特表 2023-507554 レンチウイルスベクターの一過性産生のための方法および構築物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-24

(54)【発明の名称】レンチウイルスベクターの一過性産生のための方法および構築物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/867 20060101AFI20230216BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230216BHJP

   C12N 15/47 20060101ALI20230216BHJP

   C12N 15/49 20060101ALI20230216BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20230216BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230216BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230216BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230216BHJP

【ＦＩ】

C12N15/867 Z

C12N5/10

C12N15/47

C12N15/49

C12N15/54

A61P37/04

A61P25/00

A61K35/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022530926

(86)(22)【出願日】2020-12-17

(85)【翻訳文提出日】2022-05-26

(86)【国際出願番号】 US2020065458

(87)【国際公開番号】W WO2021127076

(87)【国際公開日】2021-06-24

(31)【優先権主張番号】62/949,848

(32)【優先日】2019-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512190365

【氏名又は名称】ロンザ ウォーカーズヴィル，インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】シン， ヤン

(72)【発明者】

【氏名】セス， アナンディタ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA95Y

4B065AA97Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA24

4B065CA29

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZB09

(57)【要約】

本開示は、哺乳類細胞を使用してレンチウイルスベクターを産生するための方法に関する。具体的には、本方法は、４つではなく３つのプラスミドを利用して、必要なパッケージング要素を提供し、ベクターを細胞に導入し、懸濁液ベースの細胞を含む哺乳類細胞において、多数のレンチウイルスベクターの産生を可能にする。これらの方法は、対象となる特定の遺伝子を含むように調整することができるレンチウイルスベクターの産生を可能にする。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

レンチウイルスベクターを産生する方法であって、
ａ．哺乳類細胞を、
ｉ．第１のプロモーターの制御下のレンチウイルスビリオンタンパク質発現調節因子（ＲＥＶ）遺伝子および第２のプロモーターの制御下のエンベロープ糖タンパク質遺伝子をコードする第１の核酸、
ｉｉ．第３のプロモーターの制御下の対象遺伝子をコードする第２の核酸、ならびに
ｉｉｉ．第４のプロモーターの制御下のレンチウイルス群特異抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子の両方をコードする第３の核酸を用いてトランスフェクトすることと、
ｂ．前記トランスフェクトされた哺乳類細胞を培養することと、
ｃ．前記レンチウイルスベクターを単離することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記哺乳類細胞が、哺乳類細胞培養物である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記哺乳類細胞培養物が、懸濁培養物である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記エンベロープ糖タンパク質遺伝子が、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＧＡＧ遺伝子が、ＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、前記ＰＯＬ遺伝子が、ＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

ＶＳＶ－ＧおよびＲＥＶをコードする前記核酸が、コドン最適化される、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＶＳＶ－Ｇ遺伝子の発現が、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターによって駆動される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＲＥＶ遺伝子の発現が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記対象遺伝子が、治療対象遺伝子である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法によって産生される、レンチウイルスベクター。

【請求項12】

レンチウイルスベクターによる治療方法であって、
ａ．哺乳類対象に請求項１１に記載のレンチウイルスベクターを投与することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、哺乳類細胞を使用してレンチウイルスベクターを産生するための方法に関する。具体的には、本方法は、４つではなく３つのプラスミドを利用して、必要なパッケージング要素を提供し、ベクターを細胞に導入し、懸濁液ベースの細胞を含む哺乳類において、多数のレンチウイルスベクターの産生を可能にする。これらの方法は、対象となる特定の遺伝子を含むように調整することができるレンチウイルスベクターの産生を可能にする。

【背景技術】

【0002】

レンチウイルスベクターは、遺伝子療法および細胞療法の分野で最も一般的に使用されている送達方法の１つである。レンチウイルスベクターの産生プロセスでは、ベクター産生に必要な配列は、複製能のあるレンチウイルス（ＲＣＬ）を生成する機会を最小限に抑えるために、いくつかの異なるプラスミドまたは発現カセットに分割される。一般に、第３世代のレンチウイルス産生システムは、以下を発現する４つの別個のプラスミドまたは発現カセットを利用する：
１）レンチウイルス群特異抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク質、
２）エンベロープタンパク質（通常、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ））、
３）ＨＩＶビリオンタンパク質発現調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＲＥＶ）タンパク質、ならびに
４）対象遺伝子（ＧＯＩ）を含有する導入ベクター（ＴＶ）。

【0003】

最も一般的なアプローチでは、上記の４つのプラスミドは、レンチウイルスベクターを産生するために、細胞に一過的にトランスフェクトされ、これは労働集約的であり、コストがかかる。４つの別々のプラスミドのトランスフェクションに必要なＤＮＡの量の最適化にも時間がかかり、面倒である。加えて、４つのプラスミドの一過性トランスフェクションは、大量のプラスミドＤＮＡを必要とし、これは、複製能のあるレンチウイルスが偶発的に産生される可能性があり、安全上の懸念が生じる。

【0004】

４つのプラスミドの一過性トランスフェクションに関連する困難を克服するために必要なのは、対象遺伝子をコードするプラスミドを含む４つ未満のプラスミドのトランスフェクションを使用して、拡張可能な量のレンチウイルスベクターを産生するための方法である。本発明は、これらの必要性を満たす。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターを産生する方法が本明細書に提供され、第１のプロモーターの制御下のレンチウイルスビリオンタンパク質発現調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＲＥＶ）遺伝子および第２のプロモーターの制御下のエンベロープ糖タンパク質遺伝子をコードする第１の核酸、第３のプロモーターの制御下の対象遺伝子をコードする第２の核酸、ならびに第４のプロモーターの制御下のレンチウイルス群特異抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子をコードする第３の核酸を用いて哺乳類細胞をトランスフェクトすることと、トランスフェクトされた哺乳類細胞を培養することと、レンチウイルスベクターを単離することと、を含む。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1A】本明細書の実施形態によるレンチウイルス産生のためのプラスミドの概略図である。

【図1B】本明細書の実施形態によるレンチウイルス産生のためのプラスミドの概略図である。

【図2】ＧＦＰを対象遺伝子として使用して、本明細書に記載の方法（３プラスミドシステム）を使用して達成されたレンチウイルスの力価を示す。

【図3】対象遺伝子としてＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔを使用した市販の製品（４プラスミドシステム）と比較した、本明細書に記載の方法（３プラスミドシステム）を使用して達成されたレンチウイルスの力価を示す。

【発明を実施するための形態】

【0007】

特許請求の範囲および／または本明細書における用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つ（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」、および「１つまたは２つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）」の意味とも一致する。

【0008】

本出願を通して、用語「約」は、値が、値を決定するために採用される方法／デバイスの固有の誤差変動を含むことを示すために使用される。典型的には、この用語は、状況に応じて、およそ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、もしくは２０％、または１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、もしくは２０％未満の変動を包含することを意味する。

【0009】

特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されない限り、または代替物が互いに排他的である限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替案および「および／または」のみを指す定義をサポートしている。

【0010】

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの「含む」の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの「有する」の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの「含む」の任意の形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの「含有する」の任意の形態）は、包括的またはオープンエンドであり、追加の、列挙されない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態が、本発明の任意の方法、システム、宿主細胞、発現ベクター、および／または組成物に関して実装され得ることが企図される。さらに、本発明の組成物、システム、細胞、および／または核酸を使用して、本明細書に記載される方法のいずれかを実現することができる。

【0011】

本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸分子」、または「オリゴヌクレオチド」は、共有結合したヌクレオチドを含むポリマー化合物を意味する。「核酸」という用語は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、これらはいずれも、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡには、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、プラスミドまたはベクターＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＭＩＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。

【0012】

「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリを指し、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸分子が含まれる。「遺伝子」はまた、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列として機能し得る核酸断片を指す。一部の実施形態では、遺伝子は、複数のコピーと統合される。一部の実施形態では、遺伝子は、所定のコピー数で統合される。

【0013】

レンチウイルスベクターとその産生
レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）に基づく、よく研究されたベクターシステムである。他のレンチウイルスシステムもまた、遺伝子導入システムとして開発されており、ＨＩＶ－２サル免疫不全ウイルス、非霊長類レンチウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、およびウシ免疫不全ウイルスなどが挙げられる。ヒトにおけるＨＩＶ－１の病原性（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｎａｔｕｒｅ）による安全上の懸念に導かれ、臨床目的および研究開発目的で使用するために最も広く使用されているレンチウイルスシステムは、図１Ａに示されるような４つのプラスミドシステムに基づき、これは、以下を発現する：
１）レンチウイルス群特異抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク質、
２）エンベロープタンパク質（通常、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ））、
３）ＨＩＶビリオンタンパク質の発現調節因子（ＲＥＶ）タンパク質、ならびに
４）対象遺伝子（ＧＯＩ）を含有する導入ベクター（ＴＶ）。

【0014】

従来、接着細胞培養物として、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）などの哺乳類細胞を４つのプラスミドで各々トランスフェクトし、次いで、対象遺伝子を含有する所望のレンチウイルスを産生する。一般に、これらの一過的にトランスフェクトされた細胞は、レンチウイルスを産生することができる。

【0015】

レンチウイルスベクターは、免疫不全および神経変性疾患を含む療法および疾患治療のために、一般に、所望の細胞に導入される対象遺伝子を用いて産生される。

【0016】

本発明は、改善されたレンチウイルスを産生する方法（懸濁液中で増殖させることができる細胞を含む、３つのプラスミドシステムを使用してレンチウイルスを調製するための方法を含む）を提供し、産生されるレンチウイルスの量の有意な増加、および労力の量および時間のかかるＤＮＡ量の最適化プロトコルの低減を可能にする。

【0017】

実施形態では、レンチウイルスベクターを産生する方法が本明細書に提供され、第１のプロモーターの制御下のレンチウイルスビリオンタンパク質発現調節因子（ＲＥＶ）遺伝子および第２のプロモーターの制御下のエンベロープ糖タンパク質遺伝子をコードする第１の核酸、第３のプロモーターの制御下の対象遺伝子をコードする第２の核酸、ならびに第４のプロモーターの制御下のレンチウイルス群特異抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子の両方をコードする第３の核酸を用いて哺乳類細胞をトランスフェクトすることを含む。

【0018】

好適には、本明細書に記載の様々な方法で利用することができる細胞は、哺乳類の細胞および細胞株または培養物である。本明細書で使用される場合、用語「哺乳類細胞」は、任意の哺乳類のメンバー由来の細胞、例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、ハムスター細胞などを含む。一部の実施形態では、細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯＫ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、すべての変異体を含むＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（例えば、ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）、Ｌｏｎｚａ、Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）、すべての変異体を含むＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ（グルタミン合成酵素ノックアウト）細胞（例えば、ＸＣＥＥＤ（商標） Ｌｏｎｚａ、Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）である。例示的なヒト細胞としては、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ細胞、またはＨＴ１０８０細胞などのヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞が挙げられる。

【0019】

哺乳類細胞には、哺乳類細胞培養物が含まれ、哺乳類細胞培養物は、接着培養物または懸濁培養物のいずれかであり得る。接着培養物は、基質表面、例えば、プラスチックプレート、皿、または他の好適な細胞培養増殖プラットフォーム上で増殖する細胞であって、足場依存性であり得る細胞を指す。懸濁培養物は、例えば、ガスおよび栄養素交換のための大きな表面積を可能にする培養フラスコまたは大きな懸濁槽中で維持され得る細胞を指す。懸濁細胞培養物は、多くの場合、攪拌機構または撹拌機構を利用して、適切な混合をもたらす。細胞を懸濁液中に維持するための培地および条件は、当該技術分野において一般的に既知である。例示的な懸濁細胞培養物には、ヒトＨＥＫ２９３クローン細胞が含まれる。

【0020】

実施形態では、本明細書に記載の方法は、レンチウイルスベクターを産生することを含む。本明細書で使用される場合、「ベクター」または「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンであり、本明細書に記載の核酸分子が結合されて、細胞中で結合された核酸分子の複製および／または発現をもたらし得る。「ベクター」は、エピソーム（例えば、プラスミド）および非エピソームベクターを含む。「ベクター」という用語は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで核酸分子を細胞に導入するためのウイルス手段および非ウイルス手段の両方を含む。ベクターという用語には、合成ベクターが含まれてもよい。ベクターは、トランスフェクション、形質導入、細胞融合、およびリポフェクションを含むがこれらに限定されない、周知の方法によって、所望の宿主細胞に導入され得る。ベクターは、プロモーターを含む様々な調節要素を含むことができる。「レンチウイルスベクター」は、所望の遺伝子が、遺伝子療法の目的のために、研究または治療用途での使用に好適に挿入され得るベクターを指す。好適には、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶファミリー由来である。

【0021】

本明細書で使用される「トランスフェクション」とは、プラスミドおよび／またはベクターを含む外因性核酸分子を細胞に導入することを意味する。「トランスフェクトされた」細胞は、細胞内に外因性核酸分子を含み、「形質転換された」細胞は、細胞内の外因性核酸分子が細胞の表現型変化を誘導する細胞である。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれていてもよく、かつ／もしくは細胞によって一時的に、または染色体外で長期間維持されてもよい。外因性核酸分子または断片を発現する宿主細胞または生物は、「組換え」、「形質転換」、または「トランスジェニック」生物として参照される。いくつかのトランスフェクション技術が、当該技術分野において一般的に既知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６）、およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ１３：１９７（１９８１）を参照されたい。好適には、本明細書に記載のベクターのうちの１つ以上を用いた哺乳類細胞のトランスフェクションは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのトランスフェクション剤または様々な脂質およびポリマーを含む他の好適な薬剤を利用して、核酸を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込む。

【0022】

好適には、哺乳類細胞がトランスフェクトされる核酸は、第１のプロモーターの制御下のレンチウイルスビリオンタンパク質発現調節因子（ＲＥＶ）遺伝子、第２のプロモーターの制御下のエンベロープ糖タンパク質遺伝子、第３のプロモーターの制御下の対象遺伝子、ならびに第４のプロモーターの制御下のレンチウイルス群特異抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子の両方を含む。実施形態では、対象遺伝子は、任意選択的に利用することができる。

【0023】

レンチウイルスビリオンタンパク質発現調節因子（ＲＥＶ）は、後期遺伝子発現を促進するＲＮＡ結合タンパク質である。核から細胞質へのウイルス構造タンパク質をコードする、非スプライシングまたは単一スプライシングｍＲＮＡ輸送にも重要である。

【0024】

エンベロープ糖タンパク質遺伝子は、好適には、水疱口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子であり、レンチウイルスベクターの表面上で発現および提示され、標的細胞へのレンチウイルスベクターの形質導入を媒介する。

【0025】

ＧＡＧは、非スプライシングｍＲＮＡから翻訳されたポリタンパク質をコードし、その後、ウイルスプロテアーゼ（ＰＲ）によってマトリックスタンパク質、カプシド、およびヌクレオカプシドタンパク質に切断される。レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）は、ＧＡＧ ｍＲＮＡ翻訳中のリボソームフレームシフトの結果として、ＧＡＧ－ＰＯＬポリタンパク質として発現され、逆転写酵素、プロテアーゼ、およびインテグラーゼをコードする。これら３つのタンパク質は、ビリオン内のウイルスゲノムに関連付けられている。好適には、ＧＡＧ遺伝子はＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、ＰＯＬ遺伝子はＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である。

【0026】

好適な実施形態では、ＶＳＶ－ＧおよびＲＥＶをコードする核酸を含む核酸は、コドン最適化される。レンチウイルスベクターを産生するために使用される追加の要素は、コドン最適化することもできる。

【0027】

本明細書に記載されるように、「コドン最適化」は、核酸配列がアルゴリズムを介して処理されて、同じタンパク質をコードするいずれの他の核酸配列よりも、統計的に宿主細胞のリボソームによってうまく翻訳される可能性が高い「最適化された」核酸配列を生成するプロセスである。３つの塩基対の複数の組み合わせが同じ単一のアミノ酸をコードし得る固有の遺伝コードの縮重により、コドン最適化のプロセスが可能になる。

【0028】

好適には、ＧＡＧおよびＰｏｌ遺伝子をコードする核酸の場合、ＧＡＧからＰｏｌへのフレームシフト、ならびにポリタンパク質の発現は、その天然配列に依存する。したがって、ＧＡＧおよびＰｏｌは、それらの天然配列を保存するために、コドン最適化から好適に除外される。

【0029】

レンチウイルスベクターを産生する方法は、トランスフェクトされた哺乳類細胞を培養して、レンチウイルスベクターの産生を可能にすることと、続いて、哺乳類細胞を単離して、レンチウイルスベクターのさらなる単離を可能にすることと、をさらに含む。

【0030】

トランスフェクトされた哺乳類細胞を培養するための方法は、当該技術分野において既知であり、様々な細胞培養培地、適切なガス濃度／交換、および温度制御を使用して、細胞の増殖を促進し、構築物を細胞のゲノムに組み込むことを含む。

【0031】

ウイルスベクターを単離する方法として、様々な濾過技術が挙げられ、ふるい、フィルター装置、細胞選択装置、および磁気選別、細胞計数などを含む選別を使用することを含む。

【0032】

本明細書に記載されるように、様々な核酸の各構成要素（発現カセットとも呼ばれる）は、プロモーターの制御下にある。本明細書で使用される場合、「制御下」とは、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流のコードまたは非コード遺伝子配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域／配列を指す、「プロモーター」、「プロモーター配列」、または「プロモーター領域」によって遺伝子が調節されることを指す。換言すれば、プロモーターおよび遺伝子は、作動可能な組み合わせであるか、または作動可能に連結されている。本明細書で言及される場合、「作動可能な組み合わせで」、「作動可能な順序で」、および「作動可能に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指示することができるプロモーターが生成されるような様式での核酸配列の連結を指す。この用語はまた、機能的なタンパク質が産生されるような様式でのアミノ酸配列の連結を指す。

【0033】

好適な実施形態では、ＶＳＶ－Ｇ遺伝子の発現は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターによって駆動される。ＲＳＶの長鎖末端反復は、様々な細胞型に有用な強力なプロモーターである転写開始部位コア（ＴＳＳＣ）と呼ばれる、ＴＡＴＡボックスおよびＩｎｒ様配列から構成される転写的に強力なエンハンサーおよびコアプロモーターを含有する。

【0034】

実施形態では、ＲＥＶ遺伝子の発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される。これは、様々な細胞における導入遺伝子の一過性発現に好適に使用されるＣＭＶの最初期エンハンサーおよびプロモーターである。

【0035】

本開示の一部の実施例では、プロモーター配列は、転写開始部位を含み、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように上流に延びている。一部の実施形態では、プロモーター配列は、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインを含む。真核生物のプロモーターは、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを、常にではないが、しばしば含む。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターは、例えば、本開示の宿主細胞またはベクターにおいて、遺伝子発現を駆動するために使用され得る。一部の実施形態では、プロモーターは、リーキー（ｌｅａｋｙ）プロモーターではなく、すなわち、プロモーターは、本明細書に記載される遺伝子産物のいずれも構成的に発現しない。本明細書に記載される他の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターであり、外部調節の影響とは無関係にｍＲＮＡの合成を開始する。

【0036】

本明細書に記載されるように、好適には、哺乳類細胞は、哺乳類細胞培養物であり、実施形態では、懸濁培養物である。例示的な細胞としては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が挙げられる。

【0037】

好適な実施形態では、レンチウイルスベクターに含まれる対象遺伝子は、治療対象遺伝子である。本明細書で言及される場合、用語「対象遺伝子」または「ＧＯＩ」は、異種遺伝子を説明するために使用される。本明細書で言及される場合、コード配列または対照配列などの核酸配列に関連する用語「異種遺伝子」または「ＨＧ」は、通常は一緒に結合されないか、かつ／または通常は特定の細胞と関連付けられない核酸配列、例えば遺伝子を示している。一部の実施形態では、異種遺伝子は、コード配列自体が天然に見出されない構築物（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子変異または自然に発生する突然変異事象は、本明細書で使用される場合、異種ＤＮＡを生じさせない。

【0038】

本明細書で使用される場合、「治療対象遺伝子」という用語は、任意の機能的に関連するヌクレオチド配列を指す。したがって、本開示の治療対象遺伝子には、療法標的の細胞ゲノムから欠陥もしくは欠損しているタンパク質をコードするか、または所望の生体効果もしくは治療効果（例えば、抗ウイルス機能）を有する非天然タンパク質をコードする任意の所望の遺伝子、またはアンチセンス機能もしくはリボザイム機能を有する分子に対応し得る配列が含まれ得る。好適な治療対象遺伝子の代表的（非限定的）な例としては、ＡＩＤＳ、がん、神経疾患、心血管疾患、高コレステロール血症、様々な貧血、サラセミア、ならびに血友病を含む様々な血液疾患、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、肺気腫などのような遺伝的欠陥などの疾患を含む、炎症性疾患、自己免疫、慢性および感染性疾患の治療に使用されるものが挙げられる。がんおよびウイルス疾患のアンチセンス療法に有用な複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡの翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）の周りの配列に相補的な短いオリゴヌクレオチド）が当該技術分野において記載されており、好適な治療対象遺伝子の例でもある。

【0039】

本明細書に記載の産生方法は、任意の好適な反応器を利用することができ、撹拌タンク、エアリフト、繊維、マイクロファイバー、中空ファイバー、セラミックマトリックス、流動床、固定床、および／または噴流床バイオリアクターを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「反応器」は、発酵器もしくは発酵ユニット、または任意の他の反応容器を含むことができ、「反応器」という用語は、「発酵器」と互換的に使用される。発酵器または発酵という用語は、微生物培養物および哺乳類培養物の両方を指す。例えば、一部の態様では、例示的なバイオリアクターユニットは、以下：栄養素および／または炭素源の供給、好適なガス（例えば、酸素）の注入、発酵または細胞培養培地の流入口および流出口の流れ、気相および液相の分離、温度の維持、酸素およびＣＯ_２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、かき混ぜ（例えば、撹拌）、および／または洗浄／滅菌のうちの１つ以上またはすべてを行うことができる。例示的な反応器ユニット（発酵ユニットなど）は、ユニット内に複数の反応器を含んでもよく、例えば、ユニットは、各ユニット内に１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個、またはそれ以上のバイオリアクターを有してもよく、かつ／あるいは施設は、施設内に単一または複数の反応器を有する複数のユニットを含んでもよい。様々な実施形態では、バイオリアクターは、バッチ、セミフェッドバッチ、フェッドバッチ、灌流、および／または連続発酵プロセスに好適であり得る。任意の好適な反応器直径が使用され得る。実施形態では、バイオリアクターは、約１００ｍＬ～約５０，０００Ｌの体積を有し得る。非限定的な例には、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、および／または５０，０００リットルの体積が含まれる。さらに、好適な反応器は、マルチユース、シングルユース、ディスポーザブル、または非ディスポーザブルであり得、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌまたは任意の他の好適なステンレス鋼）ならびにインコネル、プラスチック、および／またはガラスなどの金属合金を含む任意の好適な材料で形成することができる。

【0040】

本明細書では、本明細書に記載の様々な方法に従って産生されるレンチウイルスベクターを用いて、哺乳類対象、好適にはヒト対象を治療する方法も提供される。好適には、本方法は、治療対象遺伝子を含む、対象遺伝子を有するヒト対象を治療するために使用される。ヒト対象への投与は、例えば、吸入、注射、または静脈内投与、ならびに当該技術分野で既知の他の投与方法を含むことができる。

【0041】

レンチウイルスパッケージング遺伝子および目的の遺伝子をコードする核酸の遺伝子成分と同様に、例示的な哺乳類細胞が本明細書に記載される。

【0042】

レンチウイルスを産生する方法が本明細書に記載され、好適には、レンチウイルスパッケージング遺伝子をコードする核酸および対象遺伝子をコードする核酸の産物の産生を誘導することと、トランスフェクトされた哺乳類細胞を培養することと、およびレンチウイルスベクターを回収することと、が含まれる。

【0043】

追加の例示的な実施形態
実施形態１は、レンチウイルスベクターを産生する方法が本明細書に提供され、第１のプロモーターの制御下のレンチウイルスビリオンタンパク質発現調節因子（ＲＥＶ）遺伝子および第２のプロモーターの制御下のエンベロープ糖タンパク質遺伝子をコードする第１の核酸、第３のプロモーターの制御下の対象遺伝子をコードする第２の核酸、ならびに第４のプロモーターの制御下のレンチウイルス群特異抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子の両方をコードする第３の核酸を用いて哺乳類細胞をトランスフェクトすることと、トランスフェクトされた哺乳類細胞を培養することと、ベクターを単離することと、を含む。

【0044】

実施形態２は、哺乳類細胞が、哺乳類細胞培養物である、実施形態１に記載の方法を含む。

【0045】

実施形態３は、哺乳類細胞培養物が、懸濁培養物である、実施形態２に記載の方法を含む。

【0046】

実施形態４は、哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、実施形態１に記載の方法を含む。

【0047】

実施形態５は、エンベロープ糖タンパク質遺伝子が、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法を含む。

【0048】

実施形態６は、ＧＡＧ遺伝子が、ＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、ＰＯＬ遺伝子が、ＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法を含む。

【0049】

実施形態７は、ＶＳＶ－ＧおよびＲＥＶをコードする核酸が、コドン最適化される、実施形態５または６に記載の方法を含む。

【0050】

実施形態８は、ＶＳＶ－Ｇ発現が、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターによって駆動される、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法を含む。

【0051】

実施形態９は、ＲＥＶ遺伝子発現が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される、実施形態１～８のいずれか一項に記載の方法を含む。

【0052】

実施形態１０は、対象遺伝子が、治療対象遺伝子である、実施形態１～９のいずれか一項に記載の方法を含む。

【0053】

実施形態１１は、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の方法によって産生されるレンチウイルスベクターである。

【0054】

実施形態１１は、哺乳類対象に請求項１１に記載のレンチウイルスベクターを投与することを含む、レンチウイルスベクターによる治療方法である。

【実施例】

【0055】

実施例１：３プラスミドシステムを使用したＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターの産生
材料および方法
３つのプラスミド（ｐＵＣ－Ｇａｇ－Ｐｏｌ、ｐＵＣ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＥＶ、およびｐＵＣ－ＧＦＰ）を構築した。図１Ｂに、その構造を表す。陰影領域は、ＶＳＶおよびＲｅｖ遺伝子のコドン最適化を示す。これらのプラスミドを、哺乳類産生細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）にトランスフェクトした。これらのトランスフェクションからウイルスを回収した後、フローサイトメトリーを使用して感染性レンチウイルスの力価を測定した。

【0056】

結果
図２に示されるように、試験＃１および試験＃２の細胞培養回収物において、１ミリリットル（ｍＬ）中に、３．０Ｅ＋０６形質導入単位（ＴＵ）またはそれ以上のＬＶ－ＧＦＰが産生され、３プラスミド設計が機能的であり、三重プラスミド一過性トランスフェクションプロセスを介して、レンチウイルスベクターを産生することを示す。

【0057】

実施例２：市販の４プラスミドシステムと比較して、３プラスミドシステムを使用したＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔを発現するレンチウイルスベクターの産生
材料および方法
３プラスミドシステムの有効性を別の文脈で確認するために、ＧＯＩとして、ＣＤ－１９に対して親和性を有する抗体配列を用い、第３のプラスミド導入ベクター（以下、「ＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔプラスミド」と称する）にクローニングした。ＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔプラスミド、加えてｐＵＣ－Ｇａｇ－ＰｏｌおよびｐＵＣ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＥＶを、哺乳類細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）にトランスフェクトした。３プラスミドシステムおよび４プラスミドシステム＞によって産生して得られたレンチウイルスの力価を直接比較するために、ＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔプラスミド、加えて４プラスミドシステムからの市販のパッケージングプラスミドを、哺乳類細胞株にトランスフェクトした。

【0058】

結果
各トランスフェクションからの感染性レンチウイルスの力価を、ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）によって測定した。図３に示されるように、３プラスミドシステム（９．１Ｅ＋０７ＴＵ／ｍＬ）からのＬＶ－ＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔ力価は、市販の４プラスミドシステム（６．７Ｅ＋０７ＴＵ／ｍＬ）と同等か、またはそれよりも優れていた。これらの結果は、レンチウイルスベクターを生成するための３プラスミドシステムを使用したワークフローの最適化が、市販の４プラスミドシステムと比較して、トランスフェクション効率の低下および生存可能な形質導入ユニットの産生をもたらさないことを実証する。

【0059】

本明細書に記載の方法および用途に対する他の好適な変更および適合を、実施形態のいずれかの範囲から逸脱することなく行うことができることは、関連する技術分野の当業者には容易に明らかであろう。

【0060】

ある特定の実施形態が本明細書に例示され、記載されてきたが、特許請求の範囲は、記載され、示された部分の特定の形態または構成に限定されないことを理解されたい。本明細書では、例示的な実施形態が開示されており、特定の用語が採用されるが、それらは、限定の目的ではなく、一般的かつ説明的な意味でのみ使用されている。上記の教示に照らして、実施形態の修正例および変形例が可能である。したがって、実施形態が、具体的に記載された方法以外の方法で実施され得ることを理解されたい。

【0061】

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【国際調査報告】