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特表2023-507647酵母細胞、ならびにＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、コドレモンおよびそれらの誘導体の産生方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-24
(54)【発明の名称】酵母細胞、ならびにＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、コドレモンおよびそれらの誘導体の産生方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/16 20060101AFI20230216BHJP
C12P 7/04 20060101ALI20230216BHJP
【ＦＩ】
C12N1/16 ZNA
C12P7/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022538148
(86)(22)【出願日】2020-12-18
(85)【翻訳文提出日】2022-07-28
(86)【国際出願番号】 EP2020086975
(87)【国際公開番号】W WO2021123128
(87)【国際公開日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】19218703.7
(32)【優先日】2019-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522160620
【氏名又は名称】バイオフェロ エーピーエス
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ボロディナ，イリナ
(72)【発明者】
【氏名】ホルケンブリンク，カリナ
(72)【発明者】
【氏名】ロフステッド，クリステル
(72)【発明者】
【氏名】ディング，バオジアン
(72)【発明者】
【氏名】ウェンニング，レオニー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AC09
4B064CA06
4B064DA11
4B065AA72X
4B065AA73X
4B065AA78X
4B065AA79X
4B065BA22
4B065CA47
(57)【要約】
本発明は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、コドレモン（Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール）、および任意によりその誘導体Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの産生のために操作された酵母細胞に関する。Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、コドレモン（Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール）、および任意によりその誘導体Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するための方法も提供される。そのような酵母細胞を得るために有用な核酸構築物もまた提供される。
【選択図】１
【選択図】１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる酵母細胞であって、１２の炭素鎖長を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入できる少なくとも１つの異種デサチュラーゼを発現し、これにより前記脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、前記不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部が、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり、ａ）前記少なくとも１つのデサチュラーゼが、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、または配列番号２に対し少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、例えば少なくとも８９％など、例えば少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、それに対し少なくとも８０％の同一性を有するその機能的バリアントであり、
ｂ）前記少なくとも１つのデサチュラーゼが、少なくとも２つのデサチュラーゼであり、前記２つのデサチュラーゼの少なくとも１つが、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、または配列番号２に対し少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、それに対し少なくとも８０％の同一性を有するその機能的バリアントであり、および他のデサチュラーゼが、Ｚ９－１２デサチュラーゼなどの、１２の炭素鎖長を有する脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できるデサチュラーゼである、
酵母細胞。
【請求項2】
前記少なくとも１つのデサチュラーゼが、少なくとも２つのデサチュラーゼであり、および前記他のデサチュラーゼが、Ｃｐｏ＿ＮＰＶＥ（配列番号６７）、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ（配列番号６９）および配列番号６７または配列番号６９に対し少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、それらに対し少なくとも８０％の同一性を有するその機能的バリアントから選択される、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項3】
ブラケスレア、カンジダ、クリプトコッカス、クンニンハメラ、リポマイセス、モルティエラ、ケカビ、フィコマイセス、フィチウム、ロドスポリディウム、ロドトルラ、トリコスポロン、サッカロミセスおよびヤロウイアから選択される属に属し、任意によりブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）、カンジダ・プルチェリマ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ． カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコッカス・カルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、クンニンハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）、Ｃ．エレガンズ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｃ．ジャポニカ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、リポマイセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、Ｍ．イザベリナ（Ｍ．ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、Ｍ． ラマニアナ（Ｍ．ｒａｍａｎｎｉａｎａ）、Ｍ． ビナセア（Ｍ．ｖｉｎａｃｅａ）、Ｍ． シルシネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、フィコマイセス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）、フィチウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ．グラシリス（Ｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｒ．ムチラギノーザ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、Ｒ．ピニコーラ（Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から選択される種に属し、好ましくはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、先行請求項のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項4】
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生でき、前記不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換できる少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）をさらに発現し、前記脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、先行請求項のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項5】
前記デサチュラーゼが、Ｓ８５Ａ変異などの、８５位に変異を有するＣｐｏ＿ＣＰＲＱの変異体である、かつ／または前記少なくとも１つの異種デサチュラーゼが、配列番号２に示されるＣｐｏ＿ＣＰＲＱおよびＳ８５Ａ変異などの８５位に変異を有するＣｐｏ＿ＣＰＲＱの変異体などの、少なくとも２つの異なる異種デサチュラーゼである、先行請求項のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項6】
前記脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、Ａｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）、Ｃｐｏ＿ＦＡＲ（配列番号７６）およびそれらに対し少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、それらに対し少なくとも８０％の同一性を有するそれらの機能的バリアントからなる群から選択され、任意により前記脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、１９８位または４１３位に変異、好ましくはＴ１９８Ａ変異またはＳ４１３Ａ変異を有するなどの、Ａｓｅ＿ＦＡＲの変異体である、請求項４または５に記載の酵母細胞。
【請求項7】
以下の：－オオタバコガ由来のシトクロムｂ５などの、鱗翅目由来のシトクロムｂ５などの、異種シトクロムｂ５、好ましくは配列番号４に示されるシトクロムｂ５ＨａｒＣｙｂ５またはそれに対し少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、それに対し少なくとも８０％の同一性を有するそれらの機能的バリアントを発現すること；
－オオタバコガなどの、鱗翅目からのシトクロムｂ５レダクターゼなどの、異種シトクロムｂ５レダクターゼ（ＥＣ１．６．２．２）を発現することであって、好ましくは前記シトクロムｂ５レダクターゼが、配列番号２４に示されるオオタバコガ由来のシトクロムｂ５レダクターゼまたはそれに対し少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、それに対し少なくとも８０％の同一性を有するそれらの機能的バリアントである、発現すること；
－Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉａ由来のヘモグロビンなどの、ヘモグロビン、好ましくは配列番号６に示されるＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉａ由来のヘモグロビンまたは、それに対し少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、それに対し少なくとも８０％の同一性を有するそれらの機能的バリアントを発現すること；
－エロンガーゼをコードするかつエロンガーゼ活性の部分的または完全な喪失をもたらすＥＬＯ１遺伝子（配列番号１３）の変異などの、Ｅｌｏ１活性の部分的または完全な喪失をもたらす１つ以上の遺伝子の変異を含むことであって、好ましくは前記変異が、欠失である、含むこと；
－チオエステラーゼをコードするかつＹＡＬ１０＿Ｆ１４７２９ｇ遺伝子（配列番号１９）の変異、ＹＡＬＩ０＿Ｅ１８８７６ｇ遺伝子（配列番号５４）の変異、またはＹＡＬＩ０＿Ｄ０３５９７ｇの変異（配列番号５５）などの、チオエステラーゼ活性の部分的または完全な喪失をもたらす１つ以上の遺伝子の変異を含むことであって、好ましくは前記変異が、欠失である、含むこと；
－Ｈｆｄ１、Ｈｆｄ２、Ｈｆｄ３、Ｈｆｄ４、Ｆａｏ１およびＰｅｘ１０の少なくとも１つの低下された活性をもたらす少なくとも１つの変異を含むこと、またはそれらに対し少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、それらに対し少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つのタンパク質の低下された活性をもたらす１つの変異を有すること；
－改変ケトンシンターゼドメインを有する脂肪アシルシンターゼバリアントを発現することであって、前記脂肪アシルシンターゼバリアントが、１２３位での変異、好ましくはＬ１２３Ｖ変異を有する変異体Ｆａｓ１、または１２２０位での変異、好ましくはＩ１２２０ＦまたはＩ１２２０Ｗ変異を有する変異体Ｆａｓ２などのＦａｓ１のバリアント（配列番号１６）またはＦａｓ２（配列番号１８）のバリアントである、発現すること；
－異種チオエステラーゼなどのチオエステラーゼを発現することであって、任意により配列番号３３に示されるＣｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ由来のチオエステラーゼに対し、配列番号５７に示されるクフェア・フッケリアナ由来のチオエステラーゼに対し、配列番号３５に示されるクスノキ由来のチオエステラーゼに対し、または配列番号２６に示される大腸菌由来のチオエステラーゼに対し少なくとも８０％の同一性を有するチオエステラーゼなどの、前記チオエステラーゼが、高レベルで発現され、好ましくは前記チオエステラーゼが、配列番号３５に示されるクスノキ由来のチオエステラーゼに対し、または配列番号２６に示される大腸菌由来のチオエステラーゼに対し少なくとも８０％の同一性を有する、発現すること；
－配列番号５９またはそれに対し少なくとも８０％の同一性を有するその相同体などの、短縮型脂肪アシルシンターゼおよび短縮型チオエステラーゼの融合タンパク質、を発現すること、
の１つ以上をさらに有する、先行請求項のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項8】
Ｈｆｄ１、Ｈｆｄ２、Ｈｆｄ３、Ｈｆｄ４、Ｆａｏ１、ＧＰＡＴおよびＰｅｘ１０の少なくとも１つの低下された活性をもたらす少なくとも１つの変異をさらに含む、またはそれらに対し少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、それらに対し少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つのタンパク質の低下された活性をもたらす少なくとも１つの変異を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項9】
少なくとも０．６ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．７ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．８ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．９ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５．０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２０ｍｇ／Ｌなど、２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｇ／Ｌなど、少なくとも２ｇ／Ｌなど、少なくとも３ｇ／Ｌなど、少なくとも４ｇ／Ｌなど、少なくとも５ｇ／Ｌなど、少なくとも６ｇ／Ｌなど、少なくとも７ｇ／Ｌなど、少なくとも８ｇ／Ｌなど、少なくとも９ｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｇ／Ｌなどのまたはそれより大きい、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌの力価有するＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる、先行請求項のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項10】
前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換できるアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８４）をさらに発現し、これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを産生でき、好ましくは前記アセチルトランスフェラーゼが、前記酵母細胞から発現される異種アセチルトランスフェラーゼ（ＡｃＴ）または前記酵母細胞から過剰発現される天然アセチルトランスフェラーゼであり、好ましくは前記アセチルトランスフェラーゼが、Ｓｃ＿Ａｔｆ１（配列番号３７）またはＳｃ＿Ａｔｆ１（配列番号３７）に対し少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、それに対し少なくとも８０％の同一性を有するその機能的バリアントである、先行請求項のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項11】
前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換できるアルデヒド形成脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．５０）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）、および／または脂肪アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２０）をさらに発現する、先行請求項のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項12】
さらに、ｉ）１つ以上の天然アシルＣｏＡオキシダーゼの低下された活性をもたらす１つ以上の変異を有し、かつ
ｉｉ）脂肪アシルＣｏＡを酸化できる少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼを含む酵素の少なくとも１つの群を発現し、前記酵素の前記群が、第１の炭素鎖長Ｘの脂肪アシルＣｏＡを第２の炭素鎖長Ｘ’を有する短縮された脂肪アシルＣｏＡに短縮でき、式中、Ｘ’≦Ｘ－２であり、好ましくは、Ｘ’＝１２である、
先行請求項のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項13】
ＣｒｏＺ１１デサチュラーゼ（配列番号６３）またはＣｐａＥ１１デサチュラーゼ（配列番号６５）、または配列番号６３もしくは配列番号６５に対し少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、少なくとも８０％の同一性を有するそれらの機能的バリアントなどの、炭素鎖長Ｘの前記脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できるデサチュラーゼをさらに発現する、先行請求項のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項14】
前記酵母細胞中でＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生するための方法であって、前記酵母細胞を提供するステップと培地中で前記酵母細胞をインキュベートするステップを含み、前記酵母細胞が、ｉ）１２の炭素鎖長を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入し、これにより前記脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換できる少なくとも１つの異種デサチュラーゼであって、前記不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部が、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ａ）前記少なくとも１つのデサチュラーゼが、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、または配列番号２に対し少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、それに対し少なくとも８０％の同一性を有するその機能的バリアントであり、または
ｂ）前記少なくとも１つのデサチュラーゼが、少なくとも２つのデサチュラーゼであり、前記２つのデサチュラーゼの少なくとも１つが、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、または配列番号２に対し少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の同一性などの、それに対し少なくとも８０％の同一性を有するその機能的バリアントであり、かつ他のデサチュラーゼが、Ｚ９－１２デサチュラーゼなどの、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できるデサチュラーゼ、である；
少なくとも１つの異種デサチュラーゼ
および
ｉｉ）任意による前記不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換できる少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）であって、前記脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、少なくとも１つの脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ、
を発現し、
これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生する、方法。
【請求項15】
前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａをトリアシルグリセリドなどの脂質または遊離脂肪酸に変換するステップ、前記脂質または遊離脂肪酸を回収するステップおよび前記脂質または遊離脂肪酸をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを回収するステップをさらに含み、好ましくは前記酵母細胞が、請求項１～１３のいずれか一項に記載されるとおりである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
アセチルトランスフェラーゼの発現によりまたは化学変換により前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換し、それによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートをさらに産生するステップをさらに含み、かつ任意により前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを回収するステップをさらに含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換できるアルデヒド形成脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．５０）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）、および／または脂肪アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２０）の発現により、または化学変換により前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換し、それによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールをさらに産生するステップをさらに含み、かつ任意により前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを回収するステップをさらに含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記培地が、培養温度で培養培地中などの水溶液中のその雲濃度に等しいまたはその濃度を超える量で抽出剤を含み、前記抽出剤が、消泡剤などの非イオン性エトキシル化界面活性剤、好ましくはポリエチレンポリプロピレングリコール、ポリエーテル分散液の混合物、およびシメチコンなどのポリエチレングリコールモノステアレート、脂肪アルコールアルコキシレート、ポリエトキシル化界面活性剤ならびにエトキシル化およびプロポキシル化Ｃ１６～Ｃ１８アルコールベースの消泡剤ならびにそれらの組み合わせを含む消泡剤から選択されるポリエトキシル化界面活性剤である、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記培地が、少なくとも１００％など、少なくとも１５０％など、少なくとも２００％など、少なくとも２５０％など、少なくとも３００％など、少なくとも３５０％など、少なくとも４００％など、少なくとも５００％など、少なくとも７５０％など、少なくとも１０００％などの、またはそれより多い、少なくとも５０％その雲濃度より多い量で前記抽出剤を含み、かつ／または前記培養培地が、その雲濃度の少なくとも３倍など、その雲濃度の少なくとも４倍など、その雲濃度の少なくとも５倍など、その雲濃度の少なくとも６倍など、その雲濃度の少なくとも７倍など、その雲濃度の少なくとも８倍など、その雲濃度の少なくとも９倍など、その雲濃度の少なくとも１０倍など、その雲濃度の少なくとも１２．５倍など、その雲濃度の少なくとも１５倍など、その雲濃度の少なくとも１７．５倍など、その雲濃度の少なくとも２０倍など、その雲濃度の少なくとも２５倍など、その雲濃度の少なくとも３０倍などの、その雲濃度の少なくとも２倍の量で前記抽出剤を含み、前記雲濃度が、好ましくは培養温度で、前記培地中で測定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを脂質または遊離脂肪酸に変換するステップをさらに含み、かつ前記酵母細胞により産生される前記脂質または前記遊離脂肪酸、前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、ならびに任意により前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／または前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールが、発酵ブロス中のエマルジョン中に存在し、前記エマルジョンを破壊し、それにより前記抽出剤と前記脂質または前記遊離脂肪、前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意により前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／または前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを含む産生物相を含む組成物を得るステップをさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項22】
前記エマルジョンを破壊するステップが、前記発酵ブロスの、遠心分離のステップなどの、相分離のステップを含むかまたはそのステップからなり、それにより３つの相：水相、細胞および細胞破片を含む相、および抽出剤と脂質または遊離脂肪酸、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを含む産生物相からなる組成物を得る、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記産生物相が、少なくとも５５％など、少なくとも６０％など、少なくとも６５％など、少なくとも７０％など、少なくとも７５％など、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％などのまたはそれより多い、少なくとも５０％の前記脂質または遊離脂肪酸、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意により発酵ブロス中に最初に存在する前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／または前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項24】
－好ましくは減圧下での蒸留などの蒸留ステップにより、またはカラム精製により前記脂質または前記遊離脂肪酸、前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意により前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／または前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを回収するステップと、－前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールにおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに化学変換するステップと、
－任意により、前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールおよび／または前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを回収するステップ
をさらに含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
フェロモン組成物へと前記回収されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／または前記Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを配合するステップをさらに含む、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、コドレモン（Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール）、および任意によりその誘導体Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの産生のために操作された酵母細胞に関する。Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、コドレモン（Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール）、および任意によりその誘導体Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するための方法も提供される。そのような酵母細胞を得るために有用な核酸構築物もまた提供される。
【背景技術】
【0002】
総合的有害生物管理（ＩＰＭ）は、作物の収穫量を増大させるため、および環境への影響を最小限に抑え、かつ有機食品の生産を可能にするために主要な役割を果たすことが期待されている。ＩＰＭは、フェロモンを使用する交配の混乱、フェロモンを使用する大量捕獲、益虫などの代替の害虫防除方法を採用する。
【0003】
フェロモンは、昆虫（他の生物と同様）が、配偶者の誘引、警報、トレイルマーキング、および凝集を含む、様々な状況で同じ種の個体と交信するために使用する多様な化学物質の群を構成する。長期の配偶者発見に関連する昆虫フェロモンは、農薬の安全かつ環境に優しい代替品として、害虫の監視および防除のための農業および林業の用途ですでに使用されている。
【0004】
フェロモンは、健康および環境に優しい、農薬の代替品である。野外または果樹園で性フェロモンを分配することは、昆虫の交信を混乱させ、交配を妨げる。したがって、受精卵は産まれず、作物に対する幼虫による損傷は発生しない。この方法は、「交配の混乱」と呼ばれる。フェロモンは、それらが生分解性の種特異的化合物であり、有益な種またはヒトのいずれも害しないため、殺虫薬の魅力的な代替品である。
【0005】
害虫防除のための昆虫フェロモンの適用は、フェロモンの工業規模の合成が数十年前に開始された後にのみ可能になった。それにもかかわらず、化学合成されるフェロモンの価格は、依然として高く、農林業においてそれらの使用を拡大する上で大きな障壁である。フェロモンの化学産生の別の欠点は、前駆体、触媒、および溶媒として使用される有毒な化学物質の必要性、ならびに精製中に発生する大量の有機廃棄物である。したがって、複雑な化学合成ベースプロセスに基づく現在の産生方法は、農林業における潜在的な用途の多くにおいて幅広く使用するために、産生物を極端に高価なものにする。
【0006】
化学的産生方法と比較して、生物学的産生方法にはいくつかの利点がある。まず、すべての反応は、異なる前駆体、触媒、および条件（多くの場合、高温および高圧）を必要とする複数の化学反応ステップの代わりに、発酵タンク内の周囲温度で、操作された細胞によって行われる。さらに、操作された細胞は、前駆体として複数の高価な特殊化学物質を使用する代わりに、砂糖または植物油などの安価な再生可能な材料を使用する。化学反応は多くの場合、低い特異性が欠点であり、そのため、中間化合物の精製および最終産生物の大規模な精製を必要とするが、酵素によって行われる生物学的反応は、典型的には非常に特異的であり、副産生物の形成が制限され、それにより精製するための有機溶媒および他の有毒化学物質の使用を減少させる。さらに、フェロモン活性にとって多くの場合重要である、特定の立体化学は、化学的方法によって達成するのが非常に困難であり得る一方で、酵素的方法は、シスまたはトランス異性体の１つに特異的な酵素を利用できる。
【0007】
目的の特定のフェロモンは、コドレモンであり、これは、式Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨ、ＣＡＳ番号３３９５６－４９－９）を有するジ不飽和脂肪アルコールである。コドレモンは、多数の種の性フェロモン成分であり、コドリンガ（Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ（ｃｏｄｌｉｎｇ ｍｏｔｈ））の主要な性フェロモンである。コドリンガは、鱗翅目に属し、リンゴ、ナシ、モモ、および他の果物の主要な害虫である。
【0008】
Ｄｉｎｇ ２０１４は、デサチュラーゼが発現された植物細胞を開示し、それらが蛾のフェロモンを産生できるかを決定するためにテストした。縮重ＰＣＲアプローチを使用することにより、コドリンガ由来の３つのデサチュラーゼが発見された（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｏｎ ｔｈｅ ｗａｙ ｏｆ ｍａｋｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ ｓｍｅｌｌ ｌｉｋｅ ｍｏｔｈｓ－ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【0009】
したがって、昆虫のフェロモン、特にコドレモンを産生するための生物学的プロセスが必要である。低コストの利点に加えて、発酵プロセスは、化学合成よりも本質的に危険性が低く、より環境に優しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、特許請求の範囲に定義されるとおりである。
【0011】
本明細書では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる酵母細胞を提供し、酵母細胞は、１つ以上の二重結合を、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に導入できる少なくとも１つの異種デサチュラーゼを発現し、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）である。
【0012】
本明細書では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる酵母細胞を提供し、酵母細胞は、少なくとも１つの異種デサチュラーゼおよび少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）を発現し、
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、１つ以上の二重結合を、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ｉｉ）少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる。
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、１つ以上の二重結合を、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ｉｉ）少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる。
【0013】
また、酵母細胞においてＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生するための方法も提供され、本方法は、酵母細胞を提供するステップと、培地中で酵母細胞をインキュベートするステップを含み、酵母細胞は、少なくとも１つの異種デサチュラーゼおよび少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）を発現し、
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、１つ以上の二重結合を、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ｉｉ）任意により少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換でき、
これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生する。
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、１つ以上の二重結合を、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ｉｉ）任意により少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換でき、
これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生する。
【0014】
酵母細胞を改変するための核酸構築物も提供され、構築物は、
ｉ）１つ以上の二重結合を、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に導入できる少なくとも１つの異種デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドであって、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部が、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）である、第１のポリヌクレオチドと；
ｉｉ）任意により不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換できる少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）をコードする第２のポリヌクレオチドであって、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、第２のポリヌクレオチド、
を含む。
ｉ）１つ以上の二重結合を、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に導入できる少なくとも１つの異種デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドであって、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部が、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）である、第１のポリヌクレオチドと；
ｉｉ）任意により不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換できる少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）をコードする第２のポリヌクレオチドであって、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、第２のポリヌクレオチド、
を含む。
【0015】
害虫の存在を監視するか、または害虫の交配を妨害する方法も提供され、本方法は、
ｉ）本明細書に記載の方法により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するステップと；
ｉｉ）フェロモン組成物として、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを配合するステップと；
ｉｉｉ）総合的病害虫管理組成物としてフェロモン組成物を使用するステップ、
を含む。
ｉ）本明細書に記載の方法により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するステップと；
ｉｉ）フェロモン組成物として、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを配合するステップと；
ｉｉｉ）総合的病害虫管理組成物としてフェロモン組成物を使用するステップ、
を含む。
【0016】
本明細書に記載の方法によって得られるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールも、本明細書で提供される。
また本明細書では、使用説明書および
ａ）本明細書に記載の酵母細胞；および／または
ｂ）酵母細胞を改変するための本明細書に記載の核酸構築物および任意により改変される酵母細胞であって、核酸構築物内に含まれるポリヌクレオチドの発現時に、改変された酵母細胞は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる、核酸構築物および任意により改変される酵母細胞
を含む部品のキットが提供される。
また本明細書では、使用説明書および
ａ）本明細書に記載の酵母細胞；および／または
ｂ）酵母細胞を改変するための本明細書に記載の核酸構築物および任意により改変される酵母細胞であって、核酸構築物内に含まれるポリヌクレオチドの発現時に、改変された酵母細胞は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる、核酸構築物および任意により改変される酵母細胞
を含む部品のキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】酵母におけるコドレモン産生（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨ）について提唱された生合成経路。ＡＣＣ：アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ；ＦＡ：脂肪酸；ＦＡＳ；脂肪酸シンターゼ；ＴＥ：チオエステラーゼ；ＦＡＡ：脂肪アシルシンテターゼ；Ｌ：脂質；ＦＡＥ：脂肪酸エステル；ＦＡＤ：脂肪アシルデサチュラーゼ；ＦＡＲ：脂肪アシルレダクターゼ；Ｃｏｍｐ．β－ｏｘ．：組成物完全なβ酸化。
【図2】（Ａ）空のプラスミドまたは（Ｂ）１２：Ｍｅを供給したベクターを含むＣｐｏ＿ＣＰＲＱで形質転換した酵母からのＦＡＭＥ抽出物のＧＣ－ＭＳ分析；（Ｃ）Ｅ９－１２：Ｍｅの質量スペクトル、（Ｄ）空のプラスミド、または（Ｅ）Ｅ９－１２：Ｍｅを供給したＣｐｏ＿ＣＰＲＱで形質転換した酵母からのＦＡＭＥ抽出物のＧＣ－ＭＳ分析、（Ｆ）Ｅ８，Ｅ１０－１２：Ｍｅの質量スペクトル。
【発明を実施するための形態】
【0018】
定義
生物農薬：「生物農薬」という用語は「生物学的農薬」の短縮形であり、捕食性、寄生的、または化学的関係によるいくつかの種類の害虫管理介入を指す。欧州連合では、生物農薬は、「微生物または天然物をベースにした農薬の一形態」と定義されている。米国では、これらはＥＰＡによって、「害虫を防除する天然に存在する物質（生化学農薬）、害虫を防除する微生物（微生物農薬）、および追加の遺伝物質を含む植物によって産生される殺虫物質（植物に組み込まれた保護剤）またはＰＩＰを含む」と定義されている。本開示はより具体的には、天然産物または天然に存在する物質を含む生物農薬に関する。これらは典型的には、細菌および他の微生物、真菌、線虫、タンパク質などを含む、天然に存在する生物および／またはそれらの代謝物を成長させるおよび濃縮することによって作製される。それらは多くの場合、総合的病害虫管理（ＩＰＭ）プログラムの重要な構成要素と見なされ、合成化学植物保護産生物（ＰＰＰ）の代替品として多くの実用的な注目を集めている。Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ Ａｇｅｎｔｓ（２００９年：以前の生物農薬マニュアル）は、利用可能な生物的殺虫剤（および他の生物学に基づく防除）産生物の概観を提供する。
生物農薬：「生物農薬」という用語は「生物学的農薬」の短縮形であり、捕食性、寄生的、または化学的関係によるいくつかの種類の害虫管理介入を指す。欧州連合では、生物農薬は、「微生物または天然物をベースにした農薬の一形態」と定義されている。米国では、これらはＥＰＡによって、「害虫を防除する天然に存在する物質（生化学農薬）、害虫を防除する微生物（微生物農薬）、および追加の遺伝物質を含む植物によって産生される殺虫物質（植物に組み込まれた保護剤）またはＰＩＰを含む」と定義されている。本開示はより具体的には、天然産物または天然に存在する物質を含む生物農薬に関する。これらは典型的には、細菌および他の微生物、真菌、線虫、タンパク質などを含む、天然に存在する生物および／またはそれらの代謝物を成長させるおよび濃縮することによって作製される。それらは多くの場合、総合的病害虫管理（ＩＰＭ）プログラムの重要な構成要素と見なされ、合成化学植物保護産生物（ＰＰＰ）の代替品として多くの実用的な注目を集めている。Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ Ａｇｅｎｔｓ（２００９年：以前の生物農薬マニュアル）は、利用可能な生物的殺虫剤（および他の生物学に基づく防除）産生物の概観を提供する。
【0019】
雲濃度：この用語は、本明細書では、溶液中の界面活性剤、特に非イオン性のまたはグリコールの溶液の濃度を指すために使用され、その濃度を超え、所定の温度で、界面活性剤と溶液の混合物が相分離を開始し、２つの相が現れ、したがって曇ったようになる。例えば、所与の温度での水溶液中の界面活性剤の雲濃度は、水溶液と混合されたときに２つの相を生じさせる、界面活性剤の最小濃度である。雲濃度は、界面活性剤の製造業者から入手できるか、または投与量曲線を作成し、混合相が分離する濃度を決定することによって実験的に決定できる。
【0020】
曇点：溶液、例えば水溶液中の界面活性剤、特に非イオン性のまたはグリコールの溶液の曇点は、界面活性剤と溶液、例えば水溶液との混合物の相分離が開始し、２つの相が出現し、したがって曇ったようになる温度である。この挙動は、ポリオキシエチレン鎖を含む非イオン性界面活性剤の特徴であり、それらは水中での温度挙動に対して逆溶解性を呈し、したがって、温度が上昇するとある時点で「曇る」。この挙動を示すグリコールは、「曇点グリコール」として知られている。曇点は、塩分の影響を受け、一般的に塩分の高い液体では低い。
【0021】
コドレモン：この用語は、式Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨ）を有するジ不飽和脂肪アルコールを指す。コドレモンは、コドリンガ（ｃｏｄｌｉｎｇ ｍｏｔｈ））中でとりわけ多数の種の性フェロモン成分であり、鱗翅目に属し、リンゴ、ナシ、モモ、および他の果物の主要な害虫である。「コドレモン」、「Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール」および「Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨ」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【0022】
不飽和の：「不飽和の」という用語は、本明細書では「非飽和の」という用語と交換可能に使用され、１つ以上の二重または三重炭素－炭素結合を含む化合物を指す。
エトキシル化およびプロポキシル化Ｃ１６－Ｃ１８アルコールベースの消泡剤：この用語は、Ｃ１６－Ｃ１８のエトキシル化およびプロポキシル化アルコールを含むまたは主にそれらからなるポリエトキシル化非イオン性界面活性剤の群を指し（例えばＣＡＳ番号６８００２－９６－０）、また、Ｃ１６－Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレートまたはＣ１６－Ｃ１８アルコールエトキシル化プロポキシレートポリマーとも呼ばれる。
エトキシル化およびプロポキシル化Ｃ１６－Ｃ１８アルコールベースの消泡剤：この用語は、Ｃ１６－Ｃ１８のエトキシル化およびプロポキシル化アルコールを含むまたは主にそれらからなるポリエトキシル化非イオン性界面活性剤の群を指し（例えばＣＡＳ番号６８００２－９６－０）、また、Ｃ１６－Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレートまたはＣ１６－Ｃ１８アルコールエトキシル化プロポキシレートポリマーとも呼ばれる。
【0023】
抽出剤：本明細書で使用される「抽出剤」という用語は、発酵中に産生される疎水性化合物の回収を容易にする消泡剤などの非イオン性界面活性剤、特に、ポリエチレンポリプロピレングリコール、ポリエーテル分散液の混合物、ならびにシメチコンなどのモノステアリン酸ポリエチレングリコールを含む消泡剤、ならびにエトキシル化およびプロポキシル化Ｃ１６～Ｃ１８アルコールベースの消泡剤、ならびにそれらの組み合わせから選択されるポリエトキシル化界面活性剤である。
【0024】
脂肪酸：この用語は、「脂肪酸」は、長い脂肪炭素鎖、すなわち４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個の炭素原子などの、４～２８個の炭素原子の脂肪族鎖を有するカルボン酸を指す。ほとんどの天然に存在する脂肪酸は、分岐していない。これらは飽和であり得るかまたは不飽和であり得る。
【0025】
脂肪アルコールアセテート：この用語は、本明細書では「脂肪アセテート」と交換可能に使用され、脂肪炭素鎖、すなわち、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個の炭素原子などの、４～２８個の炭素原子の脂肪族鎖を有するアセテートを指す。脂肪アルコールアセテートは、飽和であり得るかまたは不飽和であり得る。
【0026】
脂肪アシルＣｏＡ：この用語は、本明細書では「脂肪アシルＣｏＡエステル」と交換可能に使用され、一般式Ｒ－ＣＯ－ＳＣｏＡの化合物を指し、式中、Ｒは、脂肪炭素鎖である。脂肪炭素鎖は、チオエステル結合によって補酵素Ａの－ＳＨ基に結合される。脂肪アシルＣｏＡは、それが由来する脂肪酸が飽和であるか不飽和であるかに応じて、飽和または不飽和であってよい。
【0027】
脂肪アルコール：「脂肪アルコール」という用語は、本明細書では、４～２８個の炭素原子、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８などの炭素原子の炭素鎖長を有する脂肪アシルＣｏＡに由来するアルコールを指す。脂肪アルコールは、飽和または不飽和させ得る。
【0028】
脂肪アルデヒド：この用語は、本明細書では、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個の炭素原子などの、４～２８個の炭素原子の炭素鎖長を有する脂肪アシルＣｏＡに由来するアルデヒドを指す。脂肪アルデヒドは、飽和であり得るかまたは不飽和であり得る。
【0029】
異種：タンパク質または酵素などのポリペプチド、またはポリヌクレオチドを指す場合の「異種」という用語は、本明細書では、野生型細胞中に天然に存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指すと解釈されるものとする。例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に適用される場合の「異種Δ９デサチュラーゼ」という用語は、野生型Ｙ．リポリティカ細胞中に天然に存在しないΔ９デサチュラーゼ、例えばキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）に由来するΔ９デサチュラーゼを指す。
【0030】
ポリエーテル分散液の混合物：この用語は、ポリエーテル分散液の混合物、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈの有機消泡剤２０４（製品番号Ａ６４２６およびＡ８３１１、ＭＤＬ番号ＭＦＣＤ００１３０５２３）を含むか、主にこれらの混合物からなるポリエトキシル化非イオン性界面活性剤の群を指す。
【0031】
天然の：タンパク質または酵素などのポリペプチド、またはポリヌクレオチドを指す場合の「天然の」という用語は、本明細書では、野生型細胞中に天然に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指すと解釈されるものとする。この用語は、「内因性の」という用語と、同義的に使用される。
【0032】
害虫：本明細書で使用される場合、「害虫」という用語は、特に農業または家畜生産の文脈において、ヒトまたはヒトの関係に有害な生物、特に動物を指すものとする。害虫は、侵襲的または多産、有害、厄介、有害、破壊的、植物または動物への妨害、ヒトまたはヒトの懸念、家畜、ヒトの構造、野生の生態系など、任意の生物である。この用語は多くの場合、関連する用語バーミン、雑草、植物および動物の寄生虫および病原体と重複する。ある生物は、ある環境では害虫であり得るが、別の環境では有益である、家畜化される、または許容可能である。
【0033】
フェロモン：フェロモンは、アルコール、アルデヒド、またはアセテート官能基で終わり、脂肪族骨格中に最大３つの二重結合を含む非分岐脂肪族鎖（炭素数９～１８）によって指定される、天然に存在する化合物である。フェロモン組成物は、例えば本明細書に記載されるとおり、化学的または生化学的に産生され得る。したがって、フェロモンは、本明細書に記載の方法および細胞によって得ることができるような、不飽和脂肪アルコール、脂肪アルデヒドまたは脂肪アルコールアセテートを含み得る。
【0034】
ポリエトキシル化界面活性剤：本明細書でのこの用語は、ポリエトキシル化界面活性剤、すなわち非イオン性界面活性剤を指す。
【0035】
ポリエチレンポリプロピレングリコール：この用語は、ポリエトキシル化非イオン性界面活性剤の群を指し、これは、ＰＥＧ－ＰＰＧ－ＰＥＧブロックコポリマー消泡剤、例えば、Ｋｏｌｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ４０７（ＣＡＳ番号９００３－１１－６）を含むか、または主にそれらからなり、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）とも呼ばれる。
【0036】
低下された活性：「低下された活性」という用語は、本明細書では、タンパク質または酵素などの、所与のペプチドの活性の完全なまたは部分的な喪失を指し得る。場合によっては、ペプチドは、必須遺伝子によってコードされており、それは欠失され得ない。これらの場合、ペプチドの活性は、転写もしくは翻訳のダウンレギュレーション、またはペプチドの阻害などの当技術分野で知られている方法によって低下され得る。他の場合には、ペプチドは、非必須遺伝子によってコードされ、活性は、低下され得るか、またはそれは、ペプチドをコードする遺伝子の欠失の結果として、完全に喪失され得る。酵素の低下された活性はまた、当技術分野で知られているように、例えば、抑制可能なプロモーターを用いて、酵素をコードする遺伝子の転写を抑制することによって、活性を阻害することによって、または翻訳レベルでサイレンシングすることによって達成され得る。
【0037】
飽和した：「飽和した」という用語は、二重または三重の炭素－炭素結合を含まない化合物を指す。
【0038】
シメチコン：この用語は、シメチコン（ＣＡＳ番号８０５０－８１－５）、ジメチルポリシロキサン、または活性化ポリメチルシロキサンとも呼ばれるシメチコンを含む、または主にそれらからなるポリエトキシル化非イオン性界面活性剤の群を指す。シメチコンは、１．２～１．６％のポリエチレングリコールモノステアレートも含むシリコーンベースのエマルジョンである。
【0039】
界面活性剤：この用語は、２つの液体間、気体と液体の間、または液体と固体の間の表面張力（または界面張力）を低下させる化合物を指す。界面活性剤は、洗剤、湿潤剤、乳化剤、消泡剤、および分散剤として作用し得る。界面活性剤は通常、両親媒性の有機化合物であり、それらが疎水性基（テール）および親水性基（ヘッド）の両方を含むことを意味する。したがって、界面活性剤は典型的には、水不溶性（または油溶性）成分および水溶性成分の両方を含む。最も一般的には、界面活性剤は、極性ヘッド基に従って分類される。非イオン性界面活性剤は、そのヘッドに荷電基を有しない。
【0040】
力価：化合物の力価は、本明細書において、化合物の産生された濃度を指す。化合物が細胞によって産生される場合、この用語は、細胞によって産生される総濃度、すなわち、化合物の総量を培養培地の体積で割ったものを指す。これは、特に揮発性化合物の場合、力価は培養培地から蒸発した可能性のある化合物の一部分を含むことを意味し、したがって、発酵ブロスからおよび発酵槽からの潜在的なオフガスから、産生された化合物を収集することによって決定される。
【0041】
コドレモン（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨ）
コドレモンの生合成は、マロニルＣｏＡへとカルボキシル化される、アセチル補酵素Ａ（ＣｏＡ）に基づく。この反応は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）によって触媒される。マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡは、鎖長Ｃ１６／Ｃ１８以下の脂肪アシルＣｏＡを合成するために、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）によって使用される前駆体である。コドリンガペルオキシソームオキシダーゼ（ＰＯＸ）は、Ｃ１４：ＣｏＡを介してＣ１２：ＣｏＡ（ラウリル－ＣｏＡ）へのＣ１６：ＣｏＡの鎖短縮（－２Ｃ）を触媒すると仮定された（Ｄｉｎｇ，２０１４）。コドリンガにおいて、Ｃ１２：ＣｏＡをＥ９－Ｃ１２：ＣｏＡへと変換するデサチュラーゼの証拠は、早期に発見されたが、このデサチュラーゼをコードする遺伝子は、追加のデサチュラーゼをコードするさらに２つの遺伝子（Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ／Ｃｐｏ＿ＮＰＶＥ／Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ）と共に近年やっと同定された。第１の不飽和化ステップは、Ｅ／Ｚ９－Ｃ１２：ＣｏＡへのＣ１２：ＣｏＡの変換をもたらし、これは、第２の不飽和化ステップでＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ（Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ）に変換される。脂肪アシルレダクターゼ（ＦＡＲ）は次に、おそらくジエンＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡを還元して、最終的にコドレモン（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨ）を形成する。コドリンガ中のＦＡＲをコードする遺伝子は、これまでに同定されていない（Ｄｉｎｇ ２０１４，Ｌoｆｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。
コドレモンの生合成は、マロニルＣｏＡへとカルボキシル化される、アセチル補酵素Ａ（ＣｏＡ）に基づく。この反応は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）によって触媒される。マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡは、鎖長Ｃ１６／Ｃ１８以下の脂肪アシルＣｏＡを合成するために、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）によって使用される前駆体である。コドリンガペルオキシソームオキシダーゼ（ＰＯＸ）は、Ｃ１４：ＣｏＡを介してＣ１２：ＣｏＡ（ラウリル－ＣｏＡ）へのＣ１６：ＣｏＡの鎖短縮（－２Ｃ）を触媒すると仮定された（Ｄｉｎｇ，２０１４）。コドリンガにおいて、Ｃ１２：ＣｏＡをＥ９－Ｃ１２：ＣｏＡへと変換するデサチュラーゼの証拠は、早期に発見されたが、このデサチュラーゼをコードする遺伝子は、追加のデサチュラーゼをコードするさらに２つの遺伝子（Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ／Ｃｐｏ＿ＮＰＶＥ／Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ）と共に近年やっと同定された。第１の不飽和化ステップは、Ｅ／Ｚ９－Ｃ１２：ＣｏＡへのＣ１２：ＣｏＡの変換をもたらし、これは、第２の不飽和化ステップでＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ（Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ）に変換される。脂肪アシルレダクターゼ（ＦＡＲ）は次に、おそらくジエンＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡを還元して、最終的にコドレモン（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨ）を形成する。コドリンガ中のＦＡＲをコードする遺伝子は、これまでに同定されていない（Ｄｉｎｇ ２０１４，Ｌoｆｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。
【0042】
コドレモンの生合成について提唱された経路を図１に示す。
【0043】
コドレモンの産生
本開示は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりコドレモン（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨまたはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール）を産生できる酵母細胞、および酵母細胞中においてコドレモン（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨまたはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール）を産生するための方法に関する。
本開示は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりコドレモン（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨまたはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール）を産生できる酵母細胞、および酵母細胞中においてコドレモン（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨまたはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール）を産生するための方法に関する。
【0044】
本発明者らは、酵母中においてＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生するための異種経路（例として図１に概説される）を設計した。
【0045】
したがって、酵母細胞中でＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生するための方法が提供され、本方法は、酵母細胞を提供するステップと、培地中で酵母細胞をインキュベートするステップを含み、酵母細胞は、少なくとも１つの異種デサチュラーゼおよび任意により少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）を発現し、
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）に変換し；
ｉｉ）任意による少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換でき、
これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生する。
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）に変換し；
ｉｉ）任意による少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換でき、
これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生する。
【0046】
したがって、本発明の酵母細胞および方法を使用して、本明細書に記載のＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを産生することによりコドレモンを産生し、それは次に、酵母細胞中でレダクターゼを発現させることにより、ｉｎ ｖｉｖｏでＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できるか、またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａは、トリアシルグリセリドなどの脂質または遊離脂肪酸に変換でき、それは次に、回収され、当技術分野で知られているように、例えばそれらをレダクターゼと接触させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる。いずれの場合も、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールが産生される。
【0047】
酵母細胞
この方法の第１のステップでは、より長いアシルＣｏＡの生合成にアセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡを使用できる酵母細胞が提供される。アシルＣｏＡを合成できる任意の酵母細胞が、本明細書に記載のＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生するために使用され得る。あるいは、酵母細胞は、当技術分野で知られるような好適な炭素源を提供されてよい。酵母細胞は、天然に存在しない酵母細胞、例えば、本明細書に記載のＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、ならびに任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するように操作された酵母細胞であり得る。
この方法の第１のステップでは、より長いアシルＣｏＡの生合成にアセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡを使用できる酵母細胞が提供される。アシルＣｏＡを合成できる任意の酵母細胞が、本明細書に記載のＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生するために使用され得る。あるいは、酵母細胞は、当技術分野で知られるような好適な炭素源を提供されてよい。酵母細胞は、天然に存在しない酵母細胞、例えば、本明細書に記載のＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、ならびに任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するように操作された酵母細胞であり得る。
【0048】
アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡは、アシルＣｏＡ、特に炭素鎖長１２を有するアシルＣｏＡに変換され得る。これは、例えば天然または異種のアシルＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）の作用により、ドデカノイル－ＣｏＡをドデカン酸（ラウリン酸）に変換するステップを伴い得る。ラウリン酸は次に、天然または異種の脂肪アシル補酵素Ａシンテターゼ（ＦＡＡ）（ＥＣ６．２．１．３）の作用によりドデカノイルＣｏＡに変換され得る。
【0049】
酵母細胞はしたがってまた、アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡを脂肪アシルＣｏＡ、特に炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡに変換することもできる。いくつかの実施形態では、酵母細胞はしたがって、上記反応を実施できる１つ以上の脂肪アシル補酵素シンテターゼ（ＥＣ６．２．１．３）および／または１つ以上のアシルＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）を発現する。
【0050】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、培養培地中でラウリン酸またはラウリン酸メチルまたはトリラウロイルグリセロールまたは別の脂肪酸誘導体を提供される。酵母細胞が、以下で詳述するβ－酸化を介して炭素鎖を短縮できるように操作されている場合、細胞は、油脂、または１２より長い炭素鎖長を有する任意の脂肪酸誘導体を提供され得る。
【0051】
いくつかの実施形態では、細胞は、例えばゲノム中の遺伝子編集により、ゲノムレベルで改変されている。細胞はまた、少なくとも１つのベクターなどの少なくとも１つの核酸構築物の挿入によって改変され得る。ベクターは、ゲノムへの核酸配列の組み込みを可能にするか、またはゲノムの組み込みなしにベクター中に含まれる核酸配列によってコードされるポリペプチドの発現を可能にするように、当業者に知られているように設計され得る。
【0052】
本開示のいくつかの実施形態では、これらに限定されないが、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クスダマカビ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ヒゲカビ（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、フハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、リノスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）を含む属の酵母または真菌が使用される。特定の実施形態では、これらに限定されないが、ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）、カンジダ・プルチェリマ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．レブカウフィ（Ｃ．ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコッカス・カルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、クンニンハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）、Ｃ．エレガンズ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｃ．ジャポニカ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、リポマイセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、Ｍ．イザベリナ（Ｍ．ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、Ｍ．ラマニアナ（Ｍ．ｒａｍａｎｎｉａｎａ）、Ｍ．ビナセア（Ｍ．ｖｉｎａｃｅａ）、Ｍ．シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、フィコマイセス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）、フィチウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ．グラシリス（Ｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｒ．ムチラギノーザ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、Ｒ．ピニコーラ（Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を含む種の生物が使用される。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、ヤロウイア・リポリティカ細胞またはサッカロミセス・セレビシエ細胞である。
【0053】
改変される酵母細胞は、宿主細胞とも呼ばれ、得ることができるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの力価に悪影響を有し得る、天然酵素を発現し得る。天然酵素はしたがって、遺伝子編集などの当技術分野で知られている方法によって不活化され得る。例えば、力価に負の影響を有する天然酵素をコードする遺伝子は、本明細書の以下に記載されるとおり、天然酵素の活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらすように、消失され得るかまたは変異され得る。
【0054】
デサチュラーゼ
本発明の方法は、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換するための必要な酵素を発現する酵母細胞に依存する。このために必要とされる最初の酵素は、デサチュラーゼであり、それは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡに１つ以上の二重結合を導入でき、それにより炭素鎖長１２を有するおよび１つ以上の二重結合を有する不飽和脂肪アシルＣｏＡへと脂肪アシルＣｏＡを変換できる。炭素鎖長１２の不飽和脂肪アシルＣｏＡは、炭素鎖長１２の不飽和脂肪アシルＣｏＡの混合物であり得、混合物は、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡを含むが、典型的には一不飽和脂肪アシルＣｏＡＥ９－Ｃ１２：ＣｏＡおよびＺ９－Ｃ１２：ＣｏＡも含む。したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入できるデサチュラーゼを発現し、それにより脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ（Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ）に変換できる。ＥＣクラスＥＣ１．１４．１９のデサチュラーゼは、そのような反応を実行できる。
本発明の方法は、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換するための必要な酵素を発現する酵母細胞に依存する。このために必要とされる最初の酵素は、デサチュラーゼであり、それは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡに１つ以上の二重結合を導入でき、それにより炭素鎖長１２を有するおよび１つ以上の二重結合を有する不飽和脂肪アシルＣｏＡへと脂肪アシルＣｏＡを変換できる。炭素鎖長１２の不飽和脂肪アシルＣｏＡは、炭素鎖長１２の不飽和脂肪アシルＣｏＡの混合物であり得、混合物は、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡを含むが、典型的には一不飽和脂肪アシルＣｏＡＥ９－Ｃ１２：ＣｏＡおよびＺ９－Ｃ１２：ＣｏＡも含む。したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入できるデサチュラーゼを発現し、それにより脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ（Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ）に変換できる。ＥＣクラスＥＣ１．１４．１９のデサチュラーゼは、そのような反応を実行できる。
【0055】
コドレモンの産生は、２つの不飽和化ステップに依存する。これらは、１つのデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＣＰＲＱまたはＧｍｏ＿ＣＰＲＱ、以下に記載のその変異体および機能的バリアントにより、または２つの異なるデサチュラーゼにより実施され得る。２つの異なるデサチュラーゼによる実施形態において、デサチュラーゼの少なくとも１つは、以下に記載される、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体またはその機能的バリアントである。２つの異なるデサチュラーゼによる他の実施形態では、デサチュラーゼの少なくとも１つは、以下に記載される、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体またはその機能的バリアントである。他のデサチュラーゼは、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できるか、または炭素鎖長１４の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入でき、これは以下の「鎖短縮」の項で詳述するように、炭素鎖長１２の不飽和脂肪アシルＣｏＡへと短縮され得る。１つの二重結合を有する炭素鎖長１２または１４の脂肪アシルＣｏＡは次に、例えばその変異体または機能的バリアントであるＣｐｏ＿ＣＰＲＱによりさらに不飽和化できる。
【0056】
デサチュラーゼは、好ましくは異種デサチュラーゼである。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）であり、これは、コドリンガ中に自然に見られるデサチュラーゼである。実施例１６に示されるとおり、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡを産生するために、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの発現のみで十分である。Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱまたはＣｐｏ＿ＮＰＶＥのいずれか単独の発現は、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡを産生しなかった。この発見は、これらの３つのデサチュラーゼの機能アッセイが、それらがコドリンガフェロモン中で共役二重結合を連続的に形成するように機能することを示した、Ｄｉｎｇ２０１４から鑑みて、驚くべきことであり、これは、酵母では、そのようにならないようである。
【0057】
異種デサチュラーゼはまた、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱなどの異種デサチュラーゼの機能的バリアント、すなわち炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡを炭素鎖長１２の不飽和脂肪アシルＣｏＡ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡなど）に変換する能力を保持するバリアントであり得る。いくつかの実施形態では、機能的バリアントは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。
【0058】
異種デサチュラーゼはまた、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱなどの異種デサチュラーゼの機能的バリアント、すなわち炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡを炭素鎖長１２の不飽和脂肪アシルＣｏＡ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡなど）に変換する能力を保持するバリアントであり得る。いくつかの実施形態では、機能的バリアントは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。
【0059】
デサチュラーゼは、好ましくは異種デサチュラーゼである。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）であり、これはナシヒメシンクイ（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ）に自然に見られるデサチュラーゼ、または炭素鎖長が１２の脂肪アシルＣｏＡを、炭素鎖長１２の不飽和脂肪アシルＣｏＡ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡなど）に変換する能力を保持するその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、機能的バリアントは、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７８）に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７８）に対して、少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有する。
【0060】
いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、当技術分野で知られているように、デサチュラーゼをコードする核酸を導入することによって発現される。このような核酸は、当技術分野で知られているように、コドン最適化され得る。特定の実施形態では、デサチュラーゼをコードする核酸は、配列番号１に示されるものであるか、または配列番号１に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば配列番号１に対して、少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体である。他の実施形態では、デサチュラーゼをコードする核酸は、配列番号７８に示されるものであるか、または配列番号７８に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば配列番号７８に対して、少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体である。
【0061】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入できるいくつかのデサチュラーゼを発現する。このような実施形態では、好ましくはいくつかのデサチュラーゼの少なくとも１つは、以下に詳述するとおり、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体またはその機能的バリアントである。他の実施形態では、好ましくはいくつかのデサチュラーゼの少なくとも１つは、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体またはその機能的バリアントである。他のデサチュラーゼは、例えばＣｐｏ＿ＮＰＶＥ（アクセッション番号：ＡＨＷ９８３５５、配列番号６７）またはＣｐｏ＿ＳＰＴＱ（アクセッション番号：ＡＨＷ９８３５６、配列番号６９）、またはそれらに対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する機能的バリアントであり得る。そのようなデサチュラーゼは、酵母細胞に対してコドン最適化され得る核酸の導入後に、酵母細胞において発現され得、核酸は、例えば配列番号６６または配列番号６８に示される核酸、または配列番号６６または配列番号６８に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するその相同体である。
【0062】
酵母細胞は、異種デサチュラーゼのいくつかのコピーを発現するように操作できる。これは、当技術分野で知られているように行うことができる。デサチュラーゼ（複数可）はまた、例えば強力な発現レベルをもたらす構成的プロモーターの使用により、当技術分野で知られているように高レベルで発現され得る。このようなプロモーターは、当技術分野で知られている。
【0063】
いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、８５位に変異を有するＣｐｏ＿ＣＰＲＱ変異体などの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱである。いくつかの実施形態では、変異は、Ｓ８５Ａ変異である。デサチュラーゼはまた、この変異体の機能的バリアントであり得、Ｓ８５Ａ変異体などの、８５位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱに対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するその相同体を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、Ｓ８５Ｔ変異体である。
【0064】
いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、８２位に変異を有するＣｐｏ＿ＣＰＲＱ変異体などの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱである。いくつかの実施形態では、変異は、Ｓ８２Ａ変異である。デサチュラーゼはまた、変異体の機能的バリアントであり得、Ｓ８２Ａ変異体などの、８２位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱに対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するその相同体を有する。
【0065】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、２つ以上の異種デサチュラーゼを発現する。２つ以上のデサチュラーゼは、同一であっても異なっていてもよい。特定の実施形態では、酵母細胞は、配列番号２に示されるＣｐｏ＿ＣＰＲＱ、およびＳ８５Ａ変異体などの、８５位に変異を有するなどの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱを発現する。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、配列番号２に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはその機能的バリアントを発現し、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できる別のデサチュラーゼも発現する。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、配列番号７７に示されるＧｍｏ＿ＣＰＲＱ、配列番号２に示されるＣｐｏ＿ＣＰＲＱ、または本明細書に記載の変異体もしくはその機能的バリアントを発現する。
【0066】
いくつかの実施形態では、他のデサチュラーゼは、配列番号６７に示されるようなＣｐｏ＿ＮＰＶＥ、または配列番号６７に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば、配列番号６７に対して、少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するその変異体またはその機能的バリアントであり得る。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアント、およびＣｐｏ＿ＮＰＶＥ、その変異体または機能的バリアントを発現する。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアント、およびＣｐｏ＿ＮＰＶＥまたはその変異体または機能的バリアントを発現する。
【0067】
他の実施形態では、他のデサチュラーゼは、配列番号６９に示されるＣｐｏ＿ＳＰＴＱ、または配列番号６９に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、配列番号６９に対して、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するその変異体またはその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアント、およびＣｐｏ＿ＳＰＴＱ、その変異体または機能的バリアントを発現する。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアント、およびＣｐｏ＿ＳＰＴＱまたはその変異体または機能的バリアントを発現する。
【0068】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、本明細書で上に記載される、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはその変異体または機能的バリアントである。
【0069】
本明細書に記載のデサチュラーゼに加えて、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡに１つまたは２つの二重結合を導入できる酵母細胞は、１２を超える炭素鎖長（１４以上の炭素鎖長など）の脂肪アシルＣｏＡに少なくとも１つの二重結合を導入できるデサチュラーゼを発現し、１２を超える炭素鎖長の不飽和脂肪性アシルＣｏＡの炭素鎖長を短縮できる他の酵素も発現する必要がある。これについては、以下の「鎖短縮」の項で詳述する。
【0070】
酵母細胞はしたがって、本明細書の上記のデサチュラーゼのいずれか、または脂肪アシルＣｏＡを炭素鎖長１２の不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換する能力を保持するその機能的バリアントなどの、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより炭素鎖長１２のおよび１つ以上の二重結合を有する不飽和脂肪アシルＣｏＡに脂肪アシルＣｏＡを変換できるデサチュラーゼを発現する。酵母細胞はさらに、１２を超える炭素鎖長（炭素鎖長１４以上など）の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できるデサチュラーゼ、または１２を超える炭素鎖長（炭素鎖長１４以上など）の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入する能力を保持するその機能的バリアントを発現できる。
【0071】
デサチュラーゼまたはその機能的バリアントが所望の活性を有するか否かを試験するために、当技術分野で知られている方法を使用できる。例えば、試験される候補酵素は、酵母細胞、例えばベクター上または酵母細胞のゲノム内に導入され得、適切な培地中で酵母細胞をインキュベートし、ブロスから脂肪アルコールおよび／または脂肪酸メチルエステルを抽出し、不飽和化合物が産生されるか否かを決定するためにＧＣ－ＭＳ分析などの分析を実施する。天然のエロンガーゼ遺伝子（複数可）が欠失されている酵母細胞中で活性を試験することは、有利であり得る。このような手順の例は、実施例４またはＳｃｈｎｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００に記載される。
【0072】
脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）
「脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ」、「レダクターゼ」および「ＦＡＲ」という用語は、本明細書では互換的に使用される。ＦＡＲは、次の２段階の反応を触媒する：
アシル－ＣｏＡ＋２ＮＡＤＰＨ＜＝＞ＣｏＡ＋アルコール＋２ＮＡＤＰ（＋）
ここで、第１の段階において、脂肪アシルＣｏＡは、脂肪アルデヒドに還元され、その後、第２の段階において、脂肪アルデヒドは脂肪アルコールにさらに還元される。脂肪アシルＣｏＡは、不飽和脂肪アシルＣｏＡ、特にＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡであり得、これは次にＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換される。
「脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ」、「レダクターゼ」および「ＦＡＲ」という用語は、本明細書では互換的に使用される。ＦＡＲは、次の２段階の反応を触媒する：
アシル－ＣｏＡ＋２ＮＡＤＰＨ＜＝＞ＣｏＡ＋アルコール＋２ＮＡＤＰ（＋）
ここで、第１の段階において、脂肪アシルＣｏＡは、脂肪アルデヒドに還元され、その後、第２の段階において、脂肪アルデヒドは脂肪アルコールにさらに還元される。脂肪アシルＣｏＡは、不飽和脂肪アシルＣｏＡ、特にＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡであり得、これは次にＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換される。
【0073】
このような反応を触媒できるＦＡＲは、ＥＣ番号１．２．１．８４を有するアルコール形成脂肪アシルＣｏＡレダクターゼである。本発明の方法で使用される酵母細胞はしたがって、上記の反応を触媒できる異種ＦＡＲを発現し得る。あるいは、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡの回収後に、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｃｏ.Ａをｉｎ ｖｉｔｒｏでＦＡＲと接触させた後、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる。
【0074】
ＦＡＲは好ましくは、ヤガ属、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ属、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ属またはＣｙｄｉａ属の昆虫に固有のＦＡＲなどの、昆虫ＦＡＲである。例えば、ＦＡＲは、カブラヤガ、タマナヤガ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｕｂｆｌｅｘａ、タバコガ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、またはコドリンガに固有である。
【0075】
いくつかの実施形態では、ＦＡＲは、Ａｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、すなわちカブラヤガ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ａｓｅ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。例えば、機能的バリアントは、Ａｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。
【0076】
いくつかの実施形態では、ＦＡＲは、１９８位または４１３位に変異を有する変異体などの、変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲである。いくつかの実施形態では、Ａｓｅ＿ＦＡＲ変異体は、Ｔ１９８Ａ変異体である。他の実施形態では、Ａｓｅ＿ＦＡＲ変異体は、Ｓ４１３Ａ変異体である。
【0077】
いくつかの実施形態では、Ａｓｅ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントは、Ａｓｅ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントをコードする酵母細胞に核酸を導入することによって発現される。例えば、配列番号９に示される核酸、または配列番号９に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば配列番号９に対して、少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体が、導入される。
【0078】
他の実施形態では、ＦＡＲは、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、すなわちタマナヤガ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ａｉｐ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。例えば、機能的バリアントは、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。
【0079】
いくつかの実施形態では、Ａｉｐ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントは、Ａｉｐ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントをコードする酵母細胞に核酸を導入することによって発現される。例えば、配列番号６０に示されるような核酸、または配列番号６０に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、配列番号６０に対して、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体が、導入される。
【0080】
他の実施形態では、ＦＡＲは、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、すなわちＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｕｂｆｌｅｘａ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ｈｓ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。例えば、機能的バリアントは、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。
【0081】
いくつかの実施形態では、Ｈｓ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントは、Ｈｓ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントをコードする酵母細胞に核酸を導入することによって発現される。例えば、配列番号７０に示されるような核酸、または配列番号７０に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体が、導入される。
【0082】
他の実施形態では、ＦＡＲは、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、すなわちタバコガ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ｈａｓ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。例えば、機能的バリアントは、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。
【0083】
いくつかの実施形態では、Ｈａｓ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントは、Ｈａｓ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントをコードする酵母細胞に核酸を導入することによって発現される。例えば、配列番号７２に示されるような核酸、または配列番号７２に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば、配列番号７２に対して、少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体が、導入される。
【0084】
他の実施形態では、ＦＡＲは、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、すなわちＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ｈｖ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。例えば、機能的バリアントは、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。
【0085】
いくつかの実施形態では、Ｈｖ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントは、Ｈｖ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントをコードする酵母細胞に核酸を導入することによって発現される。例えば、配列番号７４に示されるような核酸、または配列番号７４に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば、配列番号７４に対して、少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体が、導入される。
【0086】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、コドリンガからのＦＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、ＦＡＲは、Ｃｐｏ＿ＦＡＲ（配列番号７６）、すなわちコドリンガ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ｃｐｏ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。例えば、機能的バリアントは、Ｃｐｏ＿ＦＡＲ（配列番号７６）に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。
【0087】
いくつかの実施形態では、Ｃｐｏ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントは、Ｃｐｏ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントをコードする酵母細胞に核酸を導入することによって発現される。例えば、配列番号７６に示されるような核酸、または配列番号７６に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば、配列番号７６に対して、少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体が、導入される。
【0088】
いくつかの実施形態では、ＦＡＲは、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）、すなわちオオタバコガ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ｈａｒ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。例えば、機能的バリアントは、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。
【0089】
いくつかの実施形態では、Ｈａｒ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントは、Ｈａｒ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントをコードする酵母細胞に核酸を導入することによって発現される。例えば、配列番号１１に示されるような核酸、または配列番号１１に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば、配列番号１１に対して、少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体が、導入される。
【0090】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、ＦＡＲのいくつかのコピーを発現する。例えば、ＦＡＲは、当技術分野で知られているように高レベルで発現される。
【0091】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、本明細書に記載のとおり、デサチュラーゼおよびＦＡＲを発現する。特定の実施形態では、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）または配列番号２に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアント、およびＡｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）または配列番号１０に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントを発現する。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）または配列番号２に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントを発現し、ＦＡＲは、１９８位または４１３位に変異を有する変異体、例えばＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体などの変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲである。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、８５位に変異を有する変異体、例えばＳ８５Ａ変異体などの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱであり、ＦＡＲは、Ａｓｅ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。他の実施形態では、デサチュラーゼは、Ｓ８５Ａ Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ変異体であり、ＦＡＲは、１９８位または４１３位に変異を有する変異体、例えばＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体などの変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲである。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、２つの同一のデサチュラーゼ、例えば、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたは８５位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、例えば、Ｓ８５Ａ変異体などの、２つのデサチュラーゼであり、ＦＡＲは、Ａｓｅ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、２つの同一のデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＣＰＲＱまたは８５位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、例えば、Ｓ８５Ａ変異体などの、２つのデサチュラーゼであり、ＦＡＲは、１９８位または４１３位に変異を有する変異体、例えばＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体などの変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲである。他の実施形態では、デサチュラーゼは、２つの異なるデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼおよび８５位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼ、例えばＳ８５Ａ変異体であり、ＦＡＲは、Ａｓｅ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。他の実施形態では、デサチュラーゼは、２つの異なるデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼおよび８５位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼ、例えばＳ８５Ａ変異体であり、ＦＡＲは、１９８位または４１３位に変異を有する変異体、例えばＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体などの変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲである。他の実施形態では、酵母細胞は、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）およびＡｓｅ＿ＦＡＲまたはその変異体または機能的バリアントを発現する。
【0092】
特定の実施形態では、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）または配列番号２に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアント、およびＡｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）または配列番号６１に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントを発現する。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、８５位に変異を有する変異体、例えばＳ８５Ａ変異体などの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱであり、ＦＡＲは、Ａｉｐ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、２つのデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼまたは８５位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼ、例えばＳ８５Ａ変異体などの、２つの同一のデサチュラーゼであり、ＦＡＲは、Ａｉｐ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。他の実施形態では、デサチュラーゼは、２つの異なるデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼおよび８５位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼ、例えばＳ８５Ａ変異体であり、ＦＡＲは、Ａｉｐ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。他の実施形態では、酵母細胞は、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）およびＡｉｐ＿ＦＡＲまたはその変異体または機能的バリアントを発現する。
【0093】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）またはそれに対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアント、およびＨｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）または配列番号７１に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントを発現する。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、８５位に変異を有する変異体、例えばＳ８５Ａ変異体などの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱであり、ＦＡＲは、Ｈｓ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、２つのデサチュラーゼ、例えば２つのＣｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼまたは８５位に変異を有する２つの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼ、例えば２つのＳ８５Ａ変異体などの、２つの同一のデサチュラーゼであり、ＦＡＲは、Ｈｓ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。他の実施形態では、デサチュラーゼは、２つの異なるデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼおよび８５位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼ、例えばＳ８５Ａ変異体であり、ＦＡＲは、Ｈｓ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。他の実施形態では、酵母細胞は、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）およびＨｓ＿ＦＡＲまたはその変異体または機能的バリアントを発現する。
【0094】
特定の実施形態では、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）または配列番号２に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアント、およびＨａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）または配列番号７３に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントを発現する。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、８５位に変異を有する変異体、例えばＳ８５Ａ変異体などの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱであり、ＦＡＲは、Ｈｓ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、２つのデサチュラーゼ、例えば２つのＣｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼまたは８５位に変異を有する２つの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼ、例えば２つのＳ８５Ａ変異体などの、２つの同一のデサチュラーゼであり、ＦＡＲは、Ｈｓ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。他の実施形態では、デサチュラーゼは、２つの異なるデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼおよび８５位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼ、例えばＳ８５Ａ変異体であり、ＦＡＲは、Ｈｓ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。他の実施形態では、酵母細胞は、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）およびＨａｓ＿ＦＡＲまたはその変異体または機能的バリアントを発現する。
【0095】
特定の実施形態では、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）または配列番号２に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアント、およびＨｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）または配列番号７５に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントを発現する。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、８５位に変異を有する変異体、例えばＳ８５Ａ変異体などの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱであり、ＦＡＲは、Ｈｖ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、２つのデサチュラーゼ、例えば２つのＣｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼまたは８５位に変異を有する２つの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼ、例えば２つのＳ８５Ａ変異体などの、２つの同一のデサチュラーゼであり、ＦＡＲは、Ｈｖ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。他の実施形態では、デサチュラーゼは、２つの異なるデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼおよび８５位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼ、例えばＳ８５Ａ変異体であり、ＦＡＲは、Ｈｖ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。他の実施形態では、酵母細胞は、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）およびＨｖ＿ＦＡＲまたはその変異体または機能的バリアントを発現する。
【0096】
特定の実施形態では、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）または配列番号２に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアント、およびＣｐｏ＿ＦＡＲ（配列番号７６）または配列番号７６に対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントを発現する。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、８５位に変異を有する変異体、例えばＳ８５Ａ変異体などの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱであり、ＦＡＲは、Ｃｐｏ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、２つのデサチュラーゼ、例えば２つのＣｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼまたは８５位に変異を有する２つの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼ、例えば２つのＳ８５Ａ変異体などの、２つの同一のデサチュラーゼであり、ＦＡＲは、Ｃｐｏ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。他の実施形態では、デサチュラーゼは、２つの異なるデサチュラーゼ、例えＣｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼおよび８５位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱデサチュラーゼ、例えば、Ｓ８５Ａ変異体であり、ＦＡＲは、Ｃｐｏ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントである。他の実施形態では、酵母細胞は、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）およびＣｐｏ＿ＦＡＲまたはその変異体または機能的バリアントを発現する。
【0097】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、上記のデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＣＰＲＱまたはＧｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアント、本明細書に記載のＦＡＲ、特にＡｓｅ＿ＦＡＲ、Ａｉｐ＿ＦＡＲ、Ｈｓ＿ＡＲ、Ｈａｓ＿ＦＡＲまたはＨｖ＿ＦＡＲ、またはそれらに対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有する変異体または機能的バリアントを発現し、また炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡに少なくとも１つの二重結合を導入できる別のデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＮＰＶＥ（配列番号６７）もしくはＣｐｏ＿ＳＰＴＱ（配列番号６９）、または配列番号６７または配列番号６９に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性を有する、例えば配列番号６７または配列番号６９に対して、少なくとも７０％の相同性または同一性、少なくとも７１％の相同性または同一性、少なくとも７２％など、少なくとも７３％など、少なくとも７４％など、少なくとも７５％など、少なくとも８０％など、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の相同性または同一性を有する変異体または機能的バリアントを発現する。
【0098】
いくつかの実施形態では、ＦＡＲは、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（オオタバコガ由来のＦＡＲ、配列番号１２）ではない。いくつかの実施形態では、ＦＡＲは、Ｔａ＿ＦＡＲ（メンフクロウ由来のＦＡＲ、配列番号８）ではない。
【0099】
したがって、酵母細胞は、本明細書の上記のデサチュラーゼのいずれか、または脂肪アシルＣｏＡを炭素鎖長１２の不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換する能力を保持するその機能的バリアントなどの、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを炭素鎖長１２のおよび１つ以上の二重結合を有する不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換できるデサチュラーゼを発現し得る。酵母細胞はさらに、上記のとおり、１２を超える炭素鎖長（炭素鎖長１４以上など）の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できるデサチュラーゼ、または１２を超える炭素鎖長（炭素鎖長１４以上など）の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入する能力を保持するその機能的バリアントを発現できる。これらの酵母細胞のいずれも、本明細書において上に記載のレダクターゼ、またはレダクターゼ活性を保持するその機能的バリアントをさらに発現し得る。
【0100】
レダクターゼまたはその機能的バリアントが所望の活性を有するか否かを試験するために、当技術分野で知られている方法を使用できる。例えば、試験される候補酵素は、酵母細胞、例えばベクター上または酵母細胞のゲノム内に導入され得、適切な培地中で酵母細胞をインキュベートし、ブロスから脂肪アルコールを抽出し、不飽和脂肪アルコールが産生されるか否かを決定するためにＧＣ－ＭＳ分析などの分析を実施する。天然のエロンガーゼ遺伝子（複数可）が欠失している酵母細胞中で活性を試験することは、有利であり得る。このような手順の例は、実施例４またはＳｃｈｎｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００に記載されている。
【0101】
前駆体の増加された利用可能性
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよびその誘導体の産生を改善するために、必要な前駆体、特にＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡの利用可能性を高めるために、酵母細胞中に追加の改変を導入することが、有利であり得る。酵母細胞はしたがって、特に、以下に詳述する改変のいずれかでさらに改変され得る：
－異種シトクロムｂ５の発現、
－異種シトクロムｂ５レダクターゼの発現、
－ヘモグロビンの発現、
－活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然エロンガーゼ（複数可）の不活性化、
－活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然チオエステラーゼ（複数可）の不活性化、
－天然の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ（複数可）、脂肪アルコールオキシダーゼ（複数可）、ペルオキシソーム生合成因子および／または脂肪アシルシンターゼ（複数可）の活性の不活性化または改変、
－異種チオエステラーゼ遺伝子の発現、
－脂肪アシルシンターゼとチオエステラーゼの融合タンパク質の発現。
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよびその誘導体の産生を改善するために、必要な前駆体、特にＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡの利用可能性を高めるために、酵母細胞中に追加の改変を導入することが、有利であり得る。酵母細胞はしたがって、特に、以下に詳述する改変のいずれかでさらに改変され得る：
－異種シトクロムｂ５の発現、
－異種シトクロムｂ５レダクターゼの発現、
－ヘモグロビンの発現、
－活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然エロンガーゼ（複数可）の不活性化、
－活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然チオエステラーゼ（複数可）の不活性化、
－天然の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ（複数可）、脂肪アルコールオキシダーゼ（複数可）、ペルオキシソーム生合成因子および／または脂肪アシルシンターゼ（複数可）の活性の不活性化または改変、
－異種チオエステラーゼ遺伝子の発現、
－脂肪アシルシンターゼとチオエステラーゼの融合タンパク質の発現。
【0102】
酵素、例えばエロンガーゼ、チオエステラーゼ、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ、脂肪アルコールオキシダーゼ、ペルオキシソーム生合成因子または脂肪アシルシンターゼは、遺伝子、例えばコード配列、プロモーター、コザック配列、ターミネーターまたは他の調節エレメント中において、例えば完全なもしくは部分的な欠失、挿入、置換、またはナンセンスもしくはミスセンス変異を含む、１つ以上の変異を導入することによって不活性化され得る。例えば天然プロモーターまたは天然ターミネーターは、それぞれ、別のより弱いプロモーターまたは別のターミネーターによって置き換えることができる。活性の部分的または完全な喪失をもたらす他の不活化方法は、転写の抑制、ならびに例えば関連する転写物の分解をもたらすＲＮＡｉシステムまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する、サイレンシングなどの、転写後不活化を含み、それにより翻訳を防止するかまたは少なくとも減少させ、ならびにタンパク質の阻害などの、翻訳後の不活性化を含む。酵素活性はあるいは、例えば細胞内局在化などの酵素の特性を改変するために、または当技術分野で知られている方法を使用して活性を増加させるために、改変されてよい。
【0103】
エロンガーゼ活性は、例えばＳｃｈｎｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００に記載されているように、脂肪酸プロファイルを分析することにより試験され得る。
【0104】
チオエステラーゼ活性は、Ｎａｎｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７に記載のチオエステラーゼ活性アッセイなどの、適切なアッセイにより試験され得る。
【0105】
脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、Ｉｗａｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１４に記載の脂肪アルデヒド分解アッセイなどの、適切なアッセイにより試験され得る。
【0106】
脂肪アルコールオキシダーゼ活性は、Ｉｗａｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１５に記載の脂肪アルコール分解アッセイなどの、適切なアッセイにより試験され得る。
【0107】
ペルオキシソーム生合成因子活性は、唯一の炭素源として脂肪酸を含む培地中での候補脂肪アルコールオキシダーゼを発現する酵母細胞の成長アッセイなどの、適切なアッセイにより試験され得る。
【0108】
脂肪アシルシンターゼ活性は、脂肪アシルシンターゼが必須遺伝子であるため、細胞成長を試験することにより、試験され得る。
【0109】
上記の改変のいずれかを組み合わせることができ、すなわち酵母細胞は、これらの改変のいくつかを含み得る。
【0110】
異種シトクロムｂ５の発現
本発明者らがコドレモンおよびその誘導体の産生に有益であることを見出した１つの改変は、酵母細胞における異種シトクロムｂ５の発現である。この膜結合ヘモプロテインは、いくつかの膜結合オキシゲナーゼの電子担体として機能する。実施例（特に実施例６）に示されるとおり、異種シトクロムｂ５の発現は、脂肪酸メチルエステル、特にＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの利用可能性を高めることが判明した。このような改変はしたがって、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりコドレモンなどの、炭素鎖長１２を有する不飽和脂肪アルコールの産生を増加させると予想される。
本発明者らがコドレモンおよびその誘導体の産生に有益であることを見出した１つの改変は、酵母細胞における異種シトクロムｂ５の発現である。この膜結合ヘモプロテインは、いくつかの膜結合オキシゲナーゼの電子担体として機能する。実施例（特に実施例６）に示されるとおり、異種シトクロムｂ５の発現は、脂肪酸メチルエステル、特にＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの利用可能性を高めることが判明した。このような改変はしたがって、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりコドレモンなどの、炭素鎖長１２を有する不飽和脂肪アルコールの産生を増加させると予想される。
【0111】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂ５は、鱗翅目種に固有のシトクロムｂ５である。特定の実施形態では、シトクロムｂ５は、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種由来のシトクロムｂ５、好ましくは配列番号４に示されるものなどの、オオタバコガ由来のシトクロムｂ５、または配列番号４に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、少なくとも７０％の相同性または同一性など、少なくとも７１％の相同性または同一性など、少なくとも７２％など、少なくとも７３％など、少なくとも７４％など、少なくとも７５％など、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントである。
【0112】
シトクロムｂ５は、高レベルで発現され得る。
【0113】
シトクロムｂ５は、シトクロムｂ５またはその相同体をコードする酵母細胞中に核酸を導入することによって発現され得る。例えば、配列番号３に示される核酸、または配列番号３に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば、配列番号３に対して、少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体が、導入される。
【0114】
シトクロムｂ５の機能的バリアントが所望の活性を保持するか否かを試験するために、当技術分野で知られている方法、例えば、Ｌａｍｂ ｅｔ ａｌ．，１９９９に記載されているような分光光度アッセイを使用できる。
【0115】
したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、上記のようにデサチュラーゼおよび脂肪アシルＣｏＡレダクターゼを発現し、本明細書に記載の異種シトクロムｂ５をさらに発現する。特に、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、例えばＳ８２変異体またはＳ８５変異体など、好ましくはＳ８５Ａ変異体などのＳ８５変異体、およびその機能的バリアントから選択される１つ以上のデサチュラーゼ、Ａｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲ、例えばＴ１９８変異体またはＳ４１３変異体、好ましくはＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）およびその機能的バリアントから選択される１つ以上のレダクターゼ、ならびに本明細書の上記に記載のシトクロムｂ５、オオタバコガ（配列番号４）由来のシトクロムｂ５またはその機能的バリアントなどを発現し得る。酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアントに加えて、上記のとおり、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できる別のデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＮＰＶＥ、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ、その変異体または機能的バリアントも発現し得る。
【0116】
酵母細胞は、本明細書に記載の改変のいずれか、特に異種シトクロムｂ５レダクターゼの発現、ヘモグロビンの発現、活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然のエロンガーゼ遺伝子（複数可）の変異、活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然のチオエステラーゼ遺伝子（複数可）の変異、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ（複数可）、脂肪アルコールオキシダーゼ（複数可）、ペルオキシソーム生合成因子および／または脂肪アシルシンターゼ（複数可）をコードする天然遺伝子（複数可）の変異、異種チオエステラーゼ遺伝子の発現、ならびに／または脂肪アシルシンターゼおよびチオエステラーゼの融合タンパク質の発現により、さらに改変され得る。
【0117】
異種シトクロムｂ５レダクターゼの発現（ＥＣ１．６．２．２）
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりコドレモンおよびその誘導体の増加された産生をもたらし得る別の改変は、異種シトクロムｂ５レダクターゼ（ＥＣ１．６．２．２）の発現である。
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりコドレモンおよびその誘導体の増加された産生をもたらし得る別の改変は、異種シトクロムｂ５レダクターゼ（ＥＣ１．６．２．２）の発現である。
【0118】
メトヘモグロビンレダクターゼとしても知られるシトクロムｂ５レダクターゼは、メトヘモグロビンをヘモグロビンに変換するＮＡＤＨ依存性酵素である。
ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋２フェリシトクロムｂ５＝ＮＡＤ＋＋２フェロシトクロムｂ５
ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋２フェリシトクロムｂ５＝ＮＡＤ＋＋２フェロシトクロムｂ５
【0119】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂ５レダクターゼは、鱗翅目種に固有のシトクロムｂ５レダクターゼである。特定の実施形態では、シトクロムｂ５レダクターゼは、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種由来のシトクロムｂ５レダクターゼ、好ましくはオオタバコガなどのＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種由来のシトクロムｂ５レダクターゼ、例えば配列番号２４に示されるシトクロムｂ５レダクターゼ、または配列番号２４に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するそれらの機能的バリアントである。
【0120】
シトクロムｂ５レダクターゼの機能的バリアントが所望の活性を保持するか否かを試験するために、当技術分野で知られている方法、例えばＬａｍｂ ｅｔ ａｌ．，１９９９に記載されるような分光光度アッセイを使用できる。
【0121】
シトクロムｂ５レダクターゼは、高レベルで発現され得る。
【0122】
シトクロムｂ５レダクターゼは、シトクロムｂ５レダクターゼまたはその相同体をコードする酵母細胞中に核酸を導入することによって発現させることができる。例えば、配列番号２３に示される核酸、または配列番号２３に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば、配列番号２３に対して、少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体が、導入される。
【0123】
したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、上記のとおりデサチュラーゼおよび脂肪アシルＣｏＡレダクターゼを発現し、本明細書の上に記載のように異種シトクロムｂ５レダクターゼをさらに発現する。酵母細胞は、本明細書に記載の改変のいずれかでさらに改変され得る。特に、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）、変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、例えば、Ｓ８２変異体またはＳ８５変異体などの変異体、好ましくはＳ８５Ａ変異体などのＳ８５変異体、およびその機能的バリアントから選択される１つ以上のデサチュラーゼ、Ａｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲ、例えば、Ｔ１９８変異体またはＳ４１３変異体、好ましくはＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）およびその機能的バリアントから選択される１つ以上のレダクターゼ、ならびに本明細書の上に記載のシトクロムｂ５レダクターゼ、オオタバコガ（配列番号２５）由来のシトクロムｂ５レダクターゼまたはその機能的バリアントなどを発現し得る。酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはＧｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアントに加えて、上記のとおり、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できる別のデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＮＰＶＥ、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ、その変異体または機能的バリアントも発現し得る。酵母細胞は、本明細書で上に記載されるとおり、シトクロムｂ５をさらに発現し得る。
【0124】
酵母細胞は、本明細書に記載の改変のいずれか、特に異種シトクロムｂ５の発現、ヘモグロビンの発現、活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然のエロンガーゼ遺伝子（複数可）の変異、活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然のチオエステラーゼ遺伝子（複数可）の変異、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ（複数可）、脂肪アルコールオキシダーゼ（複数可）、ペルオキシソーム生合成因子および／または脂肪アシルシンターゼ（複数可）をコードする天然遺伝子（複数可）の変異、異種チオエステラーゼ遺伝子の発現、ならびに／または脂肪アシルシンターゼおよびチオエステラーゼの融合タンパク質の発現により、さらに改変され得る。
【0125】
ヘモグロビンの発現
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によるコドレモンおよびその誘導体の産生に有利であり得る別の改変は、酵母細胞中でのヘモグロビン、特に異種ヘモグロビンの発現である。
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によるコドレモンおよびその誘導体の産生に有利であり得る別の改変は、酵母細胞中でのヘモグロビン、特に異種ヘモグロビンの発現である。
【0126】
実施例、特に実施例６に示されるとおり、デサチュラーゼを発現する酵母細胞中でのヘモグロビンの発現は、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生を増加させた。
【0127】
いくつかの実施形態では、ヘモグロビンは、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉａなどのビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）種に固有のヘモグロビンである。特定の実施形態では、ヘモグロビンは、配列番号６に示されるもの、または配列番号６に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、少なくとも７０％の相同性または同一性など、少なくとも７１％の相同性または同一性など、少なくとも７２％など、少なくとも７３％など、少なくとも７４％など、少なくとも７５％など、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその機能的バリアントである。
【0128】
ヘモグロビンの機能的バリアントが所望の活性を保持するか否かを試験するために、比色アッセイなどの、当技術分野で知られている適切な分析を実施できる。
【0129】
ヘモグロビンは、高レベルで発現され得る。
【0130】
ヘモグロビンは、ヘモグロビンまたはその相同体をコードする酵母細胞中に核酸を導入することによって発現され得る。例えば、配列番号５に示される核酸、または配列番号５に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば配列番号５に対して、少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体が、導入される。
【0131】
したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、上記のようにデサチュラーゼおよび脂肪アシルＣｏＡレダクターゼを発現し、本明細書に記載のとおりヘモグロビンをさらに発現する。特に、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）、変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、例えばＳ８２変異体またはＳ８５変異体など、好ましくはＳ８５Ａ変異体などのＳ８５変異体、およびその機能的バリアントから選択される１つ以上のデサチュラーゼ、Ａｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲ、例えば、Ｔ１９８変異体またはＳ４１３変異体、好ましくはＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）およびその機能的バリアントから選択される１つ以上のレダクターゼ、ならびに本明細書の上に記載のヘモグロビン、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉａ（配列番号６）のヘモグロビンまたはその機能的バリアントなどを発現し得る。酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはＧｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアントに加えて、上記のとおり、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できる別のデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＮＰＶＥ、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ、その変異体または機能的バリアントも発現し得る。
【0132】
酵母細胞は、本明細書に記載の改変のいずれか、特に異種シトクロムｂ５の発現、シトクロムｂ５レダクターゼの発現、活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然のエロンガーゼ遺伝子（複数可）の変異、活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然のチオエステラーゼ遺伝子（複数可）の変異、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ（複数可）、脂肪アルコールオキシダーゼ（複数可）、ペルオキシソーム生合成因子および／または脂肪アシルシンターゼ（複数可）をコードする天然遺伝子（複数可）の変異、異種チオエステラーゼ遺伝子の発現、ならびに／または脂肪アシルシンターゼおよびチオエステラーゼの融合タンパク質の発現により、さらに改変され得る。
【0133】
エロンガーゼ遺伝子（複数可）中の変異
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によるコドレモンおよびその誘導体の産生に有利であり得る別の改変は、酵母細胞中の特定の遺伝子の変異、特に１つ以上のエロンガーゼ遺伝子の変異であり、変異は、対応するエロンガーゼの活性の部分的または完全な喪失をもたらす。エロンガーゼは、脂肪酸を含む、いくつかの分子の炭素鎖伸長を触媒する。いくつかの実施形態では、エロンガーゼは、中鎖アシルエロンガーゼである。エロンガーゼをコードするいくつかの遺伝子を自然に含む酵母細胞を使用する場合、酵母細胞は、これらの遺伝子の１つ以上の中に変異を含むようにさらに操作され、１つ以上のエロンガーゼの活性の部分的または完全な喪失をもたらす。
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によるコドレモンおよびその誘導体の産生に有利であり得る別の改変は、酵母細胞中の特定の遺伝子の変異、特に１つ以上のエロンガーゼ遺伝子の変異であり、変異は、対応するエロンガーゼの活性の部分的または完全な喪失をもたらす。エロンガーゼは、脂肪酸を含む、いくつかの分子の炭素鎖伸長を触媒する。いくつかの実施形態では、エロンガーゼは、中鎖アシルエロンガーゼである。エロンガーゼをコードするいくつかの遺伝子を自然に含む酵母細胞を使用する場合、酵母細胞は、これらの遺伝子の１つ以上の中に変異を含むようにさらに操作され、１つ以上のエロンガーゼの活性の部分的または完全な喪失をもたらす。
【0134】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、ヤロウイア・リポリティカ細胞であり、エロンガーゼは、ＥＬＯ１遺伝子（配列番号１３）によってコードされる。
【0135】
いくつかの実施形態では、変異は、対応するエロンガーゼの活性の完全な喪失をもたらす欠失である。他の実施形態では、エロンガーゼは、遺伝子、例えばコード配列、プロモーター、コザック配列、ターミネーターまたは他の調節エレメント中において、例えば完全なもしくは部分的な欠失、挿入、置換、またはナンセンスもしくはミスセンス変異を含む、１つ以上の変異を導入することにより不活性化される。例えば天然プロモーターまたは天然ターミネーターは、それぞれ、別のより弱いプロモーターまたは別のターミネーターによって置き換えることができる。活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす他の不活化方法は、転写の抑制、ならびに例えば関連する転写物の分解をもたらすＲＮＡｉシステムまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する、サイレンシングなどの、転写後不活化を含み、それにより翻訳を防止するかまたは少なくとも減少させ、ならびにタンパク質の阻害などの、翻訳後の不活性化を含む。タンパク質がエロンガーゼ活性を保持するか否かを試験する方法の例は、実施例４またはＳｃｈｎｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００に記載される。
【0136】
したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、上記のようにデサチュラーゼおよび脂肪アシルＣｏＡレダクターゼを発現し、エロンガーゼをコードする１つ以上の遺伝子中に１つ以上の変異をさらに含み、変異は、本明細書に記載の機能の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。特に、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、例えば、Ｓ８２変異体またはＳ８５変異体、好ましくは、Ｓ８５Ａ変異体などのＳ８５変異体、およびその機能的バリアントから選択される１つ以上のデサチュラーゼ、Ａｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲ、例えばＴ１９８変異体またはＳ４１３変異体、好ましくはＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）およびその機能的バリアントから選択される１つ以上のレダクターゼを発現し、かつ本明細書の上に記載のとおり、エロンガーゼの活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす変異をさらに含み得る。酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはＧｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアントに加えて、上記のとおり、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できる別のデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＮＰＶＥ、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ、その変異体または機能的バリアントも発現し得る。
【0137】
酵母細胞は、本明細書に記載の改変のいずれか、特に異種シトクロムの発現、異種シトクロムｂ５レダクターゼの発現、ヘモグロビンの発現、活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然のチオエステラーゼ遺伝子（複数可）の変異、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ（複数可）、脂肪アルコールオキシダーゼ（複数可）、ペルオキシソーム生合成因子および／または脂肪アシルシンターゼ（複数可）をコードする天然遺伝子（複数可）の変異、異種チオエステラーゼ遺伝子の発現、ならびに／または脂肪アシルシンターゼおよびチオエステラーゼの融合タンパク質の発現により、さらに改変され得る。
【0138】
チオエステラーゼ遺伝子（複数可）中の変異
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によるコドレモンおよびその誘導体の産生に有利であり得る別の改変は、酵母細胞中の特定の遺伝子の変異、特に１つ以上のチオエステラーゼ遺伝子の変異であり、変異は、対応するチオエステラーゼの活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。チオエステラーゼをコードするいくつかの遺伝子を自然に含む酵母細胞を使用する場合、酵母細胞は、これらの遺伝子の１つ以上の中に変異を含むようにさらに操作され、１つ以上のチオエステラーゼの活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によるコドレモンおよびその誘導体の産生に有利であり得る別の改変は、酵母細胞中の特定の遺伝子の変異、特に１つ以上のチオエステラーゼ遺伝子の変異であり、変異は、対応するチオエステラーゼの活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。チオエステラーゼをコードするいくつかの遺伝子を自然に含む酵母細胞を使用する場合、酵母細胞は、これらの遺伝子の１つ以上の中に変異を含むようにさらに操作され、１つ以上のチオエステラーゼの活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。
【0139】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、ヤロウイア・リポリティカ細胞であり、チオエステラーゼは、ＹＡＬ１０＿Ｆ１４７２９ｇ遺伝子（配列番号１９）、ＹＡＬＩ０＿Ｅ１８８７６ｇ（配列番号５４）、またはＹＡＬＩ０＿Ｄ０３５９７ｇ（配列番号５５）によってコードされる。したがって、いくつかの実施形態では、ヤロウイア・リポリティカ細胞は、ＹＡＬ１０＿Ｆ１４７２９ｇ遺伝子（配列番号１９）の欠失などの変異を含み、対応するチオエステラーゼの部分的なまたは完全な喪失をもたらす。他のいくつかの実施形態では、ヤロウイア・リポリティカ細胞は、ＹＡＬＩ０＿Ｅ１８８７６ｇ遺伝子（配列番号５４）の欠失などの変異を含み、対応するチオエステラーゼの部分的なまたは完全な喪失をもたらす。他のいくつかの実施形態では、ヤロウイア・リポリティカ細胞は、ＹＡＬＩ０＿Ｄ０３５９７ｇ（配列番号５５）の欠失などの変異を含み、対応するチオエステラーゼの部分的なまたは完全な喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、ヤロウイア・リポリティカ細胞は、いくつかのチオエステラーゼ遺伝子中に変異を含む。例えば、細胞は、ＹＡＬ１０＿Ｆ１４７２９ｇ（配列番号１９）の欠失などの変異、およびＹＡＬＩ０＿Ｅ１８８７６ｇ（配列番号５４）の欠失などの変異；またはＹＡＬ１０＿Ｆ１４７２９ｇ（配列番号１９）、およびＹＡＬＩ０＿Ｄ０３５９７ｇ（配列番号５５）の欠失などの変異；またはＹＡＬＩ０＿Ｅ１８８７６ｇ（配列番号５４）およびＹＡＬＩ０＿Ｄ０３５９７ｇ（配列番号５５）の欠失などの変異を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＹＡＬ１０＿Ｆ１４７２９ｇ（配列番号１９）、ＹＡＬＩ０＿Ｅ１８８７６ｇ（配列番号５４）、およびＹＡＬＩ０＿Ｄ０３５９７ｇ（配列番号５５）の欠失などの変異を含む。
【0140】
したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、上記のようにデサチュラーゼおよび脂肪アシルＣｏＡレダクターゼを発現し、チオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子中に１つ以上の変異をさらに含み、変異は、本明細書に記載の機能の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。特に、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）、変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、例えばＳ８２変異体またはＳ８５変異体などの変異体、好ましくはＳ８５Ａ変異体などのＳ８５変異体、およびその機能的バリアントから選択される１つ以上のデサチュラーゼ、Ａｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲ、例えばＴ１９８変異体またはＳ４１３変異体、好ましくはＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）およびその機能的バリアント、およびチオエステラーゼをコードする１つ以上の遺伝子中の１つ以上の変異から選択される１つ以上のレダクターゼを発現し得、変異は、ＹＡＬ１０＿Ｆ１４７２９ｇ（配列番号１９）、ＹＡＬＩ０＿Ｅ１８８７６ｇ（配列番号５４）およびＹＡＬＩ０＿Ｄ０３５９７ｇ（配列番号５５）の１つ以上の中の変異などの、本明細書の上記に記載の機能の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはＧｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアントに加えて、上記のとおり、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できる別のデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＮＰＶＥ、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ、その変異体または機能的バリアントも発現し得る。
【0141】
酵母細胞は、本明細書に記載の改変のいずれか、特に異種シトクロムｂ５の発現、異種シトクロムｂ５レダクターゼの発現、ヘモグロビンの発現、活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然のエロンガーゼ遺伝子（複数可）の変異、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ（複数可）、脂肪アルコールオキシダーゼ（複数可）、ペルオキシソーム生合成因子および／または脂肪アシルシンターゼ（複数可）をコードする天然遺伝子（複数可）の変異、異種チオエステラーゼ遺伝子の発現、ならびに／または脂肪アシルシンターゼおよびチオエステラーゼの融合タンパク質の発現により、さらに改変され得る。
【0142】
追加の改変
酵母細胞は、脂肪酸代謝に関与する酵素の活性の低下をもたらす少なくとも１つの変異などの、他の改変をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、天然の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ（複数可）、脂肪アルコールオキシダーゼ（複数可）、ペルオキシソーム生合成因子、および／または脂肪アシルシンターゼ（複数可）の活性が改変され、好ましくは活性は、低下されるまたは消失される。例えば、酵母細胞は、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ、脂肪アルコールオキシダーゼ、および／またはペルオキシソーム生合成因子をコードする遺伝子中に１つ以上の変異をさらに含み得る。これらの酵素のいずれかは、遺伝子中で、例えばコード配列、プロモーター、コザック配列、ターミネーターまたは他の調節エレメント中で、例えば完全なもしくは部分的な欠失、挿入、置換、またはナンセンスもしくはミスセンス変異を含む、１つ以上の変異を導入することによって不活性化され得る。例えば天然プロモーターまたは天然ターミネーターは、それぞれ、別のより弱いプロモーターまたは別のターミネーターによって置き換えることができる。活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす他の不活化方法は、転写の抑制、ならびに例えば関連する転写物の分解をもたらすＲＮＡｉシステムまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する、サイレンシングなどの、転写後不活化を含み、それにより翻訳を防止するかまたは少なくとも減少させ、ならびにタンパク質の阻害などの、翻訳後の不活性化を含む。酵素活性はさもなければ、例えば細胞内局在化などの酵素の特性を改変するために、または当技術分野で知られている方法を使用して、活性を増加させるために、改変されてよい。
酵母細胞は、脂肪酸代謝に関与する酵素の活性の低下をもたらす少なくとも１つの変異などの、他の改変をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、天然の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ（複数可）、脂肪アルコールオキシダーゼ（複数可）、ペルオキシソーム生合成因子、および／または脂肪アシルシンターゼ（複数可）の活性が改変され、好ましくは活性は、低下されるまたは消失される。例えば、酵母細胞は、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ、脂肪アルコールオキシダーゼ、および／またはペルオキシソーム生合成因子をコードする遺伝子中に１つ以上の変異をさらに含み得る。これらの酵素のいずれかは、遺伝子中で、例えばコード配列、プロモーター、コザック配列、ターミネーターまたは他の調節エレメント中で、例えば完全なもしくは部分的な欠失、挿入、置換、またはナンセンスもしくはミスセンス変異を含む、１つ以上の変異を導入することによって不活性化され得る。例えば天然プロモーターまたは天然ターミネーターは、それぞれ、別のより弱いプロモーターまたは別のターミネーターによって置き換えることができる。活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす他の不活化方法は、転写の抑制、ならびに例えば関連する転写物の分解をもたらすＲＮＡｉシステムまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する、サイレンシングなどの、転写後不活化を含み、それにより翻訳を防止するかまたは少なくとも減少させ、ならびにタンパク質の阻害などの、翻訳後の不活性化を含む。酵素活性はさもなければ、例えば細胞内局在化などの酵素の特性を改変するために、または当技術分野で知られている方法を使用して、活性を増加させるために、改変されてよい。
【0143】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、本明細書で上に記載されるヤロウイア・リポリティカ細胞であり、これらの細胞は、ＨＦＤ１、ＨＦＤ２、ＨＦＤ３、ＨＦＤ４、ＦＡＯ１、ＧＰＡＴおよびＰＥＸ１０の少なくとも１つの中に変異などの改変、またはそれに対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えばそれらに対して少なくとも６５％の相同性または同一性など、少なくとも７０％の相同性または同一性など、少なくとも７５％の相同性または同一性など、少なくとも８０％の相同性または同一性など、少なくとも８１％の相同性または同一性など、少なくとも８２％の相同性または同一性など、少なくとも８３％の相同性または同一性など、少なくとも８４％の相同性または同一性など、少なくとも８５％の相同性または同一性など、少なくとも８６％の相同性または同一性など、少なくとも８７％の相同性または同一性など、少なくとも８８％の相同性または同一性など、少なくとも８９％の相同性または同一性など、少なくとも９０％の相同性または同一性など、少なくとも９１％の相同性または同一性など、少なくとも９２％の相同性または同一性など、少なくとも９３％の相同性または同一性など、少なくとも９４％の相同性または同一性など、少なくとも９５％の相同性または同一性など、少なくとも９６％の相同性または同一性など、少なくとも９７％の相同性または同一性など、少なくとも９８％の相同性または同一性など、少なくとも９９％の相同性または同一性などを有する、少なくとも１つのタンパク質の活性の低下をもたらす変異などの改変をさらに含む。
【0144】
ヤロウイア・リポリティカ中で、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼＨｆｄ１は、ＨＦＤ１（ＹＡＬＩ０＿Ｆ２３７９３ｇ）によりコードされる。これは、脂肪酸への脂肪アルデヒドの酸化を触媒する。明細書ＷＯ２０１８／１０９１６３において詳細に記載されるとおり、Ｈｆｄ１の低下された活性は、酵母細胞中の不飽和脂肪アルコールの増加された力価をもたらす。本開示によるヤロウイア・リポリティカ細胞はしたがって、ＨＦＤ１の欠失などの変異をさらに含み得、Ｈｆｄ１の活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。Ｈｆｄ１の活性の低下は、本明細書に記載の他の方法によって達成できる。
【0145】
脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼＨｆｄ２は、ＨＦＤ２（ＹＡＬＩ＿０Ｅ１５４００ｇ）によりコードされる。これは、脂肪酸への脂肪アルデヒドの酸化を触媒する。本開示によるヤロウイア・リポリティカ細胞はしたがって、ＨＦＤ２の欠失などの変異をさらに含み得、Ｈｆｄ２の活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。Ｈｆｄ２の活性の低下は、本明細書に記載の他の方法によって達成できる。
【0146】
脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼＨｆｄ３は、ＨＦＤ３（ＹＡＬＩ０＿Ａ１７８７５ｇ）によりコードされる。これは、脂肪酸への脂肪アルデヒドの酸化を触媒する。本開示によるヤロウイア・リポリティカ細胞はしたがって、ＨＦＤ３の欠失などの変異をさらに含み得、Ｈｆｄ３の活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。Ｈｆｄ３の活性の低下は、本明細書に記載の他の方法によって達成できる。
【0147】
ヤロウイア・リポリティカ中で、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼＨｆｄ４は、ＨＦＤ４（ＹＡＬＩ０＿Ｂ０１２９８ｇ）によりコードされる。これは、脂肪酸への脂肪アルデヒドの酸化を触媒する。明細書ＷＯ２０１８／１０９１６３において詳細に記載されるとおり、低下されたＨｆｄ４の活性は、酵母細胞中の不飽和脂肪アルコールの増加された力価をもたらす。本開示によるヤロウイア・リポリティカ細胞はしたがって、ＨＦＤ４の欠失などの変異をさらに含み得、Ｈｆｄ４の活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。Ｈｆｄ４の活性の低下は、本明細書に記載の他の方法によって達成できる。
【0148】
いくつかの実施形態では、酵母細胞はさらに、改変、例えば欠失などの、変異を含み、Ｈｆｄ１、Ｈｆｄ２、Ｈｆｄ３またはＨｆｄ４に対して少なくとも６０％の相同性または同一性、例えばＨｆｄ１、Ｈｆｄ２、Ｈｆｄ３またはＨｆｄ４に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性など、７０％の相同性または同一性など、７５％の相同性または同一性など、８０％の相同性または同一性など、８１％の相同性または同一性など、８２％の相同性または同一性など、８３％の相同性または同一性など、８４％の相同性または同一性など、８５％の相同性または同一性など、８６％の相同性または同一性など、８７％の相同性または同一性など、８８％の相同性または同一性など、８９％の相同性または同一性など、９０％の相同性または同一性など、９１％の相同性または同一性など、９２％の相同性または同一性など、９３％の相同性または同一性など、９４％の相同性または同一性など、９５％の相同性または同一性など、９６％の相同性または同一性など、９７％の相同性または同一性など、９８％の相同性または同一性など、９９％の相同性または同一性などを有する脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼの活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。
【0149】
ヤロウイア・リポリティカ中で、脂肪アルコールオキシダーゼＦａｏ１は、ＦＡＯ１（ＹＡＬＩ０Ｂ１４０１４ｇ）によりコードされる。その欠失は、ω－ヒドロキシ脂肪酸の増加された蓄積をもたらす。明細書ＷＯ２０１８／１０９１６３において詳細に記載されるとおり、Ｆａｏ１の低下された活性は、酵母細胞中で不飽和脂肪アルコールの増加された力価をもたらす。本開示によるヤロウイア・リポリティカ細胞はしたがって、ＦＡＯ１の欠失などの変異をさらに含み得、Ｆａｏ１の活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。Ｆａｏ１の活性の低下は、本明細書に記載の他の方法によって達成できる。
【0150】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、欠失などの変異をさらに含み、Ｆａｏ１に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えばＦａｏ１に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性など、少なくとも７０％の相同性または同一性など、少なくとも７５％の相同性または同一性など、少なくとも８０％の相同性または同一性など、少なくとも８１％の相同性または同一性など、少なくとも８２％の相同性または同一性など、少なくとも８３％の相同性または同一性など、少なくとも８４％の相同性または同一性など、少なくとも８５％の相同性または同一性など、少なくとも８６％の相同性または同一性など、少なくとも８７％の相同性または同一性など、少なくとも８８％の相同性または同一性など、少なくとも８９％の相同性または同一性など、少なくとも９０％の相同性または同一性など、少なくとも９１％の相同性または同一性など、少なくとも９２％の相同性または同一性など、少なくとも９３％の相同性または同一性など、少なくとも９４％の相同性または同一性など、少なくとも９５％の相同性または同一性など、少なくとも９６％の相同性または同一性など、少なくとも９７％の相同性または同一性など、少なくとも９８％の相同性または同一性など、少なくとも９９％の相同性または同一性などを有する脂肪アルコールオキシダーゼの活性の部分的または完全な喪失をもたらす。
【0151】
ヤロウイア・リポリティカ中で、ペルオキシソーム生合成因子１０Ｐｅｘ１０は、ＰＥＸ１０（ＹＡＬＩ０Ｃ０１０２３ｇ）によりコードされる。明細書ＷＯ２０１８／１０９１６３において詳細に記載されるとおり、Ｐｅｘ１０の低下された活性は、酵母細胞中の不飽和脂肪アルコールの増加された力価をもたらす。本開示によるヤロウイア・リポリティカ細胞はしたがって、ＰＥＸ１０の欠失などの変異をさらに含み得、Ｐｅｘ１０の活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。Ｐｅｘ１０の活性の低下は、本明細書に記載の他の方法によって達成できる。
【0152】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、欠失などの変異をさらに含み、Ｐｅｘ１０に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えばＰｅｘ１０に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性など、少なくとも７０％の相同性または同一性など、少なくとも７５％の相同性または同一性など、少なくとも８０％の相同性または同一性など、少なくとも８１％の相同性または同一性など、少なくとも８２％の相同性または同一性など、少なくとも８３％の相同性または同一性など、少なくとも８４％の相同性または同一性など、少なくとも８５％の相同性または同一性など、少なくとも８６％の相同性または同一性など、少なくとも８７％の相同性または同一性など、少なくとも８８％の相同性または同一性など、少なくとも８９％の相同性または同一性など、少なくとも９０％の相同性または同一性など、少なくとも９１％の相同性または同一性など、少なくとも９２％の相同性または同一性など、少なくとも９３％の相同性または同一性など、少なくとも９４％の相同性または同一性など、少なくとも９５％の相同性または同一性など、少なくとも９６％の相同性または同一性など、少なくとも９７％の相同性または同一性など、少なくとも９８％の相同性または同一性など、少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するペルオキシソーム生合成因子Ｐｅｘ１０の活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。
【0153】
ヤロウイア・リポリティカ中で、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼは、ＧＰＡＴ（ＹＡＬＩ０＿Ｃ００２０９ｇ）によりコードされる。ＧＰＡＴは、グリセロ脂質の生合成に向けた最初の反応を触媒する。この遺伝子は、ヤロウイア・リポリティカにおいて必須である。明細書ＷＯ２０１８／１０９１６３において詳細に記載されるとおり、ＧＰＡＴの低下された活性は、酵母細胞中で不飽和脂肪アルコールの増加された力価をもたらす。本開示によるヤロウイア・リポリティカ細胞はしたがって、ＧＰＡＴの変異をさらに含み得、ＧＰＡＴの活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。ＧＰＡＴの活性の低下は、本明細書に記載される他の方法によって達成できる。
【0154】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、変異をさらに含み、ＧＰＡＴに対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えばＧＰＡＴに対して、少なくとも６５％の相同性または同一性など、少なくとも７０％の相同性または同一性など、少なくとも７５％の相同性または同一性など、少なくとも８０％の相同性または同一性など、少なくとも８１％の相同性または同一性など、少なくとも８２％の相同性または同一性など、少なくとも８３％の相同性または同一性など、少なくとも８４％の相同性または同一性など、少なくとも８５％の相同性または同一性など、少なくとも８６％の相同性または同一性など、少なくとも８７％の相同性または同一性など、少なくとも８８％の相同性または同一性など、少なくとも８９％の相同性または同一性など、少なくとも９０％の相同性または同一性など、少なくとも９１％の相同性または同一性など、少なくとも９２％の相同性または同一性など、少なくとも９３％の相同性または同一性など、少なくとも９４％の相同性または同一性など、少なくとも９５％の相同性または同一性など、少なくとも９６％の相同性または同一性など、少なくとも９７％の相同性または同一性など、少なくとも９８％の相同性または同一性など、少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼの活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす。
【0155】
上記の酵素のいずれかの活性の部分的なまたは完全な喪失はまた、遺伝子中に、例えばコード配列、プロモーター、コザック配列、ターミネーターまたは他の調節エレメント中に、例えば完全なもしくは部分的な欠失、挿入、置換、またはナンセンスもしくはミスセンス変異を含む、１つ以上の変異を導入することにより達成され得る。例えば天然プロモーターまたは天然ターミネーターは、それぞれ、別のより弱いプロモーターまたは別のターミネーターによって置き換えることができる。活性の部分的なまたは完全な喪失をもたらす他の不活化方法は、転写の抑制、ならびに例えば関連する転写物の分解をもたらすＲＮＡｉシステムまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する、サイレンシングなどの、転写後不活化を含み、それにより翻訳を防止するかまたは少なくとも減少させ、ならびにタンパク質の阻害などの、翻訳後の不活性化を含む。変異などの改変または本明細書の上記に記載の任意の改変が活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらすか否かを決定するために、本明細書で上に詳述するような当技術分野で知られている方法を使用できる。例えば、転写の低下をもたらす欠失または改変の場合、ＰＣＲなどの増幅方法を使用して、関連する配列が存在しないことを確認できる。タンパク質の発現は、ウエスタンブロットなどの適切なアッセイを使用して、または蛍光マーカーなどのマーカーを使用して発現レベルを測定して調べられてよい。
【0156】
１つ以上の改変脂肪アシルシンターゼを発現することも、酵母細胞にとっては、有利であり得る。これは、代謝フラックスをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび不飽和脂肪アルコールおよびその誘導体、コドレモンおよびその誘導体などの、不飽和化産生物の産生に向ける助けとなり得る。したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、改変ケトンシンターゼドメインを有する脂肪アシルシンターゼを発現するようにさらに改変される。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、本明細書に記載のヤロウイア・リポリティカ細胞であり、細胞は、改変脂肪酸シンターゼ複合体をさらに発現する。一実施形態では、脂肪酸シンターゼ複合体は、複合体のアルファサブユニットをコードする遺伝子を変異させることによって改変される。いくつかの実施形態では、変異は、ＦＡＳ２（配列番号１８）をコードする遺伝子中にある。他の実施形態では、変異は、ＦＡＳ１（配列番号１６）をコードする遺伝子中にある。変異は、配列番号１６の残基１２３（Ｌ１２３）の１つ以上の改変をもたらし得る。変異は、配列番号１８の残基１２２０（Ｉ１２２０）、残基１２１７（Ｍ１２１７）、または残基１２２６（Ｍ１２２６）の１つ以上の改変をもたらし、バリアントＦＡＳ２をもたらし得る。当業者であれば、そのような変異を設計する方法を知っているであろう。
【0157】
好ましくは、ＦＡＳ２における変異は、Ｆａｓ２のＩ１２２０Ｆバリアント、Ｉ１２２０Ｗバリアント、Ｉ１２２０ＹバリアントまたはＩ１２２０Ｈバリアントをもたらす。特定の実施形態では、変異は、Ｉ１２２０Ｆバリアントをもたらす。いくつかの実施形態では、変異は、Ｍ１２１７Ｆバリアント、Ｍ１２１７Ｗバリアント、Ｍ１２１７ＹバリアントまたはＭ１２１７Ｈバリアントをもたらす。他の実施形態では、変異は、Ｍ１２２６Ｆバリアント、Ｍ１２２６Ｗバリアント、Ｍ１２２６ＹバリアントまたはＭ１２２６Ｈバリアントをもたらす。
【0158】
好ましくは、ＦＡＳ１中の変異は、Ｌ１２３Ｖバリアントをもたらす。
【0159】
ＦＡＳ２の残基Ｉ１２２０、Ｍ１２１７またはＭ１２２６での２つの変異または３つの変異、および／またはＦＡＳ１の残基１２３での１つの変異などの、上記の変異の２つ以上を有する酵母細胞もまた企図される。
【0160】
したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、上記のデサチュラーゼおよび脂肪アシルＣｏＡレダクターゼを発現し、本項に記載の１つ以上の改変をさらに含む。特に、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）、変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、Ｓ８２変異体またはＳ８５変異体など、好ましくはＳ８５Ａ変異体などのＳ８５変異体、およびそれらの機能的バリアントから選択される１つ以上のデサチュラーゼ、ならびにＡｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、Ｔ１９８変異体またはＳ４１３変異体などの変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲ、好ましくはＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）およびそれらの機能的バリアントから選択される１つ以上のレダクターゼ、上記のように、Ｈｆｄ１、Ｈｆｄ２、Ｈｆｄ３、Ｈｆｄ４、Ｆａｏ１およびＰｅｘ１０の１つ以上の機能の部分的または完全な喪失をもたらす変異などの１つ以上の改変を発現し得る、かつ／または上記のように１つ以上の改変脂肪アシルシンターゼをさらに発現し得る。酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはＧｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアントに加えて、上記のとおり、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できる別のデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＮＰＶＥ、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ、その変異体または機能的バリアントも発現し得る。
【0161】
酵母細胞は、本明細書に記載の改変のいずれか、特に異種シトクロムｂ５の発現、異種シトクロムｂ５レダクターゼの発現、ヘモグロビンの発現、活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然のエロンガーゼ（複数可）の不活性化、活性の完全なまたは部分的な喪失をもたらす天然チオエステラーゼ（複数可）の不活性化、異種チオエステラーゼ遺伝子の発現、ならびに／または脂肪アシルシンターゼおよびチオエステラーゼの融合タンパク質の発現により、さらに改変され得る。
【0162】
特に、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）、変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、例えばＳ８２変異体またはＳ８５変異体など、好ましくはＳ８５Ａ変異体などのＳ８５変異体、およびそれらの機能的バリアントから選択される１つ以上のデサチュラーゼ、ならびにＡｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲ、例えばＴ１９８変異体またはＳ４１３変異体、好ましくはＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）およびその機能的バリアントから選択される１つ以上のレダクターゼを発現し、以下の中に変異をさらに含み得る：ＨＦＤ１およびＨＦＤ２；ＨＦＤ１およびＨＦＤ３；ＨＦＤ１およびＨＦＤ４；ＨＦＤ１およびＦＡＯ１；ＨＦＤ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ２およびＨＦＤ３；ＨＦＤ２およびＨＦＤ４；ＨＦＤ２およびＦＡＯ１；ＨＦＤ２およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ３およびＨＦＤ４；ＨＦＤ３およびＦＡＯ１；ＨＦＤ３およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ４およびＦＡＯ１；ＨＦＤ４およびＰＥＸ１０；ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２およびＨＦＤ３；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２およびＨＦＤ４；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２およびＦＡＯ１；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＨＦＤ３およびＨＦＤ４；ＨＦＤ１、ＨＦＤ３およびＦＡＯ１；ＨＦＤ１、ＨＦＤ３およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＨＦＤ４およびＦＡＯ１；ＨＦＤ１、ＨＦＤ４およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ２、ＨＦＤ３およびＨＦＤ４；ＨＦＤ２、ＨＦＤ３およびＦＡＯ１；ＨＦＤ２、ＨＦＤ３およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ２、ＨＦＤ４およびＦＡＯ１；ＨＦＤ２、ＨＦＤ４およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ２、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ３、ＨＦＤ４およびＦＡＯ１；ＨＦＤ３、ＨＦＤ４およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ３、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ４、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２、ＨＦＤ３およびＨＦＤ４；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２、ＨＦＤ３およびＦＡＯ１；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２、ＨＦＤ３およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２、ＨＦＤ４およびＦＡＯ１；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２、ＨＦＤ４およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＨＦＤ３、ＨＦＤ４およびＦＡＯ１；ＨＦＤ１、ＨＦＤ３、ＨＦＤ４およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＨＦＤ３、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＨＦＤ４、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ２、ＨＦＤ３、ＨＦＤ４およびＦＡＯ１；ＨＦＤ２、ＨＦＤ３、ＨＦＤ４およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ２、ＨＦＤ３、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ２、ＨＦＤ４、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ３、ＨＦＤ４、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２、ＨＦＤ３、ＨＦＤ４およびＦＡＯ１；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２、ＨＦＤ３、ＨＦＤ４およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＨＦＤ３、ＨＦＤ４、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ２、ＨＦＤ３、ＨＦＤ４、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０；ＨＦＤ１、ＨＦＤ２、ＨＦＤ３、ＨＦＤ４、ＦＡＯ１およびＰＥＸ１０、またはこれらに対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有する対応するバリアントの前述の組み合わせ。さらに、酵母細胞は、上記のとおり、改変された脂肪アシルシンターゼ、特に変異体Ｆａｓ１および／または変異体Ｆａｓ２をさらに発現し得る。酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはＧｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアントに加えて、上記のとおり、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できる別のデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＮＰＶＥ、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ、その変異体または機能的バリアントも発現し得る。
【0163】
異種チオエステラーゼの発現
チオエステラーゼ、特に異種チオエステラーゼを導入することにより、酵母細胞をさらに操作することが有利であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、チオエステラーゼをコードする核酸は、例えばベクター上で、またはゲノムの組み込みによって、酵母細胞に導入される。チオエステラーゼ遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にあり得るか、または構成的プロモーターの制御下にあり得る。チオエステラーゼをコードする核酸は、当技術分野で知られているように、酵母細胞に対してコドン最適化され得る。特に、核酸は、ヤロウイア・リポリティカ細胞などのヤロウイア細胞に対してコドン最適化され得る。チオエステラーゼは、当技術分野で知られているように、高レベルで発現され得る。
チオエステラーゼ、特に異種チオエステラーゼを導入することにより、酵母細胞をさらに操作することが有利であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、チオエステラーゼをコードする核酸は、例えばベクター上で、またはゲノムの組み込みによって、酵母細胞に導入される。チオエステラーゼ遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にあり得るか、または構成的プロモーターの制御下にあり得る。チオエステラーゼをコードする核酸は、当技術分野で知られているように、酵母細胞に対してコドン最適化され得る。特に、核酸は、ヤロウイア・リポリティカ細胞などのヤロウイア細胞に対してコドン最適化され得る。チオエステラーゼは、当技術分野で知られているように、高レベルで発現され得る。
【0164】
いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、Ｃｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、クフェア・フッケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）、クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｍｐｈｏｒａ）、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から選択される生物に由来する。好ましい実施形態では、チオエステラーゼは、大腸菌またはクスノキに由来する。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、配列番号３３に示されるＣｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓに由来のチオエステラーゼ、配列番号５７に示されるクフェア・フッケリアナ由来のチオエステラーゼ、配列番号３５に示されるクスノキ由来のチオエステラーゼ、および配列番号２６に示される大腸菌由来のチオエステラーゼから選択されるチオエステラーゼに対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有する。好ましくは、チオエステラーゼは、配列番号３５に示されるクスノキ由来または配列番号２６に示される大腸菌由来のチオエステラーゼに対して、少なくとも６０％の相同性または同一性を有する。一実施形態では、チオエステラーゼは、配列番号３５に示されるクスノキ由来のチオエステラーゼに対して、少なくとも６０％の相同性または同一性を有する。別の実施形態では、チオエステラーゼは、配列番号２６に示される大腸菌由来のチオエステラーゼに対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有する。
【0165】
別の実施形態では、チオエステラーゼは、配列番号３５に示されるクスノキ由来のチオエステラーゼに対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、配列番号３５に示されるクスノキ由来のチオエステラーゼに対して、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の相同性または同一性などを有する。
【0166】
別の実施形態では、チオエステラーゼは、配列番号２６に示される大腸菌由来のチオエステラーゼに対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、配列番号２６に示される大腸菌由来のチオエステラーゼに対して、少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の相同性または同一性などを有する。
【0167】
チオエステラーゼをコードする核酸は、当技術分野で知られているようにコドン最適化され得る。一実施形態では、酵母細胞は、ヤロウイア細胞、好ましくはヤロウイア・リポリティカ細胞であり、核酸は、それに応じてコドン最適化される。
【0168】
一実施形態では、少なくとも１つのチオエステラーゼは、配列番号３４に示されるクスノキ由来のチオエステラーゼをコードする核酸に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、配列番号３４に示されるクスノキ由来のチオエステラーゼをコードする核酸に対して、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％の相同性または同一性、例えば少なくとも７３％の相同性または同一性、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の相同性または同一性などを有する核酸によってコードされる。
【0169】
一実施形態では、少なくとも１つのチオエステラーゼは、配列番号２５に示される大腸菌由来のチオエステラーゼをコードする核酸に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、配列番号２５に示される大腸菌由来のチオエステラーゼをコードする核酸に対して、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％の相同性または同一性、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の相同性または同一性などを有する核酸によってコードされる。
【0170】
したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、上記のとおりデサチュラーゼおよび脂肪アシルＣｏＡレダクターゼを発現し、本明細書に記載のとおり、１つ以上の異種チオエステラーゼなどの１つ以上のチオエステラーゼをさらに発現する。特に、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）、変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、例えばＳ８２変異体またはＳ８５変異体など、好ましくはＳ８５変異体、例えばＳ８５Ａ変異体、およびその機能的バリアントから選択される１つ以上のデサチュラーゼ、Ａｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲ、例えばＴ１９８変異体またはＳ４１３変異体、好ましくはＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号４）およびそれらの機能的バリアントなどから選択される１つ以上のレダクターゼ、１つ以上の異種チオエステラーゼ、例えば配列番号３３、配列番号５７、配列番号３５および／または配列番号２６に示されるチオエステラーゼ、またはそれらの機能的バリアントを発現し得る。酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはＧｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアントに加えて、上記のとおり、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できる別のデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＮＰＶＥ、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ、その変異体または機能的バリアントも発現し得る。
【0171】
酵母細胞は、特に異種シトクロムｂ５、異種シトクロムｂ５レダクターゼの発現、ヘモグロビンの発現、天然エロンガーゼ遺伝子（複数可）の変異（完全なまたは部分的な活性の喪失をもたらす）、天然チオエステラーゼ遺伝子（複数可）の変異（完全なまたは部分的な活性の喪失をもたらす）、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ（複数可）、脂肪アルコールオキシダーゼ（複数可）、ペルオキシソーム生合成因子および／または脂肪アシルシンターゼ（複数可）をコードする天然遺伝子（複数可）の変異、および／または上記のように、脂肪アシルシンターゼおよびチオエステラーゼの融合タンパク質の発現により、本明細書に記載の改変のいずれかでさらに改変され得る。
【0172】
脂肪アシルシンターゼとチオエステラーゼの融合タンパク質の発現
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、短縮型脂肪アシルシンターゼおよび短縮型チオエステラーゼの融合タンパク質、例えば配列番号５９に示される融合タンパク質、または配列番号５９に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体をさらに発現する。この融合タンパク質は、Ｙ．リポリティカのＦａｓ１の短縮型と大腸菌のチオエステラーゼＴｅｓＡの短縮型の融合である。それは、配列番号５８に示されるものなどの、核酸の導入によって発現され得る。融合タンパク質は、高レベルで発現され得る。
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、短縮型脂肪アシルシンターゼおよび短縮型チオエステラーゼの融合タンパク質、例えば配列番号５９に示される融合タンパク質、または配列番号５９に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体をさらに発現する。この融合タンパク質は、Ｙ．リポリティカのＦａｓ１の短縮型と大腸菌のチオエステラーゼＴｅｓＡの短縮型の融合である。それは、配列番号５８に示されるものなどの、核酸の導入によって発現され得る。融合タンパク質は、高レベルで発現され得る。
【0173】
したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、配列番号５９に示される融合タンパク質、または配列番号５９に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、配列番号５９に対して、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体をさらに発現する。
【0174】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、配列番号５８に示される核酸などの融合タンパク質をコードする核酸、または配列番号５８に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、配列番号５８に対して、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体をコードする核酸を含む。
【0175】
したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、上記のようにデサチュラーゼおよび脂肪アシルＣｏＡレダクターゼを発現し、配列番号５９に示される融合タンパク質などの、短縮型脂肪アシルシンターゼおよび短縮型チオエステラーゼの融合タンパク質をさらに発現する。特に、酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、例えばＳ８２変異体またはＳ８５変異体など、好ましくはＳ８５Ａ変異体などのＳ８５変異体、およびそれらの機能的バリアント、ならびにＡｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲ、例えばＴ１９８変異体またはＳ４１３変異体、好ましくはＴ１９８Ａ変異体またはＳ４１３Ａ変異体、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）およびそれらの機能的バリアント、ならびに短縮型脂肪アシルシンターゼおよび短縮型チオエステラーゼの融合タンパク質、例えば配列番号５９に記載の融合タンパク質またはその機能的バリアントから選択される１つ以上のデサチュラーゼを発現し得る。酵母細胞は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはＧｍｏ＿ＣＰＲＱ、その変異体または機能的バリアントに加えて、上記のとおり、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できる別のデサチュラーゼ、例えばＣｐｏ＿ＮＰＶＥ、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ、その変異体または機能的バリアントも発現し得る。
【0176】
酵母細胞は、特に異種シトクロムｂ５の発現、異種シトクロムｂ５レダクターゼの発現、ヘモグロビンの発現、天然エロンガーゼ遺伝子（複数可）の変異（完全なまたは部分的な活性の喪失をもたらす）、天然チオエステラーゼ遺伝子（複数可）の変異（完全なまたは部分的な活性の喪失をもたらす）、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ（複数可）、脂肪アルコールオキシダーゼ（複数可）、ペルオキシソーム生合成因子および／または脂肪アシルシンターゼ（複数可）をコードする天然遺伝子（複数可）の変異、および／または上記のように、異種チオエステラーゼ遺伝子の発現により、本明細書に記載の改変のいずれかでさらに改変され得る。
【0177】
力価
本明細書に開示される酵母細胞は、少なくとも０．２ｍｇ／Ｌの力価でＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる。いくつかの実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの力価は、少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．３ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．４ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５．０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２０ｍｇ／Ｌなど、２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｇ／Ｌなど、少なくとも２ｇ／Ｌなど、少なくとも３ｇ／Ｌなど、少なくとも４ｇ／Ｌなど、少なくとも５ｇ／Ｌなど、少なくとも６ｇ／Ｌなど、少なくとも７ｇ／Ｌなど、少なくとも８ｇ／Ｌなど、少なくとも９ｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｇ／Ｌであるまたはそれより大きい。
本明細書に開示される酵母細胞は、少なくとも０．２ｍｇ／Ｌの力価でＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる。いくつかの実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの力価は、少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．３ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．４ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５．０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２０ｍｇ／Ｌなど、２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｇ／Ｌなど、少なくとも２ｇ／Ｌなど、少なくとも３ｇ／Ｌなど、少なくとも４ｇ／Ｌなど、少なくとも５ｇ／Ｌなど、少なくとも６ｇ／Ｌなど、少なくとも７ｇ／Ｌなど、少なくとも８ｇ／Ｌなど、少なくとも９ｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｇ／Ｌであるまたはそれより大きい。
【0178】
力価を決定するための方法は、当技術分野で知られている。
【0179】
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートの産生
コドレモンはさらに、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換され得る。これは、当技術分野で知られているとおり、例えば化学変換によってｅｘ ｖｉｖｏで行われるか、またはそれは、細胞により産生されるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換できるアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８４）の作用によりｉｎ ｖｉｖｏで行われ得る。
コドレモンはさらに、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換され得る。これは、当技術分野で知られているとおり、例えば化学変換によってｅｘ ｖｉｖｏで行われるか、またはそれは、細胞により産生されるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換できるアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８４）の作用によりｉｎ ｖｉｖｏで行われ得る。
【0180】
いくつかの実施形態では、酵母細胞はしたがって、それが天然アセチルトランスフェラーゼを過剰発現するように、および／またはそれが任意により高レベルで発現される異種アセチルトランスフェラーゼを発現するように操作される。酵母細胞は、そのような実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよびＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを産生できる。
【0181】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、細胞により産生されるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部を、Ｓｃ＿Ａｔｆ１アセチルトランスフェラーゼ（配列番号３７）、または配列番号３７に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、配列番号３７に対して、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体などのＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換できるアセチルトランスフェラーゼを発現する。
【0182】
アセチルトランスフェラーゼの発現は、配列番号３６に示される核酸、または配列番号３６に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、配列番号３６に対して、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその相同体などの、酵母細胞における発現のためにコドン最適化され得る核酸を導入することによって達成され得る。
【0183】
したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、本明細書の上記に記載の異種デサチュラーゼ、本明細書の上記に記載の異種脂肪アシルレダクターゼ、および任意により上記の追加の改変のいずれかを発現し、かつ産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換できるアセチルトランスフェラーゼも発現する。
【0184】
本明細書に開示される酵母細胞はしたがって、少なくとも０．２ｍｇ／Ｌの力価で、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを産生し得る。いくつかの実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートの力価は、少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．３ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．４ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５．０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２０ｍｇ／Ｌなど、２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｇ／Ｌなど、少なくとも２ｇ／Ｌなど、少なくとも３ｇ／Ｌなど、少なくとも４ｇ／Ｌなど、少なくとも５ｇ／Ｌなど、少なくとも６ｇ／Ｌなど、少なくとも７ｇ／Ｌなど、少なくとも８ｇ／Ｌなど、少なくとも９ｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｇ／Ｌであるまたはそれより大きい。
【0185】
力価を決定するための方法は、当技術分野で知られている。
【0186】
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの産生
細胞によって産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部を、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールにさらに変換することもまた興味深い。これは、化学変換により、または酵母細胞をさらに操作することにより行うことができる。
細胞によって産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部を、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールにさらに変換することもまた興味深い。これは、化学変換により、または酵母細胞をさらに操作することにより行うことができる。
【0187】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換できるようにさらに操作され得る。これは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換できる、アルデヒド形成脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．５０）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）、および／または脂肪アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２０）をさらに発現するように酵母細胞を操作することにより行うことができる。酵母細胞は、そのような実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよびＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生できる。
【0188】
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換できるアルデヒド形成脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．５０）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）および／または脂肪アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２０）をコードする核酸をしたがって、酵母細胞に導入できる。核酸は、コドン最適化されてよく、かつ高レベルで発現されてよい。
【0189】
したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、本明細書において上記の異種デサチュラーゼ、本明細書において上記の異種脂肪アシルレダクターゼ、および任意により上記の追加の改変のいずれかを発現し、かつＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換できるアルデヒド形成脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．５０）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）および／または脂肪アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２０）も発現する。
【0190】
本明細書に開示される酵母細胞はしたがって、少なくとも０．２ｍｇ／Ｌの力価で、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生し得る。いくつかの実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの力価は、少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．３ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．４ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５．０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２０ｍｇ／Ｌなど、２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｇ／Ｌなど、少なくとも２ｇ／Ｌなど、少なくとも３ｇ／Ｌなど、少なくとも４ｇ／Ｌなど、少なくとも５ｇ／Ｌなど、少なくとも６ｇ／Ｌなど、少なくとも７ｇ／Ｌなど、少なくとも８ｇ／Ｌなど、少なくとも９ｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｇ／Ｌであるまたはそれより大きい。
【0191】
力価を決定するための方法は、当技術分野で知られている。
【0192】
鎖短縮
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、鎖短縮により所与の鎖長の脂肪アシルＣｏＡの利用可能性を高めるためにさらに改変される。理論に拘束されるものではないが、このような改変は、所望の炭素鎖長を有する、特に炭素鎖長１２を有する基質の利用可能性を高めると予想され、これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよびＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの産生が増加され得る。これは、微生物産生細胞における天然のアシルＣｏＡオキシダーゼの活性を低下させることにより、および特定のアシルＣｏＡオキシダーゼ、デサチュラーゼ、レダクターゼ、およびアセチルトランスフェラーゼを発現させることにより達成できる。このような改変は、欧州特許第１９１５７９１０．１号（同じ出願人によって２０１９年２月１９日に出願）に詳細に記載されている。
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、鎖短縮により所与の鎖長の脂肪アシルＣｏＡの利用可能性を高めるためにさらに改変される。理論に拘束されるものではないが、このような改変は、所望の炭素鎖長を有する、特に炭素鎖長１２を有する基質の利用可能性を高めると予想され、これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよびＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの産生が増加され得る。これは、微生物産生細胞における天然のアシルＣｏＡオキシダーゼの活性を低下させることにより、および特定のアシルＣｏＡオキシダーゼ、デサチュラーゼ、レダクターゼ、およびアセチルトランスフェラーゼを発現させることにより達成できる。このような改変は、欧州特許第１９１５７９１０．１号（同じ出願人によって２０１９年２月１９日に出願）に詳細に記載されている。
【0193】
したがって、いくつかの実施形態では、酵母細胞は、本明細書で上記に記載の酵母細胞のいずれかであり、さらに、
ｉ）１つ以上の天然アシルＣｏＡオキシダーゼの活性の低下をもたらす１つ以上の変異を有し、かつ
ｉｉ）脂肪アシルＣｏＡを酸化できる少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼを含む酵素の少なくとも１つの群を発現し、酵素の群は、第１の炭素鎖長Ｘの脂肪アシルＣｏＡを第２の炭素鎖長Ｘ’を有する短縮された脂肪アシルＣｏＡに短縮でき、式中、Ｘ’≦Ｘ－２である。
ｉ）１つ以上の天然アシルＣｏＡオキシダーゼの活性の低下をもたらす１つ以上の変異を有し、かつ
ｉｉ）脂肪アシルＣｏＡを酸化できる少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼを含む酵素の少なくとも１つの群を発現し、酵素の群は、第１の炭素鎖長Ｘの脂肪アシルＣｏＡを第２の炭素鎖長Ｘ’を有する短縮された脂肪アシルＣｏＡに短縮でき、式中、Ｘ’≦Ｘ－２である。
【0194】
酵母細胞中に通常存在するアシルＣｏＡオキシダーゼ、すなわち天然の酵素（複数可）の活性は、そのような実施形態では、細胞内の酵素（複数可）をコードする遺伝子を変異させることにより低下されるまたは消失される。炭素鎖短縮を指示して所望の炭素鎖長の脂肪アルコールおよびその誘導体を得るために、１つ以上のアシルＣｏＡオキシダーゼが、酵母細胞中で発現される。これらのアシルｃｏＡオキシダーゼは、酵母細胞に固有のものであり得、またはこれらのアシルｃｏＡオキシダーゼは、別の生物に由来し得る。所与の鎖長の脂肪アシルＣｏＡを酸化するために必要な他の酵素をコードする遺伝子もまた、細胞がそれらをまだ発現していない場合、または増加された活性もしくは基質特異性が望まれる場合、細胞に導入され得る。このように発現されたアシルＣｏＡオキシダーゼ（複数可）は、脂肪性アシルＣｏＡが酸化され、基質よりも短い炭素鎖長を有する脂肪性アシルＣｏＡに短縮されることを可能にする。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上の天然アシルＣｏＡオキシダーゼの低下された活性は、Ｘよりも小さい、例えばＸ’よりも小さい炭素鎖長を有するアシルＣｏＡに対する低下された活性である。
【0195】
本開示におけるアシルＣｏＡオキシダーゼという用語は、以下の反応を触媒できる、ＥＣ番号１．３．３．６の酵素などの酵素を指す：
【化1】
【0196】
この酵素は、オキシドレダクターゼのファミリーに属しており、具体的には、アクセプターとして酸素を使用してドナーのＣＨ－ＣＨ基に作用する酵素である。この酵素クラスの体系的な名前は、アシルＣｏＡ：酸素２－オキシドレダクターゼである。他の名前の使用は、脂肪アシルＣｏＡオキシダーゼ、アシル補酵素Ａオキシダーゼ、および脂肪アシル－補酵素Ａオキシダーゼを含む。
【0197】
本開示の酵母細胞は、１つ以上の天然アシルＣｏＡオキシダーゼを有する酵母細胞から出発して操作されてよい。本明細書に開示される改変された酵母細胞は好ましくは、１つ以上の天然アシルＣｏＡオキシダーゼの低下された活性を有する。これは、その天然のアシルＣｏＡオキシダーゼの少なくとも１つの低下された活性をもたらす１つ以上の変異を有する酵母細胞を使用することにより達成できる。天然のアシルＣｏＡオキシダーゼは、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、または細胞質ゾルであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、すべての天然のアシルＣｏＡオキシダーゼの低下された活性をもたらす。低下された活性により、酵母細胞は変異により、上記の反応を触媒する能力、特にアシルＣｏＡを対応するトランス－２，３－デヒドロアシルＣｏＡに変換する低下された能力を有すると理解される。いくつかの実施形態では、「低下された能力」は、反応を触媒する能力が完全にまたは部分的に消失されることを意味する。いくつかの実施形態では、「低下された能力」は、反応を触媒する能力が、通常の状況下において、すなわち通常の能力を有する酵素を使用することにより、反応に使用できる基質のサブグループに限定されることを意味する。
【0198】
本開示の酵母細胞は、脂肪アシルＣｏＡを酸化できる少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼを含む酵素の少なくとも１つの群を発現し得る。酵素の群は、少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼに加えて、所与の炭素鎖長の脂肪アシルＣｏＡをより短い炭素鎖長の脂肪アシルＣｏＡに変換するために必要とされる他の酵素を含む。これらの他の酵素は好ましくは、酵母細胞に固有であり得る。このような実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼをコードする遺伝子の導入のみが、酵母細胞が酵素の群を発現するために必要とされる。
【0199】
アシルＣｏＡオキシダーゼが酵母細胞に固有である実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼは、例えば構成的もしくは誘導性プロモーターなどのプロモーター、またはアシルＣｏＡオキシダーゼの過剰発現を可能にするプロモーターの導入によって、当技術分野で知られているように改変され得る。第１の群の酵素に再導入された固有のアシルＣｏＡオキシダーゼは、改変された基質特異性などの、改変された活性および／または反応効率の増加などの、改変された活性を有する変異型であり得る。
【0200】
他の実施形態では、アシルＣｏＡオキシダーゼは、別の生物に由来する。第１の群の酵素に含まれるアシルＣｏＡは、酵母、真菌、昆虫、哺乳動物、鳥、または植物に由来するアシルＣｏＡオキシダーゼであり得、例えば第１の群の酵素は、酵母、真菌、昆虫、哺乳動物、鳥、または植物に由来する。例えば、アシルＣｏＡオキシダーゼは、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、サッカロマイセス、ヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ヒト（Ｈｏｍｏ）、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、およびラット（Ｒａｔｔｕｓ）から選択される属の生物に由来すし、例えば第１の群の酵素の少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼは、ヤロウイア、サッカロマイセス、ヤガ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、アスペルギルス、カボチャ、ヒト、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、およびラットから選択される属の生物に由来する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の群の酵素は、ヤロウイア・リポリティカ、サッカロミセス・セレビシエ、カブラヤガ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓまたはドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来のアシルＣｏＡオキシダーゼを含む。
【0201】
このように酵母細胞に導入されるアシルＣｏＡオキシダーゼは、ヤロウイア・リポリティカ、カブラヤガ、シロイヌナズナ、アスペルギルス・ニデュランス、セイヨウカボチャ、ホモサピエンス、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓまたはドブネズミに固有のアシルＣｏＡオキシダーゼであり得る。酵母細胞は、本明細書で上記に記載されたとおりであり得る。
【0202】
本開示の酵母細胞はしたがって、脂肪アシルＣｏＡを酸化できる少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼを含む酵素の少なくとも１つの群を発現し得、少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼは、以下の群から選択される：Ｙｌｉ＿ＰＯＸ１（ＸＰ＿５０４７０３）、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ２（ＸＰ＿５０５２６４）、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ３（ＸＰ＿５０３２４４）、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ４（ＸＰ＿５０４４７５）、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ５（ＸＰ＿５０２１９９）、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ６（ＸＰ＿５０３６３２）、Ａｓｅ＿ＰＯＸ（配列番号３９）、Ａｔｈ＿ＰＯＸ１（配列番号４１）、Ａｔｈ＿ＰＯＸ２（配列番号４３）、Ａｎｉ＿ＰＯＸ（配列番号４５）、Ｃｍａ＿ＰＯＸ（配列番号４７）、Ｈｓａ＿ＰＯＸ１－２（配列番号４９）、Ｐｕｒ＿ＰＯＸ（配列番号５１）、Ｓｃ＿ＰＯＸ１（配列番号３１）およびＲｎｏ＿ＰＯＸ２（配列番号５３）、またはそれらに対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、それらに対して、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するその機能的バリアント。
【0203】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼの発現は、少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼをコードする核酸を導入することによって達成される。例えば、酵母は、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ１をコードするＹＡＬＩ０＿Ｅ３２８３５ｇ、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ２をコードするＹＡＬＩ０＿Ｆ１０８５７ｇ、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ３をコードするＹＡＬＩ０＿Ｄ２４７５０ｇ、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ４をコードするＹＡＬＩ０＿Ｅ２７６５４ｇ、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ５をコードするＹＡＬＩ０＿Ｃ２３８５９ｇ、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ６をコードするＹＡＬＩ０＿Ｅ０６５６７ｇ、配列番号３８をコードするＡｓｅ＿ＰＯＸ、配列番号４０をコードするＡｔｈ＿ＰＯＸ１、配列番号４２をコードするＡｔｈ＿ＰＯＸ２、配列番号４４をコードするＡｎｉ＿ＰＯＸ、配列番号４６をコードするＣｍａ＿ＰＯＸ、配列番号４８をコードするＨｓａ＿ＰＯＸ、配列番号５０をコードするＰｕｒ＿ＰＯＸ、配列番号３０をコードするＳｃ＿ＰＯＸ１、または配列番号５２をコードするＲｎｏ＿ＰＯＸ２、またはそれらに対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するそれらの相同体を発現する。
【0204】
いくつかの実施形態では、Ｘ’＝１２である。
【0205】
好適なアシルＣｏＡオキシダーゼは、国際公開第２０２０／１６９３８９号（同じ出願人によって２０２０年２月１０日に出願）、特に「アシルＣｏＡオキシダーゼ（Ａｃｙｌ－ＣｏＡ ｏｘｉｄａｓｅ）」の項に詳細に記載されている。
【0206】
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりコドレモンを得るために、鎖短縮が利用される実施形態では、酵母細胞はしたがって、酵素の少なくとも１つの群に加えて、炭素鎖長ＸまたはＸ’を有する脂肪アシルＣｏＡ中のＥ／Ｚコンフォメーションに少なくとも１つの二重結合を導入できる追加の異種デサチュラーゼも発現し得る。ＸまたはＸ’は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個の炭素原子であり得る。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、Ｘ’の鎖長を有する脂肪アシルＣｏＡ中のＥ／Ｚコンフォメーションにおいて少なくとも１つの二重結合を導入でき、ここでＸ’は、上で定義されたとおりである。好適なデサチュラーゼは、国際公開第２０２０／１６９３８９号（同じ出願人によって２０２０年２月１０日に出願）、特に「デサチュラーゼ（ＦＡＤ）（Ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ （ＦＡＤ））」の項に詳細に記載されている。特に、Ｃ１４：ＣｏＡをＺ１１－Ｃ１４：ＣｏＡおよび／またはＥ１１－Ｃ１４：ＣｏＡに変換できるデサチュラーゼが対象である。例えば、ハスオビハマキ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｒｏｓａｃｅａｎａ）由来のデサチュラーゼＣｒｏＺ１１（配列番号６３）またはＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｐａｒａｌｌｅｌａ由来のＣｐａＥ１１（配列番号６５）、または、それらに対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、それらに対して、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性などを有するその機能的バリアントが、使用され得る。得られたＺ１１－Ｃ１４：ＣｏＡおよび／またはＥ１１－Ｃ１４：ＣｏＡは、さらに鎖を短縮されてＺ９－Ｃ１２：ＣｏＡおよび／またはＥ９－Ｃ１２：ＣｏＡを与え、これは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱによってさらに不飽和化されて、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡを与える。
【0207】
このような実施形態では、酵母細胞はしたがって、本明細書の上記の「デサチュラーゼ」の項に記載の少なくとも１つのデサチュラーゼ、例えば、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはＧｍｏ＿ＣＰＲＱ、好ましくは、その変異体または機能的バリアントであるＣｐｏ＿ＣＰＲＱを発現し、炭素鎖長ＸまたはＸ’を有する脂肪アシルＣｏＡ中のＥ／Ｚコンフォメーションに少なくとも１つの二重結合を導入できる追加の異種デサチュラーゼをさらに発現する。ここでＸおよびＸ’は、上記のとおりである。特に、デサチュラーゼは、炭素鎖長１４を有する脂肪アシルＣｏＡ中のＥ／Ｚコンフォメーションに少なくとも１つの二重結合を導入でき、それは次いで、本明細書で上記のとおり、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡへと短縮され得る。これは次いでＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡへとさらに不飽和化され、これは次に、本明細書で上記のとおり、ＦＡＲの作用によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換され得る。
【0208】
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートの産生方法
上記の酵母細胞は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意により、さらにＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換され得る、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを産生するための方法で使用され得る。
上記の酵母細胞は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意により、さらにＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換され得る、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを産生するための方法で使用され得る。
【0209】
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生するための方法
本明細書では、酵母細胞中でＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生するための方法が提供され、本方法は、酵母細胞を提供するステップと、培地中で酵母細胞をインキュベートするステップを含み、酵母細胞は、少なくとも１つの異種デサチュラーゼおよび任意により少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）を発現し、
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ｉｉ）任意による少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換でき、
これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生する。
本明細書では、酵母細胞中でＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生するための方法が提供され、本方法は、酵母細胞を提供するステップと、培地中で酵母細胞をインキュベートするステップを含み、酵母細胞は、少なくとも１つの異種デサチュラーゼおよび任意により少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）を発現し、
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ｉｉ）任意による少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換でき、
これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生する。
【0210】
酵母細胞は、本明細書で上に記載された酵母細胞のいずれかであり得る。
【0211】
本発明の方法では好ましくは、少なくとも０．２ｍｇ／Ｌの力価を有するＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａの産生を可能にする。いくつかの実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの力価は、少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．３ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．４ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５．０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２０ｍｇ／Ｌなど、２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｇ／Ｌなど、少なくとも２ｇ／Ｌなど、少なくとも３ｇ／Ｌなど、少なくとも４ｇ／Ｌなど、少なくとも５ｇ／Ｌなど、少なくとも６ｇ／Ｌなど、少なくとも７ｇ／Ｌなど、少なくとも８ｇ／Ｌなど、少なくとも９ｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｇ／Ｌであるまたはそれより大きい。
【0212】
本発明の方法は、少なくとも０．２ｍｇ／Ｌの力価で、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの産生を可能にする。いくつかの実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの力価は、少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．３ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．４ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５．０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２０ｍｇ／Ｌなど、２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｇ／Ｌなど、少なくとも２ｇ／Ｌなど、少なくとも３ｇ／Ｌなど、少なくとも４ｇ／Ｌなど、少なくとも５ｇ／Ｌなど、少なくとも６ｇ／Ｌなど、少なくとも７ｇ／Ｌなど、少なくとも８ｇ／Ｌなど、少なくとも９ｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｇ／Ｌであるまたはそれより大きい。
【0213】
力価を決定するための方法は、当技術分野で知られている。
【0214】
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを産生するための方法
いくつかの実施形態では、この方法は、アセチルトランスフェラーゼの発現によりまたは化学変換により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換するステップをさらに含む。したがって、本明細書では、酵母細胞において、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを産生するための方法が開示され、本方法は、
ａ）酵母細胞を提供しかつ培地中で酵母細胞をインキュベートするステップであって、酵母細胞は、少なくとも１つの異種デサチュラーゼと、少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）を発現し、
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ｉｉ）少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、
ステップと、
ｂ）Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換するステップ、
を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、アセチルトランスフェラーゼの発現によりまたは化学変換により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換するステップをさらに含む。したがって、本明細書では、酵母細胞において、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを産生するための方法が開示され、本方法は、
ａ）酵母細胞を提供しかつ培地中で酵母細胞をインキュベートするステップであって、酵母細胞は、少なくとも１つの異種デサチュラーゼと、少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）を発現し、
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ｉｉ）少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、
ステップと、
ｂ）Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換するステップ、
を含む。
【0215】
いくつかの実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートは、本明細書の上の「Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートの産生」において記載されるように酵母細胞を操作することによって得られる。
【0216】
他の実施形態では、細胞によって産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールのＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートへの変換は、当技術分野で知られているように、化学的に行われる。例えば、細胞によって産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールは、回収されてよく、その後、塩化アセチルが、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに添加され、混合され、例えば室温でインキュベートされ、これにより細胞によって産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部が、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換される。
【0217】
他の実施形態では、酵母細胞は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを産生し、これは、トリアシルグリセリドなどの脂質または遊離脂肪酸に変換され得、脂質または遊離脂肪酸を回収し、これが今度はＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換され得る。Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールは次に、上記のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールにさらに変換され得る。このような実施形態では、細胞によって産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールのＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートへの変換は、当技術分野で知られているように、化学的に行われる。
【0218】
本発明の方法はしたがって、少なくとも０．２ｍｇ／Ｌの力価を有するＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートの産生を可能にする。いくつかの実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートの力価は、少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．３ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．４ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５．０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２０ｍｇ／Ｌなど、２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｇ／Ｌなど、少なくとも２ｇ／Ｌなど、少なくとも３ｇ／Ｌなど、少なくとも４ｇ／Ｌなど、少なくとも５ｇ／Ｌなど、少なくとも６ｇ／Ｌなど、少なくとも７ｇ／Ｌなど、少なくとも８ｇ／Ｌなど、少なくとも９ｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｇ／Ｌなどである、またはそれより大きい。
【0219】
力価を決定するための方法は、当技術分野で知られている。
【0220】
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するための方法
いくつかの実施形態では、この方法は、酵母細胞をさらに操作することにより、または化学変換により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換するステップをさらに含む。したがって、本明細書では、酵母細胞においてＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するための方法が開示され、本方法は、
a) 酵母細胞を提供しかつ培地中で酵母細胞をインキュベートするステップであって、酵母細胞は、少なくとも１つの異種デサチュラーゼと、少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）を発現し、
i) 少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を、導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ii) 少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、
ステップと、
b) Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換するステップ
を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、酵母細胞をさらに操作することにより、または化学変換により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換するステップをさらに含む。したがって、本明細書では、酵母細胞においてＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するための方法が開示され、本方法は、
a) 酵母細胞を提供しかつ培地中で酵母細胞をインキュベートするステップであって、酵母細胞は、少なくとも１つの異種デサチュラーゼと、少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）を発現し、
i) 少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を、導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ii) 少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、
ステップと、
b) Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換するステップ
を含む。
【0221】
いくつかの実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールは、本明細書の上の「Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの産生」において記載されるように酵母細胞を操作することによって得られる。
【0222】
他の実施形態では、この方法は、化学変換によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換するステップを含む。化学変換は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールへのＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの酸化に基づく。この変換を実施するための方法は、当技術分野で知られている。好ましい方法は、環境に優しく、有害廃棄物の量を最小限に抑える。
【0223】
他の実施形態では、酵母細胞は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを産生し、これは、上記のように、トリアシルグリセリドなどの脂質または遊離脂肪酸に変換され得、これは次いで、回収され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換され得る。このような実施形態では、細胞によって産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールのＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールへの変換は、当技術分野で知られているように、化学的に行われる。
【0224】
したがって、いくつかの実施形態では、化学変換は、金属を含まなくてよく、マンガン酸化物、クロム酸化物（Ｊｏｎｅｓ ｏｘ．ＰＤＣ、ＰＣＣ）またはルテニウム化合物（ＴＰＡＰ，Ｌｅｙ－Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｏｘ．）などの有毒な重金属ベースの試薬を避ける。いくつかの実施形態では、変換は、スワーン酸化またはフィッツナー・モファット酸化などの活性化ジメチルスルホキシドを含む反応を伴わない。このような反応は、標的産生物から除去するのが困難であり得る硫化ジメチルなど、微量の強烈な臭いのある有機硫黄化合物のステレオタイプの形成（ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｉｃ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を伴い得る。いくつかの実施形態では、この方法は、デスマーチン反応を含む（Ｙａｄａｖ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。他の実施形態では、化学変換は、水性／有機二相条件下での次亜塩素酸ナトリウムによる酸化を含む（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。いくつかの実施形態では、化学酸化は、２５％のピリジンを含む塩化メチレンの培地中で１－クロロベンゾトリアゾールを用いて実施できる（Ｆｅｒｒｅｌｌ ａｎｄ Ｙａｏ、１９７２）。
【0225】
あるいは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールのＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールへの酸化は、アルコールデヒドロゲナーゼにより酵素的に実施できる。当業者であれば、酵素的酸化を実施する方法を知っているだろう。例えば、酵素酸化は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールと、精製酵素、細胞抽出物、または細胞全体を接触させることにより実施され得る。
【0226】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、少なくとも０．２ｍｇ／Ｌの力価を有するＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの産生を可能にする。いくつかの実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの力価は、少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．３ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．４ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２．５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５．０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２０ｍｇ／Ｌなど、２５ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも５００ｍｇ／Ｌなど、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌなど、少なくとも１ｇ／Ｌなど、少なくとも２ｇ／Ｌなど、少なくとも３ｇ／Ｌなど、少なくとも４ｇ／Ｌなど、少なくとも５ｇ／Ｌなど、少なくとも６ｇ／Ｌなど、少なくとも７ｇ／Ｌなど、少なくとも８ｇ／Ｌなど、少なくとも９ｇ／Ｌなど、少なくとも１０ｇ／Ｌであるまたはそれより大きい。
【0227】
力価を決定するための方法は、当技術分野で知られている。
【0228】
回収
いくつかの実施形態では、方法は、得られた産生物を回収するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、得られた産生物を回収するステップをさらに含む。
【0229】
いくつかの実施形態では、方法は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生するためであり、したがって産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを回収するステップをさらに含む。他の実施形態では、方法は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを産生するためであり、したがって産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを回収するステップをさらに含む。他の実施形態では、方法は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するためであり、したがって産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを回収するステップをさらに含む。
【0230】
本発明の方法によって得られた産生物を回収するための方法は、当技術分野で知られており、デカン、ヘキサンまたは植物油などの疎水性溶媒による抽出を含み得る。
【0231】
あるいは、出願ＰＣＴ／欧州特許第２０２０／０７６３５１号（同じ出願人によって２０２０年９月２２日に出願された）に記載された方法もまた、所望の生成物を回収するために使用できる。例えば、この方法は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａの変換から得られるトリアシルグリセリドまたは脂肪酸などの脂質を回収するために、または産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／もしくは産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを回収するために使用できる。この方法は、培養温度での培養培地などの水溶液中で測定された雲濃度以上、またはそれを超える量の抽出剤の培養培地への添加を利用し、これにより脂肪アルコール、脂肪アルコールアセテートおよび脂肪アルデヒドなどの疎水性化合物の回収を大いに容易にする。このような方法はしたがって、本発明の方法によって産生されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよびＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの変換から得られるトリアシルグリセリドなどの脂質または脂肪酸の回収を容易にするために有利に使用できる。さらに、培養培地中の抽出剤の添加もまた、細胞によって産生される疎水性化合物の力価を一般に増加させ、細胞からの産生された疎水性化合物の分泌を増加させることが見出された。
【0232】
したがって、いくつかの実施形態では、本方法で使用される培地は、培養温度で培養培地などの水溶液中で測定されるその雲濃度以上の量または雲濃度を超える量の抽出剤を含み、抽出剤は、非イオン性界面活性剤であり、好ましくは消泡剤などの非イオン性エトキシル化界面活性剤であり、好ましくはポリエチレンポリプロピレングリコール、ポリエーテル分散液の混合物、ならびにシメチコンなどのポリエチレングリコールモノステアレート、脂肪アルコールアルコキシレート、ポリエトキシル化界面活性剤を含む消泡剤、ならびにエトキシル化およびプロポキシル化Ｃ１６～Ｃ１８アルコールベースの消泡剤、ならびにそれらの組み合わせから選択されるポリエトキシル化界面活性剤である。
【0233】
水溶液中の雲濃度は、所与の温度で、好ましくは室温で、または発酵が行われる温度、例えば３０℃もしくは室温で決定される。本明細書で使用される「抽出剤」という用語は、非イオン性界面活性剤、特に発酵中に産生された疎水性化合物の回収を容易にする消泡剤を指す。例えば、非イオン性界面活性剤は、非イオン性エトキシル化界面活性剤、例えば、ポリエチレンポリプロピレングリコール、ポリエーテル分散液の混合物、ならびにシメチコンなどのポリエチレングリコールモノステアレート、脂肪アルコールアルコキシレート、ポリエトキシル化界面活性剤を含む消泡剤、ならびにエトキシル化およびプロポキシル化Ｃ１６～Ｃ１８アルコールベースの消泡剤、ならびにそれらの組み合わせから選択されるポリエトキシル化界面活性剤である。ＰＣＴ／欧州特許第２０２０／０７６３５１号の実施例７は、界面活性剤の雲濃度を決定する方法を記載する。
【0234】
好適な抽出剤および好適な量の非イオン性界面活性剤である非イオン性界面活性剤は、出願ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０７６３５１（同じ出願人によって２０２０年９月２２日に出願）、特に「（非イオン性界面活性剤）Ｎｏｎ－ｉｏｎｉｃ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ」と題された項に詳細に記載されている。
【0235】
いくつかの実施形態では、本方法で使用される培養培地はしたがって、エトキシル化およびプロポキシル化されたＣ１６～Ｃ１８アルコールベースの消泡剤、例えばＣ１６～Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレート（ＣＡＳ番号６８００２－９６－０）を含み、培養培地は、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＣ１６～Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレート、例えば少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＣ１６～Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレート、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌの、またはそれより多いＣ１６～Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレートを含む。
【0236】
他の実施形態では、本方法で使用される培養培地は、ポリエチレンポリプロピレングリコールである非イオン性界面活性剤、例えばＫｏｌｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ４０７（ＣＡＳ番号９００３－１１－６）であり、培養培地は、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ４０７などのポリエチレンポリプロピレングリコールの少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１１％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３５％ｖｏｌ／ｖｏｌの、またはそれより多いＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ４０７などのポリエチレンポリプロピレングリコールを含む。
【0237】
他の実施形態では、本方法で使用される培養培地は、消泡剤２０４などのポリエーテル分散液の混合物である非イオン性界面活性剤を含み、培養培地は、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのポリエーテル分散液の混合物を含み、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌの、またはそれより多い消泡剤２０４などのポリエーテル分散液の混合物を含む。
【0238】
他の実施形態では、本方法で使用される培養培地は、シメチコンなどのポリエチレングリコールモノステアレートを含む非イオン性界面活性剤を含み、培養培地は、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのポリエチレングリコールモノステアレートまたはシメチコン、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌの、またはそれより多いポリエチレングリコールモノステアレートまたはシメチコンを含む。
【0239】
他の実施形態では、本方法で使用される培養培地は、脂肪アルコールアルコキシレートである非イオン性界面活性剤を含み、培養培地は、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌの脂肪アルコールアルコキシレート、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌの、またはそれより多い脂肪アルコールアルコキシレートを含む。好適な脂肪アルコールアルコキシレートとしては、Ｐｌｕｒａｆａｃ（登録商標）ＬＦ３００（ＣＡＳ番号１９６８２３－１１－７）、Ｐｌｕｒａｆａｃ（登録商標）ＬＦ１３００（６８００２－９６－０）、Ｐｌｕｒａｆａｃ（登録商標）ＳＬＦ１８０（ＣＡＳ番号１９６８２３－１１－７）、Ｄｅｈｙｐｏｎ（登録商標）２５７４（ＣＡＳ番号６８１５４－９７－２）、およびＩｍｂｅｎｔｉｎ ＳＧ／２５１（ＣＡＳ番号６８００２－９６－０）、好ましくはＰｌｕｒａｆａｃ（登録商標）ＬＦ３００またはＤｅｈｙｐｏｎ（登録商標）２５７４が挙げられる。
【0240】
他の実施形態では、本方法で使用される培養培地は、Ａｇｎｉｑｕｅ ＢＰ４２０（ＣＡＳ番号６８００２－９６－０）である非イオン性界面活性剤を含み、培養培地は、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＡｇｎｉｑｕｅ ＢＰ４２０、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌの、またはそれより多いＡｇｎｉｑｕｅ ＢＰ４２０を含む。
【0241】
いくつかの実施形態では、培養培地は、その雲濃度より少なくとも５０％、例えば少なくとも１００％、例えば少なくとも１５０％、例えば少なくとも２００％、例えば少なくとも２５０％、例えば少なくとも３００％、例えば少なくとも３５０％、例えば少なくとも４００％、例えば少なくとも５００％、例えば少なくとも７５０％、例えば少なくとも１０００％、またはそれ以上多い量の抽出剤を含む。および／または培養培地は、その雲濃度の少なくとも２倍、例えばその雲濃度の少なくとも３倍、例えばその雲濃度の少なくとも４倍、例えばその雲濃度の少なくとも５倍、例えばその雲濃度の少なくとも６倍、例えばその雲濃度の少なくとも７倍、例えばその雲濃度の少なくとも８倍、例えばその雲濃度の少なくとも９倍、例えばその雲濃度の少なくとも１０倍、例えばその雲濃度の少なくとも１２．５倍、例えばその雲濃度の少なくとも１５倍、例えばその雲濃度の少なくとも１７．５倍、例えばその雲濃度の少なくとも２０倍、例えばその雲濃度の少なくとも２５倍、例えばその雲濃度の少なくとも３０倍の量の抽出剤を含む。
【0242】
抽出剤、すなわちポリエトキシル化界面活性剤などの非イオン性界面活性剤、例えば本明細書に記載の非イオン性界面活性剤、消泡剤またはポリエトキシル化界面活性剤のいずれかの添加は、発酵ブロス中のエマルジョンの産生をもたらし、ここで微生物によって産生される疎水性化合物、すなわち、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを変換することによって得られる脂質または遊離脂肪酸）、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールは、エマルジョン中に存在する。本発明の方法が抽出剤を含む培養培地を用いて実施される実施形態において、方法はしたがって、エマルジョンを破壊して抽出剤および疎水性化合物を含む産生物相を回収するステップも含み得る。エマルジョンが破壊されると、発酵ブロスは、３つの相：主に水および水性化合物を含む水相、細胞および細胞破片を含む相、ならびに主に抽出剤およびＥ８，Ｅ１０ドデカジエニル補酵素Ａ（またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを変換することによって得られる脂質または遊離脂肪酸）、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを含む産生物相、に分離される。したがって、３つの相からなる組成物が得られる。これは、出願ＰＣＴ／欧州特許第２０２０／０７６３５１号（同じ出願人によって２０２０年９月２２日に出願）、特に「疎水性化合物を含む産生物相（Ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｈａｓｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」と題された項に詳細に記載される。
【0243】
いくつかの実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを変換することによって得られる脂質または遊離脂肪酸）のほとんど、ならびに任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールのほとんどは、産生物相中に存在する。例えば、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを変換することによって得られる脂質または遊離脂肪酸）、ならびに任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの少なくとも５０％は、産生物相中に存在し、例えばＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを変換することによって得られる脂質または遊離脂肪酸）、ならびに任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの少なくとも５５％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％は、産生物相中に存在する。いくつかの実施形態では、産生物相は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを変換することによって得られる脂質または遊離脂肪酸）、ならびに任意により最初に発酵ブロス中に存在したＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの少なくとも５０％、例えばＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを変換することによって得られる脂質または遊離脂肪酸）、ならびに任意により最初に発酵ブロス中に存在したＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールの少なくとも５５％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％を含む。
【0244】
エマルジョンを破壊するステップは、当技術分野で知られているように、例えばエマルジョンを相分離のステップに供することにより、例えば遠心分離により実施できる。
【0245】
エマルジョンを破壊するステップの後、抽出剤と、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを変換することによって得られる脂質または遊離脂肪酸、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテート、および／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを含む産生物相を、組成物から回収できる。この方法は、このような実施形態では、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを変換することによって得られる脂質または遊離脂肪酸、および任意により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを抽出剤から分離するステップを、さらに含み得る。これは、蒸留、例えば減圧下での蒸留、またはカラム精製、または任意の他の好適な方法などの当技術分野で知られている方法によって実施できる。抽出剤は、発酵槽またはバイオリアクターに再循環されてよい。
【0246】
核酸構築物
酵母細胞を改変するための核酸構築物も提供され、構築物は、
ｉ）炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換する少なくとも１つの異種デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドであって、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部が、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）である、第１のポリヌクレオチドと；
ｉｉ）任意により、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換できる少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）をコードする第２のポリヌクレオチドであって、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、第２のポリヌクレオチド、
を含む。
酵母細胞を改変するための核酸構築物も提供され、構築物は、
ｉ）炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換する少なくとも１つの異種デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドであって、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部が、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）である、第１のポリヌクレオチドと；
ｉｉ）任意により、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換できる少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）をコードする第２のポリヌクレオチドであって、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、第２のポリヌクレオチド、
を含む。
【0247】
核酸構築物を使用して、本明細書に記載の酵母細胞、すなわちＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる酵母細胞、を得ることができる。「核酸構築物」という用語は、本明細書では、単一の物理的実体、すなわち単一の分子、例えば第１のポリヌクレオチドおよび任意により第２のポリヌクレオチドが含まれるベクターまたはプラスミドを指し得るか、または複数の核酸分子を指し得、例えば第１のポリヌクレオチドは、１つのプラスミドまたはベクター内に含まれ、第２のポリヌクレオチドは別のプラスミドまたはベクター内に含まれる。
【0248】
核酸構築物は、
ｉｉｉ）異種シトクロムｂ５をコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号３に示されるポリヌクレオチド、または配列番号３に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体；
ｉｖ）異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号２３に示されるポリヌクレオチドまたは配列番号２３に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体など；
ｖ）ヘモグロビンをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号５に示されるポリヌクレオチド、または配列番号５に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体など；および／または
ｖｉ）チオエステラーゼをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号２５または配列番号３４に示されるポリヌクレオチド、または配列番号２５もしくは配列番号３４に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体
の１つ以上をさらに含み得る。
ｉｉｉ）異種シトクロムｂ５をコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号３に示されるポリヌクレオチド、または配列番号３に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体；
ｉｖ）異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号２３に示されるポリヌクレオチドまたは配列番号２３に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体など；
ｖ）ヘモグロビンをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号５に示されるポリヌクレオチド、または配列番号５に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体など；および／または
ｖｉ）チオエステラーゼをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号２５または配列番号３４に示されるポリヌクレオチド、または配列番号２５もしくは配列番号３４に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体
の１つ以上をさらに含み得る。
【0249】
ポリヌクレオチドは、上記の遺伝子のいずれかのいくつかのコピーを含み得、それらが導入される酵母細胞における適切な発現のためにコドン最適化され得る。
【0250】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）、上記のＣｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）または配列番号２に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントである。そのような実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、上記のように、配列番号１または配列番号１に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体を含む。
【0251】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、８５位に変異を有するＣｐｏ＿ＣＰＲＱ変異体などの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、またはそれに対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、変異は、Ｓ８５Ａ変異である。いくつかの実施形態では、デサチュラーゼは、８２位に変異を有するＣｐｏ＿ＣＰＲＱ変異体などの変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱである。いくつかの実施形態では、変異は、Ｓ８２Ａ変異体、またはそれに対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントである。
【0252】
他の実施形態では、少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）、上記のＧｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）または配列番号７７に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントである。そのような実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、上記のように、配列番号７８または配列番号１に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体を含む。
【0253】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、炭素鎖長１２の脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入できるいくつかのデサチュラーゼを発現する。そのような実施形態では、好ましくはいくつかのデサチュラーゼの少なくとも１つは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ、それらの変異体、または本明細書に詳述されるその機能的バリアントであり、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１、または配列番号１に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体を含むか、またはそれからなる。核酸構築物は、そのような実施形態において、それぞれが上記のようにデサチュラーゼをコードするさらなる第１のポリヌクレオチドを含み得る。例えば、核酸構築物は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱまたはそれらの相同体をコードする第１のポリヌクレオチドを含み、さらなるデサチュラーゼ、好ましくはＣｐｏ＿ＮＰＶＥ（配列番号６７）またはＣｐｏ＿ＳＰＴＱ（配列番号６９）、またはそれらに対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントをコードするさらなる第１のポリヌクレオチドをさらに含む。したがって、いくつかの実施形態では、さらなる第１のポリヌクレオチドは、配列番号６６または配列番号６８、または配列番号６６もしくは配列番号６８に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するそれらの相同体を含む。
【0254】
核酸構築物はまた、ＦＡＲをコードする第２のポリヌクレオチドを含み得る。ＦＡＲは好ましくは、ヤガ属、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ属、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ属またはＣｙｄｉａ属の昆虫に固有のＦＡＲなどの昆虫ＦＡＲである。例えば、ＦＡＲは、カブラヤガ、タマナヤガ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｕｂｆｌｅｘａ、タバコガ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、またはコドリンガに固有である。
【0255】
いくつかの実施形態では、ＦＡＲは、Ａｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、すなわちカブラヤガ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ａｓｅ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、それは、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。例えば、機能的バリアントは、それに対して少なくとも６５％の相同性または同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＦＡＲは、１９８位または４１３位に変異を有する変異体などの、変異体Ａｓｅ＿ＦＡＲである。いくつかの実施形態では、Ａｓｅ＿ＦＡＲ変異体は、Ｔ１９８Ａ変異体である。他の実施形態では、Ａｓｅ＿ＦＡＲ変異体は、Ｓ４１３Ａ変異体である。このような実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、配列番号９もしくは配列番号９に対して少なくとも６０％の相同性もしくは同一性を有するその相同体を含むかまたはそれらからなる。
【0256】
他の実施形態では、ＦＡＲは、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、すなわちタマナヤガ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ａｉｐ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、それは、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。このような実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、配列番号６０もしくは配列番号６０に対して少なくとも６０％の相同性もしくは同一性を有するその相同体を含むかまたはそれらからなる。
【0257】
他の実施形態では、ＦＡＲは、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、すなわちＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｕｂｆｌｅｘａ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ｈｓ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、それは、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。このような実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、配列番号７０もしくは配列番号７０に対して少なくとも６０％の相同性もしくは同一性を有するその相同体を含むかまたはそれらからなる。
【0258】
他の実施形態では、ＦＡＲは、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、すなわちタバコガ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ｈａｓ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、それは、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。このような実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、配列番号７２もしくは配列番号７２に対して少なくとも６０％の相同性もしくは同一性を有するその相同体を含むかまたはそれらからなる。
【0259】
他の実施形態では、ＦＡＲは、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、すなわちＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ｈｖ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、それは、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。このような実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、配列番号７４もしくは配列番号７４に対して少なくとも６０％の相同性もしくは同一性を有するその相同体を含むかまたはそれらからなる。
【0260】
他の実施形態では、ＦＡＲは、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）、すなわちオオタバコガ中で自然に発生するＦＡＲである。いくつかの実施形態では、異種ＦＡＲは、Ｈａｒ＿ＦＡＲの機能的バリアントであり、それは、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。このような実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、配列番号１３もしくは配列番号１３に対して少なくとも６０％の相同性もしくは同一性を有するその相同体を含むかまたはそれらからなる。
【0261】
他の実施形態では、ＦＡＲは、コドリンガＦＡＲ、例えばＣｐｏ＿ＦＡＲまたはその機能的バリアントであり、それは、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡをＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換する能力を保持する。このような実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、配列番号７５もしくは配列番号７５に対して少なくとも６０％の相同性もしくは同一性を有するその相同体を含むかまたはそれらからなる。
【0262】
いくつかのＦＡＲを発現することが望ましい実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、それぞれが１つのＦＡＲをコードする複数の第２のポリヌクレオチドであり得る。
【0263】
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチドを含み、これらは、第１および／または第２のポリヌクレオチドとは異なる核酸分子であり得るか、または第１および／または第２のポリヌクレオチドと同じ核酸分子の一部であり得る。
【0264】
いくつかの実施形態でさらなるポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるシトクロムｂ５などの、異種シトクロムｂ５または配列番号３に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体をコードする。いくつかの実施形態では、シトクロムｂ５は、鱗翅目種に固有のシトクロムｂ５である。特定の実施形態では、シトクロムｂ５は、配列番号４に示されるような、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種由来のシトクロムｂ５、好ましくはオオタバコガ由来のシトクロムｂ５、または配列番号４に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントである。このような実施形態では、さらなるポリヌクレオチドは、配列番号３もしくは配列番号３に対して少なくとも６０％の相同性を有するその相同体を含むかまたはそれらからなる。
【0265】
いくつかの実施形態でさらなるポリヌクレオチドは、配列番号２４に示されるシトクロムｂ５レダクターゼなどの、異種シトクロムｂ５レダクターゼまたは配列番号２４に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体をコードする。いくつかの実施形態では、シトクロムｂ５レダクターゼは、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種に固有のシトクロムｂ５レダクターゼである。特定の実施形態では、シトクロムｂ５レダクターゼは、配列番号２４に示されるような、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種由来のシトクロムｂ５レダクターゼ、好ましくはオオタバコガ由来のシトクロムｂ５レダクターゼ、または配列番号２４に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントである。このような実施形態では、さらなるポリヌクレオチドは、配列番号２３もしくは配列番号２３に対して少なくとも６０％の相同性を有するその相同体を含むかまたはそれらからなる。
【0266】
いくつかの実施形態では、さらなるポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるヘモグロビンなどの、異種ヘモグロビンまたは配列番号６に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体をコードする。いくつかの実施形態では、ヘモグロビンは、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ種に固有のヘモグロビンである。特定の実施形態では、ヘモグロビンは、配列番号６に示されるような、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉａ由来のヘモグロビン、配列番号６に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントである。このような実施形態では、さらなるポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号５に対して少なくとも６０％の相同性を有するその相同体を含むかまたはそれらからなる。
【0267】
いくつかの実施形態では、さらなるポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるチオエステラーゼなどの、チオエステラーゼまたは配列番号６に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体をコードする。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、クフェア種、ニッケイ種、またはエシェリキア種に固有である。特定の実施形態では、チオエステラーゼは、それぞれ、配列番号３３、配列番号５７、配列番号３５または配列番号２６に示されるような、Ｃｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、クフェア・フッケリアナ、クスノキ、または大腸菌、またはそれらに対して少なくとも６０％の相同性もしくは同一性を有するその機能的バリアント由来のヘモグロビンである。このような実施形態では、さらなるポリヌクレオチドは、配列番号３４、配列番号５６、配列番号３４または配列番号２５、またはそれらに対して少なくとも６０％の相同性を有するその相同体を含むか、またはそれらからなる。
【0268】
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、上記のような第１のポリヌクレオチド、および任意により上記のような第２のポリヌクレオチドを含み、上記の１つ以上のさらなるポリヌクレオチドをさらに発現する。したがって、いくつかの実施形態では、核酸構築物は、第１のポリヌクレオチドおよび任意により第２のポリヌクレオチドを含み、以下の１つをさらに含む：
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；または
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；または
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；または
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド。
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；または
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；または
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；または
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド。
【0269】
他の実施形態では、核酸構築物は、第１のポリヌクレオチドおよび任意により第２のポリヌクレオチドを含み、さらに以下を含む：
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または；
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または；
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または；
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド。
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または；
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または；
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または；
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド。
【0270】
他の実施形態では、核酸構築物は、第１のポリヌクレオチドおよび任意により第２のポリヌクレオチドを含み、さらに以下を含む：
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド。
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；
または
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド。
【0271】
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、第１のポリヌクレオチドおよび任意により第２のポリヌクレオチドを含み、以下のすべてをさらに含む：
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド。
－異種シトクロムｂ５をコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－ヘモグロビンをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド；と
－チオエステラーゼをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド。
【0272】
核酸構築物は、本明細書の上記の追加の改変のいずれかを酵母細胞に導入するための追加のポリヌクレオチド、特に酵母細胞に導入時に、天然の脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ、脂肪アルコールオキシダーゼ、ペルオキシソーム生合成因子および／または脂肪アシルシンターゼの改変された活性（好ましくは、活性は低下されるまたは消失される）をもたらすポリヌクレオチド、をさらに含み得る。
【0273】
核酸構築物は、当技術分野で知られているように、ポリヌクレオチドに含まれるコード配列の上流に位置するプロモーター、例えば誘導性、抑制性または構成的プロモーターなどの、その中に含まれるポリヌクレオチドの発現に必要とされるまたはこれらの発現を容易にする追加のエレメントを含み得る。
【0274】
フェロモン組成物としての製剤
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、当技術分野で知られるとおり、フェロモン組成物として酵母細胞によって産生されるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを配合するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、当技術分野で知られるとおり、フェロモン組成物として酵母細胞によって産生されるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを配合するステップをさらに含む。
【0275】
本発明の方法によって得ることができるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナール
本開示はまた、本発明の方法によって得ることができるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを変換することによって得られる脂質または遊離脂肪酸）、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールも提供する。酵母細胞中で昆虫デサチュラーゼおよび／またはレダクターゼを発現させる場合、結果として生じる産生物の混合物、例えばＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを含み細胞によって産生される脂肪アルコールは、昆虫のフェロモン腺で産生されるものと同様の組成を典型的に有する。これは、適切な比率で後で混合する必要がある個々のフェロモン成分を別々のプロセスで産生する代わりに、様々な昆虫に好適なフェロモン混合物の産生を可能にする。それにもかかわらず、結果として生じる産生物、例えばＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび／または脂肪アルコール、の混合物は、生物学的産生の特徴的な副産物を含み得る。
本開示はまた、本発明の方法によって得ることができるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａを変換することによって得られる脂質または遊離脂肪酸）、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールも提供する。酵母細胞中で昆虫デサチュラーゼおよび／またはレダクターゼを発現させる場合、結果として生じる産生物の混合物、例えばＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを含み細胞によって産生される脂肪アルコールは、昆虫のフェロモン腺で産生されるものと同様の組成を典型的に有する。これは、適切な比率で後で混合する必要がある個々のフェロモン成分を別々のプロセスで産生する代わりに、様々な昆虫に好適なフェロモン混合物の産生を可能にする。それにもかかわらず、結果として生じる産生物、例えばＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび／または脂肪アルコール、の混合物は、生物学的産生の特徴的な副産物を含み得る。
【0276】
したがって、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａの産生が実施されるいくつかの実施形態では、産生される脂肪アシルＣｏＡは、所望の脂肪アシルＣｏＡとは別の位置に不飽和を有する不飽和脂肪アシルＣｏＡを少なくとも１％、例えば少なくとも２％、例えば少なくとも３％、例えば少なくとも４％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％含む。および／または対応する飽和脂肪アシルＣｏＡを少なくとも１％、例えば少なくとも２％、例えば少なくとも３％、例えば少なくとも４％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％含む。
【0277】
Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの産生が実施される実施形態では、産生される脂肪アルコールは、所望の脂肪アルコールとは別の位置に不飽和を有する不飽和脂肪アルコールを少なくとも１％、例えば少なくとも２％、例えば少なくとも３％、例えば少なくとも４％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％含み、および／または対応する飽和脂肪アルコールを少なくとも１％、例えば少なくとも２％、例えば少なくとも３％、例えば少なくとも４％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％含む。発酵ブロスから回収された脂肪アルコールの混合物がアルデヒドへと化学的に酸化されるか、または酢酸塩へとアセチル化される場合、アルデヒドおよび酢酸塩の対応する混合物が産生される。
【0278】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するためである。いくつかの実施形態では、本酵母細胞および方法は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを含むが奇数鎖脂肪アルデヒドも含む脂肪アルデヒドの混合物の産生をもたらす。「奇数鎖」脂肪アルデヒドという用語は、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３個の炭素原子などの、奇数の炭素原子である炭素鎖長を有する脂肪アルデヒドを指す。「偶数鎖」脂肪アルデヒドという用語は、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２個の炭素原子などの、偶数の炭素原子である炭素鎖長を有する脂肪アルデヒドを指す。
【0279】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを産生するためである。いくつかの実施形態では、本酵母細胞および方法は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを含むが奇数鎖脂肪アルコールアセテートも含む脂肪アルコールアセテートの混合物の産生をもたらす。「奇数鎖」脂肪アルコールアセテートという用語は、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、または２３個の炭素原子などの、奇数の炭素原子である炭素鎖長を有する脂肪アルコールアセテートを指す。「偶数鎖」脂肪アルコールアセテートという用語は、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２個の炭素原子などの、偶数の炭素原子である炭素鎖長を有する脂肪アルコールアセテートを指す。
【0280】
フェロモン組成物
酵母細胞によって産生されるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールは、当業者において既知のとおり、フェロモン組成物として配合され得る。このようなフェロモン組成物は、害虫の存在を監視する方法または害虫の交配を妨害する方法において使用できる、総合的病害虫管理産生物として使用され得る。
酵母細胞によって産生されるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールは、当業者において既知のとおり、フェロモン組成物として配合され得る。このようなフェロモン組成物は、害虫の存在を監視する方法または害虫の交配を妨害する方法において使用できる、総合的病害虫管理産生物として使用され得る。
【0281】
本明細書に開示のフェロモン組成物は、生物農薬として使用され得る。このような組成物は、培養物、畑、または果樹園で、噴霧または分配できる。これらの組成物はまた、当技術分野で知られているとおり、例えばゴム製セプタムに浸すか、または他の成分と混合できる。これは、交配の妨害をもたらし、それにより害虫の繁殖を妨げることができるか、または害虫を捕獲するために捕獲デバイスと組み合わせて使用できる。本発明のフェロモン組成物を使用できる害虫の非限定的な例は、オオタバコガ（ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）（オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ））、縞模様シンクイムシ（ｓｔｒｉｐｅｄ ｓｔｅｍｂｏｒｅｒ）（ニカメイガ、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ）、コナガ（ｄｉａｍｏｎｄ ｂａｃｋ ｍｏｔｈ）（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、キャベツ蛾（ヨトウガ、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、大きいキャベツ葉の幼虫（ケブカノメイガ、Ｃｒｏｃｉｄｏｌｏｍｉａ ｂｉｎｏｔａｌｉｓ）、欧州トウモロコシストークボーラー（セサミア・ノナグリオイデス、Ｓｅｓａｍｉａ ｎｏｎａｇｒｉｏｉｄｅｓ）、スカシバガ（ｃｕｒｒａｎｔ ｃｌｅａｒｗｉｎｇ）（スグリコスカシバ、Ｓｙｎａｎｔｈｅｄｏｎ ｔｉｐｕｌｉｆｏｒｍｉｓ）、およびアーティチョークトリバガ（ａｒｔｉｃｈｏｋｅ ｐｌｕｍｅ ｍｏｔｈ）（Ｐｌａｔｙｐｔｉｌｉａ ｃａｒｄｕｉｄａｃｔｙｌａｌ）である。したがって、培養物での本組成物の使用は、実質的に環境へ影響を与えることなく、作物収量の増加をもたらし得る。
【0282】
本発明のフェロモン組成物中の異なる化合物の相対量は、作物の性質および／または防除される害虫の性質に応じて変化し得、地理的変動も存在し得る。最適な相対量を決定することはしたがって、、定期的な最適化を必要とし得る。
【0283】
本開示のいくつかの実施形態では、フェロモン組成物は、液体または固体の担体または基質などの１つ以上の追加の化合物をさらに含み得る。例えば、好適な担体または基質としては、植物油、精製鉱油またはそれらの画分、ゴム、プラスチック、シリカ、珪藻土、ワックスマトリックスおよびセルロース粉末が挙げられる。
【0284】
フェロモン組成物は、当技術分野で知られているように配合され得る。例えば、それは、溶液、ゲル、粉末の形態であり得る。フェロモン組成物は、当技術分野で知られているように、それが容易に分配され得るように配合され得る。
【0285】
キット
本明細書で提供されるのは、本方法を実行するための部品のキットである。部品のキットは、本明細書に記載されるように「すぐに使用できる」酵母細胞を含み得る。一実施形態では、酵母細胞は、ヤロウイア・リポリティカ細胞などのヤロウイア細胞、またはサッカロミセス・セレビシエ細胞などのサッカロミセス細胞である。
本明細書で提供されるのは、本方法を実行するための部品のキットである。部品のキットは、本明細書に記載されるように「すぐに使用できる」酵母細胞を含み得る。一実施形態では、酵母細胞は、ヤロウイア・リポリティカ細胞などのヤロウイア細胞、またはサッカロミセス・セレビシエ細胞などのサッカロミセス細胞である。
【0286】
あるいは、部品のキットはまた、酵母細胞に導入される目的の活性をコードする核酸構築物を含み得る。核酸構築物は、複数のベクターなどの、複数の核酸構築物として提供され得、各ベクターは、１つまたはいくつかの所望の活性をコードする。有用な核酸構築物は、上に記載されている。
【0287】
部品のキットはまた、本明細書で上記に記載された変異のいずれかなどの機能の部分的または完全な喪失をもたらす変異を導入するのに有用な核酸構築物を含み得る。
【0288】
部品のキットは任意により、改変される酵母細胞を含み得る。
【0289】
いくつかの実施形態では、部品のキットは上記のすべてを含む。
【0290】
害虫の存在を監視するためのまたは害虫の交配を妨害するための方法
酵母細胞によって産生されるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールおよび本明細書に開示される方法は、害虫の存在を監視する、または害虫の交配を妨害するための方法で使用できる。
酵母細胞によって産生されるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールおよび本明細書に開示される方法は、害虫の存在を監視する、または害虫の交配を妨害するための方法で使用できる。
【0291】
したがって、本明細書では、害虫の存在を監視する、または害虫の交配を妨害する方法も提供され、本方法は、以下のステップを含む：
i)本明細書に記載の方法により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するステップと；
ii)フェロモン組成物として、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを配合するステップと；
iii)総合的病害虫管理組成物としてフェロモン組成物を使用するステップ、
を含む。
i)本明細書に記載の方法により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するステップと；
ii)フェロモン組成物として、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを配合するステップと；
iii)総合的病害虫管理組成物としてフェロモン組成物を使用するステップ、
を含む。
【0292】
本明細書の上に記載の酵母細胞および方法のいずれかは、このような方法において使用できる。
【0293】
実施例
実施例１：バイオブリックの構築
すべての異種遺伝子は、ヤロウイア・リポリティカのコドン最適化版でＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成された。すべての遺伝子は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｕ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＰＣＲにより増幅されて、酵母発現ベクターにクローニングするための断片を得た。プライマーを表１に列挙し、得られたＤＮＡ断片（バイオブリック）を表２に列挙する。ＰＣＲ産物は、Ｍｉｄｏｒｉ Ｇｒｅｅｎ Ａｄｖａｎｃｅ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）含有１％アガロースゲル上で分離された。正確なサイズのＰＣＲ産物を、ゲルから切り出し、ＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎＧｅｌおよびＰＣＲＣｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。
実施例１：バイオブリックの構築
すべての異種遺伝子は、ヤロウイア・リポリティカのコドン最適化版でＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成された。すべての遺伝子は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｕ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＰＣＲにより増幅されて、酵母発現ベクターにクローニングするための断片を得た。プライマーを表１に列挙し、得られたＤＮＡ断片（バイオブリック）を表２に列挙する。ＰＣＲ産物は、Ｍｉｄｏｒｉ Ｇｒｅｅｎ Ａｄｖａｎｃｅ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）含有１％アガロースゲル上で分離された。正確なサイズのＰＣＲ産物を、ゲルから切り出し、ＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎＧｅｌおよびＰＣＲＣｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。
【表1】
【表2】
【0294】
実施例２：プラスミドの構築
ＵＳＥＲカセットを含む組み込み酵母ベクターを、３７℃で２時間ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＳｆａＡＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で線形化し、６５℃で１時間Ｎｂ．Ｂｓｍｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）でニックを入れた。粘着末端を含む得られたベクターを、ゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用してゲル精製した。ＤＮＡ断片を、Ｈｏｌｋｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７に記載のとおりＵＳＥＲクローニングにより、そのように調製したベクター中にクローニングした。反応物をコンピテント大腸菌 ＤＨα細胞中に化学的に形質転換し、細胞を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）寒天プレートにプレーティングした。プレートを、３７℃で一晩インキュベートし、得られたコロニーを、コロニーＰＣＲによりスクリーニングした。プラスミドを、一晩の大腸菌液体培養物から精製し、正確なクローニングを、配列決定により確認した。構築されたベクトルを表３に列挙する。
ＵＳＥＲカセットを含む組み込み酵母ベクターを、３７℃で２時間ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＳｆａＡＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で線形化し、６５℃で１時間Ｎｂ．Ｂｓｍｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）でニックを入れた。粘着末端を含む得られたベクターを、ゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用してゲル精製した。ＤＮＡ断片を、Ｈｏｌｋｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７に記載のとおりＵＳＥＲクローニングにより、そのように調製したベクター中にクローニングした。反応物をコンピテント大腸菌 ＤＨα細胞中に化学的に形質転換し、細胞を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）寒天プレートにプレーティングした。プレートを、３７℃で一晩インキュベートし、得られたコロニーを、コロニーＰＣＲによりスクリーニングした。プラスミドを、一晩の大腸菌液体培養物から精製し、正確なクローニングを、配列決定により確認した。構築されたベクトルを表３に列挙する。
【表3】
【0295】
実施例３：菌株の構築
酵母株を、Ｈｏｌｋｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７に記載のとおり、ＤＮＡベクターの形質転換によって構築した。組み込みベクターを、変換前にＦａｓｔＤｉｇｅｓｔＮｏｔＩで線形化した。必要に応じて、特定のゲノム領域への組み込みを促進するヘルパーベクターを、表４に列挙される組み込みプラスミドまたはＤＮＡ修復断片と同時形質転換した。菌株を、適切な抗生物質を選択した酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）寒天培地で選択した。正確な遺伝子型を、コロニーＰＣＲにより確認し、必要に応じてシーケンシングにより確認した。Ｙ．リポリティカ野生型株を、プラスミドｐＣｆＢ６３６４（ＥＰ１９２０４５５４）で形質転換し、ＳＴ６０２９株を作製し、次に遺伝子ＨＦＤ１（ＹＡＬＩ０＿Ｆ２３７９３ｇ）、ＨＦＤ２（ＹＡＬＩ０＿Ｅ１５４００ｇ）、ＨＦＤ３（ＹＡＬＩ０＿Ａ１７８７５ｇ）、ＨＦＤ４（ＹＡＬＩ０＿Ｂ０１２９８ｇ）、ＦＡＯ１（ＹＡＬＩ０＿Ｂ１４０１４ｇ）、およびＰＥＸ１０（ＹＡＬＩ１＿Ｃ０１４１６ｇ）を欠失させ、ＳＴ６６２９株を作製した（Ｂｏｒｏｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。菌株ＳＴ６０２９およびＳＴ６６２９を、他のすべての菌株を構築するために、親菌株として使用した。得られた菌株を表５に列挙する。
酵母株を、Ｈｏｌｋｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７に記載のとおり、ＤＮＡベクターの形質転換によって構築した。組み込みベクターを、変換前にＦａｓｔＤｉｇｅｓｔＮｏｔＩで線形化した。必要に応じて、特定のゲノム領域への組み込みを促進するヘルパーベクターを、表４に列挙される組み込みプラスミドまたはＤＮＡ修復断片と同時形質転換した。菌株を、適切な抗生物質を選択した酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）寒天培地で選択した。正確な遺伝子型を、コロニーＰＣＲにより確認し、必要に応じてシーケンシングにより確認した。Ｙ．リポリティカ野生型株を、プラスミドｐＣｆＢ６３６４（ＥＰ１９２０４５５４）で形質転換し、ＳＴ６０２９株を作製し、次に遺伝子ＨＦＤ１（ＹＡＬＩ０＿Ｆ２３７９３ｇ）、ＨＦＤ２（ＹＡＬＩ０＿Ｅ１５４００ｇ）、ＨＦＤ３（ＹＡＬＩ０＿Ａ１７８７５ｇ）、ＨＦＤ４（ＹＡＬＩ０＿Ｂ０１２９８ｇ）、ＦＡＯ１（ＹＡＬＩ０＿Ｂ１４０１４ｇ）、およびＰＥＸ１０（ＹＡＬＩ１＿Ｃ０１４１６ｇ）を欠失させ、ＳＴ６６２９株を作製した（Ｂｏｒｏｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。菌株ＳＴ６０２９およびＳＴ６６２９を、他のすべての菌株を構築するために、親菌株として使用した。得られた菌株を表５に列挙する。
【表4】
【表5】
【0296】
実施例４：菌株の培養、脂肪酸メチルエステルおよび脂肪アルコールの抽出および分析
菌株を、２４ウェルプレート（ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ）で２．５ｍＬＹＰＧ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌペプトン、４０ｇ／Ｌグリセロール）中に０．１～０．２の初期ＯＤ６００へと、ＹＰＤ寒天プレート（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌペプトン、２０ｇ／Ｌグルコース、１５ｇ／Ｌ寒天）からを含む接種した。プレートを、２８℃でインキュベートし、３００ｒｐｍで振とうした。２２時間後に、プレートを、４℃、３，０００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を、廃棄し、細胞を、１．２５ｍＬ／ウェルの産生培地に再懸濁した（Ｂｏｒｏｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。培地に、２．５μＬのドデカン酸メチルを添加した。プレートを、２８℃で２８時間インキュベートし、３００ｒｐｍで振とうした。
菌株を、２４ウェルプレート（ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ）で２．５ｍＬＹＰＧ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌペプトン、４０ｇ／Ｌグリセロール）中に０．１～０．２の初期ＯＤ６００へと、ＹＰＤ寒天プレート（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌペプトン、２０ｇ／Ｌグルコース、１５ｇ／Ｌ寒天）からを含む接種した。プレートを、２８℃でインキュベートし、３００ｒｐｍで振とうした。２２時間後に、プレートを、４℃、３，０００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を、廃棄し、細胞を、１．２５ｍＬ／ウェルの産生培地に再懸濁した（Ｂｏｒｏｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。培地に、２．５μＬのドデカン酸メチルを添加した。プレートを、２８℃で２８時間インキュベートし、３００ｒｐｍで振とうした。
【0297】
脂肪アルコールの分析用に、２００μＬのブロスを、内部標準として９９０μＬの酢酸エチル：エタノール（８４：１５）および１０μＬのＺ１０－１７：Ｍｅ（２ｍｇ／ｍＬ）で抽出した。サンプルを、２０秒間ボルテックスし、室温で１時間インキュベート後、５分間ボルテックスした。３００μＬのＨ２Ｏを、各サンプルに添加した。サンプルを、ボルテックスし、２１℃、３，０００ｘｇで５分間遠心分離した。上部有機相を、ガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ－ＭＳ）によって分析した。ＧＣ－ＭＳ分析を、質量選択検出器ＨＰ５９７３に接続されたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ ＧＣで実施した。ＧＣは、ＩＮＮＯＷａｘカラム（３０ｍｘ０．２５ｍｍｘ０．２５μｍ）を備え、ヘリウムをキャリアガスとして使用した（平均速度：３３ｃｍ／秒）。ＭＳを、電子衝撃モード（７０ｅＶ）で作動し、ｍ／ｚ３０～４００でスキャンし、インジェクタを、２２０℃で、スプリットレスモードで構成した。オーブン温度を１分間、８０℃に設定し、次に１０℃／分の速度で２１０℃に上昇させ、その後２１０℃で１５分間保持し、その後１０℃／分の速度で２３０℃に上昇させ、２３０℃で２０分間保持した。化合物を、保持時間と質量スペクトルをラボコレクションで入手可能な参照化合物のものと比較することにより特定した。化合物を、記録された総イオン電流（ＴＩＣ）により定量化した。データを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアおよびｉＷｏｒｋＮｕｍｂｅｒｓにより分析した。
【0298】
脂肪酸の分析のために、各バイアルの１ｍＬを、４℃、３，０００ｘｇで５分間の遠心分離により回収した。各ペレットを、１０００μＬの１ＭＨＣｌを含むメタノール（無水）中で抽出した。サンプルを、２０秒間ボルテックスし、８０℃の水浴に２時間入れた。サンプルを、３０分ごとに１０秒間ボルテックスした。サンプルを、室温に冷却後、１０００μＬのメタノール（無水）中の１Ｍ ＮａＯＨ、５００μＬのＮａＣｌ飽和Ｈ２Ｏ、９９０μＬのヘキサン、１０μＬのＺ１０－１７：Ｍｅ（２ｍｇ／ｍＬ）を、内部標準として添加した。サンプルを、ボルテックスし、２１℃、３，０００ｘｇで５分間遠心分離した。上部有機相を、上記のようにＧＣ－ＭＳを介して分析した。
【0299】
実施例５：Ｙ．リポリティカ中でのＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨの産生
ＳＴ６６２９株に由来するＳＴ８４９４株は、オオタバコガ脂肪アシルレダクターゼＨａｒ＿ＦＡＲ（２つのコピー）およびコドリンガデサチュラーゼＣｐｏ＿ＣＰＲＱを発現する。ＳＴ６６２９株は、脂肪アルコールの分解および貯蔵脂質の蓄積を減少させるために操作されたＹ．リポリティカ株である（Ｈｏｌｋｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
ＳＴ６６２９株に由来するＳＴ８４９４株は、オオタバコガ脂肪アシルレダクターゼＨａｒ＿ＦＡＲ（２つのコピー）およびコドリンガデサチュラーゼＣｐｏ＿ＣＰＲＱを発現する。ＳＴ６６２９株は、脂肪アルコールの分解および貯蔵脂質の蓄積を減少させるために操作されたＹ．リポリティカ株である（Ｈｏｌｋｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
【0300】
菌株を、形成された脂肪アルコールの分析のために、６つのバイアル（１．２５ｍＬ）を組み合わせ４℃、３，０００ｇで５分間遠心分離することにより回収したことを除き、実施例４に記載のとおり培養、抽出、分析した。脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算した。
【0301】
デサチュラーゼＣｐｏＣＰＲＱおよび脂肪アルコールレダクターゼＨａｒＦＡＲの発現を組み合わせたＳＴ８４９４株は、低脂肪アルコール分解用に操作された株中で、４．４ｍｇ／ＬのＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨの産生を示した（表６）。
【表6】
【0302】
実施例６：Ｙ．リポリティカにおけるＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨの増加された産生
ＳＴ８４０６株は、ＳＴ６６２９株に由来し、ＣｐｏＣＰＲＱデサチュラーゼをさらに発現する。ＳＴ８４０６から派生したＳＴ９０６６株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの２つのコピーを発現する。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。脂肪酸メチルエステルおよび脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算した（表７～１０）。
ＳＴ８４０６株は、ＳＴ６６２９株に由来し、ＣｐｏＣＰＲＱデサチュラーゼをさらに発現する。ＳＴ８４０６から派生したＳＴ９０６６株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの２つのコピーを発現する。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。脂肪酸メチルエステルおよび脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算した（表７～１０）。
【0303】
コドリンガ（ＳＴ９０６６）由来のデサチュラーゼＣｐｏ＿ＣＰＲＱの追加コピーの発現は、それぞれ、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生の２．８倍および１．５倍の増加をもたらした（表７）。これは、デサチュラーゼの過剰発現が、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生の増加をもたらし得ることを示す。
【表7】
【0304】
コドリンガ由来のデサチュラーゼＣｐｏ＿ＣＰＲＱの発現と、オオタバコガ由来のシトクロムｂ５（ＨａｒＣｙｂ５、配列番号４）、またはＶ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉａ由来のヘモグロビン（ＶＨｂ、配列番号６）のいずれかの発現を組み合わせたＳＴ８４１１株およびＳＴ８４１６株は、コドリンガ由来のデサチュラーゼのみを発現する参照株ＳＴ８４０６よりもそれぞれ１８％および２２％多くのＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅを産生した。これらの株はまた、Ｅ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの増加された産生を示した（表８）。これらのデータは、シトクロムｂ５とのまたはヘモグロビンとのデサチュラーゼの発現が、デサチュラーゼのみを発現する株よりも多くのＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅを産生できることを示す。
【表8】
【0305】
オオタバコガ（ＨａｒＣｙｂ５）（ＳＴ８４１１株）由来のシトクロムｂ５に加えて、Ｖ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉａ（ＶＨｂ）（ＳＴ９１１５）由来のヘモグロビンの発現は、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの力価におけるさらなる２１％および４１％の改善をもたらした（表９）。これらのデータは、シトクロムｂ５およびヘモグロビンとのデサチュラーゼの共発現が、３つのうちの１つのみを発現する株よりも多くのＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅを産生できることを示す。
【表9】
【0306】
カブラヤガ（Ａｓｅ＿ＦＡＲ）由来の脂肪アシルレダクターゼを発現するＳＴ９２５０株は、Ｃ１２：ＯＨ、Ｅ９／Ｚ９－Ｃ１２：ＯＨおよびＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨの産生を示し、メンフクロウ（Ｔａ＿ＦＡＲ、配列番号８））由来の脂肪アシルレダクターゼを発現するＳＴ９２４９株は、Ｃ１２：ＯＨの産生のみを示した（表１０）。
【表10】
【0307】
実施例７：Δｅｌｏ１Ｙ．リポリティカ株におけるＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅの増加された産生
内因性Ｙ．リポリティカ遺伝子ＥＬＯ１（ＹＡＬＩ０＿Ｆ０６７５４ｇ、配列番号１３）を、ＳＴ８４０６株中で欠失させ、ＳＴ９０６０株をもたらした。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。脂肪酸メチルエステルの濃度を、内部標準に基づいて計算した（表１１）。ＳＴ９０６０株は、ＳＴ８４０６株と比較して、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生がそれぞれ２．２倍および１．６倍増加したことを示した。これらのデータは、エロンガーゼ遺伝子の欠失がＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生を増加させ得ることを示す。
内因性Ｙ．リポリティカ遺伝子ＥＬＯ１（ＹＡＬＩ０＿Ｆ０６７５４ｇ、配列番号１３）を、ＳＴ８４０６株中で欠失させ、ＳＴ９０６０株をもたらした。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。脂肪酸メチルエステルの濃度を、内部標準に基づいて計算した（表１１）。ＳＴ９０６０株は、ＳＴ８４０６株と比較して、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生がそれぞれ２．２倍および１．６倍増加したことを示した。これらのデータは、エロンガーゼ遺伝子の欠失がＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生を増加させ得ることを示す。
【表11】
【0308】
実施例８：遺伝子ＹＡＬＩ０＿Ｆ１４７２９ｇ、ＹＡＬＩ０＿Ｅ１８８７６ｇまたはＹＡＬＩ０＿Ｄ０３５９７ｇの欠失を含むＹ．リポリティカ株中でのＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅの増加された産生
すべて推定チオエステラーゼをコードする、内因性Ｙ．リポリティカ遺伝子ＹＡＬＩ０＿Ｆ１４７２９ｇ（配列番号１９）、ＹＡＬＩ０＿Ｅ１８８７６ｇ（配列番号５４）およびＹＡＬＩ０＿Ｄ０３５９７ｇ（配列番号５５）を、ＳＴ８４０６株において欠失させ、それぞれＳＴ９０６１株、ＳＴ９０６２株、およびＳＴ９０６３株をもたらした。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。脂肪酸メチルエステルの濃度を、内部標準に基づいて計算した（表１２）。ＳＴ９０６１株は、ＳＴ８４０６株と比較して、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生がそれぞれ１．６倍および１．７倍増加したことを示した。ＳＴ９０６２株は、ＳＴ８４０６株と比較して、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生がそれぞれ１．２倍および１．３倍増加したことを示した。ＳＴ９０６３株は、ＳＴ８４０６株と比較して、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生が１．１倍増加したことを示した。これらのデータは、内因性推定チオエステラーゼの欠失がＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生を増加させ得ることを示す。
すべて推定チオエステラーゼをコードする、内因性Ｙ．リポリティカ遺伝子ＹＡＬＩ０＿Ｆ１４７２９ｇ（配列番号１９）、ＹＡＬＩ０＿Ｅ１８８７６ｇ（配列番号５４）およびＹＡＬＩ０＿Ｄ０３５９７ｇ（配列番号５５）を、ＳＴ８４０６株において欠失させ、それぞれＳＴ９０６１株、ＳＴ９０６２株、およびＳＴ９０６３株をもたらした。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。脂肪酸メチルエステルの濃度を、内部標準に基づいて計算した（表１２）。ＳＴ９０６１株は、ＳＴ８４０６株と比較して、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生がそれぞれ１．６倍および１．７倍増加したことを示した。ＳＴ９０６２株は、ＳＴ８４０６株と比較して、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生がそれぞれ１．２倍および１．３倍増加したことを示した。ＳＴ９０６３株は、ＳＴ８４０６株と比較して、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生が１．１倍増加したことを示した。これらのデータは、内因性推定チオエステラーゼの欠失がＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生を増加させ得ることを示す。
【表12】
【0309】
実施例９：デサチュラーゼＣｐｏ＿ＣＰＲＱ中にアミノ酸改変を含むＹ．リポリティカ株中でのＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅの産生
タンパク質Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ中の８５位のアミノ酸を、ＳＴ８４０６株でセリン（Ｓ）からアラニン（Ａ）に改変し、ＳＴ９０７２株をもたらした。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。脂肪酸メチルエステルの濃度を、内部標準に基づいて計算した（表１３）。
タンパク質Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ中の８５位のアミノ酸を、ＳＴ８４０６株でセリン（Ｓ）からアラニン（Ａ）に改変し、ＳＴ９０７２株をもたらした。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。脂肪酸メチルエステルの濃度を、内部標準に基づいて計算した（表１３）。
【0310】
Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ＿Ｓ８５Ａを発現するＳＴ９０７２株は、ＳＴ８４０６株と比較して、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅの産生が２１３％増加したことを示した。これらのデータは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱを操作してＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅ、およびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生を増加させ得ることを示す。
【表13】
【0311】
実施例１０：デサチュラーゼＣｐｏ＿ＣＰＲＱ（Ｓ８５Ａ）のアミノ酸改変を他の有益な改変と組み合わせて含むＹ．リポリティカ株でのＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨの産生
ＳＴ９０６０から派生したＳＴ９２７８株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの２つのコピーおよびＥＬＯ１の欠失を含む。ＳＴ９０６０から派生したＳＴ９２７９株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの１つのコピー、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ＿Ｓ８５Ａの１つのコピー、およびＥＬＯ１の欠失を含む。
ＳＴ９０６０から派生したＳＴ９２７８株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの２つのコピーおよびＥＬＯ１の欠失を含む。ＳＴ９０６０から派生したＳＴ９２７９株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの１つのコピー、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ＿Ｓ８５Ａの１つのコピー、およびＥＬＯ１の欠失を含む。
【0312】
株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。脂肪酸メチルエステルの濃度を、内部標準に基づいて計算した（表１４）。
【0313】
Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの２つのコピーを発現しＥＬＯ１遺伝子内に欠失を有するＳＴ９２７８株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの１つのコピー、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ＿Ｓ８５Ａの１つのコピーを発現しＥＬＯ１遺伝子中に欠失を有するＳＴ９２７９株と比較して、Ｅ９／Ｚ９－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅの低い産生を示した。
【表14】
【0314】
ＳＴ９２７９から派生したＳＴ９３５５株は、他の改変に加えてＶＨｂおよびＨａｒＣｙｂ５を発現する。ＳＴ９３５５に由来するＳＴ９３５６株は、他の改変に加えてＨａｒＣｙｂ５およびＨａｒＣｙｂ５レダクターゼ（配列番号２４）を発現する。ＳＴ９３５６に由来するＳＴ９３５７株は、他の改変に加えて内因性Ｙ．リポリティカ遺伝子ＹＡＬＩ０＿Ｆ１４７２９ｇの欠失を含む。ＳＴ９３５７から派生した株ＳＴ９３５８は、他の改変に加えてＡｓｅ＿ＦＡＲを発現する。ＳＴ９２７９から派生した株ＳＴ９３８７は、他の改変に加えてＡｓｅ＿ＦＡＲを発現する。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。脂肪酸メチルエステルおよび脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算した（表１５および１６）。
【表15】
【表16】
【0315】
これらのデータは、有益な改変を組み合わせて、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅ、ならびにＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨおよびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：ＯＨのより高い力価を達成できることを示す。
【0316】
実施例１１：レダクターゼＡｓｅ＿ＦＡＲにアミノ酸改変を含む菌株でのＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨの産生
タンパク質Ａｓｅ＿ＦＡＲ中の１９８位でのアミノ酸を、ＳＴ９２５０株中でスレオニン（Ｔ）からアラニン（Ａ）に改変し、ＳＴ９３３５株をもたらす。タンパク質Ａｓｅ＿ＦＡＲ中の４２３位のアミノ酸を、ＳＴ９２５０株中でセリン（Ｓ）からアラニン（Ａ）に改変し、ＳＴ９３３６株をもたらす。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析する。脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算する。
タンパク質Ａｓｅ＿ＦＡＲ中の１９８位でのアミノ酸を、ＳＴ９２５０株中でスレオニン（Ｔ）からアラニン（Ａ）に改変し、ＳＴ９３３５株をもたらす。タンパク質Ａｓｅ＿ＦＡＲ中の４２３位のアミノ酸を、ＳＴ９２５０株中でセリン（Ｓ）からアラニン（Ａ）に改変し、ＳＴ９３３６株をもたらす。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析する。脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算する。
【0317】
実施例１２：脂肪酸シンターゼ１（ＦＡＳ１）および脂肪酸シンターゼ２（ＦＡＳ２）中にアミノ酸改変を含むＹ．リポリティカ株中でのＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨの産生
Ｙ．リポリティカのＦＡＳ２中の１２２０位のアミノ酸（配列番号１８）を、ＳＴ９３８７株中でイソロイシン（Ｉ）からフェニルアラニン（Ｆ）に改変し、ＳＴ９３８８株をもたらす。Ｙ．リポリティカのＦＡＳ２中の１２２０位のアミノ酸を、ＳＴ９３８７株中でイソロイシン（Ｉ）からトリプトファン（Ｗ）に改変し、ＳＴ９４２０株をもたらす。Ｙ．リポリティカのＦＡＳ１中の１２３位のアミノ酸（配列番号１６）を、ＳＴ９４２０株中でロイシン（Ｌ）からバリン（Ｖ）に改変し、ＳＴ９４２１株をもたらす。株を、ドデカン酸メチルが産生培地に添加されないことを除き、実施例４に記載されるように培養し、抽出し、分析する。脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算する。
Ｙ．リポリティカのＦＡＳ２中の１２２０位のアミノ酸（配列番号１８）を、ＳＴ９３８７株中でイソロイシン（Ｉ）からフェニルアラニン（Ｆ）に改変し、ＳＴ９３８８株をもたらす。Ｙ．リポリティカのＦＡＳ２中の１２２０位のアミノ酸を、ＳＴ９３８７株中でイソロイシン（Ｉ）からトリプトファン（Ｗ）に改変し、ＳＴ９４２０株をもたらす。Ｙ．リポリティカのＦＡＳ１中の１２３位のアミノ酸（配列番号１６）を、ＳＴ９４２０株中でロイシン（Ｌ）からバリン（Ｖ）に改変し、ＳＴ９４２１株をもたらす。株を、ドデカン酸メチルが産生培地に添加されないことを除き、実施例４に記載されるように培養し、抽出し、分析する。脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算する。
【0318】
実施例１３：Ｙ．リポリティカのＦＡＳ２中のアミノ酸改変（ＦＡＳ２（Ｉ１２２０Ｆ））およびＣ１２脂肪酸形成のための大腸菌由来のチオエステラーゼを含むＹ．リポリティカ株中でのＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨの産生
ＳＴ９３９７株は、Ｙ．リポリティカ由来のＦＡＳ１の短縮型と大腸菌由来のチオエステラーゼＴｅｓＡの短縮型の融合物を発現する（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）（配列番号５９）。ＳＴ９３９７株を、Ｙ．リポリティカ由来の脂肪アシルＣｏＡシンターゼを含むプラスミドで形質転換し、ＳＴ９３９８株をもたらす。株を、ガラス管を使用したことおよび全ブロスから脂肪アルコールを抽出したことを除き、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析する。脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算する（表１７）。
ＳＴ９３９７株は、Ｙ．リポリティカ由来のＦＡＳ１の短縮型と大腸菌由来のチオエステラーゼＴｅｓＡの短縮型の融合物を発現する（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）（配列番号５９）。ＳＴ９３９７株を、Ｙ．リポリティカ由来の脂肪アシルＣｏＡシンターゼを含むプラスミドで形質転換し、ＳＴ９３９８株をもたらす。株を、ガラス管を使用したことおよび全ブロスから脂肪アルコールを抽出したことを除き、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析する。脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算する（表１７）。
【0319】
Ｙ．リポリティカ由来の脂肪アシルＣｏＡシンターゼの発現は、Ｅ８，Ｅ１０－１２：ＯＨの産生に有意な影響を与えなかった。
【表17】
【0320】
実施例１４：Ｙ．リポリティカのペルオキシソーム中での鎖短縮を介するＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨの産生
ＳＴ９３９５株中のＣ１２：ＣｏＡ前駆体の量を増加させるために、Ｙ．リポリティカの５つの内因性ペルオキシソームオキシダーゼ：ＰＯＸ１、ＰＯＸ２、ＰＯＸ３、ＰＯＸ４、およびＰＯＸ５（それぞれ、ＹＡＬＩ０＿Ｅ３２８３５ｇ、ＹＡＬＩ０＿Ｆ１０８５７ｇ、ＹＡＬＩ０＿Ｅ３２８３５ｇ、ＹＡＬＩ０＿Ｅ２７６５４ｇ、ＹＡＬＩ０＿Ｅ２７６５４ｇ）を欠失させ、代わりに、異種ペルオキシソームオキシダーゼ（例えば、セイヨウカボチャ由来のＣｍａ＿ＰＯＸ）（配列番号４７）を発現させる。
ＳＴ９３９５株中のＣ１２：ＣｏＡ前駆体の量を増加させるために、Ｙ．リポリティカの５つの内因性ペルオキシソームオキシダーゼ：ＰＯＸ１、ＰＯＸ２、ＰＯＸ３、ＰＯＸ４、およびＰＯＸ５（それぞれ、ＹＡＬＩ０＿Ｅ３２８３５ｇ、ＹＡＬＩ０＿Ｆ１０８５７ｇ、ＹＡＬＩ０＿Ｅ３２８３５ｇ、ＹＡＬＩ０＿Ｅ２７６５４ｇ、ＹＡＬＩ０＿Ｅ２７６５４ｇ）を欠失させ、代わりに、異種ペルオキシソームオキシダーゼ（例えば、セイヨウカボチャ由来のＣｍａ＿ＰＯＸ）（配列番号４７）を発現させる。
【0321】
Δ９－１２：ＣｏＡ前駆体の量を増加させるために、上記の菌株は、例えばハスオビハマキ由来のＣｒｏＺ１１（配列番号６３）またはＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｐａｒａｌｌｅｌａ由来のＣｐａＥ１１（配列番号６５）のように、さらにΔ１１－１４デサチュラーゼを発現する。これにより、Ｚ／Ｅ１１－１４：ＣｏＡが、産生され、Ｚ／Ｅ９－１２：ＣｏＡへと短縮され、これは次いでデサチュラーゼＣｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号１）によりＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅへとさらに変換される。
【0322】
株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析する。ＳＴ９６００、ＳＴ９６０７、ＳＴ９６１６株の培養物は、ミリスチン酸メチルが添加される。脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算する。
【0323】
実施例１５：サッカロミセス・セレビシエにおけるＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＭｅおよびＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨの産生
デサチュラーゼ遺伝子Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱを、プライマーａｔｔＢ１＿Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ＿ＦおよびａｔｔＢ１＿Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ＿Ｒを使用して、コドリンガフェロモン腺組織のｃＤＮＡから増幅した。
デサチュラーゼ遺伝子Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱを、プライマーａｔｔＢ１＿Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ＿ＦおよびａｔｔＢ１＿Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ＿Ｒを使用して、コドリンガフェロモン腺組織のｃＤＮＡから増幅した。
【0324】
ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して精製した。精製したＤＮＡは、Ｇａｔｅｗａｙ Ｃｌｏｎｉｎｇテクノロジー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりｐＤＯＮＲ２２１ベクター中にクローニングした。得られたベクターを、サンガーシーケンシングで確認し、遺伝子をベクターｐＹＥＸ－ＣＨＴ（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ、２００３）中にサブクローニングし、これを、ＯＬＥ１およびＥＬＯ１欠損Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ＭＡＴａ ｅｌｏ１：：ＨＩＳ３ ｏｌｅ１：：ＬＥＵ２ ａｄｅ２ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｕｒａ３）に形質転換した（Ｓｃｈｎｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）。陽性形質転換体を選択するために、細胞を、０．７％ＹＮＢ（硫酸アンモニウムを含む）、ウラシルおよびロイシンを含まないドロップアウト培地（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ ＬＴＤ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、２％グルコース、１％テルジトール（タイプＮｏｎｉｄｅｔ ＮＰ－４０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）、０．０１％アデニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）および０．５ｍＭオレイン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）を含む合成完全培地で培養した。プレートを３０℃で４日間インキュベートした後、個々のコロニーを、１０ｍｌの選択培地に接種した。培養物を、３０℃で４８時間インキュベートし、０．４のＯＤ６００へと０．５ｍＭ脂肪酸メチルエステル前駆体を補充した２ｍＭＣｕＳＯ４を含む１０ｍｌの選択培地に接種するために使用した。４８時間のインキュベーション後に、細胞を、３０００ｒｐｍでの遠心分離により回収した。培地上清を廃棄し、総脂質を、ガラス管内で３．７５ｍｌのメタノール／クロロホルム（２：１、ｖ／ｖ）を使用して抽出した。１ｍｌのＨＡｃ（０．１５Ｍ）および１．２５ｍｌの水を加え、ガラス管をボルテックスした。ガラス管を、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、下部のクロロホルム相を新しいガラス管に移した。脂質を脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に変換するために、溶媒を、窒素流下で蒸発させた。２％硫酸を含むメタノール１ｍｌを加え、懸濁液を、ボルテックスし、９０℃で１時間インキュベートした。その後、１ｍｌの水を加え、混合し、１ｍｌのヘキサンを使用してＦＡＭＥを抽出した。サンプルを、質量選択検出器ＨＰ５９７３に接続したＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ６８９０ＧＣでのＧＣ－ＭＳ分析に供した。ＧＣは、ＨＰ－８８カラム（３０ｍｘ０．２５ｍｍｘ０．２５μｍ）を備え、ヘリウムを、キャリアガスとして使用した（平均速度：３３ｍｓ）。ＭＳを、電子衝撃モード（７０ｅＶ）で作動させ、インジェクタを、２２０℃で、スプリットレスモードで構成した。オーブン温度を１分間、８０℃に設定し、次に１０℃／分の速度で２１０℃に上昇させ、その後２１０℃で１５分間保持し、その後１０℃／分の速度で２３０℃に上昇させ、２３０℃で２０分間保持した。参照標準として、Ｅ８，Ｅ１０－１２：ＯＡｃを、Ｂｅｄｏｕｋｉａｎ（ＵＳＡ）から購入し、メタノール中のＫＯＨの０．５Ｍ溶液を使用する加水分解により対応するアルコールに変換した。脂肪アルコールを、記載されるとおり（Ｂｊｏｓｔａｄ ａｎｄ Ｒｏｅｌｏｆｓ，１９８４）、ジメチルホルムアミド中のピリジニウムジクロメートで対応する酸に酸化した。
【0325】
図２のクロマトグラムは、１２：ＭｅおよびＥ９－１２：Ｍｅから、Ｅ９－１２：ＭｅおよびＥ８，Ｅ１０－１２：Ｍｅが、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱを発現するＳ．セレビシエ株中で、それぞれ、産生できることを示す。
【0326】
実施例１６：Ｙ．リポリティカにおけるＣｐｏ＿ＳＰＴＱ、Ｃｐｏ＿ＮＰＶＥおよびＣｐｏ＿ＣＰＲＱによるＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅの産生
ＳＴ６６２９から派生したＳＴ１０１３６株は、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱの１つのコピーを発現する。ＳＴ６６２９から派生したＳＴ１０１３７株は、Ｃｐｏ＿ＮＰＶＥの１つのコピーを発現する。ＳＴ８４０６から派生したＳＴ９０６４株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの１つのコピーおよびＣｐｏ＿ＳＰＴＱの１つのコピーを発現する。ＳＴ８４０６から派生したＳＴ９０６５株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの１つのコピーおよびＣｐｏ＿ＮＰＶＥの１つのコピーを発現する。ＳＴ８４０６から派生したＳＴ９０６６株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの２つのコピーを発現する。ＳＴ９０６５から派生したＳＴ１０１３８株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの１つのコピー、Ｃｐｏ＿ＮＰＶＥの１つのコピー、およびＣｐｏ＿ＳＰＴＱの１つのコピーを発現する。
ＳＴ６６２９から派生したＳＴ１０１３６株は、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱの１つのコピーを発現する。ＳＴ６６２９から派生したＳＴ１０１３７株は、Ｃｐｏ＿ＮＰＶＥの１つのコピーを発現する。ＳＴ８４０６から派生したＳＴ９０６４株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの１つのコピーおよびＣｐｏ＿ＳＰＴＱの１つのコピーを発現する。ＳＴ８４０６から派生したＳＴ９０６５株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの１つのコピーおよびＣｐｏ＿ＮＰＶＥの１つのコピーを発現する。ＳＴ８４０６から派生したＳＴ９０６６株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの２つのコピーを発現する。ＳＴ９０６５から派生したＳＴ１０１３８株は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの１つのコピー、Ｃｐｏ＿ＮＰＶＥの１つのコピー、およびＣｐｏ＿ＳＰＴＱの１つのコピーを発現する。
【0327】
株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。脂肪酸メチルエステルの濃度を、内部標準に基づいて計算した（表１８）。
【0328】
Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ（ＳＴ１０１３６）の発現は、Ｅ９－Ｃ１２：Ｍｅ、Ｚ９－Ｃ１２：ＭｅまたはＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅの産生をもたらさなかった。Ｃｐｏ＿ＮＰＶＥ（ＳＴ１０１３７）の発現は、Ｅ９－Ｃ１２：ＭｅおよびＺ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生をもたらしたが、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅは産生されなかった。ＳＴ８４０６中でのＣｐｏ＿ＳＰＴＱまたはＣｐｏ＿ＮＰＶＥの追加の発現（それぞれ、ＳＴ９０６４およびＳＴ９０６５）は、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅの増加をもたらさなかった。ＳＴ８４０６（ＳＴ９０６６）中でのＣｐｏ＿ＣＰＲＱの追加コピーの発現は、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅ、およびＥ９／Ｚ９－Ｃ１２：Ｍｅの産生において、それぞれ、２．８倍および２．１倍の増加をもたらした。Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱおよびＣｐｏ＿ＮＰＶＥ（ＳＴ１０１３８）の組み合わせた発現は、ＳＴ８４０６と比較して、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅの増加をもたらさなかった。これは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱの発現のみが、Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：Ｍｅの産生をもたらすことを示す。
【表18】
【0329】
実施例１７：生合成酵素の複数のコピーを発現させることによるＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨの産生
ＳＴ９３５８株は、実施例１０で説明される。ＳＴ９４９５株は、ＳＴ９３５７株（実施例１０に記載）に由来し、デサチュラーゼＣｐｏ＿ＣＰＲＱおよび脂肪アシルレダクターゼＡｓｅ＿ＦＡＲの追加の遺伝子コピーを発現する。株を、ガラス管を使用したことおよび全ブロスから脂肪アルコールを抽出したことを除き、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析する。脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算する。
ＳＴ９３５８株は、実施例１０で説明される。ＳＴ９４９５株は、ＳＴ９３５７株（実施例１０に記載）に由来し、デサチュラーゼＣｐｏ＿ＣＰＲＱおよび脂肪アシルレダクターゼＡｓｅ＿ＦＡＲの追加の遺伝子コピーを発現する。株を、ガラス管を使用したことおよび全ブロスから脂肪アルコールを抽出したことを除き、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析する。脂肪アルコールの濃度を、内部標準に基づいて計算する。
【0330】
表１９は、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱおよびＡｓｅ＿ＦＡＲの追加の遺伝子コピーは、Ｅ８，Ｅ１０－１２：ＯＨの産生を７．１ｍｇ／Ｌに増加できることを示す。
【表19】
【0331】
実施例１８：様々な脂肪アシルレダクターゼの発現によるコドレモンの産生
ＳＴ９３５８株およびＳＴ９６２３株は、ＳＴ９３５７株に由来する。それらはさらに、それぞれ、カブラヤガおよびタマナヤガの脂肪アシルレダクターゼを発現する。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。
ＳＴ９３５８株およびＳＴ９６２３株は、ＳＴ９３５７株に由来する。それらはさらに、それぞれ、カブラヤガおよびタマナヤガの脂肪アシルレダクターゼを発現する。株を、実施例４に記載のとおり、培養し、抽出し、分析した。
【0332】
表２０の結果は、両方の脂肪アシルレダクターゼがＥ９－Ｃ１２：ＯＨおよびＥ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＯＨを産生できることを示す。
参考文献
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【表20】
【表21】
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【0333】
項目
１．Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる酵母細胞であって、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入できる少なくとも１つの異種デサチュラーゼを発現し、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり、任意によりブラケスレア、カンジダ、クリプトコッカス、クンニンハメラ、リポマイセス、モルティエラ、ケカビ、フィコマイセス、フィチウム、ロドスポリディウム、ロドトルラ、トリコスポロン、サッカロミセスおよびヤロウイアから選択される属に属し、任意によりブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）、カンジダ・プルチェリマ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコッカス・カルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、クンニンハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）、Ｃ．エレガンズ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｃ．ジャポニカ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、リポマイセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、Ｍ．イザベリナ（Ｍ．ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、Ｍ．ラマニアナ（Ｍ．ｒａｍａｎｎｉａｎａ）、Ｍ．ビナセア（Ｍ．ｖｉｎａｃｅａ）、Ｍ．シルシネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、フィコマイセス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）、フィチウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ．グラシリス（Ｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｒ．ムチラギノーザ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、Ｒ．ピニコーラ（Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から選択される種に属し、好ましくはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、酵母細胞。
１．Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる酵母細胞であって、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入できる少なくとも１つの異種デサチュラーゼを発現し、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり、任意によりブラケスレア、カンジダ、クリプトコッカス、クンニンハメラ、リポマイセス、モルティエラ、ケカビ、フィコマイセス、フィチウム、ロドスポリディウム、ロドトルラ、トリコスポロン、サッカロミセスおよびヤロウイアから選択される属に属し、任意によりブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）、カンジダ・プルチェリマ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコッカス・カルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、クンニンハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）、Ｃ．エレガンズ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｃ．ジャポニカ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、リポマイセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、Ｍ．イザベリナ（Ｍ．ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、Ｍ．ラマニアナ（Ｍ．ｒａｍａｎｎｉａｎａ）、Ｍ．ビナセア（Ｍ．ｖｉｎａｃｅａ）、Ｍ．シルシネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、フィコマイセス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）、フィチウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ．グラシリス（Ｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｒ．ムチラギノーザ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、Ｒ．ピニコーラ（Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から選択される種に属し、好ましくはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、酵母細胞。
【0334】
２．Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる酵母細胞であって、１つ以上の二重結合を炭素鎖長が１２である脂肪アシルＣｏＡ中に導入できる少なくとも１つの異種デサチュラーゼを発現し、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）である、酵母細胞。
【0335】
３．前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞であって、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生でき、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換できる少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）をさらに発現し、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、酵母細胞。
【0336】
４．Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる酵母細胞であって、少なくとも１つの異種デサチュラーゼおよび少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）を発現し、
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ｉｉ）少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、
酵母細胞。
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ｉｉ）少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、
酵母細胞。
【0337】
５．Ｂｌａｋｅｓｌｅａ、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クスダマカビ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ヒゲカビ（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、フハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、リノスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択される属に属する、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0338】
６．ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）、カンジダ・プルチェリマ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．レブカウフィ（Ｃ．ｒｅｖｋａｕｆｉ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコッカス・カルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、クンニンハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）、Ｃ．エレガンズ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｃ．ジャポニカ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、リポマイセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、Ｍ．イザベリナ（Ｍ． ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、Ｍ．ラマニアナ（Ｍ．ｒａｍａｎｎｉａｎａ）、Ｍ．ビナセア（Ｍ．ｖｉｎａｃｅａ）、Ｍ．シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、フィコマイセス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）、フィチウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ．グラシリス（Ｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｒ．ムチラギノーザ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、Ｒ．ピニコーラ（Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ． ｃｕｔａｎｅｕｍ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から選択される種に属する、前述の項目にいずれかに記載の酵母細胞。
【0339】
７．ヤロウイア属またはサッカロミセス属のものであり、好ましくはヤロウイア・リポリティカ細胞またはサッカロミセス・セレビシエ細胞である、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0340】
８．少なくとも１つのデサチュラーゼは、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）またはＣｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、または配列番号７７または配列番号２に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するそれらの機能的バリアントであり、好ましくは少なくとも１つのデサチュラーゼは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはその機能的バリアントある；または少なくとも１つのデサチュラーゼは、少なくとも２つのデサチュラーゼであり、２つのデサチュラーゼの少なくとも１つは、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）もしくはＣｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、または配列番号７７もしくは配列番号２に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するそれらの機能的バリアントを有するそれらの機能的バリアントであり、好ましくは少なくとも１つのデサチュラーゼは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはその機能的バリアントである；他方のデサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できるデサチュラーゼ、例えばＺ９－１２デサチュラーゼであり、好ましくはＣｐｏ＿ＮＰＶＥ（配列番号６７）もしくはＣｐｏ＿ＳＰＴＱ（配列番号６９）、または配列番号６７もしくは配列番号６９に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するそれらの機能的バリアントである、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0341】
９．デサチュラーゼが、Ｓ８５Ａ変異などの、８５位に変異を有するＣｐｏ＿ＣＰＲＱの変異体である、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0342】
１０．少なくとも１つの異種デサチュラーゼが、配列番号２に示されるＣｐｏ＿ＣＰＲＱおよびＳ８５Ａ変異などの８５位に変異を有する変異体Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱなどの、少なくとも２つの異なる異種デサチュラーゼである、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0343】
１１．脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、Ａｓｅ＿ＦＡＲ（配列番号１０）、Ａｉｐ＿ＦＡＲ（配列番号６１）、Ｈｓ＿ＦＡＲ（配列番号７１）、Ｈａｓ＿ＦＡＲ（配列番号７３）、Ｈｖ＿ＦＡＲ（配列番号７５）、Ｈａｒ＿ＦＡＲ（配列番号１２）、Ｃｐｏ＿ＦＡＲ（配列番号７６）、およびそれらに対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する機能的バリアントからなる群から選択される、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0344】
１２．脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、１９８位または４１３位に変異、好ましくはＴ１９８Ａ変異またはＳ４１３Ａ変異を有するなどの、Ａｓｅ＿ＦＡＲの変異体である、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0345】
１３．異種デサチュラーゼが、高レベルで発現される、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0346】
１４．異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、高レベルで発現される、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0347】
１５．Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡの利用可能性を高めるためにさらに改変される、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0348】
１６．オオタバコガ由来のシトクロムｂ５など、鱗翅目種由来のシトクロムｂ５などの異種シトクロムｂ５、好ましくは配列番号４に示されるシトクロムｂ５ ＨａｒＣｙｂ５または配列番号４に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントをさらに発現する、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0349】
１７．Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａなどの、鱗翅目種由来のシトクロムｂ５レダクターゼなどの、異種シトクロムｂ５レダクターゼ（ＥＣ１．６．２．２）をさらに発現し、好ましくはシトクロムｂ５レダクターゼは、配列番号２４に示されるオオタバコガ由来のシトクロムｂ５レダクターゼ、または配列番号２４に対して少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するそれらの機能的バリアントである、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0350】
１８．Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉａ由来のヘモグロビン、好ましくは配列番号６に示されるＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉａ由来のヘモグロビンなどの、ヘモグロビン、または配列番号６に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するそれらの機能的バリアントをさらに発現する、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0351】
１９．エロンガーゼをコードしかつＥｌｏ１活性の部分的または完全な喪失をもたらすＥＬＯ１遺伝子（配列番号１３）の変異などの、エロンガーゼ活性の部分的または完全な喪失をもたらす１つ以上の遺伝子の変異をさらに含み、好ましくは変異は、欠失である、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0352】
２０．チオエステラーゼをコードしチオエステラーゼ活性の部分的または完全な喪失をもたらす、ＹＡＬ１０＿Ｆ１４７２９ｇ遺伝子（配列番号１９）の変異、ＹＡＬＩ０＿Ｅ１８８７６ｇ遺伝子（配列番号５４）の変異、またはＹＡＬＩ０＿Ｄ０３５９７ｇの変異（配列番号５５）などの、１つ以上の遺伝子の変異をさらに含み、好ましくは変異は、欠失である、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0353】
２１．Ｈｆｄ１、Ｈｆｄ２、Ｈｆｄ３、Ｈｆｄ４、Ｆａｏ１、ＧＰＡＴおよびＰｅｘ１０の少なくとも１つの活性の低下をもたらす少なくとも１つの変異などの少なくとも１つの改変、またはそれらに対して少なくとも６０％の相同性または同一性、それらに対して例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７５％の相同性または同一性、例えば少なくとも８０％の相同性または同一性、例えば少なくとも８１％の相同性または同一性、例えば少なくとも８２％の相同性または同一性、例えば少なくとも８３％の相同性または同一性、例えば少なくとも８４％の相同性または同一性、例えば少なくとも８５％の相同性または同一性、例えば少なくとも８６％の相同性または同一性、例えば少なくとも８７％の相同性または同一性、例えば少なくとも８８％の相同性または同一性、例えば少なくとも８９％の相同性または同一性、例えば少なくとも９０％の相同性または同一性、例えば少なくとも９１％の相同性または同一性、例えば少なくとも９２％の相同性または同一性、例えば少なくとも９３％の相同性または同一性、例えば少なくとも９４％の相同性または同一性、例えば少なくとも９５％の相同性または同一性、例えば少なくとも９６％の相同性または同一性、例えば少なくとも９７％の相同性または同一性、例えば少なくとも９８％の相同性または同一性、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する少なくとも１つのタンパク質の活性の低下をもたらす少なくとも１つの変異などの少なくとも１つの改変をさらに含む、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0354】
２２．改変されたケトンシンターゼドメインを有する脂肪アシルシンターゼバリアントをさらに発現し、脂肪アシルシンターゼバリアントは、Ｆａｓ１（配列番号１６）またはＦａｓ２（配列番号１８）のバリアント、例えば１２３位に変異を有する変異体Ｆａｓ１、好ましくはＬ１２３Ｖ変異、または１２２０位での変異を有する変異体Ｆａｓ２、好ましくはＩ１２２０ＦまたはＩ１２２０Ｗ変異である、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0355】
２３．異種チオエステラーゼなどのチオエステラーゼをさらに発現し、任意によりチオエステラーゼが、高レベルで発現される、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0356】
２４．チオエステラーゼが、配列番号３３に示されるＣｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ由来のチオエステラーゼに対して、配列番号５７に示されるクフェア・フッケリアナ由来のチオエステラーゼに対して、配列番号３５に示されるクスノキ由来のチオエステラーゼに対して、または配列番号２６に示される大腸菌由来のチオエステラーゼに対して、少なくとも６０％の相同性または同一性を有する、好ましくはチオエステラーゼは、配列番号３５に示されるクスノキ由来のチオエステラーゼに対して、または配列番号２６に示される大腸菌由来のチオエステラーゼに対して、少なくとも６０％の相同性または同一性を有する、項目２３に記載の酵母細胞。
【0357】
２５．配列番号５９に示される融合タンパク質などの、短縮型脂肪アシルシンターゼおよび短縮型チオエステラーゼの融合タンパク質、または配列番号５９に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体をさらに発現する、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0358】
２６．異種デサチュラーゼをコードする核酸と、異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼをコードする核酸を含む、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0359】
２７．異種デサチュラーゼをコードする核酸および／または異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が、高いコピー数で存在する、項目２６に記載の酵母細胞。
【0360】
２８．異種デサチュラーゼをコードする核酸が、配列番号１に示されるか、または配列番号１に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体、または配列番号７８に示されるか、または配列番号７８に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体である、項目２６または２７に記載の酵母細胞。
【0361】
２９．異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が、配列番号９に示されるか、または配列番号９に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体である、項目２６～２８のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【0362】
３０．異種シトクロムｂ５をコードする核酸、異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする核酸、ヘモグロビンをコードする核酸、脂肪酸シンターゼバリアントをコードする核酸、チオエステラーゼをコードする核酸、および／または融合タンパク質をコードする核酸を含む、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0363】
３１．異種シトクロムｂ５をコードする核酸、異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする核酸、ヘモグロビンをコードする核酸、脂肪酸シンターゼバリアントをコードする核酸、および／またはチオエステラーゼをコードする核酸が、高いコピー数で存在する、項目３０に記載の酵母細胞。
【0364】
３２．異種デサチュラーゼをコードする核酸、異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼをコードする核酸、異種シトクロムｂ５をコードする核酸、異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする核酸、ヘモグロビンをコードする核酸、脂肪酸シンターゼバリアントをコードする核酸、および／またはチオエステラーゼをコードする核酸が、酵母細胞における発現のためにコドン最適化される、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0365】
３３．異種シトクロムｂ５をコードする核酸が、配列番号３に示される、または配列番号３に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体である、異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードする核酸が、配列番号２３に示される、または配列番号２３に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体である、ヘモグロビンをコードする核酸が、配列番号５に示される、または配列番号５に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体である、および／またはチオエステラーゼをコードする核酸が、配列番号２５または配列番号３４に示される、または配列番号２５または配列番号３４に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有する配列番号２５または配列番号３４の相同体である、項目３０～３２のいずれかに記載の酵母細胞。
【0366】
３４．少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも０．６ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも０．７ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも０．８ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも０．９ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも１ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも１．５ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも２．５ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも５．０ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、例えば２５ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも２５０ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも７５０ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも１ｇ／Ｌ、例えば少なくとも２ｇ／Ｌ、例えば少なくとも３ｇ／Ｌ、例えば少なくとも４ｇ／Ｌ、例えば少なくとも５ｇ／Ｌ、例えば少なくとも６ｇ／Ｌ、例えば少なくとも７ｇ／Ｌ、例えば少なくとも８ｇ／Ｌ、例えば少なくとも９ｇ／Ｌ、例えば少なくとも１０ｇ／Ｌのまたはそれより大きい力価を有するＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0367】
３５．Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換できるアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８４）をさらに発現し、これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを産生できる、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0368】
３６．アセチルトランスフェラーゼが、酵母細胞から発現される異種アセチルトランスフェラーゼ（ＡｃＴ）、または酵母細胞から過剰発現される天然アセチルトランスフェラーゼである、項目３５に記載の酵母細胞。
【0369】
３７．アセチルトランスフェラーゼが、Ｓｃ＿Ａｔｆ１（配列番号３７）またはＳｃ＿Ａｔｆ１（配列番号３７）に対して少なくとも６０％の相同性または同一性、Ｓｃ＿Ａｔｆ１（配列番号３７）に対して、例えば少なくとも６１％の相同性または同一性、例えば少なくとも６２％の相同性または同一性、例えば少なくとも６３％の相同性または同一性、例えば少なくとも６４％の相同性または同一性、例えば少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも６６％の相同性または同一性、例えば少なくとも６７％の相同性または同一性、例えば少なくとも６８％の相同性または同一性、例えば少なくとも６９％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％を有するそのバリアントである、項目３５または３６に記載の酵母細胞。
【0370】
３８．Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換できるアルデヒド形成脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．５０）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）、および／または脂肪アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２０）をさらに発現する、前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞。
【0371】
３９．前述の項目のいずれかに記載の酵母細胞であって、さらに、
ｉ）１つ以上の天然アシルＣｏＡオキシダーゼの活性の低下をもたらす１つ以上の変異を有し、かつ
ｉｉ）脂肪アシルＣｏＡを酸化できる少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼを含む酵素の少なくとも１つの群を発現し、酵素の群は、第１の炭素鎖長Ｘの脂肪アシルＣｏＡを第２の炭素鎖長Ｘ’を有する短縮された脂肪アシルＣｏＡに短縮でき、式中、Ｘ’≦Ｘ－２である、
酵母細胞。
ｉ）１つ以上の天然アシルＣｏＡオキシダーゼの活性の低下をもたらす１つ以上の変異を有し、かつ
ｉｉ）脂肪アシルＣｏＡを酸化できる少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼを含む酵素の少なくとも１つの群を発現し、酵素の群は、第１の炭素鎖長Ｘの脂肪アシルＣｏＡを第２の炭素鎖長Ｘ’を有する短縮された脂肪アシルＣｏＡに短縮でき、式中、Ｘ’≦Ｘ－２である、
酵母細胞。
【0372】
４０．式中、Ｘ’＝１２である、項目３９に記載の酵母細胞。
【0373】
４１．炭素鎖長Ｘの脂肪アシルＣｏＡ中に少なくとも１つの二重結合を導入できるデサチュラーゼ、例えばＣｒｏＺ１１デサチュラーゼ（配列番号６３）またはＣｐａＥ１１デサチュラーゼ（配列番号６５）、または配列番号６３、配列番号６５に対して、少なくとも６５％の相同性または同一性、例えば少なくとも７０％の相同性または同一性、例えば少なくとも７１％の相同性または同一性、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するこれらの機能的バリアントをさらに発現する、項目３９または４０に記載の酵母細胞。
【0374】
４２．ｉ）の天然のアシルＣｏＡオキシダーゼおよび／またはｉｉ）のアシルＣｏＡオキシダーゼが、ペルオキシソームのアシルＣｏＡオキシダーゼである、項目３９～４２のいずれかに記載の酵母細胞。
【0375】
４３．ｉｉ）の少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼが、天然のアシルＣｏＡオキシダーゼまたは異種アシルＣｏＡオキシダーゼであり、それは、酵素の少なくとも１つの群を発現しない参照酵母株と比較して任意により過剰発現され、好ましくはｉｉ）の酵素の群の少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼが、異種アシルＣｏＡオキシダーゼである、項目３９～４１のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【0376】
４４．ｉｉ）の酵素の群が、ヤロウイア・リポリティカ、カブラヤガ、シロイヌナズナ、アスペルギルス・ニデュランス、セイヨウカボチャ、ホモサピエンス、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓまたはドブネズミから選択される属の生物に由来するアシルＣｏＡオキシダーゼを含み、好ましくは酵素の少なくとも１つの第１の群が、ヤロウイア・リポリティカ、カブラヤガ、シロイヌナズナ、アスペルギルス・ニデュランス、セイヨウカボチャ、ホモサピエンス、Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓまたはドブネズミに由来のアシルＣｏＡオキシダーゼを含み、好ましくは酵素の第１の群の少なくとも１つのアシルＣｏＡオキシダーゼが、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ１（ＸＰ＿５０４７０３）、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ２（ＸＰ＿５０５２６４）、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ３（ＸＰ＿５０３２４４）、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ４（ＸＰ＿５０４４７５）、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ５（ＸＰ＿５０２１９９）、Ｙｌｉ＿ＰＯＸ６（ＸＰ＿５０３６３２）、Ａｓｅ＿ＰＯＸ（配列番号３９）、Ａｔｈ＿ＰＯＸ１（配列番号４１）、Ａｔｈ＿ＰＯＸ２（配列番号４３）、Ａｎｉ＿ＰＯＸ（配列番号４５）、Ｃｍａ＿ＰＯＸ（配列番号４７）、Ｈｓａ＿ＰＯＸ１－２（配列番号４９）、Ｐｕｒ＿ＰＯＸ（配列番号５１）、Ｓｃ＿ＰＯＸ１（配列番号３１）およびＲｎｏ＿ＰＯＸ２（配列番号５３）、またはそれらに対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、それらに対して、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するその機能的バリアントからなる群から選択されるアシルＣｏＡオキシダーゼである、項目３９～４３のいずれかに記載の酵母細胞。
【0377】
４５．酵母細胞中でＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生するための方法であって、酵母細胞を提供するステップと、培地中で酵母細胞をインキュベートするステップを含み、酵母細胞は、少なくとも１つの異種デサチュラーゼおよび任意による少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）を発現し、
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ｉｉ）任意による少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換でき、
これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生する、方法。
ｉ）少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入でき、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部は、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）であり；
ｉｉ）任意による少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）は、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換でき、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼは、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換でき、
これによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生する、方法。
【0378】
４６．酵母細胞が、項目１～４４のいずれかに記載のとおりである、項目４５に記載の方法。
【0379】
４７．Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａをトリアシルグリセリドなどの脂質または遊離脂肪酸に変換するステップと、脂質または遊離脂肪酸を回収するステップと、脂質または遊離脂肪酸をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換するステップをさらに含む、項目４５または４６に記載の方法。
【0380】
４８．Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを回収するステップをさらに含む、項目４５～４７に記載の方法。
【0381】
４９．アセチルトランスフェラーゼの発現によりまたは化学変換により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換するステップをさらに含む、項目４５～４８のいずれかに記載の方法。
【0382】
５０．アセチルトランスフェラーゼが、酵母細胞から発現される異種アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８４）または酵母細胞から過剰発現される天然アセチルトランスフェラーゼであり、アセチルトランスフェラーゼが、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに変換でき、それによりさらにＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを産生する、項目４９に記載の方法。
【0383】
５１．アセチルトランスフェラーゼが、Ｓｃ＿Ａｔｆ１（配列番号３７）またはＳｃ＿Ａｔｆ１（配列番号３７）に対して、少なくとも７５％の相同性または同一性、例えば少なくとも８０％の相同性または同一性、例えば少なくとも８５％の相同性または同一性、例えば少なくとも９０％の相同性または同一性、例えば少なくとも９１％の相同性または同一性、例えば少なくとも９２％の相同性または同一性、例えば少なくとも９３％の相同性または同一性、例えば少なくとも９４％の相同性または同一性、例えば少なくとも９５％の相同性または同一性、例えば少なくとも９６％の相同性または同一性、例えば少なくとも９７％の相同性または同一性、例えば少なくとも９８％の相同性または同一性、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性、例えば１００％の相同性または同一性を有するバリアントである、項目５０に記載の方法。
【0384】
５２．Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを回収するステップをさらに含む、項目４５～５１のいずれかに記載の方法。
【0385】
５３．Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換できるアルデヒド形成脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．５０）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）、および／または脂肪アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２０）の発現によりまたは化学変換により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールに変換するステップをさらに含み、それによりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールをさらに産生することを含む、項目４５～５２のいずれかに記載の方法。
【0386】
５４．Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを回収するステップをさらに含む、項目５３に記載の方法。
【0387】
５５．項目４５～５４に記載の方法であって、培地が、水溶液中のその雲濃度以上の量またはその濃度を超える量の抽出剤を含み、抽出剤が、消泡剤などの非イオン性エトキシル化界面活性剤、好ましくはポリエチレンポリプロピレングリコール、ポリエーテル分散液の混合物、ならびにシメチコンなどのポリエチレングリコールモノステアレート、脂肪アルコールアルコキシレート、ポリエトキシル化界面活性剤を含む消泡剤、ならびにエトキシル化およびプロポキシル化Ｃ１６～Ｃ１８アルコールベースの消泡剤、ならびにそれらの組み合わせから選択されるポリエトキシル化界面活性剤である、方法。
【0388】
５６．項目５５に記載の方法であって、
－非イオン性エトキシル化界面活性剤が、エトキシル化およびプロポキシル化されたＣ１６～Ｃ１８アルコールベースの消泡剤、例えばＣ１６～Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレート（ＣＡＳ番号６８００２－９６－０）であり、培養培地が、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＣ１６～Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレート、例えば少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＣ１６～Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレート、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのまたはそれより多いＣ１６～Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレートを含み、
－非イオン性エトキシル化界面活性剤が、ポリエチレンポリプロピレングリコール、例えばＫｏｌｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ４０７（ＣＡＳ番号９００３－１１－６）であり、培養培地が、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ４０７などのポリエチレンポリプロピレングリコールの少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１１％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３５％ｖｏｌ／ｖｏｌのまたはそれより多いＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ４０７などのポリエチレンポリプロピレングリコールを含み、
－非イオン性エトキシル化界面活性剤が、消泡剤２０４などのポリエーテル分散液の混合物であり、培養培地が、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのポリエーテル分散液の混合物を含み、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのまたはそれより多い消泡剤２０４などのポリエーテル分散液の混合物を含み、かつ／または
－非イオン性エトキシル化界面活性剤が、シメチコンなどのポリエチレングリコールモノステアレートを含む非イオン性エトキシル化界面活性剤であり、培養培地が、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのポリエチレングリコールモノステアレートまたはシメチコン、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのまたはそれより多いポリエチレングリコールモノステアレートまたはシメチコンを含み、
－非イオン性エトキシル化界面活性剤が、脂肪アルコールアルコキシレートであり、好ましくはＰｌｕｒａｆａｃ（登録商標）ＬＦ３００（ＣＡＳ番号１９６８２３－１１－７）、Ｐｌｕｒａｆａｃ（登録商標）ＬＦ１３００（６８００２－９６－０）、Ｐｌｕｒａｆａｃ（登録商標）ＳＬＦ１８０（ＣＡＳ番号１９６８２３－１１－７）、Ｄｅｈｙｐｏｎ（登録商標）２５７４（ＣＡＳ番号６８１５４－９７－２）、およびＩｍｂｅｎｔｉｎ ＳＧ／２５１（ＣＡＳ番号６８００２－９６－０）から選択され、好ましくはＰｌｕｒａｆａｃ（登録商標）ＬＦ３００またはＤｅｈｙｐｏｎ（登録商標）２５７４であり、培養培地が、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌの脂肪アルコールアルコキシレート、例えば少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌの脂肪アルコールアルコキシレート、例えば少なくとも１．５％、例えば少なくとも２％、例えば少なくとも２．５％、例えば少なくとも３％、例えば少なくとも３．５％、例えば少なくとも４％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも６％、例えば少なくとも７％、例えば少なくとも８％、例えば少なくとも９％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１２．５％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも１７．５％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも２２．５％、例えば少なくとも２５％、例えば少なくとも２７．５％、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのまたはそれより多い脂肪アルコールアルコキシレートを含み、
－非イオン性エトキシル化界面活性剤が、Ａｇｎｉｑｕｅ ＢＰ４２０（ＣＡＳ番号６８００２－９６－０）であり、培養培地が、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＡｇｎｉｑｕｅ ＢＰ４２０、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのまたはそれより多いＡｇｎｉｑｕｅ ＢＰ４２０を含む、
方法。
－非イオン性エトキシル化界面活性剤が、エトキシル化およびプロポキシル化されたＣ１６～Ｃ１８アルコールベースの消泡剤、例えばＣ１６～Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレート（ＣＡＳ番号６８００２－９６－０）であり、培養培地が、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＣ１６～Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレート、例えば少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＣ１６～Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレート、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのまたはそれより多いＣ１６～Ｃ１８アルキルアルコールエトキシレートプロポキシレートを含み、
－非イオン性エトキシル化界面活性剤が、ポリエチレンポリプロピレングリコール、例えばＫｏｌｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ４０７（ＣＡＳ番号９００３－１１－６）であり、培養培地が、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ４０７などのポリエチレンポリプロピレングリコールの少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１１％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３５％ｖｏｌ／ｖｏｌのまたはそれより多いＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ４０７などのポリエチレンポリプロピレングリコールを含み、
－非イオン性エトキシル化界面活性剤が、消泡剤２０４などのポリエーテル分散液の混合物であり、培養培地が、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのポリエーテル分散液の混合物を含み、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのまたはそれより多い消泡剤２０４などのポリエーテル分散液の混合物を含み、かつ／または
－非イオン性エトキシル化界面活性剤が、シメチコンなどのポリエチレングリコールモノステアレートを含む非イオン性エトキシル化界面活性剤であり、培養培地が、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのポリエチレングリコールモノステアレートまたはシメチコン、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのまたはそれより多いポリエチレングリコールモノステアレートまたはシメチコンを含み、
－非イオン性エトキシル化界面活性剤が、脂肪アルコールアルコキシレートであり、好ましくはＰｌｕｒａｆａｃ（登録商標）ＬＦ３００（ＣＡＳ番号１９６８２３－１１－７）、Ｐｌｕｒａｆａｃ（登録商標）ＬＦ１３００（６８００２－９６－０）、Ｐｌｕｒａｆａｃ（登録商標）ＳＬＦ１８０（ＣＡＳ番号１９６８２３－１１－７）、Ｄｅｈｙｐｏｎ（登録商標）２５７４（ＣＡＳ番号６８１５４－９７－２）、およびＩｍｂｅｎｔｉｎ ＳＧ／２５１（ＣＡＳ番号６８００２－９６－０）から選択され、好ましくはＰｌｕｒａｆａｃ（登録商標）ＬＦ３００またはＤｅｈｙｐｏｎ（登録商標）２５７４であり、培養培地が、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌの脂肪アルコールアルコキシレート、例えば少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌの脂肪アルコールアルコキシレート、例えば少なくとも１．５％、例えば少なくとも２％、例えば少なくとも２．５％、例えば少なくとも３％、例えば少なくとも３．５％、例えば少なくとも４％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも６％、例えば少なくとも７％、例えば少なくとも８％、例えば少なくとも９％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１２．５％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも１７．５％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも２２．５％、例えば少なくとも２５％、例えば少なくとも２７．５％、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのまたはそれより多い脂肪アルコールアルコキシレートを含み、
－非イオン性エトキシル化界面活性剤が、Ａｇｎｉｑｕｅ ＢＰ４２０（ＣＡＳ番号６８００２－９６－０）であり、培養培地が、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＡｇｎｉｑｕｅ ＢＰ４２０、例えば少なくとも１．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも６％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも７％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも８％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも９％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも１７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２２．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも２７．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、例えば少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌのまたはそれより多いＡｇｎｉｑｕｅ ＢＰ４２０を含む、
方法。
【0389】
５７．培養培地が、その雲濃度より少なくとも５０％、例えば少なくとも１００％、例えば少なくとも１５０％、例えば少なくとも２００％、例えば少なくとも２５０％、例えば少なくとも３００％、例えば少なくとも３５０％、例えば少なくとも４００％、例えば少なくとも５００％、例えば少なくとも７５０％、例えば少なくとも１０００％の、またはそれより多い量の抽出剤を含み、かつ／または培養培地が、その雲濃度の少なくとも２倍、例えばその雲濃度の少なくとも３倍、例えばその雲濃度の少なくとも４倍、例えばその雲濃度の少なくとも５倍、例えばその雲濃度の少なくとも６倍、例えばその雲濃度の少なくとも７倍、例えばその雲濃度の少なくとも８倍、例えばその雲濃度の少なくとも９倍、例えばその雲濃度の少なくとも１０倍、例えばその雲濃度の少なくとも１２．５倍、例えばその雲濃度の少なくとも１５倍、例えばその雲濃度の少なくとも１７．５倍、例えばその雲濃度の少なくとも２０倍、例えばその雲濃度の少なくとも２５倍、例えばその雲濃度の少なくとも３０倍の量の抽出剤を含む、項目４５～５６に記載の方法。
【0390】
５８．項目４５～５７のいずれかに記載の方法であって、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａが、脂質または遊離脂肪酸に変換され、脂質または遊離脂肪酸、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意により酵母細胞によって産生されるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールが、発酵ブロス中のエマルジョン中に存在し、エマルジョンを破壊するステップをさらに含み、それにより抽出剤と、脂質または遊離脂肪酸、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを含む産生物相を含む組成物を得、任意により
－エマルジョンを破壊するステップは、発酵ブロスの遠心分離のステップなどの相分離のステップを含むか、またはそのステップからなり、それにより３つの相：水相、細胞および細胞破片を含む相、および抽出剤と脂質または遊離脂肪酸、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを含む産生物相からなる組成物を得る、かつ／または
－産生物相は、例えば少なくとも５５％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％のまたはそれより多い、少なくとも５０％の脂質または遊離脂肪酸、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意により発酵ブロス中に最初に存在するＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを含む、
方法。
－エマルジョンを破壊するステップは、発酵ブロスの遠心分離のステップなどの相分離のステップを含むか、またはそのステップからなり、それにより３つの相：水相、細胞および細胞破片を含む相、および抽出剤と脂質または遊離脂肪酸、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを含む産生物相からなる組成物を得る、かつ／または
－産生物相は、例えば少なくとも５５％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％のまたはそれより多い、少なくとも５０％の脂質または遊離脂肪酸、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意により発酵ブロス中に最初に存在するＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを含む、
方法。
【0391】
５９．以下のステップ：
－脂質または遊離脂肪酸、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを、好ましくは減圧下での蒸留などの蒸留ステップにより、またはカラム精製により回収するステップ、
－Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに化学的に変換するステップ、
－任意により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを回収するステップ
をさらに含む、項目４５～５８のいずれかに記載の方法。
－脂質または遊離脂肪酸、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、および任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを、好ましくは減圧下での蒸留などの蒸留ステップにより、またはカラム精製により回収するステップ、
－Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールの少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートに化学的に変換するステップ、
－任意により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエナールおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートを回収するステップ
をさらに含む、項目４５～５８のいずれかに記載の方法。
【0392】
６０．回収されたＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールをフェロモン組成物に配合するステップをさらに含む、項目４５～５９のいずれかに記載の方法。
【0393】
６１．フェロモン組成物が、液体または固体の担体または基質などの１つ以上の追加の化合物をさらに含む、項目４５～６０のいずれかに記載の方法。
【0394】
６２．酵母細胞を改変するための核酸構築物であって、
ｉ）炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入できる少なくとも１つの異種デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドであって、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部が、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）である、第１のポリヌクレオチドと；
ｉｉ）任意により、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換できる少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）をコードする第２のポリヌクレオチドであって、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、第２のポリヌクレオチド、
を含む、核酸構築物。
ｉ）炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡ中に１つ以上の二重結合を導入できる少なくとも１つの異種デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドであって、これにより脂肪アシルＣｏＡを不飽和脂肪アシルＣｏＡに変換し、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部が、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）である、第１のポリヌクレオチドと；
ｉｉ）任意により、不飽和脂肪アシルＣｏＡの少なくとも一部を不飽和脂肪アルコールに変換できる少なくとも１つの異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８４）をコードする第２のポリヌクレオチドであって、脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ（Ｅ８，Ｅ１０－Ｃ１２：ＣｏＡ）の少なくとも一部をＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールに変換できる、第２のポリヌクレオチド、
を含む、核酸構築物。
【0395】
６３．項目６２に記載の核酸構築物であって、
ａ）少なくとも１つのデサチュラーゼが、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、または配列番号７７もしくは配列番号２に対して、少なくとも８０％の同一性、配列番号７７もしくは配列番号２に対して例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％などの同一性を有するその機能的バリアントであり、好ましくは少なくとも１つのデサチュラーゼは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはその機能的バリアントである、または
ｂ）少なくとも１つのデサチュラーゼは、少なくとも２つのデサチュラーゼであり、２つのデサチュラーゼの少なくとも１つは、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、または配列番号７７もしくは配列番号２に対して、少なくとも８０％の同一性、配列番号２に対して例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％などの同一性を有するその機能的バリアントであり、好ましくは少なくとも１つのデサチュラーゼは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはその機能的バリアントであり、好ましくは少なくとも１つのデサチュラーゼは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはその機能的バリアントであり、他のデサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡに少なくとも１つの二重結合を導入できるデサチュラーゼ、例えばＺ９－１２デサチュラーゼである、核酸構築物。
ａ）少なくとも１つのデサチュラーゼが、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、または配列番号７７もしくは配列番号２に対して、少なくとも８０％の同一性、配列番号７７もしくは配列番号２に対して例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％などの同一性を有するその機能的バリアントであり、好ましくは少なくとも１つのデサチュラーゼは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはその機能的バリアントである、または
ｂ）少なくとも１つのデサチュラーゼは、少なくとも２つのデサチュラーゼであり、２つのデサチュラーゼの少なくとも１つは、Ｇｍｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号７７）、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱ（配列番号２）、または配列番号７７もしくは配列番号２に対して、少なくとも８０％の同一性、配列番号２に対して例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％などの同一性を有するその機能的バリアントであり、好ましくは少なくとも１つのデサチュラーゼは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはその機能的バリアントであり、好ましくは少なくとも１つのデサチュラーゼは、Ｃｐｏ＿ＣＰＲＱまたはその機能的バリアントであり、他のデサチュラーゼは、炭素鎖長１２を有する脂肪アシルＣｏＡに少なくとも１つの二重結合を導入できるデサチュラーゼ、例えばＺ９－１２デサチュラーゼである、核酸構築物。
【0396】
６４．項目６２または６３に記載の核酸構築物であって、少なくとも１つの異種デサチュラーゼは、少なくとも２つのデサチュラーゼであり、他のデサチュラーゼは、Ｃｐｏ＿ＮＰＶＥ（配列番号６７）、Ｃｐｏ＿ＳＰＴＱ（配列番号６９）、および配列番号６７または配列番号６９に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性、または配列番号６７または配列番号６９に対して、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の同一性を有する機能的バリアントである、核酸構築物。
【0397】
６５．項目６２～６４のいずれかに記載の核酸構築物であって、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号７８、好ましくは配列番号１、または配列番号１もしくは配列番号７８に対して、少なくとも６０％の相同性または同一性を有する相同体、配列番号１もしくは配列番号７８に対して、好ましくは配列番号１に対して、例えば６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも６６％、例えば少なくとも６７％、例えば少なくとも６８％、例えば少なくとも６９％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有する相同体を含む、核酸構築物。
【0398】
６６．項目６２～６５のいずれかに記載の核酸構築物であって、少なくとも１つの異種デサチュラーゼが、少なくとも２つの異種デサチュラーゼであり、第１のポリヌクレオチドが、配列番号６６または配列番号６８に示されるような核酸、または配列番号６６もしくは配列番号６８に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体、配列番号６６もしくは配列番号６８に対して例えば６１％、例えば少なくとも６２％、例えば少なくとも６３％、例えば少なくとも６４％、例えば少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、例えば少なくとも７４％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するそれらの相同体をさらに含む、核酸構築物。
【0399】
６７．異種デサチュラーゼが、項目１～４４のいずれかに記載のものである、項目６２～６６のいずれかに記載の核酸構築物。
【0400】
６８．少なくとも１つのデサチュラーゼが、Ｓ８５Ａ変異などの、８５位に変異を有するＣｐｏ＿ＣＰＲＱの変異体である、項目６２～６７のいずれかに記載の核酸構築物。
【0401】
６９．異種脂肪アシルＣｏＡレダクターゼが、項目１～４４のいずれかに記載のものである、項目６２～６８のいずれかに記載の核酸構築物。
【0402】
７０．項目６２～６９のいずれかに記載の核酸構築物であって、第２のポリヌクレオチドが、配列番号９、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号１１、配列番号７６およびそれらに対して少なくとも６０％の相同性または同一性、例えばそれらに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７１％、例えば少なくとも７２％、例えば少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性または同一性を有するそれらの相同体を含むまたはそれらからなる、核酸構築物。
【0403】
７１．項目６２～７０のいずれかに記載の核酸構築物であって、さらに
ｉｉｉ）異種シトクロムｂ５をコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号３に示されるポリヌクレオチド、または配列番号３に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体；
ｉｖ）異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号２３に示されるポリヌクレオチドまたは配列番号２３に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体；
ｖ）ヘモグロビンをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号５に示されるポリヌクレオチドまたは配列番号５に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体；
ｖｉ）改変ケトンシンターゼドメインを有する脂肪アシルシンターゼバリアントをコードするポリヌクレオチド；および／または
ｖｉｉ）チオエステラーゼをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号２５または配列番号３４に示されるポリヌクレオチド、または配列番号２５もしくは配列番号３４に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体
の１つ以上を含む、核酸構築物。
ｉｉｉ）異種シトクロムｂ５をコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号３に示されるポリヌクレオチド、または配列番号３に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体；
ｉｖ）異種シトクロムｂ５レダクターゼをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号２３に示されるポリヌクレオチドまたは配列番号２３に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体；
ｖ）ヘモグロビンをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号５に示されるポリヌクレオチドまたは配列番号５に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体；
ｖｉ）改変ケトンシンターゼドメインを有する脂肪アシルシンターゼバリアントをコードするポリヌクレオチド；および／または
ｖｉｉ）チオエステラーゼをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号２５または配列番号３４に示されるポリヌクレオチド、または配列番号２５もしくは配列番号３４に対して少なくとも６０％の相同性または同一性を有するその相同体
の１つ以上を含む、核酸構築物。
【0404】
７２．項目６２～７１のいずれかに記載の核酸構築物であって、異種シトクロムｂ５、異種シトクロムｂ５レダクターゼ、ヘモグロビン、脂肪アシルシンターゼバリアントおよび／またはチオエステラーゼが、項目１～４４のいずれに記載されるとおりである、核酸構築物。
【0405】
７３．害虫の存在を監視する、または害虫の交配を妨害する方法であって、
ｉ）項目４５～６１のいずれかに記載の方法により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するステップと；
ｉｉ）フェロモン組成物として、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを配合するステップと；
ｉｉｉ）総合的病害虫管理組成物としてフェロモン組成物を使用するステップ、
を含む、方法。
ｉ）項目４５～６１のいずれかに記載の方法により、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを産生するステップと；
ｉｉ）フェロモン組成物として、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナールを配合するステップと；
ｉｉｉ）総合的病害虫管理組成物としてフェロモン組成物を使用するステップ、
を含む、方法。
【0406】
７４．項目４５～６１のいずれかに記載の方法によって得ることができるＥ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａ、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オール、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニルアセテートおよび／またはＥ８，Ｅ１０－ドデカジエナール。
【0407】
７５．使用説明書と、
ａ）項目１～４４のいずれかに記載の酵母細胞；および／または
ｂ）酵母細胞および任意により改変される酵母細胞を改変するための、項目６２～７２のいずれかに記載の核酸構築物、
を含む部品のキットであって、核酸構築物内に含まれるポリヌクレオチドの発現時に、改変された酵母細胞が、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる、キット。
ａ）項目１～４４のいずれかに記載の酵母細胞；および／または
ｂ）酵母細胞および任意により改変される酵母細胞を改変するための、項目６２～７２のいずれかに記載の核酸構築物、
を含む部品のキットであって、核酸構築物内に含まれるポリヌクレオチドの発現時に、改変された酵母細胞が、Ｅ８，Ｅ１０－ドデカジエニル補酵素Ａおよび任意によりＥ８，Ｅ１０－ドデカジエン－１－オールを産生できる、キット。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【手続補正書】
【提出日】2022-08-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】