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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-28
(54)【発明の名称】分子相互作用の検出
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20230220BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20230220BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022537197
(86)(22)【出願日】2020-12-15
(85)【翻訳文提出日】2022-08-04
(86)【国際出願番号】 US2020065024
(87)【国際公開番号】W WO2021126806
(87)【国際公開日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】62/949,023
(32)【優先日】2019-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521437068
【氏名又は名称】オリオニス バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】518268352
【氏名又は名称】オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】クレイ，ニコライ
(72)【発明者】
【氏名】リーヴェンス，サミュエル
(72)【発明者】
【氏名】スー，エドワード
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QR80
4B063QS28
4B063QS36
4B063QX01
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA60
(57)【要約】
蛋白質／蛋白質相互作用または低分子／蛋白質相互作用などの分子相互作用を検出する方法が記載される。すなわち、本発明は部分的には細胞を基盤とするシステムであって、様々な分子相互作用を検出するシステムに関する。いくつかの実施態様において、本発明は、標準的アッセイを用いた場合には検出可能ではない分子相互作用（例えば、蛋白質／蛋白質相互作用、蛋白質／低分子相互作用、および／または低分子によって調節される蛋白質／蛋白質相互作用）の試験を可能にする方法を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
分子相互作用を検出する方法であって、該方法が：（ａ）リガンド依存性キメラ受容体蛋白質を含む細胞を提供することであって、該リガンド依存性キメラ受容体蛋白質が：
（ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
（ｉｉ）第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内プレイ蛋白質、
を含み、
ここで該第２の受容体の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインが、ＳＴＡＴ（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：シグナル伝達因子および転写活性化因子）の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインである、
細胞を提供すること；
（ｂ）受容体断片に融合したベイト蛋白質を細胞中で発現させることであって、
ここで該受容体断片が機能的ＳＴＡＴ動員部位を含む、
発現させること、
および
（ｃ）分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出することであって、
ここで該ベイト蛋白質が、
（ｉ）膜結合細胞内微小器官の内部よりも細胞質に局在する傾向を有し、
および／または
（ｉｉ）細胞膜および／またはキメラ受容体の非プレイ部分との非特異的相互作用よりもプレイ蛋白質と特異的相互作用する傾向を有する、
シグナルを検出すること、
を含む、
方法。
【請求項2】
請求項１の方法であって、ここで該プレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、該ベイト蛋白質に融合した受容体断片が膜貫通キメラ受容体蛋白質へ動員されるので、リガンド依存性膜貫通キメラ受容体シグナル伝達が回復し、ＳＴＡＴ分子の活性化が起こる、方法。
【請求項3】
請求項２の方法であって、ここで該細胞がＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子を含む、方法。
【請求項4】
請求項３の方法であって、ここで該活性化したＳＴＡＴ分子は核内に移行してＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子の転写を誘導するので、このレポーター遺伝子シグナルによって分子相互作用の検出が可能となる、方法。
【請求項5】
請求項１の方法であって、ここで該ベイト蛋白質が、細胞核、ミトコンドリア、小胞体、およびゴルジ体から任意選択的に選択される細胞の細胞内微小器官内に実質的に捕捉されない、方法。
【請求項6】
請求項１の方法であって、ここで該ベイト蛋白質が細胞膜と実質的に相互作用しない、方法。
【請求項7】
請求項１の方法であって、ここで該ベイト蛋白質がキメラ受容体の非プレイ部分と実質的に相互作用しない、方法。
【請求項8】
請求項７の方法であって、ここで該ベイト蛋白質がキメラ受容体の第２の受容体の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインと実質的に相互作用しない、方法。
【請求項9】
前記請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該ベイト蛋白質が、受容体断片に任意選択的に融合される足場蛋白質に会合する、方法。
【請求項10】
前記請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該分子相互作用が蛋白質／蛋白質相互作用である、方法。
【請求項11】
前記請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該方法が、該プレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することをさらに含む、方法。
【請求項12】
請求項１１の方法であって、ここで該分子相互作用が、該低分子と該プレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用である、方法。
【請求項13】
前記請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該分子相互作用が、該低分子と該プレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される２種類以上の蛋白質／蛋白質相互作用である、方法。
【請求項14】
請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該低分子と該プレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用が、蛋白質／蛋白質界面の部位における該プレイ蛋白質またはベイト蛋白質と該低分子との間の直接結合である、方法。
【請求項15】
請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該低分子の該プレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用が、該プレイ蛋白質またはベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される、方法。
【請求項16】
請求項１５の方法であって、ここで該低分子が該プレイ蛋白質またはベイト蛋白質との相互作用を可能にする該プレイ蛋白質またはベイト蛋白質の疎水性表面の露出を誘導する、方法。
【請求項17】
請求項１５または１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該低分子が該ベイト蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、それによって該プレイ蛋白質との相互作用が可能になる、方法。
【請求項18】
請求項１５または１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該低分子が該プレイ蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、それによって該ベイト蛋白質との相互作用が可能になる、方法。
【請求項19】
請求項１１～１８のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該低分子が分子糊である、方法。
【請求項20】
請求項１の方法であって、ここで該分子相互作用が複合体形成である、方法。
【請求項21】
請求項１の方法であって、ここで該分子相互作用が低分子／蛋白質相互作用である、方法。
【請求項22】
請求項１の方法であって、ここで該プレイ蛋白質が低分子に結合し、該低分子はリンカーを介して第２の低分子に連結しており、該第２の低分子が該ベイト蛋白質に結合する、方法。
【請求項23】
請求項１の方法であって、ここで該ベイト蛋白質が低分子に結合し、該低分子はリンカーを介して第２の低分子に連結しており、該第２の低分子が該プレイ蛋白質に結合する、方法。
【請求項24】
請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該第１の受容体および第２の受容体が同一の受容体である、方法。
【請求項25】
請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該第１の受容体および第２の受容体が異なる受容体である、方法。
【請求項26】
請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該第１の受容体および／または第２の受容体が多量体化受容体である、方法。
【請求項27】
請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該リガンド結合ドメインがサイトカイン受容体に由来する、方法。
【請求項28】
請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該リガンド結合ドメインが１型サイトカイン受容体（ＣＲ）に由来する、方法。
【請求項29】
請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該リガンド結合ドメインがエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）またはレプチン受容体（ＬＲ）に由来する、方法。
【請求項30】
請求項２９の方法であって、ここで該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体（ＬＲ）に由来する、方法。
【請求項31】
請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該ベイトが、該第１の受容体および／または第２の受容体断片に対して異種である、方法。
【請求項32】
請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該細胞内ドメインがＪＡＫ結合部位および／またはｇｐ１３０を含む受容体断片を含む、方法。
【請求項33】
請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該ＳＴＡＴがＳＴＡＴ１またはＳＴＡＴ３から選択される、方法。
【請求項34】
請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法であって、ここでＳＴＡＴの動員を低減または排除する該変異が１か所以上のチロシンリン酸化部位において起こる、方法。
【請求項35】
請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体（ＬＲ）に由来し、該変異がＹ９８５、Ｙ１０７７、およびＹ１１３８の位置のうちの１か所以上である、方法。
【請求項36】
請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体（ＬＲ）に由来し、該変異がＹ９８５Ｆ、Ｙ１０７７Ｆ、およびＹ１１３８Ｆである、方法。
【請求項37】
請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが、マウスレプチン受容体（ＬＲ）のＹ９８５Ｆ、Ｙ１０７７Ｆ、およびＹ１１３８Ｆと機能的に同等の変異を有する、方法。
【請求項38】
請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該ベイト蛋白質が核外搬出配列（ＮＥＳ）を含む、方法。
【請求項39】
請求項３８の方法であって、ここで該ＮＥＳが１～４個の疎水性残基を有する、方法。
【請求項40】
請求項３９の方法であって、ここで該疎水性残基がロイシンである、方法。
【請求項41】
請求項３８～４０のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該ＮＥＳが配列ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬを有し、ここでＬが疎水性残基であり、ｘは他の任意のアミノ酸である、方法。
【請求項42】
請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該ＮＥＳが配列ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬを有し、ここでＬがロイシンであり、ｘは他の任意のアミノ酸である、方法。
【請求項43】
前記請求項のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該ベイトがＥ３リガーゼ基質結合サブユニットであり、任意選択的にセレブロン（ＣＲＢＮ）およびフォン・ヒッペル・リンドウ（Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ：ＶＨＬ）（ＶＨＬ）から選択され、および任意選択的に足場蛋白質に会合しており、該足場蛋白質が損傷ＤＮＡ結合蛋白質１（ＤＤＢ１）、カリン４Ａ（ＣＵＬ４Ａ）、およびカリン１の制御因子（ＲＯＣ１）から任意選択的に選択される、方法。
【請求項44】
請求項４３の方法であって、ここで該プレイ蛋白質との相互作用前に、該ベイトが化合物に接触している、方法。
【請求項45】
請求項４４の方法であって、ここで該化合物がグルタルイミド環およびフタルイミド環を含む、方法。
【請求項46】
請求項４５の方法であって、ここで該化合物が、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ＣＣ－２２０、ＣＣ－１２２、ＣＣ－８８５、またはその誘導体または類似体から選択される、方法。
【請求項47】
前記請求項のいずれかに記載の方法であって、ここで該方法が複数の細胞をアッセイすることを含み、該複数の細胞がリガンド依存性キメラ受容体を含み、該リガンド依存性キメラ受容体が：（ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
（ｉｉ）第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内プレイ蛋白質、
を含む、方法。
【請求項48】
請求項４７の方法であって、ここで単一ベイト蛋白質が各細胞中に発現する、方法。
【請求項49】
請求項４７の方法であって、ここで単一ベイト蛋白質を複数のプレイ蛋白質との分子相互作用に関してアッセイする、方法。
【請求項50】
前記請求項のいずれかに記載の方法であって、ここで該方法が新規蛋白質／蛋白質相互作用を同定する、方法。
【請求項51】
前記請求項のいずれかに記載の方法であって、ここで該方法が、該低分子と該プレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって媒介される新規蛋白質／蛋白質相互作用を同定する、方法。
【請求項52】
前記請求項のいずれかに記載の方法であって、ここで該方法が、該プレイ蛋白質およびベイト蛋白質を含む蛋白質／蛋白質相互作用を誘導、媒介または安定化する低分子化合物を同定する、方法。
【請求項53】
請求項５２の方法であって、ここで該低分子化合物が分子糊またはハイブリッドリガンドである、方法。
【請求項54】
請求項１～４２または４７～５３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該ベイトがＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）である、方法。
【請求項55】
請求項１～４２または４７～５４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該ＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）がＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ３８およびＦＫＢＰ５２から選択される、方法。
【請求項56】
請求項５５の方法であって、ここで該化合物が、ＦＫ５０６（タクロリムス）、ラパマイシン（シロリムス）、およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはその誘導体または類似体；あるいはＦＫ５０６（タクロリムス）、ラパマイシン（シロリムス）、およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはその誘導体または類似体と同一のＦＫＢＰベイト結合部位に競争的に結合する化合物から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、とりわけ蛋白質／蛋白質相互作用または蛋白質／低分子相互作用、および／または新規低分子の検出および同定に関する。
【0002】
関連する出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月１７日付けで出願された米国仮出願番号第６２／９４９，０２３号に基づく優先権を主張する。その優先出願の開示内容全体が本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０１９年１２月１７日付けで出願された米国仮出願番号第６２／９４９，０２３号に基づく優先権を主張する。その優先出願の開示内容全体が本明細書に組み入れられる。
【0003】
電子提出のテキストファイルについての説明
本明細書に付帯する電子提出のテキストファイルの内容は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる：配列表のコンピューター可読性形態のコピー（ファイル名：「ＯＲＮ－０６０ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」；作成日：２０２０年１２月７日；ファイルサイズ：１０，３４９バイト）。
本明細書に付帯する電子提出のテキストファイルの内容は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる：配列表のコンピューター可読性形態のコピー（ファイル名：「ＯＲＮ－０６０ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」；作成日：２０２０年１２月７日；ファイルサイズ：１０，３４９バイト）。
【背景技術】
【0004】
蛋白質／蛋白質相互作用および蛋白質／低分子相互作用などの分子相互作用は、全ての生物学的過程ではなくとも、多くの生物学的過程にとっては重要な部分である。分子相互作用を同定するために、複数のアプローチが開発されている。例えば、生化学アプローチは特に、共精製、免疫共沈降を含む。しかし、これらの技術は退屈であって、大規模高速スクリーニングを可能とするものではなく、また溶解を必要とするので正常な細胞の状況が喪失する。遺伝子的アプローチは、これらの問題の一部を解決する。例えば、酵母２ハイブリッド法は卓越した有用性を示してきた。しかしながら、広く用いられているにもかかわらず、酵母２ハイブリッドシステムには複数の欠点がある；そのような欠点としては、融合蛋白質の核内移行を必要とすることが挙げられる。もう一つの別のアプローチとしては、ファージディスプレイがあるが、これは核内移行を必要とはしない。しかし、ファージディスプレイアプローチは不自然過ぎる；すなわち、蛋白質をファージ表面に露出させる必要があり、生理的に妥当であるとは言えない環境に蛋白質を曝露するため、それが生細胞の相互作用と同等であると判断することは困難である。
【0005】
すなわち、分子相互作用を検出する新規の方法に対する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【0006】
したがって、本発明は部分的には、細胞を基盤とした、様々な分子相互作用を検出するシステムに関する。いくつかの実施態様においては、本発明は、標準的アッセイを用いた場合には検出可能ではない分子相互作用（例えば、蛋白質／蛋白質、蛋白質／低分子、および／または低分子によって調節される蛋白質／蛋白質相互作用）の試験を可能にする方法を提供する。例えば、いくつかの実施態様において、本法は偽陽性または偽陰性シグナルの発生を低減または排除する。
【0007】
いくつかの実施態様においては、本法は公知の方法と相対的にベイトとプレイを逆転させることを利用する；例えば、改善された分子相互作用検出を可能にする、サイトカイン受容体を基盤とする相互作用的捕捉法および本明細書中に記載のような方法など。
【0008】
例えば、本明細書に記載するように、「順」型の哺乳動物蛋白質／蛋白質相互作用捕捉（ＭＡＰＰＩＴに関しては、Ｅｙｃｋｅｒｍａｎらの「サイトカイン受容体を基盤とする相互作用捕捉の設計と応用（Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｒａｐ）」 Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００１ Ｄｅｃ；３（１２）：１１１４－９；およびＬｉｅｖｅｎｓらの「ヒト細胞におけるプロテオームスケールの２蛋白質インタラクトミックス（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｂｉｎａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ）」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １５．１２ （２０１６）： ３６２４－３６３９）を参照のこと；これらの参考文献はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）は、場合によっては、うまく機能しないこともある。本発明の様々な実施態様では、例えば、方法設計を逆にすることにより、これらの不具合を解消する。例えば、様々な実施態様において、例えば、（本明細書に記載の）順ＭＡＰＰＩＴアッセイ形態で発現した場合に、例えば、相互作用パートナーが細胞の核または／細胞内微小器官に隔離された状態であるために、順ＭＡＰＰＩＴ法では明確に同定されない相互作用であっても、本法ではそのような相互作用の検出および／または発見を可能にする。さらに一例を挙げれば、いくつかの実施態様において、順ＭＡＰＰＩＴアッセイ形態で発現した場合に、そのアッセイ形態で発現した相互作用パートナーが細胞の膜に非特異的に接触するために、および／またはこの検出に利用している膜を基盤とした構築物に非特異的に接触するために、順ＭＡＰＰＩＴ法では明確に同定されない相互作用であっても、本法ではそのような相互作用の検出を可能にする。
【0009】
様々な実施態様においては、本発明は分子相互作用を検出する方法に関するが、ここで該方法は：
（ａ）リガンドを基盤とするキメラ受容体を有する細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が、
（ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
（ｉｉ）第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内プレイ蛋白質、
を含み、
ここで該第２の受容体の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインがＳＴＡＴ（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：シグナル伝達因子および転写活性化因子）の動員を低減または排除する変異を含む膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインである、
細胞を提供すること；
（ｂ）受容体断片に融合したベイト蛋白質を細胞中で発現させることであって、
ここで該受容体断片が機能的ＳＴＡＴ動員部位を含む、
発現させること、
および
（ｃ）分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出することであって、
ここで該ベイト蛋白質が、
（ｉ）膜結合細胞内微小器官の内部よりも細胞質に局在する傾向を有し、
および／または
（ｉｉ）細胞膜および／またはキメラ受容体の非プレイ部分との非特異的相互作用よりもプレイ蛋白質と特異的に相互作用する傾向を有する、
シグナルを検出すること、
によって分子相互作用を検出する。
実施態様においては、該第１の受容体および第２の受容体は同一の受容体である。
（ａ）リガンドを基盤とするキメラ受容体を有する細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が、
（ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
（ｉｉ）第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内プレイ蛋白質、
を含み、
ここで該第２の受容体の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインがＳＴＡＴ（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：シグナル伝達因子および転写活性化因子）の動員を低減または排除する変異を含む膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインである、
細胞を提供すること；
（ｂ）受容体断片に融合したベイト蛋白質を細胞中で発現させることであって、
ここで該受容体断片が機能的ＳＴＡＴ動員部位を含む、
発現させること、
および
（ｃ）分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出することであって、
ここで該ベイト蛋白質が、
（ｉ）膜結合細胞内微小器官の内部よりも細胞質に局在する傾向を有し、
および／または
（ｉｉ）細胞膜および／またはキメラ受容体の非プレイ部分との非特異的相互作用よりもプレイ蛋白質と特異的に相互作用する傾向を有する、
シグナルを検出すること、
によって分子相互作用を検出する。
実施態様においては、該第１の受容体および第２の受容体は同一の受容体である。
【0010】
いくつかの実施態様においては、プレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、第１の受容体に融合した第２の受容体の細胞内ドメインに対して、受容体断片の動員を引き起こすので、リガンド依存性受容体シグナル伝達が回復し、ＳＴＡＴ分子の活性化が起こる。いくつかの実施態様においては、該細胞はＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子を含む。いくつかの実施態様においては、活性化したＳＴＡＴ分子は核内に移行してＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子の転写を誘導するので、このレポーター遺伝子シグナルによって分子相互作用の検出が可能となる。
【0011】
いくつかの実施態様においては、該分子相互作用は蛋白質／蛋白質相互作用である。いくつかの実施態様においては、該分子相互作用は低分子が仲介する蛋白質／蛋白質相互作用である（例えば、該方法はプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することをさらに含む）。具体的には、いくつかの実施態様において、該分子相互作用は、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合することによって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用である。例えば、本法は複合体形成を検出するものであってもよい。いくつかの実施態様において、該低分子はプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との相互作用を可能にするプレイ蛋白質またはベイト蛋白質の疎水性表面の露出を誘導する。いくつかの実施態様においては、該低分子は分子糊または二価ハイブリッドリガンド分子（例えば、ＰＲＯＴＡＣが挙げられるが、これのみに限定されるものではない）である。
【0012】
一例を挙げれば、いくつかの実施態様においては、検出する相互作用は、限定されるものではないが例えば、免疫調節薬剤（ＩＭｉＤ）、例えば、サリドマイド、レナリドミドおよびポマリドミド、およびそれに関連する化合物；および／またはセレブロン（ＣＲＢＮ）蛋白質の同一または類似の部位（ポケット）に結合する化合物であって、いくつかの実施態様においては、本「逆」アッセイの受容体断片に融合した（または間接的に結合した）ベイトである化合物に接触しているＥ３リガーゼ蛋白質を含む。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ＭＡＰＰＩＴの概念を示す。ベイト蛋白質（「Ｂ」）はキメラ受容体のＣ末端に融合しているが、このキメラ受容体は、例えば、Ｉ型サイトカイン受容体（「ＣＹＴ」）の細胞外部分、ならびに突然変異生成によってＳＴＡＴ動員が不全となるように作成された受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを有する。機能性ＳＴＡＴ動員部位を含む受容体断片に融合しているプレイ蛋白質（「Ｐ」）を共発現した場合に、その受容体複合体は機能的に相補し、サイトカインリガンド刺激時に（Ｌ）シグナル伝達を回復する。ＳＴＡＴ分子が活性化して核内に移行し、ＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子の転写を誘導する。本開示全体を通じて、この方式を「順」アッセイとよぶ。
【図2A】図１のシステムの不全、すなわち偽陰性シグナルの発生に関する概要を示す。ここで、膜構築物に融合したベイトに、プレイが近づくことができない、例えば、それは核および／または細胞内微小器官に隔離されていることによる（左パネル）。右パネルは、隔離からプレイを開放するベイトとプレイの間の逆転を示しており、それによって分子相互作用の検出が可能になる（本開示全体を通じて、この方式を「逆」アッセイとよぶ）。
【図2B】図１のシステムのさらなる不全、すなわち偽陰性シグナルの発生に関する別の一例に関する概要を示す。ここで、プレイは膜構築物に非特異的に相互作用する（左パネル）。右パネルは、非特異的相互作用を弱める／減らすための、ベイトとプレイの間の逆転を示している（右パネル；本開示全体を通じて、この方式を「逆」アッセイとよぶ）。
【図3】「逆」アッセイの別の構築に関する概要を示す。この構築では、低分子および／またはプレイと相互作用可能なベイトは足場蛋白質と会合する。網掛け表示のセグメントは、細胞中で独立に発現させる、あるいはベイト蛋白質との直接融合物として発現させる足場蛋白質である。
【図4A】ＭＡＰＰＩＴ順および／または逆アッセイ構成による、選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。文献に記載されている公知のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンドであるレナリドミドおよびＣＣ－２２０によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴで評価した。ＭＡＰＰＩＴは既に報告されている２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。より具体的には、ＭＡＰＰＩＴアッセイの「順」および「逆」アッセイモードとよぶ２種類の構成を比較した。これら２種類の構成間の相違は、実施例１においてより具体的に概説するように、ベイト蛋白質が、この場合にはＣＲＢＮであるが、（古典的な「順」モードにおいて）ＭＡＰＰＩＴキメラ膜貫通受容体に融合されているか、あるいは（「逆」モードにおいて）可溶性ｇｐ１３０受容体部分に融合されているかの違いである。両方のアッセイ構成のいずれにおいても、ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用（すなわち、表示ネオ基質：ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＩＫＺＦ２、ＳＡＬＬ４、ＺＦＰ９１またはＣＳＮＫ１Ａ（ＣＫ１ａ）との相互作用）を促進する促進能をモニターするために、被検化合物の活性を、被検化合物濃度を増加させながら評価した（用量応答試験）。図から分かるように、ＩＫＺＦ１の場合には、順および逆アッセイ構成において、化合物誘導性のＣＲＢＮ結合が検出可能であるが、それ以外の場合には全て、逆アッセイ設定においてのみ、相互作用シグナル応答の検出が可能であった。
【図4B】ＭＡＰＰＩＴ順および／または逆アッセイ構成による、選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。文献に記載されている公知のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンドであるレナリドミドおよびＣＣ－２２０によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴで評価した。ＭＡＰＰＩＴは既に報告されている２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。より具体的には、ＭＡＰＰＩＴアッセイの「順」および「逆」アッセイモードとよぶ２種類の構成を比較した。これら２種類の構成間の相違は、実施例１においてより具体的に概説するように、ベイト蛋白質が、この場合にはＣＲＢＮであるが、（古典的な「順」モードにおいて）ＭＡＰＰＩＴキメラ膜貫通受容体に融合されているか、あるいは（「逆」モードにおいて）可溶性ｇｐ１３０受容体部分に融合されているかの違いである。両方のアッセイ構成のいずれにおいても、ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用（すなわち、表示ネオ基質：ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＩＫＺＦ２、ＳＡＬＬ４、ＺＦＰ９１またはＣＳＮＫ１Ａ（ＣＫ１ａ）との相互作用）を促進する促進能をモニターするために、被検化合物の活性を、被検化合物濃度を増加させながら評価した（用量応答試験）。図から分かるように、ＩＫＺＦ１の場合には、順および逆アッセイ構成において、化合物誘導性のＣＲＢＮ結合が検出可能であるが、それ以外の場合には全て、逆アッセイ設定においてのみ、相互作用シグナル応答の検出が可能であった。
【図4C】ＭＡＰＰＩＴ順および／または逆アッセイ構成による、選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。文献に記載されている公知のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンドであるレナリドミドおよびＣＣ－２２０によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴで評価した。ＭＡＰＰＩＴは既に報告されている２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。より具体的には、ＭＡＰＰＩＴアッセイの「順」および「逆」アッセイモードとよぶ２種類の構成を比較した。これら２種類の構成間の相違は、実施例１においてより具体的に概説するように、ベイト蛋白質が、この場合にはＣＲＢＮであるが、（古典的な「順」モードにおいて）ＭＡＰＰＩＴキメラ膜貫通受容体に融合されているか、あるいは（「逆」モードにおいて）可溶性ｇｐ１３０受容体部分に融合されているかの違いである。両方のアッセイ構成のいずれにおいても、ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用（すなわち、表示ネオ基質：ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＩＫＺＦ２、ＳＡＬＬ４、ＺＦＰ９１またはＣＳＮＫ１Ａ（ＣＫ１ａ）との相互作用）を促進する促進能をモニターするために、被検化合物の活性を、被検化合物濃度を増加させながら評価した（用量応答試験）。図から分かるように、ＩＫＺＦ１の場合には、順および逆アッセイ構成において、化合物誘導性のＣＲＢＮ結合が検出可能であるが、それ以外の場合には全て、逆アッセイ設定においてのみ、相互作用シグナル応答の検出が可能であった。
【図4D】ＭＡＰＰＩＴ順および／または逆アッセイ構成による、選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。文献に記載されている公知のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンドであるレナリドミドおよびＣＣ－２２０によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴで評価した。ＭＡＰＰＩＴは既に報告されている２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。より具体的には、ＭＡＰＰＩＴアッセイの「順」および「逆」アッセイモードとよぶ２種類の構成を比較した。これら２種類の構成間の相違は、実施例１においてより具体的に概説するように、ベイト蛋白質が、この場合にはＣＲＢＮであるが、（古典的な「順」モードにおいて）ＭＡＰＰＩＴキメラ膜貫通受容体に融合されているか、あるいは（「逆」モードにおいて）可溶性ｇｐ１３０受容体部分に融合されているかの違いである。両方のアッセイ構成のいずれにおいても、ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用（すなわち、表示ネオ基質：ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＩＫＺＦ２、ＳＡＬＬ４、ＺＦＰ９１またはＣＳＮＫ１Ａ（ＣＫ１ａ）との相互作用）を促進する促進能をモニターするために、被検化合物の活性を、被検化合物濃度を増加させながら評価した（用量応答試験）。図から分かるように、ＩＫＺＦ１の場合には、順および逆アッセイ構成において、化合物誘導性のＣＲＢＮ結合が検出可能であるが、それ以外の場合には全て、逆アッセイ設定においてのみ、相互作用シグナル応答の検出が可能であった。
【図4E】ＭＡＰＰＩＴ順および／または逆アッセイ構成による、選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。文献に記載されている公知のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンドであるレナリドミドおよびＣＣ－２２０によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴで評価した。ＭＡＰＰＩＴは既に報告されている２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。より具体的には、ＭＡＰＰＩＴアッセイの「順」および「逆」アッセイモードとよぶ２種類の構成を比較した。これら２種類の構成間の相違は、実施例１においてより具体的に概説するように、ベイト蛋白質が、この場合にはＣＲＢＮであるが、（古典的な「順」モードにおいて）ＭＡＰＰＩＴキメラ膜貫通受容体に融合されているか、あるいは（「逆」モードにおいて）可溶性ｇｐ１３０受容体部分に融合されているかの違いである。両方のアッセイ構成のいずれにおいても、ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用（すなわち、表示ネオ基質：ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＩＫＺＦ２、ＳＡＬＬ４、ＺＦＰ９１またはＣＳＮＫ１Ａ（ＣＫ１ａ）との相互作用）を促進する促進能をモニターするために、被検化合物の活性を、被検化合物濃度を増加させながら評価した（用量応答試験）。図から分かるように、ＩＫＺＦ１の場合には、順および逆アッセイ構成において、化合物誘導性のＣＲＢＮ結合が検出可能であるが、それ以外の場合には全て、逆アッセイ設定においてのみ、相互作用シグナル応答の検出が可能であった。
【図4F】ＭＡＰＰＩＴ順および／または逆アッセイ構成による、選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。文献に記載されている公知のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンドであるレナリドミドおよびＣＣ－２２０によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴで評価した。ＭＡＰＰＩＴは既に報告されている２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。より具体的には、ＭＡＰＰＩＴアッセイの「順」および「逆」アッセイモードとよぶ２種類の構成を比較した。これら２種類の構成間の相違は、実施例１においてより具体的に概説するように、ベイト蛋白質が、この場合にはＣＲＢＮであるが、（古典的な「順」モードにおいて）ＭＡＰＰＩＴキメラ膜貫通受容体に融合されているか、あるいは（「逆」モードにおいて）可溶性ｇｐ１３０受容体部分に融合されているかの違いである。両方のアッセイ構成のいずれにおいても、ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用（すなわち、表示ネオ基質：ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＩＫＺＦ２、ＳＡＬＬ４、ＺＦＰ９１またはＣＳＮＫ１Ａ（ＣＫ１ａ）との相互作用）を促進する促進能をモニターするために、被検化合物の活性を、被検化合物濃度を増加させながら評価した（用量応答試験）。図から分かるように、ＩＫＺＦ１の場合には、順および逆アッセイ構成において、化合物誘導性のＣＲＢＮ結合が検出可能であるが、それ以外の場合には全て、逆アッセイ設定においてのみ、相互作用シグナル応答の検出が可能であった。
【図5】免疫蛍光染色は、ＩＫＺＦ３ ｇｐ１３０融合構築物が核内に局在することを示しており、このことは、対応するＭＡＰＰＩＴ順アッセイにおいてシグナルが欠如することの理由を説明する。実施例１においてさらに詳細に考察されるように、ＭＡＰＰＩＴアッセイにおいて特定の相互作用を検出不能にする原因の１つは、アッセイに用いる目的の標的蛋白質のｇｐ１３０ドメイン融合物が細胞内細胞質区画で発現せず、そのため膜結合ベイト蛋白質と複合体を形成できないことなどがあり得る。図４Ａ～Ｆに示す１例はＩＫＺＦ３との相互作用であるが、この場合にＣＲＢＮについて化合物誘導性動員が検出可能であったのは逆モードのみであり、順アッセイ構成では検出されなかった。後者の順アッセイ構成においては、ＣＲＢＮのＭＡＰＰＩＴキメラ受容体融合物をｇｐ１３０－ＩＫＺＦ３融合蛋白質と組み合わせて用いる。ここでは、ｇｐ１３０－ＩＫＺＦ３融合蛋白質の免疫蛍光染色を行った。ｇｐ１３０－ＩＫＺＦ１融合蛋白質を対照として用いた；理由は、順モードではＣＲＢＮ－ＩＫＺＦ１相互作用が検出可能であったからである。免疫蛍光像において、ＩＫＺＦ１に関しては、細胞質内にｇｐ１３０融合蛋白質を示す緑色染色を観察することができるが、ＩＫＺＦ３融合の場合には、その発現は専ら核内区画（青色染色として可視化されている）にのみほぼ限定された。このことは、ＣＲＢＮ／ＩＫＺＦ３相互作用が順ＭＡＰＰＩＴ構成ではアッセイ不能であり、逆モードでのみ可能である理由を説明する；逆モードでは、ＩＫＺＦ３が細胞質に露出した状態でＭＡＰＰＩＴ膜受容体に連結されており、そのため細胞質に存在するＣＲＢＮベイト蛋白質との相互作用に利用可能である。
【図6】ＭＡＰＰＩＴ結合分析は、ＣＳＮＫ１Ａ１－ｇｐ１３０融合蛋白質がＭＡＰＰＩＴキメラ受容体構築物に対して非特異的な強い結合を示すので、ＣＲＢＮ相互作用アッセイにおいて分子糊非存在下でのバックグラウンドレポーターシグナルが高くなることを示しており、順アッセイ構成での当該相互作用について化合物／分子糊誘導性応答特異性が存在しないことの理由を説明する。実施例１に記載のように、特定標的について順構成のＭＡＰＰＩＴが化合物誘導性相互作用を検出し得ないことがあるもう一つの理由は、クローン化しｇｐ１３０融合蛋白質として発現した場合に、これらの標的がベイト蛋白質ではないＭＡＰＰＩＴキメラ受容体の構成要素（レプチン受容体の細胞質内の末尾または受容体結合ＪＡＫ２蛋白質など）に対して高親和性を示すからである。このような場合の一例としては、図４Ａ～Ｆに示すＣＳＮＫ１Ａ１（またはＣＫ１ａ）であるが、この場合には逆ＭＡＰＰＩＴ設定においてのみレナリドミド誘導性またはＣＣ－２２０誘導性の特異的シグナルを明確に示し、順ＭＡＰＰＩＴ設定ではそのようなシグナルが得られない。ここでは、ＭＡＰＰＩＴキメラ受容体融合物または無関連の大腸菌ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）蛋白質とＣＲＢＮベイトとの融合物に対する結合に関して、ＣＳＮＫ１Ａ１／ｇｐ１３０融合蛋白質（ＭＡＰＰＩＴにおいて用いたｇｐ１３０サブドメインのＮ末端またはＣ末端に融合したＣＳＮＫ１Ａ１）を試験するＭＡＰＰＩＴ結合分析を実施した。相互作用の強度を表すルシフェラーゼレポーターシグナルによって、ＣＳＮＫ１Ａ１－ｇｐ１３０融合物は、両方の受容体融合物と相互作用／結合することが分かるが、このことは、この結合がＣＲＢＮ特異的ではなく、ＣＳＮＫ１Ａ１がキメラ受容体の構成要素そのものと相互作用することを示唆する。ＣＲＢＮ結合蛋白質を評価するために用いるこの構成の場合には、ＣＲＢＮに対する特異的化合物誘導性相互作用の非存在下で得られた強いレポーターシグナルが、特定プレイ／ｇｐ１３０融合物のＣＲＢＮとの相互作用によって誘導される付加的なシグナルをマスクするので、ＣＳＮＫｌＡ１で観察される挙動と類似の挙動を与えるがために、順アッセイ設定が蛋白質のＣＲＢＮ相互作用分析に不適切なものとなる。
【図7】代替的ＣＳＮＫ１Ａ１キメラ受容体融合蛋白質を利用したＭＡＰＰＩＴ逆構成による、化合物依存性ＣＲＢＮ－ＣＳＮＫ１Ａ１相互作用の分析。実施例１で考察するように、ＭＡＰＰＩＴアッセイに複数の受容体融合物構成を用いることができる。典型的な融合蛋白質は、変異レプチン受容体の膜貫通部分および細胞内部分に融合したＥＰＯ受容体の細胞外ドメインから成る；これは、図４Ａ～Ｆ、図６および図８で用いられている構築物である。しかし、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインはレプチン受容体の細胞外ドメインで代替可能であり、その場合にはＥＰＯではなくレプチンで活性化するアッセイシステムが得られる。ここで発明者らは、代替的ＣＳＮＫ１Ａ１受容体融合物との組み合わせでＣＲＢＮ ｇｐ１３０融合物を用い、図４Ａ～Ｆに示されるレナリドミド誘導性およびＣＣ－２２０誘導性ＣＲＢＮ－ＣＳＮＫ１Ａ１相互作用を再び試験した；この場合には、ＥＰＯ受容体の細胞外ドメインの代わりに、レプチン受容体の細胞外ドメインを用い、アッセイの活性化はレプチンで行った。この代替的受容体構築物でも、逆アッセイ構成であればＣＳＮＫ１Ａ１ネオ基質動員の検出が可能であることを、この結果は示している。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０μＭ、その右隣のバーは０．１μＭ、さらにその右隣のバーは１μＭ、また最も右のバーが１０μＭを表す。
【図8A】ＭＡＰＰＩＴ順および逆アッセイ構成による、化合物依存性ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）／標的相互作用の評価。ＣＲＢＮ標的相互作用についての図４Ａ～Ｆの分析と同様に、公知の標的蛋白質に対するＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）の化合物依存性相互作用をＭＡＰＰＩＴ順構成および逆構成で評価した。図から分かるように、ＭＡＰＰＩＴ順および逆モードの両方で、ＭＴＯＲのラパマイシン誘導性動員を検出した。同様に、カルシニューリン触媒性ＰＰＰ３ＣＡサブユニットのＦＫ５０６依存性結合もまた両方のアッセイモードでモニター可能である。注目すべきは、カルシニューリン結合の場合には、ＰＰＰ３Ｒ２調節性サブユニットの共発現によって、両方のアッセイ構成でシグナル窓が有意に増加することである；ただし、順モードに比較して逆モードではその程度が小さい。
【図8B】ＭＡＰＰＩＴ順および逆アッセイ構成による、化合物依存性ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）／標的相互作用の評価。ＣＲＢＮ標的相互作用についての図４Ａ～Ｆの分析と同様に、公知の標的蛋白質に対するＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）の化合物依存性相互作用をＭＡＰＰＩＴ順構成および逆構成で評価した。図から分かるように、ＭＡＰＰＩＴ順および逆モードの両方で、ＭＴＯＲのラパマイシン誘導性動員を検出した。同様に、カルシニューリン触媒性ＰＰＰ３ＣＡサブユニットのＦＫ５０６依存性結合もまた両方のアッセイモードでモニター可能である。注目すべきは、カルシニューリン結合の場合には、ＰＰＰ３Ｒ２調節性サブユニットの共発現によって、両方のアッセイ構成でシグナル窓が有意に増加することである；ただし、順モードに比較して逆モードではその程度が小さい。
【図8C】ＭＡＰＰＩＴ順および逆アッセイ構成による、化合物依存性ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）／標的相互作用の評価。ＣＲＢＮ標的相互作用についての図４Ａ～Ｆの分析と同様に、公知の標的蛋白質に対するＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）の化合物依存性相互作用をＭＡＰＰＩＴ順構成および逆構成で評価した。図から分かるように、ＭＡＰＰＩＴ順および逆モードの両方で、ＭＴＯＲのラパマイシン誘導性動員を検出した。同様に、カルシニューリン触媒性ＰＰＰ３ＣＡサブユニットのＦＫ５０６依存性結合もまた両方のアッセイモードでモニター可能である。注目すべきは、カルシニューリン結合の場合には、ＰＰＰ３Ｒ２調節性サブユニットの共発現によって、両方のアッセイ構成でシグナル窓が有意に増加することである；ただし、順モードに比較して逆モードではその程度が小さい。
【図9】ＭＡＰＰＩＴ逆構成では、ＣＲＢＮとＤＨＦＲとの間のトリメトプリム－レナリドミド・ハイブリッドリガンド誘導性結合の検出が可能である。ＰＥＧリンカーを介して、ＣＲＢＮリガンドであるレナリドミドに融合したＤＨＦＲリガンド・トリメトプリム（ＴＭＰ）から成るハイブリッド分子を、ＭＡＰＰＩＴアッセイに用いてＣＲＢＮベイトへのＤＨＦＲ動員を誘導した。図から分かるように、ｇｐ１３０融合物として発現したＣＲＢＮおよびＭＡＰＰＩＴキメラ膜受容体に連結したＤＨＦＲを用いた逆アッセイ構成では、ＴＭＰ－ＬＥＮ用量依存性シグナルを観察することができる。
【図10A】ＩＭｉＤおよびその他の分子糊のＣＲＢＮ結合を評価するＣＲＢＮ逆ＭＡＰＰＩＴアッセイの利用。ここでは、競争的設定でＣＲＢＮ分子糊の結合を評価するために、図９に記載の逆ＭＡＰＰＩＴ ＴＭＰ－ＬＥＮ依存性ＤＨＦＲ－ＣＲＢＮ結合アッセイを用いた。図９のようなＴＭＰ－ＬＥＮハイブリッドリガンドを添加することによって陽性アッセイシグナルを生成するように、導入遺伝子（ＤＨＦＲおよびＣＲＢＮ融合蛋白質）をコードする適切なｃＤＮＡで形質転換した細胞を用いた。当該グナルを１００％ルシフェラーゼ活性に設定する。別々の試料設定において、細胞は同一の方法で調製したが、さらにそれらの細胞を、ＣＲＢＮとの相互作用を調べる被検化合物と共にインキュベートした。ＣＲＢＮ融合蛋白質に対する結合はハイブリッドリガンドの同一ＣＲＢＮ蛋白質への結合と競合するので、アッセイシグナルの生成に必要である三重複合体形成を阻止することにより、アッセイシグナルを阻害する。生細胞を用いたこの種のリガンド競争実験において決定されるようなＣＲＢＮ結合効率を求めるために、被検化合物の濃度を増加させて評価を行った。図から分かるように、公知のＩＭｉＤ化合物（レナリドミド／ＬＥＮ、ポマリドミド／ＰＯＭ、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０）は、ＣＲＢＮへの結合に関してレナリドミド・ハイブリッドリガンドと有効に競合した（ＣＲＢＮ会合アッセイシグナル阻害に関する用量応答曲線）。同様に、他の種類の化合物も様々なレベルの効能で有効に競合した。シグナル阻害特異性は並列的実験設定で評価するが、その設定においては、ハイブリッドリガンド非存在下でＤＨＦＲ受容体融合蛋白質に直接結合（すなわち、蛋白質の直接相互作用）する対照ｇｐ－１３０融合蛋白質（ＣＴＲＬ）によって生成したシグナルの阻害に関して、被検化合物の効果を評価する。
【図10B】ＩＭｉＤおよびその他の分子糊のＣＲＢＮ結合を評価するＣＲＢＮ逆ＭＡＰＰＩＴアッセイの利用。ここでは、競争的設定でＣＲＢＮ分子糊の結合を評価するために、図９に記載の逆ＭＡＰＰＩＴ ＴＭＰ－ＬＥＮ依存性ＤＨＦＲ－ＣＲＢＮ結合アッセイを用いた。図９のようなＴＭＰ－ＬＥＮハイブリッドリガンドを添加することによって陽性アッセイシグナルを生成するように、導入遺伝子（ＤＨＦＲおよびＣＲＢＮ融合蛋白質）をコードする適切なｃＤＮＡで形質転換した細胞を用いた。当該グナルを１００％ルシフェラーゼ活性に設定する。別々の試料設定において、細胞は同一の方法で調製したが、さらにそれらの細胞を、ＣＲＢＮとの相互作用を調べる被検化合物と共にインキュベートした。ＣＲＢＮ融合蛋白質に対する結合はハイブリッドリガンドの同一ＣＲＢＮ蛋白質への結合と競合するので、アッセイシグナルの生成に必要である三重複合体形成を阻止することにより、アッセイシグナルを阻害する。生細胞を用いたこの種のリガンド競争実験において決定されるようなＣＲＢＮ結合効率を求めるために、被検化合物の濃度を増加させて評価を行った。図から分かるように、公知のＩＭｉＤ化合物（レナリドミド／ＬＥＮ、ポマリドミド／ＰＯＭ、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０）は、ＣＲＢＮへの結合に関してレナリドミド・ハイブリッドリガンドと有効に競合した（ＣＲＢＮ会合アッセイシグナル阻害に関する用量応答曲線）。同様に、他の種類の化合物も様々なレベルの効能で有効に競合した。シグナル阻害特異性は並列的実験設定で評価するが、その設定においては、ハイブリッドリガンド非存在下でＤＨＦＲ受容体融合蛋白質に直接結合（すなわち、蛋白質の直接相互作用）する対照ｇｐ－１３０融合蛋白質（ＣＴＲＬ）によって生成したシグナルの阻害に関して、被検化合物の効果を評価する。
【図11】逆ＭＡＰＰＩＴアッセイ構成を用いた、ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）とＤＨＦＲとの間のＴＭＰ－ＦＫ５０６誘導性結合の検出。ＰＥＧリンカーを介して、ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）リガンドＦＫ５０６に融合したＤＨＦＲリガンド・トリメトプリム（ＴＭＰ）から成るハイブリッド分子を用いて、ＤＨＦＲのＦＫＢＰ１Ａベイトへの化合物誘導性結合を試験した；ＦＫＢＰ１Ａをｇｐ１３０融合物として用い、およびキメラ膜受容体に連結したＤＨＦＲを用いた逆ＭＡＰＰＩＴアッセイ設定で、この試験を行った。図から分かるように、明確な用量依存性ＭＡＰＰＩＴシグナルを観察することが可能であり、このことは、この逆ＭＡＰＰＩＴアッセイ構成によって、ＦＫＢＰ１ＡとＤＨＦＲとの間のＦＫ５０６ハイブリッドリガンド誘導性相互作用を評価可能であることを示す。
【図12】ＭＡＰＰＩＴ逆構成では、ＲＢＭ３９のＤＣＡＦ１５へのスルホンアミド誘導性動員を検出可能であるが、順構成では検出不能である。ＣＲＢＮへの糊誘導性基質動員と同様に、他のＥ３リガーゼの化合物誘導性基質結合も報告が成されている（例えば、ＲＢＭ３９のＤＣＡＦ１５へのスルホンアミド依存性動員）。順構成（ＲＢＭ３９ ｇｐ１３０融合物と共発現したＤＣＡＦ１５受容体融合物）または逆設定（ＤＣＡＦ１５ ｇｐ１３０融合物との組み合わせたＲＢＭ３９受容体融合物）のＭＡＰＰＩＴを用いて、ＲＢＭ３９のＤＣＡＦ１５へのスルホンアミド誘導性動員を評価した。異なるスルホンアミド類を評価した：すなわち、インジスラム（順および逆モード）、ならびにタシスラム、クロロキノキサリンスルホンアミド（ＣＱＳ）およびＥ７８２０（逆モード）である。図から分かるように、逆モードにおいてのみ、用量依存性ルシフェラーゼ・シグナル増加を観察することができた。
【図13A】化合物集合体のスクリーニングによって、ＳＡＬＬ４のＣＲＢＮヘの動員を可能にする新規分子糊を同定する。ＣＲＢＮ ｇｐ１３０融合構築物およびＳＡＬＬ４キメラ受容体融合構築物を共発現する逆ＭＡＰＰＩＴアッセイを用いて、９６種類のＩＭｉＤとＩＭｉＤ様化合物の集合体をスクリーニングした。第１スクリーニングでは、３種類の用量（低、中および高濃度）の化合物の試験を行い、ルシフェラーゼレポーターシグナルを判定した。図１３Ａ～Ｃに示す曲線（左パネル）は、化合物処理試料およびＤＭＳＯ処理対照の両方についてのルシフェラーゼ・シグナル頻度分布を示す。化合物処理試料の曲線は２峰性であり、右にシフトしたピークは、ＤＭＳＯ処理対照よりも高いレポーターシグナルを示す化合物に相当する。応答性を示し、したがってＳＡＬＬ４のＣＲＢＮへの動員を誘導する化合物であることを示す３種類の化合物に関して、用量応答性であること（ヒットしたこと）の確認を右パネルに示す。第１スクリーニングの各試験濃度に対応するシグナルを、用量応答曲線（点線、破線または実線）で用いたものに対応する線種の直線で示す。これらの試料曲線は、ＭＡＰＰＩＴ逆アプローチが広範な効力範囲に渡って分子糊を同定可能であることを示している。
【図13B】化合物集合体のスクリーニングによって、ＳＡＬＬ４のＣＲＢＮヘの動員を可能にする新規分子糊を同定する。ＣＲＢＮ ｇｐ１３０融合構築物およびＳＡＬＬ４キメラ受容体融合構築物を共発現する逆ＭＡＰＰＩＴアッセイを用いて、９６種類のＩＭｉＤとＩＭｉＤ様化合物の集合体をスクリーニングした。第１スクリーニングでは、３種類の用量（低、中および高濃度）の化合物の試験を行い、ルシフェラーゼレポーターシグナルを判定した。図１３Ａ～Ｃに示す曲線（左パネル）は、化合物処理試料およびＤＭＳＯ処理対照の両方についてのルシフェラーゼ・シグナル頻度分布を示す。化合物処理試料の曲線は２峰性であり、右にシフトしたピークは、ＤＭＳＯ処理対照よりも高いレポーターシグナルを示す化合物に相当する。応答性を示し、したがってＳＡＬＬ４のＣＲＢＮへの動員を誘導する化合物であることを示す３種類の化合物に関して、用量応答性であること（ヒットしたこと）の確認を右パネルに示す。第１スクリーニングの各試験濃度に対応するシグナルを、用量応答曲線（点線、破線または実線）で用いたものに対応する線種の直線で示す。これらの試料曲線は、ＭＡＰＰＩＴ逆アプローチが広範な効力範囲に渡って分子糊を同定可能であることを示している。
【図13C】化合物集合体のスクリーニングによって、ＳＡＬＬ４のＣＲＢＮヘの動員を可能にする新規分子糊を同定する。ＣＲＢＮ ｇｐ１３０融合構築物およびＳＡＬＬ４キメラ受容体融合構築物を共発現する逆ＭＡＰＰＩＴアッセイを用いて、９６種類のＩＭｉＤとＩＭｉＤ様化合物の集合体をスクリーニングした。第１スクリーニングでは、３種類の用量（低、中および高濃度）の化合物の試験を行い、ルシフェラーゼレポーターシグナルを判定した。図１３Ａ～Ｃに示す曲線（左パネル）は、化合物処理試料およびＤＭＳＯ処理対照の両方についてのルシフェラーゼ・シグナル頻度分布を示す。化合物処理試料の曲線は２峰性であり、右にシフトしたピークは、ＤＭＳＯ処理対照よりも高いレポーターシグナルを示す化合物に相当する。応答性を示し、したがってＳＡＬＬ４のＣＲＢＮへの動員を誘導する化合物であることを示す３種類の化合物に関して、用量応答性であること（ヒットしたこと）の確認を右パネルに示す。第１スクリーニングの各試験濃度に対応するシグナルを、用量応答曲線（点線、破線または実線）で用いたものに対応する線種の直線で示す。これらの試料曲線は、ＭＡＰＰＩＴ逆アプローチが広範な効力範囲に渡って分子糊を同定可能であることを示している。
【図14】新規分子糊誘導性ＣＲＢＮネオ基質を同定するＯＲＦ ｃＤＮＡライブラリースクリーニング。ここでは、公知のＩＭｉＤ薬剤でありＣＲＢＮリガンドであるＣＣ－２２０に応答して、ＣＲＢＮへと動員される標的について、ヒトＯＲＦ（ｅｏｍｅ）のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする、細胞マイクロアレイを基盤とするスクリーニング形態にＭＡＰＰＩＴ逆アプローチを利用した。細胞内の蛋白質と低分子の相互作用を、アレイ形態の細胞クラスター内でアッセイした。細胞マイクロアレイの各スポットは、ＣＲＢＮとのリガンド誘導性（この場合には、ＣＣ－２２０誘導性）相互作用に関する単一の被検ＯＲＦ／蛋白質候補を発現する前記のような細胞クラスターに対応する。正の相互作用は細胞の蛍光の増加として測定される。多数の個々のＯＲＦ／標的蛋白質候補に渡る／関する細胞マイクロアレイ・スクリーニングの蛍光強度データをドットプロットしたものを示す。Ｘ軸は粒子数を示し、Ｙ軸はマイクロアレイにおける各細胞クラスターの積分強度を示す。図から分かるように、ＯＲＦ ｃＤＮＡの数についてシグナルの有意な誘導が認められる。応答を示し、それゆえにＣＣ－２２０分子糊（矢印で示される）によってＣＲＢＮへと動員される蛋白質であることが示される３種類のＯＲＦ ｃＤＮＡについて、ＣＲＢＮへのＣＣ－２２０用量依存性結合を確認する目的で用量応答曲線を作成した。これらの例は、この逆ＭＡＰＰＩＴスクリーニングアプローチがＣＲＢＮの新規分子糊誘導性基質の同定を可能にすることを示している。
【図15A】ＭＡＰＰＩＴ順および逆構成による、ＦＫＢＰ蛋白質とＭＴＯＲとの間のラパマイシン誘導性結合の同定。ＭＴＯＲ（ＦＲＢドメイン）の動員に関して、ＦＫＢＰ蛋白質ファミリーの異なる構成員（ＦＫＢＰ１Ａ／ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ３、ＦＫＢＰ４およびＦＫＢＰ５）を、順アッセイ構成（ＦＫＢＰ受容体融合物およびＭＴＯＲ ｇｐ１３０融合物）または逆アッセイ構成（ＭＴＯＲ受容体融合物およびＦＫＢＰ ｇｐ１３０融合物）のいずれかのＭＡＰＰＩＴアッセイで評価した。図から分かるように、試験したＦＫＢＰ蛋白質のそれぞれについて、順設定および逆設定の両方で、ラパマイシン依存性シグナルが得られたが、これらは既報に一致するものであった。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０ｎＭのラパマイシン、その右隣のバーは１ｎＭのラパマイシン、さらにその右隣のバーは１０ｎＭのラパマイシン、また最も右のバーが１００ｎＭのラパマイシンを表す。
【図15B】ＭＡＰＰＩＴ順および逆構成による、ＦＫＢＰ蛋白質とＭＴＯＲとの間のラパマイシン誘導性結合の同定。ＭＴＯＲ（ＦＲＢドメイン）の動員に関して、ＦＫＢＰ蛋白質ファミリーの異なる構成員（ＦＫＢＰ１Ａ／ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ３、ＦＫＢＰ４およびＦＫＢＰ５）を、順アッセイ構成（ＦＫＢＰ受容体融合物およびＭＴＯＲ ｇｐ１３０融合物）または逆アッセイ構成（ＭＴＯＲ受容体融合物およびＦＫＢＰ ｇｐ１３０融合物）のいずれかのＭＡＰＰＩＴアッセイで評価した。図から分かるように、試験したＦＫＢＰ蛋白質のそれぞれについて、順設定および逆設定の両方で、ラパマイシン依存性シグナルが得られたが、これらは既報に一致するものであった。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０ｎＭのラパマイシン、その右隣のバーは１ｎＭのラパマイシン、さらにその右隣のバーは１０ｎＭのラパマイシン、また最も右のバーが１００ｎＭのラパマイシンを表す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本開示は、細胞を基盤とするシステムおよび方法であって、標準的アッセイを用いた場合には検出可能ではない分子相互作用（例えば、蛋白質／蛋白質、蛋白質／低分子、および／または低分子によって調節される蛋白質／蛋白質相互作用）の試験を可能にするシステムおよび方法の発見に部分的には基づく。一局面において、本法は分子相互作用を検出する方法を可能にするが、ここで該方法は：
（ａ）リガンドを基盤とするキメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該リガンドを基盤とするキメラ受容体が、
（ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
（ｉｉ）第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内プレイ蛋白質、
ここで該第２の受容体の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインがＳＴＡＴの動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること；
（ｂ）受容体断片に融合したベイト蛋白質を細胞中で発現させることであって、
ここで該受容体断片が機能的ＳＴＡＴ動員部位を含む、
発現させること、
および
（ｃ）分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出することであって、
ここで該ベイト蛋白質が、
（ｉ）膜結合細胞内微小器官の内部よりも細胞質に局在する傾向を有し、
および／または
（ｉｉ）細胞膜および／またはキメラ受容体の非プレイ部分との非特異的相互作用よりもプレイ蛋白質と特異的相互作用する傾向を有する、
シグナルを検出すること、
を含む。
（ａ）リガンドを基盤とするキメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該リガンドを基盤とするキメラ受容体が、
（ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
（ｉｉ）第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内プレイ蛋白質、
ここで該第２の受容体の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインがＳＴＡＴの動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること；
（ｂ）受容体断片に融合したベイト蛋白質を細胞中で発現させることであって、
ここで該受容体断片が機能的ＳＴＡＴ動員部位を含む、
発現させること、
および
（ｃ）分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出することであって、
ここで該ベイト蛋白質が、
（ｉ）膜結合細胞内微小器官の内部よりも細胞質に局在する傾向を有し、
および／または
（ｉｉ）細胞膜および／またはキメラ受容体の非プレイ部分との非特異的相互作用よりもプレイ蛋白質と特異的相互作用する傾向を有する、
シグナルを検出すること、
を含む。
【0015】
いくつかの実施態様においては、プレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、第１の受容体に融合した第２の受容体の細胞内ドメインへの受容体断片の動員を引き起こすので、リガンド依存性受容体シグナル伝達が回復し、ＳＴＡＴ分子の活性化が起こる。いくつかの実施態様においては、該細胞はＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、活性化したＳＴＡＴ分子は核内に移行してＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子の転写を誘導し、場合によっては、該レポーター遺伝子シグナルにより分子相互作用の検出が可能になることもある。
【0016】
場合によっては、プレイ蛋白質を除く、リガンドを基盤とするキメラ受容体のいずれの部分に対するベイト蛋白質の非特異的相互作用も、本明細書中に記載の細胞を基盤とするシステムによって取得するシグナルに、偽性シグナルまたはバックグラウンドノイズを発生させることもあり得る。したがって、いくつかの実施態様においては、ベイト蛋白質はプレイ蛋白質と特異的に相互作用する、あるいはプレイ蛋白質仲介性の相互作用に関与する。いくつかの実施態様において、ベイト蛋白質は、リガンド依存性キメラ受容体の他の部分との相互作用よりも、プレイ蛋白質と相互作用する傾向を有する。他の実施態様において、ベイト蛋白質は、細胞膜の一部または他の細胞構成成分に対する相互作用よりも、プレイ蛋白質と相互作用する傾向を有する。いくつかの実施態様において、ベイト蛋白質は、キメラ受容体の非プレイ部分よりも、プレイ蛋白質に対してより結合高親和性有している。いくつかの実施態様において、ベイト蛋白質は、細胞膜の一部と比較してプレイ蛋白質により結合高親和性を有している。
【0017】
細胞のいずれかの部分にベイト蛋白質が隔離または捕捉されると、ベイト蛋白質がプレイ蛋白質と相互作用できなくなるため、本明細書に記載の細胞を基盤とするシステムにおいて偽陰性シグナルが発生し得る。したがって、いくつかの実施態様において、ベイト蛋白質は、細胞内において遊離して利用可能であり、プレイ蛋白質と相互作用できる。いくつかの実施態様において、ベイト蛋白質は、細胞の核、ミトコンドリア、ゴルジ体、または小胞体など細胞の細胞内微小器官の内部に実質的に捕捉されない。いくつかの実施態様において、ベイト蛋白質は、細胞の細胞質内で利用可能であり、プレイ蛋白質と相互作用できる。いくつかの実施態様において、ベイト蛋白質は、細胞膜とは実質的に相互作用しない。いくつかの実施態様において、ベイト蛋白質は、キメラ受容体の非プレイ部分とは実質的に相互作用しない。いくつかの実施態様において、ベイト蛋白質は、キメラ受容体の第２の受容体の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインとは、実質的に相互作用しない。
【0018】
様々な実施態様において、このベイト蛋白質はリガンド依存性キメラ受容体に融合させない。
【0019】
様々な実施態様において、順ＭＡＰＰＩＴ（すなわち、プレイが膜蛋白質に結合してはいない）でアッセイした場合には、このプレイ（逆モードでは、プレイが膜蛋白質に結合している）は、膜結合細胞内微小器官の内部に捕捉されることによって、および／または細胞膜および／またはキメラ受容体の非プレイ部分と非特異的に相互作用することによって、制限を受ける。さらに、順ＭＡＰＰＩＴの場合には、ベイトが受容体融合蛋白質として発現不良のこともあり、および／または折れたたみが不適切のこともあり、および／または融合によってベイトの相互作用面が不明瞭になることもある；したがって、実施態様において、逆ＭＡＰＰＩＴでは、ベイトを可溶化する（すなわち、非融合）ことによって、これらの問題を解決する。
【0020】
様々な実施態様においては、順ＭＡＰＰＩＴにおいてｇｐ１３０融合物として分析した場合に、プレイ蛋白質は非検出または検出不良の蛋白質である。様々な実施態様において、分子相互作用（例えば、蛋白質／蛋白質相互作用、または低分子とプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって媒介される蛋白質／蛋白質相互作用が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない）は、本法で検出されるが、順ＭＡＰＰＩＴで分析した場合には、非検出または検出不良である。
【0021】
様々な実施態様においては、ベイト蛋白質を膜貫通蛋白質には融合させないので、そのため生理的条件に固有の蛋白質露出表面に、より類似した蛋白質構造の部分的表面を露出し得る。言い換えれば、ベイトが融合していないことは、天然状況のベイトの状態をより正確に反映し得る。
【0022】
本発明はまた、分子相互作用に関して、プレイ蛋白質のライブラリー、リガンドを基盤とするキメラ受容体のライブラリー、および／またはリガンドを基盤とするキメラ受容体のライブラリーを発現する細胞のライブラリーを分析することを含む。本発明はまた、化合物ライブラリーを分析することを含む。実施態様においては、ベイトが化合物に結合するが、このベイト／化合物複合体はプレイと相互作用してもよい。したがって、実施態様において、本法は化合物仲介性の新規の蛋白質／蛋白質相互作用および／または新規の蛋白質／化合物相互作用の検出および／または発見を可能にする。実施態様において、本法は分子糊として働く新規化合物の検出および／または発見を可能にする。実施態様において、本法は弱いベイト／プレイ相互作用を強いベイト／プレイ相互作用に変換する新規化合物の検出および／または発見を可能にする。
【0023】
例えば、プレイイブラリーは、本明細書に記載の方法を実施するために好適な少なくとも２つの異なるタイプ／種類の固有のプレイ蛋白質を含む。
【0024】
本発明の受容体ライブラリーは、各キメラ受容体またはキメラ受容体集団のそれぞれが、異なるタイプ／種類のプレイ蛋白質に融合している、リガンドを基盤とするキメラ受容体を少なくとも２種類含む。該細胞ライブラリーは、それぞれの細胞または細胞集団が１タイプ／種類のキメラ蛋白質を発現しており、キメラ蛋白質が１種類以上の種類／タイプのプレイ蛋白質に融合している、少なくとも２つの異なる種類／タイプの細胞を含む。
【0025】
いくつかの実施態様において、該細胞ライブラリーは、第１の細胞集団／画分および第２の細胞集団／画分を含み、ここで該１の細胞集団では、第１の集団／画分のキメラ受容体が第１の種類のプレイ蛋白質に融合しており、該第２の細胞集団では、第２の集団／画分のキメラ受容体が第２の種類のプレイ蛋白質に融合している。細胞ライブラリーに含まれる細胞集団の数は限定されない。例えば、一実施態様において、該細胞ライブラリーは２種類以上の異なる細胞集団を含むが、ここで各細胞集団は、キメラ受容体に融合した異なるプレイ蛋白質を有しており、その点で他の集団と異なる。
【0026】
いくつかの実施態様において、該受容体ライブラリーは、１種類／タイプのプレイ蛋白質に融合しているキメラ受容体である第１の集団のキメラ受容体および別の１種類／タイプのプレイ蛋白質に融合している受容体である第２の集団のキメラ受容体を含む。受容体ライブラリーに含まれ得る異なるタイプ／種類のキメラ受容体の数については制限がない。例えば、一実施態様において、該受容体ライブラリーは、２種類以上の異なるキメラ受容体集団を含むが、ここで各受容体集団は、キメラ受容体に融合した異なるプレイ蛋白質を有しており、その点で他の集団とは異なる。
【0027】
様々な実施態様において、本法はキメラ受容体に融合したプレイ蛋白質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ライブラリーに関連する。様々な実施態様において、本法はキメラ受容体に融合したプレイ蛋白質のＯＲＦライブラリーを有する細胞集団に関連する。実施態様において、キメラ受容体に融合したプレイ蛋白質に関するそのようなＯＲＦライブラリーは、キメラ受容体には融合していない単一ベイトを試験する目的で利用することができる。
【0028】
様々な実施態様において、本法は、例えば、各種のベイト蛋白質をコードするｃＤＮＡが表面上にスポットされているアレイ型形態に関連する。様々な実施態様において、本法は、例えば、ベイト蛋白質のライブラリーを細胞に導入して、平均的には各細胞が単一ベイトを発現するようにした細胞の細胞集団を基盤とする方法に関連する。そのような実施態様においては、化合物および／またはベイトと相互作用した場合に、当該コードｃＤＮＡを同定してその相互作用を明らかにする。実施態様においては、そのような同定にＦＡＣＳまたは微量流体分離を用いる。
【0029】
様々な実施態様においては、複数のプレイ蛋白質を単一ベイトとの分子相互作用に関して分析するが、ここでベイトはリガンド依存性キメラ受容体に融合していない。
【0030】
いくつかの実施態様においては、該分子相互作用は蛋白質／蛋白質相互作用である。実施態様においては、ベイトおよびプレイはいずれも蛋白質である。
【0031】
いくつかの実施態様において、該方法は、プレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することをさらに含む。いくつかの実施態様においては、該分子相互作用は、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合することによって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用である。実施態様においては、ベイトおよびプレイはいずれも蛋白質である。
【0032】
いくつかの実施態様において、該分子相互作用は、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合することによって仲介される２種類以上の蛋白質／蛋白質相互作用である。いくつかの実施態様においては、該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用は、蛋白質／蛋白質界面の部位におけるプレイ蛋白質またはベイト蛋白質と低分子との間の直接結合である。
【0033】
いくつかの実施態様においては、該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用は、プレイ蛋白質またはベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される。
【0034】
いくつかの実施態様において、該低分子はプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との相互作用を可能にするプレイ蛋白質またはベイト蛋白質の疎水性表面の露出を誘導する。いくつかの実施態様においては、該低分子がベイト蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、それによってプレイ蛋白質との相互作用が可能になる。いくつかの実施態様においては、該低分子がプレイ蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、それによってベイト蛋白質との相互作用が可能になる。
【0035】
いくつかの実施態様においては、該低分子は分子糊である。いくつかの実施態様においては、該低分子は二価ハイブリッドリガンド分子（例えば、ＰＲＯＴＡＣが挙げられるが、これのみに限定されるものではない）である。
【0036】
いくつかの実施態様においては、該分子相互作用は複合体形成である。
【0037】
いくつかの実施態様において、該分子相互作用は低分子／蛋白質相互作用である。
【0038】
いくつかの実施態様において、プレイ蛋白質は低分子に結合しており、リンカーを介して該低分子が、ベイト蛋白質に結合する第２の低分子に連結している。いくつかの実施態様において、ベイト蛋白質は低分子に結合しており、リンカーを介して該低分子が、プレイ蛋白質に結合する第２の低分子に連結している。
【0039】
様々な実施態様においては、該第１の受容体および第２の受容体は同一の受容体である。
【0040】
様々な実施態様においては、該第１の受容体および第２の受容体は異なる受容体である。
【0041】
様々な実施態様においては、該第１の受容体および／または第２の受容体は多量体化受容体である。
【0042】
いくつかの実施態様においては、該リガンド結合ドメインはサイトカイン受容体に由来する。いくつかの実施態様においては、該リガンド結合ドメインは１型サイトカイン受容体（ＣＲ）に由来する。
【0043】
いくつかの実施態様においては、該リガンド結合ドメインは、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）またはレプチン受容体に由来する。いくつかの実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインはマウスレプチン受容体に由来する。
【0044】
いくつかの実施態様において、該ベイトは、該第１の受容体および／または第２の受容体断片に対して異種である。
【0045】
いくつかの実施態様において、該細胞内ドメインはＪＡＫ結合部位を含む。
【0046】
いくつかの実施態様において、該細胞内ドメインは糖蛋白質１３０（ｇｐ１３０）またはその断片を含む。
【0047】
いくつかの実施態様において、該受容体断片は糖蛋白質１３０（ｇｐ１３０）またはその断片を含む。
【0048】
いくつかの実施態様において、該ＳＴＡＴはＳＴＡＴ１またはＳＴＡＴ３から選択される。
【0049】
いくつかの実施態様において、ＳＴＡＴの動員を低減または排除する変異は、１か所以上のチロシンリン酸化部位において起こる。いくつかの実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインはマウスレプチン受容体に由来し、該変異はＹ９８５、Ｙ１０７７、およびＹ１１３８の位置のうちの１か所以上である。いくつかの実施態様において、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、マウスレプチン受容体に由来し、該変異はＹ９８５Ｆ、Ｙ１０７７Ｆ、およびＹ１１３８Ｆである。いくつかの実施態様において、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、マウスレプチン受容体のＹ９８５Ｆ、Ｙ１０７７Ｆ、およびＹ１１３８Ｆと機能的に同等の変異を有する。いくつかの実施態様においては、膜貫通ドメインの欠失が提供されるが、ＪＡＫ結合については保持される。
【0050】
マウスレプチン受容体のアミノ酸配列は以下である：
ＭＭＣＱＫＦＹＶＶＬＬＨＷＥＦＬＹＶＩＡＡＬＮＬＡＹＰＩＳＰＷＫＦＫＬＦＣＧＰＰＮＴＴＤＤＳＦＬＳＰＡＧＡＰＮＮＡＳＡＬＫＧＡＳＥＡＩＶＥＡＫＦＮＳＳＧＩＹＶＰＥＬＳＫＴＶＦＨＣＣＦＧＮＥＱＧＱＮＣＳＡＬＴＤＮＴＥＧＫＴＬＡＳＶＶＫＡＳＶＦＲＱＬＧＶＮＷＤＩＥＣＷＭＫＧＤＬＴＬＦＩＣＨＭＥＰＬＰＫＮＰＦＫＮＹＤＳＫＶＨＬＬＹＤＬＰＥＶＩＤＤＳＰＬＰＰＬＫＤＳＦＱＴＶＱＣＮＣＳＬＲＧＣＥＣＨＶＰＶＰＲＡＫＬＮＹＡＬＬＭＹＬＥＩＴＳＡＧＶＳＦＱＳＰＬＭＳＬＱＰＭＬＶＶＫＰＤＰＰＬＧＬＨＭＥＶＴＤＤＧＮＬＫＩＳＷＤＳＱＴＭＡＰＦＰＬＱＹＱＶＫＹＬＥＮＳＴＩＶＲＥＡＡＥＩＶＳＡＴＳＬＬＶＤＳＶＬＰＧＳＳＹＥＶＱＶＲＳＫＲＬＤＧＳＧＶＷＳＤＷＳＳＰＱＶＦＴＴＱＤＶＶＹＦＰＰＫＩＬＴＳＶＧＳＮＡＳＦＨＣＩＹＫＮＥＮＱＩＩＳＳＫＱＩＶＷＷＲＮＬＡＥＫＩＰＥＩＱＹＳＩＶＳＤＲＶＳＫＶＴＦＳＮＬＫＡＴＲＰＲＧＫＦＴＹＤＡＶＹＣＣＮＥＱＡＣＨＨＲＹＡＥＬＹＶＩＤＶＮＩＮＩＳＣＥＴＤＧＹＬＴＫＭＴＣＲＷＳＰＳＴＩＱＳＬＶＧＳＴＶＱＬＲＹＨＲＲＳＬＹＣＰＤＳＰＳＩＨＰＴＳＥＰＫＮＣＶＬＱＲＤＧＦＹＥＣＶＦＱＰＩＦＬＬＳＧＹＴＭＷＩＲＩＮＨＳＬＧＳＬＤＳＰＰＴＣＶＬＰＤＳＶＶＫＰＬＰＰＳＮＶＫＡＥＩＴＶＮＴＧＬＬＫＶＳＷＥＫＰＶＦＰＥＮＮＬＱＦＱＩＲＹＧＬＳＧＫＥＩＱＷＫＴＨＥＶＦＤＡＫＳＫＳＡＳＬＬＶＳＤＬＣＡＶＹＶＶＱＶＲＣＲＲＬＤＧＬＧＹＷＳＮＷＳＳＰＡＹＴＬＶＭＤＶＫＶＰＭＲＧＰＥＦＷＲＫＭＤＧＤＶＴＫＫＥＲＮＶＴＬＬＷＫＰＬＴＫＮＤＳＬＣＳＶＲＲＹＶＶＫＨＲＴＡＨＮＧＴＷＳＥＤＶＧＮＲＴＮＬＴＦＬＷＴＥＰＡＨＴＶＴＶＬＡＶＮＳＬＧＡＳＬＶＮＦＮＬＴＦＳＷＰＭＳＫＶＳＡＶＥＳＬＳＡＹＰＬＳＳＳＣＶＩＬＳＷＴＬＳＰＤＤＹＳＬＬＹＬＶＩＥＷＫＩＬＮＥＤＤＧＭＫＷＬＲＩＰＳＮＶＫＫＦＹＩＨＤＮＦＩＰＩＥＫＹＱＦＳＬＹＰＶＦＭＥＧＶＧＫＰＫＩＩＮＧＦＴＫＤＡＩＤＫＱＱＮＤＡＧＬＹＶＩＶＰＩＩＩＳＳＣＶＬＬＬＧＴＬＬＩＳＨＱＲＭＫＫＬＦＷＤＤＶＰＮＰＫＮＣＳＷＡＱＧＬＮＦＱＫＰＥＴＦＥＨＬＦＴＫＨＡＥＳＶＩＦＧＰＬＬＬＥＰＥＰＩＳＥＥＩＳＶＤＴＡＷＫＮＫＤＥＭＶＰＡＡＭＶＳＬＬＬＴＴＰＤＰＥＳＳＳＩＣＩＳＤＱＣＮＳＡＮＦＳＧＳＱＳＴＱＶＴＣＥＤＥＣＱＲＱＰＳＶＫＹＡＴＬＶＳＮＤＫＬＶＥＴＤＥＥＱＧＦＩＨＳＰＶＳＮＣＩＳＳＮＨＳＰＬＲＱＳＦＳＳＳＳＷＥＴＥＡＱＴＦＦＬＬＳＤＱＱＰＴＭＩＳＰＱＬＳＦＳＧＬＤＥＬＬＥＬＥＧＳＦＰＥＥＮＨＲＥＫＳＶＣＹＬＧＶＴＳＶＮＲＲＥＳＧＶＬＬＴＧＥＡＧＩＬＣＴＦＰＡＱＣＬＦＳＤＩＲＩＬＱＥＲＣＳＨＦＶＥＮＮＬＳＬＧＴＳＧＥＮＦＶＰＹＭＰＱＦＱＴＣＳＴＨＳＨＫＩＭＥＮＫＭＣＤＬＴＶ（配列番号：１）。
ＭＭＣＱＫＦＹＶＶＬＬＨＷＥＦＬＹＶＩＡＡＬＮＬＡＹＰＩＳＰＷＫＦＫＬＦＣＧＰＰＮＴＴＤＤＳＦＬＳＰＡＧＡＰＮＮＡＳＡＬＫＧＡＳＥＡＩＶＥＡＫＦＮＳＳＧＩＹＶＰＥＬＳＫＴＶＦＨＣＣＦＧＮＥＱＧＱＮＣＳＡＬＴＤＮＴＥＧＫＴＬＡＳＶＶＫＡＳＶＦＲＱＬＧＶＮＷＤＩＥＣＷＭＫＧＤＬＴＬＦＩＣＨＭＥＰＬＰＫＮＰＦＫＮＹＤＳＫＶＨＬＬＹＤＬＰＥＶＩＤＤＳＰＬＰＰＬＫＤＳＦＱＴＶＱＣＮＣＳＬＲＧＣＥＣＨＶＰＶＰＲＡＫＬＮＹＡＬＬＭＹＬＥＩＴＳＡＧＶＳＦＱＳＰＬＭＳＬＱＰＭＬＶＶＫＰＤＰＰＬＧＬＨＭＥＶＴＤＤＧＮＬＫＩＳＷＤＳＱＴＭＡＰＦＰＬＱＹＱＶＫＹＬＥＮＳＴＩＶＲＥＡＡＥＩＶＳＡＴＳＬＬＶＤＳＶＬＰＧＳＳＹＥＶＱＶＲＳＫＲＬＤＧＳＧＶＷＳＤＷＳＳＰＱＶＦＴＴＱＤＶＶＹＦＰＰＫＩＬＴＳＶＧＳＮＡＳＦＨＣＩＹＫＮＥＮＱＩＩＳＳＫＱＩＶＷＷＲＮＬＡＥＫＩＰＥＩＱＹＳＩＶＳＤＲＶＳＫＶＴＦＳＮＬＫＡＴＲＰＲＧＫＦＴＹＤＡＶＹＣＣＮＥＱＡＣＨＨＲＹＡＥＬＹＶＩＤＶＮＩＮＩＳＣＥＴＤＧＹＬＴＫＭＴＣＲＷＳＰＳＴＩＱＳＬＶＧＳＴＶＱＬＲＹＨＲＲＳＬＹＣＰＤＳＰＳＩＨＰＴＳＥＰＫＮＣＶＬＱＲＤＧＦＹＥＣＶＦＱＰＩＦＬＬＳＧＹＴＭＷＩＲＩＮＨＳＬＧＳＬＤＳＰＰＴＣＶＬＰＤＳＶＶＫＰＬＰＰＳＮＶＫＡＥＩＴＶＮＴＧＬＬＫＶＳＷＥＫＰＶＦＰＥＮＮＬＱＦＱＩＲＹＧＬＳＧＫＥＩＱＷＫＴＨＥＶＦＤＡＫＳＫＳＡＳＬＬＶＳＤＬＣＡＶＹＶＶＱＶＲＣＲＲＬＤＧＬＧＹＷＳＮＷＳＳＰＡＹＴＬＶＭＤＶＫＶＰＭＲＧＰＥＦＷＲＫＭＤＧＤＶＴＫＫＥＲＮＶＴＬＬＷＫＰＬＴＫＮＤＳＬＣＳＶＲＲＹＶＶＫＨＲＴＡＨＮＧＴＷＳＥＤＶＧＮＲＴＮＬＴＦＬＷＴＥＰＡＨＴＶＴＶＬＡＶＮＳＬＧＡＳＬＶＮＦＮＬＴＦＳＷＰＭＳＫＶＳＡＶＥＳＬＳＡＹＰＬＳＳＳＣＶＩＬＳＷＴＬＳＰＤＤＹＳＬＬＹＬＶＩＥＷＫＩＬＮＥＤＤＧＭＫＷＬＲＩＰＳＮＶＫＫＦＹＩＨＤＮＦＩＰＩＥＫＹＱＦＳＬＹＰＶＦＭＥＧＶＧＫＰＫＩＩＮＧＦＴＫＤＡＩＤＫＱＱＮＤＡＧＬＹＶＩＶＰＩＩＩＳＳＣＶＬＬＬＧＴＬＬＩＳＨＱＲＭＫＫＬＦＷＤＤＶＰＮＰＫＮＣＳＷＡＱＧＬＮＦＱＫＰＥＴＦＥＨＬＦＴＫＨＡＥＳＶＩＦＧＰＬＬＬＥＰＥＰＩＳＥＥＩＳＶＤＴＡＷＫＮＫＤＥＭＶＰＡＡＭＶＳＬＬＬＴＴＰＤＰＥＳＳＳＩＣＩＳＤＱＣＮＳＡＮＦＳＧＳＱＳＴＱＶＴＣＥＤＥＣＱＲＱＰＳＶＫＹＡＴＬＶＳＮＤＫＬＶＥＴＤＥＥＱＧＦＩＨＳＰＶＳＮＣＩＳＳＮＨＳＰＬＲＱＳＦＳＳＳＳＷＥＴＥＡＱＴＦＦＬＬＳＤＱＱＰＴＭＩＳＰＱＬＳＦＳＧＬＤＥＬＬＥＬＥＧＳＦＰＥＥＮＨＲＥＫＳＶＣＹＬＧＶＴＳＶＮＲＲＥＳＧＶＬＬＴＧＥＡＧＩＬＣＴＦＰＡＱＣＬＦＳＤＩＲＩＬＱＥＲＣＳＨＦＶＥＮＮＬＳＬＧＴＳＧＥＮＦＶＰＹＭＰＱＦＱＴＣＳＴＨＳＨＫＩＭＥＮＫＭＣＤＬＴＶ（配列番号：１）。
【0051】
いくつかの実施態様において、該ドメインはマウスレプチン受容体に由来し、マウスレプチン受容体の配列のアミノ酸８３９～１１６２に由来する。
【0052】
いくつかの実施態様において、該ベイト蛋白質は核外搬出配列（ＮＥＳ）を含む。例えば、実施態様において、該ベイト蛋白質は核内蛋白質であるが、該ＮＥＳによって細胞質中に存在可能となる（すなわち、プレイが利用できる場合には、プレイと接触させることができる）。したがって、実施態様においては、強力な核局在化シグナルが存在する場合であっても、該ＮＥＳシグナルは、ベイトポリペプチドが細胞質内に存在する状態を支援するので、プレイとの相互作用が促進される。
【0053】
いくつかの実施態様においては、該ＮＥＳは１～４個の疎水性残基を有する。いくつかの実施態様においては、該疎水性残基はロイシンである。いくつかの実施態様においては、該ＮＥＳは配列ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬを有するが、ここでＬは疎水性残基であり、ｘは他の任意のアミノ酸である。いくつかの実施態様においては、該ＮＥＳは配列ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬを有するが、ここでＬはロイシンであり、ｘは他の任意のアミノ酸である。
【0054】
いくつかの実施態様において、該ＮＥＳは、ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼの熱安定阻害因子のアミノ酸３７～４６を含むが、これは強力な核局在化シグナルを無効化することが示されている（Ｗｉｌｅｙら、（１９９９）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：６３８１－６３８７；本参考文献は参照としてその全内容が本明細書に組み入れられる）。
【0055】
いくつかの実施態様において、本法は、新規相互作用パートナー、例えば、化合物に結合する蛋白質の基質またはネオ基質の同定を可能にするが、ここで該蛋白質は、該化合物のグルタルイミド環と、例えば、水素結合によって相互作用することのできる、カゴ（ｃａｇｅ）状配置をとる３つのトリプトファン残基を有する。いくつかの実施態様において、該相互作用パートナー（例えば、ネオ基質）は、表面β－ヘアピンループを有し、該表面β－ヘアピンループは、ターンの先端に３つのバックボーン水素結合受容体とそれに続くグリシン残基の配置を有してもよい。いくつかの実施態様において、該相互作用パートナー（例えば、ネオ基質）はデグロンモチーフを有する（Ｍｅｓｚａｒｏｓら、Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２０１７：１０、４７０を参照のこと；本参考文献は参照としてその全内容が本明細書に組み入れられる）。
【0056】
いくつかの実施態様においては、該ベイトは、該化合物（免疫調節薬剤または免疫調節性イミド薬剤（ＩＭｉＤ）など）のグルタルイミド環と、例えば、水素結合によって相互作用することのできる、カゴ（ｃａｇｅ）状配置をとる３つのトリプトファン残基を有する蛋白質である。
【0057】
いくつかの実施態様においては、該プレイ（例えば、ネオ基質）は、表面β－ヘアピンループを有し、該表面β－ヘアピンループは、ターンの先端に３つのバックボーン水素結合受容体とそれに続くグリシン残基の配置を有してもよい。いくつかの実施態様においては、該プレイ（例えば、ネオ基質）はデグロンモチーフを有する（Ｍｅｓｚａｒｏｓら、Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２０１７：１０、４７０を参照のこと；本参考文献は参照としてその全内容が本明細書に組み入れられる）。
【0058】
いくつかの実施態様において、該ベイトはユビキチンプロテアソームシステムを調節する蛋白質である。いくつかの実施態様において、該ベイトは、Ｅ３リガーゼ蛋白質、またはＥ３リガーゼ蛋白質を調節する蛋白質である。いくつかの実施態様において、該ベイトはカリンリングリガーゼ（ＣＲＬ）蛋白質またはＣＲＬ蛋白質を調節する蛋白質である。様々な実施態様において、該ベイトはＣＲＬ４蛋白質またはＣＲＬ４蛋白質を調節する蛋白質である。いくつかの実施態様において、該ベイトはＤＤＢ１－ＣＵＬ４関連因子（ＤＣＡＦ）蛋白質またはＤＣＡＦを調節する蛋白質である。
【0059】
いくつかの実施態様において、該ベイトは、セレブロン（ＣＲＢＮ）、損傷ＤＮＡ結合蛋白質１（ＤＤＢ１）、カリン４Ａ（ＣＵＬ４Ａ）、カリン１の制御因子（ＲＯＣ１）、およびフォン・ヒッペル・リンドウ（Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ：ＶＨＬ）のうちの１種類以上であるか、またはそれらを含む。様々な実施態様においては、該ベイトは、セレブロン（ＣＲＢＮ）、損傷ＤＮＡ結合蛋白質１（ＤＤＢ１）、カリン４Ａ（ＣＵＬ４Ａ）、カリン１の制御因子（ＲＯＣ１）、およびフォン・ヒッペル・リンドウ（Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ：ＶＨＬ）のうちの１種類以上である。様々な実施態様においては、該プレイ、セレブロン（ＣＲＢＮ）、損傷ＤＮＡ結合蛋白質１（ＤＤＢ１）、カリン４Ａ（ＣＵＬ４Ａ）、カリン１の制御因子（ＲＯＣ１）、およびフォン・ヒッペル・リンドウ（Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ：ＶＨＬ）のうちの１種類以上である。
【0060】
いくつかの実施態様において、該ベイトは、任意選択的にＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ３８およびＦＫＢＰ５２から選択されるＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）であるか、またはそれを含む。
【0061】
いくつかの実施態様においては、該ベイト蛋白質は受容体断片に融合している。いくつかの実施態様においては、該ベイト蛋白質は受容体断片のＮ末端またはＣ末端に融合している。いくつかの実施態様においては、該ベイト蛋白質はｇｐ１３０またはその断片に融合している。いくつかの実施態様においては、該ベイト蛋白質はｇｐ１３０またはその断片のＮ末端またはＣ末端に融合している。
【0062】
実施態様において、該ベイトは２種類以上の蛋白質（例えば２種類、または３種類、または４種類、または５種類の蛋白質）である。実施態様において、該ベイトは、低分子および／またはベイトと相互作用可能な第１の蛋白質を含み、足場蛋白質は第１の蛋白質と相互作用する。いくつかの実施態様においては、本法は図３のシステムを利用する。
【0063】
いくつかの実施態様において、該足場蛋白質は受容体断片に融合している。いくつかの実施態様において、該足場蛋白質は受容体断片のＮ末端またはＣ末端に融合している。実施態様において、該足場蛋白質はｇｐ１３０またはその断片に融合している。実施態様において、該足場蛋白質はｇｐ１３０またはその断片のＮ末端またはＣ末端に融合している。
【0064】
いくつかの実施態様において、該足場蛋白質は受容体断片に融合している。実施態様において、該足場蛋白質はｇｐ１３０またはその断片に融合しており、低分子および／またはベイトと相互作用可能な蛋白質は、プレイおよび／または低分子相互作用可能な該足場蛋白質と相互作用する。
【0065】
実施態様においては、該ベイトはＥ３リガーゼ基質結合サブユニットである。
【0066】
実施態様においては、該Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットは以下の遺伝子のいずれかによってコードされる蛋白質から選択される：
ＡＭＦＲ、ＡＮＡＰＣ１１、ＡＰＧ１６Ｌ、ＡＲＩＨ１、ＡＲＩＨ２、ＡＲＰＣ１Ａ、ＡＲＰＣ１Ｂ、ＡＳＢ２、ＡＳＢ２、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＢＡＦ２５０、ＢＡＲＤ１、ＢＩＲＣ２、ＢＩＲＣ３、ＢＩＲＣ４、ＢＩＲＣ７、ＢＭＩ１、ＢＲＡＰ、ＢＲＣＡ１、ｂＴｒＣＰ、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＢＬＬ１、ＣＣＩＮ、ＣＣＩＮ、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＣＲＢＮ、ＣＨＦＲ、ＣＨＩＰ、ＣＮＯＴ４、ＣＯＰ１、ＣＳＡ、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、Ｄｄａ１、ＤＤＢ２、ＤＥＴ１、ＤＮＡＩ２、ＤＴＸ３、ＤＺＩＰ３、Ｅ６ＡＰ、ＥＤＤ、ＥＥＤ、ＥＮＣ１、ＥＮＣ１、ＦＡＮＣＬ、ＦＢＸＬ１、ＦＢＸＬ１０、ＦＢＸＬ１１、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１３、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＦＢＸＬ１６、ＦＢＸＬ１７、ＦＢＸＬ１８、ＦＢＸＬ１９、ＦＢＸＬ２０、ＦＢＸＬ２１、ＦＢＸＬ２２、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ４、ＦＢＸＬ５、ＦＢＸＬ７、ＦＢＸＬ８、ＦＢＸＯ１、ＦＢＸＯ１０、ＦＢＸＯ１１、ＦＢＸＯ１２、ＦＢＸＯ１３、ＦＢＸＯ１４、ＦＢＸＯ１５、ＦＢＸＯ１６、ＦＢＸＯ１７、ＦＢＸＯ１８、ＦＢＸＯ１９、ＦＢＸＯ２、ＦＢＸＯ２０、ＦＢＸＯ２１、ＦＢＸＯ２２、ＦＢＸＯ３、ＦＢＸＯ４、ＦＢＸＯ５、ＦＢＸＯ６、ＦＢＸＯ７、ＦＢＸＯ８、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＥＭ１Ａ、ＦＥＭ１Ｂ、ＦＥＭ１Ｃ、ＧＡＮ、ＧＡＮ、ＧＮＢ１、ＧＮＢ２、ＧＮＢ５、ＧＲＷＤ１、ＧＴＦ２Ｈ２、ＧＴＦ３Ｃ２、ＨＡＣＥ１、ＨＥＣＴＤ１、ＨＥＣＴＤ２、ＨＥＣＴＤ３、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ２、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＣ４、ＨＥＲＣ５、ＨＥＲＣ６、ＨＬＴＦ、ＨＯＩＰ、ＨＵＷＥ１、ＩＢＲＤＣ２、ＩＢＲＤＣ３、ＩＦＲＧ１５、ＩＰＰ、ＩＰＰ、ＩＴＣＨ、ＩＶＮＳ１ＡＢＰ、ＩＶＮＳ１ＡＢＰ、ＫＡＴＮＢ１、ＫＢＴＢＤ１０、ＫＢＴＢＤ１０、ＫＢＴＢＤ１１、ＫＢＴＢＤ１１、ＫＢＴＢＤ１２、ＫＢＴＢＤ１２、ＫＢＴＢＤ１３、ＫＢＴＢＤ１３、ＫＢＴＢＤ２、ＫＢＴＢＤ２、ＫＢＴＢＤ３、ＫＢＴＢＤ３、ＫＢＴＢＤ４、ＫＢＴＢＤ４、ＫＢＴＢＤ５、ＫＢＴＢＤ５、ＫＢＴＢＤ６、ＫＢＴＢＤ６、ＫＢＴＢＤ７、ＫＢＴＢＤ７、ＫＢＴＢＤ８、ＫＢＴＢＤ８、ＫＣＴＤ５、ＫＥＡＰ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＡＡ０３１７、ＫＩＡＡ０６１４、ＫＬＨＤＣ５、ＫＬＨＬ１、ＫＬＨＬ１、ＫＬＨＬ１０、ＫＬＨＬ１０、ＫＬＨＬ１１、ＫＬＨＬ１１、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１４、ＫＬＨＬ１４、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ１７、ＫＬＨＬ１７、ＫＬＨＬ１８、ＫＬＨＬ１８、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２２、ＫＬＨＬ２２、ＫＬＨＬ２３、ＫＬＨＬ２３、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ２５、ＫＬＨＬ２５、ＫＬＨＬ２６、ＫＬＨＬ２６、ＫＬＨＬ２８、ＫＬＨＬ２８、ＫＬＨＬ２９、ＫＬＨＬ２９、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ３０、ＫＬＨＬ３０、ＫＬＨＬ３１、ＫＬＨＬ３１、ＫＬＨＬ３２、ＫＬＨＬ３２、ＫＬＨＬ３３、ＫＬＨＬ３３、ＫＬＨＬ３４、ＫＬＨＬ３４、ＫＬＨＬ３５、ＫＬＨＬ３５、ＫＬＨＬ３６、ＫＬＨＬ３６、ＫＬＨＬ３８、ＫＬＨＬ３８、ＫＬＨＬ４、ＫＬＨＬ４、ＫＬＨＬ５、ＫＬＨＬ５、ＫＬＨＬ６、ＫＬＨＬ６、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ８、ＫＬＨＬ８、ＫＬＨＬ９、ＫＬＨＬ９、ＬＩＮＣＲ、ＬＮＸ１、ＬＲＲ１、ＬＲＲＣ４１、ＬＲＳＡＭ１、ＬＺＴＲ１、ＬＺＴＲ１、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＢ１８、ＭＡＧＥ－Ｂ１８、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥＣ２、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＬＩＮ、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＭＡＲＣＨ２、ＭＡＲＣＨ４、ＭＡＲＣＨ５、ＭＡＲＣＨ６、ＭＡＲＣＨ７、ＭＡＲＣＨ８、ＭＡＲＣＨ９、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＸ、ＭＧＲＮ１、ＭＩＢ１、ＭＩＢ２、ＭＩＤ１、ＭＫＲＮ１、ＭＮＡＴ１、ＭＵＦ１、ＭＵＬＡＮ、ＭＵＲＦ、ＭＹＣＢＰ２、ＭＹＬＩＰ、Ｎｅｄｄ４、ＮＥＤＤ４Ｌ、ＮＥＤＬ１、ＮＥＤＬ２、ＮＥＵＲＬ、ＮＥＵＲＬ２、ＮＬＥ１、ＮＵＰ４３、ＯＳＴＭ１、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＫ２、ＰＣＧＦ１、ＰＣＧＦ２、ＰＤＺＲＮ３、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ７、ＰＪＡ１、ＰＪＡ２、ＰＯＣ１Ａ、ＰＰＩＬ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＰＦ１９、ＰＷＰ１、ＲＡＣＫ１、ＲＡＤ１８、ＲＡＥ１、ＲＡＧ１、ＲＢＢＰ４、ＲＢＢＰ５、ＲＢＢＰ６、ＲＢＢＰ７、ＲＢＣＫ１、ＲＢＸ１、ＲＣＨＹ１、ＲＦＦＬ、ＲＦＰＬ４Ａ、ＲＦＷＤ２、ＲＩＮＧ１、ＲＮＦ１０３、ＲＮＦ１１、ＲＮＦ１１１、ＲＮＦ１１４、ＲＮＦ１２、ＲＮＦ１２３、ＲＮＦ１２５、ＲＮＦ１２８、ＲＮＦ１３、ＲＮＦ１３０、ＲＮＦ１３３、ＲＮＦ１３５、ＲＮＦ１３８、ＲＮＦ１３９、ＲＮＦ１４、ＲＮＦ１４４Ａ、ＲＮＦ１６７、ＲＮＦ１６８、ＲＮＦ１８０、ＲＮＦ１８１、ＲＮＦ１８２、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ１９、ＲＮＦ２、ＲＮＦ２０、ＲＮＦ２０、ＲＮＦ２１６、ＲＮＦ２５、ＲＮＦ３４、ＲＮＦ４、ＲＮＦ４０、ＲＮＦ４１、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ５、ＲＮＦ６、ＲＮＦ７、ＲＮＦ８、ＲＮＦ８５、ＲＰＴＯＲ、ＳＣＡＰ、ＳＨ３ＲＦ１、ＳＨＰＲＨ、ＳＩＡＨ１、ＳＩＡＨ２、ＳＭＵ１、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、ＳＰＯＰ、ＳＰＳＢ１、ＳＰＳＢ１、ＳＰＳＢ２、ＳＰＳＢ２、ＳＰＳＢ４、ＳＰＳＢ４、ＳＴＸＢＰ５Ｌ、ＳＹＶＮ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＢＬ１Ｙ、ＴＨＯＣ３、ＴＬＥ１、ＴＬＥ２、ＴＬＥ３、ＴＯＰＯＲＳ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ７、ＴＲＡＩＰ、ＴＲＩＡＤ３、ＴＲＩＭ１、ＴＲＩＭ１０、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１２、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１４、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ１８、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２２、ＴＲＩＭ２３、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２６、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ３１、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３６、ＴＲＩＭ３７、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４０、ＴＲＩＭ４１、ＴＲＩＭ４４、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４７、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４、ＴＲＩＭ５５、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６２、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ７１、ＴＲＩＭ８、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＰ１２、ＴＲＰＣ４ＡＰ、ＴＳＳＣ１、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＢＥ３Ｃ、ＵＢＥ４Ａ、ＵＢＥ４Ｂ、ＵＢＯＸ５、ＵＢＲ１、ＵＢＲ２、ＵＢＲ３、ＵＢＲ４、ＵＨＲＦ１、ＵＨＲＦ２、ＶＨＬ、ＶＰＳ１８、ＷＤＲ１２、ＷＤＲ２３、ＷＤＲ２６、ＷＤＲ３、ＷＤＲ３１、ＷＤＲ３７、ＷＤＲ３９、ＷＤＲ４、ＷＤＲ４７、ＷＤＲ４８、ＷＤＲ５、ＷＤＲ５１Ｂ、ＷＤＲ５３、ＷＤＲ５７、ＷＤＲ５９、ＷＤＲ５Ｂ、ＷＤＲ６１、ＷＤＲ７６、ＷＤＲ７７、ＷＤＲ８２、ＷＤＲ８３、ＷＤＲ８６、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、ＺＮＦ２９４、ＺＮＦ３１３、ＺＮＦ３６４、ＺＮＲＦ１、ＺＮＲＦ２、ＺＹＧ１１Ａ、ＺＹＧ１１Ｂ、またはＺＹＧ１１ＢＬ。
ＡＭＦＲ、ＡＮＡＰＣ１１、ＡＰＧ１６Ｌ、ＡＲＩＨ１、ＡＲＩＨ２、ＡＲＰＣ１Ａ、ＡＲＰＣ１Ｂ、ＡＳＢ２、ＡＳＢ２、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＢＡＦ２５０、ＢＡＲＤ１、ＢＩＲＣ２、ＢＩＲＣ３、ＢＩＲＣ４、ＢＩＲＣ７、ＢＭＩ１、ＢＲＡＰ、ＢＲＣＡ１、ｂＴｒＣＰ、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＢＬＬ１、ＣＣＩＮ、ＣＣＩＮ、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＣＲＢＮ、ＣＨＦＲ、ＣＨＩＰ、ＣＮＯＴ４、ＣＯＰ１、ＣＳＡ、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、Ｄｄａ１、ＤＤＢ２、ＤＥＴ１、ＤＮＡＩ２、ＤＴＸ３、ＤＺＩＰ３、Ｅ６ＡＰ、ＥＤＤ、ＥＥＤ、ＥＮＣ１、ＥＮＣ１、ＦＡＮＣＬ、ＦＢＸＬ１、ＦＢＸＬ１０、ＦＢＸＬ１１、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１３、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＦＢＸＬ１６、ＦＢＸＬ１７、ＦＢＸＬ１８、ＦＢＸＬ１９、ＦＢＸＬ２０、ＦＢＸＬ２１、ＦＢＸＬ２２、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ４、ＦＢＸＬ５、ＦＢＸＬ７、ＦＢＸＬ８、ＦＢＸＯ１、ＦＢＸＯ１０、ＦＢＸＯ１１、ＦＢＸＯ１２、ＦＢＸＯ１３、ＦＢＸＯ１４、ＦＢＸＯ１５、ＦＢＸＯ１６、ＦＢＸＯ１７、ＦＢＸＯ１８、ＦＢＸＯ１９、ＦＢＸＯ２、ＦＢＸＯ２０、ＦＢＸＯ２１、ＦＢＸＯ２２、ＦＢＸＯ３、ＦＢＸＯ４、ＦＢＸＯ５、ＦＢＸＯ６、ＦＢＸＯ７、ＦＢＸＯ８、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＥＭ１Ａ、ＦＥＭ１Ｂ、ＦＥＭ１Ｃ、ＧＡＮ、ＧＡＮ、ＧＮＢ１、ＧＮＢ２、ＧＮＢ５、ＧＲＷＤ１、ＧＴＦ２Ｈ２、ＧＴＦ３Ｃ２、ＨＡＣＥ１、ＨＥＣＴＤ１、ＨＥＣＴＤ２、ＨＥＣＴＤ３、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ２、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＣ４、ＨＥＲＣ５、ＨＥＲＣ６、ＨＬＴＦ、ＨＯＩＰ、ＨＵＷＥ１、ＩＢＲＤＣ２、ＩＢＲＤＣ３、ＩＦＲＧ１５、ＩＰＰ、ＩＰＰ、ＩＴＣＨ、ＩＶＮＳ１ＡＢＰ、ＩＶＮＳ１ＡＢＰ、ＫＡＴＮＢ１、ＫＢＴＢＤ１０、ＫＢＴＢＤ１０、ＫＢＴＢＤ１１、ＫＢＴＢＤ１１、ＫＢＴＢＤ１２、ＫＢＴＢＤ１２、ＫＢＴＢＤ１３、ＫＢＴＢＤ１３、ＫＢＴＢＤ２、ＫＢＴＢＤ２、ＫＢＴＢＤ３、ＫＢＴＢＤ３、ＫＢＴＢＤ４、ＫＢＴＢＤ４、ＫＢＴＢＤ５、ＫＢＴＢＤ５、ＫＢＴＢＤ６、ＫＢＴＢＤ６、ＫＢＴＢＤ７、ＫＢＴＢＤ７、ＫＢＴＢＤ８、ＫＢＴＢＤ８、ＫＣＴＤ５、ＫＥＡＰ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＡＡ０３１７、ＫＩＡＡ０６１４、ＫＬＨＤＣ５、ＫＬＨＬ１、ＫＬＨＬ１、ＫＬＨＬ１０、ＫＬＨＬ１０、ＫＬＨＬ１１、ＫＬＨＬ１１、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１４、ＫＬＨＬ１４、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ１７、ＫＬＨＬ１７、ＫＬＨＬ１８、ＫＬＨＬ１８、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２２、ＫＬＨＬ２２、ＫＬＨＬ２３、ＫＬＨＬ２３、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ２５、ＫＬＨＬ２５、ＫＬＨＬ２６、ＫＬＨＬ２６、ＫＬＨＬ２８、ＫＬＨＬ２８、ＫＬＨＬ２９、ＫＬＨＬ２９、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ３０、ＫＬＨＬ３０、ＫＬＨＬ３１、ＫＬＨＬ３１、ＫＬＨＬ３２、ＫＬＨＬ３２、ＫＬＨＬ３３、ＫＬＨＬ３３、ＫＬＨＬ３４、ＫＬＨＬ３４、ＫＬＨＬ３５、ＫＬＨＬ３５、ＫＬＨＬ３６、ＫＬＨＬ３６、ＫＬＨＬ３８、ＫＬＨＬ３８、ＫＬＨＬ４、ＫＬＨＬ４、ＫＬＨＬ５、ＫＬＨＬ５、ＫＬＨＬ６、ＫＬＨＬ６、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ８、ＫＬＨＬ８、ＫＬＨＬ９、ＫＬＨＬ９、ＬＩＮＣＲ、ＬＮＸ１、ＬＲＲ１、ＬＲＲＣ４１、ＬＲＳＡＭ１、ＬＺＴＲ１、ＬＺＴＲ１、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＢ１８、ＭＡＧＥ－Ｂ１８、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥＣ２、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＬＩＮ、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＭＡＲＣＨ２、ＭＡＲＣＨ４、ＭＡＲＣＨ５、ＭＡＲＣＨ６、ＭＡＲＣＨ７、ＭＡＲＣＨ８、ＭＡＲＣＨ９、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＸ、ＭＧＲＮ１、ＭＩＢ１、ＭＩＢ２、ＭＩＤ１、ＭＫＲＮ１、ＭＮＡＴ１、ＭＵＦ１、ＭＵＬＡＮ、ＭＵＲＦ、ＭＹＣＢＰ２、ＭＹＬＩＰ、Ｎｅｄｄ４、ＮＥＤＤ４Ｌ、ＮＥＤＬ１、ＮＥＤＬ２、ＮＥＵＲＬ、ＮＥＵＲＬ２、ＮＬＥ１、ＮＵＰ４３、ＯＳＴＭ１、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＫ２、ＰＣＧＦ１、ＰＣＧＦ２、ＰＤＺＲＮ３、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ７、ＰＪＡ１、ＰＪＡ２、ＰＯＣ１Ａ、ＰＰＩＬ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＰＦ１９、ＰＷＰ１、ＲＡＣＫ１、ＲＡＤ１８、ＲＡＥ１、ＲＡＧ１、ＲＢＢＰ４、ＲＢＢＰ５、ＲＢＢＰ６、ＲＢＢＰ７、ＲＢＣＫ１、ＲＢＸ１、ＲＣＨＹ１、ＲＦＦＬ、ＲＦＰＬ４Ａ、ＲＦＷＤ２、ＲＩＮＧ１、ＲＮＦ１０３、ＲＮＦ１１、ＲＮＦ１１１、ＲＮＦ１１４、ＲＮＦ１２、ＲＮＦ１２３、ＲＮＦ１２５、ＲＮＦ１２８、ＲＮＦ１３、ＲＮＦ１３０、ＲＮＦ１３３、ＲＮＦ１３５、ＲＮＦ１３８、ＲＮＦ１３９、ＲＮＦ１４、ＲＮＦ１４４Ａ、ＲＮＦ１６７、ＲＮＦ１６８、ＲＮＦ１８０、ＲＮＦ１８１、ＲＮＦ１８２、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ１９、ＲＮＦ２、ＲＮＦ２０、ＲＮＦ２０、ＲＮＦ２１６、ＲＮＦ２５、ＲＮＦ３４、ＲＮＦ４、ＲＮＦ４０、ＲＮＦ４１、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ５、ＲＮＦ６、ＲＮＦ７、ＲＮＦ８、ＲＮＦ８５、ＲＰＴＯＲ、ＳＣＡＰ、ＳＨ３ＲＦ１、ＳＨＰＲＨ、ＳＩＡＨ１、ＳＩＡＨ２、ＳＭＵ１、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、ＳＰＯＰ、ＳＰＳＢ１、ＳＰＳＢ１、ＳＰＳＢ２、ＳＰＳＢ２、ＳＰＳＢ４、ＳＰＳＢ４、ＳＴＸＢＰ５Ｌ、ＳＹＶＮ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＢＬ１Ｙ、ＴＨＯＣ３、ＴＬＥ１、ＴＬＥ２、ＴＬＥ３、ＴＯＰＯＲＳ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ７、ＴＲＡＩＰ、ＴＲＩＡＤ３、ＴＲＩＭ１、ＴＲＩＭ１０、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１２、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１４、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ１８、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２２、ＴＲＩＭ２３、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２６、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ３１、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３６、ＴＲＩＭ３７、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４０、ＴＲＩＭ４１、ＴＲＩＭ４４、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４７、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４、ＴＲＩＭ５５、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６２、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ７１、ＴＲＩＭ８、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＰ１２、ＴＲＰＣ４ＡＰ、ＴＳＳＣ１、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＢＥ３Ｃ、ＵＢＥ４Ａ、ＵＢＥ４Ｂ、ＵＢＯＸ５、ＵＢＲ１、ＵＢＲ２、ＵＢＲ３、ＵＢＲ４、ＵＨＲＦ１、ＵＨＲＦ２、ＶＨＬ、ＶＰＳ１８、ＷＤＲ１２、ＷＤＲ２３、ＷＤＲ２６、ＷＤＲ３、ＷＤＲ３１、ＷＤＲ３７、ＷＤＲ３９、ＷＤＲ４、ＷＤＲ４７、ＷＤＲ４８、ＷＤＲ５、ＷＤＲ５１Ｂ、ＷＤＲ５３、ＷＤＲ５７、ＷＤＲ５９、ＷＤＲ５Ｂ、ＷＤＲ６１、ＷＤＲ７６、ＷＤＲ７７、ＷＤＲ８２、ＷＤＲ８３、ＷＤＲ８６、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、ＺＮＦ２９４、ＺＮＦ３１３、ＺＮＦ３６４、ＺＮＲＦ１、ＺＮＲＦ２、ＺＹＧ１１Ａ、ＺＹＧ１１Ｂ、またはＺＹＧ１１ＢＬ。
【0067】
実施態様において、該Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットはＣＲＢＮまたはＶＨＬである。
【0068】
実施態様において、該足場蛋白質はＥ３リガーゼ基質結合サブユニットと相互作用し、該足場蛋白質とＥ３リガーゼ基質結合サブユニットとの間の複合体はプレイと相互作用する、あるいはその相互作用は低分子によって誘導または媒介される。
【0069】
実施態様において、該足場は以下から選択される：
ＢＩＲＣ６、ＣＵＬ３、ＤＤＢ１、ＥＬＯＢ、ＥＬＯＣ、ＲＢＸ１、ＳＫＰ１、ＵＢＣＨ５Ａ、ＵＢＥ２Ａ、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ｂ２、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｄ１、ＵＢＥ２Ｄ２、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｄ４、ＵＢＥ２Ｅ１、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３、ＵＢＥ２Ｆ、ＵＢＥ２Ｇ１、ＵＢＥ２Ｇ２、ＵＢＥ２Ｈ、ＵＢＥ２Ｊ１、ＵＢＥ２Ｊ２、ＵＢＥ２Ｋ、ＵＢＥ２Ｌ３、ＵＢＥ２Ｌ６、ＵＢＥ２Ｍ、ＵＢＥ２Ｎ、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ、ＵＢＥ２Ｑ１、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１、ＵＢＥ２Ｒ２、ＵＢＥ２Ｓ、ＵＢＥ２Ｔ、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１、ＵＢＥ２Ｖ１、ＵＢＥ２Ｖ２、およびＵＢＥ２Ｗ。
ＢＩＲＣ６、ＣＵＬ３、ＤＤＢ１、ＥＬＯＢ、ＥＬＯＣ、ＲＢＸ１、ＳＫＰ１、ＵＢＣＨ５Ａ、ＵＢＥ２Ａ、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ｂ２、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｄ１、ＵＢＥ２Ｄ２、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｄ４、ＵＢＥ２Ｅ１、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３、ＵＢＥ２Ｆ、ＵＢＥ２Ｇ１、ＵＢＥ２Ｇ２、ＵＢＥ２Ｈ、ＵＢＥ２Ｊ１、ＵＢＥ２Ｊ２、ＵＢＥ２Ｋ、ＵＢＥ２Ｌ３、ＵＢＥ２Ｌ６、ＵＢＥ２Ｍ、ＵＢＥ２Ｎ、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ、ＵＢＥ２Ｑ１、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１、ＵＢＥ２Ｒ２、ＵＢＥ２Ｓ、ＵＢＥ２Ｔ、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１、ＵＢＥ２Ｖ１、ＵＢＥ２Ｖ２、およびＵＢＥ２Ｗ。
【0070】
いくつかの実施態様において、該足場蛋白質は、損傷ＤＮＡ結合蛋白質１（ＤＤＢ１）、カリン４Ａ（ＣＵＬ４Ａ）、およびカリン１の制御因子（ＲＯＣ１）から選択される。
【0071】
いくつかの実施態様において、プレイはＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質である。実施態様において、ＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、ｉの側鎖とｉ＋３のバックボーンＮＨとの間、およびｉのバックボーンのカルボニル酸素とｉ＋４のバックボーンＮＨとの間に水素結合を有するＡｓｘまたはＳＴモチーフなどの、水素結合受容体を有する側鎖を含むｉ－残基を有するｂ－ヘアピンａ－ターンを含む。実施態様において、ｉ＋４残基はグリシンである（ＧＳＰＴ１、ＣＫ１ａが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない）。実施態様において、ＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、システインである残基ｉおよびｉ＋３ならびにグリシンであるｉ＋４残基を含むｂ－ヘアピンａ－ターンを有する。該２つのＣｙｓ残基は亜鉛イオンに結合して、ターンの形態を強化する（ＩＫＺＦ１、ＺｎＦ６９２および以下の参考文献に報告されている全ての基質が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない：「ＣＲＢＮによってサリドマイド類似体の標的となるヒトＣ２Ｈ２ジンクフィンガーデグロムを絞り込む（Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｃ２Ｈ２ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｅｇｒｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｙ ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＲＢＮ）」、Ｓｉｅｖｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．３６２、Ｉｓｓｕｅ ６４１４、ＤＯＩ： １ ０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ． ａａｔ０５７２ （２０１８）；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。実施態様においては、ＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、ｉ＋３の位置にグリシンを含むｂ－ヘアピンｂ－ターンである「偽性ループ」を有する。ターン構造は、ｉ－１の側鎖の水素結合受容体とｉ＋３グリシンのカルボニルとの間の水素結合によって強化され得る。
【0072】
いくつかの実施態様において、プレイは、イカロス（Ｉｋａｒｏｓ）（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（Ｈｅｌｉｏｓ）（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（Ａｉｏｌｏｓ）（ＩＫＺＦ３）、Ｅｏｓ（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（Ｐｅｇａｓｕｓ）（ＩＫＺＦ５）、ＳＡＬＬ４、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、およびＺＦＰ９１のうちの１種類以上であるか、またはそれを含む。様々な実施態様において、プレイは、イカロス（Ｉｋａｒｏｓ）（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（Ｈｅｌｉｏｓ）（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（Ａｉｏｌｏｓ）（ＩＫＺＦ３）、Ｅｏｓ（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（Ｐｅｇａｓｕｓ）（ＩＫＺＦ５）、ＳＡＬＬ４、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、およびＺＦＰ９１のうちの１種類以上である。いくつかの実施態様において、プレイは、イカロス（Ｉｋａｒｏｓ）（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（Ｈｅｌｉｏｓ）（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（Ａｉｏｌｏｓ）（ＩＫＺＦ３）、Ｅｏｓ（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（Ｐｅｇａｓｕｓ）（ＩＫＺＦ５）、ＳＡＬＬ４、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、およびＺＦＰ９１のうちの１種類以上である。
【0073】
いくつかの実施態様において、該低分子または化合物は免疫調節物質である。いくつかの実施態様において、該化合物は、グルタルイミド環を含み、かつ任意選択的にフタルイミド環を含んでいてもよいグルタミン酸誘導体である。いくつかの実施態様において、該フタルイミド環は化学的に修飾される。いくつかの実施態様において、該グルタミン酸誘導体は本開示の実施態様にしたがう特性を有する合成誘導体であり得る。
【0074】
いくつかの実施態様において、該化合物は免疫調節薬剤または免疫調節性イミド薬剤（ＩＭｉＤ）として知られる化合物群の構成員である。
【0075】
実施態様において、該化合物はＩＭｉＤ様グルタルイミド環を含むが、それ以外は化学構造的に異なっており、ＣＲＢＮのグルタルアミド－ＩＭｉＤ（ＣＲＢＮのＩＭｉＤ結合ポケット）と同一または類似の低分子結合ポケットに結合する。実施態様において、該化合物はグルタルアミド環を含まずにＣＲＢＮのＩＭｉＤポケットに結合することができる。実施態様において、該化合物はＣＲＢＮに結合するがＩＭｉＤポケットには結合しない。実施態様においては、ＩＭｉＤポケットにおいて結合するＩＭｉＤまたはＩＭｉＤ様化合物と非競争的な様式で、該化合物がＣＲＢＮに結合する。
【0076】
いくつかの実施態様において、該化合物は：サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ＣＣ－２２０、ＣＣ－１２２、ＣＣ－８８５、またはその誘導体、類似体、光学異性体または光学異性体の混合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、共結晶、クラスレート、または多形体；またはＦＫ５０６（タクロリムス）、ラパマイシン（シロリムス）、およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはその誘導体または類似体と同一のＣＲＢＮベイト結合部位に競争的に結合する化合物；またはＦＫ５０６（タクロリムス）、ラパマイシン（シロリムス）、およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはその誘導体または類似体と同一のＦＫＢＰベイト結合部位に競争的に結合する化合物、である。
【0077】
実施態様においては、該化合物は、ＦＫ５０６（タクロリムス）、ラパマイシン（シロリムス）、およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはその誘導体または類似体；あるいはＦＫ５０６（タクロリムス）、ラパマイシン（シロリムス）、およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはその誘導体または類似体と同一のＦＫＢＰベイト結合部位に競争的に結合する化合物から選択される。
【0078】
いくつかの実施態様において、該化合物は、アバドミド、エンドミド、イベルドミド、レナリドミド、ミチンドミド、ポマリドミド、およびサリドマイド、またはその誘導体、類似体、光学異性体または光学異性体の混合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、共結晶、クラスレート、または多形体である。
【0079】
いくつかの実施態様において、本法はＣＲＢＮ、ＤＤＢ１、ＣＵＬ４Ａ、ＲＯＣ１、およびＶＨＬのうちの１種類以上をベイトとして含み、該ベイトを本明細書中に記載の化合物（例えば、ＣＲＢＮ、ＤＤＢ１、ＣＵＬ４Ａ、ＲＯＣ１、およびＶＨＬのうちの１種類以上に結合する化合物、例えば、ＩＭｉＤ）に接触させて、ベイトが該化合物によって調節される場合にベイトと相互作用するプレイを発見する。例えば、本法では、該化合物によって調節されるベイトに接触して相互作用するプレイを同定する。いくつかの実施態様において、該プレイは、ベイトと相互作用するので、動員および／または分解される。そのような実施態様において、該化合物はプレイと直接には相互作用しない（例えば、ベイトとプレイとの間の複合体において、該化合物はプレイには接触しなくてもよいが、それのみに限定されるものではない）；しかしながら、上記のみに限定されるものではない。
【0080】
いくつかの実施態様において、本法はＣＲＢＮの新規の基質またはネオ基質の同定を可能にする。
【0081】
様々な実施態様において、本法は新規分子相互作用を同定する。様々な実施態様において、本法は新規蛋白質／蛋白質相互作用を同定する。様々な実施態様においては、本法は低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される新規蛋白質／蛋白質相互作用を同定する。
【0082】
様々な実施態様において、本法は、順ＭＡＰＰＩＴで分析した場合には、非検出または検出不良である分子相互作用を同定する。様々な実施態様においては、本法は、順ＭＡＰＰＩＴで分析した場合には、非検出または検出不良である蛋白質／蛋白質相互作用を同定する。様々な実施態様においては、本法は、プレイ蛋白質またはベイト蛋白質との低分子の結合によって媒介される蛋白質／蛋白質相互作用であって、順ＭＡＰＰＩＴで分析した場合には、非検出または検出不良である蛋白質／蛋白質相互作用を同定する。
【0083】
様々な実施態様において、本法では、バックグラウンドシグナルが、順ＭＡＰＰＩＴに見られるバックグラウンドシグナルよりも低い。様々な実施態様において、本法は、順ＭＡＰＰＩＴに見られる偽陽性シグナルよりも偽陽性シグナルが少ない。
【0084】
様々な実施態様において、本発明は、順ＭＡＰＰＩＴおよび本明細書に記載の方法の両方を用いることによる、分子相互作用の検出を提供する。したがって、この組み合わせ法によって、単一の方法、すなわち順ＭＡＰＰＩＴおよび本明細書に記載の方法、を用いた場合には検出されない分子相互作用の検出が可能になる。
【0085】
いくつかの実施態様においては、本法では図２Ａ（右パネル）のシステムを用いる。
【0086】
いくつかの実施態様においては、本法では図３のシステムを用いる。
【0087】
実施例
実施例１：分子糊誘導性ＣＲＢＮ基質相互作用の検出に関する、ＭＡＰＰＩＴ順および逆アッセイ構成の比較
本実施例では、リガンド誘導性ＣＲＢＮ基質またはネオ基質を同定する目的で、Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５に記載の方法を利用するＭＡＰＰＩＴアッセイを用いる。従来型のＭＡＰＰＩＴアッセイは蛋白質／蛋白質相互作用をモニターするために用いられていた。ベイト蛋白質（蛋白質Ａ）を融合蛋白質として発現するが、該融合蛋白質では蛋白質Ａが、レプチン受容体の工学的に改変した細胞内受容体ドメインと遺伝子的に融合されており、該細胞内受容体ドメインはそれ自身がエリスロポエチン（Ｅｐｏ）受容体の細胞外ドメインに融合されている。該Ｅｐｏ受容体構成要素にＥｐｏリガンドが結合することによって、受容体結合細胞内ＪＡＫ２を活性化する。しかし、活性化ＪＡＫ２は、ＳＴＡＴ３結合およびそのリン酸化を引き起こすレプチン受容体を活性化できない；理由は、正常であれば活性化ＪＡＫ２によってリン酸化されるそのチロシン残基に変異が導入されているからである。代わりに蛋白質Ｂと蛋白質Ａの相互作用によって、ＪＡＫ２リン酸化可能ＳＴＡＴ３ドッキング部位の再構成を行う；これにより、蛋白質Ｂはｇｐ１３０受容体の細胞内ドメインに融合する（活性化ＪＡＫ２キナーゼが認識する適正なチロシン残基を含むことになる）。すなわち、蛋白質Ａと蛋白質Ｂの物理的相互作用または蛋白質Ａおよび蛋白質Ｂを含む蛋白質複合体の形成によって、ＥＰＯが惹起するＪＡＫ２－ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路の活性化が再構成される。ＳＴＡＴ３の活性化は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子または蛍光マーカー（ＧＦＰまたは他の種類の蛍光蛋白質（ＥＧＦＰなど）など）をコードする遺伝子を含むＳＴＡＴ３応答性レポーター遺伝子を導入することによってモニターできる。このようにして、ＭＡＰＰＩＴアッセイは無損傷細胞におけるそのような組換え蛋白質／蛋白質相互作用を評価する汎用アッセイを提供する。
実施例１：分子糊誘導性ＣＲＢＮ基質相互作用の検出に関する、ＭＡＰＰＩＴ順および逆アッセイ構成の比較
本実施例では、リガンド誘導性ＣＲＢＮ基質またはネオ基質を同定する目的で、Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５に記載の方法を利用するＭＡＰＰＩＴアッセイを用いる。従来型のＭＡＰＰＩＴアッセイは蛋白質／蛋白質相互作用をモニターするために用いられていた。ベイト蛋白質（蛋白質Ａ）を融合蛋白質として発現するが、該融合蛋白質では蛋白質Ａが、レプチン受容体の工学的に改変した細胞内受容体ドメインと遺伝子的に融合されており、該細胞内受容体ドメインはそれ自身がエリスロポエチン（Ｅｐｏ）受容体の細胞外ドメインに融合されている。該Ｅｐｏ受容体構成要素にＥｐｏリガンドが結合することによって、受容体結合細胞内ＪＡＫ２を活性化する。しかし、活性化ＪＡＫ２は、ＳＴＡＴ３結合およびそのリン酸化を引き起こすレプチン受容体を活性化できない；理由は、正常であれば活性化ＪＡＫ２によってリン酸化されるそのチロシン残基に変異が導入されているからである。代わりに蛋白質Ｂと蛋白質Ａの相互作用によって、ＪＡＫ２リン酸化可能ＳＴＡＴ３ドッキング部位の再構成を行う；これにより、蛋白質Ｂはｇｐ１３０受容体の細胞内ドメインに融合する（活性化ＪＡＫ２キナーゼが認識する適正なチロシン残基を含むことになる）。すなわち、蛋白質Ａと蛋白質Ｂの物理的相互作用または蛋白質Ａおよび蛋白質Ｂを含む蛋白質複合体の形成によって、ＥＰＯが惹起するＪＡＫ２－ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路の活性化が再構成される。ＳＴＡＴ３の活性化は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子または蛍光マーカー（ＧＦＰまたは他の種類の蛍光蛋白質（ＥＧＦＰなど）など）をコードする遺伝子を含むＳＴＡＴ３応答性レポーター遺伝子を導入することによってモニターできる。このようにして、ＭＡＰＰＩＴアッセイは無損傷細胞におけるそのような組換え蛋白質／蛋白質相互作用を評価する汎用アッセイを提供する。
【0088】
本実施例１では、本発明者らが開発した、特にＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用の判定に用いる（すなわち、特異的なＣＲＢＮベイト蛋白質を利用し、蛋白質複合体形成のリガンド依存性誘導についてアッセイする）ＭＡＰＰＩＴアッセイ派生法を用いた。以前に報告されている従来型のＭＡＰＰＩＴアッセイ構成（本明細書では、「順」とよぶ）では、目的のベイト蛋白質（本実施例１ではＣＲＢＮ）をＭＡＰＰＩＴキメラ膜受容体との融合物として発現し、相互作用する標的蛋白質を細胞内ｇｐ１３０受容体断片（本実施例１の場合には、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＩＫＺＦ３、ＳＡＬＬ４、ＺＦＰ９１またはＣＳＮＫ１Ａ１）に融合する。ここでは、ベイトとプレイ融合物とを逆にした「逆」アッセイ構成とよぶ、別のアッセイモードを例示する；すなわち、ＣＲＢＮベイトをｇｐ１３０断片に融合し、基質蛋白質を膜貫通キメラ受容体に融合する。
【0089】
古典的な順モードに比べて、この逆アッセイ構成は数々の利点を有する。第１に、天然には細胞質よりも他の細胞区画に局在する目的標的蛋白質は、ｇｐ１３０融合物として用いた場合には、膜結合ベイト（ここでは、ＣＲＢＮ）と相互作用ができるほど接近可能とはならない。この場合には、設定を逆にして、標的蛋白質をＭＡＰＰＩＴキメラ膜貫通受容体に連結して強制的に細胞質に局在化させることによって、この問題を解決し得る。そのような一例としてはＩＫＺＦ３が挙げられるが、これは実施例２で考察する。
【0090】
ｇｐ１３０融合構築物よりもＭＡＰＰＩＴ受容体融合物に標的／プレイ蛋白質を用いたほうが有益である別の例は、ｇｐ１３０－融合蛋白質としての標的／プレイ蛋白質が、相互作用する蛋白質ベイト以外のＭＡＰＰＩＴキメラ受容体構成要素（例えば、レプチン受容体の細胞内部分またはＪＡＫ２）に対して親和性を示す場合である。この場合には、上記の「接着性」によって、特異的ベイト／プレイ相互作用が非存在の状態であっても、高いレポーターシグナルを既に発生しており、そのことが特異的蛋白質／蛋白質または化合物誘導性ベイト／プレイ相互作用によって誘導されるさらなるシグナル増加を不明瞭にする可能性がある。その構成を逆にして、代わりにＭＡＰＰＩＴキメラ受容体に標的／プレイ蛋白質を融合することにより、そのようなバックグラウンドシグナルは防止される。実施例３においては、ＣＲＢＮとＣＳＮＫ１Ａ１（ＣＫ１ａ）との間の化合物誘導性相互作用について、このことを例示する。
【0091】
本実施例１では、蛋白質のＣＲＢＮに対するレナリドミド誘導性およびＣＣ－２２０誘導性結合の検出について、順および逆ＭＡＰＰＩＴアッセイ構成の両方を評価した。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＭＡＰＰＩＴ受容体融合物をコードするプラスミド（ｐＳＥＬ；順モードではＣＲＢＮ、または逆モードでは試験した基質／プレイ蛋白質のすべて）、ＭＡＰＰＩＴ ｇｐ１３０融合物をコードするプラスミド（逆モードではＣＲＢＮ、または順モードでは試験した基質／プレイ蛋白質のすべて）およびＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。試験した標的／プレイ蛋白質のそれぞれについて、完全長蛋白質を融合したが、例外は、ＩＫＺＦ１であり、この場合にはイソ型７を用いた。本実施例１に用いたＭＡＰＰＩＴ受容体融合物は、レプチン受容体の工学的に改変したシグナル伝達不全細胞内ドメインに融合した目的蛋白質（ＣＲＢＮまたは標的／プレイ蛋白質）であって、該細胞内ドメイン自体がエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体の細胞外ドメインに融合しているものから成る。受容体／受容体結合ＪＡＫ２活性化を促進するために、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインとレプチン受容体細胞外ドメイン（実施例４で用いられるように）を相互代替的に用いることができる（該活性化は、それぞれＥＰＯまたはレプチンによる）。形質転換から２４時間後に、表示用量の被検化合物の存在下または非存在下で、細胞をエリスロポエチン（ＥＰＯ）で処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。図から分かるように、ほとんどのＣＲＢＮ／（ネオ）基質／プレイ相互作用について、逆アッセイ構成のみが化合物誘導性ＣＲＢＮ相互作用を検出可能であった。
【0092】
実施例２：ｇｐ１３０融合物の免疫蛍光染色では、ＣＲＢＮ－ＩＫＺＦ３ ＭＡＰＰＩＴ順アッセイ構成におけるシグナル欠如に一致して、例外なくｇｐ１３０－ＩＫＺＦ３融合蛋白質が核内に局在することが分かる
本試験では、免疫蛍光染色によって、ｇｐ１３０融合蛋白質の細胞内局在を調べた。実施例１に記載のように、順構成のＭＡＰＰＩＴを用いた場合に特定の相互作用が検出されない理由は、ｇｐ１３０－標的融合蛋白質が細胞質内で発現していない可能性が考えられる。そこで、ポリＬリジンをコーティングしたガラススライドにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、２４時間後にＦｌａｇ－ｇｐ１３０－ＩＫＺＦ３をコードするプラスミドまたはＦｌａｇ－ｇｐ１３０－ＩＫＺＦ１（イソ型７）で形質転換した。さらに形質転換から２４時間後に、細胞をパラフォルムアルデヒドで固定し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００によって透過性処理してから抗Ｆｌａｇ （ＳＩＧＭＡ）１次抗体、および次いでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識２次抗体（ＴＨＥＲＭＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。同時に、核をＤＡＰＩ色素（ＳＩＧＭＡ）で染色した。この染色細胞調製物をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入溶液（ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で封入し、共焦点顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ）で撮像した。図５に示す画像上で、ｇｐ１３０融合蛋白質およびＤＡＰＩ染色は、それぞれ緑色および青色で示される。ＩＫＺＦ１ ｇｐ１３０融合蛋白質とＩＫＺＦ３ ｇｐ１３０融合蛋白質との間の細胞内局在の相違、すなわち発現がそれぞれ細胞質または核に局在することを、得られた顕微鏡像は明確に示しており、上記の考察にように、ＭＡＰＰＩＴ順アッセイ構成で得られた結果と整合している。
本試験では、免疫蛍光染色によって、ｇｐ１３０融合蛋白質の細胞内局在を調べた。実施例１に記載のように、順構成のＭＡＰＰＩＴを用いた場合に特定の相互作用が検出されない理由は、ｇｐ１３０－標的融合蛋白質が細胞質内で発現していない可能性が考えられる。そこで、ポリＬリジンをコーティングしたガラススライドにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、２４時間後にＦｌａｇ－ｇｐ１３０－ＩＫＺＦ３をコードするプラスミドまたはＦｌａｇ－ｇｐ１３０－ＩＫＺＦ１（イソ型７）で形質転換した。さらに形質転換から２４時間後に、細胞をパラフォルムアルデヒドで固定し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００によって透過性処理してから抗Ｆｌａｇ （ＳＩＧＭＡ）１次抗体、および次いでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識２次抗体（ＴＨＥＲＭＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。同時に、核をＤＡＰＩ色素（ＳＩＧＭＡ）で染色した。この染色細胞調製物をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入溶液（ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で封入し、共焦点顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ）で撮像した。図５に示す画像上で、ｇｐ１３０融合蛋白質およびＤＡＰＩ染色は、それぞれ緑色および青色で示される。ＩＫＺＦ１ ｇｐ１３０融合蛋白質とＩＫＺＦ３ ｇｐ１３０融合蛋白質との間の細胞内局在の相違、すなわち発現がそれぞれ細胞質または核に局在することを、得られた顕微鏡像は明確に示しており、上記の考察にように、ＭＡＰＰＩＴ順アッセイ構成で得られた結果と整合している。
【0093】
実施例３：ＣＳＮＫ１Ａ１－ｇｐ１３０融合物のＭＡＰＰＩＴキメラ受容体の共通構成要素に対する非特異的結合が高バックグラウンドのレポーターシグナルを与え、順アッセイ構成における化合物依存性シグナル検出を不明瞭にする
本実施例３では、Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５に記載のような、順ＭＡＰＰＩＴアッセイを用いて蛋白質／蛋白質相互作用の分析を行った。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＣＳＮＫ１Ａ１－ｇｐ１３０融合物 （Ｎ末端またはＣ末端のいずれに融合したもの）をコードするプラスミドおよびＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に、ＣＲＢＮまたは大腸菌ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）のいずれかに連結されたＭＡＰＰＩＴ受容体融合物（レプチン受容体の工学的に改変した細胞内ドメインに融合したＥＰＯ細胞外ドメイン；実施例１でも用いられている）をコードするプラスミドで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換から２４時間後に、細胞をＥＰＯ処理するか、または非処理のままにした。２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯで処理した細胞の非処理細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。観察された強いシグナルは、ＣＳＮＫ１Ａ１／ｇｐ１３０融合蛋白質とキメラ受容体蛋白質との間で起こる強力な相互作用であって、それに結合したベイト蛋白質の性質とは無関係な、すなわち、ベイト蛋白質以外の膜貫通キメラ受容体構成要素への結合を示唆する。実施例１でも考察しているが、この接着性は、順アッセイ構成においてＣＳＮＫ１Ａ１のＣＲＢＮとの相互作用分析を妨害する。図６を参照のこと。
本実施例３では、Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５に記載のような、順ＭＡＰＰＩＴアッセイを用いて蛋白質／蛋白質相互作用の分析を行った。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＣＳＮＫ１Ａ１－ｇｐ１３０融合物 （Ｎ末端またはＣ末端のいずれに融合したもの）をコードするプラスミドおよびＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に、ＣＲＢＮまたは大腸菌ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）のいずれかに連結されたＭＡＰＰＩＴ受容体融合物（レプチン受容体の工学的に改変した細胞内ドメインに融合したＥＰＯ細胞外ドメイン；実施例１でも用いられている）をコードするプラスミドで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換から２４時間後に、細胞をＥＰＯ処理するか、または非処理のままにした。２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯで処理した細胞の非処理細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。観察された強いシグナルは、ＣＳＮＫ１Ａ１／ｇｐ１３０融合蛋白質とキメラ受容体蛋白質との間で起こる強力な相互作用であって、それに結合したベイト蛋白質の性質とは無関係な、すなわち、ベイト蛋白質以外の膜貫通キメラ受容体構成要素への結合を示唆する。実施例１でも考察しているが、この接着性は、順アッセイ構成においてＣＳＮＫ１Ａ１のＣＲＢＮとの相互作用分析を妨害する。図６を参照のこと。
【0094】
実施例４：ＭＡＰＰＩＴ逆ＣＲＢＮ相互作用アッセイにおける、代替的ＣＳＮＫ１Ａ１キメラ受容体融合蛋白質の評価
ここでは、ＣＲＢＮとＣＳＮＫ１Ａ１ネオ基質との間のレナリドミド依存性相互作用およびＣＣ－２２０依存性相互作用の検出に関して、逆ＭＡＰＰＩＴ相互作用アッセイを用いたが、実施例１で考察したものに類似しているものの、代替的ＣＳＮＫ１Ａ１受容体融合物を利用した点において相違がある。既に実施例１で言及しているように、ＥＰＯ細胞外ドメインをレプチン受容体の細胞外ドメインで代替した代替的受容体融合物が利用可能であるが、そのアッセイシステムでは、ＥＰＯの代わりにレプチンで活性化を行う。本実施例では、文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、レプチン受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴ受容体融合物に融合したＣＳＮＫ１Ａ１をコードするプラスミド（ｐＣＬＧ－ＣＳＮＫ１Ａ１）、部分的ｇｐ１３０ドメインに融合したＣＲＢＮをコードするプラスミドおよびＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量の被検化合物の存在下または非存在下で、細胞をレプチンで処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、レプチン＋被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図７のデータは、この代替的ＭＡＰＰＩＴ受容体融合物も、逆アッセイ構成においてＣＲＢＮとの分子糊依存性ネオ基質相互作用の検出を可能にすることを示唆している。
ここでは、ＣＲＢＮとＣＳＮＫ１Ａ１ネオ基質との間のレナリドミド依存性相互作用およびＣＣ－２２０依存性相互作用の検出に関して、逆ＭＡＰＰＩＴ相互作用アッセイを用いたが、実施例１で考察したものに類似しているものの、代替的ＣＳＮＫ１Ａ１受容体融合物を利用した点において相違がある。既に実施例１で言及しているように、ＥＰＯ細胞外ドメインをレプチン受容体の細胞外ドメインで代替した代替的受容体融合物が利用可能であるが、そのアッセイシステムでは、ＥＰＯの代わりにレプチンで活性化を行う。本実施例では、文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、レプチン受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴ受容体融合物に融合したＣＳＮＫ１Ａ１をコードするプラスミド（ｐＣＬＧ－ＣＳＮＫ１Ａ１）、部分的ｇｐ１３０ドメインに融合したＣＲＢＮをコードするプラスミドおよびＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量の被検化合物の存在下または非存在下で、細胞をレプチンで処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、レプチン＋被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図７のデータは、この代替的ＭＡＰＰＩＴ受容体融合物も、逆アッセイ構成においてＣＲＢＮとの分子糊依存性ネオ基質相互作用の検出を可能にすることを示唆している。
【0095】
実施例５：順および逆ＭＡＰＰＩＴアッセイ構成における、化合物誘導性ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）基質相互作用の検出
本実施例では、ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）とＭＴＯＲおよびカルシニューリンサブユニットとの化合物依存性相互作用の検出に関して、順および逆ＭＡＰＰＩＴアッセイ構成を比較した。実験設定は実施例１に記載の方法にしたがい、以下のＭＡＰＰＩＴ受容体およびｇｐ１３０融合物をコードするプラスミド構築物を用いた：順モードでは、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴキメラ受容体構築物にＦＫＢＰ１２ベイトを融合（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰ１Ａ）し、標的蛋白質は部分的ｇｐ１３０ドメイン（ＭＴＯＲ ＦＲＢドメインまたはＰＰＰ３ＣＡ）に融合した；逆モードアッセイでは、ＦＫＢＰ１Ａベイトを部分的ｇｐ１３０ドメインに融合し、ＭＴＯＲ（ＦＲＢ）またはＰＰＰ３ＣＡをＭＡＰＰＩＴ膜貫通受容体に融合した（ｐＳＥＬ－ＭＴＯＲ（ＦＲＢ）およびｐＳＥＬ－ＰＰＰ３ＣＡ）。カルシニューリン相互作用については、付加的にもうひとつのアッセイ設定を用いたが、その設定では、ＭＡＰＰＩＴ受容体およびｇｐ１３０融合物に加えて、非融合ＰＰＰ３Ｒ２を発現するプラスミドを共発現させた。ＰＰＰ３Ｒ２はカルシニューリン調節サブユニットをコードし、またＦＫ５０６マクロライド誘導性ＦＫＢＰ１Ａ－カルシニューリン相互作用を増強／促進することが報告されている。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、表示の受容体をコードするプラスミドおよびｇｐ１３０をコードするプラスミドおよびＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量の被検化合物（ラパマイシンまたはＦＫ５０６）の存在下または非存在下で、細胞をＥＰＯで処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。図８Ａ～Ｃに示す結果は、順および逆アッセイモードの両方がＦＫＢＰ１２相互作用を検出可能であることを示している。
本実施例では、ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）とＭＴＯＲおよびカルシニューリンサブユニットとの化合物依存性相互作用の検出に関して、順および逆ＭＡＰＰＩＴアッセイ構成を比較した。実験設定は実施例１に記載の方法にしたがい、以下のＭＡＰＰＩＴ受容体およびｇｐ１３０融合物をコードするプラスミド構築物を用いた：順モードでは、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴキメラ受容体構築物にＦＫＢＰ１２ベイトを融合（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰ１Ａ）し、標的蛋白質は部分的ｇｐ１３０ドメイン（ＭＴＯＲ ＦＲＢドメインまたはＰＰＰ３ＣＡ）に融合した；逆モードアッセイでは、ＦＫＢＰ１Ａベイトを部分的ｇｐ１３０ドメインに融合し、ＭＴＯＲ（ＦＲＢ）またはＰＰＰ３ＣＡをＭＡＰＰＩＴ膜貫通受容体に融合した（ｐＳＥＬ－ＭＴＯＲ（ＦＲＢ）およびｐＳＥＬ－ＰＰＰ３ＣＡ）。カルシニューリン相互作用については、付加的にもうひとつのアッセイ設定を用いたが、その設定では、ＭＡＰＰＩＴ受容体およびｇｐ１３０融合物に加えて、非融合ＰＰＰ３Ｒ２を発現するプラスミドを共発現させた。ＰＰＰ３Ｒ２はカルシニューリン調節サブユニットをコードし、またＦＫ５０６マクロライド誘導性ＦＫＢＰ１Ａ－カルシニューリン相互作用を増強／促進することが報告されている。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、表示の受容体をコードするプラスミドおよびｇｐ１３０をコードするプラスミドおよびＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量の被検化合物（ラパマイシンまたはＦＫ５０６）の存在下または非存在下で、細胞をＥＰＯで処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。図８Ａ～Ｃに示す結果は、順および逆アッセイモードの両方がＦＫＢＰ１２相互作用を検出可能であることを示している。
【0096】
実施例６：ＣＲＢＮとＤＨＦＲとの間のレナリドミド・ハイブリッドリガンド誘導性結合の評価
ここでは、ＰＥＧリンカーを介してＣＲＢＮリガンドであるレナリドミド（ＬＥＮ）に融合したＤＨＦＲリガンド・トリメトプリム（ＴＭＰ）から成るハイブリッド分子によって誘導されるＣＲＢＮとＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）との間の結合に関する評価を、ＭＡＰＰＩＴ逆アッセイモードを用いて行った。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に、レプチン受容体細胞外ドメインを含むキメラＭＡＰＰＩＴ派生的受容体に連結した（大腸菌）ＤＨＦＲアンカー蛋白質の融合構築物をコードするプラスミド（ｐＣＬＧ－ＤＨＦＲ）およびｇｐ１３０－ＣＲＢＮベイト融合構築物で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示濃度のＴＭＰ－ＬＥＮハイブリッドリガンドの存在下および非存在下で細胞をレプチン処理し、さらに２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。図９に示す用量応答曲線は、レプチン＋被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表す。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。本明細書に記載のＭＡＰＰＩＴ逆アッセイを用いることにより、ハイブリッドリガンドで誘導される２蛋白質間の結合が評価可能であることを、本実施例は示唆している。
ここでは、ＰＥＧリンカーを介してＣＲＢＮリガンドであるレナリドミド（ＬＥＮ）に融合したＤＨＦＲリガンド・トリメトプリム（ＴＭＰ）から成るハイブリッド分子によって誘導されるＣＲＢＮとＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）との間の結合に関する評価を、ＭＡＰＰＩＴ逆アッセイモードを用いて行った。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に、レプチン受容体細胞外ドメインを含むキメラＭＡＰＰＩＴ派生的受容体に連結した（大腸菌）ＤＨＦＲアンカー蛋白質の融合構築物をコードするプラスミド（ｐＣＬＧ－ＤＨＦＲ）およびｇｐ１３０－ＣＲＢＮベイト融合構築物で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示濃度のＴＭＰ－ＬＥＮハイブリッドリガンドの存在下および非存在下で細胞をレプチン処理し、さらに２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。図９に示す用量応答曲線は、レプチン＋被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表す。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。本明細書に記載のＭＡＰＰＩＴ逆アッセイを用いることにより、ハイブリッドリガンドで誘導される２蛋白質間の結合が評価可能であることを、本実施例は示唆している。
【0097】
実施例７：ＣＲＢＮ逆ＭＡＰＰＩＴアッセイを用いた、ＣＲＢＮへの分子糊結合の特徴付け
実施例６に記載のようなＭＡＰＰＩＴアッセイを用いて、ＣＲＢＮに対する分子糊結合の評価を行った；すなわち、細胞内におけるＣＲＢＮへの結合に関して、被検化合物がＴＭＰ－レナリドミド・ハイブリッドリガンドと競争する能力を判定することによって評価した。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、変異レプチン受容体の細胞内ドメインの末尾に融合した大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードするプラスミド（ｐＣＬＧ－ＤＨＦＲ）、ｇｐ１３０細胞内ドメインを融合したＣＲＢＮプレイをコードするプラスミド、またはＤＨＦＲ融合蛋白質のレプチン受容体に直接相互作用可能なｇｐ１３０－ＲＥＭ２対照融合物をコードするプラスミド、およびＳＴＡＴ３応答性ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミドで、標準的な形質転換法を用いて、実施例６と同様にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量の被検化合物の存在下および非存在下で、細胞をレプチン処理してレプチン受容体融合蛋白質を活性化し、３００ｎＭのＴＭＰ－レナリドミド融合化合物（トリメトプリムがＤＨＦＲと相互作用し、レナリドミドがＣＲＢＮと相互作用するハイブリッドリガンド）を添加した。化合物処理の２４時間後に、ＤＨＦＲ－ＴＭＰ－レナリドミド－ＣＲＢＮを含む三重複合体の形成によって誘導されるルシフェラーゼ活性、およびその結果生じたＳＴＡＴ３シグナル伝達活性化を、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図１０Ａ～Ｂのデータ点は、レプチン（ＣＴＲＬ）またはレプチン＋ハイブリッドリガンド（ＣＲＢＮ）のみで処理した試料に対して相対的な、ＲＥＭ２対照（ＣＴＲＬ）についてレプチン＋被検化合物で処理した細胞またはレプチン＋ハイブリッドリ細胞ガンド＋被検化合物（ＣＲＢＮ）で処理した細胞の平均ルシフェラーゼ活性（三重試料）を表している（両方の場合について、添加被検化合物の非存在下で取得したシグナルをｙ軸において１００％ルシフェラーゼ活性と設定する）。誤差棒は標準偏差を表す。曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。図１０Ａ～Ｂから分かるように、レナリドミド（ＬＥＮ）、ポマリドミド（ＰＯＭ）、ＣＣ－１２２およびＣＣ－２２０などの公知のＩＭｉＤ化合物は、ハイブリッドリガンド誘導性ルシフェラーゼレポーターの活性化を特異的に用量依存性に阻害する。このことは、ＣＲＢＮへの結合およびハイブリッドリガンドとＣＲＢＮとの結合の阻害（つまり、アッセイシグナルの阻害）に関する競争が有効であることを反映している。さらに、本アッセイで複数の別の化合物（Ｃｍｐｄ１、ｃｍｐｄ２、ｃｍｐｄ３およびｃｍｐｄ４）についても評価し、様々なレベルの効能（マイクロモル（Ｃｍｐｄ１）からナノモル（Ｃｍｐｄ４）の範囲の親和性）でＴＭＰ－ＬＥＮ誘導性ルシフェラーゼ・シグナルを特異的に阻害することが明らかになった。
実施例６に記載のようなＭＡＰＰＩＴアッセイを用いて、ＣＲＢＮに対する分子糊結合の評価を行った；すなわち、細胞内におけるＣＲＢＮへの結合に関して、被検化合物がＴＭＰ－レナリドミド・ハイブリッドリガンドと競争する能力を判定することによって評価した。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、変異レプチン受容体の細胞内ドメインの末尾に融合した大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードするプラスミド（ｐＣＬＧ－ＤＨＦＲ）、ｇｐ１３０細胞内ドメインを融合したＣＲＢＮプレイをコードするプラスミド、またはＤＨＦＲ融合蛋白質のレプチン受容体に直接相互作用可能なｇｐ１３０－ＲＥＭ２対照融合物をコードするプラスミド、およびＳＴＡＴ３応答性ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミドで、標準的な形質転換法を用いて、実施例６と同様にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量の被検化合物の存在下および非存在下で、細胞をレプチン処理してレプチン受容体融合蛋白質を活性化し、３００ｎＭのＴＭＰ－レナリドミド融合化合物（トリメトプリムがＤＨＦＲと相互作用し、レナリドミドがＣＲＢＮと相互作用するハイブリッドリガンド）を添加した。化合物処理の２４時間後に、ＤＨＦＲ－ＴＭＰ－レナリドミド－ＣＲＢＮを含む三重複合体の形成によって誘導されるルシフェラーゼ活性、およびその結果生じたＳＴＡＴ３シグナル伝達活性化を、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図１０Ａ～Ｂのデータ点は、レプチン（ＣＴＲＬ）またはレプチン＋ハイブリッドリガンド（ＣＲＢＮ）のみで処理した試料に対して相対的な、ＲＥＭ２対照（ＣＴＲＬ）についてレプチン＋被検化合物で処理した細胞またはレプチン＋ハイブリッドリ細胞ガンド＋被検化合物（ＣＲＢＮ）で処理した細胞の平均ルシフェラーゼ活性（三重試料）を表している（両方の場合について、添加被検化合物の非存在下で取得したシグナルをｙ軸において１００％ルシフェラーゼ活性と設定する）。誤差棒は標準偏差を表す。曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。図１０Ａ～Ｂから分かるように、レナリドミド（ＬＥＮ）、ポマリドミド（ＰＯＭ）、ＣＣ－１２２およびＣＣ－２２０などの公知のＩＭｉＤ化合物は、ハイブリッドリガンド誘導性ルシフェラーゼレポーターの活性化を特異的に用量依存性に阻害する。このことは、ＣＲＢＮへの結合およびハイブリッドリガンドとＣＲＢＮとの結合の阻害（つまり、アッセイシグナルの阻害）に関する競争が有効であることを反映している。さらに、本アッセイで複数の別の化合物（Ｃｍｐｄ１、ｃｍｐｄ２、ｃｍｐｄ３およびｃｍｐｄ４）についても評価し、様々なレベルの効能（マイクロモル（Ｃｍｐｄ１）からナノモル（Ｃｍｐｄ４）の範囲の親和性）でＴＭＰ－ＬＥＮ誘導性ルシフェラーゼ・シグナルを特異的に阻害することが明らかになった。
【0098】
実施例８：ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）とＤＨＦＲとの間のＴＭＰ－ＦＫ５０６ハイブッドリガンド誘導性結合の逆ＭＡＰＰＩＴによる検出
ＰＥＧリンカーを介してＦＫＢＰ１ＡリガンドＦＫ５０６に融合したＤＨＦＲリガンド・トリメトプリム（ＴＭＰ）から成るハイブリッド分子によって誘導されるＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）とＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）との間の結合を、ＭＡＰＰＩＴ逆アッセイモードを用いて試験した。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に、レプチン受容体細胞外ドメインを含むキメラＭＡＰＰＩＴ派生的受容体に連結した（大腸菌）ＤＨＦＲアンカー蛋白質の融合構築物をコードするプラスミド（ｐＣＬＧ－ＤＨＦＲ）およびｇｐ１３０－ＦＫＢＰ１Ａベイト融合構築物で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示濃度のＴＭＰ－ＦＫ５０６ハイブリッドリガンドの存在下および非存在下で、細胞をレプチン処理し、さらに２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。図１１に示す用量応答曲線は、レプチン＋被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。逆ＭＡＰＰＩＴアッセイモードはまた、ＦＫＢＰ１Ａへのハイブリッドリガンド誘導性蛋白質動員の検出を可能にすることを、これらのデータは示唆している。
ＰＥＧリンカーを介してＦＫＢＰ１ＡリガンドＦＫ５０６に融合したＤＨＦＲリガンド・トリメトプリム（ＴＭＰ）から成るハイブリッド分子によって誘導されるＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）とＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）との間の結合を、ＭＡＰＰＩＴ逆アッセイモードを用いて試験した。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に、レプチン受容体細胞外ドメインを含むキメラＭＡＰＰＩＴ派生的受容体に連結した（大腸菌）ＤＨＦＲアンカー蛋白質の融合構築物をコードするプラスミド（ｐＣＬＧ－ＤＨＦＲ）およびｇｐ１３０－ＦＫＢＰ１Ａベイト融合構築物で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示濃度のＴＭＰ－ＦＫ５０６ハイブリッドリガンドの存在下および非存在下で、細胞をレプチン処理し、さらに２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。図１１に示す用量応答曲線は、レプチン＋被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。逆ＭＡＰＰＩＴアッセイモードはまた、ＦＫＢＰ１Ａへのハイブリッドリガンド誘導性蛋白質動員の検出を可能にすることを、これらのデータは示唆している。
【0099】
実施例９：ＭＡＰＰＩＴ順および逆構成を用いた、ＲＢＭ３９のＤＣＡＦ１５へのスルホンアミド誘導性結合についての評価
本実施例では、ＤＣＡＦ１５とＲＢＭ３９との間の結合を誘導するスルホンアミド類の評価を可能にするＭＡＰＰＩＴ順および逆アッセイを開発した。ＤＣＡＦ１５は、後に起こるユビキチン化の基質としてＲＢＭ３９を動員することが示されているＥ３リガーゼ基質受容体であり、この動員はインジスラム、タシスラム、クロロキノキサリンスルホンアミド（ＣＱＳ）およびＥ７８２０などのスルホンアミド類に依存性である。実験設定は上述の方法にしたがい、以下のＭＡＰＰＩＴ受容体およびｇｐ１３０融合物をコードするプラスミド構築物を用いた：順モードでは、レプチン受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴキメラ受容体構築物にＤＣＡＦ１５ベイトを融合（ｐＣＬＬ－ＤＣＡＦ１５）し、ＲＢＭ３９蛋白質を部分的ｇｐ１３０ドメインに融合した；逆モードでは、ＤＣＡＦ１５ベイトを部分的ｇｐ１３０ドメインに融合し、ＲＢＭ３９をＭＡＰＰＩＴ膜貫通受容体に融合した（ｐＣＬＧ－ＲＢＭ３９）。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、表示の受容体をコードするプラスミドおよびｇｐ１３０をコードするプラスミド、およびＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量の被検化合物（インジスラム、タシスラム、ＣＱＳまたはＥ７８２０）の存在下または非存在下で、細胞をレプチンで処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、レプチン＋被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。図１２に示す結果は、逆アッセイモードでのみ、スルホンアミド誘導性ＤＣＡＦ１５／ＲＢＭ３９結合が検出可能であることを示唆している。
本実施例では、ＤＣＡＦ１５とＲＢＭ３９との間の結合を誘導するスルホンアミド類の評価を可能にするＭＡＰＰＩＴ順および逆アッセイを開発した。ＤＣＡＦ１５は、後に起こるユビキチン化の基質としてＲＢＭ３９を動員することが示されているＥ３リガーゼ基質受容体であり、この動員はインジスラム、タシスラム、クロロキノキサリンスルホンアミド（ＣＱＳ）およびＥ７８２０などのスルホンアミド類に依存性である。実験設定は上述の方法にしたがい、以下のＭＡＰＰＩＴ受容体およびｇｐ１３０融合物をコードするプラスミド構築物を用いた：順モードでは、レプチン受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴキメラ受容体構築物にＤＣＡＦ１５ベイトを融合（ｐＣＬＬ－ＤＣＡＦ１５）し、ＲＢＭ３９蛋白質を部分的ｇｐ１３０ドメインに融合した；逆モードでは、ＤＣＡＦ１５ベイトを部分的ｇｐ１３０ドメインに融合し、ＲＢＭ３９をＭＡＰＰＩＴ膜貫通受容体に融合した（ｐＣＬＧ－ＲＢＭ３９）。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、表示の受容体をコードするプラスミドおよびｇｐ１３０をコードするプラスミド、およびＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量の被検化合物（インジスラム、タシスラム、ＣＱＳまたはＥ７８２０）の存在下または非存在下で、細胞をレプチンで処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、レプチン＋被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。図１２に示す結果は、逆アッセイモードでのみ、スルホンアミド誘導性ＤＣＡＦ１５／ＲＢＭ３９結合が検出可能であることを示唆している。
【0100】
実施例１０：新規分子糊誘導性のＣＲＢＮへのＳＡＬＬ４動員に関する化合物スクリーニング
本実施例では、ＣＲＢＮに対するＳＡＬＬ４動員を誘導する化合物を同定するために、実施例１にも記載されている逆ＭＡＰＰＩＴ ＣＲＢＮ－ＳＡＬＬ４動員アッセイを用いて、９６種類のＩＭｉＤおよびＩＭｉＤ様分子糊から成る化合物集合体をマイクロタイタープレート形態でスクリーニングした。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むキメラＭＡＰＰＩＴ膜受容体に融合したＳＡＬＬ４の融合構築物をコードするプラスミド（ｐＳＥＬ－ＳＡＬＬ４）およびｇｐ１３０－ＣＲＢＮベイト融合構築物で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、細胞をＥＰＯおよび化合物（または陰性対照としてのＤＭＳＯ）で処理した。各化合物について３種類の濃度（図１３Ａ～Ｃにおいて、「低」、「中」および「高」と表示されている）を用いた：すなわち、以前に評価した化合物の細胞毒性レベルに応じて、０．８、４および２０μＭまたは０．２、１および５μＭのいずれかを用い、各化合物濃度はそれぞれ２回試験した。化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図１３Ａ～Ｃ（左パネル）に示すグラフは、化合物処理試料およびＤＭＳＯ処理対照の両方について平均ルシフェラーゼ・シグナル（生データ）の頻度分布を示しており、またそれぞれのグラフは試験を行った３種類の化合物濃度（低、中、および高）の１つについてのデータに対応している。化合物処理試料に対応する、２峰性分布の右にシフトした部分はバックグラウンドより高いシグナルを有する化合物を表し、したがってそれらの化合物はＣＲＢＮに対するＳＡＬＬ４の動員を誘導する。３つの試験濃度のうちの１つ以上の濃度において、バックグラウンドよりも高いレポーターシグナルを示す３種類の化合物について、ルシフェラーゼ・シグナルに線（点線、破線または実線）で印付けしている；また、対応する用量応答曲線を右パネルに示す。これら用量応答曲線は、第１スクリーニングに用いたアッセイ設定およびプロトコルと同様のものを用いて得られたが、ここでは表示濃度の９点の用量範囲について試験した。ここでデータ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。まとめると、本実施例に記載したＭＡＰＰＩＴ逆アッセイが、ＣＲＢＮへの公知および新規の分子糊誘導性基質動員を同定する化合物集合体スクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。図１３Ａ～Ｃは、特にＣＲＢＮに対する糊誘導性ＳＡＬＬ４動員に関する化合物スクリーニングの例示であるが、このアプローチは他の潜在的な基質のスクリーニングにも応用可能である。
本実施例では、ＣＲＢＮに対するＳＡＬＬ４動員を誘導する化合物を同定するために、実施例１にも記載されている逆ＭＡＰＰＩＴ ＣＲＢＮ－ＳＡＬＬ４動員アッセイを用いて、９６種類のＩＭｉＤおよびＩＭｉＤ様分子糊から成る化合物集合体をマイクロタイタープレート形態でスクリーニングした。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むキメラＭＡＰＰＩＴ膜受容体に融合したＳＡＬＬ４の融合構築物をコードするプラスミド（ｐＳＥＬ－ＳＡＬＬ４）およびｇｐ１３０－ＣＲＢＮベイト融合構築物で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、細胞をＥＰＯおよび化合物（または陰性対照としてのＤＭＳＯ）で処理した。各化合物について３種類の濃度（図１３Ａ～Ｃにおいて、「低」、「中」および「高」と表示されている）を用いた：すなわち、以前に評価した化合物の細胞毒性レベルに応じて、０．８、４および２０μＭまたは０．２、１および５μＭのいずれかを用い、各化合物濃度はそれぞれ２回試験した。化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図１３Ａ～Ｃ（左パネル）に示すグラフは、化合物処理試料およびＤＭＳＯ処理対照の両方について平均ルシフェラーゼ・シグナル（生データ）の頻度分布を示しており、またそれぞれのグラフは試験を行った３種類の化合物濃度（低、中、および高）の１つについてのデータに対応している。化合物処理試料に対応する、２峰性分布の右にシフトした部分はバックグラウンドより高いシグナルを有する化合物を表し、したがってそれらの化合物はＣＲＢＮに対するＳＡＬＬ４の動員を誘導する。３つの試験濃度のうちの１つ以上の濃度において、バックグラウンドよりも高いレポーターシグナルを示す３種類の化合物について、ルシフェラーゼ・シグナルに線（点線、破線または実線）で印付けしている；また、対応する用量応答曲線を右パネルに示す。これら用量応答曲線は、第１スクリーニングに用いたアッセイ設定およびプロトコルと同様のものを用いて得られたが、ここでは表示濃度の９点の用量範囲について試験した。ここでデータ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより４パラメーター非線型回帰を用いて行った。まとめると、本実施例に記載したＭＡＰＰＩＴ逆アッセイが、ＣＲＢＮへの公知および新規の分子糊誘導性基質動員を同定する化合物集合体スクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。図１３Ａ～Ｃは、特にＣＲＢＮに対する糊誘導性ＳＡＬＬ４動員に関する化合物スクリーニングの例示であるが、このアプローチは他の潜在的な基質のスクリーニングにも応用可能である。
【0101】
実施例１１：逆ＭＡＰＰＩＴ ＯＲＦ ｃＤＮＡライブラリースクリーニングアプローチを用いた新規分子糊誘導性ＣＲＢＮ基質の同定
リガンド誘導性ＣＲＢＮ基質またはネオ基質を同定する目的で、Ｌｉｅｖｅｎｓらの文献（「ヒト細胞におけるプロテオームスケールの２蛋白質インタラクトミックス（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｂｉｎａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ）」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １ ５．１２ （２０１６）： ３６２４－３６３９）に記載の方法を用いて、ＭＡＰＰＩＴ細胞マイクロアレイ・スクリーニングを実施した。簡単に説明すると、ｇｐ１３０－ＣＲＢＮ融合構築物をコードするＣＲＢＮベイト発現プラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。次いで、１５，０００種類を超えるＯＲＦを網羅するＭＡＰＰＩＴキメラ膜受容体融合発現プラスミド集合体を含むマイクロアレイ・スクリーニングプレートに、これら形質転換細胞を添加した。マイクロアレイの各スポットは、異なるキメラ受容体ＯＲＦ融合発現プラスミドならびにＳＴＡＴ３応答性蛍光蛋白質をコードするレポータープラスミドを含有していた。したがって、これらのスポット上に到達して接着したＧｐ１３０－ＣＲＢＮベイト形質転換細胞はいずれも受容体ＯＲＦプレイプラスミドおよびレポータープラスミドで形質転換されるので、異なるそれぞれのマイクロアレイスポット上の細胞が異なるＣＲＢＮ－ＯＲＦの組み合わせで試験される。形質転換から２４時間後に、ＣＲＢＮリガンドＣＣ－２２０（最終濃度、１μＭ）の存在下または非存在下で、細胞をエリスロポエチンで特異的に刺激し、４８時間後にレポーターシグナル（ＧＦＰ様蛍光レポーター）を測定した。蛍光強度のデータを以前に報告されているような方法で分析して、ボルケーノプロットを作成した；図１４に示されるように、このプロットでは、各マイクロアレイの細胞クラスターの積算蛍光強度（Ｙ軸）に基づいて算出したｑ値を、対応する細胞クラスターの蛍光粒子数（Ｘ軸）の中央値の比に対して示す。逆ＭＡＰＰＩＴアッセイ設定を用いた用量応答を確認するために、強いシグナルを示す３種類のＯＲＦ ｃＤＮＡ（図１４において、ドットプロット上の矢印で示される）を選択した。対応する受容体ＯＲＦプラスミドおよびルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、ｇｐ１３０－ＣＲＢＮ融合プラスミドで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示濃度のＣＣ－２２０の存在下または非存在下で細胞をＥＰＯ処理し、さらに２４時間後にルシフェラーゼ活性を判定した。用量応答曲線は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより、４パラメーター非線型回帰を用いて行った。本実施例でＣＣ－２２０について例示されるように、本明細書に記載の逆ＭＡＰＰＩＴアッセイが、公知および新規の分子糊誘導性ＣＲＢＮ基質を同定するＯＲＦ ｃＤＮＡ集合体をスクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。
リガンド誘導性ＣＲＢＮ基質またはネオ基質を同定する目的で、Ｌｉｅｖｅｎｓらの文献（「ヒト細胞におけるプロテオームスケールの２蛋白質インタラクトミックス（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｂｉｎａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ）」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １ ５．１２ （２０１６）： ３６２４－３６３９）に記載の方法を用いて、ＭＡＰＰＩＴ細胞マイクロアレイ・スクリーニングを実施した。簡単に説明すると、ｇｐ１３０－ＣＲＢＮ融合構築物をコードするＣＲＢＮベイト発現プラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。次いで、１５，０００種類を超えるＯＲＦを網羅するＭＡＰＰＩＴキメラ膜受容体融合発現プラスミド集合体を含むマイクロアレイ・スクリーニングプレートに、これら形質転換細胞を添加した。マイクロアレイの各スポットは、異なるキメラ受容体ＯＲＦ融合発現プラスミドならびにＳＴＡＴ３応答性蛍光蛋白質をコードするレポータープラスミドを含有していた。したがって、これらのスポット上に到達して接着したＧｐ１３０－ＣＲＢＮベイト形質転換細胞はいずれも受容体ＯＲＦプレイプラスミドおよびレポータープラスミドで形質転換されるので、異なるそれぞれのマイクロアレイスポット上の細胞が異なるＣＲＢＮ－ＯＲＦの組み合わせで試験される。形質転換から２４時間後に、ＣＲＢＮリガンドＣＣ－２２０（最終濃度、１μＭ）の存在下または非存在下で、細胞をエリスロポエチンで特異的に刺激し、４８時間後にレポーターシグナル（ＧＦＰ様蛍光レポーター）を測定した。蛍光強度のデータを以前に報告されているような方法で分析して、ボルケーノプロットを作成した；図１４に示されるように、このプロットでは、各マイクロアレイの細胞クラスターの積算蛍光強度（Ｙ軸）に基づいて算出したｑ値を、対応する細胞クラスターの蛍光粒子数（Ｘ軸）の中央値の比に対して示す。逆ＭＡＰＰＩＴアッセイ設定を用いた用量応答を確認するために、強いシグナルを示す３種類のＯＲＦ ｃＤＮＡ（図１４において、ドットプロット上の矢印で示される）を選択した。対応する受容体ＯＲＦプラスミドおよびルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、ｇｐ１３０－ＣＲＢＮ融合プラスミドで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示濃度のＣＣ－２２０の存在下または非存在下で細胞をＥＰＯ処理し、さらに２４時間後にルシフェラーゼ活性を判定した。用量応答曲線は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより、４パラメーター非線型回帰を用いて行った。本実施例でＣＣ－２２０について例示されるように、本明細書に記載の逆ＭＡＰＰＩＴアッセイが、公知および新規の分子糊誘導性ＣＲＢＮ基質を同定するＯＲＦ ｃＤＮＡ集合体をスクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。
【0102】
実施例１２：ＭＡＰＰＩＴ順および逆構成による、ＭＴＯＲのＦＫＢＰ蛋白質へのラパマイシン誘導性動員の検出
本実施例では、ＭＴＯＲとＦＫＢＰ蛋白質ファミリー構成員（具体的にはＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）、ＦＫＢＰ３、ＦＫＢＰ４およびＦＫＢＰ５）との間のラパマイシン誘導性結合をモニターするＭＡＰＰＩＴ順および逆アッセイを開発した。順モードでは、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴ受容体融合物としてＦＫＢＰ ｃＤＮＡと（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰｘ）をクローン化し、ＭＴＯＲ（ＦＲＢドメイン）をｇｐ１３０融合物としてクローン化した；逆モードでは、ＦＫＢＰ ｃＤＮＡをｇｐ１３０に融合し、ＭＴＯＲを受容体融合物としてクローン化した（ｐＳＥＬ－ＭＴＯＲ）。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＦＫＢＰ融合構築物およびＭＴＯＲ融合プラスミドおよびＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）の組み合わせで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量のラパマイシンの存在下または非存在下で、細胞をＥＰＯで処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図１５Ａ～Ｂから分かるように、順および逆ＭＡＰＰＩＴアッセイ構成の両方において、各ＦＫＢＰ－ＭＴＯＲ相互作用について、これらの相互作用に関する公表データを再現するラパマイシン誘導性レポーターシグナルが得られた。
本実施例では、ＭＴＯＲとＦＫＢＰ蛋白質ファミリー構成員（具体的にはＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）、ＦＫＢＰ３、ＦＫＢＰ４およびＦＫＢＰ５）との間のラパマイシン誘導性結合をモニターするＭＡＰＰＩＴ順および逆アッセイを開発した。順モードでは、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴ受容体融合物としてＦＫＢＰ ｃＤＮＡと（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰｘ）をクローン化し、ＭＴＯＲ（ＦＲＢドメイン）をｇｐ１３０融合物としてクローン化した；逆モードでは、ＦＫＢＰ ｃＤＮＡをｇｐ１３０に融合し、ＭＴＯＲを受容体融合物としてクローン化した（ｐＳＥＬ－ＭＴＯＲ）。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＦＫＢＰ融合構築物およびＭＴＯＲ融合プラスミドおよびＳＴＡＴ３応答性ルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩルシフェラーゼレポータープラスミド）の組み合わせで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量のラパマイシンの存在下または非存在下で、細胞をＥＰＯで処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図１５Ａ～Ｂから分かるように、順および逆ＭＡＰＰＩＴアッセイ構成の両方において、各ＦＫＢＰ－ＭＴＯＲ相互作用について、これらの相互作用に関する公表データを再現するラパマイシン誘導性レポーターシグナルが得られた。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【国際調査報告】