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▶ エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-22
(54)【発明の名称】グアニジノ酢酸の発酵生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20230215BHJP
C12P 13/00 20060101ALI20230215BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20230215BHJP
C12N 15/60 20060101ALN20230215BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20230215BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20230215BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P13/00
C12N15/54
C12N15/60
C12N15/53
C12N9/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022537864
(86)(22)【出願日】2020-12-14
(85)【翻訳文提出日】2022-06-17
(86)【国際出願番号】 EP2020085882
(87)【国際公開番号】W WO2021122400
(87)【国際公開日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】19218204.6
(32)【優先日】2019-12-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519414848
【氏名又は名称】エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｒｅｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １－１１， ４５１２８ Ｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(72)【発明者】
【氏名】フランク シュナイダー
(72)【発明者】
【氏名】フランク ヤンコヴィッチュ
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050DD01
4B050DD02
4B050DD11
4B050LL05
4B064AE01
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE16
4B064CE20
4B064DA11
4B064DA20
4B065AA24X
4B065AA26X
4B065AA44X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA10
4B065CA16
4B065CA43
(57)【要約】
本発明は、Ｌ－アルギニン：グリシンアミドトランスフェラーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、ならびにアルギニンオペロンのａｒｇＦ、ａｒｇＧおよびａｒｇＨの発現の増加によってグアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を生産することができるように形質転換された微生物、ならびにかかる微生物を用いたＧＡＡの発酵生産方法に関する。本発明は、クレアチンの発酵生産方法にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カルバモイルリン酸シンターゼの機能を有する酵素の活性が、野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加しており、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む微生物。
【請求項2】
前記カルバモイルリン酸シンターゼの機能を有する酵素の活性の増加が、前記カルバモイルリン酸シンターゼの機能を有する酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または過剰発現によって達成される、請求項１記載の微生物。
【請求項3】
前記Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの活性が、前記Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の突然変異および／または過剰発現によって増加する、請求項１または２記載の微生物。
【請求項4】
Ｌ－アルギニンを生産する能力が前記野生型微生物の能力と比較して改善されている、請求項１から３までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項5】
アルギニノコハク酸リアーゼの機能を有する酵素の活性が、前記野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加している、請求項４記載の微生物。
【請求項6】
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの機能を有する酵素の活性が、前記野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加している、請求項４または５記載の微生物。
【請求項7】
アルギニノコハク酸シンテターゼの機能を有する酵素の活性が、前記野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加している、請求項４から６までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項8】
前記酵素の活性の増加が、それぞれの酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または過剰発現によって達成される、請求項４から７までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項9】
アルギニンオペロン（ａｒｇＣＪＢＤＦＲ）が過剰発現している、請求項４から８までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項10】
アルギニン応答性リプレッサータンパク質ＡｒｇＲをコードするａｒｇＲ遺伝子が、減衰または欠失している、請求項４から８までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項11】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ、アセチルグルタミン酸キナーゼ、アセチルグルタミルリン酸レダクターゼおよびアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをそれぞれコードするｇｄｈ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣおよび／またはａｒｇＤを含む、Ｌ－オルニチンおよびＬ－アルギニンの生合成経路の酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つ以上が過剰発現している、請求項４から８までまたは１０のいずれか１項記載の微生物。
【請求項12】
前記Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質が、配列番号２によるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から１１までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項13】
前記Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質が、配列番号１６によるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から１１までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項14】
前記Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質が、配列番号２４によるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から１１までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項15】
前記Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質が、配列番号２０によるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から１１までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項16】
前記微生物がコリネバクテリウム属、腸内細菌科属またはシュードモナス属に属する、請求項１から１５までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項17】
前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１６記載の微生物。
【請求項18】
前記微生物がエシェリキア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１６記載の微生物。
【請求項19】
前記微生物がシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）である、請求項１６記載の微生物。
【請求項20】
ａ）請求項１から１９までのいずれか１項記載の微生物を発酵培地中で培養する工程と、ｂ）前記培地中にＧＡＡを蓄積させてＧＡＡ含有発酵ブロスを形成する工程とを含む、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）の発酵生産方法。
【請求項21】
前記ＧＡＡ含有発酵ブロスからＧＡＡを単離することをさらに含む、請求項２０記載の方法。
【請求項22】
前記ＧＡＡ含有発酵ブロスを乾燥および／または顆粒化することをさらに含む、請求項２０記載の方法。
【請求項23】
グアニジノ酢酸Ｎ－メチルトランスフェラーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１から１９までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項24】
前記グアニジノ酢酸Ｎ－メチルトランスフェラーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子が過剰発現している、請求項２３記載の微生物。
【請求項25】
ａ）請求項２３または２４記載の微生物を発酵培地中で培養する工程と、ｂ）前記培地中にクレアチンを蓄積させてクレアチン含有発酵ブロスを形成する工程とを含む、クレアチンの発酵生産方法。
【請求項26】
前記クレアチン含有発酵ブロスからクレアチンを単離することをさらに含む、請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を生産することができるように形質転換された微生物、ならびにかかる微生物を用いたＧＡＡの発酵生産方法に関する。本発明は、クレアチンの発酵生産方法にも関する。
【0002】
ＧＡＡは、動物用飼料添加物として使用されている有機化合物である（国際公開第２００５１２０２４６号／米国特許出願公開第２０１１２５７０７５号明細書）。ＧＡＡは、クレアチンの天然前駆体である（例えば、Humm et al., Biochem. J. (1997) 322, 771-776）。したがって、ＧＡＡの補給により生物へのクレアチンの最適な供給が可能となる。
【0003】
本発明は、産業用供給原料（例えばアンモニア、アンモニウム塩、およびグルコースまたは糖を含有する基質）を出発物質として用いた発酵プロセスによってＧＡＡを生産する方法に関する。生体系では、ＧＡＡおよびオルニチンは、出発物質としてのアルギニンおよびグリシンからＬ－アルギニン：グリシン－アミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ；ＥＣ ２．１．４．１）の触媒作用によって形成され、これがクレアチン生合成の第１段階である（米国特許出願公開第２００６０２００８７０号明細書）：
【化1】
【0004】
Guthmiller et al.（J Biol Chem. 1994 Jul 1;269(26):17556-60）は、酵素をＥ．コリ（E. coli）にクローニングし、異種発現させることによってラット腎臓ＡＧＡＴを特性評価した。Muenchhoff et al.（FEBS Journal 277 (2010) 3844-3860）は、同様に酵素をＥ．コリ（E. coli）にクローニングし、異種発現させることによる、原核生物に由来するＡＧＡＴの最初の特性評価を報告している。Sosio et al.（Cell Chemical Biology 25, 540-549, May 17, 2018）は、ストレプトマイセス属種におけるシュードウリジマイシン（pseudouridimycin）の生合成経路を解明した。Sosio et al.は、Ｌ－アルギニン：グリシン－アミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）であるＰｕｍＮによって触媒されるＬ－アルギニンとグリシンとの反応によるＧＡＡおよびＬ－オルニチンの形成を中間反応として記載している。Humm et al.は、ヒトＡＧＡＴをコードする組換え遺伝子をエシェリキア・コリ（Escherichia coli）で発現させ、ＡＧＡＴの活性部位残基としてシステイン－４０７を同定した（Biochem. J. (1997) 322, 771-776）。
【0005】
Mijts et al.（国際公開第２０１８０７９６８７号）は、微生物における目的物質、例えばバニリンおよびバニリン酸の生産との関連で、クレアチンがＬ－アルギニンおよびグリシンから生産され得ることを開示している。Mijts et al.は、これがＬ－アルギニン生合成酵素、グリシン生合成酵素、ならびにＬ－アルギニンおよびグリシンのクレアチンへの変換を触媒する酵素を用いることで達成され得ることをさらに提唱している。Ｌ－アルギニンおよびグリシンを組み合わせることで、ＡＧＡＴ（ＥＣ ２．１．４．１）の作用によってグアニジノ酢酸（ＧＡＡ）およびオルニチンを生成することができ、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）をメチル供与体として用いて、このＧＡＡをグアニジノ酢酸Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＴ、ＥＣ ２．１．１．２）の作用によってメチル化し、クレアチンを生成することができる。Mijts et al.は、ポリアミンの生産との関連で、Ｌ－アルギニン生合成酵素の例には、既知のＬ－オルニチン生合成酵素だけでなく、いわゆるＬ－オルニチンサイクルで知られる酵素、すなわちカルバモイルリン酸シンターゼ（ｃａｒＡＢ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ａｒｇＦ、ａｒｇＩ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ａｒｇＧ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇＨ）も含まれ得ると述べている（Marc et al., Eur. J. Biochem. 267, 5217-5226, 200を参照）。
【0006】
また、微生物、特に細菌においてＧＡＡ合成の出発物質の１つ、すなわちＬ－アルギニンの生産を増加させる幾つかのより具体的なアプローチも文献から知られている。Ｌ－アルギニン生産のためのコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum））の代謝工学の概要が、Park et al.によって与えられる（NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618）。Park et al.は、既にＬ－アルギニンを生産するＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株、例えばＡＴＣＣ ２１８３１（Nakayama and Yoshida 1974、米国特許第３８４９２５０号明細書）のＬ－アルギニン生産株のランダム突然変異誘発およびスクリーニング、ならびに系全体の代謝分析に基づく段階的な合理的代謝工学が、菌株操作工程を通したＬ－アルギニン生産の漸増をもたらすことを提唱している。Yim et al.（J Ind Microbiol Biotechnol (2011) 38:1911-1920）は、Ｌ－アルギニン生合成経路を制御する主要リプレッサータンパク質ＡｒｇＲをコードする遺伝子であるａｒｇＲを、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）において染色体ａｒｇＲ遺伝子の破壊によって不活性化することで、改良されたアルギニン生産株が得られると示すことができた。Ginesy et al.（Microbial Cell Factories (2015) 14:29）は、アルギニン生産の向上のためのＥ．コリ（E. coli）の操作の成功を報告している。特に、Ginesy et al.は、ａｒｇＲリプレッサー遺伝子の欠失を提唱した。
【0007】
Kurahashi et al.（欧州特許出願公開第１０５７８９３号明細書）は、組換えＤＮＡ技術を用いて、例えば、エシェリキア属に属する微生物に由来するアセチルオルニチンデアセチラーゼ、Ｎ－アセチルグルタミン酸－γ－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｎ－アセチルグルタモキナーゼおよびアルギニノスクシナーゼの遺伝子を有するベクターＤＮＡおよびＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡを保有するようにしたコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物を用いることで、Ｌ－アルギニン生合成酵素を増強することによって微生物のＬ－アルギニン生産能を高める方法について報告している。Kurahashi et al.は、Ｌ－アルギニン生産の改善のために、細胞内グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の活性が高められ、Ｌ－アルギニン生産能を有する微生物をさらに提唱している。
【0008】
アルギニン生合成オペロンの発現を阻害する遺伝子であるａｒｇＲを不活性化した遺伝子組換え株を使用する方法が、Suga et al.（米国特許第７１６０７０５号明細書）によって報告されている。特に、アルギニンオペロンを制御するａｒｇＲの欠失は、アルギニン生産において重要な因子であると考えられてきた。
【0009】
コリネバクテリウムの微生物では、アルギニン生合成に関与するａｒｇＣＪＢＤＦＲ遺伝子は、オペロンの形態で構成され、細胞内アルギニンによるフィードバック阻害を受けるため（Sakanyan et al., Microbiology, 142:9-108, 1996）、その高収率のＬ－アルギニン生産は制限される。
【0010】
しかしながら、Bae et al.（欧州特許出願公開第３１５３５７３号明細書）は、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）におけるＬ－アルギニンの生産収率を増加させる試みの中で、アルギニンオペロンおよびオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ、ＡｒｇＦ２）の活性を高めることで、アルギニンリプレッサー（ａｒｇＲ）を欠失させることなく、親Ｌ－アルギニン生産株と比較して高い収率でＬ－アルギニンを生産し得ることを発見した。
【0011】
アルギニンオペロンは、Ｌ－アルギニン生合成機構に関与する酵素をコードする遺伝子からなるオペロンであり、特に、アルギニンオペロンは、Ｌ－アルギニン生合成の周期的段階を構成する酵素をコードする遺伝子からなる。具体的には、アルギニンオペロンは、Ｎ－アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、グルタミン酸Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、Ｎ－アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）およびアルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）からなる。これらの酵素は、Ｌ－アルギニン生合成の連続酵素反応に関与し、ａｒｇＲにコードされるアルギニンリプレッサーによって制御される（国際公開第２００６／０５７４５０号）。
【0012】
Fan Wenchaoは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）等の非病原性微生物の発酵によってクレアチンを生産する方法を開示している（中国特許出願公開第１０６０６５４１１号明細書）。この微生物は、以下の生体内変換機能を有する：Ｌ－グルタミン酸へのグルコースの変換；Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸へのＬ－グルタミン酸の変換；Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸セミアルデヒドへのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸の変換；Ｎ－アセチル－Ｌ－オルニチンへのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸セミアルデヒドの変換；Ｌ－オルニチンへのＮ－アセチル－Ｌ－オルニチンの変換；Ｌ－シトルリンへのＬ－オルニチンの変換；アルギニノコハク酸へのＬ－シトルリンの変換；Ｌ－アルギニンへのアルギニノコハク酸の変換；グアニジノ酢酸へのＬ－アルギニンの変換；最終的にクレアチンへのグアニジノ酢酸の変換。Fan Wenchaoは、微生物がＮ－アセチルグルタミン酸シンターゼ、Ｎ－アセチルオルニチン－δ－アミノトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルオルニチナーゼ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．１．４．１）およびグアニジノ酢酸Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．１．１．２）からなる群から選択される１つ以上の酵素を過剰発現すると提唱している。微生物は、好ましくはグリシンアミノトランスフェラーゼ（Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ）およびグアニジノ酢酸Ｎ－メチルトランスフェラーゼを過剰発現する。
【0013】
これまで、野生型形態と比較してＧＡＡの生産を増加させるのに適した微生物、およびかかる微生物を用いたＧＡＡのそれぞれの生産方法は報告されていない。
【0014】
したがって、本発明の根底にある課題は、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を生産することができるように形質転換された微生物、およびかかる微生物を用いたＧＡＡの発酵生産方法を提供することである。
【0015】
この課題は、カルバモイルリン酸シンターゼ（ＥＣ ６．３．４．１６）の機能を有する酵素の活性が、野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加しており、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）の機能を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む微生物によって解決される。
【0016】
異種遺伝子とは、遺伝子が本来この遺伝子を有しない宿主生物に挿入されていることを意味する。宿主への異種遺伝子の挿入は、組換えＤＮＡ技術によって行われる。組換えＤＮＡ技術を受けた微生物は、トランスジェニック、遺伝子操作または組換え体と称される。このため、本発明による微生物は組換え体である。
【0017】
カルバモイルリン酸シンターゼの機能を有する酵素の活性の増加は、カルバモイルリン酸シンターゼの機能を有する酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または過剰発現によって達成することができる。
【0018】
Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの活性は、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の突然変異および／または過剰発現によっても増加させることができる。
【0019】
Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）の機能を有するタンパク質は、アミジノトランスフェラーゼファミリーに属する。アミジノトランスフェラーゼファミリーは、それぞれクレアチンおよびストレプトマイシンの生合成に関与する酵素である、グリシン（ＥＣ：２．１．４．１）およびイノサミン（ＥＣ：２．１．４．２）アミジノトランスフェラーゼを含む。このファミリーは、アルギニンデイミナーゼ、ＥＣ：３．５．３．６も含む。これらの酵素は、反応：アルギニン＋Ｈ２Ｏ⇔シトルリン＋ＮＨ３を触媒する。このファミリーには、ストレプトコッカス抗腫瘍糖タンパク質も含まれる。Ｌ－アルギニン：グリシン－アミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）活性を有する酵素またはタンパク質が、ＰＦＡＭファミリー：Ａｍｉｄｉｎｏｔｒａｎｓｆ（ＰＦ０２２７４）に属する保存ドメインを有することも記載されており（：Marchler-Bauer A et al. (2017), “CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily domain architectures.”, Nucleic Acids Res. 45(D1):D200-D203.）、これは以下の刊行物にも記載されている：Pissowotzki K et al. , Mol Gen Genet 1991;231:113-123 (PUBMED:1661369 EPMC:1661369)；D’Hooghe I et al., J Bacteriol 1997;179:7403-7409 (PUBMED:9393705 EPMC:9393705)；Kanaoka M et al. , Jpn J Cancer Res 1987;78:1409-1414 (PUBMED:3123442 EPMC:3123442)。ＡＧＡＴの特定の例は、モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）、ラットゥス・ノルウェギクス（Rattus norvegicus）、ガレオプテラス・バリエガタス（Galeopterus variegatus）およびシリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ（Cylindrospermopsis raciborskii）のものである。
【0020】
本発明による微生物は、理想的には、Ｌ－アルギニンを生産する能力が野生型微生物の能力と比較して改善されている。この特性は、天然のＬ－アルギニン生産株であるか、または突然変異によってＬ－アルギニンを生産する能力を獲得したものであってもよい微生物の選択によって達成することができる。
【0021】
Ｌ－アルギニンを生産する能力が野生型微生物の能力と比較して改善された、本発明による微生物は、アルギニノコハク酸リアーゼ（Ｅ．Ｃ． ４．３．２．１）の機能を有する酵素の活性が、野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加していてもよい。
【0022】
さらに、本発明による微生物では、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．１．３．３）の機能を有する酵素の活性が、野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加していてもよい。
【0023】
本発明による微生物では、アルギニノコハク酸シンテターゼ（Ｅ．Ｃ． ６．３．４．５）の機能を有する酵素の活性も、野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加していてもよい。
【0024】
微生物における酵素活性の増加は、例えば対応する内在性遺伝子の突然変異によって達成することができる。酵素活性を増加させる更なる手段は、酵素をコードするｍＲＮＡを安定化させることであり得る。
【0025】
上述の酵素の活性の増加は、それぞれの酵素をコードする遺伝子を過剰発現させることによっても達成することができる。言い換えると、この課題は、好ましくは、Ｌ－アルギニンを生産する能力が野生型生物の能力と比較して改善されており、かつ／またはカルバモイルリン酸シンターゼ（ＥＣ ６．３．４．１６）の機能を有するタンパク質をコードする、少なくとも１つ以上の過剰発現された遺伝子（例えばｃａｒＡ、ｃａｒＢ）を有し、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ、例えばＥＣ ２．１．４．１）の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む微生物によって解決される。
【0026】
本発明による微生物は、好ましくは、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．１．３．３）の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（例えばａｒｇＦ／ａｒｇＦ２／ａｒｇＩ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（Ｅ．Ｃ． ６．３．４．５）の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（例えばａｒｇＧ）、およびアルギニノコハク酸リアーゼ（Ｅ．Ｃ． ４．３．２．１）の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（例えばａｒｇＨ）からなる群から選択される少なくとも１つ以上の過剰発現された遺伝子も含む。
【0027】
遺伝子の過剰発現は概して、遺伝子のコピー数を増加させること、および／または遺伝子を強力なプロモーターと機能的に連結すること、および／またはリボソーム結合部位を増強すること、および／または開始コドンもしくは遺伝子全体のコドン使用頻度を最適化すること、または上述の全ての方法の選択を含む組合せによって達成される。
【0028】
本発明との関連で、Ｌ－アルギニンを生産する能力が改善された微生物とは、自身の必要量を上回るＬ－アルギニンを生産する微生物を指す。かかるＬ－アルギニン生産微生物の例は、例えばＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ ２１８３１、またはPark et al.（NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618）もしくはGinesy et al.（Microbial Cell Factories (2015) 14:29）によって開示されているものである。
【0029】
本発明による微生物の一実施形態では、アルギニンオペロン（ａｒｇＣＪＢＤＦＲ）が過剰発現していてもよい。
【0030】
代替的には、本発明による微生物においては、アルギニン応答性リプレッサータンパク質ＡｒｇＲをコードするａｒｇＲ遺伝子が減衰または欠失していてもよい。
【0031】
本発明の更なる実施形態では、また任意に、上述の修飾に加えて、それぞれグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ、アセチルグルタミン酸キナーゼ、アセチルグルタミルリン酸レダクターゼおよびアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードするｇｄｈ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣおよび／またはａｒｇＤからなる、Ｌ－アルギニンの生合成経路の酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つ以上が、本発明による微生物において過剰発現されている。
【0032】
様々な種、すなわちＥ．コリ（E. coli）、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）およびシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）（Ｐ．プチダ（P. putida））におけるアルギニン生合成に関与または寄与する酵素の様々な名称を表１に示す。
【0033】
本発明の微生物においては、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子がさらに過剰発現されていてもよい。遺伝子の過剰発現は概して、遺伝子のコピー数を増加させること、および／または遺伝子を強力なプロモーターと機能的に連結すること、および／またはリボソーム結合部位を増強すること、および／または開始コドンもしくは遺伝子全体のコドン使用頻度を最適化すること、または上述の全ての方法の選択を含む組合せによって達成される。
【0034】
【表1-1】
【表1-2】
【0035】
本発明の微生物中のＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）の機能を有するタンパク質は、配列番号２または配列番号４（モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）の「ＡＧＡＴ＿Ｍｐ」）によるアミノ酸配列と少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含み得る。本発明の更なる実施形態では、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２または配列番号４によるアミノ酸配列と同一である（データベースＵｎｉＰｒｏｔ、２０１７年２月１５日、「グリシンアミジノトランスフェラーゼ」、ＸＰ０５５７０６８５３、ＥＢＩアクセッション番号ＵＮＩＰＲＯＴ：Ａ０Ａ１Ｄ８ＴＫＤ３を参照）。モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）ＡＧＡＴをコードする野生型ＤＮＡの配列は、配列番号１であり、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）に対してコドン最適化された対応するＤＮＡ配列は、配列番号３である。Ｐ．プチダ（P. putida）に対してコドン最適化されたモオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）ＡＧＡＴ遺伝子の対応するＤＮＡ配列は、配列番号３３である。
【0036】
本発明の微生物中のＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質は、配列番号１６または配列番号２６（シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ（Cylindrospermopsis raciborskii）ＡＴＷ２０５の「ＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡ」）によるアミノ酸配列と少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含み得る。本発明の更なる実施形態では、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１６または配列番号２６によるアミノ酸配列と同一である。シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ（Cylindrospermopsis raciborskii）ＡＧＡＴをコードする野生型ＤＮＡの配列は、配列番号１５であり、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）に対してコドン最適化された対応するＤＮＡ配列は、配列番号２５である。
【0037】
本発明の微生物中のＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質は、配列番号２３（ガレオプテラス・バリエガタス（Galeopterus variegatus）の「ＡＧＡＴ＿Ｇｖ」）、好ましくは配列番号２４または配列番号３２によるアミノ酸配列と少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含み得る。本発明の更なる実施形態では、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２４または配列番号３２によるアミノ酸配列と同一である。Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）に対してコドン最適化された対応するガレオプテラス・バリエガタス（Galeopterus variegatus）ＡＧＡＴ ＤＮＡの配列は、配列番号３１である。
【0038】
本発明の微生物中のＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質は、配列番号１８（ホモ・サピエンス（homo sapiens）の「ＡＧＡＴ＿Ｈｓ」）、好ましくは配列番号２０または配列番号２８によるアミノ酸配列、例えば配列番号２１または配列番号２２または配列番号３０（それぞれラットゥス・ノルウェギクス（Rattus norvegicus）の「ＡＧＡＴ Ｒｎ」；Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）に対してコドン最適化された対応するＤＮＡは、配列番号２９である）によるアミノ酸配列と少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含み得る。本発明の更なる実施形態では、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１８によるアミノ酸配列と同一である。ホモ・サピエンス（Homo sapiens）ＡＧＡＴをコードする野生型ＤＮＡの配列は、配列番号１７であり、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）に対してコドン最適化された対応するＤＮＡ配列は、配列番号２７である。
【0039】
本発明の微生物は、コリネバクテリウム属、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum））、または腸内細菌科、好ましくはエシェリキア・コリ（Escherichia coli）（Ｅ．コリ（E. coli））、またはシュードモナス属、好ましくはシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）（Ｐ．プチダ（P. putida））に属していてもよい。
【0040】
概して、微生物における酵素活性の増加は、例えば対応する内在性遺伝子の突然変異によって達成することができる。酵素活性は、対応する遺伝子の過剰発現によっても高めることができる。
【0041】
概して、本発明による遺伝子の過剰発現は、遺伝子のコピー数を増加させること、および／または調節因子を増強すること、例えば遺伝子を強力なプロモーターと機能的に連結すること、および／またはリボソーム結合部位を増強すること、および／または開始コドンもしくは遺伝子全体のコドン使用頻度を最適化することによって達成される。遺伝子発現に正の影響を与える、かかる調節因子の増強は、例えば、プロモーターの有効性を高めるために構造遺伝子の上流のプロモーター配列を修飾するか、または上記のプロモーターをより有効な、もしくはいわゆる強力なプロモーターに完全に置き換えることによって達成することができる。プロモーターは、遺伝子の上流に位置する。プロモーターは、約４０～５０塩基対からなるＤＮＡ配列であり、ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の結合部位および転写開始点を構成し、制御されるポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現の強さに影響を与えることができる。概して、強力なプロモーターを選択すること、例えば元のプロモーターを強力なネイティブ（本来他の遺伝子に割り当てられる）プロモーターに置き換えること、または例えばM. Patek et al.（Microbial Biotechnology 6 (2013), 103-117）によってＣ．グルタミカム（C. glutamicum）について教示されるように、所与のネイティブプロモーターの或る特定の領域（例えば、そのいわゆる－１０および－３５領域）をコンセンサス配列に向けて修飾することによって、細菌における遺伝子の過剰発現または発現の増加を達成することが可能である。「機能的な連結」とは、プロモーターが遺伝子と連続して配置され、遺伝子の転写がもたらされることを意味すると理解される。
【0042】
遺伝コードが縮重し、すなわち、或る特定のアミノ酸が複数の異なるトリプレットでコードされていてもよい。コドン使用頻度という用語は、或る特定の生物が、通常は或る特定のアミノ酸について可能な全てのコドンを同じ頻度では使用しないという観察結果を指す。代わりに、生物は通常、特定のコドンに対して或る特定の選好性を示し、すなわち、これらのコドンが生物の転写遺伝子のコード配列により頻繁に見られる。将来の宿主にとって異質の、すなわち異なる種に由来する或る特定の遺伝子が、将来の宿主生物において発現されることが望ましい場合、上記遺伝子のコード配列を上記将来の宿主生物のコドン使用頻度に応じて調整する必要がある（すなわち、コドン使用頻度の最適化）。
【0043】
上述の課題は、ａ）上に定義した本発明による微生物を好適な培地において好適な条件下で培養する工程と、ｂ）培地中にＧＡＡを蓄積させてＧＡＡ含有発酵ブロスを形成する工程とを含む、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）の発酵生産方法によってさらに解決される。
【0044】
本発明による方法は、培地にグリシンを添加し、かつ／またはＬ－アルギニンを添加し、かつ／またはＬ－オルニチンを添加することをさらに含み得る。好ましくは、培地に培地１ｌ当たり０．１～３００ｇのグリシン、好ましくは培地１ｌ当たり０．８２ｇのグリシンの範囲の濃度でグリシンを添加し、かつ／または培地１ｌ当たり０．１～２００ｇのＬ－アルギニン、好ましくは培地１ｌ当たり１．９ｇのＬ－アルギニンの範囲の濃度が得られるようにＬ－アルギニンを添加する。
【0045】
本発明の方法は、ＧＡＡを発酵ブロスから単離する工程をさらに含み得る。
【0046】
本発明による方法は、ＧＡＡ含有発酵ブロスを乾燥および／または顆粒化する工程をさらに含み得る。
【0047】
本発明は、グアニジノ酢酸Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．１．１．２）の活性を有する酵素をコードする遺伝子をさらに含む、上に定義した微生物にさらに関する。好ましくは、グアニジノ酢酸Ｎ－メチルトランスフェラーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子が過剰発現している。
【0048】
本発明は、ａ）グアニジノ酢酸Ｎ－メチルトランスフェラーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子を含む本発明による微生物を好適な培地において好適な条件下で培養する工程と、ｂ）培地中にクレアチンを蓄積させてクレアチン含有発酵ブロスを形成する工程とを含む、クレアチンの発酵生産方法にも関する。
【0049】
好ましくは、方法は、クレアチンをクレアチン含有発酵ブロスから単離することをさらに含む。クレアチンは、等電点法および／またはイオン交換法によって発酵ブロスから抽出することができる。代替的には、水中で再結晶化する方法によってクレアチンをさらに精製することができる。
【0050】
実験の項
Ａ）材料および方法
化学物質
ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）に由来するカナマイシン溶液は、Sigma Aldrich（St. Louis，USA、カタログ番号Ｋ０２５４）から購入した。ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）は、Carl-Roth（Karlsruhe，Germany、カタログ番号２３１６．４．）から購入した。特に指定のない限り、他の全ての化学物質は、Merck（Darmstadt，Germany）、Sigma Aldrich（St. Louis，USA）またはCarl-Roth（Karlsruhe，Germany）から分析的に純粋なものを購入した。
Ａ）材料および方法
化学物質
ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）に由来するカナマイシン溶液は、Sigma Aldrich（St. Louis，USA、カタログ番号Ｋ０２５４）から購入した。ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）は、Carl-Roth（Karlsruhe，Germany、カタログ番号２３１６．４．）から購入した。特に指定のない限り、他の全ての化学物質は、Merck（Darmstadt，Germany）、Sigma Aldrich（St. Louis，USA）またはCarl-Roth（Karlsruhe，Germany）から分析的に純粋なものを購入した。
【0051】
細胞増殖のための培養
特に指定のない限り、培養／インキュベーション手順は、以下のように行った：
ａ．Merck（Darmstadt，Germany；カタログ番号１１０２８５）のＬＢブロス（ＭＩＬＬＥＲ）を使用して、Ｅ．コリ（E. coli）株を液体培地中で培養した。液体培養物（３バッフル付き１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ１本当たり１０ｍｌの液体培地）をInfors GmbH（Bottmingen，Switzerland）のＩｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄインキュベーターシェーカーにおいて３０℃および２００ｒｐｍでインキュベートした。
ｂ．Merck（Darmstadt，Germany、カタログ番号１１０２８３）のＬＢ寒天（ＭＩＬＬＥＲ）を寒天プレート上でのＥ．コリ（E. coli）株の培養に使用した。寒天プレートをVWR（Radnor，USA）のＩＮＣＵ－Ｌｉｎｅ（登録商標）小型インキュベーターにおいて３０℃でインキュベートした。
ｃ．Merck（Darmstadt，Germany、カタログ番号１１０４９３）のブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ）を使用して、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）株を液体培地中で培養した。液体培養物（３バッフル付き１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ１本当たり１０ｍｌの液体培地）をInfors GmbH（Bottmingen，Switzerland）のＩｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄインキュベーターシェーカーにおいて３０℃および２００ｒｐｍでインキュベートした。
ｄ．Merck（Darmstadt，Germany、カタログ番号１１３８２５）のブレインハート寒天（ＢＨＩ寒天）を寒天プレート上でのＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株の培養に使用した。Ｋｅｌｖｉｔｒｏｎ（登録商標）温度調節器を備えるHeraeus Instruments（Hanau，Germany）のインキュベーターにおいて寒天プレートを３０℃でインキュベートした。
ｅ．エレクトロポレーション後のＣ．グルタミカム（C. glutamicum）の培養のために、ＢＨＩ寒天（Merck，Darmstadt，Germany、カタログ番号１１３８２５）に１３４ｇ／ｌソルビトール（Carl Roth GmbH + Co. KG，Karlsruhe，Germany）、２．５ｇ／ｌ酵母エキス（Oxoid/ThermoFisher Scientific，Waltham，USA、カタログ番号ＬＰ００２１）および２５ｍｇ／ｌカナマイシンを添加した。Ｋｅｌｖｉｔｒｏｎ（登録商標）温度調節器を備えるHeraeus Instruments（Hanau，Germany）のインキュベーターにおいて寒天プレートを３０℃でインキュベートした。
特に指定のない限り、培養／インキュベーション手順は、以下のように行った：
ａ．Merck（Darmstadt，Germany；カタログ番号１１０２８５）のＬＢブロス（ＭＩＬＬＥＲ）を使用して、Ｅ．コリ（E. coli）株を液体培地中で培養した。液体培養物（３バッフル付き１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ１本当たり１０ｍｌの液体培地）をInfors GmbH（Bottmingen，Switzerland）のＩｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄインキュベーターシェーカーにおいて３０℃および２００ｒｐｍでインキュベートした。
ｂ．Merck（Darmstadt，Germany、カタログ番号１１０２８３）のＬＢ寒天（ＭＩＬＬＥＲ）を寒天プレート上でのＥ．コリ（E. coli）株の培養に使用した。寒天プレートをVWR（Radnor，USA）のＩＮＣＵ－Ｌｉｎｅ（登録商標）小型インキュベーターにおいて３０℃でインキュベートした。
ｃ．Merck（Darmstadt，Germany、カタログ番号１１０４９３）のブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ）を使用して、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）株を液体培地中で培養した。液体培養物（３バッフル付き１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ１本当たり１０ｍｌの液体培地）をInfors GmbH（Bottmingen，Switzerland）のＩｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄインキュベーターシェーカーにおいて３０℃および２００ｒｐｍでインキュベートした。
ｄ．Merck（Darmstadt，Germany、カタログ番号１１３８２５）のブレインハート寒天（ＢＨＩ寒天）を寒天プレート上でのＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株の培養に使用した。Ｋｅｌｖｉｔｒｏｎ（登録商標）温度調節器を備えるHeraeus Instruments（Hanau，Germany）のインキュベーターにおいて寒天プレートを３０℃でインキュベートした。
ｅ．エレクトロポレーション後のＣ．グルタミカム（C. glutamicum）の培養のために、ＢＨＩ寒天（Merck，Darmstadt，Germany、カタログ番号１１３８２５）に１３４ｇ／ｌソルビトール（Carl Roth GmbH + Co. KG，Karlsruhe，Germany）、２．５ｇ／ｌ酵母エキス（Oxoid/ThermoFisher Scientific，Waltham，USA、カタログ番号ＬＰ００２１）および２５ｍｇ／ｌカナマイシンを添加した。Ｋｅｌｖｉｔｒｏｎ（登録商標）温度調節器を備えるHeraeus Instruments（Hanau，Germany）のインキュベーターにおいて寒天プレートを３０℃でインキュベートした。
【0052】
細菌懸濁液の光学密度の決定
ａ．振盪フラスコ培養における細菌懸濁液の光学密度を、Eppendorf AG（Hamburg，Germany）のＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて６００ｎｍ（ＯＤ６００）で決定した。
ｂ．Wouter Duetz（WDS）のマイクロ発酵システム（２４ウェルプレート）において生成した細菌懸濁液の光学密度を、Tecan Group AG（Maennedorf，Switzerland）のＧＥＮｉｏｓ（商標）プレートリーダーを用いて６６０ｎｍ（ＯＤ６６０）で決定した。
ａ．振盪フラスコ培養における細菌懸濁液の光学密度を、Eppendorf AG（Hamburg，Germany）のＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて６００ｎｍ（ＯＤ６００）で決定した。
ｂ．Wouter Duetz（WDS）のマイクロ発酵システム（２４ウェルプレート）において生成した細菌懸濁液の光学密度を、Tecan Group AG（Maennedorf，Switzerland）のＧＥＮｉｏｓ（商標）プレートリーダーを用いて６６０ｎｍ（ＯＤ６６０）で決定した。
【0053】
遠心分離
ａ．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１７ Ｒ卓上遠心分離機（１３０００ｒｐｍで５分間）を用いて、最大容量２ｍｌの細菌懸濁液を１．５ｍｌまたは２ｍｌの反応管（例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｕｂｅｓ（登録商標） ３８１０Ｘ）で遠心分離した。
ｂ．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０ Ｒ卓上遠心分離機を用いて４０００ｒｐｍで１０分間、最大容量５０ｍｌの細菌懸濁液を１５ｍｌまたは５０ｍｌの遠心管（例えば、Ｆａｌｃｏｎ（商標）５０ｍｌコニカル遠心管）で遠心分離した。
ａ．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１７ Ｒ卓上遠心分離機（１３０００ｒｐｍで５分間）を用いて、最大容量２ｍｌの細菌懸濁液を１．５ｍｌまたは２ｍｌの反応管（例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｕｂｅｓ（登録商標） ３８１０Ｘ）で遠心分離した。
ｂ．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０ Ｒ卓上遠心分離機を用いて４０００ｒｐｍで１０分間、最大容量５０ｍｌの細菌懸濁液を１５ｍｌまたは５０ｍｌの遠心管（例えば、Ｆａｌｃｏｎ（商標）５０ｍｌコニカル遠心管）で遠心分離した。
【0054】
ＤＮＡ単離
Qiagen（Hilden，Germany、カタログ番号２７１０６）のＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用い、製造業者の指示に従って、プラスミドＤＮＡをＥ．コリ（E. coli）細胞から単離した。
Qiagen（Hilden，Germany、カタログ番号２７１０６）のＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用い、製造業者の指示に従って、プラスミドＤＮＡをＥ．コリ（E. coli）細胞から単離した。
【0055】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
プルーフリーディング（高忠実度）ポリメラーゼによるＰＣＲを用いて、サンガーシークエンシングまたはＤＮＡアセンブリのためにＤＮＡの所望のセグメントを増幅した。非プルーフリーディングポリメラーゼキットを用いて、Ｅ．コリ（E. coli）またはＣ．グルタミカム（C. glutamicum）のコロニーから直接、所望のＤＮＡフラグメントの有無を決定した。
プルーフリーディング（高忠実度）ポリメラーゼによるＰＣＲを用いて、サンガーシークエンシングまたはＤＮＡアセンブリのためにＤＮＡの所望のセグメントを増幅した。非プルーフリーディングポリメラーゼキットを用いて、Ｅ．コリ（E. coli）またはＣ．グルタミカム（C. glutamicum）のコロニーから直接、所望のＤＮＡフラグメントの有無を決定した。
【0056】
ａ．New England BioLabs Inc.（Ipswich，USA、カタログ番号Ｍ０５３０）のＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｋｉｔ（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ）を、製造業者の指示に従い、選択ＤＮＡ領域の鋳型補正（template-correct）増幅に使用した（表２を参照されたい）。
【0057】
【表2】
【0058】
ｂ．Qiagen（Hilden，Germany、カタログ番号２０１２０３）のＴａｑ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｔａｑ Ｋｉｔ）を用いてＤＮＡの所望のセグメントを増幅し、その存在を確認した。キットは、製造業者の指示に従って使用した（表３を参照されたい）。
【0059】
【表3】
【0060】
ｃ．タカラバイオ株式会社（Takara Bio Europe S.A.S.，Saint-Germain-en-Laye，France、カタログ番号ＲＲ３５０Ａ／Ｂ）のＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ（登録商標） Ｆａｓｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ｍｉｘ）を、製造業者の指示に従い、代替として使用して、Ｅ．コリ（E. coli）またはＣ．グルタミカム（C. glutamicum）のコロニーから採取した細胞中のＤＮＡの所望のセグメントの存在を確認した（表４を参照されたい）。
【0061】
【表4】
【0062】
ｄ．全てのオリゴヌクレオチドプライマーが、Eurofins Genomics GmbH（Ebersberg，Germany）により、McBride and Caruthers (1983)に記載のホスホロアミダイト法を用いて合成された。
ｅ．ＰＣＲ鋳型として単離プラスミドＤＮＡ、または液体培養物から単離した全ＤＮＡ、または細菌コロニーに含まれる全ＤＮＡ（コロニーＰＣＲ）のいずれかの適切に希釈した溶液を使用した。上記コロニーＰＣＲについては、寒天プレート上のコロニーから爪楊枝で細胞物質を採取し、細胞物質を直接ＰＣＲ反応管に入れることによって鋳型を準備した。細胞物質をSEVERIN Elektrogeraete GmbH（Sundern，Germany）のＭｉｋｒｏｗａｖｅ ＆ Ｇｒｉｌｌタイプの電子レンジにおいて８００Ｗで１０秒間加熱した後、ＰＣＲ試薬をＰＣＲ反応管内の鋳型に添加した。
ｆ．全てのＰＣＲ反応をEppendorf AG（Hamburg，Germany）のＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒまたはＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｎｅｘｕｓ ｇｒａｄｉｅｎｔタイプのＰＣＲサイクラーにおいて行った。
ｅ．ＰＣＲ鋳型として単離プラスミドＤＮＡ、または液体培養物から単離した全ＤＮＡ、または細菌コロニーに含まれる全ＤＮＡ（コロニーＰＣＲ）のいずれかの適切に希釈した溶液を使用した。上記コロニーＰＣＲについては、寒天プレート上のコロニーから爪楊枝で細胞物質を採取し、細胞物質を直接ＰＣＲ反応管に入れることによって鋳型を準備した。細胞物質をSEVERIN Elektrogeraete GmbH（Sundern，Germany）のＭｉｋｒｏｗａｖｅ ＆ Ｇｒｉｌｌタイプの電子レンジにおいて８００Ｗで１０秒間加熱した後、ＰＣＲ試薬をＰＣＲ反応管内の鋳型に添加した。
ｆ．全てのＰＣＲ反応をEppendorf AG（Hamburg，Germany）のＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒまたはＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｎｅｘｕｓ ｇｒａｄｉｅｎｔタイプのＰＣＲサイクラーにおいて行った。
【0063】
ＤＮＡの制限酵素消化
制限酵素消化には、「ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限エンドヌクレアーゼ（ＦＤ）」（ThermoFisher Scientific，Waltham，USA）またはNew England BioLabs Inc.（Ipswich，USA）の制限エンドヌクレアーゼのいずれかを使用した。反応は、製造業者のマニュアルの指示に従って行った。
制限酵素消化には、「ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限エンドヌクレアーゼ（ＦＤ）」（ThermoFisher Scientific，Waltham，USA）またはNew England BioLabs Inc.（Ipswich，USA）の制限エンドヌクレアーゼのいずれかを使用した。反応は、製造業者のマニュアルの指示に従って行った。
【0064】
ＤＮＡフラグメントのサイズの決定
ａ．小さなＤＮＡフラグメント（＜１０００ｂｐ）のサイズは、通常はQiagen（Hilden，Germany）のＱＩＡｘｃｅｌを用いた自動キャピラリー電気泳動によって決定した。
ｂ．ＤＮＡフラグメントを単離する必要があるか、またはＤＮＡフラグメントが＞１０００ｂｐである場合、ＤＮＡをＴＡＥアガロースゲル電気泳動によって分離し、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）核酸ゲル染色液（Biotium, Inc.、Fremont、Canada）で染色した。染色したＤＮＡを３０２ｎｍで可視化した。
ａ．小さなＤＮＡフラグメント（＜１０００ｂｐ）のサイズは、通常はQiagen（Hilden，Germany）のＱＩＡｘｃｅｌを用いた自動キャピラリー電気泳動によって決定した。
ｂ．ＤＮＡフラグメントを単離する必要があるか、またはＤＮＡフラグメントが＞１０００ｂｐである場合、ＤＮＡをＴＡＥアガロースゲル電気泳動によって分離し、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）核酸ゲル染色液（Biotium, Inc.、Fremont、Canada）で染色した。染色したＤＮＡを３０２ｎｍで可視化した。
【0065】
ＰＣＲ増幅産物および制限フラグメントの精製
ＰＣＲ増幅産物および制限フラグメントを、Qiagen（Hilden，Germany；カタログ番号２８１０６）のＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い、製造業者の指示に従ってクリーンアップした。ＤＮＡを３０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で溶出させた。
ＰＣＲ増幅産物および制限フラグメントを、Qiagen（Hilden，Germany；カタログ番号２８１０６）のＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い、製造業者の指示に従ってクリーンアップした。ＤＮＡを３０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で溶出させた。
【0066】
ＤＮＡ濃度の決定
２０１５年よりVWRブランドのPEQLAB Biotechnologie GmbH（Erlangen，Germany）のＮａｎｏＤｒｏｐ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＮＤ－１０００を用いてＤＮＡ濃度を測定した。
２０１５年よりVWRブランドのPEQLAB Biotechnologie GmbH（Erlangen，Germany）のＮａｎｏＤｒｏｐ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＮＤ－１０００を用いてＤＮＡ濃度を測定した。
【0067】
アセンブリクローニング
New England BioLabs Inc.（Ipswich，USA、カタログ番号Ｅ５５２０）から購入した「ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」を用いてプラスミドベクターをアセンブルした。線状ベクターと少なくとも１つのＤＮＡ挿入断片とを含有する反応ミックスを５０℃で６０分間インキュベートした。０．５μｌのアセンブリ混合物を各形質転換実験に使用した。
New England BioLabs Inc.（Ipswich，USA、カタログ番号Ｅ５５２０）から購入した「ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」を用いてプラスミドベクターをアセンブルした。線状ベクターと少なくとも１つのＤＮＡ挿入断片とを含有する反応ミックスを５０℃で６０分間インキュベートした。０．５μｌのアセンブリ混合物を各形質転換実験に使用した。
【0068】
Ｅ．コリ（E. coli）の化学的形質転換
プラスミドクローニングのために、ケミカルコンピテント「ＮＥＢ（登録商標） Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｃ３０４０）を製造業者のプロトコルに従って形質転換した。首尾よく形質転換された細胞を、２５ｍｇ／ｌカナマイシンを添加したＬＢ寒天上で選択した。
プラスミドクローニングのために、ケミカルコンピテント「ＮＥＢ（登録商標） Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｃ３０４０）を製造業者のプロトコルに従って形質転換した。首尾よく形質転換された細胞を、２５ｍｇ／ｌカナマイシンを添加したＬＢ寒天上で選択した。
【0069】
Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）の形質転換
プラスミドＤＮＡによるＣ．グルタミカム（C. glutamicum）の形質転換は、Ruan et al. (2015)に記載されているように「Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ」（Bio-Rad Laboratories GmbH，Feldkirchen，Germany）を用いたエレクトロポレーションによって行った。エレクトロポレーションは、１ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad Laboratories GmbH，Feldkirchen，Germany）において１．８ｋＶおよび５ｍｓに設定した固定時定数で行った。形質転換された細胞を１３４ｇ／ｌソルビトール、２．５ｇ／ｌ酵母エキスおよび２５ｍｇ／ｌカナマイシンを含有するＢＨＩ寒天上で選択した。
プラスミドＤＮＡによるＣ．グルタミカム（C. glutamicum）の形質転換は、Ruan et al. (2015)に記載されているように「Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ」（Bio-Rad Laboratories GmbH，Feldkirchen，Germany）を用いたエレクトロポレーションによって行った。エレクトロポレーションは、１ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad Laboratories GmbH，Feldkirchen，Germany）において１．８ｋＶおよび５ｍｓに設定した固定時定数で行った。形質転換された細胞を１３４ｇ／ｌソルビトール、２．５ｇ／ｌ酵母エキスおよび２５ｍｇ／ｌカナマイシンを含有するＢＨＩ寒天上で選択した。
【0070】
ヌクレオチド配列の決定
ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、Eurofins Genomics GmbH（Ebersberg，Germany）により、Sanger et al.（Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463 - 5467, 1977）のジデオキシチェーンターミネーション法を用い、Applied Biosystems（登録商標）（Carlsbad，CA，USA）の３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒでのサイクルシークエンシングによって決定された。Scientific & Educational Software（Denver，USA）のＣｌｏｎｅｍａｎａｇｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ９ソフトウェアを用いて配列を可視化し、評価した。
ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、Eurofins Genomics GmbH（Ebersberg，Germany）により、Sanger et al.（Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463 - 5467, 1977）のジデオキシチェーンターミネーション法を用い、Applied Biosystems（登録商標）（Carlsbad，CA，USA）の３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒでのサイクルシークエンシングによって決定された。Scientific & Educational Software（Denver，USA）のＣｌｏｎｅｍａｎａｇｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ９ソフトウェアを用いて配列を可視化し、評価した。
【0071】
Ｅ．コリ（E. coli）およびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株のグリセロールストック
Ｅ．コリ（E. coli）株およびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株の長期保存のためにグリセロールストックを調製した。選択Ｅ．コリ（E. coli）クローンは、２ｇ／ｌグルコースを添加した１０ｍｌのＬＢ培地中で培養した。選択Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）クローンは、２ｇ／ｌグルコースを添加した１０ｍｌの２倍濃縮ＢＨＩ培地中で培養した。プラスミドを含有するＥ．コリ（E. coli）株およびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株の培養物に２５ｍｇ／ｌカナマイシンを添加した。培地を３バッフル付き１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。これにコロニーから採取した細胞のループを接種した。次いで、培養物を３０℃および２００ｒｐｍで１８時間インキュベートした。上記のインキュベーション期間後に、１．２ｍｌの８５％（ｖ／ｖ）滅菌グリセロールを培養物に添加した。次いで、得られたグリセロール含有細胞懸濁液を２ｍｌずつ分割し、－８０℃で保管した。
Ｅ．コリ（E. coli）株およびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株の長期保存のためにグリセロールストックを調製した。選択Ｅ．コリ（E. coli）クローンは、２ｇ／ｌグルコースを添加した１０ｍｌのＬＢ培地中で培養した。選択Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）クローンは、２ｇ／ｌグルコースを添加した１０ｍｌの２倍濃縮ＢＨＩ培地中で培養した。プラスミドを含有するＥ．コリ（E. coli）株およびＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株の培養物に２５ｍｇ／ｌカナマイシンを添加した。培地を３バッフル付き１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。これにコロニーから採取した細胞のループを接種した。次いで、培養物を３０℃および２００ｒｐｍで１８時間インキュベートした。上記のインキュベーション期間後に、１．２ｍｌの８５％（ｖ／ｖ）滅菌グリセロールを培養物に添加した。次いで、得られたグリセロール含有細胞懸濁液を２ｍｌずつ分割し、－８０℃で保管した。
【0072】
ミリリットルスケール培養におけるＧＡＡ生産
Duetz (2007)によるミリリットルスケール培養系を用いて株のＧＡＡ生産を評価した。この目的で、１ウェル当たり２．５ｍｌの培地を充填したEnzyScreen BV（Heemstede、Netherlands、カタログ番号ＣＲ１４２４）の２４ディープウェルマイクロプレート（２４ウェルＷＤＳプレート）を使用した。
Duetz (2007)によるミリリットルスケール培養系を用いて株のＧＡＡ生産を評価した。この目的で、１ウェル当たり２．５ｍｌの培地を充填したEnzyScreen BV（Heemstede、Netherlands、カタログ番号ＣＲ１４２４）の２４ディープウェルマイクロプレート（２４ウェルＷＤＳプレート）を使用した。
【0073】
株の前培養を１０ｍｌのシード培地（ＳＭ）中で行った。培地を３バッフル付き１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。これに１００μｌのグリセロールストック培養物を接種し、培養物を３０℃および２００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。シード培地（ＳＭ）の組成を表５に示す。
【0074】
【表5】
【0075】
上記のインキュベーション期間後に、前培養物の光学密度ＯＤ６００を決定した。２．５ｍｌの生産培地（ＰＭ）にＯＤ６００が０．１となるまで接種するのに必要とされる容量を前培養物からサンプリングし、遠心分離し（８０００ｇで１分間）、上清を捨てた。次いで、細胞を１００μｌの生産培地に再懸濁した。
【0076】
２４ウェルＷＤＳプレートの２．４ｍｌの生産培地（ＰＭ）を含むウェルに前培養物からの再懸濁細胞を各１００μｌ接種することによって本培養を開始した。生産培地（ＰＭ）の組成を表６に示す。
【0077】
【表6】
【0078】
本培養物をInfors GmbH（Bottmingen，Switzerland）のＩｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄインキュベーターシェーカーにおいて３０℃および３００ｒｐｍで７２時間、グルコースが完全に消費されるまでインキュベートした。LifeScan（Johnson & Johnson Medical GmbH，Neuss，Germany）の血糖測定器ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｖｉｔａ（登録商標）を用いて懸濁液中のグルコース濃度を分析した。
【0079】
培養後に培養懸濁液をディープウェルマイクロプレートに移した。ＯＤ６００を測定するために培養懸濁液の一部を適切に希釈した。培養物の別の部分を遠心分離し、上清中のＧＡＡの濃度を下記のように分析した。
【0080】
酵母ペプトンＦＭ９０２中のＬ－アルギニンおよびグリシンの含有量の決定
酵母エキスＦＭ９０２（Angel Yeast Co.,LTD，Hubei，P.R.China）は、様々なペプチドおよびアミノ酸を含有するため、そのＬ－アルギニンおよびグリシンの含有量を以下のように測定した。
酵母エキスＦＭ９０２（Angel Yeast Co.,LTD，Hubei，P.R.China）は、様々なペプチドおよびアミノ酸を含有するため、そのＬ－アルギニンおよびグリシンの含有量を以下のように測定した。
【0081】
遊離アミノ酸を測定するために、１ｇの酵母エキスを２０ｍｌの水に溶解することによってサンプルを調製した。総容量が２５ｍｌとなるまで溶液に水を加え、十分に混合し、０．２μＭナイロンシリンジフィルターを用いて濾過した。
【0082】
全アミノ酸（遊離アミノ酸＋ペプチドに結合したアミノ酸）を測定するために、１ｇの酵母エキスを１０ｍｌの６Ｍ ＨＣｌに溶解し、これを１１０℃で２４時間インキュベートすることによってサンプルを調製した。次いで、総容量が２５ｍｌとなるまで水を添加した。溶液を十分に混合し、０．２μＭナイロンシリンジフィルターを用いて濾過した。
【0083】
サンプル中のＬ－アルギニンおよびグリシンの濃度を、SYKAM Vertriebs GmbH（Fuerstenfeldbruck，Germany）のＳＹＫＡＭ Ｓ４３３アミノ酸分析装置を用いたイオン交換クロマトグラフィーによって決定した。固相として、SYKAMの球状ポリスチレン系陽イオン交換体の入ったカラム（Ｐｅｅｋ ＬＣＡ Ｎ０４／Ｎａ、寸法１５０×４．６ｍｍ）を使用した。Ｌ－アミノ酸に応じて、バッファーＡおよびＢの混合物を溶出に用いた定組成溶出（isocratic run）、または上記バッファーを用いた勾配溶出で分離を行った。バッファーＡとしては、２０ｌ中に２６３ｇのクエン酸三ナトリウム、１２０ｇのクエン酸、１１００ｍｌのメタノール、１００ｍｌの３７％ＨＣｌおよび２ｍｌのオクタン酸を含有する水溶液（最終ｐＨ３．５）を使用した。バッファーＢとしては、２０ｌ中に３９２ｇのクエン酸三ナトリウム、１００ｇのホウ酸および２ｍｌのオクタン酸（最終ｐＨ１０．２）を含有する水溶液を使用した。遊離アミノ酸をポストカラム誘導体化によってニンヒドリンで着色し、５７０ｎｍで測光的に検出した。
【0084】
表７に、酵母エキスＦＭ９０２（Angel Yeast Co.,LTD，Hubei，P.R.China）中で決定された遊離および全体のＬ－アルギニンおよびグリシンの含有量、ならびに生産培地（ＰＭ）中の結果としての量を示す。
【0085】
【表7】
【0086】
ＧＡＡの定量
質量分析計「Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６４２０」と連結したＨＰＬＣ「Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０」からなるAgilentの分析システム（Agilent Technologies Inc.，Santa Clara，USA）を用いてサンプルを分析した。クロマトグラフィー分離をＡｔｌａｎｔｉｓ ＨＩＬＩＣシリカカラム、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ（Waters Corporation，Milford，USA）にて３５℃で行った。移動相Ａは、１０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．２％ギ酸を含む水とした。移動相Ｂは、９０％アセトニトリルと１０％水との混合物とし、１０ｍＭギ酸アンモニウムを混合物に添加した。ＨＰＬＣシステムは、１００％のＢで開始し、２２分間および０．６ｍＬ／分の一定流量で６６％のＢまでの線形勾配を続けた。質量分析計は、ＥＳＩポジティブイオン化モードで操作した。ＧＡＡの検出のために、ＭＲＭフラグメンテーション［Ｍ＋Ｈ］＋１１８～７６を用いてｍ／ｚ値をモニタリングした。ＧＡＡの定量限界（ＬＯＱ）は、７ｐｐｍに固定した。
質量分析計「Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６４２０」と連結したＨＰＬＣ「Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０」からなるAgilentの分析システム（Agilent Technologies Inc.，Santa Clara，USA）を用いてサンプルを分析した。クロマトグラフィー分離をＡｔｌａｎｔｉｓ ＨＩＬＩＣシリカカラム、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ（Waters Corporation，Milford，USA）にて３５℃で行った。移動相Ａは、１０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．２％ギ酸を含む水とした。移動相Ｂは、９０％アセトニトリルと１０％水との混合物とし、１０ｍＭギ酸アンモニウムを混合物に添加した。ＨＰＬＣシステムは、１００％のＢで開始し、２２分間および０．６ｍＬ／分の一定流量で６６％のＢまでの線形勾配を続けた。質量分析計は、ＥＳＩポジティブイオン化モードで操作した。ＧＡＡの検出のために、ＭＲＭフラグメンテーション［Ｍ＋Ｈ］＋１１８～７６を用いてｍ／ｚ値をモニタリングした。ＧＡＡの定量限界（ＬＯＱ）は、７ｐｐｍに固定した。
【0087】
Ｂ）実験結果
実施例１：様々な生物に由来するＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ、ＥＣ ２．１．４．１）をコードする遺伝子の合成
モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）は、糸状性シアノバクテリアである。モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）株ＰＡＬ－８－１５－０８－１のゲノムは、Leao et al.（Leao T, Castelao G, Korobeynikov A, Monroe EA, Podell S, Glukhov E, Allen EE, Gerwick WH, Gerwick L, Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Mar 21;114(12):3198-3203. doi: 10.1073/pnas.1618556114；アクセッション番号ＣＰ０１７５９９．１）に公開されている。これは、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ、ＥＣ ２．１．４．１、アクセッション番号ＢＪＰ３４＿００３００、配列番号１）を推定的にコードするオープンリーディングフレームを含む。配列番号２および配列番号４に、ＡＧＡＴ＿Ｍｐと指定した派生アミノ酸配列（アクセッション番号ＷＰ＿０７０３９０６０２）を示す。
実施例１：様々な生物に由来するＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ、ＥＣ ２．１．４．１）をコードする遺伝子の合成
モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）は、糸状性シアノバクテリアである。モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）株ＰＡＬ－８－１５－０８－１のゲノムは、Leao et al.（Leao T, Castelao G, Korobeynikov A, Monroe EA, Podell S, Glukhov E, Allen EE, Gerwick WH, Gerwick L, Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Mar 21;114(12):3198-3203. doi: 10.1073/pnas.1618556114；アクセッション番号ＣＰ０１７５９９．１）に公開されている。これは、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ、ＥＣ ２．１．４．１、アクセッション番号ＢＪＰ３４＿００３００、配列番号１）を推定的にコードするオープンリーディングフレームを含む。配列番号２および配列番号４に、ＡＧＡＴ＿Ｍｐと指定した派生アミノ酸配列（アクセッション番号ＷＰ＿０７０３９０６０２）を示す。
【0088】
シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ（Cylindrospermopsis raciborskii）ＡＷＴ２０５（アクセッション番号ＥＵ１４０７９８．１）に由来する遺伝子ｃｙｒＡは、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（Mihali TK, Kellmann R, Muenchhoff J, Barrow KD, Neilan BA (2008) “Characterization of the gene cluster responsible for cylindrospermopsin biosynthesis.”, Appl Environ Microbiol., 74(3):716-22, doi: 10.1128/AEM.01988-07；配列番号１５）をコードする。配列番号１６および配列番号２６に、ＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡと指定した派生アミノ酸配列（アクセッション番号ＡＢＸ６０１６０）を示す。
【0089】
ヒトＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼのｃＤＮＡ配列は、Humm et al., 1994（Humm A, Huber R, Mann K (1994) “The amino acid sequences of human and pig l-arginine:glycine amidinotransferase.”, FEBS Letters, Vol. 339 (1-2), 101-107, DOI: 10.1016/0014-5793(94)80394-3；アクセッション番号ＮＭ＿００１４８２．３、配列番号１７）に記載された。派生アミノ酸配列（アクセッション番号ＮＰ＿００１４７３．１、配列番号１８）は、成熟酵素には存在しないミトコンドリア輸送ペプチド（アミノ酸１～３７）から始まる。アミノ酸５６から始まる切断型酵素は、Ｅ．コリ（E. coli）において発現させた場合に活性を有することが見出された（Humm A, Fritsche E, Mann K, Goehl M, Huber R (1997) “Recombinant expression and isolation of human L-arginine : glycine amidinotransferase and identification of its active-site cysteine residue.” Biochem. J. 322, 771-776, DOI: 10.1042/bj3220771）。７アミノ酸タグ（配列番号１９）のＮ末端融合は、Ｅ．コリ（E. coli）におけるタンパク質発現を改善することが示された（Hansted JG, Pietikaeinen L, Hoeg F, Sperling-Petersen HU, Mortensen KK (2011) “Expressivity tag: A novel tool for increased expression in Escherichia coli.” Journal of Biotechnology 155 (2011) 275-283, DOI:10.1016/j.jbiotec.2011.07.013）。したがって、タグと切断型ＡＧＡＴとからなる融合タンパク質を設計し、これをＡＧＡＴ＿Ｈｓと指定した（配列番号２０および配列番号２８）。
【0090】
ラットゥス・ノルウェギクス（Rattus norvegicus）に由来するＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（アクセッション番号ＮＰ＿１１２２９３．１、配列番号２１）は、ヒト酵素と極めて類似している。ヒト酵素について記載したように、配列を用いてＮ末端発現タグと酵素の切断型配列とからなる融合タンパク質を設計した。得られた融合タンパク質をＡＧＡＴ＿Ｒｎと指定した（配列番号２２および配列番号３０）。
【0091】
マレーヒヨケザルであるガレオプテラス・バリエガタス（Galeopterus variegatus）は、予測Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（アクセッション番号ＮＰ＿１１２２９３．１、配列番号２３）を有する。ヒト酵素について記載したように、そのアミノ酸配列を用いてＮ末端発現タグと酵素の切断型配列とからなる融合タンパク質を設計した。得られた融合タンパク質をＡＧＡＴ＿Ｇｖ（配列番号２４および配列番号３２）と指定した。
【0092】
ソフトウェアツール「ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ」（Geneart/ThermoFisher Scientific，Waltham，USA）を用いてＡＧＡＴ＿Ｍｐ、ＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡ、ＡＧＡＴ＿Ｈｓ、ＡＧＡＴ＿ＲｎおよびＡＧＡＴ＿Ｇｖのアミノ酸配列をＤＮＡ配列に逆翻訳し、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）のコドン使用頻度について最適化した。それらの末端をアセンブリクローニングのための配列で拡張し、シャイン－ダルガノ配列をオープンリーディングフレームの上流に付加した。得られるＤＮＡ配列は、配列番号３（ＡＧＡＴ＿Ｍｐをコードする）、配列番号２５（ＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡをコードする）、配列番号２７（ＡＧＡＴ＿Ｈｓをコードする）、配列番号２９（ＡＧＡＴ＿Ｒｎをコードする）および配列番号３１（ＡＧＡＴ＿Ｇｖをコードする）である。これらの遺伝子合成をInvitrogen/Geneart（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）に発注した。合成遺伝子は、ｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ、ｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡ、ｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿Ｈｓ、ｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿ＲｎおよびｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿Ｇｖと指定したクローニングプラスミドの一部として送達した。
【0093】
実施例２：発現プラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９ＥへのＡＧＡＴ＿Ｍｐのクローニング
Ｅ．コリ（E. coli）－Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）シャトルプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅを、制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩを用いて消化した。「ＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ」（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）を用いて末端リン酸塩を除去した。次いで、ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）で精製した。
Ｅ．コリ（E. coli）－Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）シャトルプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅを、制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩを用いて消化した。「ＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ」（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）を用いて末端リン酸塩を除去した。次いで、ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）で精製した。
【0094】
クローニングプラスミドｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿ＭｐをＭｌｕＩ＋ＡａｔＩＩで消化し、得られたフラグメントを「Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｋｉｔ」（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）を用いて平滑末端化した。これらをアガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー中の０．８％アガロース）によって分離し、「ＡＧＡＴ＿Ｍｐ」（１１７４ｂｐ）に対応するバンドを切り出した。そのＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）を用いて精製した。
【0095】
ＡＧＡＴ＿Ｍｐフラグメントおよび線形化ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅを「Ｒｅａｄｙ－Ｔｏ－Ｇｏ Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ」（GE Healthcare Europe GmbH，Freiburg，Germany）を用いてライゲートした。ライゲーション産物を「ＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」（New England Biolabs，Ipswich，USA）に形質転換し、２５ｍｇ／ｌカナマイシンを含有するＬＢ寒天上で細胞を成長させた。適切なクローンを制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドをｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐと命名した。
【0096】
実施例２．１：発現プラスミドｐＥＫＥｘ２へのＡＧＡＴ＿ＭｐおよびＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡのクローニング
Ｅ．コリ（E. coli）－Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）シャトルプラスミドｐＥＫＥｘ２（Eikmanns, 1991）を、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩを用いて消化した。得られたフラグメントを「Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｋｉｔ」（Thermo Fisher Scientific）を用いて平滑末端化し、末端リン酸塩を「ＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ」（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）で除去した。次いで、ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）で精製した。
Ｅ．コリ（E. coli）－Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）シャトルプラスミドｐＥＫＥｘ２（Eikmanns, 1991）を、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩを用いて消化した。得られたフラグメントを「Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｋｉｔ」（Thermo Fisher Scientific）を用いて平滑末端化し、末端リン酸塩を「ＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ」（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）で除去した。次いで、ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）で精製した。
【0097】
クローニングプラスミドｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿ＭｐおよびｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡをＭｌｕＩ＋ＡａｔＩＩで消化し、得られたフラグメントを「Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｋｉｔ」（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）を用いて平滑末端化した。これらをアガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー中の０．８％アガロース）によって分離し、ＡＧＡＴ＿Ｍｐ（１１７４ｂｐ）およびＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡ（１２０４ｂｐ）に対応するバンドを切り出した。ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）を用いて精製した。
【0098】
「Ｒｅａｄｙ－Ｔｏ－Ｇｏ Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ」（GE Healthcare Europe GmbH，Freiburg，Germany）を用いて各ＡＧＡＴフラグメントを線形化ｐＥＫＥｘ２とライゲートした。ライゲーション産物を「ＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」（New England Biolabs，Ipswich，USA）に形質転換し、２５ｍｇ／ｌカナマイシンを含有するＬＢ寒天上で細胞を成長させた。適切なクローンを制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドをｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿ＭｐおよびｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡと命名した。
【0099】
実施例２．２：発現プラスミドｐＥＫＥｘ２へのＡＧＡＴ＿Ｈｓ、ＡＧＡＴ＿ＲｎおよびＡＧＡＴ＿Ｇｖのクローニング
クローニングプラスミドｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿Ｈｓ、ｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿ＲｎおよびｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿ＧｖをＥｃｏ３１Ｉで消化し、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）を用いて産物を精製した。
クローニングプラスミドｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿Ｈｓ、ｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿ＲｎおよびｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿ＧｖをＥｃｏ３１Ｉで消化し、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）を用いて産物を精製した。
【0100】
Ｅ．コリ（E. coli）－Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）シャトルプラスミドｐＥＫＥｘ２（Eikmanns BJ, Kleinertz E, Liebl W, Sahm H (1991) “A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing.”, Gene. 1991 Jun 15;102(1):93-8）を、制限エンドヌクレアーゼＳｂｆＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）で精製した。
【0101】
ＡＧＡＴフラグメントのそれぞれを「ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｅ５５２０）を用いて消化ｐＥＫＥｘ２とアセンブルした。アセンブリ産物を「ＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」（New England Biolabs，Ipswich，USA）に形質転換し、２５ｍｇ／ｌカナマイシンを含有するＬＢ寒天上で細胞を成長させた。適切なクローンを制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドをそれぞれｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｈｓ、ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿ＲｎおよびｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｇｖと指定した。
【0102】
実施例３：プラスミドｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯへの遺伝子ａｒｇＦのクローニング
Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチドプライマーａｒｇＦ＿１．ｐ（配列番号５）およびａｒｇＦ＿２．ｐ（配列番号６）とを用いて、ａｒｇＦ遺伝子をＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｋｉｔ（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA）でＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をプラスミドｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ（Thermo Fisher Scientific/Invitrogen，Waltham，USA）にクローニングし、適当なプラスミドクローンを制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。このプラスミドをｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦと命名した。
Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチドプライマーａｒｇＦ＿１．ｐ（配列番号５）およびａｒｇＦ＿２．ｐ（配列番号６）とを用いて、ａｒｇＦ遺伝子をＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｋｉｔ（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA）でＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をプラスミドｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ（Thermo Fisher Scientific/Invitrogen，Waltham，USA）にクローニングし、適当なプラスミドクローンを制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。このプラスミドをｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦと命名した。
【0103】
実施例４：プラスミドｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯへの遺伝子ａｒｇＧおよびａｒｇＨのクローニング
Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチドプライマーａｒｇＧ＿１．ｐ（配列番号７）およびａｒｇＨ＿２．ｐ（配列番号８）とを用いて、遺伝子ａｒｇＧおよびａｒｇＨをＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｋｉｔ（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA）でＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をプラスミドｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ（Thermo Fisher Scientific/Invitrogen，Waltham，USA）にクローニングし、適当なプラスミドクローンを制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。このプラスミドをｐＣＲＩＩ－ａｒｇＧＨと命名した。
Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチドプライマーａｒｇＧ＿１．ｐ（配列番号７）およびａｒｇＨ＿２．ｐ（配列番号８）とを用いて、遺伝子ａｒｇＧおよびａｒｇＨをＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｋｉｔ（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA）でＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をプラスミドｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ（Thermo Fisher Scientific/Invitrogen，Waltham，USA）にクローニングし、適当なプラスミドクローンを制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。このプラスミドをｐＣＲＩＩ－ａｒｇＧＨと命名した。
【0104】
実施例５：プラスミドｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦへの遺伝子ａｒｇＧおよびａｒｇＨのクローニング
ＨｐａＩ＋ＡｖｒＩＩを用いてｐＣＲＩＩ－ａｒｇＧＨを切断し、２７７３ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。ＳｓｐＩ＋ＡｖｒＩＩを用いてｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦを切断し、４５２６ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。両フラグメントをライゲートした後、Ｅ．コリ（E. coli）に形質転換した。適当なプラスミドクローンを制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドをｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦＧＨと命名した。
ＨｐａＩ＋ＡｖｒＩＩを用いてｐＣＲＩＩ－ａｒｇＧＨを切断し、２７７３ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。ＳｓｐＩ＋ＡｖｒＩＩを用いてｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦを切断し、４５２６ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。両フラグメントをライゲートした後、Ｅ．コリ（E. coli）に形質転換した。適当なプラスミドクローンを制限酵素消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドをｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦＧＨと命名した。
【0105】
実施例６：発現プラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅへの遺伝子ａｒｇＦ、ａｒｇＧおよびａｒｇＨのクローニング
ＨｐａＩ＋ＡｖｒＩＩを用いてｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦＧＨを切断し、２７７３ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。Ｅｃｌ１３６ＩＩ＋ＸｂａＩを用いてプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅを切断した。６９９９ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。両フラグメントをライゲートした後、Ｅ．コリ（E. coli）に形質転換した。適当なプラスミドクローンを制限消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ａｒｇＦＧＨは、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）に由来する遺伝子ａｒｇＦ、ａｒｇＧおよびａｒｇＨを含む。
ＨｐａＩ＋ＡｖｒＩＩを用いてｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦＧＨを切断し、２７７３ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。Ｅｃｌ１３６ＩＩ＋ＸｂａＩを用いてプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅを切断した。６９９９ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。両フラグメントをライゲートした後、Ｅ．コリ（E. coli）に形質転換した。適当なプラスミドクローンを制限消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ａｒｇＦＧＨは、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）に由来する遺伝子ａｒｇＦ、ａｒｇＧおよびａｒｇＨを含む。
【0106】
実施例７：発現プラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐへの遺伝子ａｒｇＦ、ａｒｇＧおよびａｒｇＨのクローニング
ＸｂａＩ＋ＳｐｅＩを用いてｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦＧＨを切断し、３８６８ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。ＸｂａＩを用いてプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐを切断した。８１８８ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。両フラグメントをライゲートした後、Ｅ．コリ（E. coli）に形質転換した。適当なプラスミドクローンを制限消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ａｒｇＦＧＨは、ＡＧＡＴ＿Ｍｐと組み合わせてＣ．グルタミカム（C. glutamicum）に由来する遺伝子ａｒｇＦ、ａｒｇＧおよびａｒｇＨを含む。
ＸｂａＩ＋ＳｐｅＩを用いてｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦＧＨを切断し、３８６８ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。ＸｂａＩを用いてプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐを切断した。８１８８ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。両フラグメントをライゲートした後、Ｅ．コリ（E. coli）に形質転換した。適当なプラスミドクローンを制限消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ａｒｇＦＧＨは、ＡＧＡＴ＿Ｍｐと組み合わせてＣ．グルタミカム（C. glutamicum）に由来する遺伝子ａｒｇＦ、ａｒｇＧおよびａｒｇＨを含む。
【0107】
実施例８：発現プラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐへの遺伝子ａｒｇＦのクローニング
ＫｐｎＩ＋ＸｂａＩ＋ＡｓｅＩを用いてｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦを切断し、ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）で精製した。ＫｐｎＩ＋ＸｂａＩを用いてプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐを切断し、ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）で精製した。両溶出液を混合し、ＤＮＡフラグメントをライゲートし、産物を用いてＥ．コリ（E. coli）を形質転換した。適当なプラスミドクローンを制限消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ａｒｇＦは、ＡＧＡＴ＿Ｍｐと組み合わせてＣ．グルタミカム（C. glutamicum）に由来する遺伝子ａｒｇＦを含む。
ＫｐｎＩ＋ＸｂａＩ＋ＡｓｅＩを用いてｐＣＲＩＩ－ａｒｇＦを切断し、ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）で精製した。ＫｐｎＩ＋ＸｂａＩを用いてプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐを切断し、ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）で精製した。両溶出液を混合し、ＤＮＡフラグメントをライゲートし、産物を用いてＥ．コリ（E. coli）を形質転換した。適当なプラスミドクローンを制限消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ａｒｇＦは、ＡＧＡＴ＿Ｍｐと組み合わせてＣ．グルタミカム（C. glutamicum）に由来する遺伝子ａｒｇＦを含む。
【0108】
実施例９：発現プラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐへの遺伝子ａｒｇＧのクローニング
ＸｂａＩ＋ＳａｌＩを用いてｐＣＲＩＩ－ａｒｇＧＨを切断し、１７９８ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。ＸｂａＩ＋ＳａｌＩを用いてプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐを切断し、ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）で精製した。ＤＮＡフラグメントをライゲートし、産物を用いてＥ．コリ（E. coli）を形質転換した。適当なプラスミドクローンを制限消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ａｒｇＧは、ＡＧＡＴ＿Ｍｐと組み合わせてＣ．グルタミカム（C. glutamicum）に由来する遺伝子ａｒｇＧを含む。
ＸｂａＩ＋ＳａｌＩを用いてｐＣＲＩＩ－ａｒｇＧＨを切断し、１７９８ｂｐの制限フラグメントをアガロースゲルから単離した。ＸｂａＩ＋ＳａｌＩを用いてプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐを切断し、ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）で精製した。ＤＮＡフラグメントをライゲートし、産物を用いてＥ．コリ（E. coli）を形質転換した。適当なプラスミドクローンを制限消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。得られたプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ａｒｇＧは、ＡＧＡＴ＿Ｍｐと組み合わせてＣ．グルタミカム（C. glutamicum）に由来する遺伝子ａｒｇＧを含む。
【0109】
実施例１０：ＡＴＣＣ１３０３２のｃａｒＡＢオペロンの上流へのｓｏｄプロモーターの染色体挿入
ＡＴＣＣ１３０３２のｃａｒＡＢオペロンの上流への強力なｓｏｄプロモーターのゲノム挿入によってカルバモイルリン酸シンテターゼの酵素活性を高めた。したがって、プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢを以下のように構築した。ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩを用いてプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢを切断し、線形化クターＤＮＡ（５６７０ｂｐ）をアガロースゲルから切り出した。「ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（QIAGEN GmbH，Hilden，Germany）を用いてＤＮＡを抽出した。
ＡＴＣＣ１３０３２のｃａｒＡＢオペロンの上流への強力なｓｏｄプロモーターのゲノム挿入によってカルバモイルリン酸シンテターゼの酵素活性を高めた。したがって、プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢを以下のように構築した。ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩを用いてプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢを切断し、線形化クターＤＮＡ（５６７０ｂｐ）をアガロースゲルから切り出した。「ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（QIAGEN GmbH，Hilden，Germany）を用いてＤＮＡを抽出した。
【0110】
挿入断片を構築するために、以下のプライマー対を用いたＰＣＲによって３つのＤＮＡフラグメントを作製した（鋳型としてＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡ）：
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＬＡ－Ｆ（配列番号９）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＬＡ－Ｒ（配列番号１０）
＝左ホモロジーアーム（１０２５ｂｐ）
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－Ｆ（配列番号１１）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－Ｒ（配列番号１２）
＝ｓｏｄプロモーター（２５０ｂｐ）
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲＡ－Ｆ配列番号１３）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲＡ－Ｒ（配列番号１４）
＝右ホモロジーアーム（９４４ｂｐ）
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＬＡ－Ｆ（配列番号９）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＬＡ－Ｒ（配列番号１０）
＝左ホモロジーアーム（１０２５ｂｐ）
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－Ｆ（配列番号１１）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－Ｒ（配列番号１２）
＝ｓｏｄプロモーター（２５０ｂｐ）
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲＡ－Ｆ配列番号１３）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲＡ－Ｒ（配列番号１４）
＝右ホモロジーアーム（９４４ｂｐ）
【0111】
「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）を用いて産物ＤＮＡを精製した。次いで、「ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｅ５５２０）を用いて線形化プラスミドとＰＣＲ産物とをアセンブルした。適当なプラスミドクローンを制限消化およびＤＮＡシークエンシングによって同定した。
【0112】
ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢを用いて、ｃａｒＡＢ遺伝子の上流の強力なｓｏｄプロモーターをＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムに組み込んだ。プラスミドをエレクトロポレーションによってＡＴＣＣ１３０３２に形質転換した。１３４ｇ／ｌソルビトール、２．５ｇ／ｌ酵母エキスおよび２５ｍｇ／ｌカナマイシンを添加したＢＨＩ寒天上にプレーティングすることによって染色体組込み（最初の組換え事象によって生じる）を選択した。寒天プレートを３３℃で４８時間インキュベートした。
【0113】
個々のコロニーを新たな寒天プレート（２５ｍｇ／ｌカナマイシンを含む）上に移し、３３℃で２４時間インキュベートした。これらのクローンの液体培養物を、３バッフル付き１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた１０ｍｌのＢＨＩ培地にて３３℃で２４時間培養した。２回目の組換え事象を受けたクローンを単離するために、各液体培養物からアリコートを取り、適切に希釈し、１０％サッカロースを添加したＢＨＩ寒天上にプレーティングした（通例、１００～２００μｌ）。これらの寒天プレートを３３℃で４８時間インキュベートした。次いで、サッカロース含有寒天プレート上で成長するコロニーをカナマイシン感受性について試験した。そのために、爪楊枝を用いて細胞物質をコロニーから取り出し、２５ｍｇ／ｌカナマイシンを含有するＢＨＩ寒天および１０％サッカロースを含有するＢＨＩ寒天上に移した。寒天プレートを３３℃で６０時間インキュベートした。カナマイシンに感受性であり、サッカロースに耐性を示すことが判明したクローンをｓｏｄプロモーターの適切な組込みについてＰＣＲおよびＤＮＡシークエンシングによって試験した。得られた株をＡＴＣＣ１３０３２_Pｓｏｄ－ｃａｒＡＢと命名した。
【0114】
【表8】
【0115】
【表9-1】
【表9-2】
【0116】
実施例１１：様々な発現プラスミドを用いたＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株の形質転換
以下のＣ．グルタミカム（C. glutamicum）の株を様々なプラスミドで形質転換した：
・Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２（Kinoshita et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 1957; 3(3): 193-205)）は、一般に使用される野生型株である。
・Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）株ＡＴＣＣ２１８３１（Park et al., Nat Commun. 2014 Aug 5; 5:4618）は、アンモニアおよびグルコースのような一次基質からＬ－アルギニンを合成する。
・ＡＴＣＣ１３０３２__Pｓｏｄ－ｃａｒＡＢは、ｃａｒＡＢ遺伝子の上流に強力なｓｏｄプロモーターを有するＡＴＣＣ１３０３２の変異株である。
以下のＣ．グルタミカム（C. glutamicum）の株を様々なプラスミドで形質転換した：
・Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２（Kinoshita et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 1957; 3(3): 193-205)）は、一般に使用される野生型株である。
・Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）株ＡＴＣＣ２１８３１（Park et al., Nat Commun. 2014 Aug 5; 5:4618）は、アンモニアおよびグルコースのような一次基質からＬ－アルギニンを合成する。
・ＡＴＣＣ１３０３２__Pｓｏｄ－ｃａｒＡＢは、ｃａｒＡＢ遺伝子の上流に強力なｓｏｄプロモーターを有するＡＴＣＣ１３０３２の変異株である。
【0117】
株をエレクトロポレーションによって様々なプラスミドで形質転換した（表１０に示す）。プラスミドを含む細胞を２５ｍｇ／ｌカナマイシンで選択した。
【0118】
【表10】
【0119】
実施例１２：ＧＡＡ生産に対するＡＧＡＴおよび基質利用性の影響
株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ（モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）に由来するＡＧＡＴ酵素の遺伝子を有する）およびＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ（対照のための空ベクター）を、Wouter Duetzのシステム（上記）を用いたバッチ培養においてＧＡＡを生産する能力について分析した。生産培地（ＰＭ）は、主な炭素源として４０ｇ／ｌ Ｄ－グルコースを含有するものであった。一部のバッチには、指定のようにＬ－アルギニンおよび／またはグリシンを添加した。
株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ（モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）に由来するＡＧＡＴ酵素の遺伝子を有する）およびＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ（対照のための空ベクター）を、Wouter Duetzのシステム（上記）を用いたバッチ培養においてＧＡＡを生産する能力について分析した。生産培地（ＰＭ）は、主な炭素源として４０ｇ／ｌ Ｄ－グルコースを含有するものであった。一部のバッチには、指定のようにＬ－アルギニンおよび／またはグリシンを添加した。
【0120】
【表11】
【0121】
表１１に示すように、対照株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅは、前駆体であるＬ－アルギニンおよびグリシンを供給した場合であってもＧＡＡを生産することができなかった。この株は内因性ＡＧＡＴ活性を有しないと結論付けられる。株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐは、モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）に由来する推定ＡＧＡＴをコードするポリヌクレオチドを含む。この株は、無添加ＰＭ中で２５ｍｇ／ｌのＧＡＡを生産した。グリシンの添加により、３１ｍｇ／ｌのＧＡＡまで僅かに増加した。グリシンおよびＬ－アルギニンの添加により、ＧＡＡ生産が１２４ｍｇ／ｌまで大幅に増加した。
【0122】
実施例１３：一次基質からのＧＡＡの生産
産業的ＧＡＡ生産プロセスにおいては、Ｌ－アルギニンの添加は、アンモニア、尿素およびグルコースのような一次基質と比較してかなり高コストである。したがって、かかる一次基質からＧＡＡを直接生成することが望ましい。
産業的ＧＡＡ生産プロセスにおいては、Ｌ－アルギニンの添加は、アンモニア、尿素およびグルコースのような一次基質と比較してかなり高コストである。したがって、かかる一次基質からＧＡＡを直接生成することが望ましい。
【0123】
この目的で、Ｌ－アルギニン生産株であるＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＡＴＣＣ２１８３１を、
・ｐＥＫＥｘ２（対照のための空ベクター）、
・ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ（モオレア・プロドゥケンス（Morea producens）に由来するＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子を有する）、
・ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｈｓ（ホモ・サピエンス（Homo sapiens）に由来するＡＧＡＴ＿Ｈｓ遺伝子を有する）、
・ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｒｎ（ラットゥス・ノルウェギクス（Rattus norvegicus）に由来するＡＧＡＴ＿Ｒｎ遺伝子を有する）、
・ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｇｖ（ガレオプテラス・バリエガタス（Galeopterus variegatus）に由来するＡＧＡＴ＿Ｇｖ遺伝子を有する）、および
・ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡ（シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ（Cylindrospermopsis raciborskii）に由来するＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡ遺伝子を有する）
で形質転換した。
・ｐＥＫＥｘ２（対照のための空ベクター）、
・ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ（モオレア・プロドゥケンス（Morea producens）に由来するＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子を有する）、
・ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｈｓ（ホモ・サピエンス（Homo sapiens）に由来するＡＧＡＴ＿Ｈｓ遺伝子を有する）、
・ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｒｎ（ラットゥス・ノルウェギクス（Rattus norvegicus）に由来するＡＧＡＴ＿Ｒｎ遺伝子を有する）、
・ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｇｖ（ガレオプテラス・バリエガタス（Galeopterus variegatus）に由来するＡＧＡＴ＿Ｇｖ遺伝子を有する）、および
・ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡ（シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ（Cylindrospermopsis raciborskii）に由来するＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡ遺伝子を有する）
で形質転換した。
【0124】
ＡＴＣＣ２１８３１は、カナバニン耐性突然変異株として単離され、Ｌ－アルギニンを生産することが見出された。そのゲノムは、Park et al.によってシークエンシングされ（Nat Commun. 2014 Aug 5;5:4618. doi: 10.1038/ncomms5618；アクセッション番号ＣＰ００７７２２）、この株はLGC Standards（LGC Standards GmbH，Wesel，Germany）から一般に入手可能である。
【0125】
全ての形質転換ＡＴＣＣ２１８３１株を、Wouter Duetzのシステム（上記）を用いたバッチ培養においてＧＡＡを生産する能力について分析した。生産培地（ＰＭ）は、主な炭素源として４０ｇ／ｌ Ｄ－グルコースを含有するものであった。一部のバッチにはＬ－アルギニンおよび／またはグリシンを添加した。
【0126】
【表12-1】
【表12-2】
【0127】
表１２に示すように、ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＥＫＥｘ２は、前駆体であるＬ－アルギニンおよびグリシンが存在する場合であってもＧＡＡを生産しなかった。ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＥＫＥｘ２は、内因性ＡＧＡＴ活性を有しないと結論付けられる。形質転換株ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ、ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｈｓ、ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｒｎ、ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿ＧｖおよびＡＴＣＣ２１８３１／ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡは、無添加ＰＭ中で約１～最大２６ｍｇ／ｌのＧＡＡを生産した。一次基質であるＤ－グルコース、アンモニウムおよび尿素から前駆体であるＬ－アルギニンおよびグリシンが合成されたと結論付けられる。
【0128】
グリシンを添加した場合、ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ、ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｈｓ、ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿Ｒｎ、ＡＴＣＣ２１８３１／ｐＥＫＥｘ２＿ＡＧＡＴ＿ＧｖおよびＡＴＣＣ２１８３１／ＰＥＫＥＸ２＿ＡＧＡＴ＿ｃｙｒＡのＧＡＡ生産は、非添加実験と比較して顕著に増加した。株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ（表１０を参照されたい）と比較すると、ＡＧＡＴ遺伝子を有するＬ－アルギニン生産株ＡＴＣＣ２１８３１は、グリシンが制限されていない場合に、はるかに多くのＧＡＡを蓄積する。Ｌ－アルギニンを内部供給する能力がＧＡＡ生産を改善すると結論付けられる。
【0129】
実施例１４：ＧＡＡ生産に対するＬ－アルギニン再生の影響
Ｌ－アルギニン生産株（例えばＡＴＣＣ２１８３１）では、中間体Ｌ－オルニチンがｄｅ ｎｏｖｏ合成され、さらにＬ－アルギニンに変換される。かかる株にＡＧＡＴを供給すると、酵素は等モル量のＧＡＡおよびＬ－オルニチンを生産する。しかしながら、Ｌ－オルニチンの形成は、相当量の一次Ｃ源およびＮ源を消費するため、ＧＡＡの収率が低下する。
Ｌ－アルギニン生産株（例えばＡＴＣＣ２１８３１）では、中間体Ｌ－オルニチンがｄｅ ｎｏｖｏ合成され、さらにＬ－アルギニンに変換される。かかる株にＡＧＡＴを供給すると、酵素は等モル量のＧＡＡおよびＬ－オルニチンを生産する。しかしながら、Ｌ－オルニチンの形成は、相当量の一次Ｃ源およびＮ源を消費するため、ＧＡＡの収率が低下する。
【0130】
Ｌ－オルニチンからＬ－アルギニンまでの生合成経路の強化が、おそらくはＬ－オルニチンからＬ－アルギニンへのリサイクルを改善することによって、ＧＡＡ生産を改善することが見出された。
【0131】
ＡＴＣＣ１３０３２に由来する様々な株を、Wouter Duetzのシステムを用いて培養した後、ＧＡＡを生産する能力について分析した（表１３、１４および１５）。
【0132】
【表13】
【0133】
【表14】
【0134】
【表15】
【0135】
表１３～１５に示すように、ＡＧＡＴ遺伝子が欠損した株は、検出可能な量のＧＡＡを生産しなかった。
【0136】
ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿ＭｐにおけるＡＧＡＴ＿Ｍｐの発現により、１２４ｍｇ／ｌのＧＡＡが得られた。ａｒｇＧ（株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ａｒｇＧ）、ａｒｇＦ（株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ａｒｇＦ）またはａｒｇＧ＋ａｒｇＨ（株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ａｒｇＧＨ）の付加的な増幅により、ＧＡＡの生産が改善した（表１４を参照）。
【0137】
株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ａｒｇＦＧＨでは、遺伝子ａｒｇＦ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする）、ａｒｇＧ（アルギニノコハク酸シンテターゼをコードする）およびａｒｇＨ（アルギニノコハク酸リアーゼをコードする）の発現が増強される。これにより、ＧＡＡの生産が１５４ｍｇ／ｌにまでさらに改善した（表１４を参照）。
【0138】
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼによって触媒されるＬ－オルニチンからＬ－シトルリンへの変換は、補助基質であるカルバモイルリン酸の利用性に依存する。カルバモイルリン酸は、遺伝子ｃａｒＡおよびｃａｒＢによってコードされるカルバモイルリン酸シンターゼによって生成する。株ＡＴＣＣ１３０３２＿Pｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐでは、強力なｓｏｄプロモーターのゲノム挿入により、ｃａｒＡおよびｃａｒＢの発現が増強される。ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐと比較すると、これによりＧＡＡ生産が改善した（１５６ｍｇ／ｌ対１２４ｍｇ／ｌ）。
【0139】
株ＡＴＣＣ１３０３２＿Pｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ａｒｇＦＧＨでは、Ｌ－オルニチン変換の改善（ａｒｇＦ、ａｒｇＧおよびａｒｇＨの過剰発現）をカルバモイルリン酸生合成の改善（ｃａｒＡおよびｃａｒＢの過剰発現）と組み合わせた。この組合せにより、ＧＡＡ生産が１７１ｍｇ／ｌにまでさらに改善した。
【0140】
実施例１５：モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）遺伝子ＡＧＡＴ＿Ｍｐ用のＰ．プチダ（P. putida）発現ベクターの構築
Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０におけるモオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）に由来するＡＧＡＴ（ＥＣ ２．１．４．１、配列番号２および配列番号４）の異種発現のために、プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］を構築した。コドン最適化したＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子をラムノース誘導性プロモーターＰｒｈａの制御下でベクターｐＡＣＹＡＴｈ－５にクローニングすることにした。ＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子の下流にターミネーター配列が位置する。ＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子の遺伝子合成をEurofins Genomics Germany GmbH（Ebersberg，Germany）に発注し、遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列をＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０（配列番号３３）での発現に対してコドン最適化した。オープンリーディングフレームの上流にシャイン－ダルガノ配列を付加した。ＰＲｈａプロモーターカセット（配列番号３４）およびターミネーター配列（配列番号３５）をＥ．コリ（E. coli）Ｋ１２ゲノムＤＮＡから増幅した。ベクターは、ｐＡＣＹＣ１８４（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA）をベースとし、Ｅ．コリ（E. coli）のｐ１５Ａ複製起点と、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０での複製のためのｐＶＳ１複製起点とを有する。ｐＶＳ１起点は、シュードモナスプラスミドｐＶＳ１に由来する（Itoh Y, Watson JM, Haas D, Leisinger T, Plasmid 1984, 11(3), 206-20）。次の工程では、プライマーＭＷ＿２０＿０１＿ｆｗ（配列番号３６）およびＭＷ＿２０＿０２＿ｒｖ（配列番号３７）を用いたＰＣＲによってＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子フラグメントを増幅し、制限部位ＡｐａＩ／ＸｈｏＩおよびＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標） ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｅ５５２０）を用いてベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ－５にクローニングした。アセンブルした産物を１０－ｂｅｔａ ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｃ３０２０Ｋ）に形質転換した。ＰＣＲ精製、クローニングおよび形質転換の手順は、製造業者のマニュアルに従って行った。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によって確認し、導入されたＤＮＡフラグメントの真正性をＤＮＡシークエンシングによって検証した。得られた発現ベクターをｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］と命名した（配列番号３８、表１７を参照されたい）。
Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０におけるモオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）に由来するＡＧＡＴ（ＥＣ ２．１．４．１、配列番号２および配列番号４）の異種発現のために、プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］を構築した。コドン最適化したＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子をラムノース誘導性プロモーターＰｒｈａの制御下でベクターｐＡＣＹＡＴｈ－５にクローニングすることにした。ＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子の下流にターミネーター配列が位置する。ＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子の遺伝子合成をEurofins Genomics Germany GmbH（Ebersberg，Germany）に発注し、遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列をＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０（配列番号３３）での発現に対してコドン最適化した。オープンリーディングフレームの上流にシャイン－ダルガノ配列を付加した。ＰＲｈａプロモーターカセット（配列番号３４）およびターミネーター配列（配列番号３５）をＥ．コリ（E. coli）Ｋ１２ゲノムＤＮＡから増幅した。ベクターは、ｐＡＣＹＣ１８４（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA）をベースとし、Ｅ．コリ（E. coli）のｐ１５Ａ複製起点と、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０での複製のためのｐＶＳ１複製起点とを有する。ｐＶＳ１起点は、シュードモナスプラスミドｐＶＳ１に由来する（Itoh Y, Watson JM, Haas D, Leisinger T, Plasmid 1984, 11(3), 206-20）。次の工程では、プライマーＭＷ＿２０＿０１＿ｆｗ（配列番号３６）およびＭＷ＿２０＿０２＿ｒｖ（配列番号３７）を用いたＰＣＲによってＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子フラグメントを増幅し、制限部位ＡｐａＩ／ＸｈｏＩおよびＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標） ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｅ５５２０）を用いてベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ－５にクローニングした。アセンブルした産物を１０－ｂｅｔａ ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｃ３０２０Ｋ）に形質転換した。ＰＣＲ精製、クローニングおよび形質転換の手順は、製造業者のマニュアルに従って行った。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によって確認し、導入されたＤＮＡフラグメントの真正性をＤＮＡシークエンシングによって検証した。得られた発現ベクターをｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］と命名した（配列番号３８、表１７を参照されたい）。
【0141】
Ｐ．プチダ（P. putida）株ＫＴ２４４０をエレクトロポレーションによってプラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］で形質転換し、テトラサイクリン（１０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製および分析的制限分析によって正確なプラスミドの存在について確認した。得られた株をＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］と命名した（表１８を参照されたい）。
【0142】
実施例１６：モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）遺伝子ＡＧＡＴ＿Ｍｐ、ならびにＰ．プチダ（P. putida）遺伝子ａｒｇＦ、ａｒｇＧおよびａｒｇＨ用のＰ．プチダ（P. putida）発現ベクターの構築
モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）に由来するＡＧＡＴ＿ＭｐおよびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０に由来するａｒｇＦ（配列番号３９）、ａｒｇＧ（配列番号４１）、ａｒｇＨ（配列番号４３）の異種発現のために、プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］を構築した。Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ、ＥＣ ２．１．４．１、配列番号２および配列番号４）をコードするＡＧＡＴ＿Ｍｐ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ、ＥＣ ２．１．３．３、配列番号４０）をコードするａｒｇＦ、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｒｇＧ、Ｅ．Ｃ． ６．３．４．５、配列番号４２）をコードするａｒｇＧ、およびアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡｒｇＨ、Ｅ．Ｃ． ４．３．２．１、配列番号４４）をコードするａｒｇＨのそれぞれからなる合成オペロンを、ラムノース誘導性プロモーターＰｒｈａの制御下でベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ－５にクローニングした。合成オペロンの下流にターミネーター配列が位置する。ＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子の遺伝子合成をEurofins Genomics Germany GmbH（Ebersberg，Germany）に発注し、遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列をＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０での発現に対してコドン最適化した。遺伝子ａｒｇＦＧＨも遺伝子フラグメントａｒｇＦＧＨ（配列番号４５）として合成した。ＰＲｈａプロモーターカセット（配列番号３４）およびターミネーター配列（配列番号３５）をＥ．コリ（E. coli）Ｋ１２ゲノムＤＮＡから増幅した。ベクターは、ｐＡＣＹＣ１８４（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA）をベースとし、Ｅ．コリ（E. coli）のｐ１５Ａ複製起点と、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０での複製のためのｐＶＳ１複製起点とを有する。ｐＶＳ１起点は、シュードモナスプラスミドｐＶＳ１に由来する（Itoh Y, Watson JM, Haas D, Leisinger T, Plasmid 1984, 11(3), 206-20）。クローニングのために、ＡＧＡＴ＿ＭｐおよびａｒｇＦＧＨをＰＣＲによって増幅した。クローニングに用いたプライマーを表１６に挙げる。制限部位ＡｐａＩ／ＸｈｏＩおよびＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標） ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｅ５５２０）を用いてＰＣＲ産物をベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ－５ｂにクローニングし、最適化オペロンを生成した。増幅には、New England Biolabs（Ipswich，USA）のＰｈｕｓｉｏｎ（商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者のマニュアルに従って使用した。アセンブルした産物を１０－ｂｅｔａ ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｃ３０２０Ｋ）に形質転換した。ＰＣＲ精製、クローニングおよび形質転換の手順は、製造業者のマニュアルに従って行った。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によって確認し、導入されたＤＮＡフラグメントの真正性をＤＮＡシークエンシングによって検証した。得られた発現ベクターをｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］と命名した（配列番号４９、表１７を参照されたい）。
モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）に由来するＡＧＡＴ＿ＭｐおよびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０に由来するａｒｇＦ（配列番号３９）、ａｒｇＧ（配列番号４１）、ａｒｇＨ（配列番号４３）の異種発現のために、プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］を構築した。Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ、ＥＣ ２．１．４．１、配列番号２および配列番号４）をコードするＡＧＡＴ＿Ｍｐ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ、ＥＣ ２．１．３．３、配列番号４０）をコードするａｒｇＦ、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｒｇＧ、Ｅ．Ｃ． ６．３．４．５、配列番号４２）をコードするａｒｇＧ、およびアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡｒｇＨ、Ｅ．Ｃ． ４．３．２．１、配列番号４４）をコードするａｒｇＨのそれぞれからなる合成オペロンを、ラムノース誘導性プロモーターＰｒｈａの制御下でベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ－５にクローニングした。合成オペロンの下流にターミネーター配列が位置する。ＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子の遺伝子合成をEurofins Genomics Germany GmbH（Ebersberg，Germany）に発注し、遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列をＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０での発現に対してコドン最適化した。遺伝子ａｒｇＦＧＨも遺伝子フラグメントａｒｇＦＧＨ（配列番号４５）として合成した。ＰＲｈａプロモーターカセット（配列番号３４）およびターミネーター配列（配列番号３５）をＥ．コリ（E. coli）Ｋ１２ゲノムＤＮＡから増幅した。ベクターは、ｐＡＣＹＣ１８４（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA）をベースとし、Ｅ．コリ（E. coli）のｐ１５Ａ複製起点と、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０での複製のためのｐＶＳ１複製起点とを有する。ｐＶＳ１起点は、シュードモナスプラスミドｐＶＳ１に由来する（Itoh Y, Watson JM, Haas D, Leisinger T, Plasmid 1984, 11(3), 206-20）。クローニングのために、ＡＧＡＴ＿ＭｐおよびａｒｇＦＧＨをＰＣＲによって増幅した。クローニングに用いたプライマーを表１６に挙げる。制限部位ＡｐａＩ／ＸｈｏＩおよびＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標） ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｅ５５２０）を用いてＰＣＲ産物をベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ－５ｂにクローニングし、最適化オペロンを生成した。増幅には、New England Biolabs（Ipswich，USA）のＰｈｕｓｉｏｎ（商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者のマニュアルに従って使用した。アセンブルした産物を１０－ｂｅｔａ ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｃ３０２０Ｋ）に形質転換した。ＰＣＲ精製、クローニングおよび形質転換の手順は、製造業者のマニュアルに従って行った。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によって確認し、導入されたＤＮＡフラグメントの真正性をＤＮＡシークエンシングによって検証した。得られた発現ベクターをｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］と命名した（配列番号４９、表１７を参照されたい）。
【0143】
Ｐ．プチダ（P. putida）株ＫＴ２４４０をエレクトロポレーションによってプラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］で形質転換し、テトラサイクリン（１０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製および分析的制限分析によって正確なプラスミドの存在について確認した。得られた株をＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］と命名した（表１８を参照されたい）。
【0144】
【表16】
【0145】
実施例１７：発現ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］へのＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０に由来する遺伝子ｃａｒＡＢのクローニング
モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）に由来するＡＧＡＴ＿Ｍｐ、ａｒｇＦ（配列番号３９）、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０に由来するａｒｇＧ（配列番号４１）、ａｒｇＨ（配列番号４３）、ｃａｒＡ（配列番号５０）およびｃａｒＢ（配列番号５２）の異種発現のために、プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ_Pp]｛ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ｝［ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ］［ｔｅｒ］を構築した。カルバモイルリン酸シンターゼ（ＣａｒＡＢ、ＥＣ ６．３．５．５、配列番号５１および配列番号５３）をコードするｃａｒＡ（配列番号５０）およびｃａｒＢ遺伝子（配列番号５２）を、プライマーＭＷ＿２０＿３５＿ｆｗ（配列番号５４）およびＭＷ＿２０＿３６＿ｒｖ（配列番号５５）を用いたＰＣＲによって、ｃａｒＡＢオペロンのネイティブプロモーターを含むＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０のゲノムＤＮＡから増幅した。増幅には、New England Biolabs（Ipswich，USA）のＰｈｕｓｉｏｎ（商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者のマニュアルに従って使用した。ＰＣＲ産物（配列番号５６）を、Ｂｓｕ３６Ｉで切断したｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］に、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標） ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｅ５５２０）を用いてクローニングした。アセンブルした産物を１０－ｂｅｔａ ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｃ３０２０Ｋ）に形質転換した。ＰＣＲ精製、クローニングおよび形質転換の手順は、製造業者のマニュアルに従って行った。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によって確認し、導入されたＤＮＡフラグメントの真正性をＤＮＡシークエンシングによって検証した。得られた発現ベクターをｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］｛ｃａｒＡＢ_Pp｝［ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ］［ｔｅｒ］と命名した（配列番号５７、表１７を参照されたい）。
モオレア・プロドゥケンス（Moorea producens）に由来するＡＧＡＴ＿Ｍｐ、ａｒｇＦ（配列番号３９）、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０に由来するａｒｇＧ（配列番号４１）、ａｒｇＨ（配列番号４３）、ｃａｒＡ（配列番号５０）およびｃａｒＢ（配列番号５２）の異種発現のために、プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ_Pp]｛ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ｝［ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ］［ｔｅｒ］を構築した。カルバモイルリン酸シンターゼ（ＣａｒＡＢ、ＥＣ ６．３．５．５、配列番号５１および配列番号５３）をコードするｃａｒＡ（配列番号５０）およびｃａｒＢ遺伝子（配列番号５２）を、プライマーＭＷ＿２０＿３５＿ｆｗ（配列番号５４）およびＭＷ＿２０＿３６＿ｒｖ（配列番号５５）を用いたＰＣＲによって、ｃａｒＡＢオペロンのネイティブプロモーターを含むＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０のゲノムＤＮＡから増幅した。増幅には、New England Biolabs（Ipswich，USA）のＰｈｕｓｉｏｎ（商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造業者のマニュアルに従って使用した。ＰＣＲ産物（配列番号５６）を、Ｂｓｕ３６Ｉで切断したｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］に、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標） ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｅ５５２０）を用いてクローニングした。アセンブルした産物を１０－ｂｅｔａ ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞（New England BioLabs Inc.，Ipswich，USA、カタログ番号Ｃ３０２０Ｋ）に形質転換した。ＰＣＲ精製、クローニングおよび形質転換の手順は、製造業者のマニュアルに従って行った。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によって確認し、導入されたＤＮＡフラグメントの真正性をＤＮＡシークエンシングによって検証した。得られた発現ベクターをｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］｛ｃａｒＡＢ_Pp｝［ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ］［ｔｅｒ］と命名した（配列番号５７、表１７を参照されたい）。
【0146】
Ｐ．プチダ（P. putida）株ＫＴ２４４０をエレクトロポレーションによってプラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］｛ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ｝［ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ］［ｔｅｒ］で形質転換し、テトラサイクリン（１０ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。形質転換体を、プラスミド調製および分析的制限分析によって正確なプラスミドの存在について確認した。得られた株をＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］｛ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ｝［ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ］［ｔｅｒ］と命名した（表１８を参照されたい）。
【0147】
【表17】
【0148】
【表18】
【0149】
実施例１８：Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０におけるＧＡＡ生産に対するＡＧＡＴの影響
Ｍ．プロドゥケンス（M. producens）に由来するＡＧＡＴ酵素の遺伝子を有する株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］およびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５（空ベクター対照）を、振盪フラスコを用いたバッチ培養においてＧＡＡを生産する能力について分析した。１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含有するＬＢ寒天プレート上に、対応する株のグリセロール凍結培養物（cryoculture）の接種ループで画線した。寒天プレートを３０℃で２４時間インキュベートした。１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含む１５ｍｌのシード培地（オートクレーブ処理：４．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、個別滅菌：２０ｇ／Ｌグルコース、０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００６ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３、０．０１５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、１ｍｌ／Ｌ微量元素溶液ＳＬ６（滅菌濾過：０．３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、０．２ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７）を入れたバッフル付き１００ｍｌフラスコに寒天プレートの単一コロニーを接種し、振盪インキュベーターにて３０℃および２００ｒｐｍで１８時間インキュベートして、前培養物を生成した。前培養物を用いて、１０ｍｇ／ｌテトラサイクリン、３．４８ｇ／ｌアルギニンおよび１．５ｇ／ｌグリシンを含む４０ｍｌのＭ１２培地（組成：２．２ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．４ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、個別滅菌：２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、８．５１ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍｌ／ｌ微量元素溶液Ｍ１２（滅菌濾過：０．２ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／Ｌ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、１ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７．４）に開始ＯＤ６００が０．１となるまで接種した。株を４８時間培養した。約０．５～０．８のＯＤ６００で０．２％（ｗ／ｖ）ラムノースの添加によって遺伝子発現を誘導した。誘導の９時間後および２４時間後に、１．７４ｇ／ｌアルギニンおよび０．７５ｇ／ｌグリシンをスパイクした。培養の終了時にサンプルを採取し、生産されたＧＡＡの濃度を決定した。
Ｍ．プロドゥケンス（M. producens）に由来するＡＧＡＴ酵素の遺伝子を有する株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］およびＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５（空ベクター対照）を、振盪フラスコを用いたバッチ培養においてＧＡＡを生産する能力について分析した。１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含有するＬＢ寒天プレート上に、対応する株のグリセロール凍結培養物（cryoculture）の接種ループで画線した。寒天プレートを３０℃で２４時間インキュベートした。１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含む１５ｍｌのシード培地（オートクレーブ処理：４．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、個別滅菌：２０ｇ／Ｌグルコース、０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００６ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３、０．０１５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、１ｍｌ／Ｌ微量元素溶液ＳＬ６（滅菌濾過：０．３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、０．２ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７）を入れたバッフル付き１００ｍｌフラスコに寒天プレートの単一コロニーを接種し、振盪インキュベーターにて３０℃および２００ｒｐｍで１８時間インキュベートして、前培養物を生成した。前培養物を用いて、１０ｍｇ／ｌテトラサイクリン、３．４８ｇ／ｌアルギニンおよび１．５ｇ／ｌグリシンを含む４０ｍｌのＭ１２培地（組成：２．２ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．４ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、個別滅菌：２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、８．５１ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍｌ／ｌ微量元素溶液Ｍ１２（滅菌濾過：０．２ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／Ｌ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、１ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７．４）に開始ＯＤ６００が０．１となるまで接種した。株を４８時間培養した。約０．５～０．８のＯＤ６００で０．２％（ｗ／ｖ）ラムノースの添加によって遺伝子発現を誘導した。誘導の９時間後および２４時間後に、１．７４ｇ／ｌアルギニンおよび０．７５ｇ／ｌグリシンをスパイクした。培養の終了時にサンプルを採取し、生産されたＧＡＡの濃度を決定した。
【0150】
結果を表１９に示す。
【0151】
【表19】
【0152】
表１９から明らかなように、Ｍ．プロドゥケンス（M. producens）に由来するＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子を備える株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］は、約８１．５ｍｇ／ｌのＧＡＡを生産することができた。対照株であるＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５は、ＧＡＡを全く生産することができなかった。
【0153】
実施例１９：Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０におけるＧＡＡ生産に対するＡＧＡＴおよびＬ－アルギニン供給の増加の影響
Ｍ．プロドゥケンス（M. producens）に由来するＡＧＡＴ酵素の遺伝子を有する株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］およびアルギニン生合成遺伝子ａｒｇＦＧＨを付加的に有する株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］を、振盪フラスコを用いたバッチ培養においてＧＡＡを生産する能力について分析した。１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含有するＬＢ寒天プレート上に、対応する株のグリセロール凍結培養物の接種ループで画線した。寒天プレートを３０℃で２４時間インキュベートした。１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含む１５ｍｌのシード培地（オートクレーブ処理：４．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、個別滅菌：２０ｇ／Ｌグルコース、０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００６ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３、０．０１５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、１ｍｌ／Ｌ微量元素溶液ＳＬ６（滅菌濾過：０．３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、０．２ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７）を入れたバッフル付き１００ｍｌフラスコに寒天プレートの単一コロニーを接種し、振盪インキュベーターにて３０℃および２００ｒｐｍで１８時間インキュベートして、前培養物を生成した。前培養物を用いて、１０ｍｇ／ｌテトラサイクリン、３．４８ｇ／ｌアルギニンおよび１．５ｇ／ｌグリシンを含む４０ｍｌのＭ１２培地（組成：２．２ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．４ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、個別滅菌：２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、８．５１ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍｌ／ｌ微量元素溶液Ｍ１２（滅菌濾過：０．２ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／Ｌ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、１ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７．４）に開始ＯＤ６００が０．１となるまで接種した。株を４８時間培養した。約０．５～０．８のＯＤ６００で、０．２％（ｗ／ｖ）ラムノースの添加によって遺伝子発現を誘導した。誘導の９時間後および２４時間後に、１．７４ｇ／ｌアルギニンおよび０．７５ｇ／ｌグリシンをスパイクした。培養の終了時にサンプルを採取し、生産されたＧＡＡの濃度を決定した。
Ｍ．プロドゥケンス（M. producens）に由来するＡＧＡＴ酵素の遺伝子を有する株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］およびアルギニン生合成遺伝子ａｒｇＦＧＨを付加的に有する株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］を、振盪フラスコを用いたバッチ培養においてＧＡＡを生産する能力について分析した。１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含有するＬＢ寒天プレート上に、対応する株のグリセロール凍結培養物の接種ループで画線した。寒天プレートを３０℃で２４時間インキュベートした。１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含む１５ｍｌのシード培地（オートクレーブ処理：４．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、個別滅菌：２０ｇ／Ｌグルコース、０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００６ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３、０．０１５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、１ｍｌ／Ｌ微量元素溶液ＳＬ６（滅菌濾過：０．３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、０．２ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７）を入れたバッフル付き１００ｍｌフラスコに寒天プレートの単一コロニーを接種し、振盪インキュベーターにて３０℃および２００ｒｐｍで１８時間インキュベートして、前培養物を生成した。前培養物を用いて、１０ｍｇ／ｌテトラサイクリン、３．４８ｇ／ｌアルギニンおよび１．５ｇ／ｌグリシンを含む４０ｍｌのＭ１２培地（組成：２．２ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．４ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、個別滅菌：２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、８．５１ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍｌ／ｌ微量元素溶液Ｍ１２（滅菌濾過：０．２ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／Ｌ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、１ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７．４）に開始ＯＤ６００が０．１となるまで接種した。株を４８時間培養した。約０．５～０．８のＯＤ６００で、０．２％（ｗ／ｖ）ラムノースの添加によって遺伝子発現を誘導した。誘導の９時間後および２４時間後に、１．７４ｇ／ｌアルギニンおよび０．７５ｇ／ｌグリシンをスパイクした。培養の終了時にサンプルを採取し、生産されたＧＡＡの濃度を決定した。
【0154】
結果を表２０に示す。
【0155】
【表20】
【0156】
表２０から明らかなように、Ｍ．プロドゥケンス（M. producens）に由来するＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子を備える株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］は、約８１．５ｍｇ／ｌのＧＡＡを生産することができた。株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］におけるａｒｇＦ、ａｒｇＧおよびａｒｇＨの付加的な導入は、ＧＡＡ生産を１６９．５ｍｇ／ｌにまで改善した。
【0157】
実施例２０：Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０におけるＧＡＡ生産に対するＡＧＡＴおよびＬ－アルギニン再生の影響
Ｍ．プロドゥケンス（M. producens）に由来するＡＧＡＴ酵素の遺伝子を有する株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］、アルギニン生合成遺伝子ａｒｇＦＧＨを付加的に有する株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］、およびカルバモイルリン酸シンターゼ遺伝子ｃａｒＡＢを付加的に有する株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］｛ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ｝［ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ］［ｔｅｒ］を、振盪フラスコを用いたバッチ培養においてＧＡＡを生産する能力について分析した。オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼによって触媒されるＬ－オルニチンからＬ－シトルリンへの変換は、補助基質であるカルバモイルリン酸の利用性に依存する。カルバモイルリン酸は、遺伝子ｃａｒＡおよびｃａｒＢにコードされるカルバモイルリン酸シンターゼによって生成する。１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含有するＬＢ寒天プレート上に、対応する株のグリセロール凍結培養物の接種ループで画線した。寒天プレートを３０℃で２４時間インキュベートした。１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含む１５ｍｌのシード培地（オートクレーブ処理：４．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、個別滅菌：２０ｇ／Ｌグルコース、０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００６ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３、０．０１５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、１ｍｌ／Ｌ微量元素溶液ＳＬ６（滅菌濾過：０．３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、０．２ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７）を入れたバッフル付き１００ｍｌフラスコに寒天プレートの単一コロニーを接種し、振盪インキュベーターにて３０℃および２００ｒｐｍで１８時間インキュベートして、前培養物を生成した。前培養物を用いて、１０ｍｇ／ｌテトラサイクリン、３．４８ｇ／ｌアルギニンおよび１．５ｇ／ｌグリシンを含む４０ｍｌのＭ１２培地（組成：２．２ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．４ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、個別滅菌：２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、８．５１ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍｌ／ｌ微量元素溶液Ｍ１２（滅菌濾過：０．２ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／Ｌ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、１ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７．４）に開始ＯＤ６００が０．１となるまで接種した。株を４８時間培養した。約０．５～０．８のＯＤ６００で、０．２％（ｗ／ｖ）ラムノースの添加によって遺伝子発現を誘導した。誘導の４時間／１８時間／２３時間後に、６．９７ｇ／ｌ Ａｒｇ／１．５ｇ／ｌ Ｇｌｙ、２．３４ｇ／Ｌ Ａｒｇ／０．７５ｇ／Ｌ Ｇｌｙおよび６．９７ｇ／ｌ Ａｒｇ／１．５ｇ／ｌ Ｇｌｙをスパイクした。培養の終了時にサンプルを採取し、生産されたＧＡＡの濃度を決定した。
Ｍ．プロドゥケンス（M. producens）に由来するＡＧＡＴ酵素の遺伝子を有する株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ）］、アルギニン生合成遺伝子ａｒｇＦＧＨを付加的に有する株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］、およびカルバモイルリン酸シンターゼ遺伝子ｃａｒＡＢを付加的に有する株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］｛ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ｝［ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ］［ｔｅｒ］を、振盪フラスコを用いたバッチ培養においてＧＡＡを生産する能力について分析した。オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼによって触媒されるＬ－オルニチンからＬ－シトルリンへの変換は、補助基質であるカルバモイルリン酸の利用性に依存する。カルバモイルリン酸は、遺伝子ｃａｒＡおよびｃａｒＢにコードされるカルバモイルリン酸シンターゼによって生成する。１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含有するＬＢ寒天プレート上に、対応する株のグリセロール凍結培養物の接種ループで画線した。寒天プレートを３０℃で２４時間インキュベートした。１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含む１５ｍｌのシード培地（オートクレーブ処理：４．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、個別滅菌：２０ｇ／Ｌグルコース、０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００６ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３、０．０１５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、１ｍｌ／Ｌ微量元素溶液ＳＬ６（滅菌濾過：０．３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、０．２ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７）を入れたバッフル付き１００ｍｌフラスコに寒天プレートの単一コロニーを接種し、振盪インキュベーターにて３０℃および２００ｒｐｍで１８時間インキュベートして、前培養物を生成した。前培養物を用いて、１０ｍｇ／ｌテトラサイクリン、３．４８ｇ／ｌアルギニンおよび１．５ｇ／ｌグリシンを含む４０ｍｌのＭ１２培地（組成：２．２ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．４ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、個別滅菌：２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、８．５１ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍｌ／ｌ微量元素溶液Ｍ１２（滅菌濾過：０．２ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／Ｌ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００３ｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、１ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７．４）に開始ＯＤ６００が０．１となるまで接種した。株を４８時間培養した。約０．５～０．８のＯＤ６００で、０．２％（ｗ／ｖ）ラムノースの添加によって遺伝子発現を誘導した。誘導の４時間／１８時間／２３時間後に、６．９７ｇ／ｌ Ａｒｇ／１．５ｇ／ｌ Ｇｌｙ、２．３４ｇ／Ｌ Ａｒｇ／０．７５ｇ／Ｌ Ｇｌｙおよび６．９７ｇ／ｌ Ａｒｇ／１．５ｇ／ｌ Ｇｌｙをスパイクした。培養の終了時にサンプルを採取し、生産されたＧＡＡの濃度を決定した。
【0158】
結果を表２１に示す。
【0159】
【表21】
【0160】
表２１から明らかなように、Ｍ．プロドゥケンス（M. producens）に由来するＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子およびＰ．プチダ（P. putida）に由来するａｒｇＦＧＨ遺伝子を備える株は、５８９ｍｇ／ｌのＧＡＡを生産することができた。株Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０／ｐＡＣＹＣＡＴｈ－５｛ＰＲｈａ｝［ａｇａｔ＿Ｍｐ（ｃｏＰｐ） ａｒｇＦＧＨ＿Ｐｐ］｛ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ｝［ｃａｒＡＢ＿Ｐｐ］［ｔｅｒ］におけるｃａｒＡＢの付加的な導入は、ＧＡＡ生産を６９３ｍｇ／ｌにまで改善した。
【配列表】
【国際調査報告】