特表 2023-507922 ＦｃγＲＩＩＢ親和性が増強された抗体Ｆｃ領域

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-28

(54)【発明の名称】ＦｃγＲＩＩＢ親和性が増強された抗体Ｆｃ領域

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230220BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230220BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230220BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230220BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230220BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230220BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230220BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230220BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230220BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230220BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230220BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230220BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230220BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230220BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/00 ZNA

C07K19/00

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K48/00

A61P35/00

A61P35/02

A61K39/395 E

A61K39/395 T

A61K39/395 Y

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022533391

(86)(22)【出願日】2020-12-03

(85)【翻訳文提出日】2022-06-28

(86)【国際出願番号】 CN2020133685

(87)【国際公開番号】W WO2021110110

(87)【国際公開日】2021-06-10

(31)【優先権主張番号】201911223227.1

(32)【優先日】2019-12-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522200317

【氏名又は名称】上海交通大学医学院

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＪＩＡＯＴＯＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＳＣＨＯＯＬ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ２８０， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｓｏｕｔｈ Ｒｏａｄ， Ｈｕａｎｇｐｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００２５，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100135079

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 修

(72)【発明者】

【氏名】李 福彬

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼ 燕

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼ ▲み▼

(72)【発明者】

【氏名】▲畢▼ ▲艶▼侠

(72)【発明者】

【氏名】田 世豪

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼ 慧慧

(72)【発明者】

【氏名】柳 淑君

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB36

4C085BB42

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、エンジニアリングされたＦｃ領域を提供し、親Ｆｃ領域と比較し、前記のＦｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、ＦｃγＲＩＩＢに対するこれらのエンジニアリングされたＦｃ領域の親和性は、ＦｃγＲＩＩＢに対する親Ｆｃ領域の親和性と比較して向上した。前記エンジニアリングされたＦｃ領域を含む抗体、特にアゴニスト抗体も提供した。エンジニアリングされたＦｃ領域は、抗体のアゴニスト活性を最適化するために重要である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントであって、
（ｉ）前記変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、変異前の対応する野生型Ｆｃフラグメントと比較して変異を持つ；かつ
（ｉｉ）野生型Ｆｃ領域と比較し、ＦｃγＲＩＩＢに対する前記変異型Ｆｃ領域の親和性が向上する；かつ、前記野生型Ｆｃは、野生型ＩｇＧ２のＦｃであることを特徴とする変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント。

【請求項2】

請求項１に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントを含むことを特徴とする変異型免疫グロブリンＦｃ領域。

【請求項3】

請求項１に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、又は請求項２に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域を含むことを特徴とする抗体。

【請求項4】

請求項１に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、請求項２に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、又は請求項３に記載された抗体を含むことを特徴とする融合タンパク質。

【請求項5】

請求項１に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、請求項２に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、請求項３に記載された抗体、又は請求項４に記載された組換えタンパク質をコードすることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項6】

請求項５に記載された単離されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。

【請求項7】

請求項６に記載されたベクターを含むか、又はそのゲノムに請求項５に記載されたポリヌクレオチドを組み込む；
或いは請求項１に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、請求項２に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、請求項３に記載された抗体、又は請求項４に記載された組換えタンパク質を発現することを特徴とする宿主細胞。

【請求項8】

（ａ）請求項１に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、請求項２に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、請求項３に記載された抗体、又は請求項４に記載された組換えタンパク質；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体；を含むことを特徴とする薬物組成物。

【請求項9】

請求項１に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、請求項２に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、請求項３に記載された抗体、又は請求項４に記載された組換えタンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）適切な条件では、請求項７に記載された宿主細胞を培養し、前記変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、前記変異型免疫グロブリンＦｃ領域、前記抗体、又は前記組換えタンパク質を含有する培養物を得る；及び
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた培養物を精製および／または単離し、前記の前記変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、変異型免疫グロブリンＦｃ領域、抗体、又は組換えタンパク質を得るというステップを含むことを特徴とする方法。

【請求項10】

腫瘍免疫療法に用いられる、炎症および／または自身免疫症状を軽減する薬物組成物の調製に使用することを特徴とする請求項１に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、請求項２に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、請求項３に記載された抗体、又は請求項４に記載された組換えタンパク質、請求項５に記載されたポリヌクレオチド、請求項６に記載されたベクターおよび／または請求項７に記載された宿主細胞の応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオ医薬分野に関し、特に一列のヒトＩｇＧ２抗体のＦｃ領域のバリアントに関し、これらのバリアントは、増強されたＦｃγＲＩＩＢ親和性を有するので、これらのＦｃ領域バリアントを含むアゴニスト抗体は、より優れたアゴニスト活性を有すると期待される。

【背景技術】

【0002】

生体高分子医薬品の開発は、さまざまな疾病の治療に新たなアプローチと可能性をもたらし、特に抗体と重鎖定常領域（Ｆｃ領域を含む）に基づく分子標的療法は、抗体と重鎖定常領域融合タンパク質を含み、過去３０年間にバイオ医薬品分野に大きな成功を収めながら、引き続き当該分野の焦点になる。

【0003】

生体高分子は、その作用方式から、標的（分子や細胞）をクリアするエフェクター分子、標的が関与するシグナル伝達経路をブロックするブロッキング分子、標的の下流のシグナル伝達経路を活性化するアゴニスト分子に大別される。近年に、腫瘍の免疫療法が、重大な進展を遂げた。これは、免疫を抑制するノードを遮断することで、免疫細胞の活性を向上し、腫瘍を殺滅する抗体を使用することのかげである。しかしながら、ただいま相変わらず、多くのがん患者は、既存の治療手段に反応しない。そして、一方では、既存の腫瘍免疫療法の手段を最適化する必要があり、他方では、新しい腫瘍免疫療法の薬物を研究開発することは、急務である。特に、「アゴニスト抗体」と呼ばれる腫瘍免疫療法手段は、免疫細胞の表面との結合によって、免疫活性化シグナルの標的分子を転送し、かつそれに制御される重要な免疫活性化シグナル経路を活性化して、さらに抗腫瘍免疫応答を増強して、間接に腫瘍細胞を殺滅できる。しかしながら、アゴニスト腫瘍免疫療法の抗体の大きな可能性は、既に動物モデルに証明され、かつ広くに納得されだけではなく、将来性があるとみられる腫瘍免疫療法構想になるが、これらの抗体の研究開発がまだ成功しておらず、腫瘍免疫療法の分野における大きな課題である。また、アゴニスト抗体の活性化も、他の生物学過程における肝心なシグナル経路を介入・調整する有利な手段であり、疾患の予防と制御及び治療分野に広い応用見通しがある。たとえば、免疫抑制シグナル経路を活性化すると、炎症と自己免疫症状の軽減に役立つ可能性がある。

【0004】

抗体は、主に定常領域を介してＦｃγＲと相互作用し、抗体が異なればＦｃγＲへの結合能力も異なり、この違いはインビボでの抗体の機能にも影響を及ぼす。抗体Ｆｃのエンジニアリングは、治療用抗体を最適化するための重要な手段および傾向であり、ただし、抗体Ｆｃ領域と、ＦｃγＲなどの主要タンパク質との相互作用能を変更することは、抗体活性を最適化するための非常に効果的な方法である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上記課題に対し、本発明は、ＩｇＧに基づき、Ｆｃ領域を変異させることにより、ＦｃγＲＩＩＢの親和性を増強することができるアミノ酸変異およびその組み合わせを得る；これらのアミノ酸変異を含むＦｃは、抗体の活性を最適化するため、特にアゴニスト抗体のアゴニスト活性を向上するために使用することができる。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の第１の態様では、変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントを提供し、前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、以下の特徴を有する：
（ｉ）前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、変異前の対応する野生型Ｆｃフラグメントと比較して変異を持つ；かつ
（ｉｉ）野生型Ｆｃ領域と比較し、ＦｃγＲＩＩＢに対する前記変異型Ｆｃ領域の親和性が向上する；かつ、前記の野生型Ｆｃは、野生型ＩｇＧ２のＦｃである。

【0007】

別の好ましい例では、前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、変異前の対応する野生型Ｆｃフラグメントと比較して、以下から選べられるサイトの変異を有する：Ｌ３２８、Ｈ２６８、Ｓ２６７、Ｐ２７１、Ｇ３２７、又はその組み合わせ；
ただし、全てのアミノ酸の番号は、ＩｇＧ Ｅｕ番号に基づく。

【0008】

別の好ましい例では、前記の親和性は、スクリーニングの濃縮度または結合分析シグナルに反映することができる。

【0009】

別の好ましい例では、前記野生型Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ Ｅｕ番号に基づくＩｇＧ２のアミノ酸配列における２３３位から３３２位までであり、かつ前記野生型Ｆｃフラグメントのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示される。

【0010】

別の好ましい例では、野生型Ｆｃフラグメントと比較し、前記変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、増強されたＦｃγＲＩＩＢ親和性を有する。

【0011】

別の好ましい例では、ＦｃγＲＩＩＢに対する変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントの親和性は、ＦｃγＲＩＩＢに対する野生型Ｆｃフラグメントの親和性よりも１倍以上高く、好ましくに、２、３、４、５、１０、２０、５０又は１００倍以上高い。

【0012】

別の好ましい例では、前記変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、ＦｃγＲＩＩＢよりも活性化性ＦｃγＲに対する親和性が低い。

【0013】

別の好ましい例では、野生型Ｆｃフラグメントと比較し、前記変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、ＦｃγＲＩＩＢへの親和性が向上し、且つ活性化性ＦｃγＲへの親和性が低下する（Ｉ／Ａ比の値は、野生型Ｆｃフラグメントより高い）。

【0014】

別の好ましい例では、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＡ^１３１Ｒに対する前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントの親和性の比（ＲＩＩＢ／ＲＩＩＡＲ）は、野生型ＩｇＧ２より高い。

【0015】

別の好ましい例では、前記の活性化性ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ^１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩＡ^１３１Ｒ、ＦｃγＲＩＩＩＡ^１５８ＦとＦｃγＲＩＩＩＡ^１５８Ｖを含む。

【0016】

別の好ましい例では、変異Ｌ３２８は、Ｌ３２８Ｗ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｙ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ａ、Ｌ３２８Ｇ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｐ、Ｌ３２８Ｒ、Ｌ３２８Ｖ；好ましくに、Ｌ３２８Ｗ又はＬ３２８Ｅを含む。

【0017】

別の好ましい例では、変異Ｈ２６８は、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｓ、Ｈ２６８Ｅ、Ｈ２６８Ｋ、Ｈ２６８Ｎ；好ましくに、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｓ又はＨ２６８Ｅを含む。

【0018】

別の好ましい例では、変異Ｓ２６７は、Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｖ、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｍ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ａ、Ｓ２６７Ｇ、Ｓ２６７Ｒ、Ｓ２６７Ｎ、Ｓ２６７Ｗ；好ましくにＳ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｖ、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｍ；より好ましくにＳ２６７Ｅを含む。

【0019】

別の好ましい例では、変異Ｐ２７１は、Ｐ２７１Ｃ、Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２７１Ｖ、Ｐ２７１Ａ、Ｐ２７１Ｗ、Ｐ２７１Ｙ、Ｐ２７１Ｑ、Ｐ２７１Ｔ、Ｐ２７１Ｉ、Ｐ２７１Ｌ、Ｐ２７１Ｓ；好ましくにＰ２７１Ｃ、Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２７１Ｖ、Ｐ２７１Ａ、Ｐ２７１Ｗ、Ｐ２７１Ｙ、Ｐ２７１Ｑ、Ｐ２７１Ｔ；より好ましくにＰ２７１Ｃ、Ｐ２７１Ｇを含む。

【0020】

別の好ましい例では、変異Ｇ３２７は、Ｇ３２７Ａ、Ｇ３２７Ｌ、Ｇ３２７Ｓ；好ましくにＧ３２７Ａを含む。

【0021】

別の好ましい例では、前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、野生型Ｆｃフラグメントと比較して、以下から選択される部位に変異Ｌ３２８Ｗ、Ｌ３２８Ｅ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｓ、Ｈ２６８Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３３Ｇ、Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２７１Ｃ、Ｐ２７１Ｖ、Ｐ２７１Ａ、Ｐ２７１Ｗ、Ｐ２７１Ｙ、Ｇ３２７Ａ、又はその組み合わせを有する；ただし、全てのアミノ酸の番号は、ＩｇＧ Ｅｕ番号に基づく。

【0022】

別の好ましい例では、前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、野生型Ｆｃフラグメントと比較して、２つのサイトＬ３２８とＨ２６８のうちの少なくとも１つの変異を有し、かつ前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントの変異は、具体的に、以下から選べられる：Ｌ３２８Ｗ、Ｌ３２８Ｅ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｓ、Ｈ２６８Ｅ、Ｈ２６８Ｄ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗ、Ｓ２６７Ｖ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗ、Ｖ２３４Ｍ／Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗ、Ａ２３５Ｗ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗ、Ｖ２３４Ｑ／Ａ２３５Ｇ／Ｐ２３８Ｌ／Ｓ２３９Ｖ／Ｈ２６８Ｄ／Ｇ３２７Ａ／Ｌ３２８Ｅ／Ａ３３０Ｓ／Ｉ３３２Ｔ、Ｓ２３９Ｖ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗ、Ｖ２６６Ｌ／Ｌ３２８Ｗ、Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｅ２６９Ｄ／Ｐ２７１Ｑ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｓ／Ｅ２６９Ｄ、Ｐ２３３Ｆ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗ、Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗ、Ｖ２３４Ｑ／Ａ２３５Ｇ／Ｐ２３８Ｌ／Ｓ２３９Ｖ／Ｇ３２７Ａ／Ｌ３２８Ｅ／Ａ３３０Ｓ／Ｉ３３２Ｔ、Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｓ／Ｅ２６９Ｖ、Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｓ／Ｅ２６９Ｖ／Ｐ２７１Ｃ、Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｓ／Ｅ２６９Ａ／Ｐ２７１Ｃ、Ｓ２６７Ｖ／Ｓ２９８Ｇ／Ｌ３２８Ｗ、Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｍ／Ｈ２６８Ｅ／Ｐ２７１Ｑ、Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｓ／Ｅ２６９Ｇ／Ｐ２７１Ｔ、Ｖ２３４Ｑ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｅ２６９Ｄ／Ｐ２７１Ｑ、Ｖ２３４Ｑ／Ａ２３５Ｇ／Ｐ２３８Ｌ／Ｓ２３９Ｖ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｓ／Ｅ２６９Ｄ、Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｓ／Ｐ２７１Ｖ、Ｖ２３４Ｑ／Ａ２３５Ｇ／Ｐ２３８Ｌ／Ｓ２３９Ｖ／Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２９８Ｌ／Ｇ３２７Ａ／Ｌ３２８Ｅ／Ａ３３０Ｓ／Ｉ３３２Ｔ、Ｖ２３４Ｑ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｓ／Ｅ２６９Ｖ、Ｌ３２８Ｅ／Ｉ３３２Ｔ；ただし、全てのアミノ酸の番号は、ＩｇＧ Ｅｕ番号に基づく。

【0023】

別の好ましい例では、前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、野生型Ｆｃフラグメントと比較して、Ｓ２６７サイトの変異を有し、かつ前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントの変異は、具体的に、以下から選べられる：Ｓ２６７Ｅ／Ａ３３０Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２９８Ｇ、Ｐ２３３Ｇ／Ｓ２６７Ｅ、Ｖ２３４Ｍ／Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｉ３３２Ｌ、Ｐ２３３Ｇ／Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２９８Ｇ、Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２３８Ｑ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ａ／Ｐ２７１Ｃ、Ｓ２６７Ａ／Ｐ２７１Ｇ、Ｓ２６７Ｅ／Ｄ２７０Ｈ、Ｓ２６７Ｅ／Ｐ２７１Ｃ、Ｓ２６７Ｅ／Ｐ２７１Ｖ、Ｓ２６７Ｅ／Ｐ２７１Ｗ、Ｓ２６７Ｅ／Ｐ２７１Ｙ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２９８Ｒ、Ｓ２６７Ｍ／Ｐ２７１Ｃ、Ｓ２６７Ｍ／Ｐ２７１Ｇ、Ｓ２６７Ｖ／Ｓ２９８Ｌ、Ｓ２６７Ｅ／Ｐ３２９Ｒ；ただし、全てのアミノ酸の番号は、ＩｇＧ Ｅｕ番号に基づく。

【0024】

別の好ましい例では、前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、野生型Ｆｃフラグメントと比較して、Ｓ２６７サイトの変異を有し、かつ前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントの変異は、具体的に、以下から選べられる：Ｓ２６７Ｅ／Ａ３３０Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２９８Ｇ、Ｐ２３３Ｇ／Ｓ２６７Ｅ、Ｖ２３４Ｍ／Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｉ３３２Ｌ、Ｐ２３３Ｇ／Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２９８Ｇ、Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｐ２７１Ｇ、Ｓ２６７Ｅ／Ｐ２７１Ｃ；ただし、全てのアミノ酸の番号は、ＩｇＧ Ｅｕ番号に基づく。

【0025】

別の好ましい例では、前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、野生型Ｆｃフラグメントと比較して、Ｐ２７１サイトの変異を有し、かつ前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントの変異は、以下から選べられる：Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｐ２７１Ｇ、Ｖ２６６Ａ／Ｐ２７１Ｃ、Ｖ２６６Ａ／Ｐ２７１Ｇ、Ｓ２６７Ａ／Ｐ２７１Ｃ、Ｓ２６７Ａ／Ｐ２７１Ｇ、Ｓ２６７Ｅ／Ｐ２７１Ｃ、Ｓ２６７Ｅ／Ｐ２７１Ｖ、Ｓ２６７Ｅ／Ｐ２７１Ｗ、Ｓ２６７Ｅ／Ｐ２７１Ｙ、Ｓ２６７Ｍ／Ｐ２７１Ｃ、Ｓ２６７Ｍ／Ｐ２７１Ｇ、Ｖ２６６Ｇ／Ｐ２７１Ｃ、Ｐ２７１Ａ／Ｓ２９８Ｒ、Ｐ２７１Ｇ／Ｇ２３６Ｖ、Ｐ２７１Ｇ／Ｐ３２９Ｓ、Ｐ２７１Ｇ／Ｐ３３１Ｃ、Ｐ２７１Ｇ／Ｐ３３１Ｔ、Ｐ２７１Ｇ／Ｓ２９８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ／Ｓ２９８Ｅ、Ｐ２７１Ｇ／Ｓ２９８Ｇ、Ｐ２７１Ｇ／Ｓ２９８Ｋ、Ｐ２７１Ｇ／Ｓ２９８Ｌ、Ｐ２７１Ｇ／Ｓ２９８Ｎ、Ｐ２７１Ｇ／Ｓ２９８Ｒ、Ｐ２７１Ｇ／Ｔ２９９Ａ、Ｐ２７１Ｇ／Ｔ２９９Ｍ、Ｐ２７１Ｇ／Ｔ２９９Ｓ、Ｐ２７１Ｇ／Ｔ２９９Ｗ、Ｐ２７１Ｇ／Ｉ３３２Ｌ；ただし、全てのアミノ酸の番号は、ＩｇＧ Ｅｕ番号に基づく。

【0026】

別の好ましい例では、前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントは、野生型Ｆｃフラグメントと比較して、Ｇ３２７サイトの変異を有し、かつ前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントの変異は、具体的に、以下から選べられる：Ｇ３２７Ａ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ３２７Ａ／Ａ３３０Ｖ、Ｇ３２７Ａ／Ｉ３３２Ａ、Ｇ３２７Ａ／Ｉ３３２Ｃ、Ｇ３２７Ａ／Ｉ３３２Ｅ。

【0027】

別の好ましい例では、野生型Ｆｃフラグメントと比較して、前記の変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントの変異は、具体的に、以下から選べられる：Ｈ２６８Ｄ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗ、Ｓ２６７Ｖ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗ、Ｖ２３４Ｍ／Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗ、Ａ２３５Ｗ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗ、Ｖ２３４Ｑ／Ａ２３５Ｇ／Ｐ２３８Ｌ／Ｓ２３９Ｖ／Ｈ２６８Ｄ／Ｇ３２７Ａ／Ｌ３２８Ｅ／Ａ３３０Ｓ／Ｉ３３２Ｔ；ただし、全てのアミノ酸の番号は、ＩｇＧ Ｅｕ番号に基づく。

【0028】

本発明の第２の態様では、変異型免疫グロブリンＦｃ領域を提供し、前記の変異型免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明の第１の態様に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメントを含む。

【0029】

別の好ましい例では、前記の免疫グロブリンは、ヒトＩｇＧ２である。

【0030】

別の好ましい例では、野生型ＩｇＧ２ Ｆｃ領域と比較し、前記の変異型免疫グロブリンＦｃ領域は、増強されたＦｃγＲＩＩＢ親和性を有する。

【0031】

別の好ましい例では、ＦｃγＲＩＩＢに対する前記の変異型免疫グロブリンＦｃ領域の親和性は、ＦｃγＲＩＩＢに対する野生型ＩｇＧ２ Ｆｃ領域の親和性よりも１倍以上高く、好ましくに、２、３、４、５、１０、２０、５０又は１００倍以上高い。

【0032】

別の好ましい例では、前記の親和性は、スクリーニングの濃縮度または結合分析シグナルに反映することができる。

【0033】

別の好ましい例では、前記変異型免疫グロブリンＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩＢよりも活性化性ＦｃγＲに対する親和性が低い。

【0034】

別の好ましい例では、野生型ＩｇＧ２ Ｆｃ領域と比較し、前記変異型免疫グロブリンＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩＢへの親和性が向上し、且つ活性化性ＦｃγＲへの親和性が低下する（Ｉ／Ａ比の値は、野生型ＩｇＧ２ Ｆｃ領域より高い）。

【0035】

別の好ましい例では、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＡ１３１Ｒに対する前記の変異型免疫グロブリンＦｃ領域の親和性の比（ＲＩＩＢ／ＲＩＩＡＲ）は、野生型ＩｇＧ２より高い。

【0036】

本発明の第３の態様において、抗体を提供し、前記抗体は、本発明の第１の態様に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント又は本発明の第２の態様に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域を含む。

【0037】

別の好ましい例では、前記の抗体は、ヒトＩｇＧ２骨格に基づく抗体である。

【0038】

別の好ましい例では、前記抗体は、アゴニスト抗体である。

【0039】

別の好ましい例では、前記抗体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーを特異性に標的する。

【0040】

別の好ましい例では、前記抗体は、以下から選べられる標的を特異的に結合することができる：ＣＤ４０、ＤＲ５、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＡＣＩ、ＤＲ４、ＦＡＳ、又はその組み合わせ。

【0041】

別の好ましい例では、前記抗体は、ＯＸ４０を特異的に結合することができる。

【0042】

別の好ましい例では、前記抗体が標的とする抗原が、免疫受容体分子又はその組み合わせである。

【0043】

別の好ましい例では、前記抗体が標的とする抗原は、免疫抑制性受容体分子であり、かつ前記免疫抑制性受容体分子は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ－３、又はその組み合わせから選べられる。

【0044】

別の好ましい例では、前記抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。

【0045】

別の好ましい例では、前記抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、好ましくにモノクローナル抗体である。

【0046】

本発明の第４の態様において、融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、本発明の第１の態様に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、本発明の第２の態様に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、又は本発明の第３の態様に記載された抗体を含む。

【0047】

別の好ましい例では、前記融合タンパク質は、受容体アゴニスト機能を有する他のタンパク質配列又はそのフラグメントも含む。

【0048】

別の好ましい例では、前記の受容体アゴニスト機能を有する他のタンパク質は、ＴＮＦ遺伝子ファミリーにおけるサイトカインである。

【0049】

別の好ましい例では、前記の受容体アゴニスト機能を有する他のタンパク質は、免疫受容体のリガンド分子を含む。

【0050】

別の好ましい例では、前記受容体アゴニスト機能を有する他のタンパク質は、免疫受容体のリガンド分子を含み、前記免疫受容体のリガンド分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２４４、ＣＤ１５０、ＣＤ４８、ＣＤ８４、ＣＤ３１９、Ｌｙ１１８或いはＣＤ２２９から選べられるいずれか一つ、又はその組み合わせである。

【0051】

別の好ましい例では、前記受容体アゴニスト機能を有する他のタンパク質は、免疫受容体のリガンド分子を含み、前記免疫受容体のリガンド分子は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ４７、ＶＩＳＴＡ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、又はその組み合わせから選べられる。

【0052】

別の好ましい例では、前記融合タンパク質は、発現および／または精製に寄与するタグ配列を含む；好ましくに、前記のタグ配列は、６Ｈｉｓタグ、ＨＡタグおよび／またはＦＬＡＧタグを含む。

【0053】

本発明の第５の態様において、単離されたポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本発明の第１の態様に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、本発明の第２の態様に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、本発明の第３の態様に記載された抗体、又は本発明の第４の態様に記載された組換えタンパク質をコードする。

【0054】

本発明の第６の態様において、ベクターを提供し、前記ベクターは、本発明の第５の態様に記載された単離されたポリヌクレオチドを含む。

【0055】

別の好ましい例では、前記のベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスベクター、プラスミド、トランスポゾン、他の遺伝子導入システム、又はその組み合わせから選べられる。

【0056】

別の好ましい例では、前記ベクターは、ウイルスベクターを含み、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルス、逆転写ウイルス、又はその組み合わせを含む。

【0057】

本発明の第７の態様において、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第６の態様に記載されたベクターを含むか、又はそのゲノムに本発明の第５の態様に記載されたポリヌクレオチドを組み込む；
或いは、前記宿主細胞は、本発明の第１の態様に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、本発明の第２の態様に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、本発明の第３の態様に記載された抗体、又は本発明の第４の態様に記載された組換えタンパク質を発現する。

【0058】

別の好ましい例では、前記の宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む。

【0059】

別の好ましい例では、前記の宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞から選べられる。

【0060】

本発明の第８の態様において、薬物組成物を提供し、上記の薬物組成物が、以下を含む：
（ａ）本発明の第１の態様に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、本発明の第２の態様に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、本発明の第３の態様に記載された抗体、又は本発明の第４の態様に記載された組換えタンパク質；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体。

【0061】

別の好ましい例では、前記薬物組成物は、腫瘍を治療する他の薬物、例えば細胞毒性薬物を含む。

【0062】

別の好ましい例では、前記薬物組成物は、受容体アゴニスト機能を有する他の活性物質を含む。

【0063】

別の好ましい例では、前記の薬物組成物は、注射剤形である。

【0064】

本発明の第９の態様において、本発明の第１の態様に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、本発明の第２の態様に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、本発明の第３の態様に記載された抗体、又は本発明の第４の態様に記載された組換えタンパク質を産生する方法を提供し、以下のステップを含む：
（ｉ）適切な条件では、本発明の第７の態様に記載された宿主細胞を培養し、前記変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、前記変異型免疫グロブリンＦｃ領域、前記抗体、又は前記組換えタンパク質を含有する培養物を得る；及び
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた培養物を精製および／または単離し、前記の前記変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、変異型免疫グロブリンＦｃ領域、抗体、又は組換えタンパク質を得る。

【0065】

別の好ましい例では、前記精製は、プロテインＡアフィニティーカラムによる精製・単離で標的抗体を得る。

【0066】

別の好ましい例では、前記精製は、プロテインＧアフィニティーカラムによる精製・単離で標的抗体を得る。

【0067】

別の好ましい例では、前記の精製・単離された標的抗体の純度は、９５％より高く、９６％より高く、９７％より高く、９８％より高く、９９％より高く、好ましくに１００％である。

【0068】

本発明の第１０の態様において、腫瘍免疫療法に用いられる、炎症および／または自身免疫症状を軽減する薬物組成物の調製における本発明の第１の態様に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、本発明の第２の態様に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、本発明の第３の態様に記載された抗体、又は本発明の第４の態様に記載された組換えタンパク質、本発明の第５の態様に記載されたポリヌクレオチド、本発明の第６の態様に記載されたベクターおよび／または本発明の第７の態様に記載された宿主細胞の応用を提供する。

【0069】

本発明の第１１の態様において、疾患を治療する方法を提供し、当該方法は、以下のステップを含む：必要が有る対象に、本発明の第１の態様に記載された変異型Ｆｃポリペプチドフラグメント、本発明の第２の態様に記載された変異型免疫グロブリンＦｃ領域、本発明の第３の態様に記載された抗体、又は本発明の第４の態様に記載された組換えタンパク質、本発明の第５の態様に記載されたポリヌクレオチド、本発明の第６の態様に記載されたベクター、本発明の第７の態様に記載された宿主細胞、および／または本発明の第８の態様に記載された薬物組成物を使用する。

【0070】

別の好ましい例では、前記の対象は、哺乳類を含み、好ましくにヒトである。

【0071】

別の好ましい例では、前記の疾患は、腫瘍、炎症性疾患、自身免疫疾患、又はその組み合わせから選べられる。

【0072】

別の好ましい例では、前記のがんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、黒素瘤、結腸がん、胃がん、肝がん、食道がん、腎臓がん、咽喉がん、甲状腺がん、膵臓がん、精巣がん、脳がん、骨がんと血液かん（例えば白血病、慢性リンパ球性白血病）などを含むが、これらに限定されない。

【0073】

別の好ましい例では、前記のがんは、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）がん、子宮頸がん、絨毛がん、結腸直腸がん、結合組織がん、消化器系がん、子宮内膜がん、食道がん、目がん、頭頸部がん、胃がん、上皮性腫瘍、腎臓がん、喉がん、肝がん、（小細胞、大細胞）肺がん、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含む）；黒素瘤；神経芽細胞腫；口腔がん（たとえば唇、舌、口、及びのど）；卵巣がん；膵臓がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん；呼吸器系がん；肉腫；皮膚がん；胃がん；精巣がん；甲状腺がん；子宮がん；泌尿器系がん；及び他のがんと肉腫を含むが、それらに限定されない。

【0074】

別の好ましい例では、前記方法は、免疫反応を刺激するために用いられ、腫瘍の成長の抑制又は遷延や、腫瘍の大きさの減少で、腫瘍を治療する。

【0075】

本発明のもう一つの態様では、タンパク質－分子結合能を増強するアミノ酸変異をスクリーニングする方法を提供し、以下のステップを含む：
１）親タンパク質配列を提供し、ＰＣＲで親タンパク質配列にアミノ酸変異を導入する；
２）親タンパク質及び変異されたタンパク質を、発現ベクターに構築し、変異ライブラリーを作成する；
３）発現ベクターを、哺乳類細胞へトランスフェクションし、親タンパク質及び変異されたタンパク質を、細胞の表面に発現する；
４）マーカー付き相互作用分子を、前記哺乳類細胞とインキュベートし、フローサイトメトリー或いは磁気ビーズで、マークされた哺乳類細胞をソーティングする；
５）マークされた哺乳類細胞のＤＮＡを抽出し、シーケンシングを行い、ソーティング前後の配列比率の変化を分析・比較する；
ただし、ソーティング後の比率が、有意にソーティング前の比率より高いであるアミノ酸変異は、前記タンパク質と相互作用分子との間の結合能を増強できるアミノ酸変異である。

【0076】

当該スクリーニング方法は、様々なアミノ酸変異を効率的にスクリーニングでき、非常に便利で効果的であり、様々なタンパク質－タンパク質相互作用或いはタンパク質－他の分子相互作用を増強するアミノ酸変異のスクリーニングに用いられてもよい。

【0077】

本発明の有利な効果は、本発明に提供されたエンジニアリングされたＦｃ領域又はＦｃフラグメントは、増強されたＦｃγＲＩＩＢ親和性を有し、その一部は、増強されたＦｃγＲＩＩＢ親和性を有しながら、低下された活性化性ＦｃγＲ親和性も有する。これらのタンパク質は、抗体または融合タンパク質のアゴニスト活性をデザイン、エンジニアリング又は最適化するために使用できる。特に、ヒトＩｇＧ２骨格に基づく抗体或いは融合タンパク質のアゴニスト活性のデザインに用いられても良い。これによって、アゴニスト活性が著しく増強されたタンパク質分子を提供し、腫瘍、炎症性疾患、自身免疫疾患又はその組み合わせの治療に用いられ、重要な適用の見通しがある。

【図面の簡単な説明】

【0078】

【図1】哺乳類の表面ディスプレイ抗体プラスミドの構築マップを示す。

【図2】変異をスクリーニングするフローの概略図を示す。具体的に、変異ライブラリーを構築し、逆転写ウイルスによって細胞に導入し、Ｆｃ変異ライブラリーを細胞の表面に発現し、ＦｃγＲＩＩＢに対する高親和性を有する細胞をソーティングし、ＤＮＡを抽出し、ハイスループットシーケンス（ＮＳＧ）を行い、そしてソーティング前後に様々な変異の濃縮状況を分析し、野生型と比較して濃縮倍率が比較的高い変異型を選択する。

【図3】ヒトＩｇＧ２ ＦｃにＣＨ２コードアミノ酸に対応するＥｕ番号を示す。

【図4】フローサイトメトリーソーターでのソーティングが、次第にＦｃγＲＩＩＢへの結合能が高い細胞を濃縮することができることを示す。この図は、野生型ヒトＩｇＧ２細胞と、ヒトＩｇＧ２ライブラリーＬｉｂｒａｒｙＭｉｘ細胞をそれぞれ１回と２回のＦｃγＲＩＩＢソーティング後の細胞のフローサイトメトリー分析結果を示す。

【図5】ライブラリーによってスクリーニングされた細胞が、ＦｃγＲＩＩＢへの結合能を大幅に改善したことを示す。この図は、野生型ヒトＩｇＧ２細胞と２回のＦｃγＲＩＩＢソーティング後の細胞のフローサイトメトリー分析結果を示す。

【図6】２種類のコンビナトリアル変異ライブラリーの概略図を示す。種類一：４つの領域間のシングルポイントコンビナトリアル変異、すなわち、Ｐ２３３－Ｖ２４０、Ｖ２６６－Ｐ２７１、Ｓ２９８－Ｔ２９９及びＧ３２７－Ｉ３３２の４つの領域のそれぞれで０－１つの突然変異があり、合計０～４サイトのコンビナトリアル変異；種類二：単一領域内の複数のアミノ酸のコンビナトリアル変異、すなわち、Ｐ２３３－Ｖ２４０、Ｖ２６６－Ｐ２７１、Ｓ２９８－Ｔ２９９及びＧ３２７－Ｉ３３２の４つの領域の各領域内部のアミノ酸のコンビナトリアル変異である（それぞれ０－７、０－６、０－２、および０－６個のコンビナトリアル変異）。

【図7】野生型ＩｇＧ２と、フローサイトメトリーソーティングされたライブラリーＩｇＧ２＿Ｃ０１、ライブラリー ＩｇＧ２＿Ｃ０２のフローサイトメトリー分析結果を示し、ライブラリーＩｇＧ２＿Ｃ０１とライブラリー ＩｇＧ２＿Ｃ０２には、ＦｃγＲＩＩＢと結合する細胞の比率の増加が見られた。

【図8】フローサイトメトリーでのソーティング前（「＿ｂｅｆｏｒ」）とソーティング後（「＿１^ｓｔ」と「＿２^ｎｄ」）に、ライブラリーＣｍｉｘとライブラリーＣ２細胞のＦｃγＲＩＩＢへの結合能を示し、結果としては、ソーティング後のライブラリーには、ＦｃγＲＩＩＢと結合する細胞の比率は、次第に向上することが見られた（２^ｎｄ＞１^ｓｔ＞ｂｅｆｏｒ）。

【図9】異なるＩｇＧ２抗体Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩへの結合能（ＥＬＩＳＡ信号：６５０ｎｍで吸光度（Ａ６５０）として表す）を示す。

【図10】異なるＩｇＧ２抗体Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＡ^１３１Ｈへの結合能（ＥＬＩＳＡ信号：６５０ｎｍで吸光度（Ａ６５０）として表す）を示す。

【図11】異なるＩｇＧ２抗体Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＡ^１３１Ｒへの結合能（ＥＬＩＳＡ信号：６５０ｎｍで吸光度（Ａ６５０）として表す）を示す。

【図12】異なるＩｇＧ２抗体Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＢへの結合能（ＥＬＩＳＡ信号：６５０ｎｍで吸光度（Ａ６５０）として表す）を示す。

【図13】異なるＩｇＧ２抗体Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡ^１５８Ｆへの結合能（ＥＬＩＳＡ信号：６５０ｎｍで吸光度（Ａ６５０）として表す）を示す。

【図14】異なるＩｇＧ２抗体Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＩＡ^１５８Ｖへの結合能（ＥＬＩＳＡ信号：６５０ｎｍで吸光度（Ａ６５０）として表す）を示す。

【図15】ＥＬＩＳＡによって、ＩｇＧ１Ｖ１１（ｈＩｇＧ１Ｖ１１）上のＩｇＧ２に対応する変異体のＦｃγＲＩＩＡ１３１ＨおよびＦｃγＲＩＩＢへの結合能を分析した（ＥＬＩＳＡ信号：６５０ｎｍでの吸光度（Ａ６５０）として表す）。

【図16】さまざまな抗体Ｆｃ変異体抗ヒトＯＸ４０抗体の免疫活性化活性の分析結果を示し、ＣＤ４陽性細胞におけるＣＦＳＥの平均蛍光強度の棒グラフとして表される（ＣＦＳＥ信号が低いほど、活性は高くなる）。

【図17】さまざまな抗体Ｆｃ変異体抗ヒトＯＸ４０抗体の免疫活性化活性の分析結果を示し、ＣＤ４陽性細胞におけるＣＦＳＥの蛍光強度ヒストグラムとして表される（ＣＦＳＥ信号が低いほど、活性は高くなる）。

【発明を実施するための形態】

【0079】

特に記載がない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。また、本明細書に特に限定されていない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含む。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、およびタンパク質と核酸化学に関わる命名法および技術は、当技術分野において公知なものであり、一般的に用いられている。

【0080】

本発明の方法および技術は、一般に、当技術分野で公知の従来の方法に従って行われ、特に限定されていない限り、本明細書に列挙された一般的および専門的な参考文献に記載されている。たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋなどのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））及びＡｕｓｕｂｅｌなどのＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ （１９９２）、及びＨａｒｌｏｗとＬａｎｅのＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０））を参照して、その内容は引用の方式で本明細書に取り入られる。酵素反応および精製技術は、製造者の指示に従って行われ、一般に、当該分野で公知の方法または本明細書に記載の方法に従って実施することができる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、および医学および薬学に関連する命名法、ならびに実験方法と技術は、当技術分野において公知なものであり、一般的に用いられている。化学合成方法、化学分析方法、医薬品製造方法、調製方法および薬物送達方法、および患者の治療方法には、いずれも標準的な技術が用いられる。

【0081】

特に断りのない限り、以下の用語は以下の定義を有する。

【0082】

「抗体」（Ａｂ）は、糖タンパク質免疫グロブリンまたはその抗原結合部分を含むが、これに限定されなく、それは、抗原に特異的に結合し、かつ少なくとも、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各のＨ鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、単にＶＨという）と重鎖定常領域を含む。抗体の「重鎖定常領域」は、ＣＤｓとも呼ばれ、ＣＨ１、ＣＨ２とＣＨ３の三つのドメイン、及びＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に位置するヒンジ領域を含む。各の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書には、単にＶＬという）と軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬからなるものである。ＶＨとＶＬ領域は、更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高度可変な領域に細かく分かれ、それらの間に、比較的に保存的な、フレーム領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在してある。各ＶＨとＶＬは、三つのＣＤＲと四つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並べる。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と互いに作用する結合ドメインを含む。

【0083】

「Ｆｃ領域」（結晶化可能領域）又は「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ」とは、抗体の重鎖におけるＣ－末端領域であり、それが、免疫システムの各種の細胞（たとえば、エフェクター細胞）に位置するＦｃ受容体との結合、或いは古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）との結合を含む、免疫グロブリンと宿主組織或いは因子との結合を仲介する。したがって、Ｆｃ領域は、抗体重鎖定常領域の第一の定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１ドメイン）以外の部分を構成するポリペプチドである。ＩｇＧ、ＩｇＡとＩｇＤ抗体のアイソタイプには、Ｆｃ領域は、抗体の二つの重鎖の第二（ＣＨ２ドメイン）と、第三（ＣＨ３ドメイン）定常ドメインの二つの同一のタンパク質フラグメントからなる；ＩｇＭとＩｇＥのＦｃ領域は、各ポリペプチド鎖に三つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４ドメイン）を含む。ＩｇＧの場合、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣＨ２とＣＨ３、及びＣＨ１とＣＨ２の間のヒンジ領域を含む。免疫グロブリンの重鎖のＦｃ領域の限界は変化できるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、本発明では、重鎖のＰ２３１位置のアミノ残基からカルボキシ末端までの配列断片と定義され、ただし、当該番号は、Ｋａｂａｔのように、ＥＵ番号に基づくものである。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０まで伸びるが、ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置し、すなわち、ＩｇＧの約アミノ酸３４１から約アミノ酸４４７まで伸びる。

【0084】

「Ｆｃポリペプチドフラグメント」とは、Ｆｃ領域に含まれるフラグメントを指し、本発明に言及されるＦｃポリペプチドフラグメントとは、Ｆｃ領域のアミノ酸２３３からアミノ酸３３２まで伸びるフラグメント、或いは当該フラグメントを含む他のＦｃ領域の内のフラグメント、例えばＦｃ ＣＨ２ドメイン或いはＦｃ領域を指す。

【0085】

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」或いは「Ｆｃポリペプチドフラグメント」は、天然Ｆｃ又はエンジニアリングされたＦｃであっても良い。また、「Ｆｃ領域」或いは「Ｆｃポリペプチドフラグメント」とは、さらに単離される状態にあるこの領域、或いはＦｃを含むタンパク質ポリペプチドにあるこの領域を指し、このようなポリペプチドは、「Ｆｃ融合タンパク質」とも呼ばれる（例えば、抗体又はイムノアドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ））。

【0086】

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する受容体である。ＩｇＧ抗体と結合するＦｃＲは、ＦｃγＲファミリーの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子バリアントと選択的スプライシング形式も含む。ヒトＦｃγ受容体ファミリーは、いくつのメンバーを含む：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）。その中、ＦｃγＲＩＩＢは、唯一の抑制性Ｆｃγ受容体であり、他のは、いずれも活性化性Ｆｃγ受容体である。大多数の自然エフェクター細胞型が、一種又は多種の活性化性ＦｃγＲと抑制性ＦｃγＲＩＩＢを共発現するが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、選択的に一つの活性化性Ｆｃγ受容体（マウスではＦｃγＲＩＩＩ、ヒトではＦｃγＲＩＩＩＡ）を発現しつつ、マウスとヒトに、抑制性ＦｃγＲＩＩＢを発現しない。これらのＦｃγ受容体の分子構造が異なるから、各ＩｇＧ抗体サブクラスに対する異なる親和性を有する。これらのＦｃγ受容体の中、ＦｃγＲＩは、高親和性の受容体であるが、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＩＩＡは、低親和性の受容体である。遺伝子多型も、これらの異なるＦｃγ受容体に存在しつつ、それらの結合親和性に影響する。最も一般的な遺伝子多型は、ＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１／Ｈ１３１と、ＦｃγＲＩＩＩＡのＶ１５８／Ｆ１５８などの多型形式である。これらの多型形式の中、多種の疾患に関係することが見つかれることもあり、一部の特定な治療抗体の效果も、患者が特定なＦｃγ受容体遺伝子多型形式を持つか否かに依存する。

【0087】

本発明に記載された「配列」は、本発明の配列と実質的に同一の配列を含むと理解され、上記の「実質的に同一の配列」とは、最適化アラインメントされた後に、例えばＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムを採用し、デフォルトギャップ値で測定する際に、二種類のペプチド配列の間に、少なくとも７０、７５或８０％の配列同一性を有し、好ましくに、少なくとも９０或９５％の配列同一性を有し、より好ましくに、少なくとも９７、９８或９９％の配列同一性を有する。好ましくに、異なる残基位置の相違は、保存的アミノ酸置換であるのは思わしい。「保存的アミノ酸置換」とは、その中のアミノ酸残基は、化学的性質（たとえば：電荷又は親水性）が類似する側鎖のＲ基を有する別のアミノ酸残基で置換されることである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、実質的にタンパク質の機能と性質を変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって異なる場合、配列の同一性百分比または類似性は、置換の保存的な性質を修正するように向上されることができる。たとえば、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：３０７－３１（１９９４）を参照する。化学的性質が類似する側鎖を有するアミノ酸基の実例は、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、とイソロイシン；２）脂肪族－ヒドロキシル基側鎖：セリンとトレオニン；３）アミドを含有する側鎖：アスパラギンとグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、とトリプトファン；５）アルカリ側鎖：リシン、アルギニン、とヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸とグルタミン酸；及び７）硫黄を含有する側鎖：システイン与メチオニンを含む。好ましい保存的アミノ酸置換のグループは、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、及びアスパラギン－グルタミンである。以上で指摘したように、本発明にかかるＦｃ領域、抗体、Ｆｃフラグメント或いは融合タンパク質は、本発明に提供されるアミノ酸変異を備える以外、上記と実質的に同じ配列要件が満たされている限り、さらに、本発明に開示されない他の可能な修飾を含んでも良い。

【0088】

本発明の抗体及びその断片或いはドメインのアミノ酸のシリアルナンバーは、ＩｇＧ ＥＵ番号に基づくものである。本発明に関与する一部の変異体の対応する変異の種類および名前を表１に示す。

【0089】

抗体は、一般的に高親和性でその関連する抗原と特異性に結合し（同様に、本発明のタンパク質はまた、それらのエピトープ認識分子に特異的に結合することができる）、それは、１０^－５－１０^－１１Ｍ又はより小さい解離定数（ＫＤ）によって表される。約１０^－４Ｍ^－１より大きいあらゆるＫＤは、一般的に非特異性の結合を指示する。本明細書に使用されたように、抗原と「特異性に結合」する抗体とは、高親和性で、抗原や基本的に同一の抗原と結合する抗体であり、それは、ＫＤは、１０^－７Ｍ又はより小さい、好ましくに１０^－８Ｍ又はより小さい、より好ましくに５×１０^－９Ｍ又はより小さい、最も好ましくに１０^－８－１０^－１０Ｍ又はより小さいが、高親和性で関係がない抗原と結合しないことを表す。抗原が、指定された抗原と、高い配列同一性を表し、たとえば、指定された抗原の配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくに少なくとも９５％、より好ましくに少なくとも９７％、又はより好ましくに少なくとも９９％の配列同一性を表すと、当該抗原は、指定された抗原とは、「基本的に同一」なものである。

【0090】

免疫グロブリンは、一般的に知られている任意のアイソタイプに由来する可能性がある。ＩｇＧアイソタイプは、一部の種ではサブクラスに分類できる：ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４サブクラスに、マウスではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３サブクラスに分類できる。「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体のクラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。「抗体」は、たとえば天然に存在する、或いは天然に存在しない抗体；モノクローナルとポリクローナル抗体；キメラとヒト化抗体；ヒト或いは非ヒト抗体；完全合成抗体；及び単鎖抗体を含む。

【0091】

本発明に記載された「天然ＩｇＧ」は、自然界に天然に存在することができるＩｇＧを指し、これらのＩｇＧの配列は、人工的に修飾されない。注意する必要があるのは、遺伝子多型により、天然のＩｇＧでも異なる変異体があるが、変異するかどうかに関係なく、天然の状態で人工的に修飾されないＩｇＧであれば、天然ＩｇＧと呼ばれる。

【0092】

「アゴニスト抗体」は、受容体に結合し、受容体を活性化する抗体であり、アゴニスト抗体の機能実例としては、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの受容体に結合し、ＴＮＦ受容体を発現する細胞にアポトーシスを誘導する。アポトーシス誘導機能を測定するためのアッセイは、ＷＯ９８／５１７９３およびＷＯ９９／３７６８４に記載され、これらは両方とも、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本発明の具体的な実施例において、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体は、免疫細胞の表面で免疫活性化シグナルを伝達する標的分子に結合し、それらに制御される重要な免疫活性化シグナル経路を活性化することによって、抗腫瘍免疫応答を増強し、腫瘍細胞を間接的に殺滅することができる。臨床研究段階に入ったアゴニスト抗体の一部の実例は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０８７６２０に参照する。

【0093】

「アゴニスト活性」とは、抗体を抗原分子に結合させ、抗原分子を刺激してシグナルを生成することによって、ある特異的な生理学的活性の変化を誘発する活性を指す。抗原分子は、受容体分子と、シグナル伝達または生理学的機能を有する他の分子を含む。上記の特異的な生理学的活性は、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、親和性、タンパク質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、レドックス活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性およびアポトーシス誘導活性を含むが、これらに限定されない。

【0094】

「親」とは、タンパク質エンジニアリングの過程におけるエンジニアリングされた対象を指す。前記の親は、天然に存在するポリペプチド、又は天然に存在するポリペプチドのバリアントまたはエンジニアリングされたバージョンであり得る。いくつかの実施例において、本発明に記載された親Ｆｃ領域は、天然ＩｇＧのＦｃ領域である。

【0095】

「バリアント」とは、タンパク質エンジニアリング過程には、親を修飾して得るタンパク質を指す。具体的には、それは、親アミノ酸の変異、欠失、および／または付加によって誘導され、親に固有の一部またはすべての機能を保持するタンパク質であっても良く、本明細書のバリアントの配列は、好ましくは、親配列と少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、本明細書で使用される「Ｆｃバリアント」とは、少なくとも一つのアミノ酸の修飾によって、親Ｆｃ配列と異なるＦｃ配列を指す。Ｆｃバリアントは、Ｆｃ領域のみを含み得るか、または抗体、Ｆｃフュージョン、単離されたＦｃ、Ｆｃ領域、または実質的にＦｃによってコードされる他のポリペプチドとの関連で存在し得る。Ｆｃバリアントは、Ｆｃポリペプチド自体、Ｆｃ変異体ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指すことができる。

【0096】

本明細書の「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」或いは「ＴＮＦ受容体スーパーファミリー」とは、ＴＮＦファミリーのサイトカインと結合できる受容体ポリペプチドである。一般的に、これらの受容体は、その細胞外領域に一つ又は複数のシステインリッチ重複配列を有するＩ型膜貫通受容体である。ＴＮＦ遺伝子ファミリーの中のサイトカインの実例は、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、腫瘍壊死因子－β（ＴＮＦ－β又はリンパ毒素）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ－４０リガンド、４－１ＢＢリガンド、Ａｐｏ－１リガンド（Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも言う）、Ａｐｏ－２リガンド（ＴＲＡＩＬとも言う）、Ａｐｏ－３リガンド（ＴＷＥＡＫとも言う）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、ＡＰＲＩＬ、ＲＡＮＫリガンド（ＴＲＡＮＣＥとも言う）、とＴＡＬＬ－１（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも言う）を含む。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの中の受容体の実例は、１型腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ１）、２型腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ２）、ｐ７５神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、Ｂ細胞表面抗原ＣＤ４０、Ｔ細胞抗原ＯＸ－４０、Ａｐｏ－１受容体（Ｆａｓ又はＣＤ９５）、Ａｐｏ－３受容体（ＤＲ３、ｓｗ１－１、ＴＲＡＭＰとＬＡＲＤとも言う）、「膜貫通型の活性化因子およびＣＡＭＬインタラクタ（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）」又は「ＴＡＣＩ」と呼ばれる受容体、ＢＣＭＡタンパク質、ＤＲ４、ＤＲ５（或いは、Ａｐｏ－２；ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ－６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも言う）、ＤＲ６、ＤｃＲ１（ＴＲＩＤ、ＬＩＴ又はＴＲＡＩＬ－Ｒ３とも言う）、ＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ－Ｒ４又はＴＲＵＮＤＤとも言う）、ＯＰＧ、ＤｃＲ３（ＴＲ６又はＭ６８とも言う）、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ（ＡＴＡＲ又はＴＲ２とも言う）、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ－５、ＮＴＲ－１、ＴＮＦＬ１、ＣＤ３０、リンパ毒素β受容体（ＬＴＢｒ）、４－１ＢＢ受容体及びＴＲ９（ＥＰ９８８，３７１Ａ１）を含む。

【0097】

本発明に記載された「抑制性Ｆｃγ受容体及び活性化性Ｆｃγ受容体に対する親和性の比」或いは「Ｉ／Ａ比」は、抑制性Ｆｃγ受容体（例えば：ヒトＦｃγＲＩＩＢ）に対する抗体重鎖定常領域の親和性値を、同じ種の活性化性Ｆｃγ受容体（例えば：ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢを含む）に対する抗体重鎖定常領域の最高親和性値で割ったものに等しい。

【0098】

上記の「親和性」とは、二つの分子の間の結合能の大きさであり、通常に、ＫＤで計測し、本発明において、それはまた、濃縮倍率（表７のように）または結合分析シグナル（図１２のように）によって測定することができる。「ＫＤ」とは、二つの分子が（たとえば：特定な抗体と抗原、或いはリガンドと受容体）互いに作用する平衡解離定数である。「濃縮倍数」とは、本発明に提供されるフローサイトメトリーソーティング方法或いは磁気ビーズソーティング方法でソーティングした後に、特定のＦｃ変異を含む抗体を発現する細胞の、ソーティング後の百分比／ソーティング前の百分比（次世代シーケンスで分析する、表７に示す）を指す。「結合分析シグナル」は、本発明に提供されるＥＬＩＳＡアッセイにおける吸光度値を採用する（図１２に示す）。

【0099】

「ヒト」抗体とは、その可変領域は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列由来のフレーム領域とＣＤＲ領域を有する抗体である。なお、抗体が定常領域を含有すると、定常領域もヒト生殖系免疫グロブリン配列由来のものである。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（たとえば、生体外でのランダム突然変異または部位特異的突然変異や、生体内での体細胞突然変異によって、導入された突然変異）を含んでも良い。しかしながら、本明細書に使用されたように、用語「ヒト抗体」は、他の哺乳動物種（マウスのような）生殖系由来のＣＤＲ配列を、ヒトフレーム配列にグラフトしてなる抗体を含むことを意図しない。用語「ヒト」抗体と「完全ヒト」抗体は同じ意味で使用される。

【0100】

本発明の「抗体」は、たとえば天然に存在する、或いは天然に存在しない抗体；モノクローナルとポリクローナル抗体；キメラとヒト化抗体；ヒト或いは非ヒト抗体；完全合成抗体を含む。

【0101】

「ヒト化」抗体とは、その中の非ヒト抗体ＣＤＲドメインを除く一部、大部分或いは全部のアミノ酸は、ヒト免疫グロブリン由来の相応のアミノ酸に取り替えられた抗体である。ヒト化形式抗体の一つの実施の形態において、ＣＤＲドメインを除く一部、大部分或いは全部のアミノ酸は、ヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸に取り替えられたが、一つ又は複数のＣＤＲ領域のうちの一部、大部分又は全部のアミノ酸は変わらない。抗体が、特定な抗原と結合する能を取り除かない限り、アミノ酸に対する小さい付加、欠失、挿入、置換または修飾は許容される。「ヒト化」抗体は、オリジナル抗体に類似する抗原特異性を保留する。

【0102】

「キメラ抗体」とは、可変領域と定常領域は、それぞれに異なる種に由来する抗体であり、たとえば可変領域は、マウス抗体に由来するが、定常領域はヒト抗体に由来する抗体である。

【0103】

以下、具体的な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の単なる例示であることが理解されるべく。以下の実施例における特定の条件を特定しない実験方法は、通常に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）」に記載された通常条件に従って実施され、或いはメーカーが推奨する条件に従って実施される。特に指定がない限り、百分比と部は、重量百分比と質量部である。

【0104】

【表1】

［材料と方法］
［哺乳類の表面ディスプレイベクターの構築］
ヒトＩｇＧ２抗マウスＣＤ４０抗体軽鎖と重鎖の全長配列は、マルチフラグメントワンステップラピッドクローニングキット（Ｍｕｌｔｉ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｐｃｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）（上海イーセイバイオテクノロジー株式会社、中国）によって、レトロウイルスベクターＭＩＧＲＩ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｅａｒら、Ｂｌｏｏｄ． １９９８ Ｎｏｖ １５． ９２（１０）：３７８０－９２．）上に構築され、使用したプライマーを表２に、構築マップを図１に示し、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩで単一消化した後、完全抗体の軽鎖ＤＮＡと重鎖ＤＮＡを挿入し、真ん中を、自己切断Ｌｉｎｋｅｒ Ｐ２Ａで接続し、ただし、重鎖ＤＮＡの末端には、膜貫通ドメインＤＮＡ（各フラグメントのＤＮＡ配列を表３に示す）が含まれ、当該プラスミドは、抗体ヒトＩｇＧ２を発現しながらＧＦＰタンパク質も同時に発現し、表面ディスプレイ抗体とそれに関連するＦｃ領域のアミノ酸配列を表４に示す。成功した構築は、シーケンシングによって確認された。

【0105】

【表2】

【0106】

【表3】

【0107】

【表4】

［Ｆｃ変異ライブラリーの構築］
点変異ライブラリーでは、変異は縮重プライマーを介して導入され、複数の縮重プライマーが設計される。例えば、Ｐ２３３サイト変異に用いられる縮重プライマーは、ＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＮＮＳＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）である。変異ライブラリーフラグメントと所要のライゲーションベクターをＰＣＲで取得し、ワンステップラピッドクローニングキット（Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｐｃｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）（上海イーセイバイオテクノロジー株式会社、中国）によってライゲーションし、ＤＨ５αに形質転換して、変異ライブラリーを得た。各ライブラリーから２０個のコロニーを選択し、シーケンシングし、変異が標的位置に導入されたかどうかを確認した。

【0108】

コンビナトリアル変異ライブラリーの方法は、これに類似し、プライマーは、点変異ライブラリーをスクリーニングすることによって得られた濃縮された変異タイプに従って設計され、中間の縮重プライマーは、特定のアミノ酸をコードするコドン、またはいくつかのアミノ酸をコードする縮重コドンからなるプライマー配列に変更され、例えば、Ｌ３２８Ｗ（ＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、Ｃｏｍｂｉｎｅ２＿１（ＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＫＮＧＷＢＧＶＡＳＲＷＳＳＡＣＣＨＧＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）。

【0109】

上記のプライマー配列の通常の塩基以外の記号は、縮重塩基である：ＲはＡ／Ｇ、ＹはＣ／Ｔ、ＭはＡ／Ｃ、ＫはＧ／Ｔ、ＳはＧ／Ｃ、ＷはＡ／Ｔ、ＨはＡ／Ｔ／Ｃ、ＢはＧ／Ｔ／Ｃ、ＶはＧ／Ａ／Ｃ、ＤはＧ／Ａ／Ｔ、ＮはＡ／Ｔ／Ｃ／Ｇである。

【0110】

［安定発現細胞株の構築］
上記のライブラリープラスミドとヘルパープラスミドＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ（モル比２：１）およびトランスフェクション試薬ＰＥＩ（質量比１：５）を混合し、事前にプレーティングされたＰｈｏｅｎｉｘ細胞（密度８０％）に加え、６時間後、培地を新鮮な培地に交換し、４８時間後にレトロウイルスを含む上清を回収した。上記のレトロウイルス上清の５０％と新鮮な培地５０％を使用し、事前に８０％密度になるようにプレーティングされた３Ｔ３細胞に感染させ、２４時間後に培地を交換し、４８時間後に抗体を発現する安定発現細胞株を得た。

【0111】

［フローサイトメーターで抗体を発現する安定発現細胞株を分析する］
３Ｔ３細胞をトリプシン処理によって収集し、単細胞懸濁液を調製し、ＰＥ－Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５００，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＢｉｏｔｉｎ－ＦｃγＲＩＩＢ（１μｇ／ｍｌ、義翹神州会社）およびＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＡＰＣ（１：５００，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む５０μｌのＦＡＣＳバッファー（０．５％ＦＢＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含む１ｘＰＢＳ）に約１～５×１０^６個の細胞を再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。

【0112】

［ＦｃγＲＩＩＢに高い親和性を持つ細胞をフローサイトメトリーソーティングする］
上記のフローサイトメトリー分析染色法に従って、染色システムを等比率で増幅し、最後に、細胞を約１～５×１０^７細胞／ｍｌに再懸濁し、マシンに移動し、ＩｇＧを発現する（ＰＥ蛍光シグナルが強い）かつＦｃγＲＩＩＢに高い親和性を持つ（ＡＰＣ蛍光シグナルが強い）細胞を選択し、その割合はＩｇＧ陽性細胞量の１％未満に制御された。

【0113】

［ＦｃγＲＩＩＢに高い親和性を持つが、活性化性ＦｃγＲに低い親和性を持つ（Ｉ／Ａ 比が高い）細胞を磁気ビーズソーティングする］
３Ｔ３細胞をトリプシン処理によって収集し、単細胞懸濁液を調製し、Ｂｉｏｔｉｎ－ＦｃγＲＩＩＢ（１μｇ／ｍｌ、義翹神州会社）と活性化性ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ^１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩＡ^１３１Ｒ、ＦｃγＲＩＩＩＡ^１５８Ｖ、ＦｃγＲＩＩＩＡ^１５８Ｆを含む、いずれも１μｇ／ｍｌであり、上海近岸テクノロジー株式会社）を含む５０μｌのＭＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭＥＤＴＡを含む１ｘＰＢＳ）に約１ｘ１０^７個の細胞を再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした後、細胞をＭＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１００μｌのＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、２５μｌの抗Ｂｉｏｔｉｎビーズを追加し、氷上で１５分間インキュベートした後、細胞をＭＡＣＳバッファーで１回洗浄し、５００μｌに再懸濁し、磁場に置かれたＬＳカラムに加え、排出液を回収し、３ｍｌのＭＡＣＳバッファーで洗浄して回収し、最後にＬＳカラムを磁場から外し、５ｍｌのＭＡＣＳバッファーを使用し、ソーティングカラムに保持された細胞を迅速に溶出し、陽性細胞、すなわちＩ／Ａ比の高い細胞を収集した。

【0114】

［ハイスループットシーケンス分析］
標的細胞集団の約０．１～５×１０^６個の細胞を採取し、溶解し、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行い、ハイスループットシーケンシング（ＰＥ１５０またはＰＥ２５０）のためにライブラリーを自作し、各サンプルで約６０，０００～３００，０００の配列を得、変異領域のヌクレオチド配列を抽出し、対応するアミノ酸配列にバッチ翻訳し（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＶｉｒｔｕａｌＲｉｂｏｓｏｍｅ／，Ｒａｓｍｕｓ Ｗｅｒｎｅｒｓｓｏｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００６ ３４：Ｗ３８５－Ｗ３８８）、各サンプルの各変異配列の割合を計算し、変異配列の割合＝変異配列の数／配列の総数。

【0115】

［抗体の発現と精製］
次世代シーケンシングにおける望しいＦｃ変異体または新しいコンビナトリアル変異体を抗ヒトＯＸ４０抗体の重鎖に構築し、対応する抗体軽鎖とともにＨＥＫ２９３Ｓ細胞に一過性にトランスフェクトし、タンパク質を発現し、プロテインＧによる精製で異なるＦｃ変異抗体を得、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出されたように、抗体は構造的に無傷でした。抗ヒトＯＸ４０抗体のＤＮＡ配列とタンパク質配列を表５と表６に示す。

【0116】

【表5】

【0117】

【表6】

酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によってＦｃγＲへの変異抗体の結合特性を分析する
酵素結合プレートに、２μｇ／ｍＬ、１００μＬの抗体若しくはその変異体を添加し、一晩でコーティングし、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２時間ブロッキングし、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、そして適当な濃度のｂｉｏｔｉｎにマークされたＦｃγＲ細胞外ドメインタンパク質（北京義翹神州生物技術有限会社）を添加し、室温で１時間インキュベートした後に、上清を捨て、ＰＢＳＴで洗浄した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ （ＢＤバイオテクノロジー）を添加し、室温で１時間インキュベートし、ｂｉｏｔｉｎタンパク質を検出し、上清を捨て、発色液を添加し、２０－４０分間発色した後、６５０ｎｍにおける吸光値（Ａ６５０）を測定した。

【0118】

［異なる抗体Ｆｃ変異体抗ヒトＯＸ４０抗体のインビトロ免疫活性化活性分析（Ｔ細胞増殖の促進）］
ヒト化ＦＣγＲ／ＯＸ４０マウス脾臓を単離し、溶解した赤血球の単細胞懸濁液を調製し、ＣＦＳＥでマークし、細胞を５×１０^６／ｍＬの濃度で５μのＭＣＦＳＥを含むＰＢＳに再懸濁し、３７℃で１５分間置き、５％ＦＢＳを含むＰＢＳ ６００ｇで５分間、２回洗浄し、次に、初代細胞培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ＋１％ＨＥＰＥＳ＋１％ピルビン酸ナトリウム＋０．１％２ＭＥ（最終濃度５０μＭ）＋１％Ｌ－グルタミン＋１％非必須アミノ酸）に再懸濁し、細胞濃度を３×１０^６／ｍｌにし、各ウェルに１００μｌの細胞溶液を加え、つまり、各ウェルには３×１０^５個の細胞が含まれる。抗体は、０．２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３を含む初代細胞培養培地で、それぞれ２、０．２、０．０２μｇ／ｍｌの濃度に希釈された。上記で調製した抗体混合物１００μＬを、ＣＦＳＥでマークされたヒト化ＦＣγＲ／ＯＸ４０脾臓細胞をすでに含むウェルに移した。コントロールには２つのグループがある：ＣＤ３ｏｎｌｙのグループは、ＣＦＳＥでマークされた細胞と抗マウスＣＤ３を加えたが、他の抗体は加えない；ＣＤ３＋ＣＤ２８グループは、ＣＦＳＥでマークされた細胞と抗マウスＣＤ３を加え、２μｇ／ｍｌの濃度で抗マウスＣＤ２８抗体（クローン３７．５１（ＲＵＯ）、ＢＤ製薬）を加た（抗マウスＣＤ３とＣＤ２８の最終濃度はそれぞれ０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌであった）。３７℃、５％ＣＯ_２恒温セルインキュベーターで３日間インキュベートした。培養終了した後、細胞を収集し、フローサイトメトリーでＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋細胞の数と増殖を検出した。Ｔ細胞の増殖を検出するためのフローサイトメトリー：上記で培養された細胞を９６ウェルＵ底プレートに移し、ＰＢＳで２回洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、ＰＥ抗マウスＣＤ４（クローン：ＧＫ１．５、１：５００、ＢＤ）およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（クローン：５３－６．７、１：５００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む５０μｌのＦＡＣＳバッファー（０．５％ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に細胞を再懸濁し、暗所で１５分間氷上でインキュベートした後、細胞をＰＢＳバッファーで２回洗浄し、ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔＡｂｓｏｌｕｔｅＣｏｕｎｔｉｎｇＢｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２μｌ／サンプル）を含む２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。

【0119】

本発明は、主に、ヒトＩｇＧ２とＦｃγＲＩＩＢとの相互作用を増強する抗体Ｆｃ変異体配列を提供する。同時に、本発明は、これらの変異体をスクリーニング・取得する方法も提供し、図２に示すように、上記の方法に従って、特定の親和性特性を有するＦｃ変異体をスクリーニングすることができる。

【0120】

それだけでなく、本発明に提供される上記のスクリーニング方法によれば、当業者は、様々なタンパク質－タンパク質相互作用またはタンパク質－他の分子相互作用を増強するアミノ酸変異をスクリーニングすることができる；一般的なスクリーニング方法には、以下が含まれる：
１）親タンパク質配列を提供し、ＰＣＲで親タンパク質配列にアミノ酸変異を導入する。

【0121】

２）親タンパク質及び変異されたタンパク質を、発現ベクターに構築し、変異ライブラリーを作成する。

【0122】

３）発現ベクターを、哺乳類細胞へトランスフェクションし、親タンパク質及び変異されたタンパク質を、細胞の表面に発現する。

【0123】

４）マーカー付き相互作用タンパク質を、前記哺乳類細胞とインキュベートし、フローサイトメトリー或いは磁気ビーズで、マークされた哺乳類細胞をソーティングする。

【0124】

５）マークされた哺乳類細胞のＤＮＡを抽出し、シーケンシングを行い、ソーティング前後の配列比率の変化を分析・比較する；ただし、ソーティング後の比率が、有意にソーティング前の比率より高いであるアミノ酸変異は、前記タンパク質と相互作用分子との間の結合能を増強できるアミノ酸変異である。

【0125】

実施例１：ヒト抗体ＩｇＧ２＿Ｆｃ点変異ライブラリーの構築。

【0126】

本発明は、ヒトＩｇＧ２＿Ｆｃ＿ＣＨ２上の、Ｐ２３３－Ｓ２３９、Ｖ２６６－Ｐ２７１、Ｓ２９８－Ｔ２９９及びＧ３２７－Ｉ３３２（Ｅｕ番号、図３と表４に示す）を含むいくつかのサイトを選択し、これらのサイトのアミノ酸は、単一サイトランダム変異を行われ、各サイトには野生型を含めて合計２０種類のアミノ酸がある（Ａ、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｇ、Ｎ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）。上記のヒトＩｇＧ２＿Ｆｃの４つの領域に対応する単一サイトランダム変異のプラスミドライブラリー（Ｌｉｂｒａｒｙ１、Ｌｉｂｒａｒｙ２、Ｌｉｂｒａｒｙ３、Ｌｉｂｒａｒｙ４）、およびこれら４つのライブラリーの混合ライブラリー（ＬｉｂｒａｒｙＭｉｘ）を作成した。

【0127】

実施例２：フローサイトメトリーでソーティング前後の細胞濃縮状況を分析する。

【0128】

上記のプラスミドライブラリーを成功に構築した後、レトロウイルスを調製し、３Ｔ３細胞に感染させ、これらのライブラリーを発現する安定発現細胞株を得た。本発明は、フローサイトメトリーソーティング技術を利用し、ヒトＩｇＧ２（抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２によって検出される）を発現しつつ、ヒトＦｃγＲＩＩＢに結合する細胞をソーティングする。図４に示すように、フローサイトメトリーソーティングでは、次第にＦｃγＲＩＩＢとの結合能が高い細胞を濃縮することができる。ヒトＩｇＧ２ライブラリーＬｉｂｒａｒｙＭｉｘをフローサイトメトリーソーターでソーティングし、異なるラウンドで得られた細胞を別々に分析した結果として、フローサイトメトリーで検出できるＦｃγＲＩＩＢに結合した細胞の割合は、ソーティングの各ラウンド後に増加し、最初のラウンドは０．９０％、２番目のラウンドは２２．２％であったが、野生型ヒトＩｇＧ２の０．３４％と比較して、それぞれ２．６５倍と６５．２９倍に増加した。

【0129】

図５に示すように、２ラウンドのソーティング後、フローサイトメトリーで検出できるＬｉｂｒａｒｙ１、Ｌｉｂｒａｒｙ２、Ｌｉｂｒａｒｙ３、Ｌｉｂｒａｒｙ４、およびＬｉｂｒａｒｙＭｉｘの中のＦｃγＲＩＩＢに結合した細胞の割合は、すべて増加した：それぞれ１．８５％、１６．３％、０．５７％、２．１９％、２２．２％に達し、野生型ヒトＩｇＧ２の０．３４％と比較して、比率は５．４４倍、４７．９４倍、１．６９倍、６．４４倍、６５．２９倍に増加した。

【0130】

実施例３：フローサイトメトリーソーティング後の次世代シーケンシングでＦｃγＲＩＩＢへの結合能が向上したＩｇＧ２ Ｆｃ変異タイプを分析する。

【0131】

本発明は、ソーティング前後の配列の割合が野生型ヒトＩｇＧ２の２倍以上増加する変異（濃縮倍数／野生型濃縮倍数＞２）、つまり、ＦｃγＲＩＩＢへの結合能を改善するのに有利なヒトＩｇＧ２の変異タイプ（野生型と比較して濃縮倍率が少なくとも１倍増加）を選択し、表７に示される。例えば、ソーティング前のＬ３２８Ｗの割合は０．３９％、ソーティング後の割合は１２．８４％、濃縮倍率は３３．２０で、野生型（１．４９）の２２．２１倍である。

【0132】

【表7】

＃１－３：当該データは、Ｌｉｂｒａｒｙ２（＃１）、Ｌｉｂｒａｒｙ４（＃２）、およびＬｉｂｒａｒｙＭｉｘ（＃３）の実験から得される。

【0133】

点変異に加え、本発明は、いくつかの二重変異タイプもスクリーニングし、これらのアミノ酸変異の比率は、フローサイトメトリーソーティングの前後で野生型ヒトＩｇＧ２の２倍以上に増加した。なかでも、二重変異の組み合わせ（Ｖ２６６Ａ／Ｐ２７１Ｃ又はＧ、Ｓ２６７Ａ／Ｐ２７１Ｃ又はＧ、Ｓ２６７Ｅ／Ｄ２７０Ｈ、Ｓ２６７Ｅ／Ｐ２７１Ｃ又はＶ又はＷ又はＹ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２９８Ｒ、Ｓ２６７Ｍ／Ｐ２７１Ｃ又はＧ、Ｐ２７１Ａ／Ｓ２９８Ｒ、Ｐ２７１Ｇ／Ｇ２３６Ｖ、Ｐ２７１Ｇ／Ｇ３２９Ｓ、Ｐ２７１Ｇ／Ｐ３３１Ｃ又はＴ、Ｐ２７１Ｇ／Ｓ２９８Ｄ又はＥ又はＧ又はＫ又はＬ又はＮ又はＲ、Ｐ２７１Ｇ／Ｔ２９９Ａ又はＭ又はＳ又はＷ、Ｇ３２７Ａ／Ａ３３０Ｒ又はＶ、Ｇ３２７Ａ／Ｉ３３２Ａ又はＣ又はＥ、Ｌ３２８Ｅ／Ｉ３３２Ｔなど）の増加した割合は、どの点変異よりも高く、変異の組み合わせの両方のアミノ酸がＦｃγＲＩＩＢの結合能の向上に寄与することを示した。さらに、Ｓ２６７Ｖ／Ｓ２９８Ｌなどの変異の組み合わせもあり、そのコンビナトリアル変異が向上した倍数は、向上した倍数がより高いＳ２９８Ｌ変異とほぼ等しく、これにより、この変異の組み合わせの向上は、この１つのサイトの変異の寄与のみであり、他の点突然変異は基本的に効果がないと見られる（表８を参照）。したがって、本発明のＦｃ領域、抗体、Ｆｃフラグメント或いは融合タンパク質は、本発明に提供されるアミノ酸変異に加え、さらに他の可能的な組み合わせ又は修飾を含んでも良い。

【0134】

【表8】

ａ．ソーティング後の変異体の濃縮倍率／野生型の濃縮倍率の比の値
ｂ．元の点変異ソーティング後の変異体の濃縮倍率／野生型の濃縮倍率の比の値
ｃ．コンビナトリアル変異が増加した倍率／その中の一つの点変異が増加した倍率の比の値
実施例４：磁気ビーズソーティング後の次世代シーケンシングによって有利な変異体タイプを分析する。

【0135】

本発明では、磁気ビーズソーティング技術を用いて、上記のフローサイトメトリーソーティングに得られたＦｃγＲＩＩＢ高親和性細胞を続いてソーティングし、ＢｉｏｔｉｎにマークされたＦｃγＲＩＩＢとマークされない活性化性ＦｃγＲを混合し、細胞と一緒にインキュベートし、次に、抗Ｂｉｏｔｉｎ磁性ビーズを使用し、マークされた細胞をソーティングし、ソーティング前後の濃縮比率を次世代シーケンシングで分析することにより、Ｉ／Ａ比の高い変異をスクリーニングすることができ、表９に示された。変異を選択する方法：ソーティングの前後での比率が、野生型ヒトＩｇＧ２の２倍以上に増加しつつ、非結合磁気ビーズ部分（すなわち、ＬＳカラムを通過するときの排出液）のソーティングでの割合が減少した変異を選択した。

【0136】

【表9】

ＮＡは、この列のサンプルにおいて、この行に対応する変異タイプは検出されないことを表す。

【0137】

＃１－＃４：当該データは、Ｌｉｂｒａｒｙ２（＃１）、Ｌｉｂｒａｒｙ４（＃２）、ＬｉｂｒａｒｙＭｉｘ（＃３）の二回実験（＃３、＃４）から得される。

【0138】

Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ（Ｓｅｕｎｇ Ｙ． Ｃｈｕら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４５（２００８）３９２６－３９３３）の報告によって）、およびＳ２９８Ａの変異（特許ＵＳ２００９００４２２９１Ａ１の報告によって）は、ＦｃγＲＩＩＢに対するヒトＩｇＧ１の親和性を向上させることができる。しかしながら、本発明の次世代シーケンシング分析の結果は、ソーティング後のＧ２３６ＤまたはＳ２９８Ａ変異を含むＩｇＧ２変異体の割合が増加せず、むしろ減少したことを示した（表１０）；Ｓ２３９Ｄ変異を含むヒトＩｇＧ２変異体の割合は、ソーティング前は０．０２６％であり、ソーティング後のシーケンシング結果では検出されなかった。これらの結果は、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、およびＳ２９８Ａの変異がヒトＩｇＧ２のＦｃγＲＩＩＢ結合能を増加させないことを示し、表１０を参照する。

【0139】

【表10】

ＮＡは、この行の変異体タイプは、この列の実験で検出されておらず、百分比と倍率を計算できないことを表す。

【0140】

実施例５：ヒトＩｇＧ２ ＦｃポリペプチドフラグメントにおけるＦｃγＲＩＩＢ親和性を増強できるアミノ酸変異。

【0141】

表１１は、本発明の点変異ライブラリースクリーニング法に従ってスクリーニングされたＦｃγＲＩＩＢ親和性を増強できるアミノ酸変異をまとめる。以前の特許と比較して分かるように、本発明のサイトＳ２６７ＧおよびＰ２７１Ｃはいずれも、ＦｃγＲＩＩＢ結合能を向上できるヒトＩｇＧ２の新しいタイプの変異である。サイトＨ２６８Ｓ、Ｌ３２８ＡおよびＧ３２７Ａはいずれも、ＦｃγＲＩＩＢ結合能を向上できると同時に、ＦｃγＲＩＩＢよりも他の活性化性ＦｃγＲへの親和性が弱いヒトＩｇＧ２の新しいタイプの変異である。

【0142】

【表11】

実施例６：ヒト抗体ＩｇＧ２＿Ｆｃコンビナトリアル変異ライブラリーの構築。
前記の点変異ライブラリーとハイスループットシーケンシングの結果によってスクリーニングされた、ＦｃγＲＩＩＢ親和性を向上できるＦｃ変異タイプ（濃縮倍率が野生型の１倍以上高い変異）に基づき、二つのタイプのコンビナトリアル変異ライブラリーをデザインした：種類一：４つの領域間のシングルポイントコンビナトリアル変異、すなわち、Ｐ２３３－Ｖ２４０、Ｖ２６６－Ｐ２７１、Ｓ２９８－Ｔ２９９及びＧ３２７－Ｉ３３２の４つの領域のそれぞれで０－１つの突然変異があり、合計０～４サイトのコンビナトリアル変異；種類二：単一領域内の複数のアミノ酸のコンビナトリアル変異、すなわち、Ｐ２３３－Ｖ２４０、Ｖ２６６－Ｐ２７１、Ｓ２９８－Ｔ２９９及びＧ３２７－Ｉ３３２の４つの領域の各領域内部のアミノ酸のコンビナトリアル変異である（それぞれ０－７、０－６、０－２、および０－６個のコンビナトリアル変異）、図６に示された。プラスミドライブラリーのサイズは最大４．６７×１０^５であった。

【0143】

実施例７：コンビナトリアル変異ライブラリーのフローサイトメトリーソーティング前後の細胞濃縮状況。
点変異ライブラリーとハイスループットシーケンシングの結果によって、種類一と種類二のコンビナトリアル変異ライブラリーを構築し（実施例６）、コンビナトリアル変異を発現する細胞ライブラリーを得、そして、ＦｃγＲＩＩＢへ高い親和性を持つ細胞を、連続に、２～３ラウンドにソーティングした。図７に示すように、２ラウンドのソーティング後、フローサイトメトリーで検出されたように、ライブラリーＩｇＧ２＿Ｃ０１、ライブラリーＩｇＧ２＿Ｃ０２のＦｃγＲＩＩＢに結合した細胞の割合は増加し、それぞれ９．５３％、２６．９％に達し、野生型ヒトＩｇＧ２の０．２３％と比較して、比率は４１．４３倍と１１６．９６倍に増加した。ただし、ＩｇＧ２＿Ｃ０１は、Ｐ２３３－Ｖ２４０、Ｖ２６６－Ｐ２７１、Ｓ２９８－Ｔ２９９及びＧ３２７－Ｉ３３２の４つの領域には、それぞれで最大１つの変異があるコンビナトリアル変異（種類一）ライブラリーである；ＩｇＧ２＿Ｃ０２は、Ｐ２３３－Ｖ２４０、Ｖ２６６－Ｐ２７１、Ｓ２９８－Ｔ２９９とＧ３２７－Ｉ３３２の４つの領域には、連続するコンビナトリアル変異（種類二）ライブラリーを合併し、一緒に３Ｔ３細胞に導入してなる細胞ライブラリーである。

【0144】

図８に示すように、２ラウンドのソーティング後、フローサイトメトリーで検出されたように、ＦｃγＲＩＩＢへのライブラリーＣｍｉｘとライブラリーＣ２細胞の結合能は、著しく増加し、ＦｃγＲＩＩＢに結合した細胞の割合は、各ラウンドのソーティング後に大幅に増加した：ラウンド１とラウンド２のソーティング後、Ｃｍｉｘにおいて、ＦｃγＲＩＩＢに結合した細胞の割合はそれぞれ１．８６％と２８．９％に達し、ソーティング前の０．００７５６％と比較して、それぞれ２４６．０３倍と３８２２．７５倍に増加した；Ｃｍｉｘは、それぞれ６．４６％と２８．９％に達したが、ソーティング前の０．００８９９％と比較して、それぞれ７１８．５８倍と３２１４．６８倍に増加した。ライブラリＣｍｉｘは、４つの領域のそれぞれに最大１つの変異があるコンビナトリアル変異（種類一）ライブラリである；ライブラリＣ２は、Ｖ２６６－Ｐ２７１領域のコンビナトリアル変異（種類二）ライブラリである。

【0145】

実施例８：フローサイトメトリーソーティング後の次世代シーケンシングでＦｃγＲＩＩＢへの結合能が向上したＩｇＧ２ Ｆｃコンビナトリアル変異タイプを分析する。

【0146】

ＦｃγＲＩＩＢへの結合が向上されたＩｇＧ２Ｆｃコンビナトリアル変異タイプをスクリーニングするために、本発明に構築されたコンビナトリアル変異ライブラリーをフローサイトメトリーソーティングし、ＦｃγＲＩＩＢとの結合能が高い細胞を得、そして、次世代シーケンシングで、ソーティング前後の各変異タイプの濃縮倍率を分析し、結果は、表１２に示された。選択された変異はすべて、高い倍率で濃縮されたか（最終ラウンドのソーティングの後／ソーティングの前）、少なくとも１つのラウンドのソーティングで大幅に濃縮されたか（現在のラウンドのソーティングの後／現在のラウンドのソーティングの前）、最終ラウンドの後にのみ検出された。たとえば、Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗの濃縮倍率は、野生型の２１９２０．３３倍である（最終ラウンドのソーティングの後／ソーティングの前）；点変異Ｌ３２８Ｗの濃縮倍率は野生型の８．７８倍である（最終ラウンドのソーティングの後／ソーティングの前）；Ｈ２６８Ｄ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗの濃縮倍数はそれぞれ４３．９８（ラウンド２のソーティングの後／ラウンド２のソーティングの前）と５．９５である（ラウンド３のソーティングの後／ラウンド３のソーティングの前）；Ｖ２３４Ｍ／Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２９８Ｌ／Ｌ３２８Ｗの濃縮倍数は５．１３である（ラウンド３のソーティングの後／ラウンド３のソーティングの前）；Ｖ２３４Ｑ／Ａ２３５Ｇ／Ｐ２３８Ｌ／Ｓ２３９Ｖ／Ｇ３２７Ａ／Ｌ３２８Ｅ／Ａ３３０Ｓ／Ｉ３３２Ｔは、最終ラウンドの後にのみ検出された。

【0147】

【表12】

＃１－４：当該データは、ライブラリーＩｇＧ２＿Ｃ０１（＃１）、ＩｇＧ２＿Ｃ０２（＃２）、Ｃｍｉｘ（＃３）、Ｃ２（＃４）の実験から得される。ＮＡは、この列のサンプルにおいて、この行に対応する変異タイプは検出されないことを表す。

【0148】

実施例９：酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によってＦｃγＲへの変異抗体の結合特性を分析する。
次世代シーケンシングによってスクリーニングされた有利なＦｃ単一点変異および変異組み合わせに基づいて、Ｆｃ変異の新しい組み合わせを構築し、Ｆｃ変異のこれらの新しい組み合わせを含む抗ヒトＯＸ４０抗体を発現し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によってＦｃγＲへの変異抗体の結合特性を分析した。図９－１４は、異なるＦｃ変異体のＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩＡ^１３１Ｈ、ＦｃｙＲＩＩＡ^１３１Ｒ、ＦｃｙＲＩＩＢ、ＦｃｙＲＩＩＩＡ^１５８Ｆ、およびＦｃｙＲＩＩＩＡ^１５８Ｖへの結合能を示した。ＩｇＧ１の各ＦｃγＲへの結合能は、１に設定され、これらのＦｃγＲに対する各変異体の相対的結合能（ＦｃγＲに結合する当該バリアントのＥＬＩＳＡ吸光度を当該ＦｃγＲに結合するＩｇＧ１のＥＬＩＳＡ吸光度で割ったもの）および野生型ＩｇＧ２に対する各変異体のＦｃγＲＩＩＢ結合能の増加した倍率（ＦｃγＲＩＩＢに結合した当該バリアントのＥＬＩＳＡ吸光度をＦｃγＲＩＩＢに結合した野生型ＩｇＧ２のＥＬＩＳＡ吸光度で割ったもの）を計算した。表１３に示すように、野生型ＩｇＧ２と比較し、各変異体のＦｃγＲＩＩＢ結合能の増加した倍率は４．２３～２５．５５倍である。また、各変異体のＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＩＡ^１３１Ｒへの結合能（ＲＩＩＢ／ＲＩＩＡＲ）の比を算出した結果（表１３）、これらの変異体のＲＩＩＢ／ＲＩＩＡＲ比はいずれも、野生型ＩｇＧ２よりも高かった（野生型ＩｇＧ２：０．３４；変異体：０．４６－３．６７）。

【0149】

【表13】

備考：表中、ＲＩ、ＲＩＡＨ、ＲＩＩＡＲ、ＲＩＩＢ、ＲＩＩＩＡＦ、ＲＩＩＩＡＶは、それぞれＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ^１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩＡ^１３１Ｒ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ^１５８Ｆ、ＦｃγＲＩＩＩＡ^１５８Ｖを表す。

【0150】

実施例１０：有利な変異が、より強い免疫活性化活性をサポートする。
ＦＣγＲ／ＯＸ４０ヒト化マウス脾臓細胞における上記の有利な変異を含む抗ヒトＯＸ４０抗体（実施例９）の免疫活性化活性を分析し、図１６と１７は、抗体濃度が１μｇ／ｍｌの場合のＣＤ４＋細胞のＣＦＳＥ蛍光強度と対応するヒストグラムを示し、値が低いほど活性が強く、選択された抗体の活性はいずれも野生型ＩｇＧ２よりも優れた。２つの実験における異なる抗体濃度の活性値を一緒に分析し、αＣＤ３抗体のみ添加した場合の活性を０、αＣＤ３抗体とαＣＤ２８抗体を陽性対照として添加した場合の活性を１とし、各変異抗体の相対活性を計算し、平均値を算出した。表１４は、選択された３０個の変異抗体の活性が、いずれも野生型ＩｇＧ２の活性よりも優れ、活性が野生型の９．１７～１６．５１倍に向上することを示した。

【0151】

【表14】

ＮＡは、この行の変異抗体がこの列の実験を実行しなかったことを表す。

【0152】

実施例１１：ＩｇＧ１のＦｃγＲ結合能に対する既知の変異の影響に基づいて、ＩｇＧ２のＦｃγＲ結合能に対するそれらの影響を直接予測することはできない。

【0153】

Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ（Ｓｅｕｎｇ Ｙ．Ｃｈｕら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４５（２００８）３９２６－３９３３）の報告によって）、およびＳ２９８Ａの変異（特許ＵＳ２００９００４２２９１Ａ１の報告によって）は、ＦｃγＲＩＩＢに対するヒトＩｇＧ１の親和性を向上させることができる。しかしながら、本発明の次世代シーケンシング分析の結果は、ソーティング後のＧ２３６ＤまたはＳ２９８Ａ変異を含むＩｇＧ２変異体の割合が増加せず、むしろ減少したことを示した（表１０）；Ｓ２３９Ｄ変異を含むヒトＩｇＧ２変異体の割合は、ソーティング前は０．０２６％であり、ソーティング後のシーケンシング結果では検出されなかった。これらの結果は、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、およびＳ２９８Ａの変異がヒトＩｇＧ２のＦｃγＲＩＩＢ結合能を増加させないことを示し、表１０を参照する。

【0154】

さらに、ＩｇＧ１のＦｃγＲＩＩＢ結合能を大幅に向上させることができるＶ１１変異サイトをＩｇＧ２に導入することにより（Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ）（Ｆ．Ｍｉｍｏｔｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．２６ｎｏ．１０ｐｐ．５８９－５９８，２０１３）、ＩｇＧ２＿Ｍ２（Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ）、ＩｇＧ２＿Ｍ３（Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ）、ＩｇＧ２＿Ｍ４（Ｇ２３６Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ）とＩｇＧ２＿Ｍ５（Ｇ２３６Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ）を得、ただし、ＩｇＧ２中のＭ５の変異は、ＩｇＧ１Ｖ１１の変異に対応する。図１５のＥＬＩＳＡの結果は、これらの変異体がＩｇＧ１Ｖ１１と同じようにＩｇＧ２にＦｃγＲＩＩＢ結合能を付与しなかったことを示した。したがって、ＩｇＧ１のＦｃγＲ結合能に対する既知の変異の影響に基づいて、ＩｇＧ２のＦｃγＲ結合能に対するそれらの影響を直接予測することはできない。

【0155】

本出願に言及されている全ての参考文献は、参照として単独に引用されるように、本出願に引用されて、参照になる。理解すべきのは、本発明の上記の開示に基づき、当業者は、本発明を様々な変更または修正を行っても良い、これらの同等の形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

2023507922000001.app

【国際調査報告】