ホーム > 特許ランキング > オートラス リミテッド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-27
(54)【発明の名称】ＰＳＭＡに結合する抗原結合ドメイン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230217BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230217BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230217BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230217BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230217BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230217BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230217BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230217BHJP
C07K 14/725 20060101ALN20230217BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C07K19/00
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N5/10
A61K35/17 Z
A61P35/00
C07K14/725
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022537008
(86)(22)【出願日】2020-12-18
(85)【翻訳文提出日】2022-08-04
(86)【国際出願番号】 GB2020053289
(87)【国際公開番号】W WO2021123810
(87)【国際公開日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】1919019.8
(32)【優先日】2019-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517215973
【氏名又は名称】オートラス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】オヌオハ， シモビ
(72)【発明者】
【氏名】フェラーリ， マテュー
(72)【発明者】
【氏名】デラ ペルタ， マルコ
(72)【発明者】
【氏名】キンナ， アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】コルドバ， ショーン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA92X
4B065AA92Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、抗原前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する抗原結合ドメイン、およびそのような抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。本発明者らは、改善された特性を有する新しいＰＳＭＡ結合ドメインを同定し、特徴付けた。抗原結合ドメインは、例えば、以下のいずれかを含み得る：（ａ）以下から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）、および軽鎖可変領域（ＶＬ）：（ｉ）ＶＨ－配列番号７、ＶＬ－配列番号８、（ｉｉ）ＶＨ－配列番号１５、ＶＬ－配列番号１６、（ｉｉｉ）ＶＨ－配列番号２３、ＶＬ－配列番号２４、および（ｉｖ）ＶＨ－配列番号３１、ＶＬ－配列番号３２、または（ｂ）以下から選択されるドメイン抗体可変領域：（ｉ）配列番号３６、（ｉｉ）配列番号４０、（ｉｉｉ）配列番号４４、（ｉｖ）配列番号４８、および（ｖ）配列番号５２。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する抗原結合ドメインであって、（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）：以下から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびにＣＤＲ：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号１、ＨＣＤＲ２－配列番号２、ＨＣＤＲ３－配列番号３、ＬＣＤＲ１－配列番号４、ＬＣＤＲ２－配列番号５、ＬＣＤＲ３－配列番号６、
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号９、ＨＣＤＲ２－配列番号１０、ＨＣＤＲ３－配列番号１１、ＬＣＤＲ１－配列番号１２、ＬＣＤＲ２－配列番号１３、ＬＣＤＲ３－配列番号１４、
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号１７、ＨＣＤＲ２－配列番号１８、ＨＣＤＲ３－配列番号１９、ＬＣＤＲ１－配列番号２０、ＬＣＤＲ２－配列番号２１、ＬＣＤＲ３－配列番号２２、
（ｉｖ）ＨＣＤＲ１－配列番号２５、ＨＣＤＲ２－配列番号２６、ＨＣＤＲ３－配列番号２７、ＬＣＤＲ１－配列番号２８、ＬＣＤＲ２－配列番号２９、ＬＣＤＲ３－配列番号３０、
（ｖ）ＨＣＤＲ１－配列番号３３、ＨＣＤＲ２－配列番号３４、ＨＣＤＲ３－配列番号３５、ＬＣＤＲ１－配列番号３６、ＬＣＤＲ２－配列番号３７、ＬＣＤＲ３－配列番号３８、
（ｖｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号４１、ＨＣＤＲ２－配列番号４２、ＨＣＤＲ３－配列番号４３、ＬＣＤＲ１－配列番号４４、ＬＣＤＲ２－配列番号４５、ＬＣＤＲ３－配列番号４６、および
（ｖｉｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号４９、ＨＣＤＲ２－配列番号５０、ＨＣＤＲ３－配列番号５１、ＬＣＤＲ１－配列番号５２、ＬＣＤＲ２－配列番号５３、ＬＣＤＲ３－配列番号５４、または
（ｂ）以下から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＶＨＨＣＤＲ１、ＶＨＨＣＤＲ２およびＶＨＨＣＤＲ３を有するドメイン抗体可変領域、
（ｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号５７、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号５８、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号５９、
（ｉｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号６１、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号６２、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号６３、
（ｉｉｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号６５、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号６６、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号６７、
（ｉｖ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号６９、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号７０、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号７１、および
（ｖ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号７３、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号７４、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号７５、のいずれかを含む抗原結合ドメイン。
【請求項2】
（ａ）以下から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）、および軽鎖可変領域（ＶＬ）：（ｉ）ＶＨ－配列番号７、ＶＬ－配列番号８、
（ｉｉ）ＶＨ－配列番号１５、ＶＬ－配列番号１６、
（ｉｉｉ）ＶＨ－配列番号２３、ＶＬ－配列番号２４、
（ｉｖ）ＶＨ－配列番号３１、ＶＬ－配列番号３２、
（ｖ）ＶＨ－配列番号３９、ＶＬ－配列番号４０、
（ｖｉ）ＶＨ－配列番号４７、ＶＬ－配列番号４８、および
（ｖｉｉ）ＶＨ－配列番号５５、ＶＬ－配列番号５６、または
（ｂ）以下から選択されるドメイン抗体可変領域：
（ｉ）配列番号６０、
（ｉｉ）配列番号６４、
（ｉｉｉ）配列番号６８、
（ｉｖ）配列番号７２、および
（ｖ）配列番号７６
のいずれかを含む、請求項１に記載の抗原結合ドメイン。
【請求項3】
請求項１または２に記載の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項4】
請求項１もしくは２に記載の抗原結合ドメインまたは請求項３に記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
【請求項5】
請求項４に記載の核酸配列と、自殺遺伝子をコードする核酸配列とを含む核酸構築物。
【請求項6】
請求項４に記載の核酸配列または請求項５に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項7】
請求項３に記載のＣＡＲを発現する細胞。
【請求項8】
請求項３に記載のＣＡＲをコードする核酸配列をエクスビボで細胞に導入する工程を含む、請求項７に記載の細胞を作製する方法。
【請求項9】
薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と共に、請求項７に記載の複数の細胞を含む医薬組成物。
【請求項10】
請求項７に記載の細胞を対象に投与する工程を含む、癌を処置する方法。
【請求項11】
癌の処置に使用するための、請求項７に記載の細胞。
【請求項12】
癌を処置するための薬物の製造における請求項７に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、抗原前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する抗原結合ドメインに関する。本発明はまた、そのような抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。ＰＳＭＡに結合するＣＡＲを発現する細胞は、前立腺癌、腎臓癌、乳癌および結腸癌を含む固形腫瘍などの癌性疾患の処置に有用である。
本発明は、抗原前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する抗原結合ドメインに関する。本発明はまた、そのような抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。ＰＳＭＡに結合するＣＡＲを発現する細胞は、前立腺癌、腎臓癌、乳癌および結腸癌を含む固形腫瘍などの癌性疾患の処置に有用である。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
前立腺癌
前立腺癌は、男性において最も頻繁に診断される癌型であり、癌関連死の第２の主因であると推定されている。根治的前立腺切除術は依然として最も一般的な処置選択肢の１つであり、放射線療法または化学療法と組み合わせてもよい。
前立腺癌
前立腺癌は、男性において最も頻繁に診断される癌型であり、癌関連死の第２の主因であると推定されている。根治的前立腺切除術は依然として最も一般的な処置選択肢の１つであり、放射線療法または化学療法と組み合わせてもよい。
【0003】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体は、抗体の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に移植するタンパク質である。それらの通常の形態は、Ｔ細胞の生存シグナルおよび活性化シグナルを伝達する化合物エンドドメインに全て接続された、アミノ末端を認識する抗原、スペーサー、膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である（図１ａを参照のこと）。
キメラ抗原受容体は、抗体の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に移植するタンパク質である。それらの通常の形態は、Ｔ細胞の生存シグナルおよび活性化シグナルを伝達する化合物エンドドメインに全て接続された、アミノ末端を認識する抗原、スペーサー、膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である（図１ａを参照のこと）。
【0004】
これらの分子の最も一般的な形態は、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合物である。そのような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がそのようなＣＡＲを発現する場合、Ｔ細胞は、標的抗原を発現する標的細胞を認識して死滅させる。腫瘍関連抗原に対していくつかのＣＡＲが開発されており、そのようなＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する養子移入アプローチは、様々な癌の処置のために現在臨床試験中である。
【0005】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）
前立腺癌を処置するための免疫療法アプローチの１つの標的は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グルタミン酸ペプチダーゼＩ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ Ｉ）またはＮＡＡＧペプチダーゼとしても知られる前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。ＰＳＭＡは、Ｎ－アセチルアスパルチルグルタメート（ＮＡＡＧ）のグルタメートおよびＮ－アセチルアスパルタートへの加水分解を触媒する８４ｋＤａのクラスＩＩ膜貫通亜鉛金属酵素である。タンパク質は主に細胞外であり、小さな細胞内領域のみを有する。
前立腺癌を処置するための免疫療法アプローチの１つの標的は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グルタミン酸ペプチダーゼＩ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ Ｉ）またはＮＡＡＧペプチダーゼとしても知られる前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。ＰＳＭＡは、Ｎ－アセチルアスパルチルグルタメート（ＮＡＡＧ）のグルタメートおよびＮ－アセチルアスパルタートへの加水分解を触媒する８４ｋＤａのクラスＩＩ膜貫通亜鉛金属酵素である。タンパク質は主に細胞外であり、小さな細胞内領域のみを有する。
【0006】
ＰＳＭＡは前立腺で高度に発現され、全原発性前立腺癌の９０％超で過剰発現される。健康な組織でのＰＳＭＡ発現は最小限である。したがって、ＰＳＭＡは、前立腺癌の診断および処置のための標的としての有用性を示している。さらに、ＰＳＭＡは、腎臓癌、乳癌および結腸癌における標的としての潜在的有用性を有する。
【0007】
Ｊ５９１モノクローナル抗体に基づく抗原結合ドメインを含む抗ＰＳＭＡ ＣＡＲは、以前に記載されている（Ｋｌｏｓｓ ＣＣ．ら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１８ ７月５日；２６（７）：１８５５－１８６６。）。
本発明者らは、改善された特性を有する代替ＰＳＭＡ標的化ＣＡＲを作製しようと努めた。
本発明者らは、改善された特性を有する代替ＰＳＭＡ標的化ＣＡＲを作製しようと努めた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｋｌｏｓｓ ＣＣ．ら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１８ ７月５日；２６（７）：１８５５－１８６６
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】図１は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の設計。（ａ）ＣＡＲの一般化された構造：結合ドメインは抗原を認識し、スペーサーは、結合ドメインを細胞表面から上昇させ、膜貫通ドメインはタンパク質を膜に固定し、エンドドメインはシグナルを伝達する。（ｂ）～（ｄ）：ＣＡＲエンドドメインの異なる世代および並べ替え：（ｂ）初期設計は、ＦｃεＲ１－γまたはＣＤ３ζエンドドメインを介してＩＴＡＭシグナルのみを伝達し、その後の設計は、シスにおいて追加の（ｃ）１つまたは（ｄ）２つの共刺激シグナルを伝達した。
【図2】図２は、前立腺特異的膜抗原の構造。前立腺特異的膜抗原は、７５０個のアミノ酸のクラスＩＩ膜糖タンパク質である。細胞質（細胞質ゾル）ドメインは残基１～１９である。ＩＩ型膜タンパク質のシグナルアンカーは残基２０～４３である。細胞外ドメインは残基４４～７５０である。細胞外ドメインは、プロテアーゼ、頂端およびＣ末端ドメインから構成される。
【図4】図４は、クローンファージおよびｓｃＦｖ培養物のＥＬＩＳＡアッセイ。組換えタンパク質ＥＬＩＳＡアッセイでの初期スクリーニング（ｎ＝３）後の複製物中のクローンファージおよびｓｃＦｖ培養物のＥＬＩＳＡアッセイ。
【図5】図５は、特定のファージ集団の滴定および濃縮。（ａ）組換えヒトＰＳＭＡタンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）パニングのみからのパニングラウンド１および２後の特異的ファージ集団の滴定および濃縮、（ｂ）ＰＳＭＡを発現するＳｕｐＴ１細胞に対する１ラウンドの組換えタンパク質パニングおよび１ラウンドの細胞パニング後のファージの滴定および濃縮。
【図6】図６は、モノクローナルＣ Ｍｙｃタグ付きｄＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニング。細胞パニング後の滴定プレートからのＴＧ１コロニーによって発現されるモノクローナルＣ Ｍｙｃタグ付きｄＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニング。発現をＩＰＴＧ誘導によって行い、スクリーニングを組換えヒトＰＳＭＡに対して行った。検出を、抗Ｃ ＭｙｃタグＨＲＰコンジュゲートを使用して行った。
【図7】図７は、モノクローナルＣ Ｍｙｃタグ付きｄＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニング。高（クローン３０）ＰＳＭＡ発現または低（クローン８３）ＰＳＭＡ発現を形質導入していないまたは形質導入したＳｕｐＴ１細胞に結合する抗ＰＳＭＡ ｄＡｂのフローサイトメトリー分析。ｄＡｂクローンＢ８およびＧ７は、高レベルの特異的結合を示す。
【図9】ＮＧＳのフローサイトメトリー分析により、ＰＳＭＡ発現細胞株に結合するｄＡｂ配列が同定された。ｄＡｂ ２および２５は、適切な細胞株への高い結合を示した。
【図10-1】図１０は、細胞パニングおよびＮＧＳ由来ｄＡｂを使用したＰＳＭＡ発現細胞株のＩＨＣ染色。データは、ＮＧＳ由来のクローン２および２５が陽性対照（Ｊ５９１および７Ａ１２抗体）と同等の染色を示すことを示唆する。
【図10-2】図１０は、細胞パニングおよびＮＧＳ由来ｄＡｂを使用したＰＳＭＡ発現細胞株のＩＨＣ染色。データは、ＮＧＳ由来のクローン２および２５が陽性対照（Ｊ５９１および７Ａ１２抗体）と同等の染色を示すことを示唆する。
【図10-3】図１０は、細胞パニングおよびＮＧＳ由来ｄＡｂを使用したＰＳＭＡ発現細胞株のＩＨＣ染色。データは、ＮＧＳ由来のクローン２および２５が陽性対照（Ｊ５９１および７Ａ１２抗体）と同等の染色を示すことを示唆する。
【図11-1】図１１は、ＦＡＣＳに基づく死滅アッセイ。ヒトＰＳＭＡ抗原（ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡ）を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞を標的細胞として使用した。非操作ＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＮＴ）を陰性対照として使用した。Ｔ細胞を標的細胞と１：１、１：４および１：８のエフェクター対標的比で共培養した。ＦＢＫを２４時間のインキュベーション後にアッセイし、細胞蛍光測定分析によって分析した。
【図11-2】図１１は、ＦＡＣＳに基づく死滅アッセイ。ヒトＰＳＭＡ抗原（ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡ）を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞を標的細胞として使用した。非操作ＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＮＴ）を陰性対照として使用した。Ｔ細胞を標的細胞と１：１、１：４および１：８のエフェクター対標的比で共培養した。ＦＢＫを２４時間のインキュベーション後にアッセイし、細胞蛍光測定分析によって分析した。
【図12-1】図１２は、サイトカイン放出アッセイ。ＣＡＲ－Ｔ細胞およびヒトＰＳＭＡ抗原を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡ）と陰性対照としての操作されていないＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＮＴ）との共培養物から２４時間で上清を回収することによって、ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２（上）およびＩＦＮγ（下）の分泌を測定した。Ｔ細胞を標的細胞と１：１、１：４および１：８のエフェクター対標的比で共培養した。ＩＬ－２およびＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって検出した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
発明の態様の要旨
本発明者らは、改善された特性を有する新しいＰＳＭＡ結合ドメインを同定し、特徴付けた。
本発明者らは、改善された特性を有する新しいＰＳＭＡ結合ドメインを同定し、特徴付けた。
【0011】
したがって、第１の態様では、本発明は、前立腺特異的膜抗原に結合し、以下のいずれかを含む抗原結合ドメインを提供する：
（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）：以下から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：ならびにＣＤＲ：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号１、ＨＣＤＲ２－配列番号２、ＨＣＤＲ３－配列番号３、ＬＣＤＲ１－配列番号４、ＬＣＤＲ２－配列番号５、ＬＣＤＲ３－配列番号６、
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号９、ＨＣＤＲ２－配列番号１０、ＨＣＤＲ３－配列番号１１、ＬＣＤＲ１－配列番号１２、ＬＣＤＲ２－配列番号１３、ＬＣＤＲ３－配列番号１４、
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号１７、ＨＣＤＲ２－配列番号１８、ＨＣＤＲ３－配列番号１９、ＬＣＤＲ１－配列番号２０、ＬＣＤＲ２－配列番号２１、ＬＣＤＲ３－配列番号２２、
（ｉｖ）ＨＣＤＲ１－配列番号２５、ＨＣＤＲ２－配列番号２６、ＨＣＤＲ３－配列番号２７、ＬＣＤＲ１－配列番号２８、ＬＣＤＲ２－配列番号２９、ＬＣＤＲ３－配列番号３０、または
（ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）：以下から選択されるＶＨＨＣＤＲ１、ＶＨＨＣＤＲ２およびＶＨＨＣＤＲ３を有するドメイン抗体可変領域：
（ｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号３３、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号３４、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号３５、
（ｉｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号３７、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号３８、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号３９、
（ｉｉｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号４１、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号４２、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号４３、
（ｉｖ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号４５、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号４６、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号４７、および
（ｖ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号４９、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号５０、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号５１。
（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）：以下から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：ならびにＣＤＲ：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号１、ＨＣＤＲ２－配列番号２、ＨＣＤＲ３－配列番号３、ＬＣＤＲ１－配列番号４、ＬＣＤＲ２－配列番号５、ＬＣＤＲ３－配列番号６、
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号９、ＨＣＤＲ２－配列番号１０、ＨＣＤＲ３－配列番号１１、ＬＣＤＲ１－配列番号１２、ＬＣＤＲ２－配列番号１３、ＬＣＤＲ３－配列番号１４、
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号１７、ＨＣＤＲ２－配列番号１８、ＨＣＤＲ３－配列番号１９、ＬＣＤＲ１－配列番号２０、ＬＣＤＲ２－配列番号２１、ＬＣＤＲ３－配列番号２２、
（ｉｖ）ＨＣＤＲ１－配列番号２５、ＨＣＤＲ２－配列番号２６、ＨＣＤＲ３－配列番号２７、ＬＣＤＲ１－配列番号２８、ＬＣＤＲ２－配列番号２９、ＬＣＤＲ３－配列番号３０、または
（ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲ）：以下から選択されるＶＨＨＣＤＲ１、ＶＨＨＣＤＲ２およびＶＨＨＣＤＲ３を有するドメイン抗体可変領域：
（ｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号３３、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号３４、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号３５、
（ｉｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号３７、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号３８、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号３９、
（ｉｉｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号４１、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号４２、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号４３、
（ｉｖ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号４５、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号４６、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号４７、および
（ｖ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号４９、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号５０、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号５１。
【0012】
抗原結合ドメインは、例えば、以下のいずれかを含み得る：
（ａ）以下から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）、および軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉ）ＶＨ－配列番号７、ＶＬ－配列番号８、
（ｉｉ）ＶＨ－配列番号１５、ＶＬ－配列番号１６、
（ｉｉｉ）ＶＨ－配列番号２３、ＶＬ－配列番号２４、および
（ｉｖ）ＶＨ－配列番号３１、ＶＬ－配列番号３２、または
（ｂ）以下から選択されるドメイン抗体可変領域：
（ｉ）配列番号３６、
（ｉｉ）配列番号４０、
（ｉｉｉ）配列番号４４、
（ｉｖ）配列番号４８、および
（ｖ）配列番号５２。
（ａ）以下から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）、および軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉ）ＶＨ－配列番号７、ＶＬ－配列番号８、
（ｉｉ）ＶＨ－配列番号１５、ＶＬ－配列番号１６、
（ｉｉｉ）ＶＨ－配列番号２３、ＶＬ－配列番号２４、および
（ｉｖ）ＶＨ－配列番号３１、ＶＬ－配列番号３２、または
（ｂ）以下から選択されるドメイン抗体可変領域：
（ｉ）配列番号３６、
（ｉｉ）配列番号４０、
（ｉｉｉ）配列番号４４、
（ｉｖ）配列番号４８、および
（ｖ）配列番号５２。
【0013】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【0014】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様による抗原結合ドメインまたは本発明の第２の態様によるＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。
【0015】
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様に記載の核酸配列と自殺遺伝子をコードする核酸配列とを含む核酸構築物を提供する。
【0016】
第５の態様において、本発明は、本発明の第３の態様に記載の核酸配列または本発明の第４の態様に記載の核酸構築物を含むベクターを提供する。
【0017】
第６の態様では、本発明は、本発明の第２の態様によるＣＡＲを発現する細胞を提供する。
【0018】
第７の態様において、本発明は、本発明の第６の態様による細胞を作製する方法であって、本発明の第２の態様によるＣＡＲをコードする核酸配列をエクスビボで細胞に導入する工程を含む方法を提供する。
【0019】
第８の態様では、本発明は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と共に、本発明の第６の態様による複数の細胞を含む医薬組成物を提供する。
【0020】
第９の態様では、本発明は、本発明の第６の態様に記載の細胞を対象に投与する工程を含む、癌を処置する方法を提供する。
【0021】
第１０の態様では、本発明は、癌の処置に使用するための本発明の第６の態様による細胞を提供する。
【0022】
第１１の態様では、本発明は、癌を処置するための薬物の製造における本発明の第６の態様による細胞の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0023】
詳細な記載
抗原結合ドメイン
本発明の抗原結合ドメインは、標的抗原ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体ベースの結合ドメインである。
抗原結合ドメイン
本発明の抗原結合ドメインは、標的抗原ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体ベースの結合ドメインである。
【0024】
ＩｇＧ分子などの抗体の抗原結合ドメインは、２つの可変ドメインで構成され、１つは重鎖（ＶＨ）に由来し、１つは軽鎖（ＶＬ）に由来する。本発明の抗原結合ドメインのいくつかは、ＶＨドメインとＶＬドメインの両方を含む。
【0025】
ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む本発明の抗原結合ドメインは、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはＦａｂフォーマットであり得る。本発明のＣＡＲは、図３ａ（Ｆａｂ）および図３ｃ（ｓｃＦｖ）に例示されるように、例えばｓｃＦｖまたはＦａｂベースの抗原結合ドメインを含み得る。
【0026】
抗原結合ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）：以下から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびにＣＤＲ：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る：
（ｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号１、ＨＣＤＲ２－配列番号２、ＨＣＤＲ３－配列番号３、ＬＣＤＲ１－配列番号４、ＬＣＤＲ２－配列番号５、ＬＣＤＲ３－配列番号６、
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号９、ＨＣＤＲ２－配列番号１０、ＨＣＤＲ３－配列番号１１、ＬＣＤＲ１－配列番号１２、ＬＣＤＲ２－配列番号１３、ＬＣＤＲ３－配列番号１４、
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号１７、ＨＣＤＲ２－配列番号１８、ＨＣＤＲ３－配列番号１９、ＬＣＤＲ１－配列番号２０、ＬＣＤＲ２－配列番号２１、ＬＣＤＲ３－配列番号２２、および
（ｉｖ）ＨＣＤＲ１－配列番号２５、ＨＣＤＲ２－配列番号２６、ＨＣＤＲ３－配列番号２７、ＬＣＤＲ１－配列番号２８、ＬＣＤＲ２－配列番号２９、ＬＣＤＲ３－配列番号３０、または
（ｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号１、ＨＣＤＲ２－配列番号２、ＨＣＤＲ３－配列番号３、ＬＣＤＲ１－配列番号４、ＬＣＤＲ２－配列番号５、ＬＣＤＲ３－配列番号６、
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号９、ＨＣＤＲ２－配列番号１０、ＨＣＤＲ３－配列番号１１、ＬＣＤＲ１－配列番号１２、ＬＣＤＲ２－配列番号１３、ＬＣＤＲ３－配列番号１４、
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ１－配列番号１７、ＨＣＤＲ２－配列番号１８、ＨＣＤＲ３－配列番号１９、ＬＣＤＲ１－配列番号２０、ＬＣＤＲ２－配列番号２１、ＬＣＤＲ３－配列番号２２、および
（ｉｖ）ＨＣＤＲ１－配列番号２５、ＨＣＤＲ２－配列番号２６、ＨＣＤＲ３－配列番号２７、ＬＣＤＲ１－配列番号２８、ＬＣＤＲ２－配列番号２９、ＬＣＤＲ３－配列番号３０、または
【0027】
配列中のＣＤＲの位置は、異なるナンバリングスキーム、例えばＫａｂａｔおよびＩＭＧＴによって決定され得る。本出願では、特に明記しない限り、Ｋａｂａｔナンバリングシステムが使用される。
【0028】
抗原結合ドメインは、
（ｉ）ＶＨ－配列番号７、ＶＬ－配列番号８、
（ｉｉ）ＶＨ－配列番号１５、ＶＬ－配列番号１６、
（ｉｉｉ）ＶＨ－配列番号２３、ＶＬ－配列番号２４、および
（ｉｖ）ＶＨ－配列番号３１、ＶＬ－配列番号３２の対のＶＨ／ＶＬドメインのうちの１つを含み得る。
（ｉ）ＶＨ－配列番号７、ＶＬ－配列番号８、
（ｉｉ）ＶＨ－配列番号１５、ＶＬ－配列番号１６、
（ｉｉｉ）ＶＨ－配列番号２３、ＶＬ－配列番号２４、および
（ｉｖ）ＶＨ－配列番号３１、ＶＬ－配列番号３２の対のＶＨ／ＶＬドメインのうちの１つを含み得る。
【化1-1】
【化1-2】
【化1-3】
【化1-4】
【0029】
７Ａ１２についての以下の代替のヒト化軽鎖も提供される（ＣＤＲはＫａｂａｔナンバリングシステムに従って決定される）。
【化2-1】
【化2-2】
【化2-3】
【化2-4】
【0030】
さらに、７Ａ１２のヒト化重鎖も提供される（ＣＤＲはＫａｂａｔナンバリングシステムに従って決定される）。
【化3-1】
【化3-2】
【0031】
これらの配列から、ＣＤＲについての以下のコンセンサス配列を決定することができ、「Ｘ」は任意の天然アミノ酸であり得る。
【表A-1】
【表A-2】
【0032】
あるいは、本発明の抗原結合ドメインは、単一の可変ドメインを含み得る。
【0033】
ナノボディとしても知られる単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。
【0034】
第１の単一ドメイン抗体を、ラクダ科動物に見られる重鎖抗体から操作した。これらはＶＨＨフラグメントと呼ばれる。軟骨魚類はまた、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新規抗原受容体」）を有し、そこからＶＮＡＲフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。単一ドメイン抗体に関するほとんどの研究は、現在、重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖に由来するナノボディも、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。
【0035】
本発明の抗原結合ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）：以下から選択されるＶＨＨＣＤＲ１、ＶＨＨＣＤＲ２およびＶＨＨＣＤＲ３を有するドメイン抗体可変領域を含み得る：
ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号３３、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号３４、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号３５、
（ｉｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号３７、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号３８、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号３９、
（ｉｉｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号４１、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号４２、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号４３、
（ｉｖ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号４５、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号４６、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号４７、および
（ｖ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号４９、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号５０、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号５１。
ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号３３、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号３４、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号３５、
（ｉｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号３７、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号３８、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号３９、
（ｉｉｉ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号４１、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号４２、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号４３、
（ｉｖ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号４５、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号４６、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号４７、および
（ｖ）ＶＨＨＣＤＲ１－配列番号４９、ＶＨＨＣＤＲ２－配列番号５０、ＶＨＨＣＤＲ３－配列番号５１。
【0036】
抗原結合ドメインは、例えば、以下から選択されるドメイン抗体可変領域を含み得る：
（ｉ）配列番号３６、
（ｉｉ）配列番号４０、
（ｉｉｉ）配列番号４４、
（ｉｖ）配列番号４８、および
（ｖ）配列番号５２。
（ｉ）配列番号３６、
（ｉｉ）配列番号４０、
（ｉｉｉ）配列番号４４、
（ｉｖ）配列番号４８、および
（ｖ）配列番号５２。
【化4-1】
【化4-2】
【0037】
本発明者らは、本発明の抗原結合ドメインが酸性ｐＨで改善された安定性を有することを見出した（実施例７参照）。腫瘍微小環境は酸性であるため、これらの抗原結合ドメインは、固形癌の処置において有益な特性を有することが提案されている。
【0038】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲＳ）
古典的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原認識ドメイン（結合剤）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続するキメラＩ型膜貫通タンパク質である。結合剤は、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことができる。結合剤を膜から単離し、適切な配向を可能にするために、スペーサードメインが通常必要である。使用される共通のスペーサードメインはＩｇＧ１のＦｃである。
よりコンパクトなスペーサーは、抗原に応じて、例えばＣＤ８αからの柄、さらにはＩｇＧ１ヒンジのみで十分であり得る。膜貫通ドメインは、タンパク質を細胞膜に固定し、スペーサーをエンドドメインに接続する。
古典的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原認識ドメイン（結合剤）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続するキメラＩ型膜貫通タンパク質である。結合剤は、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことができる。結合剤を膜から単離し、適切な配向を可能にするために、スペーサードメインが通常必要である。使用される共通のスペーサードメインはＩｇＧ１のＦｃである。
よりコンパクトなスペーサーは、抗原に応じて、例えばＣＤ８αからの柄、さらにはＩｇＧ１ヒンジのみで十分であり得る。膜貫通ドメインは、タンパク質を細胞膜に固定し、スペーサーをエンドドメインに接続する。
【0039】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖のいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。その結果、これらの第一世代受容体は免疫学的シグナル１を伝達し、これは、同族標的細胞のＴ細胞死滅を誘発するのに十分であったが、増殖して生存するためにＴ細胞を完全に活性化することができなかった。この制限を克服するために、化合物エンドドメインが構築されている。Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分との融合は、抗原認識後に同時に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを伝達することができる第二世代受容体をもたらす。最も一般的に使用される共刺激ドメインはＣＤ２８の共刺激ドメインである。
これは、最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給し、Ｔ細胞増殖を誘発する。生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４１ＢＢなどのＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含むいくつかの受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有する、さらにより強力な第三世代ＣＡＲがここに記載されている（図１）。
これは、最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給し、Ｔ細胞増殖を誘発する。生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４１ＢＢなどのＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含むいくつかの受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有する、さらにより強力な第三世代ＣＡＲがここに記載されている（図１）。
【0040】
ＣＡＲが標的抗原に結合すると、これは、ＣＡＲが発現するＴ細胞への活性化シグナルの伝達をもたらす。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を、標的抗原を発現する腫瘍細胞に向ける。
【0041】
したがって、ＣＡＲは、典型的には、（ｉ）抗原結合ドメイン、（ｉｉ）スペーサー、（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインを含むかまたはそれと会合する細胞内ドメインを含む。
【0042】
ＣＡＲは、以下の一般構造を有し得る。
【0043】
抗原結合ドメイン－スペーサードメイン－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）。
【0044】
ＣＡＲ抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するキメラ受容体の部分である。古典的ＣＡＲでは、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む（図３ｃを参照のこと）。ＣＡＲはまた、ドメイン抗体（ｄＡｂ）またはＶＨＨ抗原結合ドメインを用いて産生されている（図３ｂを参照のこと）。
抗原結合ドメインは、抗原を認識するキメラ受容体の部分である。古典的ＣＡＲでは、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む（図３ｃを参照のこと）。ＣＡＲはまた、ドメイン抗体（ｄＡｂ）またはＶＨＨ抗原結合ドメインを用いて産生されている（図３ｂを参照のこと）。
【0045】
ＣＡＲは、抗体のＦａｂフラグメントを含み得る（図３ａを参照のこと）。ＦａｂＣＡＲは、抗体様軽鎖可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）を有する２つの鎖を含む。重鎖可変領域（ＶＨ）および定常領域（ＣＨ）を有するものである。一方の鎖はまた、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＬとＣＨとの間の会合は、受容体の集合を引き起こす。
【0046】
Ｆａｂ ＣＡＲの２つの鎖は、一般構造：
ＶＨ－ＣＨ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン、および
ＶＬ－ＣＬ
または
ＶＬ－ＣＬ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン、および
ＶＨ－ＣＨ
を有し得る。
ＶＨ－ＣＨ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン、および
ＶＬ－ＣＬ
または
ＶＬ－ＣＬ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン、および
ＶＨ－ＣＨ
を有し得る。
【0047】
本明細書中に記載されるＦａｂ型キメラ受容体の場合、抗原結合ドメインは、１つのポリペプチド鎖からのＶＨおよび別のポリペプチド鎖からのＶＬから構成される。
【0048】
ポリペプチド鎖は、ＶＨ／ＶＬドメインとＣＨ／ＣＬドメインとの間にリンカーを含み得る。リンカーは柔軟であってよく、ＶＨ／ＶＬドメインをＣＨ／ＣＬドメインから空間的に分離するのに役立ち得る。
【0049】
あるいは、ＣＡＲは、抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み得る（図３ｃを参照のこと）。これらの「古典的」ＣＡＲにおいて、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、分子中でどちらの配向にあってもよく、一般構造：
ＶＨ－ＶＬ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン、または
ＶＬ－ＶＨ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン
を与える。
ＶＨ－ＶＬ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン、または
ＶＬ－ＶＨ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン
を与える。
【0050】
ポリペプチド鎖は、ＶＨ／ＶＬの対形成および抗原結合部位の形成を可能にするのに十分な柔軟性を提供するために、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にリンカーを含み得る。
【0051】
【0052】
スペーサー
ＣＡＲは一般に、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するためのスペーサー配列またはヒンジ領域を含む。柔軟なスペーサーは、抗原結合ドメインが結合を促進するために異なる方向に配向することを可能にする。
ＣＡＲは一般に、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するためのスペーサー配列またはヒンジ領域を含む。柔軟なスペーサーは、抗原結合ドメインが結合を促進するために異なる方向に配向することを可能にする。
【0053】
スペーサーは、天然起源分子の全部もしくは一部、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４もしくはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部に由来し得る。特に、スペーサーは、ヒトＣＤ８アルファ鎖、ＦｃγＲＩＩＩα受容体またはＩｇＧ１に由来し得る。
スペーサーは、天然起源のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、または完全に合成された配列であってもよい。スペーサーは、最大３００個のアミノ酸、例えば１０～１００個のアミノ酸および／または２５～５０個のアミノ酸を含み得る。
スペーサーは、天然起源のヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、または完全に合成された配列であってもよい。スペーサーは、最大３００個のアミノ酸、例えば１０～１００個のアミノ酸および／または２５～５０個のアミノ酸を含み得る。
【0054】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にまたがるキメラ受容体の部分である。膜貫通ドメインは、膜中で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基から構成されるアルファヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを使用して、キメラ受容体の膜貫通部分を供給することができる。タンパク質の膜貫通ドメインの存在およびスパンは、当業者によって、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０／）を使用して決定することができる。あるいは、人工的に設計されたＴＭドメインを使用してもよい。
膜貫通ドメインは、膜にまたがるキメラ受容体の部分である。膜貫通ドメインは、膜中で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基から構成されるアルファヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを使用して、キメラ受容体の膜貫通部分を供給することができる。タンパク質の膜貫通ドメインの存在およびスパンは、当業者によって、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０／）を使用して決定することができる。あるいは、人工的に設計されたＴＭドメインを使用してもよい。
【0055】
エンドドメイン
エンドドメインは、キメラ受容体のシグナル伝達部分である。それは、キメラ受容体の細胞内ドメインの一部であり得るか、またはそれと会合し得る。抗原認識後、受容体クラスター、ネイティブＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３－ゼータの成分である。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３－ゼータは、完全に適格な活性化シグナルを提供し得ず、さらなる共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。共刺激シグナルは、Ｔ細胞の増殖および生存を促進する。共刺激シグナルには２つの主なタイプ：Ｉｇファミリーに属するもの（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）およびＴＮＦファミリーに属するもの（ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ等）がある。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、増殖／生存シグナルを伝達するためにＣＤ３－ゼータと共に使用することができるか、または３つ全てを一緒に使用することができる。
エンドドメインは、キメラ受容体のシグナル伝達部分である。それは、キメラ受容体の細胞内ドメインの一部であり得るか、またはそれと会合し得る。抗原認識後、受容体クラスター、ネイティブＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３－ゼータの成分である。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３－ゼータは、完全に適格な活性化シグナルを提供し得ず、さらなる共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。共刺激シグナルは、Ｔ細胞の増殖および生存を促進する。共刺激シグナルには２つの主なタイプ：Ｉｇファミリーに属するもの（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）およびＴＮＦファミリーに属するもの（ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ等）がある。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、増殖／生存シグナルを伝達するためにＣＤ３－ゼータと共に使用することができるか、または３つ全てを一緒に使用することができる。
【0056】
エンドドメインは、
（ｉ）ＩＴＡＭ含有エンドドメイン、例えばＣＤ３ζ由来のエンドドメイン、および／または
（ｉｉ）共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８またはＩＣＯＳ由来のエンドドメイン、および／または
（ｉｉｉ）生存シグナルを伝達するドメイン、例えば、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７またはＧＩＴＲなどのＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン
を含み得る。
（ｉ）ＩＴＡＭ含有エンドドメイン、例えばＣＤ３ζ由来のエンドドメイン、および／または
（ｉｉ）共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８またはＩＣＯＳ由来のエンドドメイン、および／または
（ｉｉｉ）生存シグナルを伝達するドメイン、例えば、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７またはＧＩＴＲなどのＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン
を含み得る。
【0057】
抗原認識部分がシグナル伝達部分とは別の分子上にあるいくつかの系が記載されており、例えば国際公開第０１５／１５０７７１号、国際公開第２０１６／１２４９３０号および国際公開第２０１６／０３０６９１号に記載されているものがある。
したがって、本発明のキメラ受容体は、抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含む抗原結合成分を含み得る。それは、シグナル伝達ドメインを含む別個の細胞内シグナル伝達成分と相互作用することができる。本発明のベクターは、そのような抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分を含むキメラ受容体シグナル伝達系を発現し得る。
したがって、本発明のキメラ受容体は、抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含む抗原結合成分を含み得る。それは、シグナル伝達ドメインを含む別個の細胞内シグナル伝達成分と相互作用することができる。本発明のベクターは、そのような抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分を含むキメラ受容体シグナル伝達系を発現し得る。
【0058】
キメラ受容体は、細胞内で発現される場合に、新生タンパク質が小胞体に向けられ、続いて細胞表面に向けられて発現されるように、シグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあり得る。
【0059】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）
前立腺特異的膜抗原は、Ｎ－アセチルアスパルチルグルタメート（ＮＡＡＧ）のグルタメートおよびＮ－アセチルアスパルタート（ＮＡＡ）への加水分解を触媒するクラスＩＩ膜糖タンパク質である。これは、ヒトにおいてＦＯＬＨ１遺伝子によってコードされる亜鉛金属酵素である。
前立腺特異的膜抗原は、Ｎ－アセチルアスパルチルグルタメート（ＮＡＡＧ）のグルタメートおよびＮ－アセチルアスパルタート（ＮＡＡ）への加水分解を触媒するクラスＩＩ膜糖タンパク質である。これは、ヒトにおいてＦＯＬＨ１遺伝子によってコードされる亜鉛金属酵素である。
【0060】
ヒトＰＳＭＡのアミノ酸配列は、受託番号Ｑ０４６０９（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ０４６０９）でＵｎｉｐｒｏｔから入手可能である。この７５０アミノ酸配列では、細胞質ドメインは残基１～１９である。ＩＩ型膜タンパク質のシグナルアンカーは残基２０～４３である。細胞外ドメインは残基４４～７５０である。
細胞外ドメインは、プロテアーゼ、頂端およびＣ末端ドメインからなる（図２を参照のこと）。
細胞外ドメインは、プロテアーゼ、頂端およびＣ末端ドメインからなる（図２を参照のこと）。
【0061】
核酸配列
本発明はまた、本発明の抗原結合ドメインまたはＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。
本発明はまた、本発明の抗原結合ドメインまたはＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。
【0062】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、互いに同義であることを意図している。
【0063】
多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝暗号の縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることが当業者によって理解されるであろう。さらに、当業者は、日常的な技術を使用して、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行って、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映し得ることを理解されたい。
【0064】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは一本鎖または二本鎖であり得る。それらはまた、それらの中に合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾は、当技術分野で公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書に記載の使用の目的のために、ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得ることを理解されたい。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われ得る。
【0065】
ヌクレオチド配列に関する「バリアント」、「ホモログ」または「誘導体」という用語は、配列からのまたは配列への１つ（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失または付加を含む。
【0066】
核酸配列は、特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得る。
【0067】
核酸構築物
本発明はまた、本発明のＦａｂ型ＣＡＲをコードする核酸構築物を提供する。
本発明はまた、本発明のＦａｂ型ＣＡＲをコードする核酸構築物を提供する。
【0068】
ＦａｂＣＡＲをコードする核酸構築物（図３Ａ）は、以下の構造を有し得る。
ＶＨ－ＣＨ－スペーサーＴＭ－エンド－ｃｏｅｘｐｒ－ＶＬ－ＣＬまたは
ＶＬ－ＣＬ－スペーサーＴＭ－エンド－ｃｏｅｘｐｒ－ＶＨ－ＣＨ
（式中、
ＶＨは、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり、
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり、
スペーサーは、スペーサーをコードする核酸であり、
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
エンドは、エンドドメインをコードする核酸配列であり、
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり、
ＶＬは、軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり、および
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である。）
ＶＨ－ＣＨ－スペーサーＴＭ－エンド－ｃｏｅｘｐｒ－ＶＬ－ＣＬまたは
ＶＬ－ＣＬ－スペーサーＴＭ－エンド－ｃｏｅｘｐｒ－ＶＨ－ＣＨ
（式中、
ＶＨは、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり、
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり、
スペーサーは、スペーサーをコードする核酸であり、
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
エンドは、エンドドメインをコードする核酸配列であり、
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり、
ＶＬは、軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり、および
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である。）
【0069】
上記の両方の構造について、２つのポリペプチドをコードする核酸配列は、構築物中のいずれの順序であってもよい。
【0070】
上記の構造において、「ｃｏｅｘｐｒ」は、別々の実体として２つのポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列である。これは、核酸構築物が切断部位によって連結された両方のポリペプチドを産生するように、切断部位をコードする配列であり得る。切断部位は自己切断性であってよく、ポリペプチドが産生される場合に、いかなる外部切断活性も必要とせずに個々のペプチドに直ちに切断される。
【0071】
切断部位は、２つのポリペプチドが分離されることを可能にする任意の配列であり得る。
【0072】
「切断」という用語は、便宜上本明細書で使用されるが、切断部位は、古典的な切断以外の機構によってペプチドを個々の実体に分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下を参照のこと）については、「切断」活性：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解または翻訳効果を説明するための様々なモデルが提案されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。そのような「切断」の正確な機構は、切断部位が、タンパク質をコードする核酸配列の間に位置するとき、タンパク質を別個の実体として発現させる限り、本発明の目的にとって重要ではない。
【0073】
切断部位は、例えば、フリン切断部位、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得るか、または自己切断ペプチドをコードし得る。
【0074】
「自己切断性ペプチド」とは、タンパク質および自己切断性ペプチドを含むポリペプチドが産生されると、いかなる外部切断活性も必要とせずに直ちに「切断」されるか、または別個の独立した第１および第２のポリペプチドに分離されるように機能するペプチドを指す。
【0075】
自己切断性ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルスからの２Ａ自己切断性ペプチドであり得る。アプトウイルスおよびカルジオウイルスの一次２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端で２Ａ「切断」によって媒介される。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなどのアポトウイルスでは、２Ａ領域は約１８個のアミノ酸の短いセクションであり、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存されたプロリン残基）と共に、それ自体のＣ末端で「切断」を媒介することができる自律的要素を表す（上記のＤｏｎｅｌｌｙら（２００１））。
【0076】
「２Ａ様」配列は、アプトまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、ならびにトリパノソーマ種および細菌配列内の反復配列で見出されている（上記のＤｏｎｎｅｌｌｙら（２００１））。
【0077】
切断部位は、配列番号１６１（ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）として示される２Ａ様配列を含み得る。
【0078】
本発明はまた、本発明のＣＡＲをコードする１またはそれを超える核酸配列を、自殺遺伝子などの別の分子をコードする核酸配列と共に含む核酸構築物を提供する。
【0079】
自殺遺伝子は、許容できない毒性に直面して、養子移入された細胞、例えばＴ細胞の選択的破壊を可能にする遺伝的にコードされた機構である。
【0080】
自殺遺伝子は、国際公開第２０１３／１５３３９１号に記載されている、その文献の配列番号４として示されている配列を有する「ＲＱＲ８」、または国際公開第２０１６／１３５４７０号に記載されている「Ｒａｐｃａｓｐ９」であり得る。
【0081】
ベクター
本発明はまた、本発明による抗原結合ドメインまたはキメラ抗原受容体をコードする１またはそれを超える核酸配列を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。そのようなベクターは、抗原結合ドメインまたはキメラ抗原受容体を発現するように、核酸配列を宿主細胞に導入するために使用され得る。
本発明はまた、本発明による抗原結合ドメインまたはキメラ抗原受容体をコードする１またはそれを超える核酸配列を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。そのようなベクターは、抗原結合ドメインまたはキメラ抗原受容体を発現するように、核酸配列を宿主細胞に導入するために使用され得る。
【0082】
ベクターは、例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンベースのベクターもしくは合成ｍＲＮＡであり得る。
【0083】
ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞をトランスフェクトまたは形質導入することが可能であり得る。
【0084】
細胞
本発明は、本発明のキメラ抗原受容体を含む細胞を提供する。
本発明は、本発明のキメラ抗原受容体を含む細胞を提供する。
【0085】
細胞は、本発明の核酸配列、核酸構築物またはベクターを含み得る。
【0086】
細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞溶解性免疫細胞であり得る。
【0087】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種である。それらは、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球と区別することができる。以下に要約するように、様々なタイプのＴ細胞が存在する。
【0088】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的過程において他の白血球を支援する。ＴＨ細胞は、その表面にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示されると活性化される。これらの細胞は、異なる種類の免疫応答を促進するために異なるサイトカインを分泌するＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９またはＴＦＨを含むいくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができる。
【0089】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。ＣＴＬは、その表面にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。制御性Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ－１０、アデノシンおよび他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、アネルギー状態に不活性化されることがあり、これにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患が予防される。
【0090】
メモリーＴ細胞は、感染が消散した後に長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同族抗原に再曝露されるとすぐに多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、したがって免疫系に過去の感染に対する「メモリー」を提供する。メモリーＴ細胞は、３つのサブタイプ：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【0091】
以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持にとって極めて重要である。それらの主な役割は、免疫反応の終わりに向かってＴ細胞性免疫を遮断し、胸腺における陰性選択の過程を脱した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【0092】
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラス、すなわち天然起源Ｔｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞が記載されている。
【0093】
天然起源Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られる）は、胸腺で生じ、発達中のＴ細胞と、ＴＳＬＰで活性化された骨髄系（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方との間の相互作用に関連している。天然起源Ｔｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって他のＴ細胞と区別することができる。
ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、制御性Ｔ細胞の発達を妨げ、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こす可能性がある。
ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、制御性Ｔ細胞の発達を妨げ、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こす可能性がある。
【0094】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られる）は、正常な免疫応答の間に生じ得る。
【0095】
細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、自然免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的な様式でウイルス感染細胞からの自然シグナルに対する迅速な応答を提供する
【0096】
ＮＫ細胞（自然リンパ系細胞の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通リンパ球前駆体から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺において分化および成熟し、その後、循環に入ることが知られている。
【0097】
本発明の細胞は、上記の細胞型のいずれかであり得る。
【0098】
本発明の第１の態様による細胞は、患者自身の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）からの造血幹細胞移植の状況で、または非血縁ドナー（第三者）からの末梢血のいずれかからエクスビボで作製され得る。
【0099】
あるいは、本発明の第１の態様による細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞またはＮＫ細胞へのエクスビボ分化に由来し得る。あるいは、その溶解機能を保持し、治療薬として作用し得る不死化Ｔ細胞株が使用され得る。
【0100】
全てのこれらの実施形態において、キメラポリペプチド発現細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡによるトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つによって、キメラポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって作製される。
【0101】
本発明の細胞は、対象からのエクスビボ細胞であり得る。細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料からであり得る。細胞は、本発明の第１の態様のキメラポリペプチドを提供する分子をコードする核酸で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体で処理することによって、活性化および／または増殖され得る。
【0102】
本発明の細胞は、
（ｉ）対象または上に列挙した他の供給源からの細胞含有試料の単離、および
（ｉｉ）キメラポリペプチドをコードする１またはそれを超える核酸配列での細胞の形質導入またはトランスフェクション
によって、作製され得る。
（ｉ）対象または上に列挙した他の供給源からの細胞含有試料の単離、および
（ｉｉ）キメラポリペプチドをコードする１またはそれを超える核酸配列での細胞の形質導入またはトランスフェクション
によって、作製され得る。
【0103】
次いで、細胞を、例えば抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択される精製によって得ることができる。
【0104】
医薬組成物
本発明はまた、本発明による複数の細胞を含有する医薬組成物に関する。
本発明はまた、本発明による複数の細胞を含有する医薬組成物に関する。
【0105】
医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでもよい。医薬組成物は、必要に応じて、１またはそれを超えるさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であり得る。
【0106】
処置方法
本発明は、疾患を処置および／または予防する方法であって、本発明の細胞を（例えば、上記の医薬組成物中で）対象に投与する工程を含む方法を提供する。
本発明は、疾患を処置および／または予防する方法であって、本発明の細胞を（例えば、上記の医薬組成物中で）対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【0107】
疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書では、細胞は、疾患に関連する少なくとも１つの症候を軽減、低減もしくは改善するために、および／または疾患の進行を減速、低減もしくは遮断するために、既存の疾患または症状を有する対象に投与され得る。
【0108】
疾患を予防する方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。本明細書では、そのような細胞は、疾患の原因を予防もしくは損なうため、または疾患に関連する少なくとも１つの症候の発生を軽減もしくは予防するために、疾患にまだ罹患していないおよび／または疾患の任意の症候を示していない対象に投与され得る。対象は、疾患の素因を有するか、または疾患を発症するリスクがあると考えられ得る。
【0109】
本方法は、
（ｉ）細胞含有試料を単離する工程、
（ｉｉ）本発明によって提供される核酸配列またはベクターをそのような細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を対象に投与する工程、
に関与し得る。
（ｉ）細胞含有試料を単離する工程、
（ｉｉ）本発明によって提供される核酸配列またはベクターをそのような細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を対象に投与する工程、
に関与し得る。
【0110】
細胞含有試料は、例えば上記のように、対象または他の供給源から単離され得る。細胞は、対象自身の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）からの造血幹細胞移植の状況で、または非血縁ドナー（第三者）からの末梢血から単離され得る。
【0111】
本発明は、疾患の処置および／または予防における使用のための本発明のＣＡＲ発現細胞を提供する。
【0112】
本発明はまた、疾患を処置および／または予防するための薬物の製造における本発明のＣＡＲ発現細胞の使用に関する。
【0113】
本発明の方法によって処置および／または予防される疾患は、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（腎細胞）、白血病、肺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、および甲状腺癌などの癌性疾患であり得る。
【0114】
特に、疾患は前立腺癌であり得る。
【0115】
本発明の細胞は、癌細胞などの標的細胞を死滅させることができる場合がある。標的細胞は、標的細胞の近傍における腫瘍分泌リガンドまたはケモカインリガンドの存在を特徴とし得る。標的細胞は、標的細胞表面での腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現と共に可溶性リガンドの存在を特徴とし得る。
【0116】
本発明の細胞および医薬組成物は、上記疾患の処置および／または予防に使用するためのものであり得る。
【0117】
ここで、本発明を実施例によってさらに説明するが、これらは当業者が本発明を実施するのを助けるのに役立つことを意図しており、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【0118】
実施例１－ＰＳＭＡ結合剤の生成
免疫化後にラットファージディスプレイライブラリーを作製し、ビーズ上に固定化された社内組換えヒトＰＳＭＡに対してパニングした。特異的ファージの濃縮を示した後、ファージＥＬＩＳＡアッセイを使用してライブラリーをスクリーニングし、単離されたクローンを配列決定した。さらなる分析のためにマウスＩｇＧ２Ａ Ｆｃベクターにクローニングする前に陽性選択を確認するためにクローンの結合を再評価した。
免疫化後にラットファージディスプレイライブラリーを作製し、ビーズ上に固定化された社内組換えヒトＰＳＭＡに対してパニングした。特異的ファージの濃縮を示した後、ファージＥＬＩＳＡアッセイを使用してライブラリーをスクリーニングし、単離されたクローンを配列決定した。さらなる分析のためにマウスＩｇＧ２Ａ Ｆｃベクターにクローニングする前に陽性選択を確認するためにクローンの結合を再評価した。
【0119】
材料および方法
Ｓｔｒｅｐ２タグ付きＰＳＭＡの作製
ＳｔｒｅｐＩＩタグ付きＰＳＭＡ（ＭＰ２７０３４）を社内で作製し、標準プロトコルに従って３０ｍＬのＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。４日後、培養上清を回収し、０．２２μｍフィルターで滅菌した後、アリコートし、４℃で保存した。
Ｓｔｒｅｐ２タグ付きＰＳＭＡの作製
ＳｔｒｅｐＩＩタグ付きＰＳＭＡ（ＭＰ２７０３４）を社内で作製し、標準プロトコルに従って３０ｍＬのＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。４日後、培養上清を回収し、０．２２μｍフィルターで滅菌した後、アリコートし、４℃で保存した。
【0120】
組換えＰＳＭＡおよびＦＡＣＳ分析プロトコル（ＱＣ）のビーズベースの捕捉
２５μｌのＭａｇｓｔｒｅｐビーズ（ＩＢＡ）を保存バイアルから取り出した。ビーズを１ｍＬのＰＢＳ．Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標））×３で洗浄し、洗浄間で磁気分離した。１．５ｍＬのＭＰ２７０３４上清（ＰＳＭＡは定量されなかった）を、撹拌しながら室温で３０分間ビーズとインキュベートした。ビーズを、各洗浄後に磁石を介して分離する１ｍＬ（ｘ３）のＰＢＳ．Ｔで洗浄した。ビーズを、ＱＣ実験における陰性選択／対照のために２５μｌの非コンジュゲートビーズと一緒に室温で３０分間、１ｍＬの１％ ＢＳＡ ＰＢＳ中でブロッキングした。各洗浄後に磁石を介して分離する１ｍＬ（ｘ３）のＰＢＳ．Ｔでビーズを洗浄する。撹拌しながら室温で１０分間、１／１０００希釈の抗ＰＳＭＡ Ａｌｅｘａｆｌｏｕｒ ４８８（Ａｂｃａｍ ａｂ１８７５７０）で染色する。結合のフロー確認を、Ｍｉｌｔｅｎｉ ＭＡＣＳｑｕａｎｔのコンジュゲートビーズを使用して行った。
２５μｌのＭａｇｓｔｒｅｐビーズ（ＩＢＡ）を保存バイアルから取り出した。ビーズを１ｍＬのＰＢＳ．Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標））×３で洗浄し、洗浄間で磁気分離した。１．５ｍＬのＭＰ２７０３４上清（ＰＳＭＡは定量されなかった）を、撹拌しながら室温で３０分間ビーズとインキュベートした。ビーズを、各洗浄後に磁石を介して分離する１ｍＬ（ｘ３）のＰＢＳ．Ｔで洗浄した。ビーズを、ＱＣ実験における陰性選択／対照のために２５μｌの非コンジュゲートビーズと一緒に室温で３０分間、１ｍＬの１％ ＢＳＡ ＰＢＳ中でブロッキングした。各洗浄後に磁石を介して分離する１ｍＬ（ｘ３）のＰＢＳ．Ｔでビーズを洗浄する。撹拌しながら室温で１０分間、１／１０００希釈の抗ＰＳＭＡ Ａｌｅｘａｆｌｏｕｒ ４８８（Ａｂｃａｍ ａｂ１８７５７０）で染色する。結合のフロー確認を、Ｍｉｌｔｅｎｉ ＭＡＣＳｑｕａｎｔのコンジュゲートビーズを使用して行った。
【0121】
ファージパニング
一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＲＪ）からの上清中のＰＳＭＡ Ｓｔ２（２７０３４）を、上記のように（染色なしで）ビーズにコンジュゲートした。ＩＢＡ ２型および３型ｓｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎビーズの両方をＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘにおけるパニングのために使用した。非特異的結合ファージを撹拌しながら室温で３０分間除去するために、ファージライブラリーの１００倍の表示（１×１０１０個のファージ／ｍｌ）をＢＳＡコンジュゲートビーズと共にインキュベートした。ビーズを磁気的に分離し、ファージ含有上清をＰＳＭＡコンジュゲートビーズに直接移した。
一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＲＪ）からの上清中のＰＳＭＡ Ｓｔ２（２７０３４）を、上記のように（染色なしで）ビーズにコンジュゲートした。ＩＢＡ ２型および３型ｓｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎビーズの両方をＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘにおけるパニングのために使用した。非特異的結合ファージを撹拌しながら室温で３０分間除去するために、ファージライブラリーの１００倍の表示（１×１０１０個のファージ／ｍｌ）をＢＳＡコンジュゲートビーズと共にインキュベートした。ビーズを磁気的に分離し、ファージ含有上清をＰＳＭＡコンジュゲートビーズに直接移した。
【0122】
ＰＢＳ．Ｔ ０．０５％での３分×５サイクルの洗浄を利用して、「ファージディスプレイプロトコル２」を使用して、パニング工程および洗浄工程をＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘで行った。ＰＳＭＡ Ｓｔ２コンジュゲートビーズからの溶出は、ＰＢＳ中５００μｌの２×Ｂｉｏｔｉｎ溶液を用いて２０分間行った。
【0123】
次いで、ファージを滴定し、標準プロトコルに従って増幅した。簡単に述べると、溶出したファージを対数期ＴＧ１細胞（５ｍｌ）に再感染させ、Ａｍｐ／Ｇｌｕｃ寒天プレート上に播種することによって増幅した。ファージ数および濃縮を確立するために、滴定を行った。数ラウンドのファージパニングおよび増幅を使用して結合剤を生成した。
【0124】
モノクローナルファージ発現ＥＬＩＳＡ
標準的なファージＥＬＩＳＡプロトコルを使用した。簡単に説明すると、個々の細菌コロニーを拾い、２ＴＹ Ｇｌｕｃ／Ａｍｐ培地中で３７℃で０．５のＯＤ６００ｎｍまで培養した後、ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）の添加によるファージ発現の誘導を４０分間の重複感染のために行い、アンピシリンおよびカナマイシン（それぞれ１００μｇ／ｍｌおよび７０μｇ／ｍｌ）を補充した２ＴＹ中に再懸濁し、撹拌しながら３０℃で一晩培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、上清をＥＬＩＳＡのスクリーニングおよびフローサイトメトリーに直接使用した。
標準的なファージＥＬＩＳＡプロトコルを使用した。簡単に説明すると、個々の細菌コロニーを拾い、２ＴＹ Ｇｌｕｃ／Ａｍｐ培地中で３７℃で０．５のＯＤ６００ｎｍまで培養した後、ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）の添加によるファージ発現の誘導を４０分間の重複感染のために行い、アンピシリンおよびカナマイシン（それぞれ１００μｇ／ｍｌおよび７０μｇ／ｍｌ）を補充した２ＴＹ中に再懸濁し、撹拌しながら３０℃で一晩培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、上清をＥＬＩＳＡのスクリーニングおよびフローサイトメトリーに直接使用した。
【0125】
ＥＬＩＳＡ
全てのインキュベーションを撹拌しながら室温で１時間行い、洗浄は０．０５％ ＰＢＳ．ｔｗｅｅｎで３回行った。ＰＳＭＡを１μｇ／ｍｌ（５０μｌ）でｎｕｎｃ ９６ウェルプレートに播種し、室温で１時間インキュベートし、プレートを洗浄し、２％ミルクで１時間ブロッキングし、上清を添加する前に再び洗浄した。検出抗体は抗Ｍ１３－ＨＲＰコンジュゲートであり、プレートをＴＭＢ基質で展開した後、４５０ｎｍで読み取った。
全てのインキュベーションを撹拌しながら室温で１時間行い、洗浄は０．０５％ ＰＢＳ．ｔｗｅｅｎで３回行った。ＰＳＭＡを１μｇ／ｍｌ（５０μｌ）でｎｕｎｃ ９６ウェルプレートに播種し、室温で１時間インキュベートし、プレートを洗浄し、２％ミルクで１時間ブロッキングし、上清を添加する前に再び洗浄した。検出抗体は抗Ｍ１３－ＨＲＰコンジュゲートであり、プレートをＴＭＢ基質で展開した後、４５０ｎｍで読み取った。
【0126】
このＥＬＩＳＡプロトコルからの逸脱には、必要に応じて抗ｃ－Ｍｙｃ ＨＲＰまたは抗Ｆｌａｇ－ＨＲＰを使用するｓｃＦｖ検出が含まれる。
【0127】
結果
パニング開始前のＰＳＭＡバッチＱＣ
パニングを開始する前に、一過性の２９３トランスフェクションからＰＳＭＡのバッチを作製した。このＱＣは、ビオチンを使用して、ＰＳＭＡ ＳＴ２が３型ビーズにうまく結合し、そこから溶出することができることを示した。したがって、３型ビーズを、以下のビーズベースのパニング戦略の全てに使用した。
パニング開始前のＰＳＭＡバッチＱＣ
パニングを開始する前に、一過性の２９３トランスフェクションからＰＳＭＡのバッチを作製した。このＱＣは、ビオチンを使用して、ＰＳＭＡ ＳＴ２が３型ビーズにうまく結合し、そこから溶出することができることを示した。したがって、３型ビーズを、以下のビーズベースのパニング戦略の全てに使用した。
【表1-1】
【表1-2】
【0128】
パニング濃縮は、２回のｐａｎ後にファージ力価について陽性結果を示したので、特異的抗体についてスクリーニングするために単一コロニーを選択した。
【0129】
バックグラウンドに対するＰＳＭＡ結合の選択基準に基づいて、コロニーを５０％グリセロール中のグリセロールストックとして保存し、繰り返しスクリーニングを可能にするために培養した。
【表2】
【0130】
モノクローナル選択（ファージ沈殿後）によるＭ１３ファージ発現からの繰り返されたＥＬＩＳＡの結果は、シグナルが複製可能であり、バックグラウンドタンパク質への結合と比較して有意であることを示した。
【0131】
図４は、組換えタンパク質ＥＬＩＳＡアッセイでの初期スクリーニング（ｎ＝３）後の複製物におけるクローンファージおよびｓｃＦｖ培養物のＥＬＩＳＡアッセイ
【0132】
概要
同じ動物からのハイブリドーマ生成を使用するさらなる配列と共に、このファージディスプレイキャンペーンから結合剤の選択を生成した。
同じ動物からのハイブリドーマ生成を使用するさらなる配列と共に、このファージディスプレイキャンペーンから結合剤の選択を生成した。
【0133】
７Ａ１２ヒト化
インシリコのヒト化および抗体モデリング
ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅソフトウェア（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）を使用して、インシリコのモデリングおよびＣＤＲ移植によって７Ａ１２ヒト化を行った。
インシリコのヒト化および抗体モデリング
ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅソフトウェア（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）を使用して、インシリコのモデリングおよびＣＤＲ移植によって７Ａ１２ヒト化を行った。
【0134】
インシリコ免疫原性分析
目的：ＭＨＣＩ結合およびＭＨＣＩ免疫原性特性（Ｎｉｅｌｓｅｎら、２００３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１２，１００７－１０１７；Ｂｕｉら、２００５ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５７，３０４－３１４；Ｐｅｔｅｒｓ＆Ｓｅｔｔｅ ２００５ ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ６，１３２；Ｋａｒｏｓｉｅｎｅら、２０１２ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６４，１７７－１８６；Ｚｈａｎｇｅｔら、２００９ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５，１２９３－１２９９）についてＩＥＤＢツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）を使用して、新たに設計されたヒト化構築物のＴ細胞エピトープを予測すること。さらに、Ｔ２０スコア分析器（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｍ．ｌａｋｅｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／）を用いて、移植されたフレームワークの人間性を予測する（Ｇａｏら、２０１３、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，５５）。
目的：ＭＨＣＩ結合およびＭＨＣＩ免疫原性特性（Ｎｉｅｌｓｅｎら、２００３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１２，１００７－１０１７；Ｂｕｉら、２００５ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５７，３０４－３１４；Ｐｅｔｅｒｓ＆Ｓｅｔｔｅ ２００５ ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ６，１３２；Ｋａｒｏｓｉｅｎｅら、２０１２ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６４，１７７－１８６；Ｚｈａｎｇｅｔら、２００９ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５，１２９３－１２９９）についてＩＥＤＢツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）を使用して、新たに設計されたヒト化構築物のＴ細胞エピトープを予測すること。さらに、Ｔ２０スコア分析器（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｍ．ｌａｋｅｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／）を用いて、移植されたフレームワークの人間性を予測する（Ｇａｏら、２０１３、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，５５）。
【0135】
ＩＥＤＢ
このツールは、ＭＨＣＩに対する結合親和性について抗体配列に由来するペプチドの分析を可能にする。全てのペプチド長（８～１４）を使用して、ヒトＨＬＡ対立遺伝子Ａ＊０２：０１に対するプロテアソーム切断／ＴＡＰ輸送／ＭＨＣクラスＩ複合予測因子（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ／）によって、移植された抗体フレームワークの配列を分析する。２７４ｎＭの特異的カットオフを適用して、結合ペプチドを分化させる（Ｐａｕｌ，Ｓ．ら、２０１３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１，５８３１－５８３９）。
このツールは、ＭＨＣＩに対する結合親和性について抗体配列に由来するペプチドの分析を可能にする。全てのペプチド長（８～１４）を使用して、ヒトＨＬＡ対立遺伝子Ａ＊０２：０１に対するプロテアソーム切断／ＴＡＰ輸送／ＭＨＣクラスＩ複合予測因子（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ／）によって、移植された抗体フレームワークの配列を分析する。２７４ｎＭの特異的カットオフを適用して、結合ペプチドを分化させる（Ｐａｕｌ，Ｓ．ら、２０１３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１，５８３１－５８３９）。
【0136】
ＩＥＤＢ ＭＨＣ－Ｉ免疫原性
次いで、２７４ｎｍ未満のＩＣ５０を有する全てのペプチドをクラスＩ免疫原性ツール（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ／）で分析して、免疫原性スコア（陽性値は免疫原性を示す）を決定した（Ｃａｌｉｓら、２０１３ ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．９，ｅ１００３２６６）。
次いで、２７４ｎｍ未満のＩＣ５０を有する全てのペプチドをクラスＩ免疫原性ツール（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ／）で分析して、免疫原性スコア（陽性値は免疫原性を示す）を決定した（Ｃａｌｉｓら、２０１３ ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．９，ｅ１００３２６６）。
【0137】
効率的なＣＴＬ応答（Ｓｅｔｔｅ，Ａ．ら、１９９４Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｂａｌｔｉｍ．１５３，５５８６－５５９２）には５０ｎｍの親和性閾値が必要であるので、ＭＨＣ－Ｉに対して５０ｎｍまたはそれ未満の親和性を有する全てのペプチドは、潜在的に免疫原性であると考えられる。
【0138】
Ｔ２０スコア
Ｔ２０スコア分析器は、抗体可変配列（Ｇａｏら、２０１３、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，５５）からモノクローナル抗体のヒトらしさスコアを計算するために使用される。移植された抗体フレームワークの配列は、Ｔ２０スコア分析器（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｍ．ｌａｋｅｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／）によって分析される。８０またはそれを超えるスコアがヒト配列に関連付けられる。
Ｔ２０スコア分析器は、抗体可変配列（Ｇａｏら、２０１３、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，５５）からモノクローナル抗体のヒトらしさスコアを計算するために使用される。移植された抗体フレームワークの配列は、Ｔ２０スコア分析器（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｍ．ｌａｋｅｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／）によって分析される。８０またはそれを超えるスコアがヒト配列に関連付けられる。
【0139】
実施例２－抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体の生成
固定化抗原と細胞ベースのファージディスプレイパニングとの組み合わせを使用して、免疫化ラマのファージディスプレイライブラリーからＰＳＭＡに特異性を有する単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を単離した。
固定化抗原と細胞ベースのファージディスプレイパニングとの組み合わせを使用して、免疫化ラマのファージディスプレイライブラリーからＰＳＭＡに特異性を有する単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を単離した。
【0140】
形質導入された内因性ＰＳＭＡ発現細胞への細胞結合の確認をフローサイトメトリーによって確認する前に、組換えタンパク質に対してスクリーニングアッセイを最初に行った。
【0141】
ＳＰＲ分析（Ｂｉａｃｏｒｅ）は、ＩＨＣ染色において、抗体がｎＭ範囲の親和性で結合し、選択された抗体がＰＳＭＡ（ヒトおよびアカゲザル）に結合することを示した。
【0142】
材料および方法
免疫およびライブラリーの調製
組換えＨｉｓタグ付きＰＳＭＡによるタンパク質免疫化の前に（４２日目および６３日目）免疫応答をプライミングするために、皮下注射（０日目および２１日目）を介して、２匹のラマ（９２４０、９２４１）をｐＣＭＶ－ＰＳＭＡで遺伝子免疫化した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、一次免疫の７０日後に採取した１５０ｍｌの血液試料から単離した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＢＬから単離した。オリゴ－ｄＴプライミングおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素を使用して、各ラマからｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをコードするｄＡｂを、特異的プライマーを使用してＰＣＲによって増幅し、４００ｂｐフラグメントの存在を確実にするために分析し、精製した（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ）。得られたクリーンなＰＣＲ産物を制限酵素消化（ＰＳＴ１およびＮＯＴ１）によって切断し、Ｍ１３ファージベクターウイルスコートタンパク質（ｐＲＬ１４４）に連結した。ＴＧ１大腸菌に複数の電気穿孔を行い、アンピシリン寒天プレート上で選択を行った後、試料をプールし、凍結した。
免疫およびライブラリーの調製
組換えＨｉｓタグ付きＰＳＭＡによるタンパク質免疫化の前に（４２日目および６３日目）免疫応答をプライミングするために、皮下注射（０日目および２１日目）を介して、２匹のラマ（９２４０、９２４１）をｐＣＭＶ－ＰＳＭＡで遺伝子免疫化した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、一次免疫の７０日後に採取した１５０ｍｌの血液試料から単離した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＢＬから単離した。オリゴ－ｄＴプライミングおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素を使用して、各ラマからｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをコードするｄＡｂを、特異的プライマーを使用してＰＣＲによって増幅し、４００ｂｐフラグメントの存在を確実にするために分析し、精製した（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ）。得られたクリーンなＰＣＲ産物を制限酵素消化（ＰＳＴ１およびＮＯＴ１）によって切断し、Ｍ１３ファージベクターウイルスコートタンパク質（ｐＲＬ１４４）に連結した。ＴＧ１大腸菌に複数の電気穿孔を行い、アンピシリン寒天プレート上で選択を行った後、試料をプールし、凍結した。
【0143】
タンパク質コートとして発現される抗体を有するファージをＴＧ１大腸菌から増幅した。簡潔には、ＴＧ１細胞を、グルコース（２％）／アンピシリン（１μｇ／ｍｌ）を補充した２ＴＹ培地に接種し、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを添加する前に、０．５のＯＤ６００ｎｍまで撹拌しながら３７℃で培養した。４０分後、細胞を、カナマイシンおよびアンピシリン（７０／１００μｇ／ｍｌ）を補充した２ＹＴ培地に再懸濁し、撹拌しながら３０℃で一晩インキュベートした。ＰＥＧベースの沈殿を使用してファージを精製し、ＴＧ１大腸菌に滴定してＰＦＵ／ｍｌを決定した。
【0144】
ファージディスプレイパニング
組換えタンパク質
組換えＰＳＭＡを１μｇ／ｍｌで４℃で一晩Ｎｕｎｃ免疫チューブに固定化した後、２％ミルクＰＢＳ溶液でブロッキングした。ファージを２％ミルクＰＢＳ（２ｍｌ）中で１時間ブロッキングした後、ＰＳＭＡ被覆免疫チューブに添加した。室温で１時間後、チューブ洗浄物を、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を使用する３×１分のインキュベーションで１５回洗浄した。
再加温トリプシン（２ｍｌ）をチューブに添加し、３７℃で１０～１５分間インキュベートすることによって、特異的ファージの溶出を行った。溶出したファージを対数期ＴＧ１細胞（５ｍｌ）に再感染させ、Ａｍｐ／Ｇｌｕｃ寒天プレート上に播種することによって増幅した。ファージ数および濃縮を確立するために、滴定を行った。
組換えタンパク質
組換えＰＳＭＡを１μｇ／ｍｌで４℃で一晩Ｎｕｎｃ免疫チューブに固定化した後、２％ミルクＰＢＳ溶液でブロッキングした。ファージを２％ミルクＰＢＳ（２ｍｌ）中で１時間ブロッキングした後、ＰＳＭＡ被覆免疫チューブに添加した。室温で１時間後、チューブ洗浄物を、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を使用する３×１分のインキュベーションで１５回洗浄した。
再加温トリプシン（２ｍｌ）をチューブに添加し、３７℃で１０～１５分間インキュベートすることによって、特異的ファージの溶出を行った。溶出したファージを対数期ＴＧ１細胞（５ｍｌ）に再感染させ、Ａｍｐ／Ｇｌｕｃ寒天プレート上に播種することによって増幅した。ファージ数および濃縮を確立するために、滴定を行った。
【0145】
細胞ベースのパニング
細胞ベースのパニングを使用して、細胞表面に示されるようにＰＳＭＡに対する特異性を有する結合剤を濃縮および単離した。ＰＳＭＡを安定に形質導入されたＳｕｐＴ１細胞および形質導入されていないＳｕｐＴ１細胞を培養し、ライブラリーあたり合計５×１０６個の細胞を回収し、４ｍｌの氷冷ミルク／ＰＢＳ ２％に再懸濁し、氷上で保持した。遠心分離（４００×ｇ／５分／４℃）およびファージ溶液中のＳｕｐＴ１ ＮＴ細胞の再懸濁の前に、組換えタンパク質上のｐａｎ１からのファージ（２×１０１１ ＰＦＵ／ｍｌ）を２ｍｌ ＰＢＳ／乳２％中で１時間ブロッキングした。ファージおよびＳｕｐＴ１ ＮＴ細胞を、非特異的結合剤を除去するために４℃で１時間、端から端まで回転させながらインキュベートし、その後、この過程をＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡ細胞で繰り返した。３７℃のトリプシンＥＤＴＡとのインキュベーション（１０分）、ならびにファージ滴定および上記のような大腸菌ＴＧ１細胞への増幅の前に、洗浄は、連続遠心分離およびＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｐＨ５調整）中での再懸濁によって実施した。
細胞ベースのパニングを使用して、細胞表面に示されるようにＰＳＭＡに対する特異性を有する結合剤を濃縮および単離した。ＰＳＭＡを安定に形質導入されたＳｕｐＴ１細胞および形質導入されていないＳｕｐＴ１細胞を培養し、ライブラリーあたり合計５×１０６個の細胞を回収し、４ｍｌの氷冷ミルク／ＰＢＳ ２％に再懸濁し、氷上で保持した。遠心分離（４００×ｇ／５分／４℃）およびファージ溶液中のＳｕｐＴ１ ＮＴ細胞の再懸濁の前に、組換えタンパク質上のｐａｎ１からのファージ（２×１０１１ ＰＦＵ／ｍｌ）を２ｍｌ ＰＢＳ／乳２％中で１時間ブロッキングした。ファージおよびＳｕｐＴ１ ＮＴ細胞を、非特異的結合剤を除去するために４℃で１時間、端から端まで回転させながらインキュベートし、その後、この過程をＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡ細胞で繰り返した。３７℃のトリプシンＥＤＴＡとのインキュベーション（１０分）、ならびにファージ滴定および上記のような大腸菌ＴＧ１細胞への増幅の前に、洗浄は、連続遠心分離およびＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｐＨ５調整）中での再懸濁によって実施した。
【0146】
スクリーニング
個々の細菌コロニーを拾い、ＩＰＴＧ（１ ｍＭ）の添加によるｄＡｂ発現の誘導および３０℃での一晩の培養前に、３７℃で２ＴＹ Ｇｌｕｃ／Ａｍｐ培地中で０．５のＯＤ６００ｎｍまで培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、上清をＥＬＩＳＡのスクリーニングおよびフローサイトメトリーに直接使用した。
個々の細菌コロニーを拾い、ＩＰＴＧ（１ ｍＭ）の添加によるｄＡｂ発現の誘導および３０℃での一晩の培養前に、３７℃で２ＴＹ Ｇｌｕｃ／Ａｍｐ培地中で０．５のＯＤ６００ｎｍまで培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、上清をＥＬＩＳＡのスクリーニングおよびフローサイトメトリーに直接使用した。
【0147】
ＥＬＩＳＡ
全てのインキュベーションを撹拌しながら室温で１時間行い、洗浄はＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回行った。
ＰＳＭＡをＮｕｎｃ ９６ウェルプレートに１μｇ／ｍｌ（５０μｌ）で播種し、室温で１時間インキュベートし、プレートを洗浄し、２％ミルクで１時間ブロッキングし、上清を添加する前に再び洗浄した。検出抗体は抗Ｃ Ｍｙｃ－ＨＲＰコンジュゲートであり、プレートをＴＭＢ基質で展開した後、４５０ｎｍで読み取った。
全てのインキュベーションを撹拌しながら室温で１時間行い、洗浄はＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回行った。
ＰＳＭＡをＮｕｎｃ ９６ウェルプレートに１μｇ／ｍｌ（５０μｌ）で播種し、室温で１時間インキュベートし、プレートを洗浄し、２％ミルクで１時間ブロッキングし、上清を添加する前に再び洗浄した。検出抗体は抗Ｃ Ｍｙｃ－ＨＲＰコンジュゲートであり、プレートをＴＭＢ基質で展開した後、４５０ｎｍで読み取った。
【0148】
フローサイトメトリー
ヒトＰＳＭＡを高レベルまたは低レベルで発現する形質導入されたまたは形質導入されていないＳｕｐＴ１細胞を、腫瘍細胞株ＬｎＣＡＰ、ＰＣ３および２２ＲＶ１と共に、様々なフローサイトメトリー実験において染色した。簡潔には、細胞を、マウスＦｃまたはＣ－Ｍｙｃタグのいずれかでタグ付けされたスクリーニング抗体とインキュベートした後、ＰＢＳ．Ｔ ０．０５％および適切な二次抗体（抗Ｃ Ｍｙｃ ＰＥおよび抗マウスＦｃ ＡＦ６４７）で洗浄した。使用したフローサイトメーターは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳｑｕａｎｔ（図５）およびＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ（図６）であった。
ヒトＰＳＭＡを高レベルまたは低レベルで発現する形質導入されたまたは形質導入されていないＳｕｐＴ１細胞を、腫瘍細胞株ＬｎＣＡＰ、ＰＣ３および２２ＲＶ１と共に、様々なフローサイトメトリー実験において染色した。簡潔には、細胞を、マウスＦｃまたはＣ－Ｍｙｃタグのいずれかでタグ付けされたスクリーニング抗体とインキュベートした後、ＰＢＳ．Ｔ ０．０５％および適切な二次抗体（抗Ｃ Ｍｙｃ ＰＥおよび抗マウスＦｃ ＡＦ６４７）で洗浄した。使用したフローサイトメーターは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳｑｕａｎｔ（図５）およびＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ（図６）であった。
【0149】
結果
抗体レパートリーの調査を可能にするために、２つのＤＮＡおよびタンパク質免疫化ラマから２つのファージディスプレイライブラリーを構築した。特定のクローンの初期の高濃縮を示す組換えヒトＰＳＭＡ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対してパニングを行った（図５（Ａ））。スクリーニング後、細胞膜結合ＰＳＭＡ特異性を生成するために、これらのライブラリーを両方とも、ＰＳＭＡを発現するＳｕｐＴ１細胞に対してパニングした。細胞パニングしたライブラリーは、組換えタンパク質パニングからのものと同様の濃縮力価をもたらした（図５（Ｂ））。
抗体レパートリーの調査を可能にするために、２つのＤＮＡおよびタンパク質免疫化ラマから２つのファージディスプレイライブラリーを構築した。特定のクローンの初期の高濃縮を示す組換えヒトＰＳＭＡ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対してパニングを行った（図５（Ａ））。スクリーニング後、細胞膜結合ＰＳＭＡ特異性を生成するために、これらのライブラリーを両方とも、ＰＳＭＡを発現するＳｕｐＴ１細胞に対してパニングした。細胞パニングしたライブラリーは、組換えタンパク質パニングからのものと同様の濃縮力価をもたらした（図５（Ｂ））。
【0150】
初期パニング濃縮の評価後、ＴＧ１コロニーを発現するモノクローナルファージを滴定プレートから選択し、培養し、ＩＰＴＧ添加およびグルコース飢餓によってｄＡｂ発現を誘導した。ＥＬＩＳＡ分析により、陽性クローンおよびバックグラウンド結合剤の混合物が示された（図６）。陽性クローンを選択し、配列決定し、滴定アッセイで組換えＰＳＭＡに対してさらにスクリーニングした（データは示さず）。選択された結合剤をフローサイトメトリーに進めたところ、ラマ２からのクローンＢ８およびＧ７は、高発現ＰＳＭＡクローンに対して最も高い親和性および特異性を有することが示された（図７および図８）。
【0151】
初期スクリーニングによって示された細胞パニングされたファージのライブラリー内のｄＡｂの濃縮レパートリーは、Ｎｅｘｔ ｇｅｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＮＧＳ）による同様の配列のさらなるスクリーニングを保証するのに十分重要であった。ラマ１および２を両方ともＮＧＳ（ＰａｃＢｉｏ）によって分析し、配列を、確認された細胞結合剤について高親和性の単離された配列との類似性について評価した。３６個のさらなる結合剤のセットを、Ｇ Ｂｌｏｃｋ遺伝子合成（ＩＤＴ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって作製した。これらをマウスＩｇＧ２Ａ－Ｆｃフォーマットにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞から発現させた後、形質導入および内因性発現を含む様々な細胞型に対してスクリーニングした（図９）。
【0152】
特定の目的の２つの結合剤をＮＧＳ配列（クローン２および２５）から単離した。形質導入された細胞またはヒト腫瘍試料およびアカゲザル試料に対して免疫組織化学を実施して、共局在化のインビボのモデルバリデーションおよびＩＨＣ分析の可能性を確立した（図１０）。
【0153】
結果は、Ｂ８およびＧ７クローン（４９１１０および４９１１２）はＰＳＭＡ陽性細胞株に結合したが、それらは金標準対照よりも劣っているか、またはアカゲザルのＰＳＭＡ形質導入細胞株に結合しなかったことを示した。このデータに基づいて、さらなる分析のために選択された２つの候補は、ＮＧＳ選択からのクローン２および２５である。
【0154】
実施例３－抗ＰＳＭＡ ＶＨＨ抗体の生物物理学的特徴づけ
方法
抗ＰＳＭＡクローンを、一過性トランスフェクションによってｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞において発現させた。トランスフェクトＣＨＯ細胞からの上清を、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲＥ １ｍｌカラムを５カラム体積のＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化した。
Ａｋｔａ（商標）Ｐｕｒｅシステムを使用して１ｍＬ／分の流速で上清をカラムに適用した。上清を適用した後、カラムを２０カラム体積のＰＢＳで洗浄した。次いで、試料を３ｍｌのＩｇＧ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ－２１００４）を用いて１ｍＬ／分でカラムから溶出し、２つのＨｉＴｒａｐ ５ｍｌ脱塩カラムに直接ロードし、予めＰＢＳ中で平衡化し、フラクションコレクタ装置を使用して９６ウェルプレート上に収集した。
方法
抗ＰＳＭＡクローンを、一過性トランスフェクションによってｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞において発現させた。トランスフェクトＣＨＯ細胞からの上清を、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲＥ １ｍｌカラムを５カラム体積のＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化した。
Ａｋｔａ（商標）Ｐｕｒｅシステムを使用して１ｍＬ／分の流速で上清をカラムに適用した。上清を適用した後、カラムを２０カラム体積のＰＢＳで洗浄した。次いで、試料を３ｍｌのＩｇＧ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ－２１００４）を用いて１ｍＬ／分でカラムから溶出し、２つのＨｉＴｒａｐ ５ｍｌ脱塩カラムに直接ロードし、予めＰＢＳ中で平衡化し、フラクションコレクタ装置を使用して９６ウェルプレート上に収集した。
【0155】
タンパク質を含有する画分をプールし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。材料をアリコートに分割し、－８０℃で保存した。
【0156】
サイズ排除クロマトグラフィー
２０μｌの精製組換え抗体を、Ａｋｔａ ＰｕｒｅシステムのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬカラムにロードした。簡単に説明すると、カラムを１．５カラム体積のＰＢＳで０．３ｍｌ／分で平衡化した。試料を直接ループ注入によって０．３ｍｌ／分でロードし、１．５カラム容量にわたってＰＢＳ中で実行した。溶出タンパク質をＯＤ２８０ｎｍで検出した。ＶＨＨ－Ｆｃ構築物は、２ｍｌで溶出すると予想された。
２０μｌの精製組換え抗体を、Ａｋｔａ ＰｕｒｅシステムのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬカラムにロードした。簡単に説明すると、カラムを１．５カラム体積のＰＢＳで０．３ｍｌ／分で平衡化した。試料を直接ループ注入によって０．３ｍｌ／分でロードし、１．５カラム容量にわたってＰＢＳ中で実行した。溶出タンパク質をＯＤ２８０ｎｍで検出した。ＶＨＨ－Ｆｃ構築物は、２ｍｌで溶出すると予想された。
【0157】
熱安定性
試料を１ｍｇ／ｍｌに正規化し、標準的なガラス毛細管（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）にロードした。熱安定性は、Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８装置で２０℃～９５℃まで１℃／分の線形温度増分によって決定した。データを３５０ｎｍ／３３０ｎｍ比の一次導関数として分析した。
試料を１ｍｇ／ｍｌに正規化し、標準的なガラス毛細管（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）にロードした。熱安定性は、Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８装置で２０℃～９５℃まで１℃／分の線形温度増分によって決定した。データを３５０ｎｍ／３３０ｎｍ比の一次導関数として分析した。
【0158】
表面プラズモン共鳴
可溶性ＰＳＭＡに対する速度論的親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を使用して決定した。組換え精製抗体を、１００ＲＵを目標として、１０μｌ／分で６０秒間、タンパク質Ａチップ＃７に捕捉した。ＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液中で透析した組換えＰＳＭＡ－Ｈｉｓ（ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を、１μＭから１０ポイントの１：２段階希釈で分析物として使用し、３０μｌ／分で１５０秒間流し、解離時間は３００秒であった。二重参照減算を適用した。１：１のＬａｎｇｍｕｉｒモデルを適合させたＳｅｎｓｏｇｒａｍ。
可溶性ＰＳＭＡに対する速度論的親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を使用して決定した。組換え精製抗体を、１００ＲＵを目標として、１０μｌ／分で６０秒間、タンパク質Ａチップ＃７に捕捉した。ＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液中で透析した組換えＰＳＭＡ－Ｈｉｓ（ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を、１μＭから１０ポイントの１：２段階希釈で分析物として使用し、３０μｌ／分で１５０秒間流し、解離時間は３００秒であった。二重参照減算を適用した。１：１のＬａｎｇｍｕｉｒモデルを適合させたＳｅｎｓｏｇｒａｍ。
【0159】
抗ＰＳＭＡ抗体Ｊ５９１（ＵＰｅｎｎ）を参照として使用した。
【0160】
結果
抗体を、ＥｘｐｉＣＨＯにおいてＶＨＨ－Ｆｃフォーマットで一過性に発現させ、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価し、分子分散をサイズ排除クロマトグラフィーによって測定した。抗体は、低い凝集傾向を示した。
熱安定性をＤＳＦによって評価し、試験した両方の抗体について５７℃を超える融解温度を示した。
抗体を、ＥｘｐｉＣＨＯにおいてＶＨＨ－Ｆｃフォーマットで一過性に発現させ、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価し、分子分散をサイズ排除クロマトグラフィーによって測定した。抗体は、低い凝集傾向を示した。
熱安定性をＤＳＦによって評価し、試験した両方の抗体について５７℃を超える融解温度を示した。
【0161】
親和性は、組換え可溶性ＰＳＭＡに対するＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置での表面プラズモン共鳴によって決定した。親和性を、両方の抗体についてｎＭ範囲で測定した（表３）。
【表3】
【0162】
実施例４－抗ＰＳＭＡ ＣＡＲの構築物
ＣＡＲをコードする核酸構築物のパネルを以下のように作製する。
ｆｍｃ６３＿ＢＢｚ：ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８－２Ａ－ＦＭＣ６３－ＣＤ８ＳＴＫ－ＴｙｒｐＴＭ－４１ＢＢｚ
ｍｕ７Ａ１２＿ＢＢｚ：ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８－２Ａ－ａＰＳＭＡ＿ｍｕ７Ａ１２＿ＣＤ８ＳＴＫ－ＴｙｒｐＴＭ－４１ＢＢｚ
ｈｕ７Ａ１２＿ＢＢｚ：ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８－２Ａ－ａＰＳＭＡ＿ｈｕ７Ａ１２＿ＣＤ８ＳＴＫ－ＴｙｒｐＴＭ－４１ＢＢｚ
ｈｕ７Ａ１２＿２８ｚ：ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８－２Ａ－ａＰＳＭＡ＿ｈｕ７Ａ１２＿ＣＤ８ＳＴＫ－ＴｙｒｐＴＭ－４１ＢＢｚ
Ｊ５９１＿ＢＢｚ：ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８－２Ａ－ａＰＳＭＡ＿ｈｕ７Ａ１２＿ＣＤ８ＳＴＫ－ＴｙｒｐＴＭ－４１ＢＢｚ
ＳＦＧｍＲは、ベクター骨格であり、
ＲＱＲ８は、国際公開第２０１３／１５３３９１号に記載されている自殺遺伝子ＲＱＲ８であり、
２Ａは、ＲＱＲ８およびＣＡＲポリペプチドの同時発現を可能にする２Ａ自己切断ペプチドファミリーのメンバーであり
ＣＤ８ ＳＴＫはＣＤ８柄スペーサーであり、
Ｔｒｙｐ（商標）は、Ｔｒｙｐ－１に由来する膜貫通ドメインであり、
４１ＢＢｚは、ＣＤ３ゼータおよび４－１ＢＢからのエンドドメインを含む第二世代エンドドメインである。
ＣＡＲをコードする核酸構築物のパネルを以下のように作製する。
ｆｍｃ６３＿ＢＢｚ：ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８－２Ａ－ＦＭＣ６３－ＣＤ８ＳＴＫ－ＴｙｒｐＴＭ－４１ＢＢｚ
ｍｕ７Ａ１２＿ＢＢｚ：ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８－２Ａ－ａＰＳＭＡ＿ｍｕ７Ａ１２＿ＣＤ８ＳＴＫ－ＴｙｒｐＴＭ－４１ＢＢｚ
ｈｕ７Ａ１２＿ＢＢｚ：ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８－２Ａ－ａＰＳＭＡ＿ｈｕ７Ａ１２＿ＣＤ８ＳＴＫ－ＴｙｒｐＴＭ－４１ＢＢｚ
ｈｕ７Ａ１２＿２８ｚ：ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８－２Ａ－ａＰＳＭＡ＿ｈｕ７Ａ１２＿ＣＤ８ＳＴＫ－ＴｙｒｐＴＭ－４１ＢＢｚ
Ｊ５９１＿ＢＢｚ：ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８－２Ａ－ａＰＳＭＡ＿ｈｕ７Ａ１２＿ＣＤ８ＳＴＫ－ＴｙｒｐＴＭ－４１ＢＢｚ
ＳＦＧｍＲは、ベクター骨格であり、
ＲＱＲ８は、国際公開第２０１３／１５３３９１号に記載されている自殺遺伝子ＲＱＲ８であり、
２Ａは、ＲＱＲ８およびＣＡＲポリペプチドの同時発現を可能にする２Ａ自己切断ペプチドファミリーのメンバーであり
ＣＤ８ ＳＴＫはＣＤ８柄スペーサーであり、
Ｔｒｙｐ（商標）は、Ｔｒｙｐ－１に由来する膜貫通ドメインであり、
４１ＢＢｚは、ＣＤ３ゼータおよび４－１ＢＢからのエンドドメインを含む第二世代エンドドメインである。
【0163】
実施例５－ＦＡＣベースの死滅アッセイ（ＦＢＫ）
ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞を死滅させる能力を、ＦＡＣＳベースの死滅アッセイを使用して調べた。ヒトＰＳＭＡ抗原（ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡ）を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞を標的細胞として使用した。非操作ＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＮＴ）を陰性対照として使用した。Ｔ細胞を標的細胞と１：１、１：４および１：８のエフェクター対標的比で共培養した。ＦＢＫを２４時間のインキュベーション後にアッセイし、細胞蛍光測定分析によって分析した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞を死滅させる能力を、ＦＡＣＳベースの死滅アッセイを使用して調べた。ヒトＰＳＭＡ抗原（ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡ）を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞を標的細胞として使用した。非操作ＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＮＴ）を陰性対照として使用した。Ｔ細胞を標的細胞と１：１、１：４および１：８のエフェクター対標的比で共培養した。ＦＢＫを２４時間のインキュベーション後にアッセイし、細胞蛍光測定分析によって分析した。
【0164】
実施例６－サイトカイン放出
ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２およびＩＦＮγの分泌を、実施例５に記載される共培養物から２４時間で上清を回収することによって測定した。
ＩＬ－２およびＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって検出した。
ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＬ－２およびＩＦＮγの分泌を、実施例５に記載される共培養物から２４時間で上清を回収することによって測定した。
ＩＬ－２およびＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって検出した。
【0165】
方法論
細胞株
ＳｕｐＴ１細胞株（ＮＴおよびＰＳＭＡ＋）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ ＧｌｕｔａＭＡＸを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。Ｔ細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、１０％ ＦＢＳ、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸおよび１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。
細胞株
ＳｕｐＴ１細胞株（ＮＴおよびＰＳＭＡ＋）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ ＧｌｕｔａＭＡＸを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。Ｔ細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、１０％ ＦＢＳ、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸおよび１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。
【0166】
形質導入
レトロウイルスを、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＲＤＦプラスミド（ＲＤ１１４エンベロープ）、ｇａｇ／ｐｏｌプラスミドおよびＣＡＲプラスミドで一過性にトランスフェクトすることによって作製した。レトロウイルスのウイルス上清を４８および７２時間で回収した。Ｔ細胞を、Ｔ１７５ ＴＣ処理されたＴＣ処理フラスコにおいて０．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して刺激し、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２中で維持した。
非ＴＣ処理６ウェルプレートをＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコーティングし、Ｔ細胞形質導入の前に４℃で２４時間インキュベートした。１×１０６細胞／ｍｌの濃度で１ｍｌの活性化Ｔ細胞を添加する前に３ｍｌのウイルス上清を播種し、次いで１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を添加し、室温で４０分間１０００ｘｇで遠心分離し、３７℃および５％ ＣＯ２で２－３日間インキュベートした。
レトロウイルスを、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＲＤＦプラスミド（ＲＤ１１４エンベロープ）、ｇａｇ／ｐｏｌプラスミドおよびＣＡＲプラスミドで一過性にトランスフェクトすることによって作製した。レトロウイルスのウイルス上清を４８および７２時間で回収した。Ｔ細胞を、Ｔ１７５ ＴＣ処理されたＴＣ処理フラスコにおいて０．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を使用して刺激し、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２中で維持した。
非ＴＣ処理６ウェルプレートをＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコーティングし、Ｔ細胞形質導入の前に４℃で２４時間インキュベートした。１×１０６細胞／ｍｌの濃度で１ｍｌの活性化Ｔ細胞を添加する前に３ｍｌのウイルス上清を播種し、次いで１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を添加し、室温で４０分間１０００ｘｇで遠心分離し、３７℃および５％ ＣＯ２で２－３日間インキュベートした。
【0167】
ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の欠乏
ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ５６陽性選択キットを使用してＣＤ５６欠乏を行った。
ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ５６陽性選択キットを使用してＣＤ５６欠乏を行った。
【0168】
細胞傷害性アッセイ
ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＴＣ処理された９６ウェルプレートで１：１、１：４または１：８のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ比）でＳｕｐＴ１－ＮＴおよびＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡと共培養した（標的細胞は、条件あたり５万細胞の一定濃度である）。エフェクターＴ細胞および標的細胞を分化させるために抗ＣＤ３－ＰｅＣｙ７およびＱｂｅｎ１０－ＡＰＣで染色することによって、共培養の２４時間後に読み出しを行い、７－ＡＡＤ死細胞染色を使用して死細胞を除外した。フローサイトメトリーによって細胞傷害性読み取り値にアクセスした。
ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＴＣ処理された９６ウェルプレートで１：１、１：４または１：８のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ比）でＳｕｐＴ１－ＮＴおよびＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡと共培養した（標的細胞は、条件あたり５万細胞の一定濃度である）。エフェクターＴ細胞および標的細胞を分化させるために抗ＣＤ３－ＰｅＣｙ７およびＱｂｅｎ１０－ＡＰＣで染色することによって、共培養の２４時間後に読み出しを行い、７－ＡＡＤ死細胞染色を使用して死細胞を除外した。フローサイトメトリーによって細胞傷害性読み取り値にアクセスした。
【0169】
サイトカインＥＬＩＳＡ
ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅおよびヒトＩＦＮ－γＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅキットを使用して、細胞傷害性アッセイから採取した共培養上清に分泌されたサイトカインのレベルにアクセスした。
ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅおよびヒトＩＦＮ－γＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅキットを使用して、細胞傷害性アッセイから採取した共培養上清に分泌されたサイトカインのレベルにアクセスした。
【0170】
実施例７－ｐＨスカウト
異なるレベルのｐＨでの結合剤の安定性および親和性速度論を調査した。
異なるレベルのｐＨでの結合剤の安定性および親和性速度論を調査した。
【0171】
方法論
表面プラズモン共鳴
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を使用して、異なるｐＨでの可溶性ＰＳＭＡに対する速度論的親和性を決定した。組換え精製抗体をタンパク質Ａチップ＃６に捕捉し、緩衝ＨＢＳ－Ｐ＋を用いて必要なｐＨ（ｐＨ７．４、ｐＨ７、ｐＨ６．５およびｐＨ６）を１０μｌ／分で６０秒間予備平衡化し、１００ＲＵを目標とした。ＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液中で透析し、必要なｐＨに調整した組換えＰＳＭＡ－Ｈｉｓ（ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を、１μＭから１０ポイントの１：２段階希釈で分析物として使用し、３０μｌ／分で１５０秒間流し、解離時間を３００秒とした。二重参照減算を適用した。１：１のＬａｎｇｍｕｉｒモデルを適合させたＳｅｎｓｏｇｒａｍ。
表面プラズモン共鳴
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を使用して、異なるｐＨでの可溶性ＰＳＭＡに対する速度論的親和性を決定した。組換え精製抗体をタンパク質Ａチップ＃６に捕捉し、緩衝ＨＢＳ－Ｐ＋を用いて必要なｐＨ（ｐＨ７．４、ｐＨ７、ｐＨ６．５およびｐＨ６）を１０μｌ／分で６０秒間予備平衡化し、１００ＲＵを目標とした。ＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液中で透析し、必要なｐＨに調整した組換えＰＳＭＡ－Ｈｉｓ（ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を、１μＭから１０ポイントの１：２段階希釈で分析物として使用し、３０μｌ／分で１５０秒間流し、解離時間を３００秒とした。二重参照減算を適用した。１：１のＬａｎｇｍｕｉｒモデルを適合させたＳｅｎｓｏｇｒａｍ。
【0172】
熱安定性
試料を、必要なｐＨ（ｐＨ７．４、ｐＨ７、ｐＨ６．５およびｐＨ６）に緩衝したＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌに正規化し、標準的なガラス毛細管（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）にロードした。熱安定性は、Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８装置で２０℃～９５℃まで１℃／分の線形温度増分によって決定した。データを３５０ｎｍ／３３０ｎｍ比の一次導関数として分析した。
試料を、必要なｐＨ（ｐＨ７．４、ｐＨ７、ｐＨ６．５およびｐＨ６）に緩衝したＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌに正規化し、標準的なガラス毛細管（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）にロードした。熱安定性は、Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８装置で２０℃～９５℃まで１℃／分の線形温度増分によって決定した。データを３５０ｎｍ／３３０ｎｍ比の一次導関数として分析した。
【0173】
結果
試験した全ての抗体は、より低いｐＨで標的タンパク質に対する増加した親和性を示した。ヒト化されたクローン７Ａ１２および７Ａ１２は、ｐＨ条件の変化によってほとんど影響されないより高い熱安定性を示した。これらの結果は、Ｊ５９１と比較して、クローン７Ａ１２の生理学的および腫瘍特異的ｐＨ微小環境でより安定な結合剤の結論を支持する（表４）。
試験した全ての抗体は、より低いｐＨで標的タンパク質に対する増加した親和性を示した。ヒト化されたクローン７Ａ１２および７Ａ１２は、ｐＨ条件の変化によってほとんど影響されないより高い熱安定性を示した。これらの結果は、Ｊ５９１と比較して、クローン７Ａ１２の生理学的および腫瘍特異的ｐＨ微小環境でより安定な結合剤の結論を支持する（表４）。
【表4-1】
【表4-2】
【0174】
上記の明細書で言及された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3(a)】
【図3(b)】
【図3(c)】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【配列表】
【国際調査報告】