、胎児組織で起こるが、母体組織では起こらない胎児特異的対立遺伝子である。

【0076】

本明細書中で使用される、用語「参照ゲノム」は、被験体から同定された配列を参照するために使用され得る任意の生物またはウイルスの、部分的であるか完全であるかにかかわらず、既知の、配列決定された、または特徴付けられたゲノムのいずれかを意味する。ヒト被験者ならびに他の多くの生物に使用される例示的な参照ゲノムは、国立バイオテクノロジー情報センター（「ＮＣＢＩ」）またはカリフォルニア大学サンタクルツ校（ＵＣＳＣ）が主催するオンラインゲノム・レーザーで提供される。「ゲノム」とは、核酸配列において発現される、生物またはウイルスの完全な遺伝情報を意味する。本明細書中で使用されるように、参照配列または参照ゲノムは、しばしば、個体または複数の個体由来の、組み立てられたまたは部分的に組み立てられたゲノム配列である。いくつかの実施形態において、参照ゲノムは、１以上のヒト個体由来の、組み立てられたまたは部分的に組み立てられたゲノム配列である。参照ゲノムは、種の遺伝子セットの代表的な例と見なすことができる。いくつかの実施形態において、参照ゲノムは、染色体に割り当てられた配列を含む。例示的なヒト参照ゲノムは、ＮＣＢＩビルド３４（ＵＣＳＣ等価物：ｈｇ１６）、ＮＣＢＩビルド３５（ＵＣＳＣ等価物：ｈｇ１７）、ＮＣＢＩビルド３６．１（ＵＣＳＣ等価物：ｈｇ１８）、ＧＲＣ３７（ＵＣＳＣ等価物：ｈｇ１９）、およびＧＲＣ３８（ＵＣＳＣ等価物：ｈｇ３８）を含むが、これらに限定されない。

【0077】

本明細書中で使用される、用語「配列決定」、「配列決定」などは、一般的に、核酸またはタンパク質などの生物学的巨大分子の順序を決定するために使用され得る任意のおよび全ての生化学的プロセスを指す。例えば、配列決定データは、ＤＮＡ断片のような核酸分子中のヌクレオチド塩基の全部または一部を含むことができる。

【0078】

本明細書中で使用される、用語「配列リード」または「リード」とは、本明細書に記載される、または当該技術分野で知られている任意の配列決定プロセスによって産生されるヌクレオチド配列を意味する。読取りは、核酸断片の一端から生成することができ（「一端読取り」）、時には、核酸の両端から生成することがある（例えば、対末端読取り、二端読取り）。いくつかの実施形態において、配列の読取り（例えば、一端または対端の読取り）は、標的核酸断片の一方または両方の鎖から生成することができる。読まれる塩基配列の長さは、特定の塩基配列決定技術と関連していることが多い。たとえば、ハイスループットな方法では、数十から数百塩基対（ｂｐ）の大きさで変化しうる配列の読みを提供する。いくつかの実施形態では、配列読み取りは、約１５ｂｐ～９００ｂｐ長の平均、中央値または平均長さ（例えば、約２０ｂｐ、約２５ｂｐ、約３０ｂｐ、約３５ｂｐ、約４０ｂｐ、約４５ｂｐ、約５０ｂｐ、約５５ｂｐ、約６０ｂｐ、約６５ｂｐ、約７０ｂｐ、約７５ｂｐ、約８０ｂｐ、約８５ｂｐ、約９０ｂｐ、約９５ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０ｂｐ、約１２０ｂｐ、約１３０、約１４０ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、または約５００ｂｐ）である。いくつかの実施形態において、配列リードは、約１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、５０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、または５０，０００ｂｐ以上の平均、中央値または平均長のものである。例えば、ナノポアの塩基配列決定法は、数十から数百から数千の塩基対の大きさで変化しうる配列の読みを提供することができる。イラミナ並列シークエンシングは、それほど変化しないシークエンスリードを提供することができる。例えば、シークエンスリードのほとんどは２００ｂｐより小さいことができる。読まれる配列（またはシークエンシング・リード）は、核酸分子に対応する配列情報（例えば、ヌクレオチドの列）を指すことができる。例えば、読む配列は、核酸断片の一部からのヌクレオチドの列（例えば、約２０～約１５０）に対応することができ、核酸断片の一端または両端のヌクレオチドの列に対応することができ、または核酸断片全体のヌクレオチドに対応することができる。配列の読取りは、様々な方法で得ることができ、例えば、配列決定技術を用いるか、またはプローブを用いること、例えば、ハイブリダイゼーションアレイまたは捕獲プローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または単一のプライマーまたは等温増幅を用いる線形増幅技術などの増幅技術を用いることができる。

【0079】

用語「配列決定の深さ」、「カバー率」および「カバー率」は、遺伝子座に並べられた特有の核酸標的分子（「核酸断片」）に対応して読み取られるコンセンサス配列によって遺伝子座がカバーされる回数を指すために本明細書中で互換的に使用される；例えば、配列決定の深さは、遺伝子座をカバーする特有の核酸標的断片（ＰＣＲ配列決定の重複を除く）の数に等しい。遺伝子座はヌクレオチドと同じくらい小さいものもあれば、染色体腕と同じくらい大きいものもあり、ゲノム全体と同じくらい大きいものもある。頻度は、「ＹＸ」として表すことができる。例えば、５０Ｘ、１００Ｘ等である。ここで、「Ｙ」は、核酸標的に対応する順序で軌跡がカバーされる回数、例えば、特定の軌跡をカバーする独立した順序情報が入手される回数をいう。いくつかの実施形態において、配列決定の深さは、配列決定されたゲノムの数に対応する。シークエンシングの深さは、複数の遺伝子座、または全ゲノムにも適用することができ、この場合、Ｙは、それぞれ、遺伝子座または単数体ゲノム、または全ゲノムがシークエンスされる平均または平均回数を参照することができる。平均深度を引用すると、データセットに含まれる異なる遺伝子座の実際の深さは、ある範囲の値にわたることができる。超深層シークエンシングは、軌跡上のシークエンシング深さの少なくとも１００倍に言及することができる。

【0080】

本明細書中で使用される、用語「真の陽性」（ＴＰ）は、状態を有する被験体を意味する。「真の陽性」とは、腫瘍、癌、前癌状態（例えば、前癌病変）、限局性または転移性癌、または非悪性疾患を有する被験体を指すことができる。「真の陽性」は、状態を有する被験体を意味することができ、本開示のアッセイまたは方法によってその状態を有するものとして同定される。

【0081】

本明細書中で使用される、用語「真の陰性」（ＴＮ）とは、状態を有さないか、または検出可能な状態を有さない被験体を意味する。真陰性とは、腫瘍、癌、前癌状態（例えば、前癌病変）、限局性または転移性癌、非悪性疾患、または他の点では健康な被験体など、疾患または検出可能な疾患を有さない被験体を指すことができる。真陰性とは、状態を有さないか、検出可能な状態を有さないか、または本開示のアッセイまたは方法によってその状態を有さないと同定される被験体を指すことができる。

【0082】

本明細書中で使用される「感度」または「真の陽性率」（ＴＰＲ）という用語は、真の陽性数を真の陽性数と偽陰性の数の合計で割ったものを意味する。感度は、真に状態を有する集団の割合を正確に同定するアッセイまたは方法の能力を特徴付けることができる。例えば、感度は、癌を有する集団内の被験体の数を正確に同定する方法の能力を特徴付けることができる。別の例では、感度は、癌を示す１つ以上のマーカーを正確に同定する方法の能力を特徴付けることができる。

【0083】

本明細書中で使用される、用語「特異性」または「真の陰性率」（ＴＮＲ）は、真の陰性の数を真の陰性および偽陽性の数の合計で割ったものを意味する。特異性は、真に病態を有していない集団の割合を正確に同定するアッセイまたは方法の能力を特徴付けることができる。例えば、特異性は、癌を有さない集団内の被験体の数を正確に同定する方法の能力を特徴付けることができる。別の例では、特異性は、癌を示す１つ以上のマーカーを正確に同定する方法の能力を特徴付けることができる。

【0084】

本明細書中で使用される、用語「偽陽性」（ＦＰ）は、状態を有さない被験体を意味する。偽陽性とは、腫瘍、癌、前癌状態（例えば、前癌病変）、限局性または転移性癌、非悪性疾患、または他の点では健康な被験体を指すことができる。偽陽性という用語は、状態を有さないが、本開示のアッセイまたは方法によってその状態を有するものとして同定される被験体を指すことができる。本明細書中で使用される「偽陰性」（ＦＮ）という用語は、状態を有する被験体を意味する。偽陰性とは、腫瘍、癌、前癌状態（例えば、前癌病変）、限局性または転移性癌、または非悪性疾患を有する被験体を指すことができる。「偽陰性」という用語は、ある状態を有するが、本開示のアッセイまたは方法によってその状態を有さないものとして同定される被験体を指すことができる。

【0085】

本明細書中で使用される、用語「一塩基変異体」または「ＳＮＶ」は、ヌクレオチド配列の位置（例えば部位）における１つのヌクレオチドの異なるヌクレオチドへの置換、例えば、個体から読み取られる配列を意味する。第１の核酸塩基Ｘから第２の核酸塩基Ｙへの置換は“Ｘ＞Ｙ“と表されることがある。例えば、シトシンからチミンへのＳＮＶは“Ｃ＞Ｔ“と表されることがある。

【0086】

本明細書中で使用される場合、「サイズプロファイル」および「サイズ分布」という用語は、生物学的試料中のＤＮＡ断片のサイズに関連し得る。サイズプロフィールは、様々なサイズでの量のＤＮＡ断片の分布を提供するヒストグラムとすることができる。様々な統計パラメータ（サイズパラメータまたは単なるパラメータとも呼ばれる）は、あるサイズプロファイルを別のサイズプロファイルと区別することができる。１つのパラメータは、全てのＤＮＡ断片に対する特定のサイズまたはサイズの範囲のＤＮＡ断片のパーセンテージ、または別のサイズまたは範囲のＤＮＡ断片に対するパーセンテージとすることができる。

【0087】

本明細書中で使用される用語「被験体」は、限定されるわけではないが、ヒト（例えば、男性、女性、ヒト、胎児、妊娠女性、子供など）、非ヒト動物、植物、細菌、真菌または原生生物を含む任意の生きているまたは生きていない生物を意味する。哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄類、ウシ（例えばウマ）、ウマ（例えばウマ）、ヤギおよびヒツジ（例えばヒツジ、ヤギ）、ブタ（例えばブタ）、ラクダ（例えばラクダ、ラマ、アルパカ）、サル、類人猿（例えばゴリラ、チンパンジー）、ウルシ（例えばクマ）、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚、イルカ、クジラおよびサメを含むがこれらに限定されない任意のヒトまたは非ヒト動物が被験体として働くことができる。いくつかの実施形態において、被験体は、任意の段階（例えば、男性、女性または子供）の男性または女性である。

【0088】

本明細書中で用いられる場合、用語「組織」は、機能単位として一緒にグループ化される細胞のグループに対応することができる。１つの組織に複数の種類の細胞が認められる。異なるタイプの組織は、異なるタイプの細胞（例えば、肝細胞、肺胞細胞または血液細胞）を含み得るが、また、異なる生物由来の組織（母対胎児）または健康な細胞対腫瘍細胞に対応し得る。用語「組織」は、人体に見出される任意の細胞群（例えば、心臓組織、肺組織、腎臓組織、鼻咽頭組織、口腔咽頭組織）を指すことができる。用語「組織」または「組織型」は、無細胞核酸が由来する組織を意味するために使用することができる。一例において、ウイルス核酸断片は、血液組織に由来し得る。別の例では、ウイルス核酸断片を腫瘍組織から誘導することができる。

【0089】

本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、エレメントのアレイのようなエレメントの列挙されたリストであり、ここで、各エレメントは割り当てられた意味を有する。そのように、本開示において使用される用語「ベクター」は、「テンソル」という用語と互換可能であり、一例として、ベクターが１０，０００ビンのビンカウントを含む場合、１０，０００のビンの各々について、ベクター内に所定の要素が存在する。提示を容易にするために、いくつかの例において、ベクターは一次元であると記述され得る。しかし、本開示はそれほど限定されていない。ベクター中の各要素が何を表すかの記述が定義される（例えば、要素１が複数のビンのビン１のビンカウントを表すなど）ならば、任意の次元のベクターを本開示において使用することができる。

【0090】

以下に、イラストのための適用例を参照して、いくつかの局面を記載する。本明細書に記載されている特徴の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細、関係、および方法が示されていることを理解すべきである。しかしながら、関連技術の通常の熟練者を有する者は、本明細書に記載される特徴が、特定の詳細の１つ以上なしに、または他の方法で実施され得ることを容易に認識するであろう。ここに記述される特徴は、作用または事象の図示された順序によって限定されず、いくつかの作用が異なる順序で、および／または他の作用または事象と同時に起こり得るためである。さらに、ここに記述された特徴に従って方法論を実施するためには、図示された行為や事象の全てが必要とされるわけではなく、

【0091】

ＩＩＩ．サンプル処理

【0092】

図１は、メチル化状態ベクターを得るために無細胞（ｃｆ）ＤＮＡの断片を配列決定するプロセス１００を記述する例示的なフローチャートである。分析システム（または本明細書の別の箇所に記載されるプロセシングシステム）は、まず、複数のｃｆＤＮＡ断片を含む被験体から１１０の試料を得ることができる。一般に、試料は、健康な被験体、癌を有するかまたはその疑いがあることが知られている被験体、または以前の情報が知られていない被験体由来であってもよい。試料（例えば、試料またはトレーニング試料のいずれか）は、血液、血漿、血清、尿、糞便、および／または唾液試料から選択することができる。代わりに、試料は、全血、血液分画、組織生検、胸膜液、心膜液、脳脊髄液、または腹膜液から選択することができる。

【0093】

試料から、ｃｆＤＮＡ断片を処理して、メチル化されていないシトシンをウラシル１２０に変換することができる。この方法は、メチル化シトシンを変換することなく、非メチル化シトシンをウラシルに変換するｃｆＤＮＡ断片の亜硫酸水素塩処理を用いることができる。例えば、ＥＺＤＮＡＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＴＭ－金、ＥＺＤＮＡＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＴＭ－直接またはＥＺＤＮＡＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＴＭ－照明キット（ザイモリサーチコープ（イルビン、カリフォルニア州）から入手可能）のような市販のキットを亜硫酸水素塩転換に使用することができる。メチル化されていないシトシンからウラシルへの変換は、酵素反応を用いて行うことができる。例えば、変換は、ＡＰＯＢＥＣ－Ｓｅｑ（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ社、Ｉｐｓｗｉｃｈ社、ＭＡ）のような非メチル化シトシンのウラシルへの変換のための市販のキットを使用することができる。

【0094】

変換されたｃｆＤＮＡ断片から、配列決定ライブラリーを１３０調製することができる。任意に、配列決定ライブラリーは、複数のハイブリダイゼーションプローブを用いて癌状態に有益なｃｆＤＮＡ断片、またはゲノム領域について１３５濃縮され得る。ハイブリダイゼーションプローブは、標的ｃｆＤＮＡ断片、または１つ以上の標的領域に由来するｃｆＤＮＡ断片にハイブリダイズすることができ、その後の配列決定および分析のためにそれらの断片または領域を濃縮することができる短いオリゴヌクレオチドであり得る。ハイブリダイゼーションプローブを用いて、対象とする特定のＣｐＧ部位のセットの標的化された高深度分析を行うことができる。一旦調製されると、配列決定ライブラリまたはその一部を配列決定して、複数の配列リード１４０を得ることができる。シーケンス読取りは、コンピュータソフトウェアによる処理および解釈のために、コンピュータ読取り可能なデジタルフォーマットであってもよい。複数の試料を調製し、同時に配列決定することができる。複数のサンプルは、少なくとも１０、２０、５０、９６、１００、２００、５００、１０００、１００００またはそれ以上のサンプルを含むことができる。

【0095】

シークエンスレッドから、分析システムは、参照ゲノムへのアラインメントに基づいて、１つ以上のＣｐＧ部位の各々について１５０ａの位置およびメチル化状態を決定することができる。分析システムは、１６０のメチル化状態ベクターを、参照ゲノム中の断片の位置（例えば、各断片中の最初のＣｐＧ部位の位置、または別の類似の計量値によって指定される）、断片中の多数のＣｐＧ部位、および断片中の各ＣｐＧ部位のメチル化状態、メチル化されているかどうか（例えば、Ｍと表記される）、メチル化されていないか（例えば、Ｕと表記される）、または不確定（または、本明細書中の別の記載、例えば、Ｉと表記される）であるかどうかについて生成することができる。観察された状態にはメチル化された状態とメチル化されていない状態が含まれるが、観察されていない状態は不確定である。メチル化状態ベクターは、後の使用および処理のために一時的または持続的なコンピュータ記憶に保存され得る。さらに、分析システムは、単一被験体から複製リードまたは重複メチル化状態ベクターを除去することができる。分析システムは、汚染検出（例えば、ヒト汚染源、予期せぬ生殖細胞系ハプロタイプ、交差試料汚染、プローブ汚染、生物学的汚染、および／または技術者汚染）を行うことができる。分析システムは、品質管理の計量値（例えば、濃縮、プルダウン、適用範囲、および／またはアラインメントについて）を評価することができる。分析システムは、ある断片が、不確定なメチル化状態を有する１つ以上のＣｐＧ部位を有することを決定することができる。不確定なメチル化状態は、ＤＮＡ断片の相補鎖のメチル化状態間の配列決定ミスおよび／または不一致に由来する可能性がある。分析システムはそのような断片を排除するか、そのような断片を選択的に含むかを決めることができるが、そのような不確定なメチル化状態を説明するモデルを構築することができる。不確定なサンプルをさらに起源の組織分析から除外することで、性能を高めることができる。

【0096】

図２は、メチル化状態ベクターを得るためにｃｆＤＮＡ断片を配列決定する、図１の例示的なプロセス１００の例証である。一例として、分析システムはｃｆＤＮＡ断片１１２をとることができる。ｃｆＤＮＡ断片１１２は３つのＣｐＧ部位を含むことができる。図に示すように、ｃｆＤＮＡ断片１１２の第１および第３のＣｐＧ部位を１１４メチル化することができる。処理段階１２０の間に、ｃｆＤＮＡ断片１１２を変換して、変換されたｃｆＤＮＡ断片１２２を生成することができる。治療１２０の間、メチル化されていない第２のＣｐＧ部位はそのシトシンをウラシルに変換することができるが、第１および第３のＣｐＧ部位は変換されないことがある。

【0097】

変換後、配列決定ライブラリ１３０を調製し、１４０の配列を決定し、１４２の配列を読むことができる。分析システムは、１５０の配列１４２を参照ゲノム１４４に並べることができる。参照ゲノム１４４は、ヒトゲノムにおいて、断片ｃｆＤＮＡがどの位置に由来するかについての文脈を提供することができる。分析システムは、３つのＣｐＧ部位がＣｐＧ部位２３、２４、および２５（説明の便宜のために使用される任意の参照識別子）に相関するように、１５０の読取配列をアラインメントすることができる。このようにして、分析システムは、ｃｆＤＮＡ断片１１２上の全てのＣｐＧ部位のメチル化状態、およびヒトゲノム中のどの位置にＣｐＧ部位がマップされるかの両方に関する情報を生成することができる。図に示すように、配列上のＣｐＧ部位はメチル化された１４２を読んでシトシンとして読むことができる。シトシンは、第１および第３のＣｐＧ部位において１４２読取られた配列中に現れることができ、これにより、元のｃｆＤＮＡ断片中の第１および第３のＣｐＧ部位がメチル化されていると推測することができる。一方、２番目のＣｐＧ部位はチミンとして読まれる（Ｕは塩基配列決定過程でＴに変換される）ので、２番目のＣｐＧ部位は元のｃｆＤＮＡ断片ではメチル化されていないと推測できる。これらの２つの情報断片、メチル化状態および位置により、分析システムは、ｃｆＤＮＡ断片１１２に対する１６０ａのメチル化状態ベクター１５２を生成することができる。得られたメチル化状態ベクター１５２は＜Ｍ２３、Ｕ２４、Ｍ２５＞であり得る。ここで、「Ｍ」はメチル化ＣｐＧ部位に対応し、「Ｕ」はメチル化されていないＣｐＧ部位に対応し、下付き数字は参照ゲノム中の各ＣｐＧ部位の位置に対応し得る。

【0098】

以下の実施例８でさらに議論されるように、同定されたメチル化状態ベクターは、ｐ値濾過および分類を受けることができ、分類出力を結果報告書にまとめることができる。

【0099】

ＩＶ．システム例

【0100】

図５Ａは、被験体の疾患／癌状態を決定する方法が実装できる例示的な環境／システムを示す。環境５００は、シーケンス装置５１０と、ネットワーク５２５を介して接続された１つ以上のユーザ装置５２０とを含むことができる。

【0101】

配列決定装置５１０は、試料容器５１５、フローセル５４５、グラフィックユーザインタフェイス５５０、および１つ以上のローディングトレイ５５５を含むことができる。試料容器５１５は、１つ以上の試験および／またはトレーニング試料を運搬、保持、および／または保存するように構成することができる。フローセル５４５は、配列決定装置５１０のフローセルホルダーに配置することができる。フローセル５４５は、結合された分析物上で試薬溶液を秩序正しく通過できるように構成することができる固体支持体であってもよい。グラフィックユーザインタフェイス５５０は、特定の作業（例えば、装填トレイに試料および緩衝液を装填する、または対応するメチル化パターンを有するデータセットを含む配列決定データを得る）とユーザとの相互作用を可能にすることができる。例えば、ユーザ（例えば、被験者、訓練被験者、医療専門家）が、試薬および濃縮されたフラグメントサンプルを、シーケンス装置５１０のローディングトレイ５５５に提供したならば、ユーザは、シーケンス装置５１０のグラフィックユーザインターフェース５５０と相互作用することによって、シーケンスを開始することができる。配列決定装置５１０は、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上のプロセシングシステムを含むことができる。

【0102】

利用者装置５２０は、それぞれ、ノートパソコンもしくはテーブルコンピュータのようなコンピュータシステム、またはスマートフォンもしくはタブレットのような携帯型コンピュータ装置であり得る。ユーザ装置５２０は、ネットワーク５２５を介して、シーケンス装置５１０と通信的に結合することができる。各ユーザ装置は、ユーザに癌状態に関する報告書を作成するなどの様々なアプリケーションについて、シーケンス装置５１０から得られたデータを処理することができる。ユーザは、被験体、訓練被験体、または誰でも報告書（例えば、医療専門家）にアクセスできる。ユーザ装置５２０は、本明細書の他の箇所に記載されている１つ以上の処理システムを含むことができる。１つ以上のユーザ装置５２０は、処理システムによって実行されると、処理システムが本明細書に開示されている方法またはプロセスのいずれか１つ以上のステップを実行させる処理システムおよび記憶保存コンピュータ指示を含むことができる。

【0103】

ネットワーク５２５は、図５Ａに示される様々な構成要素または装置間の通信を提供するように構成することができる。ネットワーク５２５は、インターネット、無線ネットワーク、有線ネットワーク、ローカル・エリア・ネットワーク、ワイド・エリア・ネットワーク、ブルートゥース、ニア・フィールド通信（ＮＦＣ）、または１つ以上の構成要素間の通信を提供する他の任意のタイプのネットワークとして実現することができる。ネットワーク５２５は、セル及び／又はページャーネットワーク、サテライト、ライセンスされたラジオ、又はライセンスされたラジオと免許されていないラジオの組合せを用いて実装することができる。ネットワーク５２５は、ワイヤレス、ワイヤリング、またはそれらの組合せであり得る。ネットワーク５２５は、パブリックネットワーク（例えばインターネット）、プライベートネットワーク（例えば、組織内のネットワーク）、またはパブリックネットワークとプライベートネットワークの組み合わせとすることができる。

【0104】

図５Ｂは、被験体の疾患／癌状態を決定するための処理システム５６０の例示的なブロック図を描いている。処理システム５６０は、本明細書に開示される方法またはプロセスのいずれかの１つまたは複数のステップを実行する１つまたは複数の処理装置またはサービスを含むことができる。処理システム５６０は、複数のモデル、エンジニア、モジュールを含むことができる。図５Ｂに示されているように、処理システム５６０は、データ処理モジュール５６２、データ構築モジュール５６４、アルゴリズムモデル５６６、通信エンジニア５６８、および１つ以上のデータベース５７０を含むことができる。

【0105】

データ処理モジュール５６２は、配列決定装置５１０から得られたデータを清掃し、処理し、管理し、変換し、及び／又は変換するように構成することができる。一実施形態では、データ処理モジュールは、配列決定装置から得られたデータを、他のモジュール、エンジニア、またはモデルによって使用および／または認識できるデータに変換することができる。例えば、データ構築モジュール５６４は、データ処理モジュール５６２から出力データを構築することができる。モジュール５６４を構築するデータは、シーケンス装置５１０または処理システムの任意のモジュール、モデル、およびエンジニアから得られるデータを構築および／またはさらに処理するように構成することができる（例えば、ここで記述されている１つまたは複数のパッチを構築する）。一実施形態では、モジュール５６６を構築するデータは、それぞれの断片を複数の断片から除去することによって、複数の断片を剪定することができる。

【0106】

アルゴリズムモデル５６８は、一つ以上のアルゴリズム又はモデルを介してデータを解析、翻訳、変換、モデル化、及び／又は変換するように構成することができる。そのようなアルゴリズムまたはモデルは、分類器または本明細書の別の箇所に記載された計算モデルのような任意の計算、数学、統計、または機械学習アルゴリズムを含むことができる。分類器または計算モデルは、少なくとも１つの回帰ニューラルネットワークパッチを含むことができる。分類器または計算モデルは、第１段階モデルおよび第２段階モデルを含むことができる。第１段階モデルは、複数のベクトル集合を逐次的に受け取り、複数の出力スコアを提供することができ、第２段階モデルは、第１段階モデルによって提供されるベクトル集合を受け取り、出力スコアを提供することができる。分類器または計算モデルは、入力値を受信し、フィルター重量のセットを含む少なくとも１つのフィルターに関連する層を含むことができる。この層は、次の関数として中間値を計算することができる：（ｉ）フィルター重量の集合、および（ｉｉ）複数の入力値。分類器または計算モデルは、一つ以上のデータベース（例えば、非持続記憶または持続記憶）に保存することができる。

【0107】

通信エンジニア５６８は、処理システム５６０が、１つ以上のユーザ機器５２０又は配列決定装置５１０からのデータ及び／又は任意の情報を受信することを可能にする、１つ以上のキーボード、マウス装置等の１つ以上のユーザ機器（例えば、ユーザ機器５２０）へインターフェースを提供するように構成することができる。

【0108】

１つ以上のデータベース５７０は、データを保存するように構成された１つ以上の記憶装置（例えば、あらかじめ訓練されたモデル、訓練データセットなど）を含むことができる。さらに、１つ以上のデータベース５７０は、記憶装置を有するコンピュータシステムとして実現することができる。１つまたは複数のデータベース５７０は、１つまたは複数の操作を行うために、システムまたは装置（例えば、配列決定装置５１０）の構成要素によって使用することができる。１つ以上のデータベース５７０は、処理システム５６０と共位置することができ、かつ／またはネットワーク上で互いに共位置することができる。１つ以上のデータベース５７０の各々は、他のデータベースと同一であっても、異なっていてもよい。１つ以上のデータベース５６４の各々は、他のデータベースと同じ場所に配置することができ、又は他のデータベースから遠隔にすることができる。１つ以上のデータベースは、上述または本明細書の他の場所で記述されていない追加モジュールおよびデータ構造を保存することがある。

【0109】

上述の識別された構成要素（例えば、モジュール）は、別個のソフトウェアプログラム、手順、データセット、またはモジュールとして実装されてはならず、したがって、これらのモジュールおよびデータの様々なサブセットは、さまざまな実装において、結合されるか、または別の方法で再配置されてもよい。いくつかの実施形態において、システム５００が必要に応じてそのようなデータの全てまたは一部を取得することができるように、システム５００によって対処可能であるシステム５００以外のコンピュータシステムに、上記の識別された要素の１つまたは複数を保存することができる。

【0110】

Ｖ．実施例の方法

【0111】

本開示に従ったシステムが図５Ａおよび５Ｂを参照して開示されているが、本開示に従った例示的な方法８００は、今や図８Ａとともに詳細に記載されている。この方法は、本明細書に開示されている環境５００および／または処理システム５６０によって実施することができる。

【0112】

方法８００のステップ８０２は、データセットを電子形式で取得することを含むことができ、ここで、データセットは、複数の断片中のそれぞれの断片の対応するメチル化パターンを含む。各それぞれの断片の対応するメチル化パターンは、試験対象から得られた生物学的試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定することができる。それぞれの断片の対応するメチル化パターンは、それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態を含むことができる。

【0113】

複数の断片中の各断片は、その核酸配列が異なるゲノム位置または位置に並ぶ（またはマップする）ユニークな断片を含むことができる。複数の断片中の各断片は、異なるメチル化パターンを含む特有の断片を含むことができる。断片マップを読む位置は、とりわけ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＲ、ＢＷＡ－ＭＥＭ、ＤＡＭＡＰＰＥＲ、ＮＧＭＬＲ、ＧｒａｐｈＭａｐ、ミニマップなどのプログラムを用いて決定することができる。ＢＧＲＥＡＴおよびｄｅＢＧＡは、いずれも第二世代シークエンシングデータと協働するように設計することができる。ＢｌａｓｔＧｒａｐｈはＢＬＡＳＴマッピング結果を用いてクラスターアライメントを作成し、比較ゲノム解析を行うことができる。ＧｒａｍＴｏｏｌｓは、短い読みを母集団参照グラフにマップすることができる。

【0114】

１以上の核酸試料のメチル化配列決定には、ｉ）全ゲノムメチル化配列決定、ｉｉ）全ゲノム重亜硫酸配列決定（ＷＧＢＳ）、またはｉｉｉ）複数の核酸プローブを用いた標的化ＤＮＡメチル化配列決定を含むことができる。１以上の核酸試料のメチル化配列決定には、表現の減少した重亜硫酸塩基配列決定、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定、次世代配列決定、ピロシークエンシング、メチル化特異的ＰＣＲ、重亜硫酸変換ＤＮＡの直接サンガー配列決定、および／または重亜硫酸アンプリコン配列決定（ＢＳＡＳ）を含むことができる。メチル化配列決定は、ナノポア配列決定またはＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定を用いて行うことができる。１つ以上の核酸サンプルのメチル化配列決定は、複数の核酸プローブを使用することができる（例えば、１００プローブ未満、１００から１０００プローブの間、５００から１０，０００プローブの間、１０００から５０，０００プローブの間、または５０，０００プローブ以上）。

【0115】

標的ＤＮＡメチル化配列決定は、様々な方法で行うことができる。メチル化シトシンまたは非メチル化シトシンのいずれかを変換するために、様々な酵素処理および化学処理との組合せを用いることができる。例えば、１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定は、それぞれの断片中の１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍＣ）および／または５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出することができる。別の例として、１以上の核酸試料のメチル化配列決定は、１以上の非メチル化シトシンまたは１以上のメチル化シトシンの、それぞれの断片における、対応する１以上のウラシルへの変換を含むことができる。１つまたは複数のウラシルは、メチル化配列決定の間、１つまたは複数の対応するチミンとして検出することができる。１つ以上の非メチル化シトシンまたは１つ以上のメチル化シトシンの変換は、化学変換、酵素変換、またはそのような組合せを含み得る。

【0116】

方法８００のステップ８０４は、第１のチャネルを含む第１のパッチを構築することを含むことができる。最初のパッチは、その種の参照ゲノムにおける最初の独立したＣｐＧ部位のセットを表すことができる。ＣｐＧ部位の最初の独立セットにおける各々のＣｐＧ部位は、参照ゲノム中の所定の位置に対応することができる。図６Ａに最初の貼付剤５３０－１の例の構造を示す。第１のパッチ５３０－１は、少なくとも１つのチャネル（例えば、第１のチャネル）を含むことができ、ここで、第１のチャネル５３２－１－１は、ＣｐＧ部位１からＬを含むＣｐＧ部位５３６－１－１－１の第１の独立したセットを含むことができ、ここで、Ｌは、正の整数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上、２０またはそれ以上、３０または５０またはそれ以上）であり得る。

【0117】

ＣｐＧ部位の最初の独立セットは、所定の数のＣｐＧ部位を含むことができる。ＣｐＧ部位の第一の独立セットは、参照ゲノムの選択された領域を含むことができる。ＣｐＧ部位の最初の独立セットは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１０００またはそれ以上のＣｐＧ部位を含むことができる。ＣｐＧ部位の最初の独立セットは、多くても１０００、５００、１００、５０、１０またはそれ以下のＣｐＧ部位を含むことができる。ＣｐＧ部位の第一の独立セットは、１２８のＣｐＧまたは２５６のＣｐＧ部位を含み得る。ＣｐＧ部位の第一の独立セットは、目的のＣｐＧ部位の所定のパネルから選択することができる。例えば、ヒトゲノムに存在する約２８００万個のＣｐＧ部位のうち、約１５０万個を標的メチル化配列決定によって検出することができる。標的化メチル化シークエンシングによって同定される１５０万のＣｐＧ部位（例えば、目的のＣｐＧ部位）のパネルは、標的化メチル化シークエンシング法によって予め決定することができ、または特定の実験目的に基づいて施術者によって選択することができる。ＷＧＢＳによるヒトメチロームの特徴付けは、安定にメチル化され、かつ同定可能な調節機能を持たないＣｐＧ部位と比較して、動的調節機能を有するか、または疾患に関連する一塩基多型を含むＣｐＧ部位を同定することができる。

【0118】

対象となるＣｐＧ部位の数は、先験的な知識に基づいて対象となる標的部位のサブパネルを用いて配列読取りをフィルタリングすることにより、さらに減少させることができる。例えば、対象となるＣｐＧ部位は、癌対非癌の検出において、または癌のタイプまたはサブタイプの間の鑑別において識別的または情報的であるゲノムのＣｐＧ部位または領域を同定する先験的知識によって得ることができる。目的の標的ＣｐＧ部位の一部は、ｐ値フィルター法を用いてデータセットからさらに削除することができる。興味深いＣｐＧ部位のサブパネルに含まれないＣｐＧ部位の除去は、データ前処理の間、またはデータ処理モジュール５６２および／またはデータ構築モジュール５６４を介してパッチ設計の間に実施することができる。パッチデザインの詳細および対象となるＣｐＧ部位の選択については、本稿の別の個所に記載されている。

【0119】

ＣｐＧ部位の最初の独立セットは、参照ゲノムのＣｐＧインデックスにあり得る。参照ゲノムのＣｐＧインデックスは、第１の独立セットのＣｐＧ部位に存在せず、第２のＣｐＧ部位と第３のＣｐＧ部位との間の参照ゲノムに位置する第１の独立セットのＣｐＧ部位を含むことができる。言い換えれば、パッチはＣｐＧインデックスからの非隣接ＣｐＧ部位を含むことができる。ＣｐＧ部位の第１の独立セットは、参照ゲノムのＣｐＧインデックスにおいて互いに隣接する第１のＣｐＧ部位および第２のＣｐＧ部位を含み得、複数の断片中の第１の断片は、第１のＣｐＧ部位を含み得るが、第２のＣｐＧ部位は含まれず、また、複数の断片中の第２の断片は、第２のＣｐＧ部位を含み得るが、第１のＣｐＧ部位は含まれない。したがって、隣接するＣｐＧ部位は、異なるユニークなメチル化配列決定断片上に存在することができる。逆に、ＣｐＧ部位の第１の独立セットは、参照ゲノムのＣｐＧインデックスにおいて互いに隣接する第１のＣｐＧ部位および第２のＣｐＧ部位を含み得、そして、複数の断片中の第１の断片は、第１のＣｐＧ部位および第２のＣｐＧ部位の両方を含むことができる。したがって、隣接するＣｐＧ部位は、同じユニークなメチル化配列決定断片上に存在することができる。ＣｐＧ部位の最初の独立セットは、参照ゲノム全体から引き出すことができる。メチル化配列決定によって得られた複数の断片中の各断片を参照ゲノムにアラインメントすることができる。参照ゲノムへのアラインメントは、複数の断片中の各断片におけるメチル化部位のアラインメント（例えば、メチル化パターン）を用いて行うことができる。参照ゲノムへのアラインメントは、複数の断片中の各断片における塩基対のアラインメントを用いて行うことができる（例えば、とりわけ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＲ、ＢＷＡ－ＭＥＭ、ＤＡＭＡＰＰＥＲ、ＮＧＭＬＲ、ＧｒａｐｈＭａｐ、ミニマップなどのプログラムを用いる）。

【0120】

第１のパッチの第１のチャネルは、第１の複数のパラメータの複数の例を含むことができ、ここで、第１の複数のパラメータの各インスタンスは、第１のパッチのＣｐＧ部位の第１の独立したセットにおける、それぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態（またはメチル化状態）に関するパラメータを含むことができる。

【0121】

図６Ａを参照すると、複数のインスタンスは、ＣｐＧ部位の第一の独立セットにおける各ＣｐＧ部位に対応する複数のパラメータを含むことができる。図６Ａに描かれているように、第１のパッチ５３０－１の第１のチャネル５３２－１－１は、複数のインスタンス５３４－１－１－１、５３４－１－１－２～５３４－１－１－Ｍを含み、ここで、Ｍは正の整数である。さらに、図６Ａにおいて、各インスタンスは、最初のインスタンス５３４－１－１－１－１－１、５３８－１－１－２、５３８－１－１－１－３、５３８－１－１－１－４・・・・５３８－１－１－１－１－１－Ｌ（ここでＬは正の整数である）を含み、各パラメータは、ＣｐＧ部位５３６－１－１－１の最初の独立した集合におけるＬＣｐＧ部位に対応する。同様に、図６Ａは、セカンドインスタンス５３４－１－１－１－２、５３８－１－１－２－１－２、５３８－１－２－１－３、５３８－１－２－１－４．．．．．．５３８－１－１－２－Ｌ、およびＭｔｈインスタンス５３４－１－１－１－Ｍ－１－Ｍ－２におけるＬパラメータ５３８－１－１－Ｍ－１－１－２、５３８－１－１－Ｍ－３、５３８－１－１－Ｍ－

【0122】

図６Ａの実施例パッチに図示されているように、複数の例および複数のパラメータは、代表的な２次元マトリックス（例えば、画像）を生成することができる。メチル化シークエンシングデータを２次元マトリックスに再編成することにより、回帰ニューラルネットワークに使用するのに適した入力を提供することができる。さらに、回帰ニューラルネットワークを用いたデータセットの分析は、フラグメント、サンプル、または被験者レベルでの複数のパラメータ（例えば、特性または属性）を含むように拡張することができる。例えば、２次元マトリックスは、複数の断片中のそれぞれの断片について局所的な情報を提供することができ、そこでは、断片間のメチル化状態パターンを、水平方向または垂直方向のいずれかで同定することができ、したがって、隣接するメチル化部位間または配列リード間の相関をそれぞれ同定することができる。

【0123】

２次元マトリックスのｙ軸は、最初のパッチの最初のチャネルの例数を増加させることによって増加させることができる。例えば、最初の複数のパラメータの複数の例は、２４から２０４８の間であり得る。最初の複数のパラメータの複数の例は、１２８でよい。最初の複数のパラメータの複数の例は、少なくとも１、１０、１００、１０００、１００００以上であり得る。いくつかの実施形態において、第１の複数のパラメータの複数の例は、せいぜい１００００、１０００、１００、１０またはそれ以下であり得る。最初の複数のパラメータの複数の例における例数は、複数の断片の期待読取深さに加えて、複数の断片を横切る１つの標準偏差に基づいて決定することができる。これはμ（読み深さ）＋σ（ｓｔｄ）で表すことができる。開発）いくつかのそのような実施形態において、第１の複数のパラメータの複数の例における多数の例は、本明細書の別の個所に記載されている配列決定法から得られる複数の断片の予想読取り深さに基づいて決定することができる。例えば、全ゲノム配列決定によって行われる配列決定は、被験体のゲノムにわたって、少なくとも１ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、少なくとも２０ｘ、少なくとも３０ｘ、または少なくとも４０ｘの平均配列決定深度を有することができる。標的パネルシークエンスのためのシークエンス深度は、１，０００ｘ、２，０００ｘ、３，０００ｘ、５，０００ｘ、１０，０００ｘ、１５，０００ｘ、２０，０００ｘ、または約３０，０００ｘを含むが、これらに限定されないはるかに深いものとなる可能性がある。配列決定深さは３０，０００ｘより深いことがあり、例えば、少なくとも４０，０００ｘまたは５０，０００ｘである。

【0124】

最初の複数のパラメータのインスタンスにおけるメチル化状態に関するパラメータは、複数の断片中のそれぞれの断片について、メチル化配列決定によってそれぞれの断片中の対応するＣｐＧ部位がメチル化されていると決定された場合にメチル化されること、メチル化配列決定によってそれぞれの断片中の対応するＣｐＧ部位がメチル化されていないと決定された場合にメチル化されないこと、または、メチル化配列決定によってそれぞれの断片中の対応するＣｐＧ部位がメチル化されているかまたはメチル化されていないと決定された場合にメチル化されないことを含むことができる。他のパラメータは、メチル化シークエンシングが、それぞれの断片の全体をまとめて重複することができない場合、基礎となるＣｐＧ部位がペアードエンドリードによってカバーされない場合および／またはメチル化シークエンシングリードが断片と重複することが見出されない場合にあいまいであるため、それぞれの断片のメチル化シークエンシングが、それぞれの断片における対応するＣｐＧ部位の予想される位置での対応するＣｐＧ部位と一致しないヌクレオチドを見つけた場合に、バリアントとしてフラグングされ、それぞれの断片のメチル化シークエンシングがペアエンドシークエンシングであり、対応するＣｐＧ部位をカバーするペアードのメチル化状態が、それぞれの断片における対応するＣｐＧ部位に対する同一のメチル化状態を報告しない場合、または、それぞれの断片のメチル化シークエンシングが、対応するＣｐＧ部位のメチル化状態を解消できない場合に、不明としてフラグングされた場合に、あいまいであるため、他のパラメータを含むことができる。メチル化状態には、以下が含まれるが、これらに限定されない：メチル化されていない、メチル化されている、あいまいである（例えば、基礎となるＣｐＧは、一対の配列読取りにおいて、いかなる読取りによってもカバーされない）、バリアント（例えば、読取りは、参照配列に基づいてその予想される位置で起こるＣｐＧと一致せず、部位における実際の変異体または配列エラーによって引き起こされ得る）、または葛藤（例えば、２つの読取りが両方ともＣｐＧと重複するが、一致しない場合）。あいまい、変種、葛藤などのメチル化状態はあいまいな状態（例えば、他の状態）に崩れる可能性がある。したがって、ＣｐＧ状態には、メチル化された状態、メチル化されていない状態、あいまいな状態の３つの可能な状態を含むことができる。

【0125】

第１のパッチを構築することは、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ複数の断片中の各断片について、それぞれの断片のメチル化パターンに基づく第１の複数のパラメータの全部または一部のインスタンスをポピュレーションすることを含むことができる。複数の断片中のそれぞれの断片をＣｐＧ部位の第一の独立セットにアラインメントすることは、断片がＣｐＧ部位の第一の独立セット中のすべてのＣｐＧ部位を含むことを含まない可能性がある。

【0126】

最初のパッチの構築は、さらに、それぞれのｐ値または参照ゲノムにおけるそれらの開始位置に基づいて、最初のパッチに割り当てられたそれぞれの断片を選別／選択することを含むことができる。例えば、断片をそのｐ値によって、またはそれらの出発ＣｐＧ位置によってランク付けすることによって、最初のパッチにポピュレーションする前に、断片を選別／選択することができる。断片は断片長によって選別／選択できる。フラグメントは、フラグメントセンタリングの優先順位付け（例えば、ミドルアウトまたは中央に配置されたフラグメントの選択）またはインスタンス充填の優先順位付け（例えば、トップダウンまたはトップランクのフラグメントのカップルの選択）により、最初のパッチのインスタンスにポピュレーションすることができる。異なる方法（例えば、ｐ値による断片の選別、またはトップダウンまたはミドルアウトを用いた位置および／またはポピュレーションインスタンス）による最初のパッチの構築は、２次元マトリックス（例えば、パッチ）における差を生じ得る。異なる方法によるファーストパッチの構築は、がん種の一貫した分類をもたらす可能性がある。例えば、上記の実施形態のいずれかまたはそれらの組合せを用いた最初のパッチのポピュレーションは、サンプル間で再現性があり安定している安定したパターンを生成することによって、成功した分類のためのネットワーク入力を提供することができる。図６Ｃは、２次元マトリックスとして表される、非癌ｃｆＤＮＡから得られたメチル化シークエンシング断片で集団化されたパッチの例を例示する。インスタンスはｙ軸で表すことができるが、ＣｐＧ部位に対応するパラメータ（メチル化されている場合は黒色、メチル化されていない場合は暗灰色、その他の場合は白色、空の場合は明灰色）はｘ軸で表すことができる。断片情報は、パッチ内の各ピクセルに対するセル遮光によって表記することができる。

【0127】

第１のパッチの構築は、複数の断片中のそれぞれの断片について、ｉ）第１のチャネルの第１の複数のパラメータ内で、複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が割り当てられていない、それぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを同定し、およびｉｉ）同定されたパラメータの中で、それぞれの断片の対応するＣｐＧ部位、それぞれの断片の対応するＣｐＧ部位のメチル化状態に整列する、各パラメータについて割り当てることを含むことができる。例えば、図６Ｄでは、同定ステップは、フラグメントがチャネルに割り当てられていないので、任意のインスタンスを使用することができる。したがって、図６Ｅに例示されるように、第１の断片６０２を、第１の複数のパラメータのインスタンス６０４に割り当てることができる。最初の断片は、最初の断片のＣｐＧ部位に対応する最初の複数のパラメータのインスタンス６０４内のそれらのＣｐＧ部位に割り当てることができる。

【0128】

複数の断片中の１つ以上の断片は、複数の断片が共通のＣｐＧ部位を持たない場合には、第１パッチ中の第１のチャネルの第１の複数のパラメータの単一インスタンスに割り当てることができる。したがって、図６Ｄおよび６Ｅの例を続けて、第２の断片ＣｐＧ部位が第１の断片のＣｐＧ部位と重複していなければ、第２の断片６０６を第１の複数のパラメータのインスタンス６０４に割り当てることができ、これは図６Ｆに例示されている。したがって、図６Ｆでは、複数の断片が単一のインスタンスに集団化されている場合、それぞれの断片は、インスタンス内の複数の断片中の他のいずれの断片とも重複しない可能性がある。このようにして、複数のパラメータのインスタンスを、断片のＣｐＧ部位が互いに重複しないことを条件として、１つ以上、２つ以上、３つ以上、１０以上、または２０以上の断片を割り当てることができる。第１および第２の断片のＣｐＧ部位にオーバーラップがある場合、２つの断片は、複数のパラメータの同一インスタンスには存在できない。したがって、第２の断片６０６は、図６Ｆに示されているようにインスタンス６０４に割り当てられる代わりに、図６Ｇに示されているようにインスタンス６０８に割り当てることができる。

【0129】

第一のチャネルの第一の複数のパラメータの多数の例が、それぞれのフラグメントを割り当てることができない場合、方法８００は、フラグメントを割り当てられていない第一のチャネルの複数のパラメータの例におけるゼロ充填パラメータをさらに含むことができる。例えば、図６Ｃでは、多数のインスタンス（Ｙ軸）は、それぞれの断片を割り当てることができず、そしてこれらのインスタンスにおける各パラメータは、ゼロまたは何らかの他の名義値を割り当てることができる。

【0130】

同定が、第１のチャネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内で、複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないそれぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを同定することができない可能性がある場合、この方法は、さらに、それぞれの断片を廃棄することを含むことができる。図６Ｇを参照すると、図示されたチャネルの列はすべて、ＣｐＧ部位がチャネルにまだ割り当てられていないそれぞれの断片のＣｐＧ部位と重複する少なくとも１つの断片を含むことができる。そのような例では、まだチャネルに割り当てられていないそれぞれの断片を捨てることができる。

【0131】

最初のパッチの複数の例の例数を増やして、より高い読取深度に対応できるようにすることができる。複数の例における例数は、３００例まで、５００例まで、１０００例まで、５０００例まで、１０，０００例まで、または１０，０００例以上とすることができる。したがって、図６Ｄ～６Ｎを参照すると、このような実施形態における行の数は、最大３００、最大５００、最大１０００、最大５０００、最大１０，０００または１０，０００を超えるものとすることができる。ｐ値閾値は、断片の選択の厳密性を増加させ、高シグナルメチル化パターンを有するすべての断片が、複数の例に確実にポピュレーションされるようにするために、減少させることができる（それにより、適格な断片の数を低下させる）。実施例８で議論したように、パッチ構築のためのハイパーパラメータを調整することにより、読取深度を変化させることができる。実施例８に記載されているように、パッチ構築のための超パラメータを調整することによってｐ値を変化させることができる。ハイパーパラメータ値は、アッセイの特定の要素（例えば、サンプルサイズ、サンプルタイプ、メチル化シークエンシングの方法、フラグメントの質、特にメチル化パターン）に基づいて決定することができる。ハイパーパラメータ値は実験的最適化を用いて決定できる。ハイパーパラメータ値は事前のテンプレート値に基づいて割り当てることができる。

【0132】

同定が、第１のパッチの第１のチャネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内で、複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないそれぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを同定することができない場合、この方法は、さらに、第１のパッチの追加インスタンスを作成し、第１のパッチの追加インスタンスにそれぞれの断片を割り当てることを含むことができる。したがって、図６Ｄを参照すると、図６Ｄに示したパッチにそれぞれの断片のスペースがなければ、図６Ｄに示したパッチの新たな空のレプリカ、またはパッチの追加インスタンスを作成することができる。この方法はさらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０を超える追加パッチまたは例を作成することを含むことができる。追加貼付剤は、最初の貼付剤（原貼付剤など）と同じ構造をとることができる（図６Ｄなど）。したがって、追加のパッチまたは重複したパッチは、例えば、同じ数の例、独立したＣｐＧ部位の同じセット、同じ数のチャネル、および／または、とりわけ、元のパッチの同じ特性を含むことができる。追加貼付剤は、最初の貼付剤（例：元の貼付剤）と同一の構造を有していない可能性がある。追加の例は、図６Ｄに例示される他の例と同じまたは異なる構造を含むことができる。

【0133】

それぞれの断片のメチル化パターンは、第１パッチの第１の独立したＣｐＧ部位セット中の各ＣｐＧ部位を含んでおらず、第１パッチを構築することができ、複数の断片中のそれぞれの断片について、それぞれの断片中に存在するＣｐＧ部位に対応する第１の複数のパラメータのインスタンス中にポピュレーションするパラメータ（例えば、パラメータに数値を割り当てる）を含んでいてもよい。最初の複数のパラメータのインスタンスにおけるパラメータはゼロを埋めることができる。したがって、例えば、図６Ｆを参照すると、断片６０２および６０６によって占められていないインスタンス６０４内のこれらのパラメータはゼロであることができる。

【0134】

第１のパッチの構築は、第１のパッチの第１の独立したＣｐＧ部位のセットの産物および／または第１の複数のパラメータの複数の例における例数が、事前に決定された制約を満たすために最小化されることを含むことができる。例えば、ＣｐＧ部位の第１の独立セットが「１００」であり、かつ第１の複数のパラメータの複数の例における例数が「５０」である場合、第１のパッチの第１の独立セットのＣｐＧ部位および第１の複数のパラメータの複数の例における例数の積は、５０００とすることができる。所定の制約は、最大でも１００万、５００，０００、１００，０００、５０，０００，１０，０００、１０００、１００以下であり得る。いくつかの実施形態において、所定の制約は、少なくとも１００、１０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００またはそれ以上であり得る。第一パッチの構築は、第一パッチの第一の独立したＣｐＧ部位の第一のセットが、ＣｐＧ部位を横切る高次の特徴を捕捉するためにあらかじめ決められた最小数のＣｐＧ部位（例えば、３０以上、５０以上、または１００以上）を含むことができる。

【0135】

最初のパッチの構築は、最初のパッチのＣｐＧ部位の最初の独立セットにおけるＣｐＧ部位の数および最初の複数のパラメータの複数の例における例の数が、あらかじめ構築されたマトリックスとして同じ対応する次元（ＣｐＧ部位の数、例数）を含むことができる。事前に構築されたマトリックスは、事前に訓練されたネットワークが新しい入力（例えば、新しいサンプル）を分類するために使用できるように、事前に訓練されたネットワークであり得る。いくつかの実施形態において、事前に構築されたマトリックスは、事前に訓練されたネットワークへのインプットとして使用することができる。第１のパッチの構築は、第１のパッチの第１の独立したＣｐＧ部位の第１のセットが、複数の断片中の個々の断片が第１のパッチのポピュレーションの間に人工的に分割されないように分配されることを含むことができる。最初のパッチの構築には、最初のパッチの第一の独立したＣｐＧ部位の第一の独立したセットが、第一のパッチにおける第一の独立したＣｐＧ部位のセットがセグメント化せず、ＣｐＧ部位密度の高い領域を切断または排除しないように分配され得ることを含むことができる。

【0136】

データセットを取得した後、第１パッチを構築する前、または被験体の疾患／癌状態を決定する任意の段階において、方法８００は、さらに、それぞれの断片中の複数のＣｐＧ部位を横切る対応するメチル化パターンがｐ値閾値を満たさないｐ値を有する各断片をそれぞれ複数の断片から除去することによって、複数の断片を剪定することを含むことができる。それぞれの断片のｐ値は、それぞれの断片の複数のＣｐＧ部位を有する複数の参照断片中の複数のＣｐＧ部位のメチル化パターンの分布に対するそれぞれの断片のメチル化パターンの比較に基づいて決定することができる。複数の参照断片中の各参照断片のメチル化パターンは、１つ以上の共通の特性を有する被験体のコホート（例えば、健康な被験体のコホート、喫煙する健康な被験体のコホート、喫煙しない被験体のコホート、男性被験体のコホート、女性被験体のコホート、閾値年齢を超える被験体のコホート、特定の年齢範囲にある被験体のコホート、特定の遺伝子突然変異のセットを有する被験体のコホート、特定の人種の被験体のコホートなど）から得られる生物学的試料からの核酸のメチル化配列決定によって得ることができる。この複数の参照フラグメントは、被験者の健康なコホートから得ることができる。被験者の健康なコホートは、少なくとも１０、２０、５０、１００、１０００またはそれ以上の被験者を含むことができる。

【0137】

がん陽性患者の血液サンプルから得られた断片の大部分は、血流中に排出された健康な細胞に由来する可能性がある。このような場合、メチル化配列決定から得られる複数の断片のサブセットは、癌組織に由来し得る。図３および図４の実施例ワークフローに概説されているように、ｐ値フィルターは、健康な（例えば、非癌または「正常な」）組織と比較して、高度に差別的なメチル化状態を有さない読取りを除去するために使用することができる。これは、健康なサンプルのコホート（例えば、約１３０－１５０）を用いてフラグメントメチル化パターンの正規分布を決定する生成モデル（例えば、モデル分布）を用いて行うことができる。各モデル分布が各遺伝子座の健康なメチル化状態を表すことができるように、基準分布を各遺伝子座で生成することができる。参照試料の分布に基づき、観察された断片についてｐ値を求めることができる。ここで、ｐ値は、少なくとも観察された断片の場合と同等に可能性の低いメチル化パターンを観察する確率とすることができる。Ｐ値は、各生体試料について、複数の断片中の各断片について計算することができ、したがって、優先度の低いまたは低いシグナルメチル化パターン断片（例えば、健康な細胞から）を除去し、潜在的に興味または識別値のそれらの断片を保持するハイパスフィルターを提供する。ｐ値の閾値は、せいぜい０．１、０．０５、０．０１、０．００１以下とすることができる。ｐ値の閾値は、少なくとも０．０００１、０．００１、０．０１、０．０５、０．１以上とすることができる。

【0138】

図６Ｈを参照し、第１のパッチを例示するために図６Ａの命名法を使用すると、第１のチャネル５３２－１－１および第２のチャネル５３２－１－２を含む複数のチャネルを含むことができる。各チャネルは、一つの特性（例えば、最初の特性のパラメタ）に関連する情報またはデータを表現することができる。図６Ａにおいて、第２チャネル５３２－１－２は、第１チャネル５３２－１－１の第１の複数のパラメータの各インスタンスに対する第２の複数のパラメータを含むことができ、ここで、第２の複数のパラメータの各インスタンスは、第１のパッチに対するＣｐＧ部位の第１の独立したセットにおける、ＣｐＧメチル化状態以外の、第１の特性に対するパラメータを含むことができる。第１のパッチの構築は、ＣｐＧ部位の第１の独立セット、第１の複数のパラメータの全部または一部のインスタンス、およびそれぞれの断片のメチル化パターンに基づく第２の複数のパラメータの全部または一部のインスタンスに並ぶ、複数の断片（例えば、図６Ｈの断片６０２および６０６）中の各断片について、ポピュレーションを含むことができる。第２のチャネル５３２－１－２は、それぞれのＣｐＧ部位、それぞれの断片、それぞれのサンプル、またはそれぞれの被験体についての追加の特徴および／または属性を表す別の２次元マトリックスを含むことができる。したがって、図６Ａおよび６Ｈは、第１の特徴（例えば、ＣｐＧカバー率）を含む第２のチャネル５３２－１－２を例示することができる。図６Ａおよび６Ｈの例示的な実施形態では、第２のチャネルは、複数のＭインスタンス（例えば、図６Ａおよび６Ｈに図示されているようにＹ軸に沿って）を含むことができ、ここで、各インスタンスは、第１のチャネル５３２－１－１のＬＣｐＧ部位５３６－１－１－１の第１の独立したセットに対応する複数のパラメータ（図６Ａおよび６Ｈに列として図示されている各複数）を含む。次に、第２チャネル５３２－１－２内の複数の例におけるインスタンスＭについて、図６Ａの５３８－１－２－Ｍ－１、５３８－１－２－Ｍ－２、５３８－１－２－Ｍ－３、５３８－１－２－Ｍ－４、および５３８－１－２－Ｍ－Ｌによって、複数のパラメータを示すことができる。したがって、断片６０２および６０６を、図６Ａおよび６Ｈに図示されたパッチによって表されるゲノムの領域にアラインメントすることができ、アラインメントされた断片中のＣｐＧ部位の状態を用いて、図６Ｈに図示されているように、これらのＣｐＧ部位に対応するパッチのチャネル５３２－１－１のパラメータをポピュレーションすることができる。チャネル５３２－１－１の中にそのようにポピュレーションされた各そのようなパラメータに対して、図６Ｈの中で示されるように、第二のチャネル５３２－１－２の中に対応するパラメータが存在することができる。これらの対応するパラメータは、次に、チャネル５３２－１－２が表すそれぞれのＣｐＧ部位、それぞれの断片、それぞれのサンプル、またはそれぞれの被験体についての追加の特徴および／または属性に関連する値を記入することができる。例えば、チャネル５３２－１－２がフラグメントマッピングスコアのバイナリ表現である場合、ソースフラグメントがマッピングしきい値を満たすマッピングスコアを有するとき、追加特性は「１」（説明のために図６Ｈでは左リーニングハッシュマークによって表される）とすることができ、ソースフラグメントがマッピングしきい値を満たさないマッピングスコアを有するとき、追加特性は「０」（説明のために図６Ｈでは右リーニングハッシュマークによって表される）とすることができる。図６Ｈに示すように、フラグメント６０６は、マッピング閾値を満たすマッピングスコアを有することができ、一方、フラグメント６０２は、マッピング閾値を満たさないマッピングスコアを有することができる。チャネル２（２番目のチャネル）の特徴はフラグメントレベルの特徴であり得るが、チャネル１（１番目のチャネル）の特徴は個々のＣｐＧ部位のレベルにあり得ることに注意すること。したがって、チャネル２については、与えられた断片に対応するパラメータのすべてが断片レベルの値をとるのに対し、チャネル１については、断片を表す各パラメータは異なる値をとることができる（ＣｐＧメチル化）。これは、任意のチャネルが、異なる解像度（例えば、ＣｐＧ部位の分解能、フラグメントの分解能など）で、チャネルパラメータを介してどのようにサンプルを採取し、報告できるかを示すことができる。

【0139】

複数の断片における第１のパッチの構築は、ｉ）第１の複数のパラメータの中で、第１のチャネルの第１の複数のパラメータの中で、複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が割り当てられていないそれぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを同定すること（図６Ｇで上述）、ｉｉ）特定されたパラメータの中で、それぞれの断片のＣｐＧ部位に並ぶパラメータ、それぞれの断片のＣｐＧ部位のメチル化状態（図６Ｇで上述）を割り当てること、及びｉｉｉ）特定されたパラメータの中で、第１の複数のパラメータの第２のパラメータのうち、それぞれの断片のＣｐＧ部位、それぞれの断片のＣｐＧ部位の第１の特性（チャネル５３２－１－１について図６Ｈで図示）に対応する第２の複数のパラメータの第２のパラメータの中で、それぞれの断片のＣｐＧ部位の第１の特性（チャネル５３２－１－１について図６Ｈで図示）を割り当てること、を含むことができる２）、前述したように。したがって、それぞれの断片のメチル化パターンに基づいて、第１の複数のパラメータの全てまたは一部のインスタンスにポピュレーションされる断片について、メチル化状態およびそれぞれの断片のメチル化状態以外のそれぞれのＣｐＧ部位の第１の特徴の両方を、図６Ｈに例示されるように、第１および第２のチャネルにおける対応する例にそれぞれポピュレーションすることができる。

【0140】

複数の断片中の１つ以上の断片が、図６Ｆに例示されるように、複数の断片が共通のＣｐＧ部位をもたないことを条件に、第１のパッチ中の第１のチャネルの第１の複数のパラメータの単一インスタンスに割り当てることができる。複数の断片が共通のＣｐＧ部位を持たない場合には、第１のパッチにおける第１のチャネルおよび第２のチャネルの第１の複数のパラメータの単一インスタンスに、１つ以上の断片を割り当てることができる。

【0141】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、図６Ｈのチャネル５３２－１－２の特徴）は、それぞれのＣｐＧ部位がオンであるそれぞれの断片の多重性を含むことができる。特に、第１のパッチの第２のチャネルにおける第１の独立セットのＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位について、第１の特徴は、それぞれのＣｐＧ部位に並ぶそれぞれの断片によって表される多数の重複断片を表す多重性を含み得る。たとえば、複数の断片が同一の開始位置と終了位置をもち、それぞれの断片に含まれるすべてのＣｐＧ部位で同じメチル化状態を示す場合には、同一の倍数とみなすことができる。いくつかの実施形態において、多重度は、互いに少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の重複ＣｐＧ部位を有する多数の断片を表すことができる。このように断片の多重性は、貴重な情報を保持しながら、入力データセットのサイズを小さくすることができる。複数の同一の断片が複数の細胞に由来することがある。図６Ｉでは、チャネル５３２－１－２の特性がフラグメントマッピングスコアを含む図６Ｈの場合ではなく、チャネル５３２－１－２の特性が多重性を含むことができる。さらに、フラグメント６０６は４の多重度を有し得るが、フラグメント６０２は１の多重度を有する。生物学的試料中に、断片６０６のＣｐＧ部位を有する４つの配列読取りと、断片６０２のＣｐＧ部位を有する１つの配列読取りとがあり得る。複数の同一の断片が同一の細胞に由来することもある。複数の同一断片は、ＰＣＲ増幅からではなく、メチル化配列決定から得られる断片を含むことができ、そこでは、ＰＣＲ増幅から生じた重複物が、データ前処理の間にデータセット（例えば、ｄｅ－ｄｕｐｅｄ）から除去される。ＰＣＲ増幅から生じる重複は、ノーマライゼーションおよび／または濃縮段階を用いてさらに減少させることができる。

【0142】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、健康なコホートから引き出されたＣｐＧβ値を含み得る。β値は、（ｉ）メチル化プローブ強度（例えば、メチル化ＣｐＧ部位強度）と（ｉｉ）メチル化プローブ強度と非メチル化プローブ強度の合計の間の比とすることができる。メチル化されたプローブ強度は、ＣｐＧ部位、領域、全ゲノムのメチル化状態（例えば、メチル化された部位のパーセンテージ）を示すことができる。メチル化プローブ強度は、特定のＣｐＧ部位を覆う断片の総数に対する特定のＣｐＧ部位でのメチル化断片の数の比を示すことができる。次いで、与えられた試料についての各ＣｐＧ部位におけるメチル化状態のβ値は、低メチル化または高メチル化されている断片の数を、それぞれのＣｐＧ部位における複数の断片のメチル化状態のパーセンテージとして表すことができる。例えば、それぞれのＣｐＧ部位についての参照β値は、「健康な」コントロールまたは参照試料中のＣｐＧ部位におけるメチル化のパーセンテージを定量することができる。

【0143】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、コホート（例えば、健康な被験者のコホート、喫煙する健康な被験者のコホート、喫煙しない被験者のコホート、男性被験者のコホート、女性被験者のコホート、閾値年齢を上回る被験者のコホート、特定の年齢範囲にある被験者のコホート、特定の遺伝子変異のセットを有する被験者のコホート、特定の人種の被験者のコホートなど）から導かれたＣｐＧＭ値、健康なコホートにおける所定の組織型から導かれたＣｐＧＭ値、または被験者から導かれたＣｐＧＭ値を含み、ここで、Ｍ値はメチル化プローブ対非メチル化プローブの強度の対数２比として計算される。Ｓｅｅ，Ｄｕｅｔａｌ．，２０１０，ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＢｅｔａ－ｖａｌｕｅａｎｄＭ－ｖａｌｕｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｂｙｍｉｃｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓ，“ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１１：５８７，ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１０５－１１－５８７であり、ここではその全体を引用してここに組み込む。このような特徴は、ＣｐＧの分解能にある可能性があり、図６Ｊに図示されている。図６Ｊでは、チャネル５３２－１－２の特性がフラグメントマッピングスコアとなり得る図６Ｈの場合ではなく、チャネル５３２－１－２の特性は、健康なコホートから導かれたＣｐＧβ値またはＭ値となり得る。さらに、図６Ｈおよび６Ｉとは異なり、チャネル５３２－１－２の特徴は、断片の供給源ではなく、むしろＣｐＧ部位そのものと関連している可能性がある。したがって、図６Ｊのチャネル５３２－１－２の各カラムにおけるチャネル５３２－１－２値は、各カラムが参照配列（参照ゲノム）中の同じＣｐＧ部位を表しているので、同じ値を有することができる。すなわち、図６Ｊのチャネル５３２－１－２の各列は、チャネル５３２－１－２によって表される参照ゲノム中の対応するＣｐＧ部位のβ値またはＭ値を表す。健康なコホートを用いるのではなく、他の特性の特性又は組み合わせを有する被験者のコホートを用いることができる（例えば、喫煙する健康な被験者のコホート、喫煙しない被験者のコホート、男性被験者のコホート、女性被験者のコホート、閾値年齢を超える被験者のコホート、特定の年齢範囲にある被験者のコホート、特定の遺伝子変異のセットを有する被験者のコホート、特定の人種の被験者のコホートなど）。それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、被験体から引き出されるＣｐＧβ値を含み得る。これは、β値が健康なコホートの断片ではなく、試験対象のすべての断片にわたって存在し得るという例外を除いて、図６Ｊのように正確に見える結果を有し得る。

【0144】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、５’および３’隣接ＣｐＧ部位のメチル化状態についてのピアソンの相関スコアを含み得る（コホートまたは示された与えられた対象からのいずれかからの）。これは、与えられたカラムの値が、（ｉ）与えられたカラムの左へのカラムにおけるＣｐＧのメチル化状態、および（ｉｉ）試験対象の全断片にわたる与えられたカラムの右へのカラムにおけるＣｐＧのメチル化状態、または代替的に、本明細書の別の記載のコホートの相関の尺度（例えば、ピアソンの相関）であるという例外を除いて、図６Ｊのように見える結果を有し得る。例えば、図６Ｋを参照すると、チャネル５３２－１－２のカラム６１０の特性は、チャネル５３２－１－１の所定のＣｐＧ部位に対応することができる（図６Ｊの）。さらに説明するために、このＣｐＧ部位にマップされる１０個の断片６２０－１、。。。６２０－１０があり、与えられたＣｐＧ部位の左側に１０個のＣｐＧ状態（１０個の断片のそれぞれに１個ずつ）があり、与えられたＣｐＧ部位の右側に１０個のＣｐＧ状態（１０個の断片のそれぞれに１個ずつ）がある。これら１０個の断片は、被験体から得ることができる。１０個の断片はコホート由来である。ＣｐＧ部位に置かれる値は、（ｉ）与えられたＣｐＧ部位の左側への１０個のＣｐＧ状態のメチル化状態（Ｘ値）と、（ｉｉ）与えられたＣｐＧ部位の右側への１０個のＣｐＧ状態のメチル化状態（Ｙ値）との間のピアソンの相関スコアであり得る。すなわち、（１，０）はフラグメント６２０－１について、（０，０）はフラグメント６２０－２についてなどである。ピアソンの相関係数計算器を用いてこの例のピアソンの相関スコアを計算すると、この例ではＸとＹの間にｒ（８）＝０．６７、ｐ＝０．３４のピアソン相関を示すことができる。ここで、（８）は１０サンプルを与えた自由度８を示し、これに対するｐ値は０．３４である。したがって、このＣｐＧ部位に対応するチャネル５３２－１－２のパラメータ６１０の全列を、図６Ｋに例示されるように値．６７に設定することができる。

【0145】

本明細書中の別の記載のコホートまたは示された与えられた対象からのいずれかの、５’および３’隣接ＣｐＧ部位のメチル化状態に対するピアソンの相関スコアよりもむしろ、特性は、健康なコホートに対して、被験対象におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態のＪａｃｃａｒｄ類似性（またはＪａｃｃａｒｄインデックス、Ｊａｃｃａｒｄ類似係数、およびＵｎｉｏｎを超える相互作用）を含み得る。Ｊａｃｃａｒｄ類似性インデックス（またはＪａｃｃａｒｄ類似性係数）は、２組のメンバーを比較して、どのメンバーが共有され、どちらが異なるかを見ることができる。Ｊａｃｃａｒｄ類似性指数は、０％から１００％の範囲で、２組のデータの類似性の尺度となりうる。Ｊａｃｃａｒｄ類似性指標は、交差の大きさを２組のデータの組合せの大きさで割ったものであることができる。したがって、図６Ｋの例をＪａｃｃａｒｄインデックスに適用することができるが、例外は、計算がＰｅｒｓｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎではなくＪａｃｃａｒｄ類似性のものであることである。左手および右ＣｐＧ部位（５’および３’ＣｐＧ部位）間のＪａｃｃａｒｄ類似性またはＰｅａｒｓｏｎ相関よりむしろ、オーバーラップ係数、単純マッチング係数、Ｓζｒｅｎｓｅｎ－Ｄｉｃｅ係数、重み付けＪａｃｃａｒｄ類似性、重み付けＪａｃｃａｒｄ距離、Ｔａｎｉｍｏｔｏ類似性または距離、距離メトリック、またはＴｖｅｒｓｋｙ指数を、本明細書の他の箇所に記載されるコホートまたは表される所定の対象からのいずれかから、５’および３’隣接ＣｐＧ部位のメチル化状態を用いて計算することができる。

【0146】

表１に距離測定基準の例を示す
[表１]距離メトリクスの例

【0147】

表１では、２つのメチル化状態ベクターとすることができる。それぞれのエレメントは、ｎ（ｎは正の整数である）断片のうちの１つの隣接するＣｐＧ部位のメチル化状態を表し、中央の主題ＣｐＧ部位にマッピングする断片を“１“または“０“のどちらかとする。ここで、“１“および“０“の値は、隣接するＣｐＧ部位について可能な２つのメチル化状態（メチル化および非メチル化）を表す。Ｘ＾ｐ＝［Ｘ＿１＾ｐ，…，Ｘ＿ｎ＾ｐ］ａｎｄＸ＾ｑ＝［Ｘ＿１＾ｐ，…，Ｘ＿ｎ＾ｑ］［Ｘ＿１＾ｐ，…，Ｘ＿ｎ＾ｐ］［Ｘ＿１＾ｐ，…，Ｘ＿ｎ＾ｑ］例えば、被験者の中央ＣｐＧ部位にマッピングされる複数の断片（ｎ断片）中の対応するＣｐＧ部位の５’隣接ＣｐＧ部位のメチル化状態を、各要素が被験者の中央ＣｐＧ部位にマッピングされる複数の断片中の対応する断片中の３’隣接ＣｐＧ部位のメチル化状態を表すことができるが、各要素は、被験者の中央ＣｐＧ部位にマッピングされる複数の断片中の対応する断片中の３’隣接ＣｐＧ部位のメチル化状態を表すことができる。Ｘ＾ｐＸ＾ｑまた、ｍａｘｉとｍｉｎｉは、それぞれｉｔｈ要素の最大値（“１“）と最小値（“０“）にすることができる。

【0148】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、それぞれの断片のｐ値を含むことができる。それぞれの断片のメチル化パターンを用いて、それぞれの断片と同じＣｐＧ部位をもつコホートの断片と比較して、チャネル内のそれぞれの断片のｐ値を計算することができる。したがって、図１８を参照すると、それぞれのフラグメント１８０２が、仮想的なメチル化パターン（１、１、０、１、１、１）を有する６つのＣｐＧ部位を有し、ここで、値「１」がメチル化されたことを示し、値「０」がメチル化されていないことを示す場合、式「（１、１、０、１、１、１）」は、それぞれのフラグメント１８０２のメチル化状態ベクター１８０３であり得る。この例では、それぞれの断片１８０２のメチル化パターンに対するｐ値を、同じ６つのＣｐＧ部位、例えば断片１８０４－１～１８０４－１００を有するコホートにおけるそれらの断片のメチル化パターンと関連させて決定することができる。それぞれの断片１８０２について、対照群データ１８０４と比較して、それぞれの断片のメチル化状態ベクター１８０３が生じる確率のサンプルは、それぞれの断片のメチル化状態ベクター中のＣｐＧ部位を包含する可能なメチル化状態ベクター１８０６－１、１８０６－２、１８０６－３、・・・、１８０６－Ｍのサブセットをランダムにサンプリングすることによって計算することができる。試験メチル化状態ベクター１８０３の長さは６であるので、フラグメント１８０２の６つのＣｐＧを包含するメチル化状態ベクターの２つの６可能性があり得る。一般的な例では、ｍｙｔｉｌａｔｉｏｎ状態ベクトルの可能性の数は２ｎである可能性があり、ここでｎはテストｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ状態ベクトルの長さである。サンプリングされた可能なメチル化状態ベクター１８０６の各々に対応する確率は、断片のメチル化状態ベクター１８０２およびサンプリングされた可能なメチル化状態ベクター１８０６について、例えばＭａｒｋｏｖ鎖モデルまたは何らかの他の形態のモデルを用いて計算することができ、それにより、サンプリングされた可能なメチル化状態ベクター１８０６の、それぞれの断片のメチル化パターン（メチル化状態ベクター）１８０３の確率以下に対応する割合を計算する。例えば、米国特許出版番号を参照のこと。ＵＳ２０１９－０２８７６５２Ａ１、以下を引用して組み込んでいる。隣接するＣｐＧ部位の関連性に関しては仮定がなされていない可能性があり、したがって、Ｍａｒｋｏｖ連鎖モデルを用いてｐ値を推定することはできない。例えば、米国特許出版番号で開示されているようなマルコフ連鎖モデルを用いるのではなく。ＵＳ２０１９－０２８７６５２Ａ１、統計的有意性を測定するための任意の技術は、モーメント母関数、組み合わせ法、指数族、漸近近近似、ガウス近似、ポアソン近似および大偏差近似を含むがこれらに限定されない、例として使用することができる。次に、この計算された割合に基づいて、それぞれの断片１８０２のメチル化パターン１８０３に対する推定ｐ値スコアを計算することができる。このｐ値は、本明細書の別の個所に記載されているように、断片１８０４が１つ以上の共通の特徴を有する被験体のコホートから引き出されるという、コホートにおいて、それぞれの断片１８０２または他のメチル化状態ベクターのメチル化状態ベクター１８０３を観察する確率をさらに低く表すことができる。これにより、ｐ値スコアが低くなると、コホートにはまれで、コホートに比べてフラグメントが異常にメチル化された状態で標識されるメチル化ベクターに一般的に対応することができる。断片１８０４が健康な被験体のコホートから引き出される例では、断片１８０２の高いｐ値スコアは、一般的に、健康な被験体において、相対的な意味で存在すると予想されるメチル化状態ベクター１８０３に関係し得る。断片１８０４が引き出されるコホートが非癌性グループである場合、例えば、メチル化状態ベクター１８０３に対する低いｐ値は、それぞれの断片１８０２がコホートに対して異常にメチル化されていることを示唆することができ、したがって、断片１８０２が引き出される被験体における癌の存在を示す可能性がある。

【0149】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、それぞれのＣｐＧ部位がオンであるそれぞれの断片の長さを含み得る。たとえば、図６Ｌでは、断片６０２は６２残基の長さをもつことができ、断片６０６は９８残基の長さをもつことができる。この場合、フラグメント６０２および６０６についてのチャネル５３２－１－２における対応するパラメータを、それぞれの値６２および９８とともに図示のようにポピュレーションすることができる。

【0150】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、断片配列源を含み得る。例えば、断片シークエンスソースは、被験体のシークエンス読取のために生検された器官を示すことができる。臓器は、「１」＝脳、「２」＝胃、「３」＝乳房、「４」＝肺、「５」血液などのルックアップテーブルでコード化することができる。与えられた被験体についての全ての断片が同一の器官または供給源由来である可能性が高いので、図６Ｍは、血液に由来する断片６０２および６０６が、チャネル５３２－１－２においてコードされている状況を例示することができる。供給源の器官をコードするよりも、断片配列ソースは、配列を得るために使用される配列決定のタイプを指定することができ、例えば、「１」は標的化された対末端配列決定を示し、「２」は標的化された単一末端配列決定を示し、「３」は対末端全ゲノム配列決定を示し、「４」は単一末端全ゲノム配列決定を示すなどである。チャネル５３２－１－２の第一の特徴は、配列リードが増幅され、配列決定された特定の方法を示すことができ、そこでは、ルックアップテーブルを用いて、様々な異なる可能性を追跡することができる。例えば、「１」＝５’トランスクリプトームキット、「２」＝３’トランスクリプトームキットなどである。

【0151】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、それぞれのフラグメントのフラグメントマッピング品質スコアを含み得る。断片マッピング品質スコアは、ＥｗｉｎｇおよびＧｒｅｅｎ，１９９８の技術、「フレッドを用いた自動シークエンサートレースのベースコール」を用いて計算することができる。ｉｉ．ゲノム研究所のエラー確率８：１８６-１９４．図６Ｌはこのような帰属を説明することができ、フラグメント６０６は９８のマッピング品質を有し、フラグメント６０２は６２のマッピング品質を有する。断片に寄与した複数のシークエンスリード（例えば、断片の多重度が１を超える）の場合、断片マッピングの質スコアは、複数のシークエンスリードのマッピングの質スコアの平均となりえる。

【0152】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、参照ゲノム中の５’隣接ＣｐＧ部位（または３’隣接ＣｐＧ部位までの距離）までの距離（例えば、ヌクレオチド数）を含み得る。図６Ｎでは、チャネル５３２－１－２の特徴は、与えられたＣｐＧがその近傍のＣｐＧ部位までの５’距離（または３’隣接ＣｐＧ部位までの距離）であり得る。さらに、図６Ｈや図６Ｉとは異なり、図６Ｎのチャネル５３２－１－２の特徴は断片の供給源ではなく、むしろＣｐＧ部位そのものと関連づけることができない。したがって、図６Ｎのチャネル５３２－１－２の各カラムにおけるチャネル５３２－１－２値は、各カラムが参照配列（参照ゲノム）中の同じＣｐＧ部位を表すため、同じ値を有することができる。図６Ｎのチャネル５３２－１－２の各列は、与えられたＣｐＧがその近傍のＣｐＧ部位までの５’距離（または３’隣接ＣｐＧ部位までの距離）を表すことができる。距離は、直線ヌクレオチドスケール、対数ヌクレオチドスケール、またはヌクレオチドスケールのいくつかの他の機能であり得る。

【0153】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、それぞれのＣｐＧ部位が内部にある遺伝的要素を含み得る。このような遺伝的エレメントの例としては、特に、プロモーター／エンハンサー領域、エキソン、イントロン、ヒストン修飾マーク、ＣｐＧアイランド／海岸／貝殻、進化的保存部位、転写因子結合部位、制限部位、交差ホットスポット滴下剤部位、およびポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝因子は、「１」＝エキソン、「２」＝イントロン、「３」＝制限部位などのようなルックアップ表でコード化することができる。

【0154】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、それぞれのＣｐＧ部位に関連する生物学的経路（例えば、１つ以上の遺伝子によって誘発され得る１つ以上の遺伝子または生物学的機能によって誘発される細胞内の分子間の複数の相互作用）を含み得る。第一の特徴は、主題のＣｐＧ部位を含むそれぞれの断片の生物学的経路を含み得る。したがって、ある生物学的経路が１０個の遺伝子によって引き起こされる１つ以上の生物学的機能を含み、それぞれの断片がこれらの遺伝子の１つにマップされる場合、最初の特徴は与えられた生物学的経路となり得る。生物学的経路は、ルックアップテーブルでコード化することができる。このように、図６Ｉのフラグメント６０６は、生物学的経路「４」としてのルックアップテーブルにコードされた生物学的経路にマップすることができ、フラグメント６０２は、生物学的経路「１」としてのルックアップテーブルにコードされた生物学的経路にマップすることができる。生物学的経路の例は、Ｆａｂｒｅｇａｔらに見出される。２０１８ＰＭＩＤ：２９１４５６２９、金久・後藤、２０００、「ＫＥＧＧ：ＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ」、核酸研究。２８（１），ｐｐ．２７－３０、各項目は以下に引用を含める。

【0155】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、それぞれのＣｐＧ部位に関連する遺伝子を含み得る。より詳細には、第一の特徴は、主題のＣｐＧ部位を含むそれぞれの断片がマッピングする遺伝子であり得る。遺伝子はルックアップテーブルでコード化することができる。このように、図６Ｉの断片６０６は、遺伝子「４」として、また断片６０２は、遺伝子「１」として、ルックアップテーブルにコードされた生物学的なものにマップすることができる。それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、それぞれのＣｐＧ部位についてのＣｐＧ遷移インパルス関数の値を含み得る。それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、ＣｐＧ部位がＣｐＧアイランドの一部であるかどうかの決定を含むことができる。Ｙｕら、２０１７年、「ＧａｕｓｓｉａｎＣｐＧ：ヒトゲノム配列におけるＣｐＧアイランドの検出のためのガウスモデル」、ＢＭＣゲノミクス１８（４）、ｐを参照のこと。３９２，これは、ＣｐＧ部位が島の一部であるかどうかの決定方法、およびそのような計算がインパルス関数に近づく場合についての参照によって組み込まれる。それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、それぞれのＣｐＧ部位についてコードするＣｐＧランレングスの値を含み得る。Ｃｈｅｎら、２０１８、「ＣｐＧ密度およびＤＮＡメチル化のコンフリクトは、ヒトおよびマウス組織における遺伝子調節に近位および遠位に関与する」、Ｅｐｇｅｎｅｔｉｃｓ１３（７）、ｐｐ．７２１－７４１を参照のこと。それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、ＣｐＧ部位がギャップのコンフリクト（ＣＯＧ）領域にあるか否か、ＣｐＧ部位がＣｏｎｆｌｉｃｔｏｆＯｖｅｒｌａｐ（ＣＯＯ）領域にあるか否か、ＣｐＧ部位がＨａｒｍｏｎｙｗｉｔｈＭｅｄｉｕｍＶａｌｕｅ（ＨＭＶ）領域にあるか否か、またはＣｐＧ部位がＨａｒｍｏｎｙｗｉｔｈＥｘｔｒｅｍｅＶａｌｕｅ（ＨＥＶ）領域にあるか否かを含むことができる。Ｃｈｅｎら、Ｉｄを参照。

【0156】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴（例えば、チャネル５３２－１－２の特徴）は、それぞれのＣｐＧ部位がオンである断片の読み鎖の向きを含むことができる。供給源断片は、Ｒ１（５’から３’へ）、Ｒ２（３’から５’へ）、あるいはその両方の読み鎖の向きをもつことができる。Ｒ１は“１“、Ｒ２は“２“、両方とも“０“で表すことができる。断片の読み鎖の向きは５’方向か３’方向である。断片配列源は、順方向または逆方向であり得る。

【0157】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、それぞれのＣｐＧ部位に並ぶそれぞれの断片についての１つの断片エントロピー、またはそれぞれのＣｐＧ部位を含む固定された長さの領域の横断領域エントロピーを含むことができ、ここでは、観察されたすべてのメチル化状態にわたって、横断領域エントロピーが、群として固定された長さの領域と重複していることが計算される。それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、それぞれのＣｐＧ部位についてのＣｐＧ部位ごとのエントロピーを含むことができ、ここで、部位ごとのエントロピーは、それぞれのＣｐＧ部位に対応するパラメータを含む全てのインスタンスにわたって計算される。正規化メチル化エントロピー値を算出する方法は、Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎら、２０１７年、「潜在的エネルギー景観は、エピゲノムの情報理論的性質を同定する。」Ｎａｔに開示されている。ジェネット。４９（５），ここに引用して組み込まれているｐｐ．７１９－７２９

【0158】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、それぞれの断片のメチル化密度を含むことができる。メチル化密度は式を用いて計算できる：
ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｄｅｎｓｉｔｙ＝（（β－ｖａｌｕｅ＿（ｅｘｐｅｃｔｅｄｈｅａｌｔｈｙｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）－β－ｖａｌｕｅ＿（ｏｂｓｅｒｖｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）））／（ｆｒａｇｍｅｎｔｂａｓｅｐａｉｒｄｉｓｔａｎｃｅ），

【0159】

ここで、β値ｅｘｐｅｃｔｅｄｈｅａｌｔｈｙｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎは正常なコホートのＣｐＧサイトのβ値であり、β値ｏｂｓｅｒｖｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎはそれぞれのＣｐＧサイトの被検者で観測されたβ値である。参照ゲノム中の隣接するＣｐＧ部位（例えば、参照ゲノム中の５’隣接または３’隣接するＣｐＧ部位）までの距離（断片塩基対距離）は、参照ゲノム中で５～１００塩基対離れていてもよい。隣接するＣｐＧ部位までの距離は、１００～５００塩基対離れていてもよいし、５００～１０００塩基対離れていてもよいし、１０００～５０００塩基対離れていてもよいし、５０００～１０，０００塩基対離れていてもよいし、参照ゲノム中で１０，０００塩基対以上離れていてもよい。それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、固定した長さの領域のメチル化密度（たとえば、１００塩基対のメチル化密度）、それぞれのＣｐＧ部位での最小の全被覆率、あるいはＣｐＧ近傍密度（たとえば、近隣のＣｐＧ部位でのＣｐＧ密度）である。この場合、固定した長さの領域（たとえば、２００塩基対の滑り窓）を含む滑り窓を用いて、滑り窓のＣｐＧ部位の数を求めることができる。それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、メチル化強調密度を含むことができ、そこでは、メチル化されたＣｐＧ部位の数が、固定された長さの領域（例えば、断片または滑り窓）について決定される。スライディングウィンドウの詳細は本稿の別の個所に記載されている。ＣｐＧメチル化密度を算出するための追加の方法は、Ｚｈａｎｇら、２００８、「マイクロアレイ上の領域メチル化伸長アッセイにより局所ＣｐＧメチル化密度を定量するための新規方法」、ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ９（５９）、ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１６４－９－５９に開示されており、これは以下に引用により組み込まれる。

【0160】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、ゲノム基準位置、それぞれのＣｐＧ部位に並ぶ最初の複数のパラメータのインスタンスにおける断片の開始または終了位置、それぞれのＣｐＧ部位がオンであるそれぞれの断片の長さ、それぞれのＣｐＧ部位がオンであるそれぞれの断片における反復の数、またはそれぞれのＣｐＧ部位がオンであるそれぞれの断片の５’クリップされた状態を含むことができる。

【0161】

それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、それぞれのＣｐＧ部位に対する癌関連パラメータを含み得る。がん関連パラメータには、がんに関連するあらゆる情報を含めることができる。癌関連パラメータは、差次的メチル化情報、遺伝子発現データ（例えば、メチル化マイクロアレイ、遺伝子発現マイクロアレイおよび／またはＲＮＡアレイまたはＲＮＡ配列決定）、および／またはゲノムアッセイを用いて決定することができる。がん関連パラメータは、モデル生物の知見（例えば、酵母、マウスなどの研究生物群に基づくヒト生物学を理解するための研究）を用いて決定することができる。それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、参照データベース（例えば、癌ゲノムアトラスプログラム（ＴＣＧＡ）、ＵＣＳＣゲノムＢｒｏｗｓｅｒ、および／またはマウス腫瘍生物学システム（ＭＴＢ））などの外部データ源から取得または計算することができる。
それぞれのＣｐＧ部位の最初の特徴は、限定されるわけではないが、起源組織、起源器官、および／または複製を含む組織または試料レベルの特徴を含み得る（例えば、バッチ効果を同定または調整するため、および／または縦軸パターンを検出するため）。それぞれのＣｐＧサイトの最初の特徴は、喫煙者／非喫煙者、年齢群、および／または性別を含むが、これに限定されない、被験体レベルまたはコホートレベルの生物学的なものを含み得る。第一の特徴は、該フラグメントメチル化パターンに生物学的、構造的、または技術的文脈を提供する、上記で述べられていないＣｐＧ部位レベル、フラグメントレベル、試料レベル、組織レベル、被験体レベルまたはコホートレベルにおける任意の属性を含み得る。

【0162】

複数のチャネルは、少なくとも３つのチャネルを含むことができる。第１の複数のチャネルにおける第３のチャネルは、第１の複数のパラメータの各インスタンスに対する第３の複数のパラメータの対応するインスタンスを含むことができ、ここで、第３の複数のパラメータの各インスタンスは、ＣｐＧ部位の第１の独立したセットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位の第２の特性に対するパラメータを含む。第２の特徴は、第１の特徴以外のものであり得るが、本開示において記載された第１の特徴のいずれも含み得る。

【0163】

図６Ａは、第３のチャネル５３２－１－３および第４のチャネル５３２－１－４を含む複数のチャネルの例を示しており、それぞれ第２の特性および第３の特性を含んでいる。図６Ａに描かれるように、第３のチャネルは、複数のＭインスタンスを含むことができ、ここで、各インスタンスは、第１のパッチ５３０－１のＬＣｐＧ部位５３６－１－１－１の第１の独立したセットに対応する複数のパラメータを含む。次いで、第１のパッチ５３０－１の第３のチャネル５３２－１－３における複数の例におけるインスタンスＭについて、５３８－１－３－Ｍ－１、５３８－１－３－Ｍ－２、５３８－１－３－Ｍ－３、５３８－１－３－Ｍ－４、および５３８－１－３－Ｍ－Ｌによって、複数のパラメータを示すことができる。同様に、第４のチャネルは、複数のＭインスタンスを含むことができ、ここで、各インスタンスは、第１のパッチ５３０－１のＬＣｐＧ部位５３６－１－１－１の第１の独立したセットに対応する複数のパラメータを含む。次いで、第１のパッチ５３０－１の第４のチャネル５３２－１－４における複数の例におけるインスタンスＭについて、５３８－１－４－Ｍ－１、５３８－１－４－Ｍ－２、５３８－１－４－Ｍ－３、５３８－１－４－Ｍ－４、および５３８－１－４－Ｍ－Ｌによって、複数のパラメータを示すことができる。ここで、第２および第３の特徴は、第１の特徴以外であり得るが、本開示において記載された第１の特徴のいずれをも含み得る。

【0164】

第１のパッチ５３０内の複数のチャネルは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のチャネル５３２を含むことができる。いくつかの実施形態において、第１パッチにおける複数のチャネルは、多くても２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５またはそれ以下のチャネル５３２を含むことができる。第１のパッチ５３０内の複数のチャネル中の各チャネル５３２は、異なる特性を含むことができる。第１のパッチ５３０内の複数のチャネルにおける２つ以上のチャネルは、同じ特性を含むことができる。第２の特徴は、第１の特徴について上述した特徴のいずれか１つ以上であり得る。第１のパッチ５３０内の少なくとも３つのチャネルの１つまたは複数は、第１の特性について上述した特性のいずれか１つまたは複数を含むことができる。図６Ｂは、６つのチャネル（例えば、メチル化状態、ベータコントロール（例えば、＃－コントロールまたは健康なサンプルの値）、ベータサンプル（例えば、＃－トレーニングまたは試験サンプルの値）、ｐ値、多重性、およびプリオール（例えば、プロモーター／エンハンサー領域、エキソン、イントロン、ヒストン修飾マーク、ＣｐＧアイランド、進化的保存、転写因子結合部位に関連する生物学的プリオーサー））を含む、最初のパッチ５３０－１の例を例示する。それぞれのチャネルはランク３のアレイ（たとえば、４つの平面からなるアレイ、それぞれ３列と５列を含む）として表され、最初のパッチ内で深さを縦に積み重ねることができる。
第一の独立したＣｐＧ部位セットのそれぞれのＣｐＧ部位に共通する特徴は、第一のパッチのそれぞれのチャネルを表す２次元マトリックスを、カラムのすべてまたは一部に適用することができる。例えば、ＣｐＧ部位に並ぶ試料中の複数の断片を用いて、それぞれの試料中のそれぞれのＣｐＧ部位に対するβ値を計算することができ、ＣｐＧ部位に並ぶ基準中の複数の断片を用いて、それぞれの基準中のそれぞれのＣｐＧ部位に対するβ値を計算することができる。その結果、２次元マトリックスは「バーコードされた」ように見える。ここでは、図６Ｎに図示されているように、最初のパッチにおけるそれぞれのチャネルのそれぞれのカラムの全部または一部を、同じ値でポピュレーションすることができる。バーコード画像は、近隣のＣｐＧ部位への５’距離、近隣のＣｐＧ部位への３’距離、癌関連パラメーター、参照Ｍ値、および／または試料Ｍ値を含むが、これらに限定されない、それぞれのＣｐＧ部位に対して一定の値を有する特性について得ることができる。

【0165】

それぞれの断片または第１の独立したＣｐＧ部位のセットの領域に共通する特徴は、第１のパッチ５３０のそれぞれのチャネル５３２を表す結果としての２次元マトリックスを、図６Ｌに例示されるように、インスタンスの全てまたは一部（例えば、列）に適用することができる。例えば、断片配列ソース、断片マッピング品質スコア、断片ｐ値、断片多重度、断片位置、および／または断片長は、とりわけ、同じ値をもつそれぞれのインスタンスの全てまたは一部をポピュレーションすることができる。それぞれの試料、被験体、またはコホートに共通する特性は、複数の断片に特異的な特性にかかわらず、またはＣｐＧ部位の第一の独立したセットにおける複数のＣｐＧ部位に特異的な特性にかかわらず、第一のパッチの全チャネルに適用される単一の値を含むことができる。例えば、特に喫煙者／非喫煙者、年齢群および／または性別を含むがこれらに限定されないサンプルレベル、被験者レベル、またはコホートレベルの生物学的プライヤーは、最初のパッチのそれぞれのチャネルに同じ値を適用することができる。

【0166】

方法８００のステップ８０６は、分類器に少なくとも第１のパッチを適用することを含み、それによって被験者における癌状態を決定することができる。分類子は、癌対非癌および／または起源組織を予測することができる。分類器は、癌／非癌／情報不足、起源組織、起源臓器、癌タイプ、および／または癌ステージを識別するマルチクラス予測を行うことができる。

【0167】

図３は、いくつかの実施形態に従って、ｐ値によってフィルタリングされた複数の断片が分類器に適用される例ワークフローを例示する。図３はまた、癌と非癌および／または起源の組織を識別するために分類が実施される例を概説する。このような分類は、２値分類または複数クラスの組織起源分類であり得る。癌／非癌を判別するために二元分類を行うことができる。例えばヘム、非情報性試料、交絡条件、または他の分類されていない試料を含む非癌試料から癌タイプまたはサブタイプを識別するために、マルチクラス分類または任意のタイプの分類器を実施することができる。２値がん／がん分類を実施しない場合、一般集団のサンプルに対する分類子の適用には、０．９９または９９％特異度以上のカットオフ閾値を用いることができる。カットオフ値の特異度閾値は７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％を超えることがある。いくつかの実施形態において、カットオフ特異性閾値は、最大でも９９．５％、９９％、９８％、９５％、９０％以下であり得る。複数クラスの組織起源分類を実施して、２～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～３０または３０を超える異なる癌タイプおよび／またはサブタイプを識別することができる。分類子は、直腸肛門癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、肝胆道癌、子宮内膜癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ系新生物、メラノーマ、多発性骨髄腫、骨髄性新生物、卵巣癌、非ホジキンリンパ腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、甲状腺癌、上部消化管癌、尿路上皮癌、または子宮癌を予測するために適用することができる。１つ以上の癌は、直腸肛門癌、大腸癌、食道癌、頭頸部癌、肝胆道癌、肺癌、卵巣癌、膵癌などの「高信号」癌（５０％以上の確率で５年癌特異的死亡率が得られる癌と定義される）のほか、リンパ腫や多発性骨髄腫である可能性がある。高シグナル癌はより侵攻性であり得、患者から得られた試験サンプル中の平均を超える無細胞核酸濃度を有する。「高信号がん」とは、低信号のがん（子宮がん、甲状腺がん、前立腺がん、ホルモン受容体陽性のＩ／ＩＩ期乳がんなど）のグループに該当しないがんを指す。

【0168】

複数のパッチアーキテクチャ。

【0169】

この方法は、対応する第一のチャネルを含む第二のパッチをさらに構築することを含むことができる。この２番目のパッチは、その種の参照ゲノムにおける２番目の独立したＣｐＧ部位のセットを表すことができる。ＣｐＧ部位の第２の独立セットにおける各々のＣｐＧ部位は、参照ゲノム中の所定の位置に対応することができる。第２のパッチの対応する第１のチャネルは、第１の複数のパラメータの対応する複数のインスタンスを含むことができる。第２のパッチの第１のチャネルの対応する第１の複数のパラメータの各インスタンスは、第２のパッチのＣｐＧ部位の第２の独立したセットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含むことができる。開示されたシステムおよび方法は、ＣｐＧ部位の第２の独立セットに並ぶ複数の断片中のそれぞれの断片について、それぞれの断片のメチル化パターンに基づいて、第２のパッチの第１の複数のパラメータのすべてまたは一部のインスタンスを、第２のパッチを構築することにより、それらの断片をポピュレーションすることができる。分類器への第１のパッチの上述の適用は、第１のパッチおよび第２のパッチの両方を分類器に適用することを含み得、それにより、被験体における癌状態を決定する。本開示のいくつかの実施形態は、３つ以上のパッチ、４つ以上のパッチ、１０つ以上のパッチ、１００以上のパッチ、または５０～１０００のパッチを使用することができ、それぞれが独自のＣｐＧ部位のセットを有し、それぞれが分類子に適用されている。

【0170】

第２のパッチは、対応する第１のチャネルを含む対応する複数のチャネルを含むことができる。さらに、第２パッチの対応する複数のチャネルにおける対応する第２のチャネルは、第１の複数のパラメータの各インスタンスに対する第２の複数のパラメータを含むことができ、ここで、第２のパッチの第２の複数のパラメータの各インスタンスは、第２のパッチのＣｐＧ部位の第２の独立したセットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位の第１の特性、ＣｐＧメチル化状態以外のパラメータを含む。開示されたシステムおよび方法は、ＣｐＧ部位の第２の独立セットに並ぶ複数の断片中のそれぞれの断片について、それぞれの断片のメチル化パターンに基づいて、第２のパッチの第２の複数のパラメータのインスタンスの全部または一部を、さらにポピュレーションすることができる。図７Ａおよび７Ｂは、いくつかの実施形態によれば、第１のパッチ５３０－１および第２のパッチ５３０－２を含む複数のパッチを有する例アーキテクチャを例示する。ＣｐＧ部位の第１および第２の独立セットは、それぞれＣｐＧ部位１からＬ１、およびＣｐＧ部位１からＬ２を含むことができる。各パッチは、複数のチャネルを含むことができる。

【0171】

第１の独立セットのＣｐＧ部位は、第２の独立セットのＣｐＧ部位と重複している場合もあれば、重複していない場合もある。１つ目のパッチは、２つ目のパッチと同じ大きさではあるが、対照ゲノムの異なる部分を表すことができる。１つ目のパッチは参照ゲノムの最初の部分を表し、２つ目のパッチは参照ゲノムの２つ目の部分を表すことができる。この場合、１つ目の部分のサイズは２つ目の部分のサイズとは異なる。たとえば、第１部分と第２部分のヌクレオチドの実際の大きさは異なることがある。第１の独立セットのＣｐＧ部位は第１の数のＣｐＧ部位を含み得、第２の独立セットのＣｐＧ部位は第２の数のＣｐＧ部位を含み得、第１の数のＣｐＧ部位は第２の数のＣｐＧ部位と同じであり得る。いくつかの実施形態において、第１の独立したＣｐＧ部位のセットは第１の数のＣｐＧ部位を含むことができ、第２の独立したＣｐＧ部位のセットは第２の数のＣｐＧ部位を含むことができ、第１の数のＣｐＧ部位は第２の数のＣｐＧ部位と異なることができる。

【0172】

第１のパッチは第１の数のチャネルを含み、第２のパッチは第２の数のチャネルを含むことができ、ここで、第１の数と第２の数のチャネルは同一または異なることができる。第１のパッチは、第１の複数の特性を含む第１の数のチャネルを含むことができ、第２のパッチは、第２の複数の特性を含む第２の数のチャネルを含むことができ、ここで、第１の複数の特性は、第２の複数の特性と重複することができるか、または重複することができない。

【0173】

開示されたシステムおよび方法は、さらに、複数のパッチを構築するための指示を含むことができる。図７Ａは、いくつかの実施形態によれば、第１のパッチ５３０－１、第２のパッチ５３０－２、およびＫｔｈのパッチ５３０－Ｋを含むＫパッチの例を例示するが、ここで、Ｋは正の整数であり（例えば、２から１０，０００の間）、各パッチは、独立したＣｐＧ部位５３６のセットを含むことができ、パッチ５３０－Ｋは、ＣｐＧ部位１からＣｐＧ部位Ｌ（Ｋ）を含むＫｔｈの独立したＣｐＧ部位のセットを含む。複数の貼付剤（Ｋ）は、１～１０枚、１０～２０枚、２０～５０枚、５０～１００枚、１００～５００枚、５００～１０００枚、１０００～５０００枚、５０００～１０，０００枚又は１０，０００枚以上とすることができる。

【0174】

複数のパッチ中の構築されたパッチの数は、分類子に含めるＣｐＧ部位のパネル中のＣｐＧ部位の数によって決定することができる。ＣｐＧ部位のパネルは、ヒトゲノムの全メチロームを含むことができる。したがって、複数のパッチにわたって含まれるＣｐＧ部位の数は、約２８００万であり得る。複数のパッチにわたって含まれるＣｐＧ部位の数は、１～１０，０００個、１０，０００～１００，０００個、１００，０００～５００，０００個、５００，０００～１０００００００個、１００万～１５０万個、１５０万～５００万個、５００万～１０００万個、１０００万～２０００万個、２０００万～２０００万個、または２０００万個を超える。複数のパッチにわたって含まれるＣｐＧ部位の数は１５０万であり得、複数のパッチは５０００のパッチを含み得、そして各パッチは、ＣｐＧ部位の独立セットにおける３００のＣｐＧ部位を含むことができる。複数のパッチにわたって含まれるＣｐＧ部位の数は１５０万であり得、複数のパッチは２０００のパッチを含み得、そしてそれぞれのパッチは、ＣｐＧ部位の独立セットにおける７５０のＣｐＧ部位を含むことができる。複数のパッチにわたって含まれるＣｐＧ部位の数は１５０万であり得、複数のパッチは１０００のパッチを含み得、そして各パッチは、ＣｐＧ部位の独立セットにおける１５００のＣｐＧ部位を含む。分類子に含まれるべきＣｐＧ部位のパネルは、重複したＣｐＧ部位を含むことができる。

【0175】

複数のパッチにおける構築されたパッチの数は、分類器の計算能力によって、それぞれのパッチにおけるＣｐＧ部位の独立セットにおけるＣｐＧ部位の数、それぞれのパッチに対する複数の例における例数、およびそれぞれのパッチに対する複数のチャネルにおけるチャネルの数と比較して決定することができる。一例として、分類器は、ＶＧ１１回帰ニューラルネットワークを含むことができ、複数のパッチ中の構築されたパッチの数は、１０００から２０００の間であり得、それぞれのパッチに対するＣｐＧ部位の独立セット中のＣｐＧ部位の数は２５６であり得、それぞれのパッチに対する複数の例の数は１２８であり得（例えば、１２８断片の読取深度）、そして、それぞれのパッチに対する複数のチャネル中のチャネルの数は７であり得る。分類子は、残存ネットワーク（例えば、ＲｅｓＮｅｔ）画像分類子を含むことができ、そして各々のパッチに対するＣｐＧ部位の独立セットにおけるＣｐＧ部位の数は、１０００であり得る。

【0176】

複数のパッチにおける構築されたパッチの数、ＣｐＧ部位の独立セットにおけるＣｐＧ部位の数、複数の例における例の数、および複数のチャネルにおけるチャネルの数は、実施例８に記載されているように、ハイパーパラメータの改良を通して定義および改良することができる。複数のパッチにわたって含まれるＣｐＧ部位の数は、既存の標的化メチル化配列決定法を用いて決定するか、または実験目標に基づいて施術者によって選択することができる。したがって、複数のパッチにわたって含めるべきＣｐＧ部位のパネルは、非常に有益でありかつ／または高い識別価値を有するパネルのサブ領域を同定することにより、さらに治癒させることができる。

【0177】

パッチデザイン。

【0178】

方法は、さらに、複数の臨床被験体を含む臨床コホートから得られた複数の臨床生物学的試料の複数の臨床核酸試料から得られた複数の臨床断片のメチル化配列決定によって決定された複数のＣｐＧメチル化パターンの評価を通して、第一パッチの第一の独立したＣｐＧ部位の第一のセットを選択することを含むことができる。複数の臨床被験体は、癌状態に対する第１の適応を有する第１のセットの臨床被験体、および癌状態に対する第２の適応を有する第２のセットの臨床被験体を含むことができる。臨床コホートから得られた複数の臨床生物学的試料の複数の臨床核酸試料は、研究デザイン（例えば、ＴＣＧＡ、ＣＣＧＡ）から得ることができる。癌状態の適応には、「癌か癌でないか」を含めることができる。癌状態の適応には、起源となる腫瘍（例えば、「脳対肺」）を含めることができる。癌状態の適応には、癌の病期、癌の確率などを含むが、これらに限定されない癌に関連するあらゆる情報を含むことができる。

【0179】

ＣｐＧ部位の第１の独立したセットを選択することは、臨床被験者の第１のセットと臨床被験者の第２のセットとの間の、複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態について、それぞれの第１の相互情報スコア（例えば、２つの病態を区別する際の特徴の情報内容の尺度を表す数学値）に基づいて、参照ゲノム中の複数のＣｐＧ部位の第１の順位を決定することを含むことができる。最初のパッチに対するＣｐＧ部位の対応する独立セットに対する最初の閾値数のＣｐＧ部位をランキングを用いて選択することができる。このように、相互情報はサイトごとに評価することができ、ここで、相互情報は、与えられたＣｐＧ部位での対比較のための第１クラス対第２クラスの確率質量を同定する単一の値メトリックであり得る。例えば、相互情報スコアは、複数の臨床生体試料中の各臨床被験体のペア間の対比較ごとに、各ＣｐＧ部位ごとに計算することができる。高い相互情報スコアは、それぞれのＣｐＧ部位での対被験者間の高いレベルの識別を示すことができる。例えば、上位１００、上位１０００または上位２０００の相互情報スコアに対応するＣｐＧ部位を選択することができ、残りのＣｐＧ部位を選択することはできない。０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、または０．９９を超える相互情報スコアを有する任意のＣｐＧ部位を選択することができる。

【0180】

複数の臨床被験体は、癌状態に対する第三の適応を有する第三の臨床被験体セット、および癌状態に対する第四の適応を有する第四の臨床被験体セットを含むことができ、さらに選択することは、臨床被験体の第三のセットと臨床被験体の第四のセットとの間の複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態に対するそれぞれの第二の相互情報スコアに基づいて、参照ゲノム中の複数のＣｐＧ部位の第二の順位を決定することを含むことができる。第１のパッチの第１の独立したＣｐＧ部位の第２の閾値数のＣｐＧ部位を、第２のランキングを用いて選択することができる。それぞれの相互情報スコアは、臨床被験者の第１セットと臨床被験者の第３セットの間、臨床被験者の第１セットと臨床被験者の第４セットの間、臨床被験者の第２セットと臨床被験者の第３セットの間、および／または臨床被験者の第２セットと臨床被験者の第４セットの間で計算できる。複数の臨床被験体は、５以上、１０以上、５０以上、１００以上、５００以上、１０００以上、２０００以上、５０００以上、１０，０００以上、または２０，０００以上の臨床被験体セットを含み得、ここで、各臨床被験体セットは、癌状態に対する対応する適応を有する。

【0181】

１番目または２番目の相互情報スコアに基づく参照ゲノム中の複数のＣｐＧ部位のランキングは、ＣｐＧ部位を最高から最低の相互情報スコアにランク付けすることにより行うことができる。第１パッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットに対するＣｐＧ部位の第１および／または第２の閾値数は、複数のＣｐＧ部位（例えば、比較に用いた癌条件に関係なく、最も高い相互情報スコアを有するＣｐＧ部位）についての上位ランクの相互情報スコアを用いて選択することができる。最初のパッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットに対するＣｐＧ部位の第１および／または第２の閾値数は、相互情報スコアが計算される各臨床被験者ペアの上位ランクの相互情報スコアから選択することができる（例えば、ＣｐＧ部位の選択されたセットにおいて全ての対比較が表されるように、最も高い相互情報スコアを有するＣｐＧ部位）。相互情報得点の順位付けに基づく複数の対比較において、各臨床対象者のペアごとに、上位１０００の高相互情報ＣｐＧサイトを選択することができる。各ＣｐＧ部位の相互情報スコアは、臨床被験者の多重対比較のために識別可能であると考えることができる。

【0182】

最も順位の高い相互情報スコアを有する複数のＣｐＧサイトを、最初のパッチのＣｐＧサイトの最初の独立セットとして選択することができ、ＣｐＧサイトの最初の独立セットを、最も高い～最も低い相互情報スコアの順に、最初のパッチに配置することができる。ＣｐＧ部位の最初の独立セットは、相互の情報スコアが最も低い順から最も高い順に、最初のパッチに配置することができる。パッチは、相互情報スコアの上位に位置する２５６のＣｐＧサイトを含むことができる。最初のパッチの構築は、さらに、それぞれの最初の相互情報スコアに基づいて、最初のパッチに割り当てられたそれぞれの断片を仕分けることを含むことができる。例えば、最初のパッチを構築する前に、フラグメントをそれぞれの相互情報スコアに基づいてランク付けし、それぞれの相互情報スコアの順番（例えば、最高～最低、または最低～最高）で最初のパッチの例にポピュレーションすることができる。

【0183】

癌状態の最初の適応症は、最初の癌タイプとすることができ、癌状態の２番目の適応症は、２番目の癌タイプとすることができる。第１の癌タイプまたは第２の癌タイプは、本明細書の別の箇所に記載される任意の癌であり得る。次いで、臨床被験体間の複数の対比較は、任意の２つの癌タイプ（例えば、乳癌対肺癌）間の任意の可能な対比較を含むことができる。

【0184】

最初のパッチの第一の独立したＣｐＧ部位の第一閾値数のＣｐＧ部位における各々のＣｐＧ部位は、閾値数の残基により、第一閾値数のＣｐＧ部位における全ての他のＣｐＧ部位から参照ゲノム中にパッディングすることができる。例えば、各ＣｐＧ部位を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、または３００残基ずつパッチに含めることができる。ＣｐＧ部位の第１の独立セットの選択は、パッチデザインのためにあらかじめ設定された複数の臨床生体試料（例えば、参照データベースまたはパイロット研究）からの複数の臨床核酸サンプルを用いて実施することができる。例えば、パッチ設計のための関心対象のＣｐＧ部位を選択するために第１のサンプルセットを使用することができ、分類のためのそれぞれのパッチのそれぞれの例をポピュレーションするために第２のサンプルセットを使用することができる。

【0185】

方法のＣｐＧ選択ステップは、さらに、臨床被験者の第１セットと臨床被験者の第２セットとの間の、複数の固定長領域における各固定長領域のＣｐＧ部位メチル化パターンのメチル化状態に関するそれぞれの第１の相互情報スコアに基づいて、参照ゲノム中の複数の固定長領域の第１ランキングを決定することを含むことができる。次いで、第１のランキングを用いて、複数の固定長領域におけるそれらの固定長領域から、第１のパッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットについて、第１の閾値数のＣｐＧ部位を選択することができる。このように、高い相互情報スコアは、一定の長さ領域での対被験者間の高いレベルの識別を示すことができる。混合モデルを用いて、一定の長さ領域に対する相互情報スコアを計算することができる。例えば、米国特許出版番号を参照のこと。ＵＳ２０２０－０３６５２２９Ａ１、“Ｍｏｄｅｌ－ＢａｓｅｄＦｅａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ“と題されており、ここに引用を組み込んでいる。混合モデルは、全体集団内の部分集団の存在を表すための確率論的モデルとなり得る。固定された長さの領域は、外部データベースまたはプローブの参照パネルを用いて得ることができる（例えば、目的のＣｐＧ部位を得るための関心領域を同定するために、標的配列決定アッセイにおいて複数のプローブを用いて得られた領域を選択する）。固定された長さの領域は、全ゲノムを横切って、または参照パネルを横切って滑る固定された長さの「滑り窓」を用いて得ることができる。

【0186】

例えば、２つの臨床被験体から得られた２つの臨床生物学的試料間の対比較において、ゲノム領域（例えば、標的配列決定アッセイにおけるプローブに対応するゲノム領域）を横切るスライディングウインドウ（１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、または２０００塩基対（ｂｐ）のウインドウ）によって、第１の独立したＣｐＧ部位のセットを選択することができる。スライディングウインドウの各フレームについて、スライディングウインドウの各フレーム内のＣｐＧ部位の統計モデル（例えば、混合モデル）を用いて、相互情報スコアを算出することができる。相互情報スコアは、スライディングウインドウのそれぞれのフレームにおける第一の癌状態に対する第二の癌状態に対するメチル化パターンの確率を示すことができ、したがって、それぞれの領域の識別力を示す。選択されたゲノム領域を横切って進むにつれて、滑りウインドウの各フレームの各領域について、相互情報スコアを同様に計算することができる。

【0187】

スライディング窓の長さは、１０未満、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～５００、５００～１０００、１０００～２０００、２０００～５０００、または５０００ｂｐを超えることができる。滑り窓の長さは２５６ｂｐである。スライディングウインドウの固定長領域は、５個未満のＣｐＧ部位、５～１０個のＣｐＧ部位、１０～２０個のＣｐＧ部位、２０～５０個のＣｐＧ部位、５０～１００個のＣｐＧ部位、１００～２００個のＣｐＧ部位、２００～５００個のＣｐＧ部位、または５００個以上のＣｐＧ部位を含むことができる。

【0188】

複数の固定長領域（窓）の最初の順位付けは、固定長領域を最高から最低、または最低から最高の相互情報スコアの順に順位付けすることによって行うことができる。固定長領域は１つ以上のＣｐＧ部位を含むことができ、ＣｐＧ部位の最初の独立セットは、上位順位の相互情報固定長領域から得られるＣｐＧ部位を含むことができる。ＣｐＧサイトの最初の独立セットは、上位順位の相互情報固定長領域を含むことができる。

【0189】

複数の臨床被験体は、癌状態に対する第３の適応を有する第３の臨床被験体セットおよび癌状態に対する第４の適応を有する第４の臨床被験体セットを含むことができ、さらに選択することは、臨床被験体の第３のセットと第４のセットの臨床被験体の第４のセットとの間の複数の固定長領域における各固定長領域のメチル化状態に対するそれぞれの第２の相互情報スコアに基づいて、参照ゲノム中の複数の固定長領域の第２のランキングを決定すること；および第２のランキングを用いて第１のパッチの第１の独立したセットのＣｐＧ部位に対する第２の閾値数のＣｐＧ部位を選択することを含むことができる。

【0190】

一定の長さ領域に対するそれぞれの相互情報スコアは、臨床被験者の第１セットと臨床被験者の第３セットの間、臨床被験者の第１セットと臨床被験者の第４セットの間、臨床被験者の第２セットと臨床被験者の第３セットの間、および／または臨床被験者の第２セットと臨床被験者の第４セットの間で計算することができる。複数の臨床被験体は、５以上、１０以上、５０以上、１００以上、５００以上、１０００以上、２０００以上、５０００以上、１０，０００以上、または２０，０００以上の臨床被験体セットを含み得、ここで、各臨床被験体セットは、癌状態に対する対応する適応を有する。

【0191】

第１パッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットに対するＣｐＧ部位の第１および／または第２の閾値数は、複数の固定長領域（例えば、比較に用いた癌条件に関係なく、最も高い相互情報スコアを有する固定長領域から得られたＣｐＧ部位）において、上位ランクの相互情報固定長領域を用いて選択することができる。１枚目のパッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットに対するＣｐＧ部位の第１および／または第２の閾値数は、相互情報スコアが計算される各臨床被験者の各ペアの上位ランク相互情報固定長領域を用いて選択することができる（例えば、すべてのペアワイズ比較が選択されたＣｐＧ部位のセットで表されるように、最も高い相互情報スコアを有する固定長領域）。上位１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、または２０００個の相互情報固定長領域を、相互情報スコアの順位付けに基づく複数の対比較において、それぞれの臨床被験者のペアごとに選択することができる。各固定長領域の相互情報スコアは、臨床被験者の多重対比較に対して識別可能と考えることができる。

【0192】

最初のパッチの構築は、さらに、それぞれの最初の相互情報スコアに基づいて、最初のパッチに割り当てられたそれぞれの断片を仕分けることを含むことができる（例えば、固定された長さの領域は、最低から最高の相互情報スコアによって、または最高から最低の相互情報スコアによって仕分けられる）。最初のパッチにおける最初の独立したＣｐＧ部位のセットは、固定された長さの領域および／または固定された長さの領域から得られたＣｐＧ部位を含み、相互の情報スコアの順に配置することができる（例えば、最低、最高、または最高、最低）。癌状態の最初の適応症は、最初の癌タイプとすることができ、癌状態の２番目の適応症は、２番目の癌タイプとすることができる。次いで、臨床被験体間の複数の対比較は、任意の２つの癌タイプ（例えば、乳癌対肺癌）間の任意の可能な対比較であり得る。

【0193】

第一パッチの第一の独立したＣｐＧ部位の第一閾値数のＣｐＧ部位における各々のＣｐＧ部位は、閾値数のＣｐＧ部位の第一閾値数の他の全てのＣｐＧ部位から参照ゲノム中にパッディングすることができる（例えば、一定の長さの領域から得られた各々のＣｐＧ部位は、パッチに含まれるように少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または２００残基ずつパッチすることができる）。アレイベースのメチル化シークエンシングを用いて複数の断片を得ることができ、臨床被験者の第１セットと第２セットの臨床被験者の間の複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態について、参照ゲノム中の複数のＣｐＧ部位の第１ランキングは、β値またはＭ値に基づくことができる。

【0194】

複数のＣｐＧメチル化パターンの評価を通して第１のパッチのための第１の独立したＣｐＧ部位セットの選択は、さらに、第１のパッチのための第１の独立したＣｐＧ部位セットを選択すること、および第２のパッチのための第２の独立したＣｐＧ部位セットを選択することを含むことができる。複数のＣｐＧメチル化パターンの評価による第１のパッチのための第１の独立したＣｐＧ部位のセットの選択は、さらに、複数のパッチにおけるそれぞれのパッチのためのＣｐＧ部位のそれぞれ独立したセットを選択することを含むことができる。

【0195】

分類子予測とトレーニング

【0196】

方法は、さらに、第１のパッチを含む複数のパッチを構築するための指示を含むことができ、それぞれのパッチは、参照ゲノム中の異なる独立したＣｐＧ部位のセットについてである。最初のパッチを構築することにより、最初のパッチを含む複数のパッチを構築することができる。上述の分類器は、１つまたは複数の第１段階モデルおよび第２段階モデルを含むことができる。第１段階モデルはあらかじめ訓練された（または訓練された）モデルとすることができる。さらに、分類器への少なくとも第１のパッチの上記開示された適用は、複数の特徴要素を含む特徴ベクトルを得ることを含むことができ、ここで、複数の特徴要素における各特徴要素は、対応する第１段階モデルへの複数のパッチにおけるそれぞれのパッチの適用時に、１つまたは複数の第１段階モデルにおける対応する第１段階モデルの出力である（ここで、パッチの各々は、例えば、被験体からのメチル化核酸断片から取得したデータから形成することができる）。分類器への少なくとも第１のパッチの適用は、さらに、第２段階モデルに特徴ベクターを適用することを含み、それにより、被験体における癌状態を決定することができる。

【0197】

複数のパッチは、１０パッチから１００００パッチの間、または１００パッチから３０００パッチの間であり得る。図７Ａは、Ｋパッチのセットを例示し、ここで、複数の訓練された第一段階モデルは、訓練されたモデル１、訓練されたモデル２を含み、ここで、Ｋは、いくつかの実施形態に従って、正の整数（例えば、２から３０００の間）である。第１段階モデルにはパッチレベルの分類子を含むことができ、第２段階モデルにはサンプルレベルの分類子を含むことができる。第２段階モデルへの特徴ベクターの適用は、被験体が癌であるか非癌であるかを決定することができ、または起源組織、起源臓器、癌タイプ、および／または癌の病期を同定することができる。第２段階モデルへの特徴ベクトルの適用は、第１段階モデルで正に分類されるパッチ（例えば、癌陽性）が第２レベル分類器に適用されるように、応答的な方法で行うことができる。図７ＡはＫトレーニングされたモデルを例示しているが、いくつかの他の実施形態において、Ｋパッチの集合は、Ｋトレーニングされたモデルの代わりに１つのモデルについてのデータを入力することができる。１つのモデルは、トレーニングを受けているか、トレーニングを受けていないかのいずれかである。この状況では、Ｋパッチがトレーニングサンプルから得られれば、１つのモデルをＫパッチでさらに連続的または平行的にトレーニングすることができる。別の状況では、Ｋパッチが試験サンプルから得られた場合、１つの訓練されたモデルを用いて、Ｋパッチに基づく第２段階モデル（例、サンプルレベル分類器）により、癌の状態を決定するか、またはさらなる分析のためのデータを生成することができる。

【0198】

１つまたは複数の第１段階モデルにおけるそれぞれの第１段階モデルは、対応する回帰ニューラルネットワークを含むことができ、第１パッチの第１チャネルは、第１次元を形成する第１パッチの第１の複数のパラメータの複数のインスタンスのそれぞれの二次元を含むことができる（例えば、図７Ａのパッチ５３０－１について図示されているように）。第２段階モデルにはロジスティック回帰モデルを含めることができる。例えば、米国特許出版番号を参照のこと。ＵＳ２０１９－０２８７６５２Ａ１、表題「異常な断片の検出と分類」であり、これを参考に取り入れている。第２段階モデルはサポートベクトルマシンを含むことができる。分類に用いる場合、ＳＶＭは、標識されたデータから最大に離れた超平面を有する所定の２値標識データトレーニングセットのセットを分離することができる。線形分離が不可能な場合には、ＳＶＭは機能空間への非線形マッピングを自動的に実現する「穀粒」の技術と組み合わせて働くことができる。特徴空間においてＳＶＭにより発見された超平面は、入力空間における非線形決定境界に対応することができる。第２段階モデルは、ここに開示された任意のデータまたは情報に基づいて分類を行うことができる任意の機械学習モデルまたは統計モデル（例えば、決定樹モデル、ランダム森林モデル、ナイーブベイ、Ｋ－ＮｅａｒｅｓｔＮｅｉｇｈｂｏｒｓ、確率勾配降下）を含むことができる。

【0199】

分類器は、複数の第一段階モデル（例えば、図７Ａの訓練された／訓練されていないモデル）および動的ニューラルネットワーク（例えば、図７Ａのサンプルレベル分類器）を含むことができる。方法はさらに、第１のパッチを含む複数のパッチを構築することを含み、それぞれのパッチは、参照ゲノム中の異なるセットのＣｐＧ部位についてである。最初のパッチを構築することは、最初のパッチを含むそれぞれのパッチを構築することを含むことができる。分類器への少なくとも第一のパッチの適用は、複数の第一段階モデルにおける対応する第一段階モデルに、複数のパッチ中の各パッチを適用することを含むことができる。対応する第１段階モデルは、ｉ）それぞれのパッチを受容するためのそれぞれの入力層を含み、ここで、それぞれのパッチは第１の寸法数を含む；ｉｉ）対応するウェイトのセットを含むそれぞれの完全に連結された包埋層を含み、ここで、それぞれの完全に連結された包埋層は、直接または間接的にそれぞれの入力層の出力を受け取り、そして、それぞれの包埋層のそれぞれの出力は、第１の寸法数より少ない第２の寸法数である；およびｉｉｉ）それぞれの完全に連結された包埋層から出力を直接または間接的に受け取るそれぞれの出力層を含むことができる。対応する第１段階モデルは、１つまたは複数の畳込み層をさらに含むことができる。１つ以上の畳込みレイヤは、それぞれの入力レイヤとそれぞれの完全に接続された埋込みレイヤとの間に配置することができる。１つ以上の回旋層は、少なくとも１、２、３、４、５、またはそれ以上の層を含むことができる。いくつかの実施形態において、１以上の回旋層は、せいぜい５、４、３、２またはそれ以下の層を含むことができる。第１段階モデルにおける複数回帰層については、それぞれの入力層に接続された第１回目の回帰層のニューロンは、それぞれの入力層によって受信されたそれぞれのパッチ内の全ての単一ピクセル（例えば、入力された２次元画像）に接続されていない可能性がある。同様に、第２回旋層のニューロンは、第１回旋層のすべての単一ニューロンに接続されていない可能性がある。この状況において、第１の畳み込み層のサイズは、それぞれの入力層のサイズよりも小さくすることができ、および／または第２の畳み込み層のサイズは、第１の畳み込み層のサイズよりも小さくすることができる。分類器への少なくとも第一のパッチの適用は、さらに、複数の第一段階モデルにおける各訓練された第一段階モデルのそれぞれの完全に連結された包埋層からのそれぞれの出力の集合体を、動的ニューラルネットワーク（例えば、サンプルレベル分類器）に入力することを含み、それによって、被験体における癌状態を決定することができる。それぞれの完全に連結した包埋層は、それぞれのパッチ（領域など）ごとの値のセット（スコアなど）を表すことができ、領域ごとのスコアのセットは包埋サイズを示すことができる。

【0200】

複数の第１段階モデルにおける各第１段階モデルのそれぞれの埋め込み層のそれぞれの出力は、３２～１０４８の値のセットとすることができる。複数の第１段モデルにおける各第１段モデルのそれぞれの埋込層のそれぞれの出力は、１２８とすることができる。

【0201】

複数の第一段階モデルにおける各訓練された第一段階モデルのそれぞれの完全に連結された包埋層からのそれぞれの出力の集合体は、それぞれのパッチについてのそれぞれのスコアの連結であり得る。例えば、図７Ｂは、分類器の例を示しており、ここでは、分類器は、メチル化配列決定からの断片を用いて実施される２段階分類を伴うパッチ回帰ニューラルネット（ＰａｔｃｈＣＮＮ）である。それぞれの第一段階モデルは、それぞれのパッチごとにそれぞれのパッチ特徴を含む特徴ベクトルに対応する要素を出力するパッチレベル特徴抽出器を含むことができ、サンプルレベル分類器はロジスティック回帰モデルまたはサポートベクトルマシンを含むことができる。分類器への少なくとも第一のパッチの適用は、分類器に複数のチャネルを含む複数のパッチを適用することを含み、対応する第一段階モデル（例えば、図７Ｂの対応するＣＮＮ）に入力される複数のパッチにおけるそれぞれのパッチを適用することができる。

【0202】

分類器は、一つの第一段階モデルおよび機械学習／統計モデル（例えば、動的ニューラルネットワークまたは図７Ａのサンプルレベル分類器）を含むことができる。方法はさらに、第１のパッチを含む複数のパッチを構築することを含み、それぞれのパッチは、参照ゲノム中の異なるセットのＣｐＧ部位についてである。最初のパッチを構築することは、最初のパッチを含むそれぞれのパッチを構築することを含むことができる。複数のパッチの分類器への適用は、複数のパッチを第１段階モデル（例えば、回帰ニューラルネットワーク）に適用することを含むことができる。この状況において、第１段階モデルは、ｉ）複数のパッチを受取るための入力層を含み、連続的または平行的に、ここで、複数のパッチの第１のパッチが第１の数次元を含む、ｉｉ）１組の重みを含む完全に連結された包埋層を含み、完全に連結された包埋層が直接または間接的に入力層の出力を受け取り、そして包埋層の出力が第１の次元数よりも少ない第２の数の次元を含む、ｉｉｉ）完全に連結された包埋層から出力を直接または間接的に受け取る出力層を含むことができる。第１段階モデルは、１つまたは複数の畳込み層をさらに含むことができる。１つまたは複数の畳み込みレイヤーは、入力レイヤーと完全に接続された埋め込みレイヤーの間に配置できる。１つ以上の回旋層は、少なくとも１、２、３、４、５、またはそれ以上の層を含むことができる。いくつかの実施形態において、１以上の回旋層は、せいぜい５、４、３、２またはそれ以下の層を含むことができる。第１段階モデルにおける複数回帰層に対して、入力層に接続された第１回旋層のニューロンは、入力層によって受信されたパッチ内の全ての単一ピクセル（例えば、入力２次元画像）に接続されていない可能性がある。同様に、第２回旋層のニューロンは、第１回旋層のすべての単一ニューロンに接続されていない可能性がある。この状況において、第１の畳み込み層のサイズは、入力層のサイズよりも小さくすることができ、および／または第２の畳み込み層のサイズは、第１の畳み込み層のサイズよりも小さくすることができる。分類器への複数のパッチの適用は、さらに、完全に連結された包埋層からの出力を機械学習／統計モデルに入力することを含み、それにより、被験体における癌状態を決定することができる。完全に連結された包埋層は、各パッチ（例えば領域）に対する値のセット（例えば、スコア）を表すことができ、領域ごとのスコアのセットは包埋サイズを示すことができる。

【0203】

分類器は、複数の第一段階モデルおよび機械学習／統計モデル（例えば、動的ニューラルネットワークまたは図７Ａのサンプルレベル分類器）を含むことができ、ここで、複数の第一段階モデルの数は、１つ以上のパッチの数よりも少ない。例えば、分類器は、二つの第一段階モデル（例えば、二つの回帰ニューラルネットワーク）を含むことができ、そしてパッチの数は１０００であることができる。この状況では、１０００枚のパッチの一部（例えば、４００枚）は、２つの第１段階モデルのうちの１つにデータを入力することができ、１０００枚の残りのパッチ（例えば、６００枚は、２つの第１段階モデルのうちの他の１つにデータを入力することができる。

【0204】

方法は、さらに、被験者のコホートを用いて、１つ以上の第一段階モデル（例えば、図７ＢのＣＮＮモデル）および動的ニューラルネットワーク（例えば、図７Ｂのサンプルレベル分類子）を訓練することを含み、ここで、被験者のコホートは、がん状態について第一のラベルを有する第一のサブセットの被験者、およびがん状態について第二のラベルを有する第二のサブセットの被験者を含む。トレーニングは、ａ）ランダムベースで、癌の状態、年齢、喫煙状態、または性別の任意の組み合わせに基づいて、被験者のコホートを複数の群に層別化すること；ｂ）複数の群の第１の群をトレーニング群として使用し、残りの複数の群の残りを試験／検証群として使用して、１つ以上の第１段階モデル（例えば、図７ＢのＣＮＮモデル）および動的ニューラルネットワーク（例えば、図７Ｂのサンプルレベル分類器）をトレーニング群に対してトレーニングすること；ｃ）複数の群の中の各群を、複数の群の中の各群を、ｂを使用する反復トレーニング群として使用するように反復すること；およびｄ）ｂ）を使用して、層別化ａ）を繰り返し、分類器性能基準を満たすまでｃ）を反復すること、を含むことができる。トレーニング群は、被験者のコホートから得られる情報またはデータの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上を含むことができる。この状況において、試験群は、被験者のコホートから得られる情報またはデータの多くても９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下を含むことができる。いくつかの実施形態において、トレーニング群は、被験者のコホートから得られる情報またはデータの多くても９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下を含むことができる。この状況において、試験群は、被験者のコホートから得られる情報またはデータの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上を含むことができる。分類器の性能は、約４０、４１、４５、４４、５０、５６、６５、６６、６５、６６、６５、７０、６７、６５、６６、７０、６６、６７、７５、７８、７８、８１、８６、８５、８８、８９、９０、９１、９３、９５、９８、９８．５、９９、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．８％の感度（精度）であり、約８０、８０、８２、８３、８５、８８、８９、９０、９２、９８、９８．５、９９．１、９９、２．９９、２、９９．３、４．５、９９被験者コホート全体で９９．６、９９．８、９９．９％の特異度

【0205】

例えば、分類器は、患者サンプル（例えば、被験者のコホートについて）を入手することにより、そのような患者ごとにそのがんの状態でラベル付けされ、そのような被験者についてのメチル化データを用いて、複数のパッチを集団化することにより訓練することができる（例えば、とりわけ、相互情報、事前の知識、超パラメータ、および／または既存のモデルのようなパッチ設計のための方法を用いる）。それぞれのパッチを充填するそれぞれのサンプルに対して、癌状態インジケータは、患者ラベルに対するパッチレベルの分類器トレーニングのためにパッチに割り当てることができる（例えば、複数の第一段階モデルをトレーニングする）。

【0206】

複数の第一段階モデルを含む分類器について、各第一段階モデル（例えば、パッチレベル回帰ネットワーク）を二値分類器として訓練し、特徴抽出器として用いることができ、各第一段階モデル（例えば、パッチレベル回帰ネットワーク）の出力は、複数の第一段階モデルに対応する複数の領域を横切って連結された中間特徴ベクトルとすることができる。このような中間ベクターはそれぞれ、コホート内の異なる患者に相当する。それぞれの第１段階モデルの出力は、それぞれの第１段階モデル内の中間の完全に接続された分類層からの複数の活性化（例えば、整流された線形ユニット（ＲｅＬＵ）、ｔａｎｈ、シグモイドなどの出力）を含むことができる。それぞれの第一段階モデル（対応するパッチの入力に応答する）からの活性化を用いて、それぞれの全体スコアまたは各被験体に対する包埋のベクトルを生成することができる。サンプルレベル分類器は、例えば、深く広い深いニューラルネット（ＤＮＮ）分類器の形で、それぞれの全体スコアまたは包埋のベクトルと各被験者のそれぞれのラベル上で訓練することができる。

【0207】

複数の第一段階モデル（例えば、ＣＮＮ）およびサンプルレベル分類器（例えば、動的ニューラルネットワーク）の上記トレーニングは、３ｘ６倍交差検証を含むことができる。クロスバリデーションは、トレーニングデータセットをより小さなトレーニングデータセットとバリデーションデータセットに分割し、次に最初のステージモデルをより小さなトレーニングセットに対してトレーニングし、最初のステージモデルをバリデーションデータセットに対して評価することで構成することができる。例えば、トレーニングデータセットは、各トレーニングビンが可能な限り均一にできるように、関心のある全ての分類および／または生物学的プリア（例えば、とりわけ、癌／非癌、癌タイプ、癌病期、年齢、および／または喫煙状態）により等しく層別化される６ビンに細分することができる。トレーニングは、６つのビンのうちの５つを使用して実行でき、検証は６つのｔｈビンで実行される（クロス検証）。このプロセスは、６つのビンの各々が検証のために１回使用されるように、６回繰り返すことができる。トレーニングデータセットは無作為化してシャフリングを３回行うことができ、層別化、トレーニング、バリデーションを繰り返し、合計１８回のトレーニングランを実施することができる。分類器の性能基準は、データセットの３倍のランダム化とすることができる。第１段階モデルも第２段階モデルも、３ｘ６倍交差検証のそれぞれの倍数の間に訓練することができる。３ｘ６倍のクロスバリデーションを用いるのではなく、ＰとＱが正の整数であり、同一の場合も異なる場合もあるＰｘＱ倍のクロスバリデーションを用いることができる。トレーニングデータセットは、各トレーニングビンができるだけ均一にできるように、関心のあるすべての分類および／または生物学的プリア（特に、癌／非癌、癌タイプ、癌病期、年齢、および／または喫煙状態）によって等しく層別化されたＰビンに細分することができる。トレーニングは、ＰビンのＰ－１を使用して（例えば、上述したように）、Ｐｔｈビンと共に実施される妥当性確認と共に実施することができる。このプロセスは、各Ｐビンがバリデーションに１回使用できるようにＱ回繰り返すことができる。トレーニングデータセットは無作為化し、Ｐ時間を短縮でき、ＰｘＱトレーニングを合計して実行するように、層別化、トレーニング、バリデーションを繰り返すことができる。Ｐは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上とすることができる。Ｑは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上とすることができる。

【0208】

癌の状態は、起源の組織（または起源の組織、ＴＯＯ）を含み得、被験者のコホートの各被験体は、起源の組織で標識される。コホートには、任意のタイプの癌を有する被験者、または本明細書の別の箇所に記載されている癌の組合せを含むことができる。がんの状態には、特定のがんの病期を含めることができ、被験者コホートの各被験者には、特定のがんの病期でラベルを貼る。コホートには、任意のタイプの癌の病期、または本明細書の別の個所に記載される癌の組合せを有する被験体を含めることができる。癌の状態は、被験体が癌を有するか否かを含み、層別化ａ）は、複数の群における各群が癌を有し、かつ癌を有さない被験体の数が等しいことを保証し得る。

【0209】

本開示の分類子の訓練可能なパラメータの数は、訓練中にそれぞれのデータセットにスケーリングすることができる（例えば、ＶＧＧＮｅｔ：１億４０００万の訓練可能なパラメータ対Ｐａｔｃｈ－ＣＮＮ１６：３４５，０００の訓練可能なパラメータ）。脱落は、学習加重集合を作成し、ネットワークの複雑性を減少させることにより、制御過剰適合に適用し、小さなトレーニング集合の分類を改善することができる。最大５０％の脱落が適用できる。トレーニングは、トレーニング中に、複数のパッチ中の各パッチのそれぞれの出力層によって提供される値に基づいて、Ｌ１正規化（例えば、Ｌａｓｓｏ回帰）またはＬ２正規化（Ｒｉｄｇｅ回帰）を用いて、複数のパッチ中の１つ以上のパッチを排除することができる。Ｌ２正規化は、係数１０％まで、ハイパーユニッドバッチサイズで使用することができる。トレーニングは、限られたエポック数での早期停止および／または計量ベースの早期停止を用いて、複数のパッチ中の１つ以上のパッチを除去することができる。トレーニングは、０．５、Ｌ１規則化、減衰学習率、Ａｄａｍ最適化器および２５６での大きなバッチサイズでの積極的な脱落を用いて行うことができる。トレーニングは、減衰学習率ではなく斜め三角形学習率を用いて行うことができる。

【0210】

癌／非癌について訓練されたバイナリー分類器から得られた特徴ベクトルは、組織起源、器官起源、癌タイプおよび／または癌ステージについてのマルチクラス分類器を訓練するために使用することができる。癌／非癌分類器から複数クラス（例えば、起源組織）分類器への転送学習は、起源分類器の組織における精度の増加をもたらし得る。米国暫定特許出願第を参照のこと。６２／８５１，４８６，２０１９年５月２２日に申請した「移乗学習を利用したがんの病態の有無のシステムと判定方法」は、このような移乗学習に関する開示を参考にして取り入れられている。マルチクラス分類器における精度の増加は、１％を超える、５％を超える、１０％を超える、１５％を超える、２０％を超える、または５０％を超えることができる。

【0211】

分類器は、一つ以上のＣＮＮ分類器を含むパッチＣＮＮ分類器（例えば、図７Ｂに示されるように各パッチに対して一つ）と、それに続いて、平均－プーリング、最大－プーリング、３規範プーリングによるパッチの凝集、ガウス平滑化を伴うまたは伴わないロジスティック回帰、または複数のＣＮＮ分類器から抽出された特徴に関する－平均モデリングを行うサンプルレベル分類器を含むことができる。分類器は、一つ以上のＣＮＮ分類器を含むパッチＣＮＮ分類器を含むことができる（例えば、図７Ｂに示されるように各パッチに対して一つ）。このようなＣＮＮはそれぞれ、あらかじめ訓練されたＣＮＮモデルを使用することができる。事前に訓練されたＣＮＮモデルは、ピキセレートされた画像データ（例えば、ＲＧＢピキセレートされた画像）上で訓練された１つ以上の層の回旋ニューラルネットを使用することができる。このようなあらかじめ訓練されたＣＮＮモデルの例としては、ＬｅＮｅｔ、ＡｌｅｘＮｅｔ、ＶＧ１１、ＶＧＧＮｅｔ１６、ＧｏｏｇＬｅＮｅｔ、またはＲｅｓＮｅｔが挙げられるが、これらに限定されない。事前に訓練されたＣＮＮモデルは、多層ニューラルネット、深部回旋ニューラルネット、視覚幾何学回旋ニューラルネット、又はそれらの組合せを含むことができる。あらかじめ訓練されたＣＮＮモデルは、脳回ニューラルネットワークの分類層以外に、非生物学的データ上で訓練された脳回ニューラルネットワークの全層を含むことができる。事前訓練されたＣＮＮモデルは、ａ１６層の事前訓練されたＣＮＮモデルとすることができる。サンプルレベル分類器は、あらかじめ訓練された１６層ＣＮＮモデルを含むことができる。

【0212】

第一レベル分類器のためのネットワークアーキテクチャの例は、２つの完全に連結された層および柔らかい最大出力層を有する特注のＶＧＧ－１１回帰ニューラルネットワークアーキテクチャのために、表２の下に詳述される。従来のＶＧＧ－１１は、３ｘ３の回帰フィルターサイズを含み、ＲｅＬＵ活性化関数を使用することができる。この特注のＶＧＧ－１１ＣＮＮについては、マトリックスの２次元回旋（Ｃｏｎｖ２ｄ）を伴う断片ピリュープ上の断片内配列を捕捉するために回旋フィルター（例えば、回旋粒）形状を１ｘ３に調整することができ、ＲｅＬＵの代わりに漏洩整流線形ユニット活性化（ＲｅＬＵ）活性化機能を使用することができる。

【0213】

[表２］特注のＶＧＧ－１１曲がりくねった神経回路網のためのネットワークアーキテ

【0214】

本開示の別の局面は、種の被験体の癌状態を決定する方法を提供し、少なくとも１つの処理装置と少なくとも１つの処理装置による実行のための少なくとも１つのプログラムを保存する記憶を含むコンピュータシステムを少なくとも含む方法を提供する。少なくとも１つのプログラムは、データセットを得るための指示を含むことができ、電子形態では、データセットは、複数の断片におけるそれぞれの断片の対応するメチル化パターンを含むことができる。それぞれの断片（ｉ）の対応するメチル化パターンは、試験対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片の１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定することができ、そして（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位中の各ＣｐＧ部位のメチル化状態を含むことができる。

【0215】

少なくとも１つのプログラムは、さらに、複数のパッチを得るための指示を含むことができ、ここで、複数のパッチ中の各パッチは、第１のチャネルを含み得、そして種の参照ゲノム中の対応する独立したＣｐＧ部位のセットを表すことができる。ＣｐＧ部位の対応する独立セット中の各ＣｐＧ部位は、参照ゲノム中の所定の位置に対応することができる。それぞれのパッチの第一のチャネルは、第一の複数のパラメータの複数の例を含むことができ、ここで、第一の複数のパラメータの各例は、それぞれのパッチに対するＣｐＧ部位の対応する独立セットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含む。少なくとも１つのプログラムは、さらに、それぞれの断片のＣｐＧ部位と単一のそれぞれのパッチのＣｐＧ部位の対応する独立セットとの一致に基づいて、複数の断片中のそれぞれの断片のすべてまたは一部を、複数のパッチ中のそれぞれのパッチに割り当てるための指示を含むことができる。少なくとも１つのプログラムは、さらに、複数のモデルにおいて対応する訓練されたモデルに、複数のパッチ中の各パッチを適用するための指示を含むことができ、それにより、被験体中の癌状態を決定する。

【0216】

複数の断片中の個々の断片は、異なるゲノム位置に並ぶユニークな分子断片であり得るか、または異なるメチル化パターンを含み得る。具体的には、断片は、それぞれの断片のメチル化パターンに基づくのではなく、それぞれの断片のＣｐＧ部位と、それぞれの断片のＣｐＧ部位の対応する独立セットとの一致に基づくことができるように、それぞれの断片のすべてまたは一部をそれぞれの断片に割り当てることができるように、ゲノム位置に整列するユニークな分子断片であり得る。

【0217】

本方法は、複数のパッチを使用することができる。少なくとも１つのプログラムは、ＣｐＧ部位の第１の独立セットに並ぶ各断片について、それぞれの断片のメチル化パターンに基づく第１の複数のパラメータの全部または一部のインスタンスをポピュレーションすることによってパッチを構築するための指示を含んでいないことがある。対照的に、得られた複数のパッチをあらかじめ構築することができる。

【0218】

各断片のＣｐＧ部位とそれぞれのパッチのＣｐＧ部位の対応する独立セットとの一致に基づいて、複数のパッチ中の各断片のすべてまたは一部を、複数のパッチ中の各断片に割り当てることは、以下を含むことができる：ｉ）単一の各パッチの第１の複数のパラメータの内で、複数の断片中の別の断片によってメチル化状態が割り当てられていない、それぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを、単一のパッチ中の第１の複数のパラメータの内で、第１の単一断片のＣｐＧ部位、それぞれの断片のそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態を同定すること；ｉｉ）同定されたパラメータの間で、各パラメータの内で、それぞれの断片のＣｐＧ部位に並ぶ、単一のパッチの第１の複数のパラメータの内で、各断片のそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態。

【0219】

核酸サンプルは、無細胞核酸サンプルを含むことができる。生物学的試料は、配列決定分析のための準備において、無細胞核酸を抽出するために処理することができる。生物学的試料の詳細は、本明細書の別の個所に記載されている。例えば、無細胞核酸は、Ｋ２ＥＤＴＡチューブにおいて被験体から採取された血液試料から抽出することができる。検体は、採血後２時間以内に、まず１０分で２倍に紡績し、１０００ｇで処理し、２０００ｇでプラズマ１０分に処理することができる。次いで、血漿を－８０℃で１ｍｌアリコートで保存することができる。このようにして、適切な量の血漿（例えば、１～５ｍｌ）を、無細胞核酸抽出の目的のために生物学的試料から調製することができる。無細胞核酸はＱＩＡａｍｐＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、ＤＮＡＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ）に溶出することができる。精製した無細胞核酸は、使用するまで－２０℃で保存することができる。配列決定を目的とする生物学的方法を用いて、無細胞核酸を調製するために１つ以上の方法を用いることができる。

【0220】

生物学的試料を得ることと、配列アッセイのようなアッセイを実施することとの間の時間を、アッセイまたは方法の感度および／または特異性を改善するために最適化することができる。生体試料は、アッセイを実施する直前に得ることができる。生物学的試料を入手し、アッセイを実施する前に一定時間（例えば、数時間、数日または数週間）保存することができる。検体は、１日以内、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、１年、またはトレーニング対象者から検体を入手してから１年以上経過した後に、検体について分析を行うことができる。

【0221】

個々の標的の核酸は、標的とする遺伝子群の少なくとも５０，０００ｘ個の遺伝子の配列深さ、この標的とする遺伝子群の少なくとも５５，０００ｘ個の配列深さ、この標的とする遺伝子群の少なくとも６０，０００ｘ個の遺伝子のシークエンス深さ、またはこの標的とする遺伝子群の少なくとも７０，０００ｘ個のシークエンス深さからなるデータセットを形成するために、標的とするパネル・シークエンスによって得られる。標的とする遺伝子パネルは、４５０から５００の遺伝子の間にあり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子の標的パネルは、５００±５遺伝子の範囲内、５００±１０遺伝子の範囲内、または５００±２５遺伝子の範囲内である。

【0222】

配列決定法は、全ゲノムバイサルファイト配列決定を含むことができる。全ゲノム重亜硫酸塩基配列決定法は、例えば米国特許出願第に記載されているように、１つ以上のメチル化状態ベクターを同定することができる。１６／３５２，６０２，２０１９年３月１３日に提出された「異常なフラグメントの検出および分類」と題する、または米国暫定特許出願第に開示された技術のいずれかに従った。６２／８４７，２２３，２０１９年５月１３日に提出された「モデルに基づく特徴付けと分類」と題したもので、それぞれ参考までに組み込まれている。以下の実施例１に記載するように、ＣＣＧＡ１データセットから複数の核酸を生成することができる。複数の核酸を処理して、分類器（例えば、パッチＣＮＮ分類器）を訓練するために使用されるコピー数値を得ることができる。次いで、対象からの生物学的サンプルから得られた検査データセットを、対象が疾患状態を有するかどうか、およびいくつかの実施形態において、疾患状態のタイプ、病期および／または他の特徴を決定するために訓練された分類器に入力することができる。可変性が高いか地図作成可能性が低いゲノム領域は除外できる。

【0223】

標的化配列決定には、標的化ＤＮＡメチル化配列決定を含むことができる。標的ＤＮＡメチル化配列決定は、様々な方法で行うことができる。異なる酵素処理および化学処理との組み合わせは、メチル化シトシンまたは非メチル化シトシンのどちらかを変換することができる。例えば、標的化ＤＮＡメチル化配列決定は、複数の核酸（ブロック４１０）中の１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍＣ）および／または５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出することができる。別の例として、標的ＤＮＡメチル化配列決定は、１つ以上の非メチル化シトシンまたは１つ以上のメチル化シトシンの、複数の核酸における、対応する１つ以上のウラシルへの変換を含み得る。別の例として、標的ＤＮＡメチル化配列決定は、複数の核酸において、１つ以上の非メチル化シトシンの対応する１つ以上のウラシルへの変換を含み得、ＤＮＡメチル化配列は、１つ以上のウラシルを１つ以上の対応するチミンとして読み取る。標的ＤＮＡメチル化配列決定は、複数の核酸において、１つ以上のメチル化シトシンの対応する１つ以上のウラシルへの変換を含むことができ、ＤＮＡメチル化配列は、１つ以上の５ｍＣまたは５ｈｍＣを１つ以上の対応するチミンとして読み取る。

【0224】

図８Ｂは、被験体の癌状態を決定する方法８５０を記述する別の例示的なフローチャートを示す。この方法は、本明細書に開示されている環境５００および／または処理システム５６０によって実施することができる。

【0225】

方法８５０のステップ８５２は、１人以上の処理者を介して、１人以上のトレーニング被験体からトレーニングデータセットを取得することを含むことができる。トレーニングデータセットは、１つ以上のトレーニング被験体から得られた１つ以上の生物学的サンプル中の複数の断片に関連する１つ以上のトレーニングメチル化パターン、および１つ以上のトレーニングメチル化パターンに関連する１つ以上の所定のがん状態を含むことができる。トレーニングデータセットは、ゲノムの全部または一部の一次核酸配列に関する情報（例えば、ヌクレオチド多型の有無、インデル配列の再編成、突然変異頻度など）、ゲノム内の１つまたは複数の特定のヌクレオチド配列のコピー数（例えば、コピー数、対立遺伝子頻度分画、単一染色体または全ゲノム倍数性など）、ゲノムの全部または一部のエピジェネティック状態（例えば、メチル化、ヒストン修飾、ヌクレオソーム位置決めなどの共有結合核酸修飾）、および生物のゲノムの発現プロファイル（例えば、遺伝子発現レベル、アイソタイプ発現レベル、遺伝子発現比など）を含むが、これらに限定されるものではない。

【0226】

１つまたは複数のトレーニングメチル化パターンは、１つまたは複数のトレーニング被験体から得られた１つまたは複数の生体試料中の複数の断片を含む１つまたは複数の核酸試料の少なくとも１つのメチル化シークエンシングによって決定することができる。１つまたは複数のトレーニングメチル化パターンは、１つまたは複数のトレーニング被験体から得られる１つまたは複数の生体試料中の複数の断片中の各ＣｐＧ部位の少なくとも１つのメチル化状態を含むことができる。トレーニングメチル化パターンは、トレーニング対象者のメチル化パターンとすることができる。トレーニング被験体は、その情報がコンピュータモデルをトレーニングするために使用される任意の被験体であり得る。訓練科目は、被験者と異なることができる。主題、計算モデル、メチル化パターン、およびメチル化パターンを決定する方法の詳細は、ここでは別個に記載する。１つ以上の所定の癌状態は、本明細書の別の箇所に記載される任意の癌状態であり得る。

【0227】

方法８５０のステップ８５４は、１つ以上の処理器を介して、トレーニングデータセットに基づいて１つ以上のパッチを構築することを含むことができる。１つまたは複数のパッチの各パッチは、１つまたは複数のチャネルを含むことができる。１つ以上のパッチの各パッチは、その種の参照ゲノム中の１つ以上のＣｐＧ部位を表すことができる。ＣｐＧ部位の各ＣｐＧ部位は、参照ゲノム中の所定の位置に対応することができる。１つ以上のパッチの各々のパッチまたは最初のパッチは、その種の参照ゲノムにおける最初の独立したＣｐＧ部位のセットを表すことができる。ＣｐＧ部位の最初の独立セットにおける各々のＣｐＧ部位は、参照ゲノム中の所定の位置に対応することができる。構築物は、ＣｐＧ部位の第一の独立したセット、それぞれの断片のトレーニングメチル化パターンに基づく第一の複数のパラメータの全部または一部に整列する、１つまたは複数のトレーニング被験体から得られる１つまたは複数の生物学的試料中の各断片を、複数の断片中にポピュレーションまたは充填することを含むことができる。ＣｐＧ部位の最初の独立セット、インスタンス、パラメータ、１つ以上のパッチ、および１つ以上のパッチを構築する方法の詳細は、本明細書の別の個所でさらに記述される。

【0228】

１つまたは複数のチャネルが第１のチャネルを構成することができる。第一のチャネルは、第一の複数のパラメータの複数のインスタンスを含むことができる。最初の複数のパラメータの各インスタンスは、１つ以上のパッチのパッチに対する第１の独立したＣｐＧ部位のセットにおける、それぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態に関するパラメータを含むことができる。この状況において、構築物は、１以上のトレーニング被験体から得られた１以上の生物学的試料中の複数の断片について、ｉ）複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が割り当てられていない、それぞれの断片中のＣｐＧ部位に対応するパラメータを、第１チャネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内で同定すること；およびｉｉ）各パラメータの中で、それぞれの断片の対応するＣｐＧ部位、それぞれの断片の対応するＣｐＧ部位のメチル化状態に整列するものを割り当てること、を含むことができる。パラメータを同定する方法およびメチル化状態を割り当てる方法のさらなる詳細は、本明細書の別の個所に記載されている。

【0229】

１つまたは複数のチャネルが第２のチャネルを構成することができる。第２のチャネルは、第１のチャネルとは異なる情報を含むことができる。第二のチャネルは、第一の複数のパラメータの各インスタンスに対する第二の複数のパラメータの対応するインスタンスを含むことができる。第２の複数のパラメータの各インスタンスは、第１パッチのＣｐＧ部位の第１の独立セットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位の第１の特徴、ＣｐＧメチル化状態以外のパラメータを含み得る。１つまたは複数のチャネルは、さらに、第３のチャネルを含むことができる。第三のチャネルは、第一／第二のチャネルとは異なる情報を含むことができる。第３のチャネルは、第１の複数のパラメータの各インスタンスに対する第３の複数のパラメータの対応するインスタンスを含むことができる。第３の複数のパラメータの各インスタンスは、第１の独立したＣｐＧ部位セットにおけるそれぞれのＣｐＧ部位の第２の特徴に関するパラメータを含み得る。１つ以上のチャネルの数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上とすることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上のチャネルの数は、多くても１０、９、８、７、６、５以下であり得る。１つ以上のチャネルの数が１より多い場合、１つ以上のチャネルの各チャネルには、１種類の特性（例えば、第１の特性）に関連する固有の情報を含むことができる。例えば、図６Ｂの６つのチャネルの各々は、メチル化状態、ベータコントロール、ベータサンプル、ｐ値、多重性、またはプリオに関連する情報を含み得る。この例では、６つのチャネルの各チャネルに、他のチャネルとは異なる情報を含めることができる。１つ以上のチャネルの詳細およびその特徴（例えば、第１の特徴、第２の特徴）については、ここでは別の箇所に記載する。

【0230】

ステップ８５４の前、または癌状態を決定する任意の段階において、方法８５０は、各断片のそれぞれに対応する複数のＣｐＧ部位を横切る対応するメチル化パターンがｐ値閾値を満たさないｐ値を有する、複数の断片から除去することにより、１つ以上のトレーニング対象から得られた１つ以上の生体試料中の複数の断片を剪定することを含むことができる。ｐ値、ｐ値閾値、および複数の断片の剪定の詳細は、ここでは別個に記載する。

【0231】

方法８５０のステップ８５６は、１つ以上の処理機を介して、１つ以上のパッチ及びトレーニングデータセットに基づく計算モデルをトレーニングすることができる。計算モデルは、第１段階モデル及び第２段階モデルを含むことができる。第１段階モデルは、１つ以上の回旋ニューラルネットワーク（ＣＮＮ）を含むことができる。脳回ニューラルネットワークは、事前に訓練された脳回ニューラルネットワークを含むことができる。事前に訓練されたＣＮＮは、ピキセル化された画像データ（例えば、ＲＧＢピキセル化画像）上で訓練された１つ以上の層の回旋ニューラルネットを使用することができる。このような事前訓練されたＣＮＮモデルの例は、限定されるものではないが、ＬｅＮｅｔ、ＡｌｅｘＮｅｔ、ＶＧＧ－１１、ＶＧＧＮｅｔ１６、ＧｏｏｇＬｅＮｅｔ、またはＲｅｓＮｅｔを含むことができる。あらかじめ訓練された回旋神経回路網は、特注のあらかじめ訓練されたＣＮＮを含むことができる。特注のあらかじめ訓練されたＣＮＮは、特注のＶＧＧ－１１回旋神経回路網を含むことができる。特注のＶＧＧ－１１回旋神経回路網は、特注のフィルターサイズおよび活性化機能を含むことができる。第１段階モデル、ＣＮＮ、第２段階モデル、あらかじめ訓練されたＣＮＮ、および特注のＶＧＧ－１１の詳細については、本稿の別の箇所でさらに記述する。

【0232】

方法８５０のステップ８５８は、１つ以上の処理器を介して、試験被験体から試験データセットを得ることを含むことができる。試験データセットは、試験被験体から得られる１つ以上の生物学的試料中の複数の断片の１つ以上の試験メチル化パターンを含むことができる。検査データセットには、被検者のあらゆる生物学的またはゲノム情報を含めることができる。このような生物学的およびゲノム情報の詳細は、本明細書中の別の個所に記載されている。１つ以上の試験メチル化パターンは、試験被験体から得られる生体試料中の複数の断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定することができる。１つ以上の試験メチル化パターンは、試験被験体から得られる生体試料中の複数の断片中の各ＣｐＧ部位の少なくとも１つのメチル化状態を含むことができる。試験メチル化パターンは、被験体のメチル化パターンとすることができる。

【0233】

方法８５０のステップ８６０は、検査データセットおよび計算モデルに基づいて、１つ以上の処理装置を介して、検査対象の癌状態を決定することを含むことができる。決定は、少なくとも第１のパッチを分類器に適用することを含み、それにより、被験体中の癌状態を決定することができる。コンピュータモデルは、試験データセットに基づいて、癌対非癌および／または起源組織を予測することができる。計算モデルは、癌／非癌／情報不足、起源組織、起源臓器、癌タイプ、および／または癌ステージを識別するマルチクラス予測を行うことができる。

【0234】

本明細書に記載される任意の方法は、さらに、１つ以上の生物学的プリアを用いて計算モデル／分類器を更新することを含むことができる。生物学的プライヤーは、地理的情報、喫煙者／非喫煙者、疾患状態ステージ、年齢群、疾患状態の検出可能性、および／または性別（生物学的性別）を含むことができるが、これらに限定されない。更新された計算モデルは、分類器（例えば、マルチクラス分類器）と、一般集団での適用のための数学的計算（例えば、行列計算）とを含むことができる。この状況では、分類器の前または後に数学的計算を適用することができる。いくつかの実施形態では、更新された計算モデルは、一般集団における適用のための数学的計算を含む分類器とすることができる。この状況では、数学的計算を分類器に組み込み、分類器で訓練できる。分類器は、ここに開示された任意のデータまたは情報に基づいて分類を行うことができる、本明細書の他の場所に開示された任意の機械学習または統計モデルを含むことができる。分類器が回帰ニューラルネットワークのための一つ以上のパッチを含む場合には、一つ以上の生物学的プリオルに関連する情報は、一つ以上のパッチの一つ以上のチャネルに組み込まれることがあり、組み込まれないことがある。数学的計算にはナイーブベイズ統計計算を含むことができ、ここでは１つ以上の生物学的プリアを用いて事後確率を計算することができる。数学的計算は、異なる標的集団（例えば、異なる大陸の患者）における適用のために、本明細書の別の箇所に記載されているように、計算モデルを修正する機構とすることができる。更新された計算モデルは、異なる標的集団における癌の頻度および癌タイプの相対頻度を表す情報を含むことができる。がんの頻度には、訓練データセットの頻度分布を含めることができる。更新された計算モデルは、異質な研究（例えば、ここで記述するＳＴＲＩＫＥ）にわたって一般化可能な性能を可能にすることができる。

【0235】

いくつかの実施形態において、計算モデルを更新するために、１つまたは複数の生物学的プリエーターは、疾患状態段階（例えば、癌の病期）、疾患状態の検出可能性（例えば、癌の検出可能性）、および／または性別（生物学的性別）を含み得る。この状況において、数学的計算は、ｉ）一般集団における性別特異的な発生率およびがんの病期特異的発生率、およびｉｉ）異なる病期にわたるがんの検出可能性（例えば、ＣＣＧＡ１における腫瘍分画結果から）を組み合わせることができる。数学的計算には、ｉ）一般集団におけるがんの性別特異的発生率および病期特異的発生率、ｉｉ）様々な病期にわたるがんの検出可能性の間で乗算、追加、分割、および／または差し引くことが含まれる。いくつかの実施形態において、性別特異的発生率および癌の病期特異的発生率は、異なる病期にわたる癌の検出可能性に基づいてスケーリングすることができる。性別特異的な発生率には、訓練または被験者の性別／生物学的性別に関連するあらゆる情報（例、確率）を含めることができる。いくつかの種類のがん（例えば、乳がん）は性別特異的であるため、性別特異的な発生率を用いることができる。がんの病期特異的発生率には、訓練または被験者のがんの病期に関連するあらゆる情報（例、確率）を含めることができる。癌の検出能は、腫瘍分画に基づいて決定することができる。例えば、あるタイプの癌が低排泄（例えば、血液試料中の癌タイプの腫瘍分画が低い）である場合、癌の検出能の値は低くなり得る。

【0236】

更新された計算モデルが分類器と数学計算を含む場合、分類器は訓練データセットで訓練することができ、数学計算は訓練データセットで訓練しないことがある。更新された計算モデルが数学計算を含む分類器である場合、分類器と数学計算は訓練データセットで訓練できる。この状況において、１つ以上の生物学的プリオルは、分類器に入力するためのトレーニングデータセットと組み合わせることができる１次元または多次元マトリックスとして構築することができる。

【0237】

方法は、さらに、１つ以上の処理機を介して、疾患状態（例えば、癌の状態）を、被験体のユーザ装置に関連する電子記録に送信することを含むことができる。疾患状態は、記憶共有、メッセージの通過、トークンパス、またはネットワーク送信を含む任意の適切な方法を用いて、通過、転送、または送信することができる。疾患状態は、テキスト表示、写真表示、ハイパーリンク、ビデオ／音声表示、ＳＭＳ、メッセージアプリケーションまたはサービス、電子メール、または被験体、医療専門家、または他の関係者への任意の他の適切な機構を介して送信することができる。疾患状態は、グラフィカルユーザインターフェース（例えば、グラフィカルユーザインターフェース５５０）上に示すことができる。グラフィックユーザインターフェースは、ユーザ（例えば、医療専門家）に、例えば、疾病状態及び疾病状態に基づく治療提案もしくは予防ステップの勧告のグラフィックショウイングを提供するように構成することができる。グラフィックユーザインターフェースは、特定の作業（例えば、疾患状態のレビュー及び治療計画の調整）とユーザの相互作用を可能にすることができる。疾患の状態（例えば、癌の状態）は、癌のレベル、起源の組織、および転移性疾患の状態を含み得る。癌および起源組織のレベルの詳細は、ここでは別の個所に記載されている。

【0238】

転移病変の状態は、リンパ系、血流、またはその他の経路を介して体の新たな領域にがん細胞を拡げる転移過程を表している可能性がある。癌状態は、原発組織（ＴＯＯ）に加えて、ＴＯＯから広がる癌に関連する転移性疾患状態の追加情報を提供することができる。このような転移性疾患の状態は、ＴＯＯを示すか、または体内の他の臓器（例えば、腫瘍隣接組織）への癌細胞の広がりを示すかのいずれかであり得る。ＣｆＤＮＡ断片は、細胞死に由来することができ、ｃｆＤＮＡ断片の存在は、ＴＯＯ以外の他の領域（例えば、腫瘍隣接組織または浸潤転移性疾患に罹患した体内の他の器官）における組織損傷および細胞死を示すことができる。

【0239】

転移プロセスに影響される細胞からの癌およびｃｆＤＮＡ断片の検出は、分類器または本明細書の別の個所に記載された計算モデルを使用することによって実装することができる。臨床知識は、転移部位におけるｃｆＤＮＡ断片と隣接組織からの断片とを区別するために、多段階分析で実装することができる。臨床的知見は、起源が既知の組織のがんが他の臓器または組織にどの程度頻繁に転移するかを捉えることができる。このような情報は癌登録から得ることができる。例えば、ＳＥＥＲＲｅｓｅａｒｃｈＤａｔａ１９７５－２０１７では、骨、脳、肝への遠隔転移の存在が収集されている。診断時の肺、リンパ節または他の部位。参照：Ｂｕｄｃｚｉｅｓｅｔａｌ．，２０１４，“Ｔｈｅｌａｎｄｓｃａｐｅｏｆｍｅｔａｓｔａｔｉｃｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆｍｅｓｉｏｎｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｓ“，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１４Ｎｏｖ４；６（１）：５７０－８３も参照。転移疾患状態を決定するために、本明細書に記載される任意の方法は、断片レベルの配列決定データを用いてＴＯＯおよび転移プロセスを別々に同定するための２段階をさらに含むことができる。第一段階は、試験被験体から得られた１以上の生体試料中の複数の断片（例えば、ｃｆＤＮＡ断片）を用いた分類器／計算モデルを介して、試験被験体のＴＯＯを決定するために本明細書に記載される任意の方法（例えば、方法８００または方法８５０）を含むことができる。第二段階は、決定されたＴＯＯに関連する転移過程によってより影響を受けやすい起源の組織に遠い他の組織の転移病態を検出するために、第一段階において、分類器／計算モデルを介して複数の断片を分析することを含むことができる。他の組織は臨床的知見に基づいて決定することができる。

【0240】

例えば、第一段階が、被験体の起源の組織が、被験体から得られた１以上の生物学的試料中の複数の断片を用いた分類器を介して乳房である（または被験体が乳癌である）場合、第二段階は、臨床的に公知の乳癌転移により影響を受ける一般的な臓器である肝臓、脳、骨、または肺などの他の組織への転移過程により影響を受ける非癌性細胞の存在を検出するために、分類器で複数の断片を分析することを含むことができる。同様に、一例において、第一段階が、被験体の起源の組織が、被験体から得られた１以上の生物学的試料中の複数の断片を用いた分類器を介して肺である（または被験体が肺癌である）場合、第二段階は、肺癌転移によって影響を受ける臨床的に公知の一般的な器官である肝臓、骨、脳、または副腎などの他の組織への転移プロセスによって影響を受ける非癌性細胞の存在を検出するために、分類器で複数の断片を分析することを含むことができる。別の例では、第一段階が、被験体の起源の組織が、被験体から得られた１以上の生物学的試料中の複数の断片を用いて分類器を介して結腸または直腸である（または被験体が結腸直腸癌である）場合、第二段階は、結腸直腸癌転移によって影響を受ける臨床的に公知の一般的な器官である肝臓、肺、脳、および腹膜などの他の組織への転移プロセスによって影響を受ける非癌性細胞の存在を検出するために、分類器で複数の断片を分析することを含むことができる。さらなる例において、第一段階が、被験体の起源の組織が、被験体から得られた１以上の生物学的試料中の複数の断片を用いた分類器を介して前立腺である（または被験体が前立腺癌である）場合、第二段階は、前立腺癌転移によって影響を受ける臨床的に公知の一般的な器官である骨、肝臓、および肺への広がりなどの他の組織への転移プロセスによって影響を受ける非癌性細胞の存在を検出するために、分類器で複数の断片を分析することを含むことができる。

【0241】

第１段階で使用する分類子は、第２段階で使用する分類子と同じにすることができる。例えば、分類器は、複数の組織について、癌の正規化確率（例えば、０から１の間の値）を提供することができる。正規化された確率に基づく。複数の組織のランクを作成することができる。この状況では、最も高位にランク付けされた組織は原発組織となりうるし、０を超える正規化確率（例えば、＞０．１）で２位にランク付けされた組織は、転移過程の影響を受けやすい原発組織から離れた他の組織となりうる。実施例１０はさらに詳細を提供する。分類器は腫瘍細胞由来のｃｆＤＮＡ試料上で訓練されるが、腫瘍隣接正常組織のメチル化シグナルは、時に、目に見えるスコアをもたらすのに十分に類似し得る。

【0242】

いくつかの実施形態において、第２段階で使用される分類子は、第１段階で使用される分類子とは異なることができる。この状況では、第２段階で使用した分類子は疾患特異的分類子となり得る。非癌性細胞および／または既知の癌および転移部位を有する患者から収集したトレーニングデータセットを用いて、転移部位に対する疾患特異的な分類器をトレーニングすることができる。第１段階でＴＯＯを決定するための分類器と第２段階での疾患特異的分類器の組み合わせは、第１段階と第２段階の両方の分類器を使用する場合と比較して、より高い精度とロバスト性の増加を提供することができる。
［０２６６］本開示の方法、システム、コンピュータモデル、および／または分類子は、癌の存在（または不在）、起源の組織の検出、癌の進行または再発のモニタリング、治療反応または有効性のモニタリング、最小残存疾患（ＭＲＤ）の存在またはモニタリング、またはそれらの任意の組み合わせの決定に使用することができる。一例では、コンピュータモデルおよび／または分類器を用いて、特徴ベクトルが癌を有する被験体由来である可能性または確率スコア（例えば、０から１まで）を生成することができる。可能性スコアまたは確率スコアは、疾患状態の１つのタイプとすることができる。確率スコアを閾値確率と比較して、被験体が癌を有するか否かを決定することができる。他の実施形態では、可能性または確率スコアを異なる時点（例えば、治療の前または後）で評価して、疾患の進行を監視するか、または治療の有効性（例えば、治療的有効性）を監視することができる。さらに他の実施形態では、可能性または確率スコアを用いて、臨床的決定（例えば、癌の診断、治療選択、治療有効性の評価など）を行うか、またはそれに影響することができる。例えば、可能性または確率スコアが閾値を超える場合、医療専門家は適切な治療を処方できる。

【0243】

可能性または確率スコアが異なる時点で評価される場合、最初の時点はがん治療の前（例えば、切除手術または治療的介入の前）とすることができ、２番目の時点はがん治療の後（例えば、切除手術または治療的介入の後）とすることができる。この状況において、この方法は、治療の有効性をモニタリングすることをさらに含むことができる。例えば、第２の可能性または確率スコアが第１の可能性または確率スコアと比較して減少した場合、治療が成功したとみなすことができる。しかしながら、２番目の可能性または確率スコアが最初の可能性または確率スコアと比較して増加した場合、治療は成功しなかったと考えることができる。他の実施形態では、第１および第２時点の両方は、癌治療の前（例えば、切除手術または治療的介入の前）であり得る。さらに他の実施形態では、第１および第２の時点の両方が、癌治療後（例えば、切除手術または治療的介入の前）に可能であり、この方法は、治療の有効性または治療の有効性の喪失をさらにモニタリングすることを含むことができる。さらに他の実施形態では、ｃｆＤＮＡ試料は、第１および第２の時点で癌患者から得られ、分析され得る。例えば、癌の進行を監視する、癌が寛解状態にあるかどうかを決定する（例えば、治療後）、残存疾患または疾患の再発を監視または検出する、または治療（例えば、治療）効果を監視する。

【0244】

検査試料は、任意のセットの時点にわたって癌患者から得ることができ、患者の癌状態をモニターするための開示の方法に従って分析することができる。約１、２、３、４、５、１０、７、８、１０、１１、または１２ヵ月、または約１、２、５、５、３、４、３、５、４、３．５、４、５、４、５．６、７、５．８、８、９．１０、１０．５、１１、１２．５、１４、１４．５、１５、１６、１５．５、１７、５、１７、１８．５、１９、など、約３０分、約１５分、約１５、５、７、１０、１５、６、５、６、７．５、７、８．８、９、９、１０、５、１８、１９、など、約３０分までの時間量によって、第１および第２時点と第２時点を分けることができる１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３、２３．５、２４５，２５，２５．５，２６，２６．５，２７，２７．５，２８，２８．５，２９，２９．５年または約３０年。他の実施形態では、試験試料は、少なくとも３ヵ月に１回、少なくとも６ヵ月に１回、少なくとも年に１回、少なくとも２年に１回、少なくとも３年に１回、少なくとも４年に１回、または少なくとも５年に１回、患者から得ることができる。

【0245】

本明細書に記載されている任意の方法（例えば、可能性または確率スコア、疾患状態）から得られる情報は、臨床的決定（例えば、癌の診断、治療選択、治療有効性の評価など）を行うかまたは影響するために使用することができる。例えば、可能性または確率スコアが閾値を超える場合、医療専門家は、医療専門家の使用者装置（例えば、使用者装置５２０）または任意の他の通信媒体（例えば、電話または郵送）上のグラフィカルユーザインターフェースを介して適切な治療（例えば、切除手術、放射線療法、化学療法、および／または免疫療法）を処方することができる。可能性または確率スコアのような情報は、グラフィックユーザインターフェースを介して、医師または被験体への読影として提供することができる。１つの例では、可能性または確率スコアが０．６以上であれば、１つ以上の適切な治療を処方することができる。別の実施形態では、可能性または確率スコアが０．６５以上、０．７以上、０．７５以上、０．８以上、０．８５以上、０．９以上、０．９５以上である場合、１つまたは複数の適切な治療を処方することができる。

【0246】

治療は、化学療法剤、標的癌治療剤、分化治療剤、ホルモン療法剤、および免疫療法剤を含む１つ以上の癌治療剤を含み得る。例えば、治療は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、細胞骨格破壊剤（タキサン）、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、コルチコステロイド、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体、白金系薬剤およびこれらの任意の組合せを含む１以上の化学療法剤であり得る。治療は、シグナル伝達阻害剤（例えば、チロシンキナーゼおよび成長因子受容体阻害剤）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、レチノイン受容体アゴニスト、プロテオソーム阻害剤、血管新生阻害剤、およびモノクローナル抗体結合体を含む１つ以上の標的癌治療剤を含み得る。治療には、トレチノイン、アリトレチノインおよびベキサロテンなどのレチノイドを含む１つ以上の分化誘導療法剤を含むことができる。治療は、抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤、プロゲスチン、エストロゲン、抗アンドロゲン、およびＧｎＲＨアゴニストまたは類似体を含む１以上のホルモン療法剤を含み得る。治療には、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ）およびアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ）などのモノクローナル抗体療法、ＢＣＧ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、およびインターフェロン－アルファなどの非特異的免疫療法およびアジュバント、例えばサリドマイドおよびレナリドマイド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ）などの免疫調節薬を含む１つ以上の免疫療法剤が含まれ得る。適切な癌治療薬は、腫瘍のタイプ、癌のステージ、癌治療または治療薬への以前の曝露、および癌の他の特性などの特性に基づいて選択できる。

【0247】

図１９は、種の被験体の疾患状態を決定するためにプログラムされているかまたは他の方法で構成されている例示的なコンピュータシステム１９０１を示す。コンピュータシステム１９０１は、本開示で提供される方法の様々な局面を実装および／または調節することができ、例えば、本明細書に記載されるように、訓練データセットおよび検査データセットのバイオインフォマティクス解析を行い、データ収集、解析および結果報告、ならびにデータ管理を統合する、被験体の癌状態を決定する方法を実行することなどが挙げられる。コンピュータシステム１９０１は、使用者の電子装置または電子装置に対して遠隔位置にあるコンピュータシステムであり得る。電子機器は、可動式の電子機器であることができる。

【0248】

コンピュータ・システム１９０１は、中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」および「コンピュータ・プロセッサ」）１９０５を含むことができ、これらは、単一コアまたはマルチコア・プロセッサであってもよく、または並列処理のための複数のプロセッサであってもよい。コンピュータ・システム１９０１はまた、メモリまたはメモリ位置１９１０（例えば、ランダム・アクセス・メモリ、リード・オンリー・メモリ、フラッシュ・メモリ）、電子記憶ユニット１９１５（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インタフェース１９２０（例えば、ネットワーク・アダプタ）、およびキャッシュ、他のメモリ、データ記憶および／または電子表示アダプタなどの周辺装置１９２５を含むことができる。メモリ１９１０、記憶ユニット１９１５、インターフェース１９２０および周辺装置１９２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ１９０５と通信可能である。記憶部１９１５は、データを記憶するためのデータ記憶部（又はデータリポジトリ）とすることができる。コンピュータ・システム１９０１は、通信インターフェース１９２０の助けを借りて、コンピュータ・ネットワーク（「ネットワーク」）１９３０に動作可能に結合することができる。ネットワーク１９３０は、インターネット、インターネット及び／又はエクストラネット、又はインターネットと通信しているイントラネット及び／又はエクストラネットであり得る。ネットワーク１９３０は、場合によっては、電気通信および／またはデータネットワークであり得る。ネットワーク１９３０は、クラウドコンピューティングのような分散コンピューティングを可能にすることができる１つ以上のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク１９３０は、場合によっては、コンピュータ・システム１９０１の補助を得て、ピア・ツー・ピア・ネットワークを実現することができ、これにより、コンピュータ・システム１９０１に結合された装置は、クライアントまたはサーバとして振る舞うことができる。

【0249】

ＣＰＵ１９０５は、一連の機械可読命令を実行することができ、これは、プログラムまたはソフトウェアで具体化することができる。命令は、メモリ１９１０のようなメモリ位置に記憶することができる。指示は、ＣＰＵ１９０５に向けることができ、その後プログラムするか、または、本開示の方法を実施するためにＣＰＵ１９０５を構成することができる。ＣＰＵ１９０５によって実行される動作の例は、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックを含むことができる。

【0250】

なお、マウス１９０５は、統合回路のような回路の一部とすることができる。システム１９０１の１つ以上の他の構成要素を回路に含めることができる。場合によっては、回路は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。

【0251】

記憶ユニット１９１５は、ドライバ、ライブラリ、保存されたプログラムなどのファイルを記憶することができる。記憶ユニット１９１５は、ユーザ・データ、例えば、ユーザ・プリファレンスおよびユーザ・プログラムを記憶することができる。場合によっては、コンピュータ・システム１９０１は、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータ・システム１９０１と通信している遠隔サーバ上に配置されるような、コンピュータ・システム１９０１の外部にある１つ以上の追加のデータ記憶ユニットを含むことができる。

【0252】

コンピュータ・システム１９０１は、ネットワーク１９３０を介して１つ以上の遠隔コンピュータ・システムと通信することができる。例えば、コンピュータ・システム１９０１は、ユーザの遠隔コンピュータ・システム（例えば、コンピュータ・システム１９０１から送信されたサンプル分析の結果を受信し、表示するアプリケーションと共にインストールされたスマートフォン）と通信することができる。遠隔コンピュータシステムの例には、パソコン（例えば、携帯ＰＣ）、スラートまたはタブレットＰＣ（例えば、アップル(R)ｉＰａｄ、サムスン(R)ガラキシタブ）、電話、Ｓｍａｒｔ電話（例えば、アップル(R)ｉＰｈｏｎｅ、アンドロイド対応装置、ブラックベリー(R)）、または個人用デジタルアシスタントが含まれる。ユーザは、ネットワーク１９３０を介してコンピュータシステム１９０１にアクセスすることができる。

【0253】

本明細書に記載される方法は、例えば、記憶１９１０または電子保存ユニット１９１５上などのコンピュータシステム１９０１の電子保存場所に保存された機械（例えば、コンピュータ処理装置）実行可能コードによって実装することができる。機械実行可能または機械可読コードは、ソフトウェアの形式で提供することができる。使用中、コードはプロセッサ１９０５によって実行可能である。場合によっては、コードは、記憶ユニット１９１５から取り出され、プロセッサ８０５による準備完了アクセスのためにメモリ１９１０に記憶されることができる。場合によっては、電子保存ユニット１９１５を排除することができ、機械実行可能な指示が記憶１９１０上に保存される。

【0254】

コードは、コードを実行するように構成されたプロセッサを有するマシンと共に使用するために、事前にコンパイルおよび構成することができ、または実行時にコンパイルすることができる。コードは、コンパイル済みまたはコンパイル済みの方法でコードを実行できるように選択できるプログラミング言語で提供できる。

【0255】

ここに提供するシステムおよび方法の側面はプログラミングにおいて具体化することができる。技術の様々な局面は、典型的には機械（または処理装置）実行可能コードおよび／または機械可読媒体のタイプ上に担持され、または具体化された関連データの形態で「製品」または「製造物品」と考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読み出し専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクのような電子記憶ユニット上に記憶することができる。「保存」タイプの媒体は、コンピュータ、処理器などの有形記憶、またはその関連モジュール、例えば、様々な半導体記憶、テープ駆動装置、ディスク駆動装置などの任意または全てを含み、これらはソフトウェアプログラミングのためにいつでも一過性ではない保存を提供し得る。ソフトウェアの全部または一部は、インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワークを介して時々通信することができる。このような通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサから別のコンピュータへの、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にしてもよい。したがって、ソフトウェア要素を担い得る別のタイプの媒体は、例えば、局所装置間の物理的界面を横切って、ワイヤードおよび光学ランドラインネットワークを通して、および様々な空気－リンクにわたって使用されるような、光、電気および電磁波を含む。ワイヤードまたはワイヤレスリンク、光学リンクなどのような波を運ぶ物理的要素も、ソフトウェアを担う媒体として考えることができる。本明細書中で使用される場合、非一過性で有形の「保存」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械「読取可能媒体」などの用語は、実行のためにマイクロコントローラに指示を与えることに参加する任意の媒体を意味する。

【0256】

したがって、コンピュータ実行可能コードのような機械可読媒体は、有形保存媒体、キャリア波媒体または物理的伝送媒体を含むが、これらに限定されない多くの形態をとることができる。不揮発性保存媒体は、例えば、データベース等を実装するために使用されることがある任意のコンピュータ等における保存機器のいずれかのような光学又は磁気ディスクを含む。図面に示す。揮発性記憶媒体は、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリのようなダイナミックメモリを含む。タンジブル伝送媒体には、同軸ケーブル、銅線および光ファイバが含まれ、これらには、コンピュータシステム内のバスを含むワイヤが含まれる。キャリア波伝送媒体は、電波または電磁信号、または電波（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信中に発生するような音響または光波の形態をとることがある。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態は、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、その他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤまたはＤＶＤ－ＲＯＭ、その他の光学媒体、穴のパターンを有するパンチカード紙テープ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、その他のメモリチップまたはカートリッジ、搬送波データまたは命令、搬送波を運ぶケーブルまたはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／またはデータを読み取ることができるその他の媒体を含む。これらの形式のコンピュータ可読媒体の多くは、実行のために１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスをプロセッサに運ぶことに関与してもよい。

【0257】

コンピュータシステム１９０１は、例えば、入力された配列決定データを処理する段階のグラフィックショイング、出力された配列決定データ、および病理学のさらなる分類（例えば、疾患のタイプまたは癌のタイプおよび癌のレベル）などの、限定されるわけではないが、サンプル分析の結果を提供するためのユーザ・インタフェイス（ＵＩ）１９４０を含む電子表示１９３５を含むか、またはそれと通信中であることができる。ＵＩの例には、グラフィカル・ユーザ・インタフェース（ＧＵＩ）およびＷｅｂベースのユーザ・インタフェースが含まれるが、これらに限定されません。

【0258】

本開示の方法およびシステムは、１つ以上のアルゴリズムの方法によって実装することができる。アルゴリズムは、中央処理ユニット１９０５による実行に際して、ソフトウェアによって実装することができる。アルゴリズムは、ここで述べた方法の任意のステップを実行することができる。

【0259】

実施例１－循環無細胞ゲノムアトラス研究（ＣＣＧＡ）

【0260】

ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＣｅｌｌ－ＦｒｅｅＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓＳｔｕｄｙ（ＣＣＧＡ；ＮＣＴ０２８８９９７８）は、プロスペクティブな多施設観察的ｃｆＤＮＡに基づく早期がん検出研究であり、１４１の施設で１５，２５４人の人口統計学的に均衡のとれた参加者が登録されている。登録した参加者１５，２５４例（癌５６％、非癌４４％）から血液検体を採取した。

【0261】

第１コホート（事前に規定したサブスタディ）（ＣＣＧＡ１）において、血漿ｃｆＤＮＡ抽出を３５８３名のＣＣＧＡおよびＳＴＲＩＶＥ参加者（ＣＣＧＡ：１，５３０、非癌８８４；ＳＴＲＩＶＥ１１６９名の非癌参加者）から得た。ＳＴＲＩＶＥ試験は、スクリーニングマンモグラフィーを受ける女性（参加者９９，２５９例）を登録した多施設プロスペクティブコホート研究である。各参加者から引き出された血液に対して、ペアとなったｃｆＤＮＡと白血球（ＷＢＣ）を標的とした配列決定（５０７遺伝子、６０，０００Ｘ）を単一核酸塩相変性／インデックス（ＡＲＴ配列決定アッセイ）、ペアとなったｃｆＤＮＡとＷＢＣ全ゲノム配列決定（ＷＧＳ、３０Ｘ）をコピーナンバーバリエーションに、また、ｃｆＤＮＡ全ゲノムアンダーゲノムサルファイト配列決定（ＷＧＢＳ、３０Ｘ）をリステイニングに用いた３つの配列決定アッセイを行った。

【0262】

あらかじめ規定された第２のサブスタディ（ＣＣＧＡ－２）では、全ゲノムではなく標的化された重亜硫酸塩基配列決定法を用いて、標的化メチル化配列決定法に基づいて、がん対非がんおよび起源組織の分類子を開発した。ＣＣＧＡ２については、研修参加者３１３３人と検証用サンプル１３５４人（癌患者７７５人；登録時に癌であると判定されていない５７９人、癌であるか非癌であるかの確認前）を用いた。独自のメチル化データベースおよび以前のプロトタイプ全ゲノムおよび標的配列決定アッセイから同定されたように、血漿ｃｆＤＮＡを、メチロームの最も有益な領域を標的とする重亜硫酸塩配列決定アッセイに供し、癌および組織を規定するメチル化シグナルを同定した。訓練用に残された当初の３１３３点のサンプルのうち、１３０８点のサンプルが臨床的に評価可能であり、分析可能であるとみなされた。解析対象は、主要解析対象集団ｎ＝９２７（癌６５４例、非癌２７３例）、副次解析対象集団ｎ＝１０２７（癌６５９例、非癌３７３例）とした。

【0263】

核酸断片のメチル化状態を用いて、バリデーションサンプルの分類を行った。２値分類のために、観察された核酸断片は、癌に由来する相対確率が割り当てられた。同様に、起源組織分類のために、観察された核酸断片は、特定の組織に由来する相対確率が割り当てられた。癌および起源組織に特徴的な核酸断片を標的領域にわたって組み合わせて、癌対非癌を分類し、起源組織を同定した。２値がん分類については、臨床的感度は９９％の特異度で推定された。組織起源については、メチル化データベースがある場合とない場合の２つの独立したモデルを適合させた。報告された組織起源の結果は、９９％の特異度で癌と分類された症例間の予測された組織起源と真の組織起源の一致率を反映している。

【0264】

例２：分類器のトレーニングと性能

【0265】

２０７９サンプルからトレーニングデータセットを作成した。使用したｐａｔｃｈ－ＣＮＮ分類器は５４３枚であった。このように、合計約１００万のテンソルフロー（Ｇｏｏｇｌｅ）トレーニングサンプルについて、サンプルあたり５４３パッチを計算した。このデータセットを用いて、Ｐａｔｃｈ‐ＣＮＮの分類器を訓練した。トレーニングデータセットで使用した２０７９検体は、ＣＣＧＡ１（１５２９検体）、ＣＣＧＡ２（３２８検体）およびＣｏｎｖｅｒｓａｎｔ（２２１検体）を含む複数の研究、ならびに無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）（１３４３検体）、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）（５６１検体）、播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）（８７検体）、および凍結保存（５９検体）を含む複数の生体試料から構成された。

【0266】

パッチ選択は相互情報法を用いて行い、癌種ペアごとに上位５つの高相互情報ゲノム領域を選択した。相互情報は、２つの分類タイプ間の関係を記述し、例えば、１対の癌タイプに対する高相互情報領域は、第１の癌タイプの試料と第２の癌タイプの試料との間で高度に識別可能なＣｐＧ部位を含む。いくつかの実施形態においてパッチ選択のために使用される染色体当たりの領域表示は、図９Ａに例示される。選択した各領域について、隣接するＣｐＧ部位を合併させ、関心のあるＣｐＧを中心にして、その領域を１００部位でパッド化した。次いで、ＣＣＧＡ１からの若い健康なサンプルを用いて、対照群のカバーがない領域を除いて、すべてのＣｐＧ部位がカバーされるように領域を選択した。複数の対比較が可能であったいくつかの例（例えば、複数クラスの分類子について）では、高い相互情報領域が選択され、その結果、すべての可能性のあるがん型対についての高度に識別可能な部位がモデルに表された。

【0267】

トレーニングは、がんの種類および病期により層別化した８倍のクロスバリデーションを用いて実施した（例えば、すべてのサンプルを、がんサンプル、がん以外のサンプル、がんのＩ～ＩＶ期、および／または起源組織のすべてのビンに均等な分布があるように、同じサイズの８ビンにビン化することにより実施した）。交差検証の間、モデルは７つのビンで訓練され、８つ目のビンで評価され、検証は８つのビンの各々が別々に評価されるように８回繰り返された。いくつかの実施形態において層別化のために使用される癌タイプは、例えば、卵巣、子宮、胃、白血病、結腸直腸、前立腺、乳房、肺、他の癌タイプおよび非癌タイプを含む図９Ｂにおいて例示される。

【0268】

癌対非癌（“ＤＥＴＥＣＴ“）および組織起源（“ＴＯＯ“）を検出するための分類器の性能を、ＴＯＯの場合について図９Ｃに示すように癌タイプのパネルについて評価した。詳細については、Ｏｘｎａｒｄｅｔａｌ．，“Ｍｕｌｔｉ－ｃａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＴｉｓｓｕｅｏｆＯｒｉｇｉｎ（ＴＯＯ）ＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎＵｓｉｎｇＴａｒｇｅｔｅｄＢｉｓｕｌｆｉｔｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆＰｌａｓｍａＣｅｌｌ－ｆｒｅｅＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ），“ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ（ＡＳＣＯ）Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ，２０１９，Ｏｃｔｏｂｅｒ１１－１３，Ｂａｎｇｋｏ真の陽性は三角で表され、真の陰性は丸で表され、偽陽性と判定不能のサンプルはそれぞれダイアモンドと四角で表される。検体には癌または非癌のラベルを貼り、癌検体にはさらに癌種のラベルを貼った。全サンプルが９９％の特異性で検出された。図９Ｃは、診断未確定の血液がんの存在による可能性が高いがんサンプル中の偽陽性（ダイアモンド）の存在を示している。この結果は、モデルの更なる最適化を用いて、偽陽性の検出を回避し、ひいてはバックグラウンドを減少させることができることを示唆している。このような最適化により、高いバックグラウンドによって不明瞭にされていないさらなる真の陽性癌サンプルを同定することができるより大きな感度を有するモデルが可能になる。

【0269】

Ｐａｔｃｈ－ＣＮＮ分類器の性能は、図１０Ａに示すように、がんの病期ごとに分類したがんサンプルのパネルについて評価した。全癌試料の検出を９９％の特異度で行った。１つの例では、全がん検体に対する検出感度（がん対非がん）は４２．１％、全がん検体に対する組織起源分類の感度は８９．７％、早期がん検体の検出は後期がん検体と比較して比較的低かった（Ｉ期：１０．１％、ＩＩ期：２９％、ＩＩＩ期：５８．３％、ＩＶ期：７９．８％）が、各がん病期別では起源組織予測の精度は高かった（感度約９０％）。図１０Ｂは、Ｐａｔｃｈ－ＣＮＮ分類器の性能を２値設定（例えば、サンプルが原発組織または病期のような３つ以上の標識に分類されていない場合）で示している。この例では、サンプルを癌または非癌に分類した。２値設定において、Ｐａｔｃｈ－ＣＮＮ分類器は非癌検体を割り当て、平均確率が１０％未満で、癌検体を割り当てたところ、平均確率が約８０％であったことから、２値分類器の性能が高いことが示された。Ｐａｔｃｈ－ＣＮＮ分類子について９８％、９９％、９９．５％の特異度でパラメータを調整すると、感度はそれぞれ８８％、感度は７４．３６％、感度は４４．２３％となる。

【0270】

実施例３：Ｉｓｏｍａｐクラスタリングによる性能試験

【0271】

図１１を参照して、次元縮小技術を用いて、本開示のパッチ－ＣＮＮ分類器のトレーニング後に生成される包埋値（活性化）の性能を評価した。ここで、活性化は、試料に対する分類を予測する包埋値の能力を意味する。分類には、０～２０のラベルで示された一連のがん検体を用いた。各サンプルについて、訓練された特徴抽出器を用いて各パッチごとに特徴を抽出した。各パッチについて、包埋値の規範を計算し、与えられたサンプル内の各パッチの規範を連結してサンプル特徴を与えた。次に、各試料の連結規準を多元空間上に投影してプロットした。具体的には、非線形次元減少法Ｉｓｏｍａｐを用いて、Ｎ次元空間内に異なる癌標識をクラスタ化した。図１１に示す２次元座標空間のｘ軸およびｙ軸は、クラスタリング後のサンプル間の相対的距離を示す。投影図から、異なる癌標識がＩｓｏｍａｐの異なる領域にクラスターを形成することが明らかになり、包埋値が異なる標識を有する試料間を識別できることが示された。これらの結果は、包埋値または包埋値の規範のどちらかが性能に関する情報を提供するために使用できることも示唆する。

【0272】

実施例４：最大活性化のパッチ周波数による性能試験

【0273】

図１２を参照して、５４４のパッチから成る本開示のパッチ－ＣＮＮモデルを用いて、一組の試料を評価した。ここで、５４４のパッチの各々は、ヒトゲノムの異なる部分を表した。５４４パッチの各々について、活性化の頻度を、試料のセットにわたって測定した。したがって、たとえば、５４４枚のパッチのうち１０枚のパッチが、サンプルのセットの中でサンプル２と１０に対して活性化したとすると、図１２のパッチ１０（図１２のＸ＝１０）のｙ値は２になるだろう。具体的には、サンプルについての分類を予測するために最も高いシグナルを被る５４４のパッチのセットにおけるパッチは、最大活性化されたパッチであると考えられた（例えば、埋め込み値が最も識別可能である）。５４４枚セットの各パッチについて、他のすべてのパッチと比較して、それぞれのパッチが最大に活性化された回数を求めることにより、活性化の頻度を算出した。図１２は、成績の大部分が５４４枚のうち約２０枚に由来し、特に２枚のパッチが非常に指標になることを示している。したがって、５４４パッチのセットの中には、他のパッチよりも頻繁に活性化するパッチもあり、そのようなパッチは分類器の性能を駆動する可能性が高い。例えば、あるパッチは、異なる分類タイプ（例えば、癌および／または非癌）に特化することができる。さらに、非常に指標となるパッチＩＤは、高度に差別的であるＣｐＧ部位を含む可能性が高く、パッチ選択を評価し、最適化する方法を提供する（例えば、パッチのセットを最小限にするため、計算効率を改善し、かつ／またはコストを低減するため）。具体的には、図１２に例示されているような性能指標は、新しい領域選択アルゴリズムをブートストラップする際に、訓練された特徴抽出器モデルを案内することができる。

【0274】

実施例５：ｔ－ＳＮＥクラスタリングによる性能試験

【0275】

図１３および１４を参照して、ｔ－ＳＮＥクラスタリングを、上位６つ（図１３）または上位３つ（図１４）の最大活性化パッチの包埋値を用いて、一組のサンプルに対して実施した。実施例４で上述したように、最大活性化されたパッチは、活性化の頻度が最も高いものである（例えば、他のすべてのパッチにわたって、所定のサンプルに対する分類を予測する、所定のパッチの能力）。次に、Ｔ‐ＳＮＥクラスタリングは次元縮小を行い、データを２次元空間上に投影する。２０個のサンプルのセットは、サンプルラベルが０～２０で示されている右側の説明文によって示されており、グラフ上の各離散点はサンプルの断片に対応している。図１３では、点の各クラスターは上位６つの最大活性化パッチの１つに相当する。図１３の右側のクラスターは主に癌サンプルから成り、それぞれのクラスターに代表されるパッチがいくつかの異なる癌タイプを識別できることを示している。この結果は、分類中にパッチの重みが等しくない（たとえば、いくつかのパッチが他のパッチよりも分類を駆動する）という図１２からの観察と平行している。図１４では、上位３つの最大活性化されたパッチのｔ－ＳＮＥクラスター化は不連続なクラスターをもたらさないが、グラフの右手側に沿ってがんの種類が目に見えるほど集中している。

【0276】

実施例６：がんの病期ごとの性能試験。

【0277】

図１５を参照して、本開示のパッチ－ＣＮＮアーキテクチャを用いた分類性能を、癌試料のステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶについて比較した。ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＣｅｌｌ－ｆｒｅｅＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓＳｔｕｄｙ（ＣＣＧＡ２）のサブセットからデータを入手し、９８％の特異性で濾過した。データセットの結果としての感度は、モデルに対して４５％であった。分類スコアはｙ軸に沿って示しており、０は非癌、１は癌を示す。それぞれの離散点は標本（例えば、個々の被験者）を表す。グラフの右側の参考資料として、情報が得られない検体が含まれている。図１５は、分類性能が進行性の癌ステージで改善することを示しており、ステージＩの癌試料は、対象が癌である平均確率が０．４未満であることが割り当てられ、一方、ステージＩＶの癌試料は対象が癌である平均確率が１であることが割り当てられている。

【0278】

実施例７：起源組織別性能試験

【0279】

図１６、１７Ａおよび１７Ｂを参照して、本開示のパッチ－ＣＮＮアーキテクチャを用いた分類性能を、様々な組織起源に由来する試料について評価した。データはＣＣＧＡ２から得た。図１６では、分類スコアをｙ軸に沿って示している。ここで、０は非癌、１は癌を示す。それぞれの離散点は標本（例えば、個々の被験者）を表す。興味深いことに、個々の癌タイプに対する分類結果はＣＣＧＡ１とＣＣＧＡ２データセットの間で一致していた。肛門直腸、膀胱および尿路上皮、結腸直腸、頭頸部、肝胆道、肺、リンパ系新生物、多発性骨髄腫、卵巣、膵臓、上部消化管など、他の癌種と比較して、１１種類の高信号癌種が容易に検出可能（例えば、０．６を超える確率）であると同定された。

【0280】

図１７Ａおよび１７Ｂは、不確定分析なしで予測のための８０パーセント以上の正確さが達成され（図１７Ａ）、不確定分析で予測のための約９０パーセントの正確さが達成された（図１７Ｂ）、起源の組織のために「ひとつひとつ」方法を用いて行われた混同マトリックス分析の結果を示している。

【0281】

具体的には、図１７Ａでは、リンパ系新生物癌サンプルを正確に８４％の精度で分類し（８４／９９）、肺癌サンプルを正確に８６％の精度で分類した（１５５／１８１）。他の高シグナルがんの種類は、乳がん（８９％で７０例中６２例）、大腸がん（９１％で９０例中８２例）、頭頸部がん（８５％で５３例中４５例）、肝胆道がん（７２％で２９例中２１例）、多発性骨髄腫（８８％で２５例中２２例）、卵巣がん（８１％で２７例中２２例）、膵臓がん（７６％で６６例中５０例）、上部消化管がん（７８％で５１例中４０例）など、様々な精度で予測された。

【0282】

図１７Ｂでは、不確定な試料の除去は、さらに起源の組織分類を増強した。リンパ系新生物癌試料は正確度９６％（７６／７９）で正しく分類され、肺癌試料は正確度９８．４％（１２６／１４０）で正しく分類された。他の高シグナルがんの種類は、乳がん（９５％で４３例中４１例）、大腸がん（９７％で７６例中７４例）、頭頸部がん（９０％で３９例中３５例）、肝胆道がん（７７％で２６例中２０例）、多発性骨髄腫（９５％で２２例中２１例）、卵巣がん（８６％で２２例中１９例）、膵臓がん（８８％で４８例中４２例）、上部消化管がん（９０％で３９例中３５例）など、様々な精度で予測された。

【0283】

実施例８：ハイパーパラメータを符号化する。

【0284】

開示されたパッチＣＮＮ分類子の超パラメータを符号化し、定義した。このようなハイパーパラメータの使用により、本開示のパッチＣＮＮ分類子は、特に、異なるタイプの実験デザイン、応用、配列決定方法、厳密性、正確性、および／または計算属性に適応および／または最適化するために迅速に調整および調整されることが可能となった。調整可能な超パラメータの例には、パッチの数（例えば、１０枚から１０００枚の間）、パッチごとに評価されるＣｐＧ部位の数（例えば、１０個から１０００個のＣｐＧ部位の間、または６４個から５１２個のＣｐＧ部位の間などの画像幅、１２８個のＣｐＧ部位または２５６個のＣｐＧ部位などの画像幅）、パッチごとの断片の深さ（例えば、２個から１０００個の断片の間などの画像高さ、または３２個、５０個、６４個、または１２８個の断片などの画像高さ）、パッチ内の断片パッキングの密度が含まれ、とりわけパッチ内の核酸断片の位置決めにはパッチ内での核酸断片のパッキングアルゴリズムが。追加の例ハイパーパラメーターには、ｐ値（ｐ＝０．０５またはｐ＝０．００１のようなｐ値超パラメーターによって設定されたｐ値閾値を満たさないコホートにおいて対応する核酸断片に対して評価された場合に、それぞれの核酸断片を対応するメチル化パターンを有する各核酸断片を複数の核酸断片から除去することによって、入力された複数の核酸断片を剪定するために使用される値）、使用される交差検証のタイプ（例えば、ＰおよびＱが正の整数であり、ここで記述されるように同一または異なる、ＰｘＱ倍交差検証）、Ｌ２正規化脱落率（例えば、０．２５００００）、Ｌ２正規化初期学習率（例えば、０．０００２００）、およびＬ２正規化因子（例えば、０．０１００００）が含まれるが、これらに限定されない。このような規則化のためのロス関数を、数サイクルにわたって実施し、各過剰パラメータセットに対する分類器の性能を、感度、特異性、および正確性のための計量値を用いて評価した。

【0285】

実施例９：品質管理のための管理データ構造を作成し、バリデーションを行う。

【0286】

上記のように、図３および４は、メチル化配列決定データからの癌状態の分類に使用されるワークフローを例示する。品質管理および／または品質モニタリングを、最初の前処理後およびメチル化コールおよびｐ値ベースの剪定の前に、データに対して実施した。対照群を用いて、被験試料（例えば、癌）を、正常または健康な試料データを含むデータ構造と比較した。ここでは、健常対照群のためのデータ構造を生成するためのワークフローの例を述べる。健康な対照群データ構造を作成するために、分析システム（または本明細書の別の箇所に記載される処理システム）は、複数の被験体から複数の核酸断片（例えば、ｃｆＤＮＡ）を受け取った。各核酸断片についてメチル化状態ベクターを同定することにより、対照群についてメチル化状態ベクターのセットを作成した。

【0287】

各核酸断片のメチル化状態ベクターを用いて、分析システムはメチル化状態ベクターをメチル化部位（例えば、ＣｐＧ部位）のストリングに細分した。解析システムはメチル化状態ベクターを細分化し、得られたストリングがすべて所定の長さより小さいようにした。例えば、長さが３以下のストリングに細分化された長さ１１のメチル化状態ベクターは、長さ３の９のストリング、長さ２の１０のストリング、および長さ１の１１のストリングをもたらした。別の例では、長さ７を４以下の長さの文字列に細分化した場合、長さ４の４つの文字列、長さ３の５つの文字列、長さ２の６つの文字列、長さ１の７つの文字列になりました。メチル化状態ベクターが、指定されたストリング長よりも短いか、または同じ長さであれば、メチル化状態ベクターは、ベクターのＣｐＧ部位のすべてを含む単一のストリングに変換された。

【0288】

解析システムは、可能性のあるＣｐＧ部位とベクター中のメチル化状態の可能性について、ひも中の最初のＣｐＧ部位として特定のＣｐＧ部位を持ち、メチル化状態の可能性を持つ対照群に存在するひもの数を数えてひもを集めた。例えば、与えられたＣｐＧ部位において、３のストリング長を考慮すると、２つの３または８のストリング構成が考えられた。そのＣｐＧ部位では、８つの可能なストリング配置のそれぞれについて、分析システムは、対照群において、各々のメチル化状態ベクター可能性の何回の発生が起きたかを集計した。この例題を続けると、これはレファレンスゲノム中のそれぞれの開始ＣｐＧｓｉｔｅｘに対する＜Ｍｘ，Ｍｘ＋ｌ，Ｍｘ＋２＞，＜Ｍｘ，Ｍｘ＋ｌ，Ｕｘ＋２＞，．．．，＜Ｕｘ，Ｕｘ＋ｌ，Ｕｘ＋２＞の数量を集計することを伴いました。分析システムは、開始ＣｐＧサイトとストリングの可能性ごとに集計されたカウントを格納するデータ構造を作成した。

【0289】

文字列の長さに上限を設定することには、いくつかの利点がある。まず、文字列の最大長によっては、分析システムによって作成されるデータ構造のサイズが大幅に増加する可能性がある。例えば、最大文字列長４は、すべてのＣｐＧ部位が長さ４の文字列を集計するために少なくとも２つの４番号を持つことを意味する。最大文字列長を５に増やすと、すべてのＣｐＧサイトに２４または１６個の追加の数字が追加され、前の文字列長と比較してタリー（およびコンピュータメモリ）する数字が２倍になる。ストリングサイズを小さくすることは、コンピュータおよび保存の観点から、データ構造の作成および性能（以下に述べるように後でアクセスするための使用など）を合理的に保つのに役立つ。第二に、最大ひも長を制限する統計的考察は、ひも数を用いる下流モデルの過剰適合を避けることである。ＣｐＧ部位の長いひもが生物学的には、結果に強い影響（例えば、がんの存在を予測する異常性の予測）を及ぼさない場合、ＣｐＧ部位の大きなひもに基づいて確率を計算することは、入手できないかもしれないかなりの量のデータを使用するため問題となる可能性があり、したがって、モデルを適切に実施するにはまばらすぎる可能性がある。例えば、以前の１００のＣｐＧ部位に条件付けられた異常性／癌の確率を計算することは、理想的には、いくつかが以前の１００のメチル化状態と正確に一致する、長さ１００のデータ構造におけるひものカウントを利用することができる。長さ１００のストリングのまばらな計数が利用可能であれば、試験試料中の長さ１００の与えられたストリングが異常であるか否かを決定するにはデータが不十分であり得る。

【0290】

データ構造が作成されると、解析システムはデータ構造および／またはデータ構造を利用するあらゆる下流モデルの妥当性確認を試みた。１種類のバリデーションでは、対照群のデータ構造内の一貫性を確認した。例えば、コントロール群内に何らかの外れ値の対象、サンプル、および／または断片がある場合、分析システムはそれらのカテゴリーの一つから任意の断片を除外するかどうかを決定するために様々な計算を行った。代表的な例では、健康な対照群は、診断されていないが、サンプルが異常にメチル化された断片を含むように癌性であるサンプルを含んでいた。この最初のタイプのバリデーションでは、対照群の純度に影響を与えないように、健康な対照群から潜在的な癌性サンプルを除去することを保証した。

【0291】

第２のタイプの検証では、データ構造そのもの（すなわち、健常対照群由来）からのカウントでｐ値を計算するために用いた確率モデルをチェックした。分析システムがバリデーショングループにおいてメチル化状態ベクトルのｐ値を生成したら、分析システムはｐ値による累積密度関数（ＣＤＦ）を構築した。ＣＤＦとともに、分析システムは、対照群のデータ構造を検証するために、ＣＤＦについて様々な計算を行った。１つの試験では、ＣＤＦが理想的には同一性関数かそれ以下であり、ＣＤＦ（ｘ）≦ｘであるという事実を用いた。逆に、アイデンティティ関数の上にあることから、対照群のデータ構造に用いた確率モデル内に何らかの欠陥があることが明らかになった。例えば、断片の１／１００がＣＤＦ（ｌ／１０００）＝１／１００＞１／１０００を意味するｐ値スコアが１／１０００であった場合、２番目のタイプの検証では確率モデルによる問題を示すことができなかった。

【0292】

第３のタイプのバリデーションでは、データ構造の構築に用いたものとは別の健全な一連のバリデーションサンプルを用い、データ構造が適切に構築され、モデルが作動したかどうかを検証した。第３のタイプの検証では、健常対照群が健常検体の分布をどの程度一般化したかを定量化した。第３のタイプの検証が失敗した場合、健康な対照群は健康な分布に十分に一般化しなかった。第４のタイプのバリデーションで、非健康的なバリデーショングループのサンプルを用いて試験した。

【0293】

分析システムはｐ値を計算し、健常でない検証群のＣＤＦを構築した。非健康な検証群では、分析システムは少なくともいくつかのサンプルについてＣＤＦ（ｘ）＞ｘを見たか、異なって述べたが、これは第２のタイプの検証および第３のタイプの検証で予想されたものの逆であり、健康な対照群および健康な検証群とは異なっていた。第４のタイプの検証が失敗した場合、このことは、モデルが特定するために設計された異常性を適切に特定していなかったことを示していた。

【0294】

制御グループデータ構造の一貫性を検証するために、追加のワークフローが実行されました。分析システムでは、被験者、サンプル、および／またはフラグメントの組成が対照群とほぼ同じと推測されるバリデーショングループを利用した。例えば、分析系が対照群にがんのない健常者を選択した場合、分析系も検証群にがんのない健常者を使用した。

【0295】

バリデーションのワークフローは、対照群について記載されているように、バリデーショングループのためのメチル化状態ベクターのセットを生成することを含んでいた。各メチル化状態ベクターについて、その位置にある可能性のあるすべてのメチル化状態ベクターを列挙し、対照群データ構造から可能性のあるすべてのメチル化状態ベクターの確率を計算した。次に、算出された確率に基づいて各メチル化状態ベクトルについてｐ値スコアを算出し、検証群からのすべてのｐ値の累積密度関数（ＣＤＦ）を作成した。ｐ値スコアは、特定のメチル化状態ベクターおよび他の可能性のあるメチル化状態ベクターが、対照群においてさらに低い確率を有することを見出す期待値を表した。したがって、低ｐ値スコアは、対照群内の他のメチル化状態ベクターと比較して比較的予想外のメチル化状態ベクターに相当し、高ｐ値スコアは、対照群で見出された他のメチル化状態ベクターと比較して比較的期待されるメチル化状態ベクターに相当した。ＣＤＦを用いて、対照群のデータ構造内のｐ値の一貫性を検証した。

【0296】

実施例１０：転移疾患状態を決定する。

【0297】

表３は、転移に苦しむ癌患者由来の血漿試料中のｃｆＤＮＡ断片を用いて、転移疾患状態を決定するいくつかの例を示す。転移過程の決定は、癌および起源組織（ＴＯＯ）の存在を検出するために用いたのと同じ分類器を用いて行った。

【0298】

例えば、ＴＯＯ参照データセットには、膵臓癌で既知の肝臓への転移がある被験者１８例から採取した血漿サンプルが含まれていた。これら１８人の被験者のうち、９人の被験者の血漿試料で肝臓からのシグナルが見られた。しかし、残りの膵癌被験者の血漿サンプルでも肝臓からのシグナルが見られたが、そのシグナルはあまり一般的ではなかった。同様に、別の例として、ＴＯＯ参照データセットは、乳癌を有し、肺、脳、骨、および肝臓への既知の転移を有する４人の被験者からの血漿サンプルを含んだ。脳および骨への転移を有する試料は、訓練された分類器のための脳組織を表したクラスがなくても、乳房以外の起源組織について強い交差スコア（例えば、癌の正規化確率）を有した。また、骨転移のある標本のクロススコアには、骨髄中の一部の細胞と同様のメチル化シグナルを有する多発性骨髄腫および肉腫のスコアが含まれていた。

【0299】

別の例では、ＴＯＯ参照データセットには、肺癌があり、骨、脳、心膜、肝への既知の転移がある被験者１３例の血漿サンプルが含まれていた。骨および脳への転移が認められたサンプルは、肺以外の組織に対して強い交差スコア（例えば、がんの正規化確率）を示した。別の例では、ＴＯＯ参照データセットには、結腸直腸癌および既知の肝転移を有する被験者１０例から採取した血漿サンプルが含まれていた。結腸直腸癌および肝臓への転移を有する被験体由来の試料において、肝細胞からの明白に可視的なメチル化シグナルはなかった。

【0300】

[表３］原発癌の異なる被験者に対するＴＯＯ結果（癌の正規化確率など）。

【0301】

結論

【0302】

複数のインスタンスは、単一インスタンスとして本明細書に記述される構成要素、操作または構造に対して提供されることがある。様々な構成要素、操作、およびデータ保存の間の境界はいくぶん任意であり、特定の操作は特定の図解構成との関連で図示される。機能性の他の割当が想定され、実装の範囲内に入る可能性がある。一般に、例の構成において別々の構成要素として提示される構造および機能性は、複合構造または構成要素として実装され得る。同様に、単一の構成要素として提示される構造及び機能性は、別個の構成要素として実装され得る。これら及びその他の変更、修正、追加、改善は、実施の範囲内に収まる。

【0303】

また、第一、第二等の用語ではあるが、理解されるであろう。ここでは、種々の要素を記述するために使用することができるが、これらの要素はこれらの用語によって制限されるべきではない。これらの用語は、ある要素と他の要素を区別するためにのみ使用される。例えば、第１の被験体を第２の被験体と呼ぶことができ、同様に、第２の被験体を、本開示の範囲から逸脱することなく、第１の被験体と呼ぶことができる。１番目の被験者と２番目の被験者は両方の被験者であるが、同一の被験者ではない。

【0304】

本開示で使用される用語は、特定の実施形態のみを記述する目的であり、本発明の限定を意図するものではない。本発明の記載及び添付のクレームにおいて使用されるように、単独の形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別であることを明確に示しない限り、同様に複数の形態を含むことを意図している。本明細書中で使用される「および／または」という用語は、関連する列挙された項目の１つ以上の任意の可能な組合せおよび全ての可能な組合せを意味し、包含することも理解されるであろう。用語が「含む」および／または「含む」ことは、この仕様で使用される場合、記載された特徴、整数、ステップ、操作、要素、および／または構成要素の存在を明記するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を妨げないことはさらに理解されるであろう。

【0305】

本明細書中で使用される場合、用語「もしあれば」は、状況に応じて、「いつ」または「時」または「決定することに応答して」または「検出することに応答して」を意味するように解釈され得る。同様に、「決定された場合」または「［規定された状態または事象］が検出された場合」の表現は、状況に応じて、「決定した場合」または「検出した場合（規定された状態または事象）に（規定された状態または事象を検出した場合）」または「決定した場合」（規定された状態または事象）に（または「検出した場合（

【0306】

上記の説明には、例示的な実装を例示する、例示的なシステム、方法、技術、指示シーケンス、およびコンピュータ機械プログラム製品が含まれた。説明のために、本発明の主題の様々な実施の理解を提供するために、多くの具体的な詳細が示された。しかしながら、発明の主題の実施がこれらの具体的な詳細なしに実施され得ることは、当業者には明白であろう。一般に、周知の指示例、プロトコル、構造および技術は詳細に示されていない。

【0307】

上記の説明は、説明の目的のために、特定の実装を参照して記述されている。しかしながら、上記の例示的な議論は、網羅的であること、または開示された正確な形態に実装を限定することを意図するものではない。上記の教示を考慮すると、多くの修正および変更が可能である。実装は、原理及びその実用的な適用を最もよく説明するために選択され、記述され、それにより、当業者が意図する特定の使用に適合するように種々の改変を伴う実装及び種々の実装を最良に利用することを可能にした。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図6-6】

【図6-7】

【図6-8】

【図6-9】

【図6-10】

【図6-12】

【図6-13】

【図6-14】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【誤訳訂正書】

【提出日】2022-10-24

【誤訳訂正1】

【訂正対象書類名】明細書

【訂正対象項目名】全文

【訂正方法】変更

【訂正の内容】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願）
本願は、「パッチ畳み込みニューラルネットワークを用いる癌分類」と題されており、２０１９年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９４８，１２９号の優先権を主張するのであり、参照により該出願は取り込まれる。

【0002】

対象からの遺伝子型情報を用いて癌等の疾患状態について対象を分類するパッチ畳み込みニューラルネットワークを開示する。

【背景技術】

【0003】

癌の早期発見は、癌の予後を改善するための最も人道的な手法の１つである。既存の治療（固形腫瘍については手術と化学療法と放射線療法との組合せ又は液性腫瘍については化学療法と骨髄移植との組合せ）は、不十分な生存率を含む種々の欠点を有している。多くの場合、治療は患者を苦痛状態にさらし、不十分な生存期間しか与えない。新たな免疫療法にも欠点はある。患者はＩＣＵで治療されることを要し、また、致死的な副作用が多くの場合あり得る。これらの治療のいずれもが、癌の早期発見によって有効性が増す。

【0004】

もっとも、現行のスクリーニング検査は不十分である。マンモグラフィーや結腸内視鏡検査法や子宮頸部細胞診やＰＳＡ検査等のモニタリング方法は何十年も用いられているが、いずれもが等しく宜しいわけではない。一部の病変部はとても遅く進行するのであり、患者はそれ以外によって死亡することのほうが起こりやすいこととなる一方で、一部の危険な腫瘍に関しては治癒するには手遅れとなるまでは検知不可能となることもある。また、他の種別もあるも、肺癌に関しては満足できるスクリーニング検査が用意されていない。

【0005】

本開示は上述の１つ以上の問題点を克服することに向けられている。本開示での背景技術の記載は、本開示の文脈を概して提示する目的のものである。別段の定めなき限り、このセクションにて説明されている事柄は、本願の特許請求の範囲に対しては先行技術となるのではなく、また、このセクションに含まれることによって先行技術として認容されるわけではなく或いは先行技術の示唆として認容されるわけでもない。

【発明の概要】

【0006】

本開示は上述にて技術分野における特定された課題に取り組むのであり、対象者における癌の早期発見のためのツールを提供することによってこれをなす。上述のように、癌の早期発見は重要である。なぜならば、これによって早期治療が可能となり、よって生存率が向上し得るからである。この目的に関しては、本開示は、ｃｆＤＮＡ断片のＣｐＧサイトのメチル化状態を分析するためのシステム及び方法を提供する。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片のシーケンシング及び断片中のシトシン及びグアニンの様々なジヌクレオチドのメチル化状態の分析によって、対象者が癌を有しているか否かについて識見がもたらされ得る。

【0007】

本開示は既存の分類手法に比して改善された特異度及び感度を提供し得るのであって、メチル化断片データに深層学習分類手法を適用することによってこれをなし得るのであり、特に視覚分類手法を挙げ得る。例えば、癌／非癌（Ｃ／ＮＣ、cancer/non-cancer）分類及びメチル化断片原発組織（ＴＯＯ、tissue-of-origin）分類を、視覚課題に類似する深層学習課題として再構築することによって、粒度の細かいメチル化シーケンス特徴や高次クロス領域特徴等のデータ中の非線形性に関する主要な情報がもたらされ得る。

【0008】

開示のシステム及び方法は、カスタム訓練されたパッチ畳み込みニューラルネットワーク（パッチＣＮＮ）を、データファイルからの断片データについて、癌／非癌（Ｃ／ＮＣ）分類及び原発組織（ＴＯＯ）分類に関して適用できる。細かい粒度の断片シーケンスデータと共に局所的領域情報についての可視性をもたらすために、データは２次元的な「イメージ」としてエンコード及び表されることができ、ＣｐＧサイトを第１の軸に沿わせて、堆積させた断片リード（read）の深度を直交する軸に沿わせて、補足データは追加チャンネルとしてエンコードされる。ＣＮＮアーキテクチャはビジョン及び画像処理の分野にて用いられることができるのであり、広範なデータに関して共通するパターン及び特徴を学習することができる。開示のシステム及び方法では、近隣ＣｐＧサイトの位置的コンテキストは、画素と似た態様でエンコード及び表現することができ、モデル学習の入力として用いられるのであって、異常なシーケンス及び断片を認識するために用いられる。似たようにして、ＣｐＧサイトの幅方向及びリードの深度方向の観点でより大きな領域ビューをもたらすことによって、共局在化した異常断片にわたっての高次特徴を学習することができる能力をネットワークにもたらし得る。

【0009】

主たる関心事の１つとしては入力特徴のサイズが含まれ得る。この点、次元縮小的な戦略を用いて、ネットワーク訓練を実現可能とし得る。深層学習の応用時において生じるありふれた問題の１つとしては、問題を計算量的に取り扱い可能としつつ基礎となるデータの情報量を（例えば、断片レベル並びに領域間レベルの両方で）可能な限り保全することの困難性が挙げられる。例えば、ゲノム又は標的メチル化パネル中の全ＣｐＧサイトを含む予測モデルは、それぞれ約２８Ｍ乃至は１Ｍ程のＣｐＧサイトを有し得る。約３０から１５００のリード深度を用いると、ネットワーク入力は１０億を超えるパラメータを伴うものに直ぐなってしまう。ネットワーク規模、深度、計算上の複雑度、メモリ制約、及び入力パラメータと比較した際の訓練例の個数の不均衡は、単純に解決困難なものとなり得るのであり、特に、伝統的な深層学習データベース及び最大で２８×２８のイメージ又は３万から５万の入力に関して作用する大型画像分類器に関してなおさらである。データに対してプレフィルタリングを行ったりアグレゲーションを行ったりビン入れを行ってより粗い解像度に落とすといった次元縮小方法もあるが、分類のために利用可能な情報を減らしてしまうことがある。

【0010】

次元縮小の１つの選択肢としては、入力空間をより解決容易な局所化した領域に細分化してマージ前に独立に学習可能とすることが挙げられる。該手法は、結果のマージ前に領域を独立的に探索しようとする局所化且つ共有化されたサーチを遂行することと等価たり得る。したがって、本開示にて説明されるように、ゲノム又はＣｐＧサイトのパネルは、パッチＣＮＮにて用いるための処理可能な領域に区分された大型イメージとして表現でき、疾患予測をより解決容易な問題に変換することができる。本開示は、さらに、断片データを行列等のデータ構造に落とし込む乃至はそれを組み上げるためのシステム及び方法を提供するのであり、これは安定的且つ再現可能な分類のためになされる。

【0011】

したがって、本開示は、断片、領域、及び試料レベルでの分類に関して性能向上をもたらすシステム及び方法を提供できるのであり、これは深層ニューラルネット（例えば、パッチＣＮＮ）をメチル化シーケンシングデータに対して用いるものとされる。さらに、本開示は、異常メチル化状態以外の粒度で特徴を評価することに関しての向上をもたらすシステム及び方法を提供できるのであり、細やかな粒度でのメチル化シーケンス特徴及び粗い粒度でのクロス領域パターンが含まれる。このような応用例は、（例えば、癌／非癌（Ｃ／ＮＣ、Cancer/Non-Cancer）及び原発組織（ＴＯＯ、Tissue-of-Origin））予測の性能の感度及び特異度を向上させ得るのであり、それと共に、従来的分析ワークフローとの比較で最も大きい情報ゲインをもたらすＣｐＧ関心領域を識別する。

【0012】

したがって、本開示は、種に属する検査対象の疾患状態（disease condition）を決定する方法を提供し得る。本開示のそのような態様の１つでは、方法は、少なくとも１つのプロセッサと前記少なくとも１つのプロセッサによって実行される少なくとも１つのプログラムを格納するメモリとを備えたコンピュータシステムにてなされる。前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令を含み得る：電子的態様にてデータセットを取得するステップであって、該データセットは複数の断片中のそれぞれの各々の断片の対応するメチル化パターンを備える、ステップ。それぞれの各々の断片の前記対応するメチル化パターンは、前記検査対象から取得された生物試料中の前記各々の断片を備える１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングによって決定され得るのであり、また、前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含む。

【0013】

この態様では、前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令をさらに含む：第１のチャンネルを含む第１のパッチを構築するステップ。前記第１のパッチは前記種の参照ゲノム中の、ＣｐＧサイトの第１の独立セットを表し得るのであり、また、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中のそれぞれの各ＣｐＧサイトは前記参照ゲノム中の所定の位置に対応する。前記第１のパッチの前記第１のチャンネルは第１の複数のパラメータについての複数のインスタンスを含み得る。前記第１の複数パラメータの各インスタンスは前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含み得る。第１のパッチの構築は、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれの各々の断片について、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入することを含み得る。

【0014】

この態様では、前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令をさらに含み得る：少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用してそれによって前記検査対象にての癌状態を決定するステップ。

【0015】

一部の実施形態では、前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令をさらに含む：前記データセットの取得後且つ前記第１のパッチの構築前に、前記複数の断片に対してプルーニングを行うステップ。前記複数の断片からそれぞれの各々の断片であって前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイトにわたっての対応するメチル化パターンがｐ値閾値を充足しないｐ値を有する断片を除去することによって前記複数の断片に対してプルーニングを行い得る。前記各々の断片の前記ｐ値の決定は、前記各々の断片の前記対応するメチル化パターンを、前記各々の断片の前記対応する複数のＣｐＧサイトを有する対応する複数の参照断片中の前記対応する複数のＣｐＧサイトのメチル化パターンの対応する分布と比較することによってなされ得る。前記対応する複数の参照断片中の各参照断片の前記メチル化パターンは、１つ以上の共通特徴を有する対象のコホート（例えば、健常な対象のコホート、喫煙する健常な対象のコホート、喫煙しない対象のコホート、男性の対象のコホート、女性の対象のコホート、閾値となる年齢を超える対象のコホート、指定された年齢レンジ内の対象のコホート、遺伝子変異の特定のセットを有する対象のコホート、特定の人種の対象のコホート等。）から取得された生物試料からの核酸についてのメチル化シーケンシングによって取得され得る。

【0016】

一部の実施形態では、前記第１のパッチは、前記第１のチャンネル及び第２のチャンネルを含む複数のチャンネルを含む。前記第２のチャンネルは、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスについての第２の複数のパラメータについての対応するインスタンスを含み得る。前記第２の複数のパラメータの各インスタンスは、前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのＣｐＧメチル化状態以外の第１の特徴についてのパラメータを含み得る。前記第１のパッチを構築するステップは、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれの各々の断片について、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンス並びに前記第２の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入することを含み得る。

【0017】

一部の実施形態では、各々の断片の前記メチル化パターンは、前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各ＣｐＧサイトを含まない。前記複数の断片中の各々の断片についての第１のパッチを構築するステップは、前記各々の断片内に存するＣｐＧサイトに対応する第１の複数のパラメータの前記インスタンス中のパラメータに投入することを含み得る。

【0018】

一部の実施形態では、前記複数の断片中の各々の断片についての第１のパッチを構築するステップは、前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、前記各々の断片中の前記ＣｐＧサイトに対応する、前記複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別することを含む。前記第１のパッチを構築するステップは、前記識別されたパラメータのうちの前記各々の断片の対応するＣｐＧサイトに整列する各パラメータについて、前記各々の断片の前記対応するＣｐＧサイトの前記メチル化状態を割り当てることをさらに含み得る。

【0019】

一部の実施形態では、前記複数の断片中の各々の断片について、第１のパッチを構築するステップは、前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、前記各々の断片中の前記ＣｐＧサイトに対応する、前記複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別することを含む。前記第１のパッチを構築するステップは、前記識別されたパラメータのうちの前記各々の断片の各々のＣｐＧサイトに整列する各パラメータについて、前記各々の断片の前記各々のＣｐＧサイトの前記メチル化状態を割り当てることをさらに含み得る。前記第１のパッチを構築するステップは、前記第１の複数のパラメータの前記インスタンスに対応する前記第２のチャンネルの前記第２の複数のパラメータの前記インスタンスの前記第２の複数のパラメータ中の、前記各々の断片の各々のＣｐＧサイトに整列する、前記識別されたパラメータのうちの各パラメータについて、前記各々の断片の前記各々のＣｐＧサイトの前記第１の特徴を割り当てることをさらに含み得る。一部の実施形態では、前記各々のＣｐＧサイトの前記第１の特徴は前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の多重度である。一部の実施形態では、前記各々のＣｐＧサイトの前記第１の特徴は、次のものを含む：本願の他の箇所で説明された１つ以上の共通特徴を有する対象のコホートから得られたＣｐＧβ値と、本願の他の箇所で説明された１つ以上の共通特徴を有する対象のコホート中の所定の組織タイプから得られたＣｐＧβ値と、検査対象から得られたＣｐＧβ値と、５’及び３’近隣ＣｐＧサイトのメチル化状態についてのPearson相関スコアと、癌コホート又は本願の他の箇所で説明された１つ以上の共通特徴を有する対象のコホートに対しての前記検査対象中の前記各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についての，Jaccard類似度，ユークリッド距離，マンハッタン距離，最大値，正規化ユークリッド距離，正規化最大値，dice係数，又は余弦類似度と、前記各々の断片の断片ｐ値と、前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の長さと、断片シーケンス源と、前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の断片マッピング品質スコアと、前記参照ゲノム中の５’隣接ＣｐＧサイトへの距離と、前記参照ゲノム中の３’隣接ＣｐＧサイトへの距離と、前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の多重度と、前記各々のＣｐＧサイトが所在する遺伝的要素と、前記各々のＣｐＧサイトが関連付けられている生物学的経路と、前記各々のＣｐＧサイトが関連付けられている遺伝子と、前記各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧ遷移インパルス関数の値と、前記各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧラン長符号化（run-length encoding）の値と、前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記断片のリード（read）ストランド配向。一部の実施形態では、前記複数の断片中の１つより多い断片は、１つより多い断片が共通ＣｐＧサイトを有さないことを条件として、前記第１のパッチ中の前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータの単一のインスタンスに割り当てられる。

【0020】

一部の実施形態では、前記第１の複数のパラメータの前記インスタンス中のパラメータはゼロで埋められている。一部の実施形態では、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは前記参照ゲノムのＣｐＧインデックス中にある。一部のそのような実施形態では、前記参照ゲノムの前記ＣｐＧインデックスは、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに中には所在しないもＣｐＧサイトの前記第１の独立セット内に所在する第２のＣｐＧサイトと第３のＣｐＧサイトとの間の前記参照ゲノム中に位置する第１のＣｐＧサイトを含む。

【0021】

一部の実施形態では、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは、前記参照ゲノムのＣｐＧインデックス中において互いに隣り合う第１のＣｐＧサイトと第２のＣｐＧサイトとを含む。前記複数の断片中の第１の断片は、前記第１のＣｐＧサイトを含み得るも前記第２のＣｐＧサイトを含まないことがあり。前記複数の断片中の第２の断片は、前記第２のＣｐＧサイトを含み得るも前記第１のＣｐＧサイトを含まないものとされることができる。

【0022】

一部の実施形態では、前記複数の断片中の各々の断片についての前記第１の複数のパラメータのインスタンス中のパラメータは：前記各々の断片中の前記対応するＣｐＧサイトが前記メチル化シーケンシングによってメチル化していると決定された場合には、メチル化しているとされ；前記各々の断片中の前記対応するＣｐＧサイトが前記メチル化シーケンシングによってメチル化していないと決定された場合には、メチル化していないとされ；及び／又は前記各々の断片中の前記対応するＣｐＧサイトが前記メチル化シーケンシングによってメチル化している又はメチル化していない以外のものと決定された場合には、それ以外とされる。

【0023】

一部の実施形態では、前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータの幾つかのインスタンスには各々の断片が割り当てられず、また、前記少なくとも１つのプログラムは、断片が割り当てられていない前記第１のチャンネルの前記複数のパラメータのインスタンス中にてパラメータについてゼロで埋めるための命令を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つのプログラムは、前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、前記各々の断片中の前記ＣｐＧサイトに対応する、前記複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別できず、また、前記少なくとも１つのプログラムは、前記各々の断片を破棄するための命令をさらに含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つのプログラムは、前記第１のパッチの前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、前記各々の断片中の前記ＣｐＧサイトに対応する、前記複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別できず、また、前記少なくとも１つのプログラムは、前記第１のパッチの追加のインスタンスを作成するための命令及び前記各々の断片を前記第１のパッチの前記追加のインスタンスに割り当てるための命令をさらに含む。

【0024】

一部の実施形態では、前記複数のチャンネルは少なくとも３つのチャンネルを含む。前記第１の複数のチャンネルのうちの第３のチャンネルは、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスについての第３の複数のパラメータについての対応するインスタンスを含み得る。前記第３の複数パラメータの各インスタンスは、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトの第２の特徴についてのパラメータを含み得る。前記第２の特徴は、次のものを含み得る：本願の他の箇所で説明された１つ以上の共通特徴を有する対象のコホートから得られたＣｐＧβ値と、本願の他の箇所で説明された１つ以上の共通特徴を有する対象のコホート中の所定の組織タイプから得られたＣｐＧβ値と、検査対象から得られたＣｐＧβ値と、５’及び３’近隣ＣｐＧサイトのメチル化状態についてのPearson相関スコアと、癌コホート又は本願の他の箇所で説明された１つ以上の共通特徴を有する対象のコホートに対しての検査対象中の前記各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのJaccard類似度と、前記各々の断片の断片ｐ値と、前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の長さと、断片シーケンス源と、前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の断片マッピング品質スコアと、前記参照ゲノム中の５’隣接ＣｐＧサイトへの距離と、前記参照ゲノム中の３’隣接ＣｐＧサイトへの距離と、前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の多重度と、前記各々のＣｐＧサイトが所在する遺伝的要素と、前記各々のＣｐＧサイトが関連付けられている生物学的経路と、前記各々のＣｐＧサイトが関連付けられている遺伝子と、前記各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧ遷移インパルス関数の値と、前記各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧラン長符号化の値と、前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記断片のリードストランド配向。

【0025】

一部の実施形態では、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは前記参照ゲノム全体から抽出される。一部の実施形態では、前記少なくとも１つのプログラムは、対応する第１のチャンネルを含む第２のパッチを構築するための命令をさらに含む。前記第２のパッチは、前記種の前記参照ゲノム中の、ＣｐＧサイトの第２の独立セットを表し得る。ＣｐＧサイトの前記第２の独立セット中のそれぞれの各ＣｐＧサイトは、前記参照ゲノム中の所定の位置に対応し得る。前記第２のパッチの前記対応する第１のチャンネルは、第１の複数のパラメータについての対応する複数のインスタンスを含み得る。前記第２のパッチの前記第１のチャンネルの前記対応する第１の複数パラメータの各インスタンスは、前記第２のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第２の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含み得る。前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令をさらに含む：ＣｐＧサイトの前記第２の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれの各々の断片について、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第２のパッチの前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入して、それによって前記第２のパッチを構築するステップ。前記命令は、前記第１及び第２のパッチを前記分類器に適用して、それによって前記検査対象にての癌状態を決定することをさらに含み得る。一部の実施形態では、前記第２のパッチは、前記対応する第１のチャンネルを含む対応する複数のチャンネルを含み得る。前記第２のパッチの前記対応する複数のチャンネルのうちの対応する第２のチャンネルは、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスについての第２の複数のパラメータについての対応するインスタンスを含み得る。前記第２のパッチの前記第２の複数のパラメータの各インスタンスは、前記第２のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第２の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのＣｐＧメチル化状態以外の第１の特徴についてのパラメータを含み得る。ＣｐＧサイトの前記第２の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれの各々の断片について投入するための命令は、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第２のパッチの前記第２の複数のパラメータの前記インスタンスの全部又は一部のインスタンスにさらに投入することができる。

【0026】

一部の実施形態では、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは、ＣｐＧサイトの前記第２の独立セットとは重複していない。一部の他のそのような実施形態では、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは、ＣｐＧサイトの前記第２の独立セットとは重複する。一部の実施形態では、前記第１のパッチは、前記第２のパッチとは同等のサイズではあるが前記参照ゲノムの異なる部分を表す、方法。一部の他のそのような実施形態では、前記第１のパッチは前記参照ゲノムの第１の部分を表し、また、前記第２のパッチは前記参照ゲノムの第２の部分を表し、前記第１の部分のサイズは前記第２の部分のサイズと異なる。一部の実施形態では、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは第１の個数のＣｐＧサイトを備え、ＣｐＧサイトの前記第２の独立セットは第２の個数のＣｐＧサイトを備え、ＣｐＧサイトについての前記第１の個数はＣｐＧサイトについての前記第２の個数と同一である。そのような実施形態以外の一部では、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは第１の個数のＣｐＧサイトを備え、ＣｐＧサイトの前記第２の独立セットは第２の個数のＣｐＧサイトを備え、ＣｐＧサイトについての前記第１の個数はＣｐＧサイトについての前記第２の個数と異なる。

【0027】

一部の実施形態では、１つ以上の核酸試料についての前記メチル化シーケンシングは、全ゲノムメチル化シーケンシング又は標的ＤＮＡメチル化シーケンシングであって複数の核酸プローブが用いられるものである。一部のそのような実施形態では、一部の実施形態では、１つ以上の核酸試料についての前記メチル化シーケンシングは、複数の核酸プローブを用いる。一部の実施形態では、１つ以上の核酸試料についての前記メチル化シーケンシングは、１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍｃ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍｃ）を前記各々の断片にて検出する。本明細書で使用する場合、「メチル化」分析という用語は、ヒドロキシメチル化を含むがこれには限定されないメチル基が関与する任意の種類の改質を包括し得る。

【0028】

一部の実施形態では、１つ以上の核酸試料についての前記メチル化シーケンシングは、前記各々の断片中の１つ以上の非メチル化シトシン又は１つ以上のメチル化シトシンを対応する１つ以上のウラシルに転換することを伴う。一部の実施形態では、前記１つ以上のウラシルは、前記メチル化シーケンシングに際して、１つ以上の対応するチミンとして検出される。一部の他のそのような実施形態では、１つ以上の非メチル化シトシン又は１つ以上のメチル化シトシンについての前記転換は、化学転換、酵素転換、又はそれらの組合せを含む。

【0029】

一部の実施形態では、前記少なくとも１つのプログラムは前記第１のパッチを含む複数のパッチを構築するための命令をさらに含み、それぞれの各々のパッチは前記参照ゲノム中のＣｐＧサイトについての異なる独立セットのためのものである。前記第１のパッチを構築するステップは、前記第１のパッチを含む複数のパッチを構築することをさらに含み得る。前記分類器は１つ以上の訓練済み第１段階モデル（例えば、全パッチについて単一の第１段階モデルや各々がパッチに対応する複数の訓練済み第１段階モデル）及び第２段階モデルを含むことができる。少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用するステップは、複数の特徴要素を含む特徴ベクトルを取得するステップを含み得る。前記複数の特徴要素中の各特徴要素は、前記複数のパッチ中の各々のパッチを前記対応する訓練済み第１段階モデルに適用した際の、前記複数の訓練済み第１段階モデル中の対応する訓練済み第１段階モデルの出力とされ得る。前記命令は、前記特徴ベクトルを前記第２段階モデルに適用してそれによって前記検査対象にての前記癌状態を決定するステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、前記複数の訓練済み第１段階モデル中のそれぞれの各々の訓練済み第１段階モデルは対応する訓練済み畳み込みニューラルネットワークであり、また、前記第２段階モデルはロジスティック回帰モデルである。一部の実施形態では、前記第２段階モデルは、２値分類アルゴリズム又は多項分類アルゴリズム（例えば、原発組織を分類するため）とされ得る。一部の実施形態では、前記第２段階分類アルゴリズムは次のものに基づいていることができる：勾配ブーストアルゴリズム、決断ツリーアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、Ｋ最近ネイバー（K nearest neighbors）アルゴリズム、ガウシアンＮＢアルゴリズム、又はそれらの任意の組合せ。

【0030】

前記第１のパッチの前記第１のチャンネルは２次元的であり、前記第１のパッチの前記第１の複数のパラメータの前記複数のインスタンスのそれぞれの各々のインスタンスは第１の次元を構成しており、また、前記第１のパッチの前記第１の複数のパラメータは前記第２の次元を構成している。一部の実施形態では、前記複数のパッチは１０個のパッチから１００００個のパッチとされる。一部の実施形態では、前記複数のパッチは１００個のパッチから３０００個のパッチとされる。

【0031】

一部の実施形態では、前記分類器は複数の第１段階モデル及び動的ニューラルネットワークを含む。前記少なくとも１つのプログラムは、前記第１のパッチを含む複数のパッチを構築するための命令をさらに含み得るのであり、それぞれの各々のパッチは前記参照ゲノム中のＣｐＧサイトについての異なるセットのためのものとされる。前記複数のパッチを構築するステップは、前記第１のパッチを含む各々のパッチを構築することを伴い得る。少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用するステップは、前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチを前記複数の第１段階モデル中の対応する第１段階モデルに適用することを含み得る。前記対応する第１段階モデルは、前記各々のパッチを受けるための各々の入力層を伴い得るのであり、前記各々のパッチは第１の次元数を含んでいる。前記対応する第１段階モデルは、対応する重みセットを含む各々の完全接続埋め込み層をさらに含み得る。前記各々の完全接続埋め込み層は、前記各々の入力層の出力を直接的又は間接的に受けることができる。前記各々の埋め込み層の各々の出力は、前記第１の次元数より少ない第２の次元数とされ得る。前記対応する第１段階モデルは、前記各々の完全接続埋め込み層からの出力を直接的又は間接的に受ける各々の出力層とをさらに含み得る。少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用するステップは、前記複数の第１段階モデル中の各訓練済み第１段階モデルのそれぞれの各々の完全接続埋め込み層からの前記各々の出力の集約したものを、前記動的ニューラルネットワーク内へと入力して、それによって前記検査対象にての癌状態を決定することをさらに含み得る。一部のそのような実施形態では、前記複数の第１段階モデル中のそれぞれの各々の第１段階モデルの前記各々の埋め込み層の前記各々の出力は、３２個から１０４８個の値を有するセットを含み得る。一部の更なるそのような実施形態では、前記少なくとも１つのプログラムは、対象についてのコホートを用いて前記複数の第１段階モデル及び前記動的ニューラルネットワークを訓練するための命令をさらに含む。一部のそのような実施形態では、前記対象についてのコホートは、前記癌状態に関する第１のラベルを有する対象についての第１のサブセットと、前記癌状態に関する第２のラベルを有する対象についての第２のサブセットとを含む。一部の実施形態では、単一の第１段階モデルは試料群にわたって試料毎に複数のパッチに対して訓練される（例えば、試料は既知の癌状態を有している訓練用対象の群から取得される）。

【0032】

そして、訓練された第１段階モデルは状態が未知の対象からの検査試料からのシーケンシングデータに適用して、各パッチから特徴要素を抽出できる。例えば、シーケンシングデータは訓練に用いられるのと同じパッチのセットに従って処理され得る（例えば、パッチ５３０－１，パッチ５３０－２，．．．，パッチ５３０－Ｋ）。そして、訓練された第１段階モデルを、訓練対象の群からのシーケンシングデータを用いて各パッチに適用して（例えば、実は図７Ａの訓練済みモデル１，訓練済みモデル２，．．．，訓練済みモデルＫは同じ訓練済みモデルである。）、それぞれの各々のパッチから特徴及び／又は特徴要素を別個に抽出することができる（例えば、特徴要素１，特徴要素２，．．．，特徴要素Ｋ）。一部の実施形態では、混合型の手法を用い得る。特に、複数の第１段階モデルを訓練することができ、また、これらを用いて更なる試料レベル分類のために特徴及び／又は特徴要素を取得することができる。例えば、複数のパッチを用いて試料群にわたって試料毎に共通の第１段階モデルを訓練することができる（例えば、試料は、既知の癌状態を有する訓練対象の群から取得される）。対象からの試料のシーケンシングデータに基づいて同じ共通の第１段階モデルを対応するパッチに適用して、対象から特徴及び／又は特徴要素を抽出できる。他の実施形態では、単一の第１段階モデルは試料群にわたって試料毎に単一のパッチを伴って訓練される（例えば、試料は既知の癌状態を有している訓練用対象の群から取得される）。例えば、データセットが10,000個の試料を有している場合、試料毎に１つのパッチについて訓練されたモデルは、10,000回訓練されることができる。そして、特定の第１段階モデルは対象からの対応するパッチに適用されて、対象から特徴及び／又は特徴要素を抽出できる。この特定の対象について分析される、全パッチからの特徴及び／又は特徴要素は、試料レベル分類をなすために用いられ得る。例えば、図７Ａに示すように、図７Ａの訓練済みモデル１及び訓練されたモデル２は同じとされ得るのであり、他方で訓練済みモデルＫはパッチ５３０－Ｋに固有のものとされ得る）。パッチ５３０－Ｋから特徴要素を抽出するために個別化モデルが用いられる一方で、共通のモデルは、パッチ５３０－１及びパッチ５３０－２から特徴要素を抽出するために共通のモデルが用いられ得る。訓練された第１段階モデルの個数には関わらず、同じ個数の特徴要素を分類のために試料レベル分類器に提供できる。

【0033】

一部の更なるそのような実施形態では、訓練に関する命令は、ランダムな態様で対象についての前記コホートを癌状態、年齢、喫煙状態、又は性別の任意の組合せに基づいて複数の群に階層化するステップを含む。訓練に関する命令は、前記複数の群中の第１の群を訓練群として及び前記複数の群の残部を検査群として用いて、前記複数のモデル及び前記動的ニューラルネットワークを前記訓練群に対して訓練するステップをさらに含み得る。訓練に関する命令は、訓練用の群及び検査群を用いることを複数の群の各群について用いることを反復するステップであって、複数の群中の各群が訓練群として反復回にて用いられるようにするステップをさらに含み得る。訓練に関する命令は、分類器性能基準が充足されるまで、階層化ステップと、グループを用いるステップと、反復回を反復するステップとを、反復するステップをさらに含み得る。一部の更なるそのような実施形態では、癌状態は原発組織であり、また、対象のコホート内の各対象は原発組織をもってラベル付けされている。一部の更なるそのような実施形態では、コホートは次の事項を有する対象を含む：肛門直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、頭部及び頸部癌、肝胆癌、子宮内膜癌、腎臓癌（kidney cancer）、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ系腫瘍、メラノーマ、多発性骨髄腫、骨髄腫瘍、卵巣癌、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、腎癌（renal cancer）、甲状腺癌、上部胃腸癌、尿路上皮癌、又は子宮癌。

【0034】

一部の更なるそのような実施形態では、癌状態は次の事項とされる：肛門直腸癌のステージ、膀胱癌のステージ、乳癌のステージ、子宮頸癌のステージ、結腸直腸癌のステージ、頭部及び頸部癌のステージ、肝胆癌のステージ、子宮内膜癌のステージ、腎臓癌のステージ、白血病のステージ、肝臓癌のステージ、肺癌のステージ、リンパ系腫瘍のステージ、メラノーマのステージ、多発性骨髄腫のステージ、骨髄腫瘍のステージ、卵巣癌のステージ、非ホジキンリンパ腫のステージ、膵臓癌のステージ、前立腺癌のステージ、腎癌のステージ、甲状腺癌のステージ、上部胃腸癌のステージ、尿路上皮癌のステージ、又は子宮癌のステージ。一部のそのような実施形態では、癌状態は対象が癌を有するか否かについてであり、また、対象のコホートに対しての階層化ステップによって複数の群中の各群の癌を有する対象数と癌を有さない対象数とが等しくなることを担保する。

【0035】

一部のそのような実施形態では、前記訓練によって、前記訓練中に前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチの各々の出力層から提供された値に基づいたＬ１又はＬ２正規化を用いて前記複数のパッチ中の１つ以上のパッチが除去される。一部の実施形態では、前記第１の複数のパラメータの前記複数のインスタンスは２４個から２０４８個とされる。一部の実施形態では、前記第１の複数のパラメータの前記複数のインスタンス中のインスタンス数は、前記複数の断片の期待リード深度に前記複数の断片にわたっての１標準偏差加わったものに基づいて決定される。一部の実施形態では、パッチを構築するステップは、前記第１のパッチに割り当てられた各々の断片を、それらの各々のｐ値又は前記参照ゲノムにおけるそれらの開始位置に基づいて、ソートすることをさらに含む。

【0036】

一部の実施形態では、前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令をさらに含む：前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セットを選択するステップであって、複数のＣｐＧメチル化パターンの評価を介してなされるステップ。前記複数のＣｐＧメチル化パターンは、複数の臨床的対象を備える臨床的コホートから取得された複数の臨床的生物試料の複数の臨床的核酸試料から取得された複数の臨床的断片のメチル化シーケンシングによって決定され得る。前記複数の臨床的対象は、前記癌状態に関する第１の兆候を有する臨床的対象についての第１のセットと前記癌状態に関する第２の兆候を有する臨床的対象についての第２のセットとを含み得る。

【0037】

一部のそのような実施形態では、ＣｐＧサイトのセットを選択するための命令は、臨床的対象についての前記第１のセットと臨床的対象についての前記第２のセットとの間での前記複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態についての各々の第１の相互情報スコアに基づいて、複数のＣｐＧサイトの前記参照ゲノム内での第１の順位を決定するステップを含む。前記命令は、前記順位を用いて前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記対応する独立セットについてのＣｐＧサイトの第１の閾値個数を選択するステップをさらに含み得る。一部の更なるそのような実施形態では、前記複数の臨床的対象は、前記癌状態に関する第３の兆候を有する臨床的対象についての第３のセットと前記癌状態に関する第４の兆候を有する臨床的対象についての第４のセットとを含む。一部のそのような実施形態では、選択をなすための命令は、臨床的対象についての前記第３のセットと臨床的対象についての前記第４のセットとの間での前記複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態についての各々の第２の相互情報スコアに基づいて、前記複数のＣｐＧサイトの前記参照ゲノム内での第２の順位を決定するステップをさらに含む。前記命令は、前記第２の順位を用いて、前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第２の閾値個数を選択するステップをさらに含み得る。一部のそのような実施形態では、パッチを構築するステップは、前記第１のパッチに割り当てられた各々の断片を、それらの第１又は第２の相互情報スコアに基づいて、ソートすることをさらに含む。一部のそのような実施形態では、前記癌状態についての第１の兆候は第１の癌タイプであり、また、前記癌状態についての第２の兆候は第２の癌タイプである。一部のそのような実施形態では、前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの前記第１の閾値個数中のそれぞれの各々のＣｐＧサイトに関しては、ＣｐＧサイトの前記第１の閾値個の中のあらゆる他のＣｐＧサイトから前記参照ゲノム内において閾値個の剰余部をもってパディングがなされる。

【0038】

一部のそのような実施形態では、ＣｐＧサイトのセットを選択するための命令は、臨床的対象についての前記第１のセットと臨床的対象についての前記第２のセットとの間での前記複数の固定長領域中の各固定長領域のＣｐＧサイトメチル化パターンのメチル化状態についての各々の第１の相互情報スコアに基づいて、前記参照ゲノム内での複数の固定長領域の第１の順位を決定するステップをさらに含む。選択をなすための命令は、前記第１の順位を用いて、前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第１の閾値個数を、前記複数の固定長領域中のそれらの固定長領域から、選択するステップをさらに含み得る。一部の更なるそのような実施形態では、前記複数の臨床的対象は、前記癌状態に関する第３の兆候を有する臨床的対象についての第３のセットと前記癌状態に関する第４の兆候を有する臨床的対象についての第４のセットとを含む。選択をなすための命令は、臨床的対象についての前記第３のセットと臨床的対象についての前記第４のセットとの間での前記複数の固定長領域中の各固定長領域のＣｐＧサイトメチル化パターンのメチル化状態についての各々の第２の相互情報スコアに基づいて、前記参照ゲノム内での前記複数の固定長領域の第２の順位を決定するステップをさらに含み得る。選択をなすための命令は、前記第２の順位を用いて、前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第２の閾値個数を選択するステップをさらに含み得る。一部のそのような実施形態では、パッチを構築するステップは、前記第１のパッチに割り当てられた各々の断片を、それらの第１又は第２の相互情報スコアに基づいて、ソートすることをさらに含む。一部の実施形態では、前記１つ以上の核酸試料は無細胞核酸試料である。

【0039】

本開示の別の態様では、種に属する検査対象の癌状態を決定するためのコンピュータシステムを提供する。開示されるいずれの方法も、癌状態以外の疾患状態（例えば、遺伝性疾患）を決定するためにも用いられ得る。この態様では、コンピュータシステムは、少なくとも１つのプロセッサと、前記少なくとも１つのプロセッサによって実行される少なくとも１つのプログラムを格納するメモリとを備える。前記少なくとも１つのプログラムは、電子的態様にてデータセットを取得するステップをなすための命令を含み得る。前記データセットは、複数の断片中のそれぞれの各々の断片の対応するメチル化パターンを備えることができる。それぞれの各々の断片の前記対応するメチル化パターンは、前記検査対象から取得された生物試料中の前記各々の断片を備える１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングによって決定され得るのであり、また、前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含む。この態様では、前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令をさらに含む：第１のチャンネルを含む第１のパッチを構築するステップ。前記第１のパッチは、前記種の参照ゲノム中の、ＣｐＧサイトの第１の独立セットを表し得る。ＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中のそれぞれの各ＣｐＧサイトは、前記参照ゲノム中の所定の位置に対応し得る。前記第１のパッチの前記第１のチャンネルは第１の複数のパラメータについての複数のインスタンスを含み得るのであり、また、前記第１の複数パラメータの各インスタンスは前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含む。前記第１のパッチを構築するステップは、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれの各々の断片について、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入することを含み得る。この態様では、前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令をさらに含む：少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用してそれによって前記検査対象にての癌状態（cancer condition）を決定するステップ。

【0040】

本開示の別の態様では、プロセッサによって実行されると該プロセッサに種に属する検査対象の癌状態を決定する方法を行わせるプログラムコード命令が格納された非一時的コンピュータ可読記憶媒体を提供する。該方法は、電子的態様にてデータセットを取得するステップを含み得る。前記データセットは、複数の断片中のそれぞれの各々の断片の対応するメチル化パターンを備えることができる。それぞれの各々の断片の前記対応するメチル化パターンは、前記検査対象から取得された生物試料中の前記各々の断片を備える１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングによって決定され得るのであり、また、前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含む。この態様では、前記方法は次のステップをさらに含む：第１のチャンネルを含む第１のパッチを構築するステップ。前記第１のパッチは、前記種の参照ゲノム中の、ＣｐＧサイトの第１の独立セットを表し得る。ＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中のそれぞれの各ＣｐＧサイトは、前記参照ゲノム中の所定の位置に対応し得る。前記第１のパッチの前記第１のチャンネルは第１の複数のパラメータについての複数のインスタンスを含み得るのであり、また、前記第１の複数パラメータの各インスタンスは前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含む。前記第１のパッチを構築するステップは、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれの各々の断片について、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入することを含み得る。この態様では、前記方法は、少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用してそれによって前記検査対象にての癌状態を決定するステップをさらに含む。

【0041】

本開示の別の態様では、種に属する検査対象の癌状態を決定するための方法を提供する。この態様では、方法は、少なくとも１つのプロセッサと前記少なくとも１つのプロセッサによって実行される少なくとも１つのプログラムを格納するメモリとを備えるコンピュータシステムにて、提供される。前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令を含み得る：電子的態様にてデータセットを取得するステップであって、該データセットは複数の断片中のそれぞれの各々の断片の対応するメチル化パターンを備える、ステップ。それぞれの各々の断片の前記対応するメチル化パターンは、前記検査対象から取得された生物試料中の前記各々の断片の１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングによって決定され得るのであり、また、前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含み得る。

【0042】

この態様では、前記少なくとも１つのプログラムは、複数のパッチを取得するための命令をさらに含むのであり、前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチは、第１のチャンネルを含み、且つ、前記種の参照ゲノム中のＣｐＧサイトの対応する独立セットを表す。ＣｐＧサイトの前記対応する独立セット中のそれぞれの各ＣｐＧサイトは、前記参照ゲノム中の所定の位置に対応し得る。各々のパッチの前記第１のチャンネルは第１の複数のパラメータについての複数のインスタンスを含み得るのであり、前記第１の複数パラメータの各インスタンスは前記各々のパッチについてのＣｐＧサイトの前記対応する独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含む。

【0043】

この態様では、前記少なくとも１つのプログラムは、前記各々の断片（the respective fragment）のＣｐＧサイトと前記単一の各々のパッチ（the single respective patch）のＣｐＧサイトの前記対応する独立セットとの間の合致に基づいて、前記複数の断片中のそれぞれの各々の断片の全部又は一部を、前記複数のパッチ中の各々のパッチに、割り当てるための命令をさらに含み得る。この態様では、前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令をさらに含む：前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチを前記複数のモデル中の対応する訓練済みモデルに適用してそれによって前記検査対象にての癌状態を決定するステップ。

【0044】

本開示の別の態様では、種に属する検査対象の癌状態を決定するためのコンピュータシステムであって、少なくとも１つのプロセッサと前記少なくとも１つのプロセッサによって実行される少なくとも１つのプログラムを格納するメモリとを備えたコンピュータシステムを、提供する。前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令を含み得る：電子的態様にてデータセットを取得するステップであって、該データセットは複数の断片中のそれぞれの各々の断片の対応するメチル化パターンを備える、ステップ。それぞれの各々の断片の前記対応するメチル化パターンは、前記検査対象から取得された生物試料中の前記各々の断片の１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングによって決定され得るのであり、また、前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含み得る。この態様では、前記少なくとも１つのプログラムは、複数のパッチを取得するための命令をさらに含み得るのであり、前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチは、第１のチャンネルを含み、且つ、前記種の参照ゲノム中のＣｐＧサイトの対応する独立セットを表す。ＣｐＧサイトの前記対応する独立セット中のそれぞれの各ＣｐＧサイトは、前記参照ゲノム中の所定の位置に対応し得るのであり、また、各々のパッチの前記第１のチャンネルは第１の複数のパラメータについての複数のインスタンスを含み得る。前記第１の複数パラメータの各インスタンスは、前記各々のパッチについてのＣｐＧサイトの前記対応する独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含み得る。

【0045】

この態様では、前記少なくとも１つのプログラムは、前記各々の断片（the respective fragment）のＣｐＧサイトと前記単一の各々のパッチ（the single respective patch）のＣｐＧサイトの前記対応する独立セットとの間の合致に基づいて、前記複数の断片中のそれぞれの各々の断片の全部又は一部を、前記複数のパッチ中の各々のパッチに、割り当てるステップをさらに含み得る。この態様では、前記少なくとも１つのプログラムは次のステップをさらに含む：前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチを前記複数のモデル中の対応する訓練済みモデルに適用してそれによって前記検査対象にての癌状態を決定するステップ。

【0046】

本開示の別の態様では、プロセッサによって実行されると該プロセッサに種に属する検査対象の癌状態を決定する方法を行わせるプログラムコード命令が格納された非一時的コンピュータ可読記憶媒体を提供する。該方法は、電子的態様にてデータセットを取得するステップであって、該データセットは複数の断片中のそれぞれの各々の断片の対応するメチル化パターンを備える、ステップを含み得る。それぞれの各々の断片の前記対応するメチル化パターンは、前記検査対象から取得された生物試料中の前記各々の断片の１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングによって決定され得るのであり、また、前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含む。

【0047】

この態様では、前記方法は、複数のパッチを取得するステップをさらに含むのであり、前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチは、第１のチャンネルを含み、且つ、前記種の参照ゲノム中のＣｐＧサイトの対応する独立セットを表す。ＣｐＧサイトの前記対応する独立セット中のそれぞれの各ＣｐＧサイトは、前記参照ゲノム中の所定の位置に対応し得る。各々のパッチの前記第１のチャンネルは第１の複数のパラメータについての複数のインスタンスを含み得るのであり、また、前記第１の複数パラメータの各インスタンスは前記各々のパッチについてのＣｐＧサイトの前記対応する独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含み得る。

【0048】

この態様では、前記方法は、前記各々の断片（the respective fragment）のＣｐＧサイトと前記単一の各々のパッチ（the single respective patch）のＣｐＧサイトの前記対応する独立セットとの間の合致に基づいて、前記複数の断片中のそれぞれの各々の断片の全部又は一部を、前記複数のパッチ中の各々のパッチに、割り当てるステップをさらに含む。この態様では、前記方法は次のステップをさらに含む：前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチを前記複数のモデル中の対応する訓練済みモデルに適用してそれによって前記検査対象にての癌状態を決定するステップ。

【0049】

別の態様では、種に属する検査対象の癌状態を決定する方法は、次のステップを含む：１つ以上のプロセッサを介して、訓練データセットを１つ以上の訓練対象から取得するステップであって、前記訓練データセットは、前記１つ以上の訓練対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片の１つ以上の訓練メチル化パターンと、前記１つ以上の訓練メチル化パターンに関連付けられている１つ以上の所定の癌状態とを含む、ステップと；前記１つ以上のプロセッサを介して、前記訓練データセットに基づいて１つ以上のパッチを構築するステップであって、前記１つ以上のパッチの各パッチは、１つ以上のチャンネルを含み、また、前記種の参照ゲノム中の１つ以上のＣｐＧサイトを表すのであり、前記１つ以上のＣｐＧサイトの各ＣｐＧサイトは、前記参照ゲノム中の所定の位置に対応する、ステップと；前記１つ以上のプロセッサを介して、前記１つ以上のパッチ及び前記訓練データセットに基づいて計算モデルを訓練するステップと；１つ以上のプロセッサを介して、前記検査対象から検査データセットを取得するステップであって、前記検査データセットは、前記検査対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片の１つ以上の検査メチル化パターンを含む、ステップと；１つ以上のプロセッサを介して、前記検査データセット及び前記計算モデルに基づいて前記検査対象の前記癌状態を決定するステップ。

【0050】

他の実施形態は、上述した方法に関連するシステム、可搬型の消費者向け装置、及びコンピュータ可読媒体に関する。本願にて開示するように、本願にて開示される任意の実施形態は、可能な場合は任意の態様に適用できることに留意されたい。

【0051】

当業者ならば後述の詳細な説明から本開示の追加的な態様及び利点に気付くことができるのであり、本開示の例示的な実施形態のみが開示及び説明されている。諸兄が気付いているように本開示は他の異なる実施形態にも適用可能であり、それらの幾つかの詳細事項には様々な自明な観点での変更が加えられ得るのであり、本開示の範疇から逸脱せずにそのようになせることに留意されたい。したがって、図面及び明細書の性質は例示的であり、限定的なものとして解されてはならない。

【0052】

参照による取り込み言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照によって取り込まれる。本開示の用語と取り込まれた参照物の用語との間での抵触がある場合、本開示の用語が優勢とされる。

【図面の簡単な説明】

【0053】

開示される実装例は添付の図面の図表で限定的にではなく例示的に示されている。同様の参照符号は図面の幾つかの観点において対応する部分を指す。

【0054】

【図1】本開示の１つ以上の実施形態による、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片をシーケンシングしてメチル化状態ベクトルを取得する処理についての例示的なフローチャートである。

【図2】本開示の１つ以上の実施形態による、ｃｆＤＮＡ断片をシーケンシングしてメチル化状態ベクトルを取得する図１の処理について示す図である。

【図3】本開示の１つ以上の実施形態による、ｐ値に基づいて各々の断片を複数の断片から除去する例示的方法について示す図である。

【図4】本開示の１つ以上の実施形態による、分類器を含む例示的なメチル化パターンパイプラインについて示す図である。

【図5A】本開示の１つ以上の実施形態による、種に属する検査対象の疾患状態を決定するための例示的なシステムについて示す図である。

【図5B】本開示の１つ以上の実施形態による、種に属する検査対象の疾患状態を決定するための例示的な処理システムについて示す図である。

【図6】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、６Ｉ、６Ｊ、６Ｋ、６Ｌ、６Ｍ及び６Ｎは、本開示の１つ以上の実施形態による、例示的なパッチについて示す図である。

【図7】図７Ａ及び７Ｂは、本開示の１つ以上の実施形態による、例示的なパッチ分類器について示す図である。

【図8】図８Ａ及び８Ｂは、本開示の１つ以上の実施形態による、種に属する検査対象の癌状態を決定するための例示的な方法について示す図である。

【図9A】本開示の１つ以上の実施形態による、パッチＣＮＮ分類器にて用いられる例示的なゲノム領域について示す図である。

【図9B】本開示の１つ以上の実施形態による、パッチＣＮＮ分類器にて用いられる例示的な癌タイプについて示す図である。

【図9C】本開示の１つ以上の実施形態による、パッチＣＮＮ分類器の性能の例について示す図である。

【図10A】本開示の１つ以上の実施形態による、データセットを用いたパッチＣＮＮ分類器の性能の例について示す図であって、（全ての癌のタイプ及びステージにわたっての）癌検出に関して特異度が９９％とされた場合に５３％の感度（精度）が達成された、図である。

【図10B】本開示の１つ以上の実施形態による、全ての癌タイプにわたっての２値設定におけるパッチＣＮＮ分類器の感度の例について示す図であって、分類器は、ｃｆＤＮＡ試料のＣＣＧＡ１訓練に際して、特異度が９８％とされた場合には８８．００％の感度を示し、特異度が９９％とされた場合には７４．３６％の感度を示し、特異度が９９．５％とされた場合には４４．２３％の感度を示す、図である。

【図11】本開示の１つ以上の実施形態による、各パッチから埋め込み値（活性化）を取って、Ｉｓｏｍａｐクラスタリングを用いてそれらをクラスタリングさせる際の例を示す図であって、異なる癌ラベルがＩｓｏｍａｐの異なる領域へとクラスタすることが示され、埋め込み値が癌タイプを判別するということが示される、図である。

【図12】本開示の１つ以上の実施形態による、試料セットにわたっての、分類器の５４４個のパッチの埋め込み層の活性化頻度の例について示す図である。

【図13】本開示の１つ以上の実施形態による、試料セットにわたっての、分類キノン上位６個の活性化済みパッチの埋め込み値（活性化）のｔ－ＳＮＥクラスタリングの例について示す図であって、最も右寄りのパッチがそれ自身で幾つかの異なる癌タイプを判別できるということが示されている、図である。

【図14】本開示の１つ以上の実施形態による、試料セットにわたっての、分類キノン上位３個の活性化済みパッチの埋め込み値（活性化）のｔ－ＳＮＥクラスタリングの例について示す図である。

【図15】本開示の１つ以上の実施形態による、パッチＣＮＮアーキテクチャを用いる分類性能の例示的結果について示す図である。

【図16】本開示の１つ以上の実施形態による、癌タイプの高位信号によるパッチベースド分類器の性能の例について示す図であって、各ドットはＣＣＧＡ２からの対象を表し、対象がｙ軸上にて指定された癌タイプを有している確率を分類器が提供する、図である。

【図17A】本開示の１つ以上の実施形態による、分類器における原発組織（ＴＯＯ、Tissue of Origin）に関しての例示的な混同マトリックス分析を示す図であって、全４ステージにわたっての図中に示される各癌タイプの対象を含む対象コホートでのＴＯＯ精度が８０％を超えていることが示され、状態が不定の試料が分析には含まれている、図である。

【図17B】本開示の１つ以上の実施形態による、分類器における原発組織（ＴＯＯ、Tissue of Origin）に関しての別の例示的な混同マトリックス分析を示す図であって、全４ステージにわたっての図中に示される各癌タイプの対象を含む対象コホートでのＴＯＯ精度が約９０％となることが示され、状態が不定の試料は分析から除外されている、図である。

【図18】本開示の１つ以上の実施形態による、メチル化パターンにいついてのｐ値の例示的な算出について示す図である。

【図19】本開示の１つ以上の実施形態による、検査対象の疾患状態を決定するようにプログラミング又は他の態様で構成されている例示的なコンピュータシステム１９０１について示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0055】

実施形態について参照して詳細に述べるのであり、その例については添付の図面にて示されている。後述の詳細な説明では、本開示の徹底的な理解を提供するために多くの特定の詳細事項が記載されている。もっとも、当業者にとっては、これらの具体的詳細事項なくしても本開示が実施可能であることが自明である。他方で、実施形態の諸態様を不要に曖昧としないために、周知の方法、手順、コンポーネント、回路、及びネットワークについては詳述していない。

【0056】

Ｉ． 総論
ターゲテッドメチル化分析によれば、生物試料の分類に関して計算量的に取り扱い可能なシステム及び方法を提供することができる。例えば、メチル化シーケンシングを用いることによって（例えば、約２，８００万個のＣｐＧサイト）、ＤＮＡシーケンシング塩基リード（read）についての限定的なサブセットを取得することができる（例えば、ヒト細胞については約３０億個）。そのようなＣｐＧサイトは、２値型「スイッチ」として機能して、特定の機能をトグル切り換えさせたり、生物試料中の細胞に対して分化するように指令することができる（例えば、他のものもあるが、脳細胞、胚細胞、腎細胞、及び／又は皮膚細胞等）。メチル化基の制御は、癌の検出に関しての分子マーカとしてさらに特徴付けることができる。さらに、ＣｐＧサイトは細胞分化に関与する役割を担う故に、それらのメチル化パターンは、特定の細胞試料及び／又はＤＮＡ断片の由来（例えば、原発組織（ＴＯＯ、tissue of origin））を予測するために用いることができる。したがって、ＣｐＧサイトの使用は、ＤＮＡ基リードと比べて、生物試料の分類及び特徴付けに関して明白な優位性をもたらし得る。

【0057】

検査対象の癌状態に関しての検出及び分類のためのシステム及び方法を提供するのであり、これらは核酸試料のメチル化シーケンシング及びパッチ畳み込みニューラルネットワーク（パッチＣＮＮ）を用いる。メチル化シーケンシングによって決定された断片のメチル化パターンを含むデータセットを取得できるのであり、メチル化パターンは、各々の断片中の複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含む。データセットに基づいて第１のパッチを構築できる。第１のパッチは、検査対象の種の参照ゲノム中のＣｐＧサイトの第１の独立セットを表し得るのであり、また、各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についての第１の複数のパラメータの複数のインスタンスを含む第１のチャンネルを備え得る。前記第１のパッチは次のように構築することができる：ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに整列したそれぞれの各々の断片について、前記断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入すること。検査対象での癌状態は、少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用することによって決定できる。検査対象からのｃｆＤＮＡ断片に対しては、処理をなして、非メチル化シトシンをウラシルに転換して、シーケンシングをなして、参照ゲノムに対してシーケンス済みリード（read）を比較して、断片内の１つ以上のＣｐＧサイトにてのメチル化状態を識別できる。健常対象（healthy subject）と比較して、異常メチル化ｃｆＤＮＡ断片の識別によって、対象の癌状態について洞察をもたらし得る。（健常対照群（healthy control）に比して）ＤＮＡメチル化異常は、異なる効果をもたらし得るのであり、これらは癌に寄与し得る。異常メチル化ｃｆＤＮＡ断片の識別に関しては、様々な困難が生じ得る。先ず、１つ以上のｃｆＤＮＡ断片が異常にメチル化されていると決定された場合、正常なメチル化がなされていると仮定されている断片を有している対照対象群（group of control subjects）と比べると、よりウェイトが与えられよう。また、対照対象群間ではメチル化状態は異なり得るのであり、対象のｃｆＤＮＡが異常にメチル化されているか否かを評価しようとする際にこのことを説明することが困難たり得る。また、ＣｐＧサイトにてのシトシンのメチル化は、後続のＣｐＧサイトでのメチル化に影響を因果的に及ぼし得る。

【0058】

デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）にてメチル化は、シトシン塩基のピリミジン環上の水素原子がメチル基に転換されて５－メチルシトシンが形成された場合に生じ得る。特に、メチル化は、本願では「ＣｐＧサイト」と呼ぶシトシン及びグアニンのジヌクレオチドにて生じ得る。希ではあるが、メチル化は、ＣｐＧサイトの一部ではないシトシンにて又はシトシンではない別のヌクレオチドにて生じ得る。異常なｃｆＤＮＡ断片メチル化は高メチル化又は低メチル化としてさらに識別されることができ、いずれもが癌状態を指し得る。

【0059】

本開示にて説明した諸原理は、非ＣｐＧコンテキストでのメチル化検出にも同様に適用可能であり、非シトシンメチル化も含まれる。メチル化検出に用いられるウエットラボ分析は、本開示にて説明したものとは異なり得る。さらに、メチル化状態ベクトルは、（それらのサイトが具体的にＣｐＧサイトでなくとも、）メチル化が起きたかもしれない又は起きていないかもしれないサイトのベクトルであると一般的にされる要素を、含み得る。この代替をもって本開示にて説明した処理の残部は同様とでき、また、したがって、本開示にて説明した発明的概念はそれら他のメチル化態様にも適用可能となり得る。

【0060】

ＩＩ． 定義
本明細書で使用する場合、「およそ」又は「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差範囲内を意味し得るのであり、これは、値がどのように測定又は決定されるか（例えば、測定システムの制約）に部分的に依存し得る。例えば、「およそ」は、業界の慣例により、１標準偏差以内又は１標準偏差以上を意味し得る。「およそ」とは、所与の値の±２０％、±１０％、±５％、±１％の範囲を意味し得る用語たる「およそ」又は「約」とは、値の1桁分の範囲内、5倍以内、又は2倍以内を意味し得る。別段の定めなき限り、本出願及び特許請求の範囲にて特定の値が記載されている場合、特定の値に対して許容誤差範囲内を意味するものとして「およそ」という用語を解されたい。用語たる「およそ」は、当業者によって一般的に理解される意味を有し得る。用語たる「およそ」は、±１０％を意味し得る。用語たる「およそ」は、±５％を意味し得る。

【0061】

本明細書で使用する場合、「分析」という用語は、物質（例えば、核酸、蛋白質、細胞、組織、又は臓器）の特性を決定するための手法を意味する。分析（例えば、第１分析又は第２分析）は、以下の事項を決定する手法を含み得る：試料中の核酸のコピー数の多様性（copy number variation）；試料中の核酸のメチル化状態；試料中の核酸の断片サイズ分布；試料中の核酸の突然変異状態；又は試料中の核酸の断片化パターン。本開示にて説明された任意の核酸の特性を検出するために、任意の分析法を用い得る。核酸の特性には、配列、ゲノム同一性、コピー数、１つ以上のヌクレオチド位置におけるメチル化状態、核酸のサイズ、１つ以上のヌクレオチド位置における核酸中の突然変異の有無、及び核酸の断片化のパターン（例えば、核酸が断片化するヌクレオチド位置）が含まれ得る。分析乃至は方法は、特定の感度及び／又は特異度を有し得るのであり、診断ツールとしての相対的有用性はＲＯＣ－ＡＵＣ統計を用いて測定され得る。

【0062】

本明細書で使用する場合、「生物試料」、「患者試料」及び「試料」という用語は互換的に使用されるのであり、、また、対象から採取した任意の試料を指し、これは対象と関連付けられる生物学的状態を反映し得る。一部の実施形態では、そのような試料は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ、cell-free DNA）等の無細胞核酸を含む。一部の実施形態では、そのような試料は、無細胞核酸以外の又は無細胞核酸に加えての核酸を含む。生物試料の例としては、対象の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸膜液、心嚢液、又は腹水が含まれるが、これらには限定されない（include, but are not limited to）。一部の実施形態では、生物試料は、対象の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸膜液、心嚢液、又は腹水からなる（consists of）。そのような実施形態では、生物試料は、対象の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸膜液、心嚢液、又は腹水に限定されるのであり（is limited to）、また、対象の他の要素（例えば、固形組織等）を含まない（does not contain）。生物試料は、存命の又は死亡した対象由来の任意の組織又はマテリアルを含み得る。生物試料は、無細胞試料とされ得る。生物試料は、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はその断片を含み得る。「核酸」という用語は、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ断片）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれについての任意のハイブリッド又は断片を指し得る。試料中の核酸は、無細胞核酸とされ得る。試料は、液体試料又は固体試料（例えば、細胞又は組織試料）とされ得る。生物試料は、次のような体液とされ得る：血液、血漿、血清、尿、膣液、（例えば、睾丸の）水瘤からの液、膣フラッシング液、胸膜液、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液、乳頭分泌液、（例えば、甲状腺や乳等）人体の異なる部分から吸引された液体等。生物試料は、糞便試料とされ得る。様々な実施形態では、（例えば、遠心分離プロトコルを経て取得された血漿試料等の）ｃｆＤＮＡについて精製された生物試料中のＤＮＡの主要部分は、無細胞とされていることができる（例えば、ＤＮＡの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％が無細胞とされていることができる）。生物試料に対しては処理をなして、組織又は細胞構造を物理的に破壊して（例えば、遠心分離及び／又は細胞溶解）、細胞内成分を溶液へと放出させることができ、該溶液は酵素、緩衝剤、塩、洗浄剤等をさらに含み得るのであり、これによって分析のために試料に準備を施し得る。生物試料は、対象から、侵襲的に（例えば、外科的手段により）又は非侵襲的に（例えば、採血、スワブ、又は放出された試料の収集により）取得できる。

【0063】

本明細書で使用する場合、「癌」または「腫瘍」という用語は、組織の異常な塊であって、その成長が正常な組織の成長を上回り且つこれと調整されていないものを指す。癌又は腫瘍は、次の特徴に応じて「良性」又は「悪性」として定義され得る：形態や機能を含む細胞分化の程度、成長速度、局所的浸潤及び転移。「良性」腫瘍は、分化度が高く、悪性腫瘍よりも特徴的に成長が遅く、発生部位に限局している場合がある。また、良性腫瘍は、遠隔箇所へと浸潤、侵食、又は転移する能力は有さない。「悪性」腫瘍は低分化型（退形成）であることがあり、進行性の浸潤、侵食、及び周囲組織の破壊を伴う特徴的に急速な成長を有する。さらに、悪性腫瘍は遠隔部位に転移する能力を有することがある。

【0064】

本明細書で使用する場合、循環無細胞ゲノムアトラス「ＣＣＧＡ」（Circulating Cell-free Genome Atlas）は、新規に診断を受けた癌患者からの血液及び組織並びに癌診断を有さない対象からの血液を前向きに収集する観測的臨床研究として定義される。本研究の目的は、癌と非癌とを判別し、また、癌の原発組織を識別する汎癌分類器を開発することである。例１では、ＣＣＧＡ１及びＣＣＧＡ２のデータセットについてさらに詳細を提供する。

【0065】

本明細書で使用する場合、「分類」という用語は、試料の特定の特性と関連付けられている任意の数値やキャラクタを指し得る。例えば、「＋」記号（或いは「陽性」との語）は、試料が削除又は増幅を有しているものとして分類されていることを徴表し得る。別の例では、「分類」という用語は次の事項を指し得る：対象及び／又は試料中の腫瘍組織の量、対象及び／又は試料中の腫瘍の大きさ、対象における腫瘍のステージ、対象及び／又は試料中の腫瘍ロード、並びに対象における腫瘍転移の存否。分類は、２値型とされるか（例えば、肯定又は否定）又はより多くの分類レベルを有し得る（例えば、１～１０或いは０～１の尺度）。「カットオフ」及び「閾値」という用語は、オペレーションにて用いられる所定の数値を指し得る。例えば、カットオフサイズは、断片が除外される上限サイズを指し得る。閾値は、特定の分類が適用となる上限値又は下限値とされ得る。これらの用語のいずれもが、それらのどちらの文脈でも用いられ得る。

【0066】

本明細書で使用する場合、「核酸」及び「核酸分子」という用語は、可換とされ得る。これらの用語は任意の組成形式の核酸を指すのであり、例えば、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノミックＤＮＡ（ｇＤＮＡ）等）、及び／又はＤＮＡ類似体（例えば、塩基類似体、糖類似体及び／又は非ネイティブバックボーン等）を含み、これらのいずれもが単鎖形式又は二重鎖形式であり得る。他の態様で限定されていない限り、核酸は天然ヌクレオチドの既知の類似体を含むことができ、その一部は天然由来のヌクレオチドと同様に機能し得る。核酸は、本明細書の処理をなすのに有用な任意のものとされ得る（例えば、線形、環状、スーパーコイル状、単鎖、二重鎖等）。一部の実施形態では、核酸（nucleic acid）は、単染色体又はその断片からのものであり得る（例えば、核酸試料（nucleic acid sample）は、２倍生命体から取得された試料の単染色体からのものであり得る）。特定の実施形態では、核酸は、ヌクレオソーム、ヌクレオソームの断片若しくは部分又はヌクレオソーム様構造を含む。核酸は、蛋白質（ヒストンやDNA結合蛋白質等）を含み得る。本明細書にて説明された処理によって分析された核酸は、時によっては、実質的に単離され、また、蛋白質又は他の分子と実質的に連関させられていない場合がある。核酸には、単鎖（「センス」又は「アンチセンス」、「プラス」鎖又は「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレーム又は「リバース」リーディングフレーム）及び二重鎖のポリヌクレオチドから合成、複製又は増幅されたDNAの誘導体、変種、及び類似体も含まれる。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンが含まれる。対象から得られた核酸をテンプレートとして、核酸をこしらえることができる。

【0067】

本明細書で使用する場合、「無細胞核酸」という用語は、細胞の外、被験者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹水等の体液中にて細胞外に発見することができる核酸分子を意味する。無細胞核酸は１つ以上の健常な細胞及び／又は１つ以上のがん細胞から生じるのであり、無細胞核酸は循環核酸と可換なものとして用いられる。無細胞核酸の例には、ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又はゲノミックＤＮＡが含まれるもこれらには限定されない。本明細書で使用する場合、「無細胞核酸」、「無細胞ＤＮＡ」、及び「ｃｆＤＮＡ」という用語は、可換なものとして用いられる。本明細書で使用する場合、「循環腫瘍ＤＮＡ（circulating tumor DNA）」又は「ｃｔＤＮＡ」という用語は、腫瘍細胞又は他のタイプの癌細胞由来の核酸断片を指すのであり、これは死にゆく細胞のアポトーシス又はネクローシス等の生物学的過程の結果として個人の人体から液体へと放出され得るのであり（例えば、血流中）、又は、めぼしい腫瘍細胞から積極的に放出され得る。

【0068】

本明細書で使用する場合、「断片」という用語は、「核酸断片」（例えば、ＤＮＡ断片）という用語と可換なものとして用いられるのであり、また、少なくとも３つの連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はポリペプチドシーケンスを指す。生物試料中に見つかった無細胞核酸断片のシーケンシングという文脈では、「断片」及び「核酸断片」という用語は、互換的に、生物試料又はその表現中に見つかる無細胞核酸分子を意味する。このような文脈では、シーケンシングデータ（例えば、全ゲノムシーケンシング、標的シーケンシング等からのシーケンスリード）は、そのような核酸断片の全部又は一部の１つ以上のコピーを導出するために用いられる。そのようなシーケンスリードは、実際には元の核酸断片のＰＣＲ複製のシーケンシングから得られる場合があり、したがって核酸断片を「表す」又は「サポート」しているといえる。各々が生物試料中の特定の核酸断片を表す又はサポートする複数のシーケンスリードがある場合がある（例えば、ＰＣＲ複製）。核酸断片は無細胞核酸とみなされ得る。一部の実施形態では、核酸断片の１つのコピーは、元の無細胞核酸分子を表すために用いられる（例えば、重複は、ライブラリ準備処理中に無細胞核酸分子に付着した分子識別子を介して除去される）。一部の実施形態では、メチル化シーケンシングデータは、これらの核酸断片をさらに区別するために用い得る。例えば、同一又は同一に近いシーケンスを有する２つの核酸断片が、それぞれ異なるメチル化パターンを含む場合、異なる元の無細胞核酸分子に対応し得る。

【0069】

なお、本明細書において、「健常」とは、対象が良好な健康を有していることを指す。健常な対象は、任意の悪性又は非悪性疾患の欠如を示し得る。「健常な個人」は、通常は「健常」とみなされ得ないが分析対象の状態とは無関係の他の疾患又は状態を有していることがある。

【0070】

本明細書で使用する場合、「癌のレベル」という用語は、癌が存在するか否か（例えば、存否）、癌のステージ、腫瘍のサイズ、転移の有無、推定腫瘍分画濃度、全腫瘍変異負荷値、身体の全腫瘍負荷、及び／又は癌の重症度（例えば、癌の再発）の他の指標を意味する。癌のレベルは、数値又は例えば記号やアルファベット文字や色等の他の指標たり得る。レベルは、ゼロとされ得る。癌のレベルは、突然変異又は幾つかの突然変異と関連付けられている前悪性の又は前癌性の状態をも含み得る。癌のレベルは様々な態様で用いられ得る。例えば、スクリーニングでは、以前は癌を有しているとは認識されていない人物に癌があるか否かをチェックすることができる。評価では、癌が診断された人物に関して調べることができ、経時的な癌の進行を監視したり、治療の有効性を検証したり、予後を見定めることができる。予後は、対象が癌によって死亡する確率、又は、癌が所定の期間若しくは時間経過後に進行する確率、又は、癌が転移する確率として表され得る。検出は、「スクリーニング」をなすことを含むか、或いは、癌を示唆する特徴（例えば、症状や他の陽性試験）を有している人物が癌を有するかをチェックすることを含む。「病状のレベル」は病原要素と関連付けられている病状のレベルを指し得るのであり、、レベルは癌については上述のようにされ得る。癌が病原要素と関連付けられている場合、癌のレベルは、病状のレベルのタイプたり得る。

【0071】

本明細書で使用する場合、「メチローム」は、ゲノム中の複数のサイト又は遺伝子座におけるメチル基を含むＤＮＡ修飾（例えば、メチル化又はヒドロキシメチル化修飾）の量又は程度の指標となり得る。メチロームは、ゲノムの全部若しくは一部、ゲノムのかなりの部分、又はゲノムの比較的小さな部分に、対応し得る。ゲノムのかなりの部分のメチル化プロファイルは、メチロームと等価とみなされ得る。対象となるメチロームは、体液中に核酸、例えばＤＮＡ等をもたらし得る臓器のメチローム（例えば、脳細胞、骨、肺、心臓、筋肉、腎臓等のメチローム）とされることができる。臓器は、移植臓器たり得る。

【0072】

本明細書で使用する場合、「メチル化」という用語は、ヒドロキシメチル化を含むがこれには限定されないメチル基が関与する任意の種類の改質を包括する。領域の「メチル化密度」は、領域内のメチル化を示すサイトにてのリード数を、領域内のサイトを包括するリードの総数で除した値とし得る。サイトは特定の特徴を有し得る（例えば、サイトはＣｐＧサイトたり得る）。領域の「メチル化密度」は、ＣｐＧメチル化を示すリード数を、領域内のＣｐＧサイトを包括するリードの総数で除した値とし得る（例えば、特定のＣｐＧサイト、ＣｐＧアイランド中のＣｐＧサイト、又はより大きな領域）。例えば、ヒトゲノムの各100kbビンのメチル化密度は、100kb領域にマッピングされたシーケンシングリードによって包括された全ＣｐＧサイトの割合として、ＣｐＧサイトにての未転換シトシン（メチル化シトシンに対応し得る）の総数から求めることができる。この分析は、他のビンサイズ、例えば50kbや1MB等についても行うこともできる。領域は、ゲノム全体、染色体、又は染色体の一部（例えば、染色体腕）とされ得る。

【0073】

哺乳類ゲノムにおける「ＤＮＡメチル化」とは、ＣｐＧジヌクレオチドのうち、シトシンの複素環の５位にメチル基を付加すること（例えば、５－メチルシトシンを生成すること）を指し得る。シトシンのメチル化は、例えば5'-CHG-3'及び5'-CHH-3'等の他のシーケンシングコンテキスト中のシトシンで生起し得るのであり、Hはアデニン、シトシン、又はチミンである。シトシンのメチル化は、５－ヒドロキシメチルシトシンの形の場合もある。ＤＮＡメチル化は、例えばＮ６－メチルアデニン等の非シトシンヌクレオチドのメチル化を含み得る。例えば、異なるゲノミック領域からのメチル化データ（例えば、メチル化についての密度、分布、パターン又はレベル）を１つ以上のベクトルセットに転換して、開示の方法及びシステムによって分析することができる。

【0074】

本明細書で使用する場合、「突然変異」という用語は、１つ以上の細胞の遺伝子物質における検知可能な変化を指す。特定の例について述べるに、癌細胞内において１つ以上の突然変異が見出され得るのであり、これらによって癌細胞を識別できる。突然変異は、明らかな細胞（apparent cell）から娘細胞（daughter cell）へと伝播し得る。当業者ならば、親細胞（a parent cell）内の遺伝変種（例えば、ドライバ変種）は、娘細胞内にて追加の異なる変種（例えば、パッセンジャ変種）を惹起し得ることに気付くであろう。突然変異は一般的には核酸内にて生じる。特定の例について述べるに、１つ以上のデオキシリボース核酸又はその断片内における検知可能な変化たり得る。突然変異は一般的には、追加、削除、置換、反転、又は核酸内の新たな位置へと転置されるヌクレオチドを指す。突然変異は自然突然変異又は実験的に誘発された突然変異とされ得る。特定の組織の配列における突然変異は、「組織特異的対立遺伝子」の一例である。例えば、腫瘍は、正常な細胞では生じない遺伝子座に対立遺伝子を結果としてもたらす突然変異を有し得る。「組織特異的対立遺伝子」のもう一つの例としては、胎児組織に発現するが母体組織には発現しない胎児特異的対立遺伝子がある。

【0075】

本明細書で使用する場合、「参照ゲノム」という用語は、任意の生物又はウイルスの部分的又は完全なものであるかを問わない、対象からの識別されたシーケンスを参照するために用いられ得る、任意の特定の既知のシーケンシング済み又は特徴付け済みゲノムを指す。ヒトや多くの他の生物に使用される典型的な参照ゲノムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）又はカリフォルニア大学サンタクルーズ校（ＵＣＳＣ）がホストしているオンラインゲノムブラウザ内で提供されている。「ゲノム」とは、生物又はウイルスの完全な遺伝情報を核酸配列で表現したものを指す。本明細書で使用する場合、参照シーケンスまたは参照ゲノムは、多くの場合、１つの個体又は複数の個体から組み立てられた又は部分的に組み立てられたゲノミックシーケンスである。一部の実施形態では、参照ゲノムは、１人以上のヒト個体からのアセンブルされた又は部分的にアセンブルされたゲノミックシーケンスである。参照ゲノムは、何らかの種の遺伝子のセットの代表例とみなすことができる。一部の実施形態では、参照ゲノムは染色体に割り当てられたシーケンスを含む。例示的なヒト参照ゲノムには、NCBI build 34（UCSC相当では：hg16）、NCBI build 35（UCSC相当では：hg17）、NCBI build 36.1（UCSC相当では：hg18）、GRCh37（UCSC相当では：hg19）、及びGRCh38（UCSC相当では：hg38）。

【0076】

本明細書で使用する場合、「シーケンシング」、「シーケンス決定」等の用語は、核酸や蛋白質等の生体高分子の順序を決定するために使用され得る任意の及びあらゆる生化学的処理を一般的に指す。例えば、シークエンスデータには、DNA断片等の核酸分子中に含まれるヌクレオチド塩基の全部又は一部が含まれ得る。

【0077】

本明細書で使用される場合、「シーケンスリード（sequence read）」又は「リード」という用語は、本明細書に記載されている又は当該技術分野で知られている任意のシーケンシング処理によって生じるヌクレオチド配列を指す。リードは核酸断片の片端から生成され得るし（「単一端リード」）、、核酸の両端から生成されることもある（例えば、ペア端リードやダブル端リード）。一部の実施形態では、シーケンスリード（例えば、単一端又はペア端リード）は、標的核酸断片の片方の鎖または両方の鎖から生成し得る。シーケンスリードの長さは、多くの場合特定のシーケンス技術に関連付けられている。例えば、高スループット方法では、サイズが数十から数百塩基対（bp、base pair）と変化するシーケンスリードもたらす。一部の実施形態では、シーケンスリードに関して、平均、中央値又は平均長が約15bp～約900bpの長さとなる（例えば、約20bp、約25bp、約30bp、約35bp、約40bp、約45bp、約50bp、約55bp、約60bp、約65bp、約70bp、約75bp、約80bp、約85bp、約90bp、約95bp、約100bp、約110bp、約120bp、約130bp、約140bp、約150bp、約200bp、約250bp、約300bp、約350bp、約400bp、約450bp、又は約500bp）。一部の実施形態では、シーケンスリードに関して、平均、中央値又は平均長が約1000bp、2000bp、5000bp、10,000bp、又は50,000bp以上となる。例えば、ナノポアシーケンシングでは、数十から数百から数千の塩基対のサイズのシーケンスリードをもたらし得る。Illuminaの並列シーケンシングでは、さほど散らばらないシーケンスリードを得ることができ、例えば、ほとんどのシーケンスリードが200bpより小さくなり得る。シーケンスリード（或いはシーケンシングリード）は、核酸分子（例えばヌクレオチド列）に対応するシーケンス情報を指し得る。例えば、シーケンスリードは、核酸断片の一部からのヌクレオチド列（例えば、約２０～約１５０）に対応することができ、核酸断片の片端または両端のヌクレオチド列に対応することができ、又は核酸断片全体のヌクレオチドに対応することができる。シーケンスリードは様々な方法によって取得され得るのであり、例えば、シーケンシング手法又はプローブを用いることによってであったり、例えば、ハイブリダイゼーションアレイ又はキャプチャープローブを用いたり、又は例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は単一のプライマーを用いる線形増幅又は等温増幅を用いる等の増幅手法ことにより取得され得る。

【0078】

「シーケンシング深度」、「カバレッジ」、及び「カバレッジ率」という用語は交換可能に用いられており、遺伝子座に整列した一意的核酸標的分子（「核酸断片」）に対応するコンセンサスシーケンスリードによって遺伝子座がカバーされている回数を指すのであり、例えばシーケンシング深度は遺伝子座を包括する一意的核酸標的断片（ＰＣＲシーケンシング重複を除く）の個数に等しい。遺伝子座は、小さければヌクレオチド程度のものから、大きければ染色体アーム程度のものまでになり得るのであり、或いはゲノム全体程度の大きなものまでとなり得る。シーケンシング深度は「ＹＸ」、例えば５０Ｘ、１００Ｘ等と表現でき、ここで「Ｙ」は核酸標的に対応するシーケンスを持って包括された回数を指すのであり、例えば特定の遺伝子座を包括する独立シーケンス情報が取得された回数とされる。一部の実施形態では、シーケンシング深度はシーケンス済みのゲノム数に対応する。シーケンシング深度は複数の遺伝子座又はゲノム全体にも適用され得るのであり、その場合Ｙは、ある遺伝子座や一倍体ゲノム、又は全ゲノムについて、それぞれがシーケンシングされる平均回数又は平均的回数を指し得る。平均深度について言及される場合、データセット中に含まれる異なる遺伝子座の実際の深度はある程度の数値範囲に散っていることがある。超深度シーケンシングでは、遺伝子座にて少なくとも１００Ｘのシーケンシング深度を扱える。

【0079】

本明細書で用いられる場合、「真の陽性」（ＴＰ、true positive）は、対象がある状態に陥っていることを指す。「真の陽性」は、腫瘍、癌、前癌状態（例えば、前癌病巣）、局所化した若しくは転移した癌、又は非悪性疾患を有した対象を指し得る。「真の陽性」は、対象が状態に陥っていることを指し得るのであり、本開示の解析又は方法によって状態に陥っているものとして識別される。

【0080】

本明細書で用いられる場合、「真の陰性」（ＴＮ、true negative）は、対象が状態（condition）に陥っていない又は検出可能な状態に陥っていないことを指す（refers）。真の陰性は、対象が疾患（disease）又は検出可能な疾患、例えば腫瘍、癌、前癌状態（例えば、前癌病巣）、局所化若しくは転移した癌、非悪性疾患を有さないこと、又は対象が他の意味で健常であることを指し得る（can refer）。真の陰性は、状態（condition）に陥っていない若しくは検出可能な状態に陥っていない対象又は本開示の解析又は方法によって状態に陥っていないものと識別された対象を指し得る。

【0081】

本明細書で用いられる場合、「感度」又は「真の陽性率」（ＴＰＲ、true positive rate）は、真の陽性の件数を、真の陽性及び偽陰性の件数の合計で除したものを指す。感度は、解析又は方法が、真に状態に陥っている母集団における割合を正しく識別する能力を特徴付け得る。例えば、感度は、ある手法が、癌に罹患している集団内の対象の数を正しく識別する能力を特徴付け得る。別の例では、感度は、ある方法が、癌を示す１つ以上のマーカを正しく識別する能力を特徴付け得る。

【0082】

本明細書で用いられる場合、「特異度」又は「真の陰性率」（ＴＮＲ、true negative rate）は、性真の陰性の件数を、真の陰性及び偽陽性の件数の合計で除したものを指す。特異度は、解析又は方法が、状態に真に陥ってない母集団における割合を正しく識別する能力を特徴付け得る。例えば、特異度は、ある方法が、癌に罹患していない集団内の対象の数を正しく識別する能力を特徴付け得る。別の例では、特異度は、ある方法が、癌を示す１つ以上のマーカを正しく識別する能力を特徴付け得る。

【0083】

本明細書で用いられる場合、「偽陽性」（ＦＰ、false positive）は、状態に陥っていない対象を指す。偽陽性は、腫瘍、癌、前癌状態（例えば、前癌病巣）、局所化若しくは転移した癌、非悪性疾患を有さない対象、又は他の意味で健常な対象を指し得る。偽陽性という用語は、状態に陥っていない対象ではあるが、本開示の解析又は方法によって状態に陥っているものと識別された対象を指し得る。本明細書で用いられる場合、「偽陰性」（ＦＮ、false negative）という用語は、状態に陥っている対象を指す。偽陰性は、腫瘍、癌、前癌状態（例えば、前癌病巣）、局所化若しくは転移した癌、又は非悪性疾患を有する対象を指し得る。偽陰性という用語は、状態に陥っているが本開示の解析又は方法によって状態に陥っていないものとして識別された対象を指し得る。

【0084】

本明細書で使用する場合、「単一塩基変異体」又は「ＳＮＶ」という用語は、ヌクレオチドシーケンス（例えば、個体からリードしたシーケンス）の位置（例えば、サイト）において、あるヌクレオチドが異なるヌクレオチドに置換されることを指す。第１の核酸塩基Ｘから第２の核酸塩基Ｙへの代替は「Ｘ＞Ｙ」と表記され得る。例えば、シトシンからチミンへのＳＮＶは「Ｃ＞Ｔ」と表記され得る。

【0085】

本明細書で使用する場合、「サイズプロファイル」及び「サイズ分布」という用語は生物試料中のＤＮＡ断片のサイズに関連し得る。サイズプロファイルは、様々なサイズのＤＮＡ断片の量の分布を表すヒストグラムたり得る。様々な統計パラメータ（サイズパラメータとも称するし単にパラメータとも称す。）は、あるサイズプロファイルを別のサイズプロファイルと区別することを可能とする。１つのパラメータは、特定のサイズ若しくはサイズ範囲のＤＮＡ断片の、全ＤＮＡ断片に対しての相対的な或いは別のサイズ又は範囲のＤＮＡ断片に対しての相対的な、パーセンテージとされ得る。

【0086】

本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、任意の生物又は非生物であって例えばヒト（例えば、男性のヒト、女性のヒト、胎児、妊娠中の女性、子供若しくはそれらに類するもの）、非ヒト動物、植物、細菌、真菌若しくは原生生物を含むがこれらに限定されないものを指す。任意のヒト又は非ヒト動物が対象となり得るのであり、これには、哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄類、反芻動物、ウシ（例えば、牛）、ウマ（例えば、馬）、ヤギ及びヒツジ（例えば、山羊や羊）、ブタ（例えば、豚）、ラクダ（例えば、駱駝やラマやアルパカ）、サル、類人猿（例えば、ゴリラやチンパンジー）、クマ（例えば、熊）、家禽、イヌ、ネコ、ネズミ、サカナ、イルカ、クジラ、サメ等が含まれるがこれらには限定されない。一部の実施形態では、対象は任意の段階の男性又は女性である（例えば、男、女又は子供）。

【0087】

本明細書で使用する場合、「組織」という用語は、機能的な単位として群集する細胞群に対応し得る。単一の組織中にて１つ以上のタイプの細胞が見出され得る。異なるタイプの組織は異なるタイプの細胞（例えば、肝細胞、肺胞細胞又は血液細胞）で構成され得るし、異なる生物（母対胎児）からの組織にも対応したり、健常細胞対腫瘍細胞に対応したりできる。「組織」という用語は、人体に内在する任意の細胞群（例えば、心臓組織、肺組織、腎臓組織、鼻咽頭組織、口腔組織等）を指し得る。「組織」又は「組織タイプ」という用語は、無細胞核酸の元となる組織を指すために用いられ得る。１つの例について言及するに、ウイルス核酸断片は血液組織から導き得る。別の例について言及するに、ウイルス核酸断片は腫瘍組織から導き得る。

【0088】

本明細書で使用する場合、「ベクトル」という用語は、要素のアレイのような要素について列挙したリストであり、各要素には割り当てられた意味がある。このように、本開示で用いられる「ベクトル」という用語は「テンソル」という用語と可換である。例を挙げるに、ベクトルが１０，０００ビンについてのビンカウントを含む場合、１０，０００ビンの各１つについてベクトル内には所定の要素が存在することとなる。表記の容易化のために、一部の場合においては、ベクトルは１次元的なものとして説明され得る。もっとも、本開示はそのように限定されはしない。本開示では、ベクトル中の各要素が何を表すのかについての記述が定義されていることを条件に、任意の次元のベクトルを用い得る（例えば、要素１は複数のビンのうちのビン１のビンカウントを表す等）。

【0089】

例示のために、例示的応用例を参照して幾つかの態様について後述する。本明細書に記載された特徴をについての完全な理解を供するために、多数の具体的な詳細、関係、及び方法が提示されていることを理解されたい。もっとも、関連技術において通常の技能を有する者ならば、本明細書に記載された特徴は、１つ以上の特定の詳細がなくとも実施可能であり、又は他の方法を用いて実施可能であることを容易に悟るであろう。幾つかの行為は異なる順序で起き及び／又は他の行為又は事象と同時的に発生し得る故に、本明細書に記載された特徴は、行為又は事象の例示順序によっては制限されない。さらに、本明細書に記載された特徴に従った手法を実施するためには、図示された行為又は事象の全てが必要なわけではない。

【0090】

ＩＩＩ． 試料処理
図１は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片をシーケンシングしてメチル化状態ベクトルを取得する処理についての例示的なフローチャートである。解析システム（又は本明細書の他の箇所にて記載される処理システム）は、先ず、複数のｃｆＤＮＡ断片を備える試料から、試料を、取得できる（Ｓ１１０）。一般に、試料は、健常な対象、癌を有しているもの知られているかそう疑われている対象、又は事前情報がない対象からのものとされることができる。試料（例えば、検査用試料又は訓練用試料のいずれか）は、血液、血漿、血清、尿、糞便、及び／又は唾液の試料から選択され得る。代替的には、試料は、全血、血液分画、組織生検、胸水、心嚢液、脳脊髄液、腹膜液等から選択され得る。

【0091】

試料からは、ｃｆＤＮＡ断片に対しての処理を経て非メチル化シトシンをウラシルへと転換できる（Ｓ１２０）。方法は、ｃｆＤＮＡ断片に対してのバイサルファイト処理（bisulfite treatment）を用い得るのであり、これによって非メチル化シトシンをウラシルへと転換するのであってその際メチル化シトシンは転換されずにこれがなされる。例えば、バイサルファイト転換（bisulfite conversion）に関しては、市販のキットを用い得るのであり、例えば、カリフォルニア州アーバインのZymo Research Corp社から入手可能なEZ DNA MethylationTM - GoldやEZ DNA MethylationTM - DirectやEZ DNA MethylationTM - Lightning等が挙げられる。非メチル化シトシンからウラシルへの転換は、酵素反応を用いて達成され得る。例えば、転換に関しては、非メチル化シトシンをウラシルへと転換する市販のキットを用い得るのであり、例えば、マサチューセッツ州イプスウィッチのNEBiolabs社のAPOBEC-Seq等が挙げられる。

【0092】

転換ｃｆＤＮＡ断片から、シーケンシングライブラリを準備し得る（Ｓ１３０）。随意的には、複数のハイブリッド化プローブを用いて、癌状態について情報を含有するｃｆＤＮＡ断片又はゲノミック領域について強化し得る（Ｓ１３５）。ハイブリッド化プローブは、標的ｃｆＤＮＡ断片、又は１つ以上の標的領域に由来するｃｆＤＮＡ断片にハイブリッドでき、また、その後のシーケンシング及び分析のためにそれらの断片又は領域を強化できる短オリゴヌクレオチドとされ得る。ハイブリッド化プローブは、興味対象の指定されたＣｐＧサイトのセットについての大深度標的分析をなすために用いられ得る。一旦準備されたらば、シーケンシングライブラリ又はその一部に対してシーケンシングをなすことができ、複数のシーケンスリードを取得できる（Ｓ１４０）。シーケンスリードは、コンピュータソフトウェアによる処理及び解釈のため、コンピュータ可読なデジタル形式とされ得る。複数の試料について準備及びシーケンシングを並列でなし得る。複数の試料は、少なくとも10個, 20個, 50個, 96個, 100個, 200個, 500個, 1000個, 10000個又はそれ以上の試料を含み得る。

【0093】

シーケンスリードから、分析システムは、参照ゲノムへの整列に基づいて、１つ以上のＣｐＧサイトの各々について、位置及びメチル化状態を、決定することができる（Ｓ１５０）。分析システムは、各断片についてメチル化状態ベクトルを生成できるのであり（Ｓ１６０）、これは、参照ゲノム中の断片の位置と、断片中のＣｐＧサイトの個数と、断片中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態（メチル化されている（Ｍ（methylated）と表記）、非メチル化（Ｕ（unmethylated）と表記）、又は不定（本明細書の他の箇所ではその他と説明もされるがＩ（indeterminate）と表記）であるかは問わない）とについて指定をなす。観測された状態は、メチル化及び非メチル化の状態を含み得るのであり；未観測状態は不定とされる。メチル化状態ベクトルは、後の使用及び処理のために、一時的又は永続的コンピュータメモリ内に格納され得る。さらに、分析システムは、重複するリード又は重複するメチル化状態ベクトルを、単一の対象から除き得る。分析システムは、汚染検出をなし得る（例えば、人間からの汚染源、予期せぬ生殖細胞系列ハプロタイプ、クロスサンプルのコンタミ、プローブのコンタミ、生物学的コンタミ、及び／又は技術者コンタミ）。分析システムは、品質管理メトリクスを評価し得る（例えば、強化、プルダウン、カバレッジ、及び／又は整列に関する事柄）。分析システムは、特定の断片が、不定のメチル化状態を有している１つ以上のＣｐＧサイトを有していると決定し得る。不定のメチル化状態は、シーケンシングの誤り及び／又はＤＮＡ断片の相補鎖のメチル化状態齟齬に起因していることがある。分析システムは、そのような断片を除外すると決定するか、そのような断片を選択的に含めるもそのような不定メチル化状態について配慮するモデルを構築すると決定できる。不定とされる試料をさらなる原発組織（ＴＯＯ、tissue of origin）分析から除外すると性能が改善され得る。

【0094】

図２は、メチル化状態ベクトルを取得するためのｃｆＤＮＡ断片シーケンシングについての図１の例示的処理１００について示す図である。例を挙げるに、分析システムは、ｃｆＤＮＡ断片１１２を取り込む。ｃｆＤＮＡ断片１１２は、３つのＣｐＧサイトを含み得る。示されるように、ｃｆＤＮＡ断片１１２の第１及び第３のＣｐＧサイトは、メチル化されていることができる（１１４）。処理ステップ１２０に際して、ｃｆＤＮＡ断片（cfDNA fragment）１１２に対して転換をなして転換ｃｆＤＮＡ断片（converted cfDNA fragment）１２２を生成できる。処理１２０に際して、メチル化されてはいない第２のＣｐＧサイトに関してはそのシトシンをウラシルへと転換できるのであり、その一方で第１及び第３のＣｐＧサイトに関しては転換をなさないことができる。

【0095】

転換後に、シーケンシングライブラリ１３０を準備してシーケンシング１４０をなしてシーケンスリード１４２を生成できる。分析システムは、シーケンスリード１４２を参照ゲノム１４４に整列１５０させることができる。参照ゲノム１４４は、断片ｃｆＤＮＡ（fragment cfDNA）がヒトゲノムのどの位置に由来するかについての文脈を提供し得る。分析システムは、３つのＣｐＧサイトがＣｐＧサイト２３，２４，２５（説明の便宜のために用いられる無作為な参照用識別子）に相互関連するようにシーケンスリードを整列１５０させることができる。したがって、分析システムは、ｃｆＤＮＡ断片１１２上の全ＣｐＧサイトのメチル化状態及びＣｐＧサイトがマッピングするヒトゲノム上の位置の両方についての情報を、生成できる。示されるように、メチル化されているシーケンスリード１４２上のＣｐＧサイトは、シトシンとしてリードされ得る。シトシンは、第１及び第３のＣｐＧサイト中のシーケンスリード１４２中に現れるのであり、それにより元のｃｆＤＮＡ断片中の第１及び第３のＣｐＧサイトがメチル化されていることを推認することが可能となる。一方で、第２のＣｐＧサイトはチミンとしてリードされ得るのであり（シーケンシング処理に際してＵがＴに転換される）、また、第２のＣｐＧサイトは元のｃｆＤＮＡ断片中ではメチル化されてはいないと推認可能である。これらの２つの情報（即ち、メチル化状態及び位置）に基づいて、分析システムは、ｃｆＤＮＡ断片１１２についてのメチル化状態ベクトル１５２を生成１６０できる。結果として得られるメチル化状態ベクトル１５２は＜Ｍ２３，Ｕ２４，Ｍ２５＞とされ得るのであり、ここで、「Ｍ」はメチル化ＣｐＧサイトに対応し（corresponds）、「Ｕ」は非メチル化ＣｐＧサイトに対応し、添字は参照ゲノム中の各ＣｐＧサイトの位置に対応し得る（can correspond）。

【0096】

実施例８との関係でさらに後述するように、識別されたメチル化状態ベクトルはｐ値フィルタリング及び分類に付されて、分類出力は結果報告に編纂されることできる。

【0097】

ＩＶ． 例示的システム
図５Ａは例示的な環境／システムを図示するのであり、これにおいては検査対象の疾患／癌状態を決定する方法を実装し得る。環境５００はシーケンシング装置５１０と１つ以上のユーザ装置５２０とを含み得るのであり、ネットワーク５２５を介して接続がある。

【0098】

シーケンシング装置５１０は、試料格納容器５１５と、フローセル５４５と、グラフィカルユーザインタフェース５５０と１つ以上の積み込みトレイ５５５とを含み得る。試料格納容器５１５は、１つ以上の検査及び／又は訓練用試料を搬送、保持、及び／又は格納するように構成されていることができる。フローセル５４５は、シーケンシング装置５１０のフローセルホルダー内に配されることができる。フローセル５４５は、ソリッドなサポートとされ得るのであり、拘束された検体上に試薬液を保持及び／又は規則正しく通過させるように構成されていることができる。グラフィカルユーザインタフェース５５０は、特定のタスクに関してのユーザ相互作用を可能とする（例えば、試料及び緩衝液を積み込みトレイ内に入れること、又は対応するメチル化パターンを伴うデータセットを含むシーケンシングデータを取得すること）。例を挙げるに、一旦ユーザ（例えば、検査対象や訓練対象や医療従事者等）がシーケンシング装置５１０の積み込みトレイ５５５に試薬及び精製断片試料を与えたのならば、ユーザは、シーケンシング装置５１０のグラフィカルユーザインタフェース５５０と相互作用することによってシーケンシングを開始できる。シーケンシング装置５１０は、本明細書の他の箇所にて説明した１つ以上の処理システムを含み得る。

【0099】

ユーザ装置５２０の各々は、ラップトップ機やデスクトップコンピュータ等のコンピュータシステム又はスマートフォンやタブレット等の携帯コンピューティング装置とされ得る。ユーザ装置５２０は、ネットワーク５２５を介してシーケンシング装置５１０と通信可能に結合されていることができる。各ユーザ装置はシーケンシング装置５１０から取得されたデータを様々な用途のために処理でき、例えばユーザのために癌状態についての報告を生成したりできる。ユーザは検査対象や訓練対象としたり任意の者（例えば、医療従事者）に報告に対してのアクセスを付与したりしてもよい。ユーザ装置５２０は、本明細書の他の箇所にて説明した１つ以上の処理システムを含み得る。１つ以上のユーザ装置５２０は、処理システム及びメモリを備え得るのであり、該メモリは、処理システムによって実行されると該処理システムに本明細書にて開示された任意の方法又は処理の１つ以上のステップを行わせるコンピュータ命令を格納している。

【0100】

ネットワーク５２５は、図５Ａに示される様々なコンポーネントや装置間での通信を実現するように構成されていることができる。ネットワーク５２５は、インターネット、無線ネットワーク、有線ネットワーク、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、Bluetooth（登録商標）、近距離無線通信（ＮＦＣ）、又は１つ以上のコンポーネント間の通信を提供する任意の他のタイプのネットワークとして実装可能である。ネットワーク５２５は、セルラー及び／又はポケベルネットワーク、人工衛星、認可制無線、又は認可制無線と認可不要無線との組合せによって実装され得る。ネットワーク５２５は、無線式、有線式、又はそれらの組合せとされ得る。ネットワーク５２５は、公衆ネットワーク（例えば、インターネット）、私設ネットワーク（例えば、組織内ネットワーク）、又は公衆及び私設ネットワークの組合せとされ得る。

【0101】

図５Ｂは、検査対象の疾患／癌状態を決定するための処理システム５６０についての例示的ブロック図を示す。処理システム５６０は、１つ以上のプロセッサ又はサーバを備え得るのであり、これによって本明細書にて開示された任意の方法又は処理の１つ以上のステップがなされる。処理システム５６０は、複数のモデル（model）、エンジン、及びモジュール（module）を含み得る。図５Ｂに示されるように、処理システム５６０は、データ処理モジュール５６２と、データ構築モジュール５６４と、アルゴリズムモデル５６６と、通信エンジン５６８と１つ以上のデータベースとを含み得る。

【0102】

データ処理モジュール５６２は、シーケンシング装置５１０から取得されたデータに対して、クリーニング、処理、管理、転換、及び／又は変換をなすように構成されていることができる。１つの例を挙げるに、データ処理モジュール５６２は、シーケンシング装置から取得されたデータを、他のモジュール、エンジン、又はモデルにて使用及び／又は認識できるデータに、転換することができる。例えば、データ構築モジュール５６４は、データ処理モジュール５６２からのデータから出力データを構築できる。データ構築モジュール５６４は、シーケンシング装置５１０、又は、処理システムの任意のモジュール、モデル、及びエンジンから取得されたデータを、構築する及び／又はさらに処理するように構成されていることができる（例えば、本明細書の他の箇所にて説明されている１つ以上のパッチを構築すること）。１つの例を挙げるに、データ構築モジュール５６６は、複数の断片からそれぞれの各々の断片を除くことによって複数の断片に対してプルーニングをなし得る。

【0103】

アルゴリズムモデル５６８は、１つ以上のアルゴリズム又はモデルを介して、データに対して、分析、移転、転換、モデリング、及び／又は変換をなし得る。そのようなアルゴリズム又はモデルは、本明細書の他の箇所にて説明されている分類器や計算モデル等の任意の演算的、数学的、統計的、又は機械学習系アルゴリズムを含み得る。分類器又は計算モデルは、少なくとも１つの畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ、convolutional neural network）パッチを含み得る。分類器又は計算モデルは、第１段階モデル及び第２段階モデルを備え得る。第１段階モデルは、複数のベクトルセットを逐次的に受信し且つ複数の出力スコアをもたらし得るのであり、また、第２段階モデルは、第１段階モデルによってもたらされたベクトルセットを受信し且つ出力スコアをもたらし得る。分類器又は計算モデルは層を含み得るのであって、該層は、入力値を受信し且つフィルタ重みのセットを含む少なくとも１つのフィルタと関連付けられている。該層は、中間値を次の関数として算出できる：（ｉ）フィルタ重みのセット及び（ｉｉ）複数の入力値。分類器又は計算モデルは、１つ以上のデータベース（例えば、非永続的メモリ又は永続的メモリ）内に格納されていることができる。

【0104】

通信エンジン５６８は、１つ以上のキーボードやマウス装置やそれらに類するもの等の１つ以上のユーザ装置（例えば、ユーザ装置５２０）へのインタフェースを提供するように構成されていることができるのであり、それによって１つ以上のユーザ装置５２０又はシーケンシング装置５１０からデータ及び／又は任意の情報を受信することが可能となる。

【0105】

１つ以上のデータベース５７０は、データ（例えば、予め訓練されたモデルや訓練データセット等）を格納するように構成された１つ以上のメモリ装置を含み得る。追加的には、１つ以上のデータベース５７０は、記憶装置付きコンピュータシステムとして実装され得る。１つ以上のデータベース５７０は、システム又は装置（例えば、シーケンシング装置５１０）のコンポーネントによって用いられて１つ以上のオペレーションをなすことができる。１つ以上のデータベース５７０は、処理システム５６０と共に配置されている、及び／又はネットワーク上で各々別のものと共に配置されていることができる。１つ以上のデータベース５７０の各々は、他のデータベースとの関係で同じ又は異なるものとされ得る。１つ以上のデータベース５６４の各々は、同じ位置に又は他のデータベースとの関係でリモートに配置され得る。１つ以上のデータベースは、上述されていない又は他の所でも説明されていない追加的なモジュール及びデータ構造を格納し得る。

【0106】

上述の識別されたコンポーネント（above identified component）（例えば、モジュール）は、別個のソフトウェアプログラム、手続、データセット、又はモジュールとして実装できない場合があり、したがって、これらのモジュール及びデータについての様々なサブセットは、様々な実装において組み合わされるか、或いは再構成され得る。一部の実施形態では、１つ以上の上述の識別された要素（above identified element）は、システム５００以外のコンピュータシステム内に格納され得るのであり、それにおいてはシステム５００によってアドレス可能でありそれによってシステム５００はそのようなデータの全部又は一部を必要に応じて検索し得る。

【0107】

Ｖ．例示的方法
図５Ａ及び５Ｂを参照して本開示に即するシステムを開示したのであるが、本開示に即する例示的方法８００について次に図８Ａとの関連で説明する。方法は、本明細書で開示される環境５００及び／又は処理システム５６０によって実行され得る。

【0108】

方法８００のステップ８０２には、電子的態様にてデータセットを取得するステップであって、該データセットは複数の断片中のそれぞれの各々の断片の対応するメチル化パターンを備える、ステップを含み得る。それぞれの各々の断片の前記対応するメチル化パターンは、前記検査対象から取得された生物試料中の前記各々の断片を備える１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングによって決定され得る。それぞれの各々の断片の前記対応するメチル化パターンは、前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含む。

【0109】

複数の断片中の各断片は一意的な断片を含み得るのであり、その核酸シーケンスは異なるゲノミック位置又は位置に整列する（又はマッピングされる）。複数の断片中の各断片は一意的な断片を含み得るのであり、これは異なるメチル化パターンを含む。断片のシーケンスリードがマップされる位置は、BLAST、BLASR、BWA-MEM、DAMAPPER、NGMLR、GraphMap、Minimap等のプログラムを用いて決定し得る。BGREATとdeBGAは、いずれも第２世代シーケンシングデータに対応するように設計されていることができる。BlastGraphは、BLASTマッピングの結果を用いて、アラインメントのクラスタリングや比較ゲノム解析をなし得る。GramToolsは、ショートリードを母集団参照グラフにマッピングできる。

【0110】

１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングは、（ｉ）全ゲノムメチル化シーケンシング、（ｉｉ）全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ、whole genome bisulfite sequencing）、又は（ｉｉｉ）複数の核酸プローブが用いられる標的ＤＮＡメチル化シーケンシングを含み得る。１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングは、還元表現バイサルファイトシーケンス、メチル化DNA免疫沈降シーケンシング、次世代シーケンシング、パイロシーケンシング、メチル化特異的PCR、バイサルファイト転換ＤＮＡの直接サンガー（Sanger）シークエンス、及び／又はバイサルファイト アンプリコン シーケンシング（ＢＳＡＳ、Bisulfite Amplicon Sequencing）を含み得る。メチル化シーケンシングは、Nanoporeシーケンシング又はIlluminaシーケンシングを用いてなされ得る。１つ以上の核酸試料のメチル化シーケンシングは複数の核酸プローブを用い得る（例えば、100個未満、100個～1000個の間、500個～10,000個の間、1000個～50,000個の間、又は50,000個以上）。

【0111】

標的ＤＮＡメチル化シーケンシングは、様々な態様にてなされ得る。異なる酵素処理及び化学処理との組合せを用いて、メチル化シトシン又は非メチル化シトシンのいずれかを転換できる。例えば、１つ以上の核酸試料についての前記メチル化シーケンシングは、１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍｃ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍｃ）を前記各々の断片にて検出できる。別の例を挙げるに、１つ以上の核酸試料についての前記メチル化シーケンシングは、前記各々の断片中の１つ以上の非メチル化シトシン又は１つ以上のメチル化シトシンを対応する１つ以上のウラシルに転換することを伴い得る。前記１つ以上のウラシルは、前記メチル化シーケンシングに際して、１つ以上の対応するチミンとして検出され得る。１つ以上の非メチル化シトシン又は１つ以上のメチル化シトシンについての前記転換は、化学転換、酵素転換、又はそれらの組合せを含み得る。

【0112】

方法８００のステップ８０４は次のステップをさらに含み得る：第１のチャンネルを含む第１のパッチを構築するステップ。前記第１のパッチは、前記種の参照ゲノム中の、ＣｐＧサイトの第１の独立セットを表し得る。ＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中のそれぞれの各ＣｐＧサイトは、前記参照ゲノム中の所定の位置に対応し得る。図６Ａは例示的な第１のパッチ５３０－１の構造を示す。第１のパッチ５３０－１は少なくとも１つのチャンネル（例えば、第１のチャンネル）を含み得るのであり、第１のチャンネル５３２－１－１はＣｐＧサイト１乃至Ｌを含むＣｐＧサイトの第１の独立セット５３６－１－１－１を含み得る。ここで、Ｌは正の整数たり得る（例えば、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10以上, 20以上, 30以上又は 50以上）。

【0113】

ＣｐＧサイトの第１の独立セットは、所定の個数のＣｐＧサイトを含み得る。ＣｐＧサイトの第１の独立セットは、参照ゲノムの選択領域を含み得る。ＣｐＧサイトの第１の独立セットは、少なくとも10, 50, 100, 500, 1000又はそれ以上のＣｐＧサイトを含み得る。ＣｐＧサイトの第１の独立セットは、多くとも1000, 500, 100, 50, 10又はそれ以下のＣｐＧサイトを含み得る。ＣｐＧサイトの第１の独立セットは、１２８個又は２５６個のＣｐＧサイトを含み得る。ＣｐＧサイトの第１の独立セットは、興味対象たるＣｐＧサイトについての所定のパネルから、選択され得る。例えば、ヒトゲノムに内在する約2,800万個のＣｐＧサイトのうち、約150万個が標的メチル化シーケンシングによって検出可能である。標的メチル化シーケンシングによって識別された１５０万のＣｐＧサイトを有するパネルは、標的シーケンシング方法によって予め決定されることができ、或いは、具体的な実験的目的に基づいて術者によって選択されることができる。ＷＧＢＳによるヒトメチロームの特徴付けによって、安定的にメチル化されており且つ識別可能な制御機能を有していないＣｐＧサイトと比較して、動的制御機能を有するＣｐＧサイト又は疾患と関連付けられている単一ヌクレオチド多型を含むＣｐＧサイトを識別できる。

【0114】

興味対象たるＣｐＧサイトの個数は、先験的な知識に基づいて興味対象となる標的サイトのサブパネルを用いてシーケンスリードをフィルタリングすることによって、さらに減じることができる。例えば、興味対象ＣｐＧサイトは、癌対非癌の検出又は癌タイプ若しくはサブタイプ間での区別に関して判別的又は情報提供的なＣｐＧサイト又はゲノム領域を識別する先験的な知識によって、取得できる。興味対象ＣｐＧサイトのある比率は、ｐ値フィルタリングを用いて、データセットからさらに除外できる。興味対象ＣｐＧサイトのサブパネル中に含まれないＣｐＧサイトの除外は、データ前処理中に、又はパッチ設計中になし得るのであり、データ処理モジュール５６２及び／又はデータ構築モジュール５６４を介してなされ得る。パッチ設計及び興味対象ＣｐＧサイト選択の詳細は、明細書の他の箇所にて説明されている。

【0115】

ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは、前記参照ゲノムのＣｐＧインデックス中にある場合がある。前記参照ゲノムの前記ＣｐＧインデックスは、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに中には所在しないもＣｐＧサイトの前記第１の独立セット内に所在する第２のＣｐＧサイトと第３のＣｐＧサイトとの間の前記参照ゲノム中に位置する第１のＣｐＧサイトを含み得る。換言すれば、パッチは、ＣｐＧインデックスからの非隣接ＣｐＧサイトを含み得る。ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは、前記参照ゲノムのＣｐＧインデックス中において互いに隣り合う第１のＣｐＧサイトと第２のＣｐＧサイトとを含み得るのであり；前記複数の断片中の第１の断片は、前記第１のＣｐＧサイトを含むも前記第２のＣｐＧサイトを含まないことがあり；前記複数の断片中の第２の断片は、前記第２のＣｐＧサイトを含み得るも前記第１のＣｐＧサイトを含まないものとされることができる。したがって、隣接ＣｐＧサイトは異なる一意的なメチル化シーケンシング断片上に存在することができる。他方で、 ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは、前記参照ゲノムのＣｐＧインデックス中において互いに隣り合う第１のＣｐＧサイトと第２のＣｐＧサイトとを含み得るのであり；また、前記複数の断片中の第１の断片は、前記第１のＣｐＧサイト及び前記第２のＣｐＧサイトの両方を含み得る。したがって、隣接ＣｐＧサイトは同じ一意的なメチル化シーケンシング断片上に存在することができる。ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは、前記参照ゲノム全体から抽出され得る。メチル化シーケンシングによって取得された複数の断片中の各断片は、参照ゲノムに整列させられていることができる。参照ゲノムへの整列は、複数の断片中の各断片中のメチル化サイト（例えば、メチル化パターン）の整列を用いてなし得る。参照ゲノムへの整列は、複数の断片中の各断片中の塩基対の整列を用いて（例えば、BLAST、BLASR、BWA-MEM、DAMAPPER、NGMLR、GraphMap、Minimap等のプログラムを用いて）なし得る。

【0116】

前記第１のパッチの前記第１のチャンネルは第１の複数のパラメータについての複数のインスタンスを含み得るのであり、前記第１の複数パラメータの各インスタンスは前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態（又はメチル化の様子）についてのパラメータを含み得る。

【0117】

図６Ａを参照するに、複数のインスタンスは、ＣｐＧサイトの第１の独立セット中の各ＣｐＧサイトに対応する複数のパラメータを伴い得る。図６Ａに示されるように、第１のパッチ５３０－１の第１のチャンネル５３２－１－１は、複数のインスタンス５３４－１－１－１，５３４－１－１－２～５３４－１－１－Ｍを含む（ここで、Ｍは正の整数）。また、図６Ａでは、各インスタンスは、Ｌ個のパラメータ５３８－１－１－１－１，５３８－１－１－１－２，５３８－１－１－１－３，５３８－１－１－１－４～５３８－１－１－１－Ｌを第１のインスタンス５３４－１－１－１にて含み得るのであり（ここで、Ｌは正の整数）、各パラメータはＣｐＧサイトの第１の独立セット５３６－１－１－１中のＬ個のＣｐＧサイトに対応する。同様に、図６Ａは、第２のインスタンス５３４－１－１－２中のＬ個のパラメータ５３８－１－１－２－１，５３８－１－１－２－２，５３８－１－１－２－３，５３８－１－１－２－４～５３８－１－１－２－Ｌと、第Ｍのインスタンス５３４－１－１－Ｍ中のＬ個のパラメータ５３８－１－１－Ｍ－１，５３８－１－１－Ｍ－２，５３８－１－１－Ｍ－３，５３８－１－１－Ｍ－４～５３８－１－１－Ｍ－Ｌとを示す。

【0118】

図６Ａの例示的パッチにて示されているように、複数のインスタンス及び複数のパラメータによって、代表的な２次元マトリックス（例えば、イメージ）がもたらされる。したがって、メチル化シーケンシングデータを２次元マトリックスにて再構成すると、ＣＮＮにて用いるのに適した入力がもたらされ得る。追加的に、ＣＮＮを用いてのデータセットの分析は、断片、試料又は対象レベルにて複数のパラメータ（例えば、特徴又は属性）を含むものとなるように拡大できる。例えば、２次元マトリックスによって複数の断片中のそれぞれの各々の断片についての局所的情報をもたらし得るのであり、断片間メチル化状態パターンは水平又は垂直方向にて識別され得るのであり、したがって、近隣メチル化サイト間の又はシーケンスリード間の相関が識別される。

【0119】

２次元マトリックスのｙ軸は、第１のパッチの第１のチャンネル中のインスタンス数を増やすことによって増やせる。例えば、第１の複数のパラメータの複数のインスタンスは、２４個から２０４８個とされることができる。第１の複数のパラメータの複数のインスタンスは、１２８個とされることができる。第１の複数のパラメータの複数のインスタンスは、少なくとも１個、１０個、１００個、１０００個、１００００個又はそれ以上とされることができる。一部の実施形態では、前記第１の複数のパラメータの前記複数のインスタンスは多くとも１００００個、１０００個、１００個、１０個又はそれ以下とされることができる。前記第１の複数のパラメータの前記複数のインスタンス中のインスタンス数は、前記複数の断片の期待リード深度に前記複数の断片にわたっての１標準偏差加わったものに基づいて決定され得る。これは、μ（リード深度）＋σ（標準偏差）として表され得る。一部のそのような実施形態では、前記第１の複数のパラメータの前記複数のインスタンス中のインスタンス数は、本明細書の他の箇所にて説明されたシーケンシング方法によって取得された前記複数の断片の期待リード深度に基づいて決定され得る。例えば、全ゲノムシーケンシングによってなされたシーケンシングは、検査対象のゲノムにわたって平均シーケンシング深度が少なくとも1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x、少なくとも20x、少なくとも30x、又は少なくとも40xとなり得る。標的パネルシーケンシングに関してのシーケンシング深度は比較してかなり深いものとなり得るのであり、次の深度を含むがこれらに限定されない：多くて1,000x, 2,000x, 3,000x, 5,000, 10,000x, 15,000x, 20,000x、又は約30,000x。シーケンシング深度は30,000xよりも深くなり得るのであり、例えば、少なくとも40,000x又は50,000xがあり得る。

【0120】

前記第１の複数パラメータのインスタンスにおけるメチル化状態についてのパラメータは、前記複数の断片中の各々の断片に関しては、次の事柄を含み得る：前記各々の断片中の前記対応するＣｐＧサイトが前記メチル化シーケンシングによってメチル化していると決定された場合には、メチル化しているとされること；前記各々の断片中の前記対応するＣｐＧサイトが前記メチル化シーケンシングによってメチル化していないと決定された場合には、メチル化していないとされること；及び／又は前記各々の断片中の前記対応するＣｐＧサイトが前記メチル化シーケンシングによってメチル化している又はメチル化していない以外のものと決定された場合には、それ以外とされること。それ以外とのパラメータに関しては：メチル化シーケンシングが各々の断片の全体にわたって集合的に重複することについて失敗した場合には、曖昧（ambiguous）とフラグされて；基礎となるＣｐＧサイトがペア付け済み端部リード（paired end read）によって包括されていない及び／又は断片と重複するメチル化シーケンシングリードが見つからない場合には、曖昧（ambiguous）とフラグされて；各々の断片についてのメチル化シーケンシングが各々の断片中の対応するＣｐＧサイトの予期された位置にて、対応するＣｐＧサイトと一貫性を欠く（inconsistent）ヌクレオチドを見つけた場合には、変種（variant）とフラグされて；各々の断片のメチル化シーケンシングがペア端部シーケンシング（pair-end sequencing）であり且つ対応するＣｐＧサイトを包括するペア付け済み端部リード（paired end read）のメチル化状態が各々の断片中の対応するＣｐＧサイトについてのと同じメチル化状態を報告しない場合には、抵触（conflicted）とフラグされて；又は各々の断片のメチル化シーケンシングが対応するＣｐＧサイトのメチル化状態について解決をもたらすことができない場合には、未知（unknown）とフラグされる。メチル化状態は次の状態を含み得るもそれらには限定されない：非メチル化；メチル化；曖昧（ambiguous）（例えば、基礎となるＣｐＧがシーケンスリードのペア中のいずれのリードによっても包括されていない場合）；変種（variant）（例えば、リードが、参照シーケンスに基づいてのその期待された位置に発生するＣｐＧとの一貫性を欠いている（not consistent）場合であってこれはサイトにての現実の変種又はシーケンス誤りによって惹起され得る。）；又は抵触（conflict）（例えば、２つのリードが共に重複するも一貫性を欠く（not consistent）場合）。曖昧、変種、抵触等のメチル化状態は、曖昧状態に押し込めることができる（例えば、それ以外（other））。したがって、ＣｐＧ状態の可能性としては、メチル化、非メチル化、及び曖昧の３つの状態がある。

【0121】

前記第１のパッチを構築するステップは、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれの各々の断片について、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入することを含み得る。複数の断片中のそれぞれの各々の断片をＣｐＧサイトの第１の独立セットに整列させるに際しては、断片がＣｐＧサイトの第１の独立セット中の全ＣｐＧサイトを含む場合を含まないことができる。

【0122】

前記第１のパッチを構築するステップは、前記第１のパッチに割り当てられた各々の断片を、それらの各々のｐ値又は前記参照ゲノムにおけるそれらの開始位置に基づいて、ソート／選択することをさらに含み得る。例えば、フラグメントをｐ値又は開始ＣｐＧ位置でランク付けすることによって、第１のパッチに投入する前に、断片をソート／選択することができる。断片は、断片長によってソート／選択され得る。断片を第１のパッチのインスタンスに投入できるのであって、断片センタリング（例えば、ミドルアウト又は中間に置かれた断片を選択すること）を優先させたり、或いは、インスタンス充填（例えば、トップダウン又は上位にランク付けされた断片を幾つか選択すること）を優先したりしてこれをなせる。第１のパッチを異なる方法（例えば、ｐ値又は位置によって断片をソートすること及び／又はトップダウン又はミドルアウトを用いてインスタンスに投入すること）によって構築することによって、２次元マトリックス（例えば、パッチ）に相違が結果としてもたらされ得る。第１のパッチを異なる方法によって構築することによって、癌タイプの一貫した分類が結果としてもたらされ得る。例えば、上述の任意の実施形態又はそれらの組合せを用いて第１のパッチに投入することによって、成功裏な分類のためのネットワーク入力が提供され得るのであり、これは試料間で再現可能且つ安定している安定パターンを生成することによってなされる。図６Ｃは非癌ｃｆＤＮＡから取得されたメチル化シーケンシング断片が投入されたパッチの例について例示するのであり、これは２次元マトリックスとして表されている。インスタンスはｙ軸で表され得るのであり、一方でＣｐＧサイトに対応するパラメータ（例えば、メチル化については黒色、非メチル化については濃灰色、その他については白色、空白については薄灰色）はｘ軸で表され得る。断片情報は、パッチ内の各画素についてのセルシェーディングによって表示され得る。

【0123】

複数の断片中の各々の断片についての第１のパッチを構築するステップは、ｉ）第１のチャンネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、各々の断片中のＣｐＧサイトに対応する、複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別することと、ｉｉ）識別されたパラメータのうちの各々の断片の対応するＣｐＧサイトに整列する各パラメータについて、各々の断片の対応するＣｐＧサイトのメチル化状態を割り当てることとを含み得る。例えば、図６Ｄでは、識別ステップは、任意のインスタンスを活用できる。なぜならば、チャンネルには断片が割り当てられていないからである。したがって、図６Ｅに例示されているように、第１断片６０２は、第１の複数のパラメータのインスタンス６０４に割り当てられ得る。第１断片は、第１断片のＣｐＧサイトに対応する第１の複数のパラメータのインスタンス６０４内のそれらのＣｐＧサイトに、割り当てられ得る。

【0124】

前記複数の断片中の１つより多い断片は、前記１つより多い断片が共通ＣｐＧサイトを有さないことを条件として、前記第１のパッチ中の前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータの単一のインスタンスに割り当てられ得る。したがって、図６Ｄ及び６Ｅの例についてさらに述べるに、図６Ｆで例示されるように第２断片ＣｐＧサイトが第１断片のＣｐＧサイトと重複しない場合には、第２断片６０６は、第１の複数のパラメータのインスタンス６０４に、割り当てられ得る。したがって、図６Ｆでは、複数の断片が単一インスタンス内へと投入される場合、それぞれの各々の断片は、インスタンス内の複数の断片内の任意の他の断片と重複できない。このようにして、断片のＣｐＧサイトが互いに重複しないことを条件に、複数のパラメータのインスタンスには、１個より多い或いは２個より多い或いは３個より多い或いは１０個より多い或いは２０個より多い断片が、割り当てられ得る。第１及び第２断片のＣｐＧサイト内に重複がある場合、２つの断片は、複数のパラメータの同じインスタンス内にあることができない。したがって、第２断片６０６は、図６Ｆにて例示されているようにインスタンス６０４に割り当てられている代わりに、図６Ｇに例示されているようにインスタンス６０８に割り当てられていることができる。

【0125】

前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータの幾つかのインスタンスに各々の断片が割り当てられることができない場合、方法８００は、断片が割り当てられていない前記第１のチャンネルの前記複数のパラメータのインスタンス中にてパラメータについてゼロで埋めることをさらに含み得る。例えば、図６Ｃでは、幾つかのインスタンス（ｙ軸）には各々の断片が割り当てられることができず、また、これらのインスタンス内の各パラメータには、ゼロや何らかの他の名目的値が割り当てられ得る。

【0126】

前記識別ステップで、前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、前記各々の断片中の前記ＣｐＧサイトに対応する、前記複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別できない場合、方法は、前記各々の断片を破棄することをさらに含み得る。。図６Ｇを参照するに、図示されたチャンネルの全ての行は、少なくとも１つの断片であって、そのＣｐＧサイトが未だチャンネルに割り当てられていない各々の断片のＣｐＧサイトと重複する、少なくとも１つの断片を、含み得る。このような場合、未だチャンネルに割り当てられていない各々の断片は、破棄され得る。

【0127】

第１のパッチ中の複数のインスタンス中のインスタンス数は、より高度なリード深度を可能とするために、増大させ得る。複数のインスタンス中のインスタンス数は、３００迄、５００迄、１０００迄、５０００迄、１０，０００迄、又は１０，０００より大きいものとされ得る。したがって、図６Ｄ～６Ｎを参照するに、そのような実施形態における行数は、 ３００迄、５００迄、１０００迄、５０００迄、１０，０００迄、又は１０，０００より大きいものとされ得る。ｐ値閾値を減少させることができ（これによって合格する断片の個数が減じられる）、断片選定の厳格性を増大させ得るのであり、高信号メチル化パターンを伴う全ての断片が複数のインスタンス内へと投入されることを担保できる。実施例８にて論じたように、リード深度は、パッチ構築用のハイパーパラメータを調整することによって変更できる。実施例８にて論じたように、ｐ値は、パッチ構築用のハイパーパラメータを調整することによって変更できる。ハイパーパラメータ値は解析の具体的要素に基づいて決定され得る（例えば、他のものもあるも、試料サイズ、試料タイプ、メチル化シーケンシングの方法、断片品質、メチル化パターン）。ハイパーパラメータ値は、実験的最適化を用いて決定できる。ハイパーパラメータ値は、以前のテンプレート値に基づいて割り当てられ得る。

【0128】

前記識別ステップで、前記第１のパッチの前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、前記各々の断片中の前記ＣｐＧサイトに対応する、前記複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別できなかった場合、方法は、前記第１のパッチの追加のインスタンスを作成するための命令及び前記各々の断片を前記第１のパッチの前記追加のインスタンスに割り当てることをさらに含み得る。したがって、図６Ｄを参照するに、図６Ｄに例示されるパッチ内の各々の断片のための場所がない場合、図６Ｄに例示されるパッチの新規な空レプリカ又はパッチの追加インスタンスが作成され得る。方法は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20、又は20個以上の追加パッチ若しくはインスタンスを作成することをさらに含み得る。追加パッチは、第１（例えば、元来の）パッチ（例えば、図６Ｄ）と同一の構造を有し得る。したがって、追加又は重複パッチは、元来のパッチに関して他のものもあり得るが、例えば、同じインスタンス数、独立ＣｐＧサイトについての同じセット、同じチャンネル数、及び／又は同じ特徴を含み得る。追加パッチは、第１（例えば、元来の）パッチと同一の構造を有さない場合がある。追加インスタンスは、図６Ｄに例示されているような他のインスタンスと同じ又は異なる構造を有し得る。

【0129】

各々の断片の前記メチル化パターンは前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各ＣｐＧサイトを含まないことがあり、また、前記複数の断片中の各々の断片について前記第１のパッチを構築するステップは、前記各々の断片内に存するＣｐＧサイトに対応する第１の複数のパラメータの前記インスタンス中のパラメータに投入すること（例えば、パラメータに数値を割り当てること）を含み得る。第１の複数のパラメータのインスタンス内のパラメータは、ゼロで埋められていることができる。したがって、図６Ｆを参照するに、断片６０２，６０６によって占有されていないインスタンス６０４内のそれらのパラメータについては、ゼロで埋めることができる。

【0130】

第１のパッチの構築ステップには、第１のパッチのＣｐＧサイトの第１の独立セットと第１の複数のパラメータの複数のインスタンス中のインスタンス数との積が、所定の制約を充足するように最小化されることが含まれ得る。例えば、ＣｐＧサイトの第１の独立セットが「１００」であり、且つ、第１の複数のパラメータの複数のインスタンス中のインスタンス数が「５０」である場合、第１のパッチのＣｐＧサイトの第１の独立セットと第１の複数のパラメータの複数のインスタンス中のインスタンス数との積は、５０００となり得る。所定の制約は、大きくとも、100万、500,000、100,000、50,000、10,000、1000、100以下とされ得る。一部の実施形態では、所定の制約は、少なくとも100、1000、10,000、50,000、100,000より大きいものとされ得る。第１のパッチの構築ステップに関しては、ＣｐＧサイトにわたっての高次特徴を捕捉するために、第１のパッチのＣｐＧサイトの第１の独立セットがＣｐＧサイトについての所定の下限数（例えば、３０個以上、５０個以上、又は１００個以上）を有することを伴い得る。

【0131】

第１のパッチの構築ステップに関して述べるに、第１のパッチのＣｐＧサイトの第１の独立セット中のＣｐＧサイトの個数と、第１の複数のパラメータの複数のインスタンス中のインスタンス数とが、予め構築されたマトリックスと同じ対応する次元（ＣｐＧサイトの個数，インスタンス数）となっていることが含まれ得る。予め構築されたマトリックスは予め訓練されたネットワークとされることができ、該予め訓練されたネットワークは新たな入力（例えば、新たな試料）を分類するために用いられ得る。一部の実施形態では、予め構築されたマトリックスは、予め訓練されたネットワークへの入力として用いられ得る。第１のパッチの構築ステップに関して述べるに、第１のパッチのＣｐＧサイトの第１の独立セットが、複数の断片中の個々の断片が第１のパッチについての投入に際して人工的に分断されないようにパーティショニングされる第１のパッチの構築ステップに関して述べるに、第１のパッチのＣｐＧサイトの第１の独立セットに対してのパーティショニングでは、第１のパッチ中のＣｐＧサイトの独立セットがＣｐＧサイト密度が高い領域に関してセグメンテーション、トランケーション又は排除をなさないようにされる。

【0132】

データセット取得後且つ第１のパッチ構築前、又は検査対象の疾患／癌状態の決定の任意の段階にて、方法８００は、前記複数の断片からそれぞれの各々の断片であって前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイトにわたっての対応するメチル化パターンがｐ値閾値を充足しないｐ値を有する断片を除去することによって前記複数の断片に対してプルーニングを行うプルーニングステップをさらに含み得る。前記各々の断片の前記ｐ値の決定は、前記各々の断片の前記メチル化パターンを、前記各々の断片の前記複数のＣｐＧサイトを有する複数の参照断片中の前記複数のＣｐＧサイトのメチル化パターンの分布と比較することによってなされ得る。前記複数の参照断片中の各参照断片の前記メチル化パターンは、１つ以上の共通特徴を有する対象のコホート（例えば、健常な対象のコホート、喫煙する健常な対象のコホート、喫煙しない対象のコホート、男性の対象のコホート、女性の対象のコホート、閾値となる年齢を超える対象のコホート、指定された年齢レンジ内の対象のコホート、遺伝子変異の特定のセットを有する対象のコホート、特定の人種の対象のコホート等）から取得された生物試料からの核酸についてのメチル化シーケンシングによって取得され得る。この複数の参照断片は、健常な対象のコホートから取得され得る。健常な対象のコホートは、少なくとも10, 20, 50, 100, 1000又はそれ以上の対象を含み得る。

【0133】

癌陽性の患者の血液試料から取得された断片の大半は、血流中に放出された健常な細胞由来のものたり得る。そのような場合、メチル化シーケンシングによって取得された複数の断片のサブセットは、癌組織由来のものたり得る。図３及び図４の例示的ワークフローにて概説されたように、ｐ値フィルタは、健常な（例えば、非癌又は「正常な」）組織に比して高度に差異的なメチル化状態を有さないリードを除去するために、用いられ得る。生成的モデル（例えば、モデル分布）を用いてこれをなし得るのであり、健常試料のコホート（例えば、約１３０～１５０）を用いて断片メチル化パターンの正規分布を決定する。参照分布は各遺伝子座にて生成でき、各モデル分布は各遺伝子座での健常メチル化状態を表し得る。参照試料の分布に基づいて、観測された断片についてｐ値を決定することができ、ｐ値は、観測された断片と少なくとも同じくらい希有なメチル化パターンを観測できる確率とされ得る。ｐ値は各生物試料について複数の断片中の各断片について計算でき、従ってハイパスフィルタを提供するのであり、これは低優先度又は低信号メチル化パターン断片（例えば、健常細胞からのそれ）を除去しつつ、潜在的な興味対象となる又は判別的価値を有するそれらの断片を保持する。ｐ値閾値は、大きくとも0.1, 0.05, 0.01, 0.001又はそれ以下とされ得る。ｐ値閾値は、少なくとも0.0001, 0.001, 0.01, 0.05, 0.1又はそれ以上とされ得る。

【0134】

図６Ｈを参照し、図６Ａの用語を用いて例示するに、第１のパッチは、第１のチャンネル５３２－１－１及び第２のチャンネル５３２－１－２を含む複数のチャンネルを含み得る。各チャンネルは、１つの特徴（例えば、第１の特徴のパラメータ）と関連付けられている情報又はデータを表し得る。図６Ａに転じるに、第２のチャンネル５３２－１－２は、第１のチャンネル５３２－１－１の第１の複数のパラメータの各インスタンスについて、第２の複数のパラメータの対応するインスタンスを含み得るのであり、第２の複数パラメータの各インスタンスは、第１のパッチについてのＣｐＧサイトの第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのＣＰＧのメチル化の様子以外の第１の特徴についてのパラメータを含み得る。第１のパッチを構築するステップは、ＣｐＧサイトの第１の独立セットに整列した複数の断片（例えば、図６Ｈの断片６０２，６０６）中のそれぞれの各々の断片について、各々の断片のメチル化パターンに基づいて、第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンス並びに第２の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入することを含み得る。第２のチャンネル５３２－１－２は、追加的な特徴並びに／又は各々のＣｐＧサイト、各々の断片、各々の試料、若しくは各々の対象についての属性を表す別の２次元マトリックスを含み得る。したがって、図６Ａ及び６Ｈは、第１の特徴（例えば、ＣｐＧカバレッジ）を含む第２のチャンネル５３２－１－２を示しているものとされ得る。図６Ａ及び６Ｈの例示的実施形態では、第２のチャンネルは複数のＭ個のインスタンス（例えば、図６Ａ及び６Ｈに示されているＹ軸に沿ってのそれ）を含み得るのであり、各インスタンスは、第１のチャンネル５３２－１－１のＬ個のＣｐＧサイト５３６－１－１－１の第１の独立セットに対応する複数のパラメータを、含む。そして、第２のチャンネル５３２－１－２中の複数のインスタンス中の第Ｍインスタンスに関して、複数のパラメータは、図６Ａにて538-1-2-M-1, 538-1-2-M-2, 538-1-2-M-3, 538-1-2-M-4, 538-1-2-M-Lと表示され得る。したがって、断片６０２，６０６は図６Ａ及び６Ｈに示されているパッチによって表されているゲノムの領域に整列され得るのであり、整列された断片中のＣｐＧサイトの状態は、図６Ｈに示されるこれらＣｐＧサイトに対応するパッチのチャンネル５３２－１－１のパラメータに投入するために用いられ得る。チャンネル５３２－１－１にてこのようにして投入がなされた各そのようなパラメータについて、図６Ｈに示されているように、第２のチャンネル５３２－１－２中の対応するパラメータが存在し得る。そして、これらの対応するパラメータには、追加的な特徴並びに／又はチャンネル５３２－１－２が表す各々のＣｐＧサイト、各々の断片、各々の試料、若しくは各々の対象についての属性と関連付けられている値を、と投入し得る。例えば、追加的な特徴に関してチャンネル５３２－１－２が断片マッピングスコアについてのバイナリ表示である場合、ソース断片がマッピング閾値を充足するマッピングスコアを有するのならば、追加的な特徴は「１」とすることができ（図示の目的で図６Ｈでは左傾斜のハッシュマークで表されている）、また、ソース断片がマッピング閾値を充足しないマッピングスコアを有するのならば、追加的な特徴は「０」とすることができる（図示の目的で図６Ｈでは右傾斜のハッシュマークで表されている）。図６Ｈに示されているように、断片６０６は、マッピング閾値を充足するマッピングスコアを有し得るのであり、他方で断片６０２はマッピング閾値を充足しないマッピングスコアを有し得る。チャンネル２（第２のチャンネル）の特徴は断片レベル特徴とされ得るのであり、他方でチャンネル１（第１のチャンネル）の特徴は個々のＣｐＧサイトのレベルにあることができる。したがって、チャンネル２については、所与の断片に対応する全てのパラメータは断片レベルの値を採用するのであり、他方でチャンネル１については、断片を表す各パラメータは異なる値を有し得る（ＣｐＧメチル化）。このことによって、如何にして任意の所与のチャンネルが異なる粒度でチャンネルパラメータを介してサンプリング及び報告をなし得るのかについて例示し得る（例えば、ＣｐＧサイトの次元で或いは断片等の次元で）。

【0135】

複数の断片中の各々の断片についての第１のパッチを構築するステップは：ｉ）第１のチャンネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、各々の断片中のＣｐＧサイトに対応する、複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別することと（図６Ｇについて上述した）；ｉｉ）識別されたパラメータのうちの各々の断片の各々のＣｐＧサイトに整列する各パラメータについて、各々の断片の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態を割り当てることと（図６Ｇについて上述した）；ｉｉｉ）前記第１の複数のパラメータの前記インスタンスに対応する前記第２のチャンネルの前記第２の複数のパラメータの前記インスタンスの前記第２の複数のパラメータ中の、前記各々の断片の各々のＣｐＧサイトに整列する、前記識別されたパラメータのうちの各パラメータについて、前記各々の断片の前記各々のＣｐＧサイトの前記第１の特徴を割り当てることとを含む（チャンネル５３２－１－２について図６Ｈで例示したのでありまた上述した）。したがって、各々の断片のメチル化パターンに基づいて、第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンス内へと投入される断片に関しては、メチル化状態並びに各々の断片のメチル化状態以外の各々のＣｐＧサイトの第１の特徴の両方は、図６Ｈにて各々例示されているように、第１及び第２チャンネル中の対応するインスタンス内へと投入され得る。

【0136】

図６Ｆに示されているように、前記複数の断片中の１つより多い断片は、前記１つより多い断片が共通ＣｐＧサイトを有さないことを条件として、前記第１のパッチ中の前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータの単一のインスタンスに割り当てられ得る。前記複数の断片中の１つより多い断片は、前記１つより多い断片が共通ＣｐＧサイトを有さないことを条件として、前記第１のパッチ中の前記第１のチャンネル及び前記第２のチャンネルの前記第１の複数のパラメータの単一のインスタンスに割り当てられ得る。

【0137】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、図６Ｈのチャンネル５３２－１－２の特徴）は、各々のＣｐＧサイトが所在する各々の断片の多重度を含み得る。具体的には、第１のパッチの第２のチャンネル中のＣｐＧサイトの第１の独立セット中の各ＣｐＧサイトについては、第１の特徴は、各々のＣｐＧサイトに整列する各々の断片によって表される重複断片（duplicate fragment）の個数を表す多重度（multiplicity）を含み得る。例えば、各々の断片中に含まれる全ＣｐＧサイトにて同じ開始及び終了位置並びに同じメチル化状態を有する場合に、複数の断片は同一なマルチプル（identical multiple）とみなされ得る。一部の実施形態では、多重度は、相互に少なくとも10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%又はそれ以上の重複ＣｐＧサイトを有する断片の個数を表し得る。したがって、断片の多重度は、有益な情報を保持しつつ入力データセットのサイズを減らし得る。複数の同一の断片が、複数の細胞から由来し得る。チャンネル５３２－１－２の特徴が断片マッピングスコアを含む図６Ｈの場合とは違って、図６Ｉでは、チャンネル５３２－１－２の特徴は多重度を含み得る。さらに、断片６０６は、多重度が４となっていることができ、他方で断片６０２は多重度が１となっていることができる。断片６０６のＣｐＧサイトを有する生物試料中には４つのシーケンスリードが含まれ得るのであり、断片６０２のＣｐＧサイトを有するものには１つが含まれ得る。複数の同一の断片が、同一の細胞から由来し得る。複数の同一断片はＰＣＲ増幅ではなくメチル化シーケンシングから取得された断片を含み得るのであり、その際ＰＣＲ増幅から生じる重複はデータ前処理中にデータセットから除外される（例えば、重複排除（de-dupe））。ＰＣＲ増幅から生じる重複は、正規化及び／又は増強ステップを用いてさらに減じることができる。

【0138】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、健常コホートから採取されたＣｐＧβ値を含み得る。β値は、（ｉ）メチル化プローブ強度（例えば、メチル化ＣｐＧサイト強度）と（ｉｉ）メチル化プローブ強度と非メチル化プローブ強度との合計との間の比とされ得る。メチル化プローブ強度は、ＣｐＧサイト、領域、全ゲノムのメチル化状態を示し得る（例えば、メチル化サイトの百分率）。メチル化プローブ強度は、特定のＣｐＧサイトでのメチル化断片数を特定のＣｐＧサイトを包括する断片総数で除した比を示し得る。そして、各ＣｐＧサイトでの所与の試料についてのメチル化状態のβ値は、低メチル化断片又は高メチル化断片の断片数を表し得るのであり、各々のＣｐＧサイトでの複数の断片のメチル化状態の百分率として表し得る。例えば、各々のＣｐＧサイトについての参照β値は、「健常」な対照群又は参照試料におけるＣｐＧサイトでのメチル化の百分率を数量化できる。

【0139】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴は、コホートから取られたＣｐＧ Ｍ値（例えば、健常な対象のコホート、喫煙する健常な対象のコホート、喫煙しない対象のコホート、男性の対象のコホート、女性の対象のコホート、閾値となる年齢を超える対象のコホート、指定された年齢レンジ内の対象のコホート、遺伝子変異の特定のセットを有する対象のコホート、特定の人種の対象のコホート等）、健常コホート中の所定の組織タイプからから取られたＣｐＧ Ｍ値、又は検査対象から取られたＣｐＧ Ｍ値を含み得るのであり、ここで、Ｍ値はメチル化プローブ強度対非メチル化プローブ強度のlog2比として計算される。Du et al., 2010, Comparison of Beta-value and M-value methods for quantifying methylation levels by microarray analysis,” BMC Bioinformatics. 11:587, doi:10.1186/1471-2105-11-587を参照されたいのであり、参照によってこの全体が本明細書に取り込まれる。このような特徴はＣｐＧの解決部にあることができ、図６Ｊに例示されている。図６Ｊに転じるに、チャンネル５３２－１－２の特徴が断片マッピングスコアたり得る図６Ｈの場合とは異なり、チャンネル５３２－１－２の特徴は健常コホートから取られたＣｐＧβ値又はＭ値とされ得る。さらに、図６Ｈ及び６Ｉとは異なり、チャンネル５３２－１－２の特徴は、断片のソースとは関連付けられることはできず、むしろそれら自身のＣｐＧサイトが考えられる。したがって、図６Ｊのチャンネル５３２－１－２の各カラム中のチャンネル５３２－１－２の値は同値とされ得る。なぜならば、各カラムは参照シーケンス（参照ゲノム）中の同じＣｐＧサイトを表すからである。換言するに、図６Ｊのチャンネル５３２－１－２の各列は、チャンネル５３２－１－２によって表される参照ゲノム中の対応するＣｐＧサイトのβ値又はＭ値を表す。健常コホートを用いるのではなく、特徴又は他の特徴の組合せを有している対象のコホートを用い得る（例えば、健常な対象のコホート、喫煙する健常な対象のコホート、喫煙しない対象のコホート、男性の対象のコホート、女性の対象のコホート、閾値となる年齢を超える対象のコホート、指定された年齢レンジ内の対象のコホート、遺伝子変異の特定のセットを有する対象のコホート、特定の人種の対象のコホート等）。各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、検査対象から採取されたＣｐＧβ値を含み得る。これによって結果としてもたらされ得るのは図６Ｊと酷似するのであり、ただ異なるのは、β値が、健常コホートからのものではなく検査対象の全断片に亘ってのものであることになる。

【0140】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、（コホートからの又は所与の表されている対象からの）５’及び３’近隣ＣｐＧサイトのメチル化状態についてのPearson相関スコアを含み得る。これによって結果としてもたらされ得るのは図６Ｊと似ているのであり、ただ異なるのは、所与の列の値は次の事項の相関の尺度である（例えば、Pearson相関）：（ｉ）所与の列の左の列中のＣｐＧのメチル化状態と；（ｉｉ）所与の列の右の列中のＣｐＧのメチル化状態であって検査対象の全断片に亘ってのものであるか代替的には本明細書の他の箇所にて説明されるコホートについてである、メチル化状態。例えば、図６Ｋを参照するに、チャンネル５３２－１－２の列６１０の特徴は、（図６Ｊの）チャンネル５３２－１－１中の所与のＣｐＧサイトに対応し得る。さらに例示するに、このＣｐＧサイトにマップするのは１０個の断片620-1, … 620-10であることができ、したがって、所与のＣｐＧサイトの左に１０個のＣｐＧ状態があり（１０個の断片の各々について１つ）、また、所与のＣｐＧサイトの右には１０個のＣｐＧ状態がある（１０個の断片の各々について１つ）。これらの１０個の断片は対象からのものたり得る。これらの１０個の断片はコホートからのものたり得る。ＣｐＧサイトについてもたらされる値はPearson相関スコアたり得るのであり、次の事項間のものとされ得る：（ｉ）所与のＣｐＧサイトの左にある１０個のＣｐＧ状態のメチル化状態（Ｘ値）；及び（ｉｉ）所与のＣｐＧサイトの右にある１０個のＣｐＧ状態のメチル化状態（Ｙ値）。即ち、断片６２０－１）については（１，０）であり、断片６２０－２については（０，０）であり以下同様である。この例に関してPearson相関係数計算機を用いてPearson相関スコアの算出をなすと、この例でのＸとＹとの間のPearson相関はr(8) = 0.67, p = 0.34と表され得るのであり、ここで、(8)は１０の試料を与えられて自由度が８度であることを示し、これについてのｐ値は0.34である。したがって、このＣｐＧサイトに対応するチャンネル５３２－１－２中のパラメータ６１０についての列の全体は、値として.67が設定されることができ、これは図６Ｋに示されている。

【0141】

５’及び３’近隣ＣｐＧサイトのメチル化状態についてのPearson相関スコアではなく、本明細書の他の箇所にて説明されているコホート又は表されている所与の対象からの特徴としては、健常コホートに対しての検査対象中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのJaccard類似度（或いは、Jaccardインデックス、Jaccard類似度係数、及びIntersection over Union（論理和に対して論理積））を含み得る。Jaccard類似度インデックス（或いはJaccard類似度係数）では、２つのセットの構成要素を比較して、どの構成要素が共有されており、どの構成要素が独特であるかをみる。Jaccard類似度インデックスは、２つのデータセットの類似度の尺度たり得るのであり、範囲は０％～１００％とし得る。Jaccard類似度インデックスは、２つのデータセットの論理積のサイズを２つのデータセットの論理和のサイズで除したサイズとされ得る。したがって、図６Ｋの例はJaccardインデックスに適用可能であるが、ただなされる計算はPearson相関ではなくJaccard類似度である。左右のＣｐＧサイト（５’及び３’近隣ＣｐＧサイト）間のJaccard類似度やPearson相関のではなく、重複係数、単純合致係数、Sorensen-Dice係数、重み付けJaccard類似度、重み付けJaccard距離、Tanimoto類似度若しくはTanimoto距離、距離メトリック、又はTverskyインデックスを用いることができ、５’及び３’近隣ＣｐＧサイトのメチル化状態をもちいてこれらを計算でき、本明細書の他の箇所にて説明されるコホート又は所与の表されている対象からこれをなし得る。

【0142】

表１は距離メトリクスの例を提示する：

【表1】

表１に転じるに、

は２つのメチル化状態ベクトルたり得るのであり、

におけるそれぞれの各々の要素は、中央対象ＣｐＧサイト（central subject CpG site）にマッピングされるｎ個（ｎは正の整数）の断片中の１つの隣接ＣｐＧサイトのメチル化状態を「１」又は「０」として表すのであり、値たる「１」及び「０」は隣接ＣｐＧサイトの２つのあり得るメチル化状態（メチル化及び非メチル化）を表す。例えば、Ｘ^ｐ内のそれぞれの各々の要素は、対象中央ＣｐＧサイト（subject central CpG site）にマッピングされる複数の断片（ｎ個の断片）中の対応する断片内の５’隣接ＣｐＧサイトのメチル化状態を表し得る（can represent）のであり、一方でＸ^ｑ内のそれぞれの各々の要素は、対象中央ＣｐＧサイトにマッピングされる複数の断片中の対応する断片内の３’隣接ＣｐＧサイトのメチル化状態を表す（represents）。さらに、max_i及びmin_iは、それぞれ第ｉ番目の要素の最大値（「１」）及び最小値（「０」）たり得る。

【0143】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、各々の断片のｐ値を含み得る。各々の断片のメチル化パターンは、各々の断片と同じＣｐＧサイトを有するコホート内のそれらの断片と比較してのチャンネル内の各々の断片のｐ値を計算するために用いることができる。したがって、図１８を参照するに、各々の断片１８０２が仮定的なメチル化パターンたる(1, 1, 0, 1, 1, 1)を擁している６個のＣｐＧサイトを有している場合（ここで値たる「１」はメチル化を示し値たる「０」は非メチル化を示す）、「(1, 1, 0, 1, 1, 1)」との表現は、各々の断片１８０２のメチル化状態ベクトル１８０３となり得る。 この例では、各々の断片１８０２のメチル化パターンについてのｐ値は、同じ６個のＣｐＧサイト（six CpG sites）を有するコホート内の例えば断片１８０４－１～１８０４－１００等のそれらの断片のメチル化パターンとの関係で決定できる。各々の断片１８０２については、各々の断片のメチル化状態ベクトル１８０３が対照群データ１８０４との比較で発生するサンプル確率は、各々の断片のメチル化状態ベクトル内のＣｐＧサイトを包括する可能性のあるメチル化状態ベクトル１８０６－１，１８０６－２，１８０６－３，．．．，１８０６－Ｍについてのサブセットに対してランダムなサンプリングをなすことによって計算できる。検査メチル化状態ベクトル１８０３の長さは６であるため、断片１８０２の６個のＣｐＧ（six CpG）を包括するメチル化状態ベクトルについては２＾６通りの可能性があり得る。一般的な例を挙げるに、メチル化状態ベクトルのあり得る態様は２＾ｎ通りあり、ここでｎは検査メチル化状態ベクトルの長さである。サンプリングされたあり得るメチル化状態ベクトル１８０６の各々に対応する確率は、断片のメチル化状態ベクトル１８０２及びサンプリングされたあり得るメチル化状態ベクトル１８０６について、例えばMarkov連鎖モデル又は他の何らかの態様のモデルを用いて、計算することができるのであり、それによって、各々の断片のメチル化パターン（メチル化状態ベクトル）１８０３の確率以下の確率に対応するサンプリングされたあり得るメチル化状態ベクトル１８０６の比率が計算される。米国特許公報第2019-0287652号を参照されたいのであり、これは参照によって取り込まれる。隣接ＣｐＧサイトの関係度合いについては何らの仮定を採用できず、したがって、ｐ値推定のためにMarkov連鎖モデルを用い得ない。例えば、米国特許公報第2019-0287652号にて開示されたMarkov連鎖モデルを用いるよりは、統計的有意性を測定するための任意の手法を採り得るのであり、非限定的に例示すれば、モーメント生成関数、組合せ法、指数族、漸近近似、ガウス近似、ポアソン近似、及び大偏差近似を挙げられよう。そして、この計算された割合に基づいて、各々の断片１８０２のメチル化パターン１８０３についての推定ｐ値スコアを計算することができる。本明細書の他の箇所にて説明されているように、このｐ値は、各々の断片１８０２のメチル化状態ベクトル１８０３又は断片１８０４の採取元たるコホート（１つ以上の共通特徴を有する対象のコホート）内にてより生じにくい他のメチル化状態ベクトルを観測する確率を表し得る。このように、低いｐ値スコアは、コホート内にて希であり且つコホートとの相対的関係で異常にメチル化されていると断片がラベル付けされることを惹起するメチル化状態ベクトルに、一般的に対応し得る。断片１８０４が健常対象のコホートから取られる場合、断片１８０２についての高いｐ値スコアは、相対的な意味で健常対象にて存在していることが期待されるメチル化状態ベクトル１８０３に、一般的に関連し得る。例えば、断片１８０４の採取元たるコホートが非癌群である場合、メチル化状態ベクトル１８０３についての低いｐ値は、各々の断片１８０２がコホートとの相対的関係では異常にメチル化されていることが示唆され得るのであり、よって、断片１８０２の採取元たる対象内にて癌が存在することについて可能性として指示的となり得る。

【0144】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、各々のＣｐＧサイトが載っている各々の断片の長さを含み得る。例えば、図６Ｌでは、断片６０２は長さが６２の剰余部となり得るのであり、断片６０６は長さが９８の剰余部となり得る。この場合、断片６０２，６０６についてのチャンネル５３２－１－２内の対応するパラメータについては図示のように投入できそれぞれ値として６２及び９８を伴う。

【0145】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、断片シーケンス源を含み得る。例えば、断片シーケンス源は、対象のシーケンスリードに関して生検された臓器を示し得る。臓器に関しては、次のようにしてルックアップテーブルに符号化しておくことができる：「１」＝脳、「２」＝胃、「３」＝乳房、「４」＝肺、「５」＝血液等。所与の検査対象についての全断片がおそらくは同じ臓器又は源泉からのものであると思われる故に、図６Ｍが例示しているのは、血液由来の断片６０２，６０６がチャンネル５３２－１－２に符号化されている場合である。源泉たる臓器について符号化をなさずとも、断片シーケンス源は、シーケンスを取得するために用いられたシーケンシングタイプを指定できるのであり、例えば、「１」は標的ペア端シーケンシングを示し、「２」は標的単一端シーケンシングを示し、「３」はペア端全ゲノムシーケンシングを示し、「４」は単一端全ゲノムシーケンシング等を示す。チャンネル５３２－１－２の第１の特徴は、シーケンスリードが増幅及びシーケンスされた具体的方法について示し得るのであり、ルックアップテーブルを用いて様々な異なる可能性を追跡できるのであり、例えば、「１」＝５’トランスクリプトームキット、「２」＝３’トランスクリプトームキット等。

【0146】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、各々の断片の断片マッピング品質スコアを含み得る。断片マッピング品質スコアは、Ewingらの手法を用いて計算できる（Ewing and Green, 1998, “Base-calling of automated sequencer traces using phred. ii. Error probabilities," Genome Res. 8: 186-194.）。図６Ｌはこのような割り当てを例示し得るのであり、個々で断片６０６はマッピング品質が９８であり、断片６０２はマッピング品質が６２である。複数のシーケンスリードが断片に寄与する場合（例えば、断片が１より大なる多重度を有する場合）、断片マッピング品質スコアは複数のシーケンスリードのマッピング品質スコアの平均とすることができる。

【0147】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、参照ゲノム中の５'隣接ＣｐＧサイトへの距離（例えば、ヌクレオチドの個数）（又は３'隣接ＣｐＧサイトへの距離）を含み得る。図６Ｎでは、チャンネル５３２－１－２の特徴は、所与のＣｐＧがその最近近隣（nearest neighbor）ＣｐＧサイトとの間に有している５'距離（5’ distance）（又は３'隣接（3’ adjacent）ＣｐＧサイトへの距離）とすることができる。さらに、図６Ｈ及び６Ｉとは異なり、図６Ｎのチャンネル５３２－１－２の特徴は、断片のソースとは関連付けられることはできず、むしろそれら自身のＣｐＧサイトが考えられる。したがって、図６Ｎのチャンネル５３２－１－２の各カラム中のチャンネル５３２－１－２の値は同値とされ得る。なぜならば、各カラムは参照シーケンス（参照ゲノム）中の同じＣｐＧサイトを表すからである。図６Ｎのチャンネル５３２－１－２の各カラム中は、所与のＣｐＧがその最近近隣ＣｐＧサイトとの間に有している５'距離（又は３'隣接ＣｐＧサイトへの距離）を表し得る。距離は、線形ヌクレオチド尺度、対数ヌクレオチド尺度、又は何らかの他の関数によるヌクレオチド尺度とされ得る。

【0148】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、各々のＣｐＧサイトが入っている遺伝的要素を含み得る。このような遺伝的要素の例としては、次の事項が含まれ得るがこれらには限定されはしない：プロモータ／エンハンサ領域、エクソン、イントロン、ヒストン修飾マーク、ＣｐＧアイランド／ショア／シェルフ、進化的保存サイト、転写因子結合サイト、制限サイト、クロスオーバホットスポット誘導サイト、ポリアデニル化信号等。遺伝的要素は次のようにしてルックアップテーブルに符号化されていることができる：「１」＝エクソン、「２」＝イントロン、「３」＝制限サイト等。

【0149】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、各々のＣｐＧサイトと関連付けられている生物学的経路（１つ以上の遺伝子によって惹起され得るような、又は、１つ以上の遺伝子によって惹起され得る生物学的機能によって惹起され得るような、細胞内分子間での複数の相互作用）を含み得る。第１の特徴は、対象たるＣｐＧサイトを含む各々の断片の生物学的経路を含み得る。したがって、所与の生物学的経路（biological pathway）が１０個の遺伝子によって惹起される１つ以上の生物学的機能（biological function）を含むのであり、且つ各々の断片がこれらの遺伝子の１つにマッピングされる場合、第１の特徴は、所与の生物学的経路とされ得る。生物学的経路は、ルックアップテーブルに符号化されていることができる。したがって、図６Ｉの断片６０６は、生物学的経路「４」としてルックアップテーブル中にて符号化されている生物学的経路にマッピングされ、また、断片６０２は生物学的経路「１」としてルックアップテーブル中にて符号化されている生物学的経路にマッピングされることができる。生物学的経路の例は、Fabregat et al. 2018 PMID: 29145629, and Kanehisa and Goto, 2000, “KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,” Nucleic Acids Res. 28(1), pp. 27-30にて見出され得るのであり、その各々は参照によって取り込まれる。

【0150】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、各々のＣｐＧサイトと関連付けられている遺伝子を含み得る。より具体的には、第１の特徴は、対象とされるＣｐＧサイトを含む各々のＣｐＧサイトがマッピングされる遺伝子とされ得る。遺伝子は、ルックアップテーブルに符号化されていることができる。したがって、図６Ｉの断片６０６は、遺伝子「４」としてルックアップテーブル中にて符号化されている遺伝子（gene）にマッピングされ、また、断片６０２は遺伝子「１」としてルックアップテーブル中にて符号化されている生物学的事項（biological）にマッピングされることができる。各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧ遷移インパルス関数の値を含み得る。各々のＣｐＧサイトの第１の特徴は、ＣｐＧサイトがＣｐＧアイランドの一部であるかの決定を含み得る。ＣｐＧサイトがアイランドの一部であるかの決定及びそのような計算がインパルス関数に近づく事例に関しては、Yu et al., 2017, “GaussianCpG: a Gaussian model for detection of CpG island in human genome sequences,” BMC Genomics 18(4), p. 392を参照されたいのであり、これは参照によって取り込まれる。各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧラン長符号化の値を含み得る。Chen et al., 2018, “Conflict of CpG density and DNA methylation are proximally and distally involved in gene regulation in human and mouse tissues,” Epgenetics 13(7), pp. 721-741を参照されたいのであり、これは参照によって取り込まれる。各々のＣｐＧサイトの第１の特徴は、次の事項を含み得る：ＣｐＧサイトがギャップ抵触（ＣＯＧ、Conflicts of Gap）領域にあるか否か；ＣｐＧサイトが重複抵触（ＣＯＯ、Conflict of Overlap）領域にあるか否；ＣｐＧサイトが中間値調和（ＨＭＶ、Harmony with Medium Value）領域にあるか否；又はＣｐＧサイトが極値調和（ＨＥＶ、Harmony with Extreme Value）領域にあるか否。この点に関しては、前掲Chenらを参照されたい。

【0151】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴（例えば、チャンネル５３２－１－２の特徴）は、各々のＣｐＧサイトが載っている断片のリード（read）ストランド配向を含み得る。ソース断片（source fragment）は、リードストランド配向として、R1 (5’-to-3’)、R2 (3’-to-5’)、両方を有し得る。Ｒ１は「１」によって表され得るのであり、Ｒ２は「２」によって表され得るのであり、両方は「０」によって表され得る。断片のリードストランド配向は、５'の方向又は３'の方向とされ得る。断片シーケンスソース（fragment sequence source）は、順方向又は逆方向とされ得る。

【0152】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴は、各々のＣｐＧサイトに整列するそれぞれの各々の断片についての断片毎のエントロピー（per fragment entropy）、又は、各々のＣｐＧサイトを含む固定長領域の領域横断エントロピー（across-region entropy）を含み得るのであり、領域横断エントロピーは固定長領域を一群として重複する観測された全メチル化状態に亘って計算される。各々のＣｐＧサイトの第１の特徴は、各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧサイト毎（per-CpG site）のエントロピーを含み得るのであり、サイト毎（per-site）のエントロピーは各々のＣｐＧサイトに対応するパラメータにあたる全インスタンスに亘って計算される。正規化メチル化エントロピー値の計算方法は、Jenkinson et al., 2017, “Potential energy landscapes identify the information-theoretic nature of the epigenome,” Nat. Genet. 49(5), pp. 719-729に開示されており、参照によってこれは取り込まれる。

【0153】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴は、各々の断片のメチル化密度を含み得る。メチル化密度（methylation density）は、次式によって求められる：

【数1】

ここで、β-value_{expected healthy methylation}（β－値_{予想された健常メチル化}）は健常コホート中のＣｐＧサイトについてのβ値であり、β-value_{observed fragment methylation}（β－値_{観測された断片メチル化}）は各々のＣｐＧサイトについて検査対象にて観測されたβ値である。
近隣ＣｐＧサイト（例えば、参照ゲノム中の５'隣接又は３'隣接ＣｐＧサイト）への距離（断片塩基対（ｂｐ）距離（fragment base pair distance））は、参照ゲノム中で５～１００ｂｐの間とし得る。近隣ＣｐＧサイトへの距離は、参照ゲノムにおいて、１００～５００ｂｐの間、５００～１０００ｂｐの間、１０００～５０００ｂｐの間、５０００～１０，０００ｂｐの間、又は１０，０００ｂｐ以上とされ得る。各々のＣｐＧサイトの第１の特徴は、固定長領域のメチル化密度（例えば、１００ｂｐとなるメチル化密度（methylation density））、各々のＣｐＧサイトにての最小合計カバレッジ、又はＣｐＧ近傍（neighborhood）密度（例えば、近隣ＣｐＧサイトにてのＣｐＧ密度（CpG density））とされ得るのであり、固定長領域を備えるスライディング窓（例えば、２００ｂｐのスライディング窓）を用いてスライディング窓中のＣｐＧサイト個数を決定できる。各々のＣｐＧサイトの第１の特徴はメチル化重み付け密度（methylation-weighted density）を含み得るのであり、メチル化ＣｐＧサイトの個数は固定長領域（例えば、断片又はスライディング窓）について決定される。スライディング窓については、明細書の他の箇所にて説明されている。ＣｐＧメチル化密度の計算についての追加の方法はZhang et al., 2008 “A novel method to quantify local CpG methylation density by regional methylation elongation assay on microarray,” BMC Genomics 9(59), doi:10.1186/1471-2164-9-59に開示されており、これは参照によって取り込まれる。

【0154】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴は次の事項を含み得る：ゲノム参照位置、各々のＣｐＧサイトに整列する第１の複数のパラメータのインスタンス内の断片の開始若しくは終了位置、各々のＣｐＧサイトが所在する各々の断片の長さ、各々のＣｐＧサイトが所在する各々の断片内の反復回数、各々のＣｐＧサイトが所在する各々の断片の５’クリップ済み状態。

【0155】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴は、各々のＣｐＧサイトについての癌関連付けパラメータを含みうる。癌関連付けパラメータは、癌と関連付けられている任意の情報を含み得る。癌関連付けパラメータは、差分メチル化情報、遺伝子発現データ（例えば、メチル化マイクロアレイ、遺伝子発現マイクロアレイ及び／又はＲＮＡアレイ若しくはＲＮＡシーケンシング）、及び／又はゲノム解析を用いて決定され得る。癌関連付けパラメータは、モデル生命体結果（例えば、イーストやマウス等の研究用生命体のグループに基づいてヒト生物学の知見を得るための研究）を用いて決定され得る。各々のＣｐＧサイトの第１の特徴は、参照データベース等の外部データ源から取得又は計算することができる（例えば、癌ゲノムアトラスプログラム（ＴＣＧＡ、the Cancer Genome Atlas）、ＵＣＳＣゲノムブラウザ、及び／又はマウス腫瘍生物学システム（ＭＴＢ、Mouse Tumor Biology））。

【0156】

各々のＣｐＧサイトの第１の特徴は、組織又は試料レベル特徴を含み得るのであり、原発組織、原発臓器、及び／又はレプリケイトを含むがこれらには限定されない（例えば、バッチ効果について識別又は調整するため及び／又は縦方向パターンを検出するため）。各々のＣｐＧサイトの第１の特徴は、対象レベル又はコホートレベルの生物学的先行事項を含み得るのであり、喫煙者／非喫煙者、年齢層、及び／又は性別を含むがこれらには限定されない。第１の特徴は、上述されていないが断片メチル化パターンに関して生物学的、構造的、又は技術的文脈を提供する、ＣｐＧサイトレベル、断片レベル、試料レベル、組織レベル、対象レベル又はコホートレベルの任意の属性を含み得る。

【0157】

複数のチャンネルは少なくとも３つのチャンネルを含み得る。第１の複数のチャンネル中の第３のチャンネルは、第１の複数のパラメータの各インスタンスについて、第３の複数のパラメータの対応するインスタンスを含み得るのであり、第３の複数パラメータの各インスタンスは、ＣｐＧサイトの第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトの第２の特徴についてのパラメータを含む。第２の特徴は、第１の特徴以外のものとされ得るも、本開示にて説明された第１の特徴の任意のものを含み得る。

【0158】

図６Ａは、第３のチャンネル５３２－１－３及び第４のチャンネル５３２－１－４を含む複数のチャンネルの例を示すのであり、各々はそれぞれ第２の特徴及び第３の特徴を備える。図６Ａに示されるように、第３のチャンネルは複数のＭ個のインスタンスを含み得るのであり、各インスタンスは、第１のパッチ５３０－１のＬ個のＣｐＧサイト５３６－１－１の第１の独立セットに対応する複数のパラメータを備える。そして、第１のパッチ５３０－１の第３のチャンネル５３２－１－３中の複数のインスタンス中の第Ｍインスタンスに関して、複数のパラメータは、538-1-3-M-1, 538-1-3-M-2, 538-1-3-M-3, 538-1-3-M-4, 538-1-3-M-Lと表示され得る。同様に、第４のチャンネルは複数のＭ個のインスタンスを含み得るのであり、各インスタンスは、第１のパッチ５３０－１のＬ個のＣｐＧサイト５３６－１－１の第１の独立セットに対応する複数のパラメータを備える。そして、第１のパッチ５３０－１の第４のチャンネル５３２－１－４中の複数のインスタンス中の第Ｍインスタンスに関して、複数のパラメータは、538-1-4-M-1, 538-1-4-M-2, 538-1-4-M-3, 538-1-4-M-4, 538-1-4-M-Lと表示され得る。ここで、第２及び第３の特徴は、第１の特徴以外のものとされ得るも、本開示にて説明された第１の特徴の任意のものを含み得る。

【0159】

第１のパッチ５３０内の複数のチャンネルは、少なくとも3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,又はそれ以上のチャンネル５３２を含み得る。一部の実施形態では、第１のパッチ内の複数のチャンネルは多くとも20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5又はそれ以下のチャンネル５３２を含み得る。第１のパッチ５３０内の複数のチャンネル内の各チャンネル５３２は、異なる特徴を含み得る。第１のパッチ５３０内の複数のチャンネル内の２つ以上のチャンネルは、同じ特徴を含み得る。第２の特徴は、第１の特徴に関して上述した任意の１つ以上の特徴とされ得る。第１のパッチ５３０内の少なくとも３つのチャンネルのうちの１つ以上は、第１の特徴に関して上述した任意の１つ以上の特徴とされ得る。図６Ｂは、６個のチャンネルを有する第１のパッチ５３０－１についての例を示す（例えば、メチル化状態、β対照（例えば、対照群又は健常サンプルのβ値）、βサンプル（例えば、訓練又は検査サンプルのβ値）、ｐ値、多重度、及び先行事項（例えば、プロモータ／エンハンサ領域、エクソン、イントロン、ヒストン修飾マーク、ＣｐＧアイランド、進化的保存、転写因子結合サイトと関連付けられている生物学的先行事項））。各チャンネルはランク３のアレイ（例えば、４つの平面を有するアレイであって各平面は３行及び５列を有する）として表されていることができ、第１のパッチ内にて深度方向にスタックされることができる。

【0160】

ＣｐＧサイトの第１の独立セット内の各々のＣｐＧサイトに共通する特徴は、第１のパッチの各々のチャンネルを表す結果としてもたらされる２次元マトリックス内にて、列の全部又は一部に適用され得る。例えば、各々の試料内の各々のＣｐＧサイトについてのβ値は、試料内のＣｐＧサイトに整列する複数の断片を用いて計算でき、また、各々の参照内の各々のＣｐＧサイトについてのβ値は、参照内のＣｐＧサイトに整列する複数の断片を用いて計算できる。その結果、図６Ｎに示されるように、２次元マトリックスは「バーコード的」様相を呈するのであり、第１のパッチ内の各々のチャンネルの各々の列の全部又は一部に同じ値を投入できる。各々のＣｐＧサイトについて一定値を有する特徴については、バーコード様画像を取得でき、これには他のもの有るが次のものが含まれるもこれらには限られない：隣接ＣｐＧサイトへの５'距離、隣接ＣｐＧサイトへの３'距離、癌関連付けパラメータ、参照Ｍ値、及び／又は試料Ｍ値。

【0161】

図６Ｌに示されるように、ＣｐＧサイトの第１の独立セットの各々の断片若しくは領域に共通する特徴は、第１のパッチ５３０の各々のチャンネル５３２を表す結果としてもたらされる２次元マトリックス内にて、インスタンス（例えば、行）の全部又は一部に適用され得る。例えば、他のものもあるも、断片シーケンス源、断片マッピング品質スコア、断片ｐ値、断片多重度、断片位置、及び／又は断片長に関しては、各々のインスタンスに同じ値を投入できる。各々の試料、対照、又はコホートに共通の特徴は、第１のパッチのチャンネル全体に適用される単一の値を含み得るのであり、ＣｐＧサイトの第１の独立セット内の複数の断片又は複数のＣｐＧサイトに特有の特徴は不問とされる。例えば、試料レベル、対象レベル、又はコホートレベルの生物学的先行事項（他のもの有るが喫煙者／非喫煙者、年齢層、及び／又は性別を含むがこれらには限定されない）については、同じ値を第１のパッチの各々のチャンネルに適用できる。

【0162】

方法８００のステップ８０６は、少なくとも第１のパッチを分類器に適用してそれによって検査対象にての癌状態を決定するステップを含み得る。分類器は、癌対非癌及び／又は原発組織について予測することができる。分類器は、癌／非癌／情報性無し、原発組織、原発臓器、癌タイプ、及び／又は癌ステージについて判別するマルチクラス予測をなし得る。

【0163】

図３は、幾つかの実施形態による、ｐ値によってフィルタリングされた複数の断片が分類器に適用される例示的ワークフローについて例示する。また、図３は、分類が行われて、癌対非癌及び／又は原発組織について判別がなされる例について概説する。このような分類は、２値的分類又はマルチクラスＴＯＯ分類たり得る。２値的分類は、癌／非癌を判別するために行われ得る。マルチクラス分類又は任意の分類器は、癌タイプ又はサブタイプを非癌試料から判別するために実行できるのであり、例えば、heme、非情報的な試料、交絡条件、又は他の未分類試料が含まれる。２値的な癌／非癌分類がなされる場合、分類器を一般的な試料母集団に適用するに際しては、特異度が０．９９或いは９９％又はそれ以上とされるカットオフ閾値を用い得る。カットオフ特異度閾値は、70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%,又は99.5%より高いものとされ得る。一部の実施形態では、カットオフ特異度閾値は、高くとも99.5%, 99%, 98%, 95%, 90%又はそれ以下とされ得る。マルチクラスＴＯＯ分類を行って、2-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30又は30以上の異なる癌タイプ及び／又はサブタイプの間で判別をなし得る。分類器を適用して、肛門直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、頭部及び頸部癌、肝胆癌、子宮内膜癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ系腫瘍、メラノーマ、多発性骨髄腫、骨髄腫瘍、卵巣癌、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、腎癌、甲状腺癌、上部胃腸癌、尿路上皮癌のステージ、又は子宮癌を予測できる。１つ以上の癌は「高信号」癌（５年の癌特有死亡率が５０％より高い癌として定義される）とされ得るのであり、例えば、肛門直腸癌、結腸直腸癌、食道癌、頭部及び頸部癌、肝胆癌、肺癌、卵巣癌、及び膵臓癌が含まれ、リンパ腫及び多発性骨髄腫も含まれる。高信号癌は、より攻撃性が高くなり得るのであり、また、患者から取得された検査試料内の無細胞核酸濃度が平均を超過し得る。「高信号癌」は、低信号癌群（例えば、子宮癌、甲状腺癌、前立腺癌、及びホルモン受容体陽性のステージＩ／ＩＩの乳癌）に該当しない癌を指し得る。

【0164】

複数パッチアーキテクチャ
方法は、対応する第１のチャンネルを含む第２のパッチを構築するステップをさらに含み得る。この第２のパッチは、前記種の前記参照ゲノム中の、ＣｐＧサイトの第２の独立セットを表し得る。ＣｐＧサイトの前記第２の独立セット中のそれぞれの各ＣｐＧサイトは、前記参照ゲノム中の所定の位置に対応し得る。前記第２のパッチの前記対応する第１のチャンネルは、第１の複数のパラメータについての対応する複数のインスタンスを含み得る。前記第２のパッチの前記第１のチャンネルの前記対応する第１の複数パラメータの各インスタンスは、前記第２のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第２の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含み得る。開示のシステム及び方法は、ＣｐＧサイトの第２の独立セットに整列した複数の断片中のそれぞれの各々の断片について、各々の断片のメチル化パターンに基づいて、第２のパッチの第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入して、それによって第２のパッチを構築することができる。上述した第１のパッチを分類器に適用することは、第１及び第２の両パッチを分類器に適用して、それによって検査対象にての癌状態を決定することを含み得る。本開示の一部の実施形態は、３個以上のパッチ、４個以上のパッチ、１０個以上のパッチ、１００個以上のパッチ、又は５０個から１０００個のパッチを活用でき、それぞれは独自のＣｐＧサイトのセットを有し、また、それぞれが分類器に適用される。

【0165】

第２のパッチは、対応する第１のチャンネルを含む対応する複数のチャンネルを含み得る。また、第２のパッチの対応する複数のチャンネル中の対応する第２のチャンネルは、第１の複数のパラメータの各インスタンスについて、第２の複数のパラメータの対応するインスタンスを含み得るのであり、第２の複数パラメータの対応するインスタンスを含み得るのであり、第２のパッチの第２の複数パラメータの各インスタンスは、第２のパッチについてのＣｐＧサイトの第２の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのＣＰＧのメチル化の様子以外の第１の特徴についてのパラメータを含む。開示のシステム及び方法は、ＣｐＧサイトの第２の独立セットに整列した複数の断片中のそれぞれの各々の断片について、各々の断片のメチル化パターンに基づいて、第２のパッチの第２の複数のパラメータのインスタンスの全部又は一部にさらに投入できる。図７Ａ及び７Ｂは、幾つかの実施形態による、第１のパッチ５３０－１及び第２のパッチ５３０－２を含む複数のパッチを有する例示的アーキテクチャについて示す。ＣｐＧサイトの第１及び第２の独立セットは、それぞれ、ＣｐＧサイト１～Ｌ１及びＣｐＧサイト１～Ｌ２を含み得る。各パッチは複数のチャンネルを含み得る。

【0166】

ＣｐＧサイトの第１の独立セットは、ＣｐＧサイトの第２の独立セットと重複しているかもしれないし重複していないかもしれない。第１のパッチは、第２のパッチとは同等のサイズではあるが参照ゲノムの異なる部分を表し得る。第１のパッチは参照ゲノムの第１の部分を表し得るのであり、また、第２のパッチは参照ゲノムの第２の部分を表し、第１の部分のサイズは第２の部分のサイズと異なる。例えば、第１及び第２の部部分のヌクレオチドにおける実際のサイズは、異なり得る。ＣｐＧサイトの第１の独立セットは第１の個数のＣｐＧサイトを備え得るのであり、ＣｐＧサイトの第２の独立セットは第２の個数のＣｐＧサイトを備え得るのであり、ＣｐＧサイトについての第１の個数はＣｐＧサイトについての第２の個数と同一とされ得る。一部の実施形態では、ＣｐＧサイトの第１の独立セットは第１の個数のＣｐＧサイトを備え得るのであり、ＣｐＧサイトの第２の独立セットは第２の個数のＣｐＧサイトを備え得るのであり、ＣｐＧサイトについての第１の個数はＣｐＧサイトについての第２の個数と異なるものとされ得る。

【0167】

第１のパッチは第１の個数のチャンネルを備え得るのであり、第２のパッチは第２の個数のチャンネルを備え得るのであり、第１のチャンネル個数と第２のチャンネル個数とは同一又は非同一とされ得る。第１のパッチは第１の複数の特徴を有する第１の個数のチャンネルを備え得るのであり、第２のパッチは第２の複数の特徴を有する第２の個数のチャンネルを備え得るのであり、第１の複数の特徴は第２の複数の特徴と重複できるが重複しないこともできる。

【0168】

開示のシステム及び方法は、複数のパッチを構築するための命令を更に含み得る。図７Ａは、一部の実施形態による、Ｋ個のパッチの例について示すのであり、これには、第１のパッチ５３０－１、第２のパッチ５３０－２、及び第Ｋのパッチ５３０－Ｋが含まれるのであり、ここで、Ｋは正の整数（例えば、２～１０，０００）であり、また、各パッチはＣｐＧサイト５３６の独立セットを含み得るのであり、また、パッチ５３０－ＫはＣｐＧサイト１～ＣｐＧサイトＬ（Ｋ）を含むＣｐＧサイトの第Ｋの独立セットを含む。複数のパッチ（Ｋ）は、１～１０個のパッチ、１０～２０個のパッチ、２０～５０個のパッチ、５０～１００個のパッチ、１００～５００個のパッチ、５００～１０００個のパッチ、１０００～５０００個のパッチ、５０００～１０，０００個のパッチ、又は１０，０００個以上のパッチとされ得る。

【0169】

複数のパッチ内の構築済みパッチの個数は、分類器に含めるべきＣｐＧサイトのパネル内のＣｐＧサイトの個数によって、決定され得る。ＣｐＧサイトのパネルは、ヒトゲノムのメチローム全体を含み得る。したがって、複数のパッチにわたって含まれるＣｐＧサイトの個数は、約２，８００万となり得る。複数のパッチにわたって含まれるＣｐＧサイトの個数は、１～１０，０００個、１０，０００～１００，０００個、１００，０００～５００，０００個、５００，０００～１００万個、１００万～１５０万個、１５０万～５００万個、５００万～１，０００万個、１，０００万～２，０００万個、２，０００万個以上とされ得る。複数のパッチにわたって含まれるＣｐＧサイトの個数は１５０万とされ得るのであり、複数のパッチは５０００パッチを含み得るのであり、また、それぞれの各々のパッチはＣｐＧサイトの独立セット内で３００個のＣｐＧサイトを含み得る。複数のパッチにわたって含まれるＣｐＧサイトの個数は１５０万とされ得るのであり、複数のパッチは２０００パッチを含み得るのであり、また、それぞれの各々のパッチはＣｐＧサイトの独立セット内で７５０個のＣｐＧサイトを含み得る。複数のパッチにわたって含まれるＣｐＧサイトの個数は１５０万とされ得るのであり、複数のパッチは１０００パッチを含み得るのであり、また、それぞれの各々のパッチはＣｐＧサイトの独立セット内で１５００個のＣｐＧサイトを含み得る。分類器に含めるべきＣｐＧサイトのパネルは、冗長ＣｐＧサイトを含み得る。

【0170】

複数のパッチ内の構築済みパッチの個数は、それぞれの各々のパッチ内のＣｐＧサイトの独立セット内のＣｐＧサイトの個数と、それぞれの各々のパッチについての複数のインスタンス内のインスタンス数と、それぞれの各々のパッチについての複数のチャンネル中のチャンネルの個数との相対的関係での分類器の演算処理容量によって決定され得る。例を挙げるに、分類器はＶＧＧ１１型のＣＮＮを含み得るのであり、複数のパッチ内の構築済みパッチの個数は１０００～２０００とされ得るのであり、それぞれの各々のパッチについてのＣｐＧサイトの独立セット内のＣｐＧサイトの個数は２５６とされ得るのであり、それぞれの各々のパッチについての複数のインスタンス内のインスタンス数は１２８とされ得るのであり（例えば、リード深度は１２８個の断片）、それぞれの各々のパッチについての複数のチャンネル中のチャンネル個数は７とされ得る。分類器は残部ネットワーク（例えば、ResNet）の画像分類器を含み得るのであり、それぞれの各々のパッチ用のＣｐＧサイトの独立セット内のＣｐＧサイトの個数は１０００とされ得る。

【0171】

実施例８で説明されているように、ハイパーパラメータの精緻化によって、複数のパッチ内の構築済みパッチの個数、ＣｐＧサイトの独立セット内のＣｐＧサイト個数、複数のインスタンス内のインスタンス数、及び複数のチャンネル中のチャンネル数を定義付け及び／又は精緻化できる。複数のパッチにわたって含まれるＣｐＧサイトの個数は、既存の標的メチル化シーケンシング方法を用いることによって決定でき、或いは、実験的目標に基づいて実務家によって選択され得る。したがって、複数のパッチにわたって含まれるべきＣｐＧサイトのパネルについては、高度の情報含有性を有している及び／又は高度な判別的価値を有しているパネルサブ領域を識別することによってさらに厳選できる。

【0172】

パッチ設計
方法は、前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セットを選択するステップであって、複数の臨床的対象を備える臨床的コホートから取得された複数の臨床的生物試料の複数の臨床的核酸試料から取得された複数の臨床的断片のメチル化シーケンシングによって決定された複数のＣｐＧメチル化パターンの評価を介してなされる、ステップをさらに含み得る。前記複数の臨床的対象は、前記癌状態に関する第１の兆候を有する臨床的対象についての第１のセットと前記癌状態に関する第２の兆候を有する臨床的対象についての第２のセットとを含み得る。臨床的コホートから取得された複数の臨床的生物試料の複数の臨床的核酸試料は、研究設計から取得され得る（例えば、ＴＧＣＡやＣＣＧＡ）。癌状態についての兆候には、「癌対癌無し」が含まれ得る。癌状態についての兆候には、原発腫瘍（tumor of origin）（例えば、「脳対肺」）が含まれ得る。癌状態についての兆候には任意の癌関連情報が含まれ得るのであり、癌のステージ、癌確率等が含まれるもこれらには限定されはしな。

【0173】

ＣｐＧサイトの第１の独立セットを選択することは、臨床的対象についての第１のセットと臨床的対象についての第２のセットとの間での複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態についての各々の第１の相互情報スコア（例えば、２つの疾患状態の間での判別をするに際しての特徴の情報含有量の尺度を表す数学的な値）に基づいて、複数のＣｐＧサイトの参照ゲノム内での第１の順位を決定することを含み得る。第１のパッチについてのＣｐＧサイトの対応する独立セットについてのＣｐＧサイトの第１の閾値個数を、順位を用いて選択できる。したがって、相互情報はサイト毎の態様で評価でき、相互情報は、所与のＣｐＧサイトにてのペア毎での比較のために第１クラス対第２クラスの関係での確率マスを識別する単一のバリューメトリックとされ得る。例えば、相互情報スコアは、それぞれの各々のＣｐＧサイトについて、複数の臨床的な生物試料中の臨床的対照のそれぞれの各々のペア間でのペア毎の比較全てに関して、計算できる。高い相互情報スコアは、各々のＣｐＧサイトにてのペア組みされた対象間での高いレベルの判別を示し得る。例えば、上位１００、上位１０００又は上位２０００の相互情報スコアに対応するＣｐＧサイトを選択でき、残余のＣｐＧサイトは選択しない。相互情報スコアが0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95,又は0.99を超過する任意のＣｐＧサイトを、選択し得る。

【0174】

複数の臨床的対象は、癌状態についての第３の兆候を有する臨床的対象についての第３のセットと、癌状態についての第４の兆候を有する臨床的対象についての第４のセットとを含み得るのであり、選択をなすことは、臨床的対象についての第３のセットと臨床的対象についての第４のセットとの間での複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態についての各々の第２の相互情報スコアに基づいて、複数のＣｐＧサイトの参照ゲノム内での第２の順位を決定することをさらに含み得る。第１のパッチについてのＣｐＧサイトの第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第２の閾値個数を、第２の順位を用いて選択できる。それぞれの相互情報スコアは、臨床的対象についての第１のセットと臨床的対象についての第３のセットとの間で、臨床的対象についての第１のセットと臨床的対象についての第４のセットとの間で、臨床的対象についての第２のセットと臨床的対象についての第３のセットとの間で、及び／又は臨床的対象についての第２のセットと臨床的対象についての第４のセットとの間で、計算できる。複数の臨床的対象は、５個以上、１０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１０００個以上、２０００個以上、５０００個以上、１０，０００個以上、又は２０，０００個以上の臨床的対象のセットを含み得るのであり、臨床的対象の各セットは、癌状態についての対応する兆候を有する。

【0175】

第１又は第２の相互情報スコアに基づいての参照ゲノム中での複数のＣｐＧサイトのランク付けは、最高から最低の相互情報スコアへと向かってＣｐＧサイトをランク付けすることによってなし得る。第１のパッチについてのＣｐＧサイトの第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第１及び／又は第２の閾値個数を、複数のＣｐＧサイトについてのトップランクの相互情報スコアを用いて選択できる（例えば、比較にて用いられる癌状態を問わずに最高の相互情報スコアを有するＣｐＧサイト）。第１のパッチについてのＣｐＧサイトの第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第１及び／又は第２の閾値個数を、相互情報スコアが計算されたそれぞれの各々の臨床的対象ペアのトップランク相互情報スコアから、選択できる（例えば、最高の相互情報スコアを有するＣｐＧサイトであって、全てのペア毎の比較は選択されたＣｐＧサイトのセットで表されていること）。トップ１０００の高位相互情報ＣｐＧサイト（top 1000 high mutual information CpG sites）は、複数のペア毎の比較におけるそれぞれの各々の臨床的対象ペアについて、相互情報スコア（mutual information score）のランキングに基づいて、選択できる。各々のＣｐＧサイトについての相互情報スコアは、臨床的対象についてのペア毎での複数の比較に関して、弁別的と看做し得る。

【0176】

最高のランキングの相互情報スコアを伴う複数のＣｐＧサイトは、第１のパッチのＣｐＧサイトの第１の独立セットとして選択され得るのであり、ＣｐＧサイトの第１の独立セットは、第１のパッチ内において最高から最低の相互情報スコアへと向かう順序にて、配列され得る。ＣｐＧサイトの第１の独立セットは、第１のパッチ内において最低から最高の相互情報スコアへと向かう順序にて、配列され得る。パッチは、トップランクの相互情報スコアを伴う２５６個のＣｐＧサイトを含み得る。構築することは、第１のパッチに割り当てられた各々の断片を、それらの第１の相互情報スコアに基づいて、ソートすることをさらに含み得る。例えば、第１のパッチの構築前に、断片は、それらの相互情報スコアに基づいてランク付けでき、また、第１のパッチのインスタンス内へとそれらの相互情報スコアの順序で投入できる（例えば、降順、又は昇順）。

【0177】

癌状態についての第１の兆候は第１の癌タイプとされ得るのであり、また、癌状態についての第２の兆候は第２の癌タイプとされ得る。第１の癌タイプ又は第２の癌タイプは、本明細書の他の箇所にて説明された任意の癌とされ得る。そして、臨床的対象間でのペア毎での複数の比較は、任意の２つの癌タイプの間での任意の可能なペア毎での比較を含み得る（例えば、乳癌対肺癌）。

【0178】

第１のパッチのＣｐＧサイトの第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第１の閾値個数中のそれぞれの各々のＣｐＧサイトに関しては、ＣｐＧサイトの第１の閾値個の中のあらゆる他のＣｐＧサイトから参照ゲノム内において閾値個の剰余部をもってパディングがなされ得る。例えば、パッチ内に含められるためには、各ＣｐＧサイトは、少なくとも10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200,又は300個の剰余部によってパディングされ得る。ＣｐＧサイトの第１の独立セットの選択は、パッチ設計用に取り置かれている複数の臨床的生物試料からの複数の臨床的核酸試料を用いてなされ得る（例えば、参照データベース、又は予備研究）。例えば、試料についての第１のセットを用いてパッチ設計用の興味対象とされるＣｐＧサイトを選択でき、また、試料についての第２のセットを用いて各々のパッチの各々のインスタンスに分類のために投入をなし得る。

【0179】

方法のＣｐＧを選択するステップは、臨床的対象についての第１のセットと臨床的対象についての第２のセットとの間での複数の固定長領域中の各固定長領域のＣｐＧサイトメチル化パターンのメチル化状態についての各々の第１の相互情報スコアに基づいて、参照ゲノム内での複数の固定長領域の第１の順位を決定するステップをさらに含み得る。そして、第１の順位を用いて、第１のパッチのＣｐＧサイトの第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第１の閾値個数を、複数の固定長領域中のそれらの固定長領域から、選択できる。したがって、高い相互情報スコアは、固定長領域にてのペア組みされた対象間での高いレベルの弁別力を示し得る。固定長領域についての相互情報スコアは、混合モデルを用いて計算され得る。「モデルベースドな特徴化及び分類」と題する米国特許広報第２０２０－０３６５２２９号を参照されたいのであり、これは参照によって取り込まれる。混合モデルは、全体母集団内にての部分母集団の存在を表す統計的モデルとされ得る。固定長領域は、外部データベース又はプローブの参照パネルを用いて取得できる（例えば、標的シーケンシング解析にて複数のプローブを用いて取得された領域を選択して、興味対象たるＣｐＧサイトの取得元とすべき興味対象たる領域を識別する）。固定長領域は、ゲノム全体に亘って又は参照パネルに亘ってスライドして行く固定長「スライディング窓」を用いて取得できる。

【0180】

例えば、ＣｐＧサイトの第１の独立セットはスライディング窓（例えば、100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000,又は2000塩基対（ｂｐ）の窓）によって選択できるのであり、これはゲノミック領域に亘ってスライドするのであり（例えば、標的シーケンシング解析のプローブに対応するゲノミック領域）、２つの臨床的対象から取得された２つの臨床的生物試料の間でのペア毎の比較を伴ってなされる。スライディング窓の各フレームに関して相互情報スコアを計算できるのであり、スライディング窓の各々のフレーム内のＣｐＧサイトの統計的モデル（例えば、混合モデル）を用いてこれをなし得る。相互情報スコアは、スライディング窓の各々のフレーム内の各々の領域での、第１の癌状態対第２の癌状態についてのメチル化パターンの確率を表し得るのであり、したがって、各々の領域の弁別力がこれにて示される。相互情報スコアは、同様に、スライディング窓の各フレーム内の各領域についてそれが選択されたゲノミック領域に亘って進行していくに従って計算できる。

【0181】

スライディング窓の長さは１０ｂｐ未満、１０～５０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、１００～２００ｂｐ、２００～５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、１０００～２０００ｂｐ、２０００～５０００ｂｐ、又は５０００ｂｐ超とされ得る。スライディング窓の長さは２５６ｂｐとされ得る。スライディング窓の固定長領域は、５個未満のＣｐＧサイト、５～１０個のＣｐＧサイト、１０～２０個のＣｐＧサイト、２０～５０個のＣｐＧサイト、５０～１００個のＣｐＧサイト、１００～２００個のＣｐＧサイト、２００～５００個のＣｐＧサイト、又は５００個より多いＣｐＧサイトを備え得る。

【0182】

複数の固定長領域（窓）についての第１のランク付けは、固定長領域を、相互情報スコア（mutual information score）について降順又は昇順でランク付けすることによってなし得る。固定長領域は１つ以上のＣｐＧサイトを含み得るのであり、また、ＣｐＧサイトの第１の独立セットは、トップランク相互情報固定長領域（top-ranking mutual information fixed length region）から取得されたＣｐＧサイトを含み得る。ＣｐＧサイトの第１の独立セットは、トップランク相互情報固定長領域を含み得る。

【0183】

複数の臨床的対象は、癌状態についての第３の兆候を有する臨床的対象についての第３のセットと、癌状態についての第４の兆候を有する臨床的対象についての第４のセットとを含み得るのであり；選択をなすことは：臨床的対象についての第３のセットと臨床的対象についての第４のセットとの間での複数の固定長領域中の各固定長領域のＣｐＧサイトメチル化パターンについての各々の第２の相互情報スコアに基づいて、複数の固定長領域の参照ゲノム内での第２の順位を決定することと；第２の順位を用いて第１のパッチのＣｐＧサイトの第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第２の閾値個数を選択することとをさらに含み得る。

【0184】

固定長領域についてのそれぞれの相互情報スコアは、臨床的対象についての第１のセットと臨床的対象についての第３のセットとの間で、臨床的対象についての第１のセットと臨床的対象についての第４のセットとの間で、臨床的対象についての第２のセットと臨床的対象についての第３のセットとの間で、及び／又は臨床的対象についての第２のセットと臨床的対象についての第４のセットとの間で、計算できる。複数の臨床的対象は、５個以上、１０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１０００個以上、２０００個以上、５０００個以上、１０，０００個以上、又は２０，０００個以上の臨床的対象のセットを含み得るのであり、臨床的対象の各セットは、癌状態についての対応する兆候を有する。

【0185】

第１のパッチについてのＣｐＧサイトの第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第１及び／又は第２の閾値個数を、複数の固定長領域内のトップランク相互情報固定長領域（top-ranked mutual information fixed length region）を用いて選択できる（例えば、比較にて用いられる癌状態を問わずに固定長領域から取得された最高の相互情報スコアを有するＣｐＧサイト）。第１のパッチについてのＣｐＧサイトの第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第１及び／又は第２の閾値個数を、相互情報スコア（mutual information score）が計算されたそれぞれの各々の臨床的対象ペアのトップランク相互情報固定長領域を用いて、選択できる（例えば、最高の相互情報スコアを有する固定長領域であって、全てのペア毎の比較は選択されたＣｐＧサイトのセットで表されていること）。トップ100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000,又は2000の相互情報固定長領域は、複数のペア毎の比較におけるそれぞれの各々の臨床的対象ペアについて、相互情報スコアのランキングに基づいて、選択できる。各々の固定長領域についての相互情報スコアは、臨床的対象についてのペア毎での複数の比較に関して、弁別的と看做し得る。

【0186】

構築することは、第１のパッチに割り当てられた各々の断片を、それらの第１の相互情報スコアに基づいて、ソートすることをさらに含み得る（例えば、固定長領域は、相互情報スコアについて最低から最高へとソートされる又は相互情報スコアについて最高から最低へとソートされる）。第１のパッチ内のＣｐＧサイトの第１の独立セットは、固定長領域及び／又は固定長領域から取得されたＣｐＧサイトを含み得るのであり、これらは相互情報スコアの順序で配列され得る（例えば、昇順又は降順）。癌状態についての第１の兆候は第１の癌タイプとされ得るのであり、また、癌状態についての第２の兆候は第２の癌タイプとされ得る。そして、臨床的対象間でのペア毎での複数の比較は、任意の２つの癌タイプの間での任意の可能なペア毎での比較とされ得る（例えば、乳癌対肺癌）。

【0187】

第１のパッチのＣｐＧサイトの第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第１の閾値個数中のそれぞれの各々のＣｐＧサイトに関しては、ＣｐＧサイトの第１の閾値個の中のあらゆる他のＣｐＧサイトから参照ゲノム内において閾値個の剰余部をもってパディングがなされ得る（例えば、パッチ内に含められるためには、固定長領域から取得された各ＣｐＧサイトは、少なくとも10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100又は200個の剰余部によってパディングされ得る）。複数の断片はアレイベースドメチル化シーケンシングによって取得でき、また、第１の臨床的対象と第２の臨床的対象との間の複数のＣｐＧサイト内の各ＣｐＧサイトのメチル化状態についての参照ゲノム中の複数のＣｐＧサイトの第１のランキングは、β値又はＭ値に基づいていることができる。

【0188】

複数のＣｐＧメチル化パターン（CpG methylation pattern）の評価を通じての第１のパッチ用になされるＣｐＧサイトの第１の独立セットの選択は、第１のパッチについてＣｐＧサイトの第１の独立セットを選択すること及び第２のパッチについてＣｐＧサイトの第２の独立セットを選択することをさらに含み得る。複数のＣｐＧメチル化パターンの評価を通じての第１のパッチ用になされるＣｐＧサイトの第１の独立セットの選択は、複数のパッチ内の各々のパッチについてＣｐＧサイトの各々の独立セットを選択することをさらに含み得る。

【0189】

分類器の予測及び訓練
方法は、前記第１のパッチを含む複数のパッチを構築するための命令をさらに含み、それぞれの各々のパッチは前記参照ゲノム中のＣｐＧサイトについての異なる独立セットのためのものである。 前記第１のパッチを構築するステップでは、前記第１のパッチを含む複数のパッチを構築し得る。上述の分類器は、１つ以上の第１段階モデル及び第２段階モデルを含み得る。前記第１段階モデルは、予め訓練された（又は訓練済み）モデルとされ得る。さらに、上述した少なくとも第１のパッチを分類器に適用することは複数の特徴要素を含む特徴ベクトルを取得（obtain）することを伴い得るのであり、ここで、前記複数の特徴要素中の各特徴要素は、前記複数の（plurality）パッチ中の各々のパッチを前記対応する第１段階モデルに適用した際の、前記１つ以上の（one or more）第１段階モデル中の対応する第１段階モデルの出力である（前記各パッチは、例えば、検査対象からのメチル化核酸断片から獲得（acquire）されたデータから形成され得る）。前記少なくとも１つのパッチを分類器に適用するステップは、前記特徴ベクトルを前記第２段階モデルに適用してそれによって前記検査対象にての前記癌状態を決定するステップをさらに含み得る。

【0190】

複数のパッチは、１０～１００００パッチ又は１００～３０００パッチとされ得る。図７Ａは、幾つかの実施形態によるＫ個のパッチのセットについて例示するのであり、複数の訓練済み第１段階モデルは訓練済みモデル１、訓練済みモデル２、．．．、訓練済みモデルＫを含み、ここで、Ｋは正の整数（例えば２～３０００）である。第１段階モデルはパッチレベル分類器を含み得るのであり、第２段階モデルは試料レベル分類器を含み得る。特徴ベクトルを第２段階モデルに適用すると、検査対象が癌であるか非癌であるかを決定できるのであり、或いは、原発組織、原発臓器、癌タイプ、及び／又は癌ステージを識別できる。特徴ベクトルの第２段階（second stage）モデルへの適用は応答的な態様にてなされ得るのであり、第１段階（first stage）モデルにて肯定的に分類されたパッチ（例えば、癌陽性）が第２レベル（second level）分類器に適用されるようになされる。図７ＡはＫ個の訓練済みモデルを例示するも、一部の他の実施形態では、Ｋこのパッチのセットは、Ｋ個の訓練済みモデルの代わりに１つのモデル用の入力データたり得る。該１つのモデルは、訓練済み又は未訓練なもののどちらかとされ得る。この場合、該１つのモデルはＫ個のパッチをもってさらに訓練され得るのであり、Ｋ個のパッチが訓練試料から取得されているのならばこれは逐次的又は並列的のどちらかの態様にてなされ得る。別の状況下では、該１つの訓練されたモデルは癌状態を決定するために又はＫ個のパッチが検査試料から取得されたのならば第２段階モデル（例えば、試料レベル分類器）によるＫ個のパッチに基づいたさらなる分析のためのデータを提供するために用いられ得る。

【0191】

前記１つ以上の第１段階モデル中のそれぞれの各々の第１段階モデルは対応するＣＮＮを含み得るのであり、 前記第１のパッチの前記第１のチャンネルは２次元的なものを含み得るのであり、前記第１のパッチの前記第１の複数のパラメータの前記複数のインスタンスのそれぞれの各々のインスタンスは第１の次元を構成しており、また、前記第１のパッチの前記第１の複数のパラメータは前記第２の次元を構成している（例えば、図７Ａのパッチ５３０－１について図示）。第２段階モデルは、ロジスティック回帰モデルを含み得る。「異常断片の検出及び分類」と題する米国特許広報第２０１９－０２８７６５２号を参照されたいのであり、これは参照によって取り込まれる。第２段階モデルは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を含み得る。分類に用いられた場合、ＳＶＭは、２値ラベル付けがなされたデータ訓練セットを、ラベル付けがなされたデータから最遠の超平面から、分離できる。線形分離が不能である場合、ＳＶＭは「カーネル」系手法と協働でき、これは特徴空間への非線形写像を自動的に実現する。ＳＶＭによって特徴空間にて見出された超平面は、入力空間内の非線形決定境界に対応し得る。第２段階モデルは任意の機械学習モデル又は統計的モデルを含み得るのであり（例えば、決定ツリーモデル、ランダムフォレストモデル、単純ベイズ、K-Nearest Neighbors、ストキャスティック勾配降下等）、これは本明細書にて開示された任意のデータ又は情報に基づいて分類をなし得る。

【0192】

分類器は、複数の第１段階モデル（例えば、図７Ａの訓練済み／未訓練モデル）と、動的ニューラルネットワーク（例えば、図７Ａの試料レベル分類器）とを備え得る。方法は、前記第１のパッチを含む複数のパッチを構築するステップをさらに含み、それぞれの各々のパッチは前記参照ゲノム中のＣｐＧサイトについての異なるセットのためのものである。 前記第１のパッチを構築するステップは、前記第１のパッチを含む各々のパッチを構築することを含み得る。少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用するステップは、前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチを前記複数の第１段階モデル中の対応する第１段階モデルに適用することを含み得る。前記対応する第１段階モデルは、次のものを含み得る：ｉ）前記各々のパッチを受けるための各々の入力層であって、前記各々のパッチは第１の次元数を含んでいる、各々の入力層と；ｉｉ）対応する重みセットを含む各々の完全接続埋め込み層であって、前記各々の完全接続埋め込み層は前記各々の入力層の出力を直接的又は間接的に受けるのであり、また、前記各々の埋め込み層の各々の出力は前記第１の次元数より少ない第２の次元数とされる、埋め込み層と；ｉｉｉ）前記各々の完全接続埋め込み層からの出力を直接的又は間接的に受ける各々の出力層。前記対応する第１段階モデルは、１つ以上の畳み込み層をさらに含み得る。前記１つ以上の畳み込み層は、前記各々の入力層と前記各々の完全接続埋め込み層との間に配置され得る。前記１つ以上の畳み込み層は、少なくとも次の層数を有し得る：１，２，３，４，５，又はそれ以上。一部の実施形態では、前記１つ以上の畳み込み層は、多くとも次の層数を有し得る：５，４，３，２，又はそれ以下。第１段階モデル中の複数の畳み込み層に関しては、各々の入力層に接続された第１の畳み込み層のニューロンは、各々の入力層によって受信される各々のパッチ内（例えば、２次元画像）の全ての画素に接続されていないことがある。同様に、第２の畳み込み層のニューロンは、第１の畳み込み層の全てのニューロンに接続されていないことがある。この場合、第１の畳み込み層のサイズは各々の入力層のサイズよりも小さいことがあり、及び／又は第２の畳み込み層のサイズは第１の畳み込み層のサイズよりも小さいことがある。少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用するステップは、前記複数の第１段階モデル中の各訓練済み第１段階モデルのそれぞれの各々の完全接続埋め込み層からの前記各々の出力の集約したものを、前記動的ニューラルネットワーク（例えば、試料レベル分類器）内へと入力して、それによって前記検査対象にての癌状態を決定することをさらに含み得る。それぞれの各々の完全接続埋め込み層はそれぞれの各々のパッチ（例えば、領域）についての値のセット（例えば、スコア）を表し得るのであり、また、領域毎のスコアのセットは埋め込みサイズを示し得る。

【0193】

前記複数の第１段階モデル中のそれぞれの各々の第１段階モデルの前記各々の埋め込み層の前記各々の出力は、３２個から１０４８個の値を有するセットとされ得る。前記複数の第１段階モデル中のそれぞれの各々の第１段階モデルの前記各々の埋め込み層の前記各々の出力は、１２８とされ得る。

【0194】

前記複数の第１段階モデル中の各訓練済み第１段階モデルのそれぞれの各々の完全接続埋め込み層からの前記各々の出力の集約したものは、それぞれの各々のパッチについての前記各々のスコアについての連結とされ得る。例えば、図７Ｂは分類器の例について例示するのであり、分類器はパッチ畳み込みニューラルネット（パッチＣＮＮ）であり、２段階分類がメチル化シーケンシングからの断片を用いてなされる。それぞれの各々の第１段階モデルは、対応する要素をそれぞれの各々のパッチについての各々のパッチ特徴を含む特徴ベクトル内へと出力するパッチレベル特徴抽出機を含み得るのであり、試料レベル分類器は、ロジスティック回帰モデル又はＳＶＭを含み得る。少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用するステップは、複数のチャンネルを備える複数のパッチを前記分類器に適用することを含み得るのであり、前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチは対応する第１段階モデル（例えば、図７Ｂの対応するＣＮＮ）内へと入力される。

【0195】

分類器は、１つの第１段階モデル及び機械学習／統計モデル（例えば、図７Ａの動的ニューラルネットワーク又は試料レベル分類器）を備え得る。方法は、前記第１のパッチを含む複数のパッチを構築するステップをさらに含み、それぞれの各々のパッチは前記参照ゲノム中のＣｐＧサイトについての異なるセットのためのものである。 前記第１のパッチを構築するステップは、前記第１のパッチを含む各々のパッチを構築することを含み得る。前記複数のパッチを分類器に適用するステップは、前記複数のパッチを第１段階モデル（例えば、ＣＮＮ）に適用することを含み得る。この場合、第１段階モデルは、ｉ）逐次的又は並列的のどちらかの態様で前記複数のパッチを受信するための入力層であって、前記複数のパッチの第１のパッチは第１の次元数を含む、入力層と；ｉｉ）対応する重みセットを含む各々の完全接続埋め込み層であって、前記各々の完全接続埋め込み層は前記入力層の出力を直接的又は間接的に受けるのであり、また、前記埋め込み層の出力は前記第１の次元数より少ない第２の次元数を含む、埋め込み層と；ｉｉｉ）前記完全接続埋め込み層からの出力を直接的又は間接的に受ける出力層とを含み得る。前記第１段階モデルは、１つ以上の畳み込み層をさらに含み得る。前記１つ以上の畳み込み層は、前記入力層と前記完全接続埋め込み層との間に配置され得る。前記１つ以上の畳み込み層は、少なくとも次の層数を有し得る：１，２，３，４，５，又はそれ以上。一部の実施形態では、前記１つ以上の畳み込み層は、多くとも次の層数を有し得る：５，４，３，２，又はそれ以下。第１段階モデル中の複数の畳み込み層に関しては、入力層に接続された第１の畳み込み層のニューロンは、入力層によって受信されるパッチ内（例えば、２次元画像）の全ての画素に接続されていないことがある。同様に、第２の畳み込み層のニューロンは、第１の畳み込み層の全てのニューロンに接続されていないことがある。この場合、第１の畳み込み層のサイズは入力層のサイズよりも小さいことがあり、及び／又は第２の畳み込み層のサイズは第１の畳み込み層のサイズよりも小さいことがある。前記複数のパッチを分類器に適用するステップは、前記完全接続埋め込み層からの出力を機械学習／統計モデル内へと入力して、それによって前記検査対象にての癌状態を決定することをさらに含み得る。完全接続埋め込み層は各パッチ（例えば、領域）についての値のセット（例えば、スコア）を表し得るのであり、また、領域毎のスコアのセットは埋め込みサイズを示し得る。

【0196】

分類器は、複数の第１段階モデルと機械学習／統計モデル（例えば、図７Ａの動的ニューラルネットワーク又は試料レベル分類器）とを備え得るのであり、複数の第１段階モデルの個数は１つ以上のパッチの個数より少ない。例えば、分類器は２つの第１段階モデル（例えば、２つのＣＮＮ）を含み得るのであり、パッチの個数は１０００とされ得る。この場合、１０００個のパッチの一部（例えば、４００個のパッチ）は２つの第１段階モデルの一方への入力データとされ得るのであり、また、該１０００個のパッチの残余の部部（例えば、６００個のパッチ）は２つの第１段階モデルのもう片方への入力値とされ得る。

【0197】

方法では、対象についてのコホートを用いて前記１つ以上の第１段階モデル（例えば、図７ＢのＣＮＮモデル）及び前記動的ニューラルネットワーク（例えば、図７Ｂの試料レベル分類器）を訓練するステップをさらに伴い得るのであり、前記対象についてのコホートは、前記癌状態に関する第１のラベルを有する対象についての第１のサブセットと、前記癌状態に関する第２のラベルを有する対象についての第２のサブセットとを含む。前記訓練するステップは、ａ）ランダムな態様で対象についての前記コホートを癌状態、年齢、喫煙状態、又は性別の任意の組合せに基づいて複数の群に階層化するステップと；ｂ）前記複数の群中の第１の群を訓練群として及び前記複数の群の残部を検査／検証群として用いて、前記１つ以上の第１段階モデル（例えば、図７ＢのＣＮＮモデル）及び前記動的ニューラルネットワーク（例えば、図７Ｂの試料レベル分類器）を前記訓練群に対して訓練するステップと；ｃ）前記複数の群中の各群について前記用いるステップ（ｂ）を反復するステップであって、前記複数の群中の各群が前記訓練群として前記用いるステップ（ｂ）の反復回にて用いられるようにするステップと；ｄ）分類器性能基準が充足されるまで前記の階層化ステップ（ａ）、用いるステップ（ｂ）、及び反復ステップ（ｃ）を反復するステップとを伴う。訓練群は、対象についてのコホートから取得された情報又はデータの少なくとも10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%又はそれ以上を含み得る。この場合、検査群は、多くとも、対象についてのコホートから取得された情報又はデータの90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%又はそれ以下を含み得る。一部の実施形態では、訓練群は、多くとも、対象についてのコホートから取得された情報又はデータの90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%又はそれ以下を含み得る。この場合、検査群は、対象についてのコホートから取得された情報又はデータの少なくとも10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%又はそれ以上を含み得る。分類器の性能は、対象についてのコホートにわたって次の百分率となり得る：40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98.5, 99, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8,又は99.9パーセント（精度）であり、これは次の特異度でもたらされる：80, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98.5, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8,又は99.9パーセント（特異度）。

【0198】

例えば、分類器は、（対象についてのコホートに関して）患者試料を取得することによって訓練でき、そのような患者の各々はそれらの癌状態をもってラベル付けされるのであり、そのような対象についてのメチル化データを用いて複数のパッチに投入する（例えば、他のものもあるが、相互情報、先験的な知識、ハイパーパラメータ、及び／又は既存のモデル等のパッチ設計の方法を用いてこれがなされる）。各々のパッチに投入されるそれぞれの各々の試料について、癌状態指標は、患者ラベルに対してのパッチレベル分類器訓練のためにパッチに割り当てられることができる（例えば、複数の第１段階モデルを訓練すること）。

【0199】

複数の第１段階モデルを備える分類器に関しては、各第１段階モデル（例えば、パッチレベルＣＮＮ）については、２値分類器として訓練して且つ特徴抽出機として用いることができ、また、それぞれの各々の第１段階モデルの出力（例えば、パッチレベルＣＮＮ）は、複数の第１段階モデルに対応する複数の領域にわたって連結された中間特徴ベクトル（intermediate feature vector）とされ得る。そのような各中間ベクトル（intermediate vector）は、コホート中の異なる患者に対応する。それぞれの各々の第１段階モデルの出力は、各々の第１段階モデル内の中間完全接続分類層からの複数の活性化（例えば、ＲｅＬＵ（rectified linear unit activation）の出力、tanh、sigmoid等）を含み得る。（対応するパッチの入力に応答する）それぞれの各々の第１段階モデルからの活性化事象をもって各々の総合スコア又は各対象についての埋め込みのベクトルを生成するのに用い得る。例えば、深い且つ広い大深度ニューラルネット（ＤＮＮ、deep-and-wide deep neural net）分類器としての試料レベル分類器は、各々の総合スコア又は各対象についての埋め込みのベクトル及び各々のラベルについて訓練できる。

【0200】

上述した複数の第１段階モデル（例えば、ＣＮＮ）及び試料レベル分類器（例えば、動的ニューラルネットワーク）は、３×６重クロス検証を伴い得る。クロス検証では、訓練データセット（training dataset）をより小さな訓練データセットと検証データセット（validation dataset）とに分割し、そして、第１段階モデルをより小さな訓練セット（training set）に対して訓練し、また、第１段階モデルを検証データセットに対して評価することを伴い得る。例えば、訓練データセットは、６つのビンに再分割され得るのであり、これらは興味対象たる全分類及び／又は生物学的先行事項に関して等価的に階層化されており（例えば、癌／非癌、癌タイプ、癌ステージ、年齢、及び／又は喫煙状態が含まれるもこれらには限定されない）、各訓練ビンは可能な限り均質的になるようにされている。訓練は、（上述のように）６つのビンのうちの５つを用いてなし得るのであり、検証（クロス検証）は第６のビンでなし得る。この処理を６回反復して、６つのビンのそれぞれが各１回検証に用いられるようにできる。訓練データセットに対してランダム化をなしてシャッフルを３回なして、階層化、訓練、及び検証を反復して合計１８回の訓練回がなされるようにできる。分類器性能尺度は、データセットについての３重ランダム化とすることができる。第１段階モデル及び第２段階モデルの双方についての訓練を、３×６重クロス検証のそれぞれの各々の反復回に際してなし得る。３×６重クロス検証を用いるのではなく、Ｐ×Ｑ重クロス検証を用いることもでき、ここでＰ及びＱは正の整数とされ、これらの値は同じ又は異なるものとし得る。訓練データセットは、Ｐ個のビンに再分割され得るのであり、これらは興味対象たる全分類及び／又は生物学的先行事項に関して等価的に階層化されており（例えば、癌／非癌、癌タイプ、癌ステージ、年齢、及び／又は喫煙状態が含まれるもこれらには限定されない）、各訓練ビンは可能な限り均質的になるようにされている。訓練は、（上述のように）Ｐ個のビンのうちのＰ－１個を用いてなし得るのであり、検証（クロス検証）は第Ｐ番目のビンでなし得る。この処理をＱ回反復して、Ｐ個のビンのそれぞれが各１回検証に用いられるようにできる。訓練データセットに対してランダム化をなしてシャッフルをＰ回なして、階層化、訓練、及び検証を反復して合計Ｐ×Ｑ回の訓練回がなされるようにできる。Ｐは、少なくとも2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20又はそれ以上とし得る。Ｑは少なくとも2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20又はそれ以上とし得る。

【0201】

前記癌状態は原発組織（tissue of origin）（或いはＴＯＯ）を含み得るのであり、また、対象についての前記コホート中の各対象は原発組織をもってラベル付けされる。コホートは、任意のタイプの癌又は本明細書の他の箇所で説明される癌の組合せを有する対象を、含み得る。前記癌状態は指定癌のステージを含み得るのであり、また、対象についての前記コホート中の各対象は指定癌のステージをもってラベル付けされている。コホートは、任意のタイプの癌のステージ又は本明細書の他の箇所で説明される癌の組合せを有する対象を、含み得る。前記癌状態は対象が癌を有するか否かについての事項を含み得るのであり、また、前記階層化ステップ（ａ）によって前記複数の群中の各群の癌を有する対象数と癌を有さない対象数とが等しくなることを担保する。

【0202】

本開示の分類器の訓練可能パラメータの個数は、訓練中の各々のデータセットに対してスケーリングされ得る（例えば、ＶＧＧＮｅｔ：１億４０００万個の訓練可能パラメータであるのに対して、パッチＣＮＮ１６：345,000個の訓練可能パラメータ）。ドロップアウトを適用して過剰適合を制御でき、また、小規模訓練セットの分類を向上させ得るのであり、学習済み重み付け済みアンサンブルを作成すること及びネットワーク複雑度を減じることによってそれはなされ得る。最大で５０％のドロップアウトを適用し得る。前記訓練は、前記訓練中に前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチの各々の出力層から提供された値に基づいたＬ１正規化（Lasso（投げ縄）回帰）又はＬ２正規化（Ridge（尾根）回帰）を用いて前記複数のパッチ中の１つ以上のパッチを除去できる。Ｌ２正規化は、最大で１０％の係数及びハイパーチューンされたバッチサイズを伴って用い得る。訓練によって複数のパッチ中の１つ以上のパッチを除去でき、限定されたエポック数を伴う早期ストップ及び／又はメトリックベースド早期ストップを用いてこれをなせる。０．５と設定されるアグレッシブなドロップアウト、Ｌ１正規化、減衰学習レート、Adamオプティマイザ、及び２５６と設定される大きなバッチサイズを用いて訓練をなし得る。減衰学習レートではなく、傾斜三角形学習レートを用いて訓練をなし得る。

【0203】

原発組織、原発臓器、癌タイプ、及び／又は癌ステージについてのマルチクラス分類器を訓練するために、癌／非癌についての訓練された２値分類器から取得された特徴ベクトルを用い得る。癌／非癌分類器からマルチクラス（例えば、原発組織）分類器への移転学習により、原発組織分類器における精度増強が結果としてもたらされ得る。「移転学習を用いて対象が癌状態となっているかを決定するシステム及び方法」と題する米国特許出願第６２／８５１，４８６号（出願日：２０１９年５月２２日）を参照されたいのであり、そのような移転学習に関する開示についてはこれが参照によって取り込まれる。マルチクラス分類器の精度向上は、１％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、又は５０％超となり得る。

【0204】

分類器（classifier）は、（図７Ｂに示示されるようにパッチ毎に１つとされる）１つ以上のＣＮＮ分類器（CNN classifier）を備えるパッチＣＮＮ分類器（patch CNN classifier）を備え得るのであり、試料レベル分類器（sample level classifier）がそれに続くのであり、これは複数のＣＮＮ分類器にて抽出された特徴に対してaverage-プーリング、max-プーリング、3-normプーリングによるパッチアグレゲーション、ガウジアンスムージングを伴うか伴わないロジスティック回帰、又はmeansモデリングをなす。分類器（classifier）は、（図７Ｂに示示されるようにパッチ毎に１つとされる）１つ以上のＣＮＮ分類器を備えるパッチＣＮＮ分類器を備え得る。そのようなＣＮＮの各々は予め訓練されたＣＮＮモデルを用い得る。予め訓練されたＣＮＮモデルは、画素化画像データ（例えば、ＲＧＢ画素化画像）について訓練がなされた畳み込みニューラルネット（neural net）の１つ以上の層を、用い得る。そのような予め訓練されたＣＮＮモデルの例としては、LeNet、AlexNet、VGG11、VGGNet 16、GoogLeNet、又はResNetを挙げ得るがこれらには限定されはしない。予め訓練されたＣＮＮモデルは、多層ニューラルネット、ディープ畳み込みニューラルネット、視覚幾何畳み込みニューラルネット、又はそれらの組合せを備え得る。予め訓練されたＣＮＮモデルは、畳み込みニューラルネットワーク（neural network）の分類層を除いて、非生物学的データについて訓練がなされた畳み込みニューラルネットワークの全ての層を、備え得る。予め訓練されたＣＮＮモデルは、１６層訓練済みＣＮＮモデルとされ得る。試料レベル分類器は、訓練済み１６層ＣＮＮモデルを備え得る。

【0205】

第１レベル分類器用の例示的ネットワークアーキテクチャが以下の表２にて詳述されており、これは２つの完全接続層及びsoftmax出力層を伴ったカスタマイズされたＶＧＧ－１１畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ、convolutional neural network）アーキテクチャに関する。伝統的なＶＧＧ－１１は、３ｘ３サイズの畳み込みフィルタを有することができ、また、ＲｅＬＵ活性化関数を用いることができる。このカスタマイズされたＶＧＧ－１１ＣＮＮについて述べるに、畳み込みフィルタ（例えば、畳み込みカーネル）の形状は１ｘ３に調整できて断片パイルアップに際して断片内シーケンスをキャプチャでき（マトリックスについての２次元畳み込み（Conv2d）を伴う）、ＲｅＬＵ（rectified linear unit activation）の代わりにリーキーなＲｅＬＵ活性化関数を用いることができる。

【表2】

【0206】

本開示の別の態様では、種に属する検査対象の癌状態を決定するための方法を提供するのであって、少なくとも１つのプロセッサと前記少なくとも１つのプロセッサによって実行される少なくとも１つのプログラムを格納するメモリとを備えたコンピュータシステムにてなされ得る。前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令を含み得る：電子的態様にてデータセットを取得するステップであって、該データセットは複数の断片中のそれぞれの各々の断片の対応するメチル化パターンを備え得る、ステップ。それぞれの各々の断片の前記対応するメチル化パターンは、（ｉ）前記検査対象から取得された生物試料中の前記各々の断片の１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングによって決定され得るのであり、また、（ｉｉ）前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含み得る。

【0207】

前記少なくとも１つのプログラムは、複数のパッチを取得するための命令をさらに含み得るのであり、前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチは、第１のチャンネルを含み得るのであり、且つ、前記種の参照ゲノム中のＣｐＧサイトの対応する独立セットを表す。ＣｐＧサイトの前記対応する独立セット中のそれぞれの各ＣｐＧサイトは、前記参照ゲノム中の所定の位置に対応し得る。各々のパッチの前記第１のチャンネルは第１の複数のパラメータについての複数のインスタンスを含み得るのであり、前記第１の複数パラメータの各インスタンスは前記各々のパッチについてのＣｐＧサイトの前記対応する独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含む。前記少なくとも１つのプログラムは、前記各々の断片（the respective fragment）のＣｐＧサイトと前記単一の各々のパッチ（the single respective patch）のＣｐＧサイトの前記対応する独立セットとの間の合致に基づいて、前記複数の断片中のそれぞれの各々の断片の全部又は一部を、前記複数のパッチ中の各々のパッチに、割り当てるための命令をさらに含み得る。前記少なくとも１つのプログラムは次のステップのための命令をさらに含む：前記複数のパッチ中のそれぞれの各々のパッチを前記複数のモデル中の対応する訓練済みモデルに適用してそれによって前記検査対象にての癌状態を決定するステップ。

【0208】

複数の断片中の各々の断片は、異なるゲノミック位置に整列する一意的な分子断片であることができ、或いは異なるメチル化パターンを含み得る。具体的には、断片は、異なるゲノミック位置に整列する一意的な分子断片であることができ、それぞれの各々の断片（each respective fragment）の全部又は一部を各々のパッチ（respective patch）に割り当てることは、各々の断片（respective fragment）のメチル化パターンに基づいているのではなく、むしろ、各々の断片のＣｐＧサイトと各々のパッチのＣｐＧサイトの対応する独立セットとの間の合致に基づいていることがえきる。

【0209】

方法は、複数のパッチを用いることができる。少なくとも１つのプログラムは、次のようにしてパッチを構築する命令を含まないことがある：ＣｐＧサイトの第１の独立セットに整列したそれぞれの各々の断片について、各々の断片のメチル化パターンに基づいて、第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入すること。対照的に、取得された複数のパッチは以前に構築されたものであることができる。

【0210】

各々の断片（respective fragment）のＣｐＧサイトと各々のパッチ（respective patch）のＣｐＧサイトの対応する独立セットとの間の合致に基づいて複数の断片（plurality of fragments）中のそれぞれの各々の断片（each respective fragment）の全部又は一部を複数のパッチ（plurality of patches）中の各々のパッチに割り当てるステップは、単一の各々のパッチ（single respective patch）に割り当てられた複数の断片中の各々の断片について、次のことを伴い得る：ｉ）単一の各々のパッチの第１のチャンネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、各々の断片中のＣｐＧサイトに対応する、複数の断片中の別の断片によってメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別することと；ｉｉ）単一の各々のパッチの第１のチャンネルの第１の複数のパラメータのインスタンスに関して、識別されたパラメータのうちの各々の断片の各々のＣｐＧサイトに整列する各パラメータについて、各々の断片の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態を割り当てること。

【0211】

核酸試料は、無細胞核酸試料を含み得る。生物試料を処理して、シーケンシング分析の準備として無細胞核酸を抽出できる。生物試料の詳細については、明細書の他の箇所にて説明されている。例えば、無細胞核酸は、K2 EDTA管にて対象から収集された血液試料から抽出され得る。試料は収集後２時間以内に処理でき、血液に対してのダブルスピンをなすのであり、先ず１０００ｇで１０分行って、そして血漿について２０００ｇで１０分行う。そして、血漿は、１ｍｌのアリコートで－８０°Ｃで保管できる。このようにして、無細胞核酸抽出の目的との関係で、生物試料から適切量の血漿（例えば、１～５ｍｌ）を準備できる。無細胞核酸は、QIAamp循環核酸キット（Qiagen）を用いて抽出できるのであり、また、ＤＮＡ懸濁緩衝液内（Sigma）へと溶出することができる。精製された無細胞核酸は、使用される迄は－２０°Ｃにて保管できる。生物学的方法を用いて１つ以上の方法で無細胞核酸を準備できるのであり、シーケンシングの目的のためにそれをなし得る。

【0212】

生物試料の取得時とシーケンス解析等の解析実行時との間の時間を最適化して、解析又は方法の感度及び／又は特異度を向上させ得る。生物試料は、解析実行の直前に取得できる。生物試料は、解析実行の所定期間（例えば、時間単位、日単位、又は週単位）前に取得及び保管されることができる。試料についての解析は、試料を訓練対象から取得した後次の期間内になし得る：１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、又は１年より長い期間。

【0213】

それぞれの各々の対象についての核酸は、標的パネルシーケンシングによって取得でき、対象の生物試料から取られるシーケンスリードに関しては次のようなデータセットを形成できるようにする：遺伝子に関しての当該標的パネルについて少なくともシーケンシング深度が50,000xとなる場合、遺伝子に関しての当該標的パネルについて少なくともシーケンシング深度が55,000xとなる場合、遺伝子に関しての当該標的パネルについて少なくともシーケンシング深度が60,000xとなる場合、又は遺伝子に関しての当該標的パネルについて少なくともシーケンシング深度が70,000xとなる場合。遺伝子の標的パネルは４５０～５００個の遺伝子とすることができる。一部の実施形態では、遺伝子の標的パネルは、５００±５個の遺伝子、５００±１０個の遺伝子、又は５００±２５個の遺伝子とすることができる。

【0214】

シーケンシング方法は、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）を含むことができる。ＷＧＢＳでは１つ以上のメチル化状態ベクトルを識別できるのであり、これについては例えば「異常断片の検出及び分類」と題された米国特許出願第１６／３５２，６０２号（出願日：２０１９年３月１３日）に説明されており、或いは、「モデルベースド特徴付け及び分類」と題する米国仮特許出願第６２／８４７，２２３号（出願日：２０１９年３月１３日）にて開示された任意の手法に沿ってなし得る。以下の実施例１にて説明するように、ＣＣＧＡ１データセットから複数の核酸を生成できる。複数の核酸を処理して、コピー数の値を取得できこれを用いて分類器（例えば、パッチＣＮＮ分類器）を訓練できる。そして、対象からの生物試料から取得された検査データセットは、訓練済み分類器内へと入力でき、対象が疾患状態に陥っているか否かを決定でき、また、一部の実施形態では、疾患状態についてのタイプ、ステージ、及び／又は他の特徴についても含める。高い可変性又は低いマッピング可能性を有するゲノミック領域は、除き得る。

【0215】

標的シーケンシングには、標的ＤＮＡメチル化シーケンシングが含まれ得る。標的ＤＮＡメチル化シーケンシングは、様々な態様にてなされ得る。異なる酵素処理及び化学処理との組合せによってメチル化シトシン又は非メチル化シトシンのいずれかを転換できる。例えば、標的ＤＮＡメチル化シーケンシングでは、複数の核酸中の、１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍｃ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍｃ）を検出できる（ブロック４１０）。別の例を挙げるに、標的ＤＮＡメチル化シーケンシングは、複数の核酸中の１つ以上の非メチル化シトシン又は１つ以上のメチル化シトシンを対応する１つ以上のウラシルに転換することを伴い得る。別の例を挙げるに、標的ＤＮＡメチル化シーケンシングは、複数の核酸中の１つ以上の非メチル化シトシンを対応する１つ以上のウラシルに転換することを伴い得るのであり、ＤＮＡメチル化シーケンスでは１つ以上のウラシルを１つ以上の対応するチミンとして読み出す。標的ＤＮＡメチル化シーケンシングは、複数の核酸中の１つ以上のメチル化シトシンを対応する１つ以上のウラシルに転換することを伴い得るのであり、ＤＮＡメチル化シーケンスでは１つ以上の５ｍｃ又は５ｈｍｃを１つ以上の対応するチミンとして読み出す。

【0216】

図８Ｂは、検査対象の癌状態を決定するための方法８５０について説明する別の例示的フローチャートを示す。方法は、本明細書で開示される環境５００及び／又は処理システム５６０によって実行され得る。

【0217】

方法８５０のステップ８５２は、１つ以上のプロセッサを介して、訓練データセットを１つ以上の訓練対象から取得するステップを含み得る。前記訓練データセットは、前記１つ以上の訓練対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片と関連付けられている１つ以上の訓練メチル化パターンと、前記１つ以上の訓練メチル化パターンに関連付けられている１つ以上の所定の癌状態とを含み得る。訓練データセットは訓練対象の任意の生物学的又はゲノミックな情報を含み得るのであり、次の事項がふくまれるもこれらには限定されはしない：ゲノムの全部又は一部の主核酸シーケンスに関する情報（例えば、塩基多型、インデル、シーケンス再配列、変異頻度等の有無等）；ゲノム内の１つ以上の特定のヌクレオチドシーケンスのコピー数（例えば、コピー数、対立遺伝子頻度分率、単一染色体又は全ゲノムの倍数性等）；ゲノムの全部又は一部のエピジェネティック状態（メチル化等の共有結合核酸修飾、ヒストン修飾、ヌクレオソーム配置等）；並びに生命体のゲノムの発現プロファイル（例えば、遺伝子発現レベル、アイソタイプ発現レベル、遺伝子発現比等）。

【0218】

前記１つ以上の訓練メチル化パターンは、前記１つ以上の訓練対象から取得された前記１つ以上の生物試料中の前記複数の断片を含む１つ以上の核酸試料の少なくとも１つのメチル化シーケンシングによって決定され得る。前記１つ以上の訓練メチル化パターンは、前記１つ以上の訓練対象から取得された前記１つ以上の生物試料中の前記複数の断片中の各ＣｐＧサイトの少なくとも１つのメチル化状態を含み得る。訓練メチル化パターンは、訓練対象のメチル化パターンとされ得る。訓練対象は、情報が計算モデルを訓練するために用いられる任意の対象とされ得る。訓練対象は、検査対象とは異なり得る。対象、計算モデル、メチル化パターン、及びどのようにしてメチル化パターンを決定するかについての詳細は、本明細書の他の箇所にて説明されている。１つ以上の所定の癌状態は、本明細書の他の箇所にて説明されている任意の癌状態とすることができる。

【0219】

方法８５０のステップ８５４は、１つ以上のプロセッサを介して、訓練データセットに基づいて１つ以上のパッチを構築するステップを含み得る。１つ以上のパッチの各パッチは、１つ以上のチャンネルを含み得る。１つ以上のパッチの各パッチは、種の参照ゲノム中の１つ以上のＣｐＧサイトを表し得る。ＣｐＧサイトの各ＣｐＧサイトは、参照ゲノム中の所定の位置に対応し得る。１つ以上のパッチの各パッチ又は第１のパッチは、種の参照ゲノム中の、ＣｐＧサイトの第１の独立セットを表し得る。ＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中のそれぞれの各ＣｐＧサイトは、前記参照ゲノム中の所定の位置に対応し得る。前記構築ステップは、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに整列した前記１つ以上の訓練対象から取得された１つ以上の生物試料中の前記複数の断片中のそれぞれの各々の断片について、前記各々の断片の前記訓練メチル化パターンに基づいて、前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入する又は埋めることを含み得る。ＣｐＧサイトの第１の独立セット、インスタンス、パラメータ、１つ以上のパッチ、及び１つ以上のパッチをどう構築するかについては、本明細書の他の箇所にて更に説明されている。

【0220】

１つ以上のチャンネルは、第１のチャンネルを含み得る。第１のチャンネルは、第１の複数のパラメータについての複数のインスタンスを含み得る。第１の複数パラメータの各インスタンスは、１つ以上のパッチについてのＣｐＧサイトの第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含み得る。この場合、１つ以上の訓練対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片中の各々の断片について構築をなすステップは、次のことを含み得る：ｉ）第１のチャンネルの第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、各々の断片中のＣｐＧサイトに対応する、複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別することと、ｉｉ）識別されたパラメータのうちの各々の断片の対応するＣｐＧサイトに整列する各パラメータについて、各々の断片の対応するＣｐＧサイトのメチル化状態を割り当てること。パラメータをどう識別するか及びどうメチル化状態を割り当てるかについての更なる詳細は、本明細書の他の箇所にて説明されている。

【0221】

１つ以上のチャンネルは、第２のチャンネルを含み得る。第２のチャンネルは、第１のチャンネルとは異なる情報を含み得る。前記第２のチャンネルは、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスについての第２の複数のパラメータについての対応するインスタンスを含み得る。前記第２の複数のパラメータの各インスタンスは、前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのＣｐＧメチル化状態以外の第１の特徴についてのパラメータを含み得る。１つ以上のチャンネルは、第３のチャンネルを更に含み得る。第３のチャンネルは、第１／第２のチャンネルとは異なる情報を含み得る。前記第３のチャンネルは、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスについての第３の複数のパラメータについての対応するインスタンスを含み得る。前記第３の複数パラメータの各インスタンスは、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトの第２の特徴についてのパラメータを含み得る。１つ以上のチャンネルの個数は少なくとも、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10又はそれ以上とされ得る。一部の実施形態では、１つ以上のチャンネルの個数は多くとも10, 9, 8, 7, 6, 5又はそれ以下とされ得る。１つ以上のチャンネルの個数が１より大きい場合、１つ以上のチャンネルの各チャンネルは、１つのタイプの特徴（例えば、第１の特徴）と関連付けられている一意的な情報を含み得る。例えば、図６Ｂの６つのチャンネルの各々は、メチル化状態、ベータcontrol、ベータsample、ｐ値、多重度、又は先行事項に関連する情報を含むことができる。この例では、６つのチャンネルの各チャンネルは、他のチャンネルとは異なる情報を含み得る。１つ以上のチャンネルの詳細（例えば、第１の特徴や第２の特徴）は、本明細書の他の箇所にて説明されている。

【0222】

ステップ８５４前にて或いは癌状態の決定の任意の段階にて、方法８５０は、１つ以上の訓練対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片に対してプルーニングを行うステップを含み得るのであり、これは次のことによってなし得る：複数の断片からそれぞれの各々の断片であって各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイトにわたっての対応するメチル化パターンがｐ値閾値を充足しないｐ値を有する断片を除去すること。ｐ値、ｐ値閾値、及び複数断片のプルーニングについての詳細は、本明細書の他の箇所にて説明されている。

【0223】

方法８５０のステップ８５６は、１つ以上のプロセッサを介して１つ以上のパッチ及び訓練データセットに基づいて計算モデルを訓練するステップを含み得る。計算モデルは、第１段階モデル及び第２段階モデルを備え得る。第１段階モデルは、１つ以上のＣＮＮを備え得る。ＣＮＮは、予め訓練されたＣＮＮを含み得る。予め訓練されたＣＮＮは、画素化画像データ（例えば、ＲＧＢ画素化画像）について訓練がなされた畳み込みニューラルネットの１つ以上の層を、用い得る。そのような予め訓練されたＣＮＮモデルの例としては、LeNet、AlexNet、VGG-11、VGGNet 16、GoogLeNet、又はResNetを挙げ得るがこれらには限定されはしない。予め訓練されたＣＮＮは、カスタマイズされた予め訓練されたＣＮＮを備え得る。カスタマイズされた予め訓練されたＣＮＮは、カスタマイズされたVGG-11畳み込みニューラルネットワークを含み得る。カスタマイズされたVGG-11畳み込みニューラルネットワークは、カスタマイズされたフィルタサイズ及び活性化関数を有し得る。第１段階モデル、ＣＮＮ、第２段階モデル、予め訓練されたＣＮＮ、及びカスタマイズされたVGG-11についての詳細は、本明細書の他の箇所にてさらに説明されている。

【0224】

方法８５０のステップ８５８は、１つ以上のプロセッサを介して検査対象から検査データセットを取得するステップを含み得る。検査データセットは、検査対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片の１つ以上の検査メチル化パターンを含み得る。検査データセットは、検査対象の任意の生物学的又はゲノミックな情報を含み得る。そのような生物学的やゲノミックな情報の詳細については、明細書の他の箇所にて説明されている。１つ以上の検査メチル化パターンは、検査対象から取得された生物試料中の複数の断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化シーケンシングによって決定され得る。１つ以上の検査メチル化パターンは、検査対象から取得された生物試料中の複数の断片中の各ＣｐＧサイトの少なくとも１つのメチル化状態を含み得る。検査メチル化パターンは、検査対象のメチル化パターンとされ得る。

【0225】

方法８５０のステップ８６０は、１つ以上のプロセッサを介して検査データセット及び計算モデルに基づいて検査対象の癌状態を決定するステップを含み得る。決定するステップは、少なくとも第１のパッチを分類器に適用してそれによって検査対象にての癌状態を決定するステップを含み得る。計算モデルは、検査データセットに基づいて、癌対非癌及び／又は原発組織について予測することができる。計算モデルは、癌／非癌／情報性無し、原発組織、原発臓器、癌タイプ、及び／又は癌ステージについて判別するマルチクラス予測をなし得る。

【0226】

本明細書にて説明されている任意の方法は、１つ以上の生物学的先行事項を用いて計算モデル／分類器を更新することをさらに含み得る。生物試料の例としては、地理的情報、喫煙者／非喫煙者、疾患状態ステージ、年齢層、疾患状態の検出容易性、及び／又は性別（生物学的性別）が含まれるが、これらには限定されない更新された計算モデルは、一般的な母集団に適用するための分類器（例えば、マルチクラス分類器）及び数学的計算（例えば、行列の演算）を伴い得る。この場合、数学的計算は分類器の前又は後ろに適用できる。一部の実施形態では、更新された計算モデルは、一般的な母集団に適用するための数学的計算を含む分類器とされ得る。この場合、数学的計算は、分類器に統合されて分類器と共に訓練され得る。分類器は、本明細書にて開示された任意のデータ又は情報に基づいて分類をなし得る本明細書の他の箇所にて開示された任意の機械学習モデル又は統計的モデルを含み得る。分類器がＣＮＮ用パッチを１つ以上含む場合、１つ以上の生物学的先行事項と関連付けられている情報は、１つ以上のパッチの１つ以上のチャンネル内へと統合される場合があり又は統合されない場合がある。数学的計算はナイーブなベイジアン統計計算を含み得るのであり、この場合１つ以上の生物学的先行事項を用いて事後確率を計算できる。本明細書の他の箇所にて説明されているように、数学的計算は計算モデルを修正するための機構たり得るのであり、異なる標的母集団（例えば、異なる大陸にいる患者）への適用のためになされ得る。更新された計算モデルは、異なる標的人口における癌の頻度及び癌タイプの相対頻度を表す情報を、含み得る。癌の頻度には、訓練データセットの頻度分布が含まれ得る。更新された計算モデルによって、異種研究（例えば、本明細書の他の箇所にて説明されているＳＴＲＩＫＥ等）にわたって敷衍可能な性能がもたらされ得る。

【0227】

一部の実施形態では、計算モデルを修正するために、１つ以上の生物学的先行事項には、疾患状態ステージ（例えば、癌ステージ）、疾患状態の検出容易性（例えば、癌の検出容易性）、及び／又は性別（生物学的性別）が含まれ得る。この場合、数学的計算では、ｉ）一般人口の中での癌についての性別固有の発生率及びステージ固有の発生率と、異なるステージ間での癌検出容易性（例えば、ＣＣＧＡ１における腫瘍分画結果）とを組み合わせることができる。数学的計算は、ｉ）一般的な人口における性別固有の発生率及びステージ固有の発生率と、ｉｉ）異なるステージ間での癌検出容易性との間での乗算、加算、助産、及び／又は減算を含み得る。一部の実施形態では、癌の性別固有の発生率及びステージ固有の発生率については、異なるステージ間での癌検出容易性に基づいてスケーリングすることができる。性別固有の発生率は、検査対象の性別／生物学的性別と関連付けられている任意の情報（例えば、確率）を含み得る。一部のタイプの癌（例えば、乳癌）は性別固有である故に、性別固有の発生率を用いることができる。癌のステージ固有の発生率には、訓練又は検査対象の癌ステージと関連付けられている任意の情報（例えば、確率）が含まれ得る。癌検出容易性は、腫瘍分画に基づいて決定され得る。例えば、癌の特定タイプが低シェディング（例えば、癌タイプの腫瘍分画が血液試料中において低位）である場合、癌検出容易性の値は低くなり得る。

【0228】

更新された計算モデルが分類器と数学的計算とを含む場合、分類器の訓練は訓練データセットでなし得るのであり、数学的計算の訓練には訓練データセットをあてない場合がある。更新された計算モデルが数学的計算を含む分類器である場合、分類器及び数学的計算に関しては訓練データセットをもって訓練をなし得る。この場合、１つ以上の生物学的先行事項は、１次元又は多次元マトリックスとして構成され得るのであって訓練データセットと組み合わせることが可能とでき、分類器に入れることができる。

【0229】

方法は、１つ以上のプロセッサを介して疾患状態（例えば、癌状態）を検査対象のユーザ装置に関連付けられている電子記録へと送信するステップをさらに含み得る。疾患状態は、メモリ共有、メッセージ受渡し、トークンパッシング、又はネットワーク伝送を含むあらゆる適切な方法を用いてえ、受渡、転送、又は伝送できる。疾患状態は、次の手段を介して検査対象、医療従事者等、又は他の当事者へと送信できる：テキスト表示、写真的表示（photographic display）、ハイパーリンク、動画／オーディオ表示、ＳＭＳ、メッセージングアプリケーション若しくはサービス、電子メール、又は任意の他の適切な機構。疾患状態は、ＧＵＩ（例えば、ＧＵＩ５５０）に表示できる。ＧＵＩは、例えば、疾患状態及び疾患状態に基づいた予防的手段に関する処置提案や推奨案等についての視覚的表示を、ユーザ（例えば、医療従事者等）に提供するように構成されていることができる。ＧＵＩは特定のタスクに関してのユーザ対話を可能とすることができる（例えば、疾患状態の検討及び治療計画の調整）。疾患状態（例えば、癌状態）は、癌のレベル、原発組織、及び転移疾患ステータスを含み得る。癌及び原発組織についての詳細については、明細書の他の箇所にて説明されている。

【0230】

転移疾患状態は、リンパ系、血液循環、又は他の経路を介して癌細胞が体の新たな箇所へと拡散していく転移過程を表し得る。原発組織（ＴＯＯ、tissue of origin）に加えて、癌状態は、ＴＯＯから癌が拡散したことと関連付けられる転移疾患状態についての追加的情報を提供し得る。そのような転移疾患状態は、ＴＯＯを指す又は体の他の臓器への癌細胞の拡散を指す（例えば、腫瘍隣接組織）のいずれかたり得る。ｃｆＤＮＡ断片は、細胞死に由来し得るのであり、また、ｃｆＤＮＡ断片の存在は、ＴＯＯ以外の他の領域内での組織損傷及び細胞死（例えば、腫瘍隣接組織（tumor-adjacent tissue）又は侵襲性転移疾患の影響を受けている体の他の臓器）を示し得る。

【0231】

癌及び転移過程の影響を受けている細胞からのｃｆＤＮＡ断片の検出は、本明細書の他の箇所にて説明されている分類器や計算モデルを用いてなし得る。臨床的知識を多段解析にて実装して、ＴＯＯからｃｆＤＮＡ断片を区別し、また、転移部にての隣接組織からそれらを区別できる。臨床的知識には、所与のＴＯＯの癌がどの程度の頻度で他の臓器又は組織へと転移するかが、反映されている。このような情報は、癌登録機構等から取得できる。例えば、SEER Research Data 1975-2017 collects the presence of a distant metastasis to bone, brain, liver. lung, lymph nodes or other sites at time of diagnosisを参照。また、Budczies et al., 2014, “The landscape of metastatic progression patterns across major human cancers,” Oncotarget, 2014 Nov 4;6(1):570-83も参照されたいのであり、これらは参照によって取り込まれる。転移疾患状態を決定するために、本明細書にて説明される任意の方法は２つのステップをさらに含むことができ、これによってＴＯＯ及び転移過程を別個に識別でき、断片レベルシーケンシングデータを用いてこれをなし得る。第１のステップでは、本明細書にて説明される任意の方法（例えば、方法８００又は方法８５０）を含み得るのであり、検査対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片（例えば、ｃｆＤＮＡ断片）を用いて分類器／計算モデルを介して検査対象のＴＯＯを決定できる。第２のステップでは、第１のステップでの分類器／計算モデルを介して複数の断片を分析して、決定されたＴＯＯと関連付けられる転移過程によって最も影響を受けているであろうＴＯＯから遠隔な他の組織の転移疾患状態を検出することが含まれ得るのであり、。他の組織は、臨床的知識に基づいて決定され得る。

【0232】

例えば、第１のステップにて、検査対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片を用いて分類器を介して検査対象のＴＯＯが乳房である（或いは検査対象が乳癌を有する）と決定された場合、第２のステップでは、分類器をもって複数の断片を分析して、乳癌転移による影響を受けるとして臨床的に周知であると知られている肝臓、脳、骨、又は肺等の他の組織への転移過程による影響を受けている非癌細胞の存在を検出することが含まれ得る。同様に、ある例では、第１のステップにて、検査対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片を用いて分類器を介して検査対象のＴＯＯが肺である（或いは検査対象が肺癌を有する）と決定された場合、第２のステップでは、分類器をもって複数の断片を分析して、肺癌転移による影響を受けるとして臨床的に周知であると知られている骨、脳、又は（or）副腎等の他の組織への転移過程による影響を受けている非癌細胞の存在を検出することが含まれ得る。別の例では、第１のステップにて、検査対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片を用いて分類器を介して検査対象のＴＯＯが結腸又は直腸である（或いは検査対象が結腸直腸癌を有する）と決定された場合、第２のステップでは、分類器をもって複数の断片を分析して、結腸直腸癌転移による影響を受けるとして臨床的に周知であると知られている肺、脳、及び（and）腹膜等の他の組織への転移過程による影響を受けている非癌細胞の存在を検出することが含まれ得る。更なる例では、第１のステップにて、検査対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片を用いて分類器を介して検査対象のＴＯＯが前立腺である（或いは検査対象が前立腺癌を有する）と決定された場合、第２のステップでは、分類器をもって複数の断片を分析して、前立腺癌転移による影響を受けるとして臨床的に周知であると知られている骨、肝臓、及び肺等の他の組織への転移過程による影響を受けている非癌細胞の存在を検出することが含まれ得る。

【0233】

第１のステップにて用いられる分類器は、第２のステップにて用いられる分類器と同じものとされ得る。例えば、分類器は、複数の組織についての癌の正規化確率（例えば、０～１の値）を提供できる。正規化確率に基づいて、複数の組織についてのランキングを作成できる。この場合、最高位にランク付けされた組織をＴＯＯとすることができ、また、０より大なる正規化確率（例えば、＞０．１）を伴って次順位にランク付けされた組織を転移過程によって最も影響を受けているであろうＴＯＯから遠隔な他の組織とすることができる。実施例１０が更なる詳細事項を提供する。分類器は腫瘍細胞のｃｆＤＮＡで訓練されるも、時には腫瘍隣接正常組織（tumor-adjacent normal tissue）のメチル化信号は明白なスコアを結果としてもたらすほどに類似している場合がある。

【0234】

一部の実施形態では、第２のステップにて用いられる分類器は、第１のステップにて用いられる分類器とは異なるものとされ得る。この場合、第２のステップにて用いられる分類器は、疾患特有の分類器とされ得る。非癌細胞並びに／又は既知の癌及び転移の部位（site of metastasis）を有する患者から収集された訓練データセットは、疾患特有の分類器を転移部（metastatic site）に関して訓練するために用い得る。第１のステップでのＴＯＯ決定用分類器と第２のステップでの疾患特有分類器との組合せによって、第１及び第２の両ステップで分類器を用いるのに比して、より高い精度と増大した堅牢性がもたらされ得る。

【0235】

本開示の方法、システム、計算モデル及び／又は分類器を用いて、癌の存否やＴＯＯの検出、癌の進行又は再発の監視、治療的反応又は有効性の監視、存在の決定若しくは最小限疾患（ＭＲＤ、minimum residual disease）の監視、又はこれらの任意の組合せをなし得る。１つの例では、計算モデル及び／又は分類器は、特徴ベクトルが癌を有する対象からのものである蓋然性又は確率スコア（例えば、０～１）を生成するために用いられ得る。蓋然性又は確率スコアは、疾患状態の１つのタイプとされ得る。確率スコアを閾値確率と比較して、対象が癌を有しているか否かを決定できる。他の実施形態では、蓋然性又は確率スコアは異なる時点（例えば、治療の前後）にて評価でき、疾患進行の監視又は治療有効性の監視（例えば、治療としての効率）をなし得る。更なる他の実施形態では、蓋然性又は確率スコアは、臨床的決定を行うため又は該決定に影響を及ぼすために用い得る（例えば、癌診断、治療選択、治療有効性の評価等）。例えば、蓋然性又は確率スコアが閾値を超過する場合、医療従事者等が適切な治療を処方できる。

【0236】

蓋然性又は確率スコアが異なる時点にて評価されるのであれば、第１の時点は癌治療前にあり（例えば、摘出手術前又は治療的介入前）、また、第２の時点は癌治療後にある（例えば、摘出手術後又は治療的介入後）。この場合、該方法は、治療の有効性を監視するステップをさらに含み得る。例えば、第２の蓋然性又は確率スコアが、第１の蓋然性又は確率スコアに比して減少した場合、治療が成功したものとみなされ得る。もっとも、第２の蓋然性又は確率スコアが、第１の蓋然性又は確率スコアに比して増大した場合、治療が不成功とみなされ得る。他の実施形態では、第１及び第２の両時点は、癌治療前にあることができる（例えば、摘出手術前又は治療的介入前）。更なる他の実施形態では、第１及び第２の両時点は、癌治療後にあることができ（例えば、摘出手術前又は治療的介入前）、該方法は、治療の有効性と治療の有効性の減少とを監視するステップをさらに含み得る。更なる他の実施形態では、第１及び第２の時点にて癌患者からｃｆＤＮＡ試料を取得及び分析できるのであり、これは、例えば、癌進行を監視するため、（治療後の）癌の寛解を決定するため、残存疾患又は疾患再発についての監視若しくは検出をなすため、又は処置の（例えば、治療的）有効性を監視するためになされる。

【0237】

任意の時点のセットに亘って検査試料を癌患者から取得でき、また、本開示の方法に即して分析して患者における癌状態を監視できる。第１及び第２の時点は約１５分間から約３０年間迄の期間に亘って離れていることができるのであり、例えば約３０分だったり、例えば約1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23、若しくは約24時間だったり、例えば約1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25若しくは約３０日だったり、又は例えば約1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,若しくは12ヶ月とするか、又は例えば約1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5若しくは約30年とする。他の実施形態では、検査試料は、患者から、少なくとも３ヶ月毎、少なくとも６ヶ月毎、少なくとも毎年、少なくとも隔年、少なくとも３年毎、少なくとも４年毎、又は少なくとも５年毎に取得され得る。

【0238】

本明細書にて説明された任意の方法で取得された情報（例えば、蓋然性又は確率スコアや疾患状態）は、臨床的決定を行うため又は該決定に影響を及ぼすために用い得る（例えば、癌診断、治療選択、治療有効性の評価等）。例えば、蓋然性又は確率スコアが閾値を超過する場合、医療従事者等が適切な治療を処方できるのであり（例えば、摘出手術、放射線治療、化学療法、及び／又は免疫療法）、これは医療従事者等のユーザ装置上のＧＵＩ又は任意の通信媒体（例えば、電話通話やメール（mail））を介し得る。蓋然性又は確率スコア等の情報は、ＧＵＩを介して医師又は対象にリードアウトとして提供され得る。１つの例では、蓋然性又は確率スコアが０．６以上である場合、１つ以上の適切な治療を処方できる。別の実施形態では、蓋然性又は確率スコアが０．６５以上、０．７以上、０．７５以上、０．８以上、０．８５以上、０．９以上、又は０．９５以上である場合、１つ以上の適切な治療を処方できる。

【0239】

治療は１つ以上の癌治療薬を含み得るのであり、例えば、化学療法薬剤、標的癌療法薬剤、分化療法薬剤、ホルモン療法薬剤、及び免疫療法薬剤が含まれ得る。例えば、治療は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、抗腫瘍性抗生物質、細胞骨格破壊剤（タキサン）、トポイソメラーゼ阻害剤、分裂阻害剤、コルチコステロイド、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体、プラチナ系薬剤及びこれらの任意の組み合わせを含む１つ以上の化学療法剤とされ得る。治療には、シグナル伝達阻害剤（例えば、チロシンキナーゼ及び成長因子受容体阻害剤）、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ、histone deacetylase）阻害剤、レチノイン受容体アゴニスト、プロテオソーム阻害剤、血管新生阻害剤及びモノクローナル抗体複合体を含む１つ以上の標的癌治療薬剤が含まれ得る。治療には、トレチノイン、アリトレチノイン、ベキサロテン等のレチノイドを含む１つ以上の分化療法薬剤が含まれ得る。治療には、抗エストロゲン剤、アロマターゼ阻害剤、プロゲスチン、エストロゲン、抗アンドロゲン、及びＧｎＲＨアゴニスト若しくは類似体を含む１つ以上のホルモン療法薬剤が含まれ得る。治療には、rituximab（RITUXAN）、alemtuzumab（CAMPATH）等のモノクローナル抗体療法や、BCG、インターロイキン2（IL-2）、インターフェロン－アルファ等の非特異的免疫療法及びアジュバントや、例えばサリドマイドやレナリドミド（REVLIMID）等の免疫調節薬等の１つ以上の免疫療法薬剤を含み得る。腫瘍のタイプ、癌のステージ、癌治療や治療薬剤への以前の曝露歴、及びその他の癌の特徴に基づいて、適切な癌治療薬剤を選択し得る。

【0240】

図１９には、ある種に属する検査対象の疾患状態を決定するようにプログラムされている又はそうするように他の方法で構成されている、例示的なコンピュータシステム１９０１が示されている。コンピュータシステム１９０１は、本開示にて提供される諸々の方法の様々な観点を実装及び／又は制御できるのであり、例えば、本明細書にて開示された検査対象の癌状態を決定する方法をなすことや、本明細書にて開示されたデータセット訓練及びデータセット検査に関してのバイオインフォマティクス分析の様々なステップをなすことや、データ収集、分析及び結果報告、並びにデータ管理を統合することが含まれる。コンピュータシステム１９０１は、ユーザの電子機器又は電子機器との関係でリモートに配置されているコンピュータシステムであることができる。電子機器は、携帯電子機器たり得る。

【0241】

コンピュータシステム１９０１は中央処理装置（ＣＰＵ、「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」ともいう）１９０５を含み得るのであり、これは単一コア若しくはマルチコアプロセッサ、又は並列処理のための複数のプロセッサとされ得る。コンピュータシステム１９０１は、メモリまたはメモリ位置１９１０（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ）、電子記憶ユニット１９１５（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インタフェース１９２０（例えば、ネットワークアダプタ）、並びに、キャッシュ、他のメモリ、データ記憶部及び／若しくは電子ディスプレイアダプタ等の周辺装置１９２５を含み得る。メモリ１９１０、記憶ユニット１９１５、インタフェース１９２０、及び周辺装置１９２５は、例えばマザーボード等の通信バス（実線）を介してＣＰＵ１９０５と通信可能となっていることができる。記憶ユニット１９１５は、データを記憶するためのデータ記憶ユニット（又はデータレポジトリ）とすることができる。コンピュータシステム１９０１は、通信インタフェース１９２０の助けを借りてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１９３０と動作可能に結合されていることができる。ネットワーク１９３０は、インターネット（the Internet）、インターネット（an internet）及び／若しくはエクストラネット、又はインターネット（the Internet）と通信可能なイントラネット（an intranet）及び／若しくはエクストラネットとすることができる。ネットワーク１９３０は、一部の場合は、遠隔通信ネットワーク及び／又はデータネットワークとすることができる。ネットワーク１９３０は、１つ以上のコンピュータサーバを含み得るのであり、これによってクラウドコンピューティング等の分散コンピューティングを可能とし得る。一部の場合は、コンピュータシステム１９０１の助けを借りて、ネットワーク１９３０は、Ｐ２Ｐネットワークを実装でき、これによってコンピュータシステム１９０１に結合された装置がクライアント又はサーバとして振る舞うことを可能とし得る。

【0242】

ＣＰＵ１９０５は、マシン可読命令のシーケンスを実行可能であり、これはプログラム又はソフトウェアに化体していることができる。命令は例えばメモリ１９１０等のメモリ位置に格納されていることができる命令はＣＰＵ１９０５へと仕向けられることができ、後にそれによってＣＰＵ１９０５に対してプログラミング又は他の態様での構成をなして本開示の方法を実装することができる。ＣＰＵ１９０５によってなされるオペレーションの例としては、フェッチ、復号、実行、及びライトバックが含まれ得る。

【0243】

ＣＰＵ１９０５は集積回路等とされて回路の一部とされ得る。システム１９０１の１つ以上のコンポーネントは、回路に含まれ得る。一部の場合、回路はＡＳＩＣである。

【0244】

記憶ユニット１９１５は、ドライバやライブラリや保存済みプログラムなどのファイルを記憶することができる。記憶ユニット１９１５は、ユーザ選択やユーザプログラム等のユーザデータを記憶することができる。コンピュータシステム１９０１は、一部の場合、コンピュータシステム１９０１との関係で外部にある１つ以上の追加のデータ記憶ユニットを含み得るのであり、例えばこれはイントラネット又はインターネットを介してコンピュータシステム１９０１と通信可能とされているリモートサーバ上に配置されていることができる。

【0245】

コンピュータシステム１９０１は、ネットワーク１９３０を介して１つ以上のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム１９０１は、ユーザのリモートコンピュータシステムと通信できる（例えば、コンピュータシステム１９０１から送信された試料分析の結果を受信及び表示するアプリケーションがインストールされたスマートフォン等）。リモートコンピュータシステムの例には、パーソナルコンピュータ（例えば、可搬型ＰＣ）、スレート型又はタブレット型ＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）社のｉＰａｄ（登録商標）、サムスン（登録商標）社のＧａｌａｘｙ Ｔａｂ（登録商標））、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）社のｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、アンドロイド（登録商標）利用可能機器、ブラックベリー（登録商標））、又はＰＤＡ（personal digital assistant）が含まれる。ユーザは、ネットワーク１９３０を介してコンピュータシステム１９０１にアクセスできる。

【0246】

本明細書で説明された方法の実装態様としては、コンピュータシステム１９０１の電子的記憶位置（例えば、メモリ１９１０又は電子的記憶ユニット１９１５等）上に格納されたマシン（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードによることができる。マシン実行可能又はマシン可読コードは、ソフトウェアの態様で提供され得る。使用時においては、コードは、プロセッサ１９０５によって実行され得る。一部の場合、コードは記憶ユニット１９１５から検索されて、プロセッサ８０５による容易なアクセスに備えてメモリ１９１０上に格納され得る。一部の局面では、電子的記憶ユニット１９１５は除外されて、マシン実行可能間命令はメモリ１９１０上に記憶される。

【0247】

コードは、事前コンパイルされており且つコードを実行するように適合させたプロセッサを有するマシンで使用するために構成されているか、又は、ランタイム中にコンパイルされることもできる。コードは、事前コンパイルされた態様で又はその都度コンパイルされた態様で実行できるように選択できるプログラミング言語で供給されることができる。

【0248】

本明細書で提供されるシステム及び方法の態様は、プログラミングで化体され得る。本技術の様々な側面は、典型的には、一種のマシン可読媒体にて搬送されている又は化体されているマシン（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又は関連データの態様での「製品」又は「製造品」として観念し得る。マシン実行可能なコードは、メモリ等（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ、フラッシュメモリ）又はハードディスク等の電子記憶ユニットに記憶することができる。「記憶」タイプの媒体は、コンピュータ、プロセッサ等の有体メモリ、又はその関連モジュール、例えば様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブ等のいずれか又は全てを含むことができ、ソフトウェアプログラミングのための非一時的な記憶域を提供し得る。ソフトウェアの全部又は一部は、インターネット又はその他の通信ネットワークを通じて通信され得る。このような通信により、あるコンピュータ又はプロセッサから別のそれへとソフトウェアをロードすること（例えば、管理サーバ又はホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへ等）が可能となり得る。したがって、ソフトウェア要素を化体することができる別のタイプのメディアには、ローカル装置間の物理インタフェースを介する等の有線及び光学陸地固定回線ネットワーク及び様々な空中リンクを介して使用されるような、光、電気及び電磁波が含まれる。有線又は無線リンクや光リンク等のそのような波が伝播していく物理要素も、ソフトウェアを化体する媒体とみなし得る。本明細書で使用する場合、非一時的有形「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータ又はマシン「可読媒体」等の用語は、実行のためにプロセッサへの命令の提供に関与する任意の媒体を指す。

【0249】

したがって、コンピュータ実行可能コードのようなマシン可読媒体は、有体記憶媒体、搬送波媒体又は物理的伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの態様をとることができる。不揮発性記憶媒体には、例えば、図面に示されたデータベース等を実装するために用いられ得るような任意のコンピュータの任意の記憶装置（例えば、光ディスク又は磁気ディスク）が含まれる。揮発性記憶媒体には、そのようなコンピュータプラットフォームの主メモリ等の動的メモリが含まれる。有体伝送媒体には、同軸ケーブル、銅船及び光ファイバが含まれ、コンピュータシステム内のバスを含むワイヤも含まれる。搬送波伝送媒体は、電気信号若しくは電磁信号、又は音響若しくはＲＦデータ通信やＩＲデータ通信で生じるような光波の態様をとり得る。したがって、コンピュータ可読媒体のありふれた形式としては例えば次のものが含まれる：フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意のその他の磁気媒体、CD-ROM、DVD又はDVD-ROM、その他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴パターンを有する任意のその他の物理記憶媒体、RAM、ROM、PROMお及びEPROM、Flash-EPROM、任意のその他のメモリチップ又はカートリッジ、データ又は命令を搬送する搬送波、このような搬送波を搬送するケーブル又はリンク、或いは、コンピュータがプログラミングコード及び／又はデータを読みとることができる任意のその他の媒体。１つ以上の命令についての１つ以上のシーケンスを実行のためにプロセッサへと伝送するに際して、これらのコンピュータ可読媒体の幾つもの態様が関与し得る。

【0250】

コンピュータシステム１９０１は、試料分析の結果（例えば、入力シーケンシングデータや出力シーケンシングデータの処理段階及び病理学事項の更なる分類（例えば、疾患又は癌のタイプ及び癌のレベル）についてのグラフィック表示等を含むがこれらに限られない）を提供するためのユーザインタフェース（ＵＩ）１９４０を含む電子ディスプレイ１９３５を含むかそれと通信可能であることができる。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）及びウェブベースドユーザインタフェースが含まれるもこれらには限定されない。

【0251】

本開示の方法及びシステムは、１つ以上のアルゴリズムをもって実装できる。アルゴリズムは、ＣＰＵ１９０５によってソフトウェアを実行することによって実装できる。アルゴリズムは、本明細書で説明された方法の任意のステップをなし得る。

【0252】

実施例１－循環無細胞ゲノムアトラス（ＣＣＧＡ）の研究
循環無細胞ゲノムアトラス（ＣＣＧＡ；NCT02889978）の研究は、前向き型であり多センター型であり観測型であるｃｆＤＮＡベースドな早期癌検出研究であり、１４１箇所にて１５，２５４人の人口統計学的に均整のとれた参加者が登録されている。１５，２５４人の登録されている参加者（５６％が癌有り、４４％が癌無し）から血液試料が収集された。

【0253】

第１のコホートでは、３，５８３人のＣＣＧＡ参加者及びＳＴＲＩＶＥ参加者（ＣＣＧＡ：１，５３０人、８８４人癌無し；ＳＴＲＩＶＥ：１，１６９人癌無し参加者）から血漿ｃｆＤＮＡ抽出物が取得された。ＳＴＲＩＶＥとは、多センター型であり前向き型であるコホート研究であって、スクリーニングマンモグラフィーを受ける女性が登録されている研究である（９９，２５９人の参加者が登録）。各参加者から採取された血液に対して次の３種のシーケンシング分析がなされた：単ヌクレオチド変種／indelについてのペアｃｆＤＮＡ及び白血球（ＷＢＣ）ターゲットシーケンシング（５０７遺伝子、６０，０００Ｘ）（ＡＲＴシーケンシング分析）、コピー数変種についてのペアｃｆＤＮＡ及びＷＢＣ全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ、３０Ｘ）、及びメチル化についての全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ、３０Ｘ）。

【0254】

第２の予め指定された下位研究では（ＣＣＧＡ－２）、全ゲノム型ではなくターゲット型でなされるバイサルファイトシーケンシング分析を用いて、ターゲットメチル化シーケンシングアプローチに基づいて、癌有り対癌無し並びに原発組織関連の分類器を開発した。ＣＣＧＡ２に関しては、３，１３３人の訓練参加者及び１，３５４件の検証サンプル（７７５は癌有り；５７９は癌無し、登録時に決定、該事項は癌有り対癌無し状態の確認前）が用いられた。血漿ｃｆＤＮＡに対してはバイサルファイトシーケンシング分析がなされたのであり、メチロームの最も情報が豊富な領域がターゲットされたのであり、これはユニークなメチル化データベース並びに先行するプロトタイプ全ゲノム及びターゲットシーケンシング分析によって識別されているのであり、癌及び組織定義をなすメチル化信号が識別された。訓練用に予約された元の３，１３３件の試料のうち、１，３０８件の試料は臨床的に評価可能且つ分析可能とみなされた。分析は、一次分析母集団（ｎ＝９２７（６５４が癌有り、２７３が癌無し））及び二次分析母集団（ｎ＝１，０２７（６５９が癌有り、３７３が癌無し））に対してなされた。

【0255】

検証試料の分類は、核酸断片のメチル化状態を用いてなされた。２値的な分類のために、観測された核酸断片に対しては、癌由来である相対確率が割り当てられた。同様に、原発組織分類のためには、観測された核酸断片に対しては、特定の組織由来である相対確率が割り当てられた。癌及び原発組織について特徴的な核酸断片をターゲット領域に亘って組み合わせて、癌有りと癌無しとを分類すること及び原発組織を識別することをなした。２値的な分類に関しては、臨床的な感度は特異度９９％として推定された。原発組織に関しては、２つの独立したモデルに対してフィッティングがなされたのであり、一方はメチル化データベースを有しており他方はそれを有しておらず；報告された原発組織に関する結果は、予測された原発組織と真の原発組織との間の符合パーセンテージを反映するのであり、これは特異度９９％で癌として分類された案件の間でのことである。

【0256】

実施例２：分類器の訓練及び性能
訓練データセットを、２０７９の試料から生成した。用いられたパッチＣＮＮ分類器は５４３のパッチを含む。したがって、試料毎に５４３のパッチが計算されて、合計約１００万のTensorflow（Google）訓練試料とされた。このデータセットは、パッチＣＮＮ分類器を訓練するのに用いられた。訓練データセットにて用いられた２０７９の試料は複数の研究を含むのであり、次のものが含まれる：ＣＣＧＡ１（１５２９の試料）、ＣＣＧＡ２（３２８の試料）、及びＣｏｎｖｅｒｓａｎｔ（２２１の試料）、並びに、複数の生物検体（次のものが含まれる：無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）（１３４３の試料）、フォルマリン固定パラフィン埋め込み（ＦＦＰＥ、formalin-fixed paraffin-embedded）（５６１の試料）、拡散腫瘍細胞（ＤＴＣ、disseminated tumor cell）（８７の試料）、及び凍結保存（５９の試料））。

【0257】

パッチ選択は相互情報方法を用いてなされたのであり、全ての癌タイプペアについて上位５箇所の高度相互情報ゲノミック領域（high-mutual-information genomic region）の選択が含まれる。相互情報は２つの分類タイプ間の関係を説明するのであって、例えば、癌タイプペアに関しての高度相互情報領域（high-mutual-information region）は、第１の癌タイプの試料と第２の癌タイプの試料との間で高度に弁別的なＣｐＧサイトを含む。一部の実施形態でのパッチ選択にて用いられた染色体毎の領域表現は、図９Ａに示される。各選択領域について、近隣ＣｐＧサイトがマージされて、また、領域には１００個のサイトがパディングされるのであり、興味対象のＣｐＧに対してのセンタリングが維持される。そして、全ＣｐＧサイトが包括されるように領域が選択されたが、ＣＣＧＡ１からの若年健常試料を用いての対照群カバレッジがない領域に関しては例外とされた。複数のペア単位での比較が可能であった一部の場合では（例えば、マルチクラス分類器）、高度相互情報領域が選択されたのであって、全てのあり得る癌タイプペアについての高度に弁別的なサイトがモデル中にて表されていた。

【0258】

訓練は、癌タイプ及びステージによって階層化された８重クロス検証によって（例えば、多のものもあり得るも癌試料、非癌試料、癌ステージ、及び／又は原発組織の全ビンに亘って均された分布がもたらされるように全試料を等サイズのビンにビニングすることによって）なされた。クロス検証に際しては、７つ（seven）のビンをもってモデルを訓練し、第８（eighth）のビンをもって評価（evaluated）をなしたのであって、検証（validation）は８回（8 times）反復されたのであって、８つのビン（8 bins）の各々が別個に評価された。一部の実施形態での階層化に用いられる癌タイプは例えば図９Ｂに示されており、卵巣癌、子宮癌、胃癌、白血病、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、他の癌タイプ、及び非癌タイプが含まれる。

【0259】

癌対非癌を検出すること（「ＤＥＴＥＣＴ」）及び原発組織（「ＴＯＯ（tissue-of-origin）」）を検出することに関しての分類器の性能は、ＴＯＯの場合は図９Ｃに示される癌タイプのパネルについて査定（assess）された。更なる詳細に関しては、Oxnard et al., “Simultaneous Multi-cancer Detection and Tissue of Origin (TOO) Localization Using Targeted Bisulfite Sequencing of Plasma Cell-free DNA (cfDNA),” American Society of Clinical Oncology (ASCO) Breakthrough, October 11-13, 2019, Bangkok, Thailandを参照されたいのであり、参照によってこれは取り込まれる。真の陽性は三角形によって表され、真の陰性は円形によって表され、擬陽性及び不定とされた試料はそれぞれ菱形及び正方形によって表される。試料に対しては癌又は非癌のラベル付けがなされ、さらには、癌試料には癌タイプのラベル付けがなされた。全試料は特異度９９％で検出された。図９Ｃは、癌試料中の擬陽性（菱形）の存在を示すのであり、これらは未診断の血液癌の存在に起因したものと思われる。結果によれば、モデルの更なる最適化をなして、擬陽性の検出を回避できそれによってバックグラウンドを減じ得る。そのような最適化によって、高度のバックグラウンドによって見づらくされずに追加の真の陽性癌試料を検出できるより高感度なモデルが可能となる。

【0260】

パッチＣＮＮ分類器の性能は、図１０Ａに示されるように、癌ステージによってグルーピングされた癌試料パネルについて査定された。全ての癌試料の検出は、特異度９９％にてなされた。１つの例を挙げるに、全ての癌試料についての検出の感度は４２．１％であったのであり、全ての癌試料についての原発組織分類の感度は８９．７％であったのであり、末期ステージ癌試料に比して早期ステージ癌試料の検出は相対的に低かった（ステージＩ：10.1%、ステージＩＩ：29%、ステージＩＩＩ：58.3%、ステージＩＶ：79.8%）。もっとも、癌ステージの各グループに関しては、原発組織予測の精度は高かった（感度は約９０％）。図１０Ｂは、２値的な設定下におけるパッチＣＮＮ分類器（classifier）の性能について示す（例えば、試料が原発組織やステージ等の３つ以上のラベルにカテゴライズ（categorized）されていない場合）。この例では、試料は、癌又は非癌に分類（classified）されている。２値的な設定では、パッチＣＮＮ分類器は、非癌試料には１０％未満の平均確率を割り当てたのであり、また、癌試料には約８０％の平均確率を割り当てたのであり、２値分類器が高性能を有していることが示される。パッチＣＮＮ分類器に関して、特異度９８％、９９％、及び９９．５％について、パラメータを調整すると、結果として、それぞれ感度８８％、感度７４．３６％、及び感度４４．２３％が得られる。

【0261】

実施例３：Ｉｓｏｍａｐクラスタリングによる性能試験
図１１を参照するに、次元縮小法を用いて本開示のパッチＣＮＮ分類器用の訓練後生成埋め込み値（活性化）の性能を評価したのであり、アクティベーションとは埋め込み値が試料の分類を予測する能力を指す。ラベルたる０～２０によって表された癌試料セットを、分類のために用いた。各試料について、訓練済み特徴抽出機を用いて各パッチに関して特徴を抽出した。各パッチについて、埋め込み値のノルムを計算し、所与の試料中の各パッチについてのノルムを連結させて、試料特徴をもたらした。そして、各試料についての連結されたノルムは、投射によって多様体空間にプロットされた。具体的には、非線形次元縮小法たるＩｓｏｍａｐを用いて、Ｎ次元空間内にて異なる癌ラベルをクラスタさせた。図１１に示される２次元座標空間におけるｘ軸及びｙ軸は、クラスタリングがなされた後の試料間の相対距離を示す。投射によれば、異なる癌ラベルがＩｓｏｍａｐの異なる領域へとクラスタリングすることが示されており、埋め込み値は異なるラベルを伴う試料間で判別をなし得るということが示されている。これらの結果の示唆するところによれば、埋め込み値又は埋め込み値のノルムのいずれかを用いれば、性能に関する情報をもたらし得る。

【0262】

実施例４：最大活性化のパッチ頻度による性能試験
図１２を参照するに、試料セットを、５４４個のパッチからなる本開示のパッチＣＮＮモデルを用いて評価したのであり、５４４個のパッチはヒトゲノムの異なる部分を表している。５４４個のパッチの各々について、活性化の頻度は、試料セットにわたって決定された。したがって、例を挙げるに、仮に試料セット中の試料２及び１０に関して、５４４個のパッチのうちのパッチ１０号が活性化された場合、図１２におけるパッチ１０号（図１２においてＸ＝１０）に関してのｙ値は、２となるであろう。具体的には、５４４個のパッチのうちで試料についての分類を予測する最も高い信号をもたらすパッチが、最大限に活性化されたパッチとみなされた（例えば、埋め込み値が最も弁別的となっている箇所）。５４４個のパッチのうちの各パッチについては、活性化の頻度は、他の全てのパッチとの比較で各々のパッチが最大限にアクティベートされた回数を決定することによって計算された。図１２によれば、性能の大半は、５４４個のパッチのうちの約２０個から由来しているのであり、特に２個のパッチが特に指示力が高い。したがって、５４４個のパッチのうちの幾つかのパッチは、他のパッチよりもより頻繁に活性化されるのであり、そのようなパッチが分類器性能の決め手となっているのであろう。例えば、特定のパッチは、異なる分類タイプに関して特化していることが可能である（例えば、癌及び／又は非癌）。さらに、指示力が高いパッチＩＤは、高度に差別的なＣｐＧサイトを含んでいる可能性が高く、パッチ選択を査定及び最適化するための方法が提供される（例えば、パッチのセットを最小化して計算の効率を改善したり及び／又はそのコストを削減したりすること）。具体的には、図１２に示されるような性能指標は、新領域選択アルゴリズムをブートストラップするに際して訓練済み特徴抽出モデルを導くのに用い得る。

【0263】

実施例５：ｔ－ＳＮＥクラスタリングによる性能試験
図１３及び１４を参照するに、ｔ－ＳＮＥクラスタリングは、試料セットに関して、最大限に活性化されたパッチたる上位６個（図１３）又は上位３個（図１４）についての埋め込み値を用いて、なされた。実施例４との関係で上述したように、最大限に活性化されたパッチは活性化頻度が最高のものをいう（例えば、所与のパッチが他の全てのパッチとの比較で所与の試料について分類を予測する能力）。そして、ｔ－ＳＮＥクラスタリングは次元縮小をなして、データを２次元空間上へと投射する。２０個の試料を伴うセットは右の凡例によって示されており、試料ラベルは０～２０によって表示されており、また、グラフ上の各離散的ポイントは試料の断片に対応する。図１３では、ポイントの各クラスタは、上位６個の最大限に活性化されたパッチの１つに対応する。図１３の右手側のクラスタは主に癌試料を含むのであり、各々のクラスタによって表されているパッチは幾つかの異なる癌タイプを弁別可能であることが示されている。この結果は、分類中においてパッチは不等な態様で重み付けされているとの図１２での観測に比類するものである（例えば、一部のパッチは他のそれよりも分類の決め手となること）。図１４を参照するに、上位３個の最大限に活性化されたパッチのｔ－ＳＮＥクラスタリングは離散的なクラスタをもたらさないも、グラフの右手側に沿っては視認可能な癌タイプ密集箇所がある。

【0264】

実施例６：癌ステージによる性能試験
図１５に転じるに、本開示のパッチＣＮＮアーキテクチャを用いる分類性能は、癌試料のステージＩ，ＩＩ，ＩＩＩ，及びＩＶに関して比較された。データは、循環無細胞ゲノムアトラス（ＣＣＧＡ２）のサブセットから取得されており、また、特異度を９８％としてフィルタリングされている。結果として、データセットのモデルについての感度は４５％だった分類スコアはｙ軸に沿って提示されており、０は非癌を表し、１は癌を表す。各離散的ポイントは、試料（例えば、個別の対象）を表す。非情報的な試料は参考としてグラフの右手側に含められている。図１５では、癌ステージの進行と共に分類性能が向上することが示されており、対象が癌を有することに関してはステージＩの癌試料に対しては０．４未満の平均確率が割り当てられ、他方で対象が癌を有することに関してはステージＩＶの癌試料に対しては１の平均確率が割り当てられる。

【0265】

実施例７：原発組織関する性能試験
図１６、１７Ａ、及び１７Ｂを参照するに、本開示のパッチＣＮＮアーキテクチャを用いる分類器の性能を、様々な原発組織から由来する試料について、評価した。データは、ＣＣＧＡ２から取得した。図１６に転じるに、分類スコアはｙ軸に沿って提示されており、０は非癌を表し、１は癌を表す。各離散的ポイントは、試料（例えば、個別の対象）を表す。興味深いことに、個別の癌タイプ毎の分類結果は、ＣＣＧＡ１データセットとＣＣＧＡ２データセットとの間で一貫していた。１１種の高信号癌タイプが他の癌タイプに比してより用意に検出可能（例えば、確率が０．６以上）なものとして識別されたのであり、例えば、肛門直腸癌、膀胱癌及び尿路上皮癌、結腸直腸癌、頭部及び頸部癌、肝胆癌、肺癌、リンパ系腫瘍、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、並びに上部胃腸癌が含まれる。

【0266】

図１７Ａ及び１７Ｂは、原発組織に関して「１つ取り出す」方式を用いてなされた混同マトリックス分析の結果を示すのであり、不確定分析なくして予測に関して８０％を超える精度が達成され（図１７Ａ）、また、不確定分析を伴った場合は予測に関して約９０％の精度が達成された。

【0267】

具体的には、図１７Ａにおいて、リンパ系腫瘍の癌試料は８４％（84/99）の精度で、肺癌試料は８６％（155/181）の精度で正しく分類された。他の高信号癌タイプはまちまちな精度で予測されたのであり、次のものが含まれる：乳癌（62/70で89%）、結腸直腸癌（82/90で91%）、頭部及び頸部癌（45/53で85%）、肝胆癌（21/29で72%）、多発性骨髄腫（22/25で88%）、卵巣癌（22/27で81%）、膵臓癌（50/66で76%）、及び上部胃腸癌（40/51で78%）。

【0268】

図１７Ｂに転じるに、不定試料の除外により、原発組織分類が向上した。リンパ系腫瘍の癌試料は９６％（76/79）の精度で、肺癌試料は９８．４％（126/140）の精度で正しく分類された。他の高信号癌タイプはまちまちな精度で予測されたのであり、次のものが含まれる：乳癌（41/43で95%）、結腸直腸癌（74/76で97%）、頭部及び頸部癌（35/39で90%）、肝胆癌（20/26で77%）、多発性骨髄腫（21/22で95%）、卵巣癌（19/22で86%）、膵臓癌（42/48で88%）、及び上部胃腸癌（35/39で90%）。

【0269】

実施例８：ハイパーパラメータの符号化
開示されたパッチＣＮＮ分類器用のハイパーパラメータに関して符号化及び定義付けを行った。このようなハイパーパラメータの使用により、本開示のパッチＣＮＮ分類器は、異なるタイプの実験デザイン、アプリケーション、シーケンシング方法、ストリンジェンシー、精度、及び／又は演算属性に適応及び／又は最適化するために迅速にチューニング及び調整されることが可能となった。調整可能なハイパーパラメータの例を挙げるに、他のものもあるも、パッチの数（例えば、10から1000パッチ）、パッチ毎に評価されるＣｐＧサイト数（例えば、10から1000のＣｐＧサイト又は64から512のＣｐＧサイト等の画像幅や、128のＣｐＧサイト又は256のＣｐＧサイト等の画像幅）、パッチ毎の断片の深さ（例えば、2から1000の断片等の画像高、又は32や50や64や128の断片等の画像高）、パッチ内の断片パッキングの密度、パッチ内の核酸断片を位置付けるのにどのパッキングアルゴリズムが使用されているか等がある。他のものもあるが、追加の例示的なハイパーパラメータとしては、p値（対応するメチル化パターンをコホート内の対応する核酸断片に対して評価した際に、p=0.05又はp=0.001等のｐ値ハイパーパラメータによって設定されたｐ値閾値を充足しないそれぞれの各々の核酸断片を、複数の核酸断片から除去することによって、入力された複数の核酸断片に対してプルーニングをなすために用いられる値）、用いたクロスバリデーションの種類（例えば、Ｐ×Ｑ倍クロスバリデーション、ここでＰ及びＱは正の整数であり、既述と同一のもの又は異なるもの）、L2正規化ドロップアウト率（例えば、0.250000）、L2正規化初期学習率（例えば、0.000200）、及び、L2正規化係数（例えば、0.010000）が挙げられる。そのような正規化のための損失関数を幾つかのサイクルに亘って行ったのであり、また、感度、特異度、及び精度についてのメトリクスを用いて、ハイパーパラメータの各セットについての分類器の性能を評価した。

【0270】

実施例９：品質管理のための制御データ構造の作成と検証
上述のように、図３および図４は、メチル化シーケンシングデータから癌状態の分類に用いられるワークフローを示す。初期の前処理後且つメチル化コール及びｐ値ベースドプルーニング前に、品質管理及び／又は品質監視をデータに対して行った。検査試料（例えば、癌）を、正常又は健常な試料データを含むデータ構造と比較するために、対照群を用いた。健常対照群のデータ構造を生成するための例示的ワークフローを本明細書にて説明する。健常対照群データ構造を作成するために、解析システム（又は本明細書の他の箇所にて記載される処理システム）は、複数の対象から複数の核酸断片（例えば、ｃｆＤＮＡ）を受け取った。各核酸断片のメチル化状態ベクターを識別することによって、対照群用のメチル化状態ベクターのセットを作成した。

【0271】

各核酸断片のメチル化状態ベクトルを用いて、解析システムは、メチル化状態ベクトルを、メチル化サイト（例えば、ＣｐＧサイト）の文字列に細分化した。解析システムは、結果として得られる文字列が全て所定長未満になるように、メチル化状態ベクトルを細分化した。例えば、長さ１１のメチル化状態ベクトルを長さ３以下の文字列に細分化した場合、長さ３の文字列が９個、長さ２の文字列が１０個、及び長さ１の文字列が１１個となった。例えば、長さ７のメチル化状態ベクトルを長さ４以下の文字列に細分化した場合、長さ４の文字列が４個、長さ３の文字列が５個、長さ６の文字列が２個及び長さ７の文字列が１個となった。メチル化状態ベクターが指定した文字列長以下の場合、該ベクターのＣｐＧサイトを全て含む単一の文字列に変換された。

【0272】

解析システムは、ベクター中の可能性のあるＣｐＧサイト及び可能性のあるメチル化状態毎に、文字列中の最初のＣｐＧサイトとして指定のＣｐＧサイトを有し且つ該メチル化状態の可能性を有する対照群に存在する文字列数を数えることによって、文字列を集計した。例えば、所与のＣｐＧサイトにて、文字列長が３とされていることを加味すると、２^３或いは８個の文字列の構成が可能であった。あるＣｐＧサイトで、８つの可能な文字列構成各々について、解析システムは、対照群にて各メチル化状態のベクトルの可能性が何回発生したかを集計した。この例について続けて述べるに、次のような数量を集計する：参照ゲノム中の各開始ＣｐＧサイトについて、< M_x, M_x+l, M_x+2>, < M_x, M-, U_x+2 >, ... , < U_x, U_x+l, U_x+2>。解析システムは、各々の開始ＣｐＧサイト及び文字列の可能性について、既集計カウントが格納されたデータ構造を、作成した。

【0273】

文字列長に上限を設けることには幾つかの利点がある。第１に、文字列の最大長に応じて、解析システムによって作成されたデータ構造のサイズは劇的にサイズが増大し得る。例えば、文字列の最大長を４にすると、全てのＣｐＧサイトが長さ４の文字列に対して最低でも２４個の数を集計しなければならないことを意味する。最大文字列長を５に増大させると、全てのＣｐＧサイトに２４個又は１６個の追加的数が伴うことになり、集計すべき数（及びコンピュータのメモリ）が以前の文字列長に比して２倍となることを意味する。文字列サイズを削減することで、データ構造の作成及び性能を（例えば、後述のような事後アクセスのための利用）、計算量及び記憶量の観点から合理的に保つことに資する。第二に、最大文字列長の制限に関しての統計的な考慮事項としては、文字列カウントを用いる下流モデルのオーバーフィッティング回避が挙げられる。ＣｐＧサイトの長い文字列が結果に対して生物学的に強い影響を及ぼさない場合（例えば、癌の存在を予測する異常性の予測）、ＣｐＧサイトの大きな文字列に基づいて確率を計算することは、利用不能かもしれないデータを相当量用いる故に問題があり、したがって、モデルが適切に性能を発揮するにはスパースになりすぎ得る。例えば、事前の１００個のＣｐＧサイトに条件付けて異常／癌の確率を計算する際、長さ１００のデータ構造中の文字列カウントを利用でき、理想的にはその幾つかは事前１００個のメチル化状態に正しく一致する。長さ１００の文字列のカウントがスパースである場合、検査（test）試料中の長さ１００の文字列が異常か否かを判断するのにデータが不十分となっているかもしれない。

【0274】

データ構造が作成されたらば、解析システムは、データ構造及び／又はデータ構造を利用する下流モデルについて、検証を行う。検証（validation）のあるタイプとしては、対照群のデータ構造内の一貫性を確認（check）し得る。例えば、対照群内に外れ値的な対象、試料、及び／又は断片があった場合、解析システムは様々な計算を行って、それらのカテゴリのどれかから任意の断片を除外するか否かを決定する。代表的な例を挙げるに、健常対照群には、未診断であるも癌であり、異常メチル化断片を含む試料が含まれている。この第一の検証は、健常対照群から癌の可能性のある試料を除外して、対照群の純度に影響を及ぼさないように担保する。

【0275】

第二の検証では、データ構造それ自体（即ち、健常対照群）からのカウントをもって、ｐ値の算出に用いた確率論的モデルを確認している。解析システムが検証群中のメチル化状態ベクトルのｐ値を生成したらば、解析システムは、そのｐ値から累積密度関数（ＣＤＦ、Cumulative Density Function）を構築した。解析システムは、このＣＤＦをもって様々な計算を行って、対照群のデータ構造を検証した。理想的にはＣＤＦがCDF(x) ? xとなる恒等関数以下であるということを１つの検査では用いている。他方で、恒等関数を超過した場合、対照群のデータ構造に用いられている確率論的モデルに何らかの欠陥があることが明らかとなる。例えば、１／１００の断片が１／１０００のｐ値スコアを有しており、CDF(1/1000) = 1/100 > 1/1000 を意味する場合、第２のタイプの検証は失敗したのであり、確率論的モデルに問題があることが示されていることになる。

【0276】

第３のタイプの検証では、データ構造の構築に使用された試料とは別の検証用サンプルの健常セットを使用しており、データ構造が適切に構築されているか及びモデルが機能したかどうかを検査している。第３のタイプの検証では、健常対照群（healthy control group）がどの程度良好に健常試料（healthy sample）の分布を一般化したかを数値化している。第３のタイプの検証が棄却となった場合、健常対照群が健常分布（healthy distribution）へと良好には一般化しなかったこととなる。第４のタイプの検証は、非健常検証群（non-healthy validation group）からの試料について検査を行っている。

【0277】

解析システムは、ｐ値を計算したのであり（calculated）、また、非健常検証群のためのＣＤＦを構築するのである（builds）。非健常検証群については、解析システムは、少なくとも一部の試料に関して前述のCDF(x) > xを認めたのであり、換言するに、健常対照群及び健常検証群との関係での第２のタイプの検証及び第３のタイプの検証で予期されていた事象の逆が認められた。第４のタイプの検証が失敗した場合、該モデルが識別するように設計されていた異常性をモデルが適切に識別できていなかったことがこのことによって示される。

【0278】

対照群データ構造の一貫性を検証するために、追加的なワークフローが行われた。解析システムは、対照群と同様の対象、試料、及び／又は断片の組成を有すると思われる検証群を活用した。例えば、解析システムが癌無し健常対象を対照群として選択していた場合、解析システムは検証群についても癌無し健常対象を用いていたことになる。

【0279】

検証ワークフローは、対照群について説明されているように検証群についてのメチル化状態ベクトルのセットを生成することを含む。各メチル化状態ベクトルについてその位置におけるあり得る全てのメチル化状態ベクトルが列挙されたのであり、また、対照群データ構造からのあり得る全てのメチル化状態ベクトルの確率が計算された。そして、計算された確率に基づいて各メチル化状態ベクトルについてｐ値が計算されたのであり、また、検証群からの全てのｐ値の累積密度関数（ＣＤＦ）が生成された。ｐ値スコアは、特定のメチル化状態ベクトル及び他のあり得るメチル化状態ベクトルが対照群にてより低い確率を有するという期待されていたことを、表したのである。したがって、低いｐ値スコアは対照群内の他のメチル化状態ベクトルと比較して相対的に予期せぬメチル化状態ベクトルに対応し、高いｐ値スコアは対照群に見出される他のメチル化状態ベクトルと比較して相対的により期待されるメチル化状態ベクトルに対応する。ＣＤＦを用いて、対照群データ構造内のｐ値の一貫性を検証した。

【0280】

実施例１０：転移疾患状態の決定
表３は、転移が生じた癌患者からの血漿試料中のｃｆＤＮＡ断片を用いて転移疾患状態を決定することについて幾つかの例を示す。転移過程の決定は、癌の有無及び原発組織（ＴＯＯ）の検出に用いたものと同じ分類器を用いてなされた。

【0281】

さらなる例を挙げるに、ＴＯＯ参照データセットは、膵臓癌と肝臓への既知の転移とを伴う１８の対象からの血漿試料を含んでいる。これらの１８の対象の内、９の対象中の血漿試料中にて肝臓からの信号が見出された。もっとも、膵臓癌を有する残りの対象からの血漿試料中にも肝臓からの信号が認められるも、信号はより希であった。同様に、別の例を挙げるに、ＴＯＯ参照データセットは、乳癌と、肺、脳、骨、及び肝臓への既知の転移とを伴う４の対象からの血漿試料を含んでいる。脳や骨に転移がある試料は、訓練済み分類器について脳組織を表すクラスがなくとも、乳房以外の原発組織に対して強いクロススコア（例えば、正規化された癌確率）があった。また、骨転移のある試料のクロススコアには、骨髄の一部の細胞に類似したメチル化信号を伴う多発性骨髄腫や肉腫のスコアが含まれていた。

【0282】

別の例では、ＴＯＯ参照データセットは、肺癌と、骨、脳、心膜、及び肝臓への既知の転移とを伴う１３の対象からの血漿試料を含んでいる。骨及び脳への転移を伴う試料については、強いクロススコアがあった（肺以外の組織に関しての正規化された癌確率）。さらなる例では、ＴＯＯ参照データセットは、結腸直腸癌と肝臓への既知の転移とを伴う１０の対象からの血漿試料を含んでいる。結腸直腸癌と肝臓への転移を伴う対象からの試料中の肝細胞からは、明らかに見出されるメチル化信号がもたらされなかった。

【0283】

テーブル３：異なる原発性癌を有する異なる対象に関してのＴＯＯ（Tissue-of-Origin、原発組織）結果（癌についての正規化された確率）

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表3-6】

【0284】

結論
本明細書で単一のインスタンスとして説明されたコンポーネント、オペレーション又は構造については、複数のインスタンスが提供され得る。様々なコンポーネント、オペレーション、データ記憶部の境界はある程度自由であり、特定のオペレーションは特定の例示的な構成の文脈で説明されている。その他の機能割り当ても想定されるのであり、実装の範囲に含まれ得る。一般に、構成例で別個のコンポーネントとして示された構造及び機能は、組み合わせた構造又はコンポーネントとして実装され得る。同様に、単一のコンポーネントとして提示された構造及び機能は、別個のコンポーネントとして実装され得る。このような及び他のバリエーション、変更、追加、及び改良は、実装の範囲に含まれる。

【0285】

第１や第２等の用語は、様々な要素を説明するために用いられるものと解されるも、これらの要素はこれらの用語によって限定されてはならぬことに留意されたい。これらの用語は、専ら１つの要素を他のそれから区別するために用いられる。例えば、本開示の範囲から逸脱せずに、第１主題を第２主題と称することができ、同様に、第２主題を第１主題と称することができる。第１主題及び第２主題はどちらも主題であるも、それらは同じ主題ではない。

【0286】

本開示で使用される用語は、特定の実施形態について記述することだけを目的としており、本発明を制限することを意図しない。本発明の説明及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「１（一）」、「前記」、「当該」は、文脈にて別段の明示がない限り、複数形をも含むことが意図される。本開示で用いられる場合、「及び／又は」という用語は、１つ以上の関連付けられた列挙項目の任意の及び全ての可能な組み合わせを指し示すのでありまたそれを包括する。「含む（含み）」、「含んでいる」、「備える」、及び／又は「備えている」という用語は、本開示で用いられる場合、記載される特徴、対象物、ステップ、動作、要素及び／又はコンポーネントが存在することを明示する。しかし当該用語は、１以上の他の特徴、対象物、ステップ、動作、要素、コンポーネント、及び／又はそれらの群が存在すること又は追加されることを排除しない。

【0287】

本明細書で使用する場合、「～ならば」という用語は、文脈に応じて、「～の場合」、「～されたらば」、又は「～と決定されたことに応答して」、又は「～が検出されたことに応答して」を意味すると解釈され得る。同様に、「～と決定された場合」又は「［所定の条件又は事象］が検出された場合」という句は、文脈に応じて「～と決定された際には」又は「～と決定されたことに応答して」又は「［所定の条件又は事象］が検出された場合」又は「［所定の条件又は事象］が検出されたことに応答して」という意味に解釈することができる。

【0288】

前述の説明には、例示的な実装例を具現化するシステム、方法、技術、命令シーケンス、及び計算機プログラム製品の例が含まれている。説明を目的として、多くの特定の詳細は、本発明の主題についての様々な実装例についての理解を提供するために提示した。もっとも、当業者には、本発明の主題についての実装例は、これらの特定の詳細なしに実施され得ることが明らかであろう。一般に、よく知られた命令インスタンス、プロトコル、構造、及び手法については詳細に示していない。

【0289】

上述の説明は、解説目的で特定の実装例を参照して語られた。もっとも、上述の例示的議論は、網羅的なものとなることも、実装例を開示される形態そのものに限定することも意図していない。上述の教示に照らせば、多くの改変及びバリエーションが可能となろう。実装例は諸原理及びそれらの実際的応用について最良に説明するために選定されて説明されているのであり、それによって当業者が諸々の実装例及び様々な実装例を最良に活用することが可能となり、意図される具体的な用途に適した様々な変更を伴うことができる。

【誤訳訂正2】

【訂正対象書類名】特許請求の範囲

【訂正対象項目名】全文

【訂正方法】変更

【訂正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

種に属する検査対象の癌状態を決定する方法であって、該方法は、
少なくとも１つのプロセッサと、前記少なくとも１つのプロセッサによって実行される少なくとも１つのプログラムを格納するメモリとを備えたコンピュータシステムにてなされるのであって、該少なくとも１つのプログラムは、
Ａ）電子的態様にてデータセットを取得するステップであって、前記データセットは複数の断片中のそれぞれ各々の断片の対応するメチル化パターンを備え、それぞれ各々の断片の前記対応するメチル化パターンは（ｉ）前記検査対象から取得された生物試料中の前記各々の断片を備える１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングによって決定され、且つ（ｉｉ）前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含む、取得ステップと、
Ｂ）第１のチャンネルを含む第１のパッチを構築するステップであって、前記第１のパッチは前記種の参照ゲノム中の、ＣｐＧサイトの第１の独立セットを表し、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中のそれぞれ各々のＣｐＧサイトは前記参照ゲノム中の所定の位置に対応する、構築ステップであって、
前記第１のパッチの前記第１のチャンネルは第１の複数のパラメータについての複数のインスタンスを含み、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスは前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含み、
当該構築ステップ（Ｂ）は、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれ各々の断片について、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入することを含む、構築ステップと、
Ｃ）少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用してそれによって前記検査対象にての前記癌状態を決定する、適用ステップと、をなすための命令を含む、方法。

【請求項2】

請求項１に記載の方法において、前記少なくとも１つのプログラムは、前記取得ステップ（Ａ）後且つ前記構築ステップ（Ｂ）前に：
前記複数の断片から、それぞれ各々の断片であって前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイトにわたっての対応するメチル化パターンがｐ値閾値を充足しないｐ値を有する断片を除去することによって、前記複数の断片に対してプルーニングを行うプルーニングステップであって、前記各々の断片の前記ｐ値は、前記各々の断片の前記対応するメチル化パターンを、前記各々の断片の前記対応する複数のＣｐＧサイトを有する対応する複数の参照断片中の前記対応する複数のＣｐＧサイトのメチル化パターンの対応する分布と比較することによって決定され、前記対応する複数の参照断片中の各参照断片の前記メチル化パターンは、健常な対象のコホートから取得された生物試料からの核酸についてのメチル化シーケンシングによって取得される、プルーニングステップをなすための命令をさらに含む、方法。

【請求項3】

請求項２に記載の方法において、
前記第１のパッチは、前記第１のチャンネル及び第２のチャンネルを含む複数のチャンネルを含み、
前記第２のチャンネルは、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスについての第２の複数のパラメータについての対応するインスタンスを含み、前記第２の複数のパラメータの各インスタンスは、前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのＣｐＧメチル化状態以外の第１の特徴についてのパラメータを含み、
前記構築ステップ（Ｂ）は、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれ各々の断片について、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンス並びに前記第２の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入することを含む、方法。

【請求項4】

請求項１に記載の方法において、各々の断片の前記メチル化パターンは前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各ＣｐＧサイトを含まず、前記構築ステップ（Ｂ）は、前記複数の断片中の各々の断片について、前記各々の断片内に存するＣｐＧサイトに対応する第１の複数のパラメータの前記インスタンス中のパラメータに投入することを含む、方法。

【請求項5】

請求項１に記載の方法において、前記構築ステップ（Ｂ）は、前記複数の断片中の各々の断片について：
ｉ）前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、前記各々の断片中の前記ＣｐＧサイトに対応する、前記複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別することと、
ｉｉ）前記識別されたパラメータのうちの前記各々の断片の対応するＣｐＧサイトに整列する各パラメータについて、前記各々の断片の前記対応するＣｐＧサイトの前記メチル化状態を割り当てることとを含む、方法。

【請求項6】

請求項３に記載の方法において、前記構築ステップ（Ｂ）は、前記複数の断片中の各々の断片について：
ｉ）前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、前記各々の断片中の前記ＣｐＧサイトに対応する、前記複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別することと、
ｉｉ）前記識別されたパラメータのうちの前記各々の断片の各々のＣｐＧサイトに整列する各パラメータについて、前記各々の断片の前記各々のＣｐＧサイトの前記メチル化状態を割り当てることと、
ｉｉｉ）前記第１の複数のパラメータの前記インスタンスに対応する前記第２のチャンネルの前記第２の複数のパラメータの前記インスタンスの前記第２の複数のパラメータ中の、前記各々の断片の各々のＣｐＧサイトに整列する、前記識別されたパラメータのうちの各パラメータについて、前記各々の断片の前記各々のＣｐＧサイトの前記第１の特徴を割り当てることとを含む、方法。

【請求項7】

請求項６に記載の方法において、前記各々のＣｐＧサイトの前記第１の特徴は前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の多重度である、方法。

【請求項8】

請求項６に記載の方法において、前記各々のＣｐＧサイトの前記第１の特徴は：
健常コホートから得られたＣｐＧβ値と、
健常コホート中の所定の組織タイプから得られたＣｐＧβ値と、
前記検査対象から得られたＣｐＧβ値と、
５’及び３’近隣ＣｐＧサイトのメチル化状態についてのPearson相関スコアと、
諸対象のコホートに対しての前記検査対象中の前記各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についての、Jaccard類似度、ユークリッド距離、マンハッタン距離、最大値、正規化ユークリッド距離、正規化最大値、dice係数、又は余弦係数と、
前記各々の断片の断片ｐ値と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の長さと、
断片シーケンス源と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の断片マッピング品質スコアと、
前記参照ゲノム中の５’隣接ＣｐＧサイトへの距離と、
前記参照ゲノム中の３’隣接ＣｐＧサイトへの距離と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の多重度と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する遺伝的要素と、
前記各々のＣｐＧサイトが関連付けられている生物学的経路と、
前記各々のＣｐＧサイトが関連付けられている遺伝子と、
前記各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧ遷移インパルス関数の値と、
前記各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧラン長符号化（run-length encoding）の値と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記断片のリード（read）ストランド配向とからなる群から選択される、方法。

【請求項9】

請求項５又は６に記載の方法において、前記複数の断片中の１つより多い断片は、前記１つより多い断片が共通ＣｐＧサイトを有さないことを条件として、前記第１のパッチ中の前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータの単一のインスタンスに割り当てられる、方法。

【請求項10】

請求項４に記載の方法において、前記第１の複数のパラメータの前記インスタンス中のパラメータはゼロで埋められている、方法。

【請求項11】

請求項１に記載の方法において、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは前記参照ゲノムのＣｐＧインデックス中にある、方法。

【請求項12】

請求項１１に記載の方法において、前記参照ゲノムの前記ＣｐＧインデックスは、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに中には所在しないがＣｐＧサイトの前記第１の独立セット内に所在する第２のＣｐＧサイトと第３のＣｐＧサイトとの間の前記参照ゲノム中に位置する第１のＣｐＧサイトを含む、方法。

【請求項13】

請求項１に記載の方法において、
ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは、前記参照ゲノムのＣｐＧインデックス中において互いに隣り合う第１のＣｐＧサイトと第２のＣｐＧサイトとを含み、
前記複数の断片中の第１の断片は、前記第１のＣｐＧサイトを含むが前記第２のＣｐＧサイトを含まず、
前記複数の断片中の第２の断片は、前記第２のＣｐＧサイトを含むが前記第１のＣｐＧサイトを含まない、方法。

【請求項14】

請求項１に記載の方法において、前記第１の複数のパラメータのインスタンス中のパラメータは、前記複数の断片中の各々の断片について：
前記各々の断片中の前記対応するＣｐＧサイトが前記メチル化シーケンシングによってメチル化していると決定された場合には、メチル化しているとされ、
前記各々の断片中の前記対応するＣｐＧサイトが前記メチル化シーケンシングによってメチル化していないと決定された場合には、メチル化していないとされ、
前記各々の断片中の前記対応するＣｐＧサイトが前記メチル化シーケンシングによってメチル化している又はメチル化していない以外のものと決定された場合には、それ以外とされる、方法。

【請求項15】

請求項５に記載の方法において、前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータの幾つかのインスタンスには各々の断片が割り当てられず、前記少なくとも１つのプログラムは、断片が割り当てられていない前記第１のチャンネルの前記複数のパラメータのインスタンス中にてパラメータについてゼロで埋めるための命令を含む、方法。

【請求項16】

請求項５に記載の方法において、前記識別ステップ（ｉ）では、前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、前記各々の断片中の前記ＣｐＧサイトに対応する、前記複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別できず、前記少なくとも１つのプログラムは、前記各々の断片を破棄するための命令をさらに含む、方法。

【請求項17】

請求項５に記載の方法において、前記識別ステップ（ｉ）では、前記第１のパッチの前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、前記各々の断片中の前記ＣｐＧサイトに対応する、前記複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別できず、前記少なくとも１つのプログラムは、前記第１のパッチの追加のインスタンスを作成するための命令及び前記各々の断片を前記第１のパッチの前記追加のインスタンスに割り当てるための命令をさらに含む、方法。

【請求項18】

請求項３に記載の方法において、
前記複数のチャンネルは少なくとも３つのチャンネルを含み；
前記第１の複数のチャンネルのうちの第３のチャンネルは、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスについての第３の複数のパラメータについての対応するインスタンスを含み、前記第３の複数のパラメータの各インスタンスはＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトの第２の特徴についてのパラメータを含み、前記第２の特徴は：
健常コホートから得られたＣｐＧβ値と、
健常コホート中の所定の組織タイプから得られたＣｐＧβ値と、
前記検査対象から得られたＣｐＧβ値と、
５’及び３’近隣ＣｐＧサイトのメチル化状態についてのPearson相関スコアと、
諸対象のコホートに対しての前記検査対象中の前記各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についての、Jaccard類似度、ユークリッド距離、マンハッタン距離、最大値、正規化ユークリッド距離、正規化最大値、dice係数、又は余弦係数と、
前記各々の断片の断片ｐ値と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の長さと、
断片シーケンス源と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の断片マッピング品質スコアと、
前記参照ゲノム中の５’隣接ＣｐＧサイトへの距離と、
前記参照ゲノム中の３’隣接ＣｐＧサイトへの距離と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の多重度と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する遺伝的要素と、
前記各々のＣｐＧサイトが関連付けられている生物学的経路と、
前記各々のＣｐＧサイトが関連付けられている遺伝子と、
前記各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧ遷移インパルス関数の値と、
前記各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧラン長符号化（run-length encoding）の値と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記断片のリード（read）ストランド配向とからなる群から選択される、方法。

【請求項19】

請求項１に記載の方法において、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは前記参照ゲノム全体から抽出される、方法。

【請求項20】

請求項１に記載の方法において、前記少なくとも１つのプログラムは、
対応する第１のチャンネルを含む第２のパッチを構築するステップであって、前記第２のパッチは前記種の前記参照ゲノム中の、ＣｐＧサイトの第２の独立セットを表し、ＣｐＧサイトの前記第２の独立セット中のそれぞれ各々のＣｐＧサイトは前記参照ゲノム中の所定の位置に対応し、前記第２のパッチの前記対応する第１のチャンネルは第１の複数のパラメータについての対応する複数のインスタンスを含み、前記第２のチャンネルの前記対応する第１の複数のパラメータの各インスタンスは前記第２のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第２の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含むステップと、
ＣｐＧサイトの前記第２の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれ各々の断片について、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第２のパッチの前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入して、それによって前記第２のパッチを構築するステップと、をなすための命令をさらに含み、
前記適用ステップ（Ｃ）は、前記第１及び第２のパッチを前記分類器に適用して、それによって前記検査対象にての癌状態を決定することをさらに含む、方法。

【請求項21】

請求項２０に記載の方法において、
前記第２のパッチは、前記対応する第１のチャンネルを含む対応する複数のチャンネルを含み、
前記第２のパッチの前記対応する複数のチャンネルのうちの対応する第２のチャンネルは、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスについての第２の複数のパラメータについての対応するインスタンスを含み、前記第２のパッチの前記第２の複数のパラメータの各インスタンスは、前記第２のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第２の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのＣｐＧメチル化状態以外の第１の特徴についてのパラメータを含み、
ＣｐＧサイトの前記第２の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれ各々の断片について、投入するための命令は、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第２のパッチの前記第２の複数のパラメータの前記インスタンスの全部又は一部のインスタンスにさらに投入する、方法。

【請求項22】

請求項２０に記載の方法において、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは、ＣｐＧサイトの前記第２の独立セットとは重複していない、方法。

【請求項23】

請求項２０に記載の方法において、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは、ＣｐＧサイトの前記第２の独立セットと重複している、方法。

【請求項24】

請求項２０に記載の方法において、前記第１のパッチは、前記第２のパッチとは同等のサイズではあるが前記参照ゲノムの異なる部分を表す、方法。

【請求項25】

請求項２０に記載の方法において、前記第１のパッチは前記参照ゲノムの第１の部分を表し、前記第２のパッチは前記参照ゲノムの第２の部分を表し、前記第１の部分のサイズは前記第２の部分のサイズと異なる、方法。

【請求項26】

請求項２４又は２５に記載の方法において、
ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは第１の個数のＣｐＧサイトからなり、
ＣｐＧサイトの前記第２の独立セットは第２の個数のＣｐＧサイトからなり、
ＣｐＧサイトについての前記第１の個数はＣｐＧサイトについての前記第２の個数と同一である、方法。

【請求項27】

請求項２４又は２５に記載の方法において、
ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットは第１の個数のＣｐＧサイトからなり、
ＣｐＧサイトの前記第２の独立セットは第２の個数のＣｐＧサイトからなり、
ＣｐＧサイトについての前記第１の個数はＣｐＧサイトについての前記第２の個数と異なる、方法。

【請求項28】

請求項１に記載の方法において、１つ以上の核酸試料についての前記メチル化シーケンシングは、（ｉ）全ゲノムメチル化シーケンシング又は（ｉｉ）複数の核酸プローブを用いる標的ＤＮＡメチル化シーケンシングである、方法。

【請求項29】

請求項２８に記載の方法において、１つ以上の核酸試料についての前記メチル化シーケンシングは、複数の核酸プローブを使用し、前記複数の核酸プローブは１００個以上のプローブを含む、方法。

【請求項30】

請求項１に記載の方法において、１つ以上の核酸試料についての前記メチル化シーケンシングは、１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍｃ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍｃ）を前記各々の断片にて検出する、方法。

【請求項31】

請求項１に記載の方法において、１つ以上の核酸試料についての前記メチル化シーケンシングは、前記各々の断片中の１つ以上の非メチル化シトシン又は１つ以上のメチル化シトシンを対応する１つ以上のウラシルに転換することを含む、方法。

【請求項32】

請求項３１に記載の方法において、前記１つ以上のウラシルは、前記メチル化シーケンシング中に、１つ以上の対応するチミンとして検出される、方法。

【請求項33】

請求項３１に記載の方法において、１つ以上の非メチル化シトシン又は１つ以上のメチル化シトシンの前記転換は、化学転換、酵素転換、又はそれらの組合せを含む、方法。

【請求項34】

請求項１に記載の方法において、
前記少なくとも１つのプログラムは、前記第１のパッチを含む複数のパッチを構築するための命令をさらに含み、それぞれ各々のパッチは前記参照ゲノム中のＣｐＧサイトについての異なる独立セットのためのものであり、
前記構築ステップ（Ｂ）は前記第１のパッチを含む複数のパッチを構築し、
前記分類器は複数の訓練済み第１段階モデル及び第２段階モデルを含み、
前記少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用するステップは：
複数の特徴要素を含む特徴ベクトルを取得するステップであって、前記複数の特徴要素中の各特徴要素は、前記複数のパッチ中の各々のパッチを前記対応する訓練済み第１段階モデルに適用した際の、前記複数の訓練済み第１段階モデル中の対応する訓練済み第１段階モデルの出力である、ステップと、
前記特徴ベクトルを前記第２段階モデルに適用して、それによって前記検査対象にての前記癌状態を決定するステップとを含む、方法。

【請求項35】

請求項３４に記載の方法において、
前記複数の訓練済み第１段階モデル中のそれぞれ各々の訓練済み第１段階モデルは対応する訓練済み畳み込みニューラルネットワークであり、前記第２段階モデルはロジスティック回帰モデルであり、
前記第１のパッチの前記第１のチャンネルは２次元的であり、前記第１のパッチの前記第１の複数のパラメータの前記複数のインスタンスのそれぞれ各々のインスタンスが第１の次元を構成しており、前記第１のパッチの前記第１の複数のパラメータが前記第２の次元を構成している、方法。

【請求項36】

請求項３４に記載の方法において、前記複数のパッチは１０個のパッチから１００００個のパッチとされる、方法。

【請求項37】

請求項３４に記載の方法において、前記複数のパッチは１００個のパッチから３０００個のパッチとされる、方法。

【請求項38】

請求項１に記載の方法において、
前記分類器は複数の第１段階モデル及び動的ニューラルネットワークを含み、
前記少なくとも１つのプログラムは、前記第１のパッチを含む複数のパッチを構築するための命令をさらに含み、それぞれ各々のパッチは前記参照ゲノム中のＣｐＧサイトについての異なるセットのためのものであり、
前記構築ステップ（Ｂ）は前記第１のパッチを含む各々のパッチを構築し、
前記少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用するステップ（Ｃ）は：
Ｃ１）前記複数のパッチ中のそれぞれ各々のパッチを前記複数の第１段階モデル中の対応する第１段階モデルに適用するステップであって、前記対応する第１段階モデルは：
ｉ）前記各々のパッチを受けるための各々の入力層であって、前記各々のパッチは第１の次元数を含んでいる、入力層と、
ｉｉ）対応する重みセットを含む各々の完全接続埋め込み層であって、前記各々の完全接続埋め込み層は前記各々の入力層の出力を直接的又は間接的に受け取り、前記各々の埋め込み層の各々の出力は前記第１の次元数より少ない第２の次元数とされる、埋め込み層と、
ｉｉｉ）前記各々の完全接続埋め込み層からの出力を直接的又は間接的に受け取る各々の出力層とを含む、ステップと、
Ｃ２）前記複数の第１段階モデル中の各訓練済み第１段階モデルのそれぞれ各々の完全接続埋め込み層からの前記各々の出力の集約を、前記動的ニューラルネットワーク内へと入力して、それによって前記検査対象にての癌状態を決定するステップとを含む、方法。

【請求項39】

請求項３８に記載の方法において、前記複数の第１段階モデル中のそれぞれ各々の第１段階モデルの前記各々の埋め込み層の前記各々の出力は、３２個から１０４８個の値のセットである、方法。

【請求項40】

請求項３９に記載の方法において、前記少なくとも１つのプログラムは対象についてのコホートを用いて前記複数の第１段階モデル及び前記動的ニューラルネットワークを訓練するための命令をさらに含み、前記対象についてのコホートは、前記癌状態に関する第１のラベルを有する、対象についての第１のサブセットと、前記癌状態に関する第２のラベルを有する、対象についての第２のサブセットとを含む、方法。

【請求項41】

請求項４０に記載の方法において、前記訓練のための命令は：
ａ）ランダムな態様で対象についての前記コホートを癌状態、年齢、喫煙状態、又は性別の任意の組合せに基づいて複数の群に階層化する、階層化ステップと、
ｂ）前記複数の群中の第１の群を訓練群として及び前記複数の群の残部を検査群として使用して、前記複数のモデル及び前記動的ニューラルネットワークを前記訓練群に対して訓練する、使用ステップと、
ｃ）前記複数の群中の各群について前記使用ステップ（ｂ）を反復するステップであって、前記複数の群中の各群が前記訓練群として前記使用ステップ（ｂ）の反復回にて用いられるようにする、反復ステップと、
ｄ）分類器性能基準が充足されるまで前記階層化ステップ（ａ）、使用ステップ（ｂ）、及び反復ステップ（ｃ）を反復するステップと、を含む、方法。

【請求項42】

請求項４０又は４１に記載の方法において、前記癌状態は原発組織であり、対象についての前記コホート中の各対象は原発組織をもってラベル付けされている、方法。

【請求項43】

請求項４２に記載の方法において、前記コホートは、肛門直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、頭部及び頸部癌、肝胆癌、子宮内膜癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ系腫瘍、メラノーマ、多発性骨髄腫、骨髄腫瘍、卵巣癌、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、腎癌、甲状腺癌、上部胃腸癌、尿路上皮癌、又は子宮癌を対象として含む。

【請求項44】

請求項４０に記載の方法において、前記癌状態は指定癌のステージであり、対象についての前記コホート中の各対象は指定癌のステージをもってラベル付けされている、方法。

【請求項45】

請求項４４に記載の方法において、前記コホートは、肛門直腸癌のステージ、膀胱癌のステージ、乳癌のステージ、子宮頸癌のステージ、結腸直腸癌のステージ、頭部及び頸部癌のステージ、肝胆癌のステージ、子宮内膜癌のステージ、腎臓癌のステージ、白血病のステージ、肝臓癌のステージ、肺癌のステージ、リンパ系腫瘍のステージ、メラノーマのステージ、多発性骨髄腫のステージ、骨髄腫瘍のステージ、卵巣癌のステージ、非ホジキンリンパ腫のステージ、膵臓癌のステージ、前立腺癌のステージ、腎癌のステージ、甲状腺癌のステージ、上部胃腸癌のステージ、尿路上皮癌のステージ、又は子宮癌のステージを対象として含む。

【請求項46】

請求項４１に記載の方法において、前記癌状態は対象が癌を有するか否かであり、前記階層化ステップ（ａ）は、前記複数の群中の各群が癌を有する対象数と癌を有さない対象数とを等しく有することを担保する、方法。

【請求項47】

請求項４０から４６のいずれか一項に記載の方法において、前記訓練によって、前記訓練中に前記複数のパッチ中のそれぞれ各々のパッチの各々の出力層から提供された値に基づいたＬ１又はＬ２正規化を用いて前記複数のパッチ中の１つ以上のパッチが除去される、方法。

【請求項48】

請求項１に記載の方法において、前記第１の複数のパラメータの前記複数のインスタンスは２４個から２０４８個である、方法。

【請求項49】

請求項１に記載の方法において、前記第１の複数のパラメータの前記複数のインスタンス中のインスタンス数は、前記複数の断片の期待リード深度に前記複数の断片にわたっての１標準偏差が加わったものに基づいて決定される、方法。

【請求項50】

請求項１に記載の方法において、前記構築ステップ（Ｂ）は、前記第１のパッチに割り当てられた各々の断片を、それらの各々のｐ値又は前記参照ゲノムにおけるそれらの開始位置に基づいて、ソートすることをさらに含む、方法。

【請求項51】

請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法において、前記少なくとも１つのプログラムは、複数の臨床的対象を備える臨床的コホートから取得された複数の臨床的生物試料の複数の臨床的核酸試料から取得された複数の臨床的断片のメチル化シーケンシングによって決定された複数のＣｐＧメチル化パターンの評価を介して、前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セットを選択する、選択ステップのための命令をさらに含み、前記複数の臨床的対象は、前記癌状態に関する第１の兆候を有する臨床的対象についての第１のセットと前記癌状態に関する第２の兆候を有する臨床的対象についての第２のセットとを含む、方法。

【請求項52】

請求項５１に記載の方法において、前記選択ステップのための命令は：
臨床的対象についての前記第１のセットと臨床的対象についての前記第２のセットとの間での前記複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態についての各々の第１の相互情報スコアに基づいて、複数のＣｐＧサイトの前記参照ゲノム内での第１の順位を決定するステップと、
前記順位を用いて、前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記対応する独立セットについてのＣｐＧサイトの第１の閾値個数を選択するステップとを含む、方法。

【請求項53】

請求項５１に記載の方法において、
前記複数の臨床的対象は、前記癌状態に関する第３の兆候を有する臨床的対象についての第３のセットと前記癌状態に関する第４の兆候を有する臨床的対象についての第４のセットとを含み、前記選択ステップのための命令は：
臨床的対象についての前記第３のセットと臨床的対象についての前記第４のセットとの間での前記複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態についての各々の第２の相互情報スコアに基づいて、前記複数のＣｐＧサイトの前記参照ゲノム内での第２の順位を決定するステップと、
前記第２の順位を用いて、前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第２の閾値個数を選択するステップとを含む、方法。

【請求項54】

請求項５２に記載の方法において、前記構築ステップ（Ｂ）は、前記第１のパッチに割り当てられた各々の断片を、それらの第１の相互情報スコアに基づいて、ソートすることをさらに含む、方法。

【請求項55】

請求項５１に記載の方法において、前記癌状態についての第１の兆候は第１の癌タイプであり、前記癌状態についての第２の兆候は第２の癌タイプである、方法。

【請求項56】

請求項５２に記載の方法において、前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの前記第１の閾値個数中のそれぞれ各々のＣｐＧサイトは、ＣｐＧサイトの前記第１の閾値個数の中のあらゆる他のＣｐＧサイトから前記参照ゲノム内において閾値個数の剰余部をもってパディングされる、方法。

【請求項57】

請求項５１に記載の方法において、前記選択ステップのための命令は：
臨床的対象についての前記第１のセットと臨床的対象についての前記第２のセットとの間での前記複数の固定長領域中の各固定長領域のＣｐＧサイトメチル化パターンのメチル化状態についての各々の第１の相互情報スコアに基づいて、前記参照ゲノム内での複数の固定長領域の第１の順位を決定するステップと、
前記第１の順位を用いて、前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第１の閾値個数を、前記複数の固定長領域中のそれらの固定長領域から、選択するステップとを含む、方法。

【請求項58】

請求項５７に記載の方法において、
前記複数の臨床的対象は、前記癌状態に関する第３の兆候を有する臨床的対象についての第３のセットと前記癌状態に関する第４の兆候を有する臨床的対象についての第４のセットとを含み、前記選択ステップのための命令は：
臨床的対象についての前記第３のセットと臨床的対象についての前記第４のセットとの間での前記複数の固定長領域中の各固定長領域のＣｐＧサイトメチル化パターンのメチル化状態についての各々の第２の相互情報スコアに基づいて、前記参照ゲノム内での前記複数の固定長領域の第２の順位を決定するステップと、
前記第２の順位を用いて、前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの第２の閾値個数を選択するステップとを含む、方法。

【請求項59】

請求項５７に記載の方法において、前記構築ステップ（Ｂ）は、前記第１のパッチに割り当てられた各々の断片を、それらの第１の相互情報スコアに基づいて、ソートすることをさらに含む、方法。

【請求項60】

請求項５７に記載の方法において、前記癌状態についての第１の兆候は第１の癌タイプであり、前記癌状態についての第２の兆候は第２の癌タイプである、方法。

【請求項61】

請求項５７に記載の方法において、前記第１のパッチのＣｐＧサイトの前記第１の独立セットについてのＣｐＧサイトの前記第１の閾値個数中のそれぞれ各々のＣｐＧサイトは、ＣｐＧサイトの前記第１の閾値個数の中のあらゆる他のＣｐＧサイトから前記参照ゲノム内において閾値個数の剰余部をもってパディングされる、方法。

【請求項62】

請求項１から６１のいずれか一項に記載の方法において、前記１つ以上の核酸試料は無細胞核酸試料である、方法。

【請求項63】

種に属する検査対象の癌状態を決定するためのコンピュータシステムであって、該コンピュータシステムは、
少なくとも１つのプロセッサと、
前記少なくとも１つのプロセッサによって実行される少なくとも１つのプログラムを格納するメモリであって、該少なくとも１つのプログラムは、
Ａ）電子的態様にてデータセットを取得するステップであって、前記データセットは複数の断片中のそれぞれ各々の断片の対応するメチル化パターンを備え、それぞれ各々の断片の前記対応するメチル化パターンは（ｉ）前記検査対象から取得された生物試料中の前記各々の断片を備える１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングによって決定され、且つ（ｉｉ）前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含む、取得ステップと、
Ｂ）第１のチャンネルを含む第１のパッチを構築するステップであって、前記第１のパッチは前記種の参照ゲノム中の、ＣｐＧサイトの第１の独立セットを表し、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中のそれぞれ各々のＣｐＧサイトは前記参照ゲノム中の所定の位置に対応する、構築ステップであって、
前記第１のパッチの前記第１のチャンネルは第１の複数のパラメータについての複数のインスタンスを含み、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスは前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含み、
当該構築ステップ（Ｂ）は、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれ各々の断片について、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入することを含む、ステップと、
Ｃ）少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用してそれによって前記検査対象にての前記癌状態を決定する、適用ステップと、をなすための命令を含む、メモリとを備える、コンピュータシステム。

【請求項64】

プロセッサによって実行されると、前記プロセッサに、種に属する検査対象の癌状態を決定する方法を行わせるプログラムコード命令が格納された非一時的コンピュータ可読記憶媒体であって、該命令は、
Ａ）電子的態様にてデータセットを取得するステップであって、前記データセットは複数の断片中のそれぞれ各々の断片の対応するメチル化パターンを備え、それぞれ各々の断片の前記対応するメチル化パターンは（ｉ）前記検査対象から取得された生物試料中の前記各々の断片を備える１つ以上の核酸試料についてのメチル化シーケンシングによって決定され、且つ（ｉｉ）前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイト中の各ＣｐＧサイトのメチル化状態を含む、取得ステップと、
Ｂ）第１のチャンネルを含む第１のパッチを構築するステップであって、前記第１のパッチは前記種の参照ゲノム中の、ＣｐＧサイトの第１の独立セットを表し、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中のそれぞれ各々のＣｐＧサイトは前記参照ゲノム中の所定の位置に対応する、構築ステップであって、
前記第１のパッチの前記第１のチャンネルは第１の複数のパラメータについての複数のインスタンスを含み、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスは前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含み、
当該構築ステップ（Ｂ）は、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに整列した前記複数の断片中のそれぞれ各々の断片について、前記各々の断片の前記メチル化パターンに基づいて、前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入することを含む、ステップと、
Ｃ）少なくとも前記第１のパッチを分類器に適用してそれによって前記検査対象にての前記癌状態を決定する、適用ステップとを含む、非一時的コンピュータ可読記憶媒体。

【請求項65】

種に属する検査対象の癌状態を決定する方法であって、該方法は、
Ａ）１つ以上のプロセッサを介して、訓練データセットを１つ以上の訓練対象から取得するステップであって、前記訓練データセットは、前記１つ以上の訓練対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片の１つ以上の訓練メチル化パターンと、前記１つ以上の訓練メチル化パターンに関連付けられている１つ以上の所定の癌状態とを含む、ステップと、
Ｂ）前記１つ以上のプロセッサを介して、前記訓練データセットに基づいて１つ以上のパッチを構築するステップであって、前記１つ以上のパッチの各パッチは、１つ以上のチャンネルを含み、前記種の参照ゲノム中の１つ以上のＣｐＧサイトを表し、前記１つ以上のＣｐＧサイトの各ＣｐＧサイトは、前記参照ゲノム中の所定の位置に対応する、ステップと、
Ｃ）前記１つ以上のプロセッサを介して、前記１つ以上のパッチ及び前記訓練データセットに基づいて計算モデルを訓練するステップと、
Ｄ）１つ以上のプロセッサを介して、前記検査対象から検査データセットを取得するステップであって、前記検査データセットは、前記検査対象から取得された１つ以上の生物試料中の複数の断片の１つ以上の検査メチル化パターンを含む、ステップと、
Ｅ）１つ以上のプロセッサを介して、前記検査データセット及び前記計算モデルに基づいて前記検査対象の前記癌状態を決定するステップとを含む、方法。

【請求項66】

請求項６５に記載の方法において、前記１つ以上の訓練メチル化パターンは、（ｉ）前記１つ以上の訓練対象から取得された前記１つ以上の生物試料中の前記複数の断片を含む１つ以上の核酸試料の少なくとも１つのメチル化シーケンシングによって決定され、（ｉｉ）前記１つ以上の訓練対象から取得された前記１つ以上の生物試料中の前記複数の断片中の各ＣｐＧサイトの少なくとも１つのメチル化状態を含む、方法。

【請求項67】

請求項６５に記載の方法において、前記１つ以上の検査メチル化パターンは、（ｉ）前記検査対象から取得された前記１つ以上の生物試料中の前記複数の断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化シーケンシングによって決定され、（ｉｉ）前記検査対象から取得された前記１つ以上の生物試料中の前記複数の断片中の各ＣｐＧサイトの少なくとも１つのメチル化状態を含む、方法。

【請求項68】

請求項６５に記載の方法において、前記計算モデルは畳み込みニューラルネットワークと第２段階モデルとを備える、方法。

【請求項69】

請求項６５に記載の方法において、前記ステップ（Ｂ）の前に、前記複数の断片からそれぞれ各々の断片であって前記各々の断片中の対応する複数のＣｐＧサイトにわたっての対応するメチル化パターンがｐ値閾値を充足しないｐ値を有する断片を除去することによって、前記複数の断片に対してプルーニングを行うプルーニングステップを含む、方法。

【請求項70】

請求項６９に記載の方法において、前記各々の断片の前記ｐ値は、健常な対象のコホートから取得された１つ以上の生物試料からの核酸についてのメチル化シーケンシングによって取得された複数の参照断片に関連付けられているメチル化パターンに基づいて決定される、方法。

【請求項71】

請求項６５に記載の方法において、前記１つ以上のチャンネルは第１のチャンネルを含み、前記第１のチャンネルは第１の複数のパラメータの複数のインスタンスを含み、前記第１の複数のパラメータの各インスタンスは前記１つ以上のパッチについてのＣｐＧサイトの第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についてのパラメータを含む、方法。

【請求項72】

請求項７１に記載の方法において、前記構築ステップ（Ｂ）は、ＣｐＧサイトの前記第１の独立セットに整列した前記１つ以上の訓練対象から取得された１つ以上の生物試料中の前記複数の断片中のそれぞれ各々の断片について、前記各々の断片の前記訓練メチル化パターンに基づいて、前記第１の複数のパラメータの全部又は一部のインスタンスに投入することを含む、方法。

【請求項73】

請求項７１に記載の方法において、前記構築ステップ（Ｂ）は、前記複数の断片中の各々の断片について：
ｉ）前記第１のチャンネルの前記第１の複数のパラメータのインスタンス内にて、前記各々の断片中の前記ＣｐＧサイトに対応する、前記複数の断片中の別の断片に基づいてメチル化状態が以前に割り当てられていないパラメータを識別することと、
ｉｉ）前記識別されたパラメータのうちの前記各々の断片の対応するＣｐＧサイトに整列する各パラメータについて、前記各々の断片の前記対応するＣｐＧサイトの前記メチル化状態を割り当てることとを含む、方法。

【請求項74】

請求項７１に記載の方法において、前記１つ以上のチャンネルは第２のチャンネルを含み、前記第２のチャンネルは前記第１の複数のパラメータの各インスタンスについての第２の複数のパラメータについての対応するインスタンスを含み、前記第２の複数のパラメータの各インスタンスは、前記第１のパッチについてのＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトのＣｐＧメチル化状態以外の第１の特徴についてのパラメータを含む、方法。

【請求項75】

請求項７４に記載の方法において、前記１つ以上のチャンネルは第３のチャンネルを含み、前記第３のチャンネルは前記第１の複数のパラメータの各インスタンスについての第３の複数のパラメータについての対応するインスタンスを含み、前記第３の複数のパラメータの各インスタンスはＣｐＧサイトの前記第１の独立セット中の各々のＣｐＧサイトの第２の特徴についてのパラメータを含む、方法。

【請求項76】

請求項７４に記載の方法において、前記各々のＣｐＧサイトの前記第１の特徴は前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の多重度である、方法。

【請求項77】

請求項７４に記載の方法において、前記各々のＣｐＧサイトの前記第１の特徴は、
健常コホートから得られたＣｐＧβ値と、
健常コホート中の所定の組織タイプから得られたＣｐＧβ値と、
前記検査対象から得られたＣｐＧβ値と、
５’及び３’近隣ＣｐＧサイトのメチル化状態についてのPearson相関スコアと、
諸対象のコホートに対しての前記検査対象中の前記各々のＣｐＧサイトのメチル化状態についての、Jaccard類似度、ユークリッド距離、マンハッタン距離、最大値、正規化ユークリッド距離、正規化最大値、dice係数、又は余弦係数と、
前記各々の断片の断片ｐ値と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の長さと、
断片シーケンス源と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の断片マッピング品質スコアと、
前記参照ゲノム中の５’隣接ＣｐＧサイトへの距離と、
前記参照ゲノム中の３’隣接ＣｐＧサイトへの距離と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記各々の断片の多重度と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する遺伝的要素と、
前記各々のＣｐＧサイトが関連付けられている生物学的経路と、
前記各々のＣｐＧサイトが関連付けられている遺伝子と、
前記各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧ遷移インパルス関数の値と、
前記各々のＣｐＧサイトについてのＣｐＧラン長符号化（run-length encoding）の値と、
前記各々のＣｐＧサイトが所在する前記断片のリード（read）ストランド配向、のうちの少なくとも１つを含む、方法。

【請求項78】

請求項６５に記載の方法において、前記１つ以上のプロセッサを介して、前記癌状態を、前記検査対象のユーザ装置に関連付けられている電子記録へと、送信するステップをさらに含む、方法。

【請求項79】

請求項６５に記載の方法において、前記癌状態は癌のレベルと、原発組織と、転移性疾患ステータスとを含む、方法。

【請求項80】

請求項６８に記載の方法において、前記畳み込みニューラルネットワークは予め訓練された畳み込みニューラルネットワークである、方法。

【請求項81】

請求項８０に記載の方法において、前記予め訓練された畳み込みニューラルネットワークはカスタマイズされたＶＧＧ－１１畳み込みニューラルネットワークを含み、前記カスタマイズされたＶＧＧ－１１畳み込みニューラルネットワークはカスタマイズされたフィルタサイズ及び活性化関数を有する、方法。

【請求項82】

請求項６５に記載の方法において、１つ以上の生物学的先行事項を用いて前記計算モデルを更新するステップをさらに含む、方法。

【誤訳訂正3】

【訂正対象書類名】図面

【訂正対象項目名】全図

【訂正方法】変更

【訂正の内容】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図6-6】

【図6-7】

【図6-8】

【図6-9】

【図6-10】

【図6-11】

【図6-12】

【図6-13】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【国際調査報告】