特表 2023-507549 メチル化情報を用いた細胞源分画を推定するシステムおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-24

(54)【発明の名称】メチル化情報を用いた細胞源分画を推定するシステムおよび方法

(51)【国際特許分類】

   G16B 40/20 20190101AFI20230216BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230216BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20230216BHJP

   G16H 10/40 20180101ALI20230216BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALN20230216BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALN20230216BHJP

【ＦＩ】

G16B40/20

G01N33/53 M

G01N33/574 Z

G16H10/40

C12Q1/6806 Z

C12Q1/6869 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022530797

(86)(22)【出願日】2020-12-18

(85)【翻訳文提出日】2022-07-07

(86)【国際出願番号】 US2020066217

(87)【国際公開番号】W WO2021127565

(87)【国際公開日】2021-06-24

(31)【優先権主張番号】62/950,071

(32)【優先日】2019-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522105894

【氏名又は名称】グレイル エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100211395

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 裕貴

(72)【発明者】

【氏名】ジン シャン

(72)【発明者】

【氏名】ロバート エイブ ペイン キャレフ

【テーマコード（参考）】

4B063

5L099

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR62

4B063QR72

4B063QS10

4B063QS14

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS39

5L099AA03

(57)【要約】

対象の細胞源分画を推定するための複数の特徴を特定する方法が提供される。複数のトレーニング対象における各トレーニング対象について、対応するトレーニング用の複数のセルフリー断片における各セルフリー断片の対応するメチル化パターンと、対応する対象の癌の徴候とが取得される。各セルフリー断片は、複数のビン内のビンにマッピングされ、各ビンは、ヒト参照ゲノムの一部を表す。各セルフリー断片の対応するメチル化パターンを分類器に入力すると、分類器の機能として、セルフリー断片の癌の状態が各セルフリー断片に割り当てられる。対象の癌の状態とセルフリー断片の癌の状態との間の関連性の基準がビン毎に決定される。対象の細胞源分画を推定するための複数の特徴は、複数のビンのサブセットとして識別される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象細胞源率を推定するための複数の特徴量を特定する方法であって、該方法は、以下を含む
１つ以上のプロセッサと、前記１つ以上のプロセッサが実行するための１つ以上のプログラムを記憶するメモリとを有するコンピュータシステムにおいて
Ａ）電子形式の訓練データセットを取得するステップであって、該訓練データセットは、複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象について、以下を含む、ステップ
ａ）対応するトレーニング用複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンであって、それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）それぞれのトレーニング対象から得られた対応する生体試料におけるそれぞれの断片を含む１以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片における対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位がメチル化状態を含んで成るもの、及び
それぞれの訓練対象者の対象癌表示であって、対象癌状態が、第１の癌状態及び第２の癌状態のうちの１つである、対象癌表示
Ｂ）各複数の無細胞断片中の各無細胞断片を複数のビン中のビンにマッピングし、複数のビン中のそれぞれのビンがヒト参照ゲノムの対応する部分を表し、それによって無細胞断片の複数のトレーニングセットを得、無細胞断片の各トレーニングセットは複数のビン中の異なるビンにマッピングされること
Ｃ）無細胞断片の複数の訓練セットにおける無細胞断片の各訓練セット内のそれぞれの無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てることであって、無細胞断片癌状態は第１の癌状態及び第２の癌状態のいずれかである、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力する際の分類器の出力の関数として、無細胞断片癌状態を割り当てること
Ｄ）複数のビンのそれぞれのビンについて、（ａ）複数の訓練被験者のそれぞれの訓練被験者の癌状態と、（ｂ）それぞれのビンに対応する無細胞断片の対応する訓練セットのそれぞれの無細胞断片の癌状態との間の 関連性の対応する測定値Ｉを 決定し；そして
Ｅ）対象細胞源率を推定するための複数の特徴を複数のビンのサブセットとして特定するステップであって、複数のビンのサブセットにおけるそれぞれのそれぞれのビンが、それぞれのビンについての対応する関連性の尺度に基づく選択基準を満たす、ステップと、を含む。

【請求項2】

を含む手順により、被験者の細胞源分画を推定することをさらに含む、請求項１に記載の方法
試験用の複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンを電子的形態で取得することであって、それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）試験対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む一つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態を含んでなる、ことを特徴とする、取得すること。
複数のテスト用無細胞断片の各無細胞断片を複数のビン内のビンに対応付け、複数のテスト用無細胞断片のセットを取得し、各テスト用無細胞断片のセットは複数のビン内の異なるビンに対応付けされる。
無細胞断片の各テストセットにおけるそれぞれの無細胞断片の癌状態を、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力した際の分類器の出力の関数として割り当てること。
複数のビンのサブセットにわたる無細胞断片の各テストセットにおいて、第１の癌状態を割り当てられたテスト対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第１の尺度を計算すること。
複数のビンのサブセットにわたる無細胞断片の各テストセットにおけるテスト対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第２の尺度を計算すること；及び
中心傾向の第１の尺度および中心傾向の第２の尺度を用いて、被験者の細胞源分率を推定すること。

【請求項3】

第２の癌の状態が癌の非存在であり、被検者の細胞源画分が被検者の腫瘍画分を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

請求項１に記載の方法であって、前記分類器は、形式を有することを特徴とする方法。
[数1]
のうち、どちらかである。
[外]は、第一のがん状態に対する第一のモデルである。「フラグメント」は、それぞれの無細胞フラグメントのメチル化パターンを示す。[外]は、第２の癌の状態に関する第２のモデルであり
それぞれのフラグメントの無細胞化した癌の状態が閾値を満たす場合に、第一の癌の状態に割り当てられる。[外]閾値を満たす場合である。

【請求項5】

請求項４記載の方法において、閾値が１以上１０以下であることを特徴とする方法。

【請求項6】

閾値が１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記関連性の尺度Ｉが、以下のように計算される、請求項１に記載の方法。
[数2］
のうち、どちらかである。
ｉとｊは集合｛第一癌の状態、第二癌の状態｝に対する独立したインデックスである。
[外]は、複数の訓練対象者のうち、癌の状態ｉを有する訓練対象者の数である。
[外]は、複数の訓練被験者のうち、それぞれのビンに対応する１つ以上の無細胞断片を有し、癌状態ｊが割り当てられた訓練被験者の数である。
[数3］
は、複数の訓練被験者のうち、癌の状態ｉを有し、かつ癌の状態ｊを割り当てられたそれぞれのビンに対応する１つ以上の無細胞断片を有する訓練被験者の数であり、このような訓練被験者には、癌の状態ｊが割り当てられる。[外]は、複数の訓練用被写体における訓練用被写体の数である。[外]は[外]であり、かつ[外]は[外]である。

【請求項8】

前記関連性の尺度は、相関関係、相互情報の尺度、または距離メトリックである、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

関連性の尺度がピアソン相関係数である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

関連性の尺度が、調整相関係数、加重相関係数、反射相関係数、または尺度化相関係数である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

複数のビンは、１０００ビン以上１０万ビン以下からなる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

複数のビンが１５，０００ビン以上８０，０００ビン未満で構成される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

複数のビンのそれぞれのそれぞれのビンが、平均して、１０～１２００個の残基を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

複数のビンのそれぞれのそれぞれのビンが、平均して、１０～１００００個の残基を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

中心傾向の第１の測定値が、複数のビンのサブセットにわたる無細胞断片の各テストセットにおいて第１の癌条件を割り当てられた複数のテスト対象者からの無細胞断片の数の算術平均、加重平均、中位、三分平均、ウィンザー化平均、平均、又は最頻値である、請求項２に記載の方法。

【請求項16】

中心傾向の第２の尺度が、複数のビンのサブセットにわたる無細胞断片の各テストセットにおける複数のテスト対象からの無細胞断片の数の算術平均、加重平均、中位、三等分、ウィンソライズ平均、平均、又は最頻値である、請求項２に記載の方法。

【請求項17】

細胞源分率を推定することが、中心傾向の第１の測定値を中心傾向の第２の測定値で割ることを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項18】

前記複数の訓練対象は、１０個の訓練対象から１０００個の訓練対象からなる、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

選択基準は、関連性の上位Ｎ個の尺度のうちの１つを有するビンの選択を指定し、ここで、Ｎは５０以上の正の整数である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

Ｎが５００以上５０００以下である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

Ｎが８００から１５００の間である、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

メチル化配列決定がペアエンドシーケンスである、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

メチル化配列決定がシングルリード配列決定である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

対応するトレーニング用複数個の無細胞断片が、５００ヌクレオチド未満の平均長を有する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

第１の癌の状態が癌であり、第２の癌の状態が癌の非存在である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法であって
第一のがんは、副腎がん、胆道がん、膀胱がん、骨・骨髄がん、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝・胆道がん、腎臓がんのいずれかであること。肝臓がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、骨盤がん、胸膜がん、前立腺がん、腎臓がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫または白血病。
であり、第二の癌の条件は癌がないことである。

【請求項27】

請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法であって
前記第１の癌の状態は、副腎癌の病期、胆道癌の病期、膀胱癌の病期、骨・骨髄癌の病期、脳腫瘍の病期、乳癌の病期、子宮頸癌の病期、大腸癌の病期、食道癌の病期、胃癌の病期、頭・首のがんの病期、肝・胆道のがんの病期、腎癌の病期、肝がんの病期、等のいずれかである。肺がん、卵巣がん、膵臓がん、骨盤がん、胸膜がん、前立腺がん、腎臓がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、白血病のいずれかの病期である。
であり、第二の癌の条件は癌がないことである。

【請求項28】

メチル化シークエンスが全ゲノムメチル化シークエンスである、請求項１記載の方法。

【請求項29】

メチル化配列決定が、複数の核酸プローブを用いた標的配列決定であり、複数のビンの各ビンが、複数の核酸プローブ中の少なくとも１つの核酸プローブと関連付けられている、請求項１に記載の方法。

【請求項30】

複数の核酸プローブが、１，０００個以上の核酸プローブ、２，０００個以上の核酸プローブ、３，０００個以上の核酸プローブ、５，０００個以上の核酸プローブ、１０，０００個以上の核酸プローブまたは１，０００個以上３０，０００個以下の核酸プローブからなる、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

複数のビンの各ビンが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のＣｐＧ部位を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

複数のビンの各ビンが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続したＣｐＧサイトを含む、請求項１から２９までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

複数のビンの各ビンが、ヒト参照ゲノムにおける２～１００個の連続したＣｐＧ部位からなる、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

対応する生体試料が液体生体試料である、請求項１に記載の方法。

【請求項35】

対応する生体試料が血液試料である、請求項１に記載の方法。

【請求項36】

対応する生体試料が、訓練対象者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液からなる、請求項１記載の方法。

【請求項37】

対応する生体試料が、訓練対象者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、または腹膜液からなる、請求項１記載の方法。

【請求項38】

それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態が、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
メチル化シークエンスにより、それぞれのＣｐＧ部位がメチル化されていると判断された場合にメチル化される。
メチル化シークエンスによってそれぞれのＣｐＧ部位がメチル化されていないと判定された場合に、メチル化されていないこと、および
メチル化シークエンスにより、それぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態をメチル化または非メチル化として判定できない場合、「その他」のフラグが立てられる。

【請求項39】

メチル化配列決定が、それぞれの断片中の１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍＣ）および／または５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出する、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

メチル化配列決定が、それぞれの断片の配列リードにおける、１つ以上の非メチル化シトシンまたは１つ以上のメチル化シトシンを、対応する１つ以上のウラシルに変換することを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

請求項４０記載の方法であって、１つ以上のウラシルは、１つ以上の対応するチミンとしてメチル化配列決定中に検出される、方法。

【請求項42】

つ以上の非メチル化シトシンまたは１つ以上のメチル化シトシンの変換が、化学的変換、酵素的変換、またはそれらの組み合わせからなる、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

請求項４～４２のいずれか１項に記載の方法であって
前記第１のモデルは、第１の複数のサブモデルから構成される第１の混合モデルであることを特徴とする。
前記第２のモデルは、第２の複数のサブモデルからなる第２の混合モデルであり、
第１及び第２の複数の サブモデルにおける各サブモデルは、対応する生体試料中の無細胞断片の供給源に対する独立した対応するメチル化モデルを表す。

【請求項44】

各独立対応メチル化モデルが、二項モデル、β二項モデル、独立部位モデルまたはマルコフモデルのうちの１つである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

請求項４３に記載の方法であって、以下の通りである。
前記第１の複数のサブモデルにおける２つ以上のサブモデルは、独立したサイトモデルであり
前記第２の複数のサブモデルのうち、２つ以上のサブモデルは、独立したサイトモデルであることを特徴とする。

【請求項46】

マッピングＢ）の前に、複数の無細胞断片に１つ以上のフィルタ条件を適用することをさらに含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

請求項４６に記載の方法であって、以下の通りである。
前記１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、前記複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンにｐ値閾値を適用することであり、前記ｐ値閾値は、メチル化パターンが非癌被験者のコホートにおいて観察される頻度を代表するものである、前記フィルタ条件。

【請求項48】

ｐ値の閾値が０．００１と０．２０の間である、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

コホートが少なくとも２０人の被験者を含み、複数の無細胞断片が少なくとも１０，０００の異なる対応するメチル化パターンを含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項50】

複数の無細胞断片中のそれぞれの無細胞断片に対応するメチル化パターンが０．１０以下、０．０５以下、または０．０１以下のｐ値を有するとき、対象からのメチル化パターンについてｐ値の閾値を満たす、請求項４７に記載の方法。

【請求項51】

請求項４６に記載の方法であって、以下の通りである。
前記１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件とは、前記複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、対応する生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料から測定された対応する複数の配列読み取り値における閾値数の配列読み取り値によって表されるという条件を適用することである、請求項１に記載の方法。

【請求項52】

閾値の数値が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０と１００の間の整数である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

請求項４６に記載の方法であって、以下の通りである。
前記１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件とは、前記複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、対応する生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料中の無細胞核酸の閾値数によって表されるという条件を適用することである、請求項１に記載の方法。

【請求項54】

閾値の数値が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０と１００の間の整数である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

請求項４６に記載の方法であって、以下の通りである。
前記１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件とは、前記複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が閾値数のＣｐＧ部位を有するという条件を適用することである。

【請求項56】

ＣｐＧ部位の閾値の数が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ＣｐＧ部位である、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

請求項４６に記載の方法であって、以下の通りである。
前記１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、前記複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、閾値以下の塩基対の長さを有するという条件である、請求項１に記載の方法。

【請求項58】

閾値の塩基対の数が、長さ１，０００、２，０００、３，０００、または４，０００の連続した塩基対である、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

請求項２または３に記載の方法であって、該方法はさらに以下を含むことを特徴とする方法。
取得、マッピング、割り当て、第１及び第２の中心傾向の測定値の計算、並びにエポックにわたる複数の時点におけるそれぞれの時点における被験者の細胞源分率の推定を繰り返し、それによってそれぞれの時点における被験者の、複数の細胞源分率における対応する細胞源分率を取得し；及び
複数の細胞源分画を使用して、エポック期間中の被験者の疾患状態の状態または進行を、エポック期間中の第１の細胞源分画の増加または減少という形で決定すること。

【請求項60】

前記エポックは数ヶ月の期間であり、前記複数の時点の各時点は、前記数ヶ月の期間内の異なる時点である、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

ヶ月の期間が４ヶ月未満である、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記エポックは、年の期間であり、前記複数の時点の各時点は、前記年の期間内の異なる時点である、請求項５９に記載の方法。

【請求項63】

年の期間が２年以上１０年以下である、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記エポックは時間の期間であり、前記複数の時点の各時点は、前記時間の期間内の異なる時点である、請求項５９に記載の方法。

【請求項65】

時間の期間が１時間から６時間の間である、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

請求項５９～６５のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は、前記被験者の第１の細胞源割合が前記エポックにわたって閾値だけ変化することが観察された場合に、前記被験者の診断を変更することをさらに含む、方法。

【請求項67】

被験者の第１の細胞源分率がエポックにわたって閾値だけ変化することが観察された場合に、被験者の予後を変更することをさらに含む、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

被験者の第１の細胞源分率がエポックにわたって閾値だけ変化することが観察されたときに、被験者の治療を変更することをさらに含む、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

閾値が、１０％より大きい、２０％より大きい、３０％より大きい、４０％より大きい、５０％より大きい、２倍より大きい、３倍より大きい、または５倍より大きい、請求項６６～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

被験体の腫瘍分画が０．００３～１．０である、請求項５９～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

請求項２または３に記載の方法であって、該方法はさらに以下を含むことを特徴とする方法。
被験者の細胞源分画の値に少なくとも部分的に基づいて、被験者に 治療レジメンを適用すること。

【請求項72】

治療レジメンが、癌のための薬剤を被験者に適用することを含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

癌のための薬剤が、ホルモン、免疫療法、放射線療法、または抗癌剤である、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

癌のための薬剤が、レナリドミド、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス４価（６、１１、１６、および１８型）ワクチンである、請求項７２に記載の方法。ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、プロマクタ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ボルテゾミブ又はそれらの後発品。

【請求項75】

被験者が癌のための薬剤で治療されており、該方法はさらに以下を含む、請求項２または３に記載の方法。
被験者の細胞源分画を使用して、被験者の癌治療薬に対する反応を評価すること。

【請求項76】

癌のための薬剤が、ホルモン、免疫療法、放射線療法、または抗癌剤である、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

癌のための薬剤が、レナリドミド、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス４価（６、１１、１６、および１８型）ワクチン、である、請求項７５に記載の方法。ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、プロマクタ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ボルテゾミブ又はそれらの後発品。

【請求項78】

被験者が癌のための薬剤で治療されており、該方法はさらに以下を含む、請求項２または３に記載の方法。
被験者の細胞源分画を使用して、被験者の癌に対する薬剤を強化するか中止するかを決定すること。

【請求項79】

被験体が、癌に対処するための外科的介入を受けており、該方法は、さらに以下を含む、請求項２または３に記載の方法。
被験者の細胞源分画を使用して、外科的介入に対応する被験者の状態を評価すること。

【請求項80】

複数のビンのビンが、国際公開番号ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４、国際公開番号ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２のリスト１～１６、及び／又は国際公開番号ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１のリスト１～８の１つ以上に記載されているゲノム領域に対応する、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

複数のビンのビンが、国際公開番号ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４、国際公開番号ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２のリスト１～１６、及び／又は国際公開番号ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１のリスト１～８の１つ以上に記載されているゲノム領域の少なくとも３０％にマッピングする、請求項１～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

複数のビンのビンが、国際公開番号ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４、国際公開番号ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２のリスト１～１６、及び／又は国際公開番号ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１のリスト１～８の１つ以上に記載のゲノム領域の少なくとも５０～９５％にマップする、請求項１～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

複数のビンのビンが、国際公開番号ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４、国際公開番号ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２のリスト１～１６、及び／又は国際公開番号ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１のリスト１～８の１つ以上における１～１０の固有の対応ゲノム領域にマッピングする、請求項１～８２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

複数のビンの各ビンが、国際公開番号ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４、国際公開番号ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２のリスト１～１６、及び／又は国際公開番号ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１のリスト１～８の１つ以上における単一の固有の対応ゲノム領域にマッピングする、請求項１～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象について、前記訓練用の複数の無細胞断片が、少なくとも１００，０００個の無細胞断片を含む、請求項１～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象について、前記訓練用の複数の無細胞断片が、少なくとも１００，０００個の無細胞断片を含む、請求項１～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象について、前記訓練用の複数の無細胞断片が、少なくとも１００万個の無細胞断片を含む、請求項１～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

複数のビンの各ビンが、１００未満の核酸残基、５００未満の核酸残基、１０００未満の核酸残基、２５００未満の核酸残基、５０００未満の核酸残基からなる、請求項１～８７のいずれか一項に記載の方法。１万個以下、２万５千個以下、５万個以下、１０万個以下、２５万個以下、５０万個以下の核酸残基。

【請求項89】

被験者の細胞源率を推定するための複数の特徴を特定するためのコンピュータシステムであって、該コンピュータシステムは、以下を備える、コンピュータシステム。
１つまたは複数のプロセッサ；および
メモリであって、該メモリは、該１つ以上のプロセッサによって実行されるための１つ以上のプログラムを格納し、該１つ以上のプログラムは、以下のための命令を含む、メモリ。
Ａ）電子形式の訓練データセットを取得するステップであって、該訓練データセットは、複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象について、以下を含む、ステップ。
ａ）対応するトレーニング用複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンであって、それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）それぞれのトレーニング対象から得られた対応する生体試料におけるそれぞれの断片を含む１以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片における対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位がメチル化状態を含んで成るもの、及び
ｂ）それぞれの訓練対象者の対象癌表示であって、対象癌状態が、第１の癌状態及び第２の癌状態のうちの１つである、対象癌表示。
Ｂ）各複数の無細胞断片中の各無細胞断片を複数のビン中のビンにマッピングし、複数のビン中のそれぞれのビンがヒト参照ゲノムの対応する部分を表し、それによって無細胞断片の複数のトレーニングセットを得、無細胞断片の各トレーニングセットが複数のビン中の異なるビンにマッピングされること。
Ｃ）無細胞断片の複数の訓練セットにおける無細胞断片の各訓練セット内のそれぞれの無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てることであって、無細胞断片癌状態は第１の癌状態及び第２の癌状態のいずれかである、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力する際の分類器の出力の関数として、無細胞断片癌状態を割り当てること。
Ｄ）複数のビンのそれぞれのビンについて、（ａ）複数の訓練被験者のそれぞれの訓練被験者の癌状態と、（ｂ）それぞれのビンに対応する無細胞断片の対応する訓練セットのそれぞれの無細胞断片の癌状態との間の 関連性の対応する測定値Ｉを 決定し；そして
Ｅ）対象細胞源率を推定するための複数の特徴を複数のビンのサブセットとして特定するステップであって、複数のビンのサブセットにおけるそれぞれのそれぞれのビンが、それぞれのビンについての対応する関連性の尺度に基づく選択基準を満たす、ステップと、を含む。

【請求項90】

プロセッサによって実行されると、対象細胞源率を推定するための複数の特徴を特定するための方法をプロセッサに実行させるプログラムコード命令をその上に格納した非一時的コンピュータ可読記憶媒体であって、該方法は、以下を含むことを特徴とする非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
Ａ）電子形式の訓練データセットを取得するステップであって、該訓練データセットは、複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象について、以下を含む、ステップ。
ａ）対応するトレーニング用複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンであって、それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）それぞれのトレーニング対象から得られた対応する生体試料におけるそれぞれの断片を含む１以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片における対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位がメチル化状態を含んで成るもの、及び
ｂ）それぞれの訓練対象者の対象癌表示であって、対象癌状態が、第１の癌状態及び第２の癌状態のうちの１つである、対象癌表示。
Ｂ）各複数の無細胞断片中の各無細胞断片を複数のビン中のビンにマッピングし、複数のビン中のそれぞれのビンがヒト参照ゲノムの対応する部分を表し、それによって無細胞断片の複数のトレーニングセットを得、無細胞断片の各トレーニングセットは複数のビン中の異なるビンにマッピングされること。
Ｃ）無細胞断片の複数の訓練セットにおける無細胞断片の各訓練セット内のそれぞれの無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てることであって、無細胞断片癌状態は第１の癌状態及び第２の癌状態のいずれかである、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力する際の分類器の出力の関数として、無細胞断片癌状態を割り当てること。
Ｄ）複数のビンのそれぞれのビンについて、（ａ）複数の訓練被験者のそれぞれの訓練被験者の癌状態と、（ｂ）それぞれのビンに対応する無細胞断片の対応する訓練セットのそれぞれの無細胞断片の癌状態との間の 関連性の対応する測定値Ｉを 決定し；そして
Ｅ）対象細胞源率を推定するための複数の特徴を複数のビンのサブセットとして特定するステップであって、複数のビンのサブセットにおけるそれぞれのそれぞれのビンが、それぞれのビンについての対応する関連性の尺度に基づく選択基準を満足する、ステップ。

【請求項91】

被験者の細胞源分画を推定する方法であって、該方法は、以下を含む。
１つ以上のプロセッサと、前記１つ以上のプロセッサが実行するための１つ以上のプログラムを記憶するメモリとを有するコンピュータシステムにおいて
複数の無細胞断片中のそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンを電子的形態で取得することであって、それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む１以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位中の各ＣｐＧ部位のメチル化状態からなる、取得すること。
複数の無細胞断片の各無細胞断片を複数のビンの中のビンに対応付け、それによって複数の無細胞断片のセットを得、無細胞断片の各セットは複数のビンの中の異なるビンに対応付けられる。
複数の無細胞断片の集合における各無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てること（ここで、無細胞断片癌状態は、第１の癌状態及び第２の癌状態のうちの１つであり、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力する際の分類器の出力の関数として、無細胞断片癌状態は、複数の無細胞断片の集合における各無細胞断片の集合に割り当てる）。
複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて、第１の癌状態が割り当てられた対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第１の尺度を計算すること。
複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおける対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第２の尺度を計算すること及び
中心傾向の第１の尺度および中心傾向の第２の尺度を用いて、被験者の細胞源分率を推定すること。

【請求項92】

複数のビンが１０００ビンから１０００００ビンの間で構成される、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

複数のビンが１５，０００ビンから８０，０００ビンの間で構成される、請求項９１に記載の方法。

【請求項94】

複数のビンのそれぞれのそれぞれのビンが、平均して、１０～１２００個の残基を有する、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

複数のビンのそれぞれのそれぞれのビンが、平均して、１０～１００００個の残基を有する、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

中心傾向の第１の測定値が、複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて第１の癌状態を割り当てられた対象からの無細胞断片の数の算術平均、加重平均、中位、三等分、Ｗｉｎｓｏｒｉｚｅｄ平均、平均、又は最頻値である、請求項９１～９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

中心傾向の第２の尺度が、複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおける対象からの無細胞断片の数の算術平均、加重平均、中位、中位、トリミン、ウィンソライズ平均、平均、または最頻値である、請求項９１～９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

細胞源分率を推定することが、中心傾向の第１の測定値を中心傾向の第２の測定値で割ることを含む、請求項９１～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

メチル化配列決定がペアエンドシーケンスである、請求項９１～９８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項100】

メチル化配列決定がシングルリード配列決定である、請求項９１～９８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項101】

複数の無細胞断片中の各無細胞断片が５００ヌクレオチド未満の平均長を有する、請求項９１～１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

第１の癌の状態が癌であり、第２の癌の状態が癌の非存在である、請求項９１～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

請求項９１～１０２のいずれか１項に記載の方法であって
第一のがんは、副腎がん、胆道がん、膀胱がん、骨・骨髄がん、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝・胆道がん、腎臓がんのいずれかであること。肝臓がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、骨盤がん、胸膜がん、前立腺がん、腎臓がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫または白血病
であり、第二の癌の条件は癌がないことである。

【請求項104】

請求項９１～１０２のいずれか１項に記載の方法であって、
前記第１の癌の状態は、副腎癌の病期、胆道癌の病期、膀胱癌の病期、骨・骨髄癌の病期、脳腫瘍の病期、乳癌の病期、子宮頸癌の病期、大腸癌の病期、食道癌の病期、胃癌の病期、頭・首のがんの病期、肝・胆道のがんの病期、腎癌の病期、肝がんの病期、等のいずれかである。肺がん、卵巣がん、膵臓がん、骨盤がん、胸膜がん、前立腺がん、腎臓がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、白血病のいずれかの病期であり、第二の癌の条件は癌がないことである。

【請求項105】

メチル化配列決定が全ゲノムメチル化配列決定である、請求項９１に記載の方法。

【請求項106】

メチル化配列決定が、複数の核酸プローブを用いた標的配列決定であり、複数のビンにおけるそれぞれのビンが、複数の核酸プローブにおける少なくとも１つの対応する核酸プローブと関連付けられる、請求項９１に記載の方法。

【請求項107】

複数の核酸プローブが、１，０００以上の核酸プローブ、２，０００以上の核酸プローブ、３，０００以上の核酸プローブ、５，０００以上の核酸プローブ、１０，０００以上の核酸プローブまたは１，０００核酸プローブ以上３０，０００核酸プローブ以下からなる、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

複数のビンの各ビンが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のＣｐＧ部位を含む、請求項９１～１０７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項109】

複数のビンの各ビンが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続したＣｐＧサイトを含む、請求項９１～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

複数のビンの各ビンが、ヒト参照ゲノムにおける２～１００個の連続したＣｐＧ部位からなる、請求項９１～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

生体試料が液体生体試料である、請求項９１～１１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項112】

生体試料が血液試料である、請求項９１～１１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項113】

生体試料が、被験者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液からなる、請求項９１～１１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項114】

生体試料が、被験者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、または腹膜液からなる、請求項９１～１１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項115】

それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態が、請求項９１～１１４のいずれか一項に記載の方法。
メチル化シークエンスにより、それぞれのＣｐＧ部位がメチル化されていると判断された場合にメチル化される。
メチル化シークエンスによってそれぞれのＣｐＧ部位がメチル化されていないと判定された場合に、メチル化されていないこと、および
メチル化シークエンスにより、それぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態をメチル化または非メチル化として判定できない場合、「その他」のフラグが立てられる。

【請求項116】

メチル化配列決定が、それぞれの断片中の１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍＣ）および／または５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出する、請求項９１～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

メチル化配列決定が、それぞれの断片の配列リードにおける、１つ以上の非メチル化シトシンまたは１つ以上のメチル化シトシンを、対応する１つ以上のウラシルに変換することを含む、請求項９１～１１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記１つまたは複数のウラシルは、前記メチル化配列決定中に、１つまたは複数の対応するチミンとして検出される、請求項１１７に記載の方法。

【請求項119】

つ以上の非メチル化シトシンまたは１つ以上のメチル化シトシンの変換が、化学的変換、酵素的変換、またはそれらの組み合わせからなる、請求項１１７に記載の方法。

【請求項120】

請求項９１～１１９のいずれか１項に記載の方法であって、
無細胞断片状態を割り当てるために使用される分類器は、第１の癌状態に対する第１のモデルと、第２の癌状態に対する第２のモデルとを備え、ここで前記第１のモデルは、第１の複数のサブモデルからなる第１の混合モデルであり、
前記第２のモデルは、第２の複数のサブモデルからなる第２の混合モデルであり
第１及び第２の複数のサブモデルにおける各サブモデルは、対応する生体試料中の無細胞断片の供給源に対する 独立した対応するメチル化モデルを表す。

【請求項121】

各独立対応メチル化モデルが、二項モデル、ベータ二項モデル、独立部位モデルまたはマルコフモデルのうちの１つである、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

請求項１２０に記載の方法であって、以下の通りである。
前記第１の複数のサブモデルにおける２つ以上のサブモデルは、独立したサイトモデルであり、
前記第２の複数のサブモデルのうち、２つ以上のサブモデルは、独立したサイトモデルであることを特徴とする。

【請求項123】

マッピングＢ）の前に、複数の無細胞断片に１つ以上のフィルタ条件を適用することをさらに含む、請求項９１～１２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項124】

請求項１２３に記載の方法であって、以下の通りである。
前記１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、前記複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンにｐ値閾値を適用することであり、前記ｐ値閾値は、メチル化パターンが非癌被験者のコホートにおいて観察される頻度を代表するものである、前記フィルタ条件。

【請求項125】

ｐ値の閾値が０．００１と０．２０の間である、請求項１２４に記載の方法。

【請求項126】

コホートが少なくとも２０人の被験者を含み、複数の無細胞断片が少なくとも１０，０００の異なる対応するメチル化パターンを含む、請求項１２４に記載の方法。

【請求項127】

複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片に対応するメチル化パターンが０．１０以下、０．０５以下、または０．０１以下のｐ値を有するとき、対象からのメチル化パターンについてｐ値の閾値を満たす、請求項１２４に記載の方法。

【請求項128】

請求項１２３に記載の方法であって、以下の通りである。
前記１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件とは、前記複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、対応する生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料から測定された対応する複数の配列読み取り値における閾値数の配列読み取り値によって表されるという条件を適用することである。

【請求項129】

前記閾値の数値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０と１００の間の整数であることを特徴とする請求項１２８に記載の方法。

【請求項130】

請求項１２３に記載の方法であって、以下の通りである。
前記１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件とは、前記複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、対応する生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料中の無細胞核酸の閾値数によって表されるという条件を適用することである、請求項１に記載の方法。

【請求項131】

前記閾値の数値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０と１００との間の整数である、請求項１３０に記載の方法。

【請求項132】

請求項１２３に記載の方法であって、以下の通りである。
前記１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件とは、前記複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が閾値数のＣｐＧ部位を有するという条件を適用することである。

【請求項133】

ＣｐＧ部位の閾値の数が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ＣｐＧ部位である、請求項１３２に記載の方法。

【請求項134】

請求項１２３に記載の方法であって、以下の通りである。
前記１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、前記複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、閾値以下の塩基対の長さを有するという条件である、請求項１に記載の方法。

【請求項135】

閾値の塩基対の数が、長さ１，０００、２，０００、３，０００、または４，０００の連続した塩基対である、請求項１３５に記載の方法。

【請求項136】

請求項９１～１３５のいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、さらに以下を含む。
被験者の細胞源分画の値に少なくとも部分的に基づいて、被験者に治療レジメンを適用すること。

【請求項137】

治療レジメンが、被験者に癌のための薬剤を適用することを含む、請求項１３６に記載の方法。

【請求項138】

癌のための薬剤が、ホルモン、免疫療法、放射線療法、または癌治療薬である、請求項１３７に記載の方法。

【請求項139】

癌のための薬剤が、レナリドミド、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス４価（６、１１、１６、及び１８型）ワクチンである、請求項１３７に記載の方法。ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、プロマクタ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ボルテゾミブ又はそれらの後発品。

【請求項140】

対象が癌のための薬剤で治療されており、本方法はさらに以下を含む、請求項９１～１３５のいずれか１項に記載の方法。
被験者の細胞源分画を使用して、癌治療薬に対する被験者の応答を評価すること。

【請求項141】

癌のための薬剤が、ホルモン、免疫療法、放射線療法、または癌治療薬である、請求項１４０に記載の方法。

【請求項142】

癌のための薬剤が、レナリドミド、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス４価（６、１１、１６、および１８型）ワクチンである、請求項１４０に記載の方法。ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、プロマクタ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ボルテゾミブ又はそれらの後発品。

【請求項143】

対象が癌のための薬剤で治療されており、本方法はさらに以下を含む、請求項９１～１３５のいずれか１項に記載の方法。
被験者の 細胞源分画を使用して、被験者の癌のための薬剤を強化するか中止するかを決定すること。

【請求項144】

対象が、癌に対処するための外科的介入を受けており、該方法はさらに以下を含む、請求項９１～１３５のいずれか一項に記載の方法。
被験者の細胞源分画を使用して、外科的介入に対応する被験者の状態を評価すること。

【請求項145】

請求項９１～１４４のいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、さらに以下を含む。
取得、マッピング、割り当て、第１及び第２の中心傾向の測定値の計算、並びにエポックにわたる複数の時点におけるそれぞれの時点における被験者の細胞源分画の推定を 繰り返し、それによってそれぞれの時点における被験者の、複数の細胞源分画における対応する細胞源分画を取得し；及び
複数の細胞源分画を使用して、エポック期間中の被験者の疾患状態の状態または進行を、エポック期間中の第１の細胞源分画の増加または減少という形で決定すること。

【請求項146】

前記エポックは数ヶ月の期間であり、前記複数の時点における各時点は、前記数ヶ月の期間における異なる時点である、請求項１４５に記載の方法。

【請求項147】

ヶ月の期間が４ヶ月未満である、請求項１４６に記載の方法。

【請求項148】

前記エポックは、年の期間であり、前記複数の時点における各時点は、前記年の期間における異なる時点である、請求項１４５に記載の方法。

【請求項149】

年の期間が２年以上１０年以下である、請求項１４８に記載の方法。

【請求項150】

前記エポックは時間の期間であり、前記複数の時点の各時点は、前記時間の期間内の異なる時点である、請求項１４５に記載の方法。

【請求項151】

時間の期間が１時間から６時間の間である、請求項１５０に記載の方法。

【請求項152】

請求項１４５に記載の方法であって、前記方法は、前記被験者の第１の細胞源分率が前記エポックにわたって閾値だけ変化することが観察される場合に、前記被験者の診断を変更することをさらに含む、方法。

【請求項153】

前記対象の第１の細胞源分率が、前記エポックにわたって閾値だけ変化することが観察される場合に、前記対象の予後を変更することをさらに含む、請求項１４５に記載の方法。

【請求項154】

被験者の第１の細胞源分率がエポックにわたって閾値だけ変化することが観察される場合に、被験者の治療を変更することを更に含む、請求項１４５に記載の方法。

【請求項155】

閾値が、１０％より大きい、２０％より大きい、３０％より大きい、４０％より大きい、５０％より大きい、２倍より大きい、３倍より大きい、または５倍より大きい、請求項１５２、１５３、または１５４に記載の方法。

【請求項156】

細胞源画分が腫瘍画分である、請求項１～１５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項157】

腫瘍分画が０．００３～１．０である、請求項１５６に記載の方法。

【請求項158】

複数のビンのビンが、国際公開番号ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４、国際公開番号ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２のリスト１～１６、及び／又は国際公開番号ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１のリスト１～８の１つ以上に記載されたゲノム領域に対応する、請求項９１～１５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項159】

複数のビンのビンが、国際公開番号ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４、国際公開番号ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２のリスト１～１６、及び／又は国際公開番号ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１のリスト１～８の１つ以上に記載のゲノム領域の少なくとも３０％にマップする、請求項９１～１５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項160】

複数のビンのビンが、国際公開番号ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４、国際公開番号ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２のリスト１～１６、及び／又は国際公開番号ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１のリスト１～８の１つ以上に記載されているゲノム領域の少なくとも５０～９５％にマッピングする、請求項９１～１５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項161】

複数のビンのビンが、国際公開番号ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４、国際公開番号ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２のリスト１～１６、及び／又は国際公開番号ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１のリスト１～８の１以上の中の１～１０の固有の対応ゲノム領域にマッピングする、請求項９１～１６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項162】

複数のビンの各ビンが、国際公開番号ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４、国際公開番号ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２のリスト１～１６、及び／又は国際公開番号ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１のリスト１～８の１つ以上における単一の固有の対応ゲノム領域にマッピングする、請求項９１～１６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項163】

対象について、複数の無細胞断片が、少なくとも１００，０００個の無細胞断片を含む、請求項９１～１６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項164】

対象について、複数の無細胞断片が、少なくとも５００，０００個の無細胞断片を含む、請求項９１～１６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項165】

対象について、複数の無細胞断片が、少なくとも１００万個の無細胞断片を含む、請求項９１～１６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項166】

複数のビンの各ビンが、１００未満の核酸残基、５００未満の核酸残基、１０００未満の核酸残基、２５００未満の核酸残基、５０００未満の核酸残基からなる、請求項９１～１６５のいずれか一項に記載の方法。１万個以下、２万５千個以下、５万個以下、１０万個以下、２５万個以下、５０万個以下の核酸残基。

【請求項167】

被験者の細胞源率を推定するためのコンピュータシステムであって、該コンピュータシステムは、以下を備える、コンピュータシステム。
１つまたは複数のプロセッサおよび、
メモリであって、該メモリは、該１つ以上のプロセッサによって実行されるための１つ以上のプログラムを格納し、該１つ以上のプログラムは、以下のための命令を含む、メモリ。
複数の無細胞断片中のそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンを電子的形態で取得することであって、それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む一つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位中のそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態からなる、取得すること
複数の無細胞断片の各無細胞断片を複数のビンの中のビンに対応付け、それによって複数の無細胞断片のセットを得、無細胞断片の各セットは複数のビンの中の異なるビンに対応付けられる。
複数の無細胞断片の集合における各無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てること （ここで、無細胞断片癌状態は、第１の癌状態及び第２の癌状態のうちの１つである）、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力したときの分類器の出力の関数として、分類すること
複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて、第１の癌状態が割り当てられた対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第１の尺度を計算すること。
複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおける対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第２の尺度を計算すること及び
中心傾向の第１の尺度および中心傾向の第２の尺度を用いて、被験者の細胞源分率を推定すること。

【請求項168】

プロセッサによって実行されると、プロセッサに、被験者の細胞源率を推定する方法を実行させるプログラムコード命令をその上に格納した、非一時的コンピュータ可読記憶媒体であって、該方法は、以下を含む、非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
複数の無細胞断片中のそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンを電子的形態で取得することであって、それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む１以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位中の各ＣｐＧ部位のメチル化状態からなる、取得すること。
複数の無細胞断片の各無細胞断片を複数のビンの中のビンに対応付け、それによって複数の無細胞断片のセットを得、無細胞断片の各セットは複数のビンの中の異なるビンに対応付けられる。
複数の無細胞断片の集合における各無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てること（ここで、無細胞断片癌状態は、第１の癌状態及び第２の癌状態のうちの１つであり、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力する際の分類器の出力の関数として、無細胞断片癌状態は、複数の無細胞断片の集合における各無細胞断片の集合に割り当てる）。
複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて、第１の癌状態が割り当てられた対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第１の尺度を計算すること、
複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおける対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第２の尺度を計算すること
及び中心傾向の第１の尺度および中心傾向の第２の尺度を用いて、被験者の細胞源分率を推定すること。

【発明の詳細な説明】

【関連出願との相互参照】

【0001】

本出願は、２０１９年１２月１８日に出願された「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｓｏｕｒｃｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」と題する米国仮特許出願第６２／９５０，０７１号の優先権を主張し、その内容はすべての目的のために参照によりその全体が組み込まれるものとする。

【技術分野】

【0002】

本明細書は、被験者の核酸、特に無細胞核酸試料を使用して、被験者から得られた生体試料中の細胞源分画、例えば腫瘍分画を推定することを説明する。

【背景技術】

【0003】

がんの分子基盤に関する知識の増加と次世代シーケンサー技術の急速な発展により、体液中のがん発生に関与する初期の分子変化の研究が進んでいる。次世代シーケンサー（ＮＧＳ）などの大規模なシーケンサー技術により、１００万塩基あたり１米ドル以下、実際には１０米ドルセント以下のコストでシーケンサーを実現する機会が得られている。血漿、血清、尿中の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）には、こうしたがんの発生に関連する特定の遺伝子やエピジェネティックな変化が見いだされる。このような変化は、いくつかのクラスのがんの診断バイオマーカーとして利用できる可能性がある（Ｓａｌｖｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｏｎｃｏ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ． ９：６５４９－６５５９を参照）。

【0004】

無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、血清、血漿、尿、および他の体液（Ｃｈａｎら、２００３， Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０（Ｐｔ ２）：１２２－１３０）、特定の疾患の循環像である「リキッドバイオプシー」を表する（Ｄｅ Ｍａｔｔｏｓ－Ａｒｒｕｄａ ａｎｄ Ｃａｌｄａｓ， ２０１６， Ｍｏｌ Ｏｎｃｏｌ．１０（３）：４６４－４７４）．これは、さまざまながんをスクリーニングするための非侵襲的な方法の可能性を表している。

【0005】

ｃｆＤＮＡの存在は、数十年前にＭａｎｄｅｌとＭｅｔａｉｓによって証明された（Ｍａｎｄｅｌ ａｎｄ Ｍｅｔａｉｓ， １９４８， Ｃ Ｒ Ｓｅａｎｃｅｓ Ｓｏｃ Ｂｉｏｌ Ｆｉｌ．ｃｆＤＮＡは、壊死した細胞やアポトーシス細胞に由来し、一般にあらゆる種類の細胞から放出される。Ｓｔｒｏｕｎらはさらに、患者のｃｆＤＮＡに特定の癌の変化が見られることを示した（参照、Ｓｔｒｏｕｎら、１９８９ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １９８９ ４６（５）：３１８－３２２）。その後の多くの論文で、ｃｆＤＮＡには変異、メチル化、コピー数変異（ＣＮＶ）などの特定の腫瘍関連変化が含まれていることが確認され、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の存在が確認された（参照、Ｇｏｅｓｌら、２０００ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０（２１）：５９４１－５９４５ およびＦｒｅｎｅｌら、２０１５ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２１（２０）：４５８６－４５９６）。

【0006】

血漿や血清中のｃｆＤＮＡはよく特徴づけられているが、尿中ｃｆＤＮＡ（ｕｃｆＤＮＡ）は従来、あまり特徴づけられていなかった。しかし、最近の研究では、ｕｃｆＤＮＡも有望なバイオマーカーの供給源となり得ることが実証されている（例えば、Ｃａｓａｄｉｏ ｅｔ ａｌ．３１（８）：１７４４－１７５０）．

【0007】

血液では、アポトーシスがｃｆＤＮＡの量を決定する頻度の高いイベントである。しかし、がん患者では、ｃｆＤＮＡの量はネクローシスによっても影響を受けるようである（Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１１（８）：１４８２－１４８９ ａｎｄ Ｚｏｎｔａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５ Ａｄｖ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．７０：１９７－２４６）．アポトーシスが主な放出メカニズムであると思われるので、循環ｃｆＤＮＡは、約１６７塩基対の短い断片に富むことを明らかにするサイズ分布を有する（参照、Ｈｅｉｔｚｅｒら、２０１５、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．６１（１）：１１２－１２３ および Ｌｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２（６１）：６１ｒａ９１）、アポトーシス細胞によって生成されたヌクレオソームに対応する。

【0008】

血清および血漿中の循環ｃｆＤＮＡの量は、健常対照者よりも腫瘍患者で、特に早期腫瘍よりも進行期腫瘍の患者で有意に高いようである（参照、Ｓｏｚｚｉら、２００３、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２１（２１）：３９０２－３９０８、Ｋｉｍら、２０１４、Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｓ． ８６（３）：１３６－１４２； およびＳｈａｏら、２０１５、Ｏｎｃｏｌ Ｌｅｔｔ．１０（６）：３４７８－３４８２）．循環ｃｆＤＮＡの量の変動は、健常者よりも癌患者で高い、（参照、Ｈｅｉｔｚｅｒら、２０１３、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１３３（２）：３４６－３５６参照）、循環ｃｆＤＮＡの量は、炎症性疾患を含むいくつかの生理的及び病理的条件によって影響を受ける（参照、Ｒａｐｔｉｓ ａｎｄ Ｍｅｎａｒｄ， １９８０， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．６６（６）：１３９１－１３９９、およびＳｈａｐｉｒｏら ， １９８３， Ｃａｎｃｅｒ ５１（１１）：２１１６－２１２０ を参照されたい）。

【0009】

メチル化の状態および他のエピジェネティック修飾は、癌などのいくつかの疾患状態の存在と相関することが知られている（Ｊｏｎｅｓ， ２００２， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１：５３５８－５３６０を参照）。さらに、メチル化の特定のパターンは、特定の癌の状態と関連することが決定されている（ＰａｓｋａおよびＨｕｄｌｅｒ、２０１５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ Ｍｅｄｉｃａ ２５（２）：１６１－１７６を参照のこと）。ＷａｒｔｏｎとＳａｍｉｍｉは、メチル化パターンが無細胞ＤＮＡでも観察できることを実証した（Ｗａｒｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｍｉｍｉ， ２０１５， Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｃｉ， ２（１３） ｄｏｉ： １０．３３８９／ｆｍｏｌｂ．２０１５．０００１３ ）。

【0010】

循環ｃｆＤＮＡ、ならびに他の形式の遺伝子型データが診断指標として有望であることを考えると、エピジェネティックなパターンを特定するためにそのようなデータを評価する方法が当技術分野で必要とされている。

【発明の概要】

【0011】

本開示は、ｃｆＤＮＡを用いて被験者から得られた生体試料中の腫瘍分画などの細胞源分画を決定するための堅牢な技術を提供することにより、背景において特定された欠点に対処するものである。メチル化データと全ゲノム、または標的ゲノムシーケンスデータとの組み合わせは、従来のスクリーニング方法を超える追加の診断力を提供する。

【0012】

データセットの分析に関する上記の特定された問題に対処するための技術的解決策（例えば、コンピューティングシステム、方法、及び非一時的コンピュータ可読記憶媒体）が、本開示において提供される。

【0013】

以下は、本発明のいくつかの態様の基本的な理解を提供するために、本発明の概要を示すものである。この要約は、本発明の広範な概要ではない。また、本発明の重要な／重要な要素を特定したり、本発明の範囲を明確にしたりすることを意図したものでもない。その唯一の目的は、後に提示されるより詳細な説明の前段階として、本発明の概念のいくつかを簡略化して提示することである。

【0014】

Ａ．各ビンにおける癌由来フラグメントの比率によって特定されるビンのサブセットに少なくとも部分的に基づいて、細胞源率を推定する実施形態。

【0015】

本開示の一態様は、対象細胞源率を推定するための複数の特徴を特定する方法を提供する。本方法は、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサによる実行のための１つ以上のプログラムを記憶するメモリとを有するコンピュータシステムにおいて、電子形式で、トレーニングデータセットを取得することを備える。前記トレーニングデータセットは、複数のトレーニング対象におけるそれぞれのトレーニング対象について、ａ）対応するトレーニング用の複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターン、及びｂ）それぞれのトレーニング対象の対象癌表示、を含むことを特徴とする、トレーニングデータセット。それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）それぞれの訓練対象者から得られた対応する生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態からなる。前記被験者の癌の状態は、第１の癌の状態及び第２の癌の状態のうちの１つである、ことを特徴とする。本方法は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片を、複数のビンにおけるビンにマッピングすることをさらに含む。ここで、複数のビンにおけるそれぞれのビンは、ヒト参照ゲノムの対応する部分を表し、それによって、無細胞断片の複数のトレーニングセットを得、無細胞断片の各トレーニングセットは、複数のビンにおける異なるビンにマッピングされる。本方法は、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力する際に、分類器の出力の関数として、無細胞断片の複数のトレーニングセット中のそれぞれの無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てることをさらに含む。無細胞断片の癌の状態は、第１の癌の状態及び第２の癌の状態のうちの１つであり、無細胞断片の癌の状態は、第１の癌の状態及び第２の癌の状態のうちの１つである。本方法は、複数のビンにおけるそれぞれのビンについて、（ａ）複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象の対象癌状態と、（ｂ）それぞれのビンにマッピングされる無細胞断片の対応する訓練セットにおけるそれぞれの無細胞断片の無細胞断片癌状態との間の関連性の対応尺度を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この関連付けの方法は、相関計算である。いくつかの実施形態では、この関連付けの方法は、相互情報計算である。いくつかの実施形態では、この関連付けの方法は、距離メトリック（例えば、マンハッタン距離、最大値、正規化ユークリッド距離、正規化マンハッタン距離、ダイス係数、コサイン距離又はジャカール係数等）を計算する方法によるものである。本方法は、対象細胞源率を推定するための複数の特徴を、複数のビンのサブセットとして特定することによって継続する。複数のビンのサブセットにおけるそれぞれのそれぞれのビンは、それぞれのビンについての対応する関連性の尺度に基づく選択基準を満足する。例えば、いくつかの実施形態では、他の全てのビンに対する関連性の尺度がトップランクであるそれらのビンは、選択基準を満たすとみなされる。

【0016】

いくつかの実施形態において、方法は、試験用複数の無細胞断片中のそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンを電子的形態で得ることを含む手順によって、試験対象についての細胞源分画を推定することをさらに含む。それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）被験体から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態を含んでなる。複数の無細胞断片のテストにおける各無細胞断片は、複数のビンにおけるビンにマッピングされ、それによって、無細胞断片の複数のテストセットが得られ、無細胞断片の各テストセットは、複数のビンにおける異なるビンにマッピングされる。無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力したときの分類器の出力の関数として、複数の無細胞断片のテストセット中のそれぞれの無細胞断片に対して無細胞断片癌状態が割り当てられる。無細胞断片の数の中心傾向の第１の測定値は、複数のビンのサブセットにわたる無細胞断片の各テストセットにおいて第１の癌状態を割り当てられた被検者から計算される。無細胞断片の数の中心傾向の第２の尺度は、複数のビンのサブセットにわたる無細胞断片の各テストセットにおいて、被験体から計算される。次に、被験者の細胞源分率が、中心傾向の第１及び第２の尺度を用いて推定される。

【0017】

いくつかの実施形態において、第２の癌の状態は、癌の非存在であり、被験体用の細胞源画分は、被験体用の細胞源画分を含んでいる。

【0018】

いくつかの実施形態では、分類器は、形式を有する。
[数1]
いくつかのそのような実施形態において
[数2]
は、第１の癌の状態についての第１のモデルであり、「フラグメント」は、それぞれの無細胞フラグメントのメチル化パターンを指す。
[数3]
は、第２の癌の状態に関する第２のモデルである。そのような実施形態において、R(fragment)が閾値を満たすとき、それぞれの無細胞断片の癌状態は、第１の癌状態に割り当てられる。いくつかの実施形態において、閾値は、１～１０の間である。いくつかの実施形態では、閾値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。

【0019】

いくつかの実施形態では、関連性の尺度Ｉは、以下のように計算される。
[数4］

【0020】

いくつかのそのような実施形態において、ｉ及びｊは、セットに対する独立したインデックスであり、ｘｉ は、癌状態ｉを有する複数の訓練被験者の数であり、ｙｊ は、癌状態ｊが割り当てられたそれぞれのビンにマッピングされた１つ又は複数の無細胞断片を有する複数の訓練被験者の数であり、ｙは、癌状態ｊを有する複数の訓練被験者における訓練被験者の数である。[外］は、複数の訓練被験者のうち、癌状態ｉを有し、かつ癌状態ｊを割り当てられたそれぞれのビンに対応する１つ以上の無細胞断片を有する訓練被験者の数であり、ｙは、複数の訓練被験者のうち、癌状態ｊを割り当てられたそれぞれのビンに対応する１つ以上の無細胞断片を有する訓練被験者の数である。[外］は、複数の訓練被験者における訓練被験者の数である。[外］は[4］であり、かつ[5］である。

【0021】

いくつかの実施形態では、関連性の尺度は、相関関係である。いくつかの実施形態では、相関は、ピアソン相関係数である。いくつかの実施形態では、相関は、調整相関係数、加重相関係数、反射相関係数、または尺度化相関係数を用いて実行される。

【0022】

いくつかの実施形態では、複数のビンは、１０００ビンと１００，０００ビンの間で構成される。いくつかの実施形態では、複数のビンは、１５０００ビンと８００００ビンの間で構成される。いくつかの実施形態において、複数のビンのそれぞれのそれぞれのビンは、平均して、１０～１２００個の間の残基を有する。いくつかの実施形態では、複数のビンのそれぞれのビンは、平均して、１０～１００００個の間の残基を有する。

【0023】

いくつかの実施形態において、中心傾向の第１の尺度は、複数のビンのサブセットにわたる無細胞断片の各テストセットにおいて第１の癌条件を割り当てられた複数の試験対象者からの無細胞断片の数の算術平均、加重平均、中位、三等分、Ｗｉｎｓｏｒｉｚｅｄ平均、平均、又は最頻値である。

【0024】

いくつかの実施形態では、中心傾向の第２の尺度は、複数のビンのサブセットにわたる無細胞断片の各テストセットにおける複数の被験体からの無細胞断片の数の算術平均、加重平均、中位、三分平均、ウィンソライズ平均、平均、又は最頻値である。

【0025】

いくつかの実施形態において、細胞源分率を推定することは、中心傾向の第１の尺度を中心傾向の第２の尺度で割ることを含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、複数の訓練対象は、１０個の訓練対象から１０００個の訓練対象で構成される。

【0027】

いくつかの実施形態では、選択基準は、関連性の上位Ｎ個の測定のうちの１つを有するビンの選択を指定し、Ｎは５０以上の正の整数である。いくつかの実施形態では、Ｎは５００と５０００の間である。いくつかの実施形態では、Ｎは８００と１５００の間である。

【0028】

いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、ペアエンドシーケンシングである。いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、シングルリードシーケンシングである。いくつかの実施形態では、対応するトレーニング用複数の無細胞断片は、５００ヌクレオチド未満の平均長を有する。

【0029】

いくつかの実施形態において、第１の癌の状態は癌であり、第２の癌の状態は癌の非存在である。

【0030】

いくつかの実施形態において、第１の癌の状態は、副腎癌、胆道癌、膀胱癌、骨／骨髄癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、食道癌、胃癌、頭／首癌、肝胆道癌、腎癌、肝癌のいずれかであり、第１の癌の状態は、副腎癌、胆道癌、膀胱癌、骨髄癌、胸膜癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、骨盤癌、胸膜癌、皮膚癌、子宮癌のいずれかである。肺がん、卵巣がん、膵臓がん、骨盤がん、胸膜がん、前立腺がん、腎臓がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫または白血病、そして第２のがんの条件はがんの非存在である。

【0031】

いくつかの実施形態では、第１の癌の状態は、副腎癌の段階、胆道癌の段階、膀胱癌の段階、骨／骨髄癌の段階、脳癌の段階、乳癌の段階、のうちの１つである。子宮頸がん、大腸がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝胆膵がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がんのステージ卵巣癌、膵臓癌、骨盤癌、胸膜癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、白血病のいずれかであり、第２のがんの状態はがんの非存在である。

【0032】

いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、全ゲノムメチル化シーケンシングである。いくつかの実施形態では、メチル化配列決定は、複数の核酸プローブを用いた標的配列決定であり、複数のビンの各ビンは、複数の核酸プローブ中の少なくとも１つの核酸プローブに関連付けられる。

【0033】

いくつかの実施形態では、複数の核酸プローブは、１，０００個以上の核酸プローブ、２，０００個以上の核酸プローブ、３，０００個以上の核酸プローブ、５，０００個以上の核酸プローブ、１０，０００個以上の核酸プローブ又は１，０００個以上３０，０００個以下の核酸プローブから構成される。

【0034】

いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のＣｐＧ部位を含んでなる。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続したＣｐＧ部位を含む。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、ヒト参照ゲノムにおける２～１００個の連続するＣｐＧ部位からなる。

【0035】

いくつかの実施形態では、対応する生物学的試料は、液体生物学的試料である。いくつかの実施形態では、対応する生物学的試料は、血液試料である。いくつかの実施形態では、対応する生体試料は、訓練対象の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液からなる。いくつかの実施形態では、対応する生体試料は、トレーニング対象の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液からなる。

【0036】

いくつかの実施形態において、それぞれのフラグメントにおける対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態は、それぞれのＣｐＧ部位がメチル化されているとメチル化シーケンシングによって判定された場合にメチル化され、それぞれのＣｐＧ部位がメチル化されていないとメチル化シーケンスによって判定された場合に非メチル化され、それぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態をメチル化または非メチル化としてコールできない場合には「その他」としてのフラグ付けがなされる。

【0037】

いくつかの実施形態では、メチル化配列決定により、それぞれの断片において１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）が検出される。

【0038】

いくつかの実施形態では、メチル化配列決定は、それぞれのフラグメントの配列リードにおける、１つまたは複数の非メチル化シトシンまたは１つまたは複数のメチル化シトシンを、対応する１つまたは複数のウラシルに変換することを含んでいる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のウラシルは、１つまたは複数の対応するチミンとして、メチル化配列決定中に検出される。 いくつかの実施形態では、１つまたは複数の非メチル化シトシンまたは１つまたは複数のメチル化シトシンの変換は、化学的変換、酵素的変換、またはそれらの組み合わせを含んでなる。

【0039】

いくつかの実施形態において、第１のモデルは、第１の複数のサブモデルを含む第１の混合モデルであり、第２のモデルは、第２の複数のサブモデルを含む第２の混合モデルであり、第１及び第２の複数のサブモデルにおける各サブモデルは、対応する生体試料中の無細胞断片のソースに対する独立した対応するメチル化モデルを表す。

【0040】

いくつかの実施形態において、各独立対応メチル化モデルは、二項モデル、ベータ二項モデル、独立部位モデル、又はマルコフモデルのうちの１つである。

【0041】

いくつかの実施形態では、第１の複数のサブモデル中の２つ以上のサブモデルは、独立したサイトモデルであり、第２の複数のサブモデル中の２つ以上のサブモデルは、独立したサイトモデルである。

【0042】

いくつかの実施形態において、本方法は、複数の無細胞断片に１つ以上のフィルタ条件を適用することをさらに含む。

【0043】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンへのｐ値閾値の適用であり、ｐ値閾値は、メチル化パターンが非癌被験者のコホートにおいて観察される頻度を代表するものである。

【0044】

いくつかの実施形態では、ｐ値閾値は０．００１と０．２０の間である。

【0045】

いくつかの実施形態では、コホートは少なくとも２０人の被験者からなり、複数の無細胞断片は少なくとも１０，０００の異なる対応するメチル化パターンを含んでいる。

【0046】

いくつかの実施形態において、ｐ値閾値は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片に対応するメチル化パターンが０．１０以下、０．０５以下、又は０．０１以下のｐ値を有する場合に、対象からのメチル化パターンについて満たされる。

【0047】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、対応する生体試料におけるそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料から測定された対応する複数の配列読み取り値において、閾値数の配列読み取り値によって表されるという条件の適用である。

【0048】

いくつかの実施形態では、閾値の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０と１００の間の整数である。

【0049】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、対応する生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料中の無細胞核酸の閾値数によって表されるという要求の適用である。

【0050】

いくつかの実施形態では、閾値の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０と１００の間の整数である。

【0051】

いくつかの実施形態において、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が閾値数のＣｐＧ部位を有するという要件の適用である。

【0052】

いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部位の閾値の数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のＣｐＧ部位である。

【0053】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、閾値の塩基対の数未満の長さを有するという要件である。

【0054】

いくつかの実施形態では、閾値の塩基対の数は、長さが１，０００、２，０００、３，０００、または４，０００個の連続した塩基対である。

【0055】

いくつかの実施形態において、本方法は、取得、マッピング、割り当て、第１及び第２の中心傾向の測定値の計算、並びにエポックにわたる複数の時点におけるそれぞれの時点における被験体についての細胞源分画の推定を繰り返し、これにより対応する細胞源分画を取得することをさらに含む。を求め、複数の細胞源分率を用いて、エポック中の被験者の疾患状態の状態又は進行を、エポックにわたる第１の細胞源分率の増加又は減少という形で決定することである。

【0056】

いくつかの実施形態では、エポックは数ヶ月の期間であり、複数のタイムポイントの各タイムポイントは、数ヶ月の期間内の異なるタイムポイントである。

【0057】

いくつかの実施形態では、数ヶ月の期間は、４ヶ月未満である。

【0058】

いくつかの実施形態では、エポックは年の期間であり、複数のタイムポイントにおける各タイムポイントは、年の期間における異なるタイムポイントである。

【0059】

いくつかの実施形態では、年数の期間は２年以上１０年以下である。

【0060】

いくつかの実施形態では、エポックは時間の期間であり、複数のタイムポイントにおける各タイムポイントは、時間の期間内の異なるタイムポイントである。

【0061】

いくつかの実施形態では、時間の期間は、１時間以上６時間以下である。

【0062】

いくつかの実施形態において、本方法は、被験者の第１の細胞源分率がエポックにわたって閾値だけ変化することが観察される場合に、被験者の診断を変更することをさらに含む。

【0063】

いくつかの実施形態において、本方法は、被験体の第１の細胞源分率がエポックにわたって閾値だけ変化することが観察される場合に、被験体の予後を変更することをさらに含む。

【0064】

いくつかの実施形態において、本方法は、被験体の第１の細胞源分率がエポックにわたって閾値だけ変化することが観察される場合に、被験体の治療を変更することをさらに含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、閾値は、１０％より大きい、２０％より大きい、３０％より大きい、４０％より大きい、５０％より大きい、２倍より大きい、３倍より大きい、又は５倍より大きい。

【0066】

いくつかの実施形態では、被験体の腫瘍分率は、０．００３～１．０の間である。

【0067】

いくつかの実施形態において、本方法は、被験体に対する細胞源分画の値に少なくとも部分的に基づいて、被験体に治療レジメンを適用することをさらに含む。

【0068】

いくつかの実施形態において、治療レジメンは、癌のための薬剤を被験体に適用することを含む。

【0069】

ある実施形態では、癌のための薬剤は、ホルモン、免疫療法、放射線療法、または抗癌剤である。

【0070】

いくつかの実施形態において、癌のための薬剤は、レナリドミド、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス４価（６、１１、１６、及び１８型）ワクチン。ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、プロマクタ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ボルテゾミブまたはその後発品。

【0071】

いくつかの実施形態において、被験体は、癌のための薬剤で処理されており、本方法は、被験体の癌のための薬剤に対する応答を評価するために、被験体のための細胞源画分を使用することをさらに含む。

【0072】

ある実施形態では、癌のための薬剤は、ホルモン、免疫療法、放射線療法、または抗癌剤である。

【0073】

いくつかの実施形態において、癌のための薬剤は、レナリドミド、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス４価（６、１１、１６、および１８型）ワクチン。ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、プロマクタ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ボルテゾミブ又はそれらの後発品。

【0074】

いくつかの実施形態において、被験体は、癌のための薬剤で治療されており、本方法は、被験体における癌のための薬剤を強化するか中止するかを決定するために、被験体の細胞源画分を使用することをさらに含む。

【0075】

いくつかの実施形態において、被験体は、がんに対処するための外科的介入を受けており、本方法は、被験体の細胞源画分を使用して、外科的介入に応答する被験体の状態を評価することをさらに含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、複数のビンのビンは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５３５８（ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２として公開）の表１～２４、国際特許出願番号のリスト１～８のうちの１つ以上に記載されているゲノム領域に対応する。ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３５０９（ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１として公開）、及び／又は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２（ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２として公開）のリスト１～１６に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。

【0077】

いくつかの実施形態では、複数のビンのビンは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５３５８（ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２として公開）の表１～２４、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３５０９（ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１として公開）のリスト１～８、及び／又は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２（ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２として公開）のリスト１～１６の１又は複数の中に記載されたゲノム領域の少なくとも３０％にマッピングされる。

【0078】

いくつかの実施形態では、複数のビンのビンは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５３５８（ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２として公開）の表１～２４の１つ以上に記載されているゲノム領域の少なくとも５０～９５％の間にマッピングされる。ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５３５８（ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２として公開）、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３５０９（ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１として公開）のリスト１～８、及び／又は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２（ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２として公開）のリスト１～１６のうち１つ以上に記載されているゲノム領域の少なくとも５０～９５％にマッピングされる。

【0079】

いくつかの実施形態では、複数のビンのビンは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５３５８（ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２として公開）の表１～２４、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３５０９（ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１として公開）のリスト１～８、及び／又は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２（ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２として公開）のリスト１～１６の１又は複数の中の１～１０の固有の対応ゲノム領域に対してマッピングされる。

【0080】

いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５３５８（ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２として公開）の表１～２４、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３５０９（ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１として公開）のリスト１～８、及び国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２（ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２として公開）のリスト１～１６のいずれか又は複数の単一固有の対応ゲノム領域とマッピングされる。

【0081】

いくつかの実施形態では、複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象について、訓練用の複数の無細胞断片は、少なくとも１００，０００個の無細胞断片からなる。

【0082】

いくつかの実施形態では、訓練用複数の無細胞断片は、複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象について、少なくとも１００，０００個の無細胞断片からなる。

【0083】

いくつかの実施形態では、複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象について、訓練用複数の無細胞断片は、少なくとも１００万個の無細胞断片からなる。

【0084】

いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、１００未満の核酸残基、５００未満の核酸残基、１０００未満の核酸残基、２５００未満の核酸残基、５０００未満の核酸残基から構成される。１万個以下、２万５千個以下、５万個以下、１０万個以下、２５万個以下、５０万個以下の核酸残基。

【0085】

本開示の別の態様は、被験者の細胞源率を推定するためのコンピューティングシステムを提供する。コンピューティングシステムは、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサによって実行される１つ以上のプログラムを記憶するメモリとを備える。前記１つ又は複数のプログラムは、トレーニングデータセットを取得するための命令を電子的形態で含んでいる。訓練データセットは、複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象について、ａ）対応する訓練用の複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターン、及びｂ）それぞれの訓練対象の対象癌表示、を含む。それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）それぞれの訓練対象者から得られた対応する生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位における各ＣｐＧ部位のメチル化状態から構成される。前記被験者の癌の状態は、第１の癌の状態及び第２の癌の状態のうちの一方である、ことを特徴とする。前記１つ又は複数のプログラムは、前記複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片を、前記複数のビンにおけるビンに対応付けるための命令をさらに含む。ここで、複数のビンにおけるそれぞれのビンは、ヒト参照ゲノムの対応する部分を表し、それにより、無細胞断片の複数のトレーニングセットを取得し、無細胞断片の各トレーニングセットは、複数のビンにおける異なるビンにマッピングされる。前記１つ又は複数のプログラムは、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力する際に、分類器の出力の関数として、前記複数の無細胞断片の訓練セットにおけるそれぞれの無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てるための命令を更に含む。前記無細胞断片の癌の状態は、前記第１の癌の状態及び前記第２の癌の状態のうちのいずれかである。前記１つ又は複数のプログラムは、前記複数のビンにおけるそれぞれのビンについて、（ａ）前記複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象の対象の癌状態と、（ｂ）前記それぞれのビンにマッピングされた無細胞断片の対応する訓練セットにおけるそれぞれの無細胞断片の癌状態との間の関連性の対応指標Ｉを決定する命令を更に備える。前記１つ又は複数のプログラムは、前記被験者細胞源率を推定するための複数の特徴を、前記複数のビンのサブセットとして特定するための命令を更に含むことを特徴とする。複数のビンのサブセットにおけるそれぞれのそれぞれのビンは、それぞれのビンに対する対応する関連性の尺度に基づく選択基準を満たす。

【0086】

本開示の別の態様は、１つまたは複数のプログラムが、本明細書に開示された方法のいずれかを単独または組み合わせて実行するための命令をさらに含む、上記開示されたコンピューティングシステムを提供する。

【0087】

本開示の別の態様は、被験者の細胞源率を推定するための１つ以上のプログラムを記憶した非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を提供する。つ又は複数のプログラムは、コンピュータによって実行されるように構成される。前記１つ以上のプログラムは、トレーニングデータセットを取得するための命令を電子的形態で含んでいる。トレーニングデータセットは、複数のトレーニング対象におけるそれぞれのトレーニング対象について、ａ）対応するトレーニング用の複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターン、及びｂ）それぞれのトレーニング対象の対象癌表示、を含む。それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）それぞれの訓練対象者から得られた対応する生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位の各ＣｐＧのメチル化状態から構成されている。前記被験者の癌の状態は、第１の癌の状態及び第２の癌の状態のうちの一方である、ことを特徴とする。前記１つ又は複数のプログラムは、前記複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片を、前記複数のビンにおけるビンに対応付けるための命令を含んでいる。ここで、複数のビンにおけるそれぞれのビンは、ヒト参照ゲノムの対応する部分を表し、それによって、無細胞断片の複数のトレーニングセットを取得し、無細胞断片の各トレーニングセットは、複数のビンにおける異なるビンにマッピングされる。前記１つ又は複数のプログラムは、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力する際に、分類器の出力の関数として、前記複数の無細胞断片のトレーニングセットにおけるそれぞれの無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てるための命令を更に含む。前記無細胞断片の癌の状態は、前記第１の癌の状態及び前記第２の癌の状態のうちのいずれかである。前記１つ又は複数のプログラムは、前記複数のビンにおけるそれぞれのビンについて、（ａ）前記複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象の対象の癌状態と、（ｂ）前記それぞれのビンにマッピングされた無細胞断片の対応する訓練セットにおけるそれぞれの無細胞断片の癌状態との間の関連性の対応指標Ｉを決定する命令を更に備える。前記１つ又は複数のプログラムは、前記被験者細胞源率を推定するための複数の特徴を、前記複数のビンのサブセットとして特定するための命令を含むことを特徴とする。複数のビンのサブセットにおけるそれぞれのそれぞれのビンは、それぞれのビンに対する対応する関連性の尺度に基づく選択基準を満たす。

【0088】

本開示の別の態様は、１つまたは複数のプログラムが、本明細書に開示された方法のいずれかを単独または組み合わせて実行するための命令をさらに含む、上記開示された非一時的コンピュータ可読記憶媒体を提供する。

【0089】

Ｂ．無細胞ＤＮＡから取得したメチル化データを用いて、被験者の細胞源分画を決定することを目的とした実施形態。

【0090】

本開示の別の態様は、被験者の細胞源分画を推定する方法を提供する。本方法は、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサによる実行のための１つ以上のプログラムを記憶するメモリとを有するコンピュータシステムにおいて、電子的形態で、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンを得ることを含んでいる。ここで、それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態からなるものである。本方法は、複数の無細胞断片中の各無細胞断片を複数のビン中のビンにマッピングし、それによって複数の無細胞断片のセットを得ることを含んでいる。無細胞断片の各セットは、複数のビンの中の異なるビンにマッピングされる。本方法はまた、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力した際の分類器の出力の関数として、複数の無細胞断片のセットの中のそれぞれの無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てることを含む。無細胞断片の癌の状態は、第１の癌の状態及び第２の癌の状態のうちの１つである。本方法は、複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて第１の癌状態を割り当てられた対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第１の尺度を計算し、複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第２の尺度を計算することによって継続される。本方法は、中心傾向の第１の尺度及び中心傾向の第２の尺度を用いて、被験者の細胞源分率を推定することを更に含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、複数のビンは、１０００ビンの間で構成される。いくつかの実施形態では、複数のビンは、１５０００ビンと８００００ビンの間で構成される。

【0092】

いくつかの実施形態では、複数のビンのそれぞれのビンは、平均して、１０～１２００個の間の残基を有する。いくつかの実施形態では、複数のビンのそれぞれのビンは、平均して、１０～１００００個の間の残基を有する。

【0093】

いくつかの実施形態では、中心傾向の第１の指標は、複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて第１の癌状態を割り当てられた対象からの無細胞断片の数の算術平均、加重平均、中距離、中間値、トリミン、Ｗｉｎｓｏｒｉｚｅｄ平均、平均、又は最頻値である。いくつかの実施形態では、中心傾向の第２の尺度は、複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおける対象からの無細胞断片の数の算術平均、加重平均、中位、中ヒゲ、トリミン、Ｗｉｎｓｏｒｉｚｅｄ平均、平均、又は最頻値である。

【0094】

いくつかの実施形態では、細胞源分率を推定することは、中心傾向の第１の尺度を中心傾向の第２の尺度で割ることを含んでいる。

【0095】

いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、ペアエンドシーケンシングである。いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、シングルリードシーケンシングである。

【0096】

いくつかの実施形態では、複数の無細胞断片は、５００ヌクレオチド未満の平均長を有する。

【0097】

いくつかの実施形態において、第１の癌の状態は癌であり、第２の癌の状態は癌の非存在である。

【0098】

いくつかの実施形態において、第１の癌の状態は、副腎癌、胆道癌、膀胱癌、骨／骨髄癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、食道癌、胃癌、頭／首癌、肝胆道癌、腎癌、肝癌のいずれかであり、第１の癌の状態は、副腎癌、胆道癌、膀胱癌、骨髄癌、胸膜癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、骨盤癌、胸膜癌、皮膚癌、子宮癌のいずれかである。肺がん、卵巣がん、膵臓がん、骨盤がん、胸膜がん、前立腺がん、腎臓がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫または白血病、そして第２のがんの条件はがんの非存在である。

【0099】

いくつかの実施形態では、第１の癌の状態は、副腎癌の段階、胆道癌の段階、膀胱癌の段階、骨／骨髄癌の段階、脳癌の段階、乳癌の段階、のうちの１つである。子宮頸がん、大腸がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝胆膵がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がんのステージ卵巣癌、膵臓癌、骨盤癌、胸膜癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、白血病のいずれかであり、第２のがんの状態はがんの非存在である。

【0100】

いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、全ゲノムメチル化シーケンシングである。いくつかの実施形態では、メチル化配列決定は、複数の核酸プローブを用いた標的配列決定であり、複数のビンにおけるそれぞれのビンは、複数の核酸プローブにおける少なくとも１つの対応する核酸プローブと関連付けられる。

【0101】

いくつかの実施形態では、複数の核酸プローブは、１，０００個以上の核酸プローブ、２，０００個以上の核酸プローブ、３，０００個以上の核酸プローブ、５，０００個以上の核酸プローブ、１０，０００個以上の核酸プローブ、又は１，０００個以上３０，０００個以下の核酸プローブから構成される。

【0102】

いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のＣｐＧ部位を含んでなる。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続したＣｐＧ部位を含む。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、ヒト参照ゲノムにおける２～１００個の連続するＣｐＧ部位からなる。

【0103】

いくつかの実施形態では、生体試料は、液体生体試料である。いくつかの実施形態では、生物学的試料は血液試料である。いくつかの実施形態では、生体試料は、被験者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液からなる。いくつかの実施形態では、生体試料は、被験者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液からなる。

【0104】

いくつかの実施形態において、それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態は、それぞれのＣｐＧ部位がメチル化されているとメチル化シーケンシングによって判定された場合にメチル化され、それぞれのＣｐＧ部位がメチル化されていないとメチル化シーケンスによって判定された場合に非メチル化され、それぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態をメチル化または非メチル化としてコールできない場合に「その他」としてフラッグ付けられる：この場合、それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位は、メチル化シーケンスによって判定されている。

【0105】

いくつかの実施形態では、メチル化配列決定により、それぞれの断片において１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）が検出される。

【0106】

いくつかの実施形態では、メチル化配列決定は、それぞれの断片の配列リードにおける、１つまたは複数の非メチル化シトシンまたは１つまたは複数のメチル化シトシンを、対応する１つまたは複数のウラシルに変換することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のウラシルは、１つまたは複数の対応するチミンとして、メチル化配列決定中に検出される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の非メチル化シトシンまたは１つまたは複数のメチル化シトシンの変換は、化学的変換、酵素的変換、またはそれらの組み合わせを含んでなる。

【0107】

いくつかの実施形態において、第１のモデルは、第１の複数のサブモデルを含む第１の混合モデルであり、第２のモデルは、第２の複数のサブモデルを含む第２の混合モデルであり、第１及び第２の複数のサブモデルにおける各サブモデルは、対応する生体試料中の無細胞断片のソースに対する独立した対応するメチル化モデルを表す。

【0108】

いくつかの実施形態において、各独立対応メチル化モデルは、二項モデル、ベータ二項モデル、独立部位モデル、又はマルコフモデルのうちの１つである。

【0109】

いくつかの実施形態では、第１の複数のサブモデル中の２つ以上のサブモデルは、独立したサイトモデルであり、第２の複数のサブモデル中の２つ以上のサブモデルは、独立したサイトモデルである。

【0110】

いくつかの実施形態において、本方法は、複数の無細胞断片に１つ以上のフィルター条件を適用することをさらに含む。

【0111】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンへのｐ値閾値の適用であり、ｐ値閾値は、メチル化パターンが非癌被験者のコホートにおいて観察される頻度を代表するものである。

【0112】

いくつかの実施形態では、ｐ値閾値は、０．００１と０．２０の間である。いくつかの実施形態では、ｐ値閾値は、０．０１と０．１０の間である。いくつかの実施形態では、ｐ値閾値は、０．００１、０．００５、０．０１０、０．０２０、０．０３０、０．０４０、０．０５０、０．０６０、０．０７０、０．０８０、０．０９０、または０．０１０より大きい。

【0113】

いくつかの実施形態では、コホートは、少なくとも２０人、少なくとも３０人、少なくとも５０人、少なくとも１００人、少なくとも５００人、又は少なくとも１０００人の被験者からなる。いくつかの実施形態では、複数の無細胞断片は、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも８０００、又は少なくとも１００００の異なる対応するメチル化パターンを含んでなる。

【0114】

いくつかの実施形態において、ｐ値閾値は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片に対応するメチル化パターンが０．１０以下、０．０５以下、又は０．０１以下のｐ値を有する場合に、対象からのメチル化パターンについて満たされる。

【0115】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、対応する生体試料におけるそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料から測定された対応する複数の配列リードにおける閾値数の配列リードによって表されるという要求の適用である。いくつかの実施形態では、閾値数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０と１００との間の整数である。

【0116】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、対応する生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料中の無細胞核酸の閾値数によって表されるという要求の適用である。いくつかの実施形態では、閾値数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０と１００との間の整数である。

【0117】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、閾値数のＣｐＧ部位を有するという要件の適用である。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部位の閾値数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のＣｐＧ部位である。

【0118】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、閾値の塩基対の数未満の長さを有するという条件である。いくつかの実施形態では、閾値の塩基対の数は、長さが１千、２千、３千、又は４千の連続した塩基対である。

【0119】

いくつかの実施形態では、１つのフィルタ条件が適用される。いくつかの実施形態では、２つのフィルタ条件が適用される。いくつかの実施形態では、３つのフィルタ条件が適用される。いくつかの実施形態では、４つのフィルタ条件が適用される。

【0120】

いくつかの実施形態では、本方法は、取得、マッピング、割り当て、第１及び第２の中心傾向の測定値の計算、並びにエポックにわたる複数の時点におけるそれぞれの時点における被検者の細胞源分画の推定を繰り返すことをさらに含み、したがって、それぞれの時点における被検者の複数の細胞源分画における、対応する細胞源分画を取得することを含む。いくつかの実施形態では、この複数の細胞源分画は、エポックにわたる第１の細胞源分画の増加又は減少という形で、エポック中の被験者の疾患状態の状態又は進行を決定するために使用される。

【0121】

いくつかの実施形態では、各エポックは数ヶ月の期間であり、複数のタイムポイントの各タイムポイントは、数ヶ月の期間内の異なるタイムポイントである。いくつかの実施形態では、数ヶ月の期間は、４ヶ月未満である。いくつかの実施形態では、各エポックは１ヶ月の長さである。いくつかの実施形態では、各エポックは２ヶ月の長さである。いくつかの実施形態では、各エポックは３ヶ月の長さである。いくつかの実施形態では、各エポックは４ヶ月の長さである。いくつかの実施形態では、各エポックは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヵ月の長さである。

【0122】

いくつかの実施形態では、エポックは年の期間であり、複数のタイムポイントの各タイムポイントは、年の期間内の異なるタイムポイントである。いくつかの実施形態では、年の期間は、１年以上１０年以下である。いくつかの実施形態では、年の期間は、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、または１０年である。いくつかの実施形態では、エポックは１年以上３０年以下である。

【0123】

いくつかの実施形態では、エポックは時間の期間であり、複数のタイムポイントにおける各タイムポイントは、時間の期間内の異なるタイムポイントである。いくつかの実施形態では、時間の期間は、１時間から２４時間の間である。いくつかの実施形態では、時間の期間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４時間である。

【0124】

いくつかの実施形態において、本方法は、被験体の第１の細胞源分率がエポックにわたって閾値量だけ変化することが観察された場合に、被験体の診断を変更することをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、診断は、癌を有することから寛解していることに変更される。別の例として、いくつかの実施形態では、診断は、癌を有していない状態から癌を有する状態に変更される。別の例として、いくつかの実施形態では、診断は、癌の第１ステージを有することから、癌の第２ステージを有することに変更される。別の例として、いくつかの実施形態では、診断は、癌の第２段階を有することから、癌の第３段階を有することへと変更される。さらに別の例として、いくつかの実施形態では、診断は、第３段階の癌を有することから、第４段階の癌を有することに変更される。さらに別の例として、いくつかの実施形態では、診断は、転移していない癌を有することから、転移している癌を有することへと変更される。

【0125】

いくつかの実施形態では、本方法は、被験体の第１の細胞源分率がエポックにわたって閾値量だけ変化することが観察された場合に、被験体の予後を変更することをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、予後は生命予後を含み、予後は第１の生命予後から第２の生命予後に変更され、第１及び第２の生命予後はその持続時間が異なる。いくつかの実施形態では、予後の変更は、対象の余命を増加させる。いくつかの実施形態では、予後の変化は、対象の余命を減少させる。

【0126】

いくつかの実施形態では、本方法は、被験体の第１の細胞源分率がエポックにわたって閾値量だけ変化することが観察されたときに、被験体の治療を変更することを更に含む。いくつかの実施形態では、治療の変更は、癌治療薬を開始すること、癌治療薬の投与量を増加させること、癌治療薬を停止すること、又は癌治療薬の投与量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、治療の変更は、レナリドミド、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス４価（６型、１１型、１６型、１８型）ワクチンによる対象の治療を開始または終了することからなる。１１、１６、及び１８）ワクチン、ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、プロマクタ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、又はそれらの後発品等を挙げることができる。いくつかの実施形態では、治療の変更は、レナリドミド、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス４価（６、１１、１６型。及び１８）ワクチン、ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、プロマクタ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、又は被験者に投与されたそれらの後発品等量である。いくつかの実施形態では、閾値は、１０％より大きい、２０％より大きい、３０％より大きい、４０％より大きい、５０％より大きい、２倍より大きい、３倍より大きい、または５倍より大きい。

【0127】

いくつかの実施形態では、被験体の腫瘍分画は、０．００３～１．０の間である。いくつかの実施形態では、被験体の腫瘍分画は、０．００５～０．８０の間である。いくつかの実施形態では、被験体の腫瘍分画は、０．０１～０．７０の間である。いくつかの実施形態では、被験体の腫瘍分画は、０．０５～０．６０の間である。

【0128】

いくつかの実施形態において、本方法は、被験体に対する細胞源分画の値に少なくとも部分的に基づいて、被験体に治療レジメンを適用することをさらに含む。いくつかの実施形態では、治療レジメンは、被験体に癌のための薬剤を適用することを含む。いくつかの実施形態では、癌のための薬剤は、ホルモン、免疫療法、放射線療法、又は癌治療薬である。いくつかの実施形態では、癌のための薬剤は、レナリドミド、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス４価（６、１１、１６、及び１８型）ワクチン。ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、プロマクタ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ボルテゾミブ又はそれらの後発品。

【0129】

いくつかの実施形態では、被験体は、癌のための薬剤で処理されており、本方法は、被験体の癌のための薬剤に対する応答を評価するために、被験体のための細胞源画分を使用することを更に含む。いくつかの実施形態では、癌のための薬剤は、ホルモン、免疫療法、放射線療法、又は癌治療薬である。いくつかの実施形態では、癌のための薬剤は、レナリドミド、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス４価（６、１１、１６、及び１８型）ワクチン。ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、プロマクタ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ボルテゾミブまたはその後発品。

【0130】

いくつかの実施形態では、被験体は、癌のための薬剤で治療されており、方法は、被験体における癌のための薬剤を強化するか中止するかを決定するために、被験体の細胞源分画を使用することをさらに包含する。例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも閾値細胞源割合（例えば、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、又は０．３０より大きい等）の観察が、被験体における癌の治療薬を強める（例えば、投与量を増やす、放射線治療の放射線レベルを上げる）根拠として使用される。いくつかの実施形態では、閾値細胞源割合未満（例えば、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、又は０．３０未満など）の観察は、被験体における癌のための薬剤の使用を中止するための基礎として使用される。

【0131】

いくつかの実施形態では、被験体は、がんに対処するための外科的介入を受け、方法は、被験体の細胞源分画を使用して、外科的介入に応答する被験体の状態を評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、状態は、本開示で提供される方法を用いて計算された細胞源分画に基づく指標である。

【0132】

いくつかの実施形態では、複数のビンのビンは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５３５８（ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２として公開）の表１～２４、国際特許出願番号のリスト１～８の１つ又は複数に記載されている単一のゲノム領域に相当する。ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３５０９（ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１として公開）、及び／又は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２（ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２として公開）のリスト１～１６に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。

【0133】

いくつかの実施形態では、複数のビンのビンは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５３５８（ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２として公開）の表１～２４、国際特許出願番号のリスト１～８のうちの１つ以上に記載されているゲノム領域の組み合わせに対応する。ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３５０９（ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１として公開）、及び／又は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２（ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２として公開）のリスト１～１６、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。例えば、いくつかの実施形態では、複数のビンのビンは、国際特許公開第ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２号の表１～２４、国際特許公開第ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１号のリスト１～８、及び／又は国際特許公開第ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２号のリスト１～１６に記載の１、２、３、４、５又はそれ以上の５つの領域を含んでいる。

【0134】

いくつかの実施形態では、複数のビンのビンは、国際特許公開第ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２号の表１～２４、国際特許公開第ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１号のリスト１～８、及び／又は国際特許公開第ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２号のリスト１～１６の１つ以上に記載のゲノム領域の、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％ 、９０％、９５％ 、９９％又は１００％とマッピングする。

【0135】

いくつかの実施形態では、複数のビンのビンは、国際特許公開第ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２号の表１～２４、国際特許公開第ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１号のリスト１～８、及び／又は国際特許公開第ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２号のリスト１～１６の１つ以上に記載のゲノム領域の少なくとも５０～９５％にマッピングされる。

【0136】

いくつかの実施形態では、複数のビンのビンは、国際特許公開第ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２号の表１～２４、国際特許公開第ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１号のリスト１～８、及び／又は国際特許公開第ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２号のリスト１～１６の１又は複数における１～１０の固有の対応ゲノム領域にマッピングされる。

【0137】

いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、国際特許公開第ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２号の表１～２４、国際特許公開第ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１号のリスト１～８、及び／又は国際特許公開第ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２号のリスト１～１６の１又は複数における単一の固有の対応ゲノム領域とマッピングされる。

【0138】

いくつかの実施形態では、それぞれの対象について、複数の無細胞断片は、少なくとも１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、５００，０００又は１００万の無細胞断片からなる。いくつかの実施形態では、それぞれの対象について、複数の無細胞断片は、少なくとも１００万個の無細胞断片からなる。

【0139】

いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、１００未満の核酸残基、５００未満の核酸残基、１０００未満の核酸残基、２５００未満の核酸残基、５０００未満の核酸残基から構成され、１０，０００未満の核酸残基、２５，０００未満の核酸残基、５０，０００未満の核酸残基、１００，０００未満の核酸残基、１００，０００未満の核酸残基から構成される。１００００個以下、２５０００個以下、５００００個以下、１０００００個以下、２５００００個以下、または５０００００個以下。

【0140】

いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、（ｉ）１００個の核酸残基と（ｉｉ）５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、１００，０００、２５０，０００、または５００，０００個の核酸残基との間で構成されている。

【0141】

本開示の別の態様は、被験者の細胞源率を推定するためのコンピューティングシステムを提供する。コンピューティングシステムは、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサによって実行される１つ以上のプログラムを記憶するメモリとを備える。前記１つ以上のプログラムは、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンを電子的形態で取得するための命令を含んでいる。ここで、それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位の各ＣｐＧのメチル化状態から構成される。前記１つ又は複数のプログラムは、前記複数の無細胞断片中の各無細胞断片を複数のビン中のビンにマッピングし、それによって複数の無細胞断片のセットを得るための命令を更に含む。無細胞断片の各セットは、複数のビンの中の異なるビンにマッピングされる。前記１つ又は複数のプログラムは、前記複数の無細胞断片のセットにおける各無細胞断片の各セットに無細胞断片癌条件を割り当てるための命令を更に含むことを特徴とする。無細胞断片癌状態は、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力したときの分類器の出力の関数として、第１の癌状態及び第２の癌状態のうちの１つである。前記１つ又は複数のプログラムは、前記複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて前記第１の癌状態を割り当てられた前記対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第１の尺度を計算するための命令、及び前記複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて前記対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第２の尺度を計算するための命令をさらに含む、請求項１に記載のプログラム。前記１つ又は複数のプログラムは、前記中心傾向の第１の尺度及び前記中心傾向の第２の尺度を用いて前記対象者の細胞源分率を推定するための命令を更に含む、請求項１に記載の方法。

【0142】

本開示の別の態様は、１つまたは複数のプログラムが、上記に開示された方法のいずれかを単独または組み合わせて実行するための命令をさらに含む、上記開示されたコンピューティングシステムを提供する。

【0143】

本開示の別の態様は、被験者の細胞源率を推定するための１つ以上のプログラムを記憶した非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を提供する。つ以上のプログラムは、コンピュータによって実行されるように構成される。前記１つ以上のプログラムは、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンを電子的な形態で取得するための命令を含んでいる。それぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態からなる。前記１つ又は複数のプログラムは、前記複数の無細胞断片中の各無細胞断片を複数のビン中のビンにマッピングし、それによって複数の無細胞断片のセットを得るための命令を含んでいることを特徴とする。ここで、無細胞断片の各セットは、複数のビンの中の異なるビンにマッピングされる。つ又は複数のプログラムは、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力する際に、分類器の出力の関数として、複数の無細胞断片のセットにおけるそれぞれの無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てるための命令を更に含む。前記無細胞断片の癌の状態は、前記第１の癌の状態及び前記第２の癌の状態のうちのいずれかである。前記１つ又は複数のプログラムは、前記複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて前記第１の癌状態を割り当てられた前記対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第１の尺度を計算し、前記複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて前記対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第２の尺度を計算する命令を更に含む、請求項１に記載のプログラム。前記１つ又は複数のプログラムは、前記第１の中心傾向の尺度及び前記第２の中心傾向の尺度を用いて前記対象者の細胞源分率を推定するための命令を含む、請求項１に記載の方法。

【0144】

本開示の別の態様は、１つまたは複数のプログラムが、上記開示された方法のいずれかを単独または組み合わせて実行するための命令をさらに含む、上記開示された非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を提供する。

【0145】

添付の請求項の範囲内のシステム、方法、および装置の様々な実施形態は、それぞれいくつかの側面を有し、そのうちの１つが本明細書に記載される望ましい属性に単独で関与することはない。添付の特許請求の範囲の範囲を限定することなく、いくつかの顕著な特徴を本明細書に記載する。この議論を考慮した後、特に「詳細な説明」と題されたセクションを読んだ後、様々な実施形態の特徴がどのように使用されるかを理解することができる。

【参照による組み込み】

【0146】

本明細書に記載されたすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0147】

本明細書に開示された実施態様は、限定ではなく、例として、添付の図面の図に示されている。同様の参照数字は、図面のいくつかの図を通して、対応する部品を指す。

【図1】本開示のいくつかの実施形態によるコンピューティングデバイスを例示するブロック図である。

【図2】図２Ａ及び図２Ｂは、開示のいくつかの実施形態による、対象細胞源率を推定するための複数の特徴を特定する方法の例示的フローチャートをまとめて示しており、破線のボックスは任意のステップを表している。

【図3】図３Ａ及び図３Ｂは、本開示のいくつかの実施形態による、破線のボックスが任意のステップを表す、被験者の細胞源割合を推定する方法の例示的フローチャートを集合的に示す図である。

【図4】本開示のいくつかの実施形態による、列挙された癌のいずれかを有する被験者のｃｔＤＮＡ分率を、癌の病期の関数としてプロットした図である。

【図5】本開示のいくつかの実施形態による、配列決定のための核酸試料を調製する方法のフローチャートを示す図である。

【図6】本開示のいくつかの実施形態による配列リードを得るためのプロセスのグラフ表示である。

【図7】本開示のいくつかの実施形態による、全ゲノムバイサルファイトシーケンスデータに基づく腫瘍分率推定値と、組織ベースの全ゲノムシーケンスデータから得られる既知の腫瘍分率との比較を示す図である。特に、ＷＧＢＳ推定腫瘍分率は、断片の平均総数（例えば、各断片が参照ゲノムの特定のビン又は領域にマッピングされる）に対する異常断片の平均数の比率を含んでいる。図７は、４９５名の被験者のシークエンス情報に基づいている。既知の組織腫瘍率＞０．０１の場合、ＷＧＢＳ腫瘍率推定に関するスピアマン相関は０．８６である。既知の組織腫瘍率＞０．００５では、ＷＧＢＳ腫瘍率推定のスピアマン相関は０．９０である。既知の組織腫瘍率＞０．００１では、ＷＧＢＳ腫瘍率推定に対するスピアマン相関は０．８９である。既知の組織腫瘍率＞０．０００１では、ＷＧＢＳ腫瘍率推定値のスピアマン相関は０．７４であった。これは、ＷＧＢＳに基づく腫瘍分画の推定値が既知の組織の腫瘍分画と相関があることを示している。

【図8】特徴識別のために本開示のいくつかの実施形態に従って使用される相互情報量の尺度を示す図である。

【0148】

次に、添付図面に例示されている実施形態について詳細に参照する。以下の詳細な説明では、本開示の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細が記載されている。しかしながら、本開示がこれらの具体的な詳細なしに実施され得ることは、当業者には明らかであろう。他の例では、周知の方法、手順、構成要素、回路、及びネットワークは、実施形態の側面を不必要に不明瞭にしないように、詳細には説明されていない。

【0149】

本明細書に記載される実施態様は、被験者の推定細胞源分率を決定するための様々な技術的解決策を提供する。例示的な実施形態では、核酸断片は、被験者の生物学的試料から取得される。生物学的試料は、無細胞核酸からなる。したがって、核酸断片は無細胞核酸である。核酸断片は、予め定義されたメチル化部位のセットについてメチル化状態を評価され、メチル化状態に基づくスコアが各々割り当てられる。複数のメチル化状態スコアは、複数のカウントに変換され、このカウントは、予め定義されたメチル化部位のセット内の各メチル化部位について対応するメチル化スコアと比較される。対応するメチル化スコアは、細胞ソースにおけるメチル化パターンの分析から得られたものである。この比較により、被験者のメチル化の頻度が決定され、この頻度を用いて、細胞源に関して、細胞源率を推定することができる。

【定義】

【0150】

本明細書で使用される場合、用語「約」又は「約」は、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差範囲内を意味し、これは、値が測定又は決定される方法、例えば、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、いくつかの実施形態では、「約」は、当業者の慣例に従って、１標準偏差以内又は１標準偏差より大きいことを意味する。いくつかの実施形態では、「約」は、所与の値の±２０％、±１０％、±５％、又は±１％の範囲を意味する。いくつかの実施形態では、「約」又は「約」という用語は、ある値の１桁以内、５倍以内、又は２倍以内を意味する。特定の値が本願及び特許請求の範囲に記載されている場合、特に断らない限り、特定の値に対して許容可能な誤差範囲内を意味する用語「約」が想定されるべきである。用語「約」は、当業者によって一般的に理解されるような意味を有し得る。いくつかの実施形態では、用語「約」は、±１０％を意味する。いくつかの実施形態では、用語「約」は、±５％を指す。

【0151】

本明細書において、「アッセイ」という用語は、物質、例えば、核酸、タンパク質、細胞、組織、又は器官の特性を決定するための技術を指す。アッセイ（例えば、第１のアッセイ又は第２のアッセイ）は、試料中の核酸のコピー数変動、試料中の核酸のメチル化状態、試料中の核酸の断片サイズ分布、試料中の核酸の変異状態、又は試料中の核酸の断片化パターンを決定する技術を含むことができる。本明細書で言及する核酸の特性のいずれかを検出するために、当該技術分野における通常の技能を有する者に知られている任意のアッセイを使用することができる。核酸の特性には、配列、ゲノム同一性、コピー数、１つ以上のヌクレオチド位置におけるメチル化状態、核酸のサイズ、１つ以上のヌクレオチド位置における核酸の変異の有無、および核酸の断片化のパターン（例えば、核酸が断片化するヌクレオチド位置）を含むことが可能である。アッセイや方法は、特定の感度や特異性を持つことができ、診断ツールとしての相対的な有用性は、ＲＯＣ－ＡＵＣ統計を使って測定することが可能である。

【0152】

本明細書で使用される場合、「生体試料」、「患者試料」、及び「試料」という用語は、互換的に使用され、対象から採取された任意の試料を指し、対象に関連する生体状態を反映させることができる。いくつかの実施形態では、そのような試料は、無細胞ＤＮＡなどの無細胞核酸を含む。いくつかの実施形態では、そのような試料は、無細胞核酸以外の核酸又は無細胞核酸に加えて核酸を含む。生体試料の例としては、被験者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、生体試料は、被験者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液からなる。このような実施形態では、生体試料は、被験者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液に限られ、被験者の他の成分（例えば、固体組織等）は含まれない。生物学的試料は、生きている又は死んだ被験者に由来する任意の組織又は物質を含むことができる。生物学的試料は、無細胞試料であり得る。生物学的試料は、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はその断片を含むことができる。試料は、液体試料または固体試料（例えば、細胞または組織試料）であることができる。生体試料は、血液、血漿、血清、尿、膣液、水腫（例えば、精巣の）液、膣洗浄液、胸水、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液、乳首からの排出液、身体の異なる部位（例えば、甲状腺、乳房）からの吸引液などの体液であり得る。生体試料は、便試料であり得る。様々な実施形態において、無細胞ＤＮＡについて濃縮された生体試料（例えば、遠心分離プロトコルを介して得られた血漿試料）中のＤＮＡの大部分は、無細胞であり得る（例えば、ＤＮＡの５０％より大きい、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、細胞を含まないことができる）。生物学的試料は、組織または細胞構造を物理的に破壊するように処理することができ（例えば、遠心分離および／または細胞溶解）、したがって、細胞内成分を溶液中に放出することができる。溶液中には、酵素、緩衝液、塩、洗剤などがさらに含まれており、これらは分析のために試料を準備するために使用することができる。生物学的試料は、対象から侵襲的に（例えば、外科的手段）または非侵襲的に（例えば、採血、スワブ、または排出された試料の収集）得ることができる。

【0153】

一部の実施形態では、生体試料は、１つの組織型（例えば、乳房、肺、前立腺、大腸、腎臓、子宮、膵臓、食道、リンパ、卵巣、子宮頸、表皮、甲状腺、膀胱、または胃などの単一の器官に由来する）である。いくつかの実施形態では、生体試料は、２つ以上の組織型（例えば、２つ以上の器官からの組織の組み合わせ）に由来する。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、１つ以上の細胞型（例えば、単一の器官または所定の器官のセットに由来する細胞）に由来している。

【0154】

本明細書に開示されるように、用語「核酸」及び「核酸分子」は互換的に使用される。この用語は、任意の組成形態の核酸、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）等）、リボ核酸（ＲＮＡ、例えば、，メッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、胎児または胎盤で高発現するＲＮＡなど）、および／またはＤＮＡもしくはＲＮＡアナログ（例えば、，塩基アナログ、糖アナログおよび／または非ネイティブ骨格などを含む）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドおよびポリアミド核酸（ＰＮＡ）であり、これらはすべて一本鎖または二本鎖の形態であることが可能である。特に限定されない限り、核酸は、天然ヌクレオチドの既知のアナログを含むことができ、そのいくつかは、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で機能することができる。核酸は、本明細書のプロセスを実施するのに有用な任意の形態（例えば、直鎖、円形、スーパーコイル、一本鎖、二本鎖など）であることができる。いくつかの実施形態における核酸は、単一の染色体又はその断片からであることができる（例えば、核酸サンプルは、二倍体生物から得られたサンプルの１つの染色体からであってもよい）。特定の実施形態では、核酸は、ヌクレオソーム、ヌクレオソームまたはヌクレオソーム様構造の断片もしくは部分を含んでなる。核酸は、タンパク質（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質など）を含むこともある。本明細書に記載のプロセスによって分析される核酸は、実質的に単離され、タンパク質または他の分子と実質的に結合していない場合がある。核酸には、一本鎖（「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレームまたは「リバース」リーディングフレーム）および二本鎖ポリヌクレオチドから合成、複製または増幅したＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、変種および類似物もまた含まれる。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが含まれる。ＲＮＡの場合、塩基シトシンはウラシルに置き換えられ、糖の２′位は水酸基を含む。核酸は、被験者から得られた核酸を鋳型として調製することができる。

【0155】

本明細書で使用する場合、「無細胞核酸」という用語は、細胞の外、被験者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、または腹膜液などの体液中に存在し得る核酸分子をいう。無細胞核酸は、１つ以上の健康な細胞および／または１つ以上の癌細胞に由来する 無細胞核酸は、循環核酸として互換的に使用される。無細胞核酸の例には、ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「無細胞核酸」、「無細胞ＤＮＡ」、及び「ｃｆＤＮＡ」は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「循環腫瘍ＤＮＡ」または「ｃｔＤＮＡ」という用語は、腫瘍細胞または他の種類の癌細胞に由来する核酸断片を指し、瀕死細胞のアポトーシスまたは壊死などの生体プロセスの結果として個人の身体（例えば、血流）から液体中に放出されるか、生存腫瘍細胞によって活発に放出される可能性がある。無細胞核酸の例には、ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。

【0156】

本明細書で開示するように、「循環腫瘍ＤＮＡ」または「ｃｔＤＮＡ」という用語は、腫瘍または他のタイプの癌の細胞などの異常組織に由来する核酸断片を指し、瀕死の細胞のアポトーシスまたは壊死などの生体プロセスの結果として被験者の血流中に放出されるか、生存腫瘍細胞によって活発に放出される可能性がある。

【0157】

本明細書で開示するように、「参照ゲノム」という用語は、任意の生物またはウイルスの、部分的であるか完全であるかにかかわらず、被験体からの同定配列を参照するために使用することができる、任意の特定の既知、配列決定済みまたは特徴付けられたゲノムを指す。ヒト被験体および他の多くの生物に使用される例示的な参照ゲノムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）またはカリフォルニア大学サンタクルーズ校（ＵＣＳＣ）がホストするオンラインゲノムブラウザで提供される。ゲノム」とは、核酸配列で表される、生物またはウイルスの完全な遺伝情報を指す。本明細書で使用される場合、参照配列または参照ゲノムは、多くの場合、個体または複数の個体から組み立てられたまたは部分的に組み立てられたゲノム配列である。いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、１つまたは複数のヒト個体からのアセンブルされたまたは部分的にアセンブルされたゲノム配列である。参照ゲノムは、種の遺伝子のセットの代表例とみなすことができる。いくつかの実施形態では、参照ゲノムは、染色体に割り当てられた配列からなる。例示的なヒト参照ゲノムには、ＮＣＢＩビルド３４（ＵＣＳＣ相当：ｈｇ１６）、ＮＣＢＩビルド３５（ＵＣＳＣ相当：ｈｇ１７）、ＮＣＢＩビルド３６．１（ＵＣＳＣ相当：ｈｇ１８）、ＧＲＣｈ３７（ＵＣＳＣ相当：ｈｇ１９）、およびＧＲＣｈ３８（ＵＣＳＣ相当：ｈｇ３８）などがあるがこれに限られるわけではない。

【0158】

本明細書で開示するように、「参照ゲノムの領域」、「ゲノム領域」、または「染色体領域」という用語は、参照ゲノムの任意の部分、連続または非連続を指す。また、例えば、ビン、パーティション、ゲノム部分、参照ゲノムの一部、染色体の一部等と呼ぶこともできる。いくつかの実施形態では、ゲノムセクションは、ゲノム配列の特定の長さに基づく。いくつかの実施形態では、方法は、複数のゲノム領域に対してマッピングされた複数の核酸断片の分析を含むことができる。ゲノム領域は、ほぼ同じ長さであることができ、またはゲノムセクションは、異なる長さであることができる。いくつかの実施形態では、ゲノム領域は、ほぼ同じ長さである。いくつかの実施形態では、異なる長さのゲノム領域は、調整または加重される。いくつかの実施形態では、ゲノム領域は、約１０キロベース（ｋｂ）～約５００ｋｂ、約２０ｋｂ～約４００ｋｂ、約３０ｋｂ～約３００ｋｂ、約４０ｋｂ～約２００ｋｂ、および場合によっては約５０ｋｂ～約１００ｋｂである。いくつかの実施形態では、ゲノム領域は、約１００ｋｂ～約２００ｋｂである。ゲノム領域は、配列の連続した実行に限定されない。したがって、ゲノム領域は、連続する配列及び／又は非連続する配列から構成され得る。ゲノム領域は、単一の染色体に限定されない。いくつかの実施形態では、ゲノム領域は、１つの染色体の全てもしくは一部、または２つ以上の染色体の全てもしくは一部を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム領域は、１本、２本、またはそれ以上の染色体全体にまたがっていてもよい。さらに、ゲノム領域は、複数の染色体の共同部分または不連続部分にまたがっていてもよい。

【0159】

本明細書で使用する場合、「断片」という用語は、「核酸断片」（例えば、ＤＮＡ断片）と互換的に使用され、少なくとも３つの連続したヌクレオチドからなるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部を意味する。生体試料中に見出される無細胞核酸分子の配列決定という文脈では、「断片」及び「核酸断片」という用語は、互換的に、生体試料又はその表現物中に見出される無細胞核酸分子を指す。このような文脈において、配列決定データ（例えば、全ゲノム配列決定、標的配列決定などからの配列リード）は、このような核酸断片の全部または一部の１つまたは複数のコピーを導出するために使用される。このような配列リードは、実際には、元の核酸断片のＰＣＲ複製物の配列決定から得られてもよく、したがって、核酸断片を「代表」または「支持」する。生物学的試料（例えば、ＰＣＲ複製物）中の特定の核酸断片を各々代表または支持する複数の配列リードが存在してもよい。いくつかの実施形態では、核酸断片は、無細胞核酸とみなすことができる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ重複物からの配列読み取りは、誤解を招く可能性がある；例えば、特定の無細胞核酸分子の存在量レベルを決定する必要がある場合などである。そのような実施形態では、核酸断片の１つのコピーだけが、元の無細胞核酸分子を表すために使用される（例えば、ライブラリ調製プロセス中に無細胞核酸分子に付けられる分子識別子によって重複が除去される）。いくつかの実施形態において、メチル化配列決定データは、これらの核酸断片をさらに区別するために使用され得る。例えば、同一またはほぼ同一の配列を共有する２つの核酸断片は、それぞれが異なるメチル化パターンを保有する場合、依然として異なる元の無細胞核酸分子に対応する可能性がある。

【0160】

いくつかの実施形態では、２つのフラグメントは、それぞれのフラグメント配列が、２ヌクレオチド未満、３ヌクレオチド未満、４ヌクレオチド未満、５ヌクレオチド未満、６ヌクレオチド未満、７ヌクレオチド未満で互いに異なる場合に、ほぼ同一の核酸配列を共有するとみなされる。８ヌクレオチド未満、９ヌクレオチド未満、１０ヌクレオチド未満、１５ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、３５ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、４５ヌクレオチド未満または５０ヌクレオチド未満で。 いくつかの実施形態では、２つのフラグメントは、それぞれのフラグメント配列が、全ヌクレオチドの１％未満、全ヌクレオチドの２％未満、全ヌクレオチドの３％未満、全ヌクレオチドの４％未満、または全ヌクレオチドの５％未満だけ互いに異なる場合に、ほぼ同一の配列を共有すると見なされる。

【0161】

いくつかの実施形態では、それぞれの（例えば、第１又は第２の）複数の核酸断片からの第１の断片は、参照ゲノム内の第１の位置に整列され、それぞれの（例えば、第１又は第２の）複数の核酸断片からの第２の断片は、参照ゲノム内の第２の位置に整列される。いくつかの実施形態では、第１の位置及び第２の位置は、参照ゲノム内の異なる領域に対応する。いくつかの実施形態では、第１の位置及び第２の位置は、同じ位置である（例えば、第１の位置及び第２の位置は、参照ゲノムの同じ領域に対応する）。いくつかの実施形態では、第１および第２の位置は、少なくとも１残基、少なくとも２残基、少なくとも３残基、少なくとも４残基、少なくとも５残基、少なくとも６残基、少なくとも７残基、少なくとも８残基、少なくとも９残基、少なくとも１０残基、少なくとも１１残基、少なくとも１２残基、少なくとも１３残基で参照ゲノムにおいて重なる。少なくとも１４残基によって、少なくとも１５残基によって、少なくとも１６残基によって、少なくとも１７残基によって、少なくとも１８残基によって、少なくとも１９残基によって、少なくとも２０残基によって、少なくとも３０残基によって、少なくとも４０残基によって、少なくとも５０残基によって、少なくとも６０残基によって、少なくとも７０残基によって、少なくとも８０残基によって、少なくとも９０残基によって、または少なくとも１００残基によって、である。いくつかの実施形態では、第１の位置と第２の位置は、参照ゲノムにおいて１～５０残基の間で重なる。

【0162】

いくつかの実施形態では、それぞれの断片は、参照ゲノムの少なくとも第１の場所および第２の場所にマッピングされる（例えば、それぞれの断片に対応する核酸配列は、参照ゲノムの少なくとも２つの異なる場所に存在する）。いくつかの実施形態では、それぞれの断片は、参照ゲノムの少なくとも３箇所、少なくとも４箇所、少なくとも５箇所、少なくとも６箇所、少なくとも７箇所、少なくとも８箇所、少なくとも９箇所、少なくとも１０箇所、少なくとも１１箇所、少なくとも１２箇所、少なくとも１３箇所、少なくとも１４箇所、少なくとも１５箇所、少なくとも１６箇所、少なくとも１７箇所、少なくとも１８箇所、少なくとも１９箇所または少なくとも２０箇所にマッピングされる。いくつかの実施形態では、参照ゲノムの少なくとも２つのマッピングされた位置は、参照ゲノムにおいて、少なくとも１残基、少なくとも５残基、少なくとも１０残基、少なくとも２５残基、少なくとも５０残基、少なくとも１００残基、少なくとも２００残基、少なくとも３００残基、少なくとも４００残基、少なくとも５００残基、少なくとも６００残基、少なくとも７００残基、少なくとも８００残基、少なくとも９００残基、または少なくとも１０００残基によって互いに離間している。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのマッピングされた位置は、参照ゲノム中の異なる遺伝子を構成する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのマッピングされた位置は、参照ゲノムの異なる染色体上に位置する。

【0163】

核酸断片は、親ポリヌクレオチドの生物学的活性および／またはいくつかの特性を保持することができる。一例として、鼻咽頭癌細胞は、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）ＤＮＡの断片を対象、例えば、患者の血流に沈着させ得る。これらの断片は、血漿中の腫瘍由来ＤＮＡのレベルを検出するために使用することができる１つ以上のＢａｍＨＩ－Ｗ配列断片を含むことができる。ＢａｍＨＩ－Ｗ配列断片は、Ｂａｍ－ＨＩ制限酵素を用いて認識及び／又は消化することができる配列に相当する。ＢａｍＨＩ－Ｗ配列は、配列５’－ＧＧＡＴＣＣ－３’を参照することができる。

【0164】

さらに、ポリヌクレオチドは、例えば、生体試料内に自然に存在するｃｆＤＮＡ断片のように自然のプロセスによって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏの操作によって、複数のセグメントに分割、または断片化されることが可能である。核酸を断片化する様々な方法は、当技術分野でよく知られている。これらの方法は、例えば、化学的または物理的または酵素的な性質のいずれかであってよい。酵素的断片化には、ＤＮａｓｅによる部分分解；酸による部分脱プリンティング；制限酵素の使用；イントロンにコードされたエンドヌクレアーゼ；核酸セグメントの特定のハイブリダイゼーションに依存して切断剤を核酸分子の特定の位置に局在させるトリプレックスおよびハイブリッド形成法などのＤＮＡベースの切断方法；または既知もしくは未知の位置でポリヌクレオチドを切断する他の酵素もしくは化合物などが含まれ得る。物理的断片化方法は、ポリヌクレオチドを高い剪断速度にさらすことを含むことができる。高いせん断速度は、例えば、ピットまたはスパイクを有するチャンバーまたはチャネルを通してＤＮＡを動かすこと、または制限されたサイズの流路、例えば、ミクロンまたはサブミクロンの範囲の断面寸法を有するアパーチャーを通してＤＮＡ試料を強制的に流すことによって生じることがある。その他の物理的方法としては、超音波処理、ネブライゼーションなどがある。物理的および化学的断片化方法の組み合わせも同様に、熱による断片化およびイオン媒介性加水分解のようなものを採用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、３ｒｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ． （２００１） （”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．”） を参照し、これは、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。これらの方法は、核酸を選択されたサイズ範囲の断片に消化するように最適化することができる。

【0165】

本明細書で使用される場合、用語「配列読み取り」または「読み取り」は、本明細書に記載されるまたは当該技術分野で既知の任意の配列決定プロセスによって生成されるヌクレオチド配列を指す。リードは、核酸断片の一端から生成され得（「シングルエンドリード」）、時には核酸の両端から生成される（例えば、ペアエンドリード、ダブルエンドリード）。いくつかの実施形態では、配列リード（例えば、シングルエンドリード又はペアエンドリード）は、標的核酸断片の片方の鎖又は両方の鎖から生成され得る。配列リードの長さは、しばしば、特定の配列決定技術に関連付けられる。例えば、ハイスループット法は、数十から数百の塩基対（ｂｐ）の大きさで変化し得る配列リードを提供する。いくつかの実施形態では、配列リードは、約１５ｂｐ～９００ｂｐ長の平均、中央値、または平均長さ（例えば．約２０ｂｐ、約２５ｂｐ、約３０ｂｐ、約３５ｂｐ、約４０ｂｐ、約４５ｂｐ、約５０ｂｐ、約５５ｂｐ、約６０ｂｐ、約６５ｂｐ、約７０ｂｐ、約７５ｂｐ、約８０ｂｐ、約８５ｂｐ、約９０ｂｐ，約９５ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０ｂｐ、約１２０ｂｐ、約１３０、約１４０ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、又は約５００ｂｐである。いくつかの実施形態では、配列リードは、約１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、５０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、または５０，０００ｂｐ以上の平均、中央値または平均長さである。ナノポアシークエンシングは、例えば、数十から数百から数千の塩基対の大きさで変化し得る配列リードを提供し得る。イルミナパラレルシーケンスは、それほど変化しないシーケンスリードを提供することができ、例えば、シーケンスリードの大部分は２００ｂｐより小さくすることができる。配列リード（または配列決定リード）は、核酸分子（例えば、ヌクレオチドの文字列）に対応する配列情報を指すことができる。例えば、配列読み取りは、核酸断片の一部からのヌクレオチドの列（例えば、約２０～約１５０）に対応することができ、核酸断片の一方または両方の末端のヌクレオチドの列に対応することができ、または核酸断片全体のヌクレオチドに対応することができる。配列読み取りは、様々な方法、例えば、配列決定技術を使用して、またはプローブ、例えば、ハイブリダイゼーションアレイまたは捕捉プローブにおいて、または増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または単一のプライマーを使用する線形増幅または等温増幅を使用して、得ることができる。

【0166】

本明細書で開示するように、本明細書で使用する「配列決定」、「配列決定」等の用語は、核酸またはタンパク質等の生体高分子の順序を決定するために使用され得る任意のおよびすべての生化学プロセスを一般に指す。例えば、配列決定データは、ＤＮＡ断片などの核酸分子におけるヌクレオチド塩基の全てまたは一部を含むことができる。

【0167】

本明細書で開示するように、用語「一塩基変異体」または「ＳＮＶ」は、ヌクレオチド配列、例えば、個体から読み取った配列の位置（例えば、部位）における、１つのヌクレオチドの異なるヌクレオチドへの置換をいう。第１の核酸塩基Ｘから第２の核酸塩基Ｙへの置換は、”Ｘ＞Ｙ”と表記されることがある。例えば、シトシンからチミンへのＳＮＶは、”Ｃ＞Ｔ”と表記されることがある。

【0168】

本明細書で使用されるように、用語「メチル化プロファイル」（メチル化状態とも呼ばれる）は、ある領域についてのＤＮＡメチル化に関連する情報を含むことができる。ＤＮＡメチル化に関連する情報は、ＣｐＧ部位のメチル化指数、領域内のＣｐＧ部位のメチル化密度、連続する領域にわたるＣｐＧ部位の分布、複数のＣｐＧ部位を含む領域内の個々のＣｐＧ部位に対するメチル化のパターン又はレベル、及び非ＣｐＧメチル化を含むことができる。ゲノムの相当部分のメチル化プロファイルは、メチロームと同等と考えることができる。哺乳類ゲノムにおける「ＤＮＡメチル化」は、ＣｐＧジヌクレオチドのうち、シトシンの複素環の５位へのメチル基の付加（例えば、５－メチルシトシンを生成する）を指すことができる。シトシンのメチル化は、例えば５’－ＣＨＧ－３’および５’－ＣＨＨ－３’のような他の配列コンテキストにおけるシトシンで起こり得るが、ここでＨはアデニン、シトシンまたはチミンである。シトシンのメチル化は、５－ヒドロキシメチルシトシンの形態でもあり得る。ＤＮＡのメチル化は、Ｎ６－メチルアデニンなどの非シトシンヌクレオチドのメチル化も含むことができる。

【0169】

本明細書で使用する「メチローム」は、ゲノム中の複数の部位または遺伝子座におけるＤＮＡメチル化量の指標とすることができる。メチロームは、ゲノムの全て、ゲノムのかなりの部分、又はゲノムの比較的小さな部分（複数可）に対応することができる。腫瘍メチローム」は、対象（例えば、ヒト）の腫瘍のメチロームとすることができる。腫瘍メチロームは、腫瘍組織または血漿中の無細胞腫瘍ＤＮＡを用いて決定することができる。腫瘍メチロームは、関心のあるメチロームの一例であり得る。核酸、例えばＤＮＡを体液中に供給することができる臓器（例えば、脳細胞、骨、肺、心臓、筋肉、腎臓などのメチローム）のメチロームが対象となり得る。臓器は移植された臓器でもよい。

【0170】

本明細書で使用する場合、各ゲノム部位（例えば、ＣｐＧ部位、その５’→３’方向に沿った塩基の直線配列においてシトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドに続いているＤＮＡの領域）の「メチル化指数」の用語は、その部位を覆う核酸断片の総数に対するその部位でのメチル化を示す核酸断片の比率を指すことができる。領域の「メチル化密度」は、メチル化を示す領域内の部位における読み取りの数を、その領域内の部位を覆う読み取りの総数で割ったものとすることができる。部位は、特定の特徴を有することができる（例えば、部位は、ＣｐＧ部位であり得る）。ある領域の「ＣｐＧメチル化密度」は、ＣｐＧメチル化を示すリードの数を、その領域（例えば、特定のＣｐＧ部位、ＣｐＧ島内のＣｐＧ部位、またはより大きな領域）内のＣｐＧ部位をカバーするリードの総数で割った値とすることができる。例えば、ヒトゲノムの各１００ｋｂビンに対するメチル化密度は、１００ｋｂ領域にマップされた核酸断片によってカバーされる全てのＣｐＧ部位の割合として、ＣｐＧ部位における非変換シトシン（メチル化シトシンに対応し得る）の総数から決定することができる。いくつかの実施形態では、この分析は、他のビンサイズ、例えば、５０－ｋｂ又は１－ＭＢなどに対して行われる。いくつかの実施形態において、領域は、ゲノム全体又は染色体又は染色体の一部（例えば、染色体腕）である。ＣｐＧ部位のメチル化指標は、領域がそのＣｐＧ部位のみを含む場合の領域のメチル化密度と同じであることができる。メチル化シトシンの割合」は、例えば、ＣｐＧ文脈の外側のシトシンを含む、領域内の分析されたシトシン残基の総数に対して、メチル化されている（例えば、バイサルファイト変換後に変換されていない）ことが示されたシトシン部位「Ｃの数」を指すことができる。メチル化指数、メチル化密度、メチル化シトシンの割合などは、”メチル化レベル ”の一例である。

【0171】

本明細書で使用する場合、「血漿メチローム」は、動物（例えば、ヒト）の血漿又は血清から決定されるメチロームであり得る。血漿及び血清は無細胞ＤＮＡを含み得るので、血漿メチロームは、無細胞メチロームの一例であり得る。血漿メチロームは、腫瘍／患者メチロームの混合物であり得るので、混合メチロームの一例となり得る。細胞メチローム」は、対象、例えば、患者の細胞（例えば、血液細胞又は腫瘍細胞）から決定されるメチロームであり得る。血球のメチロームは、血球メチローム（または血液メチローム）と呼ぶことができる。

【0172】

本明細書で使用される場合、用語「異常なメチル化パターン」又は「異常なメチル化パターン」は、閾値よりも低い頻度で試料中に見出されると予想されるメチル化状態ベクトル、メチル化パターン又は該メチル化状態ベクトルを有するＤＮＡ分子のメチル化状態を意味する。本明細書で提供される特定の実施形態では、健康な個体からなる健康な対照群において特定のメチル化状態ベクトルを見出すことの期待度は、ｐ値によって表される。いくつかの実施形態では、メチル化状態ベクトルのｐ値は、２０２０年５月２２日に出願された「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｗｈｅｔｈｅｒ ａ Ｓｕｂｊｅｃｔ ｈａｓ ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｌｅａｒｎｉｎｇ」と題するＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３４３１７の例５、及び２０１９年３月１３日に出願され、現在ＵＳ２０１９／０２８７６５２として公開されている「Ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願番号１６／３５２，６０２で説明されているように決定され、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。低いｐ値スコアは、それによって、一般に、健常対照群における健常者からのサンプル内の他のメチル化状態ベクトルと比較して、比較的予期しないメチル化状態ベクトルに相当する。高いｐ値スコアは、一般に、健康な対照群の健康な個体からのサンプル内に見出される他のメチル化状態ベクトルと比較して、相対的により期待されるメチル化状態ベクトルに相当する。閾値（例えば、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１など）より低いｐ値を有するメチル化状態ベクトルは、異常メチル化パターンと定義することができる。メチル化パターンまたはメチル化状態ベクトルのｐ値または期待値を計算するために、当技術分野で知られている様々な方法を使用することができる。本明細書で提供される例示的な方法は、ＣｐＧ部位のメチル化状態が隣接するＣｐＧ部位のメチル化状態に依存すると仮定するマルコフ連鎖確率の使用を含む。本明細書で提供される代替方法は、複数の混合成分を含む混合モデルを利用することにより、健康な個体において特定のメチル化状態ベクトルを観察する期待度を計算し、各ＣｐＧ部位におけるメチル化が他のＣｐＧ部位におけるメチル化状態から独立していると仮定される独立部位モデルである。本明細書で提供される方法は、異常なメチル化パターンを有するゲノム領域を使用する。ゲノム領域に対応する又はゲノム領域に由来するｃｆＤＮＡ断片が、参照試料において閾値よりも少ない頻度で現れるメチル化状態ベクトルを有する場合、ゲノム領域は異常なメチル化パターンを有すると決定され得る。参照サンプルは、対照被験者または健康な被験者からのサンプルであり得る。参照試料にメチル化状態ベクトルが出現する頻度は、ｐ値スコアとして表すことができる。ゲノム領域に対応する又はゲノム領域に由来するｃｆＤＮＡ断片が単一の均一なメチル化状態ベクトルを有しない場合、ゲノム領域は、複数のメチル化状態ベクトルに対して複数のｐ値スコアを有することができる。この場合、複数のｐ値スコアは、閾値と比較される前に、合計または平均化され得る。ゲノム領域に対応するｐ値スコアと閾値との比較には、算術平均、幾何平均、調和平均、中央値、最頻値など、当技術分野で知られる様々な方法を採用することができるが、これらに限定されるものではない。

【0173】

本明細書で使用する場合、用語「相対的存在量」は、特定の特性（例えば、特定の長さ、１つ以上の特定の座標／終端位置で終わる、ゲノムの特定の領域に整列する、または特定のメチル化状態を有する）を有する第１の量の核酸断片と特定の特性（例えば、特定の長さ、１つ以上の特定の座標／終端位置で終わる、またはゲノムの特定の領域に整列する）を有する第２の量の核酸断片の比率を意味し得る。一例では、相対的存在量は、ゲノム位置の第１のセットで終わるＤＮＡ断片の数とゲノム位置の第２のセットで終わるＤＮＡ断片の数の比率を指す場合がある。いくつかの態様において、「相対的存在量」は、ゲノム位置の１つのウィンドウ内で終わる無細胞ＤＮＡ分子の量（１つの値）を、ゲノム位置の別のウィンドウ内で終わる無細胞ＤＮＡ分子の量（他の値）に関連付ける分離値の一種であり得る。つのウィンドウは重なり合うことができるが、異なるサイズであることができる。他の実施形態では、２つのウィンドウは重なり得ない。さらに、いくつかの実施形態では、ウィンドウは１ヌクレオチドの幅であり、したがって、１ゲノム位置と等価である。

【0174】

メチル化とは、シトシン塩基のピリミジン環上の水素原子をメチル基に変換し、５－メチルシトシンを形成するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の修飾を意味する。特に、メチル化は、シトシンとグアニンのジヌクレオチド（本明細書では「ＣｐＧ部位」と呼ぶ）で起こりがちである。他の例では、メチル化は、ＣｐＧ部位の一部ではないシトシン、またはシトシン以外の別のヌクレオチドで起こり得るが、これらは稀な発生である。本開示では、メチル化は、明確化のために、ＣｐＧ部位を参照して議論される。異常なｃｆＤＮＡのメチル化は、ハイパーメチル化又はハイポメチル化として同定され、その両方が、癌の状態を示す可能性がある。当技術分野でよく知られているように、ＤＮＡメチル化異常は（健康な対照と比較して）異なる効果を引き起こし、癌に寄与する可能性がある。

【0175】

メチル化異常のあるｃｆＤＮＡ断片の同定には、様々な課題がある。まず、被験者のｃｆＤＮＡが異常にメチル化されていると判定することは、対照群との比較においてのみ重要であり、対照群の数が少ない場合には、判定が信頼できなくなる。さらに、対照群となる被験者のメチル化状態は様々であり、被験者のｃｆＤＮＡが異常にメチル化されていると判定する際に考慮することが困難な場合がある。また、あるＣｐＧ部位のシトシンのメチル化は、その後に続くＣｐＧ部位のメチル化に因果関係があるとされている。

【0176】

当業者であれば、本明細書に記載された原理は、非シトシンメチル化を含む非ＣｐＧコンテキストにおけるメチル化の検出にも同様に適用可能であることを理解されるであろう。

【0177】

本明細書に開示されるように、用語「被験体」は、ヒト（例えば、男性ヒト、女性ヒト、胎児、妊娠中の女性、子供など）、非ヒト動物、植物、細菌、真菌、または原生生物を含むがこれらに限定されない、任意の生物または非生物のことをいう。任意のヒトまたは非ヒト動物が被験体として機能し得、これには、哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、無蹄類、反芻動物、ウシ（例えば、牛）、馬（例えば、馬）、カプリンおよびオビ（例えば、，羊、山羊）、豚（例えば、豚）、ラクダ科（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ）、猿、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー）、羆（例えば、熊）、鶏、犬、猫、ネズミ、魚、イルカ、鯨、サメを指す。用語「対象」及び「患者」は、本明細書において互換的に使用され、例えば癌などの医学的状態又は障害を有することが知られている、又は潜在的に有するヒト又は非ヒト動物に言及する。いくつかの実施形態では、対象は、任意の段階の雄又は雌（例えば、男、女、又は子供）である。

【0178】

試料が採取される、又は本明細書に記載の方法若しくは組成物のいずれかによって処理される対象は、任意の年齢であり得、成人、乳児、又は子供であることが可能である。いくつかの態様において、被験体、例えば．患者は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５３．５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９歳、またはその範囲内（ｅ．ｇ．，約２歳と約２０歳の間、約２０歳と約４０歳の間、または約４０歳と約９０歳の間）。本開示の方法から利益を得ることができる被験者、例えば、患者の特定のクラスは、被験者、例えば、４０歳を超える患者である。

【0179】

本開示の方法から利益を得ることができる被験者、例えば、患者の別の特定のクラスは、慢性心臓症状のリスクがより高くなり得る小児科患者である。さらに、サンプルが採取される、または本明細書に記載の方法もしくは組成物のいずれかによって治療される対象、例えば、患者は、男性または女性であり得る。

【0180】

本明細書で使用する「正規化」という用語は、比較目的のために、値または値の集合を共通の参照枠に変換することを意味する。例えば、診断用ｃｔＤＮＡレベルがベースラインｃｔＤＮＡレベルで「正規化」される場合、診断用ｃｔＤＮＡレベルは、診断用ｃｔＤＮＡレベルがベースラインｃｔＤＮＡレベルと異なる量を決定することができるように、ベースラインｃｔＤＮＡレベルと比較される。

【0181】

本明細書で使用する「癌」または「腫瘍」という用語は、組織の異常な塊で、その塊の成長が正常な組織の成長を上回り、協調しないものを指す。癌または腫瘍は、形態および機能性を含む細胞分化の程度、成長速度、局所浸潤および転移などの特徴に応じて、「良性」または「悪性」と定義することができる。良性腫瘍は、分化度が高く、悪性腫瘍と比較して成長が遅く、発生部位に限局していることが特徴である。さらに、良性腫瘍は遠隔部位への浸潤、浸潤、転移の能力がない場合もある。悪性腫瘍は、低分化（未分化）であり、周囲組織への浸潤、浸潤、破壊を進行させながら急速に増殖することが特徴である。さらに、悪性腫瘍は遠隔部位への転移能を有することもある。

【0182】

本明細書で使用する場合、「がんのレベル」という用語は、がんが存在するかどうか（例えば、存在するかどうか）、がんのステージ、腫瘍のサイズ、転移の有無、身体の総腫瘍負担、及び／又はがんの深刻さ（例えば、がんの再発）の他の指標を指す。癌のレベルは、数字、または記号、アルファベット文字、色などの他の指標とすることができる。レベルは、ゼロであり得る。癌のレベルは、突然変異または突然変異の数に関連する前悪性または前癌状態（ｓｔａｔｅ）も含むことができる。癌のレベルは、様々な方法で使用することができる。例えば、スクリーニングでは、これまで癌であることが知られていない人に癌が存在するかどうかを調べることができる。評価は、癌と診断された人を調査して、経時的な癌の進行を監視し、治療の有効性を調査し、または予後を決定することができる。一実施形態では、予後は、被験者が癌で死亡する確率、又は特定の期間若しくは時間の後に癌が進行する確率、又は癌が転移する確率として表すことができる。検出は、「スクリーニング」を構成することができ、または、癌の示唆的な特徴（例えば、症状または他の陽性試験）を有する誰かが、癌を有するかどうかを確認することを構成することができる。

【0183】

用語「癌負荷」、「腫瘍負荷」、「癌負荷」及び「腫瘍負荷」は、試験試料中の腫瘍由来核酸の濃度又は存在を指すために、本明細書において互換的に使用される。このように、用語「癌負荷」、「腫瘍負荷」、「癌負荷」及び「腫瘍負荷」は、生体試料中の細胞源画分又は腫瘍画分の非限定的な例である。いくつかの実施形態において、腫瘍画分は、細胞源画分の特定バージョンである。

【0184】

本明細書で使用する場合、「組織」という用語は、機能単位としてまとまった細胞群に相当する。複数の種類の細胞が１つの組織に存在することもある。異なるタイプの組織は、異なるタイプの細胞（例えば、肝細胞、肺胞細胞又は血球）から構成され得るが、異なる生物（母親対胎児）からの組織又は健康な細胞対腫瘍細胞に対応することもできる。組織」という用語は、一般に、人体に見られる任意の細胞群（例えば、心臓組織、肺組織、腎臓組織、鼻咽頭組織、中咽頭組織）を指すことができる。いくつかの態様において、用語「組織」または「組織型」は、無細胞核酸が由来する組織を指すために使用され得る。一例では、ウイルス核酸断片は血液組織に由来することができる。別の例では、ウイルス核酸断片は、腫瘍組織に由来することができる。

【0185】

本書では，「未学習の分類器」という用語は，ターゲットデータセットで学習されていない分類器を指する．しかし、未訓練の分類器は、一次データセット（例えば、小規模及び／又は参照データセット）上で部分的に訓練されることがある。未訓練分類器」という用語は、未訓練分類器のそのような訓練において、転移学習技術が使用される可能性を排除しないことが理解されるであろう。例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら ， ２０１７， ”Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｐａｒｔｉａｌ Ｏｂｓｅｒｖａｂｉｌｉｔｙ Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，” Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： ８ｔｈ Ｉｂｅｒｉａｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ， ２４３－２５０（参照によりここに組み込まれる）は、かかる転送学習の非制限的な例を提供するものである。移転学習が使用される場合、未訓練の分類器には、主要な訓練データセットのデータを超える追加のデータが提供される。典型的には、この追加データは、別の補助的な学習データセットから学習された係数（例えば、回帰係数）の形式である。さらに、単一の補助訓練データセットについての説明が開示されてきたが、本開示において未訓練分類器を訓練する際に一次訓練データセットを補完するために使用され得る補助訓練データセットの数には制限がないことが理解されよう。例えば、いくつかの実施形態では、２つ以上の補助訓練データセット、３つ以上の補助訓練データセット、４つ以上の補助訓練データセット、又は５つ以上の補助訓練データセットが、転移学習によって一次訓練データセットを補完するために用いられ、かかる各補助データセットは一次訓練データセットとは異なるものである。このような実施形態では、任意の態様の転移学習が使用されてもよい。例えば、一次訓練データセットに加えて、第一補助訓練データセットと第二補助訓練データセットとが存在する場合を考える。第１の補助訓練データセットから学習された係数は、（第１の補助訓練データセットへの回帰などの分類器の適用によって）、伝達学習技術（例えば、上述の２次元行列の乗算）を用いて第２の補助訓練データセットに適用されてもよく、その結果、その係数が次に第１の訓練データセットに適用されて、これが、第１の訓練データセット自体と共に、未訓練分類器へ適用される訓練済み中間分類器が得られてもよい。あるいは、第一補助訓練データセットから学習された係数の第一セット（第一補助訓練データセットへの回帰などの分類器の適用による）と第二補助訓練データセットから学習された係数の第二セット（第二補助訓練データセットへの回帰などの分類器の適用による）をそれぞれ個別に第一訓練データセットの別々のインスタンスに（例えば、独立した行列の乗算によって）適用しても良い。一次訓練データセット自体（または一次訓練セットから学習された主成分または回帰係数のような一次訓練データセットの何らかの縮小形態）と共に、一次訓練データセットの別々のインスタンスへの係数のそのような適用の両方は、次に、未訓練の分類器を訓練するために、未訓練分類器に適用されてもよい。いずれの例でも、第１及び第２の補助訓練データセットから得られる細胞源（例えば、癌の種類など）に関する知識は、細胞源にラベル付けされた一次訓練データセット）と共に、未訓練の分類器を訓練するために使用される。

【0186】

「分類」という用語は、試料の特定の性質に関連付けられた任意の番号または他の文字を指すことができる。例えば、「＋」記号（又は「陽性」という単語）は、サンプルが欠失又は増幅を有するものとして分類されることを意味し得る。別の例では、用語「分類」は、対象及び／又は試料中の腫瘍組織の量、対象及び／又は試料中の腫瘍の大きさ、対象中の腫瘍のステージ、対象及び／又は試料中の腫瘍負荷、並びに対象中の腫瘍転移の存在を意味する。いくつかの実施形態では、分類は、二値（例えば、陽性又は陰性）であるか、又はより多くのレベルの分類（例えば、１～１０又は０～１のスケール）を有する。いくつかの実施形態において、用語「カットオフ」及び「閾値」は、操作で使用される所定の数値を指す。一例では、カットオフサイズとは、フラグメントが除外される以上のサイズを指す。いくつかの実施形態では、閾値は、特定の分類が適用される上または下の値を指す。これらの用語のいずれかは、これらの文脈のいずれでも使用することができる。

【0187】

本明細書で使用する場合、用語「癌関連変化」または「癌特異的変化」には、癌由来の変異（一塩基変異、ヌクレオチドの欠失または挿入、遺伝子または染色体セグメントの欠失、転座、逆位を含む）、遺伝子の増幅、ウイルス関連配列（例えば、ウイルスエピソーム、ウイルス挿入物、細胞に感染しその後細胞から放出されるウイルスＤＮＡ、循環または無細胞ウイルスＤＮＡ）などを含めることができる。異常なメチル化プロファイルまたは腫瘍特異的メチル化シグネチャー、異常な無細胞核酸（例えば、ＤＮＡ）サイズプロファイル、異常なヒストン修飾マークおよび他のエピジェネティック修飾、および癌関連または癌特異的な無細胞ＤＮＡ断片の末端の位置など）。

【0188】

本明細書で使用される場合、用語「対照」、「対照試料」、「参照」、「参照試料」、「正常」、及び「正常試料」は、特定の状態を有さない、又は他の点では健康である対象からの試料を表す。一例では、本明細書に開示されるような方法は、腫瘍を有する対象に対して実行することができ、ここで、参照サンプルは、対象の健康な組織から採取されたサンプルである。参照試料は、対象から取得することも、データベースから取得することも可能である。参照は、例えば、対象からの試料から得られた核酸断片をマッピングするために使用される参照ゲノムであり得る。参照ゲノムは、生体試料及び体質的試料からの核酸断片をアライメントして比較することができるハプロイド又は二倍体ゲノムを指すことができる。体質的サンプルの例としては、被験者から得られた白血球のＤＮＡを挙げることができる。ハプロイドゲノムの場合、各遺伝子座に１つだけヌクレオチドが存在することがある。２倍体ゲノムの場合、ヘテロ接合性遺伝子座を特定することができる。各ヘテロ接合性遺伝子座は２つの対立遺伝子を持つことができ、どちらの対立遺伝子も遺伝子座へのアライメントに一致させることが可能である。

【0189】

いくつかの態様は、説明のための例示的なアプリケーションを参照して以下に説明される。多数の特定の詳細、関係、および方法が、本明細書に記載される特徴の完全な理解を提供するために記載されることを理解されたい。しかしながら、関連する技術において通常の技能を有する者は、本明細書に記載される特徴が、特定の詳細の１つ以上なしに、または他の方法を用いて実施され得ることを容易に認識するであろう。いくつかの行為は異なる順序で及び／又は他の行為又は事象と同時に起こり得るので、本明細書に記載された特徴は、行為又は事象の図示された順序によって制限されない。さらに、本明細書に記載された特徴に従った方法論を実施するために、図示された全ての行為または事象が必要なわけではない。

【0190】

システムの例示的な実施形態。

【0191】

ここで、例示的なシステムの詳細が、図１と共に説明される。図１は、いくつかの実装に従ったシステム１００を例示するブロック図である。いくつかの実装におけるデバイス１００は、１つまたは複数の処理ユニットＣＰＵ（複数可）１０２（プロセッサまたは処理コアとも呼ばれる）、１つまたは複数のネットワークインターフェース１０４、ユーザインターフェース１０６、非永続メモリ１１１、永続メモリ１１２、およびこれらのコンポーネントを相互接続するための１つまたは複数の通信バス１１４を含む。つ以上の通信バス１１４は、任意に、システムコンポーネント間の通信を相互接続し制御する回路（チップセットと呼ばれることもある）を含む。非永続的メモリ１１１は、典型的には、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＤＲ ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリなどの高速ランダムアクセスメモリを含み、一方、持続的メモリ１１２は、典型的には、ＣＤ－ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）または他の光ストレージ、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスクストレージまたは他の磁気ストレージ装置、磁気ディスクストレージ装置、光ディスクストレージ装置、フラッシュメモリ装置、または他の非揮発性の固体ストレージ装置などである。永続的メモリ１１２は、任意選択で、ＣＰＵ（ｓ）１０２から遠隔に位置する１つ以上のストレージデバイスを含む。永続的メモリ１１２、および非永続的メモリ１１２内の不揮発性メモリ装置（複数可）は、非一過性のコンピュータ可読記憶媒体を構成する。いくつかの実装では、非永続的メモリ１１１または代替的に非一過性のコンピュータ可読記憶媒体は、以下のプログラム、モジュールおよびデータ構造、またはそのサブセットを、時には永続的メモリ１１２と組み合わせて格納する。
オプションのオペレーティングシステム１１６は、様々な基本システムサービスを処理するための手順と、ハードウェアに依存するタスクを実行するための手順を含んでいる。
システム１００を他の装置、または通信ネットワークと接続するための、オプションのネットワーク通信モジュール（または命令）１１８。
被験者の生体試料中の被験者の細胞源割合１５８を決定するための細胞源割合推定モジュール１２０と、を備える。
それぞれの訓練対象１２４（例えば、１２４－１、・・・、１２４－Ｚ、ここでＺは１より大きい正の整数）ごとに、それぞれの訓練対象のそれぞれの無細胞断片１２６（例えば、１２６－１－Ｘ、・・・、１２６－１－Ｙ、ここでＸ及びＹはＸより大きいＹの任意の正の整数）に対して少なくとも（ｉ）対応するメチル化パターン１２８（例えば、。１２８－１－Ｘ）であって、少なくとも、それぞれの無細胞断片における各ＣｐＧ部位１３０（例えば、１３０－１－Ｘ－Ａ、・・・、１３０－１－Ｘ－Ｑ）のそれぞれのメチル化状態から決定されるもの、及び（ｉｉ）それぞれの訓練対象の対応する対象癌表示１３６を提供する。
被検者の生体試料に由来する複数の無細胞断片中の各無細胞断片１４２（例えば、１４２－Ｇ、・・・、１４２－Ｈ、Ｇ及びＨはＧよりも大きい正の整数）に対して、（ｉ）少なくとも各ＣｐＧ部位１４８（例えば。１４６－Ｇ－Ｍ、・・・、１４６－Ｇ－Ｎ、・・・、１４６－Ｈ－Ｏ、・・・１４６Ｈ－Ｐ、ここでＭ、Ｎ、Ｏ及びＰは正の整数）、（ｉｉ）それぞれの無細胞断片におけるそれぞれのビンマッピング１４８（例えば、１４８－Ｇ、・・・、１４８Ｈ）、（ｉｉｉ）それぞれの予測された無細胞断片癌状態１５０（例えば、。１５０－Ｇ、．．．、１５０－Ｈ）、被験体データセットは、中心傾向の第１の尺度１５２、中心傾向の第２の尺度１５４、及び推定細胞源割合１５６を更に含む。

【0192】

本開示に従って、それぞれの無細胞断片の対応するビンマッピング１３２（例えば、１３２－１－Ｘ）及びそれぞれの無細胞断片の癌状態１３４（例えば、１３４－１－Ｘ）の割り当てがなされる。便宜上及び解釈の容易さのために、これらのデータ構成は、トレーニングデータセットにあるものとして示される。しかしながら、典型的な実施形態では、このようなデータ構築物は、トレーニングセット内の無細胞断片のメチル化パターンから計算され、元のデータセットの一部ではない。他の実施形態では、ビンマッピング１３２及び無細胞断片癌状態は、取得されるトレーニングデータセット１２２の一部である。

【0193】

いくつかの実施態様によれば、上記特定された要素の１つまたは複数は、先に述べたメモリデバイスの１つまたは複数に格納され、上述した機能を実行するための命令のセットに対応する。上記特定されたモジュール、データ、またはプログラム（例えば、命令のセット）は、別々のソフトウェアプログラム、手順、データセット、またはモジュールとして実装される必要はなく、したがって、これらのモジュールおよびデータの様々なサブセットは、様々な実装において組み合わせられるか、さもなければ再配置されてもよい。いくつかの実装では、非永続的メモリ１１１は、任意に、上記で特定されたモジュールおよびデータ構造のサブセットを格納する。さらに、いくつかの実施形態では、メモリは、上記で説明されていない追加のモジュール及びデータ構造を格納する。いくつかの実施形態では、上記特定された要素の１つ以上は、可視化システム１００が必要なときにかかるデータの全てまたは一部を取り出すことができるように、可視化システム１００のものとは別の、可視化システム１００によってアドレス指定可能なコンピュータシステムに格納される。

【0194】

図１は「システム１００」を描いているが、この図は、本明細書で説明する実装の構造概略図としてよりも、コンピュータシステムに存在し得る様々な特徴の機能的説明として意図されるものである。実際には、また当業者が認識するように、別々に示された項目は組み合わされ得、いくつかの項目は分離され得る。さらに、図１では、非永続的メモリ１１１にある特定のデータおよびモジュールを描いているが、これらのデータセットおよび／またはモジュールの一部または全部は、永続的メモリ１１２にある可能性がある。

【0195】

本開示に従ったシステムが図１を参照して開示されたが、本開示に従った方法が、図２Ａ及び２Ｂ並びに図３Ａ及び３Ｂを参照して今詳細に説明される。開示された方法のいずれかが、被験体における癌の状態または被験体が癌の状態を有する可能性を決定するために、２０１７年１０月２５日に出願された米国特許出願第１５／７９３，８３０号および／または２０１７年１０月２４日の国際出願日を有する国際特許公開番号ＰＣＴ／ＵＳ１７／５８０９９に開示されたアッセイまたはアルゴリズムのいずれかを利用またはそれと連動し得ることが理解でき、その各々は参照によりここに組み込まれるものとする。

【0196】

細胞源比率を推定するための特徴を特定する。

【0197】

ブロック２０２本開示の一態様は、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサによる実行のための１つ以上のプログラムを記憶するメモリとを有するコンピュータシステムにおいて実行される、対象についての細胞源率を推定するための複数の特徴を特定する方法を提供する。

【0198】

いくつかの実施形態では、図２Ａのブロック２０２の細胞源画分は、共通の原発部位の第１の癌状態に対応する。いくつかの実施形態では、細胞源画分は、ある癌種の腫瘍画分、又はその画分に対応する。いくつかの実施形態では、細胞源分画は、第１の癌状態の所定のステージの腫瘍分画に対応する。いくつかの実施形態では、細胞源画分は、１つ又は複数の種類のヒト細胞に由来する。

【0199】

被験者とがんの状態

【0200】

ブロック２０４図２Ａのブロック２０４において、本方法は、電子形式のトレーニングデータセットを取得することによって進行する。訓練データセットは、複数の訓練対象における各訓練対象について、少なくともａ）対応する訓練用複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターン、及びｂ）それぞれの訓練対象の対象癌表示であって、対象癌表示が第１癌状態及び第２癌状態のうちの１つであるものを含む。

【0201】

ブロック２０６に従って、いくつかの実施形態では、複数の訓練対象は、１０～１０００の訓練対象からなる。いくつかの実施形態では、複数の訓練被験者は、少なくとも１０の訓練被験者、少なくとも２５の訓練被験者、少なくとも５０の訓練被験者、少なくとも１００の訓練被験者、少なくとも２５０の訓練被験者、少なくとも５００の訓練被験者、少なくとも７５０の訓練被験者、少なくとも１０００の訓練被験者または少なくとも１５００の訓練被験者からなる。いくつかの実施形態では、複数の訓練科目は、１０～１００，０００の訓練科目、１００～５０，０００の訓練科目、又は１００～１０，０００の訓練科目からなる。

【0202】

いくつかの実施形態では、複数の訓練被験者において、第１の癌状態及び第２の癌状態を有する訓練被験者の数が均衡している（例えば、複数の訓練被験者は、各被験者の癌状態を有する実質的に同数の訓練被験者から構成される）。例えば、複数の訓練被験者が第１の癌状態を有する少なくとも５０人の訓練被験者からなる場合、複数の訓練被験者は、第２の癌状態を有する少なくとも５０人の訓練被験者からもなり、又は複数の訓練被験者が第１の癌状態を有する少なくとも５００人の訓練被験者からなる場合、複数の訓練被験者は、第２の癌状態を有する少なくとも５００人の訓練被験者からもなる。いくつかの実施形態では、訓練被験者の５％以上９５％以下が第１の癌の状態を有し、残りが第２の癌の状態を有している。

【0203】

いくつかの実施形態では、訓練被験者の２０パーセントから８０パーセントの間が、第１の癌の状態を有し、残りが第２の癌の状態を有する。いくつかの実施形態では、訓練被験者の３０パーセントから７０パーセントの間が、第１の癌の状態を有し、残りが第２の癌の状態を有する。いくつかの実施形態では、訓練被験者の４０パーセントから６０パーセントの間が、第１の癌の状態を有し、残りが第２の癌の状態を有する。いくつかの実施形態では、訓練被験者の４５パーセントから５５パーセントの間が第１の癌の状態を有し、残りが第２の癌の状態を有している。

【0204】

ブロック２０８を参照すると、いくつかの実施形態では、第１の癌の状態は癌からなり、第２の癌の状態は癌がないことである。いくつかの実施形態では、第１の癌の状態は、副腎癌、胆道癌、膀胱癌、骨／骨髄癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、食道癌、胃癌、頭／首癌、肝胆道癌、腎癌、肝癌のうちの１つである。肺がん、卵巣がん、膵臓がん、骨盤がん、胸膜がん、前立腺がん、腎臓がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、又は白血病であり、第２のがんの状態はがんの非存在である。いくつかの実施形態では、第１の癌の状態は、副腎癌のステージ、胆道癌のステージ、膀胱癌のステージ、骨／骨髄癌のステージ、脳癌のステージ、乳癌のステージのうちの１つである。子宮頸がん、大腸がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝胆膵がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がんのステージ卵巣癌、膵臓癌、骨盤癌、胸膜癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、白血病のいずれかであり、第２のがんの状態はがんの非存在である。

【0205】

いくつかの実施形態において、第２の癌の状態は、副腎癌、胆道癌、膀胱癌、骨／骨髄癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、食道癌、胃癌、頭／首癌、肝胆道癌のいずれかであり、副腎癌、胆道癌、膀胱癌、骨／骨髄癌、頭／首癌、肝／頸癌、肝／首癌、胆道癌、胆道癌、膀胱癌、骨／骨髄癌は、以下のいずれかである。腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、骨盤癌、胸膜癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、又は白血病が挙げられる。いくつかの実施形態では、第２の癌の状態は、副腎癌の段階、胆道癌の段階、膀胱癌の段階、骨／骨髄癌の段階、脳癌の段階、乳癌の段階、子宮頸癌の段階、大腸癌の段階、食道癌の段階、胃癌の段階、頭／首癌の段階、肝胆道癌の段階、腎癌の段階のいずれか１つである。肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、骨盤癌、胸膜癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、または白血病の病期。

【0206】

いくつかの実施形態では、被験者の癌の状態は、第１の癌の状態、第２の癌の状態、及び第３の癌の状態のうちの１つである。いくつかの実施形態では、複数の訓練被験者における各訓練被験者のそれぞれの被験者癌状態は、複数の癌状態から個別に選択される。いくつかのそのような実施形態では、複数の訓練対象は、複数の癌状態におけるそれぞれのそれぞれの癌状態を有する少なくとも最小数の訓練対象からなる。いくつかの実施形態では、それぞれのそれぞれの癌状態を有する訓練被験者の最小数は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、又は少なくとも５００の訓練被験者を有する。

【0207】

いくつかの実施形態では、複数の癌状態は、少なくとも５、少なくとも１０、または少なくとも２０の固有の癌状態からなる。いくつかの実施形態において、複数の癌の状態は、２２個の固有の癌の状態からなる。

【0208】

いくつかの実施形態において、複数の癌の状態における各癌の状態は、副腎癌、胆道癌、膀胱癌、骨／骨髄癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、食道癌、胃癌、頭／首癌の１つである。肝胆膵がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、骨盤がん、胸膜がん、前立腺がん、腎臓がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、又は白血病である。いくつかの実施形態では、複数の癌状態における各癌状態は、副腎癌の段階、胆道癌の段階、膀胱癌の段階、骨／骨髄癌の段階、脳癌の段階、乳癌の段階、子宮頸癌の段階、大腸癌の段階、食道癌の段階、胃癌の段階、頭／首癌の段階、肝胆道癌の段階、腎癌の段階のうちの１つである。肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、骨盤癌、胸膜癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、または白血病の病期。

【0209】

無細胞フラグメントの取得とメチル化シークエンス
ブロック２０４を再び参照すると、各トレーニング対象について、対応するトレーニング用複数の無細胞断片における、それぞれのそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）それぞれのトレーニング対象から得られた対応する生体試料中のそれぞれの断片を含む１以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位の各ＣｐＧのメチル化状態から構成される。

【0210】

いくつかの実施形態では、対応する生物学的試料は、液体生物学的試料である。いくつかの実施形態では、対応する生物学的試料は、血液試料である。いくつかの実施形態では、対応する生体試料は、訓練対象の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液からなる。いくつかの実施形態では、対応する生体試料は、トレーニング対象の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液からなる。

【0211】

いくつかの実施形態では、訓練対象からの対応する生体試料中の１つ以上の核酸試料は、無細胞核酸試料（例えば、液体生体試料から得られたもの）である。いくつかの実施形態では、生体試料から得られる無細胞核酸は、本開示で定義される核酸の任意の形態、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、生体試料から得られる無細胞核酸は、ＲＮＡ及びＤＮＡの混合物である。

【0212】

いくつかの実施形態では、それぞれの訓練対象についての対応する訓練用複数個の無細胞断片が、生体試料（例えば、液体生体試料）からの無細胞核酸に由来する場合、無細胞核酸が、評価可能な細胞源分率を示すことが有利である。いくつかの実施形態では、対応する訓練対象についての、第１又は第２の癌状態に関する細胞源率は、少なくとも２パーセント、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも５０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、又は少なくとも９８パーセントである。

【0213】

いくつかの実施形態では、生体試料は、配列決定解析の準備のために無細胞核酸を抽出するように処理される。非限定的な例として、いくつかの実施形態では、無細胞核酸断片は、Ｋ２ ＥＤＴＡチューブで対象から採取された生体試料（例えば、血液試料）から抽出される。生体試料が血液である場合、試料は、採取後２時間以内に、生体試料をまず１０００ｇで１０分間二重回転させ、次に、得られた血漿を２０００ｇで１０分間回転させることによって処理される。その後、血漿は１ｍｌのアリコートで－８０℃に保存される。このようにして、無細胞核酸抽出の目的のために、生体試料から適当な量の血漿（例えば、１～５ｍｌ）が調製される。いくつかのそのような実施形態では、無細胞核酸は、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出され、ＤＮＡ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ）中に溶出される。いくつかの実施形態では、精製された無細胞核酸は、使用するまで－２０℃で保存される。例えば、Ｓｗａｎｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１７， ”Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｔＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｐｉｃｔｓ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，” Ｎａｔｕｒｅ， ５４５（７６５５）：４４６－４５１であり、これは参照により本明細書に組み込まれる。配列決定の目的で生物学的方法から無細胞核酸を調製するために、他の同等の方法を使用することができ、そのような方法はすべて本開示の範囲内である。

【0214】

ある実施形態では、無細胞核酸断片は、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換するように処理される。ある実施形態では、本方法は、メチル化シトシンを変換せずに非メチル化シトシンをウラシルに変換するＤＮＡの重亜硫酸塩処理を用いる。例えば、ＥＺ ＤＮＡ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＴＭ － Ｇｏｌｄ、ＥＺ ＤＮＡ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＴＭ － Ｄｉｒｅｃｔ又はＥＺ ＤＮＡ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＴＭ － Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）から入手可能）などの市販キットが、重亜硫酸塩変換に使用される。別の実施形態では、非メチル化シトシンのウラシルへの変換は、酵素反応を用いて達成される。例えば、変換は、ＡＰＯＢＥＣ－Ｓｅｑ（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）のような非メチル化シトシンのウラシルへの変換のための市販のキットを使用することができる。

【0215】

変換された無細胞核酸断片から、シークエンシングライブラリーが調製される。オプションとして、配列決定ライブラリーは、複数のハイブリダイゼーションプローブを用いて、細胞由来の情報を有する無細胞核酸断片、またはゲノム領域について濃縮される。ハイブリダイゼーションプローブは、特に指定された無細胞核酸断片、又は標的領域にハイブリダイズし、その後の配列決定及び解析のためにそれらの断片又は領域について濃縮する短いオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、細胞起源について情報がある指定されたＣｐＧ部位のセットの標的高深度分析を実行するために使用される。一旦調製されると、配列決定ライブラリー又はその一部は、複数の配列リードを得るために配列決定される。

【0216】

いくつかの実施形態では、被験者の生体試料から得られた配列リードは、基準セット（例えば、健康な被験者の対照コホートなどの複数の基準被験者から得られたもの）に対して正規化される。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年９月１９日に公開された「高次元のデータを選択、管理、および分析するための方法およびシステム」と題する米国特許公開第２０１９－０２８７６４９号は、正規化の複数の方法を開示している。

【0217】

いくつかの実施形態では、複数の配列リードは、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、または少なくとも１００万の配列リードから構成される。いくつかの実施形態では、複数の配列リードは、少なくとも５００万、少なくとも１０００万、又は少なくとも１億の配列リードからなる。

【0218】

いくつかの実施形態では、複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象のための訓練用無細胞断片は、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１００万、少なくとも５００万、又は少なくとも１０００万の無細胞断片から構成されている。いくつかの実施形態では、複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象のための訓練用無細胞断片は、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００万又は少なくとも１０００万の無細胞断片から構成されている。

【0219】

いくつかの実施形態では、複数の訓練対象における第１の訓練対象は、第１の数の無細胞断片を含む第１の対応する複数の無細胞断片を有し、複数の訓練対象における第２の訓練対象は、第１の数とは異なる第２の数の無細胞断片を含む第２の対応する複数の無細胞断片を有する（例えば、いくつかの実施形態では、各訓練対象は異なる訓練の複数の無細胞断片を有する）。

【0220】

いくつかの実施形態では、無細胞断片の各対応する訓練用複数個は、５００ヌクレオチド未満の平均長さを有する。いくつかの実施形態では、各対応するトレーニング用無細胞断片の複数の断片は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチド未満の平均長さを有する。

【0221】

いくつかの実施形態では、配列決定は、メチル化配列決定からなる。

【0222】

いくつかの実施形態において、メチル化配列決定は、それぞれの断片において１つ以上の５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出する。いくつかのそのような実施形態では、メチル化配列決定は、それぞれの断片の配列読み取りにおける、１つ以上の非メチル化シトシンまたは１つ以上のメチル化シトシンを、対応する１つ以上のウラシルに変換することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のウラシルは、１つまたは複数の対応するチミンとして、メチル化配列決定中に検出される。いくつかの実施形態では、１つ以上の非メチル化シトシンまたは１つ以上のメチル化シトシンの変換は、化学的変換、酵素的変換、またはそれらの組み合わせからなる。いくつかの実施形態では、シトシン変換は、「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｆｒａｃｔｉｏｎ」と題され、２０１９年７月２３日に出願された米国特許出願第６２／８７７，７５５号に記載のように行われ、これは参照によりここに組み込まれるものとする。

【0223】

いくつかの実施形態において、それぞれのフラグメントにおける対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態は、以下の通りである。（ｉ）それぞれのＣｐＧ部位がメチル化されているとメチル化シークエンシングによって決定される場合、メチル化されている、（ｉｉ）それぞれのＣｐＧ部位がメチル化されていないとメチル化シークエンシングによって決定される場合、非メチル化されている、及び／又は（ｉｉｉ）それぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態をメチル化又は非メチル化として呼ぶことができない場合「その他」として旗を付けることである。

【0224】

いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシング（例えば、メチル化パターンを決定するために使用される）は、ペアエンドシーケンシングである。いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、シングルリードシーケンシングである。いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、全ゲノムメチル化シーケンシング（例えば、全ゲノムビスルファイトシーケンス）である。

【0225】

全ゲノムシーケンスアッセイとは、全ゲノムまたは全ゲノムの相当部分についてシーケンスリードを生成し、コピー数変異またはコピー数異常のような大きな変異を決定するために使用できる物理的アッセイのことをいう。このような物理的アッセイは、全ゲノムシーケンス技術または全エクソームシーケンス技術を採用することができる。

【0226】

いくつかの実施形態では、全ゲノムメチル化配列決定は、例えば、２０１９年３月１３日に出願され、現在ＵＳ２０１９／０２８７６５２として公開されている「Ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願第１６／３５２，６０２号に記載されているように、１つまたは複数のメチル化状態ベクターを特定するが、これはその全体が参照によりここに組み込まれるものである。

【0227】

いくつかの実施形態では、配列決定は、核酸（例えば、無細胞核酸）から測定された配列リードの数を得るために使用できる任意の形態の配列決定からなり、これには、Ｒｏｃｈｅ ４５４プラットフォーム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＯＬＩＤプラットフォーム、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ配列決定技術などのハイスループット配列決定システム、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．の１分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）技術、４５４ライフサイエンス、イルミナ／ソレクサ及びヘリコス・バイオサイエンスのシークエンスバイシンセシスプラットフォーム、アプライドバイオシステムズのシークエンスバイライゲーションプラットフォーム、ライフテクノロジーズのＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ技術、及び／又はナノポアシーケンスなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、シーケンシングは、シーケンシングバイシンセシスおよび可逆的ターミネーターベースのシーケンシング（例えば、イルミナのゲノムアナライザー；ゲノムアナライザーＩＩ；ＨＩＳＥＱ ２０００；ＨＩＳＥＱ ２５００（イルミナ、サンディエゴカリフォルニア））から構成される。

【0228】

いくつかの実施形態では、全ゲノムメチル化配列決定は、ゲノムの一部を配列決定するために使用される。いくつかの実施形態では、ゲノムの一部は、ゲノム（例えば、ヒト参照ゲノム）の少なくとも１０パーセント、２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９９パーセント、９９・９パーセント、又は全てである。いくつかの実施形態では、全ゲノムメチル化配列決定は、複数の配列読み取りを生成し、複数の配列読み取り中の各配列読み取りは、１０００塩基対以下の配列長を有する。いくつかの実施形態では、全ゲノムメチル化シーケンシングは、ゲノムの部分にわたって少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍であるゲノムの部分のシーケンス被覆率を取得する。いくつかの実施形態では、全ゲノムメチル化シーケンスは、ゲノム全体にわたって少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍のシーケンス被覆率を取得する。

【0229】

いくつかの実施形態では、メチル化配列決定は、複数の核酸プローブを用いた標的配列決定であり、複数のビンの各ビン（例えば、関心ゲノム領域）は、複数の核酸プローブ中の少なくとも１つの核酸プローブと関連付けられる。

【0230】

いくつかの実施形態では、標的化シーケンシングは、複数の核酸プローブを使用してゲノムの一部（例えば、ヒト参照ゲノム）を標的とし、標的化シーケンシングは、ゲノムの標的部分（例えば、プローブがマッピングする）の少なくとも５ｘ、少なくとも１０ｘ、少なくとも１５ｘ、少なくとも２０ｘ、少なくとも２５ｘ、少なくとも３０ｘ、少なくとも５０ｘ、少なくとも１００ｘ、少なくとも２５０ｘ、少なくとも５００ｘまたは少なくとも１０００ｘのシーケンスカバレッジを取得する。いくつかの実施形態では、標的化シーケンシングは、対象のゲノム内の選択された領域にわたって、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍、少なくとも４０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも１５，０００倍、少なくとも２０，０００倍、少なくとも２５，０００倍、少なくとも３０，０００×、少なくとも４０，０００×、または少なくとも５０，０００倍のシーケンスカバレッジを獲得する。

【0231】

いくつかの実施形態では、標的化パネルシーケンシングは、例えば全ゲノムシーケンシングよりも効率的（例えば、シーケンシングのための材料の使用、シーケンシングに要する時間の長さなどに関して）でありながら、対象の参照ゲノム中の関心領域に関する有意な情報を得るので有益である。言い換えれば、いくつかの実施形態では、標的化パネルシーケンシングは、対象について腫瘍分率（および／または腫瘍起源）を決定する問題を計算処理可能にしながら、基礎データから（例えば、無細胞核酸レベルおよびゲノム領域にわたる両方で）できるだけ多くの情報を取得するのに役立つ。例えば、参照ゲノム（例えば、ヒト参照ゲノム）は、約２８００万のＣｐＧ部位を含むが、参照ゲノムに向けられた標的メチル化パネルは、より少ないＣｐＧ部位（例えば、１万と５００万の間のＣｐＧ部位、１０万と３００万の間のＣｐＧ部位など。

【0232】

いくつかの実施態様において、複数のプローブ中の少なくとも１つのプローブは、少なくとも１つの所定のＣｐＧ部位を含む生体試料中の核酸に結合し、濃縮するように設計されている。いくつかの実施態様では、複数のプローブ中の各プローブは、少なくとも１つの所定のＣｐＧ部位を含む生物学的試料中の核酸に結合し、濃縮するように設計されている。

【0233】

いくつかの実施形態では、複数のプローブにおける各プローブは、ある数の所定のＣｐＧ部位を有する核酸を標的とするように設計されている。例えば、いくつかの実施形態では、複数のプローブにおける１つ以上のプローブは、５０個以下の所定のＣｐＧ部位、４０個以下の所定のＣｐＧ部位、３０個以下の所定のＣｐＧ部位、２５個以下の所定のＣｐＧ部位を含む生体試料中の核酸を結合及び濃縮するように設計される。２２個以下、２０個以下、１８個以下、１５個以下、１２個以下、１０個以下、５個以下、３個以下の所定のＣｐＧ部位を含む核酸。

【0234】

いくつかの実施形態では、標的メチル化配列決定について、複数のプローブは、１，０００～２，０００，０００個のプローブからなる。いくつかの実施形態では、複数のプローブは、１，０００以上のプローブ、２，０００以上のプローブ、３，０００以上のプローブ、４，０００以上のプローブ、５，０００以上のプローブ、１０，０００以上のプローブ、２０，０００以上のプローブ又は３０，０００以上のプローブから構成される。いくつかの実施形態では、複数のプローブは、１，０００～３０，０００個のプローブである。いくつかの実施形態では、複数のプローブは、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも６００，０００、少なくとも７００，０００、少なくとも８００，０００、少なくとも９００，０００、又は少なくとも１，０００，０００のプローブから構成される。

【0235】

複数のプローブが他の数のプローブを含んでもよいことは理解されるべきであるが、その非限定的な例としては、１，５００，０００プローブ以下、１，４００，０００プローブ以下、１，３００，０００プローブ以下、１，２００，０００プローブ以下、が挙げられる。プローブ数 １５０万個以下、１１０万個以下、１００万個以下、９０万個以下、８０万個以下、７０万個以下、６０万個以下、５０万個以下、４０万個以下、３０万個以下、２０万個以下、５０万個以下、４０万個以下、３０万個以下、５０万個以下、６０万個以下、７０万個以下、８０万個以下、１００万個以下、５０万個以下、５０万個以下、６０万個以下、７０万個以下、８０万個以下、８０万個以下、８０万個以下、８０万個以下万個以下、１０万個以下、９万個以下、８万個以下、７万個以下、６万個以下、５万個以下、４万個以下、３万個以下、２万個以下、１．１万個以下、９千個以下、８千個以下、７千個以下、６千個以下、５千個以下、４千個以下、２千個以下、または１千個以下。

【0236】

いくつかの実施形態では、複数のプローブは、参照ゲノムの０．５～５０メガバイトを集合的にカバーする複数の遺伝子標的（例えば、参照ゲノムの一部及び／又は遺伝子標的のパネル）を標的としている。いくつかの実施形態では、複数のプローブの複数の遺伝子標的は、参照ゲノムの５～４０メガバイト、参照ゲノムの１０～３０メガバイト、参照ゲノムの１５～３５メガバイト、参照ゲノムの２０～３０メガバイト、参照ゲノムの２５～３５メガバイト、または参照ゲノムの３０～４０メガバイトを集合的にカバーする。

【0237】

いくつかの実施形態では、複数のプローブは、標的化がんアッセイパネルである。多数の標的化がんアッセイパネルが当技術分野で知られており、例えば、２０１９年４月２日に出願された「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｐａｎｅｌｓ」と題するＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５３５８、国際特許出願Ｎｏ．ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３５０９、「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｐａｎｅｌ」という名称、２０１９年９月２７日に出願され、「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｒ Ｏｒｉｇｉｎ， ｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｙｐｅ」という名称、ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２として公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２、２０２０年１月２４日出願、これらはそれぞれ参照により全体を本書に組み入れるものとする。例えば、いくつかの実施形態では、標的癌アッセイパネルは、腫瘍分画の決定及び／又は癌の診断に関連する情報を一緒に提供することができる断片（無細胞核酸）を捕捉することができる複数のプローブ（又はプローブ対）を含む。いくつかの実施形態では、標的化癌アッセイパネルにおける複数のプローブは、少なくとも５０、１００、５００、１，０００、２，０００、２，５００、５，０００、６，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、又は５０，０００対のプローブが含まれる。他の実施形態では、標的癌アッセイパネルにおける複数のプローブは、少なくとも５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、又は１００，０００のプローブを含む。いくつかの実施形態では、複数のプローブは、集合的に、少なくとも０．１百万、０．２百万、０．４百万、０．６百万、０．８百万、１００万、２００万、３００万、４００万、５００万、６００万、７００万、８００万、９００万、または１０００万のヌクレオチドから構成されている。いくつかの実施形態では、プローブ（またはプローブ対）は、癌および非癌サンプルにおいて差次的にメチル化された１つまたは複数のゲノム領域を標的とするように特別に設計されている。

【0238】

例えば、標的癌アッセイパネルにおける複数のプローブは、癌性サンプルにおいて差次的にメチル化されているｃｆＤＮＡ断片を選択的に結合し、濃縮することができるプローブを含むことができる。この場合、濃縮された断片の配列決定により、腫瘍分画の決定または癌の診断に関連する情報を提供することができる。さらに、プローブは、異常なメチル化パターン及び／又はハイパーメチル化若しくはハイポメチル化パターンを有すると判定されたゲノム領域を標的として設計することができ、検出の選択性及び特異性をさらに提供することができる。

【0239】

いくつかの実施形態では、複数のプローブ中のプローブ（又はプローブ対）は、少なくとも２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、又は９０ｂｐを含むゲノム領域を標的化する。いくつかの実施形態では、複数のプローブ中のプローブは、少なくとも５つのメチル化部位を含むゲノム領域を標的としている。いくつかの実施形態では、複数のプローブ中のプローブは、２０、１５、１０、８、または６未満のメチル化部位を含むゲノム領域を標的化する。いくつかの実施形態では、複数のプローブ中のプローブは、非癌性又は癌性試料においてメチル化又は非メチル化のいずれかのメチル化（例えば、ＣｐＧ）部位を少なくとも８０、８５、９０、９２、９５、又は９８％有するゲノム領域を標的としている。

【0240】

無細胞フラグメントのフィルタリング

【0241】

いくつかの実施形態では、本方法は、複数の無細胞断片に１つ又は複数のフィルタ条件を適用することをさらに含む。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸サンプルのメチル化配列決定から得られた全ての無細胞断片が、対象細胞源分画を推定するための複数の特徴を特定するために、及び／又は対象細胞源分画を推定するために使用されるとは限らない。いくつかの実施形態では、これは、核酸断片（例えば、無細胞核酸）が情報量の点で異なり、いくつかの実施形態では、所望の情報量を有する核酸断片のみが、特徴の特定及び／又は細胞源分率の推定のために保持される（例えば、関連情報を提供しない断片は破棄される）ことに起因する。いくつかの実施形態では、特徴は、複数のフィルタリング条件における１つ以上のフィルタリング条件を満たす無細胞断片から決定される（例えば、各フィルタリング条件は断片の情報量を評価する）。複数のフィルタリング方法は、例えば、２０２０年５月２２日に出願された「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｗｈｅｔｈｅｒ ａ Ｓｕｂｊｅｃｔ ｈａｓ ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｌｅａｒｎｉｎｇ」と題する国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３４３１７、及び２０１９年３月１３日に出願され、現在ＵＳ２０１９／０２８７６５２として公開されている「Ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願番号１６／３５２，６０２で詳細に説明されている、各々は参照により本明細書に組み込まれるものとする。フィルタ条件の非限定的な例が以下に提供される。

【0242】

メチル化ベクトルに基づくＰ値フィルタリング。

【0243】

いくつかの実施形態では、複数のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片における各無細胞断片が、閾値以下である対応するｐ値を有するという条件であり、ｐ値は、国際特許出願番号の実施例５に記載されているように、ｐ値フィルタリングによって決定される。ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３４３１７、名称「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｗｈｅｔｈｅｒ ａ Ｓｕｂｊｅｃｔ ｈａｓ ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｌｅａｒｎｉｎｇ」、２０２０年５月２２日出願、及び米国特許出願番号１６／３５２，６０２、名称「Ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、２０１９年３月１３日出願、現在ＵＳ２０１９／０２８７６５２として公開、これらの各々は参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。このようなフィルタ条件の目的は、対応するメチル化状態ベクトルに基づいて、異常なメチル化無細胞断片を受け入れて使用することである。例えば、サンプル中の各無細胞断片について、断片に対応するメチル化状態ベクトル（例えば、期待されるメチル化状態ベクトルが健康な被験者のコホート（複数）の配列分析から決定される）を用いて、断片が（例えば、そこから得られる配列リードの分析を通じて）期待されるメチル化状態ベクトルに対して異常にメチル化しているかどうかについて判定が行われる。このような無細胞断片のメチル化状態ベクターの生成は、例えば、米国特許庁（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ．Ａｐｐｌ． Ｐｕｂ．Ｎｏ．２０１９／０２８７６５２に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0244】

いくつかの実施形態では、健常者コホートは、少なくとも２０人の被験者からなり、複数の無細胞断片は、少なくとも１０，０００の異なる対応するメチル化パターンを含む。いくつかの実施形態では、健常者コホートは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００人の被験者から構成される。いくつかの実施形態では、健常コホートは、１以上１０未満、１０以上５０未満、５０以上１００未満、１００以上５００未満、５００以上１０００未満、又は１０００以上の被験者から構成される。いくつかの実施形態では、複数の無細胞断片は、１以上１０００以下、１０００以上２０００以下、２０００以上４０００以下、４０００以上６０００以下、６０００以上８０００以下、８０００以上１０，０００以下、１０，０００以上２０，０００以下、２０，０００以上５０，０００以下、又は５０，０００以上の異なる対応のメチル化パターンから構成されている。

【0245】

いくつかの実施形態では、ｐ値閾値は、０．００１と０．２０の間である。いくつかの実施形態では、閾値は０．０１である（例えば、そのような実施形態では、ｐは＜０．０１でなければならない）。いくつかの実施形態では、閾値は、０．００１、０，００５、０．０１、０．０１５、０．０２、０．０５、または０．１０である。いくつかの実施形態では、閾値は０．０００１と０．２０の間である。いくつかの実施形態において、ｐ値閾値は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片に対応するメチル化パターンが、０．１０以下、０．０５以下、又は０．０１以下のｐ値を有するとき、対象からのメチル化パターンについて満たされる。

【0246】

そのような実施形態では、閾値未満のｐ値を有する無細胞断片のみが、特徴同定及び／又は細胞源分画推定に寄与する。例えば、いくつかの実施形態では、複数の無細胞断片は、それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位にわたる対応するメチル化パターン（例えば、メチル化状態ベクトル）が、ｐ値閾値を満足しないｐ値を有するそれぞれの無細胞断片を複数の無細胞断片から除去することによってフィルタリングされる。

【0247】

いくつかの実施形態では、異常な断片は、ＣｐＧ部位の数が閾値を超え、ＣｐＧ部位のメチル化率が閾値を超える（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）断片、またはＣｐＧ部位の非メチル化率が閾値を超える（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）断片と同定される。例えば、後述の最小ＣｐＧ部位及び／又は断片長に基づくフィルタ条件を参照されたい。いくつかの実施形態では、メチル化及び／又は非メチル化ＣｐＧ部位の閾値割合は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、メチル化及び／又は非メチル化ＣｐＧ部位の閾値割合は、５０％～１００％の間である。

【0248】

いくつかの実施形態では、マルコフモデル（例えば、隠れマルコフモデル「ＨＭＭ」）を使用して、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンにおける各状態について、シーケンスにおける次の状態を観察する可能性を決定する確率のセットを与えられた、メチル化状態のシーケンス（例えば、メチル化についての「Ｍ」、非メチル化についての「Ｕ」、を含む）がそれぞれの無細胞断片について観察される確率が決定される。いくつかの実施形態では、確率のセットは、ＨＭＭを訓練することによって得られる。このような訓練は、非癌被験者のコホートから得られた観察されたメチル化状態配列（例えば、メチル化パターン）の初期訓練データセットを用いて、統計パラメータ（例えば、第１の状態が第２の状態に移行する確率（移行確率）及び／又は所定のメチル化状態がそれぞれのＣｐＧ部位に対して観察される確率（放出確率））を計算することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＭＭは、教師あり訓練（例えば、観察された状態と同様に基礎となる配列が既知であるサンプルを用いて）を用いて訓練される。いくつかの代替実施形態では、ＨＭＭは、教師なし訓練（例えば、ビタビ学習、最尤推定、期待値最大化訓練、及び／又はバウム－ウェルチ訓練）を使用して訓練される。例えば、Ｂａｕｍ－Ｗｅｌｃｈアルゴリズムなどの期待値最大化アルゴリズムは、観察されたサンプルシーケンスから遷移確率及び放出確率を推定し、観察されたシーケンスを最もよく説明するパラメータ化された確率モデルを生成する。このようなアルゴリズムでは、正しく予測される状態の期待数が最大になるまで尤度関数の計算を繰り返す。例えば、Ｙｏｏｎ， ２００９， ”Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，” Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｓｅｐ； １０（６）：４０２－４１５， ｄｏｉ： １０．２１７４／１３８９２０２０９７８９１７７５７５．

【0249】

最小限の袋の大きさ
いくつかの実施形態では、複数のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、各無細胞断片が閾値整数より大きいバッグサイズを有するという要件である。言い換えれば、いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、対応する生体試料におけるそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料から測定された対応する複数の配列読み取り値における閾値数の配列読み取り値によって表されるという要求の適用である。例えば、閾値の整数が１である場合、フィルタ条件は、各無細胞断片が、生体試料から測定された対応する複数の配列読み取り部において１つ以上の配列読み取り部によって表されるという要求の適用である。いくつかの実施形態では、閾値整数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０と１００との間の整数である。いくつかの実施形態では、閾値整数は、１以上１０以下、１０以上２０以下、２０以上３０以下、３０以上４０以下、４０以上５０以下、５０以上６０以下、６０以上７０以下、７０以上８０以下、８０以上９０以下、または９０以上１００以下である。いくつかの実施形態では、閾値の整数は、１００以上５００以下、５００以上１０００以下、又は１０００以上である。

【0250】

いくつかの実施形態では、複数のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、それぞれの無細胞断片が閾値整数より大きいバッグサイズを有するという要件であり、それぞれのそれぞれのバッグ内の配列リード（例えば、それぞれの無細胞断片を表す）は、複数の無細胞核酸の配列決定から取得されたものである。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれのそれぞれの無細胞断片が、対応する生体試料におけるそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料中の無細胞核酸の閾値数によって表されるという要求の適用である。いくつかの実施形態では、閾値の整数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０と１００との間の整数である。いくつかの実施形態では、閾値整数は、１以上１０未満、１０以上２０未満、２０以上３０未満、３０以上４０未満、４０以上５０未満、５０以上６０未満、６０以上７０未満、７０以上８０未満、８０以上９０未満、または９０以上１００未満の間である。いくつかの実施形態では、閾値の整数は、１００以上５００以下、５００以上１０００以下、又は１０００以上である。

【0251】

ＣｐＧサイトの最小数
いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片が、閾値数のＣｐＧ部位を有するという要件の適用である。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部位の閾値の数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のＣｐＧ部位である。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ部位の閾値の数は、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、又は５０以上のＣｐＧ部位である。

【0252】

いくつかの実施形態では、１つ以上のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、複数の無細胞断片中のそれぞれの無細胞断片が、閾値の塩基対の数未満の長さを有するという条件である。いくつかの実施形態では、閾値の塩基対の数は、１千、２千、３千、又は４千の塩基対である。いくつかの実施形態では、閾値の塩基対の数は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００の塩基対である。いくつかの実施形態では、閾値の塩基対の数は、１０００、２０００、３０００、または４０００の連続した塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、塩基対の閾値の数は、長さが１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個の連続した塩基対である。

【0253】

いくつかの実施形態では、複数のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、各無細胞断片が第１の閾値数のＣｐＧ部位をカバーし、塩基対の観点から第２の閾値未満の長さであることを条件とするものである。例えば、第１閾値が１ＣｐＧ部位であり、第２閾値が１０００塩基対である場合、各無細胞断片は、１つ以上のＣｐＧ部位をカバーし、かつ１０００塩基対以下の長さであることが必要である。いくつかの実施形態では、各無細胞断片は、特定の断片長（例えば、第２の閾値長）内で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のＣｐＧ部位をカバーしなければならない。いくつかの実施形態では、各無細胞断片は、特定の数のＣｐＧ部位（例えば、第１の閾値）にまたがる一方で、長さが５００、１０００、２０００、３０００、または４０００の連続塩基対未満である必要がある。言い換えれば例えば、いくつかの実施形態では、複数のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、各無細胞断片が、少なくとも１つのＣｐＧ部位、少なくとも２つのＣｐＧ部位、少なくとも３つのＣｐＧ部位、少なくとも４つのＣｐＧ部位、少なくとも５つのＣｐＧ部位、少なくとも６つのＣｐＧ部位を含むことを要求する。参照ゲノムの連続する５００塩基未満の範囲にある、少なくとも７つのＣｐＧ部位、少なくとも８つのＣｐＧ部位、少なくとも９つのＣｐＧ部位、少なくとも１０つのＣｐＧ部位、少なくとも１１つのＣｐＧ部位、少なくとも１２のＣｐＧ部位、少なくとも１３のＣｐＧ部位、少なくとも１４のＣｐＧ部位または少なくとも１５のＣｐＧ部位が含まれる。

【0254】

ハイパーメチル化またはハイポメチル化
いくつかの実施形態では、複数のフィルター条件におけるフィルター条件は、各無細胞断片がハイパーメチル化されていることを条件とする。いくつかの実施形態では、複数のフィルター条件におけるフィルター条件は、各無細胞断片がハイポメチル化されていることを要件とする。いくつかの実施形態では、フィルター条件は、ゲノムの領域（例えば、ビン）に依存する。例えば、１つ以上の癌状態と関連するハイメチル化状態を有するヒトゲノムの多数の領域、ならびに１つ以上の癌状態と関連するハイメチル化状態を有するヒトゲノムの多数の領域は、ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２として公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５３５８、表題「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｐａｎｅｌｓ」、２０１９年４月２日に出願、国際特許出願番号Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２、ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２として公開された、「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｒ Ｏｒｉｇｉｎ， ｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｙｐｅ」と題する、２０２０年１月２４日出願、及び国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３５０９、ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１として公開された、「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｐａｎｅｌ」と題する、２０１９年９月２７日出願、これらはそれぞれその全体において参照によりここに援用されるものとする。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、複数のゲノム領域における１つまたは複数のビンはそれぞれ、国際特許公開番号に開示される領域における対応するゲノム領域を表す。ＷＯ２０１９／１９５２６８、ＷＯ２０２０／１５４６８２、及び／又はＷＯ２０２０／０６９３５０であり、複数のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、（ａ）国際特許公開番号で示されるＣｐＧ部位の１又は複数の癌状態に関連するハイパーメチル化状態を有するヒトゲノムの領域を表すビンにマッピングする無細胞断片を選択する場合、ハイパーメチル化している無細胞断片の選択を要求する。ＷＯ２０１９／１９５２６８、ＷＯ２０２０／１５４６８２、及び／又はＷＯ２０２０／０６９３５０、並びに（ｂ）国際特許公開番号ＷＯ２０１９／１９５２６８、ＷＯ２０２０／１５４６８２、及び／又はＷＯ２０２０／０６９３５０によって示されるＣｐＧ部位の１つ又はそれ以上の癌の状態と関連するハイポメチル化状態を有するヒトゲノムの領域を表すビンとマップするフラグメントを選択する場合にハイポメチル化しているセルフリー核酸の選択を要求する。

【0255】

いくつかの実施形態では、複数のフィルター条件は、ｐ値閾値が満たされること、及び無細胞断片がハイパーメチル化されることを必要とする。いくつかの実施形態では、複数のフィルタ条件は、ｐ値閾値が満たされること、及び無細胞断片がハイポメチル化されることを必要とする。いくつかの実施形態では、複数のフィルター条件は、各ビンに対して異なる。例えば、複数のビンのうちの１つのビンについては、複数のフィルタ条件は、ｐ値閾値が満たされ、かつ無細胞断片がハイポメチル化されていることを必要とし、複数のビンのうちの２番目のビンについては、複数のフィルタ条件は、ｐ値閾値が満たされ、かつ無細胞断片がハイポメチル化されていることを必要とする。

【0256】

癌の状態
いくつかの実施形態では、複数のフィルタ条件におけるフィルタ条件は、各無細胞断片が癌条件閾値を満たすこと（例えば、各無細胞断片がそれぞれの癌条件に関連付けられる確率が所定の閾値以上であること）という要件である。いくつかの実施形態において、各がん状態は、異なるそれぞれの予め定義された閾値を有する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年３月３１日に出願された、Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｕｓｉｎｇ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｔｏ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｅという名称の米国特許出願第６３／００３，０８７号に記載されているように、各ゲノム領域（例えばｂｉｎ）について癌確率を決定するのに、訓練済みのニューラルネットワーク（例えば、複数の基準被験者について訓練されたもの）が使用されている。

【0257】

いくつかのそのような実施形態では、複数のビンのそれぞれのビンについて、それぞれのビンにマッピングされる複数の無細胞断片のそれぞれの無細胞断片について、対応する訓練済みニューラルネットワークは、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンに基づいて、無細胞断片が癌の状態（例えば、癌の存在）と関連する確率である予測値を計算する。したがって、いくつかのそのような実施形態では、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンは、訓練されたニューラルネットワークを使用してスコア化され、訓練されたニューラルネットワークによって出力されたスコアは、無細胞断片が癌状態を有する確率及び／又は無細胞断片が癌状態（例えば、癌の存在）に関連する確率に基づく計算から構成される。それぞれの無細胞断片は、得られたスコアが上記で定義された条件（例えば、固定値の閾値を超える確率）を満たす場合、フィルタ条件を通過する（例えば、細胞源割合を推定するための特徴の識別に用いるために選択される、及び／又は細胞源割合を推定するために用いるために選択される）。それぞれの無細胞断片は、得られたスコアが上記で定義された条件（例えば、固定値の閾値を下回る確率）を満たさない場合、フィルタ条件を通過しない（例えば、廃棄される）。

【0258】

いくつかのそのような実施形態では、閾値は正または負である。いくつかの実施形態では、閾値は、０．１以上１未満、１以上５未満、５以上１０未満、１０以上５０未満、５０以上１００未満、又は１００より大きい。いくつかの実施形態では、閾値は、－０．１以上－１以下、－１以上－５以下、－５以上－１０以下、－１０以上－５０以下、－５０以上－１００以下、または－１００以下である。いくつかの実施形態では、閾値はゼロである。いくつかの実施形態では、各ビンは、それぞれのそれぞれの癌状態に対するそれぞれの閾値を有する（例えば、ビンのそれぞれのサブセットは、それぞれの癌状態に関連付けられる）。
いくつかの実施形態では、開示されたフィルター条件の任意の組合せが課される。いくつかの実施形態では、複数の無細胞断片は、メチル化パターンが本明細書に開示される１つ以上のフィルター条件を満たす１つ以上の無細胞断片を含む。

【0259】

フラグメントとビンをマッピングする。

【0260】

ブロック２１０においてブロック２１０において、本方法は、各複数の無細胞断片における各無細胞断片を複数のビンにおけるビンにマッピングし、それによって無細胞断片の複数のトレーニングセットを得ることによって進行する。複数のビンにおけるそれぞれのビンは、ヒト参照ゲノムの対応する部分を表す。無細胞フラグメントの各トレーニングセットは、複数のビンの中の異なるビンにマッピングされる。

【0261】

いくつかの実施形態では、マッピングは、例えばＡｒｉｏｃに実装されるようなＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎギャップド・アライメント、または例えばＢｏｗｔｉｅに実装されるようなＢｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換を使用して実行される。他の適切なアライメントプログラムには、ＢａｒｒａＣＵＤＡ、ＢＢＭａｐ、ＢＦＡＳＴ、ＢｉｇＢＷＡ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＴ、ＢＷＡ、ＢＷＡ－ＰＳＳＭ、ＣＡＳＨＸが含まれるが、これらに限定されるわけではない。例えば、Ｌａｎｇｍｅａｄ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ， ２０１２， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９， ｐｐ．３５７－３５９； Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ， ２００９， ”Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，” Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５（１４）， １７５４－１７６０； ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｙｕｎ， ２０１７， ”Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｒｉａｎｔ－ｃａｌｌｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ ｂｙ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” ＰＬＯＳ ＯＮＥ， ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１７４４４６．Ａｌｌ Ｒｉｇｈｔｓ Ｒｅｓｅｒｖｅｄ．を参照。の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、各無細胞断片を複数のビン内のビンにマッピングすることで、ミスマッチングが可能になる。いくつかの実施形態では、マッピングは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、又は１０を超えるミスマッチを含む。

【0262】

いくつかの実施形態では、ブロック２１２を参照すると、複数のビンは、１０００と１００，０００の間のビンで構成されるか、またはそれらで構成される。いくつかの実施形態では、複数のビンは、１５０００と８００００の間のビンで構成されるか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、複数のビンは、２５０００と６５０００の間のビンで構成されるか、またはそれらで構成される。いくつかの実施形態では、複数のビンは、４５，０００と６５，０００の間のビンで構成されるか、またはそれらで構成される。

【0263】

いくつかの実施形態では、複数のビンは、少なくとも１０００ビン、少なくとも２５００ビン、少なくとも５０００ビン、少なくとも１０，０００ビン、少なくとも２０，０００ビン、少なくとも３０，０００ビン、少なくとも４０，０００ビン、少なくとも５０，０００ビン、少なくとも６０，０００ビン、少なくとも７０，０００ビン、少なくとも８０，０００ビン、少なくとも９０，０００ビン、少なくとも１００，０００ビン又は少なくとも１１０，０００ビンから構成される。

【0264】

さらに、いくつかの実施形態では、図２Ａのブロック２１４に従って、複数のビンにおけるそれぞれのそれぞれのビンは、平均して１０～１２００個の間の残基を有する（例えば、それぞれのビンは、１０～１２００個の間のヌクレオチドからなるヒト参照ゲノムの一部に対応する）。いくつかの実施形態では、複数のビンにおけるそれぞれのそれぞれのビンは、平均して、１０～１００００個の間の残基を有する。いくつかの実施形態では、複数のビンのそれぞれのそれぞれのビンは、平均して、１０～５００個の間の残基を有する。いくつかの実施形態では、複数のビンのそれぞれのそれぞれのビンは、平均して、１０～１００個の間の残基を有する。いくつかの実施形態では、複数のビンのそれぞれのそれぞれのビンは、平均して、２５～１００個の間の残基を有する。いくつかの実施形態では、複数のビンのそれぞれのビンは、平均して、５０００～１００００個の間の残基を有する。

【0265】

いくつかの実施形態において、複数のビンにおけるそれぞれのそれぞれのビンは、１０個未満の残基、２０個未満の残基、３０個未満の残基、４０個未満の残基、５０個未満の残基、６０個未満の残基、７０個未満の残基、８０個未満の残基、９０個未満の残基、１００個未満の残基、２００個未満の残基、３００個未満の残基から構成され、３００個未満の残基は、３００個未満の残基となる。４００ 位以下、５００ 位以下、６００ 位以下、７００ 位以下、８００ 位以下、９００ 位以下、１０００ 位以下、２０００ 位以下、３０００ 位以下、４０００ 位以下、５０００ 位以下、６０００ 位以下、７０００ 位以下、８０００ 位以下、または ９０００ 位以下。

【0266】

ブロック２１６を参照すると、いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のＣｐＧ部位から構成されている。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続したＣｐＧ部位を含む。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、ヒト参照ゲノムにおける２～１００個の連続するＣｐＧ部位から構成される。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、２～５０個の連続するＣｐＧ部位からなる。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、５０個から１００個の連続するＣｐＧ部位からなる。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、少なくとも２つの連続するＣｐＧ部位からなる。

【0267】

いくつかの実施形態では、複数のビンは、参照ゲノム（例えば、哺乳類、ヒトなど）の全てまたは一部を等しい大きさのビンに分割することによって構築され、各ビンは、参照ゲノムの固有の等しい大きさの部分を表す。いくつかの実施形態では、複数のビンは、参照ゲノム（例えば、哺乳類、ヒトなど）の全て又は一部を等しい又は不等な大きさのビンに分割することによって構築され、各ビンは参照ゲノムのユニークな部分を表す。

【0268】

いくつかの実施形態では、複数のビンは、参照ゲノム（例えば、哺乳類、ヒトなど）の全て又は一部を等しい又は不等な大きさのビンに分割することによって構築され、各ビンは、参照ゲノムの対応する部分を表す。そのような実施形態では、複数のビン中の１つのビンによって表される参照ゲノムの対応する部分は、複数のビン中の別のビンによって表される参照ゲノムの対応する部分と重なり得る。いくつかのそのような実施形態では、複数のビンは、参照ゲノム（例えば、哺乳類、ヒトなど）のすべてを等しい又は不等な大きさのビンに分割することによって構築され、各ビンは、参照ゲノムの対応する重複する部分又は重複しない部分を表す。いくつかの実施形態では、複数のビンは、参照ゲノムの一部（例えば、哺乳類、ヒトなど）を等しいまたは不等な大きさのビンに分割することによって構築され、各ビンは、参照ゲノムの重複する部分または重複しない部分を表わす。

【0269】

いくつかの実施形態では、複数のビンは、癌の非存在または存在に関与するヒトゲノムの領域の少なくとも一部が複数のビンによって表される一方、参照ゲノムの他の領域がビンによって表されないように構築される。アプローチに関係なく、各ビンは参照ゲノムの一意の部分を表す。いくつかの実施形態では、かかるビンは、参照ゲノムの３０ｂｐｓと５０００ｂｐｓの間、３０ｂｐｓと４０００ｂｐｓの間、３０ｂｐｓと３０００ｂｐｓの間、３０ｂｐｓと２０００ｂｐｓの間、３０ｂｐｓと１０００ｂｐｓの間、または４０ｂｐｓと８００ｂｐｓの間のサイズ範囲である。代替実施形態では、そのようなビンは、参照ゲノムの１０，０００ ｂｐｓと１００，０００ ｂｐｓの間、２０，０００ ｂｐｓと３００，０００ ｂｐｓの間、３０，０００ ｂｐｓと５００，０００ ｂｐｓの間、４０，０００ ｂｐｓと１００万ビンの間、５万ビンと５億ビンの間、または１０万ビンと２千万ビンの間のサイズに及ぶ。

【0270】

いくつかの実施形態では、参照ゲノムの部分は、参照ゲノムの１～２２染色体、又は参照ゲノムの少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも４５パーセント、少なくとも５０パーセント、少なくとも５５パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも６５パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント又は少なくとも９９パーセントの間である。いくつかのそのような実施形態では、各ビンは、参照ゲノムの１０，０００塩基以上１００，０００塩基以下、２０，０００塩基以上３００，０００塩基以下、３０，０００塩基以上５００，０００塩基以下、４０，０００塩基以上１００万塩基以下５０，０００塩基以上５万塩基以下または１００，０００塩基以上２５，０００，０００塩基以下の範囲を表する。

【0271】

いくつかの実施形態では、ビンの各々は、がんと関連すると同定されている参照ゲノムの特定の部位を表す。

【0272】

いくつかの実施形態では、ビンの各々は、非癌対照と比較したｃｆＤＮＡにおける癌および／または組織特異的メチル化パターンによって癌と関連すると同定された参照ゲノムの特定の領域を表す。

【0273】

いくつかの実施形態では、各ビンは、参照ゲノムにおけるエンハンサー、プロモーター、５’ＵＴＲ、エクソン、エクソン／阻害剤境界、イントロン、イントロン／エクソン境界、３’ＵＴＲ領域、ＣｐＧ棚、ＣｐＧ岸、又はＣｐＧ島の全て又は一部を表す。例えば、Ｃａｖａｌｃａｎｔｅ ａｎｄ Ｓａｎｔｏｒ， ２０１７， ”ａｎｎｏｔａｔｒ：ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｃｏｎｔｅｘｔ，” Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３３（１５） ２３８１－２３８３を参照し、そのような領域の適切な定義と、多数の異なる種についてそのようなアノテーションが文書化されている場所を参照することである。

【0274】

いくつかの実施形態では、高い変動性又は低いマッピング可能性を有するゲノム領域は、例えば、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ， ２０１３， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８； ｅ５７３８１に開示される方法を使用して、複数のビンにおけるビン表現から除外される。また、Ｌｉ ａｎｄ Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ， ２０１４， Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．５， ｐ．３１８を参照し、マッピング可能性を解析する。

【0275】

ビンに使用するヒトゲノム領域を選択する。

【0276】

本開示のいくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、癌特異的メチル化パターンの標的選択用に設計されたゲノム領域のパネルから引き出される。いくつかの実施形態では、そのような各ゲノム領域は、２０２０年１月２４日に出願された「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｒ Ｏｒｉｇｉｎ， ｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｙｐｅ」という名称の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２（ＷＯ２０２０／１５４６８２Ａ２として発行）の表２から引き出され、その中で参照された配列リストを含めて参照によりここに組み込まれるものとする。ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４５２，７０６ － ４８３，４７８は、特定のハイパーメチル化またはハイポメチル化標的ゲノム領域に関するさらなる情報を提供する。これらのＳＥＱ ＩＤ ＮＯレコードは、特定の癌型の組からのサンプルにおいて差次的にメチル化され得る標的ゲノム領域を同定する。ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４５２，７０６ ～ ４８３，４７８ の標的ゲノム領域は、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２のリスト６から引き出されたものである。同じ標的ゲノム領域の多くは、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２のリスト１～５およびリスト７～１６にも見出される。各ＳＥＱ ＩＤの項目は、ｈｇ１９に対する標的ゲノム領域の染色体上の位置、その領域から濃縮されるｃｆＤＮＡ断片が高メチル化または低メチル化されているかどうか、標的ゲノム領域の１本のＤＮＡ鎖の配列、およびそのゲノム領域で差次的にメチル化されている癌タイプの１対または１組を示す。いくつかの標的ゲノム領域のメチル化状態は、１組以上のがん種を区別するので、各エントリーは、そこで参照される配列リストを含むＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２の表３に示される第１のがん種および１つまたは複数の第２のがん種を特定する。

【0277】

いくつかの実施形態では、本開示の複数のビンは、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２のリスト１～１６、リスト１～３、リスト１３～１６、リスト１２、リスト４、またはリスト８～１１のいずれか１つにおける少なくとも２００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、または５０，０００の標的ゲノム領域それぞれに対する別個のビンを含む。いくつかの実施形態では、本開示の複数のビンは、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２の１つ以上のリスト１～１６の任意の組み合わせにおける少なくとも２００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、又は５０，０００の標的ゲノム領域のそれぞれに対する別々のビンを含む（例：リスト１～３、リスト１３～１６、リスト１２、リスト４、若しくはリスト８～１１など）。

【0278】

いくつかの実施形態では、本開示の複数のビンは、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２のリスト１～１６のいずれか１つにおける標的ゲノム領域の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のそれぞれに対する別個のビンを含む。いくつかの実施形態では、本開示の複数のビンは、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５０８２の１つ以上のリスト１～１６（例えば、リスト１～３、リスト１３～１６、リスト１２、リスト４、またはリスト８～１１など）の任意の組み合わせにおける標的ゲノム領域の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のそれぞれについて、別個のビンを含む。

【0279】

ビンに使用されるヒトゲノム領域の追加選択
本開示のいくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、癌特異的なメチル化パターンの標的選択のために設計されたゲノム領域のパネルから引き出される。いくつかの実施形態では、そのような各ゲノム領域は、２０１９年９月２７日に出願された「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｐａｎｅｌ」という名称の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３５０９（ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１として発行）の表２から引き出され、その中で参照される配列リストを含め、参照によりここに組み込まれるものとする。

【0280】

ＷＯ２０２０／０６９３５０Ａ１の配列リストには、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ、（２）（ａ）ＣｐＧ部位が存在する染色体またはコンティグ、（ｂ）その領域の開始位置および停止位置を特定する配列識別子、（３）（２）に対応する配列、（４）その領域のハイパーメチル化またはハイポメチル化スコアに基づいて含まれるかどうか、という情報が含まれている。染色体番号、開始位置、停止位置は、既知のヒト参照ゲノムであるＧＲＣｈ３７／ｈｇｌ９を基準として提供される。ＧＲＣｈ３７／ｈｇｌ９の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）， ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが提供するＧｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒから入手可能である。

【0281】

一般に、ビンは、ＷＯ２０２０／０６９３５０のリスト１～８に含まれる標的領域のいずれかの開始／停止範囲内に含まれるＣｐＧ部位のいずれかを包含することができる。

【0282】

いくつかの実施形態では、本開示の複数のビンは、ＷＯ２０２０／０６９３５０のリスト１～８のいずれか１つにおける少なくとも２００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、または５０，０００の標的ゲノム領域の各々に対する別個のビンを含む。いくつかの実施形態では、本開示の複数のビンは、ＷＯ２０２０／０６９３５０のリスト１～８の任意の組み合わせにおける少なくとも２００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、又は５０，０００の標的ゲノム領域のそれぞれについて別個のビンを含む。

【0283】

いくつかの実施形態では、本開示の複数のビンは、ＷＯ２０２０／０６９３５０のリスト１～８のいずれか１つにおける標的ゲノム領域の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のそれぞれに対する別個のビンを含む。いくつかの実施形態では、本開示の複数のビンは、ＷＯ２０２０／０６９３５０のリスト１～８の任意の組み合わせにおける標的ゲノム領域の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のそれぞれに対する別個のビンを含む。

【0284】

本開示のいくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、癌特異的メチル化パターンの標的選択のために設計されたゲノム領域のパネルから引き出される。いくつかの実施形態では、そのような各ビンは、２０１９年４月２日に出願された「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｐａｎｅｌｓ」と題するＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２として公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５３５８の表１～２４のいずれかにおけるゲノム領域に対応する（その全体は参照により本書に組み込まれる）。

【0285】

いくつかの実施形態では、本開示の各ビンは、ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び／又は２４の１又は複数に記載のゲノム領域にマッピングされる。

【0286】

いくつかの実施形態では、本開示の複数のビンの全体が一緒になって、ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４の１つ以上におけるゲノム領域の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％にマッピングするように構成される。いくつかのそのような実施形態では、複数のビンの各ビンは、ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４のいずれかにおける単一の固有の対応するゲノム領域にマッピングされる。いくつかのそのような実施形態では、本開示の複数のビンにおけるビンは、ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１～２４の任意の組み合わせにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の固有の対応するゲノム領域にマッピングされる。

【0287】

いくつかのそのような実施形態では、本開示の複数のビンにおける各ビンは、ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表２～１０または１６～２４のいずれかにおける単一の一意の対応するゲノム領域にマッピングされる。いくつかのそのような実施形態では、複数のビンのビンは、ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表２～１０または１６～２４の任意の組み合わせにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の固有の対応するゲノム領域と対応付けられる。

【0288】

いくつかの実施形態では、本開示の複数のビンにおける１つ以上のビンは、一緒になって、ＷＯ２０１９／１９５２６８Ａ２の表１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および／または２４におけるゲノム領域の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％にマップするよう構成される。

【0289】

無細胞フラグメントの癌の条件を割り当てる。

【0290】

ブロック２１８を参照する。図２Ｂのブロック２１８を参照すると、方法は、無細胞断片の複数のトレーニングセットにおける無細胞断片の各トレーニングセット内のそれぞれの無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てることによって進み、ここで無細胞断片癌状態は、第１の癌状態及び第２の癌状態のいずれかであり、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力する際の分類器の出力の関数であるとされる。

【0291】

いくつかの実施形態では、分類器は、形式を有する。
[数３］

【0292】

いくつかのそのような実施形態において[外]は、第１の癌状態に対する第１のモデルである。

【0293】

いくつかのそのような実施形態において[外]は、第２の癌の状態に関する第２のモデルである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のモデルに関して、「フラグメント」は、それぞれの無細胞フラグメントのメチル化パターンを指す。いくつかの実施形態において、それぞれの無細胞断片の癌状態は、以下の場合に第１の癌状態を割り当てられる。[外]は、閾値を満たす。いくつかの実施形態では、閾値は、１～１０の間の任意の値である。いくつかの実施形態では、閾値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。

【0294】

いくつかの実施形態において、第１のモデルは、第１の複数のサブモデルを含む第１の混合モデルであり、第２のモデルは、第２の複数のサブモデルを含む第２の混合モデルであり、第１及び第２の複数のサブモデルにおける各サブモデルは、対応する生体試料中の無細胞断片のソースに対する独立した対応するメチル化モデルを表す。

【0295】

いくつかの実施形態では、対象の癌状態は、複数の癌状態のうちの１つである（例えば、複数の癌状態がＮ個の癌状態からなる場合）。いくつかのそのような実施形態において、分類器は、以下の形式を有する。
[数４]

【0296】

いくつかのそのような実施形態において[外]は、複数の癌状態における第３の癌状態のための第３のモデルである。いくつかのそのような実施形態において[外]はｔｈ、複数の癌状態におけるＮ個の癌状態に対するＮ個ｔｈ モデルである。

【0297】

本明細書の実施形態に従って使用するための混合物モデルの例は、２０１９年５月１３日に出願された「モデルベースの特徴づけ及び分類」と題する米国特許出願第６２／８４７，２２３号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0298】

いくつかの実施形態では、各独立対応メチル化モデルは、二項モデル、ベータ二項モデル、独立部位モデル、又はマルコフモデルのうちの１つである。いくつかの実施形態において、第１の複数のサブモデル中の２つ以上のサブモデルは、独立部位モデルであり、第２の複数のサブモデル中の２つ以上のサブモデルは、独立部位モデルである。

【0299】

例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年２月２８日に出願された「Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｔｈａｔ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ ｏｒ Ｉｎｄｉｃａｔｅ ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ」と題する米国特許出願第６２／９８３，４４３号は、対象の特定の癌状態を識別するメチル化パターンを特定する複数の方法を開示している。具体的には、いくつかの実施形態では、癌状態のグループにおける各癌状態（例えば、起源癌）は、参照ゲノム全体または参照ゲノムのサブセット全体（例えば、標的パネル配列決定によって評価される）にわたる異常メチル化のそれぞれのパターン（例えば、修飾メチル化パターン）に対応する。特定の被験者の癌状態を決定するために、本方法は、関心のある複数のゲノム領域を評価し、複数のゲノム領域内の各ゲノム領域について、それぞれのゲノム領域にマッピングするメチル化パターンを有するフラグメントの対応するカウントを生成する（例えば、それぞれのゲノム領域にマッピングするフラグメントにおいて特定される可能なメチル化パターンごとにフラグメントのそれぞれのカウントが存在する）。次いで、本方法は、対象についての複数のゲノム領域にわたる断片カウントを、異なる癌状態に対応するメチル化パターンのデータベース（例えば、ライブラリ）と比較し（例えば、各癌状態は、複数のゲノム領域内のゲノム領域のそれぞれのサブセットについて対応する断片カウントを有する）、対象についての癌状態の可能性を決定し、ここで癌状態は、癌対非癌、癌タイプ、及び／又は起源組織に相当する。いくつかの実施形態では、本方法は、下流アプリケーションへの入力のために（例えば、腫瘍分率を推定するため、及び／又は対象の最小残存疾患を決定するために）対象の癌状態を特定するために使用される。いくつかの実施形態では、本開示で使用される複数のビンは、米国特許出願第６２／９８３，４４３号において評価された任意の単一又は任意の組み合わせのがんに関連するメチル化パターンを含む、米国特許出願第６２／９８３，４４３号において特定されたゲノムの一部を表すように選択される。

【0300】

別の例として、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年５月１３日に出願された「モデルベースの特徴づけおよび分類」と題する米国特許出願第１５／９３１，０２２号は、異なる癌状態に対応するメチル化特徴を識別するためにゲノム領域のメチル化状態（例えば、ゲノム領域にマッピングする配列読み取りにより表される断片から決定）を用いた確率的モデルの開発を開示する。いくつかの実施形態では、本開示で使用される複数のビンは、米国特許出願第１５／９３１，０２２号において評価された任意の単一または任意の組み合わせのがんに関連するメチル化パターンを含む、米国特許出願第１５／９３１，０２２号において特定されたゲノムの部分を表すように選択される。

【0301】

核酸断片に癌分類を行う他の方法としては、例えば、２０１９年１２月１３日に出願された「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｐａｔｃｈ Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ」と題する米国特許出願第６２／９４８，１２９号、２０１９年３月１３日に出願された「高次元のデータを選択、管理、分析する方法およびシステム」と題する米国特許出願第１６／３５２，７３９号、ＵＳ．特許出願第１６／４２８，５７５号、名称「Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄａｔａ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、２０１９年５月３１日出願、および米国特許出願第６２／９８５，２５８号、名称「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ａｕｔｏｅｎｃｏｄｅｒｓ」、２０２０年３月４日出願、これらの各々は参照によりその全体がここに組み込まれるものとする。

【0302】

いくつかの実施形態では、分類器は、多変量ロジスティック回帰、ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、決定木、回帰アルゴリズム、又は教師ありクラスタリングモデルである。

【0303】

多変量ロジスティック回帰を含むロジスティック回帰アルゴリズムは、Ａｇｒｅｓｔｉ， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ， １９９６， Ｃｈａｐｔｅｒ ５， ｐｐ．１０３－１４４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに開示されており、これは参照によりここに組み込まれるものとする。

【0304】

畳み込みニューラルネットワークアルゴリズムを含むニューラルネットワークアルゴリズムは、Ｓｅｅ， Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， ”Ｓｔａｃｋｅｄ ｄｅｎｏｉｓｉｎｇ ａｕｔｏｅｎｃｏｄｅｒｓ：Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｕｓｅｆｕｌ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｄｅｅｐ ｎｅｔｗｏｒｋ ｗｉｔｈ ａ ｌｏｃａｌ ｄｅｎｏｉｓｉｎｇ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ，” Ｊ Ｍａｃｈ Ｌｅａｒｎ Ｒｅｓ １１， ｐｐ．３３７１－３４０８； Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００９， ”Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｒａｉｎｉｎｇ ｄｅｅｐ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ，” Ｊ Ｍａｃｈ Ｌｅａｒｎ Ｒｅｓ １０， ｐｐ．１－４０； ａｎｄ Ｈａｓｓｏｕｎ， １９９５， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｅａｃｈ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ａｒｅ ｈｅｒｅｉｎ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．（Ｈａｐｐｉｎｅｓｓ Ｎｅｔｗｏｒｋｓは、参照により、ここに組み込まれる）．

【0305】

ＳＶＭアルゴリズムは、Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ ａｎｄ Ｓｈａｗｅ－Ｔａｙｌｏｒ， ２０００， ”Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅｓ，” Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ； Ｂｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９２， ”Ａ ｔｒａｉｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｍａｒｇｉｎ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒｓ，” ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ５ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＡＣＭ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｈｅｏｒｙ， ＡＣＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， Ｐａ．に記述されている。ｐｐ．１４２－１５２； Ｖａｐｎｉｋ， １９９８， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｈｅｏｒｙ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｍｏｕｎｔ， ２００１， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｄｕｄａ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ，ｐｐ．２５９、２６２－２６５；およびＨａｓｔｉｅ、２００１、Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＦｕｒｅｙら、２０００、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６、９０６－９１４、これらはそれぞれ、参照によりその全体をここに組み入れるものとする。分類に使用される場合、ＳＶＭは、（例えば、腫瘍分画値によって）二値ラベル付きデータ訓練セットの所定のセットを、ラベル付きデータから最大に離れた超平面を用いて分離する。線形分離が不可能な場合、ＳＶＭは特徴空間への非線形マッピングを自動的に実現する「カーネル」という手法と組み合わせて動作させることが可能である。ＳＶＭが特徴空間で見つけた超平面は、入力空間における非線形の決定境界に対応する。

【0306】

決定木は、Ｄｕｄａ， ２００１， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．３９５－３９６によって一般的に説明されており、これは参照によりここに組み込まれる。ツリーベースの方法は、特徴空間を一組の矩形に分割し、次に、各々においてモデル（定数のようなもの）を適合させる。いくつかの実施形態では、決定木はランダムフォレスト回帰である。使用することができる１つの具体的なアルゴリズムは、分類回帰木（ＣＡＲＴ）である。他の具体的な決定木アルゴリズムは、ＩＤ３、Ｃ４．５、ＭＡＲＴ、及びランダムフォレストを含むが、これらに限定されるものではない。ＣＡＲＴ、ＩＤ３、およびＣ４．５は、Ｄｕｄａ， ２００１， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ３９６－４０８頁および４１１－４１２頁に記載されており、この内容は参照によりここに組み込まれる。ＣＡＲＴ、ＭＡＲＴ、およびＣ４．５は、Ｈａｓｔｉｅら、２００１、Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第９章に記載されており、その全体が参照により本書に組み込まれるものとする。ランダムフォレストは、Ｂｒｅｉｍａｎ， １９９９， ”Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ－－Ｒａｎｄｏｍ Ｆｅａｔｕｒｅｓ，” Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ ５６７， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｕ．Ｃ． Ｂｅｒｋｅｌｅｙ， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９９に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0307】

クラスタリングは、Ｄｕｄａ ａｎｄ Ｈａｒｔ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｅｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， １９７３， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （以下「Ｄｕｄａ １９７３」）の２１１－２５６ページに記載されており、その全体が参照によりここに組み込まれるものとする。Ｄｕｄａ １９７３の６．７項に記載されているように、クラスタリング問題は、データセット内の自然なグループ化を見つけるものとして説明されている。自然なグループ分けを特定するために、２つの問題に取り組む。まず、２つのサンプル間の類似性（または非類似性）を測定する方法が決定される。この指標（類似度指標）は、あるクラスタ内のサンプルが、他のクラスタ内のサンプルに対してより似ていることを保証するために用いられる。次に、類似度指標を用いてデータをクラスタに分割する仕組みが決定される。

【0308】

類似性の尺度はＤｕｄａ １９７３のセクション６．７で議論されており、クラスタリングの調査を始める１つの方法は、距離関数を定義し、トレーニングセット内のサンプルのすべてのペアの間の距離の行列を計算することであると述べられている。距離が類似性の良い尺度であるならば、同じクラスタ内の参照エンティティ間の距離は、異なるクラスタ内の参照エンティティ間の距離よりも有意に小さくなるであろう。しかし、Ｄｕｄａ １９７３の２１５ページに記載されているように、クラスタリングは距離メトリックを使用する必要はない。例えば、２つのベクトルｘとｘ’を比較するために、非計量的な類似性関数ｓ（ｘ， ｘ’）を使用することが可能である。従来、ｓ（ｘ， ｘ’）は対称関数であり、ｘとｘ’が何らかの形で ”似ている ”場合に値が大きくなっていた。非計量的な類似性関数ｓ（ｘ， ｘ’）の例は、Ｄｕｄａ １９７３の２１８ページに記載されている。

【0309】

データセット内の点間の「類似性」または「非類似性」を測定する方法を選択した後、クラスタリングには、データの任意のパーティションのクラスタリング品質を測定する基準関数が必要である。基準関数を極大化するようなデータセットの分割が、データのクラスタリングに用いられる。Ｄｕｄａ １９７３の２１７ページを参照。基準関数はＤｕｄａ １９７３の６．８節で説明されている。

【0310】

最近では、Ｄｕｄａら、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、が出版されている。５３７－５６３ページには、クラスタリングの詳細が記述されている。クラスタリング技術に関するより詳細な情報は、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｒｏｕｓｓｅｅｕｗ， １９９０， Ｆｉｎｄｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｄａｔａ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．； Ｅｖｅｒｉｔｔ， １９９３， Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ （３ｄ ｅｄ．）， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．； ａｎｄ Ｂａｃｋｅｒ， １９９５， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、これらの各々は参照によりここに組み込まれるものとする。本開示において使用され得る特定の例示的なクラスタリング技術には、階層的クラスタリング（最近傍アルゴリズム、最遠傍アルゴリズム、平均連結アルゴリズム、セントロイドアルゴリズム、または二乗和アルゴリズムによる凝集型クラスタリング）、ｋ－平均法、ファジーｋ－平均法、およびジャービス－パトリッククラスタリングが含まれるが、それらに限定されるものではない。かかるクラスタリングは、第１の特徴のセット｛ｐ１ ， ．．．， ｐＮ－Ｋ ｝（又は第１の特徴のセットから得られる主成分）に対するものであってもよい。いくつかの実施形態では、クラスタリングは、トレーニングセットがクラスタリングされるときにどのようなクラスタが形成されるべきかという先入観が課されない教師なしクラスタリングを構成する。

【0311】

特徴を把握する。

【0312】

ブロック２２０を参照する。図２Ｂのブロック２２０を参照すると、本方法は、複数のビンにおけるそれぞれのビンについて、（ａ）複数の訓練対象におけるそれぞれの訓練対象の対象癌状態と、（ｂ）それぞれのビンに対応付けられた無細胞断片の対応する訓練セットにおけるそれぞれの無細胞断片癌状態との間の関連の対応指標Ｉを決定することによって進行する。

【0313】

いくつかの実施形態では、ブロック２２２に関して、関連性の尺度は、相関関係である。ブロック２２４を参照すると、いくつかの実施形態では、相関は、ピアソン相関係数である。ブロック２２６を参照すると、いくつかの実施形態では、相関は、調整相関係数、加重相関、反射相関係数、または尺度化相関係数を用いて実行される。

【0314】

いくつかの実施形態では、関連性の尺度は、相互情報計算である。例えば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， ”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｓ： ｍｕｔｕａｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｍｏｄｅｌ ｂａｓｅｄ ｉｎｄｉｃｅｓ，” ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １３， ３２８．を参照されたい。例えばいくつかの実施形態では、相互情報は、図８に従って計算される。図８に記載されるように、トレーニング対象ラベルＹ（２つの癌タイプの場合、癌タイプＡ又はＢ）、及びビン特徴Ｘ間の相互情報は、相互情報によって計算される。実際、図８は、被験者が癌タイプＡ又はＢのいずれかを有する確率が同じである（Ｐ（Ｙ＝Ａ）＝Ｐ（Ｙ＝Ｂ））という仮定の下での相互情報の計算方法を提供する。いくつかの特定の実施形態では、准の尺度は、以下のように計算される相互情報である。
[数５］

【0315】

いくつかのそのような実施形態において、ｉ及びｊは、がん状態のセット（例えば、第１及び第２のがん状態）に対する独立したインデックスである。いくつかの実施形態において[外]は、複数の訓練被験者のうち、がん状態ｉを有する訓練被験者の数である（例えば、ｉは第１のがん状態であり、または代替的に、ｉは第２のがん状態であるなど。）いくつかの実施形態では[外]は、それぞれのビンにマッピングされる１つ以上の無細胞断片を有する複数の訓練被験者のうち、癌状態ｊを割り当てられた訓練被験者の数である（例えば、ｊは第１の癌状態、または代替的に、ｊは第２の癌状態などである。）．２つの癌の状態の場合、この関連性の測定は次のような形式をとる。
[数６］

【0316】

いくつかのそのような実施形態では、関連性の尺度は、少なくともａ）第１の癌の状態を有し、かつ第１の癌の状態に割り当てられたそれぞれのビン内に１つ以上の無細胞断片を有する訓練被験者の数、ｂ）第１の癌の状態を有するが、第２の癌の状態に割り当てられたそれぞれのビン内に１つ以上の無細胞断片を有する訓練被験者の数に基づいて、決定される。ｃ） 第二の癌の状態を有し、かつ第二の癌の状態に割り当てられたそれぞれのビン内に１つ以上の無細胞断片を有する訓練被験者の数、および ｄ） 第二の癌の状態を有するが、第一の癌の状態に割り当てられたそれぞれのビン内に１つ以上の無細胞断片を有する訓練被験者の数。

【0317】

ある実施形態では、この機能は
[数７］
は、癌状態ｉを有し、かつ癌状態ｊを割り当てられたそれぞれのビンにマッピングされた１つ以上の無細胞断片を有する、複数の訓練被験者の中の訓練被験者の数であり
[外]は、複数の訓練被験者における訓練被験者の総数である。いくつかの実施形態では、関数[外]は、以下を含む。
（例えば、複数の訓練被験者の中の訓練被験者の総数におけるｉｔｈ の癌状態を有する訓練被験者の数の比）、及び[外]からなり[外]である。（例えば、複数の訓練対象者における訓練対象者の総数のうち、ｊｔｈ の癌の状態を有する訓練対象者の数の割合）。

【0318】

いくつかの実施形態では、２つの可能性のある癌の状態がある場合、関連性の尺度は距離メトリックである。表１は、そのような距離メトリックの例を提供する。

【0319】

[表１］

【0320】

表１において
[外]は、、訓練データセット状態ベクトルであり、におけるそれぞれの要素は、複数の訓練対象者における対応する訓練対象者のがん表示を表し、ｎは、訓練対象者ｎ人を表す。[外]は、複数の訓練対象における対応する癌対象の訓練対象癌表示を表し、ｎは、訓練母集団のｎ対象を表す。例えば、いくつかの実施形態において、所定の要素[外]は、訓練対象が第１の癌の状態を有する場合、「０」であり、訓練対象が第２の癌の状態を有する場合、０である。表１において[外]は、距離メトリックが計算されるそれぞれのビンのためのベクトルである。のように[外]の各要素は、対応する癌の状態を表す。[外]の各要素は、対応する癌の状態を表す。ただし[外]の各要素は、対応する癌の状態を表す。[外]
は、距離メトリックが計算される訓練対象者のそれぞれのビンの測定された態様を表す。いくつかの実施形態において、各要素[外]は、被験者のビン内の断片のいずれかが第１の癌状態であると分類されたかどうかに関する二値表示である（例えば、あるときは「０」、ないときは「１」）。いくつかの実施形態では、対象ビン内の各要素は[外]は、サブジェクトビン内のフラグメントのいずれかが、第２のがんの状態であると分類されたかどうかに関するバイナリ表示である（例えば、ある場合は「０」、ない場合は「１」）。いくつかの実施形態では、各要素の[外]の各要素は、第１の癌状態であると分類されたサブジェクトビン内のフラグメントの数（例えば、ある場合は「０」、ない場合は「１」）をビン内の全フラグメントで割った比率である。いくつかの実施形態では、各要素の[外]は、被験者のビン内の、第２のがんの状態であると分類されたフラグメントの数（例えば、あるときは「０」、ないときは「１」）をビン内の全フラグメントで割った比率である。いくつかの実施形態では、各要素の[外]は、第１のがんの状態であると分類された対象のビン内のフラグメントの数（例えば、ある場合は「０」、ない場合は「１」）を、第２のがんの状態であると分類された対象のビン内のすべてのフラグメントで割った比率である。いくつかの実施形態では、以下の各要素は[外]は、第１の癌の状態であると分類された対象ビン内のフラグメントの閾値の存在（例えば、閾値を満たす場合は「０」、閾値を満たさない場合は「１」）かどうかに関する二値表示である。この閾値は、上述した比率又は断片数の何れかの閾値とすることができる。さらに、表１において、ｍａｘｉ、ｍｉｎｉは、それぞれ、ｉｔｈ要素の最大値（例えば 、「１」）、最小値（例えば、「０」）である。距離に基づく分類に関する追加の詳細および情報は、Ｙａｎｇら、１９９９、「ＤｉｓｔＡＩ：Ａｎ Ｉｎｔｅｒ－ｐａｔｔｅｒｎ Ｄｉｓｔａｎｃｅ－ｂａｓｅｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ」、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ、３（１）、５５－８３に開示されており、これは参照によりここに組み込まれるものとする。

【0321】

いくつかの実施形態では、関連性の尺度の計算は、複数の訓練対象における各訓練対象が複数の癌状態のうちの１つを有する複数のビンにおける各ビンについて、関連性の尺度を決定する。いくつかのそのような実施形態では、関連性の尺度は、以下のように計算される。
[数８］

【0322】

いくつかの実施形態では、この式におけるｉ、ｊ、及びｎは、癌状態のセットに対する（例えば、複数の癌状態におけるそれぞれのそれぞれの癌状態に対する）独立した指標である。いくつかの実施形態において[外]は、がん状態ｉを有する複数の訓練被験者中の訓練被験者の数であり、いくつかの実施形態では[外]は、がん状態ｊを割り当てられたそれぞれのビンにマッピングされた１つ以上の無細胞断片を有する、複数の訓練被験者の中の訓練被験者の数である。ｚｎ を含むまで、それぞれのそれぞれのがん状態を有する、複数の訓練被験者の中の訓練被験者のそれぞれの数が存在する。 いくつかの実施形態において、この関数は[外]は、以下の比率からなる。[外]であり、ここで[外]は、癌状態ｉを有し、かつ癌状態ｊ～ｎのうちの１つに割り当てられたそれぞれのビンにマッピングされた１つ以上の無細胞断片を有する、複数の訓練被験者の中の訓練被験者の数であり[外]
は、複数の訓練被験者における訓練被験者の総数である。いくつかの実施形態では、関数[外]は、以下を含む。[外]（例えば、複数の訓練対象における訓練対象の総数における、ｉｔｈの癌状態を有する訓練対象の数の比率）、及び[外]からなり[外]（例えば、複数の訓練被験者における訓練被験者の総数における、ｊｔｈの癌の状態を有する訓練被験者の数の比率）。いくつかの実施形態では、複数の癌状態における各癌状態は、対応する比率（例えば、[外]）が、それぞれの癌の状態を有する訓練被験者の数（例えば、ｎｔｈ癌の状態）である。

【0323】

ブロック２２８を参照する。方法は、図２Ｂのブロック２２８を参照して、対象細胞源率を推定するための複数の特徴を複数のビンのサブセットとして特定することによって続けられ、複数のビンのサブセット内のそれぞれのビンは、それぞれのビンについて対応する関連性の測定に基づく選択基準を満たす。

【0324】

いくつかの実施形態では、選択基準は、関連性の上位Ｎ個の測定のうちの１つを有するビンの選択を指定し、ここでＮは、５０以上の正の整数である。いくつかの実施形態では、Ｎは、５００と５０００の間である。いくつかの実施形態では、Ｎは８００と１５００の間である。いくつかの実施形態では、Ｎは、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００、又は少なくとも１５００の間である。

【0325】

いくつかの実施形態では、ブロック２３０を参照すると、選択基準は、関連性の上位Ｎ個の尺度のうちの１つを有するビンの選択を指定し、ここでＮは５０以上の正の整数である（例えば、関連性の最高尺度を有する少なくとも５０個のビンが、特徴として選択される）。

【0326】

いくつかの実施形態では、複数の特徴は、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００、又は少なくとも１５００の特徴からなる。いくつかの実施形態では、複数の特徴は、５００以上５０００以下、８００以上１５００以下、又は１５００以上の特徴からなる。

【0327】

細胞源分画を推定する。

【0328】

いくつかの実施形態では、被験者の細胞源率を推定するための複数の特徴（例えば、ビンのサブセット）を特定した後、方法は、少なくとも複数の特徴に基づいて被験者の細胞源率を推定することを更に含む。

【0329】

いくつかの実施形態では、本方法は、電子的形態で、試験用複数の無細胞断片におけるそれぞれのそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンを得ることを含む手順によって、細胞源または腫瘍画分推定を実行し（ｅ．から）、それぞれのそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）被験体から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む１つ以上の核酸試料のメチル化配列決定によって決定され、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位の各ＣｐＧのメチル化状態からなる、手順によって推定する。本手順は、試験用複数の無細胞断片中の各無細胞断片を複数のビン中のビンにマッピングし、それによって無細胞断片の複数の試験セットを得ることをさらに含み、無細胞断片の各試験セットは複数のビン中の異なるビンにマッピングされる。この手順は、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力したときの分類器の出力の関数として、複数の無細胞断片のテストセットにおけるそれぞれの無細胞断片に対して無細胞断片癌条件を割り当てることによって継続される。この手順は、複数のビンのサブセットにわたる無細胞断片の各テストセットにおいて第１の癌状態を割り当てられた被験体からの無細胞断片の数の中心傾向の第１の指標を計算することと、複数のビンのサブセットにわたる無細胞断片の各テストセットにおいて被験体からの無細胞断片の数の中心傾向の第２の指標を計算することとを含む。この手順は、中心傾向の第１の尺度及び中心傾向の第２の尺度を用いて、被験体に対する細胞源分率を推定する。

【0330】

いくつかの実施形態において、第２の癌状態は、癌の非存在を含み、被験体について推定された細胞源分率は、被験体についての腫瘍分率を含む。

【0331】

例えば、いくつかの実施形態では、腫瘍割合推定値は、被験者の生体試料（例えば、ｃｆＤＮＡ及び／又は血漿）中の１つ以上のメチル化状態パターンが腫瘍由来であり、かかる腫瘍由来のメチル化パターンの頻度が正常細胞に対する癌細胞の割合（例えば、腫瘍割合）に直接比例するという仮定に基づいて計算される。

【0332】

そのような画分を決定する様々な方法があり、その一部は、２０１９年１２月１８日に出願された「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｓｏｕｒｃｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願第１６／７１９，９０２号及び２０２０年４月１６日出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｓｍａｌｌ Ｖａｒｉａｎｔｓ」と題する米国特許出願第１６／８５０，６３４号に記載されており、その両方が参照により本書にその全体として援用されるものとする。

【0333】

いくつかの実施形態では、中心傾向の第１の指標は、複数のビンのサブセットにわたる無細胞断片の各テストセットにおいて第１の癌条件を割り当てられた複数の試験対象からの無細胞断片の数の算術平均、加重平均、中間値、トライミーン、Ｗｉｎｓｏｒｉｚｅｄ平均、平均、又は最頻値である。いくつかの実施形態では、中心傾向の第２の尺度は、複数のビンのサブセットにわたる無細胞断片の各テストセットにおける複数の被験体からの無細胞断片の数の算術平均、加重平均、中間値、トリミン、ウィンザー化平均、平均値、又は最頻値である。いくつかの実施形態では、細胞源分率を推定することは、中心傾向の第１の尺度を中心傾向の第２の尺度で割ることを含んでいる。幾つかの実施形態では、複数の訓練対象における各訓練対象のそれぞれの対象癌状態は、複数の癌状態から選択される。いくつかの実施形態において、対応する中心傾向の尺度は、複数の癌状態におけるそれぞれのそれぞれの癌状態について決定される。いくつかのそのような実施形態では、細胞源分率を推定することは、中心傾向の第１の尺度を中心傾向の他の各尺度の合計で割ることを含む。

【0334】

いくつかの実施形態では、被験体の腫瘍分画は、０．００３～１．０の範囲である。いくつかの実施形態では、被験体の腫瘍分率は、０．００１～１．０の範囲内である。いくつかの実施形態では、被験体の腫瘍分率は、少なくとも０．００１、少なくとも０．００５、少なくとも０．０１、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９又は少なくとも１．０である。

【0335】

いくつかの実施形態では、被験者の細胞源（例えば、腫瘍）画分を決定することは、被験者の起源の癌をさらに同定する。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の癌の状態は、起源組織（例えば、癌が起源であると考えられている場所）を含んでいる。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の癌の状態は、癌の病期（例えば、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期またはＩＶ期）を含んでいる。

【0336】

いくつかの実施形態において、起源となる癌は、非癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、腎癌、子宮癌、膵臓癌からなる群より選択される第１の癌の状態を含んでいる。食道癌、リンパ腫、頭頸部癌、卵巣癌、肝胆膵癌、メラノーマ、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、胃癌、鼻咽頭癌、肝癌、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される第１の癌の状態を含んでいる。

【0337】

いくつかの実施形態では、起源となる癌は、乳癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、腎癌、子宮癌、膵臓癌からなる群から選択される少なくとも第１の癌状態及び第２の癌状態をそれぞれ含んでいる。食道癌、リンパ腫、頭頸部癌、卵巣癌、肝胆膵癌、メラノーマ、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、胃癌、鼻咽頭癌、肝癌、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも第１の癌の状態および第２の癌の状態を含む。

【0338】

いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の癌の状態は、乳癌の段階、肺癌の段階、前立腺癌の段階、大腸癌の段階、腎癌の段階、子宮癌の段階、膵臓癌の段階、食道癌の段階、リンパ腫の段階、頭／首癌の段階から構成され、卵巣癌の段階、肝／膵臓癌の段階、黒色腫の段階、子宮頸癌の段階、多発性骨髄腫の段階、白血球の段階、又は、白血球の段階を含む。卵巣癌、肝胆膵癌、メラノーマ、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、胃癌、鼻咽頭癌、肝癌、またはこれらの組み合わせの病期。

【0339】

いくつかの実施形態では、被験体の細胞源（例えば、腫瘍）画分を決定することは、被験体に治療勧告（例えば、癌治療）を提供することをさらに含み、治療勧告は、細胞源画分（例えば、疾患がどの程度進行しているか）及び起源癌に少なくとも部分的に基づいている。

【0340】

いくつかの実施形態では、本方法は、疾患の進行を監視するため、または治療効果（例えば、治療効力）を監視するために、１つまたは複数の時点（例えば、治療の前または後）で被験体の細胞源（例えば、腫瘍）画分を決定することをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、経時的な腫瘍分画の増加（例えば、第２の後の時点）は、疾患の進行を示し、逆に、いくつかの実施形態では、経時的な腫瘍分画の減少（例えば、第２の後の時点）は、治療が成功したことを示す。

【0341】

例えば、いくつかの実施形態において、本方法は、被験体に対する細胞源分画の値に少なくとも部分的に基づいて、被験体に治療レジメンを適用することをさらに含む。いくつかの実施形態では、治療レジメンは、被験体に癌のための薬剤を適用することを含む。いくつかの実施形態では、癌のための薬剤は、ホルモン、免疫療法、放射線療法、又は癌治療薬である。いくつかの実施形態では、癌のための薬剤は、レナリドミド、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス４価（６、１１、１６、及び１８型）ワクチン。ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、プロマクタ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、又はこれらの後発品等。

【0342】

いくつかの実施形態では、被験体は、癌のための薬剤で処理されており、本方法は、被験体の細胞源画分を使用して、癌のための薬剤に対する被験体の応答を評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、癌のための薬剤は、ホルモン、免疫療法、放射線療法、又は癌治療薬である。いくつかの実施形態では、癌のための薬剤は、レナリドミド、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブルチニブ、ヒトパピローマウイルス４価（６、１１、１６、及び１８型）ワクチン。ペルツズマブ、ペメトレキセド、ニロチニブ、デノスマブ、酢酸アビラテロン、プロマクタ、イマチニブ、エベロリムス、パルボシクリブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、またはそれらの後発品等。

【0343】

いくつかの実施形態において、被験体は、癌のための薬剤で治療されており、本方法は、被験体における癌のための薬剤を強化するか中止するかを決定するために被験体の細胞源分画を使用することをさらに備える。いくつかの実施形態では、被験体は、がんに対処するための外科的介入を受けており、本方法は、外科的介入に応じた被験体の状態を評価するために、被験体の細胞源分画を使用することをさらに備える。

【0344】

いくつかの実施形態では、本方法は、エポックにわたる複数の時点（例えば、２つ以上の時点、３つ以上の時点、４つ以上の時点）におけるそれぞれの時点において繰り返される。エポックにわたる複数の時点（例えば、２つ以上の時点、３つ以上の時点、４つ以上の時点）におけるそれぞれの時点において本方法を繰り返し、それによって、それぞれの時点における被験体について、複数の細胞源（例えば、腫瘍）画分における対応する細胞源（例えば、腫瘍）画分を得、複数の細胞源（例えば、腫瘍）画分を用いて、被験体における疾患の状態又は進行を決定する。複数の細胞源（例えば、腫瘍）分画を使用して、その時点における被験者の病状の状態又は進行を、その時点における第１の細胞源（例えば、腫瘍）分画の増加又は減少という形で判定すること。

【0345】

いくつかのそのような実施形態では、エポックは数ヶ月の期間であり、複数の時点の各時点は、数ヶ月の期間内の異なる時点である。いくつかの実施形態では、数ヶ月の期間は、１ヶ月と４ヶ月の間、４ヶ月と８ヶ月の間、８ヶ月と１２ヶ月の間、１２ヶ月と１８ヶ月の間、１８ヶ月と２４ヶ月の間、または２４ヶ月より多い期間である。いくつかの実施形態では、数ヶ月の期間は、４ヶ月未満である。

【0346】

いくつかの実施形態では、エポックは年の期間であり、複数のタイムポイントの各タイムポイントは、年の期間内の異なるタイムポイントである。いくつかの実施形態では、年の期間は、２年と１０年の間である。いくつかの実施形態では、年の期間は、１年と５年の間、５年と１０年の間、１０年と１５年の間、１５年と２０年の間、又は２０年以上である。

【0347】

いくつかの実施形態では、エポックは時間の期間であり、複数のタイムポイントにおける各タイムポイントは、時間の期間内の異なるタイムポイントである。いくつかの実施形態では、時間の期間は、１時間から６時間の間である。いくつかの実施形態では、時間の期間は、１時間と３時間の間、３時間と６時間の間、６時間と９時間の間、９時間と１２時間の間、１２時間と１８時間の間、１８時間と２４時間の間、又は２４時間以上の間である。

【0348】

いくつかの実施形態では、本方法は、被験体の第１の細胞源（例えば、腫瘍）画分がエポックにわたって閾値量だけ変化することが観察されるとき、被験体の診断を変更することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、被験体の第１の細胞源（例えば、腫瘍）画分がエポックにわたって閾値量だけ変化することが観察される場合に、被験体の予後を変更することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、対象の第１の細胞源（例えば、腫瘍）画分がエポックにわたって閾値量だけ変化することが観察される場合に、対象の治療を変更することをさらに含む。前述の実施形態のいくつかでは、閾値は、１パーセントより大きい、５パーセントより大きい、１０パーセントより大きい、２０パーセントより大きい、３０パーセントより大きい、４０パーセントより大きい、又は５０パーセントより大きい。いくつかの実施形態において、閾値は、２倍より大きい、３倍より大きい、４倍より大きい、又は５倍より大きい。

【0349】

特定の実施形態では、本方法は、癌治療前（例えば、切除手術又は治療的介入の前）である第１の時点だけでなく、癌治療後（例えば、切除手術又は治療的介入の後）である第２の時点でも行われ、各時点で開示される方法によって決定される細胞源（例えば、腫瘍）画分の比較によって治療の有効性を監視するために開示される方法が使用される。例えば、第２の時点における腫瘍分率が、第１の時点における腫瘍分率と比較して減少する場合、治療は成功したとみなされる。しかし、第２の時点における腫瘍分率が第１の時点における腫瘍分率と比較して増加する場合、治療は成功しなかったとみなされる。他の実施形態では、第１及び第２の時点の両方が、癌治療の前（例えば、切除手術又は治療的介入の前）である。さらに他の実施形態では、第１及び第２の時点の両方が、癌治療の後（例えば、切除手術又は治療的介入の前）であり、本方法は、治療の効果又は治療の効果の喪失を監視するために使用される。さらに他の実施形態では、生物学的試料（ｃｆＤＮＡ試料）は、第１および第２の時点で被験体（例えば、癌患者）から得られ、例えば、癌の進行を監視するため、癌が寛解（例えば、治療後）しているかどうかを決定するため、残存疾患もしくは疾患の再発を監視もしくは検出するため、または治療（例えば、治療）効果を監視するために分析されてもよい。

【0350】

当業者であれば、生体試料を任意の数の時点にわたって試験対象（例えば、癌患者）から取得し、本開示の方法に従って分析して、患者における癌状態（例えば、腫瘍分画経由）を監視できることを容易に理解するであろう。いくつかの実施形態では、第１及び第２の時点は、約１５分から約３０年までの範囲の時間によって分離され、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０．１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または約２４時間、例えば約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５または約３０日、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月、あるいは例えば約１、１．５，２，２．５，３，３．５，４，４．５，５，５．５，６，６．５，７，７．５，８，８．５，９，９．５，１０，１０．５，１１，１１．５，１２，１２．５，１３，１３．５，１４，１４．５，１５，１５．５，１６，１６．５，１７，１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５又は約３０年の間である。他の実施形態では、生物学的サンプルは、少なくとも３ヶ月に１回、少なくとも６ヶ月に１回、少なくとも１年に１回、少なくとも２年に１回、少なくとも３年に１回、少なくとも４年に１回、または少なくとも５年に１回、患者から取得することができる。

【0351】

被検者の推定細胞源率を決定すること。

【0352】

ブロック３０２図３Ａのブロック３０２を参照すると、対象（例えば、試験対象）の細胞源分率を推定する方法が提供される。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態では、被験体は、任意の段階の男性又は女性（例えば、男性、女性、又は子供）である。いくつかの実施形態では、被験体の細胞源画分は、単一の細胞源に由来する。いくつかの実施形態では、被験者のための細胞源画分は、２つ以上の細胞源に由来する。いくつかの実施形態では、細胞源分画は、上記ブロック２０２に関して記載された通りである。

【0353】

ブロック３０４を参照する。ブロック３０４を参照すると、本方法は、電子的形態で、複数の無細胞断片におけるそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンを得ることによって続けられる（ｅ．．．，複数の無細胞断片は、対象の生体試料に由来する）、ここで、それぞれのそれぞれの無細胞断片の対応するメチル化パターンは、（ｉ）対象から得られた生体試料中のそれぞれの断片を含む１つまたは複数の核酸試料のメチル化配列決定によって求められ、（ｉｉ）それぞれの断片中の対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態から構成される。いくつかの実施形態では、ブロック３０６を参照すると、複数の無細胞断片は、５００ヌクレオチド未満の平均長さを有する。いくつかの実施形態では、無細胞断片は、ブロック２０４に関して上述したように、生体試料に由来する。

【0354】

いくつかの実施形態では、生体試料は、被験者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液からなる、又はそれらから構成される。このような実施形態では、生体試料は、被験者の血液、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、糞便、唾液、汗、涙、胸水、心嚢液、又は腹膜液の他、被験者の他の成分（例えば、固体組織等）を含んでもよい。

【0355】

そのような生物学的試料は、無細胞核酸断片（例えば、ｃｆＤＮＡ断片）を含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、配列決定分析の準備のために、無細胞核酸を抽出するように処理される。非限定的な例として、いくつかの実施形態では、無細胞核酸断片は、Ｋ２ ＥＤＴＡチューブで対象から採取された生体試料（例えば、血液試料）から抽出される。生体試料が血液である場合、試料は、採取後２時間以内に、生体試料をまず１０００ｇで１０分間二重回転させ、次に、得られた血漿を２０００ｇで１０分間回転させることによって処理される。その後、血漿は１ｍｌのアリコートで－８０℃に保存される。このようにして、無細胞核酸抽出の目的のために、生体試料から適当な量の血漿（例えば、１～５ｍｌ）が調製される。いくつかのそのような実施形態では、無細胞核酸は、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出され、ＤＮＡ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ）中に溶出される。いくつかの実施形態では、精製された無細胞核酸は、使用するまで－２０℃で保存される。例えば、Ｓｗａｎｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１７， ”Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｔＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｐｉｃｔｓ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，” Ｎａｔｕｒｅ， ５４５（７６５５）：４４６－４５１であり、これは参照により本明細書に組み込まれる。配列決定の目的で生物学的方法から無細胞核酸を調製するために、他の同等の方法を使用することができ、そのような方法はすべて本開示の範囲内である。

【0356】

いくつかの実施形態では、生体試料から得られる無細胞核酸断片は、本開示で定義される核酸の任意の形態、又はそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、生体試料から得られる無細胞核酸は、ＲＮＡ及びＤＮＡの混合物である。

【0357】

ある実施形態では、無細胞核酸断片は、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換するように処理される。ある実施形態では、本方法は、メチル化シトシンを変換せずに非メチル化シトシンをウラシルに変換するＤＮＡの重亜硫酸塩処理を用いる。例えば、ＥＺ ＤＮＡ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＴＭ － Ｇｏｌｄ、ＥＺ ＤＮＡ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＴＭ － Ｄｉｒｅｃｔ又はＥＺ ＤＮＡ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＴＭ － Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）から入手可能）などの市販キットが、重亜硫酸塩変換に使用される。別の実施形態では、非メチル化シトシンのウラシルへの変換は、酵素反応を用いて達成される。例えば、変換は、ＡＰＯＢＥＣ－Ｓｅｑ（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）のような非メチル化シトシンのウラシルへの変換のための市販のキットを使用することができる。

【0358】

変換された無細胞核酸断片から、シークエンシングライブラリーが調製される。オプションとして、配列決定ライブラリーは、複数のハイブリダイゼーションプローブを用いて、細胞由来の情報を有する無細胞核酸断片、またはゲノム領域について濃縮される。ハイブリダイゼーションプローブは、特に指定された無細胞核酸断片、又は標的領域にハイブリダイズし、その後の配列決定及び解析のためにそれらの断片又は領域を濃縮する短いオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、細胞起源について情報がある指定されたＣｐＧ部位のセットの標的高深度分析を実行するために使用される。一旦調製されると、配列決定ライブラリー又はその一部は、複数の配列リードを得るために配列決定される。

【0359】

いくつかの実施形態では、配列決定は、メチル化配列決定からなる。いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、ペアエンドシーケンシングである。いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、シングルリードシーケンシングである。いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、全ゲノムメチル化シーケンシングである。いくつかの実施形態では、メチル化シーケンシングは、複数の核酸プローブを用いた標的シーケンシングであり、複数のビンにおけるそれぞれのビンは、複数の核酸プローブにおける少なくとも１つの対応する核酸プローブと関連付けられる。いくつかの実施形態では、複数のビンのそれぞれのビンは、複数の核酸プローブの中の少なくとも２つの対応する核酸プローブと関連付けられる。

【0360】

いくつかの実施形態では、複数の核酸プローブ（例えば、標的配列決定に使用されるプローブ）は、１，０００以上の核酸プローブ、２，０００以上の核酸プローブ、３，０００以上の核酸プローブ、４，０００以上の核酸プローブ、５，０００以上の核酸プローブ、１０，０００以上の核酸プローブ、２０，０００以上の核酸プローブ又は３０，０００以上の核酸プローブから構成される。いくつかの実施形態では、１，０００個の核酸プローブと３０，０００個の核酸プローブの間の複数の核酸プローブがある。

【0361】

いくつかの実施形態において、メチル化配列決定（例えば、本明細書に記載されるまたは当該技術分野において公知の任意のメチル化配列決定方法に従って行われる）が、それぞれのフラグメントにおいて１つまたは複数の５－メチルシトシン（５ｍＣ）および／または５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出する、場合である。

【0362】

いくつかの実施形態では、メチル化配列決定は、それぞれのフラグメントの配列リードにおける、１つまたは複数の非メチル化シトシンまたは１つまたは複数のメチル化シトシンを、対応する１つまたは複数のウラシルに変換することを含んでいる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のウラシルは、１つまたは複数の対応するチミンとして、メチル化配列決定中に検出される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の非メチル化シトシンまたは１つまたは複数のメチル化シトシンの変換は、化学的変換、酵素的変換、またはそれらの組み合わせを含んでなる。

【0363】

いくつかの実施形態において、それぞれのフラグメントにおける対応する複数のＣｐＧ部位におけるそれぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態は、以下の通りである。ａ）それぞれのＣｐＧ部位がメチル化されているとメチル化シークエンシングにより決定される場合、メチル化されている、ｂ）それぞれのＣｐＧ部位がメチル化されていないとメチル化シークエンシングにより決定される場合、非メチル化されている、ｃ）それぞれのＣｐＧ部位のメチル化状態をメチル化または非メチル化として呼ぶことができないとき「その他」としてフラッグされる。

【0364】

ブロック３０８を参照する。ブロック３０８を参照すると、方法は、複数の無細胞断片中の各無細胞断片を複数のビン中のビンにマッピングし、それによって複数の無細胞断片のセットを得、無細胞断片の各セットは、複数のビン中の異なるビンにマッピングされることによって継続される。

【0365】

いくつかの実施形態では、ブロック３１０を参照すると、複数のビンは、１０００と１００，０００の間のビンで構成される。いくつかの実施形態では、複数のビンは、１５０００から８００００の間のビンで構成される。いくつかの実施形態では、複数のビンは、上記のブロック２１０に関して説明したように、任意の数のビンからなる。

【0366】

ブロック３１２を参照すると、いくつかの実施形態では、複数のビンにおけるそれぞれのそれぞれのビンは、平均して、１０～１２００個の間の残基を有している。いくつかの実施形態では、複数のビンにおけるそれぞれのビンは、平均して、１０～１００００個の間の残基を有する。いくつかの実施形態では、複数のビンのそれぞれのそれぞれのビンは、平均して、１０～５００個の間の残基を有する。いくつかの実施形態では、複数のビンのそれぞれのそれぞれのビンは、平均して、１０～１００個の間の残基を有する。いくつかの実施形態では、複数のビンのそれぞれのそれぞれのビンは、平均して、２５～１００個の間の残基を有する。いくつかの実施形態では、複数のビンのそれぞれのビンは、平均して、５０００～１００００個の間の残基を有する。

【0367】

さらに、ブロック３１４に関して、いくつかの実施形態では、複数のビンにおける各ビンは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上のＣｐＧ部位からなる又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、ヒト参照ゲノムにおける２～１００個の連続したＣｐＧ部位から構成される。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、２～５０個の連続するＣｐＧ部位からなる。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、５０個から１００個の連続するＣｐＧ部位からなる。いくつかの実施形態では、複数のビンの各ビンは、少なくとも２つの連続するＣｐＧ部位からなる。

【0368】

ブロック３１６を参照する。ブロック３１６を参照すると、本方法は、無細胞断片の複数の訓練セットにおける無細胞断片の各訓練セット内のそれぞれの無細胞断片に無細胞断片癌状態を割り当てることによって続き、無細胞断片癌状態は、それぞれの無細胞断片のメチル化パターンを分類器に入力した際の分類器の出力の関数として、第１癌状態及び第２癌状態のうちの１つである。ブロック３１８を参照すると、いくつかの実施形態では、第１の癌の状態は癌であり、第２の癌の状態は癌の非存在である。いくつかの実施形態では、第１の癌の状態は癌であり、第２の癌の状態は癌の非存在である。いくつかの実施形態では、無細胞断片癌状態は、複数の癌状態のうちの１つである（例えば、ブロック２０６を参照して上述したように）。

【0369】

いくつかの実施形態では、無細胞断片状態を割り当てるために使用される分類器は、第１の癌状態に対する第１のモデルと第２の癌状態に対する第２のモデルとを備え、第１のモデルは、第１の複数のサブモデルを含む第１の混合モデルであり、第２のモデルは、第２の複数のサブモデルを含む第２の混合モデルであり、第１及び第２の複数のサブモデルにおけるそれぞれのサブモデルは、対応する生体試料における無細胞断片の供給源に対する独立した対応メチル化モデルを表している。いくつかの実施形態では、分類器は、式（１）又は式（３）の形式を有する。

【0370】

ブロック３２０を参照する。図３Ｂのブロック３２０を参照すると、本方法は、複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて第１の癌状態を割り当てられた対象からの無細胞断片の数の中心傾向の第１の指標を計算することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ブロック３２２を参照すると、中心傾向の第１の尺度は、複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて第１の癌状態を割り当てられた対象からの無細胞断片の数の算術平均、加重平均、中位、中位、トリミン、ウィンザー化平均、平均、又は最頻値である。

【0371】

ブロック３２４を参照する。ブロック３２４を参照すると、本方法は、複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて第２の癌状態を割り当てられた対象からの無細胞断片の数の第２の中心傾向の指標を計算することを更に含む。いくつかの実施形態では、ブロック３２６を参照すると、中心傾向の第２の尺度は、複数のビンにわたる無細胞断片の各セットにおいて第１の癌状態を割り当てられた対象からの無細胞断片の数の算術平均、加重平均、中位、中位、トリメイン、Ｗｉｎｓｏｒｉｚｅｄ平均、平均、又は最頻値である。

【0372】

ブロック３２８を参照する。ブロック３２８を参照すると、本方法は、中心傾向の第１の尺度及び中心傾向の第２の尺度を用いて被験者の細胞源分画を推定することによって進む。いくつかの実施形態では、細胞源分画は、腫瘍分画を含んでいる。ブロック３３０について、いくつかの実施形態では、腫瘍分率を推定することは、中心傾向の第１の測定値を中心傾向の第２の測定値で割ることからなる。

【0373】

いくつかの実施形態では、細胞源分画は、被験体における細胞源に関連する疾患（例えば、癌）を治療するための治療選択肢を決定するための基礎又は部分的基礎として使用される。いくつかの実施形態では、細胞源分画は、治療モニタリングのための基礎として使用される。いくつかの実施形態では、被験者の推定細胞源分率が与えられると、特定の治療オプションが被験者に有効でない、又は有効でないだろうと判断することが可能である。例えば、チェックポイント免疫療法は、細胞傷害性Ｔ細胞が機能不全に陥り、アポトーシスを受けると、効果的でないだろう。このような状況は、例えば、対象者の生体試料からの複数の断片が、血液中の細胞障害性Ｔ細胞に由来すると判定された場合に示される。いくつかの実施形態では、推定された細胞源分画は、最小残存疾病量の監視を助ける。

【0374】

当業者は、前のセクションに開示された実施形態（例えば、「細胞源割合を推定するための特徴の特定」参照）のいずれかが、本明細書に記載される、被験者の推定細胞源割合を決定するための方法及び実施形態に任意の組み合わせで適用されることを認識することができる。

【0375】

例
実施例１－癌別ｃｔＤＮＡ分画中央値のステージ別増加量。

【0376】

図４を参照すると、被験者は、癌の種類に関係なく、癌のステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶでグループ化されている。図４において、Ｘ軸は各被験者がどの癌の病期を有するかを示し、Ｙ軸は各被験者について観察されたｃｔＤＮＡ分率を示す。各被験者のｃｆＤＮＡ分率を計算するために使用される方法は、コホート内の各被験者の生体試料から電子形式の第１の複数の核酸断片配列を得ることを含み、生体試料は無細胞核酸分子で構成される。

【0377】

図４は、基礎となるがんを示す無細胞配列の読み取り値を持つ被験者のうち、がんの種類に関係なく、がんのステージによってｃｔＤＮＡ分率がどのように変化するかを示す分析結果である。したがって、図４は、臨床的病期分類（ステージ１～４）によって決定されるように疾患がより重篤になると、細胞源分画の証拠（より大きなｃｔＤＮＡ分画）がｃｆＤＮＡに見いだされることを示している。図４は、これがＣＣＧＡコホート（ＣＣＧＡコホートの詳細については実施例３を参照）全体にわたる一般的なケースである一方、この傾向に対する違反（ｏｕｔｌｉｅｒｓ）が存在することを示している。図４におけるそのような外れ値は示唆的であり、臨床的な誤分類によって最もよく説明される。したがって、図４は、基礎疾患の基本的な構成要素である、ｃｆＤＮＡにおける一般的な予想細胞源分画率を示している。図４はまた、ステージ４には非常に低い菌糸放出率を示す個体があることを示しており、ステージ４内に異なるサブステートが存在することを示している。

【0378】

図４は、意味のある有益な閾値を設定するための基礎として、シェディング率（ｃｔＤＮＡの割合）を使用できることを示している。

【0379】

実施例２－複数のシーケンスリードを取得する。

【0380】

図５は、一実施形態による、配列決定のための核酸試料を調製するための方法５００のフローチャートである。方法５００は、以下のステップを含むが、これに限定されるものではない。例えば、方法５００の任意のステップは、品質管理又は当業者に知られている他の実験室アッセイ手順のための定量サブステップを構成してもよい。

【0381】

ブロック５０２において、核酸サンプル（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が被験者から抽出される。サンプルは、全ゲノムを含む、ヒトゲノムの任意のサブセットであってよい。試料は、癌を有することが知られている、又は癌を有することが疑われている対象から抽出されてもよい。試料は、血液、血漿、血清、尿、糞便、唾液、他の種類の体液、又はそれらの任意の組合せを含んでもよい。いくつかの実施形態では、血液サンプルを採取するための方法（例えば、注射器又は指刺し）は、外科手術を必要とする場合がある組織生検を得るための手順よりも侵襲性が低い場合がある。抽出された試料は、ｃｆＤＮＡ及び／又はｃｔＤＮＡを含んでいてもよい。健康な人の場合、人体はｃｆＤＮＡ及びその他の細胞残屑を自然に除去することができる。被験者が癌や疾患を患っている場合、抽出されたサンプル中のｃｔＤＮＡは、診断のために検出可能なレベルで存在する可能性がある。

【0382】

ブロック５０４では、配列決定ライブラリが調製される。ライブラリ調製中、アダプターライゲーションを通じて、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）が核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）に付加される。ＵＭＩは、アダプターライゲーション中にＤＮＡフラグメントの末端に付加される短い核酸配列（例えば、４～１０塩基対）である。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、特定のＤＮＡ断片に由来する配列読み取りを識別するために使用することができる固有のタグとして機能する縮退塩基対である。アダプターライゲーションに続くＰＣＲ増幅の間、ＵＭＩは、付着したＤＮＡ断片とともに複製される。これにより、ダウンストリーム解析において、同じオリジナル断片に由来するシーケンスリードを同定することができる。

【0383】

ブロック５０６において、標的化ＤＮＡ配列は、ライブラリーから濃縮される。濃縮の間、ハイブリダイゼーションプローブ（本明細書では「プローブ」とも呼ばれる）は、癌（または疾患）の有無、癌の状態、または癌の分類（例えば、癌クラスまたは起源組織）について情報提供する核酸断片を標的化し、プルダウンするために使用される。所定のワークフローにおいて、プローブは、ＤＮＡの標的（相補的）鎖にアニール（またはハイブリダイズ）するように設計されることがある。標的鎖は、「ポジティブ」鎖（例えば、ｍＲＮＡに転写され、その後タンパク質に翻訳される鎖）であっても、相補的な「ネガティブ」鎖であってもよい。プローブの長さは、１０、１００、または１０００塩基対の範囲であってもよい。一実施形態では、プローブは、メチル化部位パネルに基づいて設計される。一実施形態では、プローブは、特定の癌又は他の種類の疾患に対応すると疑われるゲノム（例えば、ヒト又は他の生物の）の特定の変異又は標的領域を分析するために、標的遺伝子のパネルに基づいて設計される。さらに、プローブは、標的領域の重複する部分をカバーしてもよい。ブロック４０８において、これらのプローブは、核酸サンプルの一般的な配列読み取りを行うために使用される。

【0384】

図６は、一実施形態による配列リードを得るためのプロセスを示すグラフ図である。図６は、試料からの核酸セグメント８００の一例を描写している。ここで、核酸セグメント６００は、一本鎖のような核酸セグメントとすることができる。いくつかの実施形態では、核酸セグメント６００は、二本鎖のｃｆＤＮＡセグメントである。図示された例では、異なるプローブによって標的化され得る核酸セグメントの３つの領域６０５Ａ、６０５Ｂ、及び６０５Ｃが描かれている。具体的には、３つの領域６０５Ａ、６０５Ｂ、及び６０５Ｃの各々は、核酸セグメント６００上の重なり合う位置を含む。重複する位置の例は、図５においてシトシン（「Ｃ」）ヌクレオチド塩基６０２として描かれている。シトシンヌクレオチド塩基６０２は、領域６０５Ａの第１の縁の近く、領域６０５Ｂの中央、及び領域６０５Ｃの第２の縁の近くに位置する。

【0385】

いくつかの実施形態では、プローブの１つ以上（または全て）は、特定の癌または他の種類の疾患に対応すると疑われるゲノム（例えば、ヒトまたは別の生物の）の特定の変異または標的領域を分析するための遺伝子パネルまたはメチル化部位パネルに基づいて設計される。全エクソームシーケンス」としても知られるゲノムの全ての発現遺伝子を配列決定するのではなく、標的遺伝子パネルまたはメチル化部位パネルを使用することによって、方法６００は、標的領域の配列決定深度を増加させるために使用され得、ここで深度は、サンプル内の所定の標的配列が配列決定された回数のカウントを意味する。配列決定深度を増加させることで、核酸サンプルの必要な入力量を減らすことができる。

【0386】

つ以上のプローブを用いた核酸サンプル６００のハイブリダイゼーションにより、標的配列６７０の把握が行われる。図６に示すように、標的配列６７０は、ハイブリダイゼーションプローブによって標的化される領域６０５のヌクレオチド塩基配列である。また、標的配列６７０は、ハイブリダイゼーション核酸断片と呼ぶこともできる。例えば、標的配列６７０Ａは、第１のハイブリダイゼーションプローブによって標的とされる領域６０５Ａに対応し、標的配列６７０Ｂは、第２のハイブリダイゼーションプローブによって標的とされる領域６０５Ｂに対応し、標的配列６７０Ｃは、第３のハイブリダイゼーションプローブによって標的とされる領域６０５Ｃに対応する。シトシンヌクレオチド塩基６０２がハイブリダイゼーションプローブによって標的化された各領域６０５Ａ～Ｃ内の異なる位置にあることを考えると、各標的配列６７０は、標的配列６７０上の特定の位置でシトシンヌクレオチド塩基６０２に対応するヌクレオチド塩基を含んでいる。

【0387】

ハイブリダイゼーションステップの後、ハイブリダイズした核酸断片は捕捉され、また、ＰＣＲを用いて増幅されることができる。例えば、標的配列６７０を濃縮して、その後に配列決定することができる濃縮配列６８０を得ることができる。いくつかの実施形態では、各濃縮配列６８０は、標的配列６７０から複製される。標的配列６７０Ａ及び６７０Ｃからそれぞれ増幅される濃縮配列６８０Ａ及び６８０Ｃはまた、各配列読み取り部６８０Ａ又は６８０Ｃの端部付近に位置するチミンヌクレオチド塩基を含む。以下では、参照アレル（例えば、シトシンヌクレオチド塩基６０２）に対して変異している濃縮配列６８０中の変異ヌクレオチド塩基（例えば、チミンヌクレオチド塩基）を代替アレルと見做す。さらに、標的配列６７０Ｂから増幅された各濃縮配列６８０Ｂは、各濃縮配列６８０Ｂの中心付近または中心に位置するシトシンヌクレオチド塩基を含む。

【0388】

図５のブロック５０８において、配列リードは、濃縮ＤＮＡ配列、例えば、図６に示す濃縮配列６８０から生成される。配列データは、当技術分野において既知の手段によって濃縮ＤＮＡ配列から取得されてもよい。例えば、方法６００は、合成技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、パイロシーケンス（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、イオン半導体技術（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、単一分子リアルタイムシーケンス（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ライゲーションによるシーケンス（ＳＯＬｉＤ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ナノポアシークエンス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、又はペアエンドシーケンスを含む次世代シーケンス（ＮＧＳ）技術を含んでもよい。いくつかの実施形態では、可逆的色素ターミネーターを有するｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを用いて、超並列シーケンシングを行う。

【0389】

いくつかの実施形態では、配列リードは、アライメント位置情報を決定するために、当該技術分野において既知の方法を用いて参照ゲノムにアライメントされてもよい。アラインメント位置情報は、所定の配列リードの開始ヌクレオチド塩基及び終了ヌクレオチド塩基に対応する参照ゲノム内の領域の開始位置及び終了位置を示してもよい。アラインメント位置情報は、開始位置及び終了位置から決定され得る配列リードの長さを含んでもよい。参照ゲノム中の領域は、遺伝子または遺伝子のセグメントに関連する場合がある。

【0390】

様々な実施形態において、配列読み取りは、以下のように示される読み取りペアで構成される。[外]と[外]例えば、第１リード[外]は、核酸断片の第１末端から配列決定されるかもしれない一方、第２リード[外]核酸断片の第二末端から配列決定することができる。したがって、第１のリードのヌクレオチド塩基対[外]と第２リード[外]の塩基対は、参照ゲノムの塩基と一貫して（例えば、反対の向きで）整列されることがある。リードペアから得られるアラインメント位置情報[外]と[外]は、第１のリードの末尾に対応する参照ゲノム中の開始位置（例えば、[外]）と、第２のリードの終端に対応する参照ゲノム中の終端位置（例えば．．．， [外]）．言い換えれば、参照ゲノムにおける開始位置と終了位置は、核酸断片が対応する参照ゲノム内の可能性の高い位置を表す。ＳＡＭ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｍａｐ）形式またはＢＡＭ（ｂｉｎａｒｙ）形式を有する出力ファイルを生成し、メチル化状態の決定などのさらなる解析のために出力することができる。

【0391】

実施例３ － Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｓｔｕｄｙ （ＣＣＧＡ） コホート。

【0392】

ＣＣＧＡ［ＮＣＴ０２８８９９７８］からの被験者を、本開示の実施例において使用した。ＣＣＧＡは、１４０以上の施設で１５，０００人以上の人口統計学的にバランスのとれた参加者を登録した、前向き多施設観察型ｃｆＤＮＡベース早期癌検出研究である。

【0393】

この例では、ＣＣＧＡのサブスタディの一つを見る。登録時に定義された、新たに治療歴のないがんと診断された被験者（Ｃ、ケース）およびがんと診断されていない参加者（非がん［ＮＣ］、コントロール）から血液が採取されました。この事前に計画されたサブスタディには、２０種類の腫瘍とすべての臨床病期において、８７８人の症例、５８０人の対照者、１６９人のアッセイ対照者（ｎ＝１６２７）が含まれている。

【0394】

全サンプルは以下の方法で解析された。１）ｃｆＤＮＡと白血球（ＷＢＣ）のペアターゲットシーケンス（６０，０００Ｘ、５０７遺伝子パネル）；ジョイントコーラーがＷＢＣ由来の体細胞変異と残留技術ノイズを除去；２）ｃｆＤＮＡとＷＢＣのペアホールゲノムシーケンス（ＷＧＳ、３５Ｘ）；新規の機械学習アルゴリズムが癌関連のシグナルスコアを生成；ジョイント解析が共有イベントを特定；３）ｃｆＤＮＡホールゲノムバイサルファイトシーケンス（ＷＧＢＳ、３４Ｘ）。３）ｃｆＤＮＡ全ゲノムバイサルファイトシーケンス（ＷＧＢＳ、３４Ｘ）；異常なメチル化断片を用いて正規化スコアを生成した。体細胞モザイク（例：クローン性造血）と一致するように、ＷＢＣにマッチしたバリアントは年齢とともに増加し、いくつかはこれまでに報告されていない非正規の機能喪失型突然変異であった。ＷＢＣ変異体除去後、正規のドライバー体細胞変異体はＣに非常に特異的であった（例えば、ＥＧＦＲとＰＩＫ３ＣＡでは、ＮＣは０個で、Ｃはそれぞれ１１個と３０個であった）。同様に、ＷＧＳで体細胞コピー数変化（ＳＣＮＡ）が検出された８人のＮＣのうち、４人はＷＢＣに由来するものであった。ＣＣＧＡのＷＧＢＳデータは、情報量の多いハイパーフラグメントおよびハイポフラグメントレベルのＣｐＧ（１：２の比率）を明らかにし、そのサブセットを用いてメチル化スコアを算出した。すべてのアッセイにおいて、ＮＣ被験者の１％未満に一貫した「癌様」シグナルが観察された（診断されていない癌の可能性を表す）。ＮＣ対ステージＩ－ＩＩＩ対ステージＩＶで増加傾向が観察された（ｎｏｎｓｙｎ．ＳＮＶｓ／ｉｎｄｅｌｓ ｐｅｒ Ｍｂ ［Ｍｅａｎ±ＳＤ］ ＮＣ： １．０１±０．８６， ｓｔａｇｅ Ｉ－ＩＩＩ： ２．４３±３．９８； ｓｔａｇｅ ＩＶ： ６．４５±６．７９； ＷＧＳ ｓｃｏｒｅ ＮＣ： ０．００±０．０８， Ｉ－ＩＩＩ： ０．２７±０．９８； ＩＶ： １．９５±２．３３； ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ ＮＣ： ０±０．５０； Ｉ－ＩＩＩ： １．０２±１．７７； ＩＶ： ３．９４±１．７０ ）。これらのデータは、浸潤癌に対する９９％以上の特異性を達成することが可能であることを示し、早期癌検出のためのｃｆＤＮＡアッセイの有望性を支持するものである。

【0395】

実施例４ － 細胞ソースの例
いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、共通の原発部位の第１の癌状態である。いくつかの実施形態では、第１の癌状態は、乳癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、腎癌、子宮癌、膵臓癌、食道の癌、リンパ腫、頭／首癌、卵巣癌、肝胆膵癌、黒色腫、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、胃癌またはそれらの組合せである。

【0396】

いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、ある癌種の腫瘍、又はその分画である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、副腎皮質癌、小児副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌の腫瘍、カポジ肉腫、肛門癌に関連する腫瘍、虫垂癌に関連する腫瘍、アストロサイトーマ。小児（脳腫瘍）腫瘍、非定型奇形腫・ラブドイド腫瘍、中枢神経系（脳腫瘍）腫瘍、皮膚基底細胞癌、胆管癌に伴う腫瘍、膀胱癌腫瘍、小児膀胱癌腫瘍、骨癌（ｅ．ｇ．ｇ．，ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）組織、脳腫瘍、乳癌組織、小児乳癌組織、小児気管支腫瘍、バーキットリンパ腫組織、カルチノイド腫瘍（消化管）、小児カルチノイド腫瘍、原発不明癌、小児原発不明癌、小児心臓（心）腫瘍、中枢神経（例えば、小児異型脳腫瘍など。小児非定型奇形腫・ラブドイドなどの脳腫瘍）腫瘍、小児胚性腫瘍、小児胚細胞腫瘍、子宮頸癌組織、小児子宮頸癌組織、胆管癌組織、小児脊索腫組織、慢性骨髄増殖性新生物。大腸がん腫瘍、小児大腸がん腫瘍、小児頭蓋咽頭腫組織、非浸潤性乳管がん（ＤＣＩＳ）、小児胚性腫瘍、子宮内膜がん（子宮がん）組織、小児上衣腫組織食道がん組織、小児食道がん組織、エステシオネーロブラストーマ（頭頸部がん）組織、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼球がん組織、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫。卵管癌組織、胆嚢癌組織、胃（胃）癌組織、小児胃（胃）癌組織、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、小児消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍（ｅ．ｇ．，小児中枢神経系生細胞腫瘍、小児頭蓋外生細胞腫瘍、卵巣生細胞腫瘍、または精巣癌組織）、頭頸部癌組織、小児心臓腫瘍、肝細胞癌（ＨＣＣ）組織。膵島細胞腫瘍（膵神経内分泌腫瘍）、腎臓または腎細胞癌（ＲＣＣ）組織、喉頭癌組織、白血病、肝癌組織、肺癌（非小細胞および小細胞）組織、小児肺癌組織、男性乳癌組織。骨悪性線維性組織球腫および骨肉腫、メラノーマ、小児メラノーマ、眼内メラノーマ、小児眼内メラノーマ、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、小児中皮腫、転移性癌組織。原発不明転移性扁平上皮癌組織、ＮＵＴ 遺伝子変化を伴う正中線癌、口腔癌（頭頸部癌）組織、多発性内分泌腫瘍症候群組織、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群組織。骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、慢性骨髄増殖性新生物、鼻腔・副鼻腔癌組織、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）組織、神経芽腫組織、非小細胞肺癌組織、口腔癌組織。唇・口腔がん・中咽頭がん組織、骨肉腫・骨悪性線維性組織球腫組織、卵巣がん組織、小児卵巣がん組織、膵臓がん組織、小児膵臓がん組織、乳頭腫症（小児喉頭がん）組織傍神経節腫組織、小児傍神経節腫組織、副鼻腔・鼻腔癌組織、副甲状腺癌組織、陰茎癌組織、咽頭癌組織、褐色細胞腫組織、小児褐色細胞腫組織、下垂体腫瘍。形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性腹膜癌組織、前立腺癌組織、直腸癌組織、網膜芽腫、小児横紋筋肉腫、唾液腺癌組織、肉腫（ｅ．ｇ．ｇ．，小児血管腫、骨肉腫、子宮肉腫など）、セザリー症候群（リンパ腫）組織、皮膚がん組織、小児皮膚がん組織、小細胞肺がん組織、小腸がん組織、皮膚扁平上皮がん、原発不明扁平頸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん組織、小児精巣がん組織、喉がん（例えば、上咽頭がん、上腸がん）。上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌）組織、胸腺腫または胸腺癌、甲状腺癌組織、腎盂・尿管移行細胞癌組織、原発不明癌組織、尿管または腎盂組織。移行細胞癌（腎臓（腎細胞）癌組織、尿道癌組織、子宮内膜子宮癌組織、子宮肉腫組織、膣癌組織、小児膣癌組織、血管腫瘍、外陰部癌組織、ウィルムス腫瘍などの小児腎臓腫瘍。

【0397】

いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、第１の癌の状態である。いくつかのそのような実施形態では、第１の癌の状態は、乳癌の段階、肺癌の段階、前立腺癌の段階、大腸癌の段階、腎癌の段階、子宮癌の段階、膵臓癌の段階、食道癌の段階である。リンパ腫、頭頸部がん、卵巣がん、肝胆膵がん、メラノーマ、子宮頸がん、多発性骨髄腫、白血病、甲状腺がん、膀胱がん、胃がんなどの病期である。

【0398】

いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、乳癌の所定の段階、肺癌の所定の段階、前立腺癌の所定の段階、大腸癌の所定の段階、腎癌の所定の段階、子宮癌の所定の段階、膵臓癌の所定の段階、食道癌の所定の段階、リンパ腫の所定の段階、頭頸部癌の所定の段階、肝胆膵癌の所定の段階、メラトンの所定の段階リンパ腫の所定のステージ、頭頸部がんの所定のステージ、卵巣がんの所定のステージ、肝胆膵がんの所定のステージ、メラノーマの所定のステージ、子宮頸がんの所定のステージ、多発性骨髄腫の所定のステージ、白血病の所定のステージ、甲状腺がんの所定のステージ、膀胱がんの所定のステージ又は胃癌の所定のステージである。

【0399】

いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、非癌組織由来である。いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、健康な組織に由来する細胞からのものである。いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、乳房、肺、前立腺、大腸、腎臓、子宮、膵臓、食道、リンパ、卵巣、子宮頸、表皮、甲状腺、膀胱、胃、またはそれらの組み合わせなどの健康組織からのものである。

【0400】

いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、１つの組織型から誘導される。いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、２つ以上の組織型から誘導される。いくつかの実施形態では、組織型は、１つ以上の細胞型（例えば、健康な非癌性細胞と癌性細胞との組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態では、組織型は、１つの細胞型（例えば、癌性細胞又は健康な非癌性細胞のいずれか１つ）を含む。

【0401】

いくつかの実施形態において、本開示の任意の実施形態の細胞源は、１つの細胞種、２つの細胞種、３つの細胞種、４つの細胞種、５つの細胞種、６つの細胞種、７つの細胞種、８つの細胞種、９つの細胞種、１０つの細胞種、又は１０以上の細胞種を構成している。

【0402】

いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、肝細胞である。いくつかのそのような実施形態では、細胞源は、肝細胞、肝星状脂肪蓄積細胞（ＩＴＯ細胞）、クッパー細胞、類洞内皮細胞、またはそれらの任意の組合せである。

【0403】

いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、胃細胞である。いくつかのそのような実施形態では、細胞源は、頭頂細胞である。

【0404】

いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、１つ又は複数のタイプのヒト細胞である。いくつかのそのような実施形態では、細胞源は、適応性ＮＫ細胞、脂肪細胞、肺胞細胞、アルツハイマー型ＩＩアストロサイト、アマクリン細胞、アメロブラスト、アストロサイト、Ｂ細胞、好塩基球、好塩基球活性化細胞、好塩基球増加細胞、ベッツ細胞。ベッツ細胞、ビストレート化細胞、ベッチャー細胞、心筋細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、セメント芽細胞、小脳顆粒細胞、胆管細胞、コレシスト細胞、クロマフィン細胞、シガー細胞、クラブ細胞、オルチコトロピック細胞。細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、腸クロム親和細胞、腸クロム親和様細胞、好酸球、糸球体外メサンギウム細胞、ファゴット細胞、脂肪パッド細胞、胃長細胞、ゴブレット細胞、性腺刺激性細胞肝星細胞、肝細胞、過分化好中球、糸球体内メサンギウム細胞、ｘｔａｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ 細胞、ケラチノサイト、腎近位尿細管ブラシボーダー細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ 細胞、乳酸性細胞、Ｌｅｙｄｉｇ 細胞。マクロファージ、黄斑変性細胞、マスト細胞、巨核球、メラノサイト、小胞体細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、輝細胞、好中球、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞。オキシフィル細胞（副甲状腺）、パネス細胞、傍濾胞細胞、パラソル細胞、副甲状腺長細胞、頭頂細胞、傍細胞神経分泌細胞、ペグ細胞、周皮細胞、管状ミオイド細胞、血小板、ポドサイト制御性Ｔ細胞、網状細胞、網膜双極細胞網膜水平細胞、網膜神経節細胞、網膜前駆細胞、センチネル細胞、セルトリ細胞、体細胞栄養細胞、体細胞栄養細胞、星状細胞、サステナ細胞、Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、テロサイト、腱細胞、チロトロピック細胞、移行性Ｂ細胞、トリコサイト（ヒト）、房細胞、単極ブラシセル、白血球、ゼルバーレン又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかのそのような実施形態では、細胞源のそのような細胞は、健康である。代替の実施形態では、細胞源のそのような細胞は、癌に罹患している。

【0405】

いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、そのような細胞型が単一の器官に由来することを条件として、細胞型の任意の組み合わせである。いくつかのそのような実施形態では、この単一器官は、乳房、肺、前立腺、結腸／直腸、腎臓、子宮、膵臓、食道、血液、頭／首、卵巣、肝臓、子宮頸、甲状腺、膀胱、又は胃である。いくつかの実施形態では、この単一臓器は健康である。代替的な実施形態では、この単一器官は、単一器官に由来する癌に悩まされている。さらに別の実施形態では、この単一器官は、単一器官以外の器官に由来し、単一器官に転移した癌に罹患している。

【0406】

いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、そのような細胞型が器官の所定のセットに由来することを条件として、細胞型の任意の組み合わせである。いくつかのそのような実施形態では、この所定の器官のセットは、乳房、肺、前立腺、結腸／直腸、腎臓、子宮、膵臓、食道、血液、頭／首、卵巣、肝臓、子宮頸、甲状腺、膀胱及び胃のセット内の任意の２つの器官である。いくつかの実施形態では、この所定の臓器のセットは健康である。代替的な実施形態では、この所定の臓器のセットは、所定の臓器のセット内の臓器の１つに由来する癌に悩まされている。さらに別の実施形態では、この所定の器官のセットは、所定の器官のセット以外の器官に由来し、所定の器官のセットに転移した癌に罹患している。

【0407】

いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、そのような細胞型が器官の所定のセットに由来することを条件として、細胞型の任意の組み合わせである。いくつかのそのような実施形態では、この所定の器官のセットは、乳房、肺、前立腺、結腸／直腸、腎臓、子宮、膵臓、食道、血液、頭／首、卵巣、肝臓、子宮頸、甲状腺、膀胱及び胃のセット中の任意の３つの器官である。いくつかの実施形態では、この所定の臓器のセットは健康である。代替的な実施形態では、この所定の臓器のセットは、所定の臓器のセット内の臓器の１つに由来する癌に悩まされている。さらに別の実施形態では、この所定の器官のセットは、所定の器官のセット以外の器官に由来し、所定の器官のセットに転移した癌に罹患している。

【0408】

いくつかの実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、そのような細胞型が器官の所定のセットに由来することを条件として、細胞型の任意の組み合わせである。いくつかのそのような実施形態では、この所定の器官のセットは、乳房、肺、前立腺、結腸／直腸、腎臓、子宮、膵臓、食道、血液、頭／首、卵巣、肝臓、子宮頸、甲状腺、膀胱及び胃のセット中の任意の４つの器官、５つの器官、６つの器官、又は７つの器官である。いくつかの実施形態では、この所定の臓器のセットは健康である。代替的な実施形態では、この所定の臓器のセットは、所定の臓器のセット内の臓器の１つに由来する癌に悩まされている。さらに別の実施形態では、この所定の器官のセットは、所定の器官のセット以外の器官に由来し、所定の器官のセットに転移した癌に罹患している。

【0409】

いくつかの具体的な実施形態では、本開示の任意の実施形態の細胞源は、白血球である。いくつかのそのような実施形態では、細胞源は、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、細胞障害性Ｔ細胞、単球、またはそれらの任意の組合せである。

【0410】

結論

【0411】

複数のインスタンスは、単一のインスタンスとして本明細書で説明されるコンポーネント、操作または構造に対して提供されるかもしれない。最後に、様々なコンポーネント、操作、およびデータストアの間の境界は、多少任意であり、特定の操作は、特定の例示的な構成の文脈で説明される。他の機能の割り当てが想定され、実装の範囲に入る可能性がある。一般に、例示的な構成において別々のコンポーネントとして示された構造および機能は、結合された構造またはコンポーネントとして実装されてもよい。同様に、単一のコンポーネントとして提示された構造および機能は、別々のコンポーネントとして実装されてもよい。これらおよび他の変形、修正、追加、および改善は、実装（複数可）の範囲に含まれる。

【0412】

また、本明細書では、様々な要素を説明するために第１、第２などの用語を使用することがあるが、これらの要素はこれらの用語によって限定されるべきではないことが理解されるであろう。これらの用語は、１つの要素を別の要素から区別するためにのみ使用される。例えば、本開示の範囲から逸脱することなく、第１の主題を第２の主題と称することができ、同様に、第２の主題を第１の主題と称することができる。第１の被写体及び第２の被写体は、いずれも被写体であるが、同一の被写体ではない。

【0413】

本開示で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の説明及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことが意図される。また、本明細書で使用される「及び／又は」という用語は、関連する列挙された項目の１つ以上の任意の及び全ての可能な組み合わせを指し、包含することが理解されるであろう。本明細書で使用される場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び／又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、記載された特徴、整数、ステップ、操作、要素、及び／又は成分の存在を規定するが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除しないことはさらに理解されよう。

【0414】

本明細書で使用される場合、用語「もし」は、文脈に応じて、「いつ」または「時に」または「決定に応答して」または「検出することに応答して」を意味すると解釈される場合がある。同様に、「決定されれば」または「［述べられた条件または事象］が検出されれば」という語句は、文脈に応じて、「決定時に」または「決定に応答して」または「（述べられた条件または事象）を検出する際に」または「（述べられた条件または事象）を検出することに応答して」を意味すると解釈され得る。

【0415】

前述の説明には、例示的な実装を具現化する例示的なシステム、方法、技術、命令列、および計算機プログラム製品が含まれていた。説明のために、発明的主題の様々な実装の理解を提供するために、多数の具体的な詳細が示された。しかし、当業者には、本発明主題の実装は、これらの具体的な詳細なしに実施され得ることが明らかであろう。一般に、よく知られた命令例、プロトコル、構造及び技術は詳細に示されていない。

【0416】

前述の説明は、説明のために、特定の実施態様を参照して説明されている。しかしながら、上記の例示的な議論は、網羅的であること、または実施態様を開示された正確な形態に限定することを意図していない。多くの修正および変形が、上記の教示に鑑みて可能である。実施態様は、原理およびその実用的な応用を最もよく説明し、それによって当業者が、企図される特定の使用に適するように、実施態様および様々な修正を加えた様々な実施態様を最もよく利用できるように、選択および記述されたものである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】