特表 2023-507741 ハンチントン病を処置するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-27

(54)【発明の名称】ハンチントン病を処置するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20230217BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230217BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230217BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230217BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230217BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230217BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230217BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230217BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20230217BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230217BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20230217BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230217BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20230217BHJP

   A61K 38/44 20060101ALN20230217BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/864 100Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N7/01

C12N15/12

C12Q1/68

A61K35/76

A61P25/14

A61K48/00

A61K31/7105

A61K38/44

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022537012

(86)(22)【出願日】2020-12-18

(85)【翻訳文提出日】2022-08-12

(86)【国際出願番号】 US2020066039

(87)【国際公開番号】W WO2021127455

(87)【国際公開日】2021-06-24

(31)【優先権主張番号】62/951,582

(32)【優先日】2019-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520375033

【氏名又は名称】アスクレピオス バイオファーマシューティカル， インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】514299550

【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ロウ， シュウフイ

(72)【発明者】

【氏名】シャオ， シャオ

(72)【発明者】

【氏名】シャオ， ビン

(72)【発明者】

【氏名】ムリエ， フィリップ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA19

4B063QQ42

4B063QS28

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084DC23

4C084MA66

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA022

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA66

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZA02

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA02

(57)【要約】

本開示の態様は、ハンチントン病を処置するのに有用な組成物および方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、ハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）を標的とする干渉核酸（例えば、人工ｍｉＲＮＡ）およびこれを使用してハンチントン病を処置する方法を提供する。したがって、一部の態様では、本開示は、配列番号１～２２のいずれか１つに示される配列を含むかまたはコードする単離された核酸を提供する。一態様では、（ａ）第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む第１の領域；および（ｂ）１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の領域であって、各ｍｉＲＮＡが、配列番号２５に相補的なシード配列を含む、第２の領域を含む単離された核酸が本明細書に記載される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ．第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む第１の領域；および
ｂ．１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の領域であって、各ｍｉＲＮＡが、配列番号２５に相補的なシード配列を含む、第２の領域
を含む単離された核酸。

【請求項2】

ａ．第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む第１の領域；および
ｂ．１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の領域であって、各ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ骨格配列に挟まれた配列番号１～２２のいずれか１つに示される配列を含む配列によってコードされている、第２の領域
を含む単離された核酸。

【請求項3】

前記導入遺伝子が、イントロンに挟まれたタンデムで２つのｍｉＲＮＡまたは２つの前駆体ｍｉＲＮＡを含む、請求項１または２に記載の単離された核酸。

【請求項4】

前記隣接するイントロンが、同一である、請求項３に記載の単離された核酸。

【請求項5】

前記隣接するイントロンが、同じ種に由来する、請求項３に記載の単離された核酸。

【請求項6】

前記隣接するイントロンが、ｈＣＧイントロンである、請求項３に記載の単離された核酸。

【請求項7】

前記導入遺伝子が、プロモーターを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項8】

前記プロモーターが、シナプシン（Ｓｙｎ１）プロモーターである、請求項７に記載の単離された核酸。

【請求項9】

前記導入遺伝子が、タンパク質をさらにコードする、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項10】

前記タンパク質が、ＣＹＰ４６Ａ１である、請求項９に記載の単離された核酸。

【請求項11】

前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡが、前記導入遺伝子の非翻訳部分に位置する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項12】

前記非翻訳部分が、イントロンである、請求項１１に記載の単離された核酸。

【請求項13】

前記非翻訳部分が、タンパク質をコードする核酸配列の最後のコドンとポリＡテール配列の間か、またはプロモーター配列の最後のヌクレオチド塩基とポリＡテール配列の間に存在する、請求項１１に記載の単離された核酸。

【請求項14】

第２のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む第３の領域をさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項15】

前記ＩＴＲバリアントが、機能的末端分離部位（ＴＲＳ）を欠き、必要に応じて、前記ＩＴＲバリアントが、ＡＴＲＳ ＩＴＲである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項16】

前記ｍｉＲＮＡの少なくとも１つが、ヒトハンチンチン（例えば、配列番号２５）にハイブリダイズし、ヒトハンチンチンの発現を阻害する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項17】

請求項１から１６のいずれか一項に記載の単離された核酸を含むベクター。

【請求項18】

プラスミドである、請求項１７に記載のベクター。

【請求項19】

請求項１から１６のいずれか一項に記載の単離された核酸、または請求項１７もしくは１８に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項20】

ａ．キャプシドタンパク質；および
ｂ．請求項１から１６のいずれか一項に記載の単離された核酸
を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。

【請求項21】

前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、もしくはＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質、またはそのいずれかのキメラである、請求項２０に記載のｒＡＡＶ。

【請求項22】

前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質である、請求項２０または２１に記載のｒＡＡＶ。

【請求項23】

自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項24】

中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のために製剤化されている、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。

【請求項25】

配列番号１～２２のいずれか１つに示される配列をコードする単離された核酸。

【請求項26】

請求項１から１６のいずれかに記載の単離された核酸を含む組成物。

【請求項27】

請求項１７または１８に記載のベクターを含む組成物。

【請求項28】

請求項２０から２４のいずれかに記載のｒＡＡＶ細胞を含む組成物。

【請求項29】

それを必要とする対象におけるハンチントン病を処置するための方法であって、ハンチントン病を有するかまたはハンチントン病を発症するリスクを有する対象に、請求項１から１６のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項２０から２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、または請求項２５から２８のいずれかに記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。

【請求項30】

前記対象が、３６個より多いＣＡＧリピート、４０個より多いリピート、または１００個より多いリピートを有するハンチンチン遺伝子を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記対象が、２０歳未満である、請求項２９または３０に記載の方法。

【請求項32】

前記投与が、前記単離された核酸またはｒＡＡＶの、前記対象の中枢神経系（ＣＮＳ）への送達をもたらす、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記投与が、注射、必要に応じて静脈内注射または線条体内注射によるものである、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記投与が、カテーテルまたは関連するデバイスによるものである、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

投与することの前に、ハンチントン病を有するかまたはハンチントン病を発症するリスクを有するとして対象を診断するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

投与することの前に、ハンチントン病を有するかまたはハンチントン病を発症するリスクを有するとして対象を診断するアッセイの結果を受け取るステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、その内容が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、２０１９年１２月２０日に出願した米国仮出願第６２／９５１，５８２号の利益を主張する。

【0002】

配列表
本出願は、ＥＦＳ－ＷｅｂによりＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。２０２０年１２月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０４６１９２－０９６７９０ＷＯＰＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは４０，４１９バイトである。

【0003】

技術分野
本明細書に記載の技術は、ハンチントン病を処置するための方法に関する。

【背景技術】

【0004】

背景
ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチンチン遺伝子のエクソン１におけるＣＡＧリピート領域の伸長によって引き起こされる、破壊的な遺伝性神経変性疾患である。ハンチンチンタンパク質（ＨＴＴ）は体全体で発現されるが、ポリグルタミン伸長タンパク質は、線条体の中型有棘神経細胞およびそれらの皮質接続に対して特に毒性である。患者は、鬱および不安を含む情動性症状ならびに特徴的な運動障害および舞踏病に苦しんでいる。現在、ハンチントン病には治療法がなく；治療選択肢は疾患症状を改善することに限定される。

【発明の概要】

【0005】

概要
本開示の態様は、ハンチントン病（ＨＤ）を処置するのに有用な組成物および方法に関する。一部の実施形態では、ヒトハンチンチン（ＨＴＴ）に対して特異的にハイブリダイズし、その発現を阻害する、阻害性核酸（例えば、人工ｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡ）が提供される。

【0006】

したがって、一部の態様では、本開示は、配列番号１～２２のいずれか１つに示される配列を含むかまたはそれをコードする、単離された核酸を提供する。

【0007】

一態様では、（ａ）第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む第１の領域；および（ｂ）１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の領域であって、各ｍｉＲＮＡが、配列番号２５に相補的なシード配列を含む、第２の領域を含む単離された核酸が本明細書に記載される。

【0008】

一態様では、（ａ）第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む第１の領域；および（ｂ）１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の領域であって、各ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ骨格配列に挟まれた配列番号１～２２のいずれか１つに示される配列を含む配列によってコードされている、第２の領域を含む単離された核酸が本明細書に記載される。

【0009】

一部の態様では、本開示は：第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む第１の領域；および１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の領域を含む単離された核酸を提供する。

【0010】

一部の実施形態では、各ｍｉＲＮＡをコードする配列は、配列番号１～２２のいずれか１つに示される配列を含む。一部の実施形態では、各ｍｉＲＮＡをコードする配列は、ｐｒｅ－ｍｉＲ由来の配列に挟まれた配列番号１～２２のいずれか１つに示される配列を含む。一部の実施形態では、単離された核酸は、配列番号１～２２のいずれか１つに示される成熟ｍｉＲＮＡ配列に対応するｐｒｅ－ｍｉＲ配列を含む。一部の実施形態では、各ｍｉＲＮＡをコードする配列は、ｍｉＲＮＡ骨格配列をコードする配列に挟まれた配列番号１～２２のいずれか１つに示される配列を含む。一部の態様では、本開示は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む単離された核酸であって、各ｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子の配列が、ｍｉＲＮＡ骨格配列に挟まれた配列番号１～２２に示される配列を含む、単離された核酸を提供する。

【0011】

一部の実施形態では、導入遺伝子は、イントロンに挟まれたタンデムで２つのｍｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、イントロンに挟まれたタンデムで２つの前駆体ｍｉＲＮＡであるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（例えば、配列番号３５を参照されたい）を含む。

【0012】

一部の実施形態では、導入遺伝子は、イントロンに挟まれたタンデムで２つのｍｉＲＮＡまたは２つの前駆体ｍｉＲＮＡを含む。

【0013】

一部の実施形態では、隣接するイントロンは、同一である。

【0014】

一部の実施形態では、隣接するイントロンは、同じ種に由来する。

【0015】

一部の実施形態では、隣接するイントロンは、ｈＣＧイントロンである。

【0016】

一部の実施形態では、導入遺伝子は、プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む。

【0017】

一部の実施形態では、プロモーターは、シナプシン（Ｓｙｎ１）プロモーターである。

【0018】

一部の実施形態では、導入遺伝子は、タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。

【0019】

一部の実施形態では、タンパク質は、ＣＹＰ４６Ａ１である。

【0020】

一部の実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質（例えば、非変異体ハンチンチン）またはリポータータンパク質（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質）である。

【0021】

一部の実施形態では、ヒトハンチンチンは、配列番号２５に示される配列を含む。

【0022】

一部の実施形態では、本開示は、配列番号２５の少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の）連続する塩基に対して相補的である核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）を提供する。

【0023】

一部の実施形態では、１つまたは複数のｍｉＲＮＡは、導入遺伝子の非翻訳部分に位置する。

【0024】

一部の実施形態では、非翻訳部分は、イントロンである。

【0025】

一部の実施形態では、非翻訳部分は、タンパク質をコードする核酸配列の最後のコドンとポリＡテール配列の間に存在する。

【0026】

一部の実施形態では、非翻訳部分は、プロモーター配列の最後の核酸塩基とポリＡテール配列の１番目の塩基の間に存在する。

【0027】

一部の実施形態では、ポリＡ配列は、小ポリＡ配列である。

【0028】

一部の実施形態では、導入遺伝子はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントに挟まれている。

【0029】

一部の実施形態では、単離された核酸は、第２のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む第３の領域をさらに含む。

【0030】

一部の実施形態では、第１または第２のＩＴＲバリアントは、機能的末端分離部位（ＴＲＳ）を欠き、必要に応じて、ＩＴＲバリアントは、ＡＴＲＳ ＩＴＲである。

【0031】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの少なくとも１つは、ヒトハンチンチン（例えば、配列番号２５）にハイブリダイズし、その発現を阻害する。

【0032】

一部の態様では、本開示は、本開示に記載されている単離された核酸を含むベクターを提供する。

【0033】

一部の態様では、本開示は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む単離された核酸を含むベクターであって、各ｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子の配列が、ｍｉＲＮＡ骨格配列に挟まれた配列番号１～２２に示される配列を含む、ベクターを提供する。

【0034】

一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。

【0035】

一部の実施形態では、導入遺伝子の各ｍｉＲＮＡ骨格配列は、ｍｉｒ－１５５骨格配列、ｍｉｒ－３０骨格配列、またはｍｉｒ－６４骨格配列である。

【0036】

一部の態様では、本開示は、本開示に記載されている単離された核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0037】

一部の態様では、本開示は、（ａ）キャプシドタンパク質；および（ｂ）本開示に記載されている単離された核酸を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を提供する。

【0038】

一部の態様では、本開示は、キャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）；および１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む単離された核酸であって、各ｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子の配列が、ｍｉＲＮＡ骨格配列に挟まれた配列番号１～２２に示される配列を含む、単離された核酸を提供する。

【0039】

一部の実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質である。

【0040】

一部の実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質である。

【0041】

一部の実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、もしくはＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質、またはそのいずれかのキメラである。

【0042】

一部の実施形態では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、一倍体ｒＡＡＶである。

【0043】

一部の実施形態では、一倍体ｒＡＡＶは、キメラキャプシドタンパク質を含む。

【0044】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。

【0045】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のために製剤化されている。

【0046】

本開示の態様は、本明細書に記載の単離された核酸のいずれかを含む組成物に関する。

【0047】

本開示の態様は、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む組成物に関する。

【0048】

本開示の態様は、本明細書に記載のｒＡＡＶのいずれかを含む組成物に関する。

【0049】

本開示の態様は、病原性ハンチンチンの発現を低減する（例えば、阻害する）ことが可能な単離された核酸に関し、よって、ハンチントン病の処置に有用であり得る。

【0050】

したがって、一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるハンチントン病を処置するための方法であって、ハンチントン病を有するかまたはそれを発症するリスクを有する対象に、本開示に記載されている単離された核酸、ｒＡＡＶ、または組成物の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。

【0051】

一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるハンチントン病を処置するための方法であって、ハンチントン病を有するかまたはそれを発症するリスクを有する対象に、本明細書に記載されているｒＡＡＶ（例えば、１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶであって、各ｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子の配列が、ｍｉＲＮＡ骨格配列に挟まれた配列番号１～２２に示される配列を含む、ｒＡＡＶ）の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。

【0052】

一部の実施形態では、対象は、３６個より多いＣＡＧリピート、４０個より多いリピート、または１００個より多いリピートを有するハンチンチン遺伝子を含む。

【0053】

一部の実施形態では、対象は、２０歳未満であるか、または若年性ＨＤを有すると診断されている。

【0054】

一部の実施形態では、投与は、前記単離された核酸またはｒＡＡＶの、前記対象の中枢神経系（ＣＮＳ）への送達をもたらす。

【0055】

一部の実施形態では、投与は、注射、必要に応じて静脈内注射または線条体内注射によるものである。

【0056】

一部の実施形態では、投与は、カテーテルまたは関連するデバイスによるものである。

【0057】

いずれかの態様の一部の実施形態では、方法は、投与することの前に、ハンチントン病を有するかまたはハンチントン病を発症するリスクを有するとして対象を診断するステップをさらに含む。

【0058】

いずれかの態様の一部の実施形態では、投与することの前に、ハンチントン病を有するかまたはハンチントン病を発症するリスクを有するとして対象を診断するアッセイの結果を受け取るステップをさらに含む。ハンチントン病を有するかまたはそれを発症するリスクを有するとして対象を診断するための例示的なアッセイ、例えば、少なくとも３６個のＣＡＧリピート、少なくとも４０個のＣＡＧリピート、または少なくとも１００個のＣＡＧリピート、またはそれより多いＣＡＧリピートの遺伝子スクリーニングが本明細書に記載されている。

【図面の簡単な説明】

【0059】

【図1】図１は、人工ｍｉＲＮＡの構築物を示す概略図である。ｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）－Ｓｙｎ１－ｈＣＧイントロンは対照ベクターであり、これに、エンプティヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）イントロンを挿入して、シナプシンプロモーターで駆動する。対照ｍｉＲＮＡ前駆体（ランダム配列または非機能性変異）の２つのコピーをベクターｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）－Ｓｙｎ１－ｈＣＧｉｎ－２ｘ対照ｐｒｅ－ｍｉＲのｈＣＧｉｎ中に挿入する。人工ｐｒｅ－ｍｉＲ（約１００～１５０ｂｐの隣接上流および下流配列を含む３’－ＵＴＲ標的配列と完全一致）の２つのコピーをｈＣＧイントロン間へとクローニングする。ベクターｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）－Ｓｙｎ１－ＣＹＰ４６Ａ１－ｈＣＧｉｎ－２ｘ人工ｐｒｅ－ｍｉＲは、組合せ構築物であり、ＣＹＰ４６Ａ１と人工ｍｉＲＮＡの両方を同時に生成することができる。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが、成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングされて、ＣＡＧ伸長を含むＨＴＴ標的配列（これは、成熟ｍｉＲＮＡと完全に相補的である）と組み合わされ得るかどうかを確認するために、ＨＴＴ標的配列をルシフェラーゼ遺伝子の後に挿入する。パッケージサイズの制限のために、構築物には小ポリＡが使用される。

【0060】

【図2】図２は、ハンチントン病（ＨＤ）の機序を示す概略図である。

【0061】

【図3】図３は、ＨＤ処置の例示的な方法を示す概略図である。

【0062】

【図4】図４は、ＨＤに関する人工ｍｉＲＮＡをスクリーニングするためのプロセスを示す概略図である。

【0063】

【図5】図５は、ＨＴＴ遺伝子（またはｍＲＮＡ）における人工ｍｉＲＮＡの位置を示す概略図である。ｍｉＨＴＴ－Ｈ２は領域Ｉに位置し；ｍｉＨＴＴ－Ｈ４およびｍｉＨＴＴ－Ｈ５はＣＡＧリピートの５’ジャンパーおよび３’ジャンパーに位置し；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１４は領域ＩＶに位置し；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１５、Ｈ１７、Ｈ１９およびＨ２１は領域Ｖに位置する。

【0064】

【図6】図６は、ＨＴＴ遺伝子の領域を示す概略図である。ＣＡＧリピートは、領域Ｉに位置する。

【0065】

【図7】図７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプラスミドトランスフェクションによる人工ｍｉＲＮＡの１回目のスクリーニング（例えば、２９３細胞系において；第Ｉ期）を示す概略図である。

【0066】

【図8-1】図８Ａ～８Ｂは、２９３細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのプラスミドトランスフェクションによる人工ｍｉＲＮＡの１回目のスクリーニング（例えば、第Ｉ期）を示す一連の概略図およびグラフである。図８Ａは、選択された人工ｍｉＲＮＡおよびＨＴＴ遺伝子におけるそれらの標的領域を示す概略図である。図８Ｂは、人工ｍｉＲＮＡが、共トランスフェクションによって、標的配列によるルシフェラーゼ遺伝子発現を阻害したことを示す棒グラフである。４８時間の共トランスフェクション後に、ｐＥＭＢＬ－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎ－ｍｉＨＴＴ－Ｈ２およびｍｉＨＴＴ－Ｈ５は、ｐＥＭＢＬ－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎ（対照としての）と比較して、個々に、約４６．４％および５４．８％のルシフェラーゼ活性を効率的に阻害することができた。Ｐｅｍｂｌ－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎに対して^＊＊ｐ＜０．０１。

【図8-2】同上。

【0067】

【図9】図９は、ＨＤに関する人工ｍｉＲＮＡをスクリーニングするためのプロセス（例えば、第Ｉ期）を示す概略図である。

【0068】

【図10】図１０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＡＶ感染による人工ｍｉＲＮＡの２回目のスクリーニングを示す概略図である。

【0069】

【図11-1】図１１Ａ～１１Ｂは、ヒト神経細胞系Ｕ８７（ヒト一次神経膠芽腫細胞系）におけるＡＡＶＲＨ１０に媒介される人工ｍｉＲＮＡの試験を示す一連の棒グラフである。図１１Ａは、ルシフェラーゼ活性を示し、図１１Ｂは、対照と比較したルシフェラーゼ活性のパーセンテージを示す。図１１Ａ～１１Ｂは、ＡＡＶＲＨ１０に媒介される人工ｍｉＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的配列によるルシフェラーゼ遺伝子発現を阻害したことを示す。そのそれぞれの標的配列と組み合わせたＡＡＶＲＨ１０－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎ－ｍｉＨＴＴ－Ｈ２およびＨ５をルシフェラーゼ遺伝子中に挿入し、ＡＡＶＲＨ１０－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎ（対照としての）と比較して、約８４．９％および７６．９％、ルシフェラーゼ活性を大いに阻害した。ＡＡＶＲＨ１０－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎに対して^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図11-2】同上。

【0070】

【図12】図１２は、ヒト神経細胞Ｕ８７におけるＨＴＴタンパク質に対する人工ｍｉＲＮＡの阻害の試験（例えば、第Ｉ期）を示す概略図である。

【0071】

【図13】図１３は、ヒト神経細胞系Ｕ８７におけるＨＴＴタンパク質レベルを示すウエスタンブロットを提示する。Ｕ８７細胞におけるＡＡＶＲＨ１０－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎ－ｍｉＨＴＴ－Ｈ１～Ｈ５による処置後に、ＡＡＶＲＨ１０－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎ－ｍｉＨＴＴ－Ｈ２、－ｍｉＨＴＴ－Ｈ４および－ｍｉＨＴＴ－Ｈ５によってＨＴＴタンパク質発現が低減した。β－アクチンを負荷対照として使用する。

【0072】

【図14】図１４は、ヒト神経細胞系Ｕ８７におけるＨＴＴウエスタンブロットの定量データを示す棒グラフである（例えば、図１２を参照されたい）。ＨＴＴタンパク質発現は、ＡＡＶＲＨ１０－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎ－ｍｉＨＴＴ－Ｈ２によって７３．２％まで、ｍｉＨＴＴ－Ｈ４によって５８．５％、およびｍｉＨＴＴ－Ｈ５によって４１．５％まで阻害された。（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝４）。

【0073】

【図15】図１５は、ＨＤに関する人工ｍｉＲＮＡをスクリーニングするためのプロセス（例えば、第ＩＩ期）を示す概略図である。

【0074】

【図16】図１６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプラスミドトランスフェクションによる人工ｍｉＲＮＡの１回目のスクリーニング（例えば、２９３細胞系において；第ＩＩ期）を示す概略図である。

【0075】

【図17】図１７は、３’－ＵＴＲからの配列による２回目のスクリーニングを示す棒グラフである。人工ｍｉＲＮＡは、共トランスフェクションによって標的配列によるルシフェラーゼ遺伝子発現を阻害した。２回目のスクリーニングでは、４８時間の共トランスフェクション後に、ｐＥＭＢＬ－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎ－ｍｉＨＴＴ－Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１７、Ｈ１９（ｍｉＲ－１３７）およびｍｉＨＴＴ－Ｈ２１（ｍｉＲ－２１６）は、ｐＥＭＢＬ－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎ（対照としての）と比較して、ルシフェラーゼ活性を効率的に阻害した。ＭｉＨＴＴ－Ｈ２、Ｈ４およびＨ５を陽性対照として使用した。筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子を標的とするためのＭｉＤＭＰＫ－Ｍ５、Ｍ７およびＭ９も、陰性対照として使用した。ｐＥＭＢＬ－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎに対して^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【0076】

【図18】図１８は、３’－ＵＴＲからの配列による２回目のスクリーニングを示す棒グラフである。人工ｍｉＲＮＡは、共トランスフェクションによって標的配列によるルシフェラーゼ遺伝子発現を阻害した。４８時間の共トランスフェクション後に、ｐＥＭＢＬ－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎ－ｍｉＨＴＴ－Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１７、Ｈ１９（ｍｉＲ－１３７）およびｍｉＨＴＴ－Ｈ２１（ｍｉＲ－２１６）は、ｐＥＭＢＬ－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎ（対照としての）と比較して、ルシフェラーゼ活性を効率的に阻害した。対照（１００％）と比較して、ルシフェラーゼ活性は、個々に、２．４５％（Ｈ１４）、８．７５％（Ｈ１５）、９．２％（Ｈ１７）、１２．８９％（ｍｉＲ－１３７）、および４．１７％（ｍｉＲ－２１６）であった。ＭｉＨＴＴ－Ｈ２、Ｈ４およびＨ５を陽性対照として使用した。ＤＭＰＫ遺伝子を標的とするためのＭｉＤＭＰＫ－Ｍ５、Ｍ７およびＭ９も、陰性対照として使用した。ｐＥＭＢＬ－ＣＭＶ－ｈＣＧｉｎに対して^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【0077】

【図19】図１９は、３’－ＵＴＲからの配列による２回目のスクリーニングを示す概略図である。具体的には、概略図は、ＨＴＴ遺伝子における人工ｍｉＲＮＡの位置を示す。ｍｉＨＴＴ－Ｈ２は領域Ｉに位置し；ｍｉＨＴＴ－Ｈ４およびｍｉＨＴＴ－Ｈ５は、それぞれ、ＣＡＧリピートの５’ジャンパーおよび３’ジャンパーに位置し；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１４は領域ＩＶに位置し；ならびにｍｉＨＴＴ－Ｈ１５、Ｈ１７、Ｈ１９およびＨ２１は領域Ｖに位置する。

【0078】

【図20】図２０は、ヒト神経細胞Ｕ８７におけるＨＴＴタンパク質に対する人工ｍｉＲＮＡの阻害の試験（例えば、第ＩＩ期）を示す概略図である。

【0079】

【図21】図２１は、ＨＤ患者由来のヒト線維芽細胞における人工ｍｉＲＮＡの試験を示す概略図である。非限定的な例として、２～３番目に高い性能のｍｉＨＴＴからトランスフェクトした／感染した試料を、オフターゲット分析を実施するために送ることができる。

【0080】

【図22】図２２は、人工ｍｉＲＮＡ構築物を示す概略図である。ＥＭＢＬ－Ｄ（＋）－Ｓｙｎ１－ｈＣＧｉｎｔｒｏｎは、対照として使用され、シナプシンプロモーターにより駆動される、エンプティヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）イントロン（すなわち、ｍｉＲＮＡを有さない）を含む、二本鎖ベクターである。人工ｍｉＨＴＴ（約１００～１５０ｂｐの隣接する上流および下流配列を含む標的配列と完全一致）の２つのコピーをｈＣＧイントロン間へとクローニングする。ｍｉＨＴＴが成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングされ得るかどうかを確認するために、ＣＡＧ伸長を含むＨＴＴ標的配列（これは、成熟ｍｉＲＮＡと完全に相補的である）は、ルシフェラーゼ遺伝子の後に挿入される。パッケージサイズの制限のために、構築物には小ポリＡを使用する。Ｓｙｎ１はシナプシン１を表すことに留意されたい。

【0081】

【図23-1】図２３は、ｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）－Ｓｙｎ１－ｈＣＧｉｎ－２ｘ ｍｉＨＴＴのマップを示す概略図である。

【図23-2】図２３は、ｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）－Ｓｙｎ１－ｈＣＧｉｎ－２ｘ ｍｉＨＴＴのマップを示す概略図である。

【0082】

【図24】図２４は、最適化されたＣＹＰ４６Ａ１の発現ベクターを示す概略図である。ｐＡＡＶ２．１－Ｓｙｎ１－ＧＦＰ－ｓＰＡは、対照として使用される一本鎖ベクターである。ｐＡＡＶ２．１－Ｓｙｎ１－ＣＹＰ４６Ａ１－ｓＰＡは、筋肉特異的プロモーターＳｙｎ１により駆動されるＣＹＰ４６Ａ１を過剰発現するために使用される。ベクターｐＡＡＶ２．１－Ｓｙｎ１－ＣＹＰ４６Ａ１－ｈＣＧｉｎ－２ｘ ｍｉＨＴＴは、組合せ構築物であり、ＣＹＰ４６Ａ１と人工ｍｉＨＴＴの２つのコピーの両方を同時に生成することができる。

【0083】

【図25-1】図２５は、ｐＡＡＶ２．１－Ｓｙｎ１－ＣＹＰ４６Ａ１－ｈＣＧｉｎ－２ｘ ｍｉＨＴＴのマップを示す概略図である。

【図25-2】図２５は、ｐＡＡＶ２．１－Ｓｙｎ１－ＣＹＰ４６Ａ１－ｈＣＧｉｎ－２ｘ ｍｉＨＴＴのマップを示す概略図である。

【0084】

【図26】図２６は、人工ｍｉＲＮＡをスクリーニングするプロセスおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのその標的配列の同定を示す概略図である。人工ｍｉＲＮＡ前駆体の２つのコピーを切断し、成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングする。ｍｉＲＮＡは、ＣＡＧ伸長を含むＨＴＴ標的配列とさらに正確にマッチし、ルシフェラーゼ発現を阻害する。同時に、対照ｍｉＲＮＡは、プロセシングもされ得るが、ＨＴＴ標的配列と結びつくことができないため、これは、ルシフェラーゼの発現に影響を及ぼさない。この方法は、通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍｉＲＮＡの標的配列を同定するために利用される。

【0085】

【図27】図２７は、ｍｉＲ－３０前駆体の骨格に基づく人工ｍｉＲＮＡの構築物を示す一連の概略図およびイメージならびに関連するブロットである。

【発明を実施するための形態】

【0086】

詳細な説明
本発明の態様は、対象に送達された場合に、対象における病原性ハンチンチンタンパク質（ＨＴＴ）の発現を低減するために有効である、ある特定の干渉ＲＮＡ（例えば、人工ｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡ）に関する。したがって、本開示によって記載される方法および組成物は、一部の実施形態では、ハンチントン病の処置のために有用である。
阻害性ＲＮＡ

【0087】

一態様では、ハンチントン病の処置のために使用することができる阻害性ＲＮＡが本明細書に記載される。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１～２４のうちの１つまたは配列番号１～２４の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１～２４の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0088】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0089】

記載された阻害性ＲＮＡ（例えば、配列番号１～２４）のいずれかの組合せは、例えば、本明細書に記載されているベクター、ｒＡＡＶ組成物、または処置方法において使用することができる。非限定的な例として、以下の組合せが具体的に企図される：配列番号１～２２の少なくとも１つ；配列番号１～１０の少なくとも１つ；配列番号１～５の少なくとも１つ；配列番号６～７の少なくとも１つ；配列番号８～１０の少なくとも１つ；配列番号１１～２４の少なくとも１つ；配列番号１１～１４の少なくとも１つ；配列番号１５～２４の少なくとも１つ；配列番号１５～２２の少なくとも１つ；配列番号１５～１８の少なくとも１つ；配列番号１９～２２の少なくとも１つ；配列番号２３～２４の少なくとも１つ；配列番号１もしくは４～９の少なくとも１つ；配列番号２、４、５、１４、１５、１７、１９、もしくは２１の少なくとも１つ；配列番号２、４、５、１４、１５、もしくは１７の少なくとも１つ；配列番号２、４、もしくは５の少なくとも１つ；配列番号２もしくは５の少なくとも１つ；または配列番号１４、１５、１７、１９、もしくは２１の少なくとも１つ；配列番号１４、１５、もしくは１７の少なくとも１つ。

【0090】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１～２２のうちの１つまたは配列番号１～２２の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１～１０の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0091】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子の領域Ｉ～ＩＩＩ（例えば、ＣＡＧリピート、ＣＡＧ５’ジャンパー、ＣＡＧ３’ジャンパー；５’－ＵＴＲ；またはエクソン１）のうちの少なくとも１つを標的とする。したがって、態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１～１０のうちの１つまたは配列番号１～１０の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１～１０の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0092】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子の領域Ｉ（例えば、ＣＡＧリピート、ＣＡＧ５’ジャンパー、またはＣＡＧ３’ジャンパー）を標的とする。したがって、態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１～５のうちの１つまたは配列番号１～５の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１～５の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0093】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子の領域ＩＩ（例えば、５’－ＵＴＲ）を標的とする。したがって、態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号６～７のうちの１つまたは配列番号６～７の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号６～７の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0094】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子の領域ＩＩＩ（エクソン１）を標的とする。したがって、態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号８～１０のうちの１つまたは配列番号８～１０の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号８～１０の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0095】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子の領域ＶＩ～Ｖ（例えば、エクソン２～６７または３’ＵＴＲ）のうちの少なくとも１つを標的とする。したがって、態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１１～２４のうちの１つまたは配列番号１１～２４の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１１～２４の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0096】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子の領域ＶＩ（例えば、エクソン２～６７）を標的とする。したがって、態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１１～１４のうちの１つまたは配列番号１１～１４の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１１～１４の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0097】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子の領域ＩＩＩおよびＶＩ（例えば、５’－ＵＴＲおよびエクソン２～６７）を標的とする。したがって、態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号８または１３のうちの１つまたは配列番号８または１３の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号８または１３の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0098】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子の領域Ｖ（例えば、３’ＵＴＲ）を標的とする。したがって、態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１５～２４のうちの１つまたは配列番号１５～２４の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１５～２４の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0099】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子の領域Ｖ（例えば、３’ＵＴＲ）を標的とする。したがって、態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１５～２２のうちの１つまたは配列番号１５～２２の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１５～２２の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0100】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子の領域Ｖ（例えば、３’ＵＴＲ）を標的とし、人工ｍｉＲＮＡである。したがって、態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１５～１８のうちの１つまたは配列番号１５～１８の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１５～１８の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0101】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子の領域Ｖ（例えば、３’ＵＴＲ）を標的とし、ヒト発現ｍｉＲＮＡである。したがって、態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１９～２２のうちの１つまたは配列番号１９～２２の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１９～２２の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0102】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＨＴＴ遺伝子の領域Ｖ（例えば、３’ＵＴＲ）を標的とする。したがって、態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号２３～２４のうちの１つまたは配列番号２３～２４の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号２３～２４の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号２３～２４のうちの１つまたは配列番号２３～２４の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号２３～２４の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含まない。

【0103】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１または４～９のうちの１つまたは配列番号１または４～９の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１または４～９の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0104】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号２、４、５、１４、１５、１７、１９、２１のうちの１つまたは配列番号２、４、５、１４、１５、１７、１９、２１の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号２、４、５、１４、１５、１７、１９、２１の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0105】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号２、４、５、１４、１５、１７のうちの１つまたは配列番号２、４、５、１４、１５、１７、の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号２、４、５、１４、１５、１７の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0106】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号２、４、５のうちの１つまたは配列番号２、４、５の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号２、４、５の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0107】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号２、５のうちの１つまたは配列番号２または５の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号２または５の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0108】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１４、１５、１７、１９、２１のうちの１つまたは配列番号１４、１５、１７、１９、２１の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１４、１５、１７、１９、２１の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0109】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１４、１５、１７のうちの１つまたは配列番号１４、１５、１７の少なくとも１つと同じ機能（例えば、ＨＴＴ阻害）を維持する、配列番号１４、１５、１７の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0110】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、ｍｉＨＴＴ－Ｈ２（配列番号２）を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、ｍｉＨＴＴ－Ｈ４（配列番号４）を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、ｍｉＨＴＴ－Ｈ５（配列番号５）を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、ｍｉＨＴＴ－Ｈ１４（配列番号１４）を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、ｍｉＨＴＴ－Ｈ１５（配列番号１５）を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、ｍｉＨＴＴ－Ｈ１７（配列番号１７）を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、ｍｉＨＴＴ－Ｈ１９（配列番号１９；ｍｉＲ－１３７）を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、ｍｉＨＴＴ－Ｈ２１（配列番号２１；ｍｉＲ－２１６）を含む。

【0111】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ＨＴＴ核酸（例えば、配列番号２５を参照されたい）の少なくとも１部分に結合するおよび／またはそれを標的とする。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の５’非翻訳領域に結合するおよび／またはそれを標的とする。

【0112】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、標的（例えば、ＨＴＴ）のエクソン１（すなわち、ポリペプチドをコードする第１の核酸セグメント）に結合するおよび／またはそれを標的とする。

【0113】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）のＣＡＧリピートに結合するおよび／またはそれを標的とする。用語「ＣＡＧリピート」は、ＣＡＧトリヌクレオチド（すなわち、シトシン、アデニン、およびグアニン）リピートを含むＨＴＴ遺伝子のエクソン１の領域を指す。通常、ＣＡＧトリヌクレオチドは、ＨＴＴ遺伝子内で１０～３５回反復され得る。ハンチントン病を有する個体では、ＣＡＧセグメントは、３６～１２０回より多く反復され得る。

【0114】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）のＣＡＧ５’－ジャンパーに結合するおよび／またはそれを標的とする。用語「ＣＡＧ５’－ジャンパー」は、エクソン１の３’末端およびＣＡＧリピートの５’末端を含むＨＴＴ遺伝子の領域を指す。

【0115】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）のＣＡＧ３’ジャンパーに結合するおよび／またはそれを標的とする。用語「ＣＡＧ３’－ジャンパー」は、ＣＡＧリピートの３’末端およびエクソン２～６７の５’末端を含むＨＴＴ遺伝子の領域を指す。

【0116】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）のエクソン２～６７に結合するおよび／またはそれを標的とする。用語、ＨＴＴ遺伝子の「エクソン２～６７」は、ＨＴＴ遺伝子のエクソン２～エクソン６７からなる領域を指す。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は：ＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）のエクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、またはエクソン６７の少なくとも１つに結合するおよび／またはそれを標的とする。

【0117】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合するおよび／またはそれを標的とする。

【0118】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、標的（例えば、ＨＴＴ）の５’ＵＴＲ、エクソン１、ＣＡＧリピート、ＣＡＧ５’－ジャンパー、またはＣＡＧ３’ジャンパーに結合するおよび／またはそれを標的とする。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、標的（例えば、ＨＴＴ）のエクソン２～６７または３’ＵＴＲに結合するおよび／またはそれを標的とする。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、標的（例えば、ＨＴＴ）の５’ＵＴＲ、エクソン１、ＣＡＧリピート、ＣＡＧ５’－ジャンパー、ＣＡＧ３’ジャンパーに結合するおよび／またはそれを標的とする。

【0119】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）における少なくとも１つの結合部位に結合する。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）における少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の結合部位に結合する。

【0120】

態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウスのＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に結合するおよび／またはそれを標的とする。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスのＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に結合するおよび／またはそれを標的とする。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ヒトのＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に結合するおよび／またはそれを標的とする。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、非ヒト霊長類のＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に結合するおよび／またはそれを標的とする。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、マウスのＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に結合するおよび／またはそれを標的とする。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、ヒトおよび非ヒト霊長類のＨＴＴ核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に結合するおよび／またはそれを標的とする。

【0121】

態様のいずれかの一部の実施形態では、ハンチントン病を処置する薬剤は、阻害性核酸である。態様のいずれかの一部の実施形態では、所与の遺伝子の発現の阻害剤は、阻害性核酸であってもよい。本明細書で使用される場合、「阻害性核酸」は、標的、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）などの発現を阻害することができる核酸分子を指す。

【0122】

二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知の高度に保存された調節機序において遺伝子発現を遮断することが示されている。本明細書に記載の阻害性核酸は、３０ヌクレオチド長またはそれより短い、すなわち、１５～３０ヌクレオチド長、一般に、１９～２４ヌクレオチド長である領域（この領域は、少なくとも部分的に標的ｍＲＮＡ転写物に対して実質的に相補的である）を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み得る。これらのｉＲＮＡの使用によって、ｍＲＮＡ転写物の標的化された分解が可能となり、標的の発現および／または活性の低下がもたらされる。

【0123】

本明細書で使用される場合、用語「ｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ（または本明細書において以下に記載されている修飾された核酸）を含有し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介するＲＮＡ転写物の標的化された切断を媒介する、作用因子を指す。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されているｉＲＮＡは、標的の発現および／または活性の阻害をもたらす。態様のいずれかの一部の実施形態では、細胞を阻害剤（例えば、ｉＲＮＡ）と接触させることにより、ｉＲＮＡが存在しない細胞中に見られる標的ｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、最大１００％（１００％を含む）まで、細胞中の標的ｍＲＮＡレベルの低下をもたらす。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害剤（例えば、ｉＲＮＡ）を対象に投与することにより、ｉＲＮＡが存在しない対象中に見られる標的ｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、最大１００％（１００％を含む）まで、対象中の標的ｍＲＮＡレベルの低下をもたらす。

【0124】

態様のいずれかの一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡであってもよい。ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが使用される条件下で、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分に相補的である２本のＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡのうちの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に対して、実質的に相補的であり、一般には、完全に相補的である相補的領域を含む。標的配列は、標的の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来してもよく、例えば、標的配列は、１つまたは複数のイントロン境界にまたがっていてもよい。他方の鎖（センス鎖）は、２本の鎖がハイブリダイズし、好適な条件下で組み合わされた場合に二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に対して相補的である領域を含む。一般に、二本鎖構造は、長さが１５から３０塩基対の間（両端を含む）、より一般的には長さが１８から２５塩基対の間（両端を含む）、なおより一般的には長さが１９から２４塩基対の間（両端を含む）、および最も一般的には長さが１９から２１塩基対の間（両端を含む）である。同様に、標的配列に対して相補的である領域は、長さが１５から３０塩基対の間（両端を含む）、より一般的には長さが１８から２５塩基対の間（両端を含む）、なおより一般的には長さが１９から２４塩基対の間（両端を含む）、および最も一般的には長さが１９から２１塩基対のヌクレオチド長の間（両端を含む）である。態様のいずれかの一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１５から２０ヌクレオチド長の間（両端を含む）であり、他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２５から３０ヌクレオチド長の間（両端を含む）である。当業者が認識するように、切断のために標的化されるＲＮＡの標的領域は、殆どの場合、より大きなＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ分子であることが多い）の一部である。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ指向性切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を介する切断）のための基質であるのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続配列である。９塩基対程度の短い二本鎖を有するｄｓＲＮＡは、一部の状況下で、ＲＮＡｉ特異的ＲＮＡ切断を媒介することができる。殆どの場合、標的は、少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは１５～３０ヌクレオチド長である。

【0125】

阻害性核酸の種類の例示的な実施形態は、例えば、当技術分野で周知である、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはａｍｉＲＮＡを含んでもよい。

【0126】

態様のいずれかの一部の実施形態では、ハンチントン病を処置するための阻害性ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、１７～２５ヌクレオチドの小ＲＮＡであり、真核生物において遺伝子発現の調節因子として機能する。ｍｉＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる長い転写一次産物の一部として、核において最初に発現される。核の内側では、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、酵素Ｄｒｏｓｈａによって部分的に消化され、６５～１２０ヌクレオチド長のヘアピン前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を形成し、これは、細胞質に輸送され、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によってさらにプロセシングされて、活性分子であるより短い成熟ｍｉＲＮＡとなる。動物では、これらの短いＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）に対する対合特異性の一次決定因子であると考えられる、５’近位「シード」領域（２～８ヌクレオチド）を含む。より詳細な説明は、一般的定義を提供する部分において与えられる。

【0127】

本発明の文脈では、ｍｉＲＮＡ分子またはその等価物もしくは模倣体もしくはｉｓｏｍｉＲは、合成ｍｉＲＮＡもしくは天然ｍｉＲＮＡもしくは組換えｍｉＲＮＡもしくは成熟ｍｉＲＮＡもしくは成熟ｍｉＲＮＡの一部もしくはヒトｍｉＲＮＡであってもよく、または一般的定義を提供する部分においてさらに定義されるヒトｍｉＲＮＡに由来してもよい。ヒトｍｉＲＮＡ分子は、ヒトの細胞、組織、臓器または体液において見られるｍｉＲＮＡ分子（すなわち、内因性ヒトｍｉＲＮＡ分子）である。ヒトｍｉＲＮＡ分子は、ヌクレオチドの置換、欠失および／または付加によって内因性ヒトｍｉＲＮＡ分子に由来するヒトｍｉＲＮＡ分子であってもよい。ｍｉＲＮＡ分子またはその等価物もしくは模倣体は、一本鎖ＲＮＡ分子であっても二本鎖ＲＮＡ分子であってもよい。好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子またはその等価物、もしくは模倣体は、６～３０ヌクレオチド長、好ましくは１２～３０ヌクレオチド長、好ましくは１５～２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長またはそれより大きい長さを有する。

【0128】

好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子またはその等価物、模倣体もしくはｉｓｏｍｉＲは、前記ｍｉＲＮＡ分子またはその等価物もしくは模倣体もしくはｉｓｏｍｉＲのシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６ヌクレオチドを含む。好ましくは、この実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子またはその等価物もしくは模倣体もしくはｉｓｏｍｉＲは、６～３０ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ分子またはその等価物のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６ヌクレオチドを含む。さらにより好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子またはその等価物もしくは模倣体もしくはｉｓｏｍｉＲは、１５～２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、シード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６ヌクレオチドを含み、さらにより好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長またはそれより大きい長さを有する。

【0129】

したがって、好ましいｍｉＲＮＡ分子またはその等価物もしくは模倣体もしくはｉｓｏｍｉＲは、配列番号１～２４の少なくとも１つとして同定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６ヌクレオチドを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長またはそれより大きい長さを有する。

【0130】

ｍｉＲＮＡのための送達ビヒクルとしては、以下に限定されないが：リポソーム、ポリマーナノ粒子、ウイルス系、脂質または受容体結合分子のコンジュゲーション、エキソソーム、およびバクテリオファージが挙げられる；例えば、そのそれぞれの内容が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、Ｂａｕｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｉｎｋｌｅｒ， ｍｉＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｎｏｎ－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｇｅｎｔｓ， Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ２０１４， ６（１７）： １９６７－１９８４；米国特許第８，９００，６２７号；米国特許第９，４２１，１７３号；米国特許第９，５５５，０６０号；ＷＯ２０１９／１７７５５０を参照されたい。
核酸

【0131】

一部の態様では、本開示は、ヒトハンチンチン（ＨＴＴ）の発現を低減する（例えば、阻害する）ために有用である、単離された核酸を提供する。「核酸」配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を指す。一部の実施形態では、本開示のタンパク質および核酸は、単離されている。本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、人工的に生じたことを意味する。核酸に関して本明細書で使用される場合、用語「単離された」は：（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅された；（ｉｉ）クローニングによって組換え生成された；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離によってなど、精製された；または（ｉｖ）例えば、化学合成によって合成されたことを意味する。単離された核酸は、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技法によって容易に操作可能であるものである。よって、５’および３’制限部位が知られているか、またはそれに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されている、ベクター中に含有されるヌクレオチド配列は、単離されたと考えられるが、その天然の宿主中にネイティブの状態で存在する核酸配列はそうではない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、そうである必要はない。例えば、クローニングまたは発現ベクター内で単離された核酸は、その物質が存在している細胞内において、その物質をほんのわずかなパーセンテージしか含まない可能性があるという点で純粋ではない。しかしながら、このような核酸は、当業者に公知の標準的技法によって容易に操作可能であるという理由でこの用語が使用されるため、このような核酸は単離されている。タンパク質またはペプチドに関して本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、その天然の環境から単離されたかまたは人工的に生成した（例えば、化学合成によって、組換えＤＮＡ技術によってなど）タンパク質またはペプチドを指す。

【0132】

当業者は、キャプシドタンパク質の機能的に等価なバリアント、またはホモログを提供するために、保存的アミノ酸置換がなされ得ることも認識する。一部の態様では、本開示は、保存的アミノ酸置換をもたらす配列の変更を包含する。本明細書で使用される場合、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対的変化またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。バリアントは、このような方法を編集する参照文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見られるような、当業者に公知のポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製され得る。アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸の間でなされる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。したがって、本明細書に開示されるタンパク質およびポリペプチドのアミノ酸配列に対して保存的アミノ酸置換がなされ得る。

【0133】

本発明の単離された核酸は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（ｒＡＡＶベクター）であってもよい。一部の実施形態では、本開示によって記載されている単離された核酸は、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む領域（例えば、第１の領域）を含む。単離された核酸（例えば、組換えＡＡＶベクター）は、キャプシドタンパク質中にパッケージングされ、対象に投与されてもよいおよび／または選択される標的細胞に送達されてもよい。「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、典型的には、最小限、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに５’および３’ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）から構成される。導入遺伝子は、本明細書の他の箇所に開示されるように、対象の内因性ｍＲＮＡを標的とする核酸を含む１つまたは複数の阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）をコードする１つまたは複数の領域を含んでもよい。導入遺伝子は、本開示の他の箇所に記載されているように、例えば、タンパク質をコードする領域および／または発現対照配列（例えば、ポリＡテール）を含んでもよい。

【0134】

一般に、ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、ＩＴＲをコードする全配列が分子中で実質的に使用されるが、これらの配列のある程度のマイナーな修飾は許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当技術分野の技術の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）；およびＫ． Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， ７０：５２０ ５３２ （１９９６）などの本文を参照されたい）。本発明において用いられるこのような分子の例は、導入遺伝子を含有する「シス作用」プラスミドであり、ここで、選択される導入遺伝子配列および関連する調節エレメントは、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に挟まれている。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、本発明によって同定した哺乳動物ＡＡＶ型を含む、いずれかの公知のＡＡＶから得られてもよい。一部の実施形態では、単離された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶｒｈ１０、およびそのバリアントから選択される血清型を有する少なくとも１つのＩＴＲを含む。一部の実施形態では、単離された核酸は、ＡＡＶ２ ＩＴＲをコードする領域（例えば、第１の領域）を含む。

【0135】

一部の実施形態では、単離された核酸は、第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む領域（例えば、第２の領域、第３の領域、第４の領域など）をさらに含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶｒｈ１０、およびそのバリアントから選択される血清型を有する。一部の実施形態では、第２のＩＴＲは、機能的末端分離部位（ＴＲＳ）を欠く変異体ＩＴＲである。用語「末端分離部位を欠く」は、ＩＴＲの末端分離部位（ＴＲＳ）の機能を妨げる変異（例えば、非同義の変異などのセンス変異、またはミスセンス変異）を含むＡＡＶ ＩＴＲ、または機能的ＴＲＳをコードする核酸配列を欠く切断されたＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、ＡＴＲＳ ＩＴＲ）を指し得る。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、機能的ＴＲＳを欠くＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターは、例えばＭｃＣａｒｔｈｙ （２００８） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １６（１０）： １６４８－１６５６に記載されている、自己相補的ｒＡＡＶベクターを生じる。

【0136】

組換えＡＡＶベクターに関して上記で確認された主要なエレメントに加えて、ベクターは、ベクターによりトランスフェクトされたか、または本発明によって生成されたウイルスに感染した細胞内で、その転写、翻訳および／または発現を可能にするように、導入遺伝子のエレメントと作動可能に連結している従来の制御エレメントも含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」配列は、目的の遺伝子と連続している発現制御配列と目的の遺伝子を制御するためにトランスまたは遠位で作用する発現制御配列との両方を含む。発現制御配列は、適切な転写開始配列、停止配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；および所望の場合、コードされた産物の分泌を増強する配列を含む。ネイティブの、構成的な、誘導性のおよび／または組織特異的なプロモーターを含むいくつかの発現制御配列は、当技術分野で公知であり、利用することができる。

【0137】

本明細書で使用される場合、核酸配列（例えば、コード配列）および調節配列は、核酸配列の発現または転写を、調節配列の影響下または制御下に置くように、共有結合によって連結される場合に、作動可能に連結されたと言われる。核酸配列が機能的タンパク質へと翻訳されることが望ましい場合、２つのＤＮＡ配列は、５’調節配列におけるプロモーターの誘導によって、コード配列の転写がもたらされる場合、および２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が（１）フレームシフト変異の導入をもたらさない、（２）プロモーター領域のコード配列の転写を指示する能力を妨げない、または（３）対応するＲＮＡ転写物のタンパク質へと翻訳される能力を妨げない場合に、作動可能に連結したと言われる。よって、プロモーター領域は、プロモーター領域が、得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドへと翻訳され得るように、そのＤＮＡ配列の転写を引き起こすことが可能である場合に、核酸配列に作動可能に連結しているであろう。同様に、２つまたはそれより多いコード領域は、共通のプロモーターからのそれらの転写が、インフレームの翻訳された２つまたはそれより多いタンパク質の発現をもたらすように、それらが連結されている場合に、作動可能に連結されている。一部の実施形態では、作動可能に連結されたコード配列は、融合タンパク質をもたらす。一部の実施形態では、作動可能に連結したコード配列は、機能的ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）をもたらす。

【0138】

一部の態様では、本開示は、導入遺伝子を含む単離された核酸であって、導入遺伝子が、１つまたは複数のｍｉｃｒｏＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む、単離された核酸を提供する。「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、転写または翻訳後の遺伝子サイレンシングを媒介することが可能な非コードＲＮＡの低分子である。典型的には、ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡへと酵素的に処理される（例えば、Ｄｒｏｓｈａ、ＤＧＣＲ８、Ｐａｓｈａなどによって）、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と称される、ヘアピンまたはステムループ（例えば、自己相補的な、一本鎖骨格を有する）二本鎖構造として転写される。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの長さは様々であってよい。一部の実施形態では、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは約１００～約５０００塩基対（例えば、約１００、約２００、約５００、約１０００、約１２００、約１５００、約１８００、または約２０００塩基対）の長さの範囲である。一部の実施形態では、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、２００塩基対を超える長さ（例えば、２５００、５０００、７０００、９０００、またはそれより多い塩基対の長さ）である。

【0139】

ヘアピンまたはステムループ二本鎖構造によっても特徴付けられるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの長さも様々であってよい。一部の実施形態では、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、約４０塩基対の長さから約５００塩基対の長さのサイズの範囲内である。一部の実施形態では、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、約５０～１００塩基対の長さのサイズの範囲内である。一部の実施形態では、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、約５０～約９０塩基対の長さ（例えば、約５０、約５２、約５４、約５６、約５８、約６０、約６２、約６４、約６６、約６８、約７０、約７２、約７４、約７６、約７８、約８０、約８２、約８４、約８６、約８８、または約９０塩基対の長さ）のサイズの範囲内である。

【0140】

一般に、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、細胞質中に輸送され、ダイサーによって酵素的に処理され、最初に不完全なｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二本鎖、次いで一本鎖の成熟ｍｉＲＮＡ分子を生じ、これは、次に、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に負荷される。典型的には、成熟ｍｉＲＮＡ分子は、約１９～約３０塩基対の長さのサイズの範囲内である。一部の実施形態では、成熟ｍｉＲＮＡ分子は、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または３０塩基対の長さである。一部の実施形態では、本開示の単離された核酸は、配列番号１～２４のいずれか１つに示される配列を含むｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、または成熟ｍｉＲＮＡをコードする配列を含む。

【0141】

単離された核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）が、一部の実施形態では、２以上の（例えば、複数、例えば、２、３、４、５、１０、またはそれより多い）ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含むことが認識されるべきである。一部の実施形態では、２以上のｍｉＲＮＡのそれぞれは、同じ標的遺伝子（例えば、各ｍｉＲＮＡがＨＴＴ遺伝子を標的とする、３つの固有のｍｉＲＮＡをコードする単離された核酸）を標的とする（例えば、それにハイブリダイズするかまたは特異的に結合する）。一部の実施形態では、２以上のｍｉＲＮＡのそれぞれは、同じ標的遺伝子（例えば、ＨＴＴ）の異なる領域を標的とする（例えば、それにハイブリダイズするかまたは特異的に結合する）。一部の実施形態では、２以上のｍｉＲＮＡのそれぞれは、異なる標的遺伝子を標的とする（例えば、それにハイブリダイズするかまたは特異的に結合する）。

【0142】

一部の態様では、本開示は、１つまたは複数の人工ｍｉＲＮＡをコードする単離された核酸およびベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）を提供する。本明細書で使用される場合、「人工ｍｉＲＮＡ」または「ａｍｉＲＮＡ」は、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^＊（例えば、ｍｉＲＮＡ二本鎖のパッセンジャー鎖）の配列が、例えば、Ｅａｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ． （２０１４）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １０６２：２１１－ ２２４に記載されているように、標的遺伝子の非常に効率的なＲＮＡサイレンシングを指示する、対応するａｍｉＲＮＡ／ａｍｉＲＮＡ^＊配列で置き換えられている、内因性ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（例えば、機能的成熟ｍｉＲＮＡを生じることが可能な前駆体ｍｉＲＮＡである、ｍｉＲＮＡ骨格）を指す。例えば、一部の実施形態では、人工ｍｉＲＮＡは、成熟ＨＴＴ特異的ｍｉＲＮＡ（例えば、配列番号１～２４のいずれか１つ）をコードする配列が、内因性ｍｉＲ－１５５成熟ｍｉＲＮＡコード配列の代わりに挿入されているｍｉＲ－１５５ ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格を含む。一部の実施形態では、本開示に記載されているｍｉＲＮＡ（例えば、人工ｍｉＲＮＡ；例えば、配列番号１～２４のうちの１つ）は、ｍｉＲ－１５５骨格配列、ｍｉＲ－３０骨格配列、ｍｉｒ－６４骨格配列、またはｍｉＲ－１２２骨格配列を含む。一部の実施形態では、本開示に記載されているｍｉＲＮＡ（例えば、人工ｍｉＲＮＡ；例えば、配列番号１～２４のうちの１つ）は、配列番号３５に開示されている骨格を含む。

【0143】

導入遺伝子を含む領域（例えば、第２の領域、第３の領域、第４の領域など）は、単離された核酸のいずれかの好適な場所に置かれてもよい。領域は、例えば、イントロン、５’または３’非翻訳領域などを含む核酸のいずれかの非翻訳部分に置かれてもよい。

【0144】

一部の場合には、領域（例えば、第２の領域、第３の領域、第４の領域など）を、タンパク質をコードする核酸配列（例えば、タンパク質コード配列）の最初のコドンの上流に置くことが望ましい場合がある。例えば、領域は、タンパク質コード配列の最初のコドンと最初のコドンの２０００ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。領域は、タンパク質コード配列の最初のコドンと最初のコドンの１０００ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。領域は、タンパク質コード配列の最初のコドンと最初のコドンの５００ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。領域は、タンパク質コード配列の最初のコドンと最初のコドンの２５０ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。領域は、タンパク質コード配列の最初のコドンと最初のコドンの１５０ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。一部の場合には（例えば、導入遺伝子がタンパク質コード配列を欠く場合には）、領域（例えば、第２の領域、第３の領域、第４の領域など）を導入遺伝子のポリＡテールの上流に置くことが望ましい場合がある。例えば、領域は、ポリＡテールの最初の塩基と最初の塩基の２０００ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と最初の塩基の１０００ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と最初の塩基の５００ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と最初の塩基の２５０ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と最初の塩基の１５０ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と最初の塩基の１００ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と最初の塩基の５０ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。領域は、ポリＡテールの最初の塩基と最初の塩基の２０ヌクレオチド上流との間に置かれてもよい。一部の実施形態では、領域は、プロモーター配列の最後のヌクレオチド塩基とポリＡテール配列の最初のヌクレオチド塩基との間に置かれている。

【0145】

一部の場合には、領域は、導入遺伝子のポリＡテールの最後の塩基の下流に置かれてもよい。領域は、ポリＡテールの最後の塩基と最後の塩基の２０００ヌクレオチド下流の位置との間にあってもよい。領域は、ポリＡテールの最後の塩基と最後の塩基の１０００ヌクレオチド下流の位置との間にあってもよい。領域は、ポリＡテールの最後の塩基と最後の塩基の５００ヌクレオチド下流の位置との間にあってもよい。領域は、ポリＡテールの最後の塩基と最後の塩基の２５０ヌクレオチド下流の位置との間にあってもよい。領域は、ポリＡテールの最後の塩基と最後の塩基の１５０ヌクレオチド下流の位置との間にあってもよい。

【0146】

導入遺伝子が２以上のｍｉＲＮＡをコードする場合には、各ｍｉＲＮＡが導入遺伝子内の任意の好適な場所に置かれてもよいことが認識されるべきである。例えば、第１のｍｉＲＮＡをコードする核酸は、導入遺伝子のイントロン中に置かれてもよく、第２のｍｉＲＮＡをコードする核酸配列は、別の非翻訳領域（例えば、タンパク質コード配列の最後のコドンと導入遺伝子のポリＡテールの最初の塩基との間）に置かれてもよい。

【0147】

一部の実施形態では、導入遺伝子は、１つまたは複数の発現制御配列（例えば、プロモーターなど）をコードする核酸配列をさらに含む。発現制御配列としては、適切な転写開始配列、停止配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに所望の場合に、コードされた産物の分泌を増強する配列が挙げられる。ネイティブの、構成的な、誘導性のおよび／または組織特異的なプロモーターを含む多数の発現制御配列は、当技術分野で公知であり、利用することができる。

【0148】

「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構によって認識されるか、または合成機構に導入されるＤＮＡ配列を指す。句「動作可能に置かれる」、「制御下」または「転写制御下」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸に関して正しい位置および方向にあることを意味する。

【0149】

タンパク質をコードする核酸では、ポリアデニル化配列は、一般に、導入遺伝子配列の後であって３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に挿入される。本開示において有用なｒＡＡＶ構築物は、プロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子の間に位置することが望ましい、イントロンも含有し得る。１つの可能なイントロン配列は、ＳＶ－４０に由来し、ＳＶ－４０ Ｔイントロン配列と称される。使用することができる別のベクターエレメントは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写物から２つ以上のポリペプチドを生成するために使用される。ＩＲＥＳ配列は、２つ以上のポリペプチド鎖を含有するタンパク質を生成するために使用されることになる。これらのおよび他の一般的なベクターエレメントの選択は従来通りであり、多くのこのような配列が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、およびその中の例えば、３．１８ ３．２６および１６．１７ １６．２７頁で引用された参照文献ならびにＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９を参照されたい）。一部の実施形態では、口蹄疫ウイルス２Ａ配列は、ポリタンパク質中に含まれ；これはポリタンパク質の切断を媒介することが示されている小ペプチド（およそ１８アミノ酸長）である（Ｒｙａｎ， Ｍ Ｄ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ， １９９４； ４： ９２８－９３３；Ｍａｔｔｉｏｎ， Ｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６； ｐ． ８１２４－８１２７；Ｆｕｒｌｅｒ， Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２００１； ８： ８６４－８７３；およびＨａｌｐｉｎ， Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， １９９９； ４： ４５３－４５９）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミドおよび遺伝子治療ベクター（ＡＡＶおよびレトロウイルス）を含む人工系において以前に実証されている（Ｒｙａｎ， Ｍ Ｄ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ， １９９４； ４： ９２８－９３３；Ｍａｔｔｉｏｎ， Ｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６； ｐ． ８１２４－８１２７；Ｆｕｒｌｅｒ， Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２００１ ； ８： ８６４－８７３；およびＨａｌｐｉｎ， Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， １９９９； ４： ４５３－４５９；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ， Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １９９９； ６： １９８－２０８；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ， Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２０００； １１ ： １９２１－ １９３１．；およびＫｌｕｍｐ， Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２００１ ； ８： ８１１－８１７）。

【0150】

構成的プロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（必要に応じて、ＣＭＶエンハンサーを伴う）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ４１ ：５２１－５３０ （１９８５）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。一部の実施形態では、プロモーターは、増強されたニワトリβ－アクチンプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｕ６プロモーターである。

【0151】

誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子、または特定の生理学的状態、例えば急性期の存在、細胞の特定の分化状態によって、または複製細胞においてのみ、調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを含む種々の市販の供給源から利用可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択され得る。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３：３３４６－３３５１ （１９９６））、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：５５４７－５５５１ （１９９２））、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６８： １７６６－ １７６９ （１９９５）、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ２：５１２－５１８ （１９９８）も参照されたい）、ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １５：２３９－２４３ （１９９７）およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ４：４３２－４４１ （１９９７））およびラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １００：２８６５－２８７２ （１９９７））が挙げられる。この文脈において有用であり得る、また他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製細胞中のみにより調節されるものである。

【0152】

別の実施形態では、導入遺伝子に関するネイティブのプロモーターが使用される。ネイティブのプロモーターは、導入遺伝子の発現がネイティブの発現を模倣することが望まれる場合に、好ましい場合がある。ネイティブのプロモーターは、導入遺伝子の発現が、時間的にもしくは発生的に、または組織特異的様式で、または特定の転写刺激に応答して、調節されなければならない場合に、使用され得る。さらなる実施形態では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列などの他のネイティブの発現制御エレメントも、ネイティブの発現を模倣するために使用されてよい。

【0153】

一部の実施形態では、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能を付与する。一部の場合には、組織特異的調節配列は、組織特異的様式で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。このような組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は、当技術分野で周知である。例示的な組織特異的調節配列としては、以下に限定されないが、以下の組織特異的プロモーターを含む：肝臓特異的サイロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン－１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、ａ－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）プロモーター、または心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーターが挙げられる。他の例示的なプロモーターとしては、当業者にとって明らかである数ある中でも、ベータ－アクチンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ３： １００２－９ （１９９６）；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ７： １５０３－１４ （１９９６）、骨オステオカルシンプロモーター（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ．， ２４： １８５－９６ （１９９７））；骨シアロプロテインプロモーター（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ．， １１ ：６５４－６４ （１９９６））、ＣＤ２プロモーター（Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６１： １０６３－８ （１９９８）；免疫グロブリン重鎖プロモーター；Ｔ細胞受容体ａ－鎖プロモーター、ニューロン－特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）などのニューロンプロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．， １３：５０３－１５ （１９９３））、神経フィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：５６１１－５ （１９９１））、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ， １５：３７３－ ８４ （１９９５））が挙げられる。

【0154】

本開示の態様は、２つ以上のプロモーター（例えば、２、３、４、５、またはそれより多いプロモーター）を含む単離された核酸に関する。例えば、タンパク質をコードする第１の領域および阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）をコードする第２の領域を含む導入遺伝子を有する構築物の文脈では、第１のプロモーター配列（例えば、第１のプロモーター配列は、タンパク質コード領域に作動可能に連結している）を使用して、タンパク質コード領域の発現を駆動すること、および第２のプロモーター配列（例えば、第２のプロモーター配列は、阻害性ＲＮＡコード領域に作動可能に連結している）を有する阻害性ＲＮＡコード領域の発現を駆動することが望ましい場合がある。一般に、第１のプロモーター配列および第２のプロモーター配列は、同じプロモーター配列であっても異なるプロモーター配列であってもよい。一部の実施形態では、第１のプロモーター配列（例えば、タンパク質コード領域の発現を駆動するプロモーター）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）プロモーター配列である。ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列の非限定的な例としては、Ｕ６およびＨＩプロモーター配列が挙げられる。一部の実施形態では、第２のプロモーター配列（例えば、阻害性ＲＮＡの発現を駆動するプロモーター配列）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）プロモーター配列である。ｐｏｌＩＩプロモーター配列の非限定的な例としては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、ＲＳＶ、およびサイトメガロウイルスプロモーター配列が挙げられる。一部の実施形態では、ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列は、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）コード領域の発現を駆動する。一部の実施形態では、ｐｏｌＩＩプロモーター配列は、タンパク質コード領域の発現を駆動する。

【0155】

一部の実施形態では、核酸は、タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。タンパク質は、治療用タンパク質（例えば、哺乳動物対象における疾患状態の処置または防止に有用なペプチド、タンパク質、またはポリペプチド）またはリポータータンパク質であってもよい。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、ハンチントン病の処置または防止に有用であり、例えば、Ｍａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅ １１ ：２４に記載されている、ＣＹＰ４６Ａ１、ポリグルタミン結合ペプチド１（ＱＢＰ１）、ＰＴＤ－ＱＢＰ１、ＥＤ１１、Ｃ４細胞内抗体、ＶＬ１２．３細胞内抗体、ＭＷ７細胞内抗体、Ｈａｐｐ１抗体、Ｈａｐｐ３抗体、ｍＥＭ４８細胞内抗体、ある特定のモノクローナル抗体（例えば、１Ｃ２）、およびペプチドＰ４２ならびにそれらのバリアントである。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、野生型ハンチンチンタンパク質（例えば、３６個より少ないリピートを含むＰｏｌｙＱリピート領域を有するハンチンチンタンパク質）である。

【0156】

いずれかの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、変異体ハンチンチン（ＨＴＴ）の対立遺伝子特異的サイレンシングによって、野生型ＨＴＴ発現および機能は細胞内で保存されているため、非対立遺伝子特異的サイレンシング（例えば、野生型と変異体ＨＴＴ対立遺伝子の両方のサイレンシング）と比較して、対象における安全性プロファイルの改善がもたらされ得る。本発明の態様は、硬くなった野生型ＨＴＴ遺伝子（ｍｉＲＮＡによって標的とされない野生型ＨＴＴ遺伝子）の発現を駆動しながら、非対立遺伝子特異的な様式でＨＴＴ遺伝子を標的とする１つまたは複数の阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）配列を組み込む単離された核酸およびベクターが、例えば、野生型ＨＴＴの発現の増加したＣＮＳ組織中で、相伴う変異体ＨＴＴノックダウンを達成することが可能であることの、本発明者らの認識および理解に関する。一般に、内因性野生型および変異体ＨＴＴ ｍＲＮＡをコードする核酸、ならびに「硬くなった」野生型ＨＴＴ ｍＲＮＡをコードする導入遺伝子の核酸の配列は十分に異なっており、その結果、「硬くなった」野生型ＨＴＴ導入遺伝子のｍＲＮＡは、１つまたは複数の阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）によって標的とされない。これは、例えば、ＨＴＴ導入遺伝子配列が、内因性野生型ＨＴＴ遺伝子と同じタンパク質をコードするが、異なる核酸配列を有するように、１つまたは複数のサイレント変異をＨＴＴ導入遺伝子配列中に導入することによって、達成され得る。この場合には、外因性ｍＲＮＡは、「硬くなった」と称され得る。あるいは、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、内因性野生型ＨＴＴ ｍＲＮＡの５’および／または３’非翻訳領域を標的とすることができる。次いで、これらの５’および／または３’領域は、導入遺伝子のｍＲＮＡが１つまたは複数の阻害性ＲＮＡによって標的とされないように、導入遺伝子のｍＲＮＡにおいて除去または置き換えられ得る。

【0157】

導入遺伝子中に与えられ得るリポーター配列（例えば、リポータータンパク質をコードする核酸配列）としては、限定されないが、当技術分野で周知のβ－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼなどが挙げられる。それらの発現を駆動する調節エレメントに関連する場合、リポーター配列は、酵素的アッセイ、Ｘ線撮影アッセイ、比色アッセイ、蛍光アッセイまたは他の分光写真アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイならびに酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む従来の手段によって検出可能なシグナルをもたらす。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを運ぶベクターの存在は、β－ガラクトシダーゼ活性に関するアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを運ぶベクターは、ルミノメーターにおける色または光の生成によって視覚的に測定することができる。このようなリポーターは、例えば、核酸の組織特異的標的化能および組織特異的プロモーター調節活性を検証する際に有用であり得る。組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。一部の態様では、本開示は、単離されたＡＡＶを提供する。ＡＡＶに関して本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、人工的に生成または得られたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組換え方法を使用して生成することができる。このようなＡＡＶは、本明細書において、「組換えＡＡＶ」と称される。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、好ましくは、組織特異的標的化能を有するため、ｒＡＡＶのヌクレアーゼおよび／または導入遺伝子が、１つまたは複数の所定の組織（複数可）へと特異的に送達される。ＡＡＶキャプシドは、これらの組織特異的標的化能を決定する際に重要なエレメントである。よって、組織が標的とされるのに適切なキャプシドを有するｒＡＡＶを選択することができる。

【0158】

所望のキャプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶを得るための方法は当技術分野で周知である。（例えば、その内容が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００３／０１３８７７２を参照されたい）。典型的には、本方法は、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）および導入遺伝子から構成される組換えＡＡＶベクター；ならびに組換えＡＡＶベクターのＡＡＶキャプシドタンパク質中へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することに関与する。一部の実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶのキャップ遺伝子によってコードされる構造的タンパク質である。ＡＡＶは、３つのキャプシドタンパク質、すなわち、ビリオンタンパク質１～３（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と称される）を含み、これらのすべては、選択的スプライシングによって単一のキャップ遺伝子から転写される。一部の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の分子量は、それぞれ、約８７ｋＤａ、約７２ｋＤａおよび約６２ｋＤａである。一部の実施形態では、翻訳の際に、キャプシドタンパク質は、ウイルスゲノムの周囲に球状の６０マーのタンパク質シェルを形成する。一部の実施形態では、キャプシドタンパク質の機能は、ウイルスゲノムを保護する、ゲノムを送達する、および宿主と相互作用することである。一部の態様では、キャプシドタンパク質は、ウイルスゲノムを組織特異的様式で宿主に送達する。

【0159】

一部の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のものである。一部の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、非ヒト霊長類に由来する血清型、例えば、ＡＡＶｒｈ８またはＡＡＶｒｈ１０血清型のものである。一部の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９血清型のものである。一部の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶｒｈ１０血清型のものである。一部の実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質またはそのいずれかのキメラである。一部の実施形態では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、一倍体ｒＡＡＶである。一部の実施形態では、一倍体ｒＡＡＶは、キメラキャプシドタンパク質を含む。

【0160】

一実施形態では、ウイルスキャプシドは修飾されている。一実施形態では、修飾されたウイルスキャプシドは、キメラキャプシドである。「キメラ」キャプシドタンパク質は、本明細書で使用される場合、野生型と比較したキャプシドタンパク質のアミノ酸配列における１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個などの）アミノ酸残基の置換、ならびに野生型と比較したアミノ酸配列における１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個などの）アミノ酸残基の挿入および／または欠失によって修飾されたＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３のうちのいずれか１つまたは複数）を意味する。一部の実施形態では、１つのＡＡＶ血清型に由来する完全なまたは部分的なドメイン、機能的領域、エピトープなどは、いずれかの組み合わせで、異なるＡＡＶ血清型の対応する野生型ドメイン、機能的領域、エピトープなどを置き換えて、本発明のキメラキャプシドタンパク質を生成する。キメラキャプシドタンパク質の生成は、当技術分野で周知のプロトコールに従って実行することができ、本発明のキャプシドに含まれ得るかなりの数のキメラキャプシドタンパク質が、文献および本明細書中に記載されている。

【0161】

一実施形態では、修飾されたウイルスキャプシドは、一倍体キャプシドである。本明細書で使用される場合、用語「一倍体ＡＡＶ」は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願第ＷＯ２０１８／１７０３１０号、または米国出願第ＵＳ２０１８／０３７１４９号に記載されているようなＡＡＶを意味する。一部の実施形態では、ビリオンの集団は、ビリオン粒子を構築することができる一倍体ＡＡＶ集団であり、ここで、ＡＡＶキャプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３からなる群に由来する少なくとも１つのウイルスタンパク質は、ＡＡＶゲノムを封入することが可能なビリオン粒子を形成するために必要とされる、他のウイルスタンパク質の内の少なくとも１つと異なる。各ウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３）の存在について、そのタンパク質は同じ型（例えば、すべてがＡＡＶ２ ＶＰ１）である。１つの事例では、ウイルスタンパク質の少なくとも１つはキメラウイルスタンパク質であり、他の２つのウイルスタンパク質の少なくとも１つはキメラではない。一実施形態では、ＶＰ１およびＶＰ２はキメラであり、ＶＰ３のみがキメラではない。例えば、キメラＡＡＶ２／８（ＡＡＶ２のＮ末端およびＡＡＶ８のＣ末端）由来のＶＰ１／ＶＰ２から構成されるウイルス粒子のみがＡＡＶ２由来のＶＰ３のみと対合するか；またはキメラＶＰ１／ＶＰ２ ２８ｍ－２Ｐ３（ＶＰ３開始コドンの変異を有さないＡＡＶ８からのＮ末端およびＡＡＶ２からのＣ末端）のみがＡＡＶ２由来のＶＰ３のみと対合した。別の実施形態では、ＶＰ３のみがキメラであり、ＶＰ１およびＶＰ２はキメラではない。別の実施形態では、ウイルスタンパク質の少なくとも１つは、完全に異なる血清型に由来する。例えば、キメラＶＰ１／ＶＰ２ ２８ｍ－２Ｐ３のみが、ＡＡＶ３のみに由来するＶＰ３と対合した。別の例では、キメラは存在しない。例えば、そのそれぞれの内容が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１９／０００２８４１号、または米国特許第８，９０６，６７５号を参照されたい。

【0162】

ＡＡＶキャプシド内にｒＡＡＶベクターをパッケージングするために宿主細胞中で培養される構成成分は、トランスで宿主細胞に提供され得る。あるいは、必要とされる構成成分（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）のうちのいずれか１つまたは複数は、当業者に公知の方法を使用して、必要とされる構成成分のうちの１つまたは複数を含有するように操作された安定した宿主細胞によって提供され得る。最も好適には、このような安定した宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下で、必要とされる構成成分（複数可）を含有する。しかし、必要とされる構成成分（複数可）は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。好適な誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの例は、導入遺伝子と共に使用するのに好適な調節エレメントの議論において、本明細書において提供される。さらに別の選択肢では、選択される安定した宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下で選択される構成成分（複数可）および１つまたは複数の誘導性プロモーターの制御下で選択される他の構成成分（複数可）を含有し得る。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含有する）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下ではｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有する、安定した宿主細胞が生成され得る。また他の安定した宿主細胞は、当業者によって生成され得る。一部の実施形態では、本開示は、タンパク質（例えば、野生型ハンチンチンタンパク質、必要に応じて、「硬くなった」野生型ハンチンチンタンパク質）をコードするコード配列を含む核酸を含有する宿主細胞に関する。一部の実施形態では、本開示は、上記の宿主細胞を含む組成物に関する。一部の実施形態では、上記宿主細胞を含む組成物は、凍結保存剤をさらに含む。

【0163】

組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および本開示のｒＡＡＶを生成するために必要とされるヘルパー機能は、任意の適切な遺伝子エレメント（ベクター）を使用してパッケージング宿主細胞に送達されてもよい。選択される遺伝子エレメントは、本明細書において記載されるものを含む任意の好適な方法により送達することができる。本開示の任意の実施形態を構築するために使用される方法は、核酸操作における技術を有する当業者に公知であり、遺伝子操作、組み換え操作および合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを作製する方法は、周知であり、好適な方法の選択は、本開示に関する限定ではない。例えば、Ｋ． Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０：５２０－５３２ （１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。

【0164】

一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、三重トランスフェクション方法（米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載される）を使用して生成され得る。典型的には、組換えＡＡＶは、宿主細胞を、ＡＡＶ粒子中にパッケージングされる組換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、およびアクセサリー機能ベクターでトランスフェクトすることによって生成される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターが「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードし、これは、生成的ＡＡＶ複製およびキャプシド形成に関してトランスで機能する。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、いずれかの検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能的ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）を生成することなく効率的なＡＡＶベクター生成を支持する。本開示に関して使用するのに好適なベクターの非限定的な例は、両方の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００１，６５０号に記載されるｐＨＬＰ１９および米国特許第６，１５６，３０３号に記載されるｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターを含む。アクセサリー機能ベクターは、ＡＡＶが複製に依存する非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞の機能（すなわち、「アクセサリー機能」）に関するヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能は、限定されないが、ＡＡＶ遺伝子転写、段階特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現生成物の合成、およびＡＡＶキャプシドアセンブリーの活性化に関与するこれらの部分を含む、ＡＡＶ複製に必要とされるこれらの機能を含む。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルスなどの公知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。

【0165】

一部の態様では、本開示は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合に「トランスフェクト」されている。いくつかのトランスフェクション技法が、一般に、当技術分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｇｅｎｅ １３： １９７を参照されたい。このような技法を使用して、ヌクレオチド組込みベクターおよび他の核酸分子などの１つまたは複数の外因性核酸を、好適な宿主細胞中に導入することができる。

【0166】

「宿主細胞」は、目的の物質を保有するか、またはそれを保有することが可能である任意の細胞を指す。宿主細胞は、哺乳動物細胞であることが多い。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、アクセサリー機能ベクター、または組換えＡＡＶの生成に関連する他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用することができる。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫も含む。よって、「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた細胞を指し得る。単一の親細胞の子孫は、自然の、偶発的な、または計画的な変異を原因として、形態または遺伝子またはＤＮＡ相補体全体において、必ずしも元の親と完全に同一でなくてもよいことが理解される。

【0167】

本明細書で使用される場合、用語「細胞系」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの連続的または長期にわたる成長および分裂を可能にする細胞集団を指す。多くの場合、細胞系は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。自然に起こるかまたは誘導される変化は、このようなクローン集団の保存または移入中に核型に生じ得る。したがって、言及される細胞系に由来する細胞は、祖先の細胞または培養物と正確に同一でなくてもよく、言及される細胞系は、このようなバリアントを含む。

【0168】

本明細書で使用される場合、用語「組換え細胞」は、生物学的に活性なポリペプチドの転写または生物学的に活性なＲＮＡなどの核酸の生成をもたらすＤＮＡセグメントなどの外因性ＤＮＡセグメントが導入されている細胞を指す。

【0169】

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝エレメントを含み、これは、適当な制御エレメントと関連した場合に複製が可能であり、細胞間で遺伝子配列を移入することができる。よって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、有用なベクターは、転写される核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に置かれる、これらのベクターであることが企図される。「プロモーター」は、細胞の合成機構によって認識されるか、または合成機構に導入される、遺伝子の特異的転写の開始に必要なＤＮＡ配列を指す。句「動作可能に置かれる」、「制御下」または「転写制御下」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸に関して正しい位置および方向にあることを意味する。用語「発現ベクターまたは構築物」は、核酸コード配列の一部またはすべてが転写されることが可能である核酸を含有する任意のタイプの遺伝子構築物を意味する。一部の実施形態では、発現には、例えば、転写された遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド生成物または機能的ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）を生成するための、核酸の転写が含まれる。

【0170】

本開示のｒＡＡＶを生成するために所望のＡＡＶキャプシド中に組換えベクターをパッケージングするための前記方法は限定的であることを意味せず、他の好適な方法は当業者に明らかである。

【0171】

一部の実施形態では、配列表に与えられる配列を含む、本明細書において与えられる配列中のいずれか１つまたは複数のチミジン（Ｔ）ヌクレオチドまたはウリジン（Ｕ）ヌクレオチドは、アデノシンヌクレオチドと対合するのに（例えば、ワトソンクリック塩基対によって）好適な任意の他のヌクレオチドで置き換えられてもよい。例えば、一部の実施形態では、配列表に与えられる配列を含む、本明細書において与えられる配列中のいずれか１つまたは複数のチミジン（Ｔ）ヌクレオチドは、ウリジン（Ｕ）ヌクレオチドで置き換えられるのが好適である場合もあり、逆もまた同様である。

【0172】

態様のいずれかの一部の実施形態では、核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、安定性または他の有益な特徴を増強するために化学的に修飾される。本明細書に記載の核酸は、参照によりこれにより本明細書に組み込まれる、”Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｒｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ＵＳＡに記載されるものなどの、当技術分野で十分に確立された方法によって、合成および／または修飾されてもよい。修飾には、例えば、（ａ）末端の修飾、例えば、５’末端の修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆連結など）、３’末端の修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、または広範囲のレパートリーの相手と塩基対合する塩基での置き換え、塩基の除去（無塩基ヌクレオチド）、またはコンジュゲートされた塩基、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位または４’位での）または糖の置き換え、ならびに（ｄ）ホスホジエステル連結の修飾または置き換えを含む骨格修飾が含まれる。本明細書に記載の実施形態において有用な核酸化合物の具体例には、以下に限定されないが、修飾された骨格を含有するか、または、天然のヌクレオシド間連結を含有しない核酸が含まれる。修飾された骨格を有する核酸には、とりわけ、骨格中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のために、および当技術分野において参照されることがあるように、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾された核酸はオリゴヌクレオシドであると考えることもできる。態様のいずれかの一部の実施形態では、修飾された核酸は、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有する。

【0173】

修飾された核酸骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’－５’連結を有するホスフェート、これらの２’－５’連結類似体、およびヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’から５’－３’にまたは２’－５’から５’－２’に連結している逆極性を有するもの）が含まれ得る。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた含まれる。その中にリン原子を含まない修飾された核酸骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子性もしくは複素環式ヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ連結（部分的にはヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の成分が混在している他のもの、ならびに特に、－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－－、［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知の］－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－、－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［式中、ネイティブのホスホジエステル骨格は－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－と表される］を有するものが含まれる。

【0174】

他の核酸ミメティックでは、ヌクレオチド単位の、糖とヌクレオシド間連結の両方、すなわち骨格は、新規の基で置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのこのようなオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡミメティックは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ＲＮＡの糖骨格は、アミドを含有する骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。

【0175】

核酸は、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾されてもよい。ロックド核酸は、リボース部分が２’炭素と４’炭素を接続する余分な架橋を含む、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、３’－エンド構造配座にリボースを「ロックする」。ロックド核酸のｓｉＲＮＡへの付加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増加させ、かつオフターゲット効果を低下させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ， ＯＲ． ｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｍｏｌ． Ｃａｎｃ． Ｔｈｅｒ． ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。

【0176】

修飾された核酸は、１つまたは複数の置換された糖部分を含有してもよい。本明細書に記載の核酸は、２’位に以下のうちの１つを含んでもよい：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキル、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換の、Ｃ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。例示的に好適な修飾には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が含まれ、ここで、ｎおよびｍは１～約１０である。態様のいずれかの一部の実施形態では、核酸は、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃ１～Ｃ１０の低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルもしくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、リポーター基、インターカレーター、核酸の薬物動態特性を改善するための基、または核酸の薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。態様のいずれかの一部の実施形態では、修飾には、２’メトキシエトキシ（２’－Ｏ－－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても公知）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８：４８６－５０４）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基が含まれる。別の例示的な修飾は、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書において以下の実施例において記載されている、２’－ＤＭＡＯＥとしても公知のＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、およびまた、本明細書において以下の実施例において記載される、２’ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても、当技術分野において公知）、すなわち、２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ２）２である。

【0177】

他の修飾には、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が含まれる。同様の修飾は、核酸の他の位置、特に３’末端のヌクレオチドにおける糖の３’位または２’～５’で連結したｄｓＲＮＡおよび５’末端のヌクレオチドの５’位でなされてもよい。核酸は、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖ミメティックを有してもよい。

【0178】

核酸は、核酸塩基（当技術分野において単に「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾された核酸塩基としては、以下に限定されないが、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ））、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルならびに（ａｎａｌ）他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルならびに他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニンならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンを含む他の合成および天然の核酸塩基を含んでもよい。これらの核酸塩基のうちのある特定のものは、本発明の特徴である阻害性核酸の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびに２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含むＮ－２、Ｎ－６および０～６置換プリンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸の二本鎖安定性を０．６～１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ． Ｓ．， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， Ｅｄｓ．， ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３， ｐｐ． ２７６－２７８）、さらにより詳細には、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に、例示的な塩基置換である。態様のいずれかの一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、ｄ５ＳＩＣＳおよびｄＮＡＭを含んでもよく、これらは、塩基対として別々にまたは一緒に使用することができる、非天然の核酸塩基の非限定的な例である（例えば、Ｌｅｃｏｎｔｅ ｅｔ． ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．２００８， １３０， ７， ２３３６－２３４３；Ｍａｌｙｓｈｅｖ ｅｔ． ａｌ． ＰＮＡＳ． ２０１２． １０９ （３０） １２００５－１２０１０を参照されたい）。態様のいずれかの一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドタグ（例えば、Ｏｌｉｇｏｐａｉｎｔ）は、当技術分野で公知の任意の修飾された核酸塩基、すなわち、未修飾および／または天然の核酸塩基から修飾される任意の核酸塩基を含む。

【0179】

上記の修飾された核酸、骨格、および核酸塩基の調製は、当技術分野で周知である。

【0180】

本発明の特徴である核酸の別の修飾は、核酸に対する、その核酸の活性、細胞内分布、薬物動態特性、または細胞内取込みを増強する１つもしくは複数のリガンド、部分、またはコンジュゲートへの化学的連結に関与する。このような部分としては、以下に限定されないが、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６： ６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９４， ４：１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０：３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０：５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， １９９１， １０：１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９：３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５：４９－５４）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８：３７７７－３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４：９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４：２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７：９２３－９３７）などの脂質部分が挙げられる。
処置方法

【0181】

導入遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ）を対象に送達するための方法が、本開示によって提供される。本方法は、典型的には、対象に、ハンチンチン（ｈｔｔ）タンパク質の発現を低下させることが可能な干渉ＲＮＡをコードする単離された核酸、またはハンチンチンタンパク質の発現を低下させることが可能な阻害性ＲＮＡを発現させるための核酸を含むｒＡＡＶの治療有効量を投与することに関与する。

【0182】

一部の態様では、本開示は、ヒトハンチンチン（例えば、配列番号２５）の少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれより多く）の連続する塩基に特異的に結合する（例えば、それとハイブリダイズする）阻害性ｍｉＲＮＡを提供する。本明細書で使用される場合、「連続する塩基」は、互いに（例えば、核酸分子の一部として）共有結合によって結合する（例えば、１つまたは複数のホスホジエステル結合など）２つまたはそれより多いヌクレオチド塩基を指す。一部の実施形態では、少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、配列番号２５の２つまたはそれより多い（約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれより多い）連続するヌクレオチド塩基に対して約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％同一である。一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、配列番号１～２４のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれにコードされるｍｉＲＮＡである。

【0183】

本明細書で使用される場合、「ハンチントン病」、または「ＨＤ」は、病原性変異体ハンチンチンタンパク質（ＨＴＴ、またはｍＨＴＴ）の産生をもたらすＨＴＴ遺伝子におけるトリヌクレオチドリピート伸長（例えば、ポリグルタミン、またはポリＱ、トラクトへと翻訳される、ＣＡＧ）によって引き起こされる、進行的に悪化する運動、認知および行動の変化によって特徴付けられる神経変性疾患を指す。一部の実施形態では、変異体ハンチンチンタンパク質は、脳のある特定の領域におけるニューロン細胞死の速度を加速させる。一般に、ＨＤの重症度は、対象におけるトリヌクレオチドリピート伸長のサイズに相関する。例えば、３６から３９個の間のリピートを含むＣＡＧリピート領域を有する対象は、「不完全浸透」のＨＤを有するとして特徴付けられるが、４０個より多いリピートを有する対象は「完全浸透」のＨＤを有するとして特徴付けられる。よって、一部の実施形態では、ＨＤを有するかまたはＨＤを有するリスクを有する対象は、約３６～約３９個の間のＣＡＧリピート（例えば、３６、３７、３８または３９個のリピート）を含むＨＴＴ遺伝子を有する。一部の実施形態では、ＨＤを有するかまたはＨＤを有するリスクを有する対象は、４０個またはそれより多い（例えば、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、またはそれより多い）ＣＡＧリピートを含むＨＴＴ遺伝子を有する。一部の実施形態では、１００個より多いＣＡＧリピートを含むＨＴＴ遺伝子を有する対象は、１００個より少ないＣＡＧリピートを有する対象よりも、より早くＨＤを発症する。一部の実施形態では、１００個より多いＣＡＧリピートを含むＨＴＴ遺伝子を有する対象は、約２０歳以前にＨＤ症状を発症する場合があり、若年性ＨＤ（無動－硬直ＨＤ、またはＷｅｓｔｐｈａｌバリアントＨＤとも称される）を有すると称される。対象のＨＴＴ遺伝子の対立遺伝子におけるＣＡＧリピートの数は、当技術分野で公知の任意の好適なモダリティによって決定することができる。例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）は、対象の生体試料（例えば、血液）から単離することができ、ＨＴＴ対立遺伝子のＣＡＧリピートの数は、ＰＣＲまたは核酸シーケンシング（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング、ＳＭＲＴシーケンシングなど）などのハイブリダイゼーションに基づく方法によって決定することができる。

【0184】

いずれかの態様の一部の実施形態では、本方法は、投与することの前に、ハンチントン病を有するかまたはハンチントン病を発症するリスクを有するとして対象を診断するステップをさらに含む。

【0185】

いずれかの態様の一部の実施形態では、投与することの前に、ハンチントン病を有するかまたはハンチントン病を発症するリスクを有するとして対象を診断するアッセイの結果を受け取るステップをさらに含む。ハンチントン病を有するかまたはそれを発症するリスクを有するとして対象を診断するための例示的なアッセイ、例えば、少なくとも３６個のＣＡＧリピート、少なくとも４０個のＣＡＧリピート、または少なくとも１００個のＣＡＧリピート、またはそれより多いＣＡＧリピートについての遺伝子スクリーニングが本明細書に記載されている。

【0186】

物質の「有効量」は、所望の効果を生じるのに十分な量である。一部の実施形態では、単離された核酸の有効量は、対象の標的組織の十分な数の標的細胞をトランスフェクトする（またはｒＡＡＶに媒介される送達の文脈では感染させる）のに十分な量である。一部の実施形態では、標的組織は中枢神経系（ＣＮＳ）組織（例えば、脳組織、脊髄組織、脳脊髄液（ＣＳＦ）など）である。一部の実施形態では、単離された核酸（例えば、ｒＡＡＶにより送達されてもよい）の有効量は、対象において治療利益を有する、例えば、病原性遺伝子またはタンパク質（例えば、ＨＴＴ）の発現を低下させる、対象の寿命を延長させる、対象における疾患の１つまたは複数の症状（例えば、ハンチントン病の症状）を改善するなどに十分な量であり得る。有効量は、例えば、対象の種、年齢、重量、健康、および標的とされる組織などの種々の要因に依存し、よって、本開示の他の箇所に記載されているように、対象および組織の間で変化し得る。
投与

【0187】

本開示のｒＡＡＶは、当技術分野で公知の任意の適切な方法に従って、組成物中で対象に送達され得る。例えば、ｒＡＡＶは、好ましくは薬理学的に適合する担体中に懸濁されて（すなわち、組成物中で）、対象、すなわち、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または非ヒト霊長類（例えば、マカク）などの宿主動物に投与され得る。一部の実施形態では、宿主動物はヒトを含まない。

【0188】

哺乳動物対象へのｒＡＡＶの送達は、例えば、筋肉内注射によるか、または哺乳動物対象の血流中への投与によるものであってもよい。血流中への投与は、静脈、動脈、または任意の他の血管導管中への注射によるものであってもよい。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、外科的技術分野において周知の技法である、温熱四肢灌流によって、血流中に投与され、本方法は、本質的に、当業者が、ｒＡＡＶビリオンの投与前に体循環から四肢を隔離することを可能にする。米国特許第６，１７７，４０３号に記載される、温熱四肢灌流技法のバリアントはまた、ビリオンを単離された四肢の脈管構造中に投与して、筋肉細胞または組織中への形質導入を潜在的に増強するために、当業者によって用いられ得る。さらに、ある特定の事例では、ビリオンを対象のＣＮＳに送達することが望ましい場合がある。「ＣＮＳ」によって、脊椎動物の脳および脊髄のすべての細胞および組織が意味される。よって、この用語は、以下に限定されないが、ニューロン細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質空間、骨、軟骨などを含む。組換えＡＡＶは、例えば、心室領域への注射によってＣＮＳまたは脳に、ならびに定位注射によるなど、当技術分野で公知の神経外科的技法を使用して、ニードル、カテーテルまたは関連するデバイスを用いて、線条体（例えば、線条体の尾状核または被殻）、脊髄および神経筋接合部に、または小脳小葉に、直接的に送達されてもよい（例えば、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：３４２４－３４２９， １９９９；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９７：３４２８－３４３２， ２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ３：２１９－２２３， １９９３；およびＡｌｉｓｋｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １１ ：２３１５－２３２９， ２０００を参照されたい）。一部の実施形態では、本開示において記載されているｒＡＡＶは、静脈内注射によって投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、脳内注射によって投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、髄腔内注射によって投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、線条体内注射によって投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、頭蓋内注射によって送達される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、大槽注射によって送達される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、側脳室注射によって送達される。

【0189】

本開示の態様は、キャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶおよび導入遺伝子をコードする核酸を含む組成物であって、導入遺伝子が、１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含む、組成物に関する。一部の実施形態では、各ｍｉＲＮＡは、配列番号１～２４のいずれか１つに示される配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶｒｈ１０のＩＴＲである。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。本開示の組成物は、ｒＡＡＶを単独で含んでも、または１つもしくは複数の他のウイルス（例えば、１つまたは複数の異なる導入遺伝子をコードする 有する（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈａｖｉｎｇ）第２のｒＡＡＶ）と組み合わせて含んでもよい。一部の実施形態では、組成物は、それぞれ１つまたは複数の異なる導入遺伝子を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多い異なるｒＡＡＶを含む。

【0190】

好適な担体は、ｒＡＡＶが対象とされる指示を考慮して、当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体には食塩水が含まれ、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）と共に製剤化することができる。他の例示的な担体としては、滅菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が挙げられる。担体の選択は、本開示の制限ではない。

【0191】

必要に応じて、本開示の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（複数可）に加えて、防腐剤、または化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含有してもよい。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。
好適な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。

【0192】

ｒＡＡＶは、所望の組織の細胞をトランスフェクトする、ならびに過度な有害効果を有することなく、十分なレベルの遺伝子の移入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来のおよび薬学的に許容される投与経路としては、以下に限定されないが、選択された臓器への直接的送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、および他の非経口投与経路が挙げられる。望ましい場合、投与経路は組み合わされてもよい。

【0193】

特定の「治療効果」を達成するために必要なｒＡＡＶビリオンの用量、例えば、体重１キログラム当たりのゲノムコピー数（ＧＣ／ｋｇ）での投与単位は、以下に限定されないが：ｒＡＡＶビリオンの投与経路、治療効果を達成するのに必要とされる遺伝子またはＲＮＡの発現レベル、処置される具体的な疾患または傷害、および遺伝子またはＲＮＡ産物の安定性を含むいくつかの要因に基づいて変わる。当業者であれば、前記因子、および当技術分野で周知の他の因子に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を処置するためのｒＡＡＶビリオンの用量範囲を容易に決定することができる。

【0194】

ｒＡＡＶの有効量は、動物を標的とする、動物に感染する、所望の組織を標的とするのに十分な量である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶの有効量は、安定した体細胞トランスジェニック動物モデルを生成するのに十分な量である。有効量は、対象の種、年齢、重量、健康、および標的とされる組織などの因子に主に依存し、よって、動物および組織の間で変化し得る。例えば、ｒＡＡＶの有効量は、一般に、約１０^９～１０^１６個のゲノムコピーを含有する、約１ｍｌ～約１００ｍｌの溶液の範囲内にある。一部の場合には、約１０^１１～１０^１３個の間のｒＡＡＶゲノムコピーの投与量が適切である。ある特定の実施形態では、１０^１２または１０^１３個のｒＡＡＶゲノムコピーが、ＣＮＳ組織を標的とするのに効果的である。一部の場合には、安定したトランスジェニック動物は、複数用量のｒＡＡＶによって生成される。

【0195】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶの用量は、暦日（例えば、２４時間の期間）当たり１回以下で対象に投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶの用量は、２、３、４、５、６または７暦日当たり１回以下で対象に投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶの用量は、暦週（例えば、７暦日）当たり１回以下で対象に投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶの用量は、２週間ごとに１回以下（例えば、２暦週の期間に１回）で対象に投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶの用量は、暦月当たり１回以下（例えば、３０暦日に１回）で対象に投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶの用量は、６暦月当たり１回以下で対象に投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶの用量は、暦年（例えば、３６５日またはうるう年には３６６日）当たり１回以下で対象に投与される。

【0196】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、特に高濃度のｒＡＡＶが存在する（例えば、１ｍｌ当たり－１０^１３個またはそれより多いＧＣ）場合に、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を低減するために製剤化されている。ｒＡＡＶの凝集を低減するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整などを含む。（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｒｉｇｈｔ ＦＲ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００５） １２， １７１－１７８を参照されたい）。

【0197】

薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の配合は、好適な投与レジメンおよび処置レジメンの開発が、種々の処置レジメンにおいて本明細書に記載の特定の組成物を使用するためのものであるため、当業者に周知である。

【0198】

典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％の活性化合物またはそれより多くを含有してよいが、有効成分のパーセンテージは、当然のことながら変化する場合があり、製剤全体の重量または体積の約１％または２％から約７０％または８０％またはそれより大きい％の間であることが都合がよい場合がある。本来、各治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、好適な投与量が、化合物のいずれかの所与の単位用量で得られるように、調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命などの因子、および他の薬理学的考察は、このような医薬製剤を調製する技術分野の当業者によって企図され、そのように、種々の投薬レジメンおよび処置レジメンが望ましい場合がある。

【0199】

ある特定の状況では、本明細書に開示される好適に製剤化された医薬組成物中のｒＡＡＶベースの治療用構築物を、皮下に、膵臓内に（ｉｎｔｒａｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃａｌｌｙ）、鼻腔内に、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、髄腔内に、または経口的に、腹腔内に、または吸入によってのいずれかで、送達することが望ましい。一部の実施形態では、米国特許第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号および同第５，３９９，３６３号（それぞれ参照によりその全体として本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されている投与モダリティを使用して、ｒＡＡＶを送達することができる。一部の実施形態では、好ましい投与方式は、門脈注射による。

【0200】

注射可能な使用に好適な薬剤形態には、滅菌水性液剤または分散液剤および滅菌注射用液剤または分散液剤の即時調製のための滅菌粉剤が含まれる。分散液剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中、ならびに油中で調製されてもよい。保存および使用についての通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を妨げる防腐剤を含有する。多くの場合、この形態は、無菌であり、易注射性（ｅａｓｙ ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流体である。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液剤の場合には必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって、適当な流動性が維持されてもよい。微生物の作用の保護は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合には、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらされ得る。

【0201】

注射用水性液剤の投与のために、例えば、液剤は、必要であれば、好適に緩衝されてもよく、液体希釈剤は、最初に、十分な食塩水またはグルコースで等張とされる。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。この点について、用いることのできる無菌水性媒体は、当業者に公知である。例えば、１回の投与量は、等張なＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解され、皮下注入液１０００ｍｌに添加されるかまたは注入の候補部位に注射されるかのいずれかであり得る（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照されたい）。投与量におけるいくつかの変更は、宿主の状態に応じて必然的に生じる。投与責任者は、いずれにしても、個々の宿主に適切な用量を決定する。

【0202】

滅菌注射用液剤は、活性ｒＡＡＶを、本明細書において列挙される様々な他の成分と共に、適切な溶媒中に必要な量で混合し、必要であれば、その後に濾過滅菌することによって、調製される。一般に、分散液剤は、様々な滅菌された有効成分を、基礎分散媒および上記に列挙されたものから必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に混合することによって調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌粉剤の場合には、好ましい調製方法は、前もってその滅菌ろ過された溶液から、有効成分といずれかの追加の所望の成分の粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥技術である。

【0203】

本明細書に開示されるｒＡＡＶ組成物は、中性形態または塩形態で製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、これらは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来してもよい。製剤化されると、液剤は、投与製剤と適合するように、かつこのような量が治療上有効であるように、投与される。製剤は、注射用液剤、薬物放出カプセル剤などのような種々の剤形で容易に投与される。

【0204】

本明細書で使用される場合、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファー、担体溶液、懸濁剤、コロイドなどを含む。薬学的に活性な物質に関するこのような媒体および剤の使用は、当技術分野において周知である。補充有効成分も組成物中に組み込まれてもよい。語句「薬学的に許容される」は、宿主に投与された場合に、アレルギー反応や類似する有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。

【0205】

リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、ベシクルなどのような送達ビヒクルは、本開示の組成物の、好適な宿主細胞への導入のために使用されてもよい。特に、ｒＡＡＶベクターにより送達される導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかに封入されて、送達するために製剤化されてもよい。

【0206】

このような製剤は、本明細書に開示される核酸またはｒＡＡＶ構築物の薬学的に許容される製剤の導入に関して好ましい場合がある。リポソームの形成および使用は、一般に、当業者にとって公知である。最近、血清中安定性および循環半減期の改善されたリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソーム調製物およびリポソーム様調製物についての様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号；同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号；同第５，７３８，８６８号および同第５，７９５，５８７号）。

【0207】

リポソームは、通常、他の手順によるトランスフェクションに対して抵抗性であるいくつかの細胞型に関して使用されることに成功している。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的であるＤＮＡ長の制約を有さない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射性治療剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターを、種々の培養細胞系および動物中に導入するのに効果的に使用されている。さらに、リポソームに媒介される薬物送達の有効性を調査するいくつかの成功した臨床試験が完了している。

【0208】

リポソームは、水性媒体中に分散されたリン脂質から形成され、多層同心二重層ベシクル（多層ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自然発生的に形成する。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ～４μｍの直径を有する。ＭＬＶを超音波処理することにより、コア内に水性液剤を含有する２００～５００Ａの範囲内の直径を有する小さい単層ベシクル（ＳＵＶ）の形成がもたらされる。

【0209】

あるいは、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤を使用してもよい。ナノカプセルは、一般に、安定した再生可能な方法で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマーの過負荷による副作用を回避するために、このような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、ｉｎ ｖｉｖｏで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が使用のために企図される。

【0210】

上記送達方法に加えて、ｒＡＡＶ組成物を宿主に送達する代替方法として、以下の技法も企図される。循環系へのおよび循環系を介する、薬物の浸透速度および浸透効率を増強するためのデバイスとして、ソノフォレーシス（すなわち、超音波）が使用されており、米国特許第５，６５６，０１６号に記載されている。企図される他の薬物送達の選択肢は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号）、眼科用製剤（Ｂｏｕｒｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号および同第５，７８３，２０８号）ならびにフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号）である。

【0211】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ハンチントン病を有するかまたはそれを有すると診断された対象を、本明細書に記載の核酸で処置することに関する。ハンチントン病を有する対象は、ハンチントン病を診断する現行の方法を使用して医師によって特定され得る。これらの状態を特徴付け、診断の助けとなる、ハンチントン病の症状および／または合併症は当技術分野において周知であり、以下に限定されないが、鬱および不安を含み、ならびに特徴的な運動障害および舞踏病を伴う。ハンチントン病の診断の助けとなり得る検査は、例えば、以下に限定されないが、遺伝子検査を含む。ハンチントン病の家族歴もまた、対象がハンチントン病を有し易いかどうかを決定する際、またはハンチントン病の診断をする際の助けとなり得る。

【0212】

本明細書に記載の組成物および方法は、ハンチントン病を有するか、またはそれを有すると診断された対象に投与することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の組成物、例えば、本明細書に記載の核酸の有効量を、ハンチントン病の症状を軽減するために、対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「ハンチントン病の症状を軽減すること」は、ハンチントン病に関連するいずれかの状態または症状を改善することである。等価な未処置対照と比較した場合、このような低減は、いずれかの標準的技法によって測定した場合に、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより高い割合までである。

【0213】

有効量、毒性、および治療有効性は、例えば、最小有効用量および／または最大耐用量を決定するために、細胞培養または実験動物において、標準的な薬学的手順によって決定することができる。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて変わり得る。治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。また、用量は、最小有効用量と最大耐用量の間の投与量範囲を実現するために、動物モデルにおいて処方されてもよい。いずれかの特定の投与量の効果は、好適なバイオアッセイ、例えば、とりわけ腫瘍成長および／またはサイズに関するアッセイによってモニターすることができる。投与量は、医師によって決定され、必要であれば、観察された処置の効果に合わせて調整され得る。

【0214】

所与の用量の本明細書に記載されている単離された核酸（例えば、配列番号１～２４の少なくとも１つ）、または所与の用量の本明細書に記載されている単離された核酸を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の評価を可能にするｉｎ ｖｉｔｒｏおよび動物モデルのアッセイが本明細書において提供される（例えば、図４、図９、図１５を参照されたい）。非限定的な例としては、本明細書に記載されている単離された核酸またはｒＡＡＶの用量の有効性は、以下の方法のいずれか１つによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価され得る：（１）単離された核酸（例えば、配列番号１～２４の少なくとも１つを含むプラスミド）および標的配列（例えば、ルシフェラーゼ発現に関連するＨＴＴ標的配列）を細胞（例えば、２９３細胞）中に共トランスフェクトさせ、標的の濃度および／もしくは活性を測定すること（例えば、図７、図８Ｂ、図１６～１８を参照されたい）；（２）細胞（例えば、ヒト神経細胞Ｕ８７）に、単離された核酸（例えば、ＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーターに作動可能に連結した、配列番号１～２４の少なくとも１つ）を発現するｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶＲＨ１０）、および標的配列（例えば、ルシフェラーゼ発現に関連するＨＴＴ標的配列）を発現するｒＡＡＶを感染させ、標的の濃度および／もしくは活性を測定すること（例えば、図１０、１１Ａ～１１Ｂを参照されたい）；（３）ＨＴＴを発現する細胞（例えば、ヒト神経細胞Ｕ８７またはＨＤ患者由来のヒト肺線維芽細胞）に、単離された核酸（例えば、ＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーターに作動可能に連結した、配列番号１～２４の少なくとも１つ）を発現するｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶＲＨ１０）を感染させ、ＨＴＴタンパク質および／もしくはｍＲＮＡの濃度および／もしくは活性を測定すること（例えば、図１２～１４、図２０～２１を参照されたい）；または（４）ＨＴＴを発現する細胞（例えば、ヒト神経細胞Ｕ８７またはＨＤ患者由来のヒト肺線維芽細胞）に、単離された核酸（例えば、ｈＳｙｎ１などのニューロン特異的プロモーターに作動可能に連結した、配列番号１～２４の少なくとも１つ、ここで、ｒＡＡＶが、ＣＹＰ４６Ａ１などのタンパク質をコードする導入遺伝子を必要に応じてさらに発現する）を発現するｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶＲＨ１０）を感染させ、ＨＴＴタンパク質および／もしくはｍＲＮＡの濃度および／もしくは活性を測定すること（例えば、図４、図９、図１５を参照されたい）。

【0215】

本明細書に記載されている単離された核酸またはｒＡＡＶの有効性はまた、動物モデル、例えば、ＨＴＴタンパク質を発現するマウスモデルにおいて評価することができる。例えば、以下のＨＴＴマウスモデルを、所望のＨＴＴ標的に従って使用することができる（例えば、表３を参照されたい）：Ｈｕ１２８；Ｂ６ＣＢＡ－Ｒ６／２（ＣＡＧ １２０＋／－５）；Ｂ６ＣＢＡ－Ｔｇ（ＨＤエクソン１）６２Ｇｐｂ／３Ｊ；Ｂ６ＣＢＡ－Ｒ６／２（ＣＡＧ １６０＋／－５）；またはＢ６ＣＢＡ－Ｔｇ（ＨＤエクソン１）６２Ｇｐｂ／１Ｊ。非限定的な例として、本明細書に記載されているマウスモデルに、単離された核酸（例えば、ｈＳｙｎ１などのニューロン特異的プロモーターに作動可能に連結した、配列番号１～２４の少なくとも１つ、ここで、ｒＡＡＶが、ＣＹＰ４６Ａ１などのタンパク質をコードする導入遺伝子を必要に応じてさらに発現する）を発現するｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶＲＨ１０）を感染させ、マウスにおけるＨＴＴタンパク質および／もしくはｍＲＮＡの濃度および／もしくは活性、ならびに／または疾患の病因を測定する。例えば、図４、図９、図１５を参照されたい。
ベクター

【0216】

一部の実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲＮＡの１つまたは複数は、組換え発現ベクターまたはプラスミドにおいて発現される。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、導入遺伝子を宿主細胞中に移入するのに好適なポリヌクレオチド配列を指す。用語「ベクター」は、プラスミド、ミニ染色体、ファージ、ネイキッドＤＮＡなどを含む。例えば、米国特許第４，９８０，２８５号；同第５，６３１，１５０号；同第５，７０７，８２８号；同第５，７５９，８２８号；同第５，８８８，７８３号；および同第５，９１９，６７０号、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）を参照されたい。ベクターの一種は「プラスミド」であり、これは、その中に追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、その中にそれらが導入される宿主細胞において、自発的複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。さらに、ある特定のベクターは、それらが動作可能に連結している遺伝子の発現を指示することが可能である。このようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用性の発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、互換的に使用される。しかし、本発明は、等価な機能を果たす、ウイスルベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターのこのような他の形態を含むことを意図する。

【0217】

クローニングベクターは、自発的に複製することができるか、または宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、ベクターが決定可能な様式で切断され得る、および所望のＤＮＡ配列が、新しい組換えベクターが宿主細胞において複製するその能力を保持するようにライゲーションされ得る、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴付けられる、ベクターである。プラスミドの場合には、所望の配列の複製は、プラスミドが、宿主細菌などの宿主細胞内でコピー数を増加させるように多数回起こってもよく、または宿主が有糸分裂によって再生する前に宿主ごとに一回だけ起こってもよい。ファージの場合には、複製は、溶解相中に能動的に起こってもよく、または溶原相中に受動的に起こってもよい。

【0218】

発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を、制限およびライゲーションによって挿入することができ、その結果、それが、調節配列に作動可能に接合し（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｊｏｉｎｅｄ）、ＲＮＡ転写物として発現され得る、ベクターである。ベクターは、ベクターで形質転換された、もしくは形質転換された、もしくはトランスフェクトされた、または、形質転換されていない、もしくは形質転換されていない、もしくはトランスフェクトされていない、細胞の同定において使用するのに好適な１つまたは複数のマーカー配列をさらに含有することができる。マーカーは、例えば、抗生物質または他の化合物に対する抵抗性または感受性のいずれかを増加または低下させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当技術分野で公知の標準的アッセイによって検出可能である酵素をコードする遺伝子（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ）、および形質転換されたかまたはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に視覚的影響を及ぼす遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書において使用されるベクターは、これらが作動可能に接合しているＤＮＡセグメント中に存在する構造的遺伝子産物の自発的複製および発現が可能である。

【0219】

本明細書で使用される場合、コード配列および調節配列は、それらが、コード配列の発現または転写を調節配列の影響または制御下に置くような方法で、共有結合により連結される場合に、「作動可能に」接合されると言われる。コード配列が機能性タンパク質へと翻訳されるのが望ましい場合には、２つのＤＮＡ配列は、５’調節配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさないか、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力を妨害しないか、または（３）タンパク質へと翻訳される対応するＲＮＡ転写物の能力を妨害しない場合に、作動可能に接合されると言われる。よって、プロモーター領域は、プロモーター領域が、得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドへと翻訳され得るように、そのＤＮＡ配列の転写を実行することが可能である場合に、コード配列に作動可能に接合されていることになる。

【0220】

本明細書に記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子が細胞内で発現される場合、その発現を指示するために種々の転写制御配列（例えば、プロモーター／エンハンサー配列）を使用することができる。プロモーターはネイティブのプロモーター、すなわち、遺伝子の発現の正常な調節をもたらす、その内因的状況における遺伝子のプロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターは構成的であってもよく、すなわち、プロモーターは調節されず、その関連する遺伝子の継続的な転写を可能にする。種々の条件付きプロモーター、例えば、分子の有無によって制御されるプロモーターも使用することができる。

【0221】

遺伝子発現に必要とされる調節配列の正確な性質は、種または細胞の種類間で様々であり得るが、一般に、必要であれば、それぞれ、転写および翻訳の開始に関与する５’非転写配列および５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含み得る。特に、このような５’非転写調節配列は、作動可能に接合した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列は、所望の場合には、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列も含み得る。本発明のベクターは、５’リーダー配列またはシグナル配列を必要に応じて含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。

【0222】

発現に必要なエレメントのすべてを含有する発現ベクターは、市販されており、当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９を参照されたい。細胞は、異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）の細胞中への導入によって遺伝子操作される。この異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、宿主細胞において異種ＤＮＡの発現を可能にする転写エレメントの作動可能な制御下に置かれる。

【0223】

一部の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または組換えＡＡＶである。

【0224】

態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、ｐＥＭＢＬである。態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、ｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）Ｓｙｎ１である。態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、ｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）Ｓｙｎ１－ｈＣＧイントロンのみである。態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、ｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）Ｓｙｎ１－ｈＣＧｉｎ－２ｘ対照ｐｒｅ－ｍｉＲである。態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、ｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）Ｓｙｎ１－ｈＣＧｉｎ－２ｘ人工ｐｒｅ－ｍｉＲである。態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、ｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）Ｓｙｎ１－ＣＹＰ４６Ａ１－ｈＣＧｉｎ－２ｘ人工ｐｒｅ－ｍｉＲである。態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、ｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）Ｓｙｎ１－ｌｕｃ－ＨＴＴ－３’ＵＴＲ／変異体である。

【0225】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターまたは単離された核酸は、以下のうちの少なくとも１つを含む：少なくとも１つの（例えば、２個の）ＩＴＲ；Ｓｙｎ１プロモーター（例えば、配列番号３１～３２を参照されたい）；少なくとも１つの（例えば、２個の）ｈＣＧイントロン（例えば、配列番号３４を参照されたい）；ｐｒｅｍｉＲの少なくとも１つの（例えば、２個の）コピー（例えば、配列番号３５を参照されたい；例えば、対照ｐｒｅ－ｍｉＲ；人工ｐｒｅ－ｍｉＲ；配列番号１～２４の少なくとも１つ）；小ポリＡ（例えば、配列番号３６を参照されたい）；ＣＹＰ４６Ａ１（例えば、配列番号２６～２７を参照されたい）；ルシフェラーゼ（例えば、配列番号２８～２９を参照されたい）；および／またはＨＴＴ標的配列（例えば、配列番号３０を参照されたい、例えば、ＨＴＴ－３’ＵＴＲ／変異体）。例えば、図１を参照されたい。

【0226】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されている単離された核酸またはベクターは、ＣＹＰ４６Ａ１を含む。ＣＹＰ４６Ａ１は、チトクロームＰ４５０スーパーファミリーの酵素のメンバーである。チトクロームＰ４５０タンパク質は、薬物代謝ならびにコレステロール、ステロイドおよび他の脂質の合成に関与する多くの反応を触媒するモノオキシゲナーゼである。この小胞体タンパク質は、脳内で発現され、ここで、コレステロールを２４Ｓ－ヒドロキシコレステロールに変換する。コレステロールは、血液脳関門を通過することができないが、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロールは、脳内で循環へと分泌され、異化のために肝臓に戻され得る。態様のいずれかの一部の実施形態では、ＣＹＰ４６Ａ１は、ヒトＣＹＰ４６Ａ１を含み得る（例えば、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００７９６３．１ ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ Ｒａｎｇｅ ４８８１－４７８８４；ＮＭ＿００６６６８．２；ＮＰ＿００６６５９．１を参照されたい；例えば、配列番号２６～２７を参照されたい）。コレステロール分解に関する律速酵素であるＣＹＰ４６Ａ１は、ハンチントン病において神経保護的である（例えば、そのそれぞれの内容が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、Ｂｏｕｓｓｉｃａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．， ＣＹＰ４６Ａ１， ｔｈｅ ｒａｔｅ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ， ｉｓ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ， Ｂｒａｉｎ． ２０１６ Ｍａｒ， １３９（Ｐｔ ３）：９５３－７０；Ｋａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＣＹＰ４６Ａ１ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｃｉｐｈｅｒｓ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ， Ｂｒａｉｎ． ２０１９ Ａｕｇ １；１４２（８）：２４３２－２４５０を参照されたい）。

【0227】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されている導入遺伝子（例えば、ＣＹＰ４６Ａ１）は、配列番号２７、または配列番号２７と同じ機能を維持する（例えば、ＨＤに対する治療用タンパク質）、配列番号２７の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0228】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されている導入遺伝子（例えば、ＣＹＰ４６Ａ１）は、配列番号２６を含む核酸配列、または同じ機能を維持する、配列番号２６と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、または配列番号２６のコドン最適化バージョンによってコードされる。

【0229】

配列番号２６、ＣＹＰ４６Ａ１、１５０３個のヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓチトクロームＰ４５０ファミリー４６サブファミリーＡメンバー１（ＣＹＰ４６Ａ１）、ｍＲＮＡ、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００６６６８．２を参照されたい）

【化1】

【0230】

配列番号２７、ＣＹＰ４６Ａ１、５００個のアミノ酸（ａａ）（例えば、コレステロール２４－ヒドロキシラーゼ前駆体（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００６６５９．１を参照されたい）

【0231】

【化2-1】

【化2-2】

【0232】

一部の実施形態では、組換えによって発現された遺伝子の１つまたは複数は、細胞のゲノム中に組み込まれてもよい。

【0233】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されている単離された核酸またはベクターは、少なくとも１つのプロモーターを含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトＳｙｎ１プロモーターである。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されているプロモーター（例えば、Ｓｙｎ１）は、配列番号３１～３２のうちの１つ、または配列番号３１～３２のうちの１つと同じ機能を維持する（例えば、組織特異的プロモーター）、配列番号３１～３２のうちの１つの配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0234】

配列番号３１、Ｓｙｎ１プロモーター、４７７ｎｔ

【化3】

【0235】

配列番号３２、Ｓｙｎ１プロモーター、４４８ｎｔ

【化4】

【0236】

態様のいずれかの一部の実施形態では、プロモーターは、構成的ＣＭＶプロモーターである。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されているプロモーター（例えば、ＣＭＶ）は、配列番号３３、または、配列番号３３と同じ機能を維持する（例えば、構成的プロモーター）、配列番号３３の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0237】

配列番号３３、ＣＭＶプロモーター

【化5-1】

【化5-2】

【0238】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されている単離された核酸またはベクターは、少なくとも１つのイントロンを含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、イントロンは、ｈＣＧイントロンである。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されているイントロン（例えば、ｈＣＧイントロン）は、配列番号３４、または、配列番号３４と同じ機能を維持する、配列番号３４の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されている単離された核酸またはベクターは、配列番号３４の少なくとも１つ（例えば、２つ）の部分、例えば、配列番号３４のおおよそヌクレオチド１～１００、１６～１００、１１４～６３５、および／または１２２～６３５を含む。

【0239】

配列番号３４、ｈＣＧイントロン、６３５ｎｔ（例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）遺伝子６ベータサブユニット、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００２６６．１を参照されたい）

【化6】

【0240】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されている単離された核酸またはベクターは、本明細書に記載されている人工ｍｉＲＮＡ（例えば、配列番号１～２４の１つ）の２つのコピーを含むｐｒｅｍｉＲを含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されているｐｒｅｍｉＲは、配列番号３５、または、配列番号３５と同じ機能を維持する（例えば、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現）、配列番号３５の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されている単離された核酸またはベクターは、配列番号３５の一部を、例えば、１つのｍｉＲＮＡコピーが発現されるように、例えば、配列番号３５のおおよそｎｔ１～１９１、１～１９９、１９１～３８６、または１９９～３８６を含む。

【0241】

配列番号３５、２ｘ ｍｉＨＴＴ－Ｈ１；太字のテキストは、５’隣接配列（例えば、配列番号３５のｎｔ１～６５または１９９～２６０）を示し；イタリック体のテキストは、ｍｉＨＴＴパッセンジャー（例えば、配列番号３５のｎｔ６９～８７または２６４～２８２；例えば、非限定的な例として使用される配列番号１の逆相補体を参照されたい；配列番号２～２４のいずれか１つの逆相補体は、配列番号３５において配列番号１の逆相補体の代わりに使用され得る）を示し；太字のイタリック体のテキストは、ｍｉＲ３０ａループ（例えば、配列番号３５のｎｔ９０～１０４または２８５～２９９）を示し；イタリック体の二重下線を付したテキストは、ｍｉＨＴＴガイド鎖（例えば、配列番号３５のｎｔ１０７～１２６または３０２～３２１；例えば、非限定的な例として使用される配列番号１を参照されたい；配列番号２～２４のいずれか１つは、配列番号３５において配列番号１の代わりに使用され得る）を示し；かつ太字の二重下線を付したテキストは、３’隣接配列（例えば、配列番号３５のｎｔ１３０～１９１または３２５～３８６）を示す。

【化7】

【0242】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されている単離された核酸またはベクターは、ポリアデニル化領域（例えば、小ポリＡ）を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されているポリＡは、配列番号３６、または配列番号３６と同じ機能を維持する（例えば、ポリアデニル化）、配列番号３６の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0243】

配列番号３６、小ポリＡ、５４ｎｔ、

【化8】

【0244】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されている単離された核酸またはベクター（例えば、本明細書に記載されているｍｉＲＮＡを試験するために使用される）は、リポーターとしてのルシフェラーゼを含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されているリポーター（例えば、ルシフェラーゼ）は、配列番号２９、または配列番号２９と同じ機能を維持する（例えば、ルシフェラーゼ活性およびルミネセンス）、配列番号２９の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0245】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されているリポーター（例えば、ルシフェラーゼ）は、配列番号２８を含む核酸配列、または同じ機能を維持する、配列番号２８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列、または配列番号２８のコドン最適化バージョンによってコードされる。

【0246】

配列番号２８、ルシフェラーゼ核酸、１６５３ｎｔ

【化9】

【0247】

配列番号２９、ルシフェラーゼタンパク質、５５０ａａ

【化10-1】

【化10-2】

【0248】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されている単離された核酸またはベクター（例えば、本明細書に記載されているｍｉＲＮＡを試験するために使用される）は、ＨＴＴ標的配列（すなわち、ＨＴＴ遺伝子に由来する短い核酸配列）を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されているＨＴＴ標的配列は、配列番号３０、または配列番号３０と同じ機能を維持する（例えば、本明細書に記載されているｍｉＲＮＡの標的化または試験）、配列番号３０の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。

【0249】

配列番号３０、ＨＴＴ標的配列（例えば、ＨＴＴ－３’ＵＴＲ／変異体）、４１７ｎｔ

【化11】

【0250】

本特許請求された発明の酵素をコードする核酸分子は、当技術分野において標準的である方法および技法を使用して、細胞（１つまたは複数）中に導入され得る。例えば、核酸分子は、化学的形質転換および電気穿孔を含む形質転換、形質導入、パーティクルガン法などの標準的プロトコールによって導入され得る。本特許請求された発明の酵素をコードする核酸分子の発現は、核酸分子をゲノム中に組み込むことによっても達成され得る。
キット

【0251】

本明細書に記載の薬剤は、一部の実施形態では、治療適用、診断適用または研究適用においてそれらの使用を容易にするために、医薬キットまたは診断用キットまたは研究用キット中に集められてもよい。キットは、本開示の構成成分および使用するための指示を収納する１つまたは複数の容器を含んでもよい。具体的には、このようなキットは、本明細書に記載の１つまたは複数の薬剤を、意図した適用およびこれらの薬剤の適切な使用について説明する指示と一緒に含んでもよい。ある特定の実施形態では、キット中の薬剤は、医薬製剤中に存在してもよく、かつ特定の適用および薬剤の投与方法に関して好適な投与量であってもよい。研究目的のキットは、様々な実験を行うのに適切な濃度または量の構成成分を含有してもよい。

【0252】

一部の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶを生成するためのキットに関し、キットは、配列番号１～２４のいずれか１つに示される配列を含むｍｉＲＮＡを含むか、またはそれによってコードされる、単離された核酸を収納する容器を含む。一部の実施形態では、キットは、ＡＡＶキャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質をコードする単離された核酸を収納する容器をさらに含む。

【0253】

キットは、研究者による本明細書に記載の方法の使用を容易にするように設計されてもよく、多くの形態をとり得る。キットの組成物のそれぞれは、適宜、液体形態（例えば、溶液で）、または固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供されてもよい。ある特定の場合には、組成物の一部は、例えば、好適な溶媒または他の種（例えば、水または細胞培養培地）（キットと共に提供されても提供されなくてもよい）を添加することによって、構成可能であるか、またはそうでなければ処理可能（例えば、活性形態に）であってもよい。本明細書で使用される場合、「指示」は、指示および／またはプロモーションの構成要素を規定することができ、典型的には、本開示のパッケージングに関するまたはそれに関連する書面の指示に関する。指示は、ユーザーが、指示がキットに関連すること、例えば、視聴覚による伝達（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネットによる伝達、および／またはウェブに基づく伝達などであることを明確に認識するような任意の方法で提供される、任意の口頭による指示または電子的指示も含み得る。書面の指示は、医薬製品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態であってもよく、この指示は、動物への投与のための製造、使用または販売についての機関による承認も反映し得る。

【0254】

キットは、１つまたは複数の容器内に、本明細書に記載の構成成分のいずれか１つまたは複数を含有してもよい。例として、一実施形態では、キットは、キットの１つもしくは複数の構成成分を混合する、ならびに／または試料を単離および混合する、ならびに対象に適用するための指示を含んでもよい。キットは、本明細書に記載の薬剤を収納する容器を含んでもよい。薬剤は、液体、ゲルまたは固体（粉末）の形態であってもよい。薬剤は、無菌で調製され、シリンジ内にパッケージングされ、および冷蔵で輸送されてもよい。あるいは、薬剤は、保存のためにバイアルまたは他の容器内に収納されてもよい。第２の容器は、無菌で調製された他の薬剤を有してもよい。あるいは、キットは、シリンジ、バイアル、チューブ、または他の容器内でプレミックスされ、輸送される活性剤を含んでもよい。

【0255】

本発明の例示的な実施形態は、以下の例によってより詳細に記載される。これらの実施形態は、本発明の例示であり、当業者は、本発明が例示的実施形態に限定されないことを認識する。
免疫モジュレーター

【0256】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、免疫モジュレーターを投与することをさらに含む。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、投与のとき、投与前、または投与後に投与され得る。対象が、少なくとも２回目の組成物を再投与される場合には、免疫モジュレーターは、少なくとも２回目の投与前、投与と共に、または投与後に投与され得る。

【0257】

一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＳ／Ｚ、Ｅｎｄｏ Ｓ、またはそれらの機能的バリアントなどの免疫グロブリン分解酵素である。そのそれぞれが参照によりその全体として組み込まれる、ＵＳ７，６６６，５８２、ＵＳ８，１３３，４８３、ＵＳ２０１８００３７９６２、ＵＳ２０１８００２３０７０、ＵＳ２０１７０２０９５５０、ＵＳ８，８８９，１２８、ＷＯ２０１０／０５７６２６、ＵＳ９，７０７，２７９、ＵＳ８，３２３，９０８、ＵＳ２０１９０３４５５３３、ＵＳ２０１９０２６２４３４、およびＷＯ２０２０／０１６３１８に記載されている、このような免疫グロブリン分解酵素およびそれらの使用についての参照文献の非限定的な例。

【0258】

一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、プロテアソーム阻害剤である。ある特定の態様では、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブである。実施形態の一部の態様では、免疫モジュレーターは、ボルテゾミブおよび抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブを含む。実施形態の他の態様では、免疫モジュレーターは、ボルテゾミブ、リツキシマブ、メトトレキサート、および静脈内ガンマグロブリンを含む。そのそれぞれが参照によりその全体として組み込まれる、ＵＳ１０，０２８，９９３、ＵＳ９，５９２，２４７、およびＵＳ８，８０９，２８２に記載されている、プロテアソーム阻害剤およびそれらのリツキシマブ、メトトレキサートおよび静脈内ガンマグロブリンとの組合せについて開示するこのような参照文献の非限定的な例。

【0259】

代替の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＮＦ－ｋＢ経路の阻害剤である。実施形態のある特定の態様では、免疫モジュレーターは、ラパマイシン、または機能的バリアントである。ＵＳ１０，０７１，１１４、ＵＳ２０１６００６７２２８、ＵＳ２０１６００７４５３１、ＵＳ２０１６００７４５３２、ＵＳ２０１９００７６４５８、ＵＳ１０，０４６，０６４に記載される、ラパマイシンおよびその使用について開示する参照文献の非限定的な例は、その全体として組み込まれる。実施形態の他の態様では、免疫モジュレーターは、免疫抑制剤を含む合成ナノ担体である。そのそれぞれが参照によりその全体として組み込まれる、ＵＳ２０１５０３２０７２８、ＵＳ２０１８０１９３４８２、ＵＳ２０１９０１４２９７４、ＵＳ２０１５０３２８３３３、ＵＳ２０１６０２４３２５３、ＵＳ１０，０３９，８２２、ＵＳ２０１９００７６５２２、ＵＳ２０１６００２２６５０、ＵＳ１０，４４１，６５１、ＵＳ１０，４２０，８３５、ＵＳ２０１５０３２０８７０、ＵＳ２０１４０３５６３６、ＵＳ１０，４３４，０８８、ＵＳ１０，３３５，３９５、ＵＳ２０２０００６９６５９、ＵＳ１０，３５７，４８３、ＵＳ２０１４０３３５１８６、ＵＳ１０，６６８，０５３、ＵＳ１０，３５７，４８２、ＵＳ２０１６０１２８９８６、ＵＳ２０１６０１２８９８７、ＵＳ２０２０００３８４６２、ＵＳ２０２０００３８４６３に記載されている、免疫抑制剤、合成ナノ担体に連結した免疫抑制剤、ラパマイシンを含む合成ナノ担体、および／または寛容原性合成ナノ担体、それらの用量、投与および使用についての参照文献の非限定的な例。

【0260】

一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、そのそれぞれがその全体として本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０２０００３８４６３、米国特許第９，００６，２５４号に開示されているラパマイシンを含む合成ナノ担体（ＩｍｍＴＯＲ（商標）ナノ粒子）（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ， １１（１０）： ８９０－８９９；Ｍａｌｄｏｎａｄｏ， ｅｔ ａｌ．， ２０１５， ＰＮＡＳ， １１２（２）： Ｅ１５６－１６５）である。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、操作された細胞、例えば、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７１９２７８６に開示されているＳＱＺ技術を使用して修飾された免疫細胞である。

【0261】

一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ポリ－ＩＣＬＣ、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクター系、ＰＬＧＡマイクロ粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータ－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ならびにＡｑｕｉｌａ’ｓ ＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎからなる群から選択される。別のさらなる実施形態では、免疫モジュレーターまたはアジュバントは、ポリ－ＩＣＬＣである。

【0262】

一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、クロロキン（ＴＬＲシグナル伝達阻害剤）および２－アミノプリン（ＰＫＲ阻害剤）などの、細胞における自然免疫応答を阻害する小分子であり、本明細書に開示されている少なくとも１つのｒＡＡＶを含む組成物と組み合わせて投与することもできる。市販のＴＬＲ－シグナル伝達阻害剤のいくつかの非限定的な例には、ＢＸ７９５、クロロキン、ＣＬＩ－０９５、ＯｘＰＡＰＣ、ポリミキシンＢ、およびラパマイシン（すべてＩＮＶＩＶＯＧＥＮ（商標）から購入可能）が含まれる。さらに、２－アミノプリン、ＢＸ７９５、クロロキン、およびＨ－８９などのパターン認識受容体（ＰＲＲ）（自然免疫シグナル伝達に関与する）の阻害剤も、本明細書に開示されているｉｎ ｖｉｖｏタンパク質発現に関する、本明細書に開示される少なくとも１つのｒＡＡＶベクターを含む組成物および方法において使用することができる。

【0263】

一部の実施形態では、修飾されたウイルスキャプシドを有するｒＡＡＶベクターも、ＮＬＲＸ１などの自然免疫の負の調節因子をコードし得る。したがって、一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターも、ＮＬＲＸ１、ＮＳ１、ＮＳ３／４Ａ、またはＡ４６Ｒのうちの１つもしくは複数、またはそのいずれかの組合せを必要に応じてコードし得る。さらに、一部の実施形態では、本明細書に開示されている少なくとも１つのｒＡＡＶベクターを含む組成物は、組織または対象によって生じる自然免疫応答を回避するために、自然免疫系の阻害剤をコードする合成の、修飾されたＲＮＡも含み得る。

【0264】

一部の実施形態では、本明細書に開示されている投与方法において使用するための免疫モジュレーターは、免疫抑制剤である。本明細書で使用される場合、用語「免疫抑制薬または免疫抑制剤」は、正常な免疫機能を阻害または妨害する医薬品を含むことを意図する。本明細書に開示される方法に好適な免疫抑制剤の例には、米国特許公開第２００２／０１８２２１１号に開示されている、ＣＴＬＡ４およびＢ７経路を介するＴ細胞およびＢ細胞のカップリングを妨害する薬剤などの、Ｔ細胞／Ｂ細胞共刺激経路を阻害する薬剤が含まれる。一実施形態では、免疫抑制剤は、シクロスポリンＡである。他の例には、ミオフェニレートモフェチル（ｍｙｏｐｈｅｎｙｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ）、ラパマイシン、および抗胸腺細胞グロブリンが含まれる。一実施形態では、免疫抑制薬は、本明細書に開示される少なくとも１つのｒＡＡＶベクターを含む組成物で投与されるか、または別の組成物で投与することができるが、本明細書に開示されている投与方法に従って、少なくとも１つのｒＡＡＶベクターを含む組成物の投与と同時に、またはその前に、またはその後に投与されてもよい。免疫抑制薬は、投与経路に適合する製剤で投与され、所望の治療効果を達成するのに十分な投与量で対象に投与される。一部の実施形態では、免疫抑制薬は、本明細書に開示されているｒＡＡＶベクターに対する忍容性を誘導するのに十分な時間、一過的に投与される。

【0265】

本明細書に開示されている方法および組成物のいずれかの実施形態では、本明細書に開示される組成物を投与される対象は、免疫抑制剤も投与される。ＡＡＶを投与される患者の免疫応答の免疫抑制をもたらす様々な方法が公知である。当技術分野で公知の方法は、患者に、免疫抑制剤、例えばプロテアソーム阻害剤を投与することを含む。例えば、その両方が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１６９，４９２号および米国特許出願第１５／７９６，１３７号に開示される、当技術分野で公知の１つのこのようなプロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブである。一部の実施形態では、免疫抑制剤は、例えば、抗体産生細胞の排除または抑制によって、免疫応答を抑制することが可能である、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ｓｃｆｖまたは他の抗体由来の分子を含む抗体であり得る。さらなる実施形態では、免疫抑制エレメントは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。このような実施形態では、ｓｈＲＮＡのコード領域は、ｒＡＡＶカセットに含まれ、一般に、ポリＡテールの３’の下流に位置する。ｓｈＲＮＡは、サイトカイン、成長因子（形質転換成長因子β１およびβ２、ＴＮＦならびに公知である他のものを含む）などの免疫刺激剤の発現を低下または排除するために、標的とされ得る。

【0266】

このような免疫モジュレート剤の使用は、何カ月および／または何年にもわたり、複数回の投与（ｄｏｓｉｎｇ）（例えば、複数回の投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ））を使用する者の能力を促進する。これにより、以下に議論される複数の薬剤、例えば、ｒＡＡＶベクターをコードする複数の遺伝子の使用、または対象への複数回の投与が可能になる。

【0267】

本発明の例示的な実施形態は、以下の実施例によってより詳細に記載される。これらの実施形態は、本発明の例示であり、当業者は、本発明が例示的実施形態に限定されないことを認識する。
定義

【0268】

便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語および句の意味を以下に提供する。別段に記述されていなければ、または文脈から暗に示されていなければ、以下の用語および句は、以下に提供される意味を含む。定義は、特定の実施形態を説明する際の助けとなるよう提供され、および本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ制限されるので、定義は、特許請求された発明を限定することを意図しない。別段に定義されていなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用と本明細書で提供されるその定義との間に明らかな矛盾が存在する場合、本明細書内で提供される定義が優先するこのとする。

【0269】

便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において、本明細書で用いられるある特定の用語を、ここに集める。

【0270】

用語「低下させる」、「低減する」、「低減」、または「阻害する」は、統計的に有意な量での低下を意味するために、本明細書においてすべて使用される。一部の実施形態では、「低減する」、「低減」または「低下させる」または「阻害する」は、典型的には、参照レベル（例えば、所与の処置または薬剤の非存在）と比較して、少なくとも１０％の低下を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより大きい低下を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「低減」または「阻害」は、参照レベルと比較して、完全な阻害または低減を包含しない。「完全な阻害」は、参照レベルと比較して、１００％の阻害である。低下は、所与の障害を有することなく、個体に対して正常な範囲内として許容されるレベルまでの下降が好ましい場合がある。

【0271】

用語「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」はすべて、統計的に有意な量での増加を意味するために、本明細書において使用される。一部の実施形態では、用語「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」は、参照レベルと比較して、少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の増加、または最大１００％（１００％を含む）の増加、または１０～１００％の間の任意の増加、あるいは参照レベルと比較して、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または２倍～１０倍もしくはそれを超える倍数の間の任意の増加を意味してもよい。マーカーまたは症状の文脈で、「増加」は、このようなレベルの統計的に有意な増加である。

【0272】

本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、齧歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが含まれる。齧歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが含まれる。飼育動物および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種、例えば、イエネコ、イヌ科の種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類の種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚類、例えば、マス、ナマズおよびサケが含まれる。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。用語「個体」、「患者」および「対象」は、本明細書において互換的に使用される。

【0273】

好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであってもよいが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、ハンチントン病の動物モデルを表す対象として有利に使用され得る。対象は、雄であっても雌であってもよい。

【0274】

対象は、処置を必要とする状態（例えば、ハンチントン病）またはこのような状態に関連する１つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されたことがあるか、またはそれに罹っていると確認されたことがあるか、またはそれを有する対象であってもよく、必要に応じて、ハンチントン病またはハンチントン病に関連する１つもしくは複数の合併症に対する処置を既に受けたことがあってもよい。あるいは、対象は、ハンチントン病またはハンチントン病に関連する１つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されたことがなくてもよい。例えば、対象は、ハンチントン病またはハンチントン病に関連する１つもしくは複数の合併症に関する１つまたは複数のリスク因子を示す対象、あるいはリスク因子を示さない対象であってもよい。

【0275】

特定の状態に対する処置を「必要とする対象」は、その状態を有するか、その状態を有すると診断されたか、またはその状態を発症するリスクを有する対象であってもよい。

【0276】

本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、隣接する残基のアルファ－アミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合によって互いに接続した、一連のアミノ酸残基を示すために、本明細書において互換的に使用される。用語「タンパク質」、および「ポリペプチド」は、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸アナログを含む、アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関して使用されることが多いが、用語「ペプチド」は、小さいポリペプチドに関して使用されることが多く、しかし、これらの用語の使用は、当技術分野において重複している。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、遺伝子産物およびその断片に言及する場合、本明細書において互換的に使用される。よって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片および他の等価物、前記のもののバリアント、断片、およびアナログが含まれる。

【0277】

バリアントアミノ酸またはＤＮＡ配列は、ネイティブの配列または参照配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であってもよい。ネイティブの配列と変異体の配列の間の相同性（同一性パーセント）の程度は、例えば、ワールドワイドウェブにおいてこのために通常用いられる無料で利用可能なコンピュータープログラム（例えば、デフォルト設定のＢＬＡＳＴｐまたはＢＬＡＳＴｎ）を使用して、２つの配列を比較することによって、決定することができる。

【0278】

ネイティブのアミノ酸配列の変更は、当業者に公知のいくつかの技法のいずれかによって達成することができる。変異は、例えば、ネイティブの配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位に挟まれた、変異体の配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に導入することができる。ライゲーション後に、得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有するアナログをコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド特異的部位特異的変異誘発の手順を用いて、必要とされる置換、欠失、または挿入によって変更された特定のコドンを有する変更されたヌクレオチド配列をもたらすことができる。このような変更をするための技法は、十分に確立されており、例えば、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｇｅｎｅ ４２：１３３， １９８６）；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｇｅｎｅ ３７：７３， １９８５）； Ｃｒａｉｋ （ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｊａｎｕａｒｙ １９８５， １２－１９）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， １９８１）；ならびに米国特許第４，５１８，５８４号および同第４，７３７，４６２号に開示されるものを含む。ポリペプチドの適切な立体構造を維持することに関与しない任意のシステイン残基も、一般的にはセリンで置換され、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合（複数可）は、ポリペプチドに付加され、その安定性を改善するか、またはオリゴマー化を容易にすることができる。

【0279】

本明細書で使用される場合、用語「核酸」または「核酸配列」は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはそのアナログの単位を組み込む、任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一本鎖核酸は、変性した二本鎖ＤＮＡの１つの核酸鎖であってもよい。あるいは、これは、いずれの二本鎖ＤＮＡにも由来しない一本鎖核酸であってもよい。一態様では、核酸は、ＤＮＡであってもよい。別の態様では、核酸は、ＲＮＡであってもよい。好適なＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡが含まれ得る。好適なＲＮＡには、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡが含まれ得る。

【0280】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載されているポリペプチド、核酸、または細胞は、操作されていてもよい。本明細書で使用される場合、「操作された」は、ヒトの手で操作された態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも１つの態様、例えばその配列が、ヒトの手によって、それが天然に存在する態様と異なるように操作されている場合に、「操作された」と考えられる。通常の実践であり、当業者に理解されるように、操作された細胞の後代は、典型的には、依然として、実際の操作が以前の実態で実施されたとしても「操作された」と称される。

【0281】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲＮＡは、外因性である。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲＮＡは、異所性である。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲＮＡは、内因性ではない。

【0282】

用語「外因性」は、そのネイティブの供給源以外の細胞に存在する物質を指す。用語「外因性」は、本明細書で使用される場合、それが通常見られない、かつ核酸またはポリペプチドをこのような細胞または生物中に導入したい、細胞または生物などの生物システム中に、ヒトの手を含むプロセスによって導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）またはポリペプチドを指し得る。あるいは、「外因性」は、それが比較的少ない量でしか見られない、かつ細胞または生物中の核酸またはポリペプチドの量を増加させたい、例えば、異所性の発現またはレベルを創出したい、細胞または生物などの生物システム中に、ヒトの手を含むプロセスによって導入された核酸またはポリペプチドを指し得る。対照的に、用語「内因性」は、生物システムまたは細胞に対してネイティブである物質を指す。本明細書で使用される場合、「異所性」は、普通ではない場所および／または量で見られる物質を指す。異所性の物質は、所与の細胞内で通常見られるが、非常に少ない量および／または異なる時点でしか見られない物質であり得る。異所性はまた、天然には見られないか、またはその天然環境において所与の細胞内で発現される、ポリペプチドまたは核酸などの物質も含む。

【0283】

一部の実施形態では、本明細書に記載されている阻害性ＲＮＡをコードする核酸（例えば、配列番号１～２４）は、ベクターによって含まれる。本明細書に記載の態様の一部では、本明細書に記載されている所与のポリペプチドをコードする核酸配列、またはそのいずれかのモジュールは、ベクターに作動可能に連結している。用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、宿主細胞への送達のため、または異なる宿主細胞間での移入のために設計された核酸構築物を指す。本明細書で使用される場合、ベクターは、ウイルスベクターであっても非ウイルスベクターであってもよい。用語「ベクター」は、適当な制御エレメントと関連する場合に複製が可能であり、遺伝子配列を細胞に移入することができる、任意の遺伝エレメントを包含する。ベクターは、以下に限定されないが、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどを含んでもよい。

【0284】

態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、組換えベクターであり、例えば、それは、少なくとも２つの異なる供給源を起源とする配列を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも２つの異なる種を起源とする配列を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも２つの異なる遺伝子を起源とする配列を含み、例えば、それは、融合タンパク質、または少なくとも１つのネイティブではない（例えば、異種の）遺伝制御エレメント（例えば、プロモーター、サプレッサー、アクチベーター、エンハンサー、応答エレメントなど）に作動可能に連結した発現産物をコードする核酸を含む。

【0285】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターまたは核酸は、コドン最適化されており、例えば、核酸配列のネイティブの配列または野生型配列は、変更されたかまたは操作された核酸が、ネイティブの／野生型配列と同じポリペプチド発現産物をコードするが、所望の発現系において改善された効率で転写および／または翻訳されるように、代替のコドンを含むように変更または操作されている。態様のいずれかの一部の実施形態では、発現系は、ネイティブの／野生型配列の供給源以外の生物（またはこのような生物から得られる細胞）である。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターおよび／または核酸配列は、哺乳動物または哺乳動物細胞、例えば、マウス、マウス細胞、またはヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターおよび／または核酸配列は、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターおよび／または核酸配列は、酵母または酵母細胞における発現に関してコドン最適化されている。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターおよび／または核酸配列は、細菌細胞における発現に関してコドン最適化されている。態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターおよび／または核酸配列は、Ｅ． ｃｏｌｉ 細胞における発現に関してコドン最適化されている。

【0286】

本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写調節配列に連結した配列からＲＮＡまたはポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現される配列は、必ずしもそうではないが、細胞に対して異種性であることが多い。発現ベクターは、追加のエレメントを含んでもよく、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有してもよく、よって、これは２つの生物において、例えば、発現のためのヒト細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主において、維持されることが可能になる。

【0287】

本明細書で使用される場合、用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子中にパッケージングされる能力を有する、核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、必須ではないウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載されているポリペプチドをコードする核酸を含有し得る。ベクターおよび／または粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、何れかの核酸を細胞中に移入するために利用され得る。多数の形態のウイルスベクターが当技術分野で公知である。本発明のウイルスベクターの非限定的な例としては、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、およびキメラウイルスベクターが挙げられる。

【0288】

本明細書に記載のベクターは、一部の実施形態では、他の好適な組成物および治療と組み合わされてもよいことが理解されるべきである。一部の実施形態では、ベクターは、エピソームベクターである。好適なエピソームベクターの使用により、対象における目的のヌクレオチドを、高コピー数の染色体外ＤＮＡにおいて維持する手段がもたらされ、それによって、染色体組み込みの潜在的効果を排除する。

【0289】

本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「改善」は、治療的処置を指し、ここで、その目的は、疾患または障害、例えばハンチントン病に関連する状態の進行または重症度を逆転、軽減、改善、阻害、遅延または停止することである。用語「処置すること」は、ハンチントン病に関連する状態、疾患または障害の少なくとも１つの有害効果または症状を低減または軽減することを含む。処置は、一般に、１つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減する場合に、「有効」である。あるいは、処置は、疾患の進行が低下するかまたは停止する場合に、「有効」である。すなわち、「処置」は、単に症状またはマーカーの改善だけではなく、処置の非存在下で期待されるものと比較して、症状の進行または悪化の中断、またはその少なくとも減速を含む。有益であるかまたは所望の臨床結果には、以下に限定されないが、検出可能であっても検出不能であっても、１つもしくは複数の症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患の安定化した（すなわち悪化していない）状態、疾患進行の遅延もしくは減速、疾患状態の改善もしくは緩和、寛解（部分的であっても全体的であっても）、および／または死亡率の低下が挙げられる。用語疾患の「処置」は、疾患の症状またはその副作用からの解放（緩和処置を含む）を提供することも含む。

【0290】

本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、薬学的に許容される担体、例えば、製薬産業において通常使用される担体と組み合わせた活性剤を指す。句「薬学的に許容される」は、正当な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比に見合う、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を有することなく人間および動物の組織と接触して使用するのに好適である、これらの化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために、本明細書において用いられる。態様のいずれかの一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、水以外の担体であってもよい。態様のいずれかの一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、クリーム、エマルション、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、および／または軟膏であってもよい。態様のいずれかの一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、人工的なまたは操作された担体、例えば、有効成分が天然に存在することが見出されない担体であってもよい。

【0291】

本明細書で使用される場合、用語「投与すること」は、本明細書に開示されている化合物を、薬剤の所望の部位への少なくとも部分的な送達をもたらす方法または経路によって、対象中に配置することを指す。本明細書に開示される化合物を含む医薬組成物は、対象において有効な処置をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。一部の実施形態では、投与は、物理的なヒトの活動、例えば、注射、摂取行動、適用行動、および／または送達デバイスもしくはマシンの操作を含む。このような活動は、例えば、医療専門家および／または処置される対象によって実施され得る。

【0292】

本明細書で使用される場合、「接触させること」は、薬剤を少なくとも１つの細胞に送達するか、または曝露させるための任意の好適な手段を指す。例示的な送達方法としては、以下に限定されないが、細胞培養培地への直接送達、灌流、注射、または当業者に周知の他の送達方法が挙げられる。一部の実施形態では、接触させることは、物理的なヒト活動、例えば、注射；分散、混合、および／もしくはデカントする行動；ならびに／または送達デバイスもしくはマシンの操作を含む。

【0293】

用語「統計的に有意な」または「有意に」は、統計的有意性を指し、一般に、２標準偏差（２ＳＤ）またはより大きな差を意味する。

【0294】

操作例における以外に、または他に示されている場合、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表現するすべての数は、すべての事例において、用語「約」で修飾されていると理解されるべきである。用語「約」は、パーセンテージと併せて使用される場合、±１％を意味し得る。

【0295】

本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、表された規定の要素に加えて、他の要素も存在してよいことを意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の使用は、限定ではなく包含を示す。

【0296】

用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、本明細書に記載されている組成物、方法、およびそのそれぞれの構成成分を指し、実施形態についてのその記載において列挙されていないすべての要素を除外する。

【0297】

本明細書で使用される場合、用語「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、所与の実施形態に必要とされるこれらの要素を指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。

【0298】

本明細書で使用される場合、用語「～に対応する」は、第１のポリペプチドもしくは核酸において列挙された位置におけるアミノ酸もしくはヌクレオチド、または第２のポリペプチドもしくは核酸において列挙されたアミノ酸もしくはヌクレオチドと等価であるアミノ酸もしくはヌクレオチドを指す。等価な列挙されたアミノ酸またはヌクレオチドは、当技術分野で公知の相同性プログラムの程度、例えばＢＬＡＳＴを使用して、候補配列のアライメントによって決定することができる。

【0299】

本明細書で使用される場合、用語「特異的結合」は、第１の実体が第２の実体に結合し、それが標的ではない第３の実体に結合するよりも強い特異性および親和性で実体を標的とする、２つの分子、化合物、細胞および／または粒子の間の化学的相互作用を指す。一部の実施形態では、特異的結合は、第３の非標的実体に対する親和性よりも、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍またはそれより高い倍率である、第１の実体の、第２の標的実体への親和性を指し得る。所与の標的に対して特異的な試薬は、利用されるアッセイの条件下でその標的に対して特異的結合を示す試薬である。

【0300】

単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段に明確に示していなければ、複数の指示対象を含む。同様に、語「または（ｏｒ）」は、文脈が別段に明確に示していなければ、「および（ａｎｄ）」を含むことを意図する。本明細書に記載のものに類似するかそれと同等な方法および材料は、本開示の実践または試験において使用することができ、好適な方法および材料を以下に記載する。略語「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語の例えば（ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａ）に由来し、非限定的な例を示すために本明細書において使用される。よって、略語「例えば（ｅ．ｇ．）」は、用語「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。

【0301】

本明細書に開示される本発明の代替の要素または実施形態の群分けは、限定として解釈されるべきではない。各群のメンバーは、個々に、またはその群の他のメンバーもしくは本明細書に見られる他の要素との任意の組合せで、言及されても特許請求されてもよい。群の１つまたは複数のメンバーは、便宜上および／または特許性の理由で、群に含まれても、それから削除されてもよい。いずれかのこのような包含または削除が生じる場合、本明細書は、ここで修正されたその群を含有すると見なされ、よって、添付の特許請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュ群についての書面の記載を満たす。

【0302】

本明細書において別段に定義されていなければ、本出願と併せて使用される科学用語および技術用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって通常理解される意味を有する。本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、それ自体変更可能であることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を制限することを意図するものではなく、本発明は、特許請求の範囲によってのみ定義される。免疫学および分子生物学における一般的用語の定義は、そのそれぞれの内容がすべて参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．， ２０１８ （ＩＳＢＮ ０９１１９１０１９０， ９７８－０９１１９１０４２１）；Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ． Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９９－２０１２ （ＩＳＢＮ ９７８３５２７６００９０８）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ （ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １９９５ （ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ２００６； Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ， Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ， Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ （ｅｄｓ．）， Ｗ． Ｗ． Ｎｏｒｔｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ， ２０１６ （ＩＳＢＮ ０８１５３４５０５４， ９７８－０８１５３４５０５３）；Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ２０１４ （ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ４ｔｈ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， ＵＳＡ （２０１２） （ＩＳＢＮ １９３６１１３４１４）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ （２０１２） （ＩＳＢＮ ０４４４６０１４９Ｘ）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： ＤＮＡ， Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ （ｅｄ．） Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ２０１３ （ＩＳＢＮ ０１２４１９９５４２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＣＰＭＢ）， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ （ｅｄ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， ２０１４ （ＩＳＢＮ ０４７１５０３３８Ｘ， ９７８０４７１５０３３８５）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＣＰＰＳ）， Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ （ｅｄ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ２００５；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （ＣＰＩ） （Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ， （ｅｄｓ．） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ２００３ （ＩＳＢＮ ０４７１１４２７３５， ９７８０４７１１４２７３７）、ＷＯ２０１８／０５７８５５Ａ、ＵＳ １０，４５７，９４０に見い出すことができる。

【0303】

態様のいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載の本開示は、人間をクローニングするためのプロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を改変するためのプロセス、産業上もしくは商業上の目的でのヒトの胚の使用、またはヒトもしくは動物に対していかなる実質的な医学的利益もなしに、動物に罹患を引き起こす可能性がある、動物の遺伝的同一性を改変するためのプロセス、およびこのようなプロセスから生じる動物にも、関係しない。

【0304】

他の用語は、本発明の様々な態様についての記載内で、本明細書において定義される。

【0305】

参照文献、発効された特許、公開された特許出願、および同時係属の特許出願を含み；本出願全体を通して引用される；すべての特許および他の刊行物は、例えば、本明細書に記載の技術と併せて使用され得るこのような刊行物において記載される方法論について説明および開示するために、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日前に、単にそれらの開示を提供するにすぎない。この点において、先行発明によってまたは他のいずれの理由でも、このような開示が先行するために本発明者らが権利を与えられないことの自認として、いずれも解釈されるべきではない。日付についてのすべての記述またはこれらの文書の内容についての表現は、出願人らに利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性についていずれの自認も構成しない。

【0306】

本開示の実施形態についての記載は、排他的であることも、開示された正確な形態に本開示を限定することも意図しない。本開示の特定の実施形態、およびそれに関する実施例は、例示目的で本明細書に記載されているが、関連する技術分野における当業者が認識するように、様々な同等な修正が本開示の範囲内で可能である。例えば、方法のステップまたは機能は所与の順序で表されるが、代替の実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、または機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書に提供される本開示の教示は、適宜他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本開示の態様は、必要であれば、上記参照文献および出願の組成物、機能および概念を用いるように修正され、本開示のまたさらなる実施形態を提供することができる。これらの変更および他の変更は、詳細な説明を鑑みて本開示に対してなされ得る。すべてのこのような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

【0307】

前記実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わされても、またはそれの代わりに使用してもよい。さらに、本開示のある特定の実施形態に関連する利点はこれらの実施形態に関して記載されているが、他の実施形態がこのような利点を示してもよく、本開示の範囲内にあるすべての実施形態が必ずしもこのような利点を示す必要もない。

【0308】

本明細書に記載の技術は、決してさらなる限定であると解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例証される。

【0309】

本明細書に記載の技術の一部の実施形態は、以下の番号を付された段落のいずれかによって定義され得る。
１． ａ．第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む第１の領域；および
ｂ．１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の領域であって、各ｍｉＲＮＡが、配列番号２５に相補的なシード配列を含む、第２の領域
を含む単離された核酸。
２． ａ．第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む第１の領域；および
ｂ．１つまたは複数のｍｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む第２の領域であって、各ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ骨格配列に挟まれた配列番号１～２２のいずれか１つに示される配列を含む配列によってコードされている、第２の領域
を含む単離された核酸。
３． 前記導入遺伝子が、イントロンに挟まれたタンデムで２つのｍｉＲＮＡまたは２つの前駆体ｍｉＲＮＡを含む、段落１または２に記載の単離された核酸。
４． 前記隣接するイントロンが、同一である、段落３に記載の単離された核酸。
５． 前記隣接するイントロンが、同じ種に由来する、段落３に記載の単離された核酸。
６． 前記隣接するイントロンが、ｈＣＧイントロンである、段落３に記載の単離された核酸。
７． 前記導入遺伝子が、プロモーターを含む、段落１から６のいずれか一項に記載の単離された核酸。
８． 前記プロモーターが、シナプシン（Ｓｙｎ１）プロモーターである、段落７に記載の単離された核酸。
９． 前記導入遺伝子が、タンパク質をさらにコードする、段落１から８のいずれか一項に記載の単離された核酸。
１０． 前記タンパク質が、ＣＹＰ４６Ａ１である、段落９に記載の単離された核酸。
１１． 前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡが、前記導入遺伝子の非翻訳部分に位置する、段落１から１０のいずれか一項に記載の単離された核酸。
１２． 前記非翻訳部分が、イントロンである、段落１１に記載の単離された核酸。
１３． 前記非翻訳部分が、タンパク質をコードする核酸配列の最後のコドンとポリＡテール配列の間か、またはプロモーター配列の最後のヌクレオチド塩基とポリＡテール配列の間に存在する、段落１１に記載の単離された核酸。
１４． 第２のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、またはそのバリアントを含む第３の領域をさらに含む、段落１から１３のいずれか一項に記載の単離された核酸。
１５． 前記ＩＴＲバリアントが、機能的末端分離部位（ＴＲＳ）を欠き、必要に応じて、前記ＩＴＲバリアントが、ＡＴＲＳ ＩＴＲである、段落１から１４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
１６． 前記ｍｉＲＮＡの少なくとも１つが、ヒトハンチンチン（例えば、配列番号２５）にハイブリダイズし、ヒトハンチンチンの発現を阻害する、段落１から１５のいずれか一項に記載の単離された核酸。
１７． 段落１から１６のいずれか一項に記載の単離された核酸を含むベクター。
１８． プラスミドである、段落１７に記載のベクター。
１９． 段落１から１６のいずれか一項に記載の単離された核酸、または段落１７もしくは１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
２０． ａ．キャプシドタンパク質；および
ｂ．段落１から１６のいずれか一項に記載の単離された核酸
を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
２１． 前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、もしくはＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質、またはそのいずれかのキメラである、段落２０に記載のｒＡＡＶ。
２２． 前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質である、段落２０または２１に記載のｒＡＡＶ。
２３． 自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、段落２０から２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
２４． 中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のために製剤化されている、段落２０から２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
２５． 配列番号１～２２のいずれか１つに示される配列をコードする単離された核酸。
２６． 段落１から１６のいずれかに記載の単離された核酸を含む組成物。
２７． 段落１７または１８に記載のベクターを含む組成物。
２８． 段落２０から２４のいずれかに記載のｒＡＡＶ細胞を含む組成物。
２９． それを必要とする対象におけるハンチントン病を処置するための方法であって、ハンチントン病を有するかまたはハンチントン病を発症するリスクを有する対象に、段落１から１６のいずれか一項に記載の単離された核酸、段落２０から２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、または段落２５から２８のいずれかに記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
３０． 前記対象が、３６個より多いＣＡＧリピート、４０個より多いリピート、または１００個より多いリピートを有するハンチンチン遺伝子を含む、段落２９に記載の方法。
３１． 前記対象が、２０歳未満である、段落２９または３０に記載の方法。
３２． 前記投与が、前記単離された核酸またはｒＡＡＶの、前記対象の中枢神経系（ＣＮＳ）への送達をもたらす、段落２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
３３． 前記投与が、注射、必要に応じて静脈内注射または線条体内注射によるものである、段落２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
３４． 前記投与が、カテーテルまたは関連するデバイスによるものである、段落２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
３５． 投与することの前に、ハンチントン病を有するかまたはハンチントン病を発症するリスクを有するとして対象を診断するステップをさらに含む、段落３４に記載の方法。
３６． 投与することの前に、ハンチントン病を有するかまたはハンチントン病を発症するリスクを有するとして対象を診断するアッセイの結果を受け取るステップをさらに含む、段落３４に記載の方法。

【実施例】

【0310】

（実施例１）
一態様では、ハンチントン病の処置のために使用することができる阻害性ＲＮＡが本明細書に記載される。態様のいずれかの一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡの核酸配列は、配列番号１もしくは配列番号４～９のうちの１つまたは配列番号１もしくは配列番号４～９と同じ機能を維持する（例えば、ＨＴＴ阻害）、配列番号１もしくは配列番号４～９の少なくとも１つの配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列を含む。

【0311】

人工ｍｉＲＮＡを含む構築物が本明細書に記載されている（例えば、図１を参照されたい）。ｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）－Ｓｙｎ１－ｈＣＧイントロンは、対照ベクターであり、これは、エンプティヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）イントロン（ｈＣＧｉｎ；例えば配列番号３４を参照されたい）を挿入され、シナプシンプロモーター（例えば、配列番号３１～３２を参照されたい）で駆動される。対照ｍｉＲＮＡ前駆体（ランダム配列または非機能性変異）の２つのコピーをベクターｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）－Ｓｙｎ１－ｈＣＧｉｎ－２ｘ対照ｐｒｅ－ｍｉＲのｈＣＧｉｎ中に挿入する。人工ｐｒｅ－ｍｉＲ（例えば、配列番号３５を参照されたい；約１００～１５０ｂｐの隣接する上流および下流の配列を含む、３’－ＵＴＲ標的配列と完全一致）の２つのコピーは、ｈＣＧイントロン間にクローニングされる。人工ｍｉＲＮＡ配列の２つのコピーは、インサーターを切断して、ｍｉＲＮＡの前駆体を形成することができる、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）イントロン中に挿入される。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは前駆体であり、これは、ヘアピンループ構築物を有する。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、エクスポーチン５（Ｅｘｐ５）およびＲａｎ－ＧＴＰの助けにより、細胞質中に翻訳される。これらのｍｉＲＮＡ前駆体は、核中でリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素Ｄｒｏｓｈａおよび細胞質中でダイサーの助けにより、成熟ｍｉＲＮＡへとさらにプロセシングされる（例えば、ダイサーは、前駆体を切断して成熟ｍｉＲＮＡとし、これは約２０～２２ｂｐであり得る）。ベクターｐＥＭＢＬ－Ｄ（＋）－Ｓｙｎ１－ＣＹＰ４６Ａ１－ｈＣＧｉｎ－２ｘ人工ｐｒｅ－ｍｉＲは、組合せ構築物であり、これは、ＣＹＰ４６Ａ１と人工ｍｉＲＮＡの両方を同時に生成することができる。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが、成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングされて、ＣＡＧ伸長を含むＨＴＴ標的配列（これは、成熟ｍｉＲＮＡと完璧に相補的である）と組み合わされ得るかどうかを確認するために、ＨＴＴ標的配列をルシフェラーゼ遺伝子の後に挿入する。パッケージサイズの制限のために、構築物には小さいポリＡを使用する。

【0312】

以下の配列は当技術分野で公知である：ｐＥＭＢＬ；シナプシンプロモーター（Ｓｙｎ１）；ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶｒｈ１０由来）；ｈＣＧイントロン；小ポリＡ；ＣＹＰ４６Ａ１；ルシフェラーゼ；および／またはＨＴＴ標的配列（例えば、ＨＴＴ－３’ＵＴＲ／変異体）。

【0313】

シナプシン－１（Ｓｙｎ１）は、シナプシン遺伝子ファミリーのメンバーである。シナプシンは、シナプス小胞の細胞質表面と会合するニューロンリンタンパク質をコードする。ファミリーのメンバーは、共通のタンパク質ドメインによって特徴付けられ、これらは、シナプス形成および神経伝達物質放出のモジュレーションに関係し、いくつかの神経精神疾患における潜在的な役割を示唆する。Ｓｙｎ１は、軸索形成およびシナプス形成の調節において役割を果たす。Ｓｙｎ１タンパク質は、いくつかの異なるプロテインキナーゼに関する基質としての役割を果たし、リン酸化は、神経末端におけるこのタンパク質の調節において機能することができる。この遺伝子における変異は、Ｒｅｔｔ症候群などの主要な神経退化を有するＸ関連障害に関連し得る。異なるアイソフォームをコードする選択的にスプライシングされた転写物バリアントが同定されている。態様のいずれかの一部の実施形態では、Ｓｙｎ１プロモーターは、ヒトプロモーターＳｙｎ１（例えば、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８４３７．１ ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ Ｒａｎｇｅ ５００１－５２９５７、ＮＭ＿００６９５０．３、ＮＰ＿００８８８１．２；ＮＭ＿１３３４９９．２、ＮＰ＿５９８００６．１と関連するＳｙｎ１プロモーターを参照されたい：例えば、配列番号３１～３２を参照されたい）を含んでもよい。

【0314】

ＣＹＰ４６Ａ１は、チトクロームＰ４５０スーパーファミリーの酵素のメンバーである。チトクロームＰ４５０タンパク質は、薬物代謝ならびにコレステロール、ステロイドおよび他の脂質の合成に関与する多くの反応を触媒するモノオキシゲナーゼである。この小胞体タンパク質は、脳内で発現され、ここで、コレステロールを２４Ｓ－ヒドロキシコレステロールに変換する。コレステロールは、血液脳関門を通過することができないが、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロールは、脳内で循環へと分泌され、異化のために肝臓に戻され得る。態様のいずれかの一部の実施形態では、ＣＹＰ４６Ａ１は、ヒトＣＹＰ４６Ａ１を含んでもよい（例えば、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００７９６３．１ ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ Ｒａｎｇｅ ４８８１－４７８８４；ＮＭ＿００６６６８．２；ＮＰ＿００６６５９．１を参照されたい；例えば、配列番号２６～２７を参照されたい）。コレステロール分解のための律速酵素であるＣＹＰ４６Ａ１は、ハンチントン病において神経保護的である（例えば、そのそれぞれの内容が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、Ｂｏｕｓｓｉｃａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．， ＣＹＰ４６Ａ１， ｔｈｅ ｒａｔｅ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ， ｉｓ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ， Ｂｒａｉｎ． ２０１６ Ｍａｒ， １３９（Ｐｔ ３）：９５３－７０；Ｋａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＣＹＰ４６Ａ１ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｃｉｐｈｅｒｓ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ， Ｂｒａｉｎ． ２０１９ Ａｕｇ １；１４２（８）：２４３２－２４５０を参照されたい）。

【0315】

本開示のｍｉＲＮＡの非限定的な例は、配列番号１または配列番号４～９を含む。

【0316】

配列番号６ ＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＡＣＡ

【0317】

配列番号７ ＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＡＧＧＧ

【0318】

配列番号８ ＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＴＡＴＧＴＴＴＴＣＡ

【0319】

配列番号９ ＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＧ

【0320】

配列番号１ ＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣ

【0321】

配列番号４ ＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＴＧＡＧＧＧＡ

【0322】

配列番号５ ＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ

【0323】

態様のいずれかの一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ骨格配列に挟まれた配列番号２５に示される配列の少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の）連続塩基と相補的な配列を含む。態様のいずれかの一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ骨格配列に挟まれたＨＴＴ（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３０６４を参照されたい；例えば、配列番号２５；例えば、表１または２を参照されたい）と関連する、非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ）、エクソン、ＣＡＧリピート、またはＣＡＧジャンパー（例えば、ＣＡＧ ５’ジャンパー、ＣＡＧ ３’ジャンパー）の配列の少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の）連続塩基と相補的な配列を含む。

【0324】

【表2】

【0325】

配列番号２５のハンチンチンｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）；ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ ００２１１１．８（例えば、ＮＧ＿００９３７８．１ ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ、例示的なＨＴＴ遺伝子に関する５００１～１７４２８６の範囲）

【化12-1】

【化12-2】

【化12-3】

【化12-4】

【化12-5】

【化12-6】

【化12-7】

【化12-8】

（実施例２）

【0326】

ＡＡＶに媒介される人工ｍｉＲＮＡおよびハンチントン病（ＨＤ）へのそれらの適用

【0327】

ＨＤを処置するために使用することができる人工ｍｉＲＮＡが本明細書に記載されている（例えば、図２～３を参照されたい）。人工ｍｉＲＮＡを同定および試験するために、いくつかのスクリーニングを実施した。全体として、ＨＤに関する人工ｍｉＲＮＡをスクリーニングするプロセスは：（１）人工ｍｉＲ（例えば、２４個の人工ｍｉＲＮＡ構築物；例えば、表１、配列番号１～２４、図１、図５～６、図８Ａ、図１９を参照されたい）を設計および合成することを含む。１回目のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングは：（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏでプラスミドを共トランスフェクトすること（例えば、２９３細胞におけるプラスミド共トランスフェクションにより２４個のｍｉＲをスクリーニングする；例えば、図７、図８Ｂ、図１６～１８を参照されたい）；（３）ステップ（２）由来の上位約５個の候補物質に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＡＶＲＨ１０に媒介される感染を実施すること（例えば、ＣＭＶプロモーターを使用する；例えば、図１０～１４、図２０～２１を参照されたい）；および／または（４）ステップ（３）由来の上位約２～３個の候補物質に関して、ニューロン特異的プロモーター（例えば、必要に応じてＣＹＰ４６Ａ１を共発現する、ｈＳｙｎ１プロモーター）によって駆動されるＡＡＶＲＨ１０に媒介される感染を実施して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｍｉＲの有効性を試験することを含む。（５）２回目のｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニングは、トランスジェニック（Ｔｇ）マウス（例えば、Ｈｕ－１２８またはＢ６ＣＢＡ－Ｒ６／２）においてＡＡＶｒｈ１０によって媒介される人工ｍｉＲＮＡを試験することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶＲＨ１０に媒介される処置を含む。（６）次いで、人工ｍｉＲおよびそれらのＣＹＰ４６Ａ１との組合せの有効性および安全性についての評価を実施する。例えば、図４、図９、図１５を参照されたい。
Ｉ期：領域Ｉ～ＩＩＩに位置する人工ｍｉＲＮＡのスクリーニング

【0328】

領域Ｉ～ＩＩＩに位置する人工ｍｉＲＮＡは、ｍｉＨＴＴ－Ｈ１（配列番号１）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ２（配列番号２）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ３（配列番号３）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ４（配列番号４）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ５（配列番号５）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ６（配列番号６）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ７（配列番号７）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ８（配列番号８）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ９（配列番号９）；またはｍｉＨＴＴ－Ｈ１０（配列番号１０）を含む；例えば、表１を参照されたい。

【0329】

ＨＤに関する領域Ｉ～ＩＩＩに位置する人工ｍｉＲＮＡをスクリーニングするプロセスは：（１）人工ｍｉＲを設計および合成することを含む（例えば、９～１０個の人工ｍｉＲＮＡ構築物；例えば、表１、配列番号１～１０、図８Ａを参照されたい）。１回目のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングは：（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏでプラスミドを共トランスフェクトすること（例えば、２９３細胞においてプラスミド共トランスフェクションによって９～１０個のｍｉＲをスクリーニングすること：例えば、図８Ｂを参照されたい）；（３）ステップ（２）由来の上位約５個の候補物質に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＡＡＶＲＨ１０に媒介される感染を実施すること（例えば、ＣＭＶプロモーターを使用すること；例えば、図１０～１４を参照されたい）；および／または（４）ステップ（３）由来の上位２個の候補物質（例えば、ｍｉＲ－Ｈ２およびｍｉＲ－Ｈ５）に関して、ニューロン特異的プロモーター（例えば、必要に応じてＣＹＰ４６Ａ１と共発現する、ｈＳｙｎ１プロモーター）によって駆動されるＡＡＶＲＨ１０に媒介される感染を実施して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｍｉＲの有効性を試験することを含む。（５）２回目のｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニングは、Ｔｇマウス（例えば、Ｈｕ－１２８またはＢ６ＣＢＡ－Ｒ６／２）においてＡＡＶｒｈ１０によって媒介される人工ｍｉＲＮＡを試験することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶＲＨ１０に媒介される処置を含む。（６）次いで、ＣＹＰ４６Ａ１との組合せを用いるかまたはそれを用いない、人工ｍｉＲの有効性および安全性についての評価を実施する。例えば、図９を参照されたい。本明細書に記載の実験によって、以下の人工ｍｉＲＮＡが特に有効であると確認された：ｍｉＨＴＴ－Ｈ２（配列番号２）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ４（配列番号４）；またはｍｉＨＴＴ－Ｈ５（配列番号５）；例えば、図８Ａ～８Ｂ、図１１Ａ～１１Ｂ、図１３～１４を参照されたい。特に、図１３および図１４に示されるように、ｍｉＨＴＴ－Ｈ２、Ｈ４およびＨ５は、エンプティベクター（ｍｉＲＮＡを有さない）、または試験された他のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＨＴＴ－Ｈ１またはｍｉＨＴＴ－Ｈ３によるＨＴＴ発現と比較して、神経細胞株Ｕ８７におけるＨＴＴ発現を有効に下方調節する。
ＩＩ期：領域ＩＶ～Ｖに位置する人工ｍｉＲＮＡのスクリーニング

【0330】

領域ＩＶ～Ｖに位置するｍｉＲＮＡは、ｍｉＨＴＴ－Ｈ１１（配列番号１１）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１２（配列番号１２）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１３（配列番号１３）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１４（配列番号１４）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１５（配列番号１５）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１６（配列番号１６）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１７（配列番号１７）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１８（配列番号１８）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１９（配列番号１９；ｍｉＲ－１３７）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ２０（配列番号２０；ｍｉＲ－４５５）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ２１（配列番号２１；ｍｉＲ－２１６）；またはｍｉＨＴＴ－Ｈ２２（配列番号２２；ｍｉＲ－２７ａ）を含む；例えば、表１を参照されたい。Ｉ期に由来する以下のｍｉＲは、陽性対照として使用することができる：ｍｉＨＴＴ－Ｈ２（配列番号２）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ４（配列番号４）；またはｍｉＨＴＴ－Ｈ５（配列番号５）。

【0331】

ＨＤに関する領域ＩＶ～Ｖに位置するｍｉＲＮＡをスクリーニングするプロセスは：（１）人工ｍｉＲを設計および合成することを含む（例えば、１２個の人工ｍｉＲＮＡ構築物；例えば、表１、配列番号１１～２２、図１９を参照されたい）。１回目のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングは：（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏでプラスミドを共トランスフェクトすること（例えば、２９３細胞においてプラスミド共トランスフェクションによって１２個のｍｉＲをスクリーニングすること：例えば、図１６～１８を参照されたい）；（３）ステップ（２）由来の上位約５個の候補物質（例えば、ｍｉＨＴＴ－Ｈ１４；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１５；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１７；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１９；およびｍｉＨＴＴ－Ｈ２１）に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＡＡＶＲＨ１０に媒介される感染を実施すること（例えば、ＣＭＶプロモーターを使用すること；例えば、図２０～２１を参照されたい）；および／または（４）ステップ（３）由来の上位約２～３個の候補物質に関して、ニューロン特異的プロモーター（例えば、必要に応じてＣＹＰ４６Ａ１を共発現する、ｈＳｙｎ１プロモーター）によって駆動されるＡＡＶＲＨ１０に媒介される感染を実施して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｍｉＲの有効性を試験することを含む。（５）２回目のｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニングは、Ｔｇマウス（例えば、Ｈｕ－１２８）においてＡＡＶｒｈ１０によって媒介される人工ｍｉＲＮＡを試験することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶＲＨ１０に媒介される処置を含む。（６）次いで、ＣＹＰ４６Ａ１との組合せを用いるかまたはそれを用いない、人工ｍｉＲの有効性および安全性についての評価を実施する。例えば、図１５を参照されたい。本明細書に記載の実験によって、ヒトで発現したｍｉＲＮＡであるｍｉＨＴＴ－Ｈ１９（配列番号１９；ｍｉＲ－１３７）およびｍｉＨＴＴ－Ｈ２１（配列番号２１；ｍｉＲ－２１６）と一緒に、以下の人工ｍｉＲＮＡが特に有効であると確認された：ｍｉＨＴＴ－Ｈ１４（配列番号１４）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１５（配列番号１５）；およびｍｉＨＴＴ－Ｈ１７（配列番号１７）；例えば、図１７～１９を参照されたい。

【0332】

ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－４５５、ｍｉＲ－２１６、およびｍｉＲ－２７ａ（例えば、ｍｉＨＴＴ－Ｈ１９－Ｈ２２、配列番号１９～２２）は、ＨＴＴを下方調節する際の有効性について試験された、ヒトで発現するｍｉＲＮＡの例である。ＨＴＴに対するこれらの配列の阻害活性は、以前には公知でなかった。本明細書において示されるように、ｍｉＲ－１３７（ｍｉＨＴＴ－Ｈ１９、配列番号１９）およびｍｉＲ－２１６（ｍｉＨＴＴ－Ｈ２１、配列番号２１）は、ＨＴＴ ３’－ＵＴＲを標的とする２つの特に有効な候補物質であった。

【0333】

ｍｉＲ－１３７（例えば、ｍｉＨＴＴ－Ｈ１９、配列番号１９を参照されたい）は、ヒトの第１ｐ２２染色体上に位置し、細胞周期制御によって、結腸直腸がん、扁平上皮癌および黒色腫を含むいくつかのがん型における腫瘍抑制因子として作用することが暗に示されている。ｍｉＲ－１３７は、マウスの胚性幹細胞における神経幹細胞の増殖および分化、ならびにマウス成体の海馬神経前駆細胞由来のニューロンおよびマウス胎仔の海馬ニューロンにおける樹状突起の長さ、分枝点、末端点、および脊椎密度の調節を含むニューロン成熟を調節することが示されている。ｍｉＲ４５５に関連する疾患には、子宮内膜漿液性腺癌およびペティグルー症候群が含まれる。

【0334】

ｍｉＲ－４５５（例えば、ｍｉＨＴＴ－Ｈ２０、配列番号２０を参照されたい）は、ヒトの第９ｑ３２染色体上に位置する。ｍｉＲ－４５５に関連する疾患には、子宮内膜漿液性腺癌およびペティグルー症候群が含まれる。ｍｉＲ－２１６（例えば、ｍｉＨＴＴ－Ｈ２１、配列番号２１を参照されたい）は、ヒトの第２ｐ１６．１染色体上に位置する。ｍｉＲ－２１６に関連する疾患には、糖尿病の微小血管合併症および膵管腺癌が含まれる。ｍｉＲ－２７ａ（例えば、ｍｉＨＴＴ－Ｈ２２、配列番号２２を参照されたい）は、ヒトの第１９ｐ１３．１２染色体上に位置する。ｍｉＲ２７Ａに関連する疾患には、白血病および胃がんが含まれる。ｍｉＲ－２７ａは、陽性対照として本明細書において使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで変異体ＨＴＴの凝集を低減することが報告されている；例えば、Ｂａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４８８（２）， ２０１７， ３１６－３２１を参照されたい。
ＩＩＩ期：ＩＩ期およびＩＩ期において同定されたｍｉＲＮＡに対する領域Ｖに位置する追加の人工ｍｉＲＮＡの試験

【0335】

領域Ｖに位置する追加の人工ｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－４５１ａ（配列番号２３）またはｍｉＲ－１５５（配列番号２４）が含まれる；例えば、表１を参照されたい。ｍｉＲ－４５１ａ（配列番号２３）は、ヒトの第１７ｑ１１．２染色体上に位置する。ｍｉＲ－４５１は、潜在的に、化学療法薬であるパクリタキセルに対する抵抗性を促進する、薬物輸送体タンパク質Ｐ－糖タンパク質を調節する。ｍｉＲ４５１Ａに関連する疾患には、神経膠腫感受性および胃がんが含まれる。ｍｉＲ－１５５（例えば、配列番号２４を参照されたい）は、ヒトの第２１ｑ２１．３染色体上に位置する。ｍｉＲ－１５５発現のｉｎ ｖｉｖｏでの外因性分子制御は、悪性疾患の成長、ウイルス感染症を阻害し、心血管疾患の進行を増強し得る。ｍｉＲ１５５に関連する疾患には、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫および膵管腺癌が含まれる。例えば、その内容が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、これらの追加の人工ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－４５１ａおよびｍｉＲ－１５５の議論に関する米国特許第１０，７６７，１８０号を参照されたい。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書、例えば表１に開示されている少なくとも１つまたは複数のｍｉＲＮＡは、同じ標的遺伝子を標的とするｍｉＲ－４５１ａまたはｍｉＲ－１５５の阻害効率と比較した場合に、標的遺伝子、例えばＨＴＴを阻害するのにより良好であることが期待される。

【0336】

Ｉ期およびＩＩ期に由来する以下の人工ｍｉＲは、上記の追加のｍｉＲＮＡに対して試験することができる：ｍｉＨＴＴ－Ｈ２（配列番号２）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ４（配列番号４）；およびｍｉＨＴＴ－Ｈ５（配列番号５）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１４（配列番号１４）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１５（配列番号１５）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１７（配列番号１７）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１９（配列番号１９；ｍｉＲ－１３７）；またはｍｉＨＴＴ－Ｈ２１（配列番号２１；ｍｉＲ－２１６）。

【0337】

Ｉ期およびＩＩ期において同定された人工ｍＲＮＡに対して、ＨＤに関する追加の人工ｍｉＲＮＡを試験するプロセスは：（１）人工ｍｉＲを設計および合成することを含む（例えば、２個の人工ｍｉＲＮＡ構築物；例えば、表１、配列番号２３～２４、図６を参照されたい）。１回目のｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験は：（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏでプラスミドを共トランスフェクトすること（例えば、２９３細胞においてプラスミド共トランスフェクションによって２個のｍｉＲをスクリーニングすること）；（３）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＡＡＶＲＨ１０に媒介される感染を実施すること（例えば、ＣＭＶプロモーターを使用すること）；および／または（４）ニューロン特異的プロモーター（例えば、必要に応じてＣＹＰ４６Ａ１を共発現する、ｈＳｙｎ１プロモーター）によって駆動されるＡＡＶＲＨ１０に媒介される感染を実施して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｍｉＲの有効性を試験することを含む。（５）２回目のｉｎ ｖｉｖｏでの試験は、Ｔｇマウス（例えば、Ｈｕ－１２８またはＢ６ＣＢＡ－Ｒ６／２）においてＡＡＶｒｈ１０によって媒介される人工ｍｉＲＮＡを試験することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶＲＨ１０に媒介される処置を含む。（６）次いで、ＣＹＰ４６Ａ１との組合せを用いるかまたはそれを用いない、人工ｍｉＲの有効性および安全性についての評価を実施する。

【0338】

さらに、追加のｍｉＲＮＡの有効性を、Ｉ期およびＩＩ期に同定した人工ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＨＴＴ－Ｈ２（配列番号２）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ４（配列番号４）；およびｍｉＨＴＴ－Ｈ５（配列番号５）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１４（配列番号１４）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１５（配列番号１５）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１７（配列番号１７）；ｍｉＨＴＴ－Ｈ１９（配列番号１９；ｍｉＲ－１３７）；またはｍｉＨＴＴ－Ｈ２１（配列番号２１；ｍｉＲ－２１６））の有効性と比較する。例えば、図４を参照されたい。理論に拘束されることを望むものではないが、配列番号２、４、５、１４、１５、１７、または２１のうちの少なくとも１つが、配列番号２３または２４と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで効率および／または有効性の増加（例えば、ＨＴＴ ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルまたは活性の低減において）を示し得ることが予想される。
様々なＨＴＴマウスモデルに関する人工ｍｉＲＮＡの選択

【0339】

【表3】

【0340】

導入遺伝子マウスモデルＨｕ１２８は、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）および３’－ＵＴＲを含む、フルサイズのヒトＨＴＴ遺伝子のノックインを有する（例えば、図６および表３を参照されたい）。他の導入遺伝子マウスモデル（例えば、Ｂ６ＣＢＡ－Ｒ６／２（ＣＡＧ １２０＋／－５）；Ｂ６ＣＢＡ－Ｔｇ（ＨＤエクソン１）６２Ｇｐｂ／３Ｊ；Ｂ６ＣＢＡ－Ｒ６／２（ＣＡＧ １６０＋／－５）；またはＢ６ＣＢＡ－Ｔｇ（ＨＤエクソン１）６２Ｇｐｂ／１Ｊ）は、ヒトＨＴＴの１ｋｂ ５’－ＵＴＲ、エクソンＩ およびイントロン２６０ｂｐを含み、これらは、１つの他の遺伝子（例えば、Ｇｍ１２６９５、第４染色体、ｃｈｒ４：９６，４０９，５８５～９６，４１４，９３０）中に挿入される。

【0341】

したがって、特定のｍｉＲを試験するために、選択されるマウスモデルは、ＨＴＴの標的領域を含むべきである（例えば、図５～６、表１および３を参照されたい）。非限定的な例として、フルサイズのヒトＨＴＴ遺伝子のノックインを有する導入遺伝子マウスモデルＨｕ１２８を使用して、領域Ｉ～Ｖのうちのいずれか１つを標的とするｍｉＲ（例えば、配列番号１～２４）を試験することができる。別の非限定的な例として、ヒトＨＴＴの１ｋｂ ５’－ＵＴＲ、エクソンＩおよびイントロン２６０ｂｐを有する他の導入遺伝子マウスモデル（例えば、Ｂ６ＣＢＡ－Ｒ６／２またはＢ６ＣＢＡ－Ｔｇ（ＨＤエクソン１）株）を使用して、領域Ｉ～ＩＩＩのうちのいずれか１つを標的とするｍｉＲ（配列番号１～１０）を試験することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23-1】

【図23-2】

【図24】

【図25-1】

【図25-2】

【図26】

【図27】

【配列表】

2023507741000001.app

【国際調査報告】