知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ プロキューアール セラピューティクス ツー ベスローテン フェンノートシャップの特許一覧
特表2023-507521シュタルガルト病の処置におけるヌクレオチド脱アミノ化のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-22
(54)【発明の名称】シュタルガルト病の処置におけるヌクレオチド脱アミノ化のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230215BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230215BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20230215BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230215BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230215BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20230215BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z
C12N5/10 ZNA
C12Q1/68 100Z
C12Q1/6869 Z
A61P27/02
A61K31/7105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022538359
(86)(22)【出願日】2020-12-23
(85)【翻訳文提出日】2022-08-19
(86)【国際出願番号】 EP2020087767
(87)【国際公開番号】W WO2021130313
(87)【国際公開日】2021-07-01
(31)【優先権主張番号】19219283.9
(32)【優先日】2019-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】517299054
【氏名又は名称】プロキューアール セラピューティクス ツー ベスローテン フェンノートシャップ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】スウィルデンス，ジム
(72)【発明者】
【氏名】ファン シント フィート，レンカ
(72)【発明者】
【氏名】ホーゲブーム，テス
(72)【発明者】
【氏名】ハースト，サスキア ヤコバ ペトロネラ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ13
4B063QQ52
4B063QR35
4B063QS34
4B063QX10
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA44
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA58
4C086NA14
4C086ZA33
(57)【要約】
本発明は、真核生物細胞における標的ＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド（アデノシン）の特異的編集をもたらすことができるＲＮＡ編集オリゴヌクレオチド（ＥＯＮ）に関し、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、シュタルガルト病の処置に使用するため、より好ましくは、ＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ中に存在する標的アデノシンの脱アミノ化のためのものである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的ＲＮＡ分子と二本鎖複合体を形成することができるＲＮＡ編集オリゴヌクレオチド（ＥＯＮ）であって、前記ＥＯＮは、前記標的ＲＮＡ分子と複合体を形成すると、「ＲＮＡ作用性アデノシンデアミナーゼ」（ＡＤＡＲ）酵素をリクルートし、前記ＡＤＡＲと複合体を形成することができ、それにより、前記ＡＤＡＲ酵素による前記標的ＲＮＡ分子中の標的アデノシンの脱アミノ化を可能とし、ここで、前記ＥＯＮは分子内ループ構造を形成せず、前記標的ＲＮＡ分子はヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部である、ＥＯＮ。
【請求項2】
前記ＥＯＮが３つの連続するヌクレオチドのセントラルトリプレットを含み、前記標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドがセントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、シチジンである、請求項１に記載のＥＯＮ。
【請求項3】
前記ＡＤＡＲ酵素がＡＤＡＲ２である、請求項１または２に記載のＥＯＮ。
【請求項4】
前記セントラルトリプレット中の１、２または３個のヌクレオチドが修飾を含むものであり、但し、前記中央のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾または２’－メトキシエトキシ（２’－ＭＯＥ）修飾を糖部分に有さないことを条件とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のＥＯＮ。
【請求項5】
前記修飾が、デオキシリボース（ＤＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）および２’－フルオロリボースからなる群から選択される、請求項４に記載のＥＯＮ。
【請求項6】
前記ＥＯＮが、ホスホロチオエート、キラルに純粋なホスホロチオエート、Ｒｐホスホロチオエート、Ｓｐホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホノアセテート、トホスホノアセテート、ホスホナセタミド、チオホスホナセタミド、ホスホロチオエートプロドラッグ、Ｓ－アルキル化ホスホロチオエート、Ｈ－ホスホネート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、メチルホスフェート、メチルホスホロチオエート、エチルホスフェート、エチルホスホロチオエート、ボラノホスフェート、ボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスフェート、メチルボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスホネート、メチルボラノホスホノチオエート、ホスホリルグアニジン、メチルスルホニルホスホロアミデート、ホスホロアミダイト、ホスホナミダイト、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオジアミデート、スルファメート、ジメチレンスルホキシド、スルホネート、トリアゾール、オキサリル、カルバメート、メチレンイミノ、チオアセトアミド、およびそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオシド間連結修飾を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＥＯＮ。
【請求項7】
前記ＥＯＮの５’および３’末端の２、３、４、５または６個の末端ヌクレオチドがホスホロチオエート連結で連結されており、好ましくは５’および３’末端の５個の末端ヌクレオチドがホスホロチオエート連結で連結されている、請求項６に記載のＥＯＮ。
【請求項8】
前記セントラルトリプレットの外側のＥＯＮ中の１つまたは複数のヌクレオチドが、－ＯＨ；－Ｆ；１個または複数のヘテロ原子が介在している場合がある、置換または非置換、直鎖または分枝の低級（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル、またはアラルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキニル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アリル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル；－メトキシ；－アミノプロポキシ；－メトキシエトキシ；－ジメチルアミノオキシエトキシ；および－ジメチルアミノエトキシエトキシからなる群から選択される一置換または二置換を、糖の２’、３’および／または５’位に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＥＯＮ。
【請求項9】
前記標的アデノシンが、ヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ中の未成熟停止コドンの一部である、請求項１～８のいずれか一項に記載のＥＯＮ。
【請求項10】
前記標的アデノシンが、表１に提供されるＧ＞Ａ突然変異のいずれか１つであり、好ましくはヒトＡＢＣＡ４遺伝子のエクソン４２におけるｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異である、請求項１～８のいずれか一項に記載のＥＯＮ。
【請求項11】
前記ＥＯＮが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１１、好ましくは配列番号８および９からなる群から選択される配列、より好ましくは配列番号９の配列を含むか、または前記配列からなる、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＥＯＮ。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のＥＯＮ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項13】
ヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部における標的アデノシンの脱アミノ化に使用するための、２つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）のセットを含む組成物であって、一方のＡＯＮは、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＥＯＮであり、他方のＡＯＮは「ヘルパーＡＯＮ」であり、前記ヘルパーＡＯＮは、前記ＥＯＮに相補的なヌクレオチドのストレッチとは別のヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにおけるヌクレオチドのストレッチに相補的であり、前記ヘルパーＡＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有し、前記ＥＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有する、組成物。
【請求項14】
前記ＥＯＮが配列番号９の配列を含むかまたはそれからなり、前記ヘルパーＡＯＮが配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
シュタルガルト病の処置に使用するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１２～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
細胞中の標的ＲＮＡ分子に存在する少なくとも１個の特定の標的アデノシンの、脱アミノ化方法であって、前記標的ＲＮＡ分子はヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはその一部であり、前記方法は、
（ｉ） 請求項１～１１のいずれか一項に記載のＥＯＮを前記細胞に付与するステップ；
（ii） 前記ＥＯＮを前記細胞に取り込ませるステップ；
（iii）前記ＥＯＮを前記標的ＲＮＡ分子にアニーリングさせるステップ；
（iv） 野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物のＡＤＡＲ酵素に、前記標的ＲＮＡ分子中の前記標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化させるステップ；および
（ｖ） 任意選択で前記標的ＲＮＡ分子中の前記イノシンの存在を確認するステップ
を含む、方法。
【請求項17】
ステップ（ｖ）は、ａ）前記標的ＲＮＡ分子の配列を決定するステップ；
ｂ）機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のＡＢＣＡ４タンパク質の存在を評価するステップ；
ｃ）前記ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングが前記脱アミノ化によって調節されたかどうかを評価するステップ；または
ｄ）機能的読出しを使用するステップであって、前記脱アミノ化後の前記標的ＲＮＡは、機能的な、全長の、伸長したおよび／または野生型のＡＢＣＡ４タンパク質をコードする、ステップ
を含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医学およびバイオテクノロジーの分野に関する。本発明は、シュタルガルト病に罹患している患者のＡＢＣＡ４（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡにおける変更（Ｇ＞Ａ突然変異など）を部位特異的に標的化することによる、（内在性）ＡＤＡＲ酵素を使用したＲＮＡ編集プロセスを通じたヌクレオチドの脱アミノ化に適用できるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【0002】
シュタルガルト病（ＳＴＧＤまたはＳＴＧＤ１）は、中心視力の進行性障害を引き起こす最も一般的な遺伝性黄斑ジストロフィーであり、典型的には小児期または若年成人期に発症し、後期成人期における発症の頻度が最も低く、より後期の発症がより良好な予後と一般に関連している。本疾患の有病率は８，０００～１０，０００人に１人であり、光受容細胞特異的ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＲと呼ばれることもある）をコードする遺伝子における疾患原因突然変異に関連した常染色体劣性遺伝形式を有している。このタンパク質は２２７３アミノ酸を含み、主に網膜（光受容体細胞および網膜色素上皮（ＲＰＥ））において発現し、周縁部および錐体外節ディスクに局在している。それは、Ｎ－レチニリデン－ホスファチジルエタノールアミンを光受容体ディスクの内腔側から細胞質ゾル側に反転させると考えられている。シュタルガルト病は、ＲＰＥにおけるリポフスチン含有物の大量の沈着、有害物質の除去の失敗、および光受容細胞の有意な喪失と密接に関連している。リポフスチンの主成分であるジ－レチノイド－ピリジニウム－エタノールアミンは、ＡＢＣＡ４が欠損しているか機能不全である場合に形成される。実際、ＡＢＣＡ４がシュタルガルト病の根底にある遺伝子であることを確認した複数の報告が発表されており、多数（約１０００）の疾患原因バリアントが示されているが、その半分以上が一度しか記載されていない。ＡＢＣＡ４の二対立遺伝子バリアントは、約７５％のシュタルガルト病の症例、および常染色体劣性のカムロッドジストロフィー（ＣＲＤ）の患者の約３０％において同定されている。ほとんどの突然変異はミスセンスであり、それにナンセンス突然変異、小さな挿入／欠失、およびＲＮＡスプライシングに影響を与える突然変異が続く。北欧および米国からのシュタルガルト病の症例の異常に高い割合（約３０％）が、単一のＡＢＣＡ４バリアントの結果である。イントロン３８に存在する３番目に頻度の高いＡＢＣＡ４バリアントｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃは、ＡＢＣＡ４のｍＲＮＡにおけるエクソン３９のスキッピング、またはエクソン３９＋エクソン４０のスキッピングにより、重度の形態のシュタルガルト病を引き起こすことが知られている。エクソン３９のスキッピングは、１２４ヌクレオチドのフレームシフト欠失をもたらすのに対し、エクソン３９と４０のダブルスキッピングは、２５４ヌクレオチドのフレームシフト欠失をもたらす。西欧諸国では、約７０００人のシュタルガルト病患者が、この突然変異に罹患していると推定されている。
【0003】
シュタルガルト病を処置するための３つの主要な介入経路は現在、幹細胞療法、遺伝子置換療法、および様々な薬物アプローチである。遺伝性眼疾患を処置するための比較的新しい治療法の進展は、突然変異遺伝子から転写された前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の使用である。ＡＯＮは一般に小さなポリヌクレオチド分子（１６～２５ｍｅｒ）であり、それらの配列が標的ｐｒｅ－ｍＲＮＡ分子の配列と相補的であるために、スプライシングを妨害することができる。想定されるメカニズムは、ＡＯＮがそれと相補的である標的配列に結合すると、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ内の標的化領域がスプライシング因子に干渉し、これが次いで、変更されたスプライシングをもたらすといったものである。治療的には、このような方法論は、２つの方法で使用することができる：ａ）突然変異が、隠れたスプライシング部位を活性化している遺伝子の正常なスプライシングを再指示する、およびｂ）ｍＲＮＡのリーディングフレームが依然としてインタクトのままであり、（部分的または完全に）機能的なタンパク質が生成されるような形で（タンパク質切断性の）突然変異を保有するエクソンをスキップする。どちらの方法も、すでに患者にうまく適用されている。眼疾患に関して、ＡＯＮはレーバー先天性黒内障またはＬＣＡの治療に有望であることが示されている（国際公開第２０１２／１６８４３５号パンフレット；国際公開第２０１３／０３６１０５号パンフレット；国際公開第２０１６／０３４６８０号パンフレット；国際公開第２０１６／１３５３３４号パンフレット）。さらに、国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットは、アッシャー症候群ＩＩ型の治療、予防、または遅延のために、エクソン１３、エクソン５０およびＰＥ４０のスキッピングならびに／またはエクソン１２の保持に向けた、ＵＳＨ２Ａのｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的化するためのエクソンスキッピングＡＯＮを開示している。国際公開第２０１５／００４１３３号パンフレットは、シュタルガルト病の治療のためにＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン１０のスキッピングを刺激する際のＡＯＮの使用を開示している。国際公開第２０１８／１８９３７６号パンフレットは、ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異によって引き起こされるエクソン３９およびエクソン４０のスキッピングを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。国際公開第２０１８／１０９０１１号パンフレットは、いくつかのイントロン突然変異のために誤ってｍＲＮＡに導入される偽エクソンの包含を防ぐためのＡＯＮを開示している。
【0004】
示されているように、スプライス調節、エクソンスキッピングの防止、または偽エクソンの包含の防止による処置を検討する場合、生成するｍＲＮＡは、翻訳されたタンパク質が機能するか、または少なくとも部分的に機能し、未成熟に停止されないようにインフレームであるべきである。しかし、スプライス調節では解決できない多くの突然変異がヒトＡＢＣＡ４遺伝子中に存在する。例をあげると、結果として得られる転写産物がフレームから外れる場合、または生成するタンパク質がその機能を実行するために必要な必須部分を欠く場合である。したがって、スプライシングを調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することによってシュタルガルト病を治療することに多大な努力が払われているが、多くのシュタルガルト患者は、ＡＢＣＡ４遺伝子に異なる種類の突然変異を保有しているため、これらの努力の恩恵を受けないことになる。エクソン４２におけるｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異は、想起される１つであり、これは西欧諸国においてより一般的なＡＢＣＡ４の変異の１つであり、推定有病率は１０，０００～１５，０００人である（Lewis et al. Am J Hum Genet 64:422-434, 1999）。この突然変異は、ＡＢＣＡ４タンパク質の１９６１位のアミノ酸グリシン（Ｇ；コドン：ＧＧＡ）のグルタミン酸（Ｅ、コドン：ＧＡＡ）への置換を導く。このアミノ酸は、輸送のための基質の結合のためのエネルギーを提供するために不可欠なヌクレオチド結合ドメイン２（ＮＢＤ２）中に位置している。エクソン４２は、スキップされた場合にインフレームとなるものであるが、適切に機能するＡＢＣＡ４タンパク質のためには破壊できないＮＢＤ２の一部をコードしている。生化学的な評価は、この置換を保有するＡＢＣＡ４タンパク質が低下したＡＴＰａｓｅ活性を有することを示しており（Sun et al. Nature Genetics 26:242-246, 2000）、これはまた、ＮＢＤ２のわずかな変化でもタンパク質の機能不全を引き起こし得ることのしるしでもある。ＲＮＡ編集によって標的化され得る他の突然変異は、当業者には理解されるであろうが、エクソンがその周囲のエクソンのフレームから外れているために、スキップすることができないエクソン中に現れる突然変異である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、標的ＲＮＡ分子と二本鎖複合体を形成することができるＲＮＡ編集オリゴヌクレオチド（ＥＯＮ）であって、ＥＯＮは、標的ＲＮＡ分子と複合体を形成すると、「ＲＮＡ作用性アデノシンデアミナーゼ」（ＡＤＡＲ）酵素をリクルートし、ＡＤＡＲと複合体を形成することができ、それにより、ＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ分子中の標的アデノシンの脱アミノ化を可能とし、ここで、ＥＯＮは分子内ループ構造を形成せず、標的ＲＮＡ分子はヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部であるＥＯＮに関する。一実施形態では、ＥＯＮは連続する３個のヌクレオチドのセントラルトリプレットを含み、標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドがセントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、シチジンである。好ましくは、リクルートされてｄｓＲＮＡ複合体と複合体を形成するＡＤＡＲ酵素はＡＤＡＲ２である。特に好ましい実施形態では、セントラルトリプレット中の１、２または３個のヌクレオチドが修飾を含むが、但し、中央のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾も２’－メトキシエトキシ（２’－ＭＯＥ）修飾も糖部分に有さないことを条件とする。さらに、ＥＯＮは、本明細書で概説されるように、少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオシド間連結修飾を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、標的アデノシンは、ヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにおける未成熟停止コドンの一部；表１に提供されるようなＧ＞Ａ変異のいずれか１つ；または、より好ましくはヒトＡＢＣＡ４遺伝子のエクソン４２におけるｃ．５８８２Ｇ＞Ａ変異である。本発明は、好ましい態様において、本発明によるＥＯＮであって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１１からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなるＥＯＮに関する。好ましい実施形態では、ＥＯＮは配列番号８または９の配列を含むか、またはそれからなる。さらにより好ましい実施形態では、ＥＯＮは配列番号９の配列を含むか、またはそれからなる。
【0006】
本発明はさらに、本発明によるＥＯＮ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、ヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部における標的アデノシンの脱アミノ化に使用するための２つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）のセットを含む組成物であって、一方のＡＯＮは、本発明によるＥＯＮであり、他方のＡＯＮは「ヘルパーＡＯＮ」であり、ヘルパーＡＯＮは、ＥＯＮに相補的なヌクレオチドのストレッチとは別の、ヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにおけるヌクレオチドのストレッチに相補的であり、ヘルパーＡＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有し、ＥＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有する、組成物に関する。好ましい態様では、本発明による組成物は、ヘルパーＡＯＮとして、配列番号１０の配列を含むかまたはそれからなるオリゴヌクレオチドを含み、ここで、ＥＯＮは配列番号９の配列を含むかまたはそれからなるオリゴヌクレオチドである。
【0007】
本発明はまた、シュタルガルト病の処置に使用するための本発明によるＥＯＮまたは組成物に関する。本発明はまた、細胞中の標的ＲＮＡ分子中に存在する少なくとも１個の特定の標的アデノシンの、脱アミノ化方法に関し、ここで、標的ＲＮＡ分子は、ヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはその一部であり、脱アミノ化される必要がある標的アデノシンは、好ましくは本明細書で概説される標的アデノシンの１つであり、脱アミノ化方法は、以下のステップを含む：本発明によるＥＯＮまたは組成物を細胞に付与するステップ；オリゴヌクレオチドを細胞に取り込ませるステップ；オリゴヌクレオチドを標的ＲＮＡ分子にアニーリングさせるステップ；野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物ＡＤＡＲ酵素に、標的ＲＮＡ分子中の標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化させるステップ；および、任意選択で標的ＲＮＡ分子内のイノシンの存在を確認するステップ。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1-1】図１（Ａ）は、本開示の実施例において使用されている「ＡＢＣＡ４－１～ＡＢＣＡ４－２０」と呼ばれるＥＯＮの相補性を示している（ＡＢＣＡ４－１、２、３、４、および５はそれぞれ配列番号１、２、３、４、および５であり；ＡＢＣＡ４－６～１２は配列番号６であり；ＡＢＣＡ４－１３～１６は配列番号７であり；ＡＢＣＡ４－１７～２０は配列番号８であり；ここではすべて３’から５’である）。ヒトＡＢＣＡ４標的（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡが上に示されている（５’から３’へ；配列番号１２）。標的配列中（エクソン４２中）の標的アデノシンＡは太字で示されており、下流のイントロン４２の５’末端には下線が引かれており、その前にエクソン４２の３’末端がある。ＡＢＣＡ４－１３～１６はエクソン４２／イントロン４２の境界まで相補的である。
【図1-2】図１（Ｂ）は、ＡＢＣＡ４－２１～２９と呼ばれるＥＯＮの相補性のセットを示している（ここでは３’から５’へ）。ＡＢＣＡ４－２１～２７（配列番号９）はそれぞれＡＢＣＡ４－２８（配列番号１０）と一緒に、分割されたＥＯＮのセットを形成するが、ＡＢＣＡ４－２９（配列番号１１）は複数のミスマッチを持つＥＯＮである。標的配列中の標的アデノシンＡは太字で示されており、ここでも下流のイントロン４２の５’末端に下線が引かれており、その前にエクソン４２の３’末端がある。２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡは小文字で示されている。ホスホロチオエート連結によって互いに接続されている２’－Ｏ－Ｍｅヌクレオチドはイタリック体で、小文字である。ホスホロチオエート連結によって互いに接続されているＤＮＡヌクレオチドには下線が引かれており、大文字のイタリック体となっている。２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドはイタリック体で、大文字である。ホスホロチオエート連結によって互いに接続されている２’－ＭＯＥ修飾ヌクレオチドは太字で、イタリック体で、大文字である。メチルホスホン酸（ＭｅＰ）修飾アデノシンは灰色の枠で囲まれており、これはセントラルトリプレットの中央のヌクレオチドから－１の連結位置にある（連結の番号付けについては、国際公開第２０２０／２０１４０６号パンフレットの図５を参照されたい）。セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドは、標的アデノシンの反対側にある。２’－Ｆ修飾アデノシンは太字であり、灰色の枠で囲まれている。ミスマッチは、黒枠で囲まれている。ＡＢＣＡ４－５は、ヘアピン配列を含んでいる（小文字）。
【図2-1】図２は、添付の実施例において概説されているように、精製したｈＡＤＡＲ２を適用したＲＮＡ編集反応において、図１のＡＢＣＡ４－１～２９を使用した生化学的アッセイの結果を示している（ＡＢＣＡ４－５およびＡＢＣＡ４－２８を除く）。（Ａ）～（Ｇ）は、わかりやすくするために、それぞれ４つの異なるＥＯＮの結果を示している。
【図2-2】図２は、添付の実施例において概説されているように、精製したｈＡＤＡＲ２を適用したＲＮＡ編集反応において、図１のＡＢＣＡ４－１～２９を使用した生化学的アッセイの結果を示している（ＡＢＣＡ４－５およびＡＢＣＡ４－２８を除く）。（Ａ）～（Ｇ）は、わかりやすくするために、それぞれ４つの異なるＥＯＮの結果を示している。
【図3】図３は、ミディジーン（midigene）とＡＤＡＲ２を過剰発現するプラスミドとを使用したセルベースアッセイにおいて、ＥＯＮ ＡＢＣＡ４－５、６、８、２０、２１＋２８、２２＋２８、２３＋２８、２４＋２８、ならびにＡＢＣＡ４－２１、２２、２３、２４、および２６を別々に使用した、ＡＢＣＡ４標的配列に対するＲＮＡ編集のパイロマークシーケンシング結果を示している。ＷＴは、野生型の標的配列を保有するミディジーンによるトランスフェクションを意味するが、「突然変異型」はＥＯＮを一切含まない突然変異型ミディジーン単独によるトランスフェクションを意味する。ＲＴは逆転写酵素の陰性対照である。ＥＯＮのすべてのトランスフェクションは、突然変異型ミディジーンによるトランスフェクションを伴うものであった。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明の発明者らは、ＡＢＣＡ４内の（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡの欠陥を修正するためのスプライス調節以外の手段を求めてきた。本発明者らは、多くの場合「ＲＮＡ編集」と呼ばれる別のタイプのＲＮＡ修復を使用することを企図した。ＲＮＡ編集とは、真核細胞が、多くの場合部位特異的かつ正確な方法で、それらのＲＮＡ分子の配列を変更させ、それによってゲノムにコードされたＲＮＡのレパートリーを数桁増大させる、天然の方法である。ＲＮＡ編集酵素は、動物界および植物界全体にわたって真核生物種について記載されており、これらの方法は、カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）などの最も単純な生命体からヒトまでの後生動物における細胞ホメオスタシスの管理においてある重要な役割を果たす。ＲＮＡ編集の例は、それぞれ、アデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼと呼ばれる酵素によるアデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への変換、およびシチジン（Ｃ）からウリジンへ（Ｕ）の変換である。最も広く研究されたＲＮＡ編集システムは、認識ドメインおよび触媒ドメインを含む多ドメインタンパク質であるアデノシンデアミナーゼ酵素である。認識ドメインは、特異的な二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の配列および／または立体構造を認識する一方、触媒ドメインは、核酸塩基の脱アミノ化により、標的ＲＮＡにおいて近傍の予め規定されている位置でアデノシンをイノシンに変換する。イノシンは、細胞の翻訳機構によりグアノシンとして読み取られ、このことは、編集されたアデノシンが、ｍＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍＲＮＡのコード領域にある場合、タンパク質配列を再コード化することができることを意味する。したがって、アデノシン脱アミノ化によるＲＮＡ編集は、Ｇ＞Ａ突然変異だけでなく、ＡからＧへの変換が機能的なタンパク質の生成を可能とする他の突然変異も修復する完璧な方法である。アデノシンデアミナーゼは、ヒトデアミナーゼｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、およびｈＡＤＡＲ３を含めて、ＲＮＡ上で作用するアデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ）（ＡＤＡＲ）と呼ばれる酵素のファミリーの一部である。
【0010】
アデノシンデアミナーゼを適用して標的ＲＮＡを編集するためのオリゴヌクレオチドの使用は、当技術分野において知られている。Montiel-Gonzalez et al. (Proc Natl Acad Sci USA 2013, 110(45):18285-18290)によって、ｂｏｘＢ ＲＮＡヘアピン配列を認識するバクテリオファージラムダＮタンパク質に融合された、ｈＡＤＡＲ２タンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインを含む遺伝子操作された融合タンパク質を使用した標的ＲＮＡの編集が記載された。治療設定におけるこの方法の欠点は、融合タンパク質の必要性である。これには、主たるハードルであるが、細胞が融合タンパク質を形質導入されていること、または、標的細胞に、発現向けに操作されたアデノシンデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸構築物をトランスフェクトすることが必要である。Vogel et al. (2014. Angewandte Chemie Int Ed 53:267-271)によって、ベンジルグアノシン置換ガイドＲＮＡ、および、ＳＮＡＰ－タグドメインに遺伝子的に融合された（ｄｓＲＮＡ結合ドメインを欠く）ＡＤＡＲ１または２のアデノシンデアミナーゼドメインを含む、遺伝子操作された融合タンパク質（操作されたＯ６－アルキルグアノシン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼ）を使用した、ｅＣＦＰならびに第Ｖ因子ライデンをコードするＲＮＡの編集が、開示された。このシステムには、Montiel-Gonzalez et al.（2013）によって記載された操作されたＡＤＡＲと同様の難点がある。Woolf et al. (1995. Proc Natl Acad Sci USA 92:8298-8302)により、比較的長い一本鎖アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（長さ２５～５２ヌクレオチド）を使用したより単純なアプローチが開示されており、この場合、標的ＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとの二本鎖の特質のために、より長いオリゴヌクレオチド（３４－ｍｅｒおよび５２ｍｅｒ）が内在性ＡＤＡＲによる標的ＲＮＡの編集を促進することができたが、このオリゴヌクレオチドは、細胞抽出物においてまたはマイクロインジェクションによる両生類（アフリカツメガエル（Xenopus））卵母細胞においてのみ機能するように見え、特異性に関する深刻な欠落が問題となった：アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的であった標的ＲＮＡ鎖中のほぼすべてのアデノシンが編集されたのである。Woolf et al. (1995)は、標的ＲＮＡ配列中の特定の標的アデノシンの脱アミノ化を達成しなかった。アンチセンスオリゴヌクレオチドの未修飾ヌクレオチドの反対側のほぼすべてのアデノシンが、「無作為編集」とも呼ばれるプロセスを通して編集されていたからである。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットでは、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが開示され、これは、標的ＲＮＡ配列に相補的な配列（「標的化部分（targeting portion）」）によって、およびステム－ループ構造（「リクルートメント部分）の存在によって、特徴付けられる。国際公開第２０１７／２２０７５１号パンフレットでは、単一アデノシンの特異的編集のために、リクルートメント部分がないが、標的領域に相補的であるヌクレオチドの鎖を有するＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが開示されており、この場合、オリゴヌクレオチドが特定の化学修飾との組合せで１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジを含む。かかるＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドにおける特定の化学修飾に関する極めて特定の位置が、国際公開第２０１８／０４１９７３号パンフレット、国際公開第２０１９／１５８４７５号パンフレット、および国際公開第２０１９／２１９５８１号パンフレットにおいてさらに開示された。国際公開第２０１９／００５８８４号パンフレットは、標的化システムが、アデノシンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインに連結された標的化ドメイン（ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３など）、および一般に標的配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであるガイド分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム）を含む、標的アデノシンの脱アミノ化のシステムを開示している。本発明は、「ネイキッド（naked）」（そのまま）のオリゴヌクレオチド、または（ウイルス）ベクター）から発現されるオリゴヌクレオチドに関するが、いずれの様式でも、ＣＲＩＳＰＲシステムのもののようなエフェクタータンパク質と複合体を形成するためのループ構造を生成する標的化ドメインは含まない。エフェクタータンパク質をリクルートまたは連結する分子内ループ構造を有する国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットおよび国際公開第２０１９／００５８８４号パンフレットに開示されるＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが第１世代ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドとみなされ得る場合、本発明は、そのような分子内ループ構造を含まないＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドに関し、したがって、第２世代のＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドとみなされ得る。国際公開第２０１９／００５８８４号パンフレットは、網膜および内耳の変性疾患であるアッシャー症候群ＩＩ型を引き起こすＵＳＨ２Ａ遺伝子中のＧ＞Ａ突然変異の標的化に使用するためのＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを開示している。国際公開第２０１９／００５８８４号パンフレットは、ループ構造を形成し、（突然変異型）ＡＤＡＲ酵素とも複合体を形成するＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを開示している。本発明は、ループ構造を形成する配列を含まず、ＡＤＡＲ酵素または突然変異型ＡＤＡＲ酵素と（共有結合または非共有結合で）複合体を形成せず、むしろ標的細胞中にすでに存在するＡＤＡＲなどの内在性デアミナーゼ酵素を利用するＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドに関する。本発明のＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、細胞または組織への投与後に、細胞内でそのような酵素をリクルートするが、添付の実施例に示されているように、生化学的アッセイにおいてもＡＤＡＲ酵素をリクルートすることができる。好ましい実施形態では、デアミナーゼはＡＤＡＲ酵素、より好ましくはＡＤＡＲ２であり、これは、標的細胞内に内在性レベルですでに存在し、発現ベクターまたはその他を介するなどして同時投与される必要がない。
【0011】
ＲＮＡ編集の先行技術のほとんどは、あらゆるタイプの疾患または遺伝的障害に対するそういった現象の一般的な適用性に関するものであり、この場合、特定の標的アデノシンをイノシンに編集して、翻訳を回復すること（アデノシンが停止コドンの一部であった場合）、および／またはアデノシンが、タンパク質を変化させるとともに遺伝的疾患を引き起こすコドンの一部であった場合に、ＲＮＡを修復することが必要である。先行技術の文書では、遺伝子変異が障害の原因であるシュタルガルト病などの眼疾患におけるＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの適用について、またはこれを具体的にいかに行うべきかについて、具体的に明らかにされていなかった。対照的に、タンパク質発現のダウンレギュレーションにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの有用性を明らかにする、または、スプライシングに影響を与える、多くの先行技術が蓄積されてきた（例えば、国際公開第２０１２／１６８４３５号パンフレット、国際公開第２０１３／０３６１０５号パンフレット、国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレット、国際公開第２０１６／０３４６８０号パンフレット、国際公開第２０１６／１３８３５３号パンフレット、国際公開第２０１６／１３５３３４号パンフレット、国際公開第２０１７／０６０３１７号パンフレット、国際公開第２０１７／１８６７３９号パンフレット、国際公開第２０１８／０５５１３４号パンフレット、国際公開第２０１５／００４１３３号パンフレット、国際公開第２０１８／１８９３７６号パンフレット、国際公開第２０１８／１０９０１１号パンフレット、および米国特許第９，３５３，３７１号明細書、を参照されたい）。本発明の発明者らの知る限りでは、眼の欠陥を引き起こす遺伝子中の特定のアデノシンを脱アミノ化する目的でのＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの使用、およびそのようなＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを眼障害、特にシュタルガルト病の処置に適用することは、公表されていない。
【0012】
本発明は、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチド（本明細書では全体として「ＥＯＮ」と略される）および眼疾患、特にシュタルガルト病の処置における、それらの使用に関する。本発明のＥＯＮは、ＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ中の特定のアデノシンを標的とし、これらをイノシンに脱アミノ化し、翻訳においてグアノシンとして読み取る。アデノシン（Ａ）自体が必ずしもシュタルガルト病を引き起こす突然変異である必要はないが、例をあげると、疾患の原因である未成熟終止コドンの一部であり得ること（例をあげると、より短いＡＢＣＡ４タンパク質産物が生成されるので）、また、例をあげると、グアノシン（Ｇ）またはチミジン（Ｔ）が真の突然変異であること、に留意されたい。アデノシンをイノシンに脱アミノ化することによって、野生型タンパク質、または停止コドンの代わりにアミノ酸が変更された（および野生型ｍＲＮＡの元のコドンに関して変更された）タンパク質がもたらされる場合があるが、継続的な翻訳が可能になるはずである。
【0013】
本発明は、標的ＲＮＡ分子と二本鎖複合体を形成することができるＥＯＮであって、ＥＯＮは、標的ＲＮＡ分子と複合体を形成すると、「ＲＮＡ作用性アデノシンデアミナーゼ」（ＡＤＡＲ）酵素をリクルートし、ＡＤＡＲと複合体を形成することができ、それにより、ＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ分子中の標的アデノシンの脱アミノ化を可能とし、ここで、ＥＯＮは分子内ループ構造を形成せず、標的ＲＮＡ分子はヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部であるＥＯＮに関する。ＥＯＮが細胞、組織または（ヒト）対象に投与されるときには、ＡＤＡＲ、好ましくは、ＡＤＡＲ２はＥＯＮと複合体を形成していないことに留意されたい。ＥＯＮは、そのまま（ネイキッド）、またはウイルスベクターもしくは他の発現ベクターからの発現を介して細胞に送達されることに留意されたい。細胞に入ると、ＥＯＮはＡＢＣＡ４標的ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを標的化し、その標的とハイブリダイズする。この二本鎖複合体は、そのミスマッチとＥＯＮの選択的な修飾および含量とにより、内在性のＡＤＡＲ酵素を引き付ける（またはリクルートする）ことができ、これはその後、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチド、好ましくはシチジンの反対側にある標的アデノシンを脱アミ化する。これは、ヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡのアデノシンの特異的なＲＮＡ編集を可能とする。本発明のＥＯＮは、「ネイキッド」形態で投与された場合、それが細胞に入る前には、いかなるタンパク質にも結合または（非）共有結合していない。また、それはＡＤＡＲ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムについて当技術分野で見られるような、他のエフェクタータンパク質に結合するための分子内ループ構造も形成しない。本発明のＥＯＮは、連続する３個のヌクレオチドのセントラルトリプレットを含み、標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドはセントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、好ましくはシチジンである。好ましくは、ｄｓＲＮＡ複合体によって引き寄せられるＡＤＡＲ酵素は、ＡＤＡＲ２である。添付の実施例に示されているように、当業者は、アッセイ内でＥＯＮをその標的配列と接触させ、ＡＤＡＲ酵素をリクルートし、ＡＢＣＡ４標的分子中の特定の標的アデノシンのＲＮＡ編集をもたらすという意味で、インビボの状況を代表する生化学的アッセイを設定することができる。好ましい実施形態では、セントラルトリプレット中の１、２または３個のヌクレオチドは修飾を含むが、但し、中央のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾も２’－メトキシエトキシ（２’－ＭＯＥ）修飾も糖部分に有さないことを条件とする。別の好ましい実施形態では、セントラルトリプレット中のヌクレオチドの修飾は、デオキシリボース（ＤＮＡ）、アンロック核酸（ＵＮＡ）および２’－フルオロリボースからなる群から選択される。本明細書でさらに概説されるように、ＤＮＡはつまり、ＲＮＡの化学的誘導体であるとみなされる。本発明のＥＯＮ内のほとんどの（しかし、いくつかの実施形態では確かにすべてではない）ヌクレオチドはＲＮＡであり、これは、本明細書でさらに詳述されるように、天然に存在しない置換基で修飾されていてもよい。本発明のＥＯＮは好ましくは、ホスホロチオエート、キラルに純粋なホスホロチオエート、Ｒｐホスホロチオエート、Ｓｐホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホノアセテート、トホスホノアセテート、ホスホナセタミド、チオホスホナセタミド、ホスホロチオエートプロドラッグ、Ｓ－アルキル化ホスホロチオエート、Ｈ－ホスホネート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、メチルホスフェート、メチルホスホロチオエート、エチルホスフェート、エチルホスホロチオエート、ボラノホスフェート、ボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスフェート、メチルボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスホネート、メチルボラノホスホノチオエート、ホスホリルグアニジン、メチルスルホニルホスホロアミデート、ホスホロアミダイト、ホスホナミダイト、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオジアミデート、スルファメート、ジメチレンスルホキシド、スルホネート、トリアゾール、オキサリル、カルバメート、メチレンイミノ、チオアセトアミド、およびそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオシド間連結修飾を含む。最も好ましいのは、ホスホロチオエート連結の使用であるが、ＥＯＮが完全にホスホロチオエート化されている必要はない。例をあげると、特定の実施形態では、ＥＯＮの５’および３’末端の少なくとも２、３、４、５または６個の末端ヌクレオチドがホスホロチオエート連結で連結されており、好ましくは５’および３’末端の５個の末端ヌクレオチドがホスホロチオエート連結で連結されている。セントラルトリプレットにより近いさらなるヌクレオチドもまた、ホスホロチオエートなどの天然に存在しない連結によって接続されていてもよい。好ましい実施形態では、ＥＯＮは、細胞内のＲＮａｓｅおよびインビボでの他の環境の状況による分解に対してＥＯＮを安定化するように化学的に修飾される。このために、セントラルトリプレットの外側のＥＯＮ中の１つまたは複数のヌクレオチドは、糖の２’、３’および／または５’位の一置換または二置換を含むものであって、置換が、－ＯＨ；－Ｆ；１個または複数のヘテロ原子が介在している場合がある、置換または非置換、直鎖または分枝の低級（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル、またはアラルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキニル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アリル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル；－メトキシ；－アミノプロポキシ；－メトキシエトキシ；－ジメチルアミノオキシエトキシ；および－ジメチルアミノエトキシエトキシからなる群から選択されることが好ましい。本発明のＥＯＮに導入され得る他の可能な化学修飾、特に糖、塩基およびリンカーの化学修飾については、本明細書でさらに議論される。
【0014】
本発明によって概説されるようなシステムによるＲＮＡ編集は、好ましくは、標的分子（ヒトＡＢＣＡ４遺伝子の転写されたｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）中の単一のアデノシンを標的とする。好ましくは、標的アデノシンは、ヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの未成熟終止コドンの一部である。別の好ましい実施形態では、標的アデノシンは、表１に提供されるようなＧ＞Ａ突然変異のいずれか１つである。より好ましくは、標的アデノシンは、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のエクソン４２におけるｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異である。ヒトＡＢＣＡ４遺伝子では、このＧ＞Ａ突然変異の３’側のヌクレオチドもアデノシンである。ＧＧＡ（野生型；グリシン）からのＧＡＡ（突然変異型；グルタミン酸）はＧＧＡまたはＧＧＧへと修復されると、この両方がそのコドンにおいてグリシンをもたらすため、その第２のアデノシンは標的アデノシンと同時に編集されてもよい。
【0015】
本発明は、配列番号１２の（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡ配列、またはＧ＞Ａ突然変異を含むその一部を標的とするＥＯＮにさらに関する。好ましくは、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１１からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなるＥＯＮに関する。好ましい実施形態では、ＥＯＮは配列番号８または９の配列を含むか、またはそれからなる。さらにより好ましい実施形態では、ＥＯＮは配列番号９の配列からなる。別の好ましい実施形態では、本発明によるＥＯＮは、国際公開第２０２０／２０１４０６号パンフレットの図５に開示されるようなヌクレオチドおよび連結番号付けに従って、好ましくは連結位置－１に、少なくとも１つのメチルホスホネート（ＭｅＰまたはＭＰ）連結を含む。
【0016】
本発明は、本発明によるＥＯＮ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物にさらに関する。本発明はまた、ヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部における標的アデノシンの脱アミノ化に使用するための２つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）のセットを含む組成物であって、一方のＡＯＮは、本発明によるＥＯＮであり、他方のＡＯＮは「ヘルパーＡＯＮ」であり 、ヘルパーＡＯＮは、前記ＥＯＮに相補的なヌクレオチドのストレッチとは別の、ヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにおけるヌクレオチドのストレッチに相補的であり、前記ヘルパーＡＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有し、ＥＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有する、組成物に関する。好ましくは、ＥＯＮは配列番号９の配列を含むかまたはそれからなり、ヘルパーＡＯＮは配列番号１０に記載の配列を含むかまたはそれからなる。
【0017】
本発明は、シュタルガルト病の処置に使用するための本発明によるＥＯＮにさらに関する。
【0018】
本発明は、シュタルガルト病の処置、改善、予防または進行を遅らせるために使用するための医薬の製造のための本発明によるＥＯＮの使用にさらに関する。
【0019】
本発明は、細胞中の標的ＲＮＡ分子中に存在する少なくとも１個の特定の標的アデノシンの、脱アミノ化方法にさらに関し、ここで、標的ＲＮＡ分子は、ヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、またはその一部であり、脱アミノ化方法は以下のステップを含む：本発明によるＥＯＮを細胞に付与するステップ；ＥＯＮを細胞に取り込ませるステップ；ＥＯＮを標的ＲＮＡ分子にアニーリングさせるステップ；野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物ＡＤＡＲ酵素に、標的ＲＮＡ分子中の標的アデノシンをイノシンに脱アミド化させるステップ；および、任意選択で標的ＲＮＡ分子内のイノシンの存在を確認するステップ。任意選択のステップは、好ましくは（ｉ）標的ＲＮＡ分子の配列を決定するステップ；（ｉｉ）機能的な、伸長した、全長のおよび／もしくは野生型ＡＢＣＡ４タンパク質の存在を評価するステップ；（ｉｉｉ）ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングが脱アミノ化によって調節されたかどうかを評価するステップ；または（ｉｖ）機能的読出しを使用するステップであって、脱アミノ化後の標的ＲＮＡは、機能的な、全長の、伸長したおよび／もしくは野生型ＡＢＣＡ４タンパク質をコードするステップ、を含む。
【0020】
本発明は、シュタルガルト病に罹患しているか、または罹患するリスクがある、それを必要とするヒト対象において、シュタルガルト病を処置、改善、予防および／またはその進行を遅らせる方法であって、本発明によるＥＯＮ、または本発明による医薬組成物をヒト対象に投与するステップを含む方法にさらに関する。好ましい実施形態では、ＥＯＮは、硝子体内投与によって、好ましくはネイキッドの（および化学的に改変された）ＥＯＮの直接注射によって、および網膜細胞、好ましくは光受容細胞またはＲＰＥの細胞における突然変異型ＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたは突然変異型ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡの標的化を可能にすることによって、それを必要とするヒト対象に投与されて、編集された（つまり、好ましくはほとんどが野生型の）ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡの翻訳を可能にすることにより、突然変異型ＡＢＣＡ４タンパク質の疾患を引き起こす作用を軽減する。
【0021】
本発明のＥＯＮは、国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載のリクルートメント部分を含まない。本発明のＥＯＮは、分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まない。本発明のＥＯＮは、（ＡＤＡＲをリクルートする）ループ構造を形成するものよりも短く、このことによって、本発明のＥＯＮが、生産するのにより安価となり、より使いやすくなるとともにより製造しやすくなる。さらに、それらはより長いオリゴヌクレオチドよりも効率的に細胞に侵入する可能性が高く、かつ分解しにくい。国際公開第２０１７／２２０７５１号パンフレットおよび国際公開第２０１８／０４１９７３号パンフレットでは、ＥＯＮであって、このＥＯＮが相補的である標的ＲＮＡ配列に存在する標的アデノシンを脱アミノ化するために標的ＲＮＡに相補的であるが、またリクルートメント部分を欠く一方で細胞中に存在するＡＤＡＲ酵素を利用して標的アデノシンを編集することがなおもできるＥＯＮが開示されている。本発明は、そのような知識を利用し、エクソンスキッピングが好ましい治療選択肢ではない、または代替のアプローチが捜し求められていると思われる、シュタルガルト病の突然変異を標的とするという課題を解決することを目的とする。
【0022】
本発明のＥＯＮは、１つまたは複数の天然に存在しない糖修飾を有する１個または複数のヌクレオチドを含む。それにより、ＥＯＮの単一のヌクレオチドは、１つまたは複数のそのような糖修飾を有することができる。ＥＯＮ内では、１個または複数のヌクレオチドがかかる糖修飾を有することができる。編集することが必要なヌクレオチドの反対側の本発明のＥＯＮ内のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾も２’－メトキシエトキシ（２’－ＭＯＥ）修飾も含有しないことは、本発明の一態様でもある。多くの場合、ＥＯＮ中のこのヌクレオチドの３’および５’に直接隣接するヌクレオチド（「隣接ヌクレオチド」）もまた、かかる化学修飾を欠いているが、隣接ヌクレオチドの両方ともが２’－Ｏ－アルキル基（例えば２’－ＯＭｅ）を含有すべきものではない、ということが必須ではない。「セントラルトリプレット」の一方の隣接ヌクレオチド、両方の隣接ヌクレオチドまたは３個すべてのヌクレオチドは、２’－ＯＨを保有することができる。
【0023】
当業者であれば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドが反復性のモノマーから一般にはなることを知っている。そのようなモノマーは、ほとんどの場合、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ＲＮＡ中の天然に存在する最も一般的なヌクレオチドは、アデノシン一リン酸（Ａ）、シチジン一リン酸（Ｃ）、グアノシン一リン酸（Ｇ）、およびウリジン一リン酸（Ｕ）である。これらは、ペントース糖、リボース、リン酸エステルを介して連結している５’連結リン酸基、および１’連結塩基からなる。糖は、塩基とリン酸を接続し、したがってしばしばヌクレオチドの「足場」と呼ばれる。したがって、ペントース糖の修飾は、しばしば「足場修飾」と呼ばれる。重度修飾の場合、元のペントース糖は、その全体が塩基とリン酸塩を同様に接続する別の部分で置き換えられている可能性がある。したがって、ペントース糖が足場であることが多いが、足場は必ずしもペントース糖であるとは限らないことが理解される。
【0024】
核酸塩基と呼ばれることもある塩基は一般に、アデニン、シトシン、グアニン、チミンもしくはウラシル、またはそれらの誘導体である。シトシン、チミン、およびウラシルはピリミジン塩基であり、一般にはそれらの１－窒素を通して足場に連結している。アデニンとグアニンはプリン塩基であり、一般にはそれらの９－窒素を通して足場に連結している。
【0025】
ヌクレオチドは一般に、その５’－リン酸部分が隣接するヌクレオチドモノマーの３’－ヒドロキシル部分と縮合することを通して、隣接するヌクレオチドに接続している。同様に、その３’－ヒドロキシル部分は一般に、隣接するヌクレオチドモノマーの５’－リン酸に接続している。これにより、ホスホジエステル連結を形成する。ホスホジエステルと足場は交互共重合体を形成する。塩基は、この共重合体上に、すなわち足場部分にグラフトされる。この特性のために、オリゴヌクレオチドの連結されたモノマーによって形成される交互共重合体は、しばしばオリゴヌクレオチドの「骨格」と呼ばれる。ホスホジエステル連結は隣接するモノマーをともに接続するので、しばしば「骨格連結」と呼ばれる。リン酸基が修飾され、その結果、代わりにホスホロチオエートなどの類似の部分になっている場合、そのような部分はなおもモノマーの骨格連結と呼ばれることが理解される。これは「骨格連結の修飾」と呼ばれる。一般用語では、オリゴヌクレオチドの骨格は、交互の足場および骨格連結を含む。
【0026】
一実施形態では、本発明のＥＯＮの核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、またはウラシルである。別の実施形態では、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、またはウラシルの修飾形態である。別の実施形態では、修飾された核酸塩基とは、ヒポキサンチン（イノシン中の核酸塩基）、シュードウラシル、シュードシトシン、１－メチルシュードウラシル、オロチン酸、アグマチジン、リシジン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ハロウラシル、５－ハロメチルウラシル、５－トリフルオロメチルウラシル、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－アミノメチルウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－ホルミルウラシル、５－アミノメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、８－アザ－７－デアザグアニン、８－アザ－７－デアザアデニン、８－アザ－７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、シュードイソシトシン、Ｎ４－エチルシトシン、Ｎ２－シクロペンチルグアニン、Ｎ２－シクロペンチル－２－アミノプリン、Ｎ２－プロピル－２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、Ｇクランプ、スーパーＡ、スーパーＴ、スーパーＧ、アミノ修飾核酸塩基またはそれらの誘導体；ならびに２，６－ジフルオロトルエンのような縮重もしくはユニバーサル塩基または非塩基部位のような非存在（例えば、１－デオキシリボース、１，２－ジデオキシリボース、１－デオキシ－２－Ｏ－メチルリボース、アザリボース）である。本明細書で使用される「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」および「ヒポキサンチン」という用語は、このように核酸塩基を指す。「アデノシン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」および「イノシン」という用語は、（デオキシ）リボシル糖に連結した核酸塩基を指す。「ヌクレオシド」という用語は、（デオキシ）リボシル糖に連結した核酸塩基を指す。「ヌクレオチド」という用語は、それぞれの核酸塩基－（デオキシ）リボシル－ホスホリンカー、ならびにそのリボース部分またはそのホスホ基の任意の化学修飾物を指す。したがって、この用語には、ロックドリボシル部分（当技術分野でよく知られている、メチレン基または任意の他の基を含む２’－４’架橋を含む）を含むヌクレオチド、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロ（ジ）チオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート等の各リンカーを含むリンカーを含むヌクレオチドが含まれる。アデノシンとアデニン、グアノシンとグアニン、シトシンとシチジン、ウラシルとウリジン、チミンとチミジン、イノシンとヒポキサンチンという用語は、対応する核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを指すために互換的に使用されることもある。文脈上他の意味であることが明白な場合を除き、核酸塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドという用語は互換的に使用されることもある。
【0027】
一実施形態では、本発明のＥＯＮは、２’－置換ホスホロチオエートモノマー、好ましくは２’－置換ホスホロチオエートＲＮＡモノマー、２’－置換ホスフェートＲＮＡモノマーを含む、または２’－置換混合ホスフェート／ホスホロチオエートモノマーを含む。ＤＮＡは２’置換の点ではＲＮＡ誘導体とされることに留意されたい。本発明のＥＯＮは、ホスホロチオエートまたはホスフェート骨格連結、またはそれらの混合物を通して接続された、またはそれらによって連結された、少なくとも１つの２’－置換ＲＮＡモノマーを含む。２’－置換ＲＮＡは、好ましくは、２’－Ｆ、２’－Ｈ（ＤＮＡ）、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）である。２’－Ｏ－メチルは多くの場合で「２’－ＯＭｅ」と略され、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）部分は多くの場合で「２’－ＭＯＥ」と略される。より好ましくは、本発明のＥＯＮにおける２’－置換ＲＮＡモノマーは２’－ＯＭｅモノマーであるが、本明細書でさらに概説されるように、２’－ＯＭｅ置換を保有しないはずである標的アデノシンの反対側のモノマーを除いく。本態様の好ましい実施形態では、本発明によるＥＯＮが提供され、ここで、２’－置換モノマーは、２’－Ｆモノマー、２’－ＮＨ２モノマー、２’－Ｈモノマー（ＤＮＡ）、２’－Ｏ－置換モノマー、２’－ＯＭｅモノマーもしくは２’－ＭＯＥモノマーまたはそれらの混合物などの、２’－置換ＲＮＡモノマーとすることができる。好ましくは、標的アデノシンの反対側のモノマーは２’－Ｈモノマー（ＤＮＡ）であるが、２’－ＯＭｅモノマー以外の、標的アデノシンの脱アミノ化を可能にするモノマーとすることもできる。好ましくは、ＥＯＮ内の他の任意の２’－置換モノマーは、２’－ＯＭｅ ＲＮＡモノマーまたは２’－ＭＯＥ ＲＮＡモノマーなどの、２’－置換ＲＮＡモノマーであり、これらはまた、組合せでＥＯＮ内に現れる場合もある。
【0028】
本出願全体を通して、本発明のＥＯＮ内の２’－ＯＭｅモノマーは、２’－ＯＭｅホスホロチオエートＲＮＡ、２’－ＯＭｅホスフェートＲＮＡまたは２’－ＯＭｅホスフェート／ホスホロチオエートＲＮＡで置き換えることができる。本出願全体を通して、２’－ＭＯＥモノマーは、２’－ＭＯＥホスホロチオエートＲＮＡ、２’－ＭＯＥホスフェートＲＮＡ、または２’－ＭＯＥホスフェート／ホスホロチオエートＲＮＡで置き換えることができる。本出願全体を通して、ホスホロチオエート、ホスフェートまたは混合ホスフェート／ホスホロチオエートの骨格連結によって連結またはそれを通して接続された２’－ＯＭｅ ＲＮＡモノマーからなるオリゴヌクレオチドは、２’－ＯＭｅホスホロチオエートＲＮＡ、２’－ＯＭｅホスフェートＲＮＡまたは２’－ＯＭｅホスフェート／ホスホロチオエートＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドで置き換えることができる。本出願全体を通して、ホスホロチオエート、ホスフェートまたは混合ホスフェート／ホスホロチオエートの骨格連結によって連結またはそれを通して接続された２’－ＭＯＥ ＲＮＡモノマーからなるオリゴヌクレオチドは、２’－ＭＯＥホスホロチオエートＲＮＡ、２’－ＭＯＥホスフェートＲＮＡまたは２’－ＭＯＥホスフェート／ホスホロチオエートＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドで置き換えることができる。
【0029】
本発明の化合物のある特定の位置での特定の好ましい化学修飾に加えて、本発明の化合物は、核酸塩基、足場および／または骨格連結に対する１つまたは複数の（さらなる）修飾を含んでもよくまたはそれらからなってもよいが、それらは、同一モノマー中、例をあげると３’および／または５’の位置に存在しても、存在しなくてもよい。足場修飾は、二環式糖、テトラヒドロピラン、ヘキソース、モルホリノ、２’－修飾糖、４’－修飾糖、５’－修飾糖および４’－置換糖などの、ＲＮＡに天然に存在するリボシル部分（すなわちペントース部分）の修飾バージョンの存在を示す。適切な修飾の例には、それらに限定されないが、以下が含まれる：２’－Ｏ－アルキルまたは２’－Ｏ－（置換）アルキル、例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－（２－シアノエチル）、２’－ＭＯＥ、２’－Ｏ－（２－チオメチル）エチル、２’－Ｏ－ブチリル、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－（２－アミノプロピル）、２’－Ｏ－（２－（ジメチルアミノ）プロピル）、２’－Ｏ－（２－アミノ）エチル、２’－Ｏ－（２－（ジメチルアミノ）エチル）などの、２’－Ｏ－修飾ＲＮＡモノマー；２’－デオキシ（ＤＮＡ）；２’－Ｏ－（２－クロロエトキシ）メチル（ＭＣＥＭ）、２’－Ｏ－（２，２－ジクロロエトキシ）メチル（ＤＣＥＭ）などの２’－Ｏ－（ハロアルキル）メチル；２’－Ｏ－［２－（メトキシカルボニル）エチル］（ＭＯＣＥ）、２’－Ｏ－［２－Ｎ－メチルカルバモイル）エチル］（ＭＣＥ）、２’－Ｏ－［２－（Ｎ、Ｎ－ジメチルカルバモイル）エチル］（ＤＣＭＥ）などの２’－Ｏ－アルコキシカルボニル；２’－ハロ、例えば、２’－Ｆ、ＦＡＮＡ；２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（ＮＭＡ）；二環式もしくは架橋核酸（ＢＮＡ）足場修飾、例えば、立体構造的に制限されたヌクレオチド（ＣＲＮ）モノマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）モノマー、キシロ－ＬＮＡモノマー、α－ＬＮＡモノマー、α－Ｌ－ＬＮＡモノマー、β－Ｄ－ＬＮＡモノマー、２’－アミノ－ＬＮＡモノマー、２’－（アルキルアミノ）－ＬＮＡモノマー、２’－（アシルアミノ）－ＬＮＡモノマー、２’－Ｎ－置換－２’－アミノ－ＬＮＡモノマー、２’－チオ－ＬＮＡモノマー、（２’－Ｏ，４’－Ｃ）制約されたエチル（ｃＥｔ）ＢＮＡモノマー、（２’－Ｏ，４’－Ｃ）制約されたメトキシエチル（ｃＭＯＥ）ＢＮＡモノマー、２’，４’－ＢＮＡＮＣ（ＮＨ）モノマー、２’，４’－ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）モノマー、２’，４’－ＢＮＡＮＣ（ＮＢｎ）モノマー、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）モノマー、カルバ－ＬＮＡ（ｃＬＮＡ）モノマー、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン核酸（ＤｐＮＡ）モノマー、２’－Ｃ－架橋二環式ヌクレオチド（ＣＢＢＮ）モノマー、ｏｘｏ－ＣＢＢＮモノマー、複素環式架橋ＢＮＡモノマー（例えば、トリアゾリルまたはテトラゾリル連結された）、アミド架橋ＢＮＡモノマー（例えばＡｍＮＡ）、尿素架橋ＢＮＡモノマー、スルホンアミド架橋ＢＮＡモノマー、二環式炭素環式ヌクレオチドモノマー、ＴｒｉＮＡモノマー、α－Ｌ－ＴｒｉＮＡモノマー、ビシクロＤＮＡ（ｂｃＤＮＡ）モノマー、Ｆ－ｂｃＤＮＡモノマー、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）モノマー、Ｆ－ｔｃＤＮＡモノマー、アルファアノメリックビシクロＤＮＡ（ａｂｃＤＮＡ）モノマー、オキセタンヌクレオチドモノマー、２’－アミノ－ＬＮＡ由来のロックドＰＭＯモノマー、グアニジン架橋核酸（ＧｕＮＡ）モノマー、スピロシクロプロピレン架橋核酸（ｓｃｐＢＮＡ）モノマーおよびそれらの誘導体；シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）モノマー、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）モノマー、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）モノマー、フッ素化ＨＮＡ（Ｆ－ＨＮＡ）モノマー、ピラノシル－ＲＮＡ（ｐ－ＲＮＡ）モノマー、３’－デオキシピラノシルＤＮＡ（ｐ－ＤＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）；上記のモノマーのいずれかの反転バージョン。こういった修飾のすべてが、当業者に知られている。
【0030】
「骨格修飾」とは、上記のようにリボシル部分の修飾バージョンの存在（「足場修飾」）、および／またはＲＮＡに天然に存在するホスホジエステルの修飾バージョンの存在（「骨格連結修飾」）を示す。ヌクレオシド間連結修飾の例は、ホスホロチオエート（ＰＳ）、キラルに純粋なホスホロチオエート、Ｒｐホスホロチオエート、Ｓｐホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ＰＳ２）、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、トホスホノアセテート、ホスホナセタミド（ＰＡＣＡ）、チオホスホナセタミド、ホスホロチオエートプロドラッグ、Ｓ－アルキル化ホスホロチオエート、Ｈ－ホスホネート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、メチルホスフェート、メチルホスホロチオエート、エチルホスフェート、エチルホスホロチオエート、ボラノホスフェート、ボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスフェート、メチルボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスホネート、メチルボラノホスホノチオエート、ホスホリルグアニジン（ＰＧＯ）、メチルスルホニルホスホロアミデート、ホスホロアミダイト、ホスホナミダイト、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオジアミデート、スルファメート、ジメチレンスルホキシド、スルホネート、トリアゾール、オキサリル、カルバメート、メチレンイミノ（ＭＭＩ）、およびチオアセトアミド（ＴＡＮＡ）；ならびにそれらの誘導体である。
【0031】
本発明の好ましいＥＯＮは、５’－端Ｏ６－ベンジルグアノシンまたは５’－端アミノ修飾を含まず、ＳＮＡＰタグドメイン（操作されたＯ６－アルキルグアノシン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼ）に共有結合で連結していない。一実施形態では、本発明のＥＯＮは、標的配列との０、１、２もしくは３対のゆらぎ塩基対、および／または標的ＲＮＡ配列との０、１、２もしくは３個のミスマッチを含み、ここで、単一のミスマッチは、連続する複数のヌクレオチドを含むことができる。同様に、本発明の好ましいＥＯＮは、ｂｏｘＢ ＲＮＡヘアピン配列を含まない。本発明によるＥＯＮは、内在性細胞経路および天然に利用可能なＡＤＡＲ酵素を利用して、標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンを特異的に編集することができる。本発明のＥＯＮは、ＡＤＡＲをリクルートし、これと複合体を形成し、次いで、標的ＲＮＡ配列中の（単一の）特定の標的アデノシンヌクレオチドの脱アミノ化を行うことができる。理想的には、１個のアデノシンだけが脱アミノ化される。あるいは、例をあげると、標的アデノシンが互いに近接している場合、１、２、または３個のアデノシンヌクレオチドが脱アミノ化される。例えば、突然変異が、野生型ＧＧＡ（グリシン）コドンから突然変異型ＧＡＡ（グルタミン酸）コドンへの変更である場合、両方のアデノシンを脱アミノ化するとＧＧＧがもたらされることになるが、これもグリシンをコードする。本発明のＥＯＮは、ＡＤＡＲに複合体化する場合、好ましくは、単一の標的アデノシンを脱アミノ化する。
【0032】
ＡＤＡＲ酵素の天然標的の解析により示されたところは、天然標的が概して、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２によって編集されたＲＮＡヘリックスを形成する２本の鎖間にミスマッチを含むことである。こういったミスマッチによって編集反応の特異性が高まることが示唆されている（Stefl et al. 2006. Structure 14(2):345-355; Tian et al. 2011. Nucleic Acids Res 39(13):5669-5681）。ＥＯＮと標的ＲＮＡとの間の対合／ミスマッチヌクレオチドの最適パターンの特徴付けもまた、効率的なＡＤＡＲベースのＥＯＮ療法の開発にとって極めて重要であると思われる。
【0033】
本発明のＥＯＮは、予め規定されたスポットでの特定のヌクレオチド修飾を使用して、安定性ならびに適切なＡＤＡＲ結合および活性を確保する。これらの変化は様々であり、上で詳細に詳説したように、ヌクレオチドの糖部分において、ならびに核酸塩基またはホスホジエステル連結において、ＥＯＮの骨格の修飾を含むことができる。そういった変化はまた、ＥＯＮの配列全体にわたって様々に分布し得る。ＡＤＡＲ酵素のＲＮＡ結合ドメイン内の様々なアミノ酸残基の相互作用、ならびにデアミナーゼドメイン中の様々なアミノ酸残基の相互作用を支援するために、特定の修飾を必要とする場合がある。例えば、ヌクレオチド間のホスホロチオエート連結、または２’－ＯＭｅ修飾もしくは２’－ＭＯＥ修飾は、ＥＯＮの一部の部分では許容され得るが、一方、他の部分では、ホスフェートおよび２’－ＯＨ基と酵素との極めて重要な相互作用を乱さないように回避する必要がある。標的配列がＡＤＡＲ編集に最適ではない場合には、基質ＲＮＡに対する編集活性を高めるために、特定のヌクレオチド修飾が必要となる場合もある。ある特定の配列構成が編集により適合することが先の研究により確認された。例えば、標的配列５’－ＵＡＧ－３’（中央に標的Ａを有する）はＡＤＡＲ２にとって最も好ましい最近傍ヌクレオチドを含有するが、一方、５’－ＣＡＡ－３’標的配列は優先されない（Schneider et al. 2014. Nucleic Acids Res 42(10):e87）。ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインの構造解析によって、標的トリヌクレオチドの反対側のヌクレオチドを慎重に選択することで編集が高まる可能性が、示唆された。例えば、（中央に形成されたＡ－Ｃミスマッチを有する）対向している鎖上の３’－ＧＣＵ－５’配列と対になっている５’－ＣＡＡ－３’標的配列は、グアノシン塩基がＡＤＡＲ２のアミノ酸側鎖と立体的に衝突するので、優先されない。
【0034】
本明細書で使用される「セントラルトリプレット」とは、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの反対側の３個のヌクレオチドであり、ここで、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドは標的アデノシンの直接反対側である。どちらがある特定の標的にとって好ましくとも、セントラルトリプレットは、ＥＯＮのより３’末端に位置するだけでなく、より５’末端に位置することもできるので、セントラルトリプレットはＥＯＮの中心にある必要はない。したがって、この態様での「セントラル」という用語は、化学修飾および標的アデノシンを標的とすることに関していえば、触媒活性の中心にあるトリプレットの意味をいっそう有する。また、特に標的配列が５’から３’へと示されている場合は、ＥＯＮが３’から５’へと表示されることもあることに留意されたい（例をあげると、図１を参照されたい）。しかし、本明細書においてＥＯＮ内のヌクレオチドの順序について論議する場合は常に、その順序はＥＯＮの５’から３’である。その位置は、５’から３’への方向性になおも従いながら、ＥＯＮ内の特定のヌクレオチドに関して表現することもでき、その場合、前記ヌクレオチドの５’での他のヌクレオチドは負の位置としてマークされ、前記ヌクレオチドの３’での他のヌクレオチドは正の位置としてマークされる。
【0035】
本明細書で概説されるように、セントラルトリプレットの外側のヌクレオチドは多くの場合、２’－ＯＭｅ修飾または２’－ＭＯＥ修飾である。しかし、これは本発明のＥＯＮの厳密な要件ではない。こういった２’置換を使用すると、ＥＯＮのこれらの部分の適切な安定性が保証されるが、他の修飾を適用してもよい。
【0036】
本発明によるＥＯＮは、当技術分野で知られている適切な手段を使用して間接的に投与することができる。例えば、ＥＯＮは、個体または前記個体の細胞、組織もしくは器官に発現ベクターの形態で提供することができるが、この場合、当該発現ベクターは、前記オリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする。発現ベクターは、好ましくは、遺伝子送達ビヒクルを介して細胞、組織、器官または個体に導入される。好ましい実施形態では、本明細書で特定したＥＯＮの発現または転写を駆動する発現カセットまたは転写カセットを含むウイルスベースの発現ベクターが提供される。したがって、本発明は、ＥＯＮの発現を促す条件下に置かれた場合に、本発明によるＥＯＮを発現することができるウイルスベクターを提供する（したがって、非天然の化学修飾を有さない）。細胞には、プラスミド駆動型のＥＯＮ発現、またはアデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスベースのベクターによって提供されるウイルス性発現することによって、ＥＯＮを付与することができる。発現は、Ｕ７プロモーターなどのポリメラーゼＩＩプロモーター（Ｐｏｌ ＩＩ）、またはＵ６ＲＮＡプロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターによって駆動することができる。好ましい送達ビヒクルは、ＡＡＶ、またはレンチウイルスベクター等などのレトロウイルスベクターである。また、プラスミド、人工染色体、細胞のヒトゲノムにおける標的化相同組換えおよび組込みに使用可能なプラスミドが、本明細書で定義するＥＯＮの送達に適切に適用することができる。本発明にとって好ましいのは、転写がＰｏｌ ＩＩＩプロモーターによって駆動され、および／または転写物がＵ１もしくはＵ７の転写物との融合物形態である、そういったベクターであり、これによって、小転写物の送達に関して良好な結果がもたらされる。適切な転写物を設計することは、当業者の技能の範囲内である。好ましいのは、Ｐｏｌ ＩＩＩ駆動型転写物であり、好ましくは、Ｕ１またはＵ７の転写物との融合転写物の形態であり、これは、当業者に知られている。
【0037】
典型的には、ＥＯＮは、ウイルスベクターによって送達される場合、転写物の一部中に本発明によるオリゴヌクレオチドの配列を含む、ＲＮＡ転写物の形態となっている。細胞中で活性である生成するＥＯＮは、したがって、自然に発現されるため化学修飾されていないが、「ネイキッド」の形態で製造されるＥＯＮ（＝ＥＯＮを発現するプラスミドまたはウイルスベクターの使用を伴わない）は、単一または複数の天然に存在しない修飾を含み得る。本発明によるＡＡＶベクターとは、組換えＡＡＶベクターであり、ＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質のタンパク質シェルに包まれた本発明によるコード化ＥＯＮを含むＡＡＶゲノムの一部を含むＡＡＶベクターを指す。ＡＡＶゲノムの一部は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等などのアデノ随伴ウイルス血清型由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含有することができる。カプシドタンパク質で構成されるタンパク質シェルは、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９等などのＡＡＶ血清型由来のものとすることができる。タンパク質シェルは、カプシドタンパク質シェルと称される場合もある。ＡＡＶベクターは、１つまたは好ましくはすべての野生型ＡＡＶ遺伝子が欠失されていてもよいが、なおも機能的なＩＴＲ核酸配列を含むことができる。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキュー、およびパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、野生型配列であってもよく、野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、もしくは１００％の配列同一性を有してもよく、依然として機能的である限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失もしくは置換によって変更されていてもよい。これに関連して、機能性とは、カプシドシェルへのゲノムのパッケージングを誘導し、次いで、感染する宿主細胞または標的細胞における発現を可能にする能力を指す。本発明に関して、カプシドタンパク質シェルは、ＡＡＶベクターゲノムＩＴＲとは異なる血清型のものであってもよい。したがって、本発明によるＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質シェル、すなわち、正二十面体のカプシドで構成されていてもよく、これは、１つのＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３）を含むが、一方、ＡＡＶ２ベクターを含有するＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ベクターを含めて、上記のＡＡＶ血清型のいずれかとすることができる。したがって、「ＡＡＶ２ベクター」は、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、一方、例えば、「ＡＡＶ５ベクター」は、ＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質シェルを含むが、これによって、どちらも本発明による任意のＡＡＶベクターゲノムＩＴＲをカプシドで包むことができる。好ましくは、本発明による組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２、５、８またはＡＡＶ血清型９のカプシドタンパク質シェルを含み、ここで、前記ＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２、５、８またはＡＡＶ血清型９に由来する；そのようなＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ５／５、ＡＡＶ５／８、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ８／５、ＡＡＶ８／８、ＡＡＶ８／９、ＡＡＶ９／２、ＡＡＶ９／５、ＡＡＶ９／８、またはＡＡＶ９／９ベクターと呼ばれる。
【0038】
より好ましくは、本発明による組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型５に由来する；このようなベクターは、ＡＡＶ２／５ベクターと呼ばれる。より好ましくは、本発明による組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型８に由来する；このようなベクターは、ＡＡＶ２／８ベクターと呼ばれる。より好ましくは、本発明による組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型９に由来する；このようなベクターは、ＡＡＶ２／９ベクターと呼ばれる。より好ましくは、本発明による組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２に由来する；このようなベクターは、ＡＡＶ２／２ベクターと呼ばれる。選択した核酸配列によって表される本発明によるＥＯＮをコードする核酸分子は、上で特定したＡＡＶゲノムまたはＩＴＲ配列の間に挿入されることが好ましく、例えば、発現構築物は、コード配列に作動可能に連結された発現調節エレメントおよび３’終止配列を含む。「ＡＡＶヘルパー機能」とは一般に、トランスでＡＡＶベクターに与えられるＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされる対応するＡＡＶの機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターに欠けているＡＡＶの機能を補完するが、（ＡＡＶベクターゲノムによってもたらされる）ＡＡＶ ＩＴＲがない。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの主要な２つＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐコード領域およびｃａｐコード領域またはそれらの機能上実質的に同一の配列を含む。Ｒｅｐ領域およびＣａｐ領域は、当技術分野において周知である。ＡＡＶヘルパー機能を、ＡＡＶヘルパー構築物上に与えることができ、これは、プラスミドとすることができる。
【0039】
ヘルパー構築物の宿主細胞への導入は、例えば、本明細書で特定したＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムの導入の前またはそれと同時のトランスフォーメーション、トランスフェクション、またはトランスダクションによって行うことができる。したがって、本発明のＡＡＶヘルパー構築物については、一方でＡＡＶベクターのカプシドタンパク質シェルに関する血清型と、他方で前記ＡＡＶベクター複製およびパッケージングにおいて存在するＡＡＶゲノムに関する血清型との所望の組合せをもたらすように選択することができる。「ＡＡＶヘルパーウイルス」によって、ＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされるさらなる機能がもたらされる。
【0040】
適切なＡＡＶヘルパーウイルスには、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１型および２型）およびワクチニアウイルスが含まれる。米国特許第６，５３１，４５６号明細書に記載のように、ヘルパーウイルスによってもたらされるさらなる機能も、ベクターを介して宿主細胞に導入することができる。好ましくは、本発明による組換えＡＡＶベクターに存在するようなＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）遺伝子またはｃａｐ（カプシド）遺伝子などの、ウイルスタンパク質をコードするいかなるヌクレオチド配列も含まない。ＡＡＶゲノムは、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子または当技術分野において知られている化学的に、酵素的にもしくはその他の方法で検知可能なおよび／もしくは選択可能な産物をコードする遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈ等）などの、マーカー遺伝子あるいはレポーター遺伝子をさらに含むことができる。本発明による好ましいＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクター、好ましくは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９またはＡＡＶ２／２ベクターであり、本発明によるＥＯＮを発現する。
【0041】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（「ＡＯＮ」）、「ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチド」（「ＥＯＮ」）、「オリゴヌクレオチド」、または「オリゴ」に言及する場合はいつでも、文脈が明瞭に指示しない限り、オリゴリボヌクレオチドとデオキシオリゴリボヌクレオチドの両方を意味する。「オリゴリボヌクレオチド」に言及する場合はいつでも、これには、リボヌクレオシドであるアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、ウリジン（Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）またはイノシン（Ｉ）が含まれ得る。「デオキシオリゴリボヌクレオチド」に言及する場合はいつでも、これには、デオキシリボヌクレオシドであるデオキシアデノシン（Ａ）、デオキシグアノシン（Ｇ）、デオキシシチジン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはデオキシイノシン（Ｉ）が含まれ得る。好ましい態様では、本発明のＥＯＮのほとんどが、化学修飾を含み得、いくつかの特定の位置で、デオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含み得るオリゴリボヌクレオチドである。シトシンなどのオリゴヌクレオチド構築物中のヌクレオチドに言及する場合、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、ピロロシチジン、およびβ－Ｄ－グルコシル－５－ヒドロキシ－メチルシトシンが含まれる。アデニンに言及する場合、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、８－アジドアデノシン、８－メチルアデノシン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－デアザグアノシン、Ｎ６－メチルアデニンおよび７－メチルアデニンが含まれる。ウラシルに言及する場合、５－メトキシウラシル、５－メチルウラシル、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、およびチエノウラシル、ジヒドロウラシル、４－チオウラシルおよび５－ヒドロキシメチルウラシルが含まれる。グアノシンに言及する場合、７－メチルグアノシン、８－アザ－７－デアザグアノシン、チエノグアノシンおよび１－メチルグアノシンが含まれる。ヌクレオシドまたはヌクレオチドに言及する場合、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシ、２－フルオロリボースなどのリボフラノース誘導体、および２’－Ｏ－メチルなどの２’－Ｏ－置換バリアント、ならびに、２’－４’架橋バリアントを含めてその他の修飾が含まれる。
【0042】
「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」ならびに「からなる（consisting of）」を包含する、例えば、「Ｘを含む」組成物は、排他的にＸのみからなっていてもよく、さらなる何か、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。数値ｘに関して「約」という用語は任意選択であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。「実質的に」という語は、「完全に」を除外するものではない、例えば、「Ｙを実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。適切な場合には、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略される場合もある。核酸配列に関して「下流に」という用語は、３’方向に配列にさらに沿っていることを意味し；「上流に」という用語はその逆を意味する。したがって、ポリペプチドをコードする任意の配列において、開始コドンはセンス鎖において停止コドンの上流にあるが、アンチセンス鎖において停止コドンの下流にある。「ハイブリダイゼーション」への言及は典型的には、特異的ハイブリダイゼーションを指し、非特異的ハイブリダイゼーションを除外する。特異的ハイブリダイゼーションは、プローブと標的の間での最も安定な相互作用が、プローブと標的が少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性を有している場合を確実にするように、当技術分野においてよく知られている技法を使用して、選択された実験条件下で行うことができる。「ミスマッチ」という用語は、ワトソン－クリック型塩基対合則に従う完全な塩基対を形成していない、二本鎖ＲＮＡ複合体中の対向しているヌクレオチドを指すために本明細書で使用される。ミスマッチ塩基対とは、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｃ、Ｕ－Ｕの各塩基対である。一部の実施形態では、本発明のＥＯＮは、０、１、２または３個のミスマッチを含み、ここで単一のミスマッチは連続するいくつかのヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、本発明のＥＯＮは、０、１、２または３対のゆらぎ塩基対を含む。ゆらぎ塩基対は、Ｇ－Ｕ、Ｉ－Ｕ、Ｉ－Ａ、およびＩ－Ｃの各塩基対である。
【0043】
ヌクレオチド間の通常のヌクレオシド間連結を、ホスホジエステル結合のモノ－またはジ－チオエーション（thioation）により変更して、それぞれ、ホスホロチオエートエステルまたはホスホロジチオエートエステルを得ることができる。ヌクレオシド間連結のその他の修飾が、アミド化およびペプチドリンカーを含めて、可能である。好ましい態様では、本発明のＥＯＮは、ＥＯＮの最終端のヌクレオチド間（したがって、好ましくは５’末端と３’末端の両方で）に１、２、３、４またはこれ超のホスホロチオエート連結を有し、このことは、４つのホスホロチオエート連結の場合、これは特に好ましい態様ではあるが、最終の５個のヌクレオチドがそれに応じて連結されていることを意味する。こういった連結の数は、標的配列に応じて、または安定性、毒性および／もしくは効率などの他の側面に基づいて、各末端で様々であり得ることが当業者であれば理解されよう。本発明の一実施形態では、本発明によるＥＯＮは、ホスホジエステル連結における非架橋酸素のうちの１つの置換を含む。この修飾は、塩基対合をやや不安定にするが、ヌクレアーゼ分解に対する著明な耐性を付加する。正確な化学的性質およびフォーマットは、オリゴヌクレオチド構築物ごとに、および適用ごとに左右され得、当業者の希望および好みに従って求めることができる。オリゴヌクレオチド中の連続する４個以上のＤＮＡヌクレオチドがいわゆる「ギャップマー」を創り出すが、これらは、そのＲＮＡコグネート配列にアニーリングすると、ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮＡの切断を誘導すると当技術分野では考えられている。本発明によれば、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ切断は一般には、可能な限り回避すべきである。
【0044】
本発明によるＥＯＮは通常、１０個のヌクレオチドよりも長く、好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６個よりも多く、さらにより好ましくは１７個のヌクレオチドよりも多い。一実施形態では、本発明によるＥＯＮは、２０個のヌクレオチドよりも長い。本発明によるオリゴヌクレオチドは、１００個のヌクレオチドよりも短いのが好ましく、さらにより好ましくは６０個のヌクレオチドよりも短く、さらにより好ましくは５０個のヌクレオチドよりも短い。好ましい態様では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、１８～７０個のヌクレオチドを含み、より好ましくは１８～６０個のヌクレオチドを含み、さらにより好ましくは１８～５０個のヌクレオチドを含む。したがって、特に好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドを含む。好ましい別の態様では、本発明によるＥＯＮのいずれかの末端または両末端に、反転したデオキシＴまたはジデオキシＴのヌクレオチドを組み込むことができる。
【0045】
ＲＮＡ編集実体（例えば、ヒトＡＤＡＲ酵素）が、いくつかの要因に応じて、様々な特異性を有するｄｓＲＮＡ構造を編集することが、当技術分野において知られている。重要な一要因は、ｄｓＲＮＡ配列を構成する二本鎖の相補性の程度である。二本鎖の完全な相補性によって通常は、ｈＡＤＡＲの触媒ドメインが非識別的にアデノシンを脱アミノ化し、ｈＡＤＡＲが遭遇するあらゆるアデノシンと反応する。ｈＡＤＡＲ１および２の特異性は、まだ明確になっていない方法でｄｓＲＮＡ結合ドメインを位置決めするのに役立つと推定されるいくつかのミスマッチをｄｓＲＮＡ中に確保することによって向上させることができる。加えて、脱アミノ化反応それ自体は、編集するアデノシンの反対側のミスマッチを含むＥＯＮを提供することによって増強することができる。ミスマッチは、編集するアデノシンの反対側にシチジンを有する標的部分を提供することによって創り出すことが好ましい。代替として、ウリジンもアデノシンの反対側に使用することができるが、これは、当然のことながら、ＵとＡが対になっているので、「ミスマッチ」を招かないことになる。標的鎖のアデノシンが脱アミノ化されると、標的鎖はイノシンを得ることになるが、これは、ほとんどの生化学的プロセスでは、細胞の生化学的機構によってＧとして「読み取られる」。したがって、ＡからＩへの変換後、ミスマッチが解決されたことになる。なぜなら、Ｉは、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の標的部分中の反対側のＣと塩基対合することが完全にできるからである。ミスマッチが編集により解決された後、基質が放出され、オリゴヌクレオチド構築物－編集実体複合体が標的ＲＮＡ配列から放出され、次いで、それはスプライシングや翻訳などの下流の生化学プロセスに利用可能になる。標的ＲＮＡ配列を編集する特異性の所望のレベルは、適用に依存し得る。本開示の指示に従い、当業者であれば、彼らのニーズに合わせてオリゴヌクレオチドの相補的部分を設計することができ、若干の試行錯誤で、所望の結果を得ることができることになる。
【0046】
本発明の教示はまた、インビトロで生成した眼杯などの、いわゆるオルガノイド内の細胞中の標的ＲＮＡ配列を編集するのにも使用することができる。オルガノイドにおいて、またはｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの状況で処理された細胞は一般に、アデノシンが標的とされる遺伝子突然変異を有することになる。突然変異はヘテロ接合型であってもホモ接合型であってもよい。本発明は典型的には、ＮからＡへの突然変異などの点突然変異を改変するために使用することができ、ここで、ＮはＧ、Ｃ、Ｕ（ＤＮＡレベル上ではＴ）とすることができ、好ましくはＧからＡへの突然変異、またはＮからＣへの突然変異とすることができ、ここでＮはＡ、Ｇ、Ｕ（ＤＮＡレベル上ではＴ）とすることができ、好ましくはＵからＣへの突然変異とすることができる。表１に、ＡＢＣＡ４遺伝子に見られる（当技術分野で報告されている）最も関連性のある病原性Ｇ＞Ａ突然変異のリストを示すが、それらすべてが、本発明によるＥＯＮによって標的とされる可能性を秘めている。すべての（潜在的に可能である）突然変異がここに与えられているわけではなく、その理由は、本発明のＥＯＮはまた、Ｇ＞Ａ突然変異の結果ではないが、実際にはＴまたはＧを出現させる突然変異に起因する未成熟停止コドンの一部であるアデノシンを標的とするために適用することができるからである、ということに留意されたい。例をあげると、野生型ＴＣＡコドン（セリン）がＣ＞Ｇ突然変異のためにＴＧＡ（停止）に突然変異する場合、本発明によるＥＯＮを使用したＡの標的化によって、停止コドンが、ＡＢＣＡ４タンパク質において許容され得るＴＧＧ（トリプトファン）に変化させられる。別の例としては、野生型ＡＡＡコドン（リジン）が、Ａ＞Ｔ突然変異のためにＴＡＡ（停止）に突然変異し、次いで、本発明によるＥＯＮを使用した５’のＡの標的化によって、この停止コドンがＡＢＣＡ４タンパク質において許容され得るＧＡＡ（グルタミン酸）に変化させられることであり得る。
【0047】
【表1-1】
【0048】
【表1-2】
【0049】
本発明の一態様では、本発明による少なくとも１つのＥＯＮを含む組成物が提供され、ここで、好ましくは、前記組成物は、少なくとも１つの賦形剤を含み、ならびに／または前記ＥＯＮは、前記組成物および／もしくは前記ＥＯＮの、組織および／もしくは細胞への、および／または組織および／もしくは細胞中への標的化および／もしくは送達を高めることをさらに助け得る少なくとも１つのコンジュゲートされたリガンドを含む。本明細書に記載の組成物は、本明細書では、本発明による組成物と呼ばれる。本発明による組成物は、本発明による１つまたは複数のＥＯＮを含むことができる。本発明の文脈において、賦形剤は別個の分子であり得るが、それはまた、コンジュゲートされた部分でもあり得る。第１のケースでは、賦形剤はデンプンなどの充填剤であり得る。後者のケースでは、賦形剤は例えば、本発明によるＥＯＮに連結された標的化リガンドであり得る。
【0050】
この態様の好ましい実施形態では、そのような組成物は、カチオン性両親媒性化合物（ＣＡＣ）またはカチオン性両親媒性薬物（ＣＡＤ）をさらに含むことができる。ＣＡＣは一般にリソソーム指向性の薬剤であり、エンドソームおよびリソソームを緩衝化することができる弱塩基である（Mae et al. J Contr Rel 2009, 134: 221）。ＣＡＣをさらに含む組成物は、好ましくは、前記ＣＡＣを含まない同様な組成物と比較して、ＲＮＡ編集のための改善されたパラメータを有する。ＣＡＣの例は、例えば国際公開第２０１８／００７４７５号パンフレットまたは国際公開第２０１８／１３４３１０号パンフレット中に見出すことができる。
【0051】
好ましい実施形態では、本発明による組成物は、医薬として使用するためのものである。その場合、本発明による組成物は医薬組成物である。医薬組成物は通常、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む。好ましい実施形態では、本発明による組成物は、本明細書で定義のＥＯＮを含み、任意選択で、薬学的に許容される製剤、充填剤、防腐剤、可溶化剤、担体、希釈剤、賦形剤、塩、アジュバントおよび／または溶媒をさらに含む。そのような薬学的に許容される担体、充填剤、防腐剤、可溶化剤、希釈剤、塩、アジュバント、溶媒および／または賦形剤は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20thedition, Baltimore, MD; Lippincott, Williams & Wilkins, 2000)中に見出され得る。本発明によるＥＯＮは、少なくとも１つのイオン化可能な基を有していてもよい。イオン化可能な基は、塩基または酸であってもよく、そして荷電または中性であってもよい。イオン化可能な基は、反対の電荷を保有する適切な対イオンとのイオン対として存在してもよい。カチオン性対イオンの例は、ナトリウム、カリウム、セシウム、トリス、リチウム、カルシウム、マグネシウム、トリアルキルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、およびテトラアルキルアンモニウムである。アニオン性対イオンの例は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、乳酸塩、メシル酸塩、ベシル酸塩、トリフレート、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ジクロロ酢酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、およびクエン酸塩である。
【0052】
本発明による医薬組成物は、ＥＯＮの安定性、溶解性、吸収、バイオアベイラビリティ、活性、薬物動態、薬力学、細胞への取り込み、および／または細胞内輸送を高めるための補助剤、特に、複合体、ナノ粒子、微粒子、ナノチューブ、ナノ粒子、ナノゲル、ビロソーム、エキソソーム、ヒドロゲル、ポロキサマーもしくはプルロニック、ポリマーソーム、コロイド、マイクロバブル、小胞、ミセル、リポプレックス、および／またはリポソームを形成できる賦形剤を含んでいてもよい。ナノ粒子の例としては、高分子ナノ粒子、（混合）金属ナノ粒子、炭素ナノ粒子、金ナノ粒子、脂質ナノ粒子、磁性ナノ粒子およびペプチドナノ粒子、ならびにそれらの組合せが挙げられる。ナノ粒子とオリゴヌクレオチドの組合せの例は、球状核酸（ＳＮＡ；Barnaby et al. Cancer Treat. Res. 2015, 166: 23）である。
【0053】
本発明による好ましい組成物は、組織および／もしくは細胞へのＥＯＮの標的化、ならびに／または組織および／もしくは細胞中へのＥＯＮの送達を高めるのをさらに助け得る少なくとも１つの賦形剤を含む。好ましい組織または細胞は、筋肉細胞、光受容細胞もしくはＲＰＥ層の細胞などの網膜細胞、角膜細胞、網膜組織、または角膜組織である。好ましくは、本発明によるＥＯＮは、シュタルガルト病を引き起こす突然変異を保有するヒトＡＢＣＡ４ｍＲＮＡおよび／またはＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡ中の標的アデノシンを編集するために、網膜内の光受容体細胞またはＲＰＥを標的化するために硝子体内投与によって（例をあげると、注射器を使用したネイキッドＥＯＮの直接注射によって）投与される、本発明による医薬組成物中に存在する。
【0054】
潜在的な賦形剤の多くは、当技術分野で知られており、第１のタイプの賦形剤として分類され得る。第１のタイプの賦形剤の例としては、ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、デキストラン誘導体、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）、ヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、カダベリン）、キトサン、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エステルアミン）、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、シクロデキストリン、ヒアルロン酸、コロミン酸、およびそれらの誘導体）、デンドリマー（例えば、ポリ（アミドアミン））、脂質（例えば、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ジオレオイルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ホスファチジルコリン誘導体（例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ））、リゾ－ホスファチジルコリン誘導体（例えば、１－ステアロイル－２－リゾ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｓ－ＬｙｓｏＰＣ））、スフィンゴミエリン、２－（３－ビス－（３－アミノプロピル）アミノ）プロピルアミノ）－Ｎ－ジテトラデシルカルバモイルメチルアセトアミド（ＲＰＲ２０９１２０）、ホスホグリセロール誘導体（例えば、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール，ナトリウム塩（ＤＰＰＧ－Ｎａ）、ホスファチジン酸誘導体（例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸，ナトリウム塩（ＤＳＰＡ）、ホスホエタノールアミン誘導体（例えば、ジオレオイル－Ｌ－Ｒ－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ））、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、１，３－ジ－オレオイルオキシ－２－（６－カルボキシ－スペルミル）プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）、（１，２－ジミリストイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、（Ｎ１－コレステリルオキシカルボニル－３，７－ジアザノナン－１，９－ジアミン）（ＣＤＡＮ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、（ｂ－Ｌ－アルギニル－２，３－Ｌ－ジアミノプロピオン酸Ｎ－パルミチル－Ｎ－オレイルアミド三塩酸塩（ＡｔｕＦＥＣＴ０１）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン誘導体（例えば、１，２－ジステアロイル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤｏＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル（１，３）－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、ＤＬｉｎＭＣ３ＤＭＡ（ＭＣ３）、ホスファチジルセリン誘導体（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン，ナトリウム塩（ＤＯＰＳ））、トランスフェクション試薬、タンパク質（例えば、アルブミン、ゼラチン、アテロコラーゲン）、および直鎖状もしくは環状ペプチド（例えば、プロタミン、ＰｅｐＦｅｃｔｓ、ＮｉｃｋＦｅｃｔｓ、ポリアルギニン、ヘキサ－アルギニン、ポリリジン、ポリオルニチン、ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、細胞移送ペプチド（ＣＴＰ）、標的化ペプチド、エンドソームエスケープペプチド）が挙げられる。炭水化物および炭水化物クラスターは、別個の化合物として使用される場合、第１のタイプの賦形剤としての使用にも適している。
【0055】
本発明による別の好ましい組成物は、第２のタイプの賦形剤として分類される少なくとも１つの賦形剤を含んでいてもよい。第２のタイプの賦形剤は、例えば網膜（光受容体もしくはＲＰＥ）または角膜の組織もしくは細胞などの組織および／または細胞への標的化および／または送達を高めるために、本明細書に記載のコンジュゲート基を含むか、または含有していてもよい。コンジュゲート基は、１つまたは複数の異なる、または同一のリガンドを提示し得る。コンジュゲート基のリガンドの例は、例えば、ペプチド、ビタミン、アプタマー、炭水化物または炭水化物の混合物、タンパク質、低分子、抗体、ポリマー、薬物である。炭水化物コンジュゲート基リガンドの例は、グルコース、マンノース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、Ｎ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルコサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、グルコース－６－リン酸、マンノース－６－リン酸、およびマルトトリオースである。炭水化物はまた、ＧａｌＮＡｃクラスター部分などの炭水化物クラスター部分の中に含まれていてもよい。炭水化物クラスター部分は、標的化部分、および任意選択でコンジュゲートリンカーを含むことができる。いくつかの実施形態では、炭水化物クラスターは、１、２、３、４、５もしくは６、またはそれ超のＧａｌＮＡｃ基を含む。本明細書で使用される場合、「炭水化物クラスター」は、足場またはリンカー基に結合した１つまたは複数の炭水化物残基を有する化合物を意味する（Maier et al. Bioconj Chem 2003, 14: 18）。この文脈において、「修飾炭水化物」は、天然に生じる炭水化物に対して１つまたは複数の化学修飾を有する任意の炭水化物を意味する。本明細書で使用される場合、「炭水化物誘導体」は、出発物質または中間体として炭水化物を使用して合成され得る任意の化合物を意味する。本明細書で使用される場合、「炭水化物」は、天然に存在する炭水化物、修飾された炭水化物、または炭水化物誘導体を意味する。本明細書において特定されるように、両方のタイプの賦形剤が、単一の組成物へと組み合わせられ得る。三価のＮ－アセチルグルコサミンクラスターの例は、国際公開第２０１７／０６２８６２号パンフレットに記載されており、これはまた、スルホンアミド低分子のクラスターについても記載している。低分子セルトラリンの単一のコンジュゲートの例（Ferres-Coy et al. Mol. Psych. 2016, 21: 328）、ならびにイブプロフェン（米国特許第６，６５６，７３０号明細書）、スペルミン（Noir et al. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130: 13500）、アニスアミド（Nakagawa J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 8848）、および葉酸（Dahmen Mol. Ther. Nucl. Acids 2012, 1, e7）を含む、タンパク質結合性低分子のコンジュゲートの例もまた記載されている。脂質コンジュゲートの例としては、脂肪酸およびその誘導体、例えば、パルミチル、パルミトイル、ステアリル、ステアロイル、ミリスチル、ミリストイル、ラウリル、ラウロイル、アラキドニル、アラキドノイル、ベヘニル、ベヘノイル、リグノセリル、リグノセロイル、サピエニル、サピエノイル、オレイル、オレオイル、エライジル、エライドイル、バセニル、バセノイル、リノレイル、リノレオイル、ＥＰＡ、ＤＨＡ、コレルステリル、ステロイド、ω－３脂肪酸、ω－６脂肪酸が挙げられ、脂質または脂質の混合組成物が１つまたは複数、本発明のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。オリゴヌクレオチドの脂質コンジュゲートの例が記載されている（国際公開第２０１９／２３２２５５号パンフレット；Biscans J. Control. Rel. 2019, 302, 116；Biscans Nucl. Acids Res. 2019, 47, 1082；Wang Nucl. Acid Ther. 2019, 29, 245）。コンジュゲーションに使用されるビタミンの例が知られている（Winkler Ther. Deliv. 2013, 4, 791；US 6,127,533）。オリゴヌクレオチドとアプタマーとのコンジュゲートも当技術分野で知られている（Zhao Biomaterials 2015, 67, 42）。
【0056】
抗体および抗体フラグメントもまた、本発明のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせることができる。好ましい実施形態では、特定の目的の組織、特に網膜または、および／または角膜組織を標的化する抗体またはそのフラグメントが、本発明のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。そのような抗体および／またはフラグメントの例は、例えば、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体；国際公開第２０１６／１７９２５７号パンフレット；Sugo J. Control. Rel. 2016, 237, 1）に標的化される。他のオリゴヌクレオチドコンジュゲートが当業者に知られており、Winkler et al. (Ther. Deliv. 2013, 4, 791, Manoharan Antisense Nucl. Acid Dev 2004, 12, 103)およびMing et al. (Adv. Drug Deliv. Rev. 2015, 87, 81)によりレビューされている。
【0057】
当業者は、本発明において使用するためのＥＯＮを製剤化および送達するために、上記または他の代替的な賦形剤および送達システムのうちの１つまたは複数を選択、組み合わせ、および／または適合させることができる。
【0058】
本発明による組成物に含まれる化合物は、例えば、本発明による組成物の活性成分の連続的な投与を可能にするために、別々に提供することもできる。そのような場合、本発明による組成物は、コンジュゲートされたリガンド、少なくとも１つの賦形剤、および任意選択で上記のＣＡＣを伴うか、または伴わない、本発明による少なくとも１つのＥＯＮを含む化合物の組合せである。
【0059】
好ましくは、好ましくは硝子体への直接注射による医薬組成物は硝子体内投与用であり、１眼あたり０．０５ｍｇ～５ｍｇの範囲の総ＥＯＮ量で投与される。本発明はまた、本発明による医薬組成物に関し、ここで、医薬組成物は注射による直接的な眼内投与用であり、１眼あたり０．１～１ｍｇの範囲の総ＥＯＮ量、例えば１眼あたり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇの総ＥＯＮの用量で投与される。好ましい量は、１眼あたり８０、１６０、および３２０μｇのオリゴヌクレオチドであり、初回の用量は、好ましくは２回目、３回目、およびそれ以降の用量の２倍の量である。したがって、初回の注射でオリゴヌクレオチド（２種類以上投与する場合はヌクレオチドの合計）を１６０μｇ投与し、その後８０μｇの注射を行う投与レジメン、または初回の注射が３２０μｇのオリゴヌクレオチドを含有し、その後１眼あたり１６０μｇのオリゴヌクレオチドの維持注射を行う投与レジメンである。そのような投与量は、臨床成果に応じて調整され得る。本発明はまた、本発明によるＥＯＮを発現するウイルスベクターに関する。さらに別の態様では、本発明は、医薬として使用するための、本発明によるＥＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターに関する。さらに別の態様では、本発明は、シュタルガルト病の処置、予防、または遅延に使用するための、本発明によるＥＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターに関する。さらに別の実施形態では、本発明は、シュタルガルト病の処置、予防、または遅延のための、本発明によるＥＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターの使用に関する。
【0060】
「ｐｒｅ－ｍＲＮＡ」という用語は、核内などの転写によって細胞のＤＮＡテンプレートから合成される、プロセシングを受けていないか、または部分的にプロセシングを受けた前駆体ｍＲＮＡを指す。
【0061】
これまでに達成された進歩を考慮すると、個体または前記個体の細胞、組織、器官に本発明によるＥＯＮを提供するための手段における改善が予想される。そのような将来的な改善は、もちろん、本発明の方法を使用したｍＲＮＡの再構築に対する上述の効果を達成するために組み込まれ得る。本発明によるＥＯＮは、個体、前記個体の細胞、組織、または器官にそのまま送達することができる。本発明によるＥＯＮを投与する際、ＥＯＮは、送達方法に適合する溶液に溶解されていることが好ましい。水溶液中にプラスミドを提供することにより、網膜細胞にＥＯＮ発現用のプラスミドを提供することができる。あるいは、ＥＯＮまたはＥＯＮ発現のためのプラスミドのための好ましい送達方法は、上で概説したようなウイルスベクター、またはナノ粒子である。好ましくは、ウイルスベクターまたはナノ粒子は、網膜細胞、より好ましくは、機能不全のＡＢＣＡ４タンパク質が存在し、疾患を引き起こす光受容体細胞またはＲＰＥの細胞に送達される。網膜細胞または他の関連する細胞へのそのような送達は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボであり得る。
【0062】
当業者は、本発明に使用するためのＥＯＮをパッケージ化し、送達して、ＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態の予防、処置または遅延のためにＥＯＮを送達するために、上記または他の市販の代替的な賦形剤および送達システムのいずれかを選択し、適応させ得る。「ＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態の予防、処置または遅延」は、本明細書において、好ましくは、ＡＢＣＡ４遺伝子の遺伝的欠陥によって引き起こされる部分的または完全な視覚障害または失明の予防、停止、進行中止、または逆転として定義される。
【0063】
本発明による複数の別個のＥＯＮが使用される場合、本明細書で定義の濃度または用量は、使用されるすべてのＥＯＮの総濃度もしくは総用量、または使用もしくは添加される各ＥＯＮの濃度もしくは用量を指し得る。したがって、一実施形態では、使用される本発明によるＥＯＮの各量または総量が、０．０１から２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５から２０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与される組成物が提供される。適切な硝子体内用量は、１眼あたり０．０５ｍｇから５ｍｇの間、好ましくは、約０．１から１ｍｇの間、例えば、１眼あたり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇである。
【0064】
本発明による好ましいＡＯＮは、ヒト個体のＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態の処置のためのものである。好ましくは、ＡＢＣＡ４バリアントは、表１にリストされたバリアントの群から選択され、より好ましくは、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のエクソン４２におけるｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異であるが、複数のＥＯＮを使用して、同じ処置において他のＡＢＣＡ４突然変異も標的化されることを排除することはできない。
【0065】
本発明のすべての実施形態では、「処置」という用語は、ＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態の予防および／または遅延も含むと理解される。本発明に従ってＥＯＮを使用して処置され得る個体は、ＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態を有するとすでに診断されていてもよい。あるいは、本発明に従ってＥＯＮを使用して処置され得る個体は、シュタルガルト病などのＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態を有するとまだ診断されていなくてもよいが、彼または彼女の遺伝的背景を考えると、将来、そのような疾患または状態を発症するリスクが高い個体であり得る。好ましい個体は、ヒトの個体である。好ましい実施形態では、ＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態は、シュタルガルト病である。したがって、本発明は、ＡＢＣＡ４のＲＮＡ編集を必要とするＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態を処置するための医薬として使用するための、およびＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態の予防、処置または遅延のための医薬として使用するための、本発明によるＥＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物をさらに提供する。前記使用の各特徴は、本明細書において先に定義されている。
【0066】
本発明は、ＡＢＣＡ４（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡのＲＮＡ編集（または特定のアデノシンの脱アミノ化）を必要とするＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態の処置のための、本発明によるＥＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による（医薬）組成物の使用をさらに提供する。好ましい実施形態では、本発明のすべての態様について、ＡＢＣＡ４－バリアントに関連した障害、疾患、または状態は、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子におけるｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異によって引き起こされる。
【0067】
本発明は、医薬の調製のための、ＡＢＣＡ４（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡ内の特定のアデノシンのＲＮＡ編集を必要とするＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態を処置するための医薬の調製のための、およびＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態の予防、処置または遅延のための医薬の調製のための、本発明によるＥＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物の使用をさらに提供する。したがって、さらなる態様において、医薬の調製のための、ＡＢＣＡ４（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡの特定の標的アデノシンのＲＮＡ編集を必要とする状態を処置するための医薬の調製のための、およびＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態の予防、処置または遅延のための医薬の調製のための、本明細書において定義されるＥＯＮ、ウイルスベクターまたは組成物の使用が提供される。
【0068】
本発明による使用または方法における処置は、少なくとも１回、少なくとも１週間、１カ月、数カ月、１、２、３、４、５、６年またはそれよりも長く、例えば一生涯、である。本明細書に開示の処置は、細胞のＤＮＡを編集せず、突然変異型の（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡが細胞によって絶えず生成され、突然変異型の（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡは、疾患を解除するために継続的な編集を必要とし得ることが理解されるべきである。本発明に従って使用するための本明細書で定義の各ＥＯＮまたはその等価物は、ＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態をすでに患っているか、または発症するリスクのある個体のインビボにおける細胞、組織および／または器官への直接投与に適したものであり得、インビボ、エクスビボまたはインビトロで直接投与され得る。本発明のＥＯＮ、組成物、化合物または補助化合物の投与の頻度は、疾患の重症度、患者の年齢、患者の突然変異、ＥＯＮの数（すなわち、用量）、前記ＥＯＮの製剤、投与経路など、いくつかのパラメータに依存し得る。頻度は、毎日、毎週、少なくとも２週間に１回、または３週間に１回、または４週間に１回、または５週間に１回、またはそれよりも長い期間に１回の間で変動し得る。本発明によるＥＯＮの用量範囲は、好ましくは、厳格なプロトコル要件が存在する臨床試験（インビボでの使用）における用量漸増試験に基づいて設計される。本明細書で定義のＥＯＮの濃度は、好ましい実施形態では、０．１ｎＭ～１μＭの範囲で使用される。好ましくは、この範囲は、網膜細胞または網膜組織、好ましくは光受容細胞および／またはＲＰＥなどの細胞モデルにおけるインビトロでの使用のためのものである。より好ましくは、使用される濃度は、１～４００ｎＭ、さらにより好ましくは１０～２００ｎＭ、さらにより好ましくは５０～１００ｎＭの範囲である。いくつかのＥＯＮを使用する場合、この濃度または用量は、ＥＯＮの総濃度もしくは総用量、または添加される各ＥＯＮの濃度もしくは用量を指し得る。好ましい実施形態では、本発明による分子のための送達ビヒクルとしてのウイルスベクター、好ましくは本明細書に先に記載のＡＡＶベクターは、注射１回あたり１×１０９～１×１０１７個のウイルス粒子、より好ましくは注射１回あたり１×１０１０～１×１０１２個のウイルス粒子の範囲の用量で投与される。上記のＥＯＮの濃度または用量の範囲は、インビボ、インビトロまたはエクスビボでの使用に好ましい濃度または用量である。当業者は、使用されるＥＯＮ、処置される標的細胞、遺伝子標的およびその発現レベル、使用される培地ならびにトランスフェクションおよびインキュベーション条件に応じて、使用されるＥＯＮの濃度または用量がさらに変化し得、さらに最適化される必要があり得ることを理解するであろう。
【0069】
本発明は、細胞、好ましくは網膜細胞、より好ましくは光受容細胞および／またはＲＰＥ細胞を、本発明によるＥＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させることを含む、細胞におけるＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡのＲＮＡ編集のための方法をさらに提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本明細書で先に定義されたものである。本発明によるＥＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と細胞を接触させることは、当業者に知られている任意の方法によって行われ得る。本明細書に記載のＥＯＮ、ウイルスベクターおよび組成物の送達のための方法の使用が含まれる。接触は直接的または間接的であり得、そしてインビボ、エクスビボまたはインビトロであり得る。
【0070】
本発明は、それを必要とする個体（例えば、シュタルガルト病に罹患している患者）のＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡの特定の標的アデノシンのＲＮＡ編集を必要とするＡＢＣＡ４－バリアントに関連した疾患または状態の処置のための方法であって、前記ｐｒｅ－ｍＲＮＡ内の特定のアデノシンを脱アミノ化するために、前記個体の細胞、好ましくは網膜細胞、より好ましくは光受容細胞および／またはＲＰＥ中の細胞を、本発明によるＥＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させることを含む、方法をさらに提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本明細書で先に定義されたものである。細胞、好ましくは網膜細胞、より好ましくは視細胞および／またはＲＰＥ内の細胞を、本発明によるＥＯＮ、本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させることは、当業者に知られている任意の方法によって行われ得る。本明細書に記載のＥＯＮ、ウイルスベクターおよび組成物の送達のための方法の使用が含まれる。接触は直接的または間接的であり得、そしてインビボ、エクスビボまたはインビトロであり得る。特に明記しない限り、本明細書に記載の各実施形態は、本明細書に記載の別の実施形態と組み合わせてもよい。
【0071】
本明細書で提供される配列情報は、誤って同定された塩基を含めることを要求するほど狭義に解釈されるべきではない。当業者は、そのような誤って同定された塩基を同定でき、そのような誤りを訂正する方法を知っている。
【0072】
本明細書で引用されたすべての特許および参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0073】
[実施例１]
生化学的アッセイにおいて４つのＥＯＮを使用したヒトＡＢＣＡ４（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡのエクソン４２中のｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異のＲＮＡ編集
本発明者らは、シュタルガルト病を引き起こす比較的一般的な突然変異（ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のエクソン４２におけるｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異）が、（エクスビボ、インビトロ、およびインビボで）ＡＤＡＲ２をリクルートできるオリゴヌクレオチドによって、事前にオリゴヌクレオチドをＡＤＡＲ２酵素に物理的に結合させる必要なしに修復できるかどうかを判定することにした。この突然変異は、野生型のＧＧＡコドン（グリシンをコードする）をＧＡＡ（グルタミン酸をコードする）に変える。中央のヌクレオチドである第１のアデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への脱アミノ化は、野生型の状況への復帰であるＧＧＡとして見られるリーディングフレームをもたらす。両方のアデノシンがイノシンに脱アミノ化されると、ＧＧＧコドンが生成される。そのコドンもまた、タンパク質レベルではグリシンをコードし、したがって、これもまた野生型の状況となる。したがって、第１のアデノシンの脱アミノ化、または同じ反応における第１のアデノシン＋第２のアデノシンの脱アミノ化は有益となるであろう。特に、第２のアデノシンのみが脱アミノ化された場合（ＧＡＧが生じる；これもグルタミン酸をコードする）、病状に変化はないであろう。したがって、ＲＮＡ編集反応では第１のアデノシンのみが脱アミノ化されることが好ましいが、両方のアデノシンの脱アミノ化も潜在的に有害ではない一方、第２のアデノシンの単独の脱アミノ化はすでに変異したｍＲＮＡに由来するアミノ酸（グルタミン酸）を変化させないであろう。
生化学的アッセイにおいて４つのＥＯＮを使用したヒトＡＢＣＡ４（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡのエクソン４２中のｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異のＲＮＡ編集
本発明者らは、シュタルガルト病を引き起こす比較的一般的な突然変異（ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のエクソン４２におけるｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異）が、（エクスビボ、インビトロ、およびインビボで）ＡＤＡＲ２をリクルートできるオリゴヌクレオチドによって、事前にオリゴヌクレオチドをＡＤＡＲ２酵素に物理的に結合させる必要なしに修復できるかどうかを判定することにした。この突然変異は、野生型のＧＧＡコドン（グリシンをコードする）をＧＡＡ（グルタミン酸をコードする）に変える。中央のヌクレオチドである第１のアデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への脱アミノ化は、野生型の状況への復帰であるＧＧＡとして見られるリーディングフレームをもたらす。両方のアデノシンがイノシンに脱アミノ化されると、ＧＧＧコドンが生成される。そのコドンもまた、タンパク質レベルではグリシンをコードし、したがって、これもまた野生型の状況となる。したがって、第１のアデノシンの脱アミノ化、または同じ反応における第１のアデノシン＋第２のアデノシンの脱アミノ化は有益となるであろう。特に、第２のアデノシンのみが脱アミノ化された場合（ＧＡＧが生じる；これもグルタミン酸をコードする）、病状に変化はないであろう。したがって、ＲＮＡ編集反応では第１のアデノシンのみが脱アミノ化されることが好ましいが、両方のアデノシンの脱アミノ化も潜在的に有害ではない一方、第２のアデノシンの単独の脱アミノ化はすでに変異したｍＲＮＡに由来するアミノ酸（グルタミン酸）を変化させないであろう。
【0074】
４つの異なるＥＯＮ（それぞれ、ＡＢＣＡ４－１、－２、－３、および－４；配列および化学修飾については、図１を参照されたい）を使用した第１の生化学的アッセイを、１２ｎＭおよび１ｎＭ濃度の二本鎖ＲＮＡで全長ｈＡＤＡＲ２タンパク質（組換え生成；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を飽和させて実施した（標的ＲＮＡ：ＥＯＮ比は１：６）。標的ＲＮＡ／ＥＯＮ混合物を９５℃で加熱し、分子間相互作用を促進するために、ゆっくりと室温まで冷却した（３０分）。二本鎖形成は、アニーリングバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で行った。形成された二本鎖ＲＮＡを水で２倍に希釈した後、編集反応バッファー（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４；１．５ｍＭ ＥＤＴＡ；６０ｍＭ ＫＣｌ；３ｍＭ ＭｇＳＯ４；０．５ｍＭ ＤＴＴ；３％グリセロール；０．００３％ ＮＰ－４０；４０ｍＭ Ｋ－グルタミン酸）中で１０ｎｇ／μＬの酵母ｔＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／μＬのポリＡ ＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）、プロテアーゼ（ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル）およびＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤）と混合した。編集反応を、反応混合液（最終容量５０μＬ）にｈＡＤＡＲ２タンパク質を添加することで開始させた。この反応を３７℃で最大５０分間行った。８つの異なる中間時点で、５μＬの試料を採取した。５μＬの試料を９５μＬの沸騰３ｍＭ ＥＤＴＡに添加し、９５℃でインキュベートしてタンパク質を変性させることにより、各時点の反応を停止させた。次に、製造元の指示に従って、プライマーｇＢｌｏｃｋ ＰＣＲ ＲＥＶ：５’－ＴＧＧ ＡＣＣ ＧＡＣ ＴＧＧ ＡＡＡ ＣＧＴ ＡＧ－３’（配列番号１３）を用いるＭａｘｉｍａ逆転写酵素キットを使用して、停止した反応混合物６μｌをｃＤＮＡ合成のテンプレートとして使用した。総反応量は２０μｌであり、伸長温度は６２℃を使用した。
【0075】
パイロシーケンス分析のために、Ａｍｐｌｉｔａｑ ｇｏｌｄ ３６０ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造元の指示に従って使用し、１μｌのｃＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲにより、生成物を増幅させた。以下のプライマーを１０μＭの濃度で使用した：Ｐｙｒｏｓｅｑ Ｆｗｄ ＡＢＣＡ４：５’－ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＴＧＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＡ－３’（配列番号１４）、およびＰｙｒｏｓｅｑ Ｒｅｖ ＡＢＣＡ４ Ｂｉｏｔｉｎ、５’－ＣＣＣ ＡＧＴ ＧＡＧ ＣＡＴ ＣＴＴ ＧＡＡ ＴＧＴ－３’（配列番号１５）。後者のプライマーは、パイロシーケンス反応中の自動処理に必要な、５’末端にコンジュゲートしたビオチンも含有している。
【0076】
逆転写反応におけるｃＤＮＡ合成中にイノシンはシチジンと対合するため、ＰＣＲ中に編集された位置に組み込まれるヌクレオチドはグアノシンとなる。グアノシン（編集済み）とアデノシン（未編集）のパーセンテージを、パイロシーケンスによって定義した。ＰＣＲ産物のパイロシーケンスとデータ分析を、ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ４８ Ａｕｔｏｐｒｅｐ機器（Ｑｉａｇｅｎ）によって、１０μｌのＰＣＲ産物のインプットと４μＭのシーケンシングプライマーＡＢＣＡ４－Ｓｅｑ２：５’－ＣＴＣ ＣＡＧ ＣＣＣ ＡＧＣ ＡＧＴ－３’（配列番号１６）を使用して、製造元の指示に従って実行した。この標的ＲＮＡ鎖に対して特異的に定義された設定は、２セットの配列情報を含んでいた。これらの第１のセットは、機器が分析する配列を定義し、一方、第２のセットは、各ヌクレオチドに対応する配列決定試薬が分配される順序を定義し、また、バックグラウンド信号を定義するために機器によって使用されるブランク対照（すなわち、その特定の位置に組み込まれてはならないヌクレオチド）も含む。機器によって実行される分析は、選択されたヌクレオチドの結果を、その位置で検出されたアデノシンとグアノシンのパーセンテージとして提供し、したがって、選択された位置でのＡからＩへの編集の程度は、その位置におけるグアノシンのパーセンテージによって測定されることになる。パイロシーケンスは、編集の効率が最大１４０％に達することを明らかにした（データは示さず）。標的コドン中に編集されるアデノシンが１つだけ存在する場合には、効率が１００％を超えることはあり得ない。これは、標的ＧＡＡコドン中の第１のアデノシンがイノシンに脱アミノ化されただけでなく、第２のアデノシンも編集されたことを示唆している。場合によっては、標的配列が第２のアデノシンでのみ編集されて、ＧＡＧが生じ、（上で概説したように）病状が変化しないことも排除することはできない。それでも、いずれの場合も編集のパーセンテージは、標的ＧＡＡコドンの第１のアデノシンおよび／または第２のアデノシンが編集されたことを示し、これは、本発明者らがこのＡＢＣＡ４突然変異を非常に効率的に標的化し、編集できたことを示している。
【0077】
ＡＢＣＡ４－１～４のＥＯＮを使用した生化学的実験の結果が図２Ａに示されており、これは、試験した４つのＥＯＮすべてが、比較的迅速に標的アデノシンをイノシンに編集できたことを明確に示している。３つのＥＯＮ（ＡＢＣＡ４－１、－２、および－３）は、ほぼ完全にホスホロチオエート化されたＥＯＮであるＡＢＣＡ４－４ ＥＯＮの性能を上回っていた。これは今回、本発明者らがＡＢＣＡ４のＧ＞Ａ突然変異を標的化することができ、患者がＡＢＣＡ４遺伝子中のＧ＞Ａ突然変異に罹患しているシュタルガルト病の処置に有用な医薬化合物のさらなる開発を可能としたことを示している。
【0078】
[実施例２]
生化学的アッセイにおいて追加のＥＯＮを使用したヒトＡＢＣＡ４（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡのエクソン４２中のｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異のＲＮＡ編集
最初に設計された４つのＥＯＮに加えて、本発明者らはＡＢＣＡ４－５～２９を設計した（配列および修飾については図１を参照されたい）。ＡＢＣＡ４－５は、分子内ループ構造を含有している一方、ＡＢＣＡ４－２９は、標的配列に対する様々な追加のミスマッチを含有している。ＡＢＣＡ４－１７～２７は、最初のＥＯＮおよび以前に当技術分野で使用されていたものよりも大幅に短くなるように設計され、一方、ＡＢＣＡ４－２１～２７はそれぞれ、分割されたＥＯＮのセットを形成しており、突然変異の領域を標的化しないＡＢＣＡ４－２８オリゴヌクレオチドを伴う。短いＥＯＮおよび分割されたＥＯＮの使用は協調して機能することは、英国特許出願第２０１１４２８．６号明細書（未公開）に記載されている。
生化学的アッセイにおいて追加のＥＯＮを使用したヒトＡＢＣＡ４（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡのエクソン４２中のｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異のＲＮＡ編集
最初に設計された４つのＥＯＮに加えて、本発明者らはＡＢＣＡ４－５～２９を設計した（配列および修飾については図１を参照されたい）。ＡＢＣＡ４－５は、分子内ループ構造を含有している一方、ＡＢＣＡ４－２９は、標的配列に対する様々な追加のミスマッチを含有している。ＡＢＣＡ４－１７～２７は、最初のＥＯＮおよび以前に当技術分野で使用されていたものよりも大幅に短くなるように設計され、一方、ＡＢＣＡ４－２１～２７はそれぞれ、分割されたＥＯＮのセットを形成しており、突然変異の領域を標的化しないＡＢＣＡ４－２８オリゴヌクレオチドを伴う。短いＥＯＮおよび分割されたＥＯＮの使用は協調して機能することは、英国特許出願第２０１１４２８．６号明細書（未公開）に記載されている。
【0079】
追加のＥＯＮのセットも、実施例１に開示の最初の４つのＥＯＮに対して使用されたアッセイと比較して若干の調整を加えた生化学的アッセイで試験した（配列および化学修飾については図１を参照されたい）。２４ｎＭおよび２ｎＭの二本鎖ＲＮＡ濃度で、飽和した全長ｈＡＤＡＲ２タンパク質（組換え生産；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を使用した（標的ＲＮＡ：ＥＯＮ比１：３）。標的ＲＮＡ／ＥＯＮ混合物を９５℃で加熱し、分子間相互作用を促進するために、ゆっくりと室温まで冷却した（１時間１５分）。二本鎖形成を、アニーリングバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で行った。形成された二本鎖ＲＮＡを水で２倍に希釈し、０．５×アニーリングバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で５倍に希釈した後、編集反応バッファー（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４；１．５ｍＭ ＥＤＴＡ；６０ｍＭ ＫＣｌ；３ｍＭ ＭｇＳＯ４；０．５ｍＭ ＤＴＴ；３％グリセロール；０．００３％ ＮＰ－４０；４０ｍＭ Ｋ－グルタミン酸）中で１０ｎｇ／μＬの酵母ｔＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／μＬのポリＡ ＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）、プロテアーゼ（ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル）およびＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤）と混合した。編集反応を、反応混合液（最終容量５０μＬ）にｈＡＤＡＲ２タンパク質を添加することで開始させた。この反応を３７℃で最大６０分間行った。６つの異なる中間時点で、５μＬの試料を採取した。５μＬの試料を９５μＬの沸騰３ｍＭ ＥＤＴＡに添加し、９５℃でインキュベートしてタンパク質を変性させることにより、各時点の反応を停止させた。次に、製造元の指示に従って、プライマーｇＢｌｏｃｋ ＰＣＲ ＲＥＶと共にＭａｘｉｍａ逆転写酵素キットを使用して、停止した反応混合物１０μｌをｃＤＮＡ合成のテンプレートとして使用した。総反応量は２０μｌであり、伸長温度は６２℃を使用した。
【0080】
パイロシーケンス分析のために、Ａｍｐｌｉｔａｑ ｇｏｌｄ ３６０ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造元の指示に従って使用し、１μｌのｃＤＮＡをテンプレートとして用いて、生成物を増幅させた。以下のプライマーを１０μＭの濃度で使用した：Ｐｙｒｏｓｅｑ Ｆｗｄ２ ＡＢＣＡ４：５’－ＡＣＴ ＡＡＣ ＣＡＡ ＧＡＴ ＴＴＡ ＴＣＣ ＡＧＧ Ｃ－３’（配列番号１７）およびＰｙｒｏｓｅｑ Ｒｅｖ ＡＢＣＡ４ Ｂｉｏｔｉｎ（上記を参照されたい）。後者のプライマーは、パイロシーケンス反応中の自動処理に必要な、５’末端にコンジュゲートしたビオチンも含有している。
【0081】
生化学的アッセイの結果が図２ＢからＧに示されており、それぞれ、３つまたは４つのＥＯＮの結果を示している。明らかに、一部のＥＯＮは他のＥＯＮよりも性能が優れているが、短いバージョンのＡＢＣＡ４－１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、および２７は、長いバージョンよりも効率が低くなっている。しかし、同じく短いＥＯＮであるＡＢＣＡ４－２６は、非常に優れた性能を見せている。標的配列とのミスマッチが多いＡＢＣＡ４－２９は、少なくともこのアッセイでは、他のＥＯＮと比較してうまく機能していない。生化学的アッセイは、分割されたＥＯＮ（ＡＢＣＡ４－２１～２７、それぞれＡＢＣＡ４－２８を伴う）では行わなかった。これは、セルベースアッセイにおいて試験した（以下を参照されたい）。
【0082】
[実施例３]
細胞アッセイにおいて決定されたＲＮＡ編集
細胞トランスフェクション実験を、様々な異なるＥＯＮを使用して実行した（配列および化学的改変については図１を参照されたい）。マウスのＲＰＥ細胞をＤＭＥＭ（１０％ＰＢＳ＋Ｐ／Ｓ）中、コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレートに４×１０４細胞／ｃｍ２で播種した。５％ ＣＯ２および３７℃で２～３時間インキュベートした後、トランスフェクション試薬（３μＬ）としてＤｈａｒｍａｆｅｃｔ ｄｕｏ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、細胞に５００ｎｇのミディジーンと５００ｎｇのヒトＡＤＡＲ２を発現するプラスミドを１ｍＬの総量でトランスフェクトした。ミディジーンは、ヒトＡＢＣＡ４ゲノム配列の一部、すなわち、Ｔ７によって調節され、ＣＭＶプロモーターが先行するロドプシンのエクソン３および５に隣接した中間エクソンを含む、イントロン４０からイントロン４３を含む構築物である。ミディジーンの２つのバージョンを作製した。１つは野生型ＡＢＣＡ４配列を含み、もう１つはエクソン４２のｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異（「突然変異型」）を含む。突然変異型ミディジーンは、本明細書に概説されるようにして、ＥＯＮとコトランスフェクトした。
細胞アッセイにおいて決定されたＲＮＡ編集
細胞トランスフェクション実験を、様々な異なるＥＯＮを使用して実行した（配列および化学的改変については図１を参照されたい）。マウスのＲＰＥ細胞をＤＭＥＭ（１０％ＰＢＳ＋Ｐ／Ｓ）中、コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレートに４×１０４細胞／ｃｍ２で播種した。５％ ＣＯ２および３７℃で２～３時間インキュベートした後、トランスフェクション試薬（３μＬ）としてＤｈａｒｍａｆｅｃｔ ｄｕｏ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、細胞に５００ｎｇのミディジーンと５００ｎｇのヒトＡＤＡＲ２を発現するプラスミドを１ｍＬの総量でトランスフェクトした。ミディジーンは、ヒトＡＢＣＡ４ゲノム配列の一部、すなわち、Ｔ７によって調節され、ＣＭＶプロモーターが先行するロドプシンのエクソン３および５に隣接した中間エクソンを含む、イントロン４０からイントロン４３を含む構築物である。ミディジーンの２つのバージョンを作製した。１つは野生型ＡＢＣＡ４配列を含み、もう１つはエクソン４２のｃ．５８８２Ｇ＞Ａ突然変異（「突然変異型」）を含む。突然変異型ミディジーンは、本明細書に概説されるようにして、ＥＯＮとコトランスフェクトした。
【0083】
５％ ＣＯ２および３７℃で２４時間のインキュベーション時間の後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞に新鮮な培地（９００μＬ）を補充し、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１００ｎＭ ＥＯＮをトランスフェクトした。ＥＯＮとヘルパーＡＯＮ（ＡＢＣＡ４－２８）をトランスフェクトした場合、分割されたＥＯＮを含む組成物として、両方のオリゴヌクレオチドを１００ｎＭの量でトランスフェクトした。トランスフェクションは、１μｇのＥＯＮと２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００の比率で、総量１ｍＬで行った。５％ ＣＯ２および３７℃で６時間のインキュベーション時間の後、培地を除去し、細胞を洗浄し、新鮮な培地を細胞に加えた。
【0084】
５％ ＣＯ２および３７℃で合計２４時間のインキュベーション時間の後、ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞からＲＮＡを単離し、ＲＮＡを５０μＬのＲＮａｓｅフリー水に溶解させた。
【0085】
次に、製造元の指示に従い、２５０ｎｇのＲＮＡをテンプレートとして、Ｖｅｒｓｏ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ランダムヘキサマーを用いたｃＤＮＡ合成を行った。総反応量は２０μＬであった。試料はその後、パイロマーク配列分析およびｄｄＰＣＲ分析に使用した。
【0086】
パイロシーケンス分析のために、Ａｍｐｌｉｔａｑ ｇｏｌｄ ３６０ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造元の指示に従って使用し、５μｌのｃＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲにより、生成物を増幅させた。以下のプライマーを０．４μＭの最終濃度で使用した：Ｐｙｒｏｓｅｑ Ｆｗｄ２ ＡＢＣＡ４およびＰｙｒｏｓｅｑ Ｒｅｖ ＡＢＣＡ４ Ｂｉｏｔｉｎ（上記を参照されたい）。逆転写反応におけるｃＤＮＡ合成中にイノシンはシチジンと対合するため、ＰＣＲ中に編集された位置に組み込まれるヌクレオチドはグアノシンとなる。グアノシン（編集済み）対アデノシン（未編集）のパーセンテージは、パイロシーケンスによって定義される。ＰＣＲ産物のパイロシークエンスおよびデータ分析を、ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ４８ Ａｕｔｏｐｒｅｐ機器（Ｑｉａｇｅｎ）によって、１０μｌのＰＣＲ産物の入力と４μＭのＡＢＣＡ４－Ｓｅｑ２プライマー（配列番号１６）を用いて、製造元の指示に従って実行した。この標的ＲＮＡ鎖に対して特異的に定義された設定は、２セットの配列情報を含んでいた。これらの第１のセットは、機器が可変領域におけるグアノシンとアデノシンの違いを分析するための配列を定義し、一方、第２のセットは、各ヌクレオチドに対応決定試薬が分配される順序を定義し、また、バックグラウンド信号を定義するために機器によって使用されるブランク対照（すなわち、その特定の位置に組み込まれるはずがないヌクレオチド）も含む。機器によって実行される分析は、選択されたヌクレオチドの結果を、その位置で検出されたアデノシンとグアノシンのパーセンテージとして提供し、したがって、選択された位置でのＡからＩへの編集の程度は、その位置におけるグアノシンのパーセンテージによって測定されることになる。
【0087】
パイロマークシーケンシングによって決定されたＲＮＡ編集結果が図３に示されており、これは、ＡＤＡＲ２の過剰発現を用いたセルベースアッセイにおいて、試験したＥＯＮの多くが実際に、ヒトＡＢＣＡ４（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡのエクソン４２において標的アデノシンをイノシンに編集できたことを明らかにしている。
【0088】
次に、二重ｄｄＰＣＲアッセイを用いて、試料中の野生型（ＷＴ）と参照（ｒｅｆ）のコピー数を測定した。ＷＴアッセイは、ＡＢＣＡ４エクソン４２のＧを検出（ＡＢＣＡ４エクソン４１からエクソン４３まで）するために特別に設計され、ＦＡＭ標識された陽性液滴をもたらす。ｒｅｆアッセイは、参照エクソンＲｈｏ３からＡＢＣＡ４エクソン４１を検出するように設計され、ＨＥＸ標識された陽性液滴をもたらす。
【0089】
各ｄｄＰＣＲ試料は、１×ｄｄＰＣＲプローブ用スーパーミックス（ｄＵＴＰなし）（Ｂｉｏｒａｄ製）、０．６μＭの各プライマー（フォワードｒｅｆプライマー配列：５’－ＴＴＣ ＴＧＣ ＴＡＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＣＴＣ－３’（配列番号１８）；リバースｒｅｆプライマー配列：５’－ＴＧＴ ＣＴＴ ＴＣＴ ＴＣＡ ＧＣＣ ＡＣＡ ＴＣ－３’（配列番号１９）；フォワードＷＴプライマー配列：５’－ＣＴＡ ＡＣＣ ＡＡＧ ＡＴＴ ＴＡＴ ＣＣＡ ＧＧＣ－３’（配列番号２０）；リバースＷＴプライマー配列：５’－ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＴ－３’（配列番号２１））、０．６μＭの各ダブルクエンチプローブ（ｒｅｆプローブ配列：５’－ＨＥＸ－ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＡＡ－ＺＥＮ－ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＴＧ ＣＣＧ－ＩＡＢｋＦＱ－３’（配列番号２２）；ＷＴプローブ配列：５’－６－ＦＡＭ－ＴＧＴ ＧＴＣ ＧＧＡ －ＺＥＮ－ ＧＴＴ ＣＧＣ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＡ－ＩＡＢｋＦＱ－３’（配列番号２３））、および２５ｎｇのｃＤＮＡを総量２１μＬ中に含んでいた。液滴は、ＱＸ２００液滴ジェネレーター（Ｂｉｏｒａｄ）を使用してＰＣＲミックスから作製した。次に、液滴のＰＣＲを１０５℃に加熱された蓋と２℃／秒のランプ温度を用いてＴ１００サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）において実施した。ポリメラーゼを９５℃で１０分間、熱で活性化した。各サイクルで、変性を９４℃で３０秒間行い、アニーリング／伸長を６０℃で３０秒間行った。これを合計４０サイクル繰り返した。酵素を９８℃で１０分間失活させ、反応を４℃で保持した。液滴からの蛍光シグナルを、ＱＸ２００液滴リーダー（Ｂｉｏｒａｄ）によって測定した。絶対定量をＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して行った。陽性液滴の数を決定するために、蛍光閾値をＦＡＭシグナルの場合は３５３４、ＨＥＸシグナルの場合は２０００に設定した。ＷＴ／ｒｅｆの比を、コピー数／反応を使用して計算した。各試料を二連で測定した。計算には平均値を使用した。
【0090】
図４は各試料におけるＷＴ／ｒｅｆの比を示している。それは、より小さなＥＯＮで処置した試料において最も高いＷＴ／ｒｅｆ比が測定されることを示している。より短いＥＯＮはすべてエクソン４２の内部配列に相補的であるのに対し、より長いバージョンはエクソン／イントロン境界と重なったため、より長いＥＯＮの使用は、エクソン４２のエクソンスキッピングを引き起こし、それにより、ｄｄＰＣＲのシグナルが減少し、それゆえ、観察されるＲＮＡ編集のレベルが低下したと推測された。したがって、そのようなエクソンスキッピングが実際に発生したかどうかを確認した。
【0091】
エクソン４２スキップアッセイは、ＡＢＣＡ４エクソン４２の欠失のために特別に設計した。上記と同じｄｄＰＣＲ法をフォワードエクソンスキッププライマー：５’－ＧＡＴ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＧＡ ＣＡ－３’（配列番号２４）、ＷＴアッセイと同じリバースプライマー、およびダブルクエンチプローブエクソン４２スキップ：５’－６－ＦＡＭ－ ＡＡＣ ＴＡＡ ＣＣＡ －ＺＥＮ－ ＡＧＴ ＧＣＴ ＴＴＧ ＧＣＣ ＴＣＣ－ＩＡＢｋＦＱ－３’（配列番号２５）を使用して行った。陽性液滴の数を決定するために、蛍光閾値をＦＡＭシグナルの場合は４９２３、ＨＥＸシグナルの場合は２０００に設定した。エクソン４２スキップ／ｒｅｆの比は、コピー数／反応を使用して計算した。
【0092】
図５は、各試料におけるエクソン４２スキップ／ｒｅｆの比を示しており、ＥＯＮ １３～１６で処置した試料で最も高いスキップ比が測定されることを示している。図４では、これらＥＯＮ１３～１６は、標的アデノシンの比較的低いＲＮＡ編集を示している結果が示されている 。対照的に、内部のエクソン４２配列に相補的な、より小さなＥＯＮでは、比較的高く効率的なＲＮＡ編集が観察され、そのようなエクソンスキッピングはほとんど検出できなかった。重要なことに、ＡＢＣＡ４－２１～２７を（ＡＢＣＡ４－２８を伴わずに）使用した場合、スキッピングはまったく観察されなかった。したがって、配列番号８または９の配列など、エクソン４２の３’末端および下流のイントロンと重複せず、むしろ完全にエクソン４２内にある配列と完全に相補的であるＥＯＮを使用することが好ましい。
【0093】
これらの結果は、本発明者らが、細胞中およびインビトロの生化学的な設定で、ヒトＡＢＣＡ４（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡのエクソン４２における標的アデノシンをイノシンに編集することができるＥＯＮを提供できたことを明確に示している。興味深いことに、分割されたＥＯＮのＡＢＣＡ４－２４とＡＢＣＡ４－２８とを一緒に使用した実験では、ＲＮＡ編集のパーセンテージが、個別の（単一の）ＥＯＮのトランスフェクションで見られたものよりも高く、そのような構成が好ましい場合があることを示している。さらに、検出可能なレベルのエクソンスキッピングを引き起こさないことから、短いＥＯＮ（ＡＢＣＡ４－１７から２７、より好ましくはＡＢＣＡ４－２１から２７）を使用することが好ましい。エクソン４２のエクソンスキッピングは望ましくないことが理解されるべきである。むしろ、エクソンスキッピングは生じるべきでなく、エクソン４２における標的アデノシンの特異的なＲＮＡ編集のみが生じるべきである。ここでは、そのようなことが達成できることが実証されている。より小さな（分割された）ＥＯＮの使用が好ましいということは、英国特許出願第２０１１４２８．６号明細書（未公開）に記載のようにして得られた結果を裏付けている。
【0094】
これらの実験は、本発明者らが、ヒトＡＢＣＡ４のｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン４２におけるＧ＞Ａ突然変異を標的化することができ、患者がＡＢＣＡ４遺伝子中のＧ＞Ａ突然変異に罹患しているシュタルガルト病の処置に有用な医薬化合物のさらなる開発を可能としたことを示している。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】