特表 2023-507280 ヒトＩＬ－１３及びＩＬ－１７に対する結合特異性を有する多重特異性抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-22

(54)【発明の名称】ヒトＩＬ－１３及びＩＬ－１７に対する結合特異性を有する多重特異性抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230215BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230215BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230215BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20230215BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230215BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230215BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230215BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230215BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230215BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230215BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230215BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20230215BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20230215BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230215BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230215BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20230215BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/13

C07K16/46

C07K16/24

C12N15/63 Z

C12P21/08

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/39

A61P37/08

A61P17/00

A61P1/04

A61P11/02

A61P17/00 171

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022534761

(86)(22)【出願日】2020-12-18

(85)【翻訳文提出日】2022-08-05

(86)【国際出願番号】 EP2020087046

(87)【国際公開番号】W WO2021123186

(87)【国際公開日】2021-06-24

(31)【優先権主張番号】1919061.0

(32)【優先日】2019-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514232085

【氏名又は名称】ユーシービー バイオファルマ エスアールエル

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】カーン、アドナン ラーマン

(72)【発明者】

【氏名】ヘイウッド、サム フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】ハンフリーズ、デイヴィッド ポール

(72)【発明者】

【氏名】ライトウッド、ダニエル ジョン

(72)【発明者】

【氏名】デイブ、エマ

(72)【発明者】

【氏名】バリー、エミリー メアリー ケアリスティン

(72)【発明者】

【氏名】スタンヨン、セアラ ジェイン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB31

4C085BB33

4C085BB34

4C085BB35

4C085BB36

4C085BB37

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE06

4C085FF24

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA22

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、ヒトＩＬ－１３、ヒトＩＬ－１７Ａ及び／又はヒトＩＬ－１７Ｆに対する特異性を有する多重特異性抗体に関する。本発明は更に、多重特異性抗体を製造する方法、並びにアトピー性皮膚炎及び他の疾患を治療するためのその治療的使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＩＬ－１３、ヒトＩＬ－１７Ａ及び／又はヒトＩＬ－１７Ｆに結合する多重特異性抗体であって、
ＣＤＲ－Ｌ１については配列番号１５に示される配列、ＣＤＲ－Ｌ２については配列番号１６に示される配列、及びＣＤＲ－Ｌ３については配列番号１７に示される配列を含む軽鎖可変領域と、
ＣＤＲ－Ｈ１については配列番号１８に示される配列、ＣＤＲ－Ｈ２については配列番号１９に示される配列、及びＣＤＲ－Ｈ３については配列番号２０に示される配列を含む重鎖可変領域と
を含むＩＬ－１３結合部位を含む、多重特異性抗体。

【請求項2】

前記ＩＬ－１３結合部位が、配列番号２７に示される配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号２８に示される配列を含む重鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の多重特異性抗体。

【請求項3】

前記ＩＬ－１３結合部位が、配列番号３１に示される配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号３２に示される配列を含む重鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の多重特異性抗体。

【請求項4】

ＣＤＲ－Ｌ１については配列番号１に示される配列、ＣＤＲ－Ｌ２については配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ－Ｌ３については配列番号３に示される配列を含む軽鎖可変領域と、
ＣＤＲ－Ｈ１については配列番号４に示される配列、ＣＤＲ－Ｈ２については配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ－Ｈ３については配列番号６に示される配列を含む重鎖可変領域と
を含む、ヒトＩＬ－１７Ａ及びヒトＩＬ－１７Ｆに結合する抗原結合部位を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項5】

ヒトＩＬ－１７Ａ及びヒトＩＬ－１７Ｆに結合する前記抗原結合部位が、配列番号７に示される配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号９に示される配列を含む重鎖可変領域とを含む、請求項４に記載の多重特異性抗体。

【請求項6】

ａ）式（Ｉａ）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ－ＣＨ_１－Ｘ－Ｖ_１と、
ｂ）式（ＩＩａ）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌ－Ｙ－Ｖ_２と
を含み、
式中、
Ｖ_Ｈは重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ_１は重鎖定常領域のドメイン１を表し、
Ｘは結合又はリンカーを表し、
Ｙは結合又はリンカーを表し、
Ｖ_１はｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、又はｄｓＦｖを表し、
Ｖ_Ｌは軽鎖可変ドメインを表し、
Ｃ_ＬはＣカッパなどの軽鎖定常領域由来のドメインを表し、
Ｖ_２はｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖを表し、
式（Ｉａ）のポリペプチド鎖はプロテインＡ結合ドメインを含み、
式（ＩＩａ）のポリペプチド鎖はプロテインＡに結合しない、
ヒトＩＬ－１３、ヒトＩＬ－１７Ａ及び／又はヒトＩＬ－１７Ｆに結合する、請求項１から５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項7】

Ｖ_Ｌ及びＶ_ＨはヒトＩＬ－１７Ａ及びヒトＩＬ－１７Ｆに結合する抗原結合部位を含み、
Ｖ_２はヒトＩＬ－１３に結合する抗原結合部位を含み、
Ｖ_１はヒト血清アルブミンに結合する抗原結合部位を含み、
Ｖ_Ｌは、ＣＤＲ－Ｌ１については配列番号１に示される配列、ＣＤＲ－Ｌ２については配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ－Ｌ３については配列番号３に示される配列を含み、
Ｖ_Ｈは、ＣＤＲ－Ｈ１については配列番号４に示される配列、ＣＤＲ－Ｈ２については配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ－Ｈ３については配列番号６に示される配列を含み、
Ｖ_１は、ＣＤＲ－Ｌ１については配列番号３９に示される配列、ＣＤＲ－Ｌ２については配列番号４０に示される配列、及びＣＤＲ－Ｌ３については配列番号４１に示される配列を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＲ－Ｈ１については配列番号４２に示される配列、ＣＤＲ－Ｈ２については配列番号４３に示される配列、及びＣＤＲ－Ｈ３については配列番号４４に示される配列を含む重鎖可変領域とを含み、
Ｖ_２は、ＣＤＲ－Ｌ１については配列番号１５に示される配列、ＣＤＲ－Ｌ２については配列番号１６に示される配列、及びＣＤＲ－Ｌ３については配列番号１７に示される配列を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＲ－Ｈ１については配列番号１８に示される配列、ＣＤＲ－Ｈ２については配列番号１９に示される配列、及びＣＤＲ－Ｈ３については配列番号２０に示される配列を含む重鎖可変領域とを含む、
請求項６に記載の多重特異性抗体。

【請求項8】

Ｖ_Ｌが、配列番号７に示される配列を含み、Ｖ_Ｈが配列番号９に示される配列を含む、請求項６又は請求項７に記載の多重特異性抗体。

【請求項9】

Ｖ_２が、配列番号２７に示される配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号２８に示される配列を含む重鎖可変領域とを含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項10】

Ｖ_２が、配列番号３１に示される配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号３２に示される配列を含む重鎖可変領域とを含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項11】

Ｖ_１が、配列番号４５に示される配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号４６に示される配列を含む重鎖可変領域とを含む、請求項６から１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項12】

Ｖ_１が、配列番号４９に示される配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号５０に示される配列を含む重鎖可変領域とを含む、請求項６から１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項13】

Ｖ_２の前記軽鎖可変領域及び前記重鎖可変領域がリンカーによって連結されており、前記リンカーが配列番号６６に示される配列を含む、請求項６から１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項14】

Ｖ_２が、配列番号３５に示される配列を含むｓｃＦｖ、又は配列番号３７に示される配列を含むｄｓｓｃＦｖである、請求項１３に記載の多重特異性抗体。

【請求項15】

Ｖ_１の前記軽鎖可変領域及び前記重鎖可変領域がリンカーによって連結されており、前記リンカーが配列番号６８に示される配列を含む、請求項６から１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項16】

Ｖ_１が、配列番号５３に示される配列を含むｓｃＦｖ、又は配列番号５５に示される配列を含むｄｓｓｃＦｖである、請求項１５に記載の多重特異性抗体。

【請求項17】

Ｙが、配列番号６５に示される配列を含むリンカーである、請求項６から１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項18】

Ｘが、配列番号６７に示される配列を含むリンカーである、請求項６から１７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項19】

配列番号５７又は配列番号５９に示される配列を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項20】

配列番号６１又は配列番号６３に示される配列を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項21】

配列番号５９に示される配列及び配列番号６３に示される配列を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項22】

請求項１から２１のいずれか一項で定義される多重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項23】

請求項２２に記載のポリヌクレオチドを担持する発現ベクター。

【請求項24】

請求項２３で定義されるベクターを含む宿主細胞。

【請求項25】

請求項２４に記載の宿主細胞を、抗体の産生が可能な条件下で培養すること、及び産生された前記抗体を回収することを含む、請求項１から２１のいずれか一項で定義される多重特異性抗体を産生する方法。

【請求項26】

プロテインＡ精製工程を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

請求項１から２１のいずれか一項で定義される抗体と、薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体とを含む医薬組成物。

【請求項28】

治療によるヒト又は動物の身体の治療方法における使用のための、請求項１から２１のいずれか一項で定義される抗体又は請求項２７で定義される医薬組成物。

【請求項29】

アトピー性皮膚炎、慢性手湿疹、鼻マイクロポリポーシス若しくはポリポーシス、食物アレルギー、又は好酸球性食道炎の治療又は予防における使用のための、請求項２８に記載の抗体又は医薬組成物。

【請求項30】

治療有効量の請求項１から２１に記載の多重特異性抗体又は請求項２７に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、アトピー性皮膚炎、慢性手湿疹、鼻マイクロポリポーシス若しくはポリポーシス、食物アレルギー、又は好酸球性食道炎を治療又は予防する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトＩＬ－１３、ヒトＩＬ－１７Ａ及び／又はＩＬ－１７Ｆに対する特異性を有する多重特異性抗体に関する。本発明は更に、多重特異性抗体を製造する方法、並びにアトピー性皮膚炎及び他の疾患を治療するためのその治療的使用に関する。

【背景技術】

【0002】

アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、アトピー性湿疹としても知られており、強いかゆみ、発赤、腫脹、滲出、ひび割れた皮膚をもたらし、時間の経過と共に皮膚が厚くなることが多い炎症性疾患である。

【0003】

２０世紀の初め以来、多くの粘膜炎症性障害がより一般的になってきており、アトピー性皮膚炎は、このような疾患の古典的な例である。現在、先進国及び米国では、小児の１５～３０％及び成人の２～１０％が罹患しており、過去３０～４０年でほぼ３倍になっている。１５００万人を超える米国の成人及び小児がアトピー性皮膚炎に罹患している。

【0004】

ＡＤに使用される処置には、シクロスポリン、メトトレキサート、インターフェロンガンマ、ミコフェノラート、モフェチル及びアザチオプリンなどの全身免疫抑制剤が含まれる。抗うつ薬及びナルトレキソンを使用して、掻痒（かゆみ）を制御することができる。２０１６年に、ホスホジエステラーゼ－４阻害剤であるクリサボロールが軽度から中等度の湿疹について承認され、２０１７年に、ＩＬ－４Ｒαのモノクローナル抗体アンタゴニストであるデュピルマブが中等度から重度の湿疹を治療することについて承認された。

【0005】

既存の医薬品の制限のために、アトピー性皮膚炎の改善された治療が大いに必要とされている。

【0006】

国際公開第２０１３／１０２０４２号（Ａｂｂｖｉｅ）は、ＩＬ－１３及びＩＬ－１７に対する二重特異的結合タンパク質、並びに広範な疾患リストの治療におけるそれらの潜在的な使用を記載している。結合タンパク質は臨床開発に進まなかった。

【0007】

国際公開第２０１５／１２７４０５号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、抗ＩＬ－１３／ＩＬ－１７二重特異性抗体、並びに中等度から重度の喘息及び／又は好酸球性喘息を治療するためにそれらを使用する方法を記載している。第Ｉ相臨床試験では、ＢＩＴＳ７２０１Ａは、高い発生率の抗薬物抗体（ＡＤＡ）に関連しており、臨床開発から撤退した。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、ヒトＩＬ－１３、ヒトＩＬ－１７Ａ及び／又はヒトＩＬ－１７Ｆに結合することができる改善された多重特異性抗体を提供する。

【0009】

本発明の抗体は、現在利用可能な抗体と比較して改善された特性、例えばより低い免疫原性及び／又はより良好な薬物動態学的プロファイルを有する。加えて、本発明の抗体は、それらが、現在利用可能な方法よりも少ない工程を含む改善された精製方法を使用してより効率的に精製することができるように操作することができ、これは、工業的規模で費用効果及び時間効果がある。したがって、本発明の抗体は、改善された製造可能性を有することができる。

【0010】

本発明は、以下を更に提供する。
◆多重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
◆ポリヌクレオチドを担持する発現ベクター。
◆ベクターを含む宿主細胞。
◆宿主細胞を培養し、産生された抗体を回収することを含む、多重特異性抗体を産生する方法。
◆前述の多重特異性抗体を含む医薬組成物。
◆治療によるヒト又は動物の身体の治療方法における使用のための多重特異性抗体又は医薬組成物。
◆治療有効量の多重特異性抗体又は医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、アトピー性皮膚炎、慢性手湿疹、鼻マイクロポリポーシス若しくはポリポーシス、食物アレルギー、又は好酸球性食道炎を治療又は予防する方法。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】Ａｂ６５０ヒト化アラインメント。 設計されたヒト化配列と共に、ラット抗体（ドナー）Ｖ領域配列とヒト生殖細胞系（アクセプター）Ｖ領域配列とのアラインメント。 （Ａ）軽鎖移植片６５０： ６５０＝ラットの可変軽鎖配列。 ６５０ｇＬ８＝アクセプターフレームワークとしてＩＧＫＶ１－３９ヒト生殖細胞系を使用した６５０可変軽鎖のヒト化移植片。 ＣＤＲを太字／下線で示す。 ドナー残基を太字／斜体で示し、Ｉ５８及びＹ７１を強調する。 （Ｂ）重鎖移植片６５０： ６５０＝ラット可変重鎖配列。 ６５０ｇＨ９＝アクセプターフレームワークとしてＩＧＨＶ１－６９ヒト生殖細胞系を使用した６５０可変重鎖のヒト化移植片。 ＣＤＲを太字／下線で示す。 ドナー残基を太字／斜体で示し、Ａ６７、Ｆ６９及びＶ７１を強調する。

【図2】アミノ酸配列及びＤＮＡ配列。

【図3】ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体の精製。 （Ａ）精製した多重特異性抗体のＢＥＨ２００ ＳＥＣ－ＵＰＬＣ分析、ＦＬＲによる検出。 （Ｂ）非還元（レーン１）又は還元（レーン２）条件下でトリス－グリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離したタンパク質試料。ゲルをクマシークイック染色で染色し、ｄＨ２Ｏで脱色した。Ｍａｒｋ１２タンパク質マーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を標準（Ｍ）として使用した。分子量（ＭＷ）はキロダルトン（ｋＤａ）で測定した。

【図4】ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体によるＳＴＡＴ６シグナル伝達の阻害。

【図5】（Ａ）ＴＮＦ－αと組み合わせたヒト又はカニクイザルＩＬ－１７Ａに応答したＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体によるＩＬ－６産生の阻害。（ｉ）ヒトＩＬ－１７Ａ。（ｉｉ）カニクイザルＩＬ－１７Ａ。 （Ｂ）ＴＮＦ－αと組み合わせたヒト又はカニクイザルＩＬ－１７Ｆに応答したＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体によるＩＬ－６産生の阻害。（ｉ）ヒトＩＬ－１７Ｆ。（ｉｉ）カニクイザルＩＬ－１７Ｆ。

【図6】ＮＨＥＫ ＣＸＣＬ１放出バイオアッセイにおけるＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体によるＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆの同時中和。 キー： 丸＝抗ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ 正方形＝抗ＩＬ－１７Ａ 上向き三角形＝抗ＩＬ－１７Ｆ 下向き三角形＝抗ＩＬ－１３

【図7】本発明による多重特異性ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ抗体の概略図。

【発明を実施するための形態】

【0012】

ＩＬ－１３
ＩＬ－１３は、ＩＬ－４と２５％の配列同一性を共有する短鎖サイトカインである。これは、残基３３～３６及び８７～９０にわたる２つのβ鎖と共に、残基１０～２１（ヘリックスＡ）、４３～５２（ヘリックスＢ）、６１～６９（ヘリックスＣ）及び９２～１１０（ヘリックスＤ）にわたる４つのヘリックスの二次構造を形成する約１３２個のアミノ酸を含む。ＩＬ－１３の溶液構造が解明され、ＩＬ－４でも観察される、アップ－アップ－ダウン－ダウン４ヘリックスバンドルコンフォメーションが明らかになった。（Ｅｉｓｅｎｍｅｓｓｅｒ ２００１）。

【0013】

ヒトＩＬ－１３は１７ｋＤａの糖タンパク質であり、Ｔｈ２系統の活性化Ｔ細胞によって産生されるが、Ｔｈ０及びＴｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、並びにマスト細胞などのいくつかの非Ｔ細胞集団もＩＬ－１３を産生する。ＩＬ－１３の機能としては、ヒトＢ細胞におけるＩｇＥへの免疫グロブリンアイソタイプスイッチング、並びにヒト及びマウスの両方における炎症性サイトカイン産生の抑制が挙げられる。

【0014】

ＩＬ－１３は、その細胞表面受容体であるＩＬ－１３Ｒ－アルファ１及びＩＬ－１３Ｒ－アルファ２に結合する。ＩＬ－１３Ｒ－α１は、低親和性（Ｋ_Ｄ約１０ｎＭ）でＩＬ－１３と相互作用し、続いてＩＬ－４Ｒ－αを動員して高親和性（Ｋ_Ｄ約０．４ｎＭ）シグナル伝達ヘテロ二量体受容体複合体を形成する。

【0015】

ＩＬ－４Ｒ／ＩＬ－１３Ｒ－アルファ１複合体は、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好塩基球、線維芽細胞、内皮細胞、気道上皮細胞、及び気道平滑筋細胞などの多くの細胞型で発現される。ＩＬ－１３Ｒ－アルファ／ＩＬ－４Ｒ受容体複合体のライゲーションは、シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）及びインスリン受容体基質２（ＩＲＳ２）経路を含む様々なシグナル伝達経路の活性化をもたらす。

【0016】

ＩＬ－１３Ｒ－アルファ２鎖のみがＩＬ－１３に対して親和性が高い（Ｋ_Ｄ約０．２５～０．４ｎＭ）。それは、ＩＬ－１３結合を負に調節するデコイ受容体として、並びにマクロファージ及びおそらくは他の細胞型においてＡＰ－１経路を介してＴＧＦ－β合成及び線維化を誘導するシグナル伝達受容体としての両方として機能する。

【0017】

ＩＬ－１３は多くのヒト障害の病因に関与しており、ＩＬ－１３活性を阻害又は打ち消すように治療戦略が設計されている。特に、ＩＬ－１３活性を阻害する手段として、ＩＬ－１３に結合してＩＬ－１３を中和する抗体が求められている。しかし、当該分野では、ＩＬ－１３、特にヒトＩＬ－１３に結合することができる好適な抗体及び／又は改善された抗体、特にヒトＩＬ－１３を中和することができる抗体が必要とされている。

【0018】

本発明は、ヒトＩＬ－１３に結合し、高親和性で結合し、ヒトＩＬ－１３に結合して中和することができる、結合タンパク質、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体及びそれらの断片の新規なファミリーを提供する。

【0019】

ＩＬ－１３活性を阻害する抗体は、いくつかの可能な作用機序を介して作用することができる。Ｂｉｎ１は、ヒトＩＬ－１３に結合し、ＩＬ－１３Ｒα１の結合を防止し、その結果、ＩＬ－４Ｒの結合もブロックする抗体を表す。Ｂｉｎ１抗体はまた、ＩＬ－１３のＩＬ－１３Ｒα２への結合を阻害することができる。Ｂｉｎ２は、ＩＬ－１３Ｒα１への結合を可能にするが複合体へのＩＬ－４Ｒの動員を阻害するようにｈＩＬ－１３に結合する抗体を表す。本発明者らは、Ｂｉｎ１を介して作用する抗体を選択していた。

【0020】

一実施形態では、多重特異性抗体はヒトＩＬ－１３に結合し、ＩＬ－１３Ｒα１の結合を阻害する。

【0021】

一実施形態では、多重特異性抗体はヒトＩＬ－１３に結合し、ＩＬ－１３Ｒα２の結合を阻害する。

【0022】

一実施形態では、多重特異性抗体はヒトＩＬ－１３に結合し、ＩＬ－１３Ｒα１及びＩＬ－１３Ｒα２の結合を阻害する。

【0023】

一実施形態では、多重特異性抗体は、１００ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１３に結合する。

【0024】

ＩＬ－１７
サイトカインのＩＬ－１７ファミリーは、２３～３６ｋＤａの分子質量及び二量体構造を有する、構造類似性に基づく６つのメンバーからなる。初代メンバーであるＩＬ－１７Ａ（文献では依然として単にＩＬ－１７と呼ばれることが多い）は、他のメンバーであるＩＬ－１７Ｂ、ＩＬ－１７Ｃ、ＩＬ－１７Ｄ、ＩＬ－１７Ｅ（ＩＬ－２５としても知られる）及びＩＬ－１７Ｆと１６％～５０％のアミノ酸配列同一性を共有する。ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆは、最大の相同性（５０％）を共有し、同じ受容体複合体に結合し、したがって、共有された生物学的活性が、これらの２つのサイトカインの間で認められている。加えて、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆは、ホモ二量体としてだけでなく、ＩＬ－１７Ａ／Ｆヘテロ二量体としても存在する。ＩＬ－１７Ｅ（ＩＬ－２５）は、ＩＬ－１７Ａとの類似性が最も低い。ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆの生物学的活性にとって重要かつ関連性があるのは、それらが同じＩＬ－１７ＲＡ／ＩＬ－１７ＲＣ受容体複合体を共有しており、ＩＬ－１７ＡがＩＬ－１７ＲＡに対して最も大きい親和性を有するのに対して、ＩＬ－１７ＦはＩＬ－１７ＲＣにより強く結合するという知見である。ＩＬ－１７ＲＡを利用する他のファミリーメンバーは、ＩＬ－１７ＲＡ／ＩＬ－１７ＲＢ受容体複合体を介してシグナル伝達するＩＬ－１７Ｅである。

【0025】

ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１７サブセットによって産生される。加えて、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｔｃ１７）、ｇｄＴ細胞及びＮＫ Ｔ細胞を含む他のＴ細胞サブセットは、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆを産生する。ＩＬ－１７Ａを分泌すると報告されている他の細胞集団としては、好中球、単球、ＮＫ細胞、リンパ系組織誘導因子様（ＬＴｉ様）細胞、腸パネート細胞、更にＢ細胞及び肥満細胞が挙げられる。加えて、上皮細胞はＩＬ－１７Ｆを分泌することが報告されている。

【0026】

ＩＬ－１７サイトカインに応答する細胞型は、異なる受容体の発現によって反映される。ＩＬ－１７ＲＡは、造血組織において特に高レベルで遍在的に発現されるのに対して、ＩＬ－１７ＲＣは、関節、肝臓、腎臓、甲状腺及び前立腺の非免疫細胞においてより高度に発現される。高レベルのＩＬ－１７ＲＣを発現する細胞はＩＬ－１７Ｆに対してより応答性であり得るが、ＩＬ－１７ＲＣよりもＩＬ－１７ＲＡの発現が高い細胞はＩＬ－１７Ａに対してより容易に応答し得るので、この差次的発現は、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆの生物学的活性の差を説明することができる。ＩＬ－１７Ａ及びＦに応答性である特定の細胞型としては、線維芽細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、滑膜細胞及び内皮細胞が挙げられ、ＩＬ－１７Ａはまた、Ｔ細胞及びＢ細胞並びにマクロファージに作用することが報告されている。

【0027】

本発明の多重特異性抗体は、ヒトＩＬ－１７Ａ及び／又はＩＬ－１７Ｆに結合することができる。したがって、抗体は、ＩＬ－１７Ａホモ二量体、ＩＬ－１７Ｆホモ二量体及び／又はＩＬ－１７ＡＦヘテロ二量体に結合することができる。

【0028】

一実施形態では、多重特異性抗体はヒトＩＬ－１７Ａに結合する。一実施形態では、多重特異性抗体はヒトＩＬ－１７Ｆに結合する。一実施形態では、多重特異性抗体はヒトＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆに結合する。

【0029】

一実施形態では、多重特異性抗体は、５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１７Ａに結合する。一実施形態では、多重特異性抗体は、２５ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１７Ａに結合する。一実施形態では、多重特異性抗体は、１０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１７Ａに結合する。

【0030】

一実施形態では、多重特異性抗体は、２００ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１７Ｆに結合する。一実施形態では、多重特異性抗体は、１００ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１７Ｆに結合する。

【0031】

アルブミン
抗体の高い特異性及び親和性は、抗体を、特にタンパク質：タンパク質相互作用を調節するための理想的な診断薬及び治療薬にする。しかし、抗体は、特にインビボで長い寿命を付与するＦｃドメインを欠く場合、血清からのクリアランス速度の増加に悩まされることがある（Ｍｅｄａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２２１１－２２１７）。

【0032】

抗体の半減期を改善する手段は公知である。１つのアプローチは、断片をポリマー分子にコンジュゲートすることであった。したがって、動物におけるＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２断片の短い循環半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えば、国際公開第９８／２５７９１号、国際公開第９９／６４４６０号及び国際公開第９８／３７２００号を参照されたい）への結合によって改善されている。別のアプローチは、ＦｃＲｎ受容体と相互作用する薬剤へのコンジュゲーションによって抗体断片を修飾することであった（例えば、国際公開第９７／３４６３１号を参照されたい）。半減期を延長するための更に別のアプローチは、血清アルブミンに結合するポリペプチドを使用することであった（例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１２：７５０－７５６、欧州特許第０４８６５２５号、米国特許第６２６７９６４号、国際公開第０４／００１０６４号、国際公開第０２／０７６４８９号、及び国際公開第０１／４５７４６号）。

【0033】

血清アルブミンは、血管コンパートメントと血管外コンパートメントの両方に豊富に存在するタンパク質であり、ヒトでの半減期は約１９日である（Ｐｅｔｅｒｓ，１９８５，Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３７：１６１－２４５）。これは、約２１日であるＩｇＧ１の半減期に類似している（Ｗａｌｄｅｍａｎ＆Ｓｔｒｏｂｅｒ，１９６９，Ｐｒｏｇｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ，１３：１－１１０）。

【0034】

抗血清アルブミン結合単一可変ドメインは、ＮＣＥ（化学的実体）薬物、プロテイン及びペプチドを含む薬物の半減期を増加させるためのコンジュゲートとしてのそれらの使用と共に記載されており、例えば、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｖｏｌ ２１，５，ｐｐ２８３－２８８、国際公開第０４００３０１９号、国際公開第２００８／０９６１５８号、国際公開第０５１１８６４２号、国際公開第２００６／０５９１０５６号及び、国際公開第２０１１／００６９１５号を参照されたい。他の抗血清アルブミン抗体及び多重特異性抗体フォーマットにおけるそれらの使用は、国際公開第２００９／０４０５６２号、国際公開第２０１０／０３５０１２号及び国際公開第２０１１／０８６０９１号に記載されている。特に、本発明者らは、改善されたヒト化を有する抗アルブミン抗体を国際公開第２０１３／０６８５７１号に以前に記載している。

【0035】

本発明の多重特異性抗体は、それらのインビボ血清半減期を延長し、改善された薬物動態プロファイルをもたらすために、ヒト血清アルブミンに結合するように操作することができる。

【0036】

抗体
本開示の文脈で使用するための抗体は、全抗体及びその機能的に活性な断片、すなわち、抗原結合断片とも呼ばれる、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ及び／又はＩＬ－１７Ｆに特異的に結合する分子を含む。抗体に関して本明細書に記載される特徴は、文脈が特に指示しない限り、抗体断片にも適用される。

【0037】

「免疫グロブリン（Ｉｇ）」としても公知の全抗体は、一般に、インタクト又は全長抗体、すなわち、特徴的なＹ字形三次元構造を規定するように集合する、ジスルフィド結合によって相互に連結された２つの重鎖及び２つの軽鎖の要素を含む抗体に関する。古典的な天然全抗体は、１つの抗原タイプに結合するという点で単一特異性であり、２つの独立した抗原結合ドメインを有するという点で二価である。「インタクト抗体」、「全長抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書で定義されるＦｃ領域を含む、ネイティブ抗体構造に類似した構造を有する単一特異性二価抗体を指すために互換的に使用される。

【0038】

各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略す）及び軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）で構成される。各重鎖は、Ｉｇクラスに応じて、重鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｈと略す）と、３つの定常ドメインＣＨ_１、ＣＨ_２及びＣＨ_３、又は４つの定常ドメインＣＨ_１、ＣＨ_２、ＣＨ_３及びＣＨ_４で構成される重鎖定常領域（ＣＨ）とで構成される。Ｉｇ又は抗体の「クラス」は、定常領域のタイプを指し、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含み、それらのいくつかはサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に更に分割することができる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

【0039】

本発明による抗体のＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより構造的に保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、抗原の認識を決定する超可変性の領域（又は「超可変領域」）に更に細分することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。ＣＤＲ及びＦＲは共に可変領域を形成する。慣例により、抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域内のＣＤＲはＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３と呼ばれ、軽鎖可変領域内のＣＤＲはＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と呼ばれる。それらは、各鎖のＮ末端からＣ末端の方向に連続して番号付けされる。

【0040】

ＣＤＲは、従来、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従ってナンバリングされる。このシステムは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ（以下「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（前出）」）に記載されている。このナンバリングシステムは、別段の指示がない限り、本明細書で使用される。

【0041】

Ｋａｂａｔ残基の名称は、アミノ酸残基の直鎖状ナンバリングと必ずしも直接対応しない。実際の直鎖状アミノ酸配列は、フレームワーク又は相補性決定領域にかかわらず、基本可変ドメイン構造の構造成分の短縮又は挿入に対応する、厳密なＫａｂａｔナンバリングよりも少ない又は追加のアミノ酸を含むことができる。残基の正しいＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列における相同性の残基と「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリング配列とのアラインメントによって、所与の抗体について決定することができる。

【0042】

重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基３１～３５（ＣＤＲ－Ｈ１）、残基５０～６５（ＣＤＲ－Ｈ２）及び残基９５～１０２（ＣＤＲ－Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１－９１７（１９８７））によれば、ＣＤＲ－Ｈ１と等価なループは、残基２６から残基３２まで延びる。したがって、特に指示しない限り、本明細書で使用される「ＣＤＲ－Ｈ１」は、ＫａｂａｔナンバリングシステムとＣｈｏｔｈｉａのトポロジカルループ定義との組み合わせによって記載される残基２６から３５を指すことが意図される。

【0043】

軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基２４～３４（ＣＤＲ－Ｌ１）、残基５０～５６（ＣＤＲ－Ｌ２）及び残基８９～９７（ＣＤＲ－Ｌ３）に位置する。

【0044】

ＣＤＲループに加えて、第４のループが、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２又はＣＤＲ－Ｈ２）と、フレームワーク３（ＦＲ３）によって形成されるＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３又はＣＤＲ－Ｈ３）との間に存在する。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、フレームワーク３を重鎖の位置６６～９４及び軽鎖の位置５７～８８として定義する。

【0045】

免疫グロブリンファミリーの異なるメンバーの配列のアラインメントに基づいて、ナンバリングスキームが提案されており、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１、及びＤｏｎｄｅｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ９，ａｒｔｉｃｌｅ ２２７８に記載されている。

【0046】

本明細書で使用される「定常ドメイン」、「定常領域」という用語は、可変領域の外側にある抗体のドメインを指すために交換可能に使用される。定常ドメインは、同じアイソタイプの全ての抗体において同一であるが、アイソタイプごとに異なる。典型的には、重鎖の定常領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、３つ又は４つの定常ドメインを含むＣＨ_１－ヒンジ－ＣＨ_２－ＣＨ_３、場合によりＣＨ_４によって形成される。

【0047】

本発明の抗体分子の定常ドメインは、存在する場合、抗体分子の提案された機能、特に必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択することができる。例えば、定常ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。特に、抗体分子が治療用途を意図し、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、ヒトＩｇＧ定常ドメイン、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプを使用することができる。或いは、抗体分子が治療目的を意図しており、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。これらの定常ドメインの配列変異体も使用することができることが理解されるであろう。例えば、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ（ＩｇＧ４）ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｕｒｉｎｇ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０，１０５－１０８）に記載されているように（Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って番号付けされた）２４１位のセリンがプロリンに変更されており、本明細書でＩｇＧ４Ｐと呼ばれるＩｇＧ４分子を使用することができる。

【0048】

「Ｆｃ」、「Ｆｃ断片」、「Ｆｃドメイン」及び「Ｆｃ領域」は、第１の定常免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含む抗体のＣ末端領域を指すために互換的に使用される。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常ドメイン、ＣＨ_２及びＣＨ_３、又はＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常ドメイン、及びこれらのドメインに対する可撓性ヒンジＮ末端を指す。ヒトＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域は、本明細書において、残基Ｃ２２６からそのカルボキシル末端までを含むと定義され、ナンバリングはＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う。ヒトＩｇＧ１の文脈において、下側ヒンジは、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って、位置２２６～２３６を指し、ＣＨ_２ドメインは、位置２３７～３４０を指し、ＣＨ_３ドメインは、位置３４１～４４７を指す。他の免疫グロブリンの対応するＦｃ領域は、配列アラインメントによって同定することができる。

【0049】

本開示の文脈において、存在する場合、定常領域又はＦｃ領域は、上記で定義したように天然であってもよく、又は機能的ＦｃＲ結合ドメイン、好ましくは機能的ＦｃＲｎ結合ドメインを含む限り、様々な方法で修飾することができる。好ましくは、修飾された定常領域又はＦｃ領域は、機能性及び／又は薬物動態を改善する。修飾は、Ｆｃ断片の特定の部分の欠失を含むことができる。修飾は、抗体の生物学的特性に影響を及ぼすことができる様々なアミノ酸置換を更に含むことができる。ＦｃＲｎ結合、したがってインビボ半減期を増加させるための変異も存在することができる。修飾は、抗体のグリコシル化プロファイルの修飾を更に含むことができる。天然Ｆｃ断片は、ＣＨ_２ドメインにおいてグリコシル化されており、２つの重鎖のそれぞれに、２９７位のアスパラギン残基（Ａｓｎ２９７）に結合したＮ－グリカンが存在する。本開示の文脈において、抗体は、例えば、改善された特性、例えば改善されたエフェクター機能、又は改善された血清半減期をもたらす特定のグリコシル化プロファイルを有するように糖修飾、すなわち操作することができる。

【0050】

本明細書に記載の抗体を単離する。「単離」抗体は、その自然環境の成分から分離（例えば、精製手段によって）された抗体である。

【0051】

「抗体」という用語は、一価、すなわち、１つの抗原結合ドメインのみを含む抗体（例えば、「半抗体」とも呼ばれる、相互接続された完全長重鎖及び完全長軽鎖を含む１アーム抗体）、及び多価抗体、すなわち、２つ以上の抗原結合ドメインを含む抗体を包含する。

【0052】

本発明による「抗体」という用語はまた、抗体の抗原結合断片を包含する。抗体の抗原結合断片としては、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ及びｄｓｓｃｆｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体又はナノボディ（例えば、Ｖ_Ｈ若しくはＶ_Ｌ、又はＶ_ＨＨ若しくはＶ_ＮＡＲ）が挙げられる。本発明で使用するための他の抗体断片としては、国際公開第２０１１／１１７６４８号、国際公開第２００５／００３１６９号、国際公開第２００５／００３１７０号及び国際公開第２００５／００３１７１号に記載されているＦａｂ及びＦａｂ’断片が挙げられる。

【0053】

これらの抗体断片を生成及び製造する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５－１８１を参照されたい）。

【0054】

本明細書で使用される「Ｆａｂ断片」という用語は、Ｖ_Ｌ（可変軽鎖）ドメイン及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片、並びにＶ_Ｈ（可変重鎖）ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ_１）を含む抗体断片を指す。

【0055】

典型的な「Ｆａｂ’断片」は、重鎖と軽鎖の対を含み、重鎖は可変領域Ｖ_Ｈ、定常ドメインＣＨ_１及び天然又は修飾ヒンジ領域を含み、軽鎖は可変領域Ｖ_Ｌ及び定常ドメインＣＬを含む。本開示によるＦａｂ’の二量体はＦ（ａｂ’）_２を生成し、例えば、二量体化はヒンジを介することができる。

【0056】

本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」という用語は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。単一ドメイン抗体の例としては、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ又はＶ_ＨＨ又はＶ－ＮＡＲが挙げられる。

【0057】

「Ｆｖ」という用語は、２つの可変ドメイン、例えば同族対又は親和性成熟可変ドメイン、すなわちＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ対などの協同可変ドメインを指す。

【0058】

本明細書で使用される「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と、Ｖ_Ｈ可変ドメインとＶ_Ｌ可変ドメインとの間のペプチドリンカーによって安定化された軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）とを含むか、又はそれらからなる一本鎖可変断片を指す。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ可変ドメインは、任意の適切な配向であってもよく、例えば、Ｖ_ＨのＣ末端はＶ_ＬのＮ末端に連結されてもよく、又はＶ_ＬのＣ末端はＶ_ＨのＮ末端に連結されてもよい。

【0059】

本明細書で使用される「ジスルフィド安定化一本鎖可変断片」又は「ｄｓｓｃＦｖ」は、Ｖ_Ｈ可変ドメインとＶ_Ｌ可変ドメインとの間のペプチドリンカーによって安定化され、Ｖ_ＨとＶ_Ｌとの間のドメイン間ジスルフィド結合も含む一本鎖可変断片を指す（例えば、Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５（３２１－３２９），２０１２、国際公開第２００７１０９２５４号を参照されたい）。

【0060】

本明細書で使用される「ジスルフィド安定化可変断片」又は「ｄｓＦｖ」は、Ｖ_Ｈ可変ドメインとＶ_Ｌ可変ドメインとの間にペプチドリンカーを含まず、代わりにＶ_ＨとＶ_Ｌとの間のドメイン間ジスルフィド結合によって安定化される一本鎖可変断片を指す。

【0061】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体はアンタゴニスト抗体である。本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト抗体」という用語は、例えばＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ及び／又はＩＬ－１７Ｆの受容体への結合をブロックするか、又は結合を減少させることによって、１つ又は複数の抗原の生物学的シグナル伝達活性を阻害又は中和することができる抗体を表す。

【0062】

本発明で使用するための抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体又はキメラ抗体であってもよいが、これらに限定されない。

【0063】

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ７７－９６，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）などの当技術分野で公知の任意の方法によって調製することができる。

【0064】

抗体はまた、例えばＢａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３－７８４８ｌ、国際公開第９２／０２５５１号、国際公開第２００４／０５１２６８号及び国際特許出願第２００４／１０６３７７号に記載される方法によって特定の抗体を産生するために選択した単一リンパ球から生成した免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし発現させることにより、単一リンパ球抗体法を用いて生成することができる。

【0065】

抗体のスクリーニングは、抗原への結合を測定するアッセイ、及び／又は抗原の１つ又は複数の受容体への結合をブロックする能力を測定するアッセイを使用して行うことができる。結合アッセイの例は、例えば、プレート上に固定化されたＩＬ－１３の融合タンパク質を使用し、ＩＬ－１３に結合した抗ＩＬ－１３抗体を検出するために結合した二次抗体を使用するＥＬＩＳＡである。ブロッキングアッセイの例は、ＩＬ－１３Ｒに結合するＩＬ－１３リガンドタンパク質のブロッキングを測定するフローサイトメトリーに基づくアッセイである。蛍光標識二次抗体を使用して、ＩＬ－１３Ｒに結合するＩＬ－１３リガンドタンパク質の量を検出する。

【0066】

ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体を含む）は、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、国際公開第９１／０９９６７号を参照されたい）。ＣＤＲ全体ではなくＣＤＲの特異性決定残基を移入するだけでよいことが理解されよう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５－３４を参照されたい）。ヒト化抗体は、場合により、ＣＤＲが由来する非ヒト種に由来する１つ又は複数のフレームワーク残基を更に含むことができる。

【0067】

キメラ抗体は、要素が、それが由来する種の特徴を保持するように、２つの異なる種に由来する要素から構成される。一般に、キメラ抗体は、例えばマウス、ラット、ウサギなどのある種の可変領域と、ヒトなどの別の種の定常領域を含む。

【0068】

抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて生成することができ、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２：４１－５０）、ＡｍｅｓらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４：１７７－１８６）、（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：９５２－９５８）、Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ，１９９７ １８７ ９－１８）、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７：１９１－２８０）並びに国際公開第９０／０２８０９号、国際公開第９１／１０７３７号、国際公開第９２／０１０４７号、国際公開第９２／１８６１９号、国際公開第９３／１１２３６号、国際公開第９５／１５９８２号、国際公開第９５／２０４０１号、並びに米国特許第５，６９８，４２６号、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５，７５０，７５３号、米国特許第５，８２１，０４７号、米国特許第５，５７１，６９８号、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５，５１６，６３７号、米国特許第５，７８０，２２５号、米国特許第５，６５８，７２７号、米国特許第５，７３３，７４３号及び米国特許第５，９６９，１０８号によって開示されたものを含む。

【0069】

完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が全てヒト起源であるか、又はヒト起源の配列と実質的に同一であるが、必ずしも同じ抗体由来ではない抗体である。完全ヒト抗体の例としては、例えば上記のファージディスプレイ法によって産生される抗体、及び例えば欧州特許第０５４６０７３号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、欧州特許第０４３８４７４号及び欧州特許第０４６３１５１号に一般的な用語で記載されているように、マウス免疫グロブリン可変遺伝子及び場合により定常領域遺伝子がそれらのヒト対応物によって置き換えられたマウスによって産生される抗体を挙げることができる。

【0070】

多重特異性抗体
本発明の抗体は多重特異性抗体である。本明細書で使用される「多重特異性（Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）又は多重特異性（Ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体」は、少なくとも２つの結合ドメイン、すなわち２つ以上の結合ドメイン、例えば２つ又は３つの結合ドメインを有する本明細書に記載される抗体を指し、少なくとも２つの結合ドメインは、同じ抗原上の２つの異なる抗原又は２つの異なるエピトープに独立して結合する。多重特異性抗体は、一般に、各特異性（抗原）に対して一価である。本明細書に記載の多重特異性抗体は、一価及び多価、例えば二価、三価、四価の多重特異性抗体を包含する。

【0071】

パラトープは、抗原を認識して結合する抗体の領域である。本発明の抗体は、マルチパラトピック抗体であってもよい。本明細書で使用される「マルチパラトピック抗体」は、同じ抗原又は２つの異なる抗原のいずれかからの異なるエピトープと相互作用する２つ以上の異なるパラトープを含む本明細書に記載の抗体を指す。本明細書中に記載されるマルチパラトピック抗体は、バイパラトピック、トリパラトピック、テトラパラトピックであってもよい。

【0072】

本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」は、標的抗原と特異的に相互作用する１つ又は複数の可変ドメインの一部又は全部、例えば一対の可変ドメインＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの一部又は全部を含む抗体の一部を指す。結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含むことができる。一実施形態では、各結合ドメインは一価である。好ましくは、各結合ドメインは、１つ以下のＶＨ及び１つのＶ_Ｌを含む。

【0073】

本明細書で使用される「特異的に」は、特異的である抗原のみを認識する結合ドメイン、又は非特異的である抗原に対する親和性と比較して、特異的である抗原に対して有意に高い結合親和性を有する結合ドメインを指す。結合親和性は、標準的なアッセイ、例えばＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴によって測定することができる。

【0074】

様々な多重特異性抗体フォーマットが生成されている。様々な分類が提案されているが、多重特異性ＩｇＧ抗体フォーマットとしては、一般に、例えばＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５－１０６に記載されているように、二重特異性ＩｇＧ、付加ＩｇＧ、多重特異性（例えば二重特異性）抗体断片、多重特異性（例えば二重特異性）融合タンパク質、及び多重特異性（例えば二重特異性）抗体コンジュゲートが挙げられる。

【0075】

二重特異性抗体を作製するための技術としては、ＣｒｏｓｓＭａｂ技術（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣｒｏｓｓＭａｂ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ １５４（２０１９）２１－３１）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（例えば、国際公開第１９９６０２７０１１号、国際公開第１９９８０５０４３１号）、ＤｕｏＢｏｄｙ技術（例えば、国際公開第２０１１１３１７４６号）、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ技術（例えば、国際公開第２０１２０５８７６８号）が挙げられるが、これらに限定されない。二重特異性抗体を作製するための更に技術が、例えば、Ｇｏｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｓ：ａ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｒｅｖｉｅｗ（１９９４－２０１７）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ，２８：３，２５１－２７６に記載されている。二重特異性抗体としては、特にＣｒｏｓｓＭａｂ抗体、ＤＡＦ（ツー・イン・ワン）、ＤＡＦ（フォー・イン・ワン）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ｌｇＧ、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ共通ＬＣ、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓアセンブリ、電荷対、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、トリオマブ、ＬＵＺ－Ｙ、Ｆｃａｂ、κλ－ｂｏｄｙ及び直交Ｆａｂが挙げられる。

【0076】

付加ＩｇＧは、古典的には、ＩｇＧの重鎖及び／又は軽鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に追加の抗原結合ドメイン又は抗原結合断片を付加することによって操作された全長ＩｇＧを含む。そのような追加の抗原結合断片の例としては、ｓｄＡｂ抗体（例えばＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｖが挙げられる。付加ＩｇＧ抗体フォーマットとしては、例えばＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５－１０６に記載されているように、特にＤＶＤ－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ｌｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ、Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ｌｇＧ、ＩｇＣ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ｌｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－ｌｇ、Ｚｙｂｏｄｙ及びＤＶＩ－ＩｇＧ（フォー・イン・ワン）が挙げられる。

【0077】

多重特異性抗体断片としては、例えばＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５－１０６に記載されているように、ナノボディ、ナノボディ－ＨＡＳ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃ二重特異性抗体、ｓｃ－二重特異性抗体－ＣＨ３、二重特異性抗体－ＣＨ３、トリプルボディ（Ｔｒｉｐｌｅ Ｂｏｄｙ）、ミニ抗体、ミニボディ、Ｔｒｉ Ｂｉミニボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦＶ３、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣａｂ、ｓｃ二重特異性抗体－Ｆｃ、二重特異性抗体－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、及びイントラボディが挙げられる。

【0078】

多重特異性融合タンパク質としては、Ｄｏｃｋ及びＬｏｃｋ、ＩｍｍＴＡＣ、ＨＳａｂｏｄｙ、ｓｃ二重特異性抗体－ＨＡＳ、及びタンデムｓｃＦｖ－トキシンが挙げられる。

【0079】

多重特異性抗体コンジュゲートとしては、ＩｇＧ－ｌｇＧ、Ｃｏｖ－Ｘ－ボディ、及びｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦｖ２が挙げられる。

【0080】

更に多重特異性抗体フォーマットは、例えばＢｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｍＡｂｓ，９：２，１８２－２１２（２０１７）、特に図２に、例えばタンデムｓｃＦｖ、三重特異性抗体、Ｆａｂ－ＶＨＨ、ｔａＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ_４－Ｉｇ、ｓｃＦｖ_２－Ｆｃａｂ、ｓｃＦｖ_４－ＩｇＧで記載されている。二重特異性抗体、三重特異性抗体及びそれらの産生方法は、例えば国際公開第９９／３７７９１号に開示されている。

【0081】

本発明は、ヒトＩＬ－１３、ヒトＩＬ－１７Ａ及び／又はヒトＩＬ－１７Ｆに結合する多重特異性抗体を提供する。

【0082】

一実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトＩＬ－１３に結合する抗原結合部位を含み、ＩＬ－１３結合部位は、ＣＤＲ－Ｌ１については配列番号１５に示される配列、ＣＤＲ－Ｌ２については配列番号１６に示される配列、及びＣＤＲ－Ｌ３については配列番号１７に示される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0083】

一実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトＩＬ－１３に結合する抗原結合部位を含み、ＩＬ－１３結合部位は、ＣＤＲ－Ｈ１については配列番号１８に示される配列、ＣＤＲ－Ｈ２については配列番号１９に示される配列、及びＣＤＲ－Ｈ３については配列番号２０に示される配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0084】

一実施形態では、ＩＬ－１３結合部位は、配列番号２７に示される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0085】

一実施形態では、ＩＬ－１３結合部位は、配列番号２８に示される配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0086】

一実施形態では、ＩＬ－１３結合部位は、配列番号３１に示される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0087】

一実施形態では、ＩＬ－１３結合部位は、配列番号３２に示される配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0088】

一態様では、多重特異性抗体は、ヒトＩＬ－１７Ａ及びヒトＩＬ－１７Ｆに結合する抗原結合部位を含み、抗原結合部位は、
ＣＤＲ－Ｌ１については配列番号１に示される配列、ＣＤＲ－Ｌ２については配列番号２に示される配列、及びＣＤＲ－Ｌ３については配列番号３に示される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0089】

一態様では、多重特異性抗体は、ヒトＩＬ－１７Ａ及びヒトＩＬ－１７Ｆに結合する抗原結合部位を含み、抗原結合部位は、
ＣＤＲ－Ｈ１については配列番号４に示される配列、ＣＤＲ－Ｈ２については配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ－Ｈ３については配列番号６に示される配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0090】

一態様では、ヒトＩＬ－１７Ａ及びヒトＩＬ－１７Ｆに結合する抗原結合部位は、配列番号７に示される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0091】

一態様では、ヒトＩＬ－１７Ａ及びヒトＩＬ－１７Ｆに結合する抗原結合部位は、配列番号９に示される配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0092】

一態様では、多重特異性抗体はＦｃドメインを欠き、半減期は血清アルブミンに結合する抗原結合部位によって提供される。

【0093】

一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号５７又は配列番号５９に示される配列を含む。

【0094】

一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号６１又は配列番号６３に示される配列を含む。

【0095】

一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号５９に示される配列及び配列番号６３に示される配列を含む。

【0096】

一実施形態では、多重特異性抗体は、
式（Ｉ）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ－ＣＨ_１－（ＣＨ_２）_ｓ－（ＣＨ_３）_ｔ－Ｘ－（Ｖ_１）_ｐ、及び
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌ－Ｙ－Ｖ_２
を含むか、又はこれらからなり、
式中、
Ｖ_Ｈは重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ_１は重鎖定常領域のドメイン１を表し、
ＣＨ_２は重鎖定常領域のドメイン２を表し、
ＣＨ_３は重鎖定常領域のドメイン３を表し、
Ｘは結合又はリンカーを表し、
Ｖ_１はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖを表し、
Ｖ_Ｌは軽鎖可変ドメインを表し、
Ｃ_ＬはＣカッパなどの軽鎖定常領域由来のドメインを表し、
Ｙは結合又はリンカーを表し、
Ｖ_２はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はｓｃＦｖを表し、
ｐは０又は１を表し、
ｓは０又は１を表し、
ｔは０又は１を表し、
式中、ｐが０である場合、Ｘは存在せず、ｑが０である場合、Ｙは存在せず、
式（Ｉ）のポリペプチド鎖はプロテインＡ結合ドメインを含み、
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖はプロテインＡに結合しない。

【0097】

一実施形態では、ｓが０であり、ｔが０である場合、本開示による多重特異性抗体は、
式（Ｉ）及び（ＩＩ）のそれぞれの重鎖及び軽鎖の二量体として提供され、Ｖ_Ｈ－ＣＨ_１部分がＶ_Ｌ－Ｃ_Ｌ部分と共に機能的Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を形成する。

【0098】

一実施形態では、ｓが１であり、ｔが１である場合、本開示による多重特異性抗体は、
式（Ｉ）及び（ＩＩ）のそれぞれの２つの重鎖及び２つの軽鎖の二量体として提供され、２つの重鎖が鎖間相互作用により、特にＣＨ_２－ＣＨ_３のレベルで接続され、各重鎖のＶ_Ｈ－ＣＨ_１部分が各軽鎖のＶ_Ｌ－Ｃ_Ｌ部分と共に、機能的Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を形成する。そのような実施形態では、２つのＶ_Ｈ－ＣＨ_１－ＣＨ_２－ＣＨ_３部分は、２つのＶ_Ｌ－Ｃ_Ｌ部分と共に機能的全長抗体を形成する。そのような実施形態では、全長抗体は、機能的Ｆｃ領域を含むことができる。

【0099】

Ｖ_Ｈは重鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖ_Ｈはヒト化されている。一実施形態では、Ｖ_Ｈは完全にヒト型である。

【0100】

Ｖ_Ｌは軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖ_Ｌはヒト化されている。一実施形態では、Ｖ_Ｌは完全ヒト型である。

【0101】

一般に、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは一緒になって抗原結合ドメインを形成する。一実施形態では、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは同族対を形成する。

【0102】

本明細書で使用される「同族対」は、インビボで生成された単一の抗体由来の可変ドメインの対、すなわち宿主から単離された可変ドメインの天然に存在する対を指す。したがって、同族対はＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ対である。一例では、同族対は抗原に協同的に結合する。

【0103】

本明細書で使用される「可変領域」又は「可変ドメイン」は、ＣＤＲ及びフレームワーク、特に適切なフレームワークを含む抗体鎖の領域を指す。

【0104】

本開示で使用するための可変領域は、一般に、当技術分野で公知の任意の方法によって産生することができる抗体に由来する。

【0105】

本明細書で使用される「由来する」とは、使用される配列又は使用される配列に非常に類似する配列が、抗体の軽鎖又は重鎖などの元の遺伝物質から得られたという事実を指す。

【0106】

本明細書で使用される「非常に類似している」とは、その全長にわたって、９６、９７、９８又は９９％など、９５％以上類似しているアミノ酸配列を指すことを意図する。

【0107】

Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌについて本明細書で上述した本発明で使用するための可変領域は、任意の適切な供給源からのものであってもよく、例えば完全ヒト型又はヒト化されていてもよい。

【0108】

一実施形態では、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌによって形成される結合ドメインは、第１の抗原に特異的である。

【0109】

一態様では、Ｖ_１の結合ドメインは第２の抗原に特異的である。

【0110】

一態様では、Ｖ_２の結合ドメインは第３の抗原に特異的である。

【0111】

一実施形態では、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ、Ｖ_１、及びＶ_２の各々は、存在する場合、それぞれの抗原に別々に結合する。

【0112】

一実施形態では、ＣＨ_１ドメインは、抗体重鎖由来の天然に存在するドメイン１又はその誘導体である。一実施形態では、ＣＨ_２ドメインは、抗体重鎖由来の天然に存在するドメイン２又はその誘導体である。一実施形態では、ＣＨ_３ドメインは、抗体重鎖由来の天然に存在するドメイン３又はその誘導体である。

【0113】

一実施形態では、軽鎖中のＣ_Ｌ断片は、定常カッパ配列又はその誘導体である。一実施形態では、軽鎖中のＣ_Ｌ断片は、定常ラムダ配列又はその誘導体である。

【0114】

本明細書で使用される天然に存在するドメインの誘導体は、例えば望ましくない特性を排除することなどによってドメインの特性を最適化するために、天然に存在する配列中の少なくとも１つのアミノ酸が置換又は欠失されているが、ドメインの特徴的な特徴が保持されていることを指すことを意図する。一実施形態では、天然に存在するドメインの誘導体は、天然に存在する配列と比較して、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、１１個又は１２個のアミノ酸の置換又は欠失を含む。

【0115】

一実施形態では、１つ又は複数の天然又は操作された鎖間（すなわち軽鎖と重鎖との間）ジスルフィド結合は、機能性Ｆａｂ又はＦａｂ’断片中に存在する。

【0116】

一実施形態では、式（Ｉ）及び（ＩＩ）のポリペプチド鎖中のＣＨ_１とＣ_Ｌとの間に「天然」ジスルフィド結合が存在する。

【0117】

Ｃ_Ｌドメインがカッパ又はラムダのいずれかに由来する場合、システインを形成する結合の天然の位置は、ヒトｃカッパ及びｃラムダにおいて２１４である（Ｋａｂａｔナンバリング第４版１９８７）。

【0118】

ＣＨ_１中のシステインを形成するジスルフィド結合の正確な位置は、実際に使用される特定のドメインに依存する。したがって、例えば、ヒトガンマ－１では、ジスルフィド結合の天然の位置は位置２３３に位置する（Ｋａｂａｔナンバリング第４版１９８７）。ガンマ２、３、４、ＩｇＭ及びＩｇＤなどの他のヒトアイソタイプのシステインを形成する結合の位置は公知であり、例えばヒトＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４については位置１２７、ヒトＩｇＤ及びＩｇＡ２Ｂの重鎖については１２８である。

【0119】

場合により、式Ｉ及びＩＩのポリペプチドのＶ_ＨとＶ_Ｌとの間にジスルフィド結合が存在してもよい。

【0120】

一実施形態では、本開示による多重特異性抗体は、ＣＨ_１とＣ_Ｌとの間に天然に存在するものと同等又は対応する位置にジスルフィド結合を有する。

【0121】

一実施形態では、ＣＨ_１を含む定常領域及びＣ_Ｌなどの定常領域は、天然に存在しない位置にあるジスルフィド結合を有する。これは、必要な１つ又は複数の位置でシステインをアミノ酸鎖に導入することによって分子に操作することができる。この天然に存在しないジスルフィド結合は、ＣＨ_１とＣ_Ｌとの間に存在する天然ジスルフィド結合に加えて、又はその代わりとして存在する。天然の位置のシステインは、ジスルフィド架橋を形成することができないセリンなどのアミノ酸で置き換えることができる。

【0122】

操作されたシステインの導入は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。これらの方法としては、ＰＣＲ伸長オーバーラップ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発又はカセット突然変異誘発（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ，１９８９、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ＆Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９３を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。部位特異的突然変異誘発キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）が市販されている。カセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅ，３４：３１５－３２３に基づいて行うことができる。

【0123】

或いは、変異体は、アニーリング、ライゲーション及びＰＣＲ増幅、並びに重複オリゴヌクレオチドのクローニングによる全遺伝子合成によって作成することができる。

【0124】

一実施形態では、ＣＨ_１とＣ_Ｌとの間のジスルフィド結合は完全に存在せず、例えば、鎖間システインは、セリンなどの別のアミノ酸で置き換えられてもよい。したがって、一実施形態では、分子の機能性Ｆａｂ断片に鎖間ジスルフィド結合は存在しない。参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／００３１７０号などの開示は、鎖間ジスルフィド結合なしにＦａｂ断片を提供する方法を記載している。

【0125】

本発明で使用するための抗体フォーマットの例としては、付加ＩｇＧ及び付加Ｆａｂが挙げられ、全ＩｇＧ又はＦａｂ断片はそれぞれ、少なくとも１つの追加の抗原結合ドメイン（例えば、１つ、２つ、３つ又は４つの追加の抗原結合ドメイン）、例えば単一ドメイン抗体（例えば、Ｖ_Ｈ若しくはＶ_Ｌ、又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖを、当該ＩｇＧ又はＦａｂの軽鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に、場合により当該ＩｇＧ又はＦａｂの重鎖に付加することによって操作され、例えば、全て参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第２００９／０４０５６２号、国際公開第２０１００３５０１２号、国際公開第２０１１／０３０１０７号、国際公開第２０１１／０６１４９２号、国際公開第２０１１／０６１２４６号及び国際公開第２０１１／０８６０９１号に記載される。ＩｇＧの軽鎖のＣ末端に（及び場合により重鎖に）ｄｓＦｖを付加することによって操作された全長ＩｇＧを含む付加ＩｇＧは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１９７７８９号に最初に開示された。

【0126】

本発明で使用するための好ましい抗体フォーマットは、２つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂを含み、各ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは同じ又は異なる標的に結合する（例えば、１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは治療標的に結合し、１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、例えばアルブミンに結合することによって半減期を増加させる）。そのような抗体断片は、参照によりその全体が、特に抗体断片の考察に関して本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第２０１５／１９７７７２号に記載されている。

【0127】

Ｖ_１は、ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はｓｃＦｖを表す。

【0128】

Ｖ_２は、ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はｓｃＦｖを表す。

【0129】

一実施形態では、Ｖ_１及び／又はＶ_２がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_１及び／又はＶ_２の可変ドメインＶ_ＨとＶ_Ｌとの間のジスルフィド結合は、以下に列挙される残基のうちの２つの間にある（文脈上別段の指示がない限り、以下のリストではＫａｂａｔナンバリングが使用される）。Ｋａｂａｔナンバリングが参照される場合、関連する参照は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１（５^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．），ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡである。

【0130】

一実施形態では、ジスルフィド結合は、
・例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照されたい、Ｖ_Ｈ３７＋Ｖ_Ｌ９５Ｃ、
・例えば、Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５（３２１－３２９），２０１２）を参照されたい、Ｖ_Ｈ４４＋Ｖ_Ｌ１００、
・例えば、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８，８２５－８３１ Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ（１９９５）を参照されたい、Ｖ_Ｈ４４＋Ｖ_Ｌ１０５、
・例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照されたい、Ｖ_Ｈ４５＋Ｖ_Ｌ８７、
・例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５－１３９ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９５）を参照されたい、Ｖ_Ｈ５５＋Ｖ_Ｌ１０１、
・例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９ １３６２－１３６７ Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９０）を参照されたい、Ｖ_Ｈ１００＋Ｖ_Ｌ５０、
・例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９ １３６２－１３６７ Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９０）を参照されたい、Ｖ_Ｈ１００ｂ＋Ｖ_Ｌ４９、
・例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照されたい、Ｖ_Ｈ９８＋Ｖ_Ｌ４６、
・例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照されたい、Ｖ_Ｈ１０１＋Ｖ_Ｌ４６、
・例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９０ｐｐ．７５３８－７５４２ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）、又はＰｒｏｔｅｉｎｓ １９，３５－４７ Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９４）を参照されたい、Ｖ_Ｈ１０５＋Ｖ_Ｌ４３、
・例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５－１３９ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９５）を参照されたい、Ｖ_Ｈ１０６＋Ｖ_Ｌ５７からなる群から選択される位置
及び分子内に位置する可変領域対中のそれに対応する位置にある。

【0131】

一実施形態では、ジスルフィド結合は、位置Ｖ_Ｈ４４と位置Ｖ_Ｌ１００との間に形成される。

【0132】

上記のアミノ酸対は、ジスルフィド結合を形成することができるようにシステインによる置換を助長する位置にある。システインは、公知の技術によってこれらの所望の位置に操作することができる。したがって、一実施形態では、本開示による操作されたシステインは、所与のアミノ酸位置の天然に存在する残基がシステイン残基で置換されている場合を指す。

【0133】

操作されたシステインの導入は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。これらの方法としては、ＰＣＲ伸長オーバーラップ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発又はカセット突然変異誘発（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ，１９８９、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ＆Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９３を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。部位特異的突然変異誘発キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、カリフォルニア州ラホヤ）が市販されている。カセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅ，３４：３１５－３２３に基づいて行うことができる。

【0134】

或いは、変異体は、アニーリング、ライゲーション及びＰＣＲ増幅、並びに重複オリゴヌクレオチドのクローニングによる全遺伝子合成によって作成することができる。

【0135】

したがって、一実施形態では、Ｖ_１及び／又はＶ_２がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_１の可変ドメインＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ並びに／又はＶ_２の可変ドメインＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されてもよく、システイン残基の対の位置は、Ｖ_Ｈ３７及びＶ_Ｌ９５、Ｖ_Ｈ４４及びＶ_Ｌ１００、Ｖ_Ｈ４４及びＶ_Ｌ１０５、Ｖ_Ｈ４５及びＶ_Ｌ８７、Ｖ_Ｈ１００及びＶ_Ｌ５０、Ｖ_Ｈ１００ｂ及びＶ_Ｌ４９、Ｖ_Ｈ９８及びＶ_Ｌ４６、Ｖ_Ｈ１０１及びＶ_Ｌ４６、Ｖ_Ｈ１０５及びＶ_Ｌ４３、並びにＶ_Ｈ１０６及びＶ_Ｌ５７からなる群から選択される。

【0136】

一実施形態では、Ｖ_１及び／又はＶ_２がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_１の可変ドメインＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ並びに／又はＶ_２の可変ドメインＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは、ＣＤＲの外側にある２つのシステイン残基、Ｖ_Ｈ中に１つ及びＶ_Ｌ中に１つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって連結されてもよく、システイン残基の対の位置は、Ｖ_Ｈ３７及びＶ_Ｌ９５、Ｖ_Ｈ４４及びＶ_Ｌ１００、Ｖ_Ｈ４４及びＶ_Ｌ１０５、Ｖ_Ｈ４５及びＶ_Ｌ８７、Ｖ_Ｈ１００及びＶ_Ｌ５０、Ｖ_Ｈ９８及びＶ_Ｌ４６、Ｖ_Ｈ１０５及びＶ_Ｌ４３、Ｖ_Ｈ１０６及びＶ_Ｌ５７からなる群から選択される。

【0137】

一実施形態では、Ｖ_１がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_１の可変ドメインＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは、一方がＶ_Ｈ４４位置にあり、他方がＶ_Ｌ１００位置にある２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結される。一実施形態では、Ｖ_２がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_２の可変ドメインＶ_Ｈ及びＶ_Ｌは、一方がＶ_Ｈ４４位置にあり、他方がＶ_Ｌ１００位置にある２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結される。

【0138】

一実施形態では、Ｖ_１がｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖである場合、Ｖ_１のＶ_ＨドメインはＸに結合している。

【0139】

一実施形態では、Ｖ_１がｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖである場合、Ｖ_１のＶ_ＬドメインはＸに結合している。

【0140】

一実施形態では、Ｖ_２がｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖである場合、Ｖ_２のＶ_ＨドメインはＹに結合している。

【0141】

一実施形態では、Ｖ_２がｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖである場合、Ｖ_２のＶ_ＬドメインはＹに結合している。

【0142】

当業者は、Ｖ_１及び／又はＶ_２がｄｓＦｖを表す場合、多重特異性抗体は、Ｘ又はＹに結合していない対応する遊離Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインをコードする第３のポリペプチドを含むことを理解するであろう。Ｖ_１及びＶ_２がｄｓＦｖである場合、「遊離可変ドメイン」（すなわち、ジスルフィド結合を介してポリペプチドの残りの部分に連結されたドメイン）は両方の鎖に共通である。したがって、Ｘ又はＹを介してポリペプチドに融合又は連結された実際の可変ドメインは、各ポリペプチド鎖において異なっていてもよいが、それと対になった遊離可変ドメインは、一般に互いに同一である。

【0143】

いくつかの実施形態では、ｐは１である。いくつかの実施形態では、ｐは０である。

【0144】

いくつかの実施形態では、ｓは１である。いくつかの実施形態では、ｓは０である。

【0145】

いくつかの実施形態では、ｔは１である。いくつかの実施形態では、ｔは０である。

【0146】

いくつかの実施形態では、ｓは１であり、ｔは１である。いくつかの実施形態では、ｓは０であり、ｔは０である。

【0147】

一実施形態では、ｐは１であり、ｑは１であり、ｒは０であり、ｓは０であり、ｔは０であり、Ｖ_１及びＶ_２は両方ともｄｓｓｃＦｖを表す。したがって、一態様では、
ａ）式（Ｉａ）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ－ＣＨ_１－Ｘ－Ｖ_１、及び
ｂ）式（ＩＩａ）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌ－Ｙ－Ｖ_２
を含むか、又はこれらからなり、
式中、
Ｖ_Ｈは重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ_１は重鎖定常領域のドメイン１を表し、
Ｘは結合又はリンカーを表し、
Ｙは結合又はリンカーを表し、
Ｖ_１はｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、又はｄｓＦｖを表し、
Ｖ_Ｌは軽鎖可変ドメインを表し、
Ｃ_ＬはＣカッパなどの軽鎖定常領域由来のドメインを表し、
Ｖ_２はｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖを表し、
Ｖ_１又はＶ_２の少なくとも１つはｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、
式（Ｉａ）のポリペプチド鎖はプロテインＡ結合ドメインを含み、
式（ＩＩａ）のポリペプチド鎖はプロテインＡに結合しない、ヒトＩＬ－１３、ヒトＩＬ－１７Ａ及び／又はヒトＩＬ－１７Ｆに結合する、多重特異性抗体を提供する。

【0148】

そのような実施形態では、Ｖ_２はプロテインＡに結合しない、すなわち、Ｖ_２のｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖはプロテインＡ結合ドメインを含まない。一実施形態では、Ｖ_２、すなわちＶ_２のｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖはＶＨ１ドメインを含む。別の実施形態では、Ｖ_２、すなわちＶ_２のｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖは、プロテインＡに結合しないＶＨ３ドメインを含む。一実施形態では、Ｖ_２、すなわちＶ_２のｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖは、ＶＨ２ドメインを含む。一実施形態では、Ｖ_２、すなわちＶ_２のｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖはＶＨ４ドメインを含む。一実施形態では、Ｖ_２、すなわちＶ_２のｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖはＶＨ５ドメインを含む。一実施形態では、Ｖ_２、すなわちＶ_２のｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖはＶＨ６ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉａ）のポリペプチド鎖は、Ｖ_Ｈ又はＶ_１中に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。一実施形態では、式（Ｉａ）のポリペプチド鎖は、Ｖ_１中に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。別の実施形態では、式（Ｉａ）のポリペプチド鎖は、それぞれＶＨ及びＶ_１に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。

【0149】

別の実施形態では、ｐは０であり、ｑは１であり、ｒは０であり、ｓは１であり、ｔは１であり、Ｖ_２はｄｓｓｃＦｖである。したがって、一態様では、
ａ）式（Ｉｂ）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ－ＣＨ_１－ＣＨ_２－ＣＨ_３、及び
ｂ）式（ＩＩｂ）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌ－Ｙ－Ｖ_２
を含むか、又はこれらからなり、
式中、
Ｖ_Ｈは重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ_１は重鎖定常領域のドメイン１を表し、
ＣＨ_２は重鎖定常領域のドメイン２を表し、
ＣＨ_３は重鎖定常領域のドメイン３を表し、
Ｙは結合又はリンカーを表し、
Ｖ_Ｌは軽鎖可変ドメインを表し、
Ｃ_ＬはＣカッパなどの軽鎖定常領域由来のドメインを表し、
Ｖ_２はｄｓｓｃＦｖを表し、
式（Ｉｂ）のポリペプチド鎖はプロテインＡ結合ドメインを含み、
式（ＩＩｂ）のポリペプチド鎖はプロテインＡに結合しない、ヒトＩＬ－１３、ヒトＩＬ－１７Ａ及び／又はヒトＩＬ－１７Ｆに結合する、多重特異性抗体を提供する。

【0150】

そのような実施形態では、Ｖ_２はプロテインＡに結合しない、すなわちＶ_２のｄｓｓｃＦｖはプロテインＡ結合ドメインを含まない。一実施形態では、Ｖ_２、すなわちＶ_２のｄｓｓｃＦｖはＶＨ１ドメインを含む。別の実施形態では、Ｖ_２、すなわちＶ_２のｄｓｓｃＦｖは、プロテインＡに結合しないＶＨ３ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉｂ）のポリペプチド鎖は、Ｖ_Ｈ又はＣＨ_２－ＣＨ_３に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。別の実施形態では、式（Ｉｂ）のポリペプチド鎖は、それぞれＶＨ及びＣＨ_２－ＣＨ_３に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。

【0151】

別の実施形態では、ｐは０であり、ｑは１であり、ｒは０であり、ｓは１であり、ｔは１であり、Ｖ_２はｄｓＦｖである。したがって、一態様では、
ａ）式（Ｉｃ）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ－ＣＨ_１－ＣＨ_２－ＣＨ_３、及び
ｂ）式（ＩＩｃ）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌ－Ｙ－Ｖ_２
を含むか、又はこれらからなり、
式中、
Ｖ_Ｈは重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ_１は重鎖定常領域のドメイン１を表し、
ＣＨ_２は重鎖定常領域のドメイン２を表し、
ＣＨ_３は重鎖定常領域のドメイン３を表し、
Ｙは結合又はリンカーを表し、
Ｖ_Ｌは軽鎖可変ドメインを表し、
Ｃ_ＬはＣカッパなどの軽鎖定常領域由来のドメインを表し、
Ｖ_２はｄｓＦｖを表し、
式（Ｉｃ）のポリペプチド鎖はプロテインＡ結合ドメインを含み、
式（ＩＩｃ）のポリペプチド鎖はプロテインＡに結合しない、ヒトＩＬ－１３、ヒトＩＬ－１７Ａ及び／又はヒトＩＬ－１７Ｆに結合する、多重特異性抗体を提供する。

【0152】

そのような実施形態では、Ｖ_２、すなわちＶ_２のｄｓＦｖはプロテインＡに結合しない。一実施形態では、式（Ｉｃ）のポリペプチド鎖は、Ｖ_Ｈ又はＣＨ_２－ＣＨ_３に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。別の実施形態では、式（Ｉｃ）のポリペプチド鎖は、それぞれＶ_Ｈ及びＣＨ_２－ＣＨ_３に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。

【0153】

本発明の多重特異性抗体の一実施形態では、
Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈは、ヒトＩＬ－１７Ａ及び／又はヒトＩＬ－１７Ｆに結合する抗原結合部位を含み、
Ｖ_１は、ヒト血清アルブミンに結合する抗原結合部位を含み、
Ｖ_２は、ヒトＩＬ－１３に結合する抗原結合部位を含む。

【0154】

一実施形態では、Ｖ_Ｌは、ＣＤＲ－Ｌ１については配列番号１に示される配列、ＣＤＲ－Ｌ２については配列番号２に示される配列及びＣＤＲ－Ｌ３については配列番号３に示される配列を含み、Ｖ_Ｈは、ＣＤＲ－Ｈ１については配列番号４に示される配列、ＣＤＲ－Ｈ２については配列番号５に示される配列、及びＣＤＲ－Ｈ３については配列番号６に示される配列を含む。

【0155】

一実施形態では、Ｖ_１は、ＣＤＲ－Ｌ１については配列番号３９に示される配列、ＣＤＲ－Ｌ２については配列番号４０に示される配列、及びＣＤＲ－Ｌ３については配列番号４１に示される配列を含む軽鎖可変領域、並びにＣＤＲ－Ｈ１については配列番号４２に示される配列、ＣＤＲ－Ｈ２については配列番号４３に示される配列、及びＣＤＲ－Ｈ３については配列番号４４に示される配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0156】

一実施形態では、Ｖ_２は、ＣＤＲ－Ｌ１については配列番号１５に示される配列、ＣＤＲ－Ｌ２については配列番号１６に示される配列、及びＣＤＲ－Ｌ３については配列番号１７に示される配列を含む軽鎖可変領域、並びにＣＤＲ－Ｈ１については配列番号１８に示される配列、ＣＤＲ－Ｈ２については配列番号１９に示される配列、及びＣＤＲ－Ｈ３については配列番号２０に示される配列を含む重鎖可変領域を含み、
一実施形態では、Ｖ_Ｌは配列番号７に示される配列を含み、Ｖ_Ｈは配列番号９に示される配列を含む。

【0157】

一実施形態では、Ｖ_１は、配列番号４５に示される配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号４６に示される配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0158】

一実施形態では、Ｖ_１は、配列番号４９に示される配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号５０に示される配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0159】

一実施形態では、Ｖ_１の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域はリンカーによって連結されており、当該リンカーは配列番号６８に示される配列を含む。

【0160】

一実施形態では、Ｖ_１は、配列番号５３に示される配列を含むｓｃＦｖ、又は配列番号５５に示される配列を含むｄｓｓｃＦｖである。

【0161】

一実施形態では、Ｖ_２は、配列番号２７に示される配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号２８に示される配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0162】

一実施形態では、Ｖ_２は、配列番号３１に示される配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号３２に示される配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0163】

一実施形態では、Ｖ_２の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域はリンカーによって連結されており、当該リンカーは配列番号６６に示される配列を含む。

【0164】

一実施形態では、Ｖ_２は、配列番号３５に示される配列を含むｓｃＦｖ、又は配列番号３７に示される配列を含むｄｓｓｃＦｖである。

【0165】

一実施形態では、Ｘは、配列番号６７に示される配列を含むリンカーである。

【0166】

一実施形態では、Ｙは、配列番号６５に示される配列を含むリンカーである。

【0167】

一実施形態では、式（Ｉａ）のポリペプチド鎖は、配列番号５７又は配列番号５９に示される配列を含む。

【0168】

一実施形態では、式（ＩＩａ）のポリペプチド鎖は、配列番号６１又は配列番号６３に示される配列を含む。

【0169】

一実施形態では、式（Ｉａ）のポリペプチド鎖は配列番号５９に示される配列を含み、式（ＩＩａ）のポリペプチド鎖は配列番号６３に示される配列を含む。

【0170】

抗体が抗原に結合し、その生物学的活性を中和する能力を有意に変化させることなく、本発明によって提供される配列に対して１つ又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を行ってもよいことが理解されるであろう。任意のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失の効果は、例えば、本明細書に記載の方法、特に例に例示される方法を使用して、抗原結合及び生物学的活性の阻害を決定することによって、当業者によって容易に試験することができる。

【0171】

したがって、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３９、４０、４１、４２、４３及び４４に示される配列によって定義されるＣＤＲを含む多重特異性抗体であって、ＣＤＲの１つ又は複数における１つ又は複数のアミノ酸が別のアミノ酸、例えば本明細書において以下に定義される類似のアミノ酸で置換されている多重特異性抗体を提供する。

【0172】

本明細書で使用される「同一性」は、整列した配列の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。本明細書で使用される「類似性」は、整列した配列の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを示す。例えば、イソロイシン又はバリンの代わりにロイシンを用いてもよい。互いに置換され得る他のアミノ酸としては、
－フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、
－リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）、
－アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）、
－アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、及び
－システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）が挙げられるが、これらに限定されない。同一性及び類似性の程度は、容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６，）。

【0173】

一実施形態では、多重特異性抗体のＣＤＲは、配列番号１、２、３、４、５、６、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３９、４０、４１、４２、４３及び４４に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。

【0174】

一実施形態では、Ｖ_Ｌは、配列番号７に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含み、ＶＨは、配列番号９に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。

【0175】

一実施形態では、Ｖ_１は、配列番号４５に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む軽鎖可変領域及び／又は配列番号４６に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0176】

一実施形態では、Ｖ_１は、配列番号４９に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む軽鎖可変領域及び／又は配列番号５０に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0177】

一実施形態では、Ｖ_１の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域はリンカーによって連結されており、当該リンカーは、配列番号６８に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。

【0178】

一実施形態では、Ｖ_１は、配列番号５３に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むｓｃＦｖ、又は配列番号５５に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むｄｓｓｃＦｖである。

【0179】

一実施形態では、Ｖ_２は、配列番号２７に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む軽鎖可変領域及び／又は配列番号２８に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0180】

一実施形態では、Ｖ_２は、配列番号３１に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む軽鎖可変領域及び／又は配列番号３２に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0181】

一実施形態では、Ｖ_２の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域はリンカーによって連結されており、当該リンカーは、配列番号６６に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。

【0182】

一実施形態では、Ｖ_２は、配列番号３５に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むｓｃＦｖ、又は配列番号３７に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９８％の同一性若しくは類似性を有する配列を含むｄｓｓｃＦｖである。

【0183】

一実施形態では、Ｘは、配列番号６７に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含むリンカーである。

【0184】

一実施形態では、Ｙは、配列番号６５に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含むリンカーである。

【0185】

一実施形態では、式（Ｉａ）のポリペプチド鎖は、配列番号５７又は配列番号５９に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。

【0186】

一実施形態では、式（ＩＩａ）のポリペプチド鎖は、配列番号６１又は配列番号６３に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。

【0187】

一実施形態では、式（Ｉａ）のポリペプチド鎖は、配列番号５９に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含み、式（ＩＩａ）のポリペプチド鎖は、配列番号６３に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。

【0188】

エピトープ
エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的又は機能的として定義することができる。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、立体配座であってもよく、すなわち、非直鎖状アミノ酸から構成されてもよい。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基である決定基を含むことができ、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有してもよい。

【0189】

抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するか、又は参照抗体と結合について競合するかどうかは、当技術分野で公知の日常的な方法を使用することによって容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件下でタンパク質又はペプチドに結合させる。次に、タンパク質又はペプチドに結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が参照抗体との飽和結合後にタンパク質又はペプチドに結合することができる場合、試験抗体は参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方、試験抗体が参照抗体との飽和結合後にタンパク質又はペプチドに結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープに結合し得る。

【0190】

抗体が参照抗体との結合について競合するかどうかを決定するために、上記の結合方法論は２つの方向で行われる。第１の方向では、参照抗体を飽和条件下でタンパク質／ペプチドに結合させ、続いて試験抗体のタンパク質／ペプチド分子への結合を評価する。第２の方向では、試験抗体を飽和条件下でタンパク質／ペプチドに結合させ、続いて参照抗体のタンパク質／ペプチドへの結合を評価する。両方向において、第１の（飽和）抗体のみがタンパク質／ペプチドに結合することができる場合、試験抗体及び参照抗体はタンパク質／ペプチドへの結合について競合すると結論付けられる。当業者には理解されるように、参照抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合するわけではないが、重複又は隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的にブロックすることができる。

【0191】

２つの抗体は、各々が抗原への他方の結合を競合的に阻害（ブロック）する場合、同じ又は重複するエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍又は１００倍過剰の一方の抗体は、競合結合アッセイで測定した場合に、他方の結合を少なくとも５０％、７５％、９０％又は更に９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９０：５０：１４９５－１５０２を参照されたい）。或いは、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減又は排除するいくつかのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は重複エピトープを有する。

【0192】

次いで、試験抗体の結合の観察された欠如が実際に参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるかどうか、又は立体ブロッキング（又は別の現象）が観察された結合の欠如の原因であるかどうかを確認するために、更に慣用的な実験（例えば、ペプチド突然変異及び結合分析）を行うことができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、又は当技術分野で利用可能な任意の他の定量的若しくは定性的抗体結合アッセイを使用して行うことができる。

【0193】

抗体は、配列番号１／２／３／４／５／６のＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３配列の組み合わせを含む多重特異性抗体とＩＬ－１７Ａ又はＩＬ－１７Ｆへの結合について競合するか、又は多重特異性抗体と同じエピトープに結合することができる。

【0194】

抗体は、配列番号１５／１６／１７／１８／１９／２０のＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３配列の組み合わせを含む多重特異性抗体とＩＬ－１３への結合について競合するか、又は多重特異性抗体と同じエピトープに結合することができる。

【0195】

抗体は、配列番号３９／４０／４１／４２／４３／４４のＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３配列の組み合わせを含む多重特異性抗体と血清アルブミンへの結合について競合するか、又は多重特異性抗体と同じエピトープに結合することができる。

【0196】

エフェクター分子
所望であれば、本発明で使用するための多重特異性抗体は、１つ又は複数のエフェクター分子にコンジュゲートすることができる。エフェクター分子は、本発明の抗体に結合することができる単一部分を形成するように連結された単一のエフェクター分子又は２つ以上のそのような分子を含むことができることが理解されるであろう。エフェクター分子に連結された抗体断片を得ることが望ましい場合、抗体断片が直接又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結される標準的な化学的又は組換えＤＮＡ手順によって調製することができる。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせるための技術は、当技術分野で公知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ｐｐ．６２３－５３、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９－５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７－１２３を参照されたい）。特定の化学的手順としては、例えば、国際公開第９３／０６２３１号、国際公開第９２／２２５８３号、国際公開第８９／００１９５号、国際公開第８９／０１４７６号及び国際公開第０３０３１５８１号に記載されているものが挙げられる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、例えば国際公開第８６／０１５３３号及び欧州特許第０３９２７４５号に記載されているように、組換えＤＮＡ手順を使用して連結を達成することができる。

【0197】

本明細書で使用されるエフェクター分子という用語は、例えば、抗悪性腫瘍薬、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子及びレポーター基、例えば蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出することができる化合物を含む。

【0198】

エフェクター分子の例としては、細胞に有害な（例えば、死滅させる）任意の薬剤を含む細胞毒素又は細胞傷害剤を挙げることができる。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにそれらの類似体又はホモログが挙げられる。

【0199】

エフェクター分子としてはまた、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0200】

他のエフェクター分子としては、^１１１Ｉｎ及び^９０Ｙ、Ｌｕ^１７７、ビスマス^２１３、カリフォルニウム^２５２、イリジウム^１９２及びタングステン^１８８／レニウム^１８８などのキレート化放射性核種、又はアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0201】

他のエフェクター分子としては、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。目的の酵素としては、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。目的のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドとしては、免疫グロブリン、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素、タンパク質、例えば、インスリン、腫瘍壊死因子、α－インターフェロン、β－インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓剤又は抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン又はエンドスタチン、又は生物学的応答調節剤、例えば、リンホカイン、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）又は他の成長因子及び免疫グロブリンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0202】

他のエフェクター分子としては、例えば診断に有用な検出可能な物質を挙げることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、（陽電子放出断層撮影に使用するための）陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断薬として使用するために抗体にコンジュゲートさせることができる金属イオンについては、一般に米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが挙げられ、適切な蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンが挙げられ、適切な発光物質としては、ルミノールが挙げられ、適切な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ、適切な放射性核種としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ及び^９９Ｔｃが挙げられる。

【0203】

別の例では、エフェクター分子は、インビボでの抗体の半減期を増加させ、及び／又は抗体の免疫原性を低下させ、及び／又は上皮バリアを越えて免疫系への抗体の送達を増強することができる。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、国際公開第０５／１１７９８４号に記載されているものなどのポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又はアルブミン結合化合物が挙げられる。

【0204】

エフェクター分子がポリマーである場合、それは一般に、合成又は天然に存在するポリマー、例えば置換されていてもよい直鎖若しくは分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー又は分岐若しくは非分岐多糖、例えばホモ又はヘテロ多糖であってもよい。

【0205】

上記の合成ポリマー上に存在し得る特定の任意選択の置換基としては、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が挙げられる。

【0206】

合成ポリマーの具体例としては、置換されていてもよい直鎖又は分岐鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に置換されていてもよいポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が挙げられる。

【0207】

具体的な天然に存在するポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はそれらの誘導体が挙げられる。

【0208】

本明細書で使用される「誘導体」は、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのチオール選択的反応性基を含むことを意図している。反応性基は、ポリマーに直接又はリンカーセグメントを介して連結することができる。そのような基の残基は、場合によっては、抗体断片とポリマーとの間の連結基として生成物の一部を形成することが理解されるであろう。

【0209】

ポリマーのサイズは、所望に応じて変えることができるが、一般に、５００Ｄａ～５００００Ｄａ、例えば５０００～４００００Ｄａ、例えば２００００～４００００Ｄａの平均分子量範囲である。ポリマーサイズは、特に、生成物の意図される用途、例えば腫瘍などの特定の組織に局在する能力又は循環半減期を延長する能力に基づいて選択することができる（総説については、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１－５４５を参照されたい）。したがって、例えば、生成物が循環を離れて組織に浸透することを意図する場合、例えば約５０００Ｄａの分子量を有する低分子量ポリマーを使用することが有利である可能性がある。生成物が循環中に留まる用途では、例えば２００００Ｄａ～４００００Ｄａの範囲の分子量を有する高分子量ポリマーを使用することが有利である可能性がある。

【0210】

適切なポリマーとしては、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）又は特にメトキシポリ（エチレングリコール）若しくはその誘導体、特に約１５０００Ｄａ～約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するものが挙げられる。

【0211】

一例では、本発明で使用するための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合している。１つの特定の例では、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を介して結合することができる。そのようなアミノ酸は、抗体断片中に天然に存在してもよいか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号、米国特許第５，６６７，４２５号、国際公開第９８／２５９７１号を参照されたい）を使用して断片に操作することができる。一例では、本発明の抗体分子は、修飾されたＦａｂ断片であり、修飾は、エフェクター分子の結合を可能にするためのその重鎖のＣ末端への１つ又は複数のアミノ酸の付加である。適切には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子が結合することができる１つ又は複数のシステイン残基を含む修飾ヒンジ領域を形成する。複数の部位を使用して、２つ以上のＰＥＧ分子を結合することができる。

【0212】

適切には、ＰＥＧ分子は、抗体断片中に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合することができる。修飾抗体断片に結合した各ポリマー分子は、断片中に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合することができる。共有結合は、一般にジスルフィド結合、又は特に硫黄－炭素結合である。チオール基が結合点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えば、マレイミド又はシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体を使用することができる。活性化ポリマーは、上記のポリマー修飾抗体断片の調製における出発材料として使用することができる。活性化ポリマーは、α－ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどのチオール反応性基を含む任意のポリマーであってもよい。そのような出発材料は、商業的に得ることができ（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．、米国アラバマ州ハンツビル）、又は従来の化学的手順を使用して商業的に入手可能な出発材料から調製することができる。特定のＰＥＧ分子としては、２０Ｋメトキシ－ＰＥＧ－アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ及びＳｕｎＢｉｏから得ることができる）及びＭ－ＰＥＧ－ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから得ることができる）が挙げられる。

【0213】

一実施形態では、抗体は、例えば欧州特許第０９４８５４４号又は欧州特許第１０９００３７号に開示されている方法に従って、ＰＥＧ化された、すなわち、それに共有結合したＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する修飾Ｆａｂ断片又はｄｉＦａｂである［’’Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’’，１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、’’Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’’，１９９７，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ及び’’Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ’’，１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ ａｎｄ Ａ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００２，５４：５３１－５４５も参照されたい］一例では、ＰＥＧはヒンジ領域内のシステインに結合している。一例では、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域内の単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リジン残基は、マレイミド基に共有結合することができ、リジン残基上の各アミン基に、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合することができる。したがって、Ｆａｂ断片に結合したＰＥＧの総分子量は、約４０，０００Ｄａであってもよい。

【0214】

一実施形態では、多重特異性抗体はエフェクター分子に結合していない。

【0215】

ポリヌクレオチド／ベクター／宿主細胞
本発明はまた、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体分子のポリペプチド鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0216】

変異体ポリヌクレオチドは、配列表に示される配列からの１、２、３、４、５、最大１０、最大２０、最大３０、最大４０、最大５０、最大７５又はそれ以上の核酸置換及び／又は欠失を含むことができる。一般に、変異体は、１～２０、１～５０、１～７５又は１～１００の置換及び／又は欠失を有する。

【0217】

適切な変異体は、本明細書に開示される核酸配列のいずれか１つのポリヌクレオチドと少なくとも約７０％相同であってもよく、典型的には少なくとも約８０又は９０％、より適切には少なくとも約９５％、９７％又は９９％相同であってもよい。変異体は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を保持することができる。変異体は、典型的には、約６０％～約９９％の同一性、約８０％～約９９％の同一性、約９０％～約９９％の同一性又は約９５％～約９９％の同一性を保持する。これらのレベルでの相同性及び同一性は、一般に、少なくともポリヌクレオチドのコード領域に関して存在する。相同性を測定する方法は当技術分野で公知であり、本文脈において、相同性は核酸同一性に基づいて計算されることが当業者によって理解されるであろう。そのような相同性は、（長さに応じて）少なくとも約１５、少なくとも約３０、例えば少なくとも約４０、６０、１００、２００又はそれ以上の連続するヌクレオチドの領域にわたって存在することができる。そのような相同性は、非修飾ポリヌクレオチド配列の全長にわたって存在することができる。

【0218】

ホモログは、関連するポリヌクレオチド中の配列と、約３、５、１０、１５、２０未満又はそれ以上の変異（それぞれが置換、欠失又は挿入であってもよい）だけ異なる可能性がある。例えば、ホモログは、３～５０個の変異、多くは３～２０個の変異によって異なる可能性がある。これらの変異は、ホモログの少なくとも３０個、例えば少なくとも約４０個、６０個又は１００個又はそれ以上の連続するヌクレオチドの領域にわたって測定することができる。

【0219】

本発明のＤＮＡ配列は、例えば化学処理によって生成された合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

【0220】

ベクターを構築することができる一般的な方法である、トランスフェクション方法及び培養方法は、当業者に公知である。この点に関しては、’’Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ’’，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。

【0221】

ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体をコードするＤＮＡ配列の発現には、任意の適切な宿主細胞／ベクター系を使用することができる。細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及び他の微生物系を使用することができ、又は真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系もまた使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞が挙げられる。

【0222】

本発明はまた、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現に適した条件下でベクターを含む宿主細胞を培養すること、及びＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体を単離することを含む、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体の産生方法を提供する。

【0223】

多重特異性抗体の産生
多重特異性抗体、特に二重特異性抗体を産生するためのいくつかのアプローチがある。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｌｏｍａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ １９９７，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１５９－１６３）は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の全抗体、例えばＩｇＧへの融合を記載している。Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６５，７０５０－７０５７は、ｓｃＦｖと抗体Ｆａｂ断片との融合を記載している。国際公開第２０１５／１９７７７２号は、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖ（ｄｓｓｃＦｖ）とＦａｂ断片との融合を記載している。

【0224】

先行技術に記載されている標準的なアプローチは、少なくとも２つのポリペプチドの宿主細胞における発現を含み、各ポリペプチドは、抗体全体又はその抗原結合断片、例えばＦａｂの重鎖（ＨＣ）又は軽鎖（ＬＣ）をコードし、抗体の追加の抗原結合断片は、重鎖及び／又は軽鎖のＮ末端及び／又はＣ末端位置に融合することができる。２つ（付加Ｆａｂを形成するための１つの軽鎖及び１つの重鎖）又は４つのポリペプチド（付加ＩｇＧを形成するための２つの軽鎖及び２つの重鎖）を発現させることによってこのような多重特異性抗体を組換え産生しようとする場合、通常、その対応する軽鎖とのアセンブリの際に重鎖の適切な折り畳みを確実にするために、重鎖よりも過剰に軽鎖を発現させることが必要である。特に、ＣＨ_１（重鎖定常領域のドメイン１）は、対応するＬＣによって置換することができるＢＩＰタンパク質によって、それ自体で折り畳まれることが防止され、したがって、ＣＨ_１／ＨＣの正しい折り畳みは、その対応するＬＣの利用可能性に依存する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０，２２０９－２２１９）。

【0225】

本発明者らは、多重特異性抗体を発現するそれらの方法が、宿主細胞採取物中に残る重鎖よりも過剰な軽鎖の産生をもたらす可能性があること、及び過剰な軽鎖が、所望の多重特異性抗体、特に単量体との産生プロセスの副産物として存在する二量体複合体（又は「ＬＣ二量体」）を形成する傾向があり、したがって精製除去する必要があることを観察した。

【0226】

重要なことに、軽鎖の二量体の形成に関連する技術的問題は、Ｎ末端及び／又はＣ末端で追加の抗原結合断片に融合された場合、これまで同定されておらず、一般的に使用される分析方法は、産生プロセスの不均一な生成物の中で、付加ＬＣ二量体の検出及び定量を可能にしていない。これは、標準的な分析方法を使用して生成物の量を推定するときに大きなバイアスをもたらす可能性がある。

【0227】

したがって、多重特異性抗体及びその産生方法を改善する必要があり、これは、産生プロセスの最も早い段階で、付加ＬＣ二量体の単離及び除去を容易かつ効率的に可能にし、したがって、治療に使用するための目的のタンパク質、すなわち多重特異性抗体、特にその単量体形態のタンパク質の収率を改善する。

【0228】

本発明の多重特異性抗体は、精製後、特にプロテインＡアフィニティクロマトグラフィを含む一段階精製後に得られる「多重特異性抗体」材料、特に単量体の収率を増加させながら、同等の機能性及び安定性を有する改善された多重特異性抗体を提供するように操作されている。

【0229】

有利には、本開示の多重特異性抗体は、先行技術で一般的に使用される方法よりも改良された精製方法で、特に、改良された方法がより少ない工程を含むという点で、より効率的に精製することができ、これは、工業規模で費用及び時間効率が高い。特に、本開示の多重特異性抗体は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィを含む一段階精製方法の後に得られる目的のタンパク質（すなわち、正しい多重特異性抗体フォーマット）の量を最大化し、それにより、目的の多重特異性抗体の精製及び付加ＬＣ二量体の除去が同時に起こる。有利には、本開示の多重特異性抗体の産生及び精製方法は、遊離の未結合軽鎖、特に付加ＬＣ二量体を過剰に捕捉するための追加の精製工程を必要としない。

【0230】

プロテインＡ
プロテインＡは、細菌の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁に最初に見出された４２ｋＤａの表面タンパク質である。プロテインＡは、免疫グロブリンを検出、定量及び精製するために広く使用されている。プロテインＡは、ＶＨ３ファミリー抗体に由来するＦａｂ部分、及びＩｇＧの定常領域部分（ＣＨ_２ドメインとＣＨ_３ドメインとの間）のＦｃガンマ領域に結合することが報告されている。プロテインＡとＦａｂとによって形成される複合体の結晶構造は、例えば、Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＰＮＡＳ，９７（１０）：５３９９－５４０４に記載されている。本開示の文脈において、プロテインＡは、プロテインＡ変異体又は誘導体がＶＨ３ドメイン及び／又はＦｃガンマドメインに結合する能力を維持する限り、天然プロテインＡ及びその任意の変異体又は誘導体を包含する。

【0231】

本発明の式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、プロテインＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、１、２又は３つのプロテインＡ結合ドメインを含む。

【0232】

本明細書で使用される「プロテインＡ結合ドメイン」は、プロテインＡに特異的に結合する結合ドメインを指すことを意図している。プロテインＡ結合ドメインは、プロテインＡに結合する、すなわちプロテインＡ結合界面を含むＶＨ３ドメイン又はＶＨ３ドメインの一部を指すことができる。プロテインＡに結合するＶＨ３ドメインの部分は、ＶＨ３ドメインのＣＤＲを含まない、すなわち、ＶＨ３のプロテインＡ結合界面はＣＤＲを含まず、したがって、プロテインＡ結合ドメインは、本出願に開示される抗原結合ドメインと競合しないことが理解されるであろう。

【0233】

一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、Ｖ_Ｈ及び／又はＣＨ_２－ＣＨ_３及び／又はＶ_１中に存在するプロテインＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、Ｖ_Ｈ及び／又はＣＨ_２－ＣＨ_３及び／又はＶ１中に存在する１、２又は３つのプロテインＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、Ｖ_Ｈ又はＶ_１中に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。一実施形態では、ｓは０であり、ｔは０であり、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、Ｖ_Ｈ又はＶ_１中に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、Ｖ_Ｈ中に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。一実施形態では、ｓは０であり、ｔは０であり、ｐは０であり、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、Ｖ_Ｈ中に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、Ｖ_１中に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。一実施形態では、ｓは０であり、ｔは０であり、ｐは１であり、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、Ｖ_１中に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。

【0234】

一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、それぞれＶ_Ｈ及びＣＨ_２－ＣＨ_３に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。別の実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、それぞれＶ_Ｈ及びＶ_１に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。別の実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、それぞれＣＨ_２－ＣＨ_３及びＶ_１に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。

【0235】

一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、それぞれがＶ_Ｈ、ＣＨ_２－ＣＨ_３及びＶ_１に存在する３つのプロテインＡ結合ドメインを含む。

【0236】

天然のプロテインＡは、ＩｇＧの定常領域部分において、特にＦｃガンマ領域と相互作用することができる。より具体的には、プロテインＡは、ＣＨ_２とＣＨ_３との間の結合ドメインと相互作用することができる。一実施形態では、ｓが１であり、ｔが１である場合、ＣＨ_２及びＣＨ_３の両方がＩｇＧクラスの天然に存在するドメインである。

【0237】

いくつかの実施形態では、プロテインＡ結合ドメインは、プロテインＡに結合するＶＨ３ドメイン又はその変異体を含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、プロテインＡ結合ドメインは、天然に存在するＶＨ３ドメインを含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、プロテインＡに結合するＶＨ３ドメインの変異体は、天然に存在するＶＨ３ドメインの変異体であり、当該天然に存在するＶＨ３ドメインはプロテインＡに結合することができない。

【0238】

本開示の式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、プロテインＡに結合しない。一実施形態では、Ｖ_２の結合ドメインは、プロテインＡに結合しない。

【0239】

いくつかの実施形態では、Ｖ_２は、ＶＨ１及び／又はＶＨ２及び／又はＶＨ４及び／又はＶＨ５及び／又はＶＨ６を含むか、又はそれらからなり、ＶＨ３ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、Ｖ_２は、プロテインＡに結合しないＶＨ３ドメイン又はその変異体を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｖ_２は、プロテインＡに結合することができない天然に存在するＶＨ３ドメインを含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、プロテインＡに結合しないＶＨ３ドメインの変異体は、天然に存在するＶＨ３の変異体であり、当該天然に存在するＶＨ３ドメインは、プロテインＡに結合することができる。

【0240】

ヒトＶＨ３生殖細胞系遺伝子及びＶＨ３ドメイン（又はフレームワーク）は、十分に特徴付けられている。天然に存在するＶＨ３ドメインの多くはプロテインＡに結合する能力を有するが、特定の天然に存在するＶＨ３ドメインはプロテインＡに結合する能力を有しない（Ｒｏｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１５４（１２）：６４３７－６４４５を参照されたい）。

【0241】

本開示で使用するためのＶＨ３ドメインは、いくつかの方法によって得ることができる。一実施形態では、本開示で使用するためのＶＨ３ドメインは、本開示のポリペプチド（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）内のその位置に応じて、プロテインＡに結合する能力又は不能性について選択される、天然に存在するＶＨ３ドメインである。例えば、非ヒト動物の免疫化によって目的の抗原に対して抗体のパネルを生成し、次いでヒト化し、ヒト化抗体をスクリーニングし、例えばプロテインＡアフィニティカラムに対して、ヒト化ＶＨ３ドメインを介してプロテインＡに結合する能力又は不能性に基づいて選択することができる。或いは、ディスプレイ技術（例えば、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイ、哺乳動物細胞表面ディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ）を使用して、抗体ライブラリをスクリーニングし、特にＣＤＲを含まないプロテインＡ結合界面を介してプロテインＡに結合するか又は結合しないＶＨ３ドメインを含む抗体を選択することができる。

【0242】

或いは、本開示で使用するためのＶＨ３ドメインは、天然に存在するＶＨ３の変異体である。一実施形態では、ＶＨ３変異体は、プロテインＡに結合することができる天然に存在するＶＨ３の配列を含み、プロテインＡに結合するその能力を消失させる少なくとも１つのアミノ酸変異を更に含む。一実施形態では、プロテインＡに結合するＶＨ３変異体は、プロテインＡに結合することができない天然に存在するＶＨ３の配列を含み、少なくとも１つのアミノ酸変異を更に含む。そのような実施形態では、変異は、ＶＨ３ドメインがプロテインＡに結合する能力を得ることに関与し、すなわち変異は、天然には存在しなかったプロテインＡ結合ドメインの生成に寄与する。

【0243】

一実施形態では、ＶＨ３変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又はは１２個のアミノ酸変異を含む。一実施形態では、ＶＨ３変異体は、ＶＨ３上の１５、１７、１９、５７、５９、６４、６５、６６、６８、７０、８１又は８２の位置に変異を含み、ナンバリングはＫａｂａｔによるものであり、例えば、Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＰＮＡＳ，９７（１０）：５３９９－５４０４に記載されている。変異は、置換、欠失又は挿入であってもよい。一実施形態では、ＶＨ３変異体は、ＶＨ３上の１５、１７、１９、５７、５９、６４、６５、６６、６８、７０、８１又は８２の位置に置換を含み、ナンバリングはＫａｂａｔによるものである。

【0244】

天然に存在するＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ４、ＶＨ５及びＶＨ６は、プロテインＡに結合しない。一実施形態では、プロテインＡに結合しないＶ_Ｈドメインは、ＶＨ１である。一実施形態では、プロテインＡに結合しないＶ_Ｈドメインは、ＶＨ２である。一実施形態では、プロテインＡに結合しないＶ_Ｈドメインは、ＶＨ４である。一実施形態では、プロテインＡに結合しないＶ_Ｈドメインは、ＶＨ５である。一実施形態では、プロテインＡに結合しないＶ_Ｈドメインは、ＶＨ６である。

【0245】

医薬組成物、投与量及び投与レジメン
本発明の多重特異性抗体は、医薬組成物中に提供することができる。医薬組成物は通常無菌であり、典型的には薬学的に許容される担体及び／又はアジュバントを含む。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体を更に含むことができる。

【0246】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」としては、生理学的に適合性である、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。担体は、例えば注射又は注入による非経口、例えば静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口投与経路に適してもよい。或いは、担体は、局所、表皮又は粘膜投与経路などの非経口投与に適してもよい。担体は、経口投与に適してもよい。投与経路に応じて、モジュレータは、化合物を不活性化することができる酸及び他の自然条件の作用から化合物を保護するために材料でコーティングすることができる。

【0247】

本発明の医薬組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容される塩を含むことができる。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、いかなる望ましくない毒物学的効果も付与しない塩を指す。そのような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。

【0248】

薬学的に許容される担体は、水性担体又は希釈剤を含む。本発明の医薬組成物に使用することができる適切な水性担体の例としては、水、緩衝水及び生理食塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが望ましい。

【0249】

治療用組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。

【0250】

本発明の医薬組成物は、追加の活性成分を含むことができる。

【0251】

本発明の抗体又は調節剤を含むキット及び使用説明書も本発明の範囲内である。キットは、１つ又は複数の追加の試薬、例えば上記の追加の治療薬又は予防薬を更に含むことができる。

【0252】

本発明のモジュレータ及び／又は抗体若しくはその製剤又は組成物は、予防的処置及び／又は治療的処置のために投与することができる。

【0253】

治療用途では、化合物は、上記の障害又は状態に既に罹患している対象に、その状態又は１つ又は複数のその症状を治癒、緩和又は部分的に停止させるのに十分な量で投与される。そのような治療的処置は、疾患症状の重症度の低下、又は無症状期間の頻度若しくは持続期間の増加をもたらすことができる。これを達成するのに十分な量を「治療有効量」と定義する。

【0254】

予防的適用では、製剤は、上記の障害又は状態のリスクがある対象に、状態若しくは１つ又は複数のその症状のその後の効果を予防又は低減するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量を「予防有効量」と定義する。各目的のための有効量は、疾患又は損傷の重症度並びに対象の体重及び一般状態に依存する。

【0255】

投与対象は、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。ヒトへの投与が典型的である。

【0256】

本発明の抗体／モジュレータ又は医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法の１つ又は複数を使用して、１つ又は複数の投与経路を介して投与することができる。当業者によって理解されるように、投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変化する。本発明の化合物又は医薬組成物の投与経路の例としては、例えば注射又は注入による、静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射によるものである。或いは、本発明の抗体／調節剤又は医薬組成物は、局所、表皮又は粘膜投与経路などの非経口経路を介して投与することができる。本発明の抗体／調節剤又は医薬組成物は、経口投与用であってもよい。

【0257】

本発明の抗体／調節剤又は医薬組成物の適切な投与量は、当業者によって決定することができる。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対して有毒になることなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化することができる。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態及び以前の病歴、並びに医学分野で周知の同様の因子を含む様々な薬物動態学的因子に依存する。

【0258】

適切な用量は、例えば、治療される患者の約０．０１μｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、典型的には約０．１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよい。例えば、適切な投与量は、約１μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日又は約１０μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ体重／日であってもよい。

【0259】

投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整することができる。例えば、単回用量を投与することができ、いくつかの分割用量を経時的に投与することができ、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少又は増加させることができる。本明細書で使用される投薬単位形態は、治療される対象のための単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体と会合して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。

【0260】

投与は、単回投与又は複数回投与であってもよい。複数回投与は、同じ又は異なる経路を介して、同じ又は異なる位置に投与することができる。或いは、用量は徐放性製剤を介したものであってもよく、この場合、必要とされる投与頻度はより少ない。投与量及び頻度は、患者におけるアンタゴニストの半減期及び所望の治療期間に応じて変化することができる。

【0261】

上述のように、本発明のモジュレータ／抗体又は医薬組成物は、１つ又は複数の他の治療薬と同時投与することができる。

【0262】

２つ以上の薬剤の併用投与は、いくつかの異なる方法で達成することができる。両方を単一の組成物で一緒に投与することができ、又は併用療法の一部として別々の組成物で投与することができる。例えば、一方は、他方の前、後又は同時に投与することができる。

【0263】

治療適応症
本発明の抗体は、ＩＬ－１３及び／又はＩＬ－１７Ａ及び／又はＩＬ－１７Ｆ活性に関連する任意の状態、例えば、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ及び／又はＩＬ－１７Ｆ受容体を介したシグナル伝達から全体的又は部分的に生じる任意の状態の治療、予防又は改善において使用することができる。

【0264】

そのような疾患としては、原発性及び転移性の癌が挙げられ、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌及び胆管癌、小腸癌、尿路癌（腎臓、膀胱及び尿路上皮を含む）、女性生殖器癌（子宮頸部、子宮及び卵巣並びに絨毛癌及び妊娠性絨毛性疾患を含む）、男性生殖器癌（前立腺、精嚢、精巣及び生殖細胞腫瘍を含む）、内分泌腺癌（甲状腺、副腎、及び下垂体腺を含む）及び皮膚癌、並びに血管腫、黒色腫、肉腫（骨及び軟組織から生じるもの並びにカポジ肉腫を含む）、脳、神経、眼及び髄膜の腫瘍（星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン細胞腫及び髄膜腫を含む）、白血病及びリンパ腫などの造血器悪性腫瘍から生じる固形腫瘍（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫の両方）、関節リウマチ、骨関節炎、若年性慢性関節炎、化膿性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、アレルギー性疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、臓器移植に伴う急性又は慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固、川崎病、グレーブス病、腎症候群、慢性疲労症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッフ・シェンライン病、腎臓の微細血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染症、寄生虫症、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、アジソン病、散発性多腺性欠乏症Ｉ型及び多腺性欠乏症ＩＩ型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸窮迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸炎性滑膜炎、クラミジア、エルシニア及びサルモネラ関連関節症、アテローム性疾患／動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎／慢性疲労症候群、慢性皮膚粘膜カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、突発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全関連疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、女性不妊、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、線維性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織病関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス関連肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、シェーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、血鉄症関連肺疾患、薬物誘発性間質性肺疾患、線維症、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球性浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫又はルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、自己免疫性低血糖、黒色表皮症を伴うＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、骨関節症、原発性硬化性胆管炎、１型乾癬、２型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患ＮＯＳ、糸球体腎炎、腎臓の顕微鏡的血管炎、ライム病、円板状エリテマトーデス、男性不妊特発性又はＮＯＳ、精子自己免疫、多発性硬化症（全サブタイプ）、交感性眼炎、結合組織病に続発する肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発性動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スチル病、全身性硬化症、シェーグレン症候群、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液浮腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑性急性肝疾患、慢性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール誘発性肝損傷、胆汁うっ滞、特発性肝疾患、薬物誘発性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、アレルギー、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ 感染症、精神障害、うつ病、統合失調症、Ｔｈ２型及びＴｈ１型媒介性疾患、急性及び慢性疼痛、疼痛の異なる形態、癌、肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、造血性悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、無βリポタンパク血症、先端チアノーゼ、急性及び慢性寄生虫又は感染プロセス、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性又は慢性細菌感染症、急性膵炎、急性腎不全、腺癌、空気異所性拍動、ＡＩＤＳ認知症合併症、アルコール誘発性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（季節性アレルギー性鼻炎を含む）、非アレルギー性鼻炎、同種移植片拒絶、α－Ｉ－アンチトリプシン欠損症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、狭心症、前角細胞変性症、抗ｃｄ３療法、抗リン脂質症候群、抗受容体過敏反応、大動脈及び末梢動脈瘤、大動脈解離、動脈高血圧症、動脈硬化症、動静脈瘻、運動失調、心房細動（持続性又は発作性）、心房粗動、房室ブロック、Ｂ細胞リンパ腫、骨移植片拒絶、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶、脚ブロック、バーキットリンパ腫、熱傷、不整脈、心機能不全症候群、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症応答、軟骨移植拒絶、小脳皮質変性症、小脳疾患、無秩序又は多源性心房頻脈、化学療法関連障害、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性アルコール依存症、慢性炎症性病態、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸癌、うっ血性心不全、結膜炎、接触性皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツフェルトヤコブ病、培養陰性敗血症、嚢胞性線維症、サイトカイン療法関連障害、拳闘家認知症、脱髄性疾患、デング出血熱、皮膚炎、皮膚病、糖尿病、真性糖尿病、糖尿病性動脈硬化性疾患、びまん性レビー小体病、拡張型うっ血性心筋症、基底核の障害、中年期のダウン症候群、ＣＮＳドーパミン受容体をブロックする薬物によって誘発される薬物誘導性運動障害、薬物感受性、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌障害、喉頭蓋炎、エプスタイン・バーウイルス感染症、紅痛症、錐体外路障害及び小脳障害、家族性血球貪食性リンパ組織球症、胎児胸腺移植片拒絶、フリードライヒ運動失調症、機能性末梢動脈障害、真菌性敗血症、ガス壊疽、胃潰瘍、糸球体腎炎、任意の臓器又は組織の移植片拒絶、グラム陰性敗血症、グラム陽性敗血症、細胞内生物による肉芽腫、ヘアリー細胞白血病、ハラーフォルデン・シュパッツ病、橋本病、花粉症、心臓移植拒絶、ヘモクロマトーシス、血液透析、溶血性尿毒症症候群／血栓溶解性血小板減少性紫斑病、出血、Ａ型肝炎、ヒス束性不整脈、ＨＩＶ感染／ＨＩＶニューロパシー、ホジキン病、多動性運動障害、過敏反応、過敏性肺炎、高血圧症、運動不足性運動機能低下症、視床下部・下垂体・副腎皮質系、特発性アジソン病、特発性肺線維症、抗体媒介性細胞傷害性、無力症、乳児脊髄性筋萎縮症、大動脈の炎症、インフルエンザ、電離放射線被曝、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、虚血－再灌流傷害、虚血性脳卒中、若年性関節リウマチ、若年性脊髄性筋萎縮症、カポジ肉腫、腎移植拒絶、レジオネラ、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系の病変、肝移植拒絶、リンパ水腫、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球増加症、悪性黒色腫、髄膜炎、髄膜炎菌血症、代謝性／特発性、片頭痛、ミトコンドリア性多臓器疾患、混合性結合組織病、モノクローナル高γグロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性症（Ｍｅｎｃｅｌ Ｄｅｊｅｒｉｎｅ－Ｔｈｏｍａｓ Ｓｈｉ－Ｄｒａｇｅｒ及びＭａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ）、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、結核菌、骨髄異形成症候群、心筋梗塞、心筋虚血性障害、上咽頭癌、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経原性筋萎縮症、好中球減少性発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈及びその分岐部の閉塞、閉塞性動脈障害、ｏｋｔ３治療、精巣炎／精巣上体炎、精巣炎／精管切除反転処置、臓器肥大、骨粗鬆症、膵臓移植拒絶、膵臓癌、腫瘍随伴症候群／悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症、副甲状腺移植拒絶、骨盤内炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢動脈硬化性疾患、末梢血管障害、腹膜炎、悪性貧血、ニューモシスチス・カリニ肺炎、肺炎、ＰＯＥＭＳ症候群（多発神経障害、臓器肥大、内分泌疾患、モノクローナル高γグロブリン血症及び皮膚変化症候群）、灌流後症候群、ポンプ後症候群、Ｍｌ心臓切開後症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺高血圧症、放射線療法、レイノー現象及び疾患、レイノー病、レフサム病、正常ＱＲＳ波の規則的な頻脈、腎血管性高血圧症、再灌流傷害、拘束性心筋症、肉腫、老人性舞踏病、レビー小体型老人性認知症、血清反応陰性関節症、ショック、鎌状赤血球貧血、皮膚同種移植片拒絶、皮膚症状症候群、小腸移植拒絶、固形腫瘍、特異的不整脈、脊髄運動失調、脊髄小脳変性、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造病変、亜急性硬化性汎脳炎、失神、心血管系の梅毒、全身性無髄軸、全身性炎症反応症候群、全身発症若年性関節リウマチ、Ｔ細胞又はＦＡＢ ＡＬＬ毛細血管拡張症、閉塞性血栓血管炎、血小板減少症、毒性、移植片、外傷／出血、ＩＩＩ型過敏症反応、ＩＶ型過敏症、不安定狭心症、尿毒症、尿路敗血症、心臓弁膜症、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルス感染及び真菌感染、ウイルス性脳炎（ｖｉｔａｌ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）／無菌性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群（ｖｉｔａｌａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｍａｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ウィルソン病、任意の臓器又は組織の異種移植片拒絶、急性冠動脈症候群、急性特発性多発性神経炎、急性炎症性脱髄性多発神経炎、急性虚血、成人スチル病、アナフィラキシー、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、連鎖球菌感染に関連する自己免疫障害、自己免疫性腸症、自己免疫性難聴、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫心筋炎、自己免疫性早発性卵巣不全、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、心血管疾患、突発性抗リン脂質症候群、セリアック病、頸椎症、慢性虚血、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症のリスクを伴う臨床的に孤立した症候群（シス）、小児期発症の精神障害、涙嚢炎、皮膚筋炎、糖尿病性網膜症、椎間板ヘルニア、円板隆起、薬物誘発性免疫性溶血性貧血、子宮内膜症、眼内炎、上強膜炎、多形性紅斑、多形性紅斑重症型、妊娠性類天疱瘡、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、ヒューズ症候群、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、ＩｇＥ媒介性アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染性眼炎症性疾患、炎症性脱髄性疾患、炎症性心疾患、炎症性腎臓疾患、ＩＰＦ／ＵＩＰ、虹彩炎、角膜炎、乾性角結膜炎、クスマウル病又はクスマウル・マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞組織球症、網状皮斑、黄斑変性、顕微鏡的多発血管炎、強直性脊椎炎、運動ニューロン障害、粘膜類天疱瘡、多臓器不全、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋炎、神経根障害、ニューロパチー、非Ａ型非Ｂ型肝炎、視神経炎、骨溶解、少関節型ＪＲＡ、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、静脈炎、結節性多発動脈炎（又は結節性動脈周囲炎）、多発性軟骨炎、ポリオ、多関節型ＪＲＡ、多発性内分泌不全症候群、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、原発性パーキンソニズム、前立腺炎、純粋赤血球形成不全、原発性副腎機能不全、再発性視神経脊髄炎、再狭窄、リウマチ性心疾患、ＳＡＰＨＯ（滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨増殖症及び骨炎）、続発性アミロイドーシス、ショック肺、強膜炎、坐骨神経痛、
続発性副腎機能不全、シリコーン関連結合組織疾患、スニドン・ウィルキンソン皮膚病、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、側頭動脈炎、トキソプラズマ網膜炎、中毒性表皮壊死症、横断性脊髄炎、ＴＲＡＰＳ（腫瘍壊死因子受容体、１型アレルギー反応、ＩＩ型糖尿病、蕁麻疹、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、血管炎、春季結膜炎、ウイルス性網膜炎、フォークト・小柳・原田症候群（ＶＫＨ症候群）、滲出型黄斑変性、又は創傷治癒、アスピリン過敏性喘息、アトピー性喘息、慢性手湿疹、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、セリアック病、チャーグ・ストラウス症候群（結節性動脈周囲炎＋アトピー）、好酸球増加筋痛症候群、好酸球増加症候群、偶発性血管浮腫を含む浮腫性反応、蠕虫感染症、毛嚢性皮膚炎、好酸球関連胃腸障害、好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性腸炎、好酸球性大腸炎、鼻マイクロポリポーシス及びポリポーシス、食物アレルギー、アスピリン不耐性、及び閉塞性睡眠時無呼吸、慢性喘息、クローン病及び心筋内膜線維症、癌（例えば、膠芽腫（多形性膠芽腫など）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））、線維症、炎症性腸疾患、肺線維症（特発性肺線維症（ＩＰＦ）、及び硬化症に続発する肺線維症を含む）、ＣＯＰＤ、及び肝線維症が挙げられる。

【0265】

本発明の多重特異性抗体は、アトピー性皮膚炎、慢性手湿疹、鼻マイクロポリポーシス若しくはポリポーシス、食物アレルギー、又は好酸球性食道炎の治療又は予防に特に有用である可能性がある。したがって、一実施形態では、本発明の多重特異性抗体又は医薬組成物は、治療によるヒト又は動物の身体の治療方法における使用のために提供される。一実施形態では、アトピー性皮膚炎、慢性手湿疹、鼻マイクロポリポーシス若しくはポリポーシス、食物アレルギー、又は好酸球性食道炎を治療する方法における使用のための多重特異性抗体又は医薬組成物が提供される。一実施形態では、本発明は、治療有効量の多重特異性抗体又は医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、アトピー性皮膚炎、慢性手湿疹、鼻マイクロポリポーシス若しくはポリポーシス、食物アレルギー、又は好酸球性食道炎を治療又は予防する方法を提供する。

【0266】

以下の例は、本発明を例示する。

【0267】

例
例１ 治療用抗ＩＬ－１３抗体ＣＡ６５０の作製及び選択
ラットを、精製ヒトＩＬ－１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）又はヒトＩＬ－１３を発現するラット線維芽細胞（培養上清中に約１ｕｇ／ｍｌを発現する）のいずれか、又は場合によってはこれら２つの組み合わせで免疫化した。３～６回の注射の後、動物を屠殺し、ＰＢＭＣ、脾臓、骨髄及びリンパ節を採取した。血清を、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＩＬ－１３への結合について、また、ＨＥＫ－２９３ ＩＬ－１３Ｒ－ＳＴＡＴ－６レポーター細胞アッセイ（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）においてｈＩＬ－１３を中和する能力について監視した。

【0268】

Ｂ細胞培養物を準備し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＦＭＡＴアッセイにおけるビーズに基づくアッセイにおいて、ｈＩＬ－１３に結合するそれらの能力について上清を最初にスクリーニングした。これは、ストレプトアビジンビーズ上にコーティングされたビオチン化ヒトＩＬ－１３及びリビール剤としてヤギ抗ラットＦｃ－Ｃｙ５コンジュゲートを使用した均一アッセイであった。次いで、このアッセイからの陽性をＨＥＫ－２９３ ＩＬ－１３Ｒ－ＳＴＡＴ－６レポーター細胞アッセイ（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に進めて中和剤を同定した。次いで、中和上清をＢｉａｃｏｒｅでプロファイリングして、オフレートを推定し、また中和の作用様式を特徴付けた。中和をビン１又はビン２のいずれかに分類した。Ｂｉｎ１は、ヒトＩＬ－１３に結合し、ＩＬ－１３Ｒα１の結合を防止し、その結果、ＩＬ－４Ｒの結合もブロックする抗体を表す。Ｂｉｎ１抗体はまた、ＩＬ－１３のＩＬ－１３Ｒα２への結合を阻害することができる。Ｂｉｎ２は、ＩＬ－１３Ｒα１への結合を可能にするが複合体へのＩＬ－４Ｒの動員を阻害するようにｈＩＬ－１３に結合する抗体を表す。本発明者らは、Ｂｉｎ１を介して作用する抗体を選択していた。

【0269】

合計２７×１００プレートＳＬＡＭ実験からの一次ＦＭＡＴスクリーニングにおいて、約７５００個のＩＬ－１３特異的陽性が同定された。８００ウェルは、ＨＥＫ－青色アッセイにおいて中和を実証した。１７０ウェルは、望ましいＢｉａｃｏｒｅプロファイル、すなわち、５×１０^－４ ｓ^－１未満のオフレートを有するビン１抗体を有していた。これらの１７０ウェルからの可変領域クローニングを試みたところ、１６０個が蛍光フォーカスを得ることに成功した。１００ウェルは、逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲ後に重鎖可変領域遺伝子対及び軽鎖可変領域遺伝子対を生成した。これらのＶ領域遺伝子をマウスＩｇＧ１全長抗体としてクローニングし、ＨＥＫ－２９３一過性発現系において再発現させた。配列分析により、抗ヒトＩＬ－１３抗体の２７のユニークなファミリーが存在することが明らかにされた。次いで、これらの組換え抗体を、細胞ベースアッセイにおいて、組換えｈＩＬ－１３（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来及び哺乳動物由来）、組換え変異体ｈＩＬ－１３（Ｒ１３０ Ｑ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来）、天然の野生型及び変異体ｈＩＬ－１３（ヒトドナー由来）並びにカニクイザルＩＬ－１３（哺乳動物由来）をブロックする能力について再試験した。組換え抗体もまた、Ｂｉａｃｏｒｅにおいて変異体ヒトＩＬ－１３（Ｒ１３０Ｑ）及びカニクイザルＩＬ－１３に結合するそれらの能力について試験した。この特徴付けの後、抗体ファミリーを、本発明者らの基準を満たすように、すなわち、全てのヒトＩＬ－１３調製物及びカニクイザルＩＬ－１３調製物に対する効力及び親和性の低下が最小限である１００ｐＭ未満の抗体を満たすように選択した。

【0270】

ヒト化移植片における中和効力、親和性及びドナー含量に基づいて（下記参照）、ヒト化ＣＡ６５０を更に進行のために選択した。

【0271】

例２ 抗体ＣＡ６５０のヒト化
ラットＶ領域からのＣＤＲをヒト生殖細胞系抗体Ｖ領域フレームワークに移植することによって、抗体６５０をヒト化した。抗体の活性を回復するために、ラットＶ領域からのいくつかのフレームワーク残基もヒト化配列に保持した。これらの残基は、Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．国際公開第９１／０９９６７号）によって概説されたプロトコルを用いて選択した。設計されたヒト化配列と共に、ラット抗体（ドナー）Ｖ領域配列とヒト生殖細胞系（アクセプター）Ｖ領域配列とのアラインメントを図１に示す。（図１（Ａ）軽鎖移植片６５０及び図１（Ｂ）重鎖移植片６５０）。ドナーからアクセプター配列に移植されたＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔの組合せ定義が使用されるＣＤＲ－Ｈ１（Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．国際公開第９１／０９９６７号を参照されたい）を除いて、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７）によって定義される通りである。

【0272】

初期Ｖ領域配列をコードする遺伝子を設計し、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ ＧｍｂＨによる自動合成アプローチによって構築し、オリゴヌクレオチド指向型変異誘発によって移植片化バージョンｇＬ８及びｇＨ９を生成するように修飾した。ｇＬ８配列を、ヒトＣ－κ定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含むＵＣＢ Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒト軽鎖発現ベクターｐＶｈＣＫにサブクローニングした。ｇＨ９配列を、ヒト重鎖ガンマ－１ ＣＨ_１定常領域をコードするＤＮＡを含むｐＶｈｇ１Ｆａｂにサブクローニングした。

【0273】

ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１－３９＋ＪＫ２ Ｊ領域（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を、抗体６５０軽鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択した。移植片ｇＬ８中の軽鎖フレームワーク残基は全て、ドナー残基イソロイシン（Ｉ５８）及びチロシン（Ｙ７１）がそれぞれ保持された残基５８及び７１（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を除いて、ヒト生殖細胞系遺伝子に由来する。残基Ｉ５８及びＹ７１の保持は、ヒト化抗体の完全な効力に必須であった。

【0274】

ヒトＶ領域ＩＧＨＶ１－６９＋ＪＨ４ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を、抗体６５０の重鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択した。移植片ｇＨ９中の重鎖フレームワーク残基は全て、ドナー残基アラニン（Ａ６７）、フェニルアラニン（Ｆ６９）及びバリン（Ｖ７１）がそれぞれ保持された残基６７、６９及び７１（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を除いて、ヒト生殖細胞系遺伝子に由来する。残基Ａ６７、Ｆ６９及びＶ７１の保持は、ヒト化抗体の完全な効力に必須であった。ヒトフレームワークの１位のグルタミン残基をグルタミン酸（Ｅ１）で置換して、均一な生成物の発現及び精製をもたらし、抗体及び抗体断片のＮ末端でのグルタミンからピログルタミン酸への変換は広く報告されている。最終的に選択された可変移植片配列ｇＬ８及びｇＨ９をそれぞれ図１（Ａ）及び図１（Ｂ）に示す。

【0275】

抗体６５０のＣＤＲ、重鎖及び軽可変領域、ｓｃＦｖ及びｄｓｓｃＦＶフォーマットをコードするアミノ酸及びＤＮＡ配列を図２に示す。

【0276】

例３ 抗ＩＬ－１７ ＡＦ抗体４９６．ｇ３の作製
ヒトＩＬ－１７Ａ及びヒトＩＬ－１７Ｆに対する抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３（本明細書では抗体４９６．ｇ３とも呼ばれる）の産生は、国際公開第２０１２／０９５６６２号に以前に記載されている。抗体は、ヒトＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ及びＩＬ－１７Ａ／Ｆヘテロ二量体にｐＭの親和性で結合する。抗体４９６．ｇ３のＦａｂフォーマットのＣＤＲ、重鎖及び軽可変領域並びに軽鎖及び重鎖をコードするアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を図２に示す。４９６．ｇ３（ＩＬ－１７Ａ／Ｆ結合）Ｆａｂ定常領域は、ヒトＣ－κ定常領域（Ｋ１ｍ３アロタイプ）並びにヒトγ－１ ＣＨ_１定常領域及びヒンジ（Ｇ１ｍ１７アロタイプ）を含んでいた。

【0277】

例４ 抗ヒトアルブミン抗体６４５の作製
抗ヒトアルブミン抗体６４５の産生は、国際公開第２０１３／０６８５７１号に以前に記載されている。抗体６４５のＣＤＲ、重鎖及び軽可変領域、ｓｃＦｖ及びｄｓｓｃＦＶフォーマットをコードするアミノ酸及びＤＮＡ配列を図２に示す。

【0278】

例５ 多重特異性抗体ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ－一過性プラスミドの構築及び細胞における発現。
Ｆａｂ位置に固定された抗ＩＬ－１７ＡＦＶ領域（４９６．ｇ３）を用いて多重特異性抗体を設計し、抗アルブミンＶ領域（６４５ｇＬ４ｇＨ５）及びＩＬ－１３（１５３９ｇＬ８ｇＨ９）を、ＨＬ配向（ｄｓＨＬ）でジスルフィド結合ｓｃＦｖに再フォーマット化し、１１アミノ酸グリシン－セリンリッチリンカーを介してＦａｂのそれぞれの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のＣ末端に結合させた。（図７）多重特異性抗体の全長重鎖及び軽鎖をコードするアミノ酸及びＤＮＡ配列を図２に示す。

【0279】

軽鎖及び重鎖遺伝子を、ｈＣＭＶプロモーターの制御下での一過性発現のために哺乳動物発現ベクターに独立してクローニングした。等しい比率の両方のプラスミドを、市販のＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ一過性発現キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＣＨＯ－Ｓ ＸＥ細胞株（ＵＣＢ）にトランスフェクトした。培養物を、通気キャップを備えたＣｏｒｎｉｎｇローラーボトル内で３７℃、８．０％ＣＯ_２、１９０ｒｐｍでインキュベートした。１８～２２時間後、培養物に、製造業者によって提供された適切な容量のＣＨＯエンハンサー及びＨｉＴｉｔｅｒ法のための供給物を供給した。培養物を３２℃、８．０％ＣＯ_２、１９０ｒｐｍで更に１０～１２日間再インキュベートした。４℃で１時間、４０００ｒｐｍで遠心分離することによって上清を回収した後、０．４５μｍ、続いて０．２μｍのフィルターで濾過滅菌した。発現力価を、１ｍｌのＧＥ ＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び本発明者らが作製したＦａｂ標準を使用してプロテインＧ ＨＰＬＣによって定量した。発現力価を表１に示す。

【表1】

【0280】

例６ ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体－哺乳動物細胞株の発達。
ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体の安定な発現を実証するために、安定に発現する哺乳動物細胞株を作製した。ＣＨＯ細胞株を、４９６．ｇ３ Ｆａｂ、１５３９ｇＨ９ｇＬ８ ｄｓｓｃＦｖ ＨＬ（ＬＣ、ＩＮＳ００２５６０９）、６４５ｇＨ５ｇＬ４ ｄｓｓｃＦｖ ＨＬ（ＨＣ、ＩＮＳ００２５３０６）及び選択マーカーを含有するベクターでトランスフェクトした。細胞株をクローニングし、適切な製造プロセスへの適合について評価した。タンパク質の質及び量を評価し、最適な細胞株が選択されたことを確実にするために、細胞株を製造流加バイオリアクターの小規模モデルにおいて評価した。１．８ｇ／Ｌ超及び７５％超の単量体でＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体を発現するＣＨＯ細胞株を選択した。

【0281】

例７ ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体の精製方法。
多重特異性抗体タンパク質を、未変性プロテインＡ捕捉工程、続いて分取サイズ排除研磨工程によって精製した。標準的な一過性ＣＨＯ発現からの清澄化上清をＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにロードして５分間接触させ、結合緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。結合した物質を０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ３．１段階溶出で溶出し、２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．５で中和し、２８０ｎｍでの吸光度によって定量した。

【0282】

サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥ－ＵＰＬＣ）を使用して、溶出生成物の純度状態を決定した。抗体（約２μｇ）をＢＥＨ２００、２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍＩＤ×３００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ）にロードし、０．３５ｍＬ／分で０．２ＭホスファートｐＨ７の定組成勾配で展開した。連続検出は、２８０ｎｍでの吸光度及びマルチチャネル蛍光（ＦＬＲ）検出器（Ｗａｔｅｒｓ）によるものであった。溶出した多重特異性抗体は７２％単量体であることが見出された。

【0283】

中和された試料を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５濃縮器（１０ｋＤａの分子量カットオフ膜）を使用して濃縮し、スイングアウトロータにおいて４０００ｘｇで遠心分離した。濃縮した試料を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化したＸＫ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４の定組成勾配を用いて１ｍｌ／分で展開した。画分を回収し、ＢＥＨ２００、２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍＩＤ×３００ｍｍカラム（Ａｑｕｉｔｙ）でサイズ排除クロマトグラフィによって分析し、０．３５ｍＬ／分で０．２ＭホスファートｐＨ７の定組成勾配で展開し、２８０ｎｍでの吸光度及びマルチチャネル蛍光（ＦＬＲ）検出器（Ｗａｔｅｒｓ）によって検出した。選択された単量体画分をプールし、０．２２μｍ滅菌濾過し、最終試料をＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６（Ｔｒｉｎｅａｎ）でのＡ２８０走査によって濃度についてアッセイした。Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）試験カートリッジを備えたＣｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒのＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）ポータブル試験システムによって評価したところ、エンドトキシンレベルは１．０ＥＵ／ｍｇ未満であった。

【0284】

最終的な多重特異性抗体の単量体状態を、ＢＥＨ２００、２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍＩＤ×３００ｍｍカラム（Ａｑｕｉｔｙ）でのサイズ排除クロマトグラフィによって決定し、０．３５ｍＬ／分で０．２ＭホスファートｐＨ７の定組成勾配で展開し、２８０ｎｍでの吸光度及びマルチチャネル蛍光（ＦＬＲ）検出器（Ｗａｔｅｒｓ）によって検出した。最終的な多重特異性抗体は、図３（Ａ）に示すように９９％超の単量体であることが見出された。

【0285】

ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による分析のために、４×ＮｏｖｅｘＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１０×ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は１００ｍＭ Ｎ－エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかを約５μｇの精製タンパク質に添加することによって試料を調製し、３分間１００℃に加熱した。試料を１０ウェルＮｏｖｅｘ ４～２０％Ｔｒｉｓ－グリシン１．０ｍｍ ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードし、Ｔｒｉｓ－グリシンＳＤＳ泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、２２５Ｖの定電圧で４０分間分離した。Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質標準（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を標準として使用した。ゲルをクマシークイック染色（Ｇｅｎｅｒｏｎ）で染色し、蒸留水中で脱色した。

【0286】

非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、多重特異性抗体の理論分子量（ＭＷ）は約１００ｋＤａであり、約１２０ｋＤａに移動した。多重特異性抗体タンパク質が還元されると、両方の鎖は、それぞれの理論上の分子量である重鎖（ＨＣ）約５２ｋＤａ及び軽鎖（ＬＣ）約５１ｋＤａに近づく移動度で移動した。約４５～５０ｋＤａの非還元ゲル上の更にバンドは、分子のＦａｂ部分のジスルフィド結合を欠く「遊離」ＬＣ及びＨＣであり、完全に還元されていないので、レーン２のＬＣ及びＨＣと同じ位置に移動しない。（図３（Ｂ））

【0287】

例８ ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体分子の抗原結合。
（ｉ）抗原結合親和性
ヒト及びカニクイザルＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ、ＡＦ、Ｆ及びアルブミンの結合動態を表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）によって評価した。

【0288】

ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、アミンカップリング化学を介してＣＭ５センサーチップ上に約５０００ＲＵのレベルに固定化した。各分析サイクルは、抗Ｆ（ａｂ’）_２表面へのＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ／アルブミン多重特異性抗体分子の捕捉、分析物の注入（２５℃、流速３０μｌ／分）、その後の表面再生からなった。ヒト及びカニクイザル分析物を、ＩＬ－１３については１０ｎＭ～０．３１２５ｎＭ、ＩＬ－１７Ａ、ＡＦ、Ｆについては５ｎＭ～０．１５６ｎＭ、アルブミンについては１００ｎＭ～３．１２５ｎＭの濃度で、ＨＢＳ－ＥＰ＋泳動緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に２倍段階希釈で注入した。ヒトＩＬ－１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カニクイザルＩＬ－１３（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及びヒト血清アルブミン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を除いて、抗原を本発明者らが調製した。装置ノイズ及びドリフトを差し引くために、緩衝液ブランク注入を含めた。

【0289】

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（バージョン３．０）を使用して１：１結合モデルを使用して速度論的パラメータを決定し、表２（１）及び２（２）に要約した。解離速度（ｋ_ｄ）が１．０×１０^－５未満として測定された場合、それらを１．０×１０^－５（製造業者ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって定義されるＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置の検出限界）に固定して、親和性（Ｋ_Ｄ）を計算した。

【0290】

結果は、多重特異性抗体がヒト及びカニクイザルのＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７ＡＦ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１３及びアルブミンに効果的に結合することを実証した。

【表2】

【表3】

【0291】

（ｉｉ）同時抗原結合
表面プラズモン共鳴を使用して、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１３及びアルブミンが、ヒト又はカニクイザルのいずれかの形態のタンパク質を使用してＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体に同時に結合することができることを実証した。

【0292】

分析物のＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体への同時結合を評価するための方法フォーマットは、抗体試料を固定化抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片特異的抗体に捕捉することであった。次いで、ヒト又はカニクイザルＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ及びアルブミンを、捕捉されたＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体（最終濃度は３０ｎＭ ＩＬ－１３、１５ｎＭ ＩＬ－１７Ａ、１５０ｎＭアルブミン）上に、単独で、又は３つ全ての分析物の混合溶液中に（３０μｌ／分で３００秒間）注入した。

【0293】

各サイクルの最後に、５０ｍＭ ＨＣｌの６０秒間の注入、続いて５ｍＭ ＮａＯＨの３０秒間の注入及び５０ｍＭ ＨＣｌの最終６０秒間の注入を用いて、１０μｌ／分の流量で表面を再生した。

【0294】

単独で注射した場合の各抗原の結合応答を決定し、個々の応答の合計を、３つ全ての抗原の混合物を注射した場合の結合応答と比較した。

【0295】

ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体に対するヒトＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１３及びアルブミンの混合物の平均結合応答は、個々の結合応答の合計の１００％であり（表３に要約）、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体が各抗原に同時に独立して結合することができたことを示した。

【表4】

【0296】

ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体に対するカニクイザルＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１３及びアルブミンの混合物の平均結合応答は、個々の結合応答の合計の９７％であり（表４に要約）、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体が各抗原に同時に独立して結合することができたことを示した。

【表5】

【0297】

例９ ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体によるＩＬ－１３の中和。
ＨＥＫ２９３ヒトＩＬ４／ＩＬ－１３ＳＥＡＰレポーター細胞株アッセイを使用して、ＩＬ－１３を中和するＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体の活性を評価した。ＳＴＡＴ６経路の活性化時にＳＥＡＰ分泌を測定して、ＩＬ－１３応答を評価した。

【0298】

ＨＥＫ２９３ヒトＩＬ４／ＩＬ－１３ＳＥＡＰレポーター細胞（＃ｈｋｂ－ｉｌ４１３）を、サンディエゴのＩｎｖｉｖｏｇｅｎから入手した。細胞株の培養、凍結及び維持は製造業者のプロトコルに従った。

【0299】

組換えヒトＩＬ－１３を、ミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した（＃２１３－ＩＬＢ）。

【0300】

９６平底ウェル中で刺激時に細胞が約８０％コンフルエントになるように細胞を播種した。

【0301】

細胞を、２５０ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１３と共に３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％で３０分間プレインキュベートした抗体で二連で処理した後、細胞に２４時間添加した。

【0302】

２４時間後、２０μＬの上清を細胞刺激からピペットで取り、製造業者の指示に従って１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－ｂｌｕｅ＃ｒｅｐ－ｑｂｓ（サンディエゴのＩｎｖｉｖｏｇｅｎ）に添加した。

【0303】

可視の色変化勾配が存在するまでアッセイを展開し、分光光度計を使用して６２０ｎｍで吸光度を読み取った。ＩＣ５０を、Ｇｒａｐｈｐａｄプリズム（カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した非線形回帰によって計算した。図４は、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体によるＳＴＡＴ６シグナル伝達の阻害％の代表的なグラフを示す。

【表6】

【0304】

例１０ ヒト及びカニクイザルＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆに対するヒト皮膚線維芽細胞によるＩＬ－６応答におけるＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体の中和効果
この研究の目的は、ヒト初代細胞系におけるヒト及びカニクイザルＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆに対するＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体の中和能を決定することであった。ＩＬ－１７がＴＮＦ－αなどの他のサイトカインと組み合わせて存在する場合、炎症促進性応答が誘導される。したがって、この相乗効果を利用して、ＩＬ－１７及びＴＮＦ－αで刺激した初代正常新生児ヒト皮膚線維芽細胞（ｎＨＤＦ）からＩＬ－６放出アッセイを作成した。

【0305】

ｎＨＤＦからのＩＬ－１７誘導性ＩＬ－６放出を阻害するＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体の能力をこのアッセイで測定した。具体的には、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体（ＩＬ－１７Ａ研究については５０００ｐＭ～０．２５ｐＭの濃度範囲、ＩＬ－１７Ｆ研究については５００，０００ｐＭ～２５ｐＭ）の力価の存在下で、ＴＮＦ－α（２５ｐＭ）と組み合わせたヒト又はカニクイザルＩＬ－１７Ａ（５０ｐＭ）又はＩＬ－１７Ｆ（２５，０００ｐＭ）でｎＨＤＦを刺激した。次いで、得られたＩＬ－６応答を、均一時間分解ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）を使用して測定した。

【0306】

ｎＨＤＦ細胞（Ｓｉｇｍａ＃１０６－０５ｎ）を完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭ Ｌ－グルタミン）中で培養し、標準的な技術を使用して組織培養フラスコ中で維持した。細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１２６０５０３６）を使用して組織培養フラスコから回収した。完全培地（４５ｍｌ）を使用してＴｒｙｐＬＥを中和し、細胞を３００×ｇで３分間遠心分離した。細胞を完全培地（３～５ｍｌ）に再懸濁し、計数し、３．１２５×１０^４細胞／ｍＬの濃度に調整した後、４０μｌ／ウェルで３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３７０１）に添加した。細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で３時間インキュベートしてプレートに接着させた。ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体を、３８４ウェル希釈プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃７８１２８１）中の完全培地中で、ＩＬ－１７Ａに対する評価については５０００ｐＭ～０．２５ｐＭ、及びＩＬ－１７Ｆに対する評価については５００，０００ｐＭ～２５ｐＭの最終濃度範囲に連続希釈した。ヒト又はカニクイザルＩＬ－１７Ａ ５０ｐＭ又はＩＬ－１７Ｆ ２５，０００ｐＭのいずれかと共に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１７サイトカインの混合物を完全培地中でＴＮＦ－α ２５ｐＭの最終濃度に調製した。次いで、３０μｌ／ウェルのこれらの溶液を３８４ウェル試薬プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃７８１２８１）に添加した。次いで、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体段階希釈プレートからの１０μｌを、３０μｌの希釈サイトカインを含有する試薬プレートに移した。次いで、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体をサイトカイン混合物と共に３７℃／５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。インキュベーション後、１０μｌを試薬プレートから細胞を含むアッセイプレートに移した。次いで、アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ_２で１８時間±２時間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、Ｃｉｓｂｉｏ ＩＬ－６ ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ＃６２ＩＬ６ＰＥＢ）からのユウロピウムクリプタート及びＡｌｅｘａ６６５抗体を再構成緩衝液で希釈し、キット添付文書に従って１：１で混合した。続いて、１０μｌ／ウェルのこの抗体混合物を白色低容量３８４ウェルＨＴＲＦプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃７８４０７５）に添加した。次いで、アッセイプレートからの上清を１０μｌ／ウェルでＨＴＲＦプレートに移した。次いで、ＨＴＲＦプレートを穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした。次いで、製造者の説明書に従って、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２プレートリーダでＨＴＲＦプレートを読み取り、３３０／６２０ｎｍ及び３３０／６６５ｎｍの読み取り値で蛍光を測定した。次いで、以下の式（３３０／６６５ｎｍ÷３３０／６２０ｎｍ）×１０，０００を使用して比の値を計算し、これを使用して、対照ウェルと比較した相対阻害率をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して決定した。４ＰＬ曲線フィッティング及びＩＣ_５０値の計算を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０を使用して行った。

【0307】

示される結果は、３つの独立した実験の平均（＋／－ＳＥＭ）である。ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体のＩＣ５０値を、ヒトＩＬ－１７Ａについては４２ｐＭ、カニクイザルＩＬ－１７Ａについては４９ｐＭとして計算した。ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体のＩＣ５０値を、ヒトＩＬ－１７Ｆについては２８，０３０ｐＭ、カニクイザルＩＬ－１７Ｆについては３４，３２０ｐＭと計算した。（図５）

【表7】

【0308】

例１１ ＮＨＥＫ ＣＸＣＬ１放出バイオアッセイにおけるＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体によるＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆの同時中和
このアッセイの目的は、初代細胞系においてＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆを同時に中和するＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体の能力を評価することであった。ＮＨＥＫをＩＬ－１３又はＩＬ－１７Ａ又はＩＬ－１７Ｆで個別に処理すると、それらは、炎症部位への細胞動員に関与するケモカインであるＣＸＣＬ１の分泌を誘導する。アトピー性皮膚炎の状況では、ＣＸＣＬ１が、より低い興奮閾値を有するようにニューロンを感作する役割を有するという証拠がある。この観察は、患者が経験するかゆみに関連する可能性がある（Ｙａｎｇ Ｔ．Ｂ．ａｎｄ Ｋｉｍ Ｂ．Ｓ．２０１９；’’Ｐｒｕｒｉｔｕｓ ｉｎ ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４４（２）：３５３－３６０）。

【0309】

ＮＨＥＫ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、ハイデルベルク）を、製造業者のプロトコルに従って保存、培養及び使用した。４８平底ウェルプレート中で刺激時に１００％コンフルエントになるように細胞を播種した。細胞を漸増濃度の抗ＩＬ－１３、抗ＩＬ－１７Ａ、抗ＩＬ－１７Ｆ又はＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体とそれぞれ３０分間プレインキュベートした後、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１３及び１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１７Ａ、１μｇ／ｍＬのＩＬ－１７Ｆで７２時間処理した。経過時間後、製造業者のプロトコル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ＥＬＩＳＡによるＣＸＣＬ１濃度の定量のために５０μｌの無細胞上清を回収した。各実験群のＩＣ_５０を、Ｇｒａｐｈｐａｄプリズム（カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した非線形回帰によって計算した。

【0310】

結果は、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体がＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆ活性を同時に中和したことを実証した。（図６）アッセイで利用可能な結合部位の数について正規化すると、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体（８１．３％）は、ＣＸＣＬ１放出の阻害において抗ＩＬ－１７Ａ（５２．７％）、抗ＩＬ－１７Ｆ（０．７％）又は抗ＩＬ－１３（４８．８％）よりも有効であった。抗ＩＬ－１７Ａ、抗ＩＬ－１７Ｆ又は抗ＩＬ－１３の濃度を単独で増加させても、達成される最大阻害は改善されなかった。結果は、単一のサイトカイン中和と比較して、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆを同時に阻害する利点を強調している。

【0311】

例１２ 多重特異性ＩＬ－１３／ＩＬ－１７抗体と先行技術のＩＬ－１３／ＩＬ－１７抗体との比較。
序論
本発明によるＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体の例を図７に示す。これは、一方がＩＬ－１３に特異的であり、他方がアルブミンに特異的である２つのｓｃＦｖドメインに連結された、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆに対する二重特異性を有するＦａｂドメインを含む。抗アルブミンドメインは、半減期が延長された多重特異性抗体を付与する。

【0312】

ＩＬ－１３及びＩＬ－１７に結合する二重特異性抗体は、Ａｂｂｖｉｅ（国際公開第２０１３／１０２０４２号）及びＧｅｎｅｎｔｅｃｈ（国際公開第２０１５／１２７４０５号）によって以前に記載されている。しかし、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆにどのように結合し、どの程度結合するかについてはほとんど開示されていない。これらの特性を比較するために、本発明者らは、先行技術に記載される抗体を作製し、以下の特徴についてそれらの結合挙動を調べた。
・ＩＬ－１３に対する親和性
・分子とＩＬ－１３及びＩＬ－１３Ｒα１との相互作用
・ＩＬ－１７Ａに対する親和性
・ＩＬ－１７Ｆに対する親和性

【0313】

比較抗体の作製
国際公開第２０１５／１２７４０５号の例６に記載されている配列を使用して、ＢＩＴＳ７２０１Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を構築した。

【0314】

国際公開第２０１３／１０２０４２号、表６及び表７に記載されている配列を使用して、ＤＶＤ２１６６及びＤＶＤ２１７４（Ａｂｂｖｉｅ）を構築した。これらの分子は、ＩＬ－１３及びＩＬ－１７に対する二重特異性の個々のアームの報告された活性が、それぞれの親抗体とほぼ同等又は同等であることに基づいて選択された（国際公開第２０１３／１０２０４２号、例４、８３頁、０１９５）。

【0315】

ＥｘｐｉＣＨＯトランスフェクションシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の高力価プロトコルを使用して、ＤＮＡ構築物をＣＨＯ－ＳＸＥ細胞にトランスフェクトした。回収したら、細胞培養物を４０００ＲＰＭで少なくとも１時間遠心分離し、０．２２μＭのＳｔｅｒｉｃｕｐフィルターユニットを使用した濾過によって上清を清澄化した。

【0316】

ＤＶＤ２１６６＋ＤＶＤ２１７４の精製
１０ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラムに清澄化上清を適用することによってＤＶＤ－ＩｇＧタンパク質を精製し、３カラム容積（ＣＶ）のＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ３．６段階溶出でカラムから溶出し、２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５で中和した。ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化したＨｉＬｏａｄ １６ｘ６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラム（Ｓｉｇｍａ）に適用することによって、単量体タンパク質を単離した。単量体タンパク質を含有する画分をプールし、滅菌濾過し、４℃で保存した。

【0317】

ＢＩＴＳ７２０１Ａの精製
親ノブ及びホールタンパク質を、１０ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラムに清澄化上清を適用することによって精製し、３ＣＶのＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ３．６を用いてタンパク質をカラムから溶出した。タンパク質を中和及び安定化するために、試料を１Ｍアルギニン／コハク酸緩衝液、ｐＨ８．７で１：１に希釈した。次いで、親抗体を、０．１５Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍアルギニン緩衝液、ｐＨ８．５で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６ｘ６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラム（Ｓｉｇｍａ）に適用した。続いて、５ｍＭシステアミンの存在下で親抗体を１：１の比で混合し、室温で一晩インキュベートすることによって二重特異性材料を生成させた。ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６ｘ６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムに適用することによって、第２の分取ゲル濾過工程を実施して、交換された二重特異性材料から任意の高分子量種を除去した。単量体二重特異性タンパク質を含有する画分をプールし、滅菌濾過し、４℃で保存した。

【0318】

結合特性の比較
「ＵＣＢＸＸＸＸ」と呼ばれるＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体及び先行技術の抗体へのヒトＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆの結合動態を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）によって評価し、単一の実験内で直接比較した。加えて、表面プラズモン共鳴を使用して、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体ＵＣＢＸＸＸＸ又は比較分子のＩＬ－１３に対する結合が、ＩＬ－１３受容体とのＩＬ－１３相互作用のブロッキングをもたらしたかどうかを評価した。

【0319】

ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、アミンカップリング化学を介してＣＭ５センサーチップ上に約５０００ＲＵのレベルに固定化した。親和性評価のために、各分析サイクルは、抗Ｆ（ａｂ’）_２表面へのＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体又は比較二重特異性分子の捕捉（５０～１００ＲＵ）、分析物の注入（２５℃、流速３０μｌ／分で１８０秒間）からなり、その後、解離をＩＬ－１３及びＩＬ－１７Ａについては１２００秒間、ＩＬ－１７Ｆについては６００秒間監視した。各サイクルの最後に、５０ｍＭ ＨＣｌの６０秒間の注入、続いて５ｍＭ ＮａＯＨの３０秒間の注入及び５０ｍＭ ＨＣｌの最終６０秒間の注入を用いて、１０μｌ／分の流量で表面を再生した。分析物を、ＩＬ－１３については１０ｎＭ～０．３１２５ｎＭ、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆについては５ｎＭ～０．１５６ｎＭの濃度で、ＨＢＳ－ＥＰ＋泳動緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に２倍段階希釈で注入した。ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆは本発明者らが調製したが、ヒトＩＬ－１３はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから供給された。装置ノイズ及びドリフトを差し引くために、緩衝液ブランク注入を含めた。

【0320】

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（バージョン３．０）を使用して１：１結合モデルを使用して速度論的パラメータを決定した。結果を表７に要約する。

【表8】

【0321】

ＩＬ－１３Ｒα１受容体ブロッキングを評価するために、各抗体分子をヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２表面に捕捉し（約５０～１００ＲＵ）、続いてＩＬ－１３（２５ｎＭ、１０μｌ／分で１８０秒間）を注入し、ＩＬ－１３Ｒα１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１００ｎＭ、１０μｌ／分で３００秒間）を注入した。任意のドリフト応答又はバックグラウンド応答を差し引くために、ＩＬ－１３及びＩＬ－１３Ｒα１の両方のブランク注入を含めた。表８に要約されるように、ＵＣＢＸＸＸＸはＩＬ－１３とＩＬ－１３Ｒα１との相互作用をブロックすることができたが、ＢＩＴＳ７２１０Ａ、ＤＶＤ２１６６及びＤＶＤ２１７４分子はブロックしなかった。

【表9】

【0322】

ＩＬ－１３Ｒα１及びＩＬ－１３Ｒα２への結合をブロックするＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体の能力を評価するために、更に実験を行った。この実験では、約２６０ＲＵのＵＣＢＸＸＸＸを固定化マウス抗ヒトＣＨ１抗体（ＵＣＢ本発明者ら）に捕捉し、続いてＩＬ－１３を注入し（２５ｎＭ、１０μｌ／分で１８０秒間）、次いでＩＬ－１３Ｒα１又はＩＬ－１３Ｒα２のいずれかを注入した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１００ｎＭ、１０μｌ／分で３００秒間）。任意のドリフト応答又はバックグラウンド応答を差し引くために、ＩＬ－１３、ＩＬ－１３Ｒα１及びＩＬ－１３Ｒα２のブランク注入を含めた。結果は、ＩＬ－１３と、ＩＬ－１３Ｒａ１及びＩＬ－１３Ｒａ２の両方との相互作用をＵＣＢＸＸＸＸがブロックできることを実証した。（表９）

【表10】

【0323】

考察
比較研究は、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体ＵＣＢＸＸＸＸ、二重特異性抗体ＢＩＴＳ７２１０Ａ、並びに二重可変ドメイン抗体ＤＶＤ２１６６及びＤＶＤ２１７４がＩＬ－１３に対して高い親和性で結合することができることを実証した。しかし、結合相互作用の特徴は非常に異なっていた。ＵＣＢＸＸＸＸはＩＬ－１３とＩＬ－１３－Ｒα１との相互作用をブロックすることができたが、ＢＩＴＳ７２１０Ａ、ＤＶＤ２１６６及びＤＶＤ２１７４はブロックできなかった。

【0324】

比較研究は、多重特異性抗体ＵＣＢＸＸＸＸ、二重特異性抗体ＢＩＴＳ７２１０Ａ、並びに二重可変ドメイン抗体ＤＶＤ２１６６及びＤＶＤ２１７４がＩＬ－１７に結合することができることを更に実証した。しかし、やはり、結合相互作用の特徴は非常に異なっていた。ＩＬ－１７Ａに対するＵＣＢＸＸＸＸの結合親和性は、ＢＩＴＳ７２１０Ａ及びＤＶＤ抗体の結合親和性よりも有意に高かった。ＵＣＢＸＸＸＸ及びＢＩＴＳ７２１０ＡはＩＬ－１７Ｆに対して同様の親和性で結合したが、ＤＶＤ抗体はＩＬ－１７Ｆに全く結合することができなかった。

【0325】

これらの抗体の存在下でのＩＬ－１３とＩＬ－１３Ｒα１との間の相互作用は、潜在的な免疫原性を低下させるという観点で重要である。潜在的な新規二重特異性抗体治療薬を調べる場合、免疫原性、特に抗薬物抗体（ＡＤＡ）の生成を綿密に考慮すべきであることを証拠が示唆している。ＡＤＡ生成の主な駆動源は、細胞表面上に発現される標的抗原との治療用抗体の会合及びその後の内在化である（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，Ｈ．，２００２；Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒ．２４（１１）：１７２０－４０）。内在化された治療用抗体／標的抗原複合体は、様々な細胞内コンパートメントを介した輸送を受け、細胞表面に再循環することができるか、又は分解を受けることができ（Ｓｔ Ｐｉｅｒｒｅら、２０１１）、これは、抗原提示分子によるペプチド提示及びＡＤＡ生成をもたらすことができる。

【0326】

二重特異性抗体ＢＩＴＳ７２０１Ａでは、分子のＩＬ－１３Ｆ（ａｂ）部分は、抗ＩＬ－１３抗体であるレブリキズマブと同じである（国際公開第２０１５／１２７４０５号の例６を参照されたい）。レブリキズマブは、ＩＬ－１３がその受容体ＩＬ－１３Ｒα１及びＩＬ－１３Ｒα２に結合することを可能にするが、ＩＬ－４Ｒα受容体との相互作用をブロックする部位でＩＬ－１３に結合すると考えられている（Ｐｏｐｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４２９（２）：２０８－１９）。この特定のタイプの相互作用は、ＩＬ－１３Ｒα２を介した抗体／標的抗原／受容体複合体の内在化を可能にし、したがって免疫原性応答の可能性を高める可能性がある。第Ｉ相臨床試験では、ＢＩＴＳ７２０１Ａは、高い発生率の抗薬物抗体（ＡＤＡ）に関連しており、臨床開発から撤退した。

【0327】

同様に、二重可変ドメイン抗体ＤＶＤ２１６６及びＤＶＤ２１７４は、ＩＬ－１３とＩＬ－１３－Ｒα１との相互作用をブロックすることができなかった。

【0328】

潜在的な免疫原性リスクを軽減するために、ＵＣＢＸＸＸＸは、そのそれぞれの標的抗原ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－１７Ｆと会合すると、それらが細胞上の受容体と相互作用するのを防止し、したがって、内在化、分解の機会及びＡＤＡ生成の可能性を減少させるように、特異的に設計されている。ＵＣＢＸＸＸＸによるヒトでのＡＤＡの発生率は、臨床データが利用可能になって初めて確実なものとなる。

【0329】

上記で生成されたデータは、ＩＬ－１３／ＩＬ－１７ＡＦ多重特異性抗体ＵＣＢＸＸＸＸが、有効性が改善され、免疫原性のリスクが低い、有効なＩＬ－１３／ＩＬ－１７抗体治療薬になるための正しい特性を有することを示している。

【配列表フリーテキスト】

【0330】

配列表１～６８ ＜２２３＞組換え配列

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図2-6】

【図2-7】

【図2-8】

【図2-9】

【図2-10】

【図2-11】

【図2-12】

【図3】

【図4】

【図5(A)】

【図5(B)】

【図6】

【図7】

【配列表】

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【国際調査報告】