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特表2023-507923プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いた生理活性ペプチドの精製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-28
(54)【発明の名称】プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いた生理活性ペプチドの精製方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/16 20060101AFI20230220BHJP
C07K 16/06 20060101ALI20230220BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20230220BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230220BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20230220BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230220BHJP
【ＦＩ】
C07K1/16 ZNA
C07K16/06
C07K1/22
C12P21/08
C12P21/00 C
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022534158
(86)(22)【出願日】2020-12-24
(85)【翻訳文提出日】2022-06-30
(86)【国際出願番号】 IB2020062434
(87)【国際公開番号】W WO2021130717
(87)【国際公開日】2021-07-01
(31)【優先権主張番号】62/953,685
(32)【優先日】2019-12-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/953,687
(32)【優先日】2019-12-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】10-2020-0173808
(32)【優先日】2020-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522181544
【氏名又は名称】エービーエルバイオインク
(74)【代理人】
【識別番号】100113376
【弁理士】
【氏名又は名称】南条 雅裕
(74)【代理人】
【識別番号】100179394
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬田 あや子
(74)【代理人】
【識別番号】100185384
【弁理士】
【氏名又は名称】伊波 興一朗
(74)【代理人】
【識別番号】100137811
【弁理士】
【氏名又は名称】原 秀貢人
(72)【発明者】
【氏名】ソン テヘ
(72)【発明者】
【氏名】パク ヨンドン
(72)【発明者】
【氏名】ジョン ジンウォン
(72)【発明者】
【氏名】ホン ジュンヒョン
(72)【発明者】
【氏名】イム ヒジン
(72)【発明者】
【氏名】キム ドンジン
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE10
4B064CE12
4H045AA20
4H045BA09
4H045DA76
4H045FA74
4H045GA21
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、第１のＦｃ含有生理活性ペプチド及び第２のＦｃ含有生理活性ペプチドを含み、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドと比較してヒトＶＨ３ドメインを少なくとも１つ以上を含むものであるＦｃ含有生理活性ペプチドの混合物を、プロテインＡリガンドを含有する親和性マトリックスを含む親和性カラムを用いて精製する方法を提供する。前記精製方法によれば、工程の簡略化が達成されながらも同一又は類似の構造を有する生理活性ペプチドを高純度で精密に単離することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）Ｆｃ含有生理活性ペプチドの混合物を、プロテインＡリガンドを含む親和性マトリックスを含むカラムにロードするステップであって、前記生理活性ペプチドの混合物は、第１のＦｃ含有生理活性ペプチド及び第２のＦｃ含有生理活性ペプチドを含み、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドと比較して、ヒトＶＨ３ドメインを少なくとも１つさらに含むステップと、及び（ｂ）前記カラムに溶出液をロードし、前記生理活性ペプチドの混合物に含まれる前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドそれぞれが含むヒトＶＨ３ドメインの数に応じて、互いに異なるｐＨで前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドを単離溶出するステップを含む、Ｆｃ含有生理活性ペプチドの精製方法。
【請求項2】
前記生理活性ペプチドの混合物は、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドと比較して、ヒトＶＨ３ドメインを少なくとも１つさらに含む第３のＦｃ含有生理活性ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の精製方法。
【請求項3】
前記生理活性ペプチドの混合物は、前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドがｎ個（ｎは０以上の整数）のヒトＶＨ３ドメインを含み、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドはｎ＋１個のヒトＶＨ３ドメインを含み、前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドがｎ＋２個のヒトＶＨ３ドメインを含む、請求項２に記載の精製方法。
【請求項4】
前記ステップ（ｂ）は、（ｂ１）第１のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップと、
（ｂ２）前記第１のｐＨ範囲より低い第２のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップを含む、請求項１に記載の精製方法。
【請求項5】
上記ステップ（ｂ）は、（ｂ１）第１のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップと、
（ｂ２）前期第１のｐＨ範囲より低い第２のｐＨ範囲を有する溶出液を前期カラムにロードして前期第２のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップと、
（ｂ３）前期第２のｐＨ範囲より低い第３のｐＨ範囲を有する溶出液を用いて前期第３のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップをさらに含む、請求項２に記載の精製方法。
【請求項6】
前記Ｆｃは、野生型プロテインＡとの結合力に影響を及ぼす突然変異が導入されていない、請求項１に記載の精製方法。
【請求項7】
前期第１又は第２のＦｃ含有生理活性ペプチドがＶＨ３ドメインを含む場合、前記第１又は第２のＦｃ含有生理活性ペプチドが、以下の配列から選択されるＶＨドメイン含有可変領域配列を含む、請求項１に記載の精製方法。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の軽鎖可変配列と、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４の軽鎖可変配列と、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６の軽鎖可変配列と、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の軽鎖可変配列と、又は
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０の軽鎖可変配列。
【請求項8】
前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドが、以下の配列から選択されるＶＨドメイン含有可変領域配列を含む、請求項２に記載の精製方法。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の軽鎖可変配列と、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４の軽鎖可変配列と、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６の軽鎖可変配列と、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の軽鎖可変配列と、又は
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の軽鎖可変配列。
【請求項9】
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドがＩｇＧを含む抗体である、請求項１に記載の精製方法。
【請求項10】
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重抗体である、請求項１に記載の精製方法。
【請求項11】
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、Ｆｃに結合したペプチド薬物を含む、請求項１に記載の精製方法。
【請求項12】
前記ペプチド薬物は、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択される、請求項１１に記載の精製方法。
【請求項13】
前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドはｓｃＦｖを含まずに、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは、Ｆｃの２つの重鎖のうちの１つのＣ末端に連結された配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１からなる１つのｓｃＦｖを含み、及び
前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドが、Ｆｃの２つの重鎖の全てのＣ末端にそれぞれ連結された配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１からなる２つのｓｃＦｖを含む、
請求項２に記載の精製方法。
【請求項14】
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドはＩｇＧであり、前記ＩｇＧ抗体の可変領域がヒトＶＨ３ドメインを含む、
請求項１に記載の精製方法。
【請求項15】
（ａ－１）抗体混合物を、プロテインＡリガンドを含む親和性マトリックスを含むカラムにロードするステップであって、前記抗体混合物は単一特異性抗体と、前記単一特異性抗体の２つの重鎖定常領域のいずれかのＣ末端にヒトＶＨ３ドメインを含む１つの抗原結合断片が結合した一価二重特異性抗体と、前記単一の特異性抗体の２つの重鎖定常領域のＣ末端に前記抗原結合断片がそれぞれ１つずつ結合した二価二重特異性抗体を含むステップと、（ｂ－１）第１のｐＨ範囲を有する溶出液をカラムにロードして前記単一特異性抗体を溶出するステップと、
（ｃ－１）前記第１のｐＨ範囲より低い第２のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記一価二重特異性抗体を溶出するステップと、
（ｄ－１）前記第２のｐＨ範囲より低い第３のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして二価二重特異性抗体を溶出するステップを含む、
精製方法。
【請求項16】
前記単一特異性抗体の可変領域がヒトＶＨ３ドメインを含む、請求項１５に記載の精製方法。
【請求項17】
前記単一特異性抗体の可変領域がヒトＶＨ３ドメインを含まない、請求項１５に記載の精製方法。
【請求項18】
前記抗原結合断片は、配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、請求項１５に記載の精製方法。
【請求項19】
前記第１のｐＨ範囲は３．４以上５．０以下であり、前記第２のｐＨ範囲は３．３以上４．１以下であり、
前記第３のｐＨ範囲は３．０以上４．０以下である、請求項１５に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いたＦｃ含有生理活性ペプチドの精製方法に関するものであり、より具体的にはＦｃ含有生理活性ペプチドに含まれるヒトＶＨ３ドメインの数の差によるプロテインＡとの結合力の差を用いてペプチド混合物の中で特定のペプチドを高純度で精製する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
特定のペプチドを単離するために様々な精製方法が使用される。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーなどが使用される。
しかしながら、同様の構造のペプチドの場合、等電点、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）、サイズの差及び親和性の差が大きくないため、普遍的な精製方法では高純度の特定ペプチドを得ることが難しい。このような場合、人為的に配列に変化を与え、目的とする特定ペプチドと以外に生成することができるペプチドとの間に等電点及び親和性の差を生じさせ、これを精製方法に用いる方法が多く知られている。いずれの場合も、等電点や親和性の差を大きくするための人為的な配列変化に応じて、特定ペプチドの物理化学的性質が変化し、これから予想できない免疫原性などが誘発されることがある。
しかしながら、同様の構造のペプチドの場合、等電点、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）、サイズの差及び親和性の差が大きくないため、普遍的な精製方法では高純度の特定ペプチドを得ることが難しい。このような場合、人為的に配列に変化を与え、目的とする特定ペプチドと以外に生成することができるペプチドとの間に等電点及び親和性の差を生じさせ、これを精製方法に用いる方法が多く知られている。いずれの場合も、等電点や親和性の差を大きくするための人為的な配列変化に応じて、特定ペプチドの物理化学的性質が変化し、これから予想できない免疫原性などが誘発されることがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本発明は、生理活性ペプチド混合物に含まれるＦｃ含有生理活性ペプチドのヒトＶＨ３ドメインの数の差によるプロテインＡの結合力の差を用いて、アフィニティークロマトグラフィーを介してペプチド混合物又は抗体混合物からＦｃ含有生理活性ペプチド又は抗体を高純度で精製する方法を提供することを一目的とする。さらに具体的には、親和性又は等電点特性の差は大きくないが、ＶＨ３ドメインの数の点で異なるペプチドが一緒に製造される場合、ペプチドに含まれるＶＨ３ドメインの数に応じて全長ドメイン（ｆｕｌｌ ｄｏｍａｉｎ）プロテインＡとの親和成が異なるため、ＶＨ３ドメインの数が異なるペプチドの全長ドメインプロテインＡとの親和度の差を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、ペプチドをＶＨ３ドメインの数に応じて単離することにより所望のペプチドを高純度で得る方法を提供することを一目的とする。
特に、非対称ヘテロ二量体（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）タンパク質の製造過程で不要なホモ二量体（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）タンパク質が一緒に生成される場合、各タンパク質に含まれるＶＨ３ドメインの数の差に基づいて、非対称ヘテロ二量体タンパク質とホモ二量体タンパク質を単離精製する方法を提供することを一目的とする。
本発明で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本発明で開示される様々な要素の全ての組み合わせが本発明の範囲に属する。
さらに、以下に記載される具体的な説明によって本発明の範囲が制限されるとは言えない。
本明細書で第１、第２などの用語は様々な構成要素を説明するのに使用することができるが、前記構成要素は前記用語によって限定されるべきではない。前記用語は、ある構成要素を他の構成要素と区別する目的でのみ使用される。例えば、本発明の権利の範囲から逸脱することなく、第１の構成要素を第２の構成要素と命名することができ、同様に第２の構成要素も第１の構成要素と命名することができる。単数の表現は、文脈上明らかに別段の意味を持たない限り、複数の表現を含む。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。さらに、一般的に使用される辞書で定義されている用語などの用語は、関連技術の文脈で意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、理想的又は過度に形式的な意味で解釈されない限り、明示的にここで定義される。
「含む」又は「含有」などの用語は、明細書に記載されている特徴、数字、ステップ、動作、構成要素、又はそれらを組み合わせたものが存在することを指定するものであり、１つ又は複数の他の特徴又は数字、ステップ、動作、構成要素又はそれらを組み合わせたものの存在又は追加の可能性を予め排除しないことを理解すべきである。
「及び／又は」は、関連する構成が定義することができる１つ又は複数の組み合わせの両方を含む。
本発明で使用される用語「生理活性ペプチド」は、１つ以上の生理活性を示すペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質の一部及び融合タンパク質等を全て含む概念であり、特定分子量ないしアミノ酸の長さ、種類等によって限定されるものではない。
本発明で使用される「Ｆｃ含有生理活性ペプチド」という用語は、抗体に見られるＦｃ領域（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含む生理活性ペプチドを意味する。例えば、Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、Ｆｃ領域を含有する抗体を含む物質である。
本発明は、Ｆｃ含有生理活性ペプチドの混合物の中でＦｃ含有生理活性ペプチドを単離及び／又は精製する方法を提供することができる。
本明細書において、生理活性ペプチドとは、生物に伝達されて生体の機能を調節するペプチドを意味するものであり、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質又は受容体などの生体機能を調節するペプチドを生理活性物質と定義することができ、例えば上述したペプチドは、ＦｃのＮ末端又はＣ末端に連結された形態であり得る。
本発明の一実施形態によれば、（ａ）Ｆｃ含有生理活性ペプチドの混合物を、プロテインＡリガンドを含む親和性マトリックスを含むカラムにロードするステップであって、前記生理活性ペプチドの混合物は第１のＦｃ含有生理活性ペプチド及び第２のＦｃ含有生理活性ペプチドを含み、ここで前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドと比較してヒトＶＨ３ドメインを少なくとも１つさらに含む、ステップと、（ｂ）前記カラムに溶出液をロードし、前記生理活性ペプチドの混合物に含まれる前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドのそれぞれが含むヒトＶＨ３ドメインの数に応じて、互いに異なるｐＨで前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドを単離溶出するステップを含むＦｃ含有生理活性ペプチドの精製方法を提供することができる。
一実施形態では、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドと比較してヒトＶＨ３ドメインを少なくとも１つさらに含むか、又はヒトＶＨ３ドメインと９５％以上、９０％以上、８０％以上又は７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を少なくとも１つさらに含むものであり得る。ヒトＶＨ３ドメインとは、ＶＨ３ファミリーのヒト抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置するアミノ酸配列であって、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３～ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３７のいずれかの配列を含むことができるが、これらに限定されず、通常の技術者であれば、タンパク質に含まれるヒトＶＨ３ドメイン配列を容易に把握することができる。前記ヒトＶＨ３ドメインは主にＶＨ３ファミリーのヒト抗体に存在するが、まれにマウスなどの哺乳動物（又はキメラ）抗体のフレームワークにも見られる。例えば、本発明の実施形態で使用されるｈｕ１１Ｆ１１はヒトＶＨ３ドメインを含む抗体であり、ｃｈ１Ｅ４及び抗ＢＡＣＥ抗体はヒトＶＨ３ドメインを含まない抗体である。ただし、例外的にｃｈ１１Ｆ１１は、キメラ抗体であってもヒトＶＨ３ドメインを含む抗体である。
前記プロテインＡリガンドは全長ドメインプロテインＡリガンドであり得る。すなわち、プロテインＡリガンドは、全長ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメイン）の全てを含むものであり得る。しかしながら、実施形態はこれに限定されるわけではなく、前記プロテインＡリガンドは、Ｅドメイン及びＤドメインのうち選択される１つ又は複数のドメインを含むことができる。例えば、前記プロテインＡリガンドは、Ｅドメイン及びＤドメインを含むことができる。
前記親和性マトリックスにおいて、プロテインＡリガンドを支持する支持体は、球（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）形のようなビード（ｂｅａｄ）形態を有する粒子であり得る。前記親和性マトリックスにおいて、支持体の平均粒子サイズは、例えば約９０μｍ未満であってもよく、例えば約８０μｍ以下又は７５μｍ以下であってもよい。さらに、前記親和性マトリックスにおいて、前記支持体の平均粒子サイズは、例えば、約１μｍ以上又は５μｍ以上であってもよい。前記親和性マトリックスにおいて、前記支持体のサイズが上記の範囲を満たす場合、生理活性ペプチドの単離能はさらに優れている可能性がある。
前記ステップ（ｂ）は、（ｂ１）第１のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップと、（ｂ２）前記第１のｐＨ範囲より低い第２のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップを含むことができる。前記第１のｐＨ範囲を有する溶出液及び前記第２のｐＨ範囲を有する溶出液は、それぞれ別々に又は順次カラムにロードされるか、又は前記溶出液がカラムに連続的にロードされながら、ロード時間に応じて第１のｐＨ範囲から第２のｐＨ範囲に濃度勾配を変えることができる。
前記生理活性ペプチドの混合物は、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドと比較してヒトＶＨ３ドメインを少なくとも１つさらに含む第３のＦｃ含有生理活性ペプチドをさらに含むことができる。
本発明の精製方法によれば、それぞれＶＨ３ドメインの数が異なる第１のＦｃ含有生理活性ペプチド、第２のＦｃ含有生理活性ペプチド及び第３のＦｃ含有生理活性ペプチドを互いに単離して精製することができ、これらいずれを精製目的にしても高純度で精製が可能な利点がある。
さらに、本発明は精製対象物質の構成においてＦｃを排除するものではなく、ＦｃとプロテインＡとの間の結合も精製工程において考慮されている。Ｆｃはそれ自体としてプロテインＡに対する親和性を有するため、ＦｃとプロテインＡとの親和性を利用した精製方法では、Ｆｃ以外の構成要素の親和性を排除しようとし、逆の場合にはＦｃの親和性を排除しようとするのが一般的です。一方、本発明では、重鎖ＦｃとＶＨ３ドメインの両方を構成要素とするＦｃ含有生理活性ペプチドをＶＨ３ドメインの数に応じて精製することができる方法を提供しようとした。
前記生理活性ペプチドの混合物は、前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドがｎ個（ｎは０以上の整数）のヒトＶＨ３ドメインを含み、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドがｎ＋１個～ｎ＋９個のヒトＶＨ３ドメインを含み、前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドがｎ＋２個か～ｎ＋１０個のヒトＶＨ３ドメインを含んでもよく、例えば、前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドがｎ個（ｎは０以上の整数）のヒトＶＨ３ドメインを含み、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドはｎ＋１個のヒトＶＨ３ドメインを含み、前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドがｎ＋２個のヒトＶＨ３ドメインを含んでもよい。
ｎは、例えば、０以上１０以下、０以上８以下、０以上６以下、０以上５以下、０以上３以下、１以上１０以下、１以上８以下、１以上６以下、１以上５以下、１以上３以下、２以上１０以下、２以上８以下、２以上６以下、２以上５以下であってもよい。ｎは、例えば０、１、２、又は３であり得る。
前記ステップ（ｂ）は、（ｂ１）第１のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップと、（ｂ２）前記第１のｐＨ範囲より低い第２のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップと、（ｂ３）前記第２のｐＨ範囲より低い第３のｐＨ範囲を有する溶出液を用いて前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップをさらに含むことができる。ここで、前記ステップ（ｂ１）～（ｂ３）は連続的に行われることができる（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）。すなわち、前記第１～第３のｐＨ範囲は、それぞれのｐＨ範囲が断続的なものではなく、第１のｐＨ範囲の開始値と第３のｐＨ範囲の末端値との間の連続的なｐＨ範囲に含まれ、最初に第１のｐＨ範囲を有する溶出液をカラムにロードし、連続的にロードされる溶出液のｐＨを徐々に下げることにより、溶出液のｐＨが次第に第２のｐＨ範囲及び第３のｐＨ範囲に移行することにより、前記ステップ（ｂ１）～（ｂ３）が行われることができる。また、精製対象の生理活性ペプチドの種類によって溶出されるｐＨ範囲が異なってもよい。
又は、前記ステップ（ｂ１）～（ｂ３）は段階的に行われることができる（ｓｔｅｐ ｇｒａｄｉｅｎｔ）。
前記Ｆｃは、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）タンパク質Ａとの結合力に影響を与える突然変異が導入されていないものであり得る。前記突然変異は、Ｆｃのポリペプチド配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸残基に挿入、欠失、付加及び／又は置換が生じたポリペプチドを意味する。すなわち、一実施形態のＦｃは、プロテインＡとの結合力を阻害する突然変異又はプロテインＡとの結合力を上昇させる突然変異が導入されていないものであり得る。
前記第１、第２及び／又は第３のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記Ｆｃに結合したペプチド薬物を含むことができる。ここで、前記「ペプチド薬物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ）」とは、前記生理活性ペプチドと同一又は異なる生理活性を有しながら、前記生理活性ペプチドに結合した独立のペプチドを意味する。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、前記ＦｃのＮ末端又はＣ末端に前記ペプチド薬物が結合したものであり得る。例えば、前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、前記Ｆｃの２つの重鎖が有する２つのＮ末端及び２つのＣ末端から選択される１つ又は複数に前記ペプチド薬物が結合したものであり得る。
本明細書で使用される「結合」という用語は、２つの対象が物理的又は化学的に直接結合したもの、及びリンカーを介して結合又は連結されたものの両方を含む意味で定義される。一実施形態では、Ｆｃとペプチド薬物がリンカーを介して連結される場合、前記リンカーは例えばペプチドであり得るが、当技術分野でペプチドを連結するために使用される通常の材料であれば特に限定されないことは言うまでもない。
前記ペプチド薬物は、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択される少なくとも１つであり得る。例えば、前記ペプチド薬物は、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、ＧＬＰ－１のようなグルカコン様ペプチド類、Ｇプロテイン関連受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合タンパク質類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、アレルギー抑制因子、細胞の壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α－１アンチトリプシン、アルブミン、α－ラクトアルブミン、アポリポタンパク質－Ｅ、エリスロポエチン、高グリコシル化エリスロポエチン、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、クラムビン、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、及びＸＩＩＩ、プラズミノゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレトキナーゼ、ヒルジン、プロテインＣ、Ｃ反応性タンパク、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、せクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗薬、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片類からなる群から選択される少なくとも１つであることができる。
前記グルカゴン様ペプチドは、エクセナチド、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）、タスポグルチド（Ｔａｓｐｏｇｌｕｔｉｄｅ）、アルビグルチド（Ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ）、リキシセナチド（Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅ）、及びＧＬＰ－１から選択される少なくとも１つ、例えばＧＬＰ－１であることができる。
前記第１又は第２のＦｃ含有生理活性ペプチドがＶＨ３ドメインを含む場合、前記第１及び第２のＦｃ含有生理活性ペプチドはそれぞれ独立してＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の軽鎖可変配列と、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０の軽鎖可変配列のいずれかのＶＨドメイン含有可変領域配列を含むことができ、例えば、前記重鎖可変配列及び軽鎖可変配列はｓｃＦｖの重鎖可変配列及び軽鎖可変配列であり得る。
前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７の重鎖可変配列及び ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の軽鎖可変配列と、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０の軽鎖可変配列のいずれかのＶＨドメイン含有可変領域配列を含むことができ、例えば、前記重鎖可変配列及び軽鎖可変配列はｓｃＦｖの重鎖可変配列及び軽鎖可変配列であり得る。
ただし、ＶＨ３ドメインは重鎖可変配列内に含まれるものであるため、上述の配列から選択される重鎖可変配列及び他の軽鎖可変配列からなるｓｃＦｖ、又は上述の配列から選択される重鎖可変配列のみからなる短鎖抗体も上記Ｆｃ含有生理活性ペプチドに含めることができる。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧ）を含む抗体であり得る。
本明細書において「抗体」は、任意のアイソタイプの完全な免疫グロブリン、標的抗原への結合のための完全な抗体と競合することができる抗原結合断片、又はそれらの組み合わせを意味することができる。例えば、マウス、キメラ、ヒト化、完全ヒト抗体、それらの抗原結合断片、又はそれらの組み合わせを含むことができる。抗体はそれ自体で抗原結合タンパク質の一種であり得る。抗体は一般に少なくとも２つの全長重鎖と２つの全長軽鎖を含むが、場合によって抗体は重鎖のみを含むこともある。前記抗体は、１つの標的に特異的に結合する単一特異性抗体、及び複数の標的に特異的に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体及び三重特異性抗体）を含み得る。
前記抗体はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体も含み、前記モノクローナル抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であるＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する単離された抗体であり得る。前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４型であるＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する単離された抗体であり得る。
本明細書における「軽鎖」は、抗原又はエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長の軽鎖及びその断片を含み得る。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ、及び不変領域ドメインＣＬを含み得る。軽鎖の可変領域ドメインは、軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在してもよい。軽鎖の種類には、カッパ及びラムダ鎖が含まれ得る。
本明細書において、「相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ，ＣＭＰ）」とは、抗体の可変領域のうち、抗原との結合特異性を付与する部位を意味することができる。
本明細書における「重鎖」は、抗原又はエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長重鎖及びその断片を含み得る。全長重鎖は、可変領域ドメイン及び３つの不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含み得る。可変領域（ＶＨ）ドメインは重鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在し、不変領域（ＣＨ）ドメインはカルボキシ末端に存在し、ＣＨ３はカルボキシ末端に最も近く位置することができる。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ及びＩｇＥのアイソタイプを含み得る。
前記抗体は、すべてのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）から選択され得る。前記ＩｇＧ形態の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ２サブタイプの形態であり得る。前記ＩｇＧ形態の抗体は２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、各重鎖及び軽鎖はジスルフィド結合を介して結合して２つの重鎖・軽鎖構造体（ｄｉｍｅｒ）を形成し、前記形成された２つの重鎖・軽鎖は、重鎖のＦｃ部位でジスルフィド結合を介して連結された形態を有し得る。前記ＩｇＧ形態の抗体は、両方の重鎖・軽鎖構造体に同じ抗原に対する抗原結合部位を含み、１つの抗原を標的とする単一特異性抗体、又は両方の重鎖・軽鎖構造体に異なる抗原に対する抗原結合部位を含み２つの抗原を標的とする二重特異性抗体であり得る。
本発明による抗体には、二重特異性抗体、全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（又は合成抗体）、抗体融合体（又は抗体複合体）、その断片及びそれらの組み合わせが含まれるが、これに限定されない。様々な抗体の構造が、以下の本発明で追加で開示される。
本発明において、例えば抗原結合断片、タンパク質、又は抗体などのペプチドの「変異体」とは、他のペプチド配列と比較して１つ以上のアミノ酸残基に挿入、欠失、付加及び／又は置換が生じたペプチドであり、融合ペプチドを含めることができる。例えば、抗体の一部は、前記重鎖又は軽鎖、可変領域、又はＣＤＲ配列の１つ又は複数の残基で保存（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換を含み得る。
本発明による抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して、所望の抗体を形質転換動物（例えば、遺伝子導入マウス）から産生され選択されることができる。そのような抗体は、適切なベクター及び宿主細胞を使用してクローニングされ発現したり、又は前記抗体は培養されたハイブリドーマ細胞から採取されることができる。また、前記抗体はファージディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ－ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ）に由来し得る。ファージディスプレイ技術は、繊維状（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）バクテリオファージの表面上に抗体レパートリーを提示し、これから所望の抗原に結合するファージを選別する一種の免疫選択（ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を模倣した方法である。このような技術の１つは、本発明の実施形態又はＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／１０４９４を参照することができる。
抗体又はその抗原結合断片は、単一の源（ｓｏｕｒｃｅ）ののみに由来してもよいし、又はキメラであってもよい。キメラ抗体は、２つの異なる抗体から由来される部分を含み、以下により詳細に記載される。抗体又はその抗原結合断片は、ハイブリドーマ、組換えＤＮＡ技術、又は完全な抗体の酵素的又は化学的切断によって産生することができる。本明細書における用語「抗体」は、他に言及しない限り、２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含む抗体はもちろん、それらの誘導体、変異体、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片、突然変異体及びそれらの組み合わせを含み、例えば、２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖の他に１つ又は２つのｓｃＦｖを含むことができ、それらの例は以下に記載される通りである。
本明細書に記載の「抗原結合断片」は、抗原に対する特異的結合能を有する抗体の一部又はそれを含むポリペプチドを意味することができる。例えば、抗原結合断片は、抗原（例えば、エピトープ）と相互作用して、抗体に抗原に対する特異性及び／又は親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗体の一部又はそれを含むポリペプチドであり得る。そのような断片は、全長軽鎖又は重鎖内に存在する少なくとも１つのＣＤＲを含み、いくつかの実施形態では、一本鎖、重鎖及び／又は軽鎖、又はその一部を含み得る。そのような生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ技術によって産生するか、又は例えば完全な抗体を酵素的又は化学的切断することによって産生することができる。
免疫学的に機能的な免疫グロブリンの断片には、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ドメイン抗体及び一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｃ－ｓｃＦｖなど）が含まれる。また、これに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、カメリド又はウサギを含む任意の哺乳動物に由来し得る。本明細書に開示されている１つ以上のＣＤＲなどの抗体の機能部分は、第２のタンパク質又は低分子化合物と共有結合して連結され、特定の標的に対する標的治療薬として使用することができる。
本明細書において「一本鎖抗体」は、重鎖及び軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって連結された抗原結合領域の単一のポリペプチド鎖である。例えば、前記一本鎖抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が単一鎖形態で連結されたｓｃＦｖ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、及びＦｃが単鎖形態で連結されたＦｃ－ｓｃＦｖ等からなる群から選択された１種以上であり得る。一本鎖抗体は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号を参照することができる。
本明細書において「親和性又は親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」とは、抗体又はその抗原結合断片と抗原との間の相互作用の強度であり、抗体又は抗原結合断片のＣＤＲ配列、及び／又は抗体又は抗原結合断片の物理化学的特性（親水性／疎水性、静電気の特性など）、抗原の大きさ、形状、及び／又は電荷などの抗原の特徴などによって決定することができる。このような親和度を決定する方法は当業界に公示されており、通常は解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＫＤ）として表すことができるが、これらに限定されない。
本明細書で「多重特異的抗原結合タンパク質」又は「多重特異性抗体」は、２つ以上の抗原又はエピトープを標的とするものである。
本明細書において、「二特異性」、二重特異性」抗原結合タンパク質又は抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質又は抗体である。そのような二特異性抗体は、多重特異性抗原結合タンパク質又は多重特異性抗体の一種であり、公知の様々な方法、例えばハイブリドーマの融合又はＦａｂ′断片又はｓｃＦｖ断片の連結によって産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９０，７９：３１５－３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９２，１４８：１５４７－１５５３などを参照することができる。二特異性抗原結合タンパク質又は抗体の２つの抗原結合部位が結合する２つの異なるエピトープは、同じ又は異なるタンパク質標的に位置し得る。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、重鎖Ｆｃと抗原結合断片が結合した抗体タンパク質を含むことができ、例えば、前記重鎖ＦｃはＩｇＧに含まれるものであってもよく、前記抗原結合断片は重鎖可変領域を含むｓｃＦｖ又は一本鎖抗体として、前記重鎖ＦｃのＣ末端に連結されたものであってもよい。
例えば、Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、ＩｇＧとｓｃＦｖが結合したＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重抗体であり得る。前記ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重抗体は、ＩｇＧにｓｃＦｖが１つ結合した一価二重特異性抗体であるか、又はｓｃＦｖが２つ結合した二価二重特異性抗体であってもよい。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、Ｆｃに結合したペプチド薬物を含み得る。ここで、前記ペプチド薬物は、前述のペプチド薬物と同様に定義することができる。前記ペプチド薬物は、前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドのＦｃのＮ末端又はＣ末端に結合したものであり得る。前記ペプチド薬物は、前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドのＦｃの２つの重鎖のうちの１つ以上の重鎖のＮ末端に結合したものであり得る。
前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドは免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧ）を含む抗体であり、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドはＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重抗体であり得る。前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドはｓｃＦｖを含まず、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは、Ｆｃの２つの重鎖のいずれかのＣ末端に連結された配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１からなる１つのｓｃＦｖを含むことができる。
前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドは免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧ）を含む抗体であり、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドはＩｇＧ－ｓｃＦｖ一価二重特異性抗体であり、前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドは、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二価二重特異性抗体であり得る。前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドはｓｃＦｖを含まず、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは、Ｆｃの２つの重鎖のいずれかのＣ末端に連結された配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１からなる１つのｓｃＦｖを含み、前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドは、Ｆｃの２つの重鎖の両方のＣ末端にそれぞれ連結された配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１からなる２つのｓｃＦｖを含み得る。
前記第１～第３のＦｃ含有生理活性ペプチドはＩｇＧであり、前記ＩｇＧ抗体の可変領域はヒトＶＨ３ドメインを含むものであり得る。例えば、この場合、前記第１～第３のＦｃ含有生理活性ペプチドは、いずれもＩｇＧ内にはそれぞれ同一に２つずつのＶＨ３ドメイン（可変領域の重鎖内）を有するがＩｇＧ部分以外の領域では含むＶＨ３ドメインの数が異なることがあり得る。
前記第１～第３のＦｃ含有生理活性ペプチドはＩｇＧであり、前記ＩｇＧ抗体の可変領域はヒトＶＨ３ドメインを含まないことができる。例えば、この場合、前記第１～第３のＦｃ含有生理活性ペプチドともに同じＩｇＧ内にはＶＨ３ドメインがなく、ＩｇＧ部分以外の領域に含まれるＶＨ３ドメインの数が異なるものであってもよい。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドがヒトＶＨ３ドメインを含む場合、前記ヒトＶＨ３ドメインは、前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドの重鎖可変領域に含まれ得る。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドがヒトＶＨ３ドメインを含む場合、ヒトＶＨ３ドメインを含む抗体又はその断片は、前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドに少なくとも１つ以上結合することができる。例えば、ヒトＶＨ３ドメインを含むｓｃＦｖが前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドに結合することができる。
前記第１又は第２のＦｃ含有生理活性ペプチドがヒトＶＨ３ドメインを含む場合、前記ヒトＶＨ３ドメインは前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドの重鎖可変領域に含まれ、ヒトＶＨ３ドメインを含む抗体又はその断片を前記生理活性ペプチドに少なくとも１つ以上結合させることができる。
上述したＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重抗体において、ＩｇＧ及びｓｃＦｖのうち少なくとも１つはヒトＶＨ３ドメインを含むものであり得る。ＩｇＧ及びｓｃＦｖの両方がヒトＶＨ３ドメインを含む場合、ＩｇＧのヒトＶＨ３ドメインとｓｃＦｖのヒトＶＨ３ドメインの配列は互いに同一でも異なっていてもよい。上述したＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重抗体は、１つ以上の生理活性を有し得る。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドがＩｇＧ抗体を含む場合、前記ＩｇＧ抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖のうち選択される１つ以上を含み得る。ここで、前記第１の重鎖はＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖから構成されてもよく、前記第２の重鎖はＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３から構成されてもよい。
前記第１の重鎖と第２の重鎖との二量体化確率を高めて一価二重特異性抗体の製造を容易にするために、一つの重鎖の重鎖定常領域の特定位置はホール変異（ｈｏｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）（例えば、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、又はＹ４０６Ｖ）され、他の重鎖の重鎖定常領域の特定の位置は、ノブ変異（ｋｎｏｂ ｍｕｔａｔｉｏｎ）（例えば、Ｔ３６６Ｗ）されたものであり得る。前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、抗αシヌクレインＩｇＧ抗体又は抗ＢＡＣＥ抗体を含むことができる。
前記抗αシヌクレイン抗体は、第１の重鎖又は第２の重鎖のうち少なくとも１つを含み得る。例えば、前記第１の重鎖は抗αシヌクレイン抗体の重鎖可変領域と、ヒト重鎖定常領域と、及び前記重鎖定常領域のＣ末端に結合した抗ＩＧＦ１Ｒ抗体又はその断片（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ）を含んでもよく、前記第２の重鎖は抗αシヌクレイン抗体の重鎖可変領域及びヒト重鎖定常領域を含み、上述した抗ＩＧＦ１Ｒ抗体を含まなくてもよい。
前記抗αシヌクレイン抗体は、前記第１の重鎖を２つ含むか、又は前記第２の重鎖を２つ含んでもよい。また、前記αシヌクレイン抗体は、前記第１重鎖及び前記第２重鎖をそれぞれ１つずつ含んでもよい。
前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記第１の重鎖及び前記第２の重鎖をそれぞれ１つ含み、前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記第１の重鎖を２つ含み、前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記第２の重鎖を２つ含む生理活性ペプチドを含み得る。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドの混合物は、前記抗αシヌクレイン抗体の２つの重鎖のそれぞれのＣ末端に前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体又はその断片が結合していない第１のＦｃ含有生理活性ペプチド、前記抗αシヌクレイン抗体の２つの重鎖のいずれかの重鎖のＣ末端に、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体又はその断片が結合した第２のＦｃ含有生理活性ペプチド及び前記抗αシヌクレイン抗体の２つの重鎖のそれぞれＣ末端に前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体又はその断片が結合した第３のＦｃ含有生理活性ペプチドを含むものであってもよい。
本明細書において、ｃｈ１１Ｆ１１については矛盾しない限り、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１９／１１７６８４に記載されたｃｈ１１Ｆ１１の説明は同様に適用され、ｈｕ１１Ｆ１１については矛盾しない限り、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１９／１１７６８４に記載されたｈｕ１１Ｆ１１の説明は同様に適用されることができる。ｃｈ１１Ｆ１１及びｈｕ１１Ｆ１１の配列は、前述したＰＣＴ公開公報を参照することができる。
前記生理活性ペプチドは、ｃｈ１１Ｆ１１、ｃｈ１Ｅ４、抗ＢＡＣＥ、及びｈｕ１１Ｆ１１からなる群から選択されるいずれかの抗αシヌクレイン抗体の重鎖可変領域を含む抗αシヌクレイン抗体であり、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の軽鎖可変配列と、又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０の軽鎖可変配列で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
一実施形態のＦｃ含有生理活性ペプチドの単離方法によれば、アフィニティークロマトグラフィーを用いてＦｃ含有生理活性ペプチドの混合物から目的とするＦｃ含有生理活性ペプチドを容易に単離することができる。特に、一実施形態によるＦｃ含有生理活性ペプチドの精製方法によれば、工程簡略化を達成することができ、同一又は類似の構造を有する生理活性ペプチドを高純度で精密に単離することができる。
また、一実施形態のＦｃ含有生理活性ペプチドの単離方法によれば、Ｆｃに特定の突然変異を導入してプロテインＡリガンドとの親和性を人工的に調節せずに同一又は類似の構造を有する生理活性ペプチドを高純度で精密に単離することができる。また、一実施形態のＦｃ含有生理活性ペプチドの単離方法によれば、突然変異が導入されていない野生型プロテインＡリガンド又は既存のプロテインＡリガンドを使用しながらも生理活性ペプチドを単離することができる。したがって、一実施形態の製造方法によれば、Ｆｃ領域との親和度が上昇するように突然変異が導入された高価なプロテインＡリガンドを使用せずに、Ｆｃ含有生理活性ペプチドを高純度で精密に単離することができる。
本発明の他の実施形態によれば、抗体混合物で抗体を精製する方法を提供することができる。生理活性ペプチドの精製方法に対する実施形態について説明した内容は、矛盾しない限り、後述する抗体の精製方法に対する実施形態にも適用できることはもちろんである。
本発明の一実施形態によれば、（ａ－１）抗体混合物を、プロテインＡリガンドを含む親和性マトリックスを含むカラムにロードするステップであって、前記抗体混合物は単一特異性抗体、前記単一特異性抗体の２つの重鎖定常領域のいずれかのＣ末端にヒトＶＨ３ドメインを含む１つの抗原結合断片が結合した一価二重特異性抗体及び前記単一特異性抗体の２つの重鎖定常領域のＣ末端に、前記抗原結合断片がそれぞれ１つずつ結合した二価二重特異性抗体を含むステップと、（ｂ－１）第１のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記単一特異性抗体を溶出するステップと、（ｃ－１）前記第１のｐＨ範囲より低い第２のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記一価二重特異性抗体を溶出するステップと、及び（ｄ－１）前記第２のｐＨ範囲より低い第３のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして二価二重特異性抗体を溶出するステップを含む抗体の精製方法が提供することができる。
前記単一特異性抗体の可変領域は、ヒトＶＨ３ドメインを含むものでも含まれないものでもよい。
前記抗原結合断片はｓｃＦｖであり得る。前記抗原結合断片は、配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖであり得る。
すなわち、本発明による例示的な二重特異性抗体は、重鎖組合せ（Ｈｅａｖｙ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）及び抗αシヌクレイン抗体の軽鎖を含むことができ、前記重鎖組合せは（１）抗αシヌクレイン抗体の重鎖及び（２）抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖を含むものであってもよい。言い換えれば、本発明による二重特異性抗体は、ｓｃＦｖ型の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体が、ＩｇＧ型の抗αシヌクレイン抗体のＣ末端のいずれか又は両側（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ（一価）又はｂｉｖａｌｅｎｔ（二価）でそれぞれ言う）に結合する形態であり得る。
前記第１のｐＨ範囲は３．４以上５．０以下であり、前記第２のｐＨ範囲は３．３以上４．１以下であり、前記第３のｐＨ範囲は３．０以上４．０以下であることができる。例えば、前記第１のｐＨ範囲は３．４以上４．５以下であり、前記第２のｐＨ範囲は３．３以上４．１以下であり、前記第３のｐＨ範囲は３．０以上４．０以下であることができる。
ただし、前記第１～第３のｐＨ範囲は例示的な範囲に過ぎず、当分野の通常の技術者であれば、生理活性ペプチドの種類によって異なる前記第１～第３のｐＨ範囲を、本明細書記載を参照して容易に導出することができるだろう。
特に、非対称異種二量体（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｈｅｔｅｒｏ ｄｉｍｅｒ）形態のタンパク質の場合、産生過程で発生し得る同種二量体（ｈｏｍｏ ｄｉｍｅｒ）を精製工程から除去することは非常に困難である。異種二量体と同種二量体との間には、タンパク質精製工程で一般的に使用される親和性カラム又はイオン交換カラムを用いて精製できるほどの親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）及び等電点（ｐＩ）の差が現れないためである。
異種二量体形態の抗体の単離に関して、米国特許登録公報ＵＳ８５８６７１３ Ｂ２等では、Ｆｃ配列を人為的に置換して親和度及び等電点の差を大きくする方法が試みられたが、このように人為的にアミノ酸を置換する場合、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が発生することになる問題がある。また、ＶＨ３配列が同時に存在する場合、親和性レジンを必ず２回使用しなければならず、二価二重特異性抗体を最初に除去してこそ、一価二重特異性抗体と単一特異性抗体を単離することができる。したがって、工程が複雑になり、単離に多くの時間とコストがかかる。
しかしながら、一実施形態による抗体の精製方法によれば、異種二量体と同種二量体のような等電点の差が非常に小さく（例えば、０．１以下）、一般的なアフィニティークロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーによる精製しにくいペプチドに人為的なアミノ酸置換を行わずに、８５％～９０％以上の高純度で異種二量体を精製することができる。また、一実施形態の単離方法によれば、抗体の断片だけでなく、Ｆｃ領域を含む全抗体も効果的に単離することができ、ＶＨ３ドメインの数に応じて細かく単離可能である。
特に、非対称ヘテロ二量体（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）タンパク質の製造過程で不要なホモ二量体（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）タンパク質が一緒に生成される場合、各タンパク質に含まれるＶＨ３ドメインの数の差に基づいて、非対称ヘテロ二量体タンパク質とホモ二量体タンパク質を単離精製する方法を提供することを一目的とする。
本発明で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本発明で開示される様々な要素の全ての組み合わせが本発明の範囲に属する。
さらに、以下に記載される具体的な説明によって本発明の範囲が制限されるとは言えない。
本明細書で第１、第２などの用語は様々な構成要素を説明するのに使用することができるが、前記構成要素は前記用語によって限定されるべきではない。前記用語は、ある構成要素を他の構成要素と区別する目的でのみ使用される。例えば、本発明の権利の範囲から逸脱することなく、第１の構成要素を第２の構成要素と命名することができ、同様に第２の構成要素も第１の構成要素と命名することができる。単数の表現は、文脈上明らかに別段の意味を持たない限り、複数の表現を含む。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。さらに、一般的に使用される辞書で定義されている用語などの用語は、関連技術の文脈で意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、理想的又は過度に形式的な意味で解釈されない限り、明示的にここで定義される。
「含む」又は「含有」などの用語は、明細書に記載されている特徴、数字、ステップ、動作、構成要素、又はそれらを組み合わせたものが存在することを指定するものであり、１つ又は複数の他の特徴又は数字、ステップ、動作、構成要素又はそれらを組み合わせたものの存在又は追加の可能性を予め排除しないことを理解すべきである。
「及び／又は」は、関連する構成が定義することができる１つ又は複数の組み合わせの両方を含む。
本発明で使用される用語「生理活性ペプチド」は、１つ以上の生理活性を示すペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質の一部及び融合タンパク質等を全て含む概念であり、特定分子量ないしアミノ酸の長さ、種類等によって限定されるものではない。
本発明で使用される「Ｆｃ含有生理活性ペプチド」という用語は、抗体に見られるＦｃ領域（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含む生理活性ペプチドを意味する。例えば、Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、Ｆｃ領域を含有する抗体を含む物質である。
本発明は、Ｆｃ含有生理活性ペプチドの混合物の中でＦｃ含有生理活性ペプチドを単離及び／又は精製する方法を提供することができる。
本明細書において、生理活性ペプチドとは、生物に伝達されて生体の機能を調節するペプチドを意味するものであり、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質又は受容体などの生体機能を調節するペプチドを生理活性物質と定義することができ、例えば上述したペプチドは、ＦｃのＮ末端又はＣ末端に連結された形態であり得る。
本発明の一実施形態によれば、（ａ）Ｆｃ含有生理活性ペプチドの混合物を、プロテインＡリガンドを含む親和性マトリックスを含むカラムにロードするステップであって、前記生理活性ペプチドの混合物は第１のＦｃ含有生理活性ペプチド及び第２のＦｃ含有生理活性ペプチドを含み、ここで前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドと比較してヒトＶＨ３ドメインを少なくとも１つさらに含む、ステップと、（ｂ）前記カラムに溶出液をロードし、前記生理活性ペプチドの混合物に含まれる前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドのそれぞれが含むヒトＶＨ３ドメインの数に応じて、互いに異なるｐＨで前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドを単離溶出するステップを含むＦｃ含有生理活性ペプチドの精製方法を提供することができる。
一実施形態では、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドと比較してヒトＶＨ３ドメインを少なくとも１つさらに含むか、又はヒトＶＨ３ドメインと９５％以上、９０％以上、８０％以上又は７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を少なくとも１つさらに含むものであり得る。ヒトＶＨ３ドメインとは、ＶＨ３ファミリーのヒト抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置するアミノ酸配列であって、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３～ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３７のいずれかの配列を含むことができるが、これらに限定されず、通常の技術者であれば、タンパク質に含まれるヒトＶＨ３ドメイン配列を容易に把握することができる。前記ヒトＶＨ３ドメインは主にＶＨ３ファミリーのヒト抗体に存在するが、まれにマウスなどの哺乳動物（又はキメラ）抗体のフレームワークにも見られる。例えば、本発明の実施形態で使用されるｈｕ１１Ｆ１１はヒトＶＨ３ドメインを含む抗体であり、ｃｈ１Ｅ４及び抗ＢＡＣＥ抗体はヒトＶＨ３ドメインを含まない抗体である。ただし、例外的にｃｈ１１Ｆ１１は、キメラ抗体であってもヒトＶＨ３ドメインを含む抗体である。
前記プロテインＡリガンドは全長ドメインプロテインＡリガンドであり得る。すなわち、プロテインＡリガンドは、全長ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメイン）の全てを含むものであり得る。しかしながら、実施形態はこれに限定されるわけではなく、前記プロテインＡリガンドは、Ｅドメイン及びＤドメインのうち選択される１つ又は複数のドメインを含むことができる。例えば、前記プロテインＡリガンドは、Ｅドメイン及びＤドメインを含むことができる。
前記親和性マトリックスにおいて、プロテインＡリガンドを支持する支持体は、球（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）形のようなビード（ｂｅａｄ）形態を有する粒子であり得る。前記親和性マトリックスにおいて、支持体の平均粒子サイズは、例えば約９０μｍ未満であってもよく、例えば約８０μｍ以下又は７５μｍ以下であってもよい。さらに、前記親和性マトリックスにおいて、前記支持体の平均粒子サイズは、例えば、約１μｍ以上又は５μｍ以上であってもよい。前記親和性マトリックスにおいて、前記支持体のサイズが上記の範囲を満たす場合、生理活性ペプチドの単離能はさらに優れている可能性がある。
前記ステップ（ｂ）は、（ｂ１）第１のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップと、（ｂ２）前記第１のｐＨ範囲より低い第２のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップを含むことができる。前記第１のｐＨ範囲を有する溶出液及び前記第２のｐＨ範囲を有する溶出液は、それぞれ別々に又は順次カラムにロードされるか、又は前記溶出液がカラムに連続的にロードされながら、ロード時間に応じて第１のｐＨ範囲から第２のｐＨ範囲に濃度勾配を変えることができる。
前記生理活性ペプチドの混合物は、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドと比較してヒトＶＨ３ドメインを少なくとも１つさらに含む第３のＦｃ含有生理活性ペプチドをさらに含むことができる。
本発明の精製方法によれば、それぞれＶＨ３ドメインの数が異なる第１のＦｃ含有生理活性ペプチド、第２のＦｃ含有生理活性ペプチド及び第３のＦｃ含有生理活性ペプチドを互いに単離して精製することができ、これらいずれを精製目的にしても高純度で精製が可能な利点がある。
さらに、本発明は精製対象物質の構成においてＦｃを排除するものではなく、ＦｃとプロテインＡとの間の結合も精製工程において考慮されている。Ｆｃはそれ自体としてプロテインＡに対する親和性を有するため、ＦｃとプロテインＡとの親和性を利用した精製方法では、Ｆｃ以外の構成要素の親和性を排除しようとし、逆の場合にはＦｃの親和性を排除しようとするのが一般的です。一方、本発明では、重鎖ＦｃとＶＨ３ドメインの両方を構成要素とするＦｃ含有生理活性ペプチドをＶＨ３ドメインの数に応じて精製することができる方法を提供しようとした。
前記生理活性ペプチドの混合物は、前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドがｎ個（ｎは０以上の整数）のヒトＶＨ３ドメインを含み、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドがｎ＋１個～ｎ＋９個のヒトＶＨ３ドメインを含み、前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドがｎ＋２個か～ｎ＋１０個のヒトＶＨ３ドメインを含んでもよく、例えば、前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドがｎ個（ｎは０以上の整数）のヒトＶＨ３ドメインを含み、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドはｎ＋１個のヒトＶＨ３ドメインを含み、前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドがｎ＋２個のヒトＶＨ３ドメインを含んでもよい。
ｎは、例えば、０以上１０以下、０以上８以下、０以上６以下、０以上５以下、０以上３以下、１以上１０以下、１以上８以下、１以上６以下、１以上５以下、１以上３以下、２以上１０以下、２以上８以下、２以上６以下、２以上５以下であってもよい。ｎは、例えば０、１、２、又は３であり得る。
前記ステップ（ｂ）は、（ｂ１）第１のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップと、（ｂ２）前記第１のｐＨ範囲より低い第２のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップと、（ｂ３）前記第２のｐＨ範囲より低い第３のｐＨ範囲を有する溶出液を用いて前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドを溶出するステップをさらに含むことができる。ここで、前記ステップ（ｂ１）～（ｂ３）は連続的に行われることができる（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）。すなわち、前記第１～第３のｐＨ範囲は、それぞれのｐＨ範囲が断続的なものではなく、第１のｐＨ範囲の開始値と第３のｐＨ範囲の末端値との間の連続的なｐＨ範囲に含まれ、最初に第１のｐＨ範囲を有する溶出液をカラムにロードし、連続的にロードされる溶出液のｐＨを徐々に下げることにより、溶出液のｐＨが次第に第２のｐＨ範囲及び第３のｐＨ範囲に移行することにより、前記ステップ（ｂ１）～（ｂ３）が行われることができる。また、精製対象の生理活性ペプチドの種類によって溶出されるｐＨ範囲が異なってもよい。
又は、前記ステップ（ｂ１）～（ｂ３）は段階的に行われることができる（ｓｔｅｐ ｇｒａｄｉｅｎｔ）。
前記Ｆｃは、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）タンパク質Ａとの結合力に影響を与える突然変異が導入されていないものであり得る。前記突然変異は、Ｆｃのポリペプチド配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸残基に挿入、欠失、付加及び／又は置換が生じたポリペプチドを意味する。すなわち、一実施形態のＦｃは、プロテインＡとの結合力を阻害する突然変異又はプロテインＡとの結合力を上昇させる突然変異が導入されていないものであり得る。
前記第１、第２及び／又は第３のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記Ｆｃに結合したペプチド薬物を含むことができる。ここで、前記「ペプチド薬物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｒｕｇ）」とは、前記生理活性ペプチドと同一又は異なる生理活性を有しながら、前記生理活性ペプチドに結合した独立のペプチドを意味する。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、前記ＦｃのＮ末端又はＣ末端に前記ペプチド薬物が結合したものであり得る。例えば、前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、前記Ｆｃの２つの重鎖が有する２つのＮ末端及び２つのＣ末端から選択される１つ又は複数に前記ペプチド薬物が結合したものであり得る。
本明細書で使用される「結合」という用語は、２つの対象が物理的又は化学的に直接結合したもの、及びリンカーを介して結合又は連結されたものの両方を含む意味で定義される。一実施形態では、Ｆｃとペプチド薬物がリンカーを介して連結される場合、前記リンカーは例えばペプチドであり得るが、当技術分野でペプチドを連結するために使用される通常の材料であれば特に限定されないことは言うまでもない。
前記ペプチド薬物は、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択される少なくとも１つであり得る。例えば、前記ペプチド薬物は、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、ＧＬＰ－１のようなグルカコン様ペプチド類、Ｇプロテイン関連受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合タンパク質類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、アレルギー抑制因子、細胞の壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホ毒素、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α－１アンチトリプシン、アルブミン、α－ラクトアルブミン、アポリポタンパク質－Ｅ、エリスロポエチン、高グリコシル化エリスロポエチン、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、クラムビン、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、及びＸＩＩＩ、プラズミノゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレトキナーゼ、ヒルジン、プロテインＣ、Ｃ反応性タンパク、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、せクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗薬、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片類からなる群から選択される少なくとも１つであることができる。
前記グルカゴン様ペプチドは、エクセナチド、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）、タスポグルチド（Ｔａｓｐｏｇｌｕｔｉｄｅ）、アルビグルチド（Ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ）、リキシセナチド（Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅ）、及びＧＬＰ－１から選択される少なくとも１つ、例えばＧＬＰ－１であることができる。
前記第１又は第２のＦｃ含有生理活性ペプチドがＶＨ３ドメインを含む場合、前記第１及び第２のＦｃ含有生理活性ペプチドはそれぞれ独立してＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の軽鎖可変配列と、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０の軽鎖可変配列のいずれかのＶＨドメイン含有可変領域配列を含むことができ、例えば、前記重鎖可変配列及び軽鎖可変配列はｓｃＦｖの重鎖可変配列及び軽鎖可変配列であり得る。
前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７の重鎖可変配列及び ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の軽鎖可変配列と、又は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０の軽鎖可変配列のいずれかのＶＨドメイン含有可変領域配列を含むことができ、例えば、前記重鎖可変配列及び軽鎖可変配列はｓｃＦｖの重鎖可変配列及び軽鎖可変配列であり得る。
ただし、ＶＨ３ドメインは重鎖可変配列内に含まれるものであるため、上述の配列から選択される重鎖可変配列及び他の軽鎖可変配列からなるｓｃＦｖ、又は上述の配列から選択される重鎖可変配列のみからなる短鎖抗体も上記Ｆｃ含有生理活性ペプチドに含めることができる。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧ）を含む抗体であり得る。
本明細書において「抗体」は、任意のアイソタイプの完全な免疫グロブリン、標的抗原への結合のための完全な抗体と競合することができる抗原結合断片、又はそれらの組み合わせを意味することができる。例えば、マウス、キメラ、ヒト化、完全ヒト抗体、それらの抗原結合断片、又はそれらの組み合わせを含むことができる。抗体はそれ自体で抗原結合タンパク質の一種であり得る。抗体は一般に少なくとも２つの全長重鎖と２つの全長軽鎖を含むが、場合によって抗体は重鎖のみを含むこともある。前記抗体は、１つの標的に特異的に結合する単一特異性抗体、及び複数の標的に特異的に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体及び三重特異性抗体）を含み得る。
前記抗体はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体も含み、前記モノクローナル抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であるＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する単離された抗体であり得る。前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４型であるＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する単離された抗体であり得る。
本明細書における「軽鎖」は、抗原又はエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長の軽鎖及びその断片を含み得る。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ、及び不変領域ドメインＣＬを含み得る。軽鎖の可変領域ドメインは、軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在してもよい。軽鎖の種類には、カッパ及びラムダ鎖が含まれ得る。
本明細書において、「相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ，ＣＭＰ）」とは、抗体の可変領域のうち、抗原との結合特異性を付与する部位を意味することができる。
本明細書における「重鎖」は、抗原又はエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長重鎖及びその断片を含み得る。全長重鎖は、可変領域ドメイン及び３つの不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含み得る。可変領域（ＶＨ）ドメインは重鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在し、不変領域（ＣＨ）ドメインはカルボキシ末端に存在し、ＣＨ３はカルボキシ末端に最も近く位置することができる。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ及びＩｇＥのアイソタイプを含み得る。
前記抗体は、すべてのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）から選択され得る。前記ＩｇＧ形態の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ２サブタイプの形態であり得る。前記ＩｇＧ形態の抗体は２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、各重鎖及び軽鎖はジスルフィド結合を介して結合して２つの重鎖・軽鎖構造体（ｄｉｍｅｒ）を形成し、前記形成された２つの重鎖・軽鎖は、重鎖のＦｃ部位でジスルフィド結合を介して連結された形態を有し得る。前記ＩｇＧ形態の抗体は、両方の重鎖・軽鎖構造体に同じ抗原に対する抗原結合部位を含み、１つの抗原を標的とする単一特異性抗体、又は両方の重鎖・軽鎖構造体に異なる抗原に対する抗原結合部位を含み２つの抗原を標的とする二重特異性抗体であり得る。
本発明による抗体には、二重特異性抗体、全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（又は合成抗体）、抗体融合体（又は抗体複合体）、その断片及びそれらの組み合わせが含まれるが、これに限定されない。様々な抗体の構造が、以下の本発明で追加で開示される。
本発明において、例えば抗原結合断片、タンパク質、又は抗体などのペプチドの「変異体」とは、他のペプチド配列と比較して１つ以上のアミノ酸残基に挿入、欠失、付加及び／又は置換が生じたペプチドであり、融合ペプチドを含めることができる。例えば、抗体の一部は、前記重鎖又は軽鎖、可変領域、又はＣＤＲ配列の１つ又は複数の残基で保存（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換を含み得る。
本発明による抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して、所望の抗体を形質転換動物（例えば、遺伝子導入マウス）から産生され選択されることができる。そのような抗体は、適切なベクター及び宿主細胞を使用してクローニングされ発現したり、又は前記抗体は培養されたハイブリドーマ細胞から採取されることができる。また、前記抗体はファージディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ－ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ）に由来し得る。ファージディスプレイ技術は、繊維状（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）バクテリオファージの表面上に抗体レパートリーを提示し、これから所望の抗原に結合するファージを選別する一種の免疫選択（ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を模倣した方法である。このような技術の１つは、本発明の実施形態又はＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／１０４９４を参照することができる。
抗体又はその抗原結合断片は、単一の源（ｓｏｕｒｃｅ）ののみに由来してもよいし、又はキメラであってもよい。キメラ抗体は、２つの異なる抗体から由来される部分を含み、以下により詳細に記載される。抗体又はその抗原結合断片は、ハイブリドーマ、組換えＤＮＡ技術、又は完全な抗体の酵素的又は化学的切断によって産生することができる。本明細書における用語「抗体」は、他に言及しない限り、２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含む抗体はもちろん、それらの誘導体、変異体、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片、突然変異体及びそれらの組み合わせを含み、例えば、２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖の他に１つ又は２つのｓｃＦｖを含むことができ、それらの例は以下に記載される通りである。
本明細書に記載の「抗原結合断片」は、抗原に対する特異的結合能を有する抗体の一部又はそれを含むポリペプチドを意味することができる。例えば、抗原結合断片は、抗原（例えば、エピトープ）と相互作用して、抗体に抗原に対する特異性及び／又は親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗体の一部又はそれを含むポリペプチドであり得る。そのような断片は、全長軽鎖又は重鎖内に存在する少なくとも１つのＣＤＲを含み、いくつかの実施形態では、一本鎖、重鎖及び／又は軽鎖、又はその一部を含み得る。そのような生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ技術によって産生するか、又は例えば完全な抗体を酵素的又は化学的切断することによって産生することができる。
免疫学的に機能的な免疫グロブリンの断片には、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ドメイン抗体及び一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｃ－ｓｃＦｖなど）が含まれる。また、これに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、カメリド又はウサギを含む任意の哺乳動物に由来し得る。本明細書に開示されている１つ以上のＣＤＲなどの抗体の機能部分は、第２のタンパク質又は低分子化合物と共有結合して連結され、特定の標的に対する標的治療薬として使用することができる。
本明細書において「一本鎖抗体」は、重鎖及び軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって連結された抗原結合領域の単一のポリペプチド鎖である。例えば、前記一本鎖抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が単一鎖形態で連結されたｓｃＦｖ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、及びＦｃが単鎖形態で連結されたＦｃ－ｓｃＦｖ等からなる群から選択された１種以上であり得る。一本鎖抗体は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号を参照することができる。
本明細書において「親和性又は親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」とは、抗体又はその抗原結合断片と抗原との間の相互作用の強度であり、抗体又は抗原結合断片のＣＤＲ配列、及び／又は抗体又は抗原結合断片の物理化学的特性（親水性／疎水性、静電気の特性など）、抗原の大きさ、形状、及び／又は電荷などの抗原の特徴などによって決定することができる。このような親和度を決定する方法は当業界に公示されており、通常は解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＫＤ）として表すことができるが、これらに限定されない。
本明細書で「多重特異的抗原結合タンパク質」又は「多重特異性抗体」は、２つ以上の抗原又はエピトープを標的とするものである。
本明細書において、「二特異性」、二重特異性」抗原結合タンパク質又は抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質又は抗体である。そのような二特異性抗体は、多重特異性抗原結合タンパク質又は多重特異性抗体の一種であり、公知の様々な方法、例えばハイブリドーマの融合又はＦａｂ′断片又はｓｃＦｖ断片の連結によって産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９０，７９：３１５－３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９２，１４８：１５４７－１５５３などを参照することができる。二特異性抗原結合タンパク質又は抗体の２つの抗原結合部位が結合する２つの異なるエピトープは、同じ又は異なるタンパク質標的に位置し得る。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、重鎖Ｆｃと抗原結合断片が結合した抗体タンパク質を含むことができ、例えば、前記重鎖ＦｃはＩｇＧに含まれるものであってもよく、前記抗原結合断片は重鎖可変領域を含むｓｃＦｖ又は一本鎖抗体として、前記重鎖ＦｃのＣ末端に連結されたものであってもよい。
例えば、Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、ＩｇＧとｓｃＦｖが結合したＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重抗体であり得る。前記ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重抗体は、ＩｇＧにｓｃＦｖが１つ結合した一価二重特異性抗体であるか、又はｓｃＦｖが２つ結合した二価二重特異性抗体であってもよい。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、Ｆｃに結合したペプチド薬物を含み得る。ここで、前記ペプチド薬物は、前述のペプチド薬物と同様に定義することができる。前記ペプチド薬物は、前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドのＦｃのＮ末端又はＣ末端に結合したものであり得る。前記ペプチド薬物は、前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドのＦｃの２つの重鎖のうちの１つ以上の重鎖のＮ末端に結合したものであり得る。
前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドは免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧ）を含む抗体であり、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドはＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重抗体であり得る。前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドはｓｃＦｖを含まず、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは、Ｆｃの２つの重鎖のいずれかのＣ末端に連結された配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１からなる１つのｓｃＦｖを含むことができる。
前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドは免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧ）を含む抗体であり、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドはＩｇＧ－ｓｃＦｖ一価二重特異性抗体であり、前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドは、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二価二重特異性抗体であり得る。前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドはｓｃＦｖを含まず、前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは、Ｆｃの２つの重鎖のいずれかのＣ末端に連結された配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１からなる１つのｓｃＦｖを含み、前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドは、Ｆｃの２つの重鎖の両方のＣ末端にそれぞれ連結された配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１からなる２つのｓｃＦｖを含み得る。
前記第１～第３のＦｃ含有生理活性ペプチドはＩｇＧであり、前記ＩｇＧ抗体の可変領域はヒトＶＨ３ドメインを含むものであり得る。例えば、この場合、前記第１～第３のＦｃ含有生理活性ペプチドは、いずれもＩｇＧ内にはそれぞれ同一に２つずつのＶＨ３ドメイン（可変領域の重鎖内）を有するがＩｇＧ部分以外の領域では含むＶＨ３ドメインの数が異なることがあり得る。
前記第１～第３のＦｃ含有生理活性ペプチドはＩｇＧであり、前記ＩｇＧ抗体の可変領域はヒトＶＨ３ドメインを含まないことができる。例えば、この場合、前記第１～第３のＦｃ含有生理活性ペプチドともに同じＩｇＧ内にはＶＨ３ドメインがなく、ＩｇＧ部分以外の領域に含まれるＶＨ３ドメインの数が異なるものであってもよい。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドがヒトＶＨ３ドメインを含む場合、前記ヒトＶＨ３ドメインは、前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドの重鎖可変領域に含まれ得る。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドがヒトＶＨ３ドメインを含む場合、ヒトＶＨ３ドメインを含む抗体又はその断片は、前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドに少なくとも１つ以上結合することができる。例えば、ヒトＶＨ３ドメインを含むｓｃＦｖが前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドに結合することができる。
前記第１又は第２のＦｃ含有生理活性ペプチドがヒトＶＨ３ドメインを含む場合、前記ヒトＶＨ３ドメインは前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドの重鎖可変領域に含まれ、ヒトＶＨ３ドメインを含む抗体又はその断片を前記生理活性ペプチドに少なくとも１つ以上結合させることができる。
上述したＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重抗体において、ＩｇＧ及びｓｃＦｖのうち少なくとも１つはヒトＶＨ３ドメインを含むものであり得る。ＩｇＧ及びｓｃＦｖの両方がヒトＶＨ３ドメインを含む場合、ＩｇＧのヒトＶＨ３ドメインとｓｃＦｖのヒトＶＨ３ドメインの配列は互いに同一でも異なっていてもよい。上述したＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重抗体は、１つ以上の生理活性を有し得る。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドがＩｇＧ抗体を含む場合、前記ＩｇＧ抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖のうち選択される１つ以上を含み得る。ここで、前記第１の重鎖はＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖから構成されてもよく、前記第２の重鎖はＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３から構成されてもよい。
前記第１の重鎖と第２の重鎖との二量体化確率を高めて一価二重特異性抗体の製造を容易にするために、一つの重鎖の重鎖定常領域の特定位置はホール変異（ｈｏｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）（例えば、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、又はＹ４０６Ｖ）され、他の重鎖の重鎖定常領域の特定の位置は、ノブ変異（ｋｎｏｂ ｍｕｔａｔｉｏｎ）（例えば、Ｔ３６６Ｗ）されたものであり得る。前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドは、抗αシヌクレインＩｇＧ抗体又は抗ＢＡＣＥ抗体を含むことができる。
前記抗αシヌクレイン抗体は、第１の重鎖又は第２の重鎖のうち少なくとも１つを含み得る。例えば、前記第１の重鎖は抗αシヌクレイン抗体の重鎖可変領域と、ヒト重鎖定常領域と、及び前記重鎖定常領域のＣ末端に結合した抗ＩＧＦ１Ｒ抗体又はその断片（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ）を含んでもよく、前記第２の重鎖は抗αシヌクレイン抗体の重鎖可変領域及びヒト重鎖定常領域を含み、上述した抗ＩＧＦ１Ｒ抗体を含まなくてもよい。
前記抗αシヌクレイン抗体は、前記第１の重鎖を２つ含むか、又は前記第２の重鎖を２つ含んでもよい。また、前記αシヌクレイン抗体は、前記第１重鎖及び前記第２重鎖をそれぞれ１つずつ含んでもよい。
前記第２のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記第１の重鎖及び前記第２の重鎖をそれぞれ１つ含み、前記第３のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記第１の重鎖を２つ含み、前記第１のＦｃ含有生理活性ペプチドは、前記第２の重鎖を２つ含む生理活性ペプチドを含み得る。
前記Ｆｃ含有生理活性ペプチドの混合物は、前記抗αシヌクレイン抗体の２つの重鎖のそれぞれのＣ末端に前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体又はその断片が結合していない第１のＦｃ含有生理活性ペプチド、前記抗αシヌクレイン抗体の２つの重鎖のいずれかの重鎖のＣ末端に、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体又はその断片が結合した第２のＦｃ含有生理活性ペプチド及び前記抗αシヌクレイン抗体の２つの重鎖のそれぞれＣ末端に前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体又はその断片が結合した第３のＦｃ含有生理活性ペプチドを含むものであってもよい。
本明細書において、ｃｈ１１Ｆ１１については矛盾しない限り、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１９／１１７６８４に記載されたｃｈ１１Ｆ１１の説明は同様に適用され、ｈｕ１１Ｆ１１については矛盾しない限り、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１９／１１７６８４に記載されたｈｕ１１Ｆ１１の説明は同様に適用されることができる。ｃｈ１１Ｆ１１及びｈｕ１１Ｆ１１の配列は、前述したＰＣＴ公開公報を参照することができる。
前記生理活性ペプチドは、ｃｈ１１Ｆ１１、ｃｈ１Ｅ４、抗ＢＡＣＥ、及びｈｕ１１Ｆ１１からなる群から選択されるいずれかの抗αシヌクレイン抗体の重鎖可変領域を含む抗αシヌクレイン抗体であり、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６の軽鎖可変配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８の軽鎖可変配列と、又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９の重鎖可変配列及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０の軽鎖可変配列で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
一実施形態のＦｃ含有生理活性ペプチドの単離方法によれば、アフィニティークロマトグラフィーを用いてＦｃ含有生理活性ペプチドの混合物から目的とするＦｃ含有生理活性ペプチドを容易に単離することができる。特に、一実施形態によるＦｃ含有生理活性ペプチドの精製方法によれば、工程簡略化を達成することができ、同一又は類似の構造を有する生理活性ペプチドを高純度で精密に単離することができる。
また、一実施形態のＦｃ含有生理活性ペプチドの単離方法によれば、Ｆｃに特定の突然変異を導入してプロテインＡリガンドとの親和性を人工的に調節せずに同一又は類似の構造を有する生理活性ペプチドを高純度で精密に単離することができる。また、一実施形態のＦｃ含有生理活性ペプチドの単離方法によれば、突然変異が導入されていない野生型プロテインＡリガンド又は既存のプロテインＡリガンドを使用しながらも生理活性ペプチドを単離することができる。したがって、一実施形態の製造方法によれば、Ｆｃ領域との親和度が上昇するように突然変異が導入された高価なプロテインＡリガンドを使用せずに、Ｆｃ含有生理活性ペプチドを高純度で精密に単離することができる。
本発明の他の実施形態によれば、抗体混合物で抗体を精製する方法を提供することができる。生理活性ペプチドの精製方法に対する実施形態について説明した内容は、矛盾しない限り、後述する抗体の精製方法に対する実施形態にも適用できることはもちろんである。
本発明の一実施形態によれば、（ａ－１）抗体混合物を、プロテインＡリガンドを含む親和性マトリックスを含むカラムにロードするステップであって、前記抗体混合物は単一特異性抗体、前記単一特異性抗体の２つの重鎖定常領域のいずれかのＣ末端にヒトＶＨ３ドメインを含む１つの抗原結合断片が結合した一価二重特異性抗体及び前記単一特異性抗体の２つの重鎖定常領域のＣ末端に、前記抗原結合断片がそれぞれ１つずつ結合した二価二重特異性抗体を含むステップと、（ｂ－１）第１のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記単一特異性抗体を溶出するステップと、（ｃ－１）前記第１のｐＨ範囲より低い第２のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして前記一価二重特異性抗体を溶出するステップと、及び（ｄ－１）前記第２のｐＨ範囲より低い第３のｐＨ範囲を有する溶出液を前記カラムにロードして二価二重特異性抗体を溶出するステップを含む抗体の精製方法が提供することができる。
前記単一特異性抗体の可変領域は、ヒトＶＨ３ドメインを含むものでも含まれないものでもよい。
前記抗原結合断片はｓｃＦｖであり得る。前記抗原結合断片は、配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖであり得る。
すなわち、本発明による例示的な二重特異性抗体は、重鎖組合せ（Ｈｅａｖｙ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）及び抗αシヌクレイン抗体の軽鎖を含むことができ、前記重鎖組合せは（１）抗αシヌクレイン抗体の重鎖及び（２）抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖を含むものであってもよい。言い換えれば、本発明による二重特異性抗体は、ｓｃＦｖ型の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体が、ＩｇＧ型の抗αシヌクレイン抗体のＣ末端のいずれか又は両側（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ（一価）又はｂｉｖａｌｅｎｔ（二価）でそれぞれ言う）に結合する形態であり得る。
前記第１のｐＨ範囲は３．４以上５．０以下であり、前記第２のｐＨ範囲は３．３以上４．１以下であり、前記第３のｐＨ範囲は３．０以上４．０以下であることができる。例えば、前記第１のｐＨ範囲は３．４以上４．５以下であり、前記第２のｐＨ範囲は３．３以上４．１以下であり、前記第３のｐＨ範囲は３．０以上４．０以下であることができる。
ただし、前記第１～第３のｐＨ範囲は例示的な範囲に過ぎず、当分野の通常の技術者であれば、生理活性ペプチドの種類によって異なる前記第１～第３のｐＨ範囲を、本明細書記載を参照して容易に導出することができるだろう。
特に、非対称異種二量体（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｈｅｔｅｒｏ ｄｉｍｅｒ）形態のタンパク質の場合、産生過程で発生し得る同種二量体（ｈｏｍｏ ｄｉｍｅｒ）を精製工程から除去することは非常に困難である。異種二量体と同種二量体との間には、タンパク質精製工程で一般的に使用される親和性カラム又はイオン交換カラムを用いて精製できるほどの親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）及び等電点（ｐＩ）の差が現れないためである。
異種二量体形態の抗体の単離に関して、米国特許登録公報ＵＳ８５８６７１３ Ｂ２等では、Ｆｃ配列を人為的に置換して親和度及び等電点の差を大きくする方法が試みられたが、このように人為的にアミノ酸を置換する場合、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が発生することになる問題がある。また、ＶＨ３配列が同時に存在する場合、親和性レジンを必ず２回使用しなければならず、二価二重特異性抗体を最初に除去してこそ、一価二重特異性抗体と単一特異性抗体を単離することができる。したがって、工程が複雑になり、単離に多くの時間とコストがかかる。
しかしながら、一実施形態による抗体の精製方法によれば、異種二量体と同種二量体のような等電点の差が非常に小さく（例えば、０．１以下）、一般的なアフィニティークロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーによる精製しにくいペプチドに人為的なアミノ酸置換を行わずに、８５％～９０％以上の高純度で異種二量体を精製することができる。また、一実施形態の単離方法によれば、抗体の断片だけでなく、Ｆｃ領域を含む全抗体も効果的に単離することができ、ＶＨ３ドメインの数に応じて細かく単離可能である。
【発明の効果】
【0004】
一実施形態によるＦｃ含有生理活性ペプチド又は抗体の精製方法は、Ｆｃ含有生理活性ペプチド又は抗体混合物に含まれるペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による全長ドメインプロテインＡリガンドの結合力の差を利用してペプチド又は抗体を高純度で精製することができる。さらに、一実施形態によるＦｃ含有生理活性ペプチド又は抗体の精製方法は、ＦｃとプロテインＡリガンドとの結合力を調節するためにＦｃ又はプロテインＡリガンドに別途の突然変異を導入する必要がないため、工程コストの削減及び工程簡略化を達成しながらも、高純度でタンパク質を精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【0005】
図１は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＭａｂＳｅｌｅｔ Ｓｕｒｅレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図２は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図３は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、プロテインＡ ＦＦレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図４は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図５は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａレジンを適用した精製結果をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によって確認したものである。
図６は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａレジンを適用した精製結果をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で確認したものである。
図７は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、プロテインＡ ＨＰレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図８は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、プロテインＡ ＨＰレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣによって確認したものである。
図９は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、プロテインＡ ＨＰレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図１０は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図１１は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図１２は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図１３は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＡｂＳｏｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図１４は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＡｂＳｏｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図１５は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＡｂＳｏｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図１６は、トランジェント（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）法で生産された培養液（Ｈａｒｖｅｓｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌｕｉｄ）と当該培養液をプロテインＡで精製した試料をそれぞれＰＯＲＯＳ Ａ ２０μｍ分析カラムを用いて分析したプロファイルを示す。ピーク１、ピーク２、ピーク３は、それぞれ精製された単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体をＰＯＲＯＳ Ａ ２０μｍ分析カラムにロードして各物質の保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を確認した。
図１７は、ｈｕ１１Ｆ１１及びｈｕ１１Ｆ１１－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図１８は、ｈｕｌｌＦｌｌ及びｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図１９は、ｈｕ１１Ｆ１１及びｈｕ１１Ｆ１１－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図２０は、ｃｈ１Ｅ４及びｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対してＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図２１は、抗ＢＡＣＥ及び抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図２２は、ｃｈ１Ｅ４及びｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図２３は、抗ＢＡＣＥ及び抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図２４は、ｃｈ１Ｅ４及びｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図２５は、抗ＢＡＣＥ及び抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図２６は、Ｆｃ及びＦｃ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図２７は、Ｆｃ及びＦｃ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図２７は、Ｆｃ及びＦｃ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図２９は、ＧＬＰ－１－Ｆｃ及びＧＬＰ－１－Ｆｃ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図３０は、ＧＬＰ－１－Ｆｃ及びＧＬＰ－１－Ｆｃ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図３１は、抗ＢＡＣＥ、抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６、ｈｕｌｌＦｌｌ、及びｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６を含む試料に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図３２は、抗ＢＡＣＥ、抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６、ｈｕｌｌＦｌｌ、及びｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６を含む試料に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図３３は、抗ＢＡＣＥ、抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６、ｈｕｌｌＦｌｌ、及びｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６を含む試料に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図３４は、抗ＢＡＣＥ、抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６、ｈｕｌｌＦｌｌ、及びｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６を含む試料に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）で確認したものである。
図３５は、ｃｈ１Ｅ４、ｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６、ｈｕｌｌＦｌｌ及びｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６を含む試料に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図２は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図３は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、プロテインＡ ＦＦレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図４は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図５は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａレジンを適用した精製結果をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によって確認したものである。
図６は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａレジンを適用した精製結果をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で確認したものである。
図７は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、プロテインＡ ＨＰレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図８は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、プロテインＡ ＨＰレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣによって確認したものである。
図９は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、プロテインＡ ＨＰレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図１０は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図１１は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図１２は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図１３は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＡｂＳｏｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図１４は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＡｂＳｏｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図１５は、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＡｂＳｏｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図１６は、トランジェント（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）法で生産された培養液（Ｈａｒｖｅｓｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌｕｉｄ）と当該培養液をプロテインＡで精製した試料をそれぞれＰＯＲＯＳ Ａ ２０μｍ分析カラムを用いて分析したプロファイルを示す。ピーク１、ピーク２、ピーク３は、それぞれ精製された単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体をＰＯＲＯＳ Ａ ２０μｍ分析カラムにロードして各物質の保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を確認した。
図１７は、ｈｕ１１Ｆ１１及びｈｕ１１Ｆ１１－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図１８は、ｈｕｌｌＦｌｌ及びｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図１９は、ｈｕ１１Ｆ１１及びｈｕ１１Ｆ１１－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図２０は、ｃｈ１Ｅ４及びｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対してＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図２１は、抗ＢＡＣＥ及び抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図２２は、ｃｈ１Ｅ４及びｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図２３は、抗ＢＡＣＥ及び抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図２４は、ｃｈ１Ｅ４及びｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図２５は、抗ＢＡＣＥ及び抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図２６は、Ｆｃ及びＦｃ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図２７は、Ｆｃ及びＦｃ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図２７は、Ｆｃ及びＦｃ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図２９は、ＧＬＰ－１－Ｆｃ及びＧＬＰ－１－Ｆｃ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図３０は、ＧＬＰ－１－Ｆｃ及びＧＬＰ－１－Ｆｃ－Ｆ０６を含む生理活性ペプチド混合物に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図３１は、抗ＢＡＣＥ、抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６、ｈｕｌｌＦｌｌ、及びｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６を含む試料に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
図３２は、抗ＢＡＣＥ、抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６、ｈｕｌｌＦｌｌ、及びｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６を含む試料に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＥ－ＨＰＬＣで確認したものである。
図３３は、抗ＢＡＣＥ、抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６、ｈｕｌｌＦｌｌ、及びｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６を含む試料に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図３４は、抗ＢＡＣＥ、抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６、ｈｕｌｌＦｌｌ、及びｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６を含む試料に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用した精製結果を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）で確認したものである。
図３５は、ｃｈ１Ｅ４、ｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６、ｈｕｌｌＦｌｌ及びｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６を含む試料に対して、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンを適用したアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
【発明の実施のための形態】
【0006】
以下から、下記の実施形態を参照して本発明の利点及び特徴、ならびにそれらを達成する方法を詳細に説明する。しかしながら、本発明は以下に開示される実施形態に限定されるものではなく、互いに異なる様々な形態で実施することができる。ただ、本実施形態は、本発明の開示が完全になるようにし、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は請求項によって定義されるだけである。
実施形態１：一価二重特異性抗体の調製
（１）一価二重特異性抗体発現ベクターの作製
一価二重特異性抗体（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）発現ベクターを作製するために、ｐｃＤＮＡ３．４（ｕｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターのマルチクローニングサイト（Ｍｕｌｔｉ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ、ＭＣＳ）にシグナル配列を含む抗体のヌクレオチド配列を挿入した。使用した発現ベクターはモノシストロニックベクターであり、重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターをそれぞれ作製した。
重鎖発現ベクターは、第１の重鎖配列を有する重鎖発現ベクター１と第２の重鎖配列を有する重鎖発現ベクター２を作製した。
重鎖発現ベクター１は、抗αシヌクレイン（抗α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）抗体であるｃｈ１１Ｆ１１（国際公開番号ＷＯ２０１９／１１７６８４の配列リスト参照）、ｃｈ１Ｅ４（重鎖配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８及び軽鎖配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９参照）、又はｈｕｌｌＦｌｌ（国際公開番号ＷＯ２０１９／１１７６８４の配列リスト参照）、又は抗ＢＡＣＥ（国際公開番号ＷＯ２０１９／０９４６０８のｈｕ２Ｈ８ｖ２９の配列参照）、抗体の重鎖可変領域及びヒト重鎖定常領域が連結された免疫グロブリンのＣ末端に抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ（１５６４，ＦＯ６，ＶＨ５，ＶＨ５，ＶＨ９，ＶＨ１６，表２参照）がリンカーで連結された形態であり、重鎖定常領域の特定位置に配列置換（ｈｏｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ：Ｔ３６６Ｓ，Ｌ３６８Ａ，Ｙ４０６Ｖ）がされている。
重鎖発現ベクター２は、抗αシヌクレイン抗体又は抗ＢＡＣＥ抗体をコードする重鎖可変領域及びヒト重鎖定常領域のみ連結された形態であり、重鎖定常領域の特定位置に配列置換（ｋｎｏｂ ｍｕｔａｔｉｏｎ：Ｔ３６６Ｗ）となっている。
軽鎖発現ベクターに挿入された軽鎖配列の場合、抗αシヌクレイン抗体又は抗ＢＡＣＥ抗体をコードする軽鎖可変領域及びヒト軽鎖定常領域が連結された形態である。
実施形態１において、重鎖発現ベクター１、重鎖発現ベクター２、及び軽鎖発現ベクター内で抗体をコードする核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２０～ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２２に示されている。
本明細書の一実施形態による一価二重特異性抗体の例示であるｈｕｌｌＦｌｌ×Ｆ０６を構成するアミノ酸配列を以下の表１に示す。
一価二重特異性抗体（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、抗αシヌクレイン抗体又は抗ＢＡＣＥ抗体の重鎖Ｆｃのうち１つのＣ末端にｓｃＦｖが連結され、他の重鎖ＦｃにはｓｃＦｖが連結されていない異種二量体形態である。
一般に、一価二重特異性抗体の産生において、ノブ‐ノブ（Ｋｎｏｂ‐Ｋｎｏｂ）二量体、ノブ‐ホール（Ｋｎｏｂ‐ｈｏｌｅ）二量体、ホール‐ホール（ｈｏｌｅ‐ｈｏｌｅ）二量体抗体の組み合わせがすべて産生される。純粋な異種二量体（ｋｎｏｂ－ｈｏｌｅ ｄｉｍｅｒ）単離のための精製過程における精製単離能の比較及び対照物質の使用のために、単一特異性抗体（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｋｎｏｂ‐ｋｎｏｂ ｄｉｍｅｒと同じサイズの１５０ｋｄ）及び二価二重特異性抗体（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｈｏｌｅ‐ｈｏｌｅ ｄｉｍｅｒと同じサイズの２００ｋｄ）をさらにクローニングした。
精製単離能の比較及び分析に必要な対照物質の生産のための単一特異性抗体の重鎖配列の場合には、抗αシヌクレイン抗体又は抗ＢＡＣＥ抗体をコードする重鎖可変領域及びヒト免疫グロブリンの重鎖定常領域のみがある形態であり、これが二重特異性抗体の重鎖配列の場合には、単独抗体と同じ重鎖配列Ｃ末端にｓｃＦｖがリンカーで連結されているが、重鎖定常領域にいかなる配列置換もされていない形態である。単独抗体、二価二重特異性抗体、及び一価二重特異性抗体において、軽鎖配列部分はすべて同一である。
本実施形態で使用した抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ（１５６４、Ｆ０６、ＶＨ５、ＶＨ９、ＶＨ１６）の重鎖可変配列及び軽鎖可変配列を下記表２に示す。
（２）一過性発現（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
前記調製したベクターをマキシプレップ（ｍａｘｉ－ｐｒｅｐ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））し、大量のプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡを確保後、次のように細胞に導入した。一価二重特異性抗体を産生する場合、ホール型重鎖発現ベクターＤＮＡ、ノブ型重鎖発現ベクターＤＮＡ、及び軽鎖発現ベクターＤＮＡを０．５：０．５：１の比で形質導入し、単一特異性抗体又は二価二重特異性抗体を産生する場合には、重鎖発現ベクターＤＮＡ及び軽鎖発現ベクターＤＮＡを１：１の比で形質導入した。
形質注入の前日、ＥｘｐｉＣｈｏ（商標）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ：Ａ２９１２７）細胞をＥｘｐｉＣｈｏ（商標）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ：Ａ２９１００－０１）培地に３×１０Ｅ６～４×１０Ｅ６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで濃度を合わせた後、８％ ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍで１日間培養した。ＤＮＡ形質注入の当日７×１０Ｅ６～１０×１０Ｅ６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率は９５％以上に育った細胞を、新鮮培地を用いて６×１０６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈して調製した。
調製した母細胞に形質導入のためにＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２９）を使用して、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ及びプラスミドＤＮＡ複合体を調製した。冷たいＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ：１２３０９０１９）培地をそれぞれ分注し、適正濃度で調製したＤＮＡ及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬をそれぞれ接種後、ミックスして常温で５分間静置し、母細胞に接種して形質注入後培養を始めた。形質注入の翌日にはＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔに含まれるｅｎｈａｎｃｅｒ及びｆｅｅｄを形質注入細胞に接種し、５日後にはｆｅｅｄを追加接種後、８％ ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍ条件で１０日間培養して産生を完了した。
（３）培養液収得（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ Ｈａｒｖｅｓｔ）
産生が完了した培養液を得るために遠心単離用ボトルに培養液を移し、４℃、６５００ｒｐｍで３０分間遠心単離後、０．２μｍの大きさのフィルターで濾過を行い、浮遊物を除いた培養液を試料として確保した。その後、精製過程を行った。
実施形態２：アフィニティークロマトグラフィーによる一価二重特異性抗体の精製工程条件を確認するための実験の準備
実施形態１の方法に従って一価二重特異性抗体を作製した。この時、二重特異性抗体のうち、抗αシヌクレイン抗体としてはｃｈ１１Ｆ１１又はｈｕｌｌＦｌｌクローンを、抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体としては１５６４、ＶＨ５、ＶＨ９、ＶＨ１６又はＦ０６クローンを使用し、いずれもＶＨ３ファミリー抗体に該当して、それぞれ重鎖可変領域はＶＨ３ドメインを含んでいた。
実際の産生では、ノブ・イン・ホールによって目的抗体である一価二重特異性抗体が主に産生され、付随的生産物である二価二重特異性抗体及び単一特異性抗体は比較的少量で産生される。しかしながら、本実施形態では、本発明による精製工程がＶＨ３ドメインの数による親和度の差によって抗体を単離できることをより明確に証明するために、当該精製における付随的生成物、すなわち不純物とされる二価二重特異性抗体及び単一特異性抗体の濃度を高めた組成物を調製し（すなわち、精製にさらに不利な条件を提供して）、この組成物を対象に精製工程を実施した。
そのような組成物は、ノブ又はホールを含まないことを除いて、実施形態１と同じ方法で調製された単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体が１：３：１の比で含まれている。そのような組成物は、以下の精製工程によって単離された抗体を含む。
Ｂ（Ｚ）ドメインのみを有するＭａｂＳｅｌｅｔＳｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ． Ｎｏ． １７５４３８０３）をレジンとして使用するアフィニティークロマトグラフィーで精製し、Ｆｃを有する精製対象物質を単離した。
平衡化バッファー（トリス塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）５０ｍＭ ｐＨ７．２、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）１００ｍＭ）を用いて平衡化した後、回収した培養液をカラムにロードした。
ロードが完了したら、平衡化バッファーで３カラム体積洗浄後、クエン酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ３．４を用いて溶出した。溶出液に１Ｍトリス塩酸塩ｐＨ９．０を加えてｐＨ７．０となるように中和後、０．２μｍ除菌フィルターした。
実施形態３：各種プロテインＡ（プロテインＡ）レジンを用いた抗体精製効果の比較
一価二重特異性抗体の精製に適したプロテインＡレジンを選択するために、以下の表３に示すように、様々な仕様及びドメインを有する市販のプロテインＡカラムを用いたｃｈ１１Ｆ１１単一特異性抗体、ｃｈ１１Ｆ１１－Ｆ０６一価二重特異性抗体ｃｈ１１Ｆ１１－Ｆ０６二価二重特異性抗体を含む試料から精製を行い、その効果を比較した。
各レジン別精製方法及び精製方法については、以下の実施形態３－１～３－７に詳細に記載した。
精製した試料をＳＥ－ＨＰＬＣ（Ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ－ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）又はＬＣ／ＭＳ（Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で分析して精製結果を確認した。
ＳＥ－ＨＰＬＣ分析では、移動相としてリン酸ナトリウム４０ｍＭ、過塩素酸ナトリウム４００ｍＭ、ｐＨ６．８を使用し、分析試料濃度１ｍｇ／ｍＬで分析試料体積２０ｕＬを注入し、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで分析を行った。分析ピークは、２８０ｎｍの波長での吸光度で測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、ＮｕＰＡＧＥ４－１２％ Ｂｉｓ－ＴｒｉｓゲルとＭＯＰＳランニングバッファを使用して、非還元及び還元条件で分析を行った。還元条件の場合、５％２メルカプトエタノールを分析試料に入れ、７０℃で１０分間加熱後分析を行った。ＬＣ／ＭＳ分析では、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ超高速高分離液体クロマトグラフ（ＵＰＬＣ）システムとＷａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓ四重極・飛行時間型質量分析計（Ｑ－ＴＯＦ）で構成し、ＰＬＲＰ－Ｓ １０００ オングストローム ＢＥＨ Ｓ－２００カラムを使用して分析した。データはＷａｔｅｒｓ ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ Ｖ．１．３． ソフトウェアを使用して分析した。
実施形態３－１：ＭａｂＳｅｌｅｔ Ｓｕｒｅ
ＨｉＴｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ． Ｎｏ． ２９－０４８６－８４）レジンを用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化した後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて滞留時間（ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ）５分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図１に、実施形態３－１によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。図１において、ｘ軸は試料体積として単位はｍＬであり、ｙ軸は２８０ｎｍでのＵＶ波長を意味し、単位はｍＡｕである。図１に示すように、実施形態３－１では、１つの溶出ピークのみが示された。これから、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による親和性の差が見られないことを確認した。
実施形態３－２：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ． Ｎｏ． １７－５１９９－０１）を用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いてレジデンス時間５分、ウォッシュ条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図２に、実施形態３－２によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。図２に示すように、実施形態３－２では、１つの溶出ピークのみが示された。これから、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による親和性の差を示さないことを確認した。
実施形態３－３：プロテインＡ ＦＦ
ＨｉＴｒａｐ プロテインＡ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ． Ｎｏ． １７－５０７９－０１）を用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて滞留時間５分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図３に、実施形態３－３によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。図３に示すように、実施形態３－３では、溶出ピークが明確に単離されて現れなかった。これから、ＨｉＴｒａｐ プロテインＡ ＦＦレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による有意な親和性の差を示さないことを確認した。
実施形態３－４：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｃａｔ． Ｎｏ． １７－５２６９－０７）を用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて滞留時間５分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図４に実施形態３－４によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図５及び図６にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。図４に示すように、溶出緩衝液のｐＨ範囲で３つのピークが確認された。具体的には、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインの数が少ない（２個）単一特異性抗体が最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを３個有する一価二重特異性抗体が次に溶出され、より低いｐＨでＶＨ３ドメインを最も多く有する（４個）二価二重特異性抗体が最後に溶出された。このことから、ＭｚｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による親和性の差を示し、このような親和性の差によってｃｈ１１Ｆ１１－Ｆ０６を選択的に精製できることを確認した。このような結果は、他のクローンの組合せにおいても同様に示された。
また、図５及び図６によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果により、アフィニティークロマトグラフィーによって単離されたペプチドがそれぞれ単一特異性抗体、一価二重特異性抗体及び二価二重特異性抗体に該当するという事実を再確認した。
実施形態３－５：プロテインＡ ＨＰ
ＨｉＴｒａｐ プロテインＡ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ． Ｎｏ． １７－０４０２－０１）を用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて滞留時間５分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図７に実施形態３－５によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図８及び図９にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。図７に示すように、溶出緩衝液のｐＨ範囲で３つのピークが確認された。具体的には、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインの数が少ない（２個）単一特異性抗体が最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを３個有する一価二重特異性抗体が次に溶出され、より低いｐＨで最も高いＶＨ３ドメインを最も多く有する（４個）二価特異性抗体が最後に溶出された。このことから、ＨｉＴｒａｐ プロテインＡ ＨＰレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による親和性の差を示し、このような親和性の差によってｃｈ１１Ｆ１１－Ｆ０６を選択的に精製できることを確認した。このような結果は、他のクローンの組合せにおいても同様に示された。
また、図８及び図９によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果により、アフィニティークロマトグラフィーによって単離されたペプチドがそれぞれ単一特異性抗体、一価二重特異性抗体及び二価二重特異性抗体に該当するという事実を再確認した。
実施形態３－６：ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ
ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて滞留時間５分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図１０に実施形態３－６によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図１１及び図１２にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。図１０に示すように、溶出緩衝液のｐＨ範囲で３つのピークが確認された。具体的には、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインの数が少ない（２個）単一特異性抗体が最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを３個有する一価二重特異性抗体が次に溶出され、より低いｐＨでＶＨ３ドメインを最も多く有する（４個）二価二重特異性抗体が最後に溶出された。このことから、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による親和性の差を示し、このような親和性の差によってｃｈ１１Ｆ１１－Ｆ０６を選択的に精製できることを確認した。このような結果は、他のクローンの組合せにおいても同様に示された。
また、図１１及び図１２によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果により、アフィニティークロマトグラフィーによって単離されたペプチドがそれぞれ単一特異性抗体、一価二重特異性抗体及び二価二重特異性抗体に該当するという事実を再確認した。
実施形態３－７：ＡｂＳｏｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐ
ＡｂＳｏｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐ（ＡＧＣ）を用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて滞留時間５分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図１３に実施形態３－６によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図１４及び図１５にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。図１３に示すように、溶出緩衝液のｐＨ範囲で３つのピークが確認された。具体的には、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインの数が少ない（２個）単一特異性抗体が最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを３個有する一価二重特異性抗体が次に溶出され、より低いｐＨでＶＨ３ドメインを最も多く有する（４個）二価二重特異性抗体が最後に溶出された。このことから、ＡｂＳｏｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による親和性の差を示し、この親和性の差によってｃｈ１１Ｆ１１－Ｆ０６を選択的に精製できることを確認した。このような結果は、他のクローンの組合せにおいても同様に示された。
また、図１４及び図１５によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果により、アフィニティークロマトグラフィーによって単離されたペプチドがそれぞれ単一特異性抗体、一価二重特異性抗体及び二価二重特異性抗体に該当するという事実を再確認した。
実施形態３－１～実施形態３－７の精製結果のまとめ
実施形態３－４～実施形態３－７でピークが検出された溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配は、下記表４に記載の通りである。
実施形態３－１～実施形態３－７の精製結果をまとめて下記表５に詳細に記載した。
各実施形態における単離度（Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｒｓ）、回収率（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｙｉｅｌｄ）及び一価抗体収率（Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ Ｙｉｅｌｄ）は、下記式のように計算した。
＊
ｔＲ１：ピーク１の保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）。
ｔＲ２：ピーク２の保持時間
Ｗ１／２１：ピーク１からハーフハイト（ｈａｌｆ ｈｅｉｇｈｔ）間の幅
Ｗ１／２２：ピーク２からハーフハイト間の幅
＊＊回収率（％）＝アウトプット（ｍｇ）／インプット（ｍｇ）ｘ１００
＊＊＊一価抗体収率（％）＝一価抗体アウトプット（ｍｇ）×純度（％）／一価抗体インプット（ｍｇ）×純度（％）×１００
実験の結果、実施形態３－４～３－７で使用したカラムのみがペプチド内に含まれるＶＨ３ドメインの数による親和性の差を示し、その結果、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体及び二価二重特異性敵抗体がｐＨ濃度勾配に応じて効果的に単離されることが確認された。より具体的には、実施形態３－４～３－７で単離される抗体は、可変領域にＶＨ３ドメインを含む単一特異性抗体のＦｃのＣ末端に連結された抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖの存在及び数に応じてＶＨ３ドメインの数がそれぞれ２個、３個、及び４個に異なり、実施形態３－４～３－７で使用されたカラムはプロテインＡレジンが全長ドメインを有することで前記抗体のＶＨ３ドメインノ数の差を細かく認識して抗体が効果的に単離された。このような効果は、Ｆｃ結合力及び塩基安定性（ａｌｋａｌｉｎｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）の向上のために特定ドメインＢ（Ｚ）のみを使用して一般にさらに好ましいＭａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡなどの改善されたカラムと比較して、従来の（特別な変異を導入されていない）プロテインＡを含むレジンが、ＶＨ３ドメインを含むペプチド混合物からＶＨ３の数に応じてペプチドを単離するのにより効果的に使用できるという点でさらに驚くべきことである。
実施形態４：培養液からの抗体純度分析
ＰＯＲＯＳ Ａ ２０ｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ． Ｎｏ． １－５０２２－２６）を用いて、プロテインＡ精製なしで培養液を直接利用する場合でも、所望のＦｃ含有生理活性ペプチドを分析できるか確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化した後、培養液（Ｈａｒｖｅｓｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌｕｉｄ）を直接ロードした。平衡化バッファーを用いて２カラム体積で非結合洗浄（ｕｎｂｏｕｎｄ ｗａｓｈ）し、溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を使用して滞留時間１分、勾配条件の溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。これと同様の方法で、プロテインＡで前処理（ｐｒｅ－ｐｕｒｉｆｉｅｄ）した試料も分析し、結果を比較した。
図１６に、実施形態４によるアフィニティークロマトグラフィーの分析プロファイルを示す。図１６に示すように、プロテインＡカラムを経ずに培養液を直接分析した結果とプロテインＡで前処理（ｐｒｅ－ｐｕｒｉｆｉｅｄ）した試料を分析した結果、値がそれぞれ９０．３％と９０．５％と非常に類似しており、溶出プロファイルと単離度（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）も類似していることを確認した。
以上の結果から、一実施形態の単離方法に従った場合、トランジェント（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）培養液をプロテインＡで一次精製しなくても優れた単離度でペプチドを単離及び分析できることが確認される。したがって、一実施形態に係る単離方法は、細胞株開発の初期段階で候補細胞株の数が多い場合でも、一次精製過程なしに培養液を用いてすぐに抗体の割合及び純度を確認できる非常に効果的な分析法としても活用できる。
実施形態５：様々な非対称型ポリペプチドの精製
実施形態５－１：ＩｇＧ（ＶＨ３（＋））－ｓｃＦｖ（ＶＨ３＋）
実施形態３で使用したプロテインＡレジンを用いて試料の単離能を確認した。プロテインＡレジンとしては、表５に記載の単離能が確認される全てのプロテインＡレジンを使用できることは言うまでもないが、代表的にはＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて精製した。精製のための試料としては、実施形態１の方法に従って生成された２つのＶＨ３ドメインを有する単一特異性抗体（ｈｕ１１Ｆ１１）及び３つのＶＨ３ドメインを有する一価二重特異性抗体（ｈｕ１１Ｆ１１－Ｆ０６）の混合物を使用した。
平衡化緩衝液（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ７．０）を用いて平衡化した後、調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ２．５）を用いたレジデンス時間６分、ウォッシュ条件は、溶出バッファー０％＞５０％／１カラムボリュームでｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。図１７にアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図１８及び図１９にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。
溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配を適用した結果、図１７に示すようにピークが２つに単離された。具体的には、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインの数が少ない（２個）単一特異性抗体が最初に溶出され（Ｐｅａｋ１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを３個有する一価二重特異性抗体が次に溶出した（ピーク２）。これらの結果は、図１８及び図１９によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果から再確認された。
実施形態５－２。ＩｇＧ（ＶＨ３（－））－ｓｃＦｖ（ＶＨ３＋）
実施形態３で使用したプロテインＡレジンを用いて試料の単離能を確認した。プロテインＡレジンとしては、表５に記載の単離能が確認された全てのプロテインＡレジンを使用できることは言うまでもないが、代表的にはＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて精製した。精製のための試料としては、ＩｇＧの可変領域にＶＨ３ドメインを含まない抗体であるｃｈ１Ｅ４クローン又は抗ＢＡＣＥ抗体を用いたことを除いて実施形態１と同様の方法によって生成された、ＶＨ３ドメインを有さない単一特異性抗体（ｃｈ１Ｅ４又は抗ＢＡＣＥ）及び１つのＶＨ３ドメインを有する一価二重特異性抗体（ｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６又は抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６）の混合物を使用した。
平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ２．５）を用いた滞留時間６分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。図２０及び図２１にアフィニティークロマトグラフィーの溶出ピークをそれぞれ示し、図２２及び図２３にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ結果を示し、図２４及び図２５にそれぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。
溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配を適用した結果、図２０及び図２１に示すようにピークが２つに単離された。具体的には、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインを有さない（０個）、単一特異性抗体が最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを１つ有する一価二重特異性抗体が次に溶出された（ピーク２）。このような結果は、図２２～図２５によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果により再確認された。
実施形態５－３。Ｆｃ－ｓｃＦｖ（ＶＨ３＋）
実施形態３で使用したプロテインＡレジンを用いて試料の単離能を確認した。プロテインＡレジンとしては、表５に記載の単離能が確認された全てのプロテインＡレジンを使用できることは言うまでもないが、代表的にはＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて精製した。精製のための試料としては、単一特異性抗体（ｈｕｌｌＦｌｌ）及び一価二重特異性抗体（ｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６）をパパイン（ｐａｐａｉｎ）で処理してＦａｂを除去したＦｃ及びＦｃ－ｓｃＦｖ（Ｆ０６）を調製した。具体的には、パパインを消化緩衝液（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）２０ｍＭ、システイン塩酸塩（ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ＨＣｌ）１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈し、調製した試料に１：１００（パパイン：抗体）比で混合し、３７℃で４時間反応させた。
平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ２．５）を用いて滞留時間６分、洗浄条件は、溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。図２６にアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図２７及び図２８にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。
溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配を適用した結果、図２６に示すようにピークが２つに単離された。一般的な抗体は、ＦｃのＮ末端にＦａｂが連結されているが、本実施形態で単離された試料はＦｃのＮ末端にＦａｂを含まない。それにもかかわらず、図２６によれば、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインがない（０個）Ｆｃが最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを１つ有するＦｃ－ｓｃＦｖ（Ｆ０６）が次に。溶出し（ピーク２）、これらの結果は、図２７及び図２８によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果から再確認した。これは、本発明による精製方法が単純な抗体精製だけでなく、ＶＨ３ドメインの数に差を有する様々なＦｃ含有ペプチド、例えばＦｃ－ｓｃＦｖを含む様々なペプチド（例えば、薬物又は機能性ペプチドと連結されたＦｃ－ｓｃＦｖ）にも幅広く適用できることを示唆するものである。
実施形態５－４。ＧＬＰ－１－Ｆｃ－ｓｃＦｖ（ＶＨ３＋）
実施形態３で使用したプロテインＡレジンを用いて試料の単離能を確認した。プロテインＡレジンとしては、表５に記載の単離能が確認された全てのプロテインＡレジンを使用できることは言うまでもないが、代表的にはＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて精製した。精製のための試料としては、ＦｃにＦａｂの代わりにＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１）の公知の配列が連結されたことを除いて実施形態１の方法と同様の方法により生成されたＧＬＰ－１－Ｆｃ（Ｆ０６）及び１つのＶＨ３ドメインを有するＧＬＰ－１－Ｆｃ－ｓｃＦｖ（Ｆ０６）の混合物を使用した。本実施形態で使用されたＧＬＰ－１は、ペプチド薬物の一種として糖尿やアルツハイマーなどの疾患に関連して研究及び臨床が活発に進行している物質である。このようなペプチド薬物を含む場合でも、ＶＨ３ドメインの数に応じた単離が可能であるかを本実施形態で試験した。
平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ２．５）を用いた滞留時間６分、洗浄条件は、溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。図２９にアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図３０にＳＥ－ＨＰＬＣ結果を示す。
溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配を適用した結果、図２９に示すようにピークが２つに単離された。一般的な抗体は、ＦｃのＮ末端にＦａｂが連結されているが、本実施形態で単離された試料は、ＦｃのＮ末端にＦａｂの代わりにＧＬＰ－１を含む融合ペプチドである。それにもかかわらず、図２９によれば、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインを有さない（０個）ＧＬＰ－１－Ｆｃが最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを１つ有するＧＬＰ－１－Ｆｃ－ｓｃＦｖ（Ｆ０６）が次に溶出され（ピーク２）、これらの結果を図３０によるＳＥ－ＨＰＬＣ結果から再確認した。これは、本発明による精製方法が単純な抗体精製だけでなく、ＶＨ３ドメインの数に差を有する様々なＦｃ含有ペプチド、特に抗体の構成要素以外の他の有効成分もさらに含む生理活性ペプチドの単離にも幅広く適用できることを示唆するものである。
実施形態５－１～実施形態５－４における溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配は、以下の表６に記載の通りである。
実施形態５－５。ＩｇＧ（ＶＨ３（±））－ｓｃＦｖ（ＶＨ３＋）
実施形態３で使用したプロテインＡレジンを用いて試料の単離能を確認した。プロテインＡレジンとしては、表５に記載の単離能が確認された全てのプロテインＡレジンを使用できることは言うまでもないが、代表的にはＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて精製した。精製のための試料としては、実施形態１の方法に従って産生された２つのＶＨ３ドメインを有する単一特異性抗体（ｈｕ１１Ｆ１１）及び３つのＶＨ３ドメインを有する一価二重特異性抗体（ｈｕ１１Ｆ１１－Ｆ０６）、そしてＩｇＧの可変領域にＶＨ３ドメインを含まない抗体である抗ＢＡＣＥ抗体を使用したことを除いて、実施形態１と同じ方法に従って産生された、ＶＨ３ドメインを有さない単一特異性抗体（抗ＢＡＣＥ）及び１つのＶＨ３ドメインを有する一価二重特異性抗体（抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６）の合計４種類の混合物を使用した。
平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ２．５）を用いた滞留時間６分、洗浄条件は、溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。図３１にアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図３２～図３４にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＬＣ／ＭＳ結果を示す。
溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配を適用した結果、図３１に示すようにピークが４つに単離され、ＶＨ３ドメインの数に応じたペプチド（抗ＢＡＣＥ抗体：０個、抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６：１個、ｈｕｌｌＦｌｌ抗体：２個、ｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６：３個）のピークが明確に単離され、所望のペプチドを選択的に精製できることを確認した。さらに、これらの結果は、図３２～図３４のＳＥ－ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＬＣ／ＭＳ結果から再確認された。これから、本明細書の単離方法は、各ペプチドに含まれるＶＨ３ドメインの数に応じてペプチドを非常に細かく精製できることを確認した。
実施形態５－６。ＩｇＧ（ＶＨ３（±））‐ｓｃＦｖ（ＶＨ３＋）
実施形態３で使用したプロテインＡレジンを用いて試料の単離能を確認した。プロテインＡレジンとしては、表５に記載の単離能が確認された全てのプロテインＡレジンを使用できることは言うまでもないが、代表的にはＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて精製した。精製のための試料としては、実施形態１の方法に従って産生された２つのＶＨ３ドメインを有する単一特異性抗体（ｈｕ１１Ｆ１１）及び３つのＶＨ３ドメインを有する一価二重特異性抗体（ｈｕ１１Ｆ１１－Ｆ０６）、そしてＩｇＧの可変領域にＶＨ３ドメインを含まない抗体クローンであるｃｈ１Ｅ４抗体を使用したことを除いて、実施形態１と同じ方法に従って産生された、ＶＨ３ドメインを有さない単一特異性抗体（ｃｈ１Ｅ４）及び１つのＶＨ３ドメインを有する一価二重特異性抗体（ｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６）の合計４種の混合物を使用した。
平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ２．５）を用いて滞留時間６分、洗浄条件を溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。図３５に、アフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配を適用した結果、図３５に示すようにピークが４つに単離され、ＶＨドメインの数に応じてペプチド（ｃｈ１Ｅ４：０個、ｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６：１個、ｈｕｌｌＦｌｌ：２個、ｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６：３個）のピークを明確に単離され、所望のペプチドをＶＨ３ドメインの数に応じて選択的に精製できることを確認した。
実施形態１：一価二重特異性抗体の調製
（１）一価二重特異性抗体発現ベクターの作製
一価二重特異性抗体（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）発現ベクターを作製するために、ｐｃＤＮＡ３．４（ｕｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターのマルチクローニングサイト（Ｍｕｌｔｉ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ、ＭＣＳ）にシグナル配列を含む抗体のヌクレオチド配列を挿入した。使用した発現ベクターはモノシストロニックベクターであり、重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターをそれぞれ作製した。
重鎖発現ベクターは、第１の重鎖配列を有する重鎖発現ベクター１と第２の重鎖配列を有する重鎖発現ベクター２を作製した。
重鎖発現ベクター１は、抗αシヌクレイン（抗α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）抗体であるｃｈ１１Ｆ１１（国際公開番号ＷＯ２０１９／１１７６８４の配列リスト参照）、ｃｈ１Ｅ４（重鎖配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８及び軽鎖配列番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９参照）、又はｈｕｌｌＦｌｌ（国際公開番号ＷＯ２０１９／１１７６８４の配列リスト参照）、又は抗ＢＡＣＥ（国際公開番号ＷＯ２０１９／０９４６０８のｈｕ２Ｈ８ｖ２９の配列参照）、抗体の重鎖可変領域及びヒト重鎖定常領域が連結された免疫グロブリンのＣ末端に抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ（１５６４，ＦＯ６，ＶＨ５，ＶＨ５，ＶＨ９，ＶＨ１６，表２参照）がリンカーで連結された形態であり、重鎖定常領域の特定位置に配列置換（ｈｏｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ：Ｔ３６６Ｓ，Ｌ３６８Ａ，Ｙ４０６Ｖ）がされている。
重鎖発現ベクター２は、抗αシヌクレイン抗体又は抗ＢＡＣＥ抗体をコードする重鎖可変領域及びヒト重鎖定常領域のみ連結された形態であり、重鎖定常領域の特定位置に配列置換（ｋｎｏｂ ｍｕｔａｔｉｏｎ：Ｔ３６６Ｗ）となっている。
軽鎖発現ベクターに挿入された軽鎖配列の場合、抗αシヌクレイン抗体又は抗ＢＡＣＥ抗体をコードする軽鎖可変領域及びヒト軽鎖定常領域が連結された形態である。
実施形態１において、重鎖発現ベクター１、重鎖発現ベクター２、及び軽鎖発現ベクター内で抗体をコードする核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２０～ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２２に示されている。
本明細書の一実施形態による一価二重特異性抗体の例示であるｈｕｌｌＦｌｌ×Ｆ０６を構成するアミノ酸配列を以下の表１に示す。
【表1】
一般に、一価二重特異性抗体の産生において、ノブ‐ノブ（Ｋｎｏｂ‐Ｋｎｏｂ）二量体、ノブ‐ホール（Ｋｎｏｂ‐ｈｏｌｅ）二量体、ホール‐ホール（ｈｏｌｅ‐ｈｏｌｅ）二量体抗体の組み合わせがすべて産生される。純粋な異種二量体（ｋｎｏｂ－ｈｏｌｅ ｄｉｍｅｒ）単離のための精製過程における精製単離能の比較及び対照物質の使用のために、単一特異性抗体（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｋｎｏｂ‐ｋｎｏｂ ｄｉｍｅｒと同じサイズの１５０ｋｄ）及び二価二重特異性抗体（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｈｏｌｅ‐ｈｏｌｅ ｄｉｍｅｒと同じサイズの２００ｋｄ）をさらにクローニングした。
精製単離能の比較及び分析に必要な対照物質の生産のための単一特異性抗体の重鎖配列の場合には、抗αシヌクレイン抗体又は抗ＢＡＣＥ抗体をコードする重鎖可変領域及びヒト免疫グロブリンの重鎖定常領域のみがある形態であり、これが二重特異性抗体の重鎖配列の場合には、単独抗体と同じ重鎖配列Ｃ末端にｓｃＦｖがリンカーで連結されているが、重鎖定常領域にいかなる配列置換もされていない形態である。単独抗体、二価二重特異性抗体、及び一価二重特異性抗体において、軽鎖配列部分はすべて同一である。
本実施形態で使用した抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ（１５６４、Ｆ０６、ＶＨ５、ＶＨ９、ＶＨ１６）の重鎖可変配列及び軽鎖可変配列を下記表２に示す。
【表2】
前記調製したベクターをマキシプレップ（ｍａｘｉ－ｐｒｅｐ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））し、大量のプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡを確保後、次のように細胞に導入した。一価二重特異性抗体を産生する場合、ホール型重鎖発現ベクターＤＮＡ、ノブ型重鎖発現ベクターＤＮＡ、及び軽鎖発現ベクターＤＮＡを０．５：０．５：１の比で形質導入し、単一特異性抗体又は二価二重特異性抗体を産生する場合には、重鎖発現ベクターＤＮＡ及び軽鎖発現ベクターＤＮＡを１：１の比で形質導入した。
形質注入の前日、ＥｘｐｉＣｈｏ（商標）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ：Ａ２９１２７）細胞をＥｘｐｉＣｈｏ（商標）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ：Ａ２９１００－０１）培地に３×１０Ｅ６～４×１０Ｅ６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで濃度を合わせた後、８％ ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍで１日間培養した。ＤＮＡ形質注入の当日７×１０Ｅ６～１０×１０Ｅ６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率は９５％以上に育った細胞を、新鮮培地を用いて６×１０６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈して調製した。
調製した母細胞に形質導入のためにＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２９）を使用して、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ及びプラスミドＤＮＡ複合体を調製した。冷たいＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ：１２３０９０１９）培地をそれぞれ分注し、適正濃度で調製したＤＮＡ及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬をそれぞれ接種後、ミックスして常温で５分間静置し、母細胞に接種して形質注入後培養を始めた。形質注入の翌日にはＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔに含まれるｅｎｈａｎｃｅｒ及びｆｅｅｄを形質注入細胞に接種し、５日後にはｆｅｅｄを追加接種後、８％ ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍ条件で１０日間培養して産生を完了した。
（３）培養液収得（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ Ｈａｒｖｅｓｔ）
産生が完了した培養液を得るために遠心単離用ボトルに培養液を移し、４℃、６５００ｒｐｍで３０分間遠心単離後、０．２μｍの大きさのフィルターで濾過を行い、浮遊物を除いた培養液を試料として確保した。その後、精製過程を行った。
実施形態２：アフィニティークロマトグラフィーによる一価二重特異性抗体の精製工程条件を確認するための実験の準備
実施形態１の方法に従って一価二重特異性抗体を作製した。この時、二重特異性抗体のうち、抗αシヌクレイン抗体としてはｃｈ１１Ｆ１１又はｈｕｌｌＦｌｌクローンを、抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体としては１５６４、ＶＨ５、ＶＨ９、ＶＨ１６又はＦ０６クローンを使用し、いずれもＶＨ３ファミリー抗体に該当して、それぞれ重鎖可変領域はＶＨ３ドメインを含んでいた。
実際の産生では、ノブ・イン・ホールによって目的抗体である一価二重特異性抗体が主に産生され、付随的生産物である二価二重特異性抗体及び単一特異性抗体は比較的少量で産生される。しかしながら、本実施形態では、本発明による精製工程がＶＨ３ドメインの数による親和度の差によって抗体を単離できることをより明確に証明するために、当該精製における付随的生成物、すなわち不純物とされる二価二重特異性抗体及び単一特異性抗体の濃度を高めた組成物を調製し（すなわち、精製にさらに不利な条件を提供して）、この組成物を対象に精製工程を実施した。
そのような組成物は、ノブ又はホールを含まないことを除いて、実施形態１と同じ方法で調製された単一特異性抗体、一価二重特異性抗体、及び二価二重特異性抗体が１：３：１の比で含まれている。そのような組成物は、以下の精製工程によって単離された抗体を含む。
Ｂ（Ｚ）ドメインのみを有するＭａｂＳｅｌｅｔＳｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ． Ｎｏ． １７５４３８０３）をレジンとして使用するアフィニティークロマトグラフィーで精製し、Ｆｃを有する精製対象物質を単離した。
平衡化バッファー（トリス塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）５０ｍＭ ｐＨ７．２、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）１００ｍＭ）を用いて平衡化した後、回収した培養液をカラムにロードした。
ロードが完了したら、平衡化バッファーで３カラム体積洗浄後、クエン酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ３．４を用いて溶出した。溶出液に１Ｍトリス塩酸塩ｐＨ９．０を加えてｐＨ７．０となるように中和後、０．２μｍ除菌フィルターした。
実施形態３：各種プロテインＡ（プロテインＡ）レジンを用いた抗体精製効果の比較
一価二重特異性抗体の精製に適したプロテインＡレジンを選択するために、以下の表３に示すように、様々な仕様及びドメインを有する市販のプロテインＡカラムを用いたｃｈ１１Ｆ１１単一特異性抗体、ｃｈ１１Ｆ１１－Ｆ０６一価二重特異性抗体ｃｈ１１Ｆ１１－Ｆ０６二価二重特異性抗体を含む試料から精製を行い、その効果を比較した。
【表3】
精製した試料をＳＥ－ＨＰＬＣ（Ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ－ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）又はＬＣ／ＭＳ（Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で分析して精製結果を確認した。
ＳＥ－ＨＰＬＣ分析では、移動相としてリン酸ナトリウム４０ｍＭ、過塩素酸ナトリウム４００ｍＭ、ｐＨ６．８を使用し、分析試料濃度１ｍｇ／ｍＬで分析試料体積２０ｕＬを注入し、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで分析を行った。分析ピークは、２８０ｎｍの波長での吸光度で測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、ＮｕＰＡＧＥ４－１２％ Ｂｉｓ－ＴｒｉｓゲルとＭＯＰＳランニングバッファを使用して、非還元及び還元条件で分析を行った。還元条件の場合、５％２メルカプトエタノールを分析試料に入れ、７０℃で１０分間加熱後分析を行った。ＬＣ／ＭＳ分析では、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ超高速高分離液体クロマトグラフ（ＵＰＬＣ）システムとＷａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓ四重極・飛行時間型質量分析計（Ｑ－ＴＯＦ）で構成し、ＰＬＲＰ－Ｓ １０００ オングストローム ＢＥＨ Ｓ－２００カラムを使用して分析した。データはＷａｔｅｒｓ ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ Ｖ．１．３． ソフトウェアを使用して分析した。
実施形態３－１：ＭａｂＳｅｌｅｔ Ｓｕｒｅ
ＨｉＴｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ． Ｎｏ． ２９－０４８６－８４）レジンを用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化した後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて滞留時間（ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ）５分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図１に、実施形態３－１によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。図１において、ｘ軸は試料体積として単位はｍＬであり、ｙ軸は２８０ｎｍでのＵＶ波長を意味し、単位はｍＡｕである。図１に示すように、実施形態３－１では、１つの溶出ピークのみが示された。これから、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による親和性の差が見られないことを確認した。
実施形態３－２：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ． Ｎｏ． １７－５１９９－０１）を用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いてレジデンス時間５分、ウォッシュ条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図２に、実施形態３－２によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。図２に示すように、実施形態３－２では、１つの溶出ピークのみが示された。これから、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による親和性の差を示さないことを確認した。
実施形態３－３：プロテインＡ ＦＦ
ＨｉＴｒａｐ プロテインＡ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ． Ｎｏ． １７－５０７９－０１）を用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて滞留時間５分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図３に、実施形態３－３によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。図３に示すように、実施形態３－３では、溶出ピークが明確に単離されて現れなかった。これから、ＨｉＴｒａｐ プロテインＡ ＦＦレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による有意な親和性の差を示さないことを確認した。
実施形態３－４：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｃａｔ． Ｎｏ． １７－５２６９－０７）を用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて滞留時間５分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図４に実施形態３－４によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図５及び図６にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。図４に示すように、溶出緩衝液のｐＨ範囲で３つのピークが確認された。具体的には、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインの数が少ない（２個）単一特異性抗体が最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを３個有する一価二重特異性抗体が次に溶出され、より低いｐＨでＶＨ３ドメインを最も多く有する（４個）二価二重特異性抗体が最後に溶出された。このことから、ＭｚｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による親和性の差を示し、このような親和性の差によってｃｈ１１Ｆ１１－Ｆ０６を選択的に精製できることを確認した。このような結果は、他のクローンの組合せにおいても同様に示された。
また、図５及び図６によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果により、アフィニティークロマトグラフィーによって単離されたペプチドがそれぞれ単一特異性抗体、一価二重特異性抗体及び二価二重特異性抗体に該当するという事実を再確認した。
実施形態３－５：プロテインＡ ＨＰ
ＨｉＴｒａｐ プロテインＡ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ． Ｎｏ． １７－０４０２－０１）を用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて滞留時間５分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図７に実施形態３－５によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図８及び図９にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。図７に示すように、溶出緩衝液のｐＨ範囲で３つのピークが確認された。具体的には、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインの数が少ない（２個）単一特異性抗体が最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを３個有する一価二重特異性抗体が次に溶出され、より低いｐＨで最も高いＶＨ３ドメインを最も多く有する（４個）二価特異性抗体が最後に溶出された。このことから、ＨｉＴｒａｐ プロテインＡ ＨＰレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による親和性の差を示し、このような親和性の差によってｃｈ１１Ｆ１１－Ｆ０６を選択的に精製できることを確認した。このような結果は、他のクローンの組合せにおいても同様に示された。
また、図８及び図９によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果により、アフィニティークロマトグラフィーによって単離されたペプチドがそれぞれ単一特異性抗体、一価二重特異性抗体及び二価二重特異性抗体に該当するという事実を再確認した。
実施形態３－６：ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ
ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて滞留時間５分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図１０に実施形態３－６によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図１１及び図１２にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。図１０に示すように、溶出緩衝液のｐＨ範囲で３つのピークが確認された。具体的には、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインの数が少ない（２個）単一特異性抗体が最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを３個有する一価二重特異性抗体が次に溶出され、より低いｐＨでＶＨ３ドメインを最も多く有する（４個）二価二重特異性抗体が最後に溶出された。このことから、ＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による親和性の差を示し、このような親和性の差によってｃｈ１１Ｆ１１－Ｆ０６を選択的に精製できることを確認した。このような結果は、他のクローンの組合せにおいても同様に示された。
また、図１１及び図１２によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果により、アフィニティークロマトグラフィーによって単離されたペプチドがそれぞれ単一特異性抗体、一価二重特異性抗体及び二価二重特異性抗体に該当するという事実を再確認した。
実施形態３－７：ＡｂＳｏｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐ
ＡｂＳｏｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐ（ＡＧＣ）を用いて試料の単離能を確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、実施形態１で調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて滞留時間５分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。
図１３に実施形態３－６によるアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図１４及び図１５にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。図１３に示すように、溶出緩衝液のｐＨ範囲で３つのピークが確認された。具体的には、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインの数が少ない（２個）単一特異性抗体が最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを３個有する一価二重特異性抗体が次に溶出され、より低いｐＨでＶＨ３ドメインを最も多く有する（４個）二価二重特異性抗体が最後に溶出された。このことから、ＡｂＳｏｌｕｔｅ Ｈｉｇｈ Ｃａｐレジンは、試料内に存在するペプチドのＶＨ３ドメインの数の差による親和性の差を示し、この親和性の差によってｃｈ１１Ｆ１１－Ｆ０６を選択的に精製できることを確認した。このような結果は、他のクローンの組合せにおいても同様に示された。
また、図１４及び図１５によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果により、アフィニティークロマトグラフィーによって単離されたペプチドがそれぞれ単一特異性抗体、一価二重特異性抗体及び二価二重特異性抗体に該当するという事実を再確認した。
実施形態３－１～実施形態３－７の精製結果のまとめ
実施形態３－４～実施形態３－７でピークが検出された溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配は、下記表４に記載の通りである。
【表4】
【表5】
ｔＲ１：ピーク１の保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）。
ｔＲ２：ピーク２の保持時間
Ｗ１／２１：ピーク１からハーフハイト（ｈａｌｆ ｈｅｉｇｈｔ）間の幅
Ｗ１／２２：ピーク２からハーフハイト間の幅
＊＊回収率（％）＝アウトプット（ｍｇ）／インプット（ｍｇ）ｘ１００
＊＊＊一価抗体収率（％）＝一価抗体アウトプット（ｍｇ）×純度（％）／一価抗体インプット（ｍｇ）×純度（％）×１００
実験の結果、実施形態３－４～３－７で使用したカラムのみがペプチド内に含まれるＶＨ３ドメインの数による親和性の差を示し、その結果、単一特異性抗体、一価二重特異性抗体及び二価二重特異性敵抗体がｐＨ濃度勾配に応じて効果的に単離されることが確認された。より具体的には、実施形態３－４～３－７で単離される抗体は、可変領域にＶＨ３ドメインを含む単一特異性抗体のＦｃのＣ末端に連結された抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖの存在及び数に応じてＶＨ３ドメインの数がそれぞれ２個、３個、及び４個に異なり、実施形態３－４～３－７で使用されたカラムはプロテインＡレジンが全長ドメインを有することで前記抗体のＶＨ３ドメインノ数の差を細かく認識して抗体が効果的に単離された。このような効果は、Ｆｃ結合力及び塩基安定性（ａｌｋａｌｉｎｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）の向上のために特定ドメインＢ（Ｚ）のみを使用して一般にさらに好ましいＭａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡなどの改善されたカラムと比較して、従来の（特別な変異を導入されていない）プロテインＡを含むレジンが、ＶＨ３ドメインを含むペプチド混合物からＶＨ３の数に応じてペプチドを単離するのにより効果的に使用できるという点でさらに驚くべきことである。
実施形態４：培養液からの抗体純度分析
ＰＯＲＯＳ Ａ ２０ｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ． Ｎｏ． １－５０２２－２６）を用いて、プロテインＡ精製なしで培養液を直接利用する場合でも、所望のＦｃ含有生理活性ペプチドを分析できるか確認した。平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて平衡化した後、培養液（Ｈａｒｖｅｓｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌｕｉｄ）を直接ロードした。平衡化バッファーを用いて２カラム体積で非結合洗浄（ｕｎｂｏｕｎｄ ｗａｓｈ）し、溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ、ｐＨ２．５）を使用して滞留時間１分、勾配条件の溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。これと同様の方法で、プロテインＡで前処理（ｐｒｅ－ｐｕｒｉｆｉｅｄ）した試料も分析し、結果を比較した。
図１６に、実施形態４によるアフィニティークロマトグラフィーの分析プロファイルを示す。図１６に示すように、プロテインＡカラムを経ずに培養液を直接分析した結果とプロテインＡで前処理（ｐｒｅ－ｐｕｒｉｆｉｅｄ）した試料を分析した結果、値がそれぞれ９０．３％と９０．５％と非常に類似しており、溶出プロファイルと単離度（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）も類似していることを確認した。
以上の結果から、一実施形態の単離方法に従った場合、トランジェント（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）培養液をプロテインＡで一次精製しなくても優れた単離度でペプチドを単離及び分析できることが確認される。したがって、一実施形態に係る単離方法は、細胞株開発の初期段階で候補細胞株の数が多い場合でも、一次精製過程なしに培養液を用いてすぐに抗体の割合及び純度を確認できる非常に効果的な分析法としても活用できる。
実施形態５：様々な非対称型ポリペプチドの精製
実施形態５－１：ＩｇＧ（ＶＨ３（＋））－ｓｃＦｖ（ＶＨ３＋）
実施形態３で使用したプロテインＡレジンを用いて試料の単離能を確認した。プロテインＡレジンとしては、表５に記載の単離能が確認される全てのプロテインＡレジンを使用できることは言うまでもないが、代表的にはＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて精製した。精製のための試料としては、実施形態１の方法に従って生成された２つのＶＨ３ドメインを有する単一特異性抗体（ｈｕ１１Ｆ１１）及び３つのＶＨ３ドメインを有する一価二重特異性抗体（ｈｕ１１Ｆ１１－Ｆ０６）の混合物を使用した。
平衡化緩衝液（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ７．０）を用いて平衡化した後、調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ２．５）を用いたレジデンス時間６分、ウォッシュ条件は、溶出バッファー０％＞５０％／１カラムボリュームでｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。図１７にアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図１８及び図１９にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。
溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配を適用した結果、図１７に示すようにピークが２つに単離された。具体的には、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインの数が少ない（２個）単一特異性抗体が最初に溶出され（Ｐｅａｋ１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを３個有する一価二重特異性抗体が次に溶出した（ピーク２）。これらの結果は、図１８及び図１９によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果から再確認された。
実施形態５－２。ＩｇＧ（ＶＨ３（－））－ｓｃＦｖ（ＶＨ３＋）
実施形態３で使用したプロテインＡレジンを用いて試料の単離能を確認した。プロテインＡレジンとしては、表５に記載の単離能が確認された全てのプロテインＡレジンを使用できることは言うまでもないが、代表的にはＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて精製した。精製のための試料としては、ＩｇＧの可変領域にＶＨ３ドメインを含まない抗体であるｃｈ１Ｅ４クローン又は抗ＢＡＣＥ抗体を用いたことを除いて実施形態１と同様の方法によって生成された、ＶＨ３ドメインを有さない単一特異性抗体（ｃｈ１Ｅ４又は抗ＢＡＣＥ）及び１つのＶＨ３ドメインを有する一価二重特異性抗体（ｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６又は抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６）の混合物を使用した。
平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ２．５）を用いた滞留時間６分、洗浄条件は溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。図２０及び図２１にアフィニティークロマトグラフィーの溶出ピークをそれぞれ示し、図２２及び図２３にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ結果を示し、図２４及び図２５にそれぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。
溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配を適用した結果、図２０及び図２１に示すようにピークが２つに単離された。具体的には、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインを有さない（０個）、単一特異性抗体が最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを１つ有する一価二重特異性抗体が次に溶出された（ピーク２）。このような結果は、図２２～図２５によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果により再確認された。
実施形態５－３。Ｆｃ－ｓｃＦｖ（ＶＨ３＋）
実施形態３で使用したプロテインＡレジンを用いて試料の単離能を確認した。プロテインＡレジンとしては、表５に記載の単離能が確認された全てのプロテインＡレジンを使用できることは言うまでもないが、代表的にはＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて精製した。精製のための試料としては、単一特異性抗体（ｈｕｌｌＦｌｌ）及び一価二重特異性抗体（ｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６）をパパイン（ｐａｐａｉｎ）で処理してＦａｂを除去したＦｃ及びＦｃ－ｓｃＦｖ（Ｆ０６）を調製した。具体的には、パパインを消化緩衝液（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）２０ｍＭ、システイン塩酸塩（ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ＨＣｌ）１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈し、調製した試料に１：１００（パパイン：抗体）比で混合し、３７℃で４時間反応させた。
平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ２．５）を用いて滞留時間６分、洗浄条件は、溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。図２６にアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図２７及び図２８にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。
溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配を適用した結果、図２６に示すようにピークが２つに単離された。一般的な抗体は、ＦｃのＮ末端にＦａｂが連結されているが、本実施形態で単離された試料はＦｃのＮ末端にＦａｂを含まない。それにもかかわらず、図２６によれば、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインがない（０個）Ｆｃが最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを１つ有するＦｃ－ｓｃＦｖ（Ｆ０６）が次に。溶出し（ピーク２）、これらの結果は、図２７及び図２８によるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果から再確認した。これは、本発明による精製方法が単純な抗体精製だけでなく、ＶＨ３ドメインの数に差を有する様々なＦｃ含有ペプチド、例えばＦｃ－ｓｃＦｖを含む様々なペプチド（例えば、薬物又は機能性ペプチドと連結されたＦｃ－ｓｃＦｖ）にも幅広く適用できることを示唆するものである。
実施形態５－４。ＧＬＰ－１－Ｆｃ－ｓｃＦｖ（ＶＨ３＋）
実施形態３で使用したプロテインＡレジンを用いて試料の単離能を確認した。プロテインＡレジンとしては、表５に記載の単離能が確認された全てのプロテインＡレジンを使用できることは言うまでもないが、代表的にはＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて精製した。精製のための試料としては、ＦｃにＦａｂの代わりにＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１）の公知の配列が連結されたことを除いて実施形態１の方法と同様の方法により生成されたＧＬＰ－１－Ｆｃ（Ｆ０６）及び１つのＶＨ３ドメインを有するＧＬＰ－１－Ｆｃ－ｓｃＦｖ（Ｆ０６）の混合物を使用した。本実施形態で使用されたＧＬＰ－１は、ペプチド薬物の一種として糖尿やアルツハイマーなどの疾患に関連して研究及び臨床が活発に進行している物質である。このようなペプチド薬物を含む場合でも、ＶＨ３ドメインの数に応じた単離が可能であるかを本実施形態で試験した。
平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ２．５）を用いた滞留時間６分、洗浄条件は、溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。図２９にアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図３０にＳＥ－ＨＰＬＣ結果を示す。
溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配を適用した結果、図２９に示すようにピークが２つに単離された。一般的な抗体は、ＦｃのＮ末端にＦａｂが連結されているが、本実施形態で単離された試料は、ＦｃのＮ末端にＦａｂの代わりにＧＬＰ－１を含む融合ペプチドである。それにもかかわらず、図２９によれば、比較的高いｐＨでＶＨ３ドメインを有さない（０個）ＧＬＰ－１－Ｆｃが最初に溶出され（ピーク１）、ｐＨが低くなるにつれてＶＨ３ドメインを１つ有するＧＬＰ－１－Ｆｃ－ｓｃＦｖ（Ｆ０６）が次に溶出され（ピーク２）、これらの結果を図３０によるＳＥ－ＨＰＬＣ結果から再確認した。これは、本発明による精製方法が単純な抗体精製だけでなく、ＶＨ３ドメインの数に差を有する様々なＦｃ含有ペプチド、特に抗体の構成要素以外の他の有効成分もさらに含む生理活性ペプチドの単離にも幅広く適用できることを示唆するものである。
実施形態５－１～実施形態５－４における溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配は、以下の表６に記載の通りである。
【表6】
実施形態３で使用したプロテインＡレジンを用いて試料の単離能を確認した。プロテインＡレジンとしては、表５に記載の単離能が確認された全てのプロテインＡレジンを使用できることは言うまでもないが、代表的にはＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて精製した。精製のための試料としては、実施形態１の方法に従って産生された２つのＶＨ３ドメインを有する単一特異性抗体（ｈｕ１１Ｆ１１）及び３つのＶＨ３ドメインを有する一価二重特異性抗体（ｈｕ１１Ｆ１１－Ｆ０６）、そしてＩｇＧの可変領域にＶＨ３ドメインを含まない抗体である抗ＢＡＣＥ抗体を使用したことを除いて、実施形態１と同じ方法に従って産生された、ＶＨ３ドメインを有さない単一特異性抗体（抗ＢＡＣＥ）及び１つのＶＨ３ドメインを有する一価二重特異性抗体（抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６）の合計４種類の混合物を使用した。
平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ２．５）を用いた滞留時間６分、洗浄条件は、溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。図３１にアフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示し、図３２～図３４にそれぞれＳＥ－ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＬＣ／ＭＳ結果を示す。
溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配を適用した結果、図３１に示すようにピークが４つに単離され、ＶＨ３ドメインの数に応じたペプチド（抗ＢＡＣＥ抗体：０個、抗ＢＡＣＥ－Ｆ０６：１個、ｈｕｌｌＦｌｌ抗体：２個、ｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６：３個）のピークが明確に単離され、所望のペプチドを選択的に精製できることを確認した。さらに、これらの結果は、図３２～図３４のＳＥ－ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＬＣ／ＭＳ結果から再確認された。これから、本明細書の単離方法は、各ペプチドに含まれるＶＨ３ドメインの数に応じてペプチドを非常に細かく精製できることを確認した。
実施形態５－６。ＩｇＧ（ＶＨ３（±））‐ｓｃＦｖ（ＶＨ３＋）
実施形態３で使用したプロテインＡレジンを用いて試料の単離能を確認した。プロテインＡレジンとしては、表５に記載の単離能が確認された全てのプロテインＡレジンを使用できることは言うまでもないが、代表的にはＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ２６４５８）を用いて精製した。精製のための試料としては、実施形態１の方法に従って産生された２つのＶＨ３ドメインを有する単一特異性抗体（ｈｕ１１Ｆ１１）及び３つのＶＨ３ドメインを有する一価二重特異性抗体（ｈｕ１１Ｆ１１－Ｆ０６）、そしてＩｇＧの可変領域にＶＨ３ドメインを含まない抗体クローンであるｃｈ１Ｅ４抗体を使用したことを除いて、実施形態１と同じ方法に従って産生された、ＶＨ３ドメインを有さない単一特異性抗体（ｃｈ１Ｅ４）及び１つのＶＨ３ドメインを有する一価二重特異性抗体（ｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６）の合計４種の混合物を使用した。
平衡化バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた後、調製した試料をカラムにロードした。溶出バッファー（クエン酸塩２５ｍＭ／リン酸ナトリウム２５ｍＭ ｐＨ２．５）を用いて滞留時間６分、洗浄条件を溶出バッファー０％＞５０％／１カラム体積でｐＨ７．０～５．０の範囲で行った。勾配条件は、溶出バッファー５０％＞１００％／３０カラム体積で行った。図３５に、アフィニティークロマトグラフィーの精製プロファイルを示す。
溶出緩衝液のｐＨ濃度勾配を適用した結果、図３５に示すようにピークが４つに単離され、ＶＨドメインの数に応じてペプチド（ｃｈ１Ｅ４：０個、ｃｈ１Ｅ４－Ｆ０６：１個、ｈｕｌｌＦｌｌ：２個、ｈｕｌｌＦｌｌ－Ｆ０６：３個）のピークを明確に単離され、所望のペプチドをＶＨ３ドメインの数に応じて選択的に精製できることを確認した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【配列表】
【国際調査報告】