知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-27
(54)【発明の名称】膵臓がんの治療および予後
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20230217BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20230217BHJP
A61K 31/495 20060101ALI20230217BHJP
A61K 31/7068 20060101ALI20230217BHJP
A61K 31/513 20060101ALI20230217BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20230217BHJP
A61K 31/438 20060101ALI20230217BHJP
A61K 31/4523 20060101ALI20230217BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230217BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20230217BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230217BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61K45/06
A61K31/495
A61K31/7068
A61K31/513
A61K31/337
A61K31/438
A61K31/4523
A61P35/00
A61P1/18
A61P43/00 111
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022537349
(86)(22)【出願日】2020-12-18
(85)【翻訳文提出日】2022-08-12
(86)【国際出願番号】 GB2020053295
(87)【国際公開番号】W WO2021123813
(87)【国際公開日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】1918692.3
(32)【優先日】2019-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501308812
【氏名又は名称】ケンブリッジ エンタープライズ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(74)【代理人】
【識別番号】100170900
【弁理士】
【氏名又は名称】大西 渉
(72)【発明者】
【氏名】ウー，トニー ジェイムズ
(72)【発明者】
【氏名】ジル，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ミラー，マーティン
(72)【発明者】
【氏名】キャスト，オリヴァー
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084AA19
4C084AA20
4C084MA02
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC202
4C084ZC412
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA02
4C086BC43
4C086BC50
4C086CB22
4C086EA17
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZC41
4C086ZC75
(57)【要約】
本発明は、膵臓がんの治療における使用のためのＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物、特に、例えば、膵臓がんの治療における抗腫瘍剤として有効な１つ以上のさらなる治療薬と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニストを提供する。そのような抗腫瘍剤は、ゲムシタビン、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（ロイコボリンカルシウム、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩およびオキサリプラチン）、Ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））ならびにそれらの組み合わせから選択される化学療法剤であり得る。がん免疫療法剤（例えば、ＰＤ－１阻害剤および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤）もまた、ＣＣＲ１アンタゴニストとともに好適に使用され得る。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
膵臓がんの治療における使用のための、ＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物。
【請求項2】
膵臓がんの治療における抗腫瘍剤として有効な１つ以上のさらなる治療薬と組み合わせた、請求項１に記載の使用のためのＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物または水和物。
【請求項3】
ゲムシタビン、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（ロイコボリンカルシウム、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩およびオキサリプラチン）、Ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））ならびにそれらの組み合わせから選択される化学療法剤と組み合わせた、請求項１または２に記載の使用のためのＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物または水和物。
【請求項4】
がん免疫療法剤（例えば、ＰＤ－１阻害剤および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤）と組み合わせた、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物または水和物。
【請求項5】
ＭＥＫ阻害剤および／またはＩＧＦ１Ｒ阻害剤と組み合わせた、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物または水和物。
【請求項6】
前記ＣＣＲ１アンタゴニストが、ＵＣＢ－３５６２５、ＢＸ－４７１、ＡＺＤ－４８１８、Ｊ１１３８６３、ＢＡＹ－８６５０４７、ＢＭＳ－８１７３９９、Ｃ－４４６２、ＣＣＸ－３５４、ＣＰ－４８１７１５、およびＭＬＮ－３８９７、またはその薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のためのＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物または水和物。
【請求項7】
前記ＣＣＲ１アンタゴニストが、ＢＸ－４７１であり、それが、ゲムシタビンおよび任意選択でＰＤ－１阻害剤と組み合わせて使用される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物または水和物。
【請求項8】
以下の薬剤：ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ、Ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））およびそれらの組み合わせから選択される化学療法剤、
ＰＤ－１および／もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、
ＭＥＫ阻害剤、ならびに／または
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、のうちの１つ以上と組み合わせてＣＣＲ１アンタゴニストを含む医薬組成物。
【請求項9】
前記膵臓がんが、ステージＩＩＩもしくはＩＶのがんである、かつ／または前記膵臓がんが、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）である、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のためのＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物または水和物。
【請求項10】
膵臓がんの治療を必要とする対象において膵臓がんを治療する方法であって、前記方法は、前記対象に治療有効量のＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物を投与することを含む、方法。
【請求項11】
前記方法が、請求項２～９のいずれか一項に記載の特徴のうちの１つ以上を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
パーツキットであって、以下の構成要素：－任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、本明細書で規定されるＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
－任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される１つ以上の化学療法剤と、を含み、
前記構成要素は、逐次的な、別個の、および／または同時の投与に適切である形態で提供される、パーツキット。
【請求項13】
膵臓がんと診断された対象の予後決定を実施する方法であって、前記方法は、ａ）前記対象から取得されたサンプルにおける免疫（例えば、マクロファージ）浸潤のレベルおよび／またはＣＣＲ１発現のレベルを測定するステップと、
ｂ）ステップａ）において測定された前記免疫（例えば、マクロファージ）浸潤のレベルおよび／または前記ＣＣＲ１発現のレベルをそれぞれ参照浸潤レベルおよび／または参照発現レベルと比較するステップと、
ｃ）ステップｂ）において決定された、前記参照浸潤レベルと比較した前記免疫（例えば、マクロファージ）浸潤レベルおよび／または前記参照発現レベルに対する前記ＣＣＲ１発現のレベルに基づいて前記対象の予後を決定するステップと、を含み、
それぞれの前記参照レベルに対して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤および／またはＣＣＲ１発現は、前記対象にとって好ましくない予後を示し、前記それぞれの参照レベルと比較して減少したかまたは変化していないレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤および／またはＣＣＲ１発現は、前記対象にとって好ましい予後を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
序論
本発明は、膵臓がんの治療におけるＣＣＲ１アンタゴニストの使用に関する。本発明はまた、膵臓がんの治療のための、ＣＣＲ１アンタゴニストを含む医薬組成物の使用、および１つ以上の他の治療薬と組み合わせたＣＣＲ１アンタゴニストの使用に関する。膵臓がんのための治療および予後の新規の方法もまた記載される。
本発明は、膵臓がんの治療におけるＣＣＲ１アンタゴニストの使用に関する。本発明はまた、膵臓がんの治療のための、ＣＣＲ１アンタゴニストを含む医薬組成物の使用、および１つ以上の他の治療薬と組み合わせたＣＣＲ１アンタゴニストの使用に関する。膵臓がんのための治療および予後の新規の方法もまた記載される。
【背景技術】
【0002】
膵臓がんは、がんが進行した状態になるまで非常に少ししか症状を呈しない、侵襲性形態のがんである。その名称が示唆するように、膵臓がんは、膵臓の組織において悪性（がん性）細胞が形成される疾患である。膵臓がんは現在、英国において診断されるがんの１０番目に一般的な形態となっており、９，９１２の膵臓がんの症例が２０１５年に英国において診断された。膵臓がんと診断された患者についての生存率は著しく低く、膵臓がんと診断された患者の１％未満が１０年を超えて生存する。２０１６年だけでも、英国における９，２６３人の人々が膵臓がんで死亡し、この数は、同じ年に英国において膵臓がんと診断された人の数におおよそ相関している。
【0003】
過去４０年にわたる予防、検出および治療における著しい改善により、大部分の他の形態のがんと診断された患者の生存率は革命的に変化したが、膵臓がんと診断された患者の臨床アウトカムは変わらず不良である。全膵臓がん症例の９０％超を構成する膵管腺がん（ＰＤＡＣ）は、地球全体でおおよそ１４０，０００の新たな症例が見られ、世界で４番目に多いがん関連死の原因となっている。
【0004】
膵臓がんに関連する不良な臨床アウトカムおよび低い生存率は、部分的には、この疾患を治療するために現在利用可能である有効な治療オプションの欠如に起因する。例えば、切除不能な膵臓がんのための現在の第１選択のオプションであるゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））＋ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））および／またはＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカンおよびオキサリプラチンの組み合わせ）は、切除不能な膵臓がんと診断された個体に投与されると、その個体の寿命を平均して１１ヶ月のみ延長する、化学療法剤である。
【0005】
したがって、膵臓がんのための新たな改善された治療レジメンの必要性が依然として存在する。また、医師が、進行した形態の膵臓がんを有する患者をどのように治療するのが最善かについてより多くの情報に基づいた決定を下し得るように、この疾患と診断された患者を予後決定および層別化するための新たな方法が望まれている。
【発明の概要】
【0006】
本発明の第１の態様によれば、膵臓がんの治療における使用のための、ＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物または水和物が提供される。
【0007】
本発明者らは、膵臓がん細胞（例えば、ＰＤＡＣ細胞）において発現されるＣＣＲ１と患者の予後との間に強い相関が存在すると決定し、本発明者らは、高レベルのＣＣＲ１が、最も悪い臨床アウトカムを有する患者に強く相関することを見出した。本発明者らはさらに、高レベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤もまた、患者の不良な予後とよく相関することを見出した。したがって、本発明者らは、膵臓がん患者を予後決定するための新たなバイオマーカーおよび方法を特定することができた。
【0008】
さらに、本発明者らは、いくつかの構造的に異なるＣＣＲ１アンタゴニストが、膵臓がん細胞のマクロファージ媒介性浸潤促進性（ｐｒｏ－ｉｎｖａｓｉｖｅ）特性を妨害すること、およびＣＣＲ１発現レベルを低下させることの両方において有効であることを見出した。インビボ腫瘍成長研究により、特に膵臓がん細胞がマクロファージにも曝露されたときに、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）の投与が、膵臓がん細胞（例えば、ＰＤＡＣ細胞）の増殖に対する著しい阻害をもたらすことが確認された。本発明者らはまた、標準治療薬物治療にＣＣＲ１アンタゴニストを含めることが、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）のマウスモデルにおけるマウスの生存期間を増加することを見出した。
【0009】
本発明による使用のためのＣＣＲ１アンタゴニストは、しばしば「標準治療」と称される治療などの、確立された治療レジメンと組み合わせて使用されるときに、膵臓がんの治療において特に有効である。そのような組み合わせは、以下でさらに詳細に考察される。好ましい実施形態では、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される１つ以上の化学療法剤と組み合わせた、膵臓がんの治療における使用のための、ＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物が提供される。
【0010】
ＣＣＲ１アンタゴニストは、さらに、またはあるいは、がん免疫療法剤（例えば、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤）と組み合わせて使用され得る。
【0011】
ＣＣＲ１アンタゴニストは、さらに、またはあるいは、ＭＥＫ阻害剤と組み合わせて使用され得る。
【0012】
ＣＣＲ１アンタゴニストは、さらに、またはあるいは、ＩＧＦ１Ｒ阻害剤と組み合わせて使用され得る。
【0013】
上記のように、本発明者らは、膵臓がん細胞（例えば、ＰＤＡＣ細胞）において発現されるＣＣＲ１のレベルと患者の予後との間に強い相関を見出した。したがって、本発明の治療は、一実施形態では、参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１発現を有すると特定された対象の治療である。
【0014】
上記のように、本発明者らは、免疫（例えば、マクロファージ）浸潤のレベルと患者の予後との間に強い相関を見出した。したがって、本発明の治療は、一実施形態では、参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤が特定された対象の治療である。いくつかの実施形態では、マクロファージは、Ｍ１マクロファージである。他の実施形態では、マクロファージは、Ｍ２マクロファージである。すなわち、適切には、本明細書で言及されるマクロファージ浸潤は、Ｍ１またはＭ２マクロファージ浸潤であると理解される。
【0015】
適切には、本発明の任意の態様に関するＣＣＲ１アンタゴニストは、ＵＣＢ－３５６２５、ＢＸ－４７１、ＡＺＤ－４８１８、およびＪ１１３８６３、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ＴＣＧＡヒト膵臓がんにおける免疫浸潤画分のｓｓＧＳＥＡ分析を示す。列は、個々の患者を表し、行は、種々の免疫細胞型を表す。
【図2】膵臓がん患者の層別化のためのＴＣＧＡ ＰＡＡＤ（膵臓がん）におけるマクロファージ浸潤のカプラン・マイヤー生存分析を示す。免疫スコア（Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｃｏｒｅ）対Ｍ１およびＭ２様マクロファージシグネチャーによって計算された膵臓がん患者の生存：しかしながら、免疫浸潤状態（免疫スコア）に従って膵臓がん患者において差次的な全生存は計算されなかった；低レベルのＭ１またはＭ２様マクロファージシグネチャーを有する膵臓がん患者においてより高い全生存が計算された（ｐ＝０．０１）。＊低＜３０パーセンタイル＜中＜７０パーセンタイル＜高。
【図3】マウスＰＤＡＣ間葉系細胞が、浸潤の３Ｄインビトロアッセイにおいて血管擬態を形成することを示す。細胞クラスターを形成するＰＤＡＣ上皮細胞とは対照的に、ＰＤＡＣ間葉系細胞は、１００％のｍａｔｒｉｇｅｌでプレコートされたプレート上で増殖するときに、血管擬態（ＶＭ）様構造を形成する。播種後９６時間で取得された血管構造の定量化（ｐ＝０．０１）。
【図4】ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍによって７日間にわたって画像化された３Ｄ細胞培養におけるｍＣｈｅｒｒｙ標識ＰＤＡＣ上皮および間葉系細胞と、ＺｓＧｒｅｅｎ標識初代骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を示す。それぞれＰＤＡＣ上皮およびＰＤＡＣ間葉系について６日目および４日目に取得された浸潤促進性表現型の代表的な画像および定量化。スケールバー、３００ミクロン。
【図5】以下を示す：Ａ）２Ｄ培養における単培養または混合ＰＤＡＣおよびＢＭＤＭ細胞の模式図と、下流のＲＮＡシーケンシング分析のためのその後の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）；Ｂ）ケモカインおよびその受容体は、ＢＭＤＭとの延長された共培養の後のＰＤＡＣトランスクリプトームにおいて最も高い差次的に発現される遺伝子に入る；およびＣ）ＢＭＤＭとの延長された共培養の後のＰＤＡＣ細胞におけるｑＲＴ－ＰＣＲによるＲＮＡシーケンシングデータの確認。
【図6】ＰＤＡＣ細胞浸潤を促進する新規のタンパク質標的を特定するために（プロテオーム）ＣＴＡＰ（アミノ酸前駆体を使用した細胞型特異的標識）標識された２Ｄ培養における単培養または混合ＰＤＡＣおよびＢＭＤＭ細胞の模式図を示す。単培養物および混合共培養物を、下流のプロテオームおよびセクレトーム分析のためにバルクで回収した。
【図7】図６のプロテオームアプローチの結果を示す。ＣＴＡＰ－ＴＭＴ（タンデム質量タグ）プロテオームは、ケモカインおよびその受容体を、ＢＭＤＭとの延長された共培養の後のＰＤＡＣにおいて最も高い差次的に発現される遺伝子に入るものとして明らかにする。
【図10】ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍによって７日間にわたって画像化された、ＣＣＲ１の種々の小分子阻害剤で処理した、３Ｄ細胞培養におけるｍＣｈｅｒｒｙ標識ＰＤＡＣ間葉系細胞と、ＺｓＧｒｅｅｎ標識ＢＭＤＭを示す。４日目に取得された代表的な画像および浸潤促進性表現型の定量化。スケールバー、３００ミクロン。下は、４日目に取得された浸潤促進性表現型の定量化である。
【図11】ｑＲＴ－ＰＣＲによる種々のＣＣＲ１アンタゴニストの存在下および非存在下でのＢＭＤＭとの共培養の後のＰＤＡＣ間葉系細胞における相対的ＣＣＲ１発現（ｍＲＮＡ）を示し、これは図１０において得られたデータと一致する。
【図12】種々のＣＣＲ１アンタゴニストの存在下および非存在下での延長された共培養の後のＰＤＡＣ細胞におけるＣＣＲ１発現（タンパク質）を示す。
【図14】ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍによって７日間にわたって画像化された３Ｄ細胞培養におけるｍＣｈｅｒｒｙ標識ＰＤＡＣ間葉系細胞のＺｓＧｒｅｅｎ標識ＢＭＤＭとの共培養の前のｓｉＲＮＡによるＣＣＲ１のノックダウンを示す。４日目に取得された浸潤促進性表現型の代表的な画像。
【図16】ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍによって７日間にわたって画像化された、ＣＣＲ１に結合する既知および新規のリガンドに対する種々の中和抗体で処理した、３Ｄ細胞培養におけるｍＣｈｅｒｒｙ標識ＰＤＡＣ間葉系細胞とＺｓＧｒｅｅｎ標識ＢＭＤＭを示す。４日目に取得された代表的な画像および浸潤促進性表現型の定量化。スケールバー、３００ミクロン。
【図17】以下についての、経時的な（例えば、７～３４日の）腫瘍体積を示す２つのグラフを示す：ｉ）ＰＤＡＣ細胞（Ｋ８４）単独、ｉｉ）ＰＤＡＣ細胞（Ｋ８４）＋ＣＣＲ１アンタゴニスト、ＢＸ４７１、ｉｉｉ）ＰＤＡＣ細胞（Ｋ８４）＋骨髄由来マクロファージ、およびｉｖ）ＰＤＡＣ細胞（Ｋ８４）＋ＣＣＲ１アンタゴニスト、ＢＸ４７１＋骨髄由来マクロファージ。
【図18】以下についての生存パーセンテージを示すグラフを示す：ｉ）ＰＤＡＣ細胞（Ｋ８４）単独、ｉｉ）ＰＤＡＣ細胞（Ｋ８４）＋ＣＣＲ１アンタゴニスト、ＢＸ４７１、ｉｉｉ）ＰＤＡＣ細胞（Ｋ８４）＋骨髄由来マクロファージ、およびｉｖ）ＰＤＡＣ細胞（Ｋ８４）＋ＣＣＲ１アンタゴニスト、ＢＸ４７１＋骨髄由来マクロファージ。
【図19】ＴＣＧＡ膵臓がん（ＰＡＡＤ）における免疫細胞高／低サンプルのＣＣＲ１発現を示す。各列は、それぞれの細胞型についてのサンプルの高および低への分岐ならびにグループにわたるＣＣＲ１発現を示す。
【図21】延長された共培養の後に最も変化したタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析が、ケモカイン関連生物学的プロセスのエンリッチメントを明らかにすることを示す。
【図22】実施例１の組み合わせたマクロファージ浸潤およびＣＣＲ１発現データのカプラン・マイヤー生存分析を通じて生成された経時的な生存率（％）を示すグラフを示す。
【図23】ＰＤＡＣ間葉系細胞におけるＩＧＦ１シグナル伝達経路の発現を示す。ＰＤＡＣ細胞からの総タンパク質（３０ｕｇ）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって分離した。ＩＧＦ１下流標的遺伝子の発現を、抗ＡＫＴ、４Ｅ－ＢＰ１、ＭＥＫおよびＭＡＰＫ抗体を用いたウエスタンブロット分析によって検出した。ＧＡＰＤＨを、すべてのサンプルのためのローディング対照として使用した。
【図24】ＩＧＦ１およびＢＸ－４７１の両方の組み合わせで処理されたサンプルと比較した、組換えＩＧＦ１で処理したサンプルにおける様々なキナーゼ活性について観察されたキナーゼ活性を推定するためのキナーゼセットエンリッチメント分析（ＫＳＥＡ）を使用して生成されたヒートマッププロットを示す。
【図25】ＰＤＡＣのＫＰＣマウスモデルを使用した、膵臓がんの治療におけるＣＣＲ１アンタゴニストＢＸ－４７１の有効性を決定するための研究計画を示す。使用した５つの実験コホートの説明ならびに治療条件および研究期間を示すタイムラインが含まれる。
【図26】コラーゲンＩＶ、免疫細胞（Ｈ＆ＥおよびＣＤ４５）、ならびにがん細胞（ＫＲＴ１９）について染色した、ＫＰＣマウス（ビヒクル、ＢＸ－４７１、ゲムシタビン、ゲムシタビン＋ＢＸ４７１、またはゲムシタビン＋抗ＰＤ１＋ＢＸ－４７１のいずれかで治療した）からの原発腫瘍の予備的なイメージングを示す。
【図27】以下で治療したＫＰＣマウスについての経時的な生存率（％）を示すグラフを示す：（ｉ）ビヒクル、（ｉｉ）ＢＸ－４７１、（ｉｉｉ）ゲムシタビン、（ｉｖ）ゲムシタビン＋ＢＸ４７１二重療法、または（ｖ）ゲムシタビン＋抗ＰＤ１＋ＢＸ－４７１三重療法。
【発明を実施するための形態】
【0017】
ＣＣＲ１アンタゴニスト
ＣＣＲ１遺伝子によってコードされるタンパク質である、ＣＣケモカイン受容体１型（ＣＣＲ１）は、シグナル伝達の媒介および炎症の部位へのエフェクター免疫細胞の動員における能動的な役割を果たすことが知られている受容体のファミリーである、ベータケモカイン受容体ファミリーのメンバーである。免疫応答を媒介することにおけるＣＣＲ１、ならびに他のケモカインファミリーメンバー（例えば、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５）の能動的な関与に起因して、ＣＣＲ１のいくつかの小分子アンタゴニスト、およびＣＣＲ１中和抗体が開発されており、自己免疫疾患および慢性炎症性疾患の治療において高度に有効であることが示されている。
ＣＣＲ１遺伝子によってコードされるタンパク質である、ＣＣケモカイン受容体１型（ＣＣＲ１）は、シグナル伝達の媒介および炎症の部位へのエフェクター免疫細胞の動員における能動的な役割を果たすことが知られている受容体のファミリーである、ベータケモカイン受容体ファミリーのメンバーである。免疫応答を媒介することにおけるＣＣＲ１、ならびに他のケモカインファミリーメンバー（例えば、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５）の能動的な関与に起因して、ＣＣＲ１のいくつかの小分子アンタゴニスト、およびＣＣＲ１中和抗体が開発されており、自己免疫疾患および慢性炎症性疾患の治療において高度に有効であることが示されている。
【0018】
自己免疫疾患および炎症性障害の治療におけるＣＣＲ１アンタゴニストの広範な使用にかかわらず、ＣＣＲ１アンタゴニストが、一般的に他の形態のがんよりも治療することがずっと挑戦的であると考えられている（膵臓がん患者の間での不良な生存率によって証明されている）、侵襲性形態の固形がんの治療のために有効な薬剤として使用されるという報告は非常に少ししか存在しない。
【0019】
米国特許出願第２０１７／０２９０８０８号は、特定のＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＣＣＲ１の小分子アンタゴニスト）とＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤との特定の組み合わせが、例えば、トリプルネガティブ乳がん転移などの、乳がん転移の治療において有用であり得ることを報告している。しかしながら、ＵＳ２０１７／０２９０８０８には、ＣＣＲ１アンタゴニストが、例えば、膵臓がんなどの、より侵襲性形態のがんを治療するために使用され得ることを支持するか、または推察する理由を与えるデータも、原発がんの治療におけるＣＣＲ１アンタゴニストの使用を支持するデータも含まれていない。さらに、膵臓がん細胞は、典型的には、多くの他の形態の固形腫瘍よりも高い量のコラーゲンおよび／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を有することから、膵臓がんは、一般的に、構造的に異なる形態の固形がんとみなされている（Ｗｅｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ，２０１９，１０（９），３１６）。すなわち、膵臓がん細胞において典型的に見出される高レベルのコラーゲンおよび／またはＥＣＭは、膵臓がん細胞への化学療法剤の接近を制限し、これは、今度は、多くの化学療法剤が膵臓がんの治療において有効に使用され得ないことを意味する。
【0020】
ＵＳ２００９／０２８６８２３において、特定のＣＣＲ１阻害剤が、多発性骨髄腫および他の障害の治療のために有用であることが報告されている。膵臓がんは、阻害剤がそのために有用であり得ると著者らが推測するがんのリストにおいて言及されている。そこに記載される化合物が、単独でまたはいずれかの他の療法との組み合わせで膵臓がんの治療において有効であろうという何らかの示唆を支持するデータは提供されていない。
【0021】
ＵＳ２０１３／０２８０２５４において、ＣＣＲ１受容体の、特定のアンタゴニストとの拮抗作用が、患者における腫瘍の転移を抑制し得ることが報告されている。膵臓がんは、アンタゴニストがそのために有用であり得ると著者らが推測するがんのリストにおいて言及されている。そこに記載される化合物が単独でまたはいずれかの他の療法との組み合わせで膵臓がんの治療において有効であろうという何らかの示唆を支持するデータは提供されていない。
【0022】
上記のように、本発明者らは、特に他の治療と組み合わせて使用されるときに、ＣＣＲ１のアンタゴニストが膵臓がんを治療することにおいて有効であることを見出した。
【0023】
「ＣＣＲ１アンタゴニスト」という用語は、ケモカイン受容体ＣＣＲ１およびそのリガンドのうちのいずれか１つの相互作用に拮抗する薬剤（例えば、小分子またはＣＣＲ１中和抗体）を意味すると理解される。すなわち、ＣＣＲ１アンタゴニストは、通常、ＣＣＲ１の、そのリガンドのうちの１つとの相互作用によってトリガーされるプロセスのうちの１つ以上を阻害することができる。適切には、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＩＬ１Ｂ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣｌ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２０および／またはＣＣＬ２３リガンドの相互作用に拮抗する薬剤である。最も適切には、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＩＬ１Ｂ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ９および／またはＣＣＬ２３リガンド、例えば、ＣＣＬ９リガンドの相互作用に拮抗する薬剤である。
【0024】
特定の実施形態では、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＣＣＲ１中和抗体である。ＣＣＲ１中和抗体の例は、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から入手可能な抗体ＩｇＧ１（クローン１４１－２）である。当該技術分野で知られている方法を使用してさらなる抗体が実現され得ることが理解される。
【0025】
本発明者らは、ＣＣＲ１アンタゴニストが、非がん性細胞に対する最小の有害な効果を伴うことを見出した。ＣＣＲ１アンタゴニスト（ＢＸ４７１）で処理された線維芽細胞およびマクロファージは、ビヒクル対照で処理された細胞と同じように生存可能であるようであることが観察された。したがって、ヒト対象におけるそれらの使用は、多くの他のがん治療よりも、少なく重度の低い副作用を伴うことが予想される。
【0026】
好ましくは、ＣＣＲ１アンタゴニストは、例えば、本明細書中下記のものなどの、小分子アンタゴニストである。適切には、ＣＣＲ１アンタゴニストは、最大１０００Ｄａの分子量を有する小分子ＣＣＲ１アンタゴニストである。最も適切には、ＣＣＲ１アンタゴニストは、２５０Ｄａ～５５０Ｄａの分子量を有する小分子ＣＣＲ１アンタゴニストである。
【0027】
特定の実施形態では、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＢＬ－５９２３、ＵＣＢ－３５６２５、ＢＸ－４７１、ＢＩ－６３８６８３、ＢＩ－６３９６６７、ＰＳ－０３１２９１、ＭＬＮ－３７０１、ＡＺＤ－４８１８、ＡＺＤ－０４９２、ＭＬＮ－３８９７、ＣＰ－４８１７１５、Ｆ－１８－ＣＣＲ１、ＡＯＰ－ＲＡＮＴＥＳ、ＰＳ－３７５１７９、Ｊ１１３８６３、ＮＳＣ－６５１０１６、およびＢＡＹ－８６５０４７、ＢＭＳ－８１７３９９、Ｃ－４４６２およびＣＣＸ－３５４、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される（例えば、ＢＬ－５９２３、ＵＣＢ－３５６２５、ＢＸ－４７１、ＢＩ－６３８６８３、ＢＩ－６３９６６７、ＰＳ－０３１２９１、ＭＬＮ－３７０１、ＡＺＤ－４８１８、ＡＺＤ－０４９２、ＭＬＮ－３８９７、ＣＰ－４８１７１５、Ｆ－１８－ＣＣＲ１、ＡＯＰ－ＲＡＮＴＥＳ、ＰＳ－３７５１７９、Ｊ１１３８６３およびＮＳＣ－６５１０１６、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される）。適切には、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＢＬ－５９２３、ＵＣＢ－３５６２５、ＢＸ－４７１、ＢＩ－６３８６８３、ＢＩ－６３９６６７、ＰＳ－０３１２９１、ＡＺＤ－４８１８、ＡＺＤ－０４９２、ＰＳ－３７５１７９、Ｊ１１３８６３およびＮＳＣ－６５１０１６、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される。より適切には、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＵＣＢ－３５６２５、ＢＸ－４７１、ＢＩ－６３９６６７、ＡＺＤ－４８１８、ＡＺＤ－０４９２、およびＪ１１３８６３、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される。さらにより適切には、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＢＸ－４７１、ＢＩ－６３９６６７、Ｊ１１３８６３、ＡＺＤ－４８１８もしくはＡＺＤ－０４９２またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される。さらにより適切には、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＢＸ－４７１、ＢＩ－６３９６６７、Ｊ１１３８６３もしくはＡＺＤ－０４９２またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される。最も適切には、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＢＸ－４７１、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物である。
【0028】
特定の実施形態では、ＣＣＲ１アンタゴニストは、以下のＣＣＲ１アンタゴニスト：ＵＣＢ－３５６２５、ＢＸ－４７１およびＪ１１３８６３、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物のうちの１つから選択される。
【0029】
例えば、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＷＯ０３／０３５６２７および／またはＵＳ２００３／０１０９５３４に記載されるタイプのピペラジンベースのＣＣＲ１アンタゴニストである。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＣＲ１アンタゴニストは、以下に示される式（Ｉ）の化合物：
（式中、
ｎは、１、２または３から選択される整数であり、
Ｒ１００は、アルキルまたはヒドロキシアルキルから選択される置換基であり、
Ｒ２００は、４位がクロロ基で置換され、２位がアミノカルボニル、ウレイドまたはグリシンアミド基で置換されたフェニル基である）、
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物である。
【化1】
ｎは、１、２または３から選択される整数であり、
Ｒ１００は、アルキルまたはヒドロキシアルキルから選択される置換基であり、
Ｒ２００は、４位がクロロ基で置換され、２位がアミノカルボニル、ウレイドまたはグリシンアミド基で置換されたフェニル基である）、
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物である。
【0030】
例えば、ＣＣＲ１アンタゴニストは、以下に示される、ＢＸ－４７１（（２Ｒ）－１－［［２－［（アミノカルボニル）アミノ］－４－クロロフェノキシ］アセチル］－４－［（４－フルオロフェニル）メチル］－２－メチルピペラジン）：
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物である。
【化2】
【0031】
例えば、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＷＯ２００８／１０３１２６に記載されるようなスピロ環式ピペリジンベースのＣＣＲ１アンタゴニストである。すなわち、いくつかの実施形態では、ＣＣＲ１アンタゴニストは、以下に示される式（ＩＩ）の化合物：
（式中、
ｍは、１であり、
ｔは、１であり、
Ｒ１は、ハロゲンであり、
Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、結合、－Ｏ－または－ＣＨ２－であり、ただし、Ｘ、ＹおよびＺのうちの１つのみが結合であり、
Ｒ２は、任意選択でヒドロキシルおよびカルボキシルから独立して選択される１つ以上の置換基によって置換された、Ｃ１－６アルコキシであり、
Ｒ３は、ハロゲンであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素およびＣ１－６アルキルから独立して選択される）
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物である。
【化3】
ｍは、１であり、
ｔは、１であり、
Ｒ１は、ハロゲンであり、
Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、結合、－Ｏ－または－ＣＨ２－であり、ただし、Ｘ、ＹおよびＺのうちの１つのみが結合であり、
Ｒ２は、任意選択でヒドロキシルおよびカルボキシルから独立して選択される１つ以上の置換基によって置換された、Ｃ１－６アルコキシであり、
Ｒ３は、ハロゲンであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素およびＣ１－６アルキルから独立して選択される）
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物である。
【0032】
例えば、ＣＣＲ１アンタゴニストは、以下に示される、ＡＺＤ－４８１８（（２－［２－クロロ－５－［（２Ｓ）－３－（５－クロロスピロ［ベンゾフラン－２（３Ｈ），４’－ピペリジン］－１’－イル）－２－ヒドロキシプロポキシ］－４－［（メチルアミノ）カルボニル］フェノキシ］－２－メチルプロパン酸）：
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物である。
【化4】
【0033】
例えば、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＥＰ０９１６６６８Ａ１に記載されるような２，７－ジクロロ－９Ｈ－キサンテン－９－イルベースのＣＣＲ１アンタゴニストである。すなわち、いくつかの実施形態では、ＣＣＲ１アンタゴニストは、以下に示される式（ＩＩＩ）の化合物：
（式中、
Ｒ１０およびＲ２０は、水素原子、ハロゲン原子またはＣ１－６アルカリ原子から独立して選択され、
Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－または－ＣＨ２－であり、
Ｑは、アニオン（例えば、Ｃｌ－、Ｂｒ－またはＩ－）であり、
Ｒ３０は、シクロオクチルメチル基、シクロノニルメチル基、１－デカリルメチル基、２－デカリルメチル基、（１－シクロオクテニル）メチル基または（１－シクロノネニル）メチル基であり、
Ｒ４０は、メチル、エチル、プロピルまたはアリルから選択される）
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物である。
【化5】
Ｒ１０およびＲ２０は、水素原子、ハロゲン原子またはＣ１－６アルカリ原子から独立して選択され、
Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－または－ＣＨ２－であり、
Ｑは、アニオン（例えば、Ｃｌ－、Ｂｒ－またはＩ－）であり、
Ｒ３０は、シクロオクチルメチル基、シクロノニルメチル基、１－デカリルメチル基、２－デカリルメチル基、（１－シクロオクテニル）メチル基または（１－シクロノネニル）メチル基であり、
Ｒ４０は、メチル、エチル、プロピルまたはアリルから選択される）
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物である。
【0034】
例えば、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＥＰ０９１６６６８Ａ１に記載されるような２，７－ジクロロ－９Ｈ－キサンテン－９－イルベースのＣＣＲ１アンタゴニストである。すなわち、いくつかの実施形態では、ＣＣＲ１アンタゴニストは、以下に示される式（ＩＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物である：
（式中、Ｒ１０、Ｒ２０、Ｘ、Ｑ、Ｒ３０およびＲ４０は、上記で定義されたとおりである）。
【化6】
【0035】
例えば、ＣＣＲ１アンタゴニストは、以下に示される、Ｊ１１３８６３（１，４－ｃｉｓ－１－（１－シクロオクテン－１－イルメチル）－４－［［（２，７－ジクロロ－９Ｈ－キサンテン－９－イル）カルボニル］アミノ］－１－エチルピペリジニウムヨージド）：
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物である。
【化7】
【0036】
本発明は、本明細書に記載されるＣＣＲ１アンタゴニストのすべての薬学的に許容される塩を包含する。本発明のＣＣＲ１アンタゴニストの適切な薬学的に許容される塩は、例えば、十分に塩基性である本発明の化合物の酸付加塩、例えば、無機酸または有機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ギ酸、クエン酸 メタンスルホン酸またはマレイン酸を有する酸付加塩である。加えて、十分に酸性である本発明のＣＣＲ１アンタゴニストの適切な薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウムもしくはカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウムもしくはマグネシウム塩、アンモニウム塩または薬学的に許容されるカチオンを与える有機塩基を有する塩、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリンもしくはトリス－（２－ヒドロキシエチル）アミンを有する塩である。
【0037】
本発明はまた、１つ以上の同位体置換を含む本明細書で規定される本発明のＣＣＲ１アンタゴニストを包含する。例えば、Ｈは、１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、および３Ｈ（Ｔ）を含む、任意の同位体形態であり得、Ｃは、１２Ｃ、１３Ｃ、および１４Ｃを含む、任意の同位体形態であり得、Ｏは、１６Ｏおよび１８Ｏを含む、任意の同位体形態であり得る、など。
【0038】
本発明の特定のＣＣＲ１アンタゴニストは、例えば、水和形態などの溶媒和形態ならびに非溶媒和形態で存在し得ることもまた理解される。本発明は、抗がん活性を有するすべてのそのような溶媒和形態を包含することが理解される。
【0039】
特定のＣＣＲ１アンタゴニストは、多形を示し得ること、および本発明は、抗がん活性を有するすべてのそのような形態を包含することもまた理解される。
【0040】
ＣＣＲ１アンタゴニストはまた、ヒトまたは動物の身体中で分解されて、本発明のＣＣＲ１アンタゴニストを放出するプロドラッグの形態で投与され得る。プロドラッグは、ＣＣＲ１アンタゴニストの物理的特質および／または薬物動態学的特質を変化させるために使用され得る。プロドラッグは、ＣＣＲ１アンタゴニストが、それに特質修飾基が結合され得る適切な基または置換基を含有するときに形成され得る。プロドラッグの例には、ＣＣＲ１アンタゴニスト中のカルボキシ基またはヒドロキシ基で形成され得るインビボで切断可能なエステル誘導体、およびＣＣＲ１アンタゴニスト中のカルボキシ基またはアミノ基で形成され得るインビボで切断可能なアミド誘導体が含まれる。
【0041】
治療の方法
本発明は、膵臓がんの治療を必要とする対象において膵臓がんを治療する方法であって、当該方法は、当該対象に治療有効量のＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物、またはその医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
本発明は、膵臓がんの治療を必要とする対象において膵臓がんを治療する方法であって、当該方法は、当該対象に治療有効量のＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物、またはその医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【0042】
「治療する」または「治療」への言及は、予防ならびに状態の確立された症状の軽減を含むことが理解される。したがって、健康状態、障害または状態を「治療する」またはその「治療」には、（１）健康状態、障害または状態に罹患している可能性があるかまたはその素因があり得るが、健康状態、障害または状態の臨床的または準臨床的症状をまだ経験していないかまたは呈していないヒトにおいて発達する健康状態、障害または状態の臨床的症状の出現を防止するかまたは遅延させること、（２）健康状態、障害または状態を阻害すること、すなわち、疾患の発達またはその再発（維持治療の場合）またはその少なくとも１つの臨床的もしくは準臨床的症状を停止、低下または遅延させること、あるいは（３）疾患を和らげるかまたは減弱すること、すなわち、健康状態、障害もしくは状態またはその臨床的もしくは準臨床的症状のうちの少なくとも１つの退行を引き起こすことが含まれる。
【0043】
膵臓がんの治療を必要とする対象において本発明による膵臓がんを治療する方法は、それが、しばしば「標準治療」と称される治療などの、確立された治療レジメンと組み合わせて実施されるときに、膵臓がんの治療において特に有効である。そのような組み合わせは、以下でさらに詳細に考察される。好ましい実施形態では、膵臓がんを治療する方法であって、当該対象に治療有効量のＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物、またはその医薬組成物を、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される１つ以上の化学療法剤と組み合わせて投与することを含む、方法が提供される。
【0044】
ＣＣＲ１アンタゴニストは、さらに、またはあるいは、がん免疫療法剤（例えば、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤）と組み合わせて使用され得る。
【0045】
ＣＣＲ１アンタゴニストは、さらに、またはあるいは、ＭＥＫ阻害剤と組み合わせて使用され得る。
【0046】
上記のように、本発明者らは、膵臓がん細胞（例えば、ＰＤＡＣ細胞）において発現されるＣＣＲ１のレベルと患者の予後との間に強い相関を見出した。したがって、本発明の治療の方法は、一実施形態では、参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１発現を有すると特定された対象において膵臓がんを治療する方法である。
【0047】
上記のように、本発明者らは、免疫（例えば、マクロファージ）浸潤のレベルと患者の予後との間に強い相関を見出した。したがって、本発明の治療の方法は、一実施形態では、参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤が特定された対象において膵臓がんを治療する方法である。
【0048】
また本明細書で言及されるように、本発明者らは、バイオマーカーＰＩＭ３、ＧＳＫ３Ｂ、ＡＴＫ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ５、ＭＡＰＫ１４、ＭＴＯＲ、ＭＡＰＫ３、ＣＡＭＫ２Ａ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰＫ８、ＰＲＫＡＣＡ、ＳＲＣ、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＭＡＰＫ１およびＰＲＫＣＡのレベルと不良な患者の予後との間の相関を見出した。ＡＫＴ／ＭＡＰＫ経路におけるこれらのキナーゼおよび遺伝子は、一般に多発がんにおける不良な予後と関連している。したがって、本発明の治療の方法は、一実施形態では、ＰＩＭ３、ＧＳＫ３Ｂ、ＡＴＫ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ５、ＭＡＰＫ１４、ＭＴＯＲ、ＭＡＰＫ３、ＣＡＭＫ２Ａ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰＫ８、ＰＲＫＡＣＡ、ＳＲＣ、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＭＡＰＫ１およびＰＲＫＣＡから選択される少なくとも１つのバイオマーカーの増加したレベルが特定された対象において膵臓がんを治療する方法である。
【0049】
「治療有効量」は、疾患を治療するために哺乳動物に投与されたときに、疾患のためにそのような治療をもたらすのに十分である化合物の量を意味する。「治療有効量」は、化合物、疾患およびその重症度、治療される哺乳動物の年齢、体重など、ならびに／または画像化および／もしくはスキャンされた腫瘍のサイズに応じて変動する。適切には、「治療有効量」は、画像化および／またはスキャンされた腫瘍のサイズに応じて変動する。医師は、上記で概要を述べた要因（例えば、画像化および／またはスキャンされた腫瘍のサイズ）を考慮して、「治療有効量」を決定するように適切に資格を与えられる。以下に記載される現在の標準治療は、それらに伴う確立された最良の投薬レジメンを有しており、これらはまた、治療が組み合わせて使用されるときに適切である。
【0050】
本発明の「対象」は、ヒトおよび／または動物の対象を意味すると理解される。
【0051】
「膵臓がん」という用語は、膵臓のがんのすべての形態を包含することが理解される。すなわち、膵臓がんは、外分泌腺のがん（例えば、膵管腺がん）および／または内分泌腺のがん（例えば、膵神経内分泌腫瘍）であり得る。「膵臓がん」という用語はまた、身体における他所（例えば、肝臓、腹膜、肺、副腎および骨）を起源とする悪性腫瘍から膵臓に広がったがんを包含し得ることもまた理解される。
【0052】
膵臓がんは、典型的には、身体内のがんのサイズおよび位置によって分類される。ステージ１の膵臓がんは、膵臓がんの最も早期の形態であり、がん細胞が優勢に膵臓内に含有されている状況を記述する。ステージ１の膵臓がんはしばしば、早期の、局在性のまたは切除可能な膵臓がんと称される（これは、がんがしばしば外科手術によって除去され得るという事実を指す）。ステージ２の膵臓がんは、がん細胞が膵臓から、例えば、十二指腸、胆管、または膵臓を直接取り囲んでいる組織に広がったときに使用される記述語である。ステージ２の膵臓がんのいくつかの形態は、切除可能である。ステージ３の膵臓がんは、がん細胞が膵臓から胃、脾臓、大腸、または膵臓近くの大血管に広がったときに使用される記述語である。ステージ３の膵臓がんは、しばしば切除可能でない。ステージ４の膵臓がんは、がん細胞が膵臓から肺、肝臓または腹膜などの身体の部分に広がったときに使用される記述語である。ステージ４の膵臓がんは、切除不能である。
【0053】
特定の実施形態では、膵臓がんは、ステージ３またはステージ４の膵臓がん、適切には、ステージ４の膵臓がんである。
【0054】
さらなる実施形態では、膵臓がんは、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）、適切には、ステージ４の膵管腺がん（ＰＤＡＣ）である。
【0055】
膵臓がんの治療における使用のためのＣＣＲ１アンタゴニストの有効量は、膵臓がんの増殖性を治療、予防もしくは治癒する、その進行を遅らせる、かつ／または膵臓がんに関連する症状を低下させるのに十分な量であることが理解される。
【0056】
１つ以上の賦形剤と組み合わされて、単回剤形を生じさせる有効成分（例えば、ＣＣＲ１アンタゴニスト）の量は、治療される個体および特定の投与経路に応じて必然的に変動する。例えば、ヒトへの経口投与のために意図される製剤は、一般的に、全組成物の約５～約９８重量パーセントで変動し得る適切で好都合な量の賦形剤と配合された、例えば、０．５ｍｇ～０．５ｇの活性剤（より適切には、０．５～１００ｍｇ、例えば、１～３０ｍｇ）を含有する。
【0057】
ＣＣＲ１アンタゴニストの治療（または予防）目的のための用量のサイズは、よく知られている医学の原則に従って、状態の性質および重症度、動物または患者の年齢および性別ならびに投与経路に従って当然に変動する。
【0058】
膵臓がんの治療のためにＣＣＲ１アンタゴニストを使用するときに、分割用量で必要とされるとすると、それは一般的に、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～７５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の１日用量が与えられるように投与される。一般に、非経口経路が用いられるときは、より低い用量が投与される。したがって、例えば、静脈内または腹腔内投与については、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量が一般的に使用される。同様に、吸入による投与については、例えば、０．０５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量が使用される。経口投与（特に錠剤形態での）もまた適切であり得る。典型的には、単位剤形は、約０．５ｍｇ～０．５ｇのＣＣＲ１アンタゴニストを含有する。
【0059】
膵臓がん患者の診断：
対象における膵臓がんの診断において、ＣＣＲ１の発現レベルは、当該技術分野で知られている任意の適切な手段によって決定され得る。例えば、ＣＣＲ１の発現のレベルは、ＣＣＲ１タンパク質レベルを測定することによって決定され得る。ＣＣＲ１タンパク質レベルは、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと、それに続く、標的タンパク質に対して惹起された適切な抗体を使用するウエスタンブロット、プロテオミクスによる、メンブレンスポットアレイ、または免疫組織化学（ＩＨＣ）方法によるなどの、当該技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して測定され得る。加えて、またはあるいは、ＣＣＲ１の発現のレベルは、ｍＲＮＡのレベルを測定することによって決定され得る。ｍＲＮＡのレベルは、例えば、ノーザンブロット、イメージングマスサイトメトリー（ＩＭＣ）、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）、シングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）または定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）などの、当該技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して測定され得る。分析は、対象から取得された生検に対して実施され得る。各々の場合で、サンプルにおいて測定されたレベルは、参照発現レベルと比較され得る。
対象における膵臓がんの診断において、ＣＣＲ１の発現レベルは、当該技術分野で知られている任意の適切な手段によって決定され得る。例えば、ＣＣＲ１の発現のレベルは、ＣＣＲ１タンパク質レベルを測定することによって決定され得る。ＣＣＲ１タンパク質レベルは、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと、それに続く、標的タンパク質に対して惹起された適切な抗体を使用するウエスタンブロット、プロテオミクスによる、メンブレンスポットアレイ、または免疫組織化学（ＩＨＣ）方法によるなどの、当該技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して測定され得る。加えて、またはあるいは、ＣＣＲ１の発現のレベルは、ｍＲＮＡのレベルを測定することによって決定され得る。ｍＲＮＡのレベルは、例えば、ノーザンブロット、イメージングマスサイトメトリー（ＩＭＣ）、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）、シングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）または定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）などの、当該技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して測定され得る。分析は、対象から取得された生検に対して実施され得る。各々の場合で、サンプルにおいて測定されたレベルは、参照発現レベルと比較され得る。
【0060】
免疫（例えば、マクロファージ）浸潤は、当該技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して決定され得ることが理解される。マクロファージ浸潤レベルを決定するための可能な技術の非限定的なリストには、免疫蛍光（ＩＦ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、イメージングマスサイトメトリー（ＩＭＣ）、フローサイトメトリー、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）、シングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）またはプロテオミクスが含まれる。
【0061】
試験スコアは、免疫スコアメトリック（本明細書中下記の実施例の節に記載されるような）を発現レベルデータに適用することによって計算され得る。適切には、免疫スコアは、単一サンプル遺伝子セットエンリッチメント分析（ｓｓＧＳＥＡ）を発現データに対して用いて、正規化されたエンリッチメントスコア（ＮＥＳ）を計算することによって計算される。最も適切には、免疫スコアは、単一サンプル遺伝子セットエンリッチメント分析（ｓｓＧＳＥＡ）ベースの方法である「発現データを使用した悪性腫瘍におけるストローマ細胞および免疫細胞の推定」（”Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＴｒｏｍａｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｕｍｏｕｒｓ ｕｓｉｎｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ”）（ＥＳＴＩＭＡＴＥ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，２０１３，４（２６１２），１－１１）を発現データに対して用いることによって計算される。
【0062】
事前に決定された閾値スコアは、膵臓がん患者の参照サンプルセットから生成された事前に決定された免疫スコアを表す。適切には、事前に決定された閾値スコアは、ステージＩＶの膵臓がん（ＰＤＡＣ）患者の参照サンプルセットから生成された事前に決定された免疫スコアを表す。
【0063】
事前に決定された閾値スコアは、当該技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して導き出され得る。適切には、事前に決定された閾値スコアは、膵臓がん患者の参照サンプルセットからの発現データから導き出される。参照サンプルセットは、例えば、それについての発現データが生成されている膵臓がん患者（例えば、ステージＩＶの膵臓がん患者）のサンプルであり得る。適切な参照サンプルセットの非限定的な例には、例えば、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）、または同様のデータベース（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＩＣＤＣ）、ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｒｅおよびＱｕｅｅｎｓｌａｎｄ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＱＣＭＧ）のデータベース）で利用可能である膵臓がん患者（例えば、ステージＩＶの膵臓がん患者）についての発現データが含まれる。したがって、事前に決定された閾値スコアは、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）から利用可能である膵臓がん患者（例えば、ステージＩＶの膵臓がん患者）からの発現データを使用して、単一サンプル遺伝子セットエンリッチメント分析（ｓｓＧＳＥＡ）ベースの方法である「発現データを使用した悪性腫瘍におけるストローマ細胞および免疫細胞の推定」（ＥＳＴＩＭＡＴＥ）を当該発現データに対して用いることによって生成され得る。
【0064】
適切には、事前に決定された閾値スコアは、参照サンプルセットから生成された免疫スコアの２５パーセンタイルに対応する免疫スコアである。
【0065】
適切には、方法は、試験スコア（例えば、免疫スコア）が、参照サンプルセットから生成された免疫スコア（すなわち、事前に決定された閾値スコア）の２５パーセンタイルよりも大きい場合に対象を治療することを含む。
【0066】
例えば、治療を必要とする対象は、膵臓がんと診断され、以下のうちの１つ以上を有すると特定された対象である：
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１の発現、
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤、
高レベルのＭＹＣ発現および／もしくはＭＹＣがん遺伝子の変異、
ＳＭＡＤ４変異、ならびに／または
古典的なモフィットの腫瘍ＲＮＡサブタイプ。
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１の発現、
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤、
高レベルのＭＹＣ発現および／もしくはＭＹＣがん遺伝子の変異、
ＳＭＡＤ４変異、ならびに／または
古典的なモフィットの腫瘍ＲＮＡサブタイプ。
【0067】
本明細書で使用される「ＭＹＣ」という用語は、ＭＹＣ遺伝子ファミリー内に入る調節遺伝子（転写因子）のファミリー全体を意味すると理解される。ＭＹＣ転写因子ファミリーのメンバーには、ｃ－ＭＹＣ、ＭＹＣＮおよびＭＹＣＬが含まれ、したがって、本明細書における「ＭＹＣ」への言及は、そのようなファミリーメンバーのすべてをカバーすると理解される。ＭＹＣ調節遺伝子は、細胞増殖、成長、分化およびアポトーシスに関与する転写因子のファミリーをコードする。正常なＭＹＣ遺伝子の活性化は、細胞周期進行、細胞の増殖および分裂、代謝、テロメラーゼ活性、接着および運動性、血管新生および分化を含む、多数の細胞プロセスに影響する。ＭＹＣは、強いがん原遺伝子として同定されており、その変異バージョンは、血液がんおよび固形腫瘍悪性腫瘍などの、特定の型のがんにおいてアップレギュレートされる、かつ／または構成的に発現されることがしばしば見出される（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０１２，１８（２０），５５４６－５５５３）。したがって、膵臓がんと診断され、高いＭＹＣ発現および／またはＭＹＣがん遺伝子の突然変異を有すると特定された対象は、膵臓がんのための標準治療に対してより悪く応答する対象である可能性があり、したがって、より不良な無増悪生存率を有する可能性がある。
【0068】
膵臓がんにおける重要な遺伝子変化は、ＳＭＡＤ４変異であり、これは、ＳＭＡＤ４タンパク質発現の喪失を導く。ＳＭＡＤ４は、膵臓がん症例の５０％超において不活化されている腫瘍抑制遺伝子である。多くの研究は、ＳＭＡＤ４発現の喪失が膵臓がん患者における不良な予後と正に関連することを示している（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌ．Ｏｎｃｏｌ．２０１６，９（１），１－７）。したがって、膵臓がんと診断され、ＳＭＡＤ４変異を有すると特定された対象は、より高い必要性およびより不良な無増悪生存率を有する可能性がある対象である。
【0069】
併用療法
本発明の重要な態様では、膵臓がんの治療における使用のための、１つ以上の標準的な膵臓がん治療レジメンと組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物または水和物が提供される。
本発明の重要な態様では、膵臓がんの治療における使用のための、１つ以上の標準的な膵臓がん治療レジメンと組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト、その薬学的に許容される塩、溶媒和物または水和物が提供される。
【0070】
１つ以上の標準的な膵臓がん治療レジメンは、膵臓がんを治療するために一般に用いられる任意の適切な治療レジメン（すなわち、膵臓がんのための「標準治療」）であり得ることが理解される。適切には、１つ以上の標準的な膵臓がん治療レジメンは、外科手術、放射線療法、化学療法、免疫療法およびそれらの組み合わせから選択される。より適切には、標準的な膵臓がん治療レジメンは、外科手術、化学療法または免疫療法およびそれらの組み合わせから選択される。最も適切には、標準的な膵臓がん治療レジメンは、化学療法ならびに任意選択で外科手術および免疫療法から選択される１つ以上の追加の治療レジメンを含む。
【0071】
早期膵臓がん（ステージＩまたはＩＩ）と診断された膵臓がん患者については、標準的な膵臓がん治療レジメンは、外科手術ならびに任意選択で化学療法および免疫療法から選択される１つ以上の追加の治療レジメンを含む。例えば、英国国立臨床評価機構は、非転移性またはそうでなければ十分に「局所進行性」でないものについて、膵臓がんが外科手術とそれに続く補助化学療法によって治療されることを推奨している。第１の推奨は、ゲムシタビン＋カペシタビンの組み合わせを６治療サイクルであり、この併用療法が許容されない場合は、ゲムシタビン単独である。
【0072】
後期膵臓がん（ステージＩＩＩまたはＩＶ）と診断された膵臓がん患者については、標準的な膵臓がん治療レジメンは、化学療法ならびに任意選択で外科手術および免疫療法から選択される１つ以上の追加の治療レジメンを含む。例えば、英国国立臨床評価機構は、局所進行性または転移性膵臓がんについて、それが化学療法または化学放射線療法によって治療されることを推奨している。局所進行性膵臓がんについては、第１の推奨は、全身的併用化学療法（例えば、以下で考察されるＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸの組み合わせ）である。組み合わせが許容されない場合は、ゲムシタビン単独である。化学放射線療法が使用される場合は、カペシタビンが与えられるべきである。ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸのバリアントは、ｍＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸであり、これは、フルオロウラシルの初期注射／ボーラスを有さず、イリノテカンレベルは１５０ｍｇ／ｍ２に減少されている。米国における膵臓がんのための米国診療ガイドラインによって推奨される、さらなる治療オプションは、新規の阻害剤、例えば、エルロチニブ、カペシタビンまたはタキサン（ドセタキセルなど）を含む。
【0073】
転移性膵臓がんについては、第１の推奨は、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸでの治療である（これは、最良の生存統計を有するが、最も低く許容される）。ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸが許容されない場合は、ゲムシタビン＋ｎａｂ－パクリタキセルが与えられるべきである。いずれの組み合わせも許容されない場合は、ゲムシタビン単独が与えられるべきである。米国における膵臓がんのための米国診療ガイドラインによって推奨される、さらなる治療オプションは、さらなる新規の薬剤であるペムブロリズマブ、ラロトレクチニブまたはエヌトレクチニブを加えることを含む。
【0074】
転移性の第２選択の療法は、ゲムシタビンベースのレジメン（第１選択のＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸの後）、またはオキサリプラチンベースのレジメン（他の第１選択の組み合わせの後）である。イリノテカン＋フルオロウラシル＋フォリン酸のナノリポソームの組み合わせは、欧州臨床腫瘍学会（ＥＳＭＯ）の診療ガイドラインにおける第２選択の療法として推奨されている（第１選択のゲムシタビンベースの療法の後）。米国における膵臓がんのための米国診療ガイドラインによって推奨される、さらなる治療オプションは、カペシタビンまたはフルオロウラシル単独、およびさらなる新規の薬剤であるペムブロリズマブ、ラロトレクチニブまたはエヌトレクチニブを加えることを含む。
【0075】
外科手術は、腫瘍の全体または一部を除去するための医師による外科的介入であり得る。
【0076】
放射線療法は、電離放射線を利用する任意の形態の治療であり得る。適切な放射線療法治療の非限定的な例には、例えば、外照射療法（ＥＢＲＴ）、定位放射線照射（ＳＴＲＳ）および遠隔照射治療が含まれる。
【0077】
化学療法は、１つ以上の抗腫瘍（抗がん）剤の投与による治療であり得る。上記のように、膵臓がんの治療に適切な抗腫瘍剤の非限定的な例には、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（ロイコボリンカルシウム、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩およびオキサリプラチン）ならびにＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））が含まれる。
【0078】
ゲムシタビン、５－フルオロウラシル、およびカペシタビンは、ピリミジンアンタゴニストである（ときおり広く代謝拮抗剤としても分類される）。
【0079】
免疫療法（がん免疫療法）は、患者の免疫系を活用する任意の形態の治療であり得る。適切な免疫療法治療の非限定的な例には、例えば、モノクローナル抗体（ＭＡＢ）、予防接種、サイトカイン、およびＣＡＲ－Ｔ細胞のうちの１つまたは複数を利用する治療が含まれる。適切には、免疫療法（がん免疫療法）は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤および／またはＰＤ－１阻害剤の投与を含む。適切なＰＤ－１阻害剤の非限定的な例には、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ＩＢＩ－３０８、ｍＤＸ－４００、ＢＧＢ－１０８、ＭＥＤＩ－０６８０、ＳＨＲ－１２１０、ＰＦ－０６８０１５９１、ＰＤＲ－００１、ＧＢ－２２６およびＳＴＩ－１１１０が含まれる。適切なＰＤ－Ｌ１阻害剤の非限定的な例には、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、ＡＬＮ－ＰＤＬ、ＴＳＲ－０４２、ＫＤ－０３３、ＣＡ－１７０、ＳＴＩ－１０１４およびＫＹ－１００３が含まれる。
【0080】
適切には、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブまたはニボルマブから選択される。最も適切には、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブである。
【0081】
したがって、要約すると、膵臓がん（例えば、ステージＩまたはＩＩの膵臓がん）のための標準的な膵臓がん治療レジメンは、腫瘍の一部または全部を除去するための外科手術と、それに続くゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ、Ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））またはそれらの組み合わせから選択される化学療法剤の投与を含み得る。同様に、ステージＩＩＩまたはＩＶの膵臓がんのための標準的な腫瘍治療レジメンは、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ、Ｎａｂ－パクリタキセル（アブラキサン（登録商標））またはそれらの組み合わせから選択される化学療法剤の投与を含む。
【0082】
本発明による好ましい治療では、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物は、膵臓がんのための確立された療法と組み合わせて使用される。
【0083】
現在推奨されている標準治療レジメンを考慮すると、ＣＣＲ１アンタゴニストは、適切には、ゲムシタビンまたはカペシタビンから選択される化学療法剤、特にゲムシタビンと組み合わせて使用される。本発明者らは、ＣＣＲ１アンタゴニストがゲムシタビンとともに投与されたときに、マウスモデルにおいて特に強い治療上有益な効果を見ている。
【0084】
さらに特定の併用療法では、ＣＣＲ１アンタゴニストは、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸと組み合わせて使用される。それはまた、オキサリプラチンと組み合わせて使用され得る。それはまた、Ｎａｂ－パクリタキセルと組み合わせて使用され得る。それはまた、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１阻害剤などの、免疫療法と組み合わせて使用され得る。
【0085】
さらなる新規の療法が開発されており、ＣＣＲ１アンタゴニストはまた、それらと適切に使用され得る。したがって、ＣＣＲ１アンタゴニストは、エルロチニブ、カペシタビン タキサン（ドセタキセルなど）、ペムブロリズマブ、ラロトレクチニブまたはエヌトレクチニブと組み合わせて使用され得る。
【0086】
特に適切な併用療法は、ゲムシタビン（例えば、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸの組み合わせ中の）およびＰＤ－１阻害剤とともに投与されるＣＣＲ１アンタゴニストである。本発明者らは、ＣＣＲ１アンタゴニストがゲムシタビンおよびＰＤ－１阻害剤とともに投与されたときに、マウスモデルにおいて特に強い治療上有益な効果を見ている。したがって、ＣＣＲ１アンタゴニスト、ゲムシタビンおよびＰＤ－１阻害剤の併用治療が好ましい。Ｎａｂ－パクリタキセルもまた任意選択で含まれ得る。
【0087】
さらに特に適切な併用療法は、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＰＤ－１阻害剤とともに投与されるＣＣＲ１アンタゴニストである。したがって、ＣＣＲ１アンタゴニスト、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＰＤ－１阻害剤の併用治療が好ましい。Ｎａｂ－パクリタキセルもまた任意選択で含まれ得る。
【0088】
例えば、ＣＣＲ１アンタゴニストは、膵臓がんの治療において、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される１つ以上の化学療法剤と組み合わせて使用される。適切には、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、Ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸまたはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の化学療法剤と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物が提供される。より適切には、膵臓がんの治療における使用のための、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））および／またはＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物が提供される。最も適切には、膵臓がんの治療における使用のための、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物が提供される。
【0089】
本発明の別の態様では、膵臓がんの治療における使用のための、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤、ならびに任意選択で以下の薬剤：ＭＥＫ阻害剤、ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤および／またはがん免疫療法剤（例えば、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤）のうちの１つ以上と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物が提供される。
【0090】
本発明の別の態様では、膵臓がんの治療における使用のための、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤、ならびに任意選択で１つ以上のがん免疫療法剤（例えば、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤）と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物が提供される。
【0091】
例えば、化学療法剤は、同時に投与され、１つ以上のがん免疫療法剤は、その後逐次的に投与される。
【0092】
例えば、化学療法剤および１つ以上のがん免疫療法剤は、逐次的に投与される。ＣＣＲ１アンタゴニスト、化学療法剤および１つ以上のがん免疫療法剤は、任意の逐次的な順序で投与され得ることが理解される。適切には、ＣＣＲ１アンタゴニストが先ず投与され、それに化学療法剤および１つ以上のがん免疫療法剤の逐次的な投与が続く。
【0093】
本発明の別の態様では、膵臓がんの治療における使用のための、
ＭＥＫ阻害剤および／またはＩＧＦ１Ｒ阻害剤、ならびに
任意選択でゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤
と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物が提供される。
ＭＥＫ阻害剤および／またはＩＧＦ１Ｒ阻害剤、ならびに
任意選択でゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤
と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物が提供される。
【0094】
本発明の別の態様では、膵臓がんの治療における使用のための、
ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１阻害剤、ならびに
任意選択でゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤
と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物が提供される。
ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１阻害剤、ならびに
任意選択でゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤
と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物が提供される。
【0095】
本発明の別の態様では、膵臓がんの治療における使用のための、ＭＥＫ阻害剤および／またはＩＧＦ１Ｒ阻害剤と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、その薬学的に許容される塩、溶媒和物または水和物が提供される。
【0096】
適切なＭＥＫ阻害剤の非限定的な例には、ＣＩ－１０４０（ＰＤ１８４３５２）、ＰＤ０３２５９０１、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＭＥＫ１６２、ＡＺＤ８３３０、ＴＡＫ－７３３、ＧＤＣ－０６２３、レファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９、ＢＡＹ８６９７６６）、ピマセルチブ（ＡＳ７０３０２６）、ＲＯ４９８７６５５（ＣＨ４９８７６５５）、ＲＯ５１２６７６６、ＷＸ－５５４、ＨＬ－０８５およびそれらの組み合わせが含まれる（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１７，２２（１０），１５５１）。
【0097】
適切なＩＧＦ１Ｒ阻害剤の非限定的な例には、ダロツズマブ（およびダロツズマブの、ＭＫ－２２０６、リダフォロリムス、ＭＫ－０７５２、セツキシマブ、イリノテカン、シスプラチン エトポシドおよびエルロチニブのうちの１つ以上との組み合わせ）フィギツムマブ（およびフィギツムマブの、カルボプラチン、パクリタキセル、デキサメタゾン、ドセタキセル、プレドニゾン、エルロチニブおよびエベロリムスのうちの１つ以上との組み合わせ）、ガンチツマブ（Ｇａｎｔｉｔｕｍａｂ）（およびガンチツマブの、エキセメスタン、フルベストラント、ＦＯＬＦＩＲＩ、ゲムシタビン、パニツムマブ、ソラフェニブおよびエルロチニブのうちの１つ以上との組み合わせ）、リンシツムマブ（およびリンシチニブのエベロリムスとの組み合わせ）ならびにＲ１５０７が含まれる（Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１５，２９（１１），１５４９－１５５７）。
【0098】
本発明のさらなる態様では、膵臓がんの治療を必要とする対象における膵臓がんの治療における使用のための、以下の薬剤：
ＭＥＫ阻害剤
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、
ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、ならびに／または
ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤
のうちの１つ以上と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物であって、当該対象は、膵臓がんと診断され、
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１の発現、および／または
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤を有すると特定された対象である、ＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物が提供される。
ＭＥＫ阻害剤
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、
ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、ならびに／または
ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤
のうちの１つ以上と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物であって、当該対象は、膵臓がんと診断され、
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１の発現、および／または
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤を有すると特定された対象である、ＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物が提供される。
【0099】
一実施形態では、本発明は、膵臓がんの治療を必要とする対象における膵臓がんの治療における使用のための、以下の薬剤：
ＭＥＫ阻害剤
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、
ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、ならびに／または
ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、Ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸもしくはそれらの組み合わせから選択される化学療法剤
のうちの１つ以上と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物であって、当該対象は、膵臓がんと診断され、
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１の発現、
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤、
高レベルのＭＹＣ発現および／もしくはＭＹＣがん遺伝子の変異、
ＳＭＡＤ４変異、ならびに／または
古典的なモフィットの腫瘍ＲＮＡサブタイプを有すると特定された対象である、ＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物を提供する。
ＭＥＫ阻害剤
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、
ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、ならびに／または
ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、Ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸもしくはそれらの組み合わせから選択される化学療法剤
のうちの１つ以上と組み合わせた、ＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物であって、当該対象は、膵臓がんと診断され、
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１の発現、
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤、
高レベルのＭＹＣ発現および／もしくはＭＹＣがん遺伝子の変異、
ＳＭＡＤ４変異、ならびに／または
古典的なモフィットの腫瘍ＲＮＡサブタイプを有すると特定された対象である、ＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物を提供する。
【0100】
特定の実施形態では、対象は、膵臓がんと診断され、本明細書中上記で規定される本発明の方法によって決定される、事前に決定された閾値スコアよりも大きな試験スコア（例えば、参照サンプルセットから生成された免疫スコアの２５パーセンタイル）を有すると特定された対象である。
【0101】
本発明のさらに別の態様では、膵臓がんの治療を必要とする対象において膵臓がんを治療する方法であって、当該方法は、当該対象に治療有効量のＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物、あるいはその医薬組成物を、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される１つ以上の化学療法剤と組み合わせて投与することを含む、方法が提供される。
【0102】
いくつかの実施形態では、膵臓がんの治療を必要とする対象において膵臓がん（例えば、ステージＩＶの膵臓がん）を治療する方法であって、当該方法は、当該対象に治療有効量のＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物、あるいはその医薬組成物を、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、Ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸまたはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の化学療法剤、ならびに任意選択で１つ以上のがん免疫療法剤（例えば、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤）と組み合わせて投与することを含む、方法が提供される。
【0103】
本発明のさらに別の態様では、膵臓がんの治療を必要とする対象において膵臓がんを治療する方法であって、当該方法は、当該対象に治療有効量のＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物、あるいはその医薬組成物を、ＭＥＫ阻害剤および／またはＩＧＦ１Ｒ阻害剤、ならびに任意選択でゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される１つ以上の化学療法剤と組み合わせて投与することを含む、方法が提供される。
【0104】
いくつかの実施形態では、膵臓がんの治療を必要とする対象において膵臓がん（例えば、ステージＩＶの膵臓がん）を治療する方法であって、当該方法は、当該対象に治療有効量のＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物、あるいはその医薬組成物を、ＭＥＫ阻害剤および／またはＩＧＦ１Ｒ阻害剤、ならびに任意選択でゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、Ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸまたはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の化学療法剤と組み合わせて投与することを含む、方法が提供される。
【0105】
本発明のさらなる態様では、膵臓がんの治療を必要とする対象において膵臓がんを治療する方法であって、当該方法は、当該対象に治療有効量のＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物、あるいはその医薬組成物を、以下の薬剤：
ＭＥＫ阻害剤
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、
ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、ならびに／または
ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤
のうちの１つ以上と組み合わせて投与することを含み、治療を必要とする対象は、
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１の発現、および／または
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤を有すると特定された対象である、方法が提供される。
ＭＥＫ阻害剤
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、
ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、ならびに／または
ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤
のうちの１つ以上と組み合わせて投与することを含み、治療を必要とする対象は、
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１の発現、および／または
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤を有すると特定された対象である、方法が提供される。
【0106】
特定の実施形態では、膵臓がんの治療を必要とする対象において膵臓がん（例えば、ステージＩＶの膵臓がん）を治療する方法であって、当該方法は、当該対象に治療有効量のＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物、あるいはその医薬組成物を、以下の薬剤：
ＭＥＫ阻害剤
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、
ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、ならびに／または
ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、Ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸまたはそれらの組み合わせから選択される化学療法剤
のうちの１つ以上と組み合わせて投与することを含み、治療を必要とする対象は、以下：
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１の発現、
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤、
高レベルのＭＹＣ発現および／もしくはＭＹＣがん遺伝子の変異、
ＳＭＡＤ４変異、ならびに／または
古典的なモフィットの腫瘍ＲＮＡサブタイプのうちの１つ以上を有すると特定された対象である、方法が提供される。
ＭＥＫ阻害剤
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、
ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、ならびに／または
ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、Ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸまたはそれらの組み合わせから選択される化学療法剤
のうちの１つ以上と組み合わせて投与することを含み、治療を必要とする対象は、以下：
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１の発現、
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤、
高レベルのＭＹＣ発現および／もしくはＭＹＣがん遺伝子の変異、
ＳＭＡＤ４変異、ならびに／または
古典的なモフィットの腫瘍ＲＮＡサブタイプのうちの１つ以上を有すると特定された対象である、方法が提供される。
【0107】
より適切には、膵臓がんの治療を必要とする対象において膵臓がん（例えば、ステージＩＶの膵臓がん）を治療する方法であって、当該方法は、当該対象に治療有効量のＣＣＲ１アンタゴニスト（例えば、ＢＸ－４７１）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物、あるいはその医薬組成物を、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤と組み合わせて、ならびに任意選択で以下の薬剤：
ＭＥＫ阻害剤、
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、および／または
ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤
のうちの１つ以上と組み合わせて投与することを含み、対象は、
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１の発現、および／または
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤
を有すると特定され、そして任意選択で治療を必要とする対象は、以下
高レベルのＭＹＣ発現および／もしくはＭＹＣがん遺伝子の変異、
ＳＭＡＤ４変異、ならびに／または
古典的なモフィットの腫瘍ＲＮＡサブタイプのうちの１つ以上を有すると特定された対象である、方法が提供される。
ＭＥＫ阻害剤、
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、および／または
ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤
のうちの１つ以上と組み合わせて投与することを含み、対象は、
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１の発現、および／または
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤
を有すると特定され、そして任意選択で治療を必要とする対象は、以下
高レベルのＭＹＣ発現および／もしくはＭＹＣがん遺伝子の変異、
ＳＭＡＤ４変異、ならびに／または
古典的なモフィットの腫瘍ＲＮＡサブタイプのうちの１つ以上を有すると特定された対象である、方法が提供される。
【0108】
特定の実施形態では、対象は、膵臓がんと診断され、本明細書中上記で規定される本発明の方法によって決定される、事前に決定された閾値スコアよりも大きな試験スコア（例えば、参照サンプルセットから生成された免疫スコアの２５パーセンタイル）を有すると特定された対象である。
【0109】
本明細書に記載される組み合わせは、列挙された薬剤の逐次的な、別個の、および／または同時の組み合わせであり得ることが理解される。すなわち、列挙された薬剤は、同時にまたは別個に加えられ得る。組み合わせが２つよりも多い薬剤を含む状況では、組み合わせは、列挙された薬剤のすべての逐次的な、別個の、および／または同時の投与を含み得るか、あるいは組み合わせは、いくつかの薬剤の逐次的な投与および他の薬剤の同時の投与を含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される組み合わせは、逐次的な組み合わせであり、ここで、列挙された薬剤は、順を追って（例えば、１つずつ）投与される。他の実施形態では、本明細書に記載される組み合わせは、同時の組み合わせであり、ここで、列挙された薬剤は、一緒に投与される。
【0110】
医薬組成物
本発明の別の態様によれば、膵臓がんの治療における使用のための、薬学的に許容される希釈剤または担体を伴う、本明細書中上記で規定されるＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を含む医薬組成物が提供される。
本発明の別の態様によれば、膵臓がんの治療における使用のための、薬学的に許容される希釈剤または担体を伴う、本明細書中上記で規定されるＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を含む医薬組成物が提供される。
【0111】
本発明は、ＣＣＲ１アンタゴニストを、
ＭＥＫ阻害剤
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、
ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、ならびに／または
ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤から選択される１つ以上の追加の治療薬と一緒に含む医薬組成物を提供する。
ＭＥＫ阻害剤
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、
ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、ならびに／または
ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される化学療法剤から選択される１つ以上の追加の治療薬と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【0112】
好ましくは、膵臓がんの治療における使用のための医薬組成物は、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）およびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））から選択される１つ以上の追加の治療薬を含む。
【0113】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上のＭＥＫ阻害剤および／またはＩＧＦ１Ｒ阻害剤を含む。
【0114】
本発明の医薬組成物は、経口使用（例えば、錠剤、ロゼンジ、硬もしくは軟カプセル、水性もしくは油性の懸濁液、乳濁液、分散性の粉末もしくは顆粒、シロップまたはエリキシルとして）、局所使用（例えば、クリーム、軟膏、ゲル、または水性もしくは油性の溶液もしくは懸濁液として）、吸入による投与（例えば、微細粉末または液体エアロゾルとして）、吹送による投与（例えば、微細粉末として）あるいは非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内もしくは筋肉内投薬のための無菌の水性もしくは油性の溶液として、または直腸投薬のための坐剤として）に適切な形態であり得る。
【0115】
ＣＣＲ１アンタゴニストの選択に応じて、特定の有効な製剤が知られており、市販されている。
【0116】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で知られている、従来の医薬賦形剤を使用する従来の手順によって得られ得る。したがって、経口使用のために意図される医薬組成物は、例えば、１つ以上の着色剤、甘味料、香味剤および／または防腐剤を含有し得る。
【0117】
予後の方法
本発明は、膵臓がんと診断された対象の予後決定を実施する方法であって、当該方法は、
対象から取得されたサンプルにおけるＣＣＲ１発現のレベルを測定するステップと、
ステップａ）において測定されたＣＣＲ１発現のレベルを参照発現レベルと比較するステップと、
ステップｂ）において決定された、参照発現レベルに対するＣＣＲ１のレベルに基づいて対象の予後を決定するステップと、を含み、
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１発現は、対象にとって好ましくない予後を示し、対照と比較して減少したかまたは変化していないレベルのＣＣＲ１発現は、対象にとって好ましい予後を示す、方法を提供する。
本発明は、膵臓がんと診断された対象の予後決定を実施する方法であって、当該方法は、
対象から取得されたサンプルにおけるＣＣＲ１発現のレベルを測定するステップと、
ステップａ）において測定されたＣＣＲ１発現のレベルを参照発現レベルと比較するステップと、
ステップｂ）において決定された、参照発現レベルに対するＣＣＲ１のレベルに基づいて対象の予後を決定するステップと、を含み、
参照発現レベルと比較して増加したレベルのＣＣＲ１発現は、対象にとって好ましくない予後を示し、対照と比較して減少したかまたは変化していないレベルのＣＣＲ１発現は、対象にとって好ましい予後を示す、方法を提供する。
【0118】
本発明の別の態様では、膵臓がんと診断された対象の予後決定を実施する方法であって、当該方法は、
対象から取得されたサンプルにおける免疫（例えば、マクロファージ）浸潤のレベルを測定するステップと、
ステップａ）において測定された免疫（例えば、マクロファージ）浸潤のレベルを参照浸潤レベルと比較するステップと、
ステップｂ）において決定された、参照浸潤レベルと比較した免疫（例えば、マクロファージ）浸潤レベルに基づいて対象の予後を決定するステップと、を含み、
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤は、対象にとって好ましくない予後を示し、参照浸潤レベルと比較して減少したかまたは変化していないレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤は、対象にとって好ましい予後を示す、方法が提供される。
対象から取得されたサンプルにおける免疫（例えば、マクロファージ）浸潤のレベルを測定するステップと、
ステップａ）において測定された免疫（例えば、マクロファージ）浸潤のレベルを参照浸潤レベルと比較するステップと、
ステップｂ）において決定された、参照浸潤レベルと比較した免疫（例えば、マクロファージ）浸潤レベルに基づいて対象の予後を決定するステップと、を含み、
参照浸潤レベルと比較して増加したレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤は、対象にとって好ましくない予後を示し、参照浸潤レベルと比較して減少したかまたは変化していないレベルの免疫（例えば、マクロファージ）浸潤は、対象にとって好ましい予後を示す、方法が提供される。
【0119】
例えば、免疫（例えば、マクロファージ）浸潤およびＣＣＲ１発現のレベルの両方が、対象から取得されたサンプルにおいて測定され得る。
【0120】
例えば、ＭＹＣの発現のレベル、ＳＭＡＤ４変異、または古典的なモフィットの腫瘍ＲＮＡサブタイプもまた、予後の一部として測定され得る。
【0121】
本発明のさらなる態様によれば、予後決定を実施する方法は、ＰＩＭ３、ＧＳＫ３Ｂ、ＡＴＫ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ５、ＭＡＰＫ１４、ＭＴＯＲ、ＭＡＰＫ３、ＣＡＭＫ２Ａ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰＫ８、ＰＲＫＡＣＡ、ＳＲＣ、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＭＡＰＫ１およびＰＲＫＣＡから選択される少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルを測定することを含む。
【0122】
方法は、ＣＣＲ１および少なくとも１つのバイオマーカーの測定された発現レベルから導き出された試験スコアを決定することと、試験スコアと事前に決定された閾値スコアとを比較することとを含み得、ここで、事前に決定された閾値よりも大きな試験スコアは、対象にとって好ましくない予後を示し、事前に決定された閾値スコアよりも低いかそれと等しい試験スコアは、対象にとって好ましい予後を示す。
【0123】
「予後」という用語は、医学的状態（例えば、膵臓がん）の可能性のある経過を指すことが理解される。したがって、「好ましい予後」という用語は、膵臓がんの経過が、対象にとって好ましくなることを意味すると理解される。適切には、「好ましい予後」という用語は、膵臓がんを有する対象が、１つ以上の標準的な膵臓がん治療レジメン（すなわち、外科手術および／または化学療法治療）の後に、少なくとも３ヶ月間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、より好ましくは少なくとも１年間、さらにより適切には少なくとも２年間、最も好ましくは少なくとも５年間生存する可能性が高いことを意味する。すなわち、「好ましい予後」という用語は、膵臓がん患者の間で一般的に非常に不良な予後の文脈内で、１つ以上の標準的な膵臓がん治療レジメンに対して良好に応答する高い可能性（すなわち、膵臓がんが治療後に再発または進行しない高い可能性）を有する膵臓がんを有する対象を指す。
【0124】
「好ましくない予後」という用語は、膵臓がんの経過が、対象にとって好ましくなくなることを意味すると理解される。適切には、「好ましくない予後」という用語は、膵臓がんを有する対象が、１つ以上の標準的な膵臓がん治療レジメン（すなわち、外科手術および／または化学療法治療）の後に、少なくとも３ヶ月間（適切には少なくとも６ヶ月間、より適切には少なくとも１年間、さらにより適切には少なくとも２年間、最も適切には少なくとも５年間）生存する可能性が低いことを意味する。すなわち、「好ましくない予後」という用語は、１つ以上の標準的な膵臓がん治療レジメンに対して良好に応答する低い可能性（すなわち、膵臓がんが治療後に再発または進行する高い可能性）を有する膵臓がんを有する対象を指す。
【0125】
適切には、本明細書中上記の予後の方法は、対象からサンプルを取得する最初のステップを含む。当該サンプルは、例えば、患者の膵臓（または周囲組織）から取得された腫瘍細胞のサンプルおよび／または対象の血液のサンプルであり得る。サンプルは、例えば、外科手術、生検または血液サンプルなどの、当該技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して取得され得る。
【0126】
本明細書中上記で言及される参照レベル（すなわち、「参照発現レベル」および「参照浸潤レベル」）は、対象から取得されたサンプルにおいて測定されたＣＣＲ１発現および／またはマクロファージ浸潤のレベルがそれから比較され得る、参照点（またはベンチマーク）として作用する対照値を指す。参照レベルは、例えば、膵臓がんと診断されていない対象におけるＣＣＲ１発現の平均レベルおよび／もしくはマクロファージ浸潤の平均レベル（例えば、陰性対照もしくは参照レベル）、または膵臓がんと診断された対象についてのＣＣＲ１発現の平均レベルおよび／もしくはマクロファージ浸潤の平均レベル（例えば、陽性対照もしくは参照レベル）に対応し得る。
【0127】
一実施形態では、対象における遺伝子発現レベルまたはマクロファージ浸潤レベルは、レベルが、関連する集団のより低い四分位数、最も高い四分位数または中間の２つの四分位数に入るかどうかに応じて、「高」、「中」および「低」グループに層別化され得、あるいは、対象における遺伝子発現レベルまたはマクロファージ浸潤レベルは、レベルが、関連する集団のより低い四分位数、最も高い四分位数または中間の２四分位数に入るかどうかに応じて、「高」または「低」グループに層別化され得る。
【0128】
パーツキット
上記のように、本発明による使用のためのＣＣＲ１アンタゴニストは、最も好ましくは、１つ以上のさらなる治療薬と組み合わせて使用される。したがって、ＣＣＲ１アンタゴニストは、そのような他の治療薬と一緒に提供され得る。
上記のように、本発明による使用のためのＣＣＲ１アンタゴニストは、最も好ましくは、１つ以上のさらなる治療薬と組み合わせて使用される。したがって、ＣＣＲ１アンタゴニストは、そのような他の治療薬と一緒に提供され得る。
【0129】
本発明の別の態様では、したがって、パーツキットであって、以下の構成要素：
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、本明細書で規定されるＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される１つ以上の化学療法剤と、を含み、
構成要素は、逐次的な、別個の、および／または同時の投与に適切である形態で提供される、パーツキットが提供される。
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、本明細書で規定されるＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される１つ以上の化学療法剤と、を含み、
構成要素は、逐次的な、別個の、および／または同時の投与に適切である形態で提供される、パーツキットが提供される。
【0130】
本発明の別の態様では、パーツキットであって、以下の構成要素：
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、本明細書で規定されるＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ＭＥＫ阻害剤および／もしくはＩＧＦ１Ｒ阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、を含み、
構成要素は、逐次的な、別個の、および／または同時の投与に適切である形態で提供される、パーツキットが提供される。
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、本明細書で規定されるＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ＭＥＫ阻害剤および／もしくはＩＧＦ１Ｒ阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、を含み、
構成要素は、逐次的な、別個の、および／または同時の投与に適切である形態で提供される、パーツキットが提供される。
【0131】
本発明の別の態様では、パーツキットであって、以下の構成要素：
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、本明細書で規定されるＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ＭＥＫ阻害剤および／もしくはＩＧＦ１Ｒ阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される１つ以上の化学療法剤と、を含み、
構成要素は、逐次的な、別個の、および／または同時の投与に適切である形態で提供される、パーツキットが提供される。
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、本明細書で規定されるＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ＭＥＫ阻害剤および／もしくはＩＧＦ１Ｒ阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される１つ以上の化学療法剤と、を含み、
構成要素は、逐次的な、別個の、および／または同時の投与に適切である形態で提供される、パーツキットが提供される。
【0132】
本発明の別の態様では、パーツキットであって、以下の構成要素：
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、本明細書で規定されるＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ＰＤ－１および／もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される１つ以上の化学療法剤と、を含み、
構成要素は、逐次的な、別個の、および／または同時の投与に適切である形態で提供される、パーツキットが提供される。
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、本明細書で規定されるＣＣＲ１アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ＰＤ－１および／もしくはＰＤ－Ｌ１阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物と、
任意選択で薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を伴う、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸおよびＮａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物から選択される１つ以上の化学療法剤と、を含み、
構成要素は、逐次的な、別個の、および／または同時の投与に適切である形態で提供される、パーツキットが提供される。
【0133】
パーツキットは、膵臓がんの治療のためのものである。適切には、パーツキットは、本明細書に記載されるような膵臓がんの治療における使用のためのもの、および／または本明細書に記載される方法による治療に適切であると特定された対象の治療における使用のためのものである。
【0134】
本発明の特定の態様、実施形態または例と併せて記載される特徴、整数、特性、化合物、または特質は、それと不適合でない限り本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態または例に適用可能であると理解される。本明細書（いずれの添付の特許請求の範囲、要約および図面も含む）に開示される特徴のすべて、および／またはそのように開示されるいずれの方法もしくはプロセスのステップのすべてが、そのような特徴および／またはステップの少なくともいくらかが相互に排他的である組み合わせを除いて、いずれの組み合わせでも組み合わされ得る。
【実施例】
【0135】
実施例１－ヒト膵臓がんにおける免疫浸潤の画分としてのマクロファージ集団
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥ：デコンボリューションツール
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥは、１８個の細胞型の相対的腫瘍微小環境（ＴＭＥ）細胞推定のためのすべての他の現在のデコンボリューション方法からの遺伝子セットを統合するデコンボリューションツールである。すなわち、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥは、様々な公開されているＴＭＥ細胞推定方法によって使用される一般的な細胞型特異的遺伝子セットをコンパイルするＲソフトウェア環境用のパッケージである。このプログラムは、ヒト腫瘍サンプルのバルク発現データを使用した細胞型量の推定を可能にする。さらに、それは、独立した細胞推定方法からの細胞型特異的遺伝子マーカーを含み、様々ながん型に特異的であるように遺伝子セットをフィルタリングし、単一サンプル遺伝子セットエンリッチメント分析（ｓｓＧＳＥＡ）を使用して、バルク遺伝子発現データからＴＭＥ細胞型および腫瘍特異的エンリッチメントスコアを算出する。
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥ：デコンボリューションツール
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥは、１８個の細胞型の相対的腫瘍微小環境（ＴＭＥ）細胞推定のためのすべての他の現在のデコンボリューション方法からの遺伝子セットを統合するデコンボリューションツールである。すなわち、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥは、様々な公開されているＴＭＥ細胞推定方法によって使用される一般的な細胞型特異的遺伝子セットをコンパイルするＲソフトウェア環境用のパッケージである。このプログラムは、ヒト腫瘍サンプルのバルク発現データを使用した細胞型量の推定を可能にする。さらに、それは、独立した細胞推定方法からの細胞型特異的遺伝子マーカーを含み、様々ながん型に特異的であるように遺伝子セットをフィルタリングし、単一サンプル遺伝子セットエンリッチメント分析（ｓｓＧＳＥＡ）を使用して、バルク遺伝子発現データからＴＭＥ細胞型および腫瘍特異的エンリッチメントスコアを算出する。
【0136】
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥ遺伝子セットを生成するために、それについて少なくとも２つの異なるソースからのシグネチャーが存在する細胞型を特定し、合計で１８個の細胞型を使用した。
【0137】
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１５，１２，４５３－４５７）によって使用されているシグネチャーマトリックス「ＬＭ２２」から遺伝子を抽出するために、その発現値が各細胞型について平均の１．９６標準偏差未満である遺伝子を先ずフィルタリング除去した。加えて、対応する細胞型についての活性化および休止状態を崩壊させた。一旦、他のデコンボリューション方法（Ｂｉｎｄｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１３，３９（４），７８２－７９５、Ｄａｎａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２０１７，５（１８），１－１５、Ｄａｖｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，３５５（６３２２），２４９９－２５０、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１５，１２，４５３－４５７、ＭＣＰ－Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６，１７（２１８），１－２０、およびｘＣｅｌｌ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７，１８（２２０），１－１４）からのシグネチャー遺伝子を収集すると、各細胞型についての遺伝子の特有のユニオンを作成した。この遺伝子のユニオンから、ＴＣＧＡがん型の各々について細胞型特異的遺伝子のセットをキュレートした。これを、ＴＩＭＥＲアルゴリズム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６，１７（１７４），１－１６）と同様のアプローチを使用して行い、ここで、その遺伝子の発現が、対応するがん型についての腫瘍純度（ＡＢＳＯＬＵＴＥ由来）と負の相関（ピアソンの相関＜０．２、ｐ値０．０５）を有する場合にのみ遺伝子を含めた。
【0138】
最後に、単一サンプル遺伝子セットエンリッチメント分析（ｓｓＧＳＥＡ）を用いて、上記のように各細胞型について正規化されたエンリッチメントスコア（ＮＥＳ）を計算した。各腫瘍型についての一般的な免疫スコアを、様々な免疫細胞の遺伝子を各ＴＣＧＡがん型について１つの遺伝子セットに組み合わせることによって生成した。
【0139】
膵臓がんにおける腫瘍サンプルの免疫浸潤に対するマクロファージの相対的寄与を全身的に探索するために、ＴＣＧＡ腫瘍サンプルの遺伝子発現データをＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥを使用して分析して、上記のように、免疫細胞遺伝子発現シグネチャーを各腫瘍サンプルバルクＲＮＡ混合物からデコンボリューションした。
【0140】
汎がんデータ（ＤＮＡ由来の純度、白血球メチル化およびＨ＆Ｅ由来のリンパ球数）ならびに細胞特異的ベンチマークデータセット（末梢血細胞および腫瘍組織）からなる包括的なベンチマークデータセットを収集した。
【0141】
ＴＣＧＡ膵臓がんにおける免疫浸潤画分のｓｓＧＳＥＡ分析を図１に示し、ここで、マクロファージが膵臓がん患者における免疫浸潤において最も豊富な免疫細胞型の１つであることが見られ得る。
【0142】
実施例２－膵臓がん患者の層別化のためのＴＣＧＡ ＰＡＡＤ（膵臓がん）におけるマクロファージ浸潤のカプラン・マイヤー生存分析
カプラン・マイヤー生存分析
ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌから収集したＲＮＡ－Ｓｅｑデータである、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からの遺伝子発現データを使用して、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥを適用して、ＰＡＡＤコホートについて１８個の免疫細胞型の相対的存在量を推定した。データは、ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１４，２（５），４０１－４０４）で公開されている、ＲＮＡ－Ｓｅｑからの遺伝子発現データであった。患者を最初に、マクロファージの存在量に応じて、「高」、「中」および「低」に層別化した（高＞０．７５四分位数＞中＞０．２５四分位数＞低）。
カプラン・マイヤー生存分析
ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌから収集したＲＮＡ－Ｓｅｑデータである、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からの遺伝子発現データを使用して、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥを適用して、ＰＡＡＤコホートについて１８個の免疫細胞型の相対的存在量を推定した。データは、ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１４，２（５），４０１－４０４）で公開されている、ＲＮＡ－Ｓｅｑからの遺伝子発現データであった。患者を最初に、マクロファージの存在量に応じて、「高」、「中」および「低」に層別化した（高＞０．７５四分位数＞中＞０．２５四分位数＞低）。
【0143】
この層別化に基づく無増悪生存のカプラン・マイヤー生存分析は、生存曲線における分岐を示し、高／中グループは一緒のままである一方で、低グループはより良い予後を示した。高および中グループは有意差を示さず、それらを組み合わせて、２つの患者グループ、マクロファージ低およびマクロファージ中／高を残した。
【0144】
中または高のマクロファージ浸潤の数を有する患者は、不良な予後とよく相関することが見出された。
【0145】
ＣＣＲ１発現によって患者を層別化するＴＣＧＡ ＰＡＡＤにおけるさらなるＫＭ分析は、ＣＣＲ１高発現（＞中央値）の患者が有意により悪い無増悪生存を示すことを明らかにした。
【0146】
次に、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥマクロファージ遺伝子シグネチャーをＣＣＲ１発現と組み合わせて、組み合わせたシグネチャーを作成した。ｓｓＧＳＥＡを実施して、この組み合わせたシグネチャーのエンリッチメントを調べ、サンプルをこのシグネチャーのエンリッチメントに基づいてもう一度「低」または「中／高」のいずれかに層別化した。これは、組み合わせたシグネチャーが、膵臓がん患者における無増悪生存（ＰＦＳ）の差異を予測し得ることを明らかにした。
【0147】
結果を図２に示す。
【0148】
実施例３－ＰＤＡＣ間葉系細胞は、浸潤の３Ｄインビトロアッセイにおいて血管擬態を形成する
細胞培養
使用したマウスがん細胞株、ＴＢ３２０４８（本明細書中以下で、ＰＤＡＣ上皮と称される）およびＫ８４８４（本明細書中以下で、ＰＤＡＣ間葉系と称される）は、ＫＰＣマウス（Ｄａｖｉｄ Ｔｕｖｅｓｏｎによって生成された）から生じた腫瘍から単離され、Ｄｕｎｃａｎ Ｊｏｄｒｅｌｌによって供給された。すべての細胞株を、１０％熱不活化ウシ胎児血清、ＦＢＳ、（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地：栄養素混合物Ｆ－１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させ、３７℃で５％ＣＯ２中でインキュベートした。すべての細胞株は、マイコプラズマについて陰性であると試験された。
細胞培養
使用したマウスがん細胞株、ＴＢ３２０４８（本明細書中以下で、ＰＤＡＣ上皮と称される）およびＫ８４８４（本明細書中以下で、ＰＤＡＣ間葉系と称される）は、ＫＰＣマウス（Ｄａｖｉｄ Ｔｕｖｅｓｏｎによって生成された）から生じた腫瘍から単離され、Ｄｕｎｃａｎ Ｊｏｄｒｅｌｌによって供給された。すべての細胞株を、１０％熱不活化ウシ胎児血清、ＦＢＳ、（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地：栄養素混合物Ｆ－１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させ、３７℃で５％ＣＯ２中でインキュベートした。すべての細胞株は、マイコプラズマについて陰性であると試験された。
【0149】
浸潤の３Ｄインビトロモデル
細胞マトリックス培養を、１ｍｇ／ｍＬのＭａｔｒｉｘ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でプレコートしたウェル上にＰＤＡＣ細胞を播種することによって行った。Ｍａｔｒｉｇｅｌを通った細胞浸潤を観察するために、プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に配置し、緑色および蛍光タンパク質（ＧＦＰ／ＲＦＰ）／明視野（または位相差）で３時間ごとに画像をとらえるようにソフトウェアを設定した。
細胞マトリックス培養を、１ｍｇ／ｍＬのＭａｔｒｉｘ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でプレコートしたウェル上にＰＤＡＣ細胞を播種することによって行った。Ｍａｔｒｉｇｅｌを通った細胞浸潤を観察するために、プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に配置し、緑色および蛍光タンパク質（ＧＦＰ／ＲＦＰ）／明視野（または位相差）で３時間ごとに画像をとらえるようにソフトウェアを設定した。
【0150】
ＶＭ様構造の定量化
血管擬態（ＶＭ）構造を形成するＰＤＡＣ細胞の能力を定量化するために、３Ｄインビトロアッセイを、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって提供される血管新生分析ソフトウェアによって定量化した。血管新生ツールは、代表的な視野において３Ｄ構造が有する枝の数の、自動化された客観的な定量化を可能にする。一旦パラメータが規定されると、それらを堅調で再現性のある定量化のためにすべての３Ｄインビトロ構造形成実験に適用した。
血管擬態（ＶＭ）構造を形成するＰＤＡＣ細胞の能力を定量化するために、３Ｄインビトロアッセイを、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって提供される血管新生分析ソフトウェアによって定量化した。血管新生ツールは、代表的な視野において３Ｄ構造が有する枝の数の、自動化された客観的な定量化を可能にする。一旦パラメータが規定されると、それらを堅調で再現性のある定量化のためにすべての３Ｄインビトロ構造形成実験に適用した。
【0151】
結果を図３に示す。
【0152】
浸潤の３Ｄインビトロアッセイにおいてクラスターを形成するＰＤＡＣ上皮細胞とは対照的に、ＰＤＡＣ間葉系細胞は、ウェルの表面積全体にわたって広範で複雑な管状の格子状ネットワークを形成した。これらのネットワークの完全性は、実験期間にわたって概して不変であった。加えて、管状構造は、ＶＭを表すことが示唆されており、（上皮間葉転換）ＥＭＴ状態が３Ｄアーキテクチャーの構造を形成する能力を媒介し得ることを暗示する。
【0153】
実施例４－初代ＢＭＤＭは、ＥＭＴ状態にかかわりなく、膵臓がん細胞に浸潤促進性表現型を付与する
すべてのその後のマクロファージ共培養アッセイにおいて、生物学的に関連するマクロファージ集団を最もよく表すために、浸潤の３Ｄインビトロモデルにおいて、ＺｓＧｒｅｅｎ標識初代ＢＭＤＭを、ｍＣｈｅｒｒｙ発現ＰＤＡＣ上皮細胞と共培養した。
すべてのその後のマクロファージ共培養アッセイにおいて、生物学的に関連するマクロファージ集団を最もよく表すために、浸潤の３Ｄインビトロモデルにおいて、ＺｓＧｒｅｅｎ標識初代ＢＭＤＭを、ｍＣｈｅｒｒｙ発現ＰＤＡＣ上皮細胞と共培養した。
【0154】
骨髄由来マクロファージ
骨髄を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０～１４週齢）の大腿骨および脛骨から単離した。大腿骨および脛骨にＰＢＳ緩衝液を流し、７０μＭのふるい（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に通し、細胞を標準的なプラスチック組織培養１００ｍｍ２ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に再播種した。細胞を、１０％ＦＢＳおよび１５％Ｌ９２９－Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉａ（ＬＣＭ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中での培養によって、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）に分化させ、３７℃で低酸素条件（１％Ｏ２）で３日間インキュベートした。ＢＭＤＭを、１０％熱不活化ウシ胎児血清、ＦＢＳ、（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地：栄養素混合物Ｆ－１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させ、維持し、３７℃で１％Ｏ２中でインキュベートした。
骨髄を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０～１４週齢）の大腿骨および脛骨から単離した。大腿骨および脛骨にＰＢＳ緩衝液を流し、７０μＭのふるい（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に通し、細胞を標準的なプラスチック組織培養１００ｍｍ２ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に再播種した。細胞を、１０％ＦＢＳおよび１５％Ｌ９２９－Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉａ（ＬＣＭ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中での培養によって、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）に分化させ、３７℃で低酸素条件（１％Ｏ２）で３日間インキュベートした。ＢＭＤＭを、１０％熱不活化ウシ胎児血清、ＦＢＳ、（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地：栄養素混合物Ｆ－１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させ、維持し、３７℃で１％Ｏ２中でインキュベートした。
【0155】
細胞共培養
本研究において使用したＰＤＡＣおよびＢＭＤＭ細胞株のための培養条件は上記のとおりである。共培養のために、ｍＣｈｅｒｒｙ標識ＰＤＡＣ細胞を、ＺｓＧｒｅｅｎ標識マクロファージ（別段の記載がない限り典型的には初代ＢＭＤＭ）と１：１で混合した。共培養物を播種し、サブコンフルエントな培養物として２Ｄまたは３Ｄのいずれかの条件で４８～９６時間保持した。
本研究において使用したＰＤＡＣおよびＢＭＤＭ細胞株のための培養条件は上記のとおりである。共培養のために、ｍＣｈｅｒｒｙ標識ＰＤＡＣ細胞を、ＺｓＧｒｅｅｎ標識マクロファージ（別段の記載がない限り典型的には初代ＢＭＤＭ）と１：１で混合した。共培養物を播種し、サブコンフルエントな培養物として２Ｄまたは３Ｄのいずれかの条件で４８～９６時間保持した。
【0156】
浸潤の３Ｄインビトロアッセイの定量化
ＰＤＡＣ細胞の浸潤能力を定量化するために、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって提供されるソフトウェア、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｋを使用して３Ｄインビトロ浸潤アッセイを定量化した。この方法は、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって設計されたソフトウェアアルゴリズムを用いて、ＩｎｃｕＣｙｔｅＺｏｏｍプラットフォームによって生成された動態データを測定する。細胞の固定、染色、およびエンドポイント分析を必要とする、ハイコンテントイメージングシステムとは異なり、アルゴリズムは生細胞ダイナミクスを測定した。ＮｅｕｒｏＴｒａｃｋは、時間に対して３Ｄ構造から浸潤する細胞の数を表示した。この方法は、ｍＣｈｅｒｒｙ標識ＰＤＡＣ細胞との共培養の計数プロセスにおけるマクロファージ（非標識および／またはＺｓＧｒｅｅｎ）の除外を可能にした。一旦パラメータが規定されると、それらを定量化のためにすべての３Ｄインビトロ浸潤アッセイに適用した。
ＰＤＡＣ細胞の浸潤能力を定量化するために、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって提供されるソフトウェア、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｋを使用して３Ｄインビトロ浸潤アッセイを定量化した。この方法は、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって設計されたソフトウェアアルゴリズムを用いて、ＩｎｃｕＣｙｔｅＺｏｏｍプラットフォームによって生成された動態データを測定する。細胞の固定、染色、およびエンドポイント分析を必要とする、ハイコンテントイメージングシステムとは異なり、アルゴリズムは生細胞ダイナミクスを測定した。ＮｅｕｒｏＴｒａｃｋは、時間に対して３Ｄ構造から浸潤する細胞の数を表示した。この方法は、ｍＣｈｅｒｒｙ標識ＰＤＡＣ細胞との共培養の計数プロセスにおけるマクロファージ（非標識および／またはＺｓＧｒｅｅｎ）の除外を可能にした。一旦パラメータが規定されると、それらを定量化のためにすべての３Ｄインビトロ浸潤アッセイに適用した。
【0157】
ＮｅｕｒｏＴｒａｃｋソフトウェアは、蛍光標識細胞を測定する。処理規定を、上皮間葉転換（ＥＭＴ）状態および３Ｄ構造の寸法にかかわらず、２つのＰＤＡＣ細胞型（両方がＨ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙによって核標識されている）の浸潤を一貫して分析するように調整した。ここで、ＢＭＤＭは、ＺｓＧｒｅｅｎ標識細胞を表す。この方法では、３Ｄ構造から浸潤したＰＤＡＣ細胞のみが、それらがその核中に存在する蛍光ｍＣｈｅｒｒｙ標識を有する場合に、計数される。データを、ｙ軸上に計数された核の数、ｘ軸上に時間でプロットする。
【0158】
結果を図４に示す。
【0159】
血管網を形成する代わりに、ＰＤＡＣ上皮細胞は、先ず播種の２４時間以内にそれらのそれぞれの丸みを帯びた凝集したクラスターを形成した後、驚くべきことに、およそ９６時間の時点でこれらの構造から浸潤した。一旦自由になると、これらの浸潤細胞は広がり始め、およそ７日後にプレートの表面積全体を覆った。平行した研究において、ＰＤＡＣ間葉系細胞単独またはＢＭＤＭの存在下での挙動もまた調べた。ＰＤＡＣ間葉系細胞もまた、先ず播種の２４時間以内にそれらのＶＭ構造を形成した後、自由になり、ずっと速い速度ではありが、およそ４８時間の時点で、浸潤促進性表現型を示すことが見出された。
【0160】
実施例５－ＢＭＤＭとの延長された共培養の後のＰＤＡＣ細胞浸潤を促進する新規のＲＮＡ標的を特定するためのマルチオミクスアプローチ（トランスクリプトーム）
延長された共培養の後のＰＤＡＣ細胞およびマクロファージのトランスクリプトームにおける変化を解明するために、ＢＭＤＭとの共培養からの事前教育されたＰＤＡＣ上皮および間葉系細胞を、単培養ＰＤＡＣ細胞およびＢＭＤＭ対照とともに蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって選別し、ＲＮＡシーケンシングに付した。単培養と比較したＰＤＡＣ細胞の共培養からの全ゲノムトランスクリプトーム分析は、ほぼすべてのケモカイン受容体およびそれらの受容体遺伝子のアップレギュレーションを示した。
延長された共培養の後のＰＤＡＣ細胞およびマクロファージのトランスクリプトームにおける変化を解明するために、ＢＭＤＭとの共培養からの事前教育されたＰＤＡＣ上皮および間葉系細胞を、単培養ＰＤＡＣ細胞およびＢＭＤＭ対照とともに蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって選別し、ＲＮＡシーケンシングに付した。単培養と比較したＰＤＡＣ細胞の共培養からの全ゲノムトランスクリプトーム分析は、ほぼすべてのケモカイン受容体およびそれらの受容体遺伝子のアップレギュレーションを示した。
【0161】
ＲＮＡ品質管理
ＲＮＡの品質を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ／ＲＮＡ ｎａｎｏ ６０００キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してチェックした。
ＲＮＡの品質を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ／ＲＮＡ ｎａｎｏ ６０００キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してチェックした。
【0162】
差次的に発現される遺伝子の決定
非特異的フィルタリングを使用して、サンプルの９０％以上の、０．３未満の四分位間範囲、または低い発現値（ｌｏｇ２スケールで３未満）の遺伝子を除去した。ＰＤＡＣ細胞における単培養と比較して共培養の後に差次的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）を見出すために、閾値を１．５の最小倍率変化、および０．１０の偽発見率中央値（ＦＤＲ）に設定した。ＢＭＤＭの単培養対共培養において、および他の関連する比較においてＤＥＧを決定するために、これらの同じパラメータを使用した。注釈なしの転写物は考慮しなかった。
非特異的フィルタリングを使用して、サンプルの９０％以上の、０．３未満の四分位間範囲、または低い発現値（ｌｏｇ２スケールで３未満）の遺伝子を除去した。ＰＤＡＣ細胞における単培養と比較して共培養の後に差次的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）を見出すために、閾値を１．５の最小倍率変化、および０．１０の偽発見率中央値（ＦＤＲ）に設定した。ＢＭＤＭの単培養対共培養において、および他の関連する比較においてＤＥＧを決定するために、これらの同じパラメータを使用した。注釈なしの転写物は考慮しなかった。
【0163】
ｑＲＴ－ＰＣＲ遺伝子発現分析
全ＲＮＡを、Ｑｉａｚｏｌ試薬およびｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞から単離および精製した。ｃＤＮＡを、製造者の説明書に従ってＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（ＡＢＩ）を使用して合成した。ｑＲＴ－ＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ ７９００（ＡＢＩ）上でＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ）を使用して行った。相対的発現レベルを、ΔΔＣｔ法を使用して規定し、１８Ｓ ｒＲＮＡおよび／またはＧＡＰＤＨに対して正規化した。
全ＲＮＡを、Ｑｉａｚｏｌ試薬およびｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞から単離および精製した。ｃＤＮＡを、製造者の説明書に従ってＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（ＡＢＩ）を使用して合成した。ｑＲＴ－ＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ ７９００（ＡＢＩ）上でＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ）を使用して行った。相対的発現レベルを、ΔΔＣｔ法を使用して規定し、１８Ｓ ｒＲＮＡおよび／またはＧＡＰＤＨに対して正規化した。
【0164】
結果を図５に示す。
【0165】
ケモカインファミリー遺伝子のマクロファージ媒介性誘導が、試験したすべてのＰＤＡＣ細胞において、ＥＭＴ状態にかかわりなく観察され、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって確認された。
【0166】
実施例６－ＢＭＤＭとの延長された共培養の後のＰＤＡＣ細胞浸潤を促進する新規のタンパク質標的を特定するためのマルチオミクスアプローチ（プロテオーム）
延長された共培養の後のＰＤＡＣ細胞およびマクロファージのプロテオームまたはセクレトームにおける変化を解明するために、ＢＭＤＭとの共培養からの事前教育されたＰＤＡＣ上皮および間葉系細胞を、単培養ＰＤＡＣ細胞およびＢＭＤＭ対照とともにバルクで回収し、ＴＭＴ完全プロテオームおよびセクレトーム分析に付した。
延長された共培養の後のＰＤＡＣ細胞およびマクロファージのプロテオームまたはセクレトームにおける変化を解明するために、ＢＭＤＭとの共培養からの事前教育されたＰＤＡＣ上皮および間葉系細胞を、単培養ＰＤＡＣ細胞およびＢＭＤＭ対照とともにバルクで回収し、ＴＭＴ完全プロテオームおよびセクレトーム分析に付した。
【0167】
ＣＴＡＰ標識
標識交換実験のために、ＰＤＡＣおよびＢＭＤＭ細胞を、先ず７９８μＭの軽同位体標識ｌ－リジン（本明細書中以下で、軽もしくはＤＡＰと称される）または重同位体標識［１３Ｃ６、 １５Ｎ２］ｌ－リジン（＋８ダルトン、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）（本明細書中以下で、重もしくはｄ－Ｌｙｓ－８と称される）を補充したｌ－アルギニンおよび１０％透析ＦＢＳ含有ＳＩＬＡＣ ＤＭＥＭ中で少なくとも１０細胞倍加（１０日以上）の増殖によって代謝的に標識した。標識を維持する実験のために、細胞を、最初にそれらのそれぞれの前駆体中で少なくとも１０細胞倍加（１０日以上）増殖させた：ＤＡＰ（Ｌ）中のＤＯＰＡデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）発現細胞（初代ＢＭＤＭ）およびｄ－リジン（Ｈ）中のｌｙｒ発現細胞（ＰＤＡＣ細胞）。次いで、集団を１０ｍＭ ＤＡＰ（Ｌ）および１ｍＭ ｄ－リジン（Ｈ）中で合わせ、共培養で４日間（およそ４細胞倍加）一緒に増殖させた。共培養物を、実験の終わりに等しい数の細胞が予想される比率で播種した。馴化培地（ＣＭ）を回収し、下流のセクレトーム分析のために急速凍結した。細胞ペレットおよび溶解物を回収し、下流のプロテオーム分析のために急速凍結した。
標識交換実験のために、ＰＤＡＣおよびＢＭＤＭ細胞を、先ず７９８μＭの軽同位体標識ｌ－リジン（本明細書中以下で、軽もしくはＤＡＰと称される）または重同位体標識［１３Ｃ６、 １５Ｎ２］ｌ－リジン（＋８ダルトン、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）（本明細書中以下で、重もしくはｄ－Ｌｙｓ－８と称される）を補充したｌ－アルギニンおよび１０％透析ＦＢＳ含有ＳＩＬＡＣ ＤＭＥＭ中で少なくとも１０細胞倍加（１０日以上）の増殖によって代謝的に標識した。標識を維持する実験のために、細胞を、最初にそれらのそれぞれの前駆体中で少なくとも１０細胞倍加（１０日以上）増殖させた：ＤＡＰ（Ｌ）中のＤＯＰＡデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）発現細胞（初代ＢＭＤＭ）およびｄ－リジン（Ｈ）中のｌｙｒ発現細胞（ＰＤＡＣ細胞）。次いで、集団を１０ｍＭ ＤＡＰ（Ｌ）および１ｍＭ ｄ－リジン（Ｈ）中で合わせ、共培養で４日間（およそ４細胞倍加）一緒に増殖させた。共培養物を、実験の終わりに等しい数の細胞が予想される比率で播種した。馴化培地（ＣＭ）を回収し、下流のセクレトーム分析のために急速凍結した。細胞ペレットおよび溶解物を回収し、下流のプロテオーム分析のために急速凍結した。
【0168】
結果を図６および７に示す。
【0169】
単培養と比較した共培養におけるＰＤＡＣ細胞からのプロテオーム分析は、ＰＤＡＣ細胞が、ＢＭＤＭとの延長された共培養の後にマクロファージ由来のケモカインを取り入れることを示唆するＲＮＡシーケンシングデータを確証する。
【0170】
実施例７－ＢＭＤＭとの延長された共培養の後のＰＤＡＣ細胞浸潤を促進する新規のタンパク質標的を特定するためのマルチオミクスアプローチ（セクレトーム）
３Ｄ混合培養において観察された迅速な浸潤促進性表現型変化は、これらのＰＤＡＣ上皮およびＢＭＤＭ細胞の相互作用から放出されるシグナルによって媒介されている可能性があることが仮定された。それを特定するために、馴化培地（ＣＭ）を４８時間インキュベートした共培養物から回収し、タンパク質抽出物を使用して炎症抗体アレイを調べた。
３Ｄ混合培養において観察された迅速な浸潤促進性表現型変化は、これらのＰＤＡＣ上皮およびＢＭＤＭ細胞の相互作用から放出されるシグナルによって媒介されている可能性があることが仮定された。それを特定するために、馴化培地（ＣＭ）を４８時間インキュベートした共培養物から回収し、タンパク質抽出物を使用して炎症抗体アレイを調べた。
【0171】
馴化培地
馴化培地サンプルを、播種の４８時間後にＰＤＡＣおよびＢＭＤＭの単培養物および共培養物から単離し、製造者の説明書に従ってマウス炎症抗体アレイ（Ａｂｃａｍ）上でインキュベートした。画像を取得し、シグナルの強度をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６８０を使用して分析した。
馴化培地サンプルを、播種の４８時間後にＰＤＡＣおよびＢＭＤＭの単培養物および共培養物から単離し、製造者の説明書に従ってマウス炎症抗体アレイ（Ａｂｃａｍ）上でインキュベートした。画像を取得し、シグナルの強度をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６８０を使用して分析した。
【0172】
結果を図８および９に示す。
【0173】
４０個の潜在的な候補のうち、延長された共培養による最も高い検出可能なアップレギュレートされた強度を有する３つの炎症シグナルには、ＣＣモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）のリガンドである、ケモカインＣＣＬ２、ＣＣＬ３およびＣＣＬ９が含まれた。
【0174】
実施例８－ＣＣＲ１遮断は、マクロファージ媒介性浸潤促進性表現型を阻害する
ＢＭＤＭとの延長された共培養の後のＰＤＡＣ細胞におけるＣＣＲ１発現のアップレギュレーションがｑＲＴ－ＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって確認されたことから、次に、種々の小分子阻害剤を使用したＣＣＲ１の遮断が、ＢＭＤＭが浸潤の３ＤインビトロアッセイにおいてＰＤＡＣ細胞に浸潤促進性表現型を付与することを可能にする、ＰＤＡＣ細胞とマクロファージとの間のクロストークを潜在的に妨害し得るかどうかを決定しようとした。
ＢＭＤＭとの延長された共培養の後のＰＤＡＣ細胞におけるＣＣＲ１発現のアップレギュレーションがｑＲＴ－ＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって確認されたことから、次に、種々の小分子阻害剤を使用したＣＣＲ１の遮断が、ＢＭＤＭが浸潤の３ＤインビトロアッセイにおいてＰＤＡＣ細胞に浸潤促進性表現型を付与することを可能にする、ＰＤＡＣ細胞とマクロファージとの間のクロストークを潜在的に妨害し得るかどうかを決定しようとした。
【0175】
細胞共培養におけるＣＣＲ１アンタゴニスト処理
前処理：ＰＤＡＣ細胞およびＢＭＤＭを、実験開始の２４時間前にＣＣＲ１アンタゴニストで前処理し、回収し、次いで、実験期間の間、以前に記載される共培養方法に従って播種した。
前処理：ＰＤＡＣ細胞およびＢＭＤＭを、実験開始の２４時間前にＣＣＲ１アンタゴニストで前処理し、回収し、次いで、実験期間の間、以前に記載される共培養方法に従って播種した。
【0176】
共培養時の処理：ＰＤＡＣ細胞およびＢＭＤＭを、以前に記載される共培養方法に従って播種し、ＣＣＲ１アンタゴニストを、播種時に処理し、実験期間の間インキュベートした。
【0177】
結果を図１０～１３に示す。
【0178】
３つの市販のＣＣＲ１アンタゴニスト（ＢＸ－４７１、Ｊ１１３８６３およびＵＣＢ３５６２５、すべてＴｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから供給）での処理は、ｑＲＴ－ＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって、マクロファージの効果を制御して、ＰＤＡＣ細胞に機能的な浸潤促進能力を付与する一方で、延長された共培養に起因するＣＣＲ１発現の誘導を鈍らせもする著しい能力を示した。
【0179】
実施例９－ｓｉＲＮＡによるＣＣＲ１のノックダウンは、マクロファージ媒介性浸潤促進性表現型を鈍らせる
遺伝子ターゲティングおよび発現
ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウンを、ＳｍａｒｔＰｏｏｌ ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または個々のｓｉＲＮＡ配列を使用して達成し、１５ｎＭのｓｉＲＮＡおよびＲＮＡ ｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトした。
遺伝子ターゲティングおよび発現
ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウンを、ＳｍａｒｔＰｏｏｌ ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または個々のｓｉＲＮＡ配列を使用して達成し、１５ｎＭのｓｉＲＮＡおよびＲＮＡ ｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトした。
【0180】
細胞共培養におけるＣＣＲ１のｓｉＲＮＡノックダウン
ＣＣＲ１のｓｉＲＮＡノックダウンを、実験開始の２４時間前にＰＤＡＣ細胞およびＢＭＤＭに対して行い、回収し、次いで、実験期間の間、以前に記載される共培養方法に従って播種した。
ＣＣＲ１のｓｉＲＮＡノックダウンを、実験開始の２４時間前にＰＤＡＣ細胞およびＢＭＤＭに対して行い、回収し、次いで、実験期間の間、以前に記載される共培養方法に従って播種した。
【0181】
結果を図１４および１５に示す。
【0182】
共培養前のＰＤＡＣおよびＢＭＤＭ細胞におけるＣＣＲ１のノックダウンは、対照と比較してＣＣＲ１発現の誘導を抑制し、また、３Ｄでのマクロファージ媒介性浸潤を部分的に阻害した。この結果は、ＣＣＲ１を標的とする複数の異なるｓｉＲＮＡを用いて観察された。
【0183】
実施例１０－ＣＣＲ１に結合するリガンドに対する中和抗体は、マクロファージ媒介性浸潤促進性表現型を緩和し得る
炎症性ケモカイン受容体は、無差別なリガンド結合を示し、ケモカインは、今度は、複数の異なるケモカイン受容体に結合する。これが生物学的冗長性を表す程度、または個々のケモカイン受容体を通じた異なるケモカインによってトリガーされる個別のシグナルが存在するかどうかは、まだ決定されていない。単一のリガンドの遮断が、マクロファージによってＰＤＡＣ細胞に付与される浸潤促進性表現型を減少させるのに十分であり得るかどうかを試験するために、中和抗体（すべて、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の使用によって、２つの既知のリガンドであるＣＣＬ３およびＣＣＬ９（ヒトホモログＣＣＬ１５）、ならびにＣＣＲ１の１つの未知であるが潜在的に新規のリガンドであるＩＬ－１Ｂを中和した。すべてのリガンドを、以前のマルチオミクスハイスループットスクリーニングにおいて特定および確証した後に選択した。
炎症性ケモカイン受容体は、無差別なリガンド結合を示し、ケモカインは、今度は、複数の異なるケモカイン受容体に結合する。これが生物学的冗長性を表す程度、または個々のケモカイン受容体を通じた異なるケモカインによってトリガーされる個別のシグナルが存在するかどうかは、まだ決定されていない。単一のリガンドの遮断が、マクロファージによってＰＤＡＣ細胞に付与される浸潤促進性表現型を減少させるのに十分であり得るかどうかを試験するために、中和抗体（すべて、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の使用によって、２つの既知のリガンドであるＣＣＬ３およびＣＣＬ９（ヒトホモログＣＣＬ１５）、ならびにＣＣＲ１の１つの未知であるが潜在的に新規のリガンドであるＩＬ－１Ｂを中和した。すべてのリガンドを、以前のマルチオミクスハイスループットスクリーニングにおいて特定および確証した後に選択した。
【0184】
細胞共培養における中和抗体処理
前処理：ＰＤＡＣ細胞およびＢＭＤＭを、実験開始の２４時間前にＣＣＲ１リガンド中和抗体で前処理し、回収し、次いで、実験期間の間、以前に記載される共培養方法に従って播種した。
前処理：ＰＤＡＣ細胞およびＢＭＤＭを、実験開始の２４時間前にＣＣＲ１リガンド中和抗体で前処理し、回収し、次いで、実験期間の間、以前に記載される共培養方法に従って播種した。
【0185】
共培養での処理：ＰＤＡＣ細胞およびＢＭＤＭを、以前に記載される共培養方法に従って播種し、ＣＣＲ１リガンド中和抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから供給）を、播種時に処理し、実験期間の間インキュベートさせた。
【0186】
結果を図１６に示す。
【0187】
３つのリガンド（ＣＣＬ３およびＣＣＬ９およびＩＬ－１Ｂ）の各々の単一の遮断は、ＢＭＤＭの存在下でＰＤＡＣ細胞がその構造から浸潤することを防止する効力を示した。興味深いことに、抗ＣＣＬ９は、観察されたマクロファージ遊走の能力において独特であり、浸潤についてのＰＤＡＣ細胞の追跡能力の喪失を伴った。これは、どのようにして種々のリガンドがＣＣＲ１に結合し得るかにおける明確な二分を示唆し、さらなる調査の理論的根拠を提供する。重要なことに、ＩＬ－１ＢはＰＤＡＣの浸潤促進性表現型を鈍らせもすることが観察された。
【0188】
実施例１１－ＣＣＲ１アンタゴニスト、ＢＸ４７１は、インビボで原発腫瘍成長を鈍らせる
皮下側腹部注射モデルを、ＰＤＡＣの遺伝子操作されたマウスモデル、ＫＰＣマウスモデルのパイロットおよび代用実験として使用した。ここで、ＢＭＤＭ有りまたは無しのＰＤＡＣ細胞株を注射し、原発腫瘍を成長について追跡した。
皮下側腹部注射モデルを、ＰＤＡＣの遺伝子操作されたマウスモデル、ＫＰＣマウスモデルのパイロットおよび代用実験として使用した。ここで、ＢＭＤＭ有りまたは無しのＰＤＡＣ細胞株を注射し、原発腫瘍を成長について追跡した。
【0189】
インビボマウス研究
前処理：ＰＤＡＣおよびＢＭＤＭ細胞を、実験開始の２４時間前に、ＣＣＲ１アンタゴニスト、ＢＸ４７１で前処理し、一晩のインキュベーションのために、以前に記載される共培養方法に従って播種した。翌日に、等しい数の初代ＢＭＤＭ有りまたは無しの１×１０６個のｍＣｈｅｒｒｙ標識ＰＤＡＣ間葉系細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌとともに、６～８週齢の雄性の免疫能力のあるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから供給）の側腹部に注射した。７日目から開始して、マウスをカリパスを使用して別々に測定した。
前処理：ＰＤＡＣおよびＢＭＤＭ細胞を、実験開始の２４時間前に、ＣＣＲ１アンタゴニスト、ＢＸ４７１で前処理し、一晩のインキュベーションのために、以前に記載される共培養方法に従って播種した。翌日に、等しい数の初代ＢＭＤＭ有りまたは無しの１×１０６個のｍＣｈｅｒｒｙ標識ＰＤＡＣ間葉系細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌとともに、６～８週齢の雄性の免疫能力のあるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから供給）の側腹部に注射した。７日目から開始して、マウスをカリパスを使用して別々に測定した。
【0190】
結果を図１７および１８に示す。
【0191】
原発腫瘍成長の低下が、ＣＣＲ１アンタゴニスト、ＢＸ４７１の治療群において観察された。重要なことに、ＢＸ４７１治療マウスは、特にＰＤＡＣ細胞をＢＭＤＭ細胞と組み合わせたときに、延長された全生存を有することが観察された。
【0192】
実施例１２－ＣＣＲ１の高発現は、マクロファージ浸潤に関連しており、膵臓がんを有する患者を層別化するために使用され得る
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥ：デコンボリューションツール
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴによって使用されているシグネチャーマトリックス「ＬＭ２２」から遺伝子を抽出するために、その発現値が各細胞型について平均の１．９６標準偏差未満である遺伝子を先ずフィルタリング除去した。加えて、対応する細胞型についての活性化および休止状態を崩壊させた。一旦、他のデコンボリューション方法（Ｂｉｎｄｅａ ｅｔ ａｌ．、Ｄａｎａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｄａｖｏｌｉ ｅｔ ａｌ．ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ、ＭＣＰ－ＣｏｕｎｔｅｒおよびｘＣｅｌｌ）からのシグネチャー遺伝子を収集すると、各細胞型についての遺伝子の特有のユニオンを作成した。この遺伝子のユニオンから、ＴＣＧＡがん型の各々についての細胞型特異的遺伝子のセットをキュレートした。これを、ＴＩＭＥＲアルゴリズムと同様のアプローチを使用して行い、ここで、その遺伝子の発現が、対応するがん型についての腫瘍純度（ＡＢＳＯＬＵＴＥ由来）と負の相関（ピアソンの相関＜０．２、ｐ値０．０５）を有する場合にのみ遺伝子を含めた。最後に、単一サンプル遺伝子セットエンリッチメント分析（ｓｓＧＳＥＡ）を用いて、上記のように各細胞型について正規化されたエンリッチメントスコア（ＮＥＳ）を計算した。各腫瘍型についての一般的な免疫スコアを、様々な免疫細胞の遺伝子を各ＴＣＧＡがん型について１つの遺伝子セットに組み合わせることによって生成した。
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥ：デコンボリューションツール
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴによって使用されているシグネチャーマトリックス「ＬＭ２２」から遺伝子を抽出するために、その発現値が各細胞型について平均の１．９６標準偏差未満である遺伝子を先ずフィルタリング除去した。加えて、対応する細胞型についての活性化および休止状態を崩壊させた。一旦、他のデコンボリューション方法（Ｂｉｎｄｅａ ｅｔ ａｌ．、Ｄａｎａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｄａｖｏｌｉ ｅｔ ａｌ．ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ、ＭＣＰ－ＣｏｕｎｔｅｒおよびｘＣｅｌｌ）からのシグネチャー遺伝子を収集すると、各細胞型についての遺伝子の特有のユニオンを作成した。この遺伝子のユニオンから、ＴＣＧＡがん型の各々についての細胞型特異的遺伝子のセットをキュレートした。これを、ＴＩＭＥＲアルゴリズムと同様のアプローチを使用して行い、ここで、その遺伝子の発現が、対応するがん型についての腫瘍純度（ＡＢＳＯＬＵＴＥ由来）と負の相関（ピアソンの相関＜０．２、ｐ値０．０５）を有する場合にのみ遺伝子を含めた。最後に、単一サンプル遺伝子セットエンリッチメント分析（ｓｓＧＳＥＡ）を用いて、上記のように各細胞型について正規化されたエンリッチメントスコア（ＮＥＳ）を計算した。各腫瘍型についての一般的な免疫スコアを、様々な免疫細胞の遺伝子を各ＴＣＧＡがん型について１つの遺伝子セットに組み合わせることによって生成した。
【0193】
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥ細胞型比較
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥ細胞型存在量を、以前に記載されるようにＴＣＧＡ膵臓がんコホートからのバルク腫瘍ＲＮＡ－Ｓｅｑを使用して生成した。各細胞型についてのｓｓＧＳＥＡエンリッチメントスコアを、総免疫細胞存在量で割ることによってさらに正規化して、総免疫細胞浸潤の画分割合に似た細胞型スコアの比較をよりよく可能にした。次いで、これらのスコアを、中央値分割を使用してサンプルを免疫細胞画分が高いもの対低いものに層別化するために使用した。
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥ細胞型存在量を、以前に記載されるようにＴＣＧＡ膵臓がんコホートからのバルク腫瘍ＲＮＡ－Ｓｅｑを使用して生成した。各細胞型についてのｓｓＧＳＥＡエンリッチメントスコアを、総免疫細胞存在量で割ることによってさらに正規化して、総免疫細胞浸潤の画分割合に似た細胞型スコアの比較をよりよく可能にした。次いで、これらのスコアを、中央値分割を使用してサンプルを免疫細胞画分が高いもの対低いものに層別化するために使用した。
【0194】
カプラン・マイヤー生存分析
実施例２のＴＣＧＡ発現データを使用して、カプラン・マイヤー生存分析を以前に記載されるように行った。
実施例２のＴＣＧＡ発現データを使用して、カプラン・マイヤー生存分析を以前に記載されるように行った。
【0195】
ＴＣＧＡ膵臓がんコホートからのＲＮＡ－Ｓｅｑデータを、カプラン・マイヤー分析のために使用した。患者を、中分割に基づいて「低」または「高」発現に層別化した。２つのグループ間のログランク検定は、ＣＣＲ１低グループが高グループよりも有意に良好な無増悪生存を有することを示した（ｐ＝０．０３１）。
【0196】
ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥによって生成された免疫細胞推定を使用して、マクロファージ、樹状細胞および単球高カテゴリーのサンプルが、免疫細胞低カテゴリーよりも高いＣＣＲ１の平均発現を有することが見られ得る。逆は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞および制御性Ｔ細胞を含む多くの他の免疫細胞型について見られる。これは、ＴＣＧＡ膵臓がんサンプルにおけるＣＣＲ１とマクロファージ浸潤との間に有意な関連が存在することを示す。
【0197】
ＣＣＲ１遺伝子発現の高発現を有する患者は、低レベルを有する患者よりも悪い無増悪生存を示す。
【0198】
結果を図１９および２０に示す。
【0199】
実施例１３－延長された共培養の後に最も変化したタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析は、ケモカイン関連生物学的プロセスのエンリッチメントを明らかにする
延長された共培養の後に最も変化したタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析（本明細書中上記、実施例４）は、ケモカイン関連生物学的プロセスのエンリッチメントを明らかにする
遺伝子オントロジー（ＧＯ）は、遺伝子または遺伝子産物を、グラフ構造に編成された用語に階層的に分類するためのシステムを提供する。ＧＯの主な用途の１つは、遺伝子セットに対してエンリッチメント分析を行うことである。例えば、ＢＭＤＭとの延長された共培養条件下で膵臓がん細胞においてアップレギュレートされる遺伝子のセットが与えられると、このエンリッチメント分析により、その遺伝子セットのための注釈を使用して過剰提示されるＧＯ用語、または生物学的プロセスが見出された。
延長された共培養の後に最も変化したタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析（本明細書中上記、実施例４）は、ケモカイン関連生物学的プロセスのエンリッチメントを明らかにする
遺伝子オントロジー（ＧＯ）は、遺伝子または遺伝子産物を、グラフ構造に編成された用語に階層的に分類するためのシステムを提供する。ＧＯの主な用途の１つは、遺伝子セットに対してエンリッチメント分析を行うことである。例えば、ＢＭＤＭとの延長された共培養条件下で膵臓がん細胞においてアップレギュレートされる遺伝子のセットが与えられると、このエンリッチメント分析により、その遺伝子セットのための注釈を使用して過剰提示されるＧＯ用語、または生物学的プロセスが見出された。
【0200】
ＰＡＮＴＨＥＲ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ｐａｎｔｈｅｒｄｂ．ｏｒｇ）を使用して、分析しようとする遺伝子の名称を、１行当たり１つまたはコンマで区切って入力した。このツールは、ＭＯＤ特異的遺伝子名およびＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤの両方を処理し得る。分析のためのＧＯ態様（分子機能、生物学的プロセス、細胞構成要素）の選択を行った（この場合、生物学的プロセス）。種選択、マウスおよびヒトの両方、を考慮し、分析した。結果は、リダイレクトされたＰＡＮＴＨＥＲウェブサイトに表示される。これらの結果は、ステップ３において選択したゲノムにおけるすべてのタンパク質コード遺伝子のセットに対するエンリッチメントに基づいている。
【0201】
結果を図２１に示す。
【0202】
実施例１４－組み合わせたマクロファージおよびＣＣＲ１シグネチャーを、無増悪生存によって膵臓がん患者を層別化するために使用し得る。
カプラン・マイヤー分析
組み合わせた遺伝子シグネチャーを、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥマクロファージ遺伝子シグネチャーをＣＣＲ１と組み合わせて、新たな遺伝子セットを作成することによって作成し、その後、ｓｓＧＳＥＡを使用して、ＴＣＧＡ膵臓がんコホートにおける新たな遺伝子セットについての正規化されたエンリッチメントスコアを生成した。組み合わせたシグネチャーについての層別化を、「中／高」（ｘ＞０．２５分位数）および「低」（ｘ＜０．２５分位数）カテゴリーを作成するためのマクロファージシグネチャーカプラン・マイヤー分析において以前に記載されるように実施した。ログランク検定は、この組み合わせたシグネチャーのエンリッチメントが、有意により悪い無増悪生存と関連していることを示した（ｐ＝０．０３）。
カプラン・マイヤー分析
組み合わせた遺伝子シグネチャーを、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥマクロファージ遺伝子シグネチャーをＣＣＲ１と組み合わせて、新たな遺伝子セットを作成することによって作成し、その後、ｓｓＧＳＥＡを使用して、ＴＣＧＡ膵臓がんコホートにおける新たな遺伝子セットについての正規化されたエンリッチメントスコアを生成した。組み合わせたシグネチャーについての層別化を、「中／高」（ｘ＞０．２５分位数）および「低」（ｘ＜０．２５分位数）カテゴリーを作成するためのマクロファージシグネチャーカプラン・マイヤー分析において以前に記載されるように実施した。ログランク検定は、この組み合わせたシグネチャーのエンリッチメントが、有意により悪い無増悪生存と関連していることを示した（ｐ＝０．０３）。
【0203】
腫瘍内の高レベルのＣＣＲ１発現とマクロファージ浸潤との併用効果を調べるために、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＴＭＥマクロファージおよびＣＣＲ１発現の組み合わせた遺伝子シグネチャーを作成した。ｓｓＧＳＥＡを使用して、膵臓がんＴＣＧＡコホートにおける患者にわたるこのスコアのエンリッチメントを決定すると、組み合わせたシグネチャーのエンリッチメントがより悪い予後を示すことが観察された。この組み合わせたシグネチャーは、患者のさらなる層別化に役立てるために、２つの別々のカプラン・マイヤー分析の代わりに使用され得る。
【0204】
結果を図２２に示す。
【0205】
実施例１７－ＢＸ－４７１での処理は、下流のＩＧＦ１シグナル伝達経路遺伝子の活性化を鈍らせる。
ウエスタンブロッティング
６ウェルプレート中で増殖するＰＤＡＣ細胞株を、組換えＩＧＦ１、ＣＣＲ１アンタゴニスト、ＢＸ－４７１もしくはＪ－１１３８６３、または組換えＩＧＦ１とＣＣＲ１アンタゴニストとの組み合わせで２４時間処理した。細胞をかき取り、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する氷冷溶解緩衝液中で溶解した。タンパク質抽出物をヒートブロック中で５分間９５℃で変性させ、次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をニトロセルロースメンブレンに移し、これを一次抗体で一晩４℃でプローブし、続いてＩＲＤｙｅ二次抗体（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）との室温で６０分間のインキュベーションを行った。標的タンパク質を、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて検出した。使用した一次抗体には、ＡＫＴ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＫＴ、４Ｅ－ＢＰ１、Ｐｈｏｓｐｈｏ－４Ｅ－ＢＰ１、ＭＥＫ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＭＥＫ、ＭＡＰＫ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ１／２およびＧＡＰＤＨに対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）が含まれる。
ウエスタンブロッティング
６ウェルプレート中で増殖するＰＤＡＣ細胞株を、組換えＩＧＦ１、ＣＣＲ１アンタゴニスト、ＢＸ－４７１もしくはＪ－１１３８６３、または組換えＩＧＦ１とＣＣＲ１アンタゴニストとの組み合わせで２４時間処理した。細胞をかき取り、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する氷冷溶解緩衝液中で溶解した。タンパク質抽出物をヒートブロック中で５分間９５℃で変性させ、次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をニトロセルロースメンブレンに移し、これを一次抗体で一晩４℃でプローブし、続いてＩＲＤｙｅ二次抗体（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）との室温で６０分間のインキュベーションを行った。標的タンパク質を、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて検出した。使用した一次抗体には、ＡＫＴ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＫＴ、４Ｅ－ＢＰ１、Ｐｈｏｓｐｈｏ－４Ｅ－ＢＰ１、ＭＥＫ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＭＥＫ、ＭＡＰＫ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ１／２およびＧＡＰＤＨに対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）が含まれる。
【0206】
以前の報告から、ＩＧＦ１が、化学療法に対する膵臓がんの耐性において中心的な役割を果たしていることが明らかである。これに関連して、本発明者らは、ＣＣＲ１阻害がＩＧＦ１シグナル伝達経路に何らかの影響を及ぼすかどうかを決定しようとした。組換えＩＧＦ１および種々のＣＣＲ１アンタゴニストでの処理後のＰＤＡＣ細胞株における下流のＩＧＦ１シグナル伝達経路遺伝子の発現を、ウエスタンブロッティングを用いて評価した。組換えＩＧＦ１処理後のＡＫＴおよび４Ｅ－ＢＰ１の活性化および発現プロファイルは、アンタゴニストＢＸ－４７１を使用したＣＣＲ１の阻害によって特に鈍らされ、これは、ＢＸ－４７１に対する本発明者らの優先度の理論的根拠を提供した。
【0207】
どのようにしてＣＣＲ１阻害がＩＧＦ１シグナル伝達経路に影響を及ぼすかをさらに調べるために、組換えＩＧＦ１および種々のＣＣＲ１アンタゴニストでの処理後のＰＤＡＣ細胞株を、包括的および比較プロテオームならびにリン酸化プロテオームプロファイリングアッセイによって評価した。データを、研究室のポストドクター研究員によって自前で開発された遺伝子経路ネットワーク分析パイプラインに入力した。ＩＧＦ１ファミリー遺伝子は、対照と比較して組換えＩＧＦ１を加えることでアップレギュレートされた。しかしながら、ＣＣＲ１アンタゴニスト、ＢＸ－４７１での処理は、このアップレギュレーションを激しく鈍らせた。
【0208】
結果を図２３および２４に示す。
【0209】
実施例１８－ＣＣＲ１アンタゴニストベースの併用療法での治療は、ＰＤＡＣのインビボ、遺伝子操作マウスモデル（ＫＰＣモデル）において有効である
インビボ研究の理論的根拠
本研究は、ＰＤＡＣのための新規の治療オプションとしてのＣＣＲ１阻害剤のゲムシタビンおよび／または免疫療法との併用を試験することを目的とする。予備的な前臨床データは、小分子ＣＣＲ１阻害剤が、免疫抑制性であるとして関係付けられている腫瘍微小環境の主要な亜集団である、マクロファージと腫瘍細胞との間の細胞間コミュニケーションを妨害するという証拠を提供する。ＰＤＡＣは線維形成によって特徴付けられることから、先ずＢＸ－４７１などのＣＣＲ１阻害剤を使用することによって患者の腫瘍微小環境を標的化し、次いで、ゲムシタビンおよび／または免疫療法で腫瘍を治療することが、標準治療を改善し、クリニックにおけるＰＤＡＣのための将来の治療オプションの情報を与えることが期待される。この進行中の概念実証研究は、インビボＫＰＣマウスモデルを使用する。これは、前臨床的に、臨床第Ｉ相検討の前にＰＤＡＣのための治療オプションの効力を決定するための、ゴールドスタンダードである。この研究には、臨床グレードとみなされるＫＰＣバンドＡマウスを使用した無作為化５群間介入研究、ならびに追加のパイロット実験が含まれる。
インビボ研究の理論的根拠
本研究は、ＰＤＡＣのための新規の治療オプションとしてのＣＣＲ１阻害剤のゲムシタビンおよび／または免疫療法との併用を試験することを目的とする。予備的な前臨床データは、小分子ＣＣＲ１阻害剤が、免疫抑制性であるとして関係付けられている腫瘍微小環境の主要な亜集団である、マクロファージと腫瘍細胞との間の細胞間コミュニケーションを妨害するという証拠を提供する。ＰＤＡＣは線維形成によって特徴付けられることから、先ずＢＸ－４７１などのＣＣＲ１阻害剤を使用することによって患者の腫瘍微小環境を標的化し、次いで、ゲムシタビンおよび／または免疫療法で腫瘍を治療することが、標準治療を改善し、クリニックにおけるＰＤＡＣのための将来の治療オプションの情報を与えることが期待される。この進行中の概念実証研究は、インビボＫＰＣマウスモデルを使用する。これは、前臨床的に、臨床第Ｉ相検討の前にＰＤＡＣのための治療オプションの効力を決定するための、ゴールドスタンダードである。この研究には、臨床グレードとみなされるＫＰＣバンドＡマウスを使用した無作為化５群間介入研究、ならびに追加のパイロット実験が含まれる。
【0210】
方法：動物モデルおよびサンプル処理
自発的ＰＤＡＣを保有するＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；ＬＳＬ－Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋；Ｐｄｘ－１－Ｃｒｅ（ＫＰＣ）マウスの生成は、以前に記載されている（Ｈｉｎｇｏｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２００５，７（５），４６９－４８３）。遺伝子型決定したＫＰＣマウスを、主な介入研究および追加のパイロット実験に登録した。（それらのＰＣ同腹子は、腫瘍を生成しない。）すべてのＫＰＣ実験グループを、性別および年齢について無作為化した。
自発的ＰＤＡＣを保有するＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；ＬＳＬ－Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋；Ｐｄｘ－１－Ｃｒｅ（ＫＰＣ）マウスの生成は、以前に記載されている（Ｈｉｎｇｏｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２００５，７（５），４６９－４８３）。遺伝子型決定したＫＰＣマウスを、主な介入研究および追加のパイロット実験に登録した。（それらのＰＣ同腹子は、腫瘍を生成しない。）すべてのＫＰＣ実験グループを、性別および年齢について無作為化した。
【0211】
ＫＰＣマウスにおけるＰＤＡＣ腫瘍を、触診および高解像度超音波スキャン（Ｖｅｖｏ ２１００、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）によって検出し、剖検で確認した。直径３～６ｍｍ（超音波による）の腫瘍を有する体重が安定したＰＤＡＣ保有マウスとして規定される、臨床グレードのＫＰＣバンドＡマウスを、主な介入研究に登録した。（１）１個より多い腫瘍の特定、（２）大きな閉塞した総胆管、（３）６ｍｍよりも大きな腫瘍、（４）腎炎の存在、（５）脾腫、（６）大きな嚢胞、または（７）横隔膜中に存在する可視性の転移性腫瘍を含むとして規定される、ＫＰＣバンドＢマウス（非臨床グレードのＫＰＣ腫瘍保有マウス）を、追加の最初のパイロット実験のために使用した。すべての腫瘍は、組織病理学的に腺がんと確認された。すべてのマウスを、体重および状態について毎日モニターした。
【0212】
安楽死を、１２時間の明期内に行った。終末出血を、イソフルラン麻酔下での心臓穿刺を介した放血を通じて得、死亡を頸椎脱臼によって確認した。血漿を、１４，０００ｇで５分間４℃での遠心分離によって調製し、液体窒素中で急速凍結した。臓器、他の組織、および腫瘍サンプルのアリコートを、一貫した順序で迅速に解剖し、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド（ＮＢＦ）中で２４時間室温で固定した後、７０％エタノールに移し、免疫組織化学のために処理した。
【0213】
主な介入研究の設計
図２５は、使用した５つの実験コホートの規定を含む、主な介入研究のための実験計画、ならびに治療条件および研究期間を示すタイムラインを示す。使用したＣＣＲ１阻害剤は、ＢＸ－４７１であった。使用した抗ＰＤ－１抗体は、ＢｉｏＸＣｅｌｌ ＩｎＶｉｖｏＭａｂラット抗マウスＰＤ－１（ＣＤ２７９）（クローン－ＲＭＰ１－１４モノクローナル抗体、ＩｇＧ２ａ、ｋ）であった。
図２５は、使用した５つの実験コホートの規定を含む、主な介入研究のための実験計画、ならびに治療条件および研究期間を示すタイムラインを示す。使用したＣＣＲ１阻害剤は、ＢＸ－４７１であった。使用した抗ＰＤ－１抗体は、ＢｉｏＸＣｅｌｌ ＩｎＶｉｖｏＭａｂラット抗マウスＰＤ－１（ＣＤ２７９）（クローン－ＲＭＰ１－１４モノクローナル抗体、ＩｇＧ２ａ、ｋ）であった。
【0214】
最初のパイロット実験は、併用（３×）療法におけるコラーゲン断片化および免疫細胞浸潤の増加を明らかにする
ホットで変化した（除外され、免疫抑制された）腫瘍とコールドな腫瘍との間の区別は、腫瘍内の細胞傷害性Ｔ細胞ランドスケープに基づく。この単純化は、腫瘍と免疫系との間の複雑な相互作用の結末を反映する。ＫＰＣバンドＢマウスを使用して、主な研究の種々の介入群を先ず見た。
ホットで変化した（除外され、免疫抑制された）腫瘍とコールドな腫瘍との間の区別は、腫瘍内の細胞傷害性Ｔ細胞ランドスケープに基づく。この単純化は、腫瘍と免疫系との間の複雑な相互作用の結末を反映する。ＫＰＣバンドＢマウスを使用して、主な研究の種々の介入群を先ず見た。
【0215】
少数のＫＰＣバンドＢマウスを、ビヒクル単独、ＢＸ－４７１単独（図２８Ａ）、ゲムシタビン単独もしくはＢＸ－４７１との組み合わせ（図２８Ｂ）、またはゲムシタビン、ＢＸ－４７１および抗ＰＤ１の併用（３×療法）として（図２８Ｃ）のいずれかでの治療に登録した。規制上の制限に起因して、これらのマウスを延長された生存研究のために維持することはできず、登録後およそ１０日で処分した。
【0216】
パイロット実験の結果を図２６に示す。（Ａ）は、ビヒクルまたはＢＸ－４７１で１０日間治療したときのＫＰＣバンドＢ腫瘍におけるＣｏｌＶＩ（コラーゲン）およびＫＲＴ１９（腫瘍細胞）の免疫蛍光染色を示す。（Ｂ）は、ゲムシタビン＋ビヒクルまたはゲムシタビン＋ＢＸ－４７１（２×療法）のいずれかで１０日間治療したときのＫＰＣバンドＢ腫瘍のＨ＆Ｅ染色を示す。（Ｃ）は、ビヒクルまたはゲムシタビン＋ＢＸ－４７１＋抗ＰＤ－１（３×療法）のいずれかで１０日間治療したときのＫＰＣバンドＢ腫瘍におけるＣＤ４５（免疫細胞）、ＣｏｌＶＩ（コラーゲン）およびＫＲＴ１９（腫瘍細胞）の免疫蛍光染色を示す。
【0217】
薬物送達に対する単純な生物物理学的障害としてのＰＤＡＣストローマの特徴付けは、ストローマ中に存在する数十個の異なる細胞型の寄与を過度に単純化する。しかしながら、興味深いことに、コラーゲンＶＩに対する抗体で染色したバンドＢ腫瘍の予備的な分析は、マウスをＣＣＲ１アンタゴニスト、ＢＸ－４７１で治療したときの、ビヒクル対照と比較しての、ＰＤＡＣ腫瘍微小環境の形態の変化を明らかにした（図２８Ａ）。コラーゲン沈着のこの断片化は、マウスにおけるＣＣＲ１シグナル伝達軸を損なうことが、重大な生物学的アーキテクチャー変化をもたらし得ることを示唆する。
【0218】
マウスの別のコホートを、ゲムシタビン単独またはＢＸ－４７１との組み合わせで治療した。興味深いことに、Ｈ＆Ｅ染色は、以前に観察されたストローマ断片化表現型上に築かれ、原発腫瘍部位中への浸潤リンパ球および白血球の増加を示す（図２８Ｂ）。浸潤免疫細胞集団および線維化アーキテクチャーの二分の差異は著しく、これは、ＣＣＲ１の遮断が腫瘍部位中への免疫細胞侵入を改善することを示唆する。
【0219】
最後に、１匹のＫＰＣバンドＢマウスを、ビヒクル対照と並行して実行した、三重併用療法に登録した。三重療法は、コラーゲン断片化（コラーゲンＶＩ染色によって明らかにされた）、ＣＤ４５＋染色の増加、およびＫＲＴ１９腫瘍細胞染色の減少を示した（Ｃ）。
【0220】
介入研究の最初の結果：併用２×（ＢＸ－４７１＋ＧＥＭ）または３×（ＢＸ－４７１＋ＧＥＭ＋抗ＰＤ１）療法におけるＣＣＲ１阻害は、ＰＤＡＣのマウスモデルにおける延命効果を示す
併用療法群の理論的根拠は、腫瘍細胞とマクロファージとの間のコミュニケーションを遮断し、コラーゲン配置の生物物理学的密度を断片化し、原発腫瘍部位中へのＴＩＬの流入を可能にするためのＣＣＲ１阻害のためである。ＣＣＲ１の遮断と同時に、ゲムシタビンの治療は、全身的で直接的な腫瘍死滅を提供するように作用する（二重療法）。最後に、ＰＤ－１に結合する抗体を加えることは、このチェックポイント分子が浸潤細胞傷害性Ｔ細胞のスイッチをオフにするのを止めることによって免疫細胞の活性をブーストすることを目的とする（三重療法）。
併用療法群の理論的根拠は、腫瘍細胞とマクロファージとの間のコミュニケーションを遮断し、コラーゲン配置の生物物理学的密度を断片化し、原発腫瘍部位中へのＴＩＬの流入を可能にするためのＣＣＲ１阻害のためである。ＣＣＲ１の遮断と同時に、ゲムシタビンの治療は、全身的で直接的な腫瘍死滅を提供するように作用する（二重療法）。最後に、ＰＤ－１に結合する抗体を加えることは、このチェックポイント分子が浸潤細胞傷害性Ｔ細胞のスイッチをオフにするのを止めることによって免疫細胞の活性をブーストすることを目的とする（三重療法）。
【0221】
図２７は、主な介入研究の５つすべての治療群に登録されたマウスについての生存率曲線を示す。生存の増加が、ゲムシタビンまたはＢＸ－４７１単剤療法と比較して、２×（ＢＸ－４７１＋ゲムシタビン）および３×（ＢＸ－４７１＋ゲムシタビン＋抗ＰＤ１）の両方の併用治療について観察された。
【0222】
本発明の特定の実施形態を、参照および例証の目的のために説明したが、種々の改変が、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲から逸脱することなしに、当業者にとって明らかとなる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26-1】
【図26-2】
【図27】
【国際調査報告】