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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-22
(54)【発明の名称】広範な治療限界を有する効率的な遺伝子送達ツール
(51)【国際特許分類】
C07J 63/00 20060101AFI20230215BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230215BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20230215BHJP
A61K 36/36 20060101ALN20230215BHJP
【ＦＩ】
C07J63/00 CSP
A61K47/26
C12N15/87 Z
A61K36/36
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022537736
(86)(22)【出願日】2020-12-17
(85)【翻訳文提出日】2022-08-10
(86)【国際出願番号】 EP2020086781
(87)【国際公開番号】W WO2021122998
(87)【国際公開日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】19217512.3
(32)【優先日】2019-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518294476
【氏名又は名称】フライエ ウニヴェルジテート ベルリン
(74)【代理人】
【識別番号】100087941
【弁理士】
【氏名又は名称】杉本 修司
(74)【代理人】
【識別番号】100112829
【弁理士】
【氏名又は名称】堤 健郎
(74)【代理人】
【識別番号】100142608
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 由佳
(74)【代理人】
【識別番号】100155963
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】100154771
【弁理士】
【氏名又は名称】中田 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100150566
【弁理士】
【氏名又は名称】谷口 洋樹
(74)【代理人】
【識別番号】100213470
【弁理士】
【氏名又は名称】中尾 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100220489
【弁理士】
【氏名又は名称】笹沼 崇
(74)【代理人】
【識別番号】100187469
【弁理士】
【氏名又は名称】藤原 由子
(74)【代理人】
【識別番号】100225026
【弁理士】
【氏名又は名称】古後 亜紀
(72)【発明者】
【氏名】ザマ・ジムコ
(72)【発明者】
【氏名】ヴェンク・アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】ミットダンク・ハルディー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C088
4C091
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC29
4C076CC47
4C076DD69
4C076FF31
4C076FF36
4C088AB12
4C088AC04
4C088BA10
4C088BA32
4C088CA06
4C088CA11
4C088CA14
4C091AA06
4C091EE06
4C091QQ05
4C091QQ15
4C091RR13
(57)【要約】
【課題】ペプチドや核酸などの低分子化合物を細胞に送達することができ、かつサポニンＧＥ１７４１よりもさらに細胞毒性において優れた特性を有する化合物を提供する。
【解決手段】本発明は、その糖残基のうちの２つにアセチル残基を有する、新規なサポニンに関するものである。これらのサポニンは、トランスフェクション効率を高くすることができ、既に知られているサポニンと比べて細胞毒性副作用が非常に小さいという特徴を有する。
【選択図】図３
【解決手段】本発明は、その糖残基のうちの２つにアセチル残基を有する、新規なサポニンに関するものである。これらのサポニンは、トランスフェクション効率を高くすることができ、既に知られているサポニンと比べて細胞毒性副作用が非常に小さいという特徴を有する。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）で表されるサポニン：【化1】
【請求項2】
請求項１に記載のサポニンであって、４つのアセチル残基を有することを特徴とする、サポニン。
【請求項3】
請求項２に記載のサポニンであって、それぞれの場合において、１つのアセチル残基が、対応するキノボース残基のＣ３およびＣ４位置の酸素原子に結合しており、並びに、対応するグルコース残基のＣ４およびＣ６位置の酸素原子に結合していることを特徴とする、サポニン。
【請求項4】
核酸、脂質、ペプチドおよび／またはタンパク質の細胞へのインビトロ送達における、請求項１～３のいずれかに一項に記載のサポニンの使用。
【請求項5】
請求項４に記載の使用であって、細胞が真核生物細胞であることを特徴とする、使用。
【請求項6】
核酸、脂質、ペプチドおよび／またはタンパク質をヒトまたは動物にインビボ送達することによる治療または診断に用いるための、請求項１～３のいずれか一項に記載のサポニン。
【請求項7】
請求項４若しくは５の使用、または請求項６に用いられるサポニンであって、サポニンが、リポソームベースのトランスフェクション試薬およびポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群の中から選択される少なくとも１つのトランスフェクション試薬と組み合わせて適用されることを特徴とする、使用またはサポニン。
【請求項8】
請求項１～３のいずれか一項に記載のサポニンを含む、トランスフェクション組成物。
【請求項9】
請求項８に記載のトランスフェクション組成物であって、リポソームベースのトランスフェクション試薬及びポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群の中から選択される少なくとも１つのトランスフェクション試薬を更に含むことを特徴とする、トランスフェクション組成物。
【請求項10】
インビトロトランスフェクションのための方法であって、請求項１～３のいずれか一項に記載のサポニンの存在下で細胞を核酸と一緒にインキュベートする工程を含む、方法。
【請求項11】
請求項１０に記載の方法であって、前記細胞が真核細胞であることを特徴とする、方法。
【請求項12】
請求項１０または１１に記載の方法であって、核酸がナノ粒子の一部を形成することを特徴とする、方法。
【請求項13】
請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法であって、サポニンが１μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬの範囲内の濃度で使用されることを特徴とする、方法。
【請求項14】
請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法であって、サポニンが、リポソームベースのトランスフェクション試薬およびポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群の中から選択される少なくとも1つのトランスフェクション試薬と組み合わせて使用されることを特徴とする、方法。
【請求項15】
請求項１から３のいずれか一項に記載のサポニンをＡｇｒｏｓｔｅｍｍａ ｇｉｔｈａｇｏ Ｌ．から単離する方法であって、以下の工程：Ａｇｒｏｓｔｅｍｍａ ｇｉｔｈａｇｏ Ｌ．の種子を粉砕し、粉砕した種子を有機溶媒により脱脂して、脱脂粉砕種子を得る工程；
前記脱脂粉砕種子を凍結乾燥して種子粉末を得る工程；
前記種子粉末をアルコール溶媒で抽出し、種子抽出物を得る工程；
前記種子抽出物からアルコール溶媒を除去し、乾燥抽出物を得る工程；
前記乾燥抽出物を低濃度有機溶媒に溶解し、抽出物溶液を得る工程；
前記抽出物溶液を少なくとも１つのクロマトグラフィー分離工程に供して、精製されたサポニン溶液を得る工程；及び
前記精製されたサポニン溶液から溶媒を除去し、精製サポニン粉末を得る工程；
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、請求項１のプリアンブルに記載のサポニン、請求項４及び６のプリアンブルの記載に係るサポニンの用途、請求項８のプリアンブルに記載のトランスフェクション組成物、請求項１０のプリアンブルに記載のインビトロトランスフェクションのための方法、及び請求項１５のプリアンブルの記載に係るサポニンを分離する方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
この数十年、遺伝子治療の重要性がますます高まっている。遺伝子治療は、治療が困難な重篤な疾患を治癒させるために用いられる。血友病Ａ、嚢胞性線維症、あるいは種々の癌などの遺伝性疾患が、新しく開発された遺伝子治療の治療対象になっている。現在、哺乳類の細胞内に遺伝子を送達する技術は数多く存在する。しかし、遺伝子治療を臨床に応用するためには、複数の所定の条件を満たさなければならない。最も重要な条件の１つは、効率的な遺伝子送達であり、可能であれば毒性副作用がないことが好ましい。これまでに確立された多くの遺伝子治療法は、この点で失敗している。
【0003】
多くのサポニンについては過去に何らかの記載がされている。例えば、非特許文献１（Weng, Alexander, et al. "A simple method for isolation of Gypsophila saponins for the combined application of targeted toxins and saponins in tumor therapy." Planta medica 75 (13) (2009):1421-1422）；非特許文献２（Weng, Alexander, et al. "A convenient method for saponin isolation in tumour therapy." Journal of Chromatography B 878 (7) (2010):713-718）；非特許文献３（Weng, Alexander, et al. "The toxin component of targeted anti-tumor toxins determines their efficacy increase by saponins." Molecular oncology 6 (3) (2012):323-332）；及び、非特許文献４（Weng, Alexander, et al. "Saponins modulate the intracellular trafficking of protein toxins." Journal of controlled release 164 (1) (2012):74-86）に言及されている。また、特定のサポニン（ＳＯ１８６１）が、ペプチドおよび脂質ナノ粒子の改善された細胞内送達を媒介できることが記載されている（非特許文献５（Weng, Alexander, et al. "Improved intracellular delivery of peptide- and lipid-nanoplexes by natural glycosides." Journal of Controlled Release 206 (2015): 75-90））。
【0004】
特定のトリテルペノイドサポニンは、特に遺伝子含有ナノプレックスに共添加した場合に、患者に送達される遺伝物質の量を非常に効率的に増加させることができるので、植物由来のトランスフェクションエンハンサーと表記することも可能である。サポニンベースのトランスフェクション増強は、サポフェクションと名付けられた。特に効率的なサポニンは、Ｓａｐｏｎａｒｉａ（サポナリア） ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（オフィシナリス） Ｌ．由来のＳＯ１８６１（サポフェクドシド）（非特許文献６（Sama, Simko et al. "Sapofectosid - Ensuring non-toxic and effective DNA and RNA delivery", International Journal of Pharmaceutics 534 (2017): 195-205））、及びＧｙｐｓｏｐｈｉｌａ（ジプソフィラ） ｅｌｅｇａｎｓ（エレガンス） Ｍ． Ｂｉｅｂ由来のＧＥ１７４１（ジプソフィロシドＡ）（非特許文献７（Sama, Simko et al. "Plant derived triterpenes from Gypsophila elegans M.Bieb. enable non-toxic delivery of gene loaded nanoplexes", Journal of Biotechnology 284 (2018): 131-139））である。
【0005】
ＧＥ１７４１およびその使用は、特許文献１（国際公開第２０１９／０１１９１４号）にも記載されている。
【0006】
サポニン介在性のトランスフェクションについてのインビトロおよびインビボ研究では、毒性効果を伴うことなく、送達される核酸の大量増加を示した。実施されたマウスを用いての研究では、送達された、毒性リボソーム不活性化タンパク質であるサポリンをコードするＤＮＡが、標的ナノプレックスに複合化され、腫瘍の量の大幅な減少が観察された（非特許文献８（Sama, Simko et al. "Targeted suicide gene transfections reveal promising results in nu/nu mice with aggressive neuroblastoma", Journal of Controlled Release, 275 (2018): 208-216））。
【0007】
その他のサポニンについては、以下の文献に記載されている。
・非特許文献９（Thakur, Mayank, et al. "High-speed countercurrent chromatographic recovery and off-line electrospray ionization mass spectrometry profiling of bisdesmodic saponins from Saponaria officinalis possessing synergistic toxicity enhancing properties on targeted antitumor toxins." Journal of Chromatography B 955 (2014):1-9）
・非特許文献１０（Jia, Zhonghua, Kazuo Koike, and Tamotsu Nikaido."Major triterpenoid saponins from Saponaria officinalis." Journal of natural products 61 (11) (1998):1368-1373）
・非特許文献１１（Haddad, Mohamed, et al. "New triterpene saponins from Acanthophyllum pachystegium".Helvetica chimica acta 87 (1) (2004):73-81）
・非特許文献１２（Fu, Hongzheng et al. "Silenorubicosides A-D, Triterpenoid Saponins from Silene rubicunda." Journal of Natural Products 68 (5) (2005):754-758）
・非特許文献１３（Moniuszko-Szajwaj, Barbara, et al. "Highly Polar Triterpenoid Saponins from the Roots of Saponaria officinalis L." Helvetica Chimica Acta 99 (5) (2016):347-354）
・非特許文献１４（Fuchs, Hendrik, et al. "Glycosylated Triterpenoids as Endosomal Escape Enhancers in Targeted Tumor Therapies.".Biomedicines 5 (2) (2017):14）
・非特許文献９（Thakur, Mayank, et al. "High-speed countercurrent chromatographic recovery and off-line electrospray ionization mass spectrometry profiling of bisdesmodic saponins from Saponaria officinalis possessing synergistic toxicity enhancing properties on targeted antitumor toxins." Journal of Chromatography B 955 (2014):1-9）
・非特許文献１０（Jia, Zhonghua, Kazuo Koike, and Tamotsu Nikaido."Major triterpenoid saponins from Saponaria officinalis." Journal of natural products 61 (11) (1998):1368-1373）
・非特許文献１１（Haddad, Mohamed, et al. "New triterpene saponins from Acanthophyllum pachystegium".Helvetica chimica acta 87 (1) (2004):73-81）
・非特許文献１２（Fu, Hongzheng et al. "Silenorubicosides A-D, Triterpenoid Saponins from Silene rubicunda." Journal of Natural Products 68 (5) (2005):754-758）
・非特許文献１３（Moniuszko-Szajwaj, Barbara, et al. "Highly Polar Triterpenoid Saponins from the Roots of Saponaria officinalis L." Helvetica Chimica Acta 99 (5) (2016):347-354）
・非特許文献１４（Fuchs, Hendrik, et al. "Glycosylated Triterpenoids as Endosomal Escape Enhancers in Targeted Tumor Therapies.".Biomedicines 5 (2) (2017):14）
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開第２０１９／０１１９１４号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Weng, Alexander, et al. "A simple method for isolation of Gypsophila saponins for the combined application of targeted toxins and saponins in tumor therapy." Planta medica 75 (13) (2009):1421-1422
【非特許文献2】Weng, Alexander, et al. "A convenient method for saponin isolation in tumour therapy." Journal of Chromatography B 878 (7) (2010):713-718
【非特許文献3】Weng, Alexander, et al. "The toxin component of targeted anti-tumor toxins determines their efficacy increase by saponins." Molecular oncology 6 (3) (2012):323-332
【非特許文献4】Weng, Alexander, et al. "Saponins modulate the intracellular trafficking of protein toxins." Journal of controlled release 164 (1) (2012):74-86
【非特許文献5】Weng, Alexander, et al. "Improved intracellular delivery of peptide- and lipid-nanoplexes by natural glycosides." Journal of Controlled Release 206 (2015): 75-90
【非特許文献6】Sama, Simko et al. "Sapofectosid - Ensuring non-toxic and effective DNA and RNA delivery", International Journal of Pharmaceutics 534 (2017): 195-205
【非特許文献7】Sama, Simko et al. "Plant derived triterpenes from Gypsophila elegans M.Bieb. enable non-toxic delivery of gene loaded nanoplexes", Journal of Biotechnology 284 (2018): 131-139
【非特許文献8】Sama, Simko et al. "Targeted suicide gene transfections reveal promising results in nu/nu mice with aggressive neuroblastoma", Journal of Controlled Release, 275 (2018): 208-216
【非特許文献9】Thakur, Mayank, et al. "High-speed countercurrent chromatographic recovery and off-line electrospray ionization mass spectrometry profiling of bisdesmodic saponins from Saponaria officinalis possessing synergistic toxicity enhancing properties on targeted antitumor toxins." Journal of Chromatography B 955 (2014):1-9
【非特許文献10】Jia, Zhonghua, Kazuo Koike, and Tamotsu Nikaido."Major triterpenoid saponins from Saponaria officinalis." Journal of natural products 61 (11) (1998):1368-1373
【非特許文献11】Haddad, Mohamed, et al. "New triterpene saponins from Acanthophyllum pachystegium".Helvetica chimica acta 87 (1) (2004):73-81
【非特許文献12】Fu, Hongzheng et al. "Silenorubicosides A-D, Triterpenoid Saponins from Silene rubicunda." Journal of Natural Products 68 (5) (2005):754-758
【非特許文献13】Moniuszko-Szajwaj, Barbara, et al. "Highly Polar Triterpenoid Saponins from the Roots of Saponaria officinalis L." Helvetica Chimica Acta 99 (5) (2016):347-354
【非特許文献14】Fuchs, Hendrik, et al. "Glycosylated Triterpenoids as Endosomal Escape Enhancers in Targeted Tumor Therapies.".Biomedicines 5 (2) (2017):14
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の目的は、ペプチドや核酸などの低分子化合物を細胞に送達することができ、かつサポニンＧＥ１７４１よりもさらに細胞毒性において優れた特性を有する化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
この目的は、式（Ｉ）に対応するサポニンを提供することで達成される。
【化1】
【0012】
ここで、Ｒ１は、同一分子内の他のＲ１残基から独立しており、Ｈまたはアセチル残基であり、ただし、少なくとも２つのＲ１残基はアセチル残基である。Ｒ２は、同一分子内の他のＲ２残基から独立しており、Ｈまたはアセチル残基であり、ただし、少なくとも２つのＲ２残基はアセチル残基である。
【0013】
このサポニンは、一般的なサポニンのコア構造を有し、特殊な結合は有さない。むしろ、他のサポニンと異なるのは、その糖残基および/またはそのアセチル残基についてのみである。式（Ｉ）中の個々の糖残基をよりよく識別するために、式（Ｉ）中の記載において対応する略語を用いている。それぞれの略語は、以下の意味を有する。
【0014】
【表1】
【0015】
式（Ｉ）に示される化合物は、ＧＥ１７４１のトランスフェクション効率と同程度のトランスフェクション効率を示した。しかしながら、式（Ｉ）で示される化合物の細胞毒性は、ＧＥ１７４１の細胞毒性よりも顕著に低かった。より詳細には、式（Ｉ）で示される化合物は、２４μｇ／ｍＬという高濃度においても、著しい細胞毒性作用は示さなかった。ＧＥ１７４１は、このような濃度下では既に細胞毒性作用を発揮していた。サポニンの細胞毒性がこのように著しく低くなることは期待できないので、これは全く予想外の驚くべき結果である。既存のサポニン類は多数存在しているため、本発明者らは、本特許請求の範囲における化合物がこのように低い細胞毒性を示すことは予想することは不可能であった。ここで、サポニン類は合成することができず、一般に、化学物質の供給業者から単純に購入することはできないことに留意すべきである。むしろ、サポニンを得るためには、植物または植物の一部から単離する必要がある。そのため、サポニンの特性を調べることは非常に難しい。
【0016】
本発明者らは、驚くべきことに、一般式（Ｉ）で示されるサポニンがＡｇｒｏｓｔｅｍｍａ(アグロステンマ) ｇｉｔｈａｇｏ（ギサゴ） Ｌ．（コガネバナ）から単離可能であること、これが他のサポニンと同等のトランスフェクション効率を示しつつ、予想外に低い細胞毒性を示すことを見いだした。このようなサポニンがＡｇｒｏｓｔｅｍｍａ ｇｉｔｈａｇｏ Ｌ．から抽出されることは、これまでどこにも記載されていない。
【0017】
一実施形態では、全ての糖は、そのＤ立体異性体の形態で存在する。
【0018】
一実施形態において、サポニンは、一般式（ＩＩ）に示される立体異性体の形態で存在する。
【化2】
【0019】
一実施形態において、サポニンは、４つのアセチル基を担持し、すなわち、それぞれの場合において、Ｒ１残基の２つはアセチル残基であり、残りのＲ１残基は水素であり、Ｒ２残基の２つはアセチル残基で、残りのＲ２残基は水素である。
【0020】
一実施形態では、それぞれの場合において、１つのアセチル残基が、対応するキノボース残基のＣ３およびＣ４位の酸素原子と、対応するグルコース残基のＣ４およびＣ６位の酸素原子とに結合し、式（ＩＩＩ）のサポニンを形成している。このサポニンは、ＡＧ１８５６と表記することもできる。ＡＧ１８５６はＸｙｌ－ＧｌｃＡ－Ｇａｌの糖鎖を持ち、ＧｌｃＡを介してキラ酸／ジプソジェニンのＣ－３原子と結合している。ＡＧ１８５６は、ＧＥ１７４１のような先行技術のサポニンから知られている構造モチーフ、すなわち、キラ酸／ジプソジェニンのＣ－２８鎖に、フコース残基に接続された二重アセチル化キノボース残基が、順に直接（エステル架橋を介して）結合されている。ＧＥ１７４１ではフコース残基に直鎖状の糖鎖が結合しているが、ＡＧ１８５６ではキシロース残基とアセチル化グルコース残基を持つ分岐ラムノース残基を有している。
【化3】
【0021】
一実施形態において、上述の実施形態のサポニンは、一般式（ＩＶ）で表される立体異性体の形態で存在する。
【化4】
【0022】
一実施形態においで、３つのＲ１残基はすべてアセチル残基であり、式（Ｖ）のサポニンを形成する。
【化5】
【0023】
一実施形態において、４つのＲ２残基はすべてアセチル残基であり、式（ＶＩ）のサポニンを形成する。
【化6】
【0024】
一実施形態において、全てのＲ１残基及び全てのＲ２残基は、アセチル残基である。
【0025】
一態様において、本発明はまた、核酸、脂質、ペプチドおよび／またはタンパク質の細胞へのインビトロ送達における、先の説明に従ったサポニンの使用に関する。それによって、核酸のインビトロ送達は、サポニンの特に適切な使用の例である。送達される（delivered）べき適切な核酸は、プラスミドＤＮＡまたはミニサークルＤＮＡなどのＤＮＡ、および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのＲＮＡである。送達されるべき核酸または他の分子は、ナノプレックス（nanoplex）の形態で存在することができる。ナノプレックスは、典型的には、送達されるべき低分子を結合することが可能なペプチドまたは脂質によって生成される。したがって、核酸送達性ナノプレックスは、核酸がそれに結合される脂質または非脂質担体を備える。ナノプレックスは、ナノ粒子とも呼ばれ得る。一実施形態において、送達されるべき核酸は、ミニサークルＤＮＡである。一実施形態において、送達されるべき分子は、ペプチドミニサークルＤＮＡ粒子である。
【0026】
一実施形態において、核酸、脂質、ペプチド及び／又はタンパク質が送達されるべき細胞は、真核細胞である。細胞として使用されるのは、ヒト細胞、動物細胞（げっ歯類細胞など）、または植物細胞が特に適切である。また、酵母細胞も使用することができる。
【0027】
一態様において、本発明は、治療または診断における先に説明したサポニンの使用に関するものである。それによって、サポニンは、ヒトまたは動物への核酸、脂質、ペプチドおよび／またはタンパク質のインビボ送達のために使用される。
【0028】
一実施形態では、動物は哺乳類、特にげっ歯類である。
【0029】
本発明者らは、一般式（Ｉ）～（ＶＩ）で示されるサポニンが、単独で使用した場合にトランスフェクション効率を向上させるだけでなく、従来からあるトランスフェクション試薬のトランスフェクション効率を向上させるのにも特に適していることを見出した。従って、このようなトランスフェクション試薬のブースターとしてサポニンを使用することができる。上述の使用には、従来からあるトランスフェクション試薬のためのブースターとしてのそのようなサポニンの使用が包含される。一実施形態では、サポニンは、リポソームベースのトランスフェクション試薬およびポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群の中から選択される少なくとも1つのトランスフェクション試薬と組み合わせて、インビボまたはインビトロで使用される。このようなトランスフェクション試薬の例を以下に列挙する。
【0030】
一態様において、本発明は、先に説明したサポニンを用いて、核酸、脂質、ペプチド及び／又はタンパク質を、それを必要とするヒト又は動物に送達する方法に関するものである。
【0031】
一態様において、本発明は、先に説明したサポニンを含むトランスフェクション組成物に関する。それにより、サポニンは、トランスフェクション増強剤として特に好適に使用することができる。
【0032】
一態様において、本発明は、従来からあるトランスフェクション試薬と、式（Ｉ）～（ＶＩ）のいずれかで示される少なくとも１つのサポニンとを含む、トランスフェクション組成物に関し、ここで残基Ｒ１およびＲ２は、上述した意味を有する。従来からあるトランスフェクション試薬は、２つのサブグループ、すなわちリポソームベースのトランスフェクション試薬およびポリマーベースのトランスフェクション試薬に分類することができる。リポソームベースのトランスフェクション試薬は、トリメチルアンモニウムプロパンのような極性頭部基に結合した疎水性脂肪酸鎖を有する、主にカチオン性に荷電した脂質から構成されている。ポリマーベースのトランスフェクション試薬は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような荷電した頭部基を有する有機ポリマーからなる。
【0033】
市販されている従来からあるリポソームベースのトランスフェクション試薬の例としては、ＭＥＴＡＦＥＣＴＥＮＥ、ＴｒａｎｓＦａｓｔ、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ、およびＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎが挙げられる。
【0034】
市販されている従来からあるポリマーベースのトランスフェクション試薬の例としては、ＧｅｎｅＣｅｌｌｉｎや、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧｅｎｅ ９ ＤＮＡトランスフェクション試薬、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧｅｎｅ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション薬、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧｅｎｅ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬などのＸ－ｔｒｅｍｅＧｅｎｅトランスフェクション試薬や、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２ダイナミック・デリバリー・システム、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－２０２０試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ＰＲＯ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ＶｉｒｕｓＧＥＮ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｌｅｎｔｉ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｉｎｓｅｃｔ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－２９３試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ＢｒＣａ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ＣＨＯトランスフェクション試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ＨｅＬａＭＯＮＳＴＥＲトランスフェクション試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｊｕｒｋａｔ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡトランスフェクション試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ＴＫＯ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ｓｉＱＵＥＳＴ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｏｌｉｇｏ試薬などのＴｒａｎｓＩＴトランスフェクション試薬や、Ｖｉａｆｅｃｔや、ＦｕＧＥＮＥや、Ｘｆｅｃｔや、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔや、ＧｅｎＪｅｔなどがある。
【0035】
一実施形態において、トランスフェクション試薬は、リポソームベースのトランスフェクション試薬である。
【0036】
一実施形態において、トランスフェクション試薬は、ポリマーベースのトランスフェクション試薬である。
【0037】
一実施形態において、トランスフェクション試薬は、ＴｒａｎｓＩＴトランスフェクション試薬、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧｅｎｅトランスフェクション試薬、及びＧｅｎｅＣｅｌｌｉｎからなる群の中から選択される。
【0038】
一実施形態において、トランスフェクション試薬は、ＧｅｎｅＣｅｌｌｉｎである。
【0039】
一態様において、本発明は、細胞のインビトロトランスフェクションのための方法に関するものである。この方法は、先に説明したサポニンの存在下で、核酸と共に細胞をインキュベートする工程を含む。トランスフェクションは、一過性のトランスフェクションであっても、安定トランスフェクションであってもよい。ＤＮＡ及びＲＮＡは適切な核酸であり、ＤＮＡは特に適切である。一実施形態において、送達される核酸は、ミニサークルＤＮＡである。
【0040】
一実施形態において、細胞は、真核細胞である。細胞としては、ヒト細胞、動物細胞（げっ歯類細胞等）又は植物細胞を用いることが特に適切である。また、酵母細胞も使用することができる。
【0041】
一実施形態では、核酸は、ナノ粒子の一部を形成する。一例を挙げると、ＤＮＡナノ粒子が使用されてもよい。ペプチドミニサークルＤＮＡ粒子またはＤＮＡに結合したペプチドを含む粒子は、さらに適切な例である。同様に、ＲＮＡナノ粒子は、トランスフェクションを実施するための適切な実体である。
【0042】
一実施形態において、サポニンは、１μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬ、特に１．５ｇ／ｍＬ～４５μｇ／ｍＬ、特に２μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬ、特に２．５μｇ／ｍＬ～３５μｇ／ｍＬ、特に３μｇ／ｍＬ～３０μｇ／ｍＬ、特に４μｇ／ｍＬ～２５μｇ／ｍＬ、特に４．５μｇ／ｍＬ～２４μｇ／ｍＬ、特に５μｇ／ｍＬ～２３μｇ／ｍＬ、特に５．５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬ、特に６μｇ／ｍＬ～１５μｇ／ｍＬ、特に７μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、特に８μｇ／ｍＬ～９μｇ／ｍＬの範囲内の濃度で使用される。
【0043】
一実施形態において、サポニンは、リポソームベースのトランスフェクション試薬及びポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群の中から選択される少なくとも1つのトランスフェクション試薬と組み合わせて使用される。トランスフェクション試薬の適切な例は、上に列挙している。
【0044】
一態様において、本発明は、Ａｇｒｏｓｔｅｍｍａ ｇｉｔｈａｇｏ Ｌ．から先に説明したサポニンを単離するための方法に関する。この方法は、以下に説明する工程を含んでいる。それによって、各工程は、必ずしも示された順序で実行される必要はない。むしろ、方法ステップの任意の他の実用的（sensible）な順序もまた適用され得る。
【0045】
最初の工程において、Ａｇｒｏｓｔｅｍｍａ ｇｉｔｈａｇｏ Ｌ．の種子が粉砕される。次に、粉砕された種子は、有機溶媒、例えば、石油エーテルで脱脂される。その後、粉砕され脱脂された種子を凍結乾燥させる。そうすることで、種子粉末が得られる。
【0046】
種子粉末をアルコール溶媒で抽出し、種子抽出物を得る。アルコール溶媒としては、メタノールまたは他の短鎖有機アルコール（エタノール、イソプロパノールなど）が好適である。一例を挙げると、７０～１００％（ｖ／ｖ）、特に７５～９５％、特に８０～９０％の溶媒濃度は、適切な高濃度である。アルコール溶媒としては、９０％メタノールが特に適切である。アルコール溶媒を水と混和可能である場合、水を共溶媒として使用することができる。
【0047】
その後、種子抽出物からアルコール溶媒を除去し、乾燥抽出物を得る。この除去は、例えば、減圧蒸留によって行うことができる。
【0048】
この乾燥抽出物を低濃度有機溶媒に溶解し、抽出溶液を得る。「低濃度有機溶媒」という用語は、濃度が５０％（ｖ／ｖ）未満の有機溶媒をいう。一例を挙げると、１０％～５０％、特に１５％～４５％、特に２０％～４０％、特に２５％～３０％の濃度は、低濃度有機溶媒の適切な濃度範囲である。繰り返しになるが、メタノールまたは他の短鎖有機アルコールは好適な有機溶媒である。同様に、低濃度有機溶媒を水と混和可能である場合は、水を共溶媒として使用することもできる。
【0049】
この抽出溶液は、次に少なくとも1回のクロマトグラフィー分離工程に供される。それにより、精製されたサポニン溶液が得られる。クロマトグラフィー分離は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により実施することができる。通常、精製サポニン溶液の純度を高めるために、クロマトグラフィー分離工程を２回以上行うことが望ましい。したがって、第１のクロマトグラフィー分離工程の後に得られた精製サポニン溶液を、少なくとも１回の後続のクロマトグラフィー分離工程に供することが可能である。この場合、個々のクロマトグラフィー分離工程において、互いに異なるカラムを使用することができる。
【0050】
個々のクロマトグラフィー分離工程（２つ以上のクロマトグラフィー分離工程を実施する場合）を異なる固定相および／または移動相で実施することが可能である。したがって、個々のクロマトグラフィー分離工程で使用する溶媒を、これらの工程間で変更することが可能である。
【0051】
最後に、少なくとも１つのクロマトグラフィー分離工程の後、精製されたサポニン溶液から溶媒を除去する。これは、例えば、減圧蒸留または凍結乾燥によって行うことができる。その結果、精製されたサポニン粉末が得られる。
【0052】
本明細書に開示された全ての実施形態は、任意の所望の方法で組み合わせることができる。さらに、特許請求の範囲に記載されたサポニンに関して説明された実施形態は、特許請求の範囲に記載された使用及び方法に関する説明にも適用することができ、その逆もまた可能である。同様に、説明された使用及び方法の実施形態は、任意の所望の方法で、説明された他の方法及び用途にも適用することができる。記載されたトランスフェクション組成物はまた、記載された実施形態のいずれかを利用することができる。
【0053】
本発明の態様の更なる詳細は、例示的な実施形態および添付の図面に基づいて説明される。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図5】ペプチドに結合したＤＮＡを含むナノプレックスへのトランスフェクションにおける、種々のサポニンのトランスフェクション効率を示している。
【図7】インビボ毒性試験の結果を示している。
【図8】インビトロ毒性試験の結果を示している。
【0055】
[例示的な実施形態：Ａｇｒｏｓｔｅｍｍａ ｇｉｔｈａｇｏ Ｌ．からのサポニンＡＧ１８５６の単離]
Ａｇｒｏｓｔｅｍｍａ ｇｉｔｈａｇｏ Ｌ．の種子を抽出に用いた（Agrostemmae semen、 AGRO 26/80、Gaterslebenの連邦栽培植物育種研究センター（ＢＡＺ）より入手）。粉砕後、１９０ｇの種子を、石油エーテルを用いたソックスレー抽出により一晩脱脂した。脱脂した種子粉末（１７７．１ｇ）を９０％メタノールを用いて３回（各回におけるメタノールの量：１Ｌ）抽出した。メタノールを減圧蒸留で蒸発させ、水相を凍結乾燥した（Christ alpha 2-4, Osterode, ドイツ）。乾燥抽出物の収量は１１．５ｇ（６％）であった。
Ａｇｒｏｓｔｅｍｍａ ｇｉｔｈａｇｏ Ｌ．の種子を抽出に用いた（Agrostemmae semen、 AGRO 26/80、Gaterslebenの連邦栽培植物育種研究センター（ＢＡＺ）より入手）。粉砕後、１９０ｇの種子を、石油エーテルを用いたソックスレー抽出により一晩脱脂した。脱脂した種子粉末（１７７．１ｇ）を９０％メタノールを用いて３回（各回におけるメタノールの量：１Ｌ）抽出した。メタノールを減圧蒸留で蒸発させ、水相を凍結乾燥した（Christ alpha 2-4, Osterode, ドイツ）。乾燥抽出物の収量は１１．５ｇ（６％）であった。
【0056】
[サイズ排除クロマトグラフィー]
乾燥抽出物（２００ｍｇ）を１ｍＬのＤＭＳＯと１ｍＬの５０％メタノールに溶かした。この溶液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ－２０カラム（１０×２０００ｍｍ）を備えた中圧クロマトグラフィー(ＭＰＬＣ，Ａｚｕｒａ－ｓｙｓｔｅｍ，Ｋｎａｕｅｒ，ドイツ)によるサイズ排除クロマトグラフィーに供した。溶出はメタノール／水（１：１）を用いて行った。流速は１ｍＬ／ｍｉｎで、検出は２１０ｎｍで行った。フラクションを回収し、真空遠心分離と凍結乾燥によって乾燥させた。
乾燥抽出物（２００ｍｇ）を１ｍＬのＤＭＳＯと１ｍＬの５０％メタノールに溶かした。この溶液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ－２０カラム（１０×２０００ｍｍ）を備えた中圧クロマトグラフィー(ＭＰＬＣ，Ａｚｕｒａ－ｓｙｓｔｅｍ，Ｋｎａｕｅｒ，ドイツ)によるサイズ排除クロマトグラフィーに供した。溶出はメタノール／水（１：１）を用いて行った。流速は１ｍＬ／ｍｉｎで、検出は２１０ｎｍで行った。フラクションを回収し、真空遠心分離と凍結乾燥によって乾燥させた。
【0057】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）］
ＭＰＬＣから選択されたフラクションを、Ｃ１８カラム（Kinetex（登録商標） 5μm C18 100A, ＬＣカラム250 × 10.0 mm）を用いたＨＰＬＣ（LC-8A Shimadzu）に供した。溶媒系は，（Ａ）アセトニトリルおよび（Ｂ）水（０．０１％トリフルオロ酢酸）であった。移動相は、１０分の間８０～７０％（Ｂ）、１０～１５分の間７０～６０％（Ｂ）、１５～２０分の間６０～５０％（Ｂ）、２０～２５分の間５０～３０％（Ｂ）、２５～３０分の間３０～１０％（Ｂ）、３０～４０分の間で１０～８０％（Ｂ）、さらに５分の間８０％（Ｂ）で維持する勾配を適用（４５分）した。流速は２ｍＬ／ｍｉｎとし、分析値は２１０ｎｍと２５４ｎｍで記録された。
ＭＰＬＣから選択されたフラクションを、Ｃ１８カラム（Kinetex（登録商標） 5μm C18 100A, ＬＣカラム250 × 10.0 mm）を用いたＨＰＬＣ（LC-8A Shimadzu）に供した。溶媒系は，（Ａ）アセトニトリルおよび（Ｂ）水（０．０１％トリフルオロ酢酸）であった。移動相は、１０分の間８０～７０％（Ｂ）、１０～１５分の間７０～６０％（Ｂ）、１５～２０分の間６０～５０％（Ｂ）、２０～２５分の間５０～３０％（Ｂ）、２５～３０分の間３０～１０％（Ｂ）、３０～４０分の間で１０～８０％（Ｂ）、さらに５分の間８０％（Ｂ）で維持する勾配を適用（４５分）した。流速は２ｍＬ／ｍｉｎとし、分析値は２１０ｎｍと２５４ｎｍで記録された。
【0058】
このサポニンの構造は、式（ＩＶ）に相当する。ＡＧ１８５６は４つのアセチル残基（キノボース残基のＣ３位とＣ４位に１つずつ、Ｃ４位に１つとＣ６位のメチル残基に１つずつの結合）を含んでいるが、予備データからアセチル残基の量と位置を表示範囲内で変えてもそれぞれのサポニンの特性を大きく変えることはないことが示唆される。
【0059】
［他のサポニンと比較したときのＡＧ１８５６の特性についての試験］
マウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞、ＡＴＴＣ ＣＣＬ－１３１（商標））を、１ｇ／ＬのＤ－グルコース、１０％ＦＢＳ、および安定化グルタミンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。これらの細胞を、異なるサポニンとともにインキュベートし、サポニンの細胞毒性効果を試験した。
マウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞、ＡＴＴＣ ＣＣＬ－１３１（商標））を、１ｇ／ＬのＤ－グルコース、１０％ＦＢＳ、および安定化グルタミンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。これらの細胞を、異なるサポニンとともにインキュベートし、サポニンの細胞毒性効果を試験した。
【0060】
試験したサポニンはＧＥ１７４１、ＳＯ１８６１、ＡＧ１８５６である。３つのサポニンは全て共通の構造モチーフを持つが、わずかに異なる糖残基を持つ。このことは、次の一般式（ＶＩＩ）とそれに続く表１で解明されている。
【化7】
【0061】
【表2】
【0062】
【0063】
図１Ａは、播種後２４時間のＮｅｕｒｏ２ａ細胞に異なる濃度のＧＥ１７４１を作用させた場合の実験結果である。ＧＥ１７４１の濃度が２４μｇ／ｍＬのときに明確な毒性作用が観察された。最初のピークは、アポトーシス細胞の膨張によるものであった。
【0064】
図１Ｂは、播種後２４時間のＮｅｕｒｏ２ａ細胞に異なる濃度のＳＯ１８６１を作用させたときの実験結果を示している。ＳＯ１８６１の濃度が２４μｇ／ｍＬになると、明確な毒性作用が観察された。最初のピークは、アポトーシス細胞の膨張によるものであった。
【0065】
図１Ｃは、播種後２４時間が経過したＮｅｕｒｏ２ａ細胞に異なる濃度のＡＧ１８５６を作用させたときの実験結果である。ＡＧ１８５６の濃度が２４μｇ／ｍＬでは、明確な毒性は観察されなかった。
【0066】
図１Ｄは、異なるサポニンであるＧＥ１７４１、ＳＯ１８６１、ＡＧ１８５６をそれぞれ２４μｇ／ｍＬの濃度でＮｅｕｒｏ２ａ細胞に作用させた場合の比較である。ＡＧ１８５６のみ、２４μｇ／ｍＬの濃度で毒性作用を示さなかった。
【0067】
ネガティブコントロールとして、それぞれのケースで緩衝液が使用された。
【0068】
［細胞インピーダンス測定］
図２は、ＡＧ１８５６の濃度を様々に変えて、インピーダンス測定による細胞生存率試験を行った結果を示す。ｉＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）装置により、付着細胞のリアルタイム細胞生存率測定として、ウェル底部のインピーダンス（交流抵抗）を測定した。８ウェルＥプレートＬ８を２枚用いて、１ウェルあたり８０００個のＮｅｕｒｏ２ａ細胞を播種し、８００μＬの容量で２４時間インキュベートした。トランスフェクションの毒性試験には、各容量の培養液を除去した後、５０μＬの試薬を添加した。１０分ごとにインピーダンス/生存率を測定した。結果はＲＴＣＡデータ解析ソフトウェアを用いて解析・表示された。
図２は、ＡＧ１８５６の濃度を様々に変えて、インピーダンス測定による細胞生存率試験を行った結果を示す。ｉＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）装置により、付着細胞のリアルタイム細胞生存率測定として、ウェル底部のインピーダンス（交流抵抗）を測定した。８ウェルＥプレートＬ８を２枚用いて、１ウェルあたり８０００個のＮｅｕｒｏ２ａ細胞を播種し、８００μＬの容量で２４時間インキュベートした。トランスフェクションの毒性試験には、各容量の培養液を除去した後、５０μＬの試薬を添加した。１０分ごとにインピーダンス/生存率を測定した。結果はＲＴＣＡデータ解析ソフトウェアを用いて解析・表示された。
【0069】
図２に示す曲線は、以下の測定結果を示す。
【0070】
【表3】
【0071】
ＡＧ１８５６の濃度を段階的に増加させても、毒性は顕著には増加しなかった。一方、毒性の強いＧＥ１７４１（濃度２４μｇ／ｍＬ）では、毒性の強いポジティブコントロールであるピューロマイシン（濃度４μｇ／ｍＬ）の場合と同様に細胞増殖が阻害された。
【0072】
図３は、ＡＧ１８５６の濃度を様々に変えてＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイで行った細胞生存率試験の結果である。
【0073】
ＭＴＴのホルマザン生成によるミトコンドリア活性の測定は、細胞生存率を測定する生化学的方法として機能した。ＡＧ１８５６（曲線９）では毒性による生存率の低下は認められなかったが、ＧＥ１７４１（曲線１０）およびＳＯ１８６１（曲線１１）では同濃度において生存率の低下が観察された。
【0074】
図４は、ペプチドに結合したＤＮＡからなるナノ粒子（ＰＤナノプレックス）の送達におけるＡＧ１８５６の特性を示している。ＰＤナノプレックスは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡを含んでいた。これにより、対応するＤＮＡナノ粒子とインキュベートされた細胞の蛍光を検出することで、トランスフェクション効率を非常に容易にモニターすることができた。本ケースでは、対応するインキュベーション期間が４８時間となるように選択された。
【0075】
ＰＤナノプレックスの製剤化
インテグリン受容体標的アミノ配列を持たない正電荷ポリリジンペプチド２０ｍｇをGenecust社から購入した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｐ－ＥＧＦＰ－Ｎ３のベクターを入手し、ＤＨ５α－Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞で増殖させた（１．６４５ｍｇ／ｍＬ）。さらなる核酸として、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｅＧＦＰｍＲＮＡ（２０μｇ）およびＧＦＰをコードするミニサークルＤＮＡ（Gene Bank Accession: U55761）を使用した。トランスフェクションを行うために、ナノプレックスを以下のように調合した。ポリリジンペプチド（Ｐ）およびｐ－ＥＧＦＰ－Ｎ３ベクター（Ｄ）を水で希釈し（各５０μＬ）、４：１の割合で高速ピペッティングにより十分に混合した。３０分のインキュベーション工程でナノプレックスを形成させた。その後、ナノプレックス懸濁液をＯｐｔｉＭＥＭで希釈し、総量を１ｍＬとした。市販のトランスフェクション試薬リポフェクタミン（登録商標）３０００は、製造業者の記載に従って調合した。
インテグリン受容体標的アミノ配列を持たない正電荷ポリリジンペプチド２０ｍｇをGenecust社から購入した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｐ－ＥＧＦＰ－Ｎ３のベクターを入手し、ＤＨ５α－Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞で増殖させた（１．６４５ｍｇ／ｍＬ）。さらなる核酸として、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｅＧＦＰｍＲＮＡ（２０μｇ）およびＧＦＰをコードするミニサークルＤＮＡ（Gene Bank Accession: U55761）を使用した。トランスフェクションを行うために、ナノプレックスを以下のように調合した。ポリリジンペプチド（Ｐ）およびｐ－ＥＧＦＰ－Ｎ３ベクター（Ｄ）を水で希釈し（各５０μＬ）、４：１の割合で高速ピペッティングにより十分に混合した。３０分のインキュベーション工程でナノプレックスを形成させた。その後、ナノプレックス懸濁液をＯｐｔｉＭＥＭで希釈し、総量を１ｍＬとした。市販のトランスフェクション試薬リポフェクタミン（登録商標）３０００は、製造業者の記載に従って調合した。
【0076】
［サポフェクション（トリテルペン系サポニンを用いたトランスフェクション）］
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞（１５，０００個/ウェル）を、培地４００μＬのウェル体積をもつ２４ウェルプレートに播種し２４時間インキュベートした。トランスフェクション試薬は上記のように調合し、必要ならばサポニン溶液と共に混和して使用した。培地を最終量５００ｎｇのＤＮＡ／ＲＮＡを含むトランスフェクション培地に置換した。４８時間のインキュベーション期間後、トランスフェクション培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）のポリスチレンチューブに移した。各測定では、１０，０００個の細胞を取得した。トランスフェクション効率は、解析ソフトウェアＣｙｆｌｏｇｉｃによって決定した（サンプルプロットとネガティブコントロールの蛍光の比較による）。
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞（１５，０００個/ウェル）を、培地４００μＬのウェル体積をもつ２４ウェルプレートに播種し２４時間インキュベートした。トランスフェクション試薬は上記のように調合し、必要ならばサポニン溶液と共に混和して使用した。培地を最終量５００ｎｇのＤＮＡ／ＲＮＡを含むトランスフェクション培地に置換した。４８時間のインキュベーション期間後、トランスフェクション培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）のポリスチレンチューブに移した。各測定では、１０，０００個の細胞を取得した。トランスフェクション効率は、解析ソフトウェアＣｙｆｌｏｇｉｃによって決定した（サンプルプロットとネガティブコントロールの蛍光の比較による）。
【0077】
ＡＧ１８５６においては、２μｇ／ｍＬの濃度で既にゴールドスタンダードであるリポフェクタミンに匹敵する非常に優れたトランスフェクション効率が確認された。４μｇ／ｍＬ以上の濃度では、ＡＧ１８５６のトランスフェクション効率はリポフェクタミンのそれよりもさらに高くなった。図４のデータは，平均値±標準偏差（ＳＤ）で表されている。リポフェクタミン3000はポジティブコントロールであった（Ｎ＝４；ｐ値＜０．０１（＊＊），ｐ値＜０．０００１（＊＊＊＊），ｎｓ：一元配置分散分析で比較してＰＤと有意差がない)。
【0078】
図５は、高濃度サポニン介在性のトランスフェクションにおける、トランスフェクションの効率を示す。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞は、サポニンを共添加した場合と、添加しなかった場合のそれぞれについて、上記で説明したようにＧＦＰプラスミドを有するナノプレックスでトランスフェクトされた。サポニンＧＥ１７４１、ＳＯ１８６１およびＡＧ１８５６は、その作業濃度または２４μｇ／ｍＬの濃度で使用された。ＧＥ１７４１とＳＯ１８６１の作業濃度は、無毒性である範囲の最も高い濃度を示している。ＡＧ１８５６では、最も低い有効濃度を示し、濃度を上げてもトランスフェクション効率の顕著な上昇は見られなかった（図４参照）。濃度を２４μｇ／ｍＬに増加した場合、ＧＥ１７４１とＳＯ１８６１ではその毒性により、効率が著しく低下したが、ＡＧ１８５６の場合は、むしろ効率が向上していることが確認された。リポフェクタミン3000はポジティブコントロールとして使用した。(Ｎ＝３；ｐ＜０．０１（＊＊），ｐ値＜０．０００１（＊＊＊＊），ｎｓ：一元配置分散分析で比較してＰＤと有意差がない）。
【0079】
図６Ａおよび６Ｂは、ＡＧ１８５６を介してＧＦＰ－ミニサークル－ＤＮＡまたはＲＩＰ－ミニサークル－ＤＮＡを含むナノプレックスを送達した際の細胞生存率試験である。この実験の目的は、無毒かつ高効率な遺伝子送達が可能であることを明らかにし、レポーター遺伝子だけでなく、腫瘍治療のための治療遺伝子の送達が可能であることを示すことであった。
【0080】
図６Ａは、ＧＦＰミニサークルＤＮＡ、サポリンニサークルＤＮＡ、ジアンチンミニサークルＤＮＡをトランスフェクションした際の生存率を示している。サポリンとジアンチンは細胞毒性を持つタンパク質である。トランスフェクションが成功した場合、トランスフェクションされた細胞は死滅する。
【0081】
図６Ａに描かれた曲線は、以下の測定結果を表している。
【0082】
【表4】
【0083】
ＡＧ１８５６を併用しない場合と併用した場合におけるＧＦＰミニサークルＤＮＡの毒性について、明確な差は観察されなかった。リボソーム不活性化タンパク質であるジアンチンおよびサポリンのナノプレックス（ジアンチンミニサークルDNAまたはサポリンミニサークルDNA）のトランスフェクションでは、ＡＧ１８５６を共存させた場合にのみ重篤な毒性を示した。ＡＧ１８５６単独では、毒性は確認できなかった。
【0084】
図６Ｂは、ＧＦＰ－ＤＮＡをコードするミニサークルＤＮＡ（ＤＮＡプラスミドよりも小さく、分解しにくく、効率が良い）を用いたトランスフェクションをＡＧ１８５６で行った場合、非常に効率的に遺伝子を送達できることを示す。フローサイトメトリー解析により、５個中４個の細胞が蛍光を発していた（ｎ≧３）。
【0085】
さらなる実験により、ＡＧ１８５６はインビボおよびインビトロにおいて低毒性であることが確認された。これらの実験について、以下に説明する。
【実施例】
【0086】
［ＡＧ１８５６と標的抗腫瘍ナノプラスミドとの併用によるインビボでの慢性毒性試験］
（目的）
本試験は、Naval Medical Research Institute（NMRI）のｎｕ／ｎｕマウスを用い、ナノプラスミド（ＮＰ）とＡＧ１８５６との併用投与による忍容性（tolerability）を評価するために実施された。
（目的）
本試験は、Naval Medical Research Institute（NMRI）のｎｕ／ｎｕマウスを用い、ナノプラスミド（ＮＰ）とＡＧ１８５６との併用投与による忍容性（tolerability）を評価するために実施された。
【0087】
（説明）
試験には、雌のＮＭＲＩｎｕ／ｎｕマウスを使用した。動物にＮＰ＋ＡＧ１８５６をそれぞれ５０および９０μｇ／マウスの用量で投与し、動物の回復後に同じ用量で第２ラウンドを行った。
試験には、雌のＮＭＲＩｎｕ／ｎｕマウスを使用した。動物にＮＰ＋ＡＧ１８５６をそれぞれ５０および９０μｇ／マウスの用量で投与し、動物の回復後に同じ用量で第２ラウンドを行った。
【0088】
（結果のまとめと考察）
本試験では、ＮＰ＋ＡＧ１８５６の併用投与を受けたマウスに副作用が出ないことが確認された。したがって、繰り返された全ての処置は、十分に許容された。図７に描かれた結果を参照して、体重の変化は見られなかった。
本試験では、ＮＰ＋ＡＧ１８５６の併用投与を受けたマウスに副作用が出ないことが確認された。したがって、繰り返された全ての処置は、十分に許容された。図７に描かれた結果を参照して、体重の変化は見られなかった。
【0089】
（結論）
結論として、本治療法は、所定用量を所定スケジュールで適用することにより、今後の治療実験に十分適用可能である。マウス一匹当たり９０μｇを適用した場合、他のサポニンをより高用量用いた場合と比較しても、ＡＧ１８５６が優れた忍容性を有していることが認められる。
結論として、本治療法は、所定用量を所定スケジュールで適用することにより、今後の治療実験に十分適用可能である。マウス一匹当たり９０μｇを適用した場合、他のサポニンをより高用量用いた場合と比較しても、ＡＧ１８５６が優れた忍容性を有していることが認められる。
【0090】
［ＡＧ１８５６とそれとは異なる標的抗腫瘍ナノプラスミドとの併用によるインビトロでの毒性試験］
（材料および方法）
ＡＧ１８５６によるトランスフェクション効率の向上を評価するために、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）を用いたトランスフェクション後の光学ベースの細胞毒性アセスメントを選択した。
（材料および方法）
ＡＧ１８５６によるトランスフェクション効率の向上を評価するために、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）を用いたトランスフェクション後の光学ベースの細胞毒性アセスメントを選択した。
【0091】
（プラスミド）
トランス遺伝子として、6-His-アグロスチン(Agrostin) RNA3 (Weise et al. 2020)および6-His-サポリン3 (Fabbrini et al. 1997)をBamHIおよびXbaI(アグロスチン)により、SalIおよびNheI切断を介してpMC.CMV-MCS- SV40polyA (BioCat GmbH, Heidelberg,ドイツ) にクローニングしてZYCY10P3S2T (Kay et al. 2010)とのミニサイクルを作製した。これに加えて、サポリン 3およびジプソフィリン（Gypsophillin） S (Kokorin et al. 2019)をNTC9385R-BGHpA-ナノプラスミドにクローニングし、上述したようにNature Technology Corporation (Lincoln, NB, USA)により合成した (Luke et al. 2011)。
トランス遺伝子として、6-His-アグロスチン(Agrostin) RNA3 (Weise et al. 2020)および6-His-サポリン3 (Fabbrini et al. 1997)をBamHIおよびXbaI(アグロスチン)により、SalIおよびNheI切断を介してpMC.CMV-MCS- SV40polyA (BioCat GmbH, Heidelberg,ドイツ) にクローニングしてZYCY10P3S2T (Kay et al. 2010)とのミニサイクルを作製した。これに加えて、サポリン 3およびジプソフィリン（Gypsophillin） S (Kokorin et al. 2019)をNTC9385R-BGHpA-ナノプラスミドにクローニングし、上述したようにNature Technology Corporation (Lincoln, NB, USA)により合成した (Luke et al. 2011)。
【0092】
（ナノプレックス形成）
３つのウェル（９６ウェルプレート）において、３００ｎｇのプラスミドＤＮＡを２５μＬの水で希釈し、２，１００ｎｇのペプチドＹ（Ｋ１６ ＧＡＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ） (GeneCust, Dudelage, Luxembourg)を含む溶液２５μＬに混合した。３０分のインキュベーション期間の後、ナノプレックスは自動的に形成された。
３つのウェル（９６ウェルプレート）において、３００ｎｇのプラスミドＤＮＡを２５μＬの水で希釈し、２，１００ｎｇのペプチドＹ（Ｋ１６ ＧＡＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ） (GeneCust, Dudelage, Luxembourg)を含む溶液２５μＬに混合した。３０分のインキュベーション期間の後、ナノプレックスは自動的に形成された。
【0093】
（細胞培養）
マウス神経芽細胞腫細胞Neuro2A (ATCC（登録商標） CCL-131) を、１０％ＦＢＳおよび１％非必須アミノ酸を添加した BioWhittaker（登録商標）Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) (Lonza Group, Basel, Switzerland) で、５％ＣＯ２大気で３７℃の条件で培養した。
マウス神経芽細胞腫細胞Neuro2A (ATCC（登録商標） CCL-131) を、１０％ＦＢＳおよび１％非必須アミノ酸を添加した BioWhittaker（登録商標）Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) (Lonza Group, Basel, Switzerland) で、５％ＣＯ２大気で３７℃の条件で培養した。
【0094】
（トランスフェクション）
１ウェルあたり４，０００細胞が、９６ウェルプレートの清浄なウェルに播種され、２４時間培養された。この後、新たに配合されたナノプレックス（上述）、培地（上述）、およびＡＧ１８５６（５μｇ／ｍＬ）の混合液、またはコントロール用の水により培地交換を行った。これは、５００ｎｇ／ｍＬＤＮＡを含むウェルあたり２００μＬの培地となる。ネガティブコントロールとして水を、ポジティブコントロールとして５μｇ／ｍＬピューロマイシン(Carl Roth, Karlsruhe,ドイツ)を使用した。トランスフェクション後、４８時間細胞を観察した。
１ウェルあたり４，０００細胞が、９６ウェルプレートの清浄なウェルに播種され、２４時間培養された。この後、新たに配合されたナノプレックス（上述）、培地（上述）、およびＡＧ１８５６（５μｇ／ｍＬ）の混合液、またはコントロール用の水により培地交換を行った。これは、５００ｎｇ／ｍＬＤＮＡを含むウェルあたり２００μＬの培地となる。ネガティブコントロールとして水を、ポジティブコントロールとして５μｇ／ｍＬピューロマイシン(Carl Roth, Karlsruhe,ドイツ)を使用した。トランスフェクション後、４８時間細胞を観察した。
【0095】
（生細胞撮像）
細胞の各処理の細胞毒性は、1時間ごとに各ウェルの底面の写真を撮像するカメラベースのシステムであるＣｙｔｏＳＭＡＲＴ（登録商標）Ｏｍｎｉによって測定された。ＣｙｔｏＳＭＡＲＴ（登録商標）Ｏｍｎｉのソフトウェアは、底面に付着している生細胞によって形成される細胞密集度（confluence）を計算した。これにより、７２時間の間、細胞の成長をモニタリングすることができた。
細胞の各処理の細胞毒性は、1時間ごとに各ウェルの底面の写真を撮像するカメラベースのシステムであるＣｙｔｏＳＭＡＲＴ（登録商標）Ｏｍｎｉによって測定された。ＣｙｔｏＳＭＡＲＴ（登録商標）Ｏｍｎｉのソフトウェアは、底面に付着している生細胞によって形成される細胞密集度（confluence）を計算した。これにより、７２時間の間、細胞の成長をモニタリングすることができた。
【0096】
（結果と考察）
細胞密集度値は、グループ間の比較可能性を高めるため、介入のある時点で正規化した（Normalized Cell Index、NCI）。介入後、ＡＧ１８５６ではなくナノプレックスで処理した全てのウェルは、増殖の阻害の徴候を示さなかった。これらはネガティブコントロール群と同様の挙動を示し、部分的にはより良好な増殖さえも示した。ＡＧ１８５６のみで処理した細胞は、ネガティブコントロール群よりも１２％増殖が劣っていたが、ナノプレックスとＡＧ１８５６を併用した群の細胞毒性は、より大きかった。細胞は、３６時間を経過した後は、それ以上の増殖を示さなかった。これは、３６時間を経過した後にＲＩＰが形成されてタンパク質の生合成が阻害され、それにより細胞障害性効果が得られたと考えられるため、トランスフェクションに成功したことが示唆される。ポジティブコントロールもほぼ同様の挙動を示したが、細胞賦活効果が観察されるまでのラグ期間は見られなかった。その理由は、ピューロマイシンを形成するまでもなく、瞬時に細胞の成長を阻害することができたからである。
細胞密集度値は、グループ間の比較可能性を高めるため、介入のある時点で正規化した（Normalized Cell Index、NCI）。介入後、ＡＧ１８５６ではなくナノプレックスで処理した全てのウェルは、増殖の阻害の徴候を示さなかった。これらはネガティブコントロール群と同様の挙動を示し、部分的にはより良好な増殖さえも示した。ＡＧ１８５６のみで処理した細胞は、ネガティブコントロール群よりも１２％増殖が劣っていたが、ナノプレックスとＡＧ１８５６を併用した群の細胞毒性は、より大きかった。細胞は、３６時間を経過した後は、それ以上の増殖を示さなかった。これは、３６時間を経過した後にＲＩＰが形成されてタンパク質の生合成が阻害され、それにより細胞障害性効果が得られたと考えられるため、トランスフェクションに成功したことが示唆される。ポジティブコントロールもほぼ同様の挙動を示したが、細胞賦活効果が観察されるまでのラグ期間は見られなかった。その理由は、ピューロマイシンを形成するまでもなく、瞬時に細胞の成長を阻害することができたからである。
【0097】
図８は、詳細な結果、すなわち、介入時点（ｔ＝２４ｈ）で正規化した細胞密集度を示している。曲線は、以下のコンストラクトで処理した後の細胞密集度を表す。
【0098】
【表5】
【0099】
ＲＩＰ－ナノプレックスとＡＧ１８５６で処理したすべてのグループは、細胞増殖が強く停滞したが、ナノプレックスのみで処理しＡＧ１８５６を用いなかったグループへの介入は、細胞増殖に影響を与えなかった。
【0100】
（結論）
ＡＧ１８５６は、ＲＩＰをコードするナノプレックスの細胞毒性効果において極めて重要であった。このトランスフェクション増強剤がなければ、細胞毒性効果は観察されなかった。
ＡＧ１８５６は、ＲＩＰをコードするナノプレックスの細胞毒性効果において極めて重要であった。このトランスフェクション増強剤がなければ、細胞毒性効果は観察されなかった。
【0101】
（毒性試験に関する参照文献）
M.S. Fabbrini, E. Rappocciolo, D. Carpani, et al., Characterization of a Saporin isoform with lower ribosome-inhibiting activity, The Biochemical journal, 322 (Pt 3) (1997) 719-727
M.A. Kay, C.-Y.He und Z.-Y.Chen, A robust system for production of minicircle DNA vectors, Nature Biotechnology, 28 (2010) 1287-1289
A.Kokorin, C. Weise, S. Sama, et al., A new type 1 ribosome-inactivating protein from seeds of Gypsophila elegans M.Bieb, Phytochemistry, 157 (2019) 121-127
J.M. Luke, J. M. Vincent, S. X. Du, et al., Improved antibiotic-free plasmid vector design by incorporation of transient expression enhancers, Gene Therapy, 18 (2011) 334-343
C.Weise, A. Schrot, L. T. D. Wuerger, et al., An unusual type I ribosome-inactivating protein from Agrostemma githago L, Scientific Reports, 10 (2020) 15377
M.S. Fabbrini, E. Rappocciolo, D. Carpani, et al., Characterization of a Saporin isoform with lower ribosome-inhibiting activity, The Biochemical journal, 322 (Pt 3) (1997) 719-727
M.A. Kay, C.-Y.He und Z.-Y.Chen, A robust system for production of minicircle DNA vectors, Nature Biotechnology, 28 (2010) 1287-1289
A.Kokorin, C. Weise, S. Sama, et al., A new type 1 ribosome-inactivating protein from seeds of Gypsophila elegans M.Bieb, Phytochemistry, 157 (2019) 121-127
J.M. Luke, J. M. Vincent, S. X. Du, et al., Improved antibiotic-free plasmid vector design by incorporation of transient expression enhancers, Gene Therapy, 18 (2011) 334-343
C.Weise, A. Schrot, L. T. D. Wuerger, et al., An unusual type I ribosome-inactivating protein from Agrostemma githago L, Scientific Reports, 10 (2020) 15377
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】