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特表2023-508121パルボウイルスベクターならびにその作製および使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-01
(54)【発明の名称】パルボウイルスベクターならびにその作製および使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20230221BHJP
C12N 7/00 20060101ALI20230221BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20230221BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z
C12N7/00 ZNA
C12N15/35
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021576294
(86)(22)【出願日】2020-12-16
(85)【翻訳文提出日】2021-12-21
(86)【国際出願番号】 US2020065329
(87)【国際公開番号】W WO2021126991
(87)【国際公開日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】62/949,052
(32)【優先日】2019-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521193315
【氏名又は名称】ナイキジェン，リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100135415
【弁理士】
【氏名又は名称】中濱 明子
(72)【発明者】
【氏名】シャオ，ウェイドン
(72)【発明者】
【氏名】ユー，シャンピン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065BA01
(57)【要約】
パルボウイルスカプシドと、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖ベクターゲノムとを含む組換えパルボウイルスベクター。センス鎖は、５’から３’の方向に：５’末端におけるパルボウイルス末端反復配列；目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列；および３’末端におけるパルボウイルス末端反復配列を含む。ベクターゲノムはさらに、ＲＮＡ不安定化／破壊ドメイン（ＲＤＤＤ）を含む。
【選択図】図４
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
パルボウイルスカプシドと；センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ベクターゲノムと
を含むパルボウイルスベクターであって、
センス鎖が、５’から３’方向に：
５’末端におけるパルボウイルス末端反復配列；
目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列；および
３’末端におけるパルボウイルス末端反復配列
を含み、
ベクターゲノムがさらに、ＲＮＡ不安定化／破壊ドメイン（ＲＤＤＤ）を含む、パルボウイルスベクター。
【請求項2】
ＲＤＤＤが、アンチセンス鎖に位置する、請求項１に記載のパルボウイルスベクター。
【請求項3】
ＲＤＤＤが、逆の方向でＧＯＩのイントロンに位置する、請求項１に記載のパルボウイルスベクター。
【請求項4】
ＡＡＶベクターである、請求項１に記載のパルボウイルスベクター。
【請求項5】
ＲＤＤＤが、マイクロＲＭＡを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のパルボウイルスベクター。
【請求項6】
ＲＤＤＤが、配列番号１および／または配列番号３を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のパルボウイルスベクター。
【請求項7】
ＲＤＤＤが、配列番号１の２つ以上のコピーおよび／または配列番号３の２つ以上のコピーを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のパルボウイルスベクター。
【請求項8】
ＲＤＤＤが、配列番号２、４、５、６、および７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のパルボウイルスベクター。
【請求項9】
さらに、第２のＲＤＤＤを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のパルボウイルスベクター。
【請求項10】
第２のＲＤＤＤが、配列番号８を含む、請求項９に記載のパルボウイルスベクター。
【請求項11】
ＲＤＤＤが、リボザイムを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のパルボウイルスベクター。
【請求項12】
リボザイムが、配列番号９を含む、請求項１１に記載のパルボウイルスベクター。
【請求項13】
ＲＮＡ不安定化／破壊ドメイン（ＲＤＤＤ）を組換えパルボウイルスに挿入するステップを含む、組換えパルボウイルスの産生収量を改善するための方法であって、組換えパルボウイルスが、
パルボウイルスカプシドと；
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ウイルスゲノムと、
を含み、センス鎖が、５’から３’方向に：
５’末端におけるパルボウイルス末端反復配列；
目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列；および
３’末端におけるパルボウイルス末端反復配列
を含み、
ＲＤＤＤが、ウイルスゲノムに挿入される、方法。
【請求項14】
ＲＤＤＤが、ウイルスゲノムのアンチセンス鎖に位置する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ＲＤＤＤが、逆の方向でＧＯＩのイントロンに位置する、請求項１３に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
[0001]本願は、２０１９年１２月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／９４９，０５２号の優先権を主張するものである。
[0002]本発明は、概して、遺伝子導入および遺伝子治療用途での使用のためのベクターに関する。特に、本願は、パルボウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターの産生の間に産生される望ましくないアンチセンスＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の管理に関する。
[0002]本発明は、概して、遺伝子導入および遺伝子治療用途での使用のためのベクターに関する。特に、本願は、パルボウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターの産生の間に産生される望ましくないアンチセンスＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の管理に関する。
【背景技術】
【0002】
[0003]アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの組換えパルボウイルスは、遺伝子治療の分野において遺伝子導入ベクターとして広く使用されてきた。しかしながら、組換えパルボウイルスは、多くの場合、複製の際にアンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを生じ、それらは、結果として、ウイルス産生の収量の減少の原因となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
[0004]したがって、高収量で産生することができる新規のパルボウイルスが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0004】
概要
[0005]本願は、アンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ不安定化／破壊ドメイン（ＲＤＤＤ）を有するウイルスゲノムを伴うパルボウイルスベクターについて記載し、そのようなベクターを産生するための方法およびＤＮＡコンストラクトを含む。コンストラクト、ベクター、および方法は、組換え遺伝子発現カセットの送達を必要とするものを含めた遺伝子導入／遺伝子治療用途に適用可能である。
[0005]本願は、アンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ不安定化／破壊ドメイン（ＲＤＤＤ）を有するウイルスゲノムを伴うパルボウイルスベクターについて記載し、そのようなベクターを産生するための方法およびＤＮＡコンストラクトを含む。コンストラクト、ベクター、および方法は、組換え遺伝子発現カセットの送達を必要とするものを含めた遺伝子導入／遺伝子治療用途に適用可能である。
【0005】
[0006]本願の一態様は、パルボウイルスカプシドと；センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ベクターゲノムとを含むパルボウイルスベクターであって、センス鎖が、５’から３’方向に：５’末端におけるパルボウイルス末端反復配列；目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列；および３’末端におけるパルボウイルス末端反復配列を含み、ベクターゲノムがさらに、ＲＤＤＤを含む、パルボウイルスベクターに関する。
【0006】
[0007]いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、アンチセンス鎖に位置する。いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、逆の方向でＧＯＩのイントロンに位置する。
[0008]いくつかの実施形態において、パルボウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。
[0008]いくつかの実施形態において、パルボウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。
【0007】
[0009]いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、マイクロＲＭＡを含む。いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、配列番号１および／または配列番号３を含む。いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、配列番号１の２つ以上のコピーおよび／または配列番号３の２つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、配列番号２、４、５、６、および７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0008】
[0010]いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、リボザイムを含む。いくつかの実施形態において、リボザイムは、配列番号９を含む。
[0011]いくつかの実施形態において、パルボウイルスベクターはさらに、第２のＲＤＤＤを含む。いくつかの実施形態において、第２のＲＤＤＤは、配列番号８を含む。
[0011]いくつかの実施形態において、パルボウイルスベクターはさらに、第２のＲＤＤＤを含む。いくつかの実施形態において、第２のＲＤＤＤは、配列番号８を含む。
【0009】
[0012]本願の別の態様は、組換えパルボウイルスの産生収量を改善するための方法であって、ＲＮＡ不安定化／破壊ドメイン（ＲＤＤＤ）を組換えパルボウイルスに挿入するステップを含む方法に関する。組換えパルボウイルスは、パルボウイルスカプシドと；センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ウイルスゲノムとを含み、センス鎖は、５’から３’方向に：５’末端におけるパルボウイルス末端反復配列；目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列；および３’末端におけるパルボウイルス末端反復配列を含み、ＲＤＤＤは、ウイルスゲノムに挿入される。
【0010】
[0013]いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、ウイルスゲノムのアンチセンス鎖に位置する。いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、逆の方向でＧＯＩのイントロンに位置する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】[0014]ＧＯＩｍＲＮＡの発現および活性に悪影響を及ぼしうる、目的の遺伝子（ＧＯＩ）発現カセットのアンチセンス鎖からのアンチセンスＲＮＡの発現を駆動する、ＧＯＩのアンチセンス方向のクリプティックプロモーター（ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を示す。
【図2】[0015]パルボウイルスベクターにおけるｄｓＲＮＡ形成メカニズムを示す。経路Ａは、ネガティブ鎖にアンチセンス転写を有し得ない、ＧＯＩに対して完全転写ユニットをコードする完全ゲノムを含む組換えパルボウイルスベクターからのＧＯＩｍＲＮＡの形成を示す。経路Ｂは、組換えパルボウイルスベクターゲノムの一部を含む欠陥干渉（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ：ＤＩ）粒子からのｄｓＲＮＡの形成を示す。結果として生じるｄｓＲＮＡは、次いで、ＧＯＩｍＲＮＡの発現および活性を妨げることができる。
【図3】[0016]ｍＲＮＡの発現またはそこからの翻訳を制御または調節するＲＮＡｉ、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを示す。これらのツールは、パルボウイルスベクターから形成されたアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを調節するために、本願のパルボウイルスベクターにおいて使用される。
【図4】[0017]アンチセンスＲＮＡの負の効果を減少または消失させるＲＮＡ不安定化／破壊ドメイン（ＲＤＤＤ）の実施形態を示す。ＲＤＤＤは、クリプティックプロモーターを伴うＧＯＩのアンチセンス鎖の転写終結部位または３’ＩＴＲの前の領域に置かれる。アンチセンスＲＮＡは、ＲＮＡ不安定化／破壊実行分子（ＲＤＤＤＥＭ）によって不安定化または破壊され（右側のパネル）、その一方で、ＧＯＩｍＲＮＡは、影響を受けない（左側のパネル）。
【図5】[0018]パルボウイルスベクターから形成され得るｄｓＲＮＡの効果を減少または消失させるためにＲＤＤＤを含む例示的パルボウイルスベクターを表す。ＲＤＤＤは、ＧＯＩのアンチセンス鎖の転写終結部位または３’ＩＴＲの前に置かれる。この場合、欠陥干渉粒子から発現されるｄｓＲＮＡは、ＲＤＤＤＥＭによって不安定化または破壊され（右側のパネル）、その一方で、ＧＯＩｍＲＮＡは影響を受けない（左側のパネル）。ＲＤＤＤの位置は、それが全長ベクターではなく、ＤＩ粒子から転写されるのみである限り、変更することができる。
【図6】[0019]アンチセンスＲＮＡの効果を減少または消失させるために自己切断性リボザイムを使用するための例示的戦略を例示する。リボザイムは、クリプティックプロモーターを伴うＧＯＩのアンチセンス鎖の転写終結部位または３’ＩＴＲの前の領域に置かれる。アンチセンスＲＮＡは、リボザイムによって不安定化または破壊され（右側のパネル）、その一方で、ＧＯＩｍＲＮＡは影響を受けない（左側のパネル）。
【図7】[0020]ｄｓＲＮＡの効果を減少または消失させるために自己切断性リボザイムを使用するための例示的戦略を例示する。リボザイムは、ＧＯＩのアンチセンス鎖における転写終結部位または３’ＩＴＲの前の領域に置かれる。ＤＩ粒子から発現されるｄｓＲＮＡは、リボザイムによって不安定化または破壊され（右側のパネル）、その一方で、ＧＯＩｍＲＮＡは影響を受けない（左側のパネル）。
【図8】[0021]アンチセンスＲＮＡによる干渉を制御するための、ＲＤＤＤが埋め込まれたイントロンの使用を例示する。イントロンは、ＧＯＩ鎖に置かれる。ＲＤＤＤは、イントロンのアンチセンス鎖内に置かれる。ＲＤＤＤを伴うイントロンの使用は、ＲＤＤＤの配置に対してさらなる柔軟性を可能にする。イントロンは、好適なスプライスドナー／アクセプター部位が存在するかそこに導入される限り、任意の遺伝子内に置くことができる。パネルＡにおいて、イントロンは、転写開始部位直後のＧＯＩ開始コドンの５’末端に埋め込まれる。パネルＢにおいて、イントロンは、ＧＯＩのコード領域に埋め込まれる。
【図9】[0022]ｄｓＲＮＡによる干渉を制御するための、ＲＤＤＤが埋め込まれたイントロンの使用を例示する。イントロンは、ＧＯＩ鎖に存する。ＲＤＤＤは、イントロンのアンチセンス鎖に存する。ＲＤＤＤを伴うイントロンの使用は、ＲＤＤＤの配置においてさらなる柔軟性を可能にする。イントロンは、任意の部位一致エクソン境界コンセンサス配列における遺伝子に置くことができる。パネルＡにおいて、イントロンは、転写開始部位直後のＧＯＩ開始コドンの５’末端に埋め込まれる。パネルＢにおいて、イントロンは、ＧＯＩのコード領域に埋め込まれる。
【図10】[0023]宿主細胞におけるＲＤＤＤＥＭの発現によってアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを管理／制御するための３つの異なる経路を例示する。ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなどの内因的に発現したＲＤＤＤの使用は、ベクターからのｄｓＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの消失を可能にする。
【図11】[0024]ポリＡ配列が埋め込まれたイントロンの使用を例示する。複数のポリＡ配列を使用することができる。イントロンは、ＧＯＩに対するアンチセンスＲＮＡの転写を止めるために、クリプティックプロモーターに極めて近接して置かれ（右側のパネル）、その一方で、ＧＯＩにおけるイントロンはＲＮＡスプライシングの際に除去されるため、ＧＯＩ発現は影響を受けない。
【図12】[0025]ｄｓＲＮＡの効果を減少または消失させるためにＲＤＤＤを組み込むことによって改良された例示的パルボウイルスベクターを表す。ＲＤＤＤは、ＧＯＩアンチセンス鎖の転写終結部位または３’ＩＴＲの前の場所に置かれる。欠陥干渉（ＤＩ）粒子から発現されるｄｓＲＮＡは、ＲＤＤＤＥＭによって不安定化または破壊され（右側のパネル）、その一方で、ＧＯＩｍＲＮＡは影響を受けない（左側のパネル）。ＲＤＤＤの位置は、全長ベクターからではなく、ＤＩ粒子から転写されるのみである限り、変更することができる。第２の特徴は、プロモーターの反対の鎖に付加された転写停止配列（ポリＡ部位）である。センス鎖において、ポリＡ部位は、プロモーターの反対の方向であり、したがって、活性ではない。ＡＡＶ調製物から形成されるＤＩ粒子において、プロモーターからのリードスルーは止められる。それは、ＡＡＶが統合する場合に、連結した転写配列を有さないプロモーターが細胞遺伝子を活性化し得るような状況を防ぐ。転写停止部位（すなわち、ポリＡ）は、正常なＡＡＶ転写に影響を及ぼさない。それは、ＡＡＶベクターの安全性を改善するのに役立つ。
【発明を実施するための形態】
【0012】
定義
[0026]本明細書において使用される場合、用語「パルボウイルス」は、自己複製性パルボウイルスおよびディペンドウイルス属のメンバーを含む、サブファミリーパルボウイルス亜科の任意のメンバーを意味する。自己複製性パルボウイルスは、アムドパルボウイルス属（Ａｍｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アベパルボウイルス属（Ａｖｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、ボカパルボウイルス属（Ｂｏｃａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、チャップパルボウイルス（Ｃｈａｐｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、コピパルボウイルス属（Ｃｏｐｉｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、エリスロパルボウイルス属（Ｅｒｙｔｈｒｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、プロトパルボウイルス属（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、テトラパルボウイルス属（Ｔｅｔｒａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）のメンバーを含む。例示的な自律性パルボウイルスとしては、これらに限定されるわけではないが、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）、ウシパルボウイルス（ＢＰＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、チキンパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ボカウイルス、Ｂ１９ウイルス、ラットウイルス（ＲＶ）、Ｈ－１ウイルス（Ｈ－ｌ）が挙げられる。他の自律性パルボウイルスは、当業者に既知である。例えば、Ｋｉｎｇ Ａ．Ｍ．Ｑ．， Ａｄａｍｓ Ｍ．Ｊ．， Ｃａｒｓｔｅｎｓ Ｅ．Ｂ． およびＬｅｆｋｏｗｉｔｚ Ｅ．Ｊ． （２０１２） Ｖｉｒｕｓ ｔａｘｏｎｏｍｙ： ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ： Ｎｉｎｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。
[0026]本明細書において使用される場合、用語「パルボウイルス」は、自己複製性パルボウイルスおよびディペンドウイルス属のメンバーを含む、サブファミリーパルボウイルス亜科の任意のメンバーを意味する。自己複製性パルボウイルスは、アムドパルボウイルス属（Ａｍｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アベパルボウイルス属（Ａｖｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、ボカパルボウイルス属（Ｂｏｃａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、チャップパルボウイルス（Ｃｈａｐｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、コピパルボウイルス属（Ｃｏｐｉｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、エリスロパルボウイルス属（Ｅｒｙｔｈｒｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、プロトパルボウイルス属（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、テトラパルボウイルス属（Ｔｅｔｒａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）のメンバーを含む。例示的な自律性パルボウイルスとしては、これらに限定されるわけではないが、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）、ウシパルボウイルス（ＢＰＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、チキンパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ボカウイルス、Ｂ１９ウイルス、ラットウイルス（ＲＶ）、Ｈ－１ウイルス（Ｈ－ｌ）が挙げられる。他の自律性パルボウイルスは、当業者に既知である。例えば、Ｋｉｎｇ Ａ．Ｍ．Ｑ．， Ａｄａｍｓ Ｍ．Ｊ．， Ｃａｒｓｔｅｎｓ Ｅ．Ｂ． およびＬｅｆｋｏｗｉｔｚ Ｅ．Ｊ． （２０１２） Ｖｉｒｕｓ ｔａｘｏｎｏｍｙ： ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ： Ｎｉｎｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。
【0013】
[0027]ディペンドパルボウイルス属は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含み、その例としては、これらに限定されるわけではないが、ＡＡＶタイプ１（ＡＡＶ－１）、ＡＡＶタイプ２（ＡＡＶ－２）、ＡＡＶタイプ３（ＡＡＶ－３）、ＡＡＶタイプ４（ＡＡＶ－４）、ＡＡＶタイプ５（ＡＡＶ－５）、ＡＡＶタイプ６（ＡＡＶ－６）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶなどが挙げられる。本願のパルボウイルス粒子、カプシド、およびゲノムは、好ましくは、ＡＡＶ由来である。
【0014】
[0028]本願での使用のためのパルボウイルスは、さらに、ＰＶカプシド遺伝子、非構造遺伝子、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、左末端ヘアピン（ＬＥＨ）、右末端ヘアピン（ＲＥＨ）においてさらなる修飾を有する遺伝子操作由来の新規のバリアントを含む。本発明のパルボウイルスベクターは、インビトロおよびインビボの両方における細胞への核酸の送達にとって有用である。特に、本願の発明のベクターは、核酸を動物細胞に送達するためまたは移動させるために有利に用いられ得る。目的の核酸（ＮＡＯＩ）は、ＲＮＡ、ペプチド、およびタンパク質をコードする核酸、好ましくは、治療用（例えば、医薬用途または獣医学用途）または免疫原性（例えば、ワクチン用）ペプチドまたはタンパク質を含む。それは、標的送達のための遺伝子編集および／またはアダプタマーのためのＤＮＡ鋳型配列も提供し得る。
【0015】
[0029]用語「ハイブリッドパルボウイルス」は、本明細書において使用される場合、異なる（すなわち、別の、外来の、外因性の）パルボウイルスカプシドに包まれたパルボウイルスゲノムを意味する。言い換えると、ハイブリッドパルボウイルスは、異なるパルボウイルスカプシドに包まれたパルボウイルスゲノムを有する。本明細書において使用される場合、「異なる」によって、パルボウイルスが、別のパルボウイルスカプシド内にパッケージされること、例えば、パルボウイルスカプシドが、別のパルボウイルスセロタイプまたは自律性パルボウイルス由来であることが意図される。
【0016】
[0030]用語「パルボウイルスＩＴＲ」は、本明細書において使用される場合、任意のパルボウイルスに由来する逆方向末端反復配列を意味し、それは、パルボウイルス複製、カプシド化、レスキュー、統合などの支援において機能する。パルボウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）は、それらの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲが異なる場合、左端ヘアピン（ＬＥＨ）、右端ヘアピン（ＲＥＨ）とも呼ばれる。「ＡＡＶＩＴＲ」は、ＡＡＶゲノムが隣接する逆方向末端反復配列を意味する。パルボウイルスＩＴＲおよびＡＡＶＩＴＲは、任意のパルボウイルスまたは任意のパルボウイルスセロタイプ由来のＩＴＲを含むことができ、さらに、野生型ＩＴＲと同様に、ＡＡＶ複製、カプシド化、レスキュー、および／または統合を支援する変異を伴うＩＴＲを含むことができる。
【0017】
[0031]用語「ＡＡＶセロタイプ」は、本明細書において使用される場合、少なくとも１つのＡＡＶＩＴＲを伴うゲノムでパッケージされた任意のカプシドを意味する。それは、天然において見出される任意のＡＡＶセロタイプ、またはＡＡＶゲノムをパッケージすることができる任意の遺伝子操作されたまたは化学修飾されたカプシドを含む。それは、生物学的または化学的に修飾されたカプシドを含む。
【0018】
[0032]用語「低分子ヘアピンＤＮＡ」および「ｓｈＤＮＡ」は、米国特許出願公開第２０１８／０２９８３８０号に記載されるようなｓｈＤＮＡに関連して、本明細書において相互互換的に使用される。
【0019】
[0033]用語「ｓｃＡＡＶ」は、本明細書において使用される場合、ＡＡＶのＩＴＲのうちの１つから末端分離（ＴＲ）部位の不在によって生成される二本鎖領域を含む一本鎖ＡＡＶベクターを意味し、この場合、ＴＲの不在は、ＴＲが存在しないベクター終点での複製開始を防ぐ。ｓｃＡＡＶベクターは、典型的には、各末端における野生型（ｗｔ）ＡＡＶ ＴＲと、二本鎖領域によってＡＡＶ ＴＲに接続的に連結された、中央の変異ＴＲ（ｍＴＲ）とを含む。用語「ｍＴＲ」および「ｍＩＴＲ」は、米国特許第７，４６５，５８３号に記載されるような変異逆方向末端反復配列を意味するために、本明細書において相互互換的に使用される。
【0020】
[0034]語句「共有結合性閉端ドメイン」、「ｃｃｅドメイン」、「一本鎖共有結合性閉端ドメイン」、および「ＳＳ－ＣＣＥドメイン」は、二本鎖（ＤＳ）ドメインの末端において形成され、ＤＳドメインのセンス鎖をＤＳドメインのアンチセンス鎖に接続する、閉じた一本鎖領域に関連して相互互換的に使用される。
【0021】
[0035]語句「共有結合性閉端（ｃｃｅ）パルボウイルス」は、本明細書において使用される場合、パルボウイルスカプシド内にパッケージされた線状パルボウイルスゲノム、５’および３’末端においてヘアピン構造の対を形成する自己相補性ＤＮＡ配列を含むパルボウイルスゲノム、５’末端と３’末端との間の二本鎖ドメイン（本明細書において、「ＤＳドメイン」と呼ばれる）、およびＳＳ－ＣＣＥ末端を意味する。ＤＳドメインは、ゲノムＤＮＡにおいてお互いにアニールする自己相補性配列で構成される。ＳＳ－ＣＣＥ末端は、ＤＳ ＤＳドメインにおけるアニールされた部分を接続する閉じた一本鎖領域を含む非相補的配列を含む。カプシドは、任意のパルボウイルスセロタイプを含めた任意のパルボウイルスから得ることができる。好ましい実施形態において、ｃｃｅパルボウイルス（ｃｃｅＰＶ）は、ｃｃｅアデノ随伴ウイルス（ｃｃｅＡＡＶ）である。自己相補的（ｓｃ）パルボウイルスベクターおよびｓｃＡＡＶは、ベクターゲノム構成においてｃｃｅＰＶおよびｃｃｅＡＡＶと同様であるが、それらは異なる方法によって作製される。
【0022】
[0036]ＤＳドメインにおけるＤＮＡ鎖は、ＤＳドメインの長さにわたって完全に相補であり得るかまたは部分的に相補であり得、それにより、相補的配列は、お互いにアニールすることにより安定な二重鎖領域を形成することができ、非相補性の領域において膨らんだ構造またはループした構造を形成し得る。非相補性の領域は、一意の一本鎖ＤＮＡ領域が、それ自体へのＤＮＡ鎖のアニーリングの後に形成され得るように、一方または両方のＤＮＡ鎖における欠失または挿入を含み得る。結果として得られるステム構造は、ＤＳドメインの長さの少なくとも５％を含み得る。ｃｃｅＡＡＶとｓｃＡＡＶとの間の違いは、ｃｃｅＡＡＶは、変異体ＴＲ（ｍＴＲ）を必要としない方式においてより広く定義することができる点である。ｓｃＡＡＶは、本明細書において記載される、より大きなｃｃｅＡＡＶ属内の種を代表しており、それは、変異体ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）またはｓｈＤＮＡ配列の形態において一意のｃｃｅ末端を有する。ｓｃＡＡＶを調製する方法は、本明細書において定義されるｃｃｅＡＡＶベクターを産生することができない。しかしながら、本願の方法は、ｓｃＡＡＶを産生するためのより効率的な手段を提供するというさらなる利点を有しており、というのも、新規の中間鋳型分子は、２つの完全に機能的なＩＴＲを用いており、それらは、上記において記載されるようなプロデューサー細胞においてより効率的に複製することができるためである。
【0023】
[0037]用語「アプタマー」は、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子を意味する。アプタマーは、典型的には、大きなランダム配列プールを用いる選択プロセスによって作出され、様々な研究、産業、および臨床の用途を有する。例えば、アプタマーは、リボザイムと組み合わせることで、それらの標的分子の存在下において自己切断することができる。その上、天然アプタマーは、リボスイッチに存在することが知られている。標的リガンドに選択的に結合する従来的機能以外に、本明細書において使用される「アプタマー」は、ＤＮＡ酵素、ＤＮＡザイム、および、特定の酵素反応を実施することができるＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む触媒ＤＮＡを含めた、デオキシリボザイムをより広く含み得る。
【0024】
[0038]用語「ｍｉＲＮＡ」は、本明細書において使用される場合、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略される）を意味し、それは、植物、動物、およびいくつかのウイルスにおいて見出される小さい非コードＲＮＡ分子（約２２のヌクレオチドを含む）であり、それらは、ＲＮＡサイレンシングおよび転写後遺伝子発現調節、ｍＲＮＡ分子内での相補配列との塩基対合によるｍｉＲＮＡ機能において機能する。結果として、これらのｍＲＮＡ分子は、以下のプロセス：（１）２つ片へのｍＲＮＡ鎖の切断、（２）そのポリ（Ａ）テールの短縮によるｍＲＮＡの不安定化、および（３）リボザイムによるタンパク質へのｍＲＮＡの効率的でない翻訳、のうちの１つまたは複数によって発現停止される。
【0025】
[0039]ｍｉＲＮＡは、それ自身を折り曲げて低分子ヘアピンを形成するＲＮＡ転写物の領域に由来するが、その一方で、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡのより長い領域に由来することを除いて、ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に酷似する。ヒトゲノムは、１９００超のｍｉＲＮＡをコードし得る。ｍｉＲＮＡは、典型的なｍｉＲＮＡと同様の機能を有する限り、長いまたは短い塩基を有する多くのバリアントを含む。ｍｉＲＮＡの標的配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列、ｍｉＲ－ＴＳとも称される。
【0026】
[0040]用語「ｓｉＲＮＡ」は、本明細書において使用される場合、多くの場合に低分子干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとして知られる、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を意味し、それは、ｍｉＲＮＡと同様に、２０～２５の塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ非コードＲＮＡ分子であり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内において作動する。それは、転写後にｍＲＮＡを分解し、翻訳を防ぐことによって、相補ヌクレオチド配列を伴う特定の遺伝子の発現を妨害する。
【0027】
[0041]用語「リボザイム」は、本明細書において使用される場合、遺伝子発現におけるＲＮＡスプライシングを含む、特定の生化学反応を触媒することができるＲＮＡ分子を意味する。天然のまたはインビトロにおいて発生したリボザイムの最も一般的な活動は、ＲＮＡおよびＤＮＡの切断またはライゲーションならびにペプチド結合の形成である。リボザイムの例としては、ハンマーヘッドリボザイム、ＶＳリボザイム、リードザイム（Ｌｅａｄｚｙｍｅ）、およびヘアピンリボザイムが挙げられる。リボザイムは、ＲＮＡ分子を切断することができる任意のＲＮＡ分子を含む。それは、人工的に構築されたものを含む。
【0028】
[0042]用語「ＲＮＡ破壊／不安定化ドメイン」および「ＲＤＤＤ」は、（１）ＲＮＡ分子に位置し、（２）ＲＮＡにその生物学的機能を失わせるかあるいは部分的または完全に分解する破壊／不安定化シグナルとして機能する、ヌクレオチド配列に関して本明細書において使用される。ＲＤＤＤは、ｍｉＲＮＡ標的配列、ｓｈＲＮＡ標的配列、ｓｉＲＮＡ標的配列、またはリボザイム標的配列、あるいはそれらの組み合わせであり得る。ｍｉＲＮＡ標的配列、ｓｈＲＮＡ標的配列、ｓｉＲＮＡ標的配列、またはリボザイム標的配列は、対応するｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ、またはリボザイムの標的配列であり、それらは、それらの標的配列を含有するＲＮＡ分子に影響を及ぼすことができ、ＲＮＡ分子を部分的にまたは完全に分解することができる。ＤＮＡ形態のＲＤＤＤは、そのＲＮＡ形態をコードする。
【0029】
[0043]用語「ＲＮＡ破壊／不安定化ドメイン実行分子」「ＲＤＤＤＥＭ」は、本明細書において使用される場合、それらの対応するＲＤＤＤを含有するＲＮＡ分子に影響を及ぼすことができ、ＲＮＡ分子を部分的にまたは完全に分解することができる分子を意味する。ＲＤＤＤＥＭは、ＲＤＤＤに対して特異的または非特異的であり得る。ＲＤＤＤＥＮは、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ、またはリボザイム、あるいはそれらの組み合わせであり得る。対応するｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ、あるいはリボザイムは、内因的に発現することができ、ＲＤＤＤを含有する同じベクターに送達することができ、別々のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって標的細胞に送達することができる。
【0030】
[0044]本願は、概して、ＧＯＩｍＲＮＡの発現および／または翻訳に干渉することができる欠陥干渉粒子から生じたアンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードしたネガティブ鎖ＤＮＡの望ましくない効果を軽減するための組成物および方法に関する。
【0031】
[0045]図１は、従来のパルボウイルスベクター、詳細には、目的の遺伝子（ＧＯＩ）および３’ポリＡシグナルに作動可能に連結したプロモーターを含む発現カセットに隣接するＩＴＲを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを示している。プロモーター由来の転写は、ＧＯＩｍＲＮＡの産生につながる。しかしながら、クリプティックプロモーターが、ＧＯＩ転写ユニットのアンチセンス鎖に存在することができることは可能であり、それは、ＧＯＩｍＲＮＡに対するアンチセンスｍＲＮＡの転写を促進し得る。これらのアンチセンスＲＮＡは、必ずしもコード領域のみではなく、ＧＯＩｍＲＮＡに対して相補的であり、パルボウイルスベクターを使用して発現された場合、ＧＯＩ発現およびその意図される治療効果に負の影響を及ぼすことができる。
【0032】
[0046]パルボウイルスベクターは、多くの場合、部分的ＡＡＶベクター配列を欠く自己相補的ゲノムを有し得る、欠陥干渉（ＤＩ）粒子によって汚染されることが知られている。図２に示されるように、プロモーター領域および不完全なＧＯＩ領域を有するＤＩ粒子は、ＤＩ粒子が第２鎖ＤＮＡ合成を完了した後にｄｓＲＮＡを形成するＧＯＩＲＮＡの転写を可能にするであろう。ｄｓＲＮＡは、野生型ＧＯＩ発現に負の影響を及ぼすことができ、パルボウイルスベクターの治療効果を低下させることができる。
【0033】
[0047]アンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの望ましくない効果を減少または消失させるために、本願は、ＲＤＤＤをベクター設計に導入する。したがって、そうでなければこれらの望ましくないアンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡが産生される状況において、ＲＤＤＤは、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを不安定化／分解することができ、それにより、それらは、ＧＯＩ発現に悪影響を及ぼさないであろう。
【0034】
[0048]いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムに対する１つまたは複数の標的配列を含む。これらの標的配列は、基本的なｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはリボザイムのための標的として機能する限り、定義されるｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはリボザイムのための標準的な標的配列とは同一でなくてもよい。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはリボザイムのための標的配列は、それらの標準的な標的配列に対して５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一である。ＲＤＤＤのためのヌクレオチド配列は、プロモーターおよびＧＯＩのアンチセンス鎖におけるアンチセンスＲＮＡの任意の領域に置くことができる。好ましくは、ＧＯＩのためのプロモーターが、ＩＴＲに極めて近接している場合、ｄｓＲＮＡの発現は、ＧＯＩのプロモーターによって駆動され、ｄｓＲＮＡを発現するＤＩ粒子は、通常、ベクターゲノムの半分未満を含むため、ＲＤＤＤは、ＧＯＩのためのプロモーターが位置するゲノムの同じ半分に置かれる。潜在的アンチセンスＲＮＡをＲＮＡｓｅｑによって分析または特定することにより、潜在的転写開始部位および転写終結部位を定義することができる。ＲＤＤＤは、そのような部位の間に置かれるべきである。１つまたは複数のＲＤＤＤを使用することができる。ＧＯＩのアンチセンス鎖における転写末端シグナルの不在下において、パルボウイルスＩＴＲは、転写終結部位として機能することがわかっている。
【0035】
[0049]一実施形態において、１つまたは複数のＲＤＤＤが、アンチセンス転写物の３’末端に置かれる。別の実施形態において、１つまたは複数のＲＤＤＤが、３’末端に近接して、アンチセンス転写物の中間領域に置かれる。別の実施形態において、１つまたは複数のＲＤＤＤが、アンチセンス転写物の５’末端に置かれる。さらなる別の実施形態において、１つまたは複数のＲＤＤＤが、逆の方向でＧＯＩのセンス鎖のイントロンに置かれる。この場合、１つまたは複数のＲＤＤＤは、最終的なＧＯＩ発現に影響を及ぼすことなく、ＧＯＩのコード領域に置くことができる。イントロンは、ＧＯＩの５’非翻訳領域、ＧＯＩの３’非翻訳領域、またはＧＯＩのコード領域に存在することができる。別の実施形態において、ポリＡ部位の１つまたは複数のコピーが、１つまたは複数のＲＤＤＤの後に置かれる。この場合、ポリＡ部位のＲＮＡ配列上流は、１つまたは複数のＲＤＤＤによって分解される。ｄｓＲＮＡの効果を減少させるために、１つまたは複数のＲＤＤＤが、概して、潜在的ｄｓＲＮＡの３’末端に置かれる。ｄｓＲＮＡは、ＧＯＩを発現するために使用される同じプロモーターを共有するため、一実施形態において、１つまたは複数のＲＤＤＤは、逆の方向で、ＲＤＤＤを伴うイントロンを使用してＧＯＩのセンス鎖に置かれる。別の実施形態において、１つまたは複数のＲＤＤＤは、ＧＯＩのアンチセンス鎖上の転写終結部位の直前において、プロモーターのアンチセンス鎖に置かれる。
【0036】
[0050]イントロンのほとんど全てのスプライス部位が、コンセンサス配列（マトリックス）に一致することは、既に知られていることである。これらのコンセンサス配列は、イントロンの各末端におけるほぼ不変のジヌクレオチド、イントロンの５’末端におけるＧＴ、およびイントロンの３’末端におけるＡＧを含む。
【0037】
[0051]プレｍＲＮＡにおけるＵ２（主要クラス）イントロンに対するスプライス部位コンセンサス配列は、概して、以下のコンセンサス配列：３’スプライス部位：ＣＡＧ｜Ｇ、５’スプライス部位：ＭＡＧ｜ＧＴＲＡＧＴ（この場合、Ｍは、ＡまたはＣであり、Ｒは、ＡまたはＧである）に一致する。概して、ＭＡＧＧヌクレオチドは、ＭＡＧとＧとの間のイントロン挿入に対して調査することができる。ＲＮＡスプライシングにとって機能的である限り、追加の部位を使用することにより、ＲＤＤＤまたはポリＡ配列を含むイントロンを挿入することができる。
【0038】
[0052]一実施形態において、本願のベクターのイントロンは、アンチセンス鎖における１つまたは複数のポリＡ部位を含む。この立体配置では、ポリＡシグナルの後にアンチセンスＲＮＡの転写はない。したがって、これは、（参照鎖（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｎｄ）として「ＧＯＩ」を使用する）イントロン前のＧＯＩに対するアンチセンス転写物の産生を消失させる。さらなる別の実施形態において、１つまたは複数のＲＤＤＤが、イントロンのアンチセンス方向でイントロンのポリＡ部位の前に置かれる。これは、（参照鎖として「ＧＯＩ」を使用する）イントロンの後のＧＯＩに対するアンチセンスＲＮＡが、ＧＯＩに対するＲＤＤＤＥＭによって分解されることを可能にする。
【0039】
[0053]あるいは、ポリＡ部位または転写終結部位は、プロモーターのアンチセンス鎖に置くことができる。一実施形態において、１つまたは複数のポリＡ部位が、プロモーターと転写開始部位との間に位置する。センス鎖において、ポリＡは、機能的ではなく、それは、アンチセンス鎖において機能的である。したがって、これは、プロモーターを伴うＤＩ粒子を与え、二量体へのＤＩ粒子の変換後に機能性ポリＡ部位を有するであろう。さらなる別の実施形態において、１つまたは複数のポリＡ部位が、プロモーターとエンハンサーとの間に位置し、それは、上記において記載されるようなアンチセンス方向である。さらなる別の実施形態において、１つまたは複数のポリＡ部位が、プロモーターの前に位置し、それは、上記において記載されるようなプロモーターに関してアンチセンス方向である。ポリＡ配列または部位のそのような配置の主な有用性は、ＤＩ粒子におけるプロモーターのリードスルーを防ぐことである。
【0040】
[0054]ＲＤＤＤは、対応するＲＤＤＤＥＭのための生物学的標的である。組換えパルボウイルスベクターから作製されたアンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡが確実に不安定化または分解されるために、ＲＤＤＤＥＭは、本願のＲＤＤＤ含有パルボウイルスベクターを用いて形質導入された細胞において活性でなければならない。ＲＤＤＤＥＭをそのような標的化のために利用可能することができるいくつかの方法が存在する。第一に、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはリボザイムなどの調節ＲＮＡは、ＲＤＤＤを標的化するために内因的に利用可能であり得る。第二に、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはリボザイムは、上流のプロモーターを使用してセンス鎖またはアンチセンス鎖における対応するパルボウイルスベクターから発現され得る。あるいは、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはリボザイムは、別々のウイルスベクター、例えば、二次パルボウイルスベクター、アデノウィルスベクター、ヘルペスクターなどによって送達され得、あるいは、それらは、非ウイルス性ベクターまたはトランスフェクション剤、例えばリポソームによって標的細胞へと送達され得る。
【0041】
[0055]いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤおよびＲＤＤＤＥＭは、組織特異的発現のため、または誘導性発現系として、使用され得、パルボウイルス／ＡＡＶベクターは、ＧＯＩの発現を抑制するために、アンチセンスまたはｄｓＲＮＡを発現するように意図的に設計される。そのようなアンチセンスおよびｄｓＲＮＡは、ＲＤＤＤの制御下にある。それに続いて、ＲＤＤＤＥＭが誘導され、それにより、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの効果が無効化され、その一方で、ＧＯＩの発現が回復される。一実施形態において、ＲＤＤＤＥＭの発現は、誘導可能であり、結果として、誘導性発現ベクターを生じる。さらなる別の実施形態において、ＲＤＤＤＥＭの発現は、組織特異的であり、結果として、組織特異的発現ベクターを生じる。
【0042】
[0056]いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤＥＭが構成的に発現される条件下において標的細胞を一緒に形質導入するために、ＲＤＤＤＥＭベクターおよびＧＯＩベクターとＲＤＤＤエレメントとの組み合わせが使用される。この場合、ＲＤＤＤＥＭ発現は抑制されず、ＲＤＤＤＥＭは、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを分解するであろうため、ＧＯＩは、正常に発現される。逆に、ＲＤＤＤＥＭ発現が誘導剤（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ａｇｅｎｔ）（誘導系（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｙｓｔｅｍ）において）によって抑制される場合、またはＲＤＤＤＥＭ発現が、組織特異的方式において（組織特異的プロモーターを使用して）制限される場合、ＧＯＩ発現は、誘導的に発現停止されるかまたは組織特異的方式において発現停止されるであろう。したがって、ＧＯＩの発現を制御または調節することができる。
【0043】
[0057]ＲＤＤＤ源としてのｍｉＲＮＡ
[0058]マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、転写後に、約６０％超のヒトタンパク質－コード遺伝子の遺伝子発現を調節する約２１ｂｐの低分子内因性非コードＲＮＡ配列である。それらは、発生、分化、増殖、およびアポトーシスを含むほとんどの細胞プロセスに関与する。ｍｉＲＮＡは、種の間において高度に保存され、例えば、組織、系統、または分化の状態などの関数として、特定のレベルにおいて特異的に発現される。今までに、２５００超の独特な成熟ヒトｍｉＲＮＡが識別されている。全てのそのようなｍｉＲＮＡは、本発明において利用することができる。個々のｍｉＲＮＡ種は、１細胞あたり１０未満から３００００超のコピーの範囲のコピー数において大きく変えることができる。それらの組織特異的発現プロファイル以外に、いくつかのｍｉＲＮＡは、癌、感染病、心臓および肝臓の疾患において調節不全となり、それらは、本願における使用のためのＲＤＤＤＥＭとして利用することができる。
[0058]マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、転写後に、約６０％超のヒトタンパク質－コード遺伝子の遺伝子発現を調節する約２１ｂｐの低分子内因性非コードＲＮＡ配列である。それらは、発生、分化、増殖、およびアポトーシスを含むほとんどの細胞プロセスに関与する。ｍｉＲＮＡは、種の間において高度に保存され、例えば、組織、系統、または分化の状態などの関数として、特定のレベルにおいて特異的に発現される。今までに、２５００超の独特な成熟ヒトｍｉＲＮＡが識別されている。全てのそのようなｍｉＲＮＡは、本発明において利用することができる。個々のｍｉＲＮＡ種は、１細胞あたり１０未満から３００００超のコピーの範囲のコピー数において大きく変えることができる。それらの組織特異的発現プロファイル以外に、いくつかのｍｉＲＮＡは、癌、感染病、心臓および肝臓の疾患において調節不全となり、それらは、本願における使用のためのＲＤＤＤＥＭとして利用することができる。
【0044】
[0059]マイクロＲＮＡは、通常、折り重なって不完全塩基対ステムを伴うヘアピン構造を形成する前駆体分子（ｐｒｉ－マイクロＲＮＡ）から処理される。ｐｒｉ－マイクロＲＮＡはさらに、核および細胞質切断タンパク質によって処理され、結果として、低分子ＲＮＡ二重鎖を生じる。二重鎖の一方の鎖であるガイド鎖（マイクロＲＮＡ）は、マイクロＲＮＡ二重鎖末端の相対自由エネルギーに基づいて選択され、マルチ酵素複合遺体であるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に負荷される。あまり一般的でない産物は、パッセンジャー鎖（マイクロＲＮＡ）として定義され、それは、分解されると考えられる。あるいは、ＲＮＡ二重鎖の両方の鎖、すなわち、５’鎖（ｍｉＲ－５ｐ）および３’鎖（ｍｉｒ－３ｐ）は、成熟した機能性マイクロＲＮＡとなる。成熟ｍｉＲＮＡは、アルゴノート（ＡＧＯ）ファミリータンパク質に関連付けられ、ＲＩＳＣのコアを構成し、ｍＲＮＡ中に位置する対応する標的部位への塩基対合結合によって機能し、結果としてタンパク質合成を抑制する。マイクロＲＮＡおよびその標的部位の完全な相補性は、ｓｉＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ干渉と同様のメカニズムを使用して、ＡＧＯ２によるマイクロＲＮＡ／ｍＲＮＡ－二重鎖のエンドヌクレアーゼ的中央切断を生じる。植物において、このメカニズムは、支配的なものであり、その一方で、動物における支配的なメカニズムは、不完全な相補性による結合を伴い、結果として、翻訳の阻害および／またはｍＲＮＡの分解の開始を生じる。ｍｉＲＮＡ標的部位がほとんどタンパク質－コード領域に位置している植物とは対照的に、動物の標的部位は、多くの場合、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおける反復配列として見出される。
【0045】
[0060]ｍｉＲＮＡとその標的部位との間の相互作用に関連するいくつかの重要な規則が、実験および生物情報学的分析によって決定された。ｍｉＲＮＡの特異性を標的とするｍＲＮＡは、シード配列、すなわち、ｍｉＲＮＡの５’末端の位置２～７または２～８に通常は位置する保存配列と、ｍＲＮＡにおける対応する配列との間の完全な一致によって決定される。マイクロＲＮＡの位置１の反対側のアデニンならびにｍｉＲＮＡの位置９の反対側のアデニンまたはウラシルは、必須ではないが、結合の有効性を増加させる。同じシード配列を示すマイクロＲＮＡは、同じｍｉＲＮＡのファミリーに属し、同じｍＲＮＡ標的を調節することができる。単一のｍｉＲＮＡ種は、おそらくｍＲＮＡにおける同じシード一致配列を認識することによって、数百のタンパク質の産生を調節することができる。内因性マイクロＲＮＡ－ｍＲＮＡ相互作用の第２の共通の特徴は、マイクロＲＮＡにおける位置９～１２でのヌクレオチド不一致を含み、それは、おそらく、標的ｍＲＮＡのＡＧＯ２媒介切断を防ぐ。第３の特徴は、シード領域内での一致のみが、遺伝子抑制を誘導するのに常に十分なわけではなく、マイクロＲＮＡ結合の安定化は、マイクロＲＮＡの３’部分において追加の相補性を必要とし得る。特に、シードマッチングが最適でない場合、ｍｉＲＮＡの位置１３～１６におけるヌクレオチドは、重要になる。したがって、３’の位置は、セノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）ｌｉｎ－４におけるｌｅｔ７部位に対して、および哺乳動物Ｈｏｘｂ８ ｍＲＮＡにおけるｍｉＲ－１９６に対して、実験的に確認されるように、シード領域における単一のヌクレオチドミスマッチを補うのに役立つことができる。追加の因子は、結合安定性に影響を及ぼすことができ、その結果、マイクロＲＮＡ媒介遺伝子調節の有効性に影響を及ぼすことができる。例えば、より効果的な抑制は、標的部位に近いＡＵリッチなヌクレオチド組成から得ることができる。さらに、ｍｉＲＮＡ標的配列（ｍｉＲ－ＴＳ）と停止コドンとの間の１５超のヌクレオチドは、それぞれ、翻訳に関与するタンパク質とｍｉＲＮＡ媒介サイレンシングとの間の競合を減じ得る。
【0046】
[0061]内因的に発現されるｍｉＲＮＡは、治療的ｃＤＮＡの形態の外因性ＧＯＩの発現を特異的に調整するために使用することもできる。特に、ｍｉＲＮＡ標的部位またはｍｉＲ－ＴＳは、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの特異的ｍｉＲＮＡ媒介転写後サイレンシングのための標的としてとして機能することができる。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、パルボウイルスベクターから発現させることができ、または本願のパルボウイルスベクターを使用して発現停止させることができるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡに挿入することができる。この場合、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによる分解と同様に、エンドヌクレアーゼ的に切断され、マイクロＲＮＡ－ＲＩＳＣは、急速に再利用される。通常、ｍｉＲＮＡガイド鎖は、標的化ＲＮＡ抑制を調整し、結果として、ｍｉＲ－ＴＳを代表する対応する配列が、導入遺伝子発現カセットのアンチセンス鎖に挿入される。
【0047】
[0062]ｍｉＲＮＡが、全ての組織において普遍的に発現される場合、ＲＤＤＤとして対応するｍｉＲ－ＴＳを伴うパルボウイルスベクターから発現されるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡは、全ての組織において分解され、それにより、全ての細胞においてＧＯＩ発現が増強される。多くのそのようなｍｉＲＮＡは、既に定義されている。ｍｉＲＮＡが、細胞タイプ特異的方式および組織特異的方式において発現される場合、対応するｍｉＴ－ＴＳエレメントは、ｍｉＲＮＡが発現される細胞または組織のみにおいて機能的であろう。例えば、ｍｉＲ－１２２は、肝臓組織においてほぼ排他的に発現される。したがって、一実施形態において、ＧＯＩ転写物にｍｉＲ－１２２－ＴＳは存在しないため、肝臓でのＧＯＩの標的発現が影響を受けないように、ｍｉＲ－１２２－ＴＳがＲＤＤＤとして使用される。しかしながら、ｍｉＲ－１２２－ＴＳを含有するアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡは、抑制および分解される。したがって、ＲＤＤＤとしてｍｉＲ－１２２－ＴＳを伴うベクターを使用した肝臓組織でのＧＯＩ発現は、未改変パルボウイルスベクター比べて改善および増強された発現を提供する。ｍｉＲ－１４２－３ｐに対してｍｉＲ－ＴＳがＲＤＤＤとして使用される別の実施形態において、ＧＯＩ転写物にｍｉＲ－１４２－ＴＳは存在しないため、脾臓組織（ｍｉＲ－１４２が高度に発現される）でのＧＯＩの発現は影響を受けない。アンチセンスＲＮＡおよびｄｓ－ＲＮＡは、脾臓組織において発現されるｍｉＲ－１４２転写物によって分解されるため、それらの干渉は、減少または消失する。
【0048】
[0063]以下のリストは、本願での適用可能性における組織選択性を有するｍｉＲＮＡ標的配列をまとめたものである。
[0064]いくつかの実施形態において、ＥＳ細胞特異的ｍｉＲ－２９６が、ＲＤＤＤとして使用される。
[0064]いくつかの実施形態において、ＥＳ細胞特異的ｍｉＲ－２９６が、ＲＤＤＤとして使用される。
【0049】
[0065]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－２１およびｍｉＲ－２２が、分化したＥＳ細胞においてＲＤＤＤとして使用される。
[0066]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－９２、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ－９６、ｍｉＲ－１３０、またはｍｉＲ－１３０ｂが、ＥＳ細胞および様々な成体組織の両方においてＲＤＤＤとして使用される。
[0066]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－９２、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ－９６、ｍｉＲ－１３０、またはｍｉＲ－１３０ｂが、ＥＳ細胞および様々な成体組織の両方においてＲＤＤＤとして使用される。
【0050】
[0067]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－１３１、ｍｉＲ－１７８、ｍｉＲ－１２４ａ、ｍｉＲ－２６６、またはｍｉＲ－１０３が、マウス脳発達においてＲＤＤＤとして使用される。
【0051】
[0068]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－９＊、ｍｉＲ－１２５ａ、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１３２ｂｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３９、ｍｉＲ－７、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ１２４ａ、ｍｉＲ－１２４ｂ、ｍｉＲ－１３５、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１４９、ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１９０、またはｍｉＲ－２１９が、成体脳においてＲＤＤＤとして使用される。
【0052】
[0069]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１８、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－３２、ｍｉＲ－１３０、ｍｉＲ－２１３、ｍｉＲ－２０、ｍｉＲ－１４１、ｍｉＲ－１９３、またはｍｉＲ－２００ｂが、肺においてＲＤＤＤとして使用される。
【0053】
[0070]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ９９ａ、ｍｉＲ－１２７、ｍｉＲ－１４２－ａ、ｍｉＲ－１４２－ｓ、ｍｉＲ－１５１、ｍｉＲ－１８９ｂ、またはｍｉＲ－２１２が、脾臓においてＲＤＤＤとして使用される。
【0054】
[0071]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－ｌ－３ｐ、またはｍｉＲ－２０６が、筋肉においてＲＤＤＤとして使用される。
[0072]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２２３、またはｍｉＲ－１４２が、造血組織においてＲＤＤＤとして使用される。
[0072]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－２２３、またはｍｉＲ－１４２が、造血組織においてＲＤＤＤとして使用される。
【0055】
[0073]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１２２ａ、ｍｉＲ－１５２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－１９９、またはｍｉＲ－２１５が、肝臓においてＲＤＤＤとして使用される。
【0056】
[0074]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－ｌｂ、ｍｉＲ－ｌｄ、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８ｂ、またはｍｉＲ－１４３が、心臓においてＲＤＤＤとして使用される。
【0057】
[0075]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－３０ｂ、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－１８、ｍｉＲ－２０、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－３２、ｍｉＲ－１４１、ｍｉＲ－１９３、またはｍｉＲ－２００ｂが、腎臓においてＲＤＤＤとして使用される。
【0058】
[0076]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－１４１、またはｍｉＲ－２００ａが、下垂体においてＲＤＤＤとして使用される。
[0077]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－２０５－５ｐが、皮膚においてＲＤＤＤとして使用される。
[0077]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－２０５－５ｐが、皮膚においてＲＤＤＤとして使用される。
【0059】
[0078]いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１４３ａ、ｍｉＲ－２１、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－７ｂ、ｍｉＲ－３０ｂ、またはｍｉＲ－３０ｃは、随所において発現されるため、それらが、ＲＤＤＤとして使用される。
【0060】
[0079]ｍｉＲ－ＴＳの立体配置は、抑制の有効性に影響を及ぼす重要な因子である。完全な相補ｍｉＲ－ＴＳ配列は、ｍｉＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシングの記載されているメカニズムに基づいて、不完全な相補配列よりもより高度な抑制を容易にするであろう。完全な相補標的配列は、マイクロＲＮＡの位置１０／１１の間においてエンドヌクレアーゼ的に切断されるため、ｍｉＲＮＡは、迅速に再利用される。その結果、完全な相補性は、ｍｉＲＮＡ飽和および望ましくない副作用の誘発のリスクを減じるが、それは、その天然標的を調節するための同系のｍｉＲＮＡのバイオアベイラビリティが維持されるためである。ｍｉＲ－ＴＳ配列の慎重な設計は、図１および図２に概説されるように、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの発現の制御において最良の結果を達成するために重要である。
【0061】
[0080]加えて、ｍｉＲ－ＴＳ反復配列の数は、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの発現のｍｉＲＮＡ媒介抑制に影響を及ぼす。概して、ｍｉＲ－ＴＳの数の増加は、アンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの発現のマイクロＲＮＡ依存性抑制を増強する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－ＴＳの２、３、４、または５つの同じ反復配列が、本願のパルボウイルスにおいてＲＤＤＤとして使用される。他の実施形態において、ｍｉＲ－ＴＳの６、７、８、９、１０、１１、または１２つの同じ反復配列が、本願のパルボウイルスにおいてＲＤＤＤとして使用される。いくつかの実施形態において、異なるｍｉＲＮＡ発現プロファイルを有する様々な細胞タイプにおいてアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの活性を制御するために、異なるｍｉＲ－ＴＳが、順番に挿入される。所定の細胞タイプまたは組織に対して異なるｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲ－ＴＳの組み合わせは、特に、マイクロＲＮＡが中程度のレベルにおいてのみ発現する場合、ｍｉＲＮＡ媒介アンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの抑制を増強することができる。その上、協力的ｍｉＲＮＡの採用は、特定のマイクロＲＮＡの機能を飽和状態にするリスクを減じ得る。
【0062】
[0081]アンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの発現のマイクロＲＮＡ媒介抑制の増強は、マイクロＲＮＡ調節を他の調節システムと組み合わせることによっても達成することもできる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－ＴＳの反復配列を分離するために、小さい４から６のヌクレオチド長のスペーサー配列が使用される。スペーサーの導入は、概して、マイクロＲＮＡ／ｍｉＲ－ＴＳ二重鎖に結合する酵素複合体の立体障害を減少させ得、より良い抑制を容易にし得る。いくつかの実施形態において、スペーサー不含多量体ｍｉＲ－ＴＳが、本願のパルボウイルスベクターにおいてＲＤＤＤとして使用される。より短いスペーサーの挿入は、マイクロＲＮＡとｍｉＲ－ＴＳとの間での塩基対合を妨害し得るｍｉＲ－ＴＳの周りに二次構造を形成するリスクを減じ得る。ｍｉＲ－ＴＳのコピー数およびｍｉＲ－ＴＳの間の間隔も、それらがベクターゲノムに挿入された導入遺伝子発現カセットのサイズを増加することができる限り、ウイルスベクター構築に関連する。ｍｉＲ－ＴＳはサイズが小さいため（約２２ｂｐ）、スペーサー配列を含め、ｍｉＲ－ＴＳのタンデム式の反復配列の挿入は、概して、ほとんどのウイルスベクターに対して容量問題を構成しない。しかしながら、低パッケージング能力のいくつかのウイルスベクター、例えば、自己相補性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの場合、ｍｉＲ－ＴＳの全長および数を抑えることは、重要な考慮すべき事項であり得る。これに関して、ｍｉＲ－ＴＳの短縮が必要な場合もある。一実施形態において、ｍｉＲ－１２２ＴＳの５’末端からの最大で５つまでのヌクレオチドの欠失は、十分に許容され、アンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの抑制を媒介することにおけるその役割には影響を及ぼさなかった。
【0063】
[0082]ｍＲＮＡにおけるｍｉＲ－ＴＳの位置も、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの活性の制御におけるその有効性にとって重要である。ｍｉＲ－ＴＳの挿入により結果として生じるｍＲＮＡにおける二次構造も、標的ｍＲＮＡに対するアクセシビリティが妨げられるような抑制に影響を及ぼすことができる。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、好ましくは停止コドン付近に挿入される。他の実施形態において、１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが、５’ＵＴＲに挿入される。他の実施形態において、１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳが、ＧＯＩのオープンリーディングフレームに挿入される。この場合、それは、ＧＯＩのアンチセンス鎖から発現されるため、アンチセンスＲＮＡの抑制にとって比較的単純である。ｄｓＲＮＡの場合、１つまたは複数のｍｉＲ－ＴＳは、ＧＯＩのアンチセンス鎖、より詳細には、ＧＯＩのセンス鎖におけるイントロンの逆相補的な方向で置くことができる。
【0064】
[0083]概して、ベクター由来のアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの最適なｍｉＲＮＡ媒介抑制は、達成することができ、その場合、ｍｉＲＮＡの高い発現が生じ、完全な相補性を有するｍｉＲ－ＴＳの複数のコピー（例えば、３～４のコピー）の挿入が採用され、ｍｉＲ－ＴＳの挿入は、低二次構造の部位に存在し、ｍｉＲＮＡおよびその標的部位は、高い特異度を示す。
【0065】
[0084]いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、ｍｉＲ－２０６ＴＳを含む。ｍｉＲ２０６は、骨格筋において非常に発現され、心臓には存在しない。対照的に、ｍｉＲ－１は、ｍｉＲ－２０６に対して高い配列相同性を示すが、心臓において非常に発現される。したがって、ｍｉＲ－２０６ＴＳは、マイクロＲＮＡ／ｍｉＲ－２０６ＴＳデュプレックスのシード領域に単一のヌクレオチド置換を導入することによって変異され得る。変異ｍｉＲ－２０６ＴＳは、ｍｉＲ－１調節に対して耐性を有するが、ｍｉＲ－２０６に対して非常に影響を受けやすいままである。これは、変異したｍｉＲ２０６ＴＳに対するｍｉＲ２０６の３’位の完全な相補性によって誘導される補償効果の結果である。変異したｍｉＲ２０６ＴＳおよびｍｉＲ１２２ＴＳを有するＡＡＶ９ベクターのインビボアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ発現は、骨格筋および肝臓の両方において強く抑制され得るが、その一方で、心臓におけるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡは、影響を受けないままである。
【0066】
[0085]いくつかの実施形態において、アンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを発現するためのｍｉＲ－１２２ＴＳ含有ベクターは、ＧＯＩ発現が肝臓に制限されるように、ｍｉＲ－１２２ＴＳを有さないＧＯＩベクターと組み合わせることができ、その場合、ｍｉＲ－１２２による干渉を消失させることができる。このアプローチは、ｍｉＲ－ＴＳ媒介組織特異的発現を達成するための上記において記載される単一ベクターとは異なっているが、それは、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの活性を調節するｍｉＲ－ＴＳが、ｍｉＴ－ＴＳを有さないＧＯＩベクターとは別々のコンストラクトに位置するためである。
【0067】
[0086]いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、ｍｉＲ３１、ｍｉＲ１２７、またはｍｉＲ１４３に対して、ｍｉＲ－ＴＳを含む。ｍｉＲ３１、ｍｉＲ１２７、およびｍｉＲ１４３は、グリオーマ細胞よりも正常な神経細胞においてより多く発現される。いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、ｍｉＲ－１２４ＴＳを含む。ｍｉＲ－１２４ＴＳは、インビトロおよびインビボでのニューロン細胞における導入遺伝子発現を抑制するのに十分であり、その一方で、星状細胞での発現は、影響を受けない。
【0068】
[0087]いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、ｍｉＲ－２０４ＴＳを含む。１つまたは複数のｍｉＲ－２０４ＴＳを含むパルボウイルスベクターは、ｍｉＲ２０４発現が生じることが知られている網膜色素上皮（ＲＰＥ）ＲＰＥにおいて選択的に抑制することができる。いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、光受容体ＰＲにおいて発現されるがＲＰＥには存在しないマイクロＲＮＡであるｍｉＲ－１２４に対して、ｍｉＲ－ＴＳを含む。いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、ｍｉＲ－１８１ｃＴＳを含む。ｍｉＲ－１８１ｃは、網膜神経節細胞および内網膜において発現されるマイクロＲＮＡである。
【0069】
[0088]ｍｉＲ－ＴＳのおよそ１００ｂｐの配列の挿入は、従来のクローン技術によって達成することができる。概して、ｍｉＲ－ＴＳの小さいサイズは、大きいサイズだとパルボウイルスベクターでの使用のための導入遺伝子コンストラクトの範囲を制限することができるパッケージングの制限を回避し、それにより、ウイルスベクターおよびウイルスの両方に広い適用性を提供する。
【0070】
[0089]図１２に示されるような別の実施形態において、ＲＤＤＤは、ｄｓＲＮＡの効果を減少または消失させるために含まれる。ＲＤＤＤ部位は、ＧＯＩのアンチセンス鎖の転写終結部位または３’ＩＴＲの前の領域に置かれる。欠陥干渉粒子から発現されるｄｓＲＮＡは、ＲＤＤＤＥＭによって不安定化または破壊され（右側のパネル）、その一方で、ＧＯＩｍＲＮＡは影響を受けない（左側のパネル）。ＲＤＤＤの位置は、全長ベクターからではなく、ＤＩ粒子から転写されるのみである限り、変更することができる。第２の特徴は、プロモーターの反対の鎖に付加された転写停止配列（ポリＡ部位）である。センス鎖において、ポリＡ部位は、プロモーターの反対の方向であり、したがって、活性ではない。ＡＡＶ調製物から形成されるＤＩ粒子において、プロモーターからのリードスルーは止められる。それは、プロモーターが、ＡＡＶが統合するときに細胞遺伝子を活性化し得るような状況を防ぐ。転写停止部位（すなわち、ポリＡ）は、正常なＡＡＶ転写に影響を及ぼさない。それは、ＡＡＶベクターの安全性を改善するのに役立つ。
【0071】
[0090]ＲＤＤＤ源としてのリボザイム
[0091]自己切断性リボザイムは、ツイスターリボザイム、ツイスターシスターリボザイム、ハチェットリボザイム、ピストルリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム（ＨＨＲ）などを含む、ＲＮＡ分子の広いカテゴリである。ＨＨＲ構造は、３つのステムによって形成される「Ｙ」形状を含み、この場合、ステム１および２は、活性部位の立体配置の安定化により迅速な切断メカニズムを促進する遠位三次接触と相互作用する。必要な残基の最適な位置決めにより、エステル交換反応が触媒され、結果として、末端２’－３’－環状ホスフェートを有する５’産物および遊離末端５’－ヒドロキシル基を有する３’産物を生じる。ＨＨＲにおける３つの異なるトポロジーは、モチーフの３つのステムのうちの１つがＨＨＲをＲＮＡバックボーンに接続する方式に応じて、区別することができる。１０，０００を超えるＨＨＲモチーフが、生命の全ての界にわたって分配された遺伝子配列における生命情報工学分析によって発見されている。
[0091]自己切断性リボザイムは、ツイスターリボザイム、ツイスターシスターリボザイム、ハチェットリボザイム、ピストルリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム（ＨＨＲ）などを含む、ＲＮＡ分子の広いカテゴリである。ＨＨＲ構造は、３つのステムによって形成される「Ｙ」形状を含み、この場合、ステム１および２は、活性部位の立体配置の安定化により迅速な切断メカニズムを促進する遠位三次接触と相互作用する。必要な残基の最適な位置決めにより、エステル交換反応が触媒され、結果として、末端２’－３’－環状ホスフェートを有する５’産物および遊離末端５’－ヒドロキシル基を有する３’産物を生じる。ＨＨＲにおける３つの異なるトポロジーは、モチーフの３つのステムのうちの１つがＨＨＲをＲＮＡバックボーンに接続する方式に応じて、区別することができる。１０，０００を超えるＨＨＲモチーフが、生命の全ての界にわたって分配された遺伝子配列における生命情報工学分析によって発見されている。
【0072】
[0092]Ｉ群のイントロンベースのリボザイムは、その基質ＲＮＡを標的として切断し、切断された標的ＲＮＡ上へとその３’末端に結合したエクソン（例えば、治療用ＲＮＡ）をトランススプライシングし、その結果、治療用ＲＮＡの発現および基質ＲＮＡの抑制が生じる。そのようなリボザイムは、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡ陽性癌細胞と、さらに造血幹細胞由来の血液細胞も、特異的に標的とすることができるため、リボザイムは、その３’エクソンの下流の血液細胞特異的ｍｉＲ１８１aのための標的部位を挿入することによって改変することができる。リボザイムがＲＤＤＤとして使用される場合、それは、ＲＤＤＤＥＭを通常は必要としない自己触媒反応を促進するＲＤＤＥＭの機能を果たすこともできる。
【0073】
[0093]概して、真核生物系における遺伝的制御は、自己切断性リボザイムを、所定のｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方に挿入することによって達成することができる。
【0074】
[0094]リボザイムの切断は、安定化５’キャップまたはポリ（Ａ）構造の除去およびその結果による遺伝子発現の減少に起因して、ｍＲＮＡの分解を生じる。脱アデニル化ｍＲＮＡは、細胞質エキソソームにより迅速に分解される。このメカニズムにより、リガンド依存性リボザイムが、哺乳動物細胞での使用のために首尾よく開発された。
【0075】
[0095]アプタザイムは、より小さい、リガンド誘導性の自己切断性ＲＮＡベースのリボザイムであり、転写因子を必要とせず、様々な小分子リガンドに対する応答性のためにカスタマイズすることができる。ｍＲＮＡ自己切断のトリガリングのためのリガンド依存性リボザイムは、哺乳動物細胞を含む様々な有機体において実証されているが、ほとんどが、人工レポーター遺伝子発現調節に限定されている。一実施形態において、テオフィリン依存性ハンマーヘッドリボザイム（Ｔｈｅｏ－ＨＨＲ）が、本願のパルボウイルスベクターにおいてＲＤＤＤとして使用される。いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤとしてリボザイムベースの人工スイッチを構築するために、Ｔｈｅｏ－ＨＨＲがアンチセンスＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの３’末端に挿入される。アプタマーとＨＨＲリボザイムとの間の接合配列は、このリボスイッチシステムの機能および性能に影響を及ぼすように調整することができる。
【0076】
[0096]哺乳動物細胞における遺伝子発現の化学的調節は、ハンマーヘッドリボザイムをｍＲＮＡの非翻訳領域（ＵＴＲ）に埋め込むことによって達成することができる。そのため、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの活性を誘導的に制御するために、ＨＨＲが使用され得る。いくつかの実施形態において、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの３’ＵＴＲに埋め込まれた、アロステリックに調節されたリボザイム（アプタザイム）は、哺乳動物細胞における遺伝子発現を化学的に調節するためのリボスイッチとして使用することができる。
【0077】
[0097]自己切断性リボザイムは、生命の全ての界において見出される小さいＲＮＡモチーフである。ハンマーヘッドリボザイム（ＨＨＲ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム、ヘアピンリボザイム、およびツイスターリボザイムを含む、小さい自己切断性リボザイムの異なるクラスが存在する。アンチセンス鎖［正しい？］の異なる位置における、遺伝子操作されたＨＨＲ、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム、ヘアピンリボザイム、およびツイスターリボザイムの実践形態は、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの切断および崩壊を促進させ、それにより、ＧＯＩ発現のそれらの抑制を減少させることができる。リボザイムの主要構造エレメントへのアプタマーの統合は、それらの自己切断活性のリガンド応答性制御を可能にする。
【0078】
[0098]一実施形態において、１つまたは複数のアプタマー（例えば、テオフィリンアプタマー、テトラサイクリンアプタマー、グアニンアプタマー、およびＭＳ２ステムループ／ＭＳ２外皮タンパク質アプタマー）は、ＨＨＲ（例えば、短いコミュニケーション配列を介するタバコ輪点ウイルスのサテライトＲＮＡ（ｓＴＲＳＶ）に由来する）の相互作用性ステムルームのうちの１つに接続的に連結される。この設計コンセプトは、リボザイムを活性立体配座状態と不活性立体配座状態との間でスイッチさせるリボザイムの二次構造のリガンド誘導変化に基づいている。リボザイムへのコミュニケーション配列の接続に応じて、ＯＮタイプまたはＯＦＦタイプの遺伝子スイッチを遺伝子操作することができる。コミュニケーション配列の配列同一性は、遺伝子スイッチの基本的発現および動的範囲を含む、アプタザイムの性能を強く決定する。したがって、アプタザイムの制御下のアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの活性は、それぞれ、正および負に調節することができる。
【0079】
[0099]いくつかの実施形態において、アプタザイムが、ＲＤＤＤとして使用されるＨＨＲである。他の実施形態において、アプタザイムは、グアニンアプタマーに接続したＨＤＶリボザイムを含み、結果として、哺乳動物細胞におけるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡのためのグアニン応答性遺伝子スイッチをもたらす。他の実施形態において、ＨＤＶアプタザイムのライブラリーは、リボザイムの異なる位置にアプタマーを融合させることによって生成される。一実施形態において、グアニンアプタマーが、ＨＤＶ様リボザイムｄｒｚ－Ａｇａｍ－２－１の２つの異なる部位に融合される。別の実施形態において、優れた自己切断活性を有するリガンド応答性リボザイムであるツイスターリボザイムが、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを抑制するためのＲＤＤＤとして使用される。さらなる別の実施形態において、ＨＨＲおよびツイスターリボザイムが、ＲＤＤＤとしてｍｉＲ－ＴＳと共に使用される。いくつかの実施形態において、アプタザイムの複数のコピーが、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの３’ＵＴＲ、またはパルボウイルスベクターのアンチセンス鎖における３’ＵＴＲに統合される。いくつかの実施形態において、アプタザイムが、同時に、イントロンおよび３’－ＵＴＲに統合される。アプタザイムを統合する場合、特に、複数のコピーを単一のｍＲＮＡに統合する場合、隣接するＲＮＡ配列および構造を慎重に分析するべきである。いくつかの実施形態において、望ましくない二次構造を防ぐため、ならびに個々のアプタザイムの正しい折り畳みを確保するために、アプタザイムがスペーサー配列によって隣接される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ二次構造のインシリコ予測のため、およびアプタザイムの遺伝子操作および設計されたＲＮＡ配列のための統合手順を容易にするために、生命情報工学ツールが使用される。表１は、異なる標的細胞および組織におけるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの活性を制御するためにＲＤＤＤとして使用することができるｍｉＲ－ＴＳエレメントの例示的一覧を示している。
【0080】
[0100]表１：異なる標的細胞および組織におけるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを制御するためのＲＤＤＤとしての例示的ｍｉＲ－ＴＳエレメント。例えば、ｌｅｔ－７ａの場合のｍｉＲ－ＴＳは、非多能性細胞におけるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを制御するためのＲＤＤＤとして使用することができ；ｍｉＲ－１の場合のｍｉＲ－ＴＳは、心臓組織におけるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを制御するためのＲＤＤＤとして使用することができる、など。
【0081】
【表1】
【0082】
本願のＲＤＤＤの機能的な利点
[0101] ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムのターゲティング配列を有する従来のＡＡＶと比較して、本願のＲＤＤＤは、本質的に異なる役割を果たす。ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムのターゲティング配列がＧＯＩ転写物の３’末端に置かれる従来のベクターとは異なり、本願のＧＯＩ転写物は、対応するｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムによって直接的に調節される。本願において、ＲＤＤＤは、アンチセンスまたはｄｓＲＮＡに統合される。その方向は、常に、ＧＯＩ転写物の相補鎖の方向である。したがって、パルボウイルスベクターに対するｄｓＲＮＡは、ＧＯＩ転写物に影響を及ぼす、対応するそのＤＩ粒子から産生される。換言すれば、ＲＤＤＤは、その方向が常にＧＯＩ転写物に対して逆相補的であるように、アンチセンス鎖に統合される。したがって、パルボウイルスＤＩ粒子から産生されるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの機能的活性、詳細には、ＧＯＩ発現に対するそれらの負の効果を、減少または消失させることができる。
[0101] ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムのターゲティング配列を有する従来のＡＡＶと比較して、本願のＲＤＤＤは、本質的に異なる役割を果たす。ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムのターゲティング配列がＧＯＩ転写物の３’末端に置かれる従来のベクターとは異なり、本願のＧＯＩ転写物は、対応するｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムによって直接的に調節される。本願において、ＲＤＤＤは、アンチセンスまたはｄｓＲＮＡに統合される。その方向は、常に、ＧＯＩ転写物の相補鎖の方向である。したがって、パルボウイルスベクターに対するｄｓＲＮＡは、ＧＯＩ転写物に影響を及ぼす、対応するそのＤＩ粒子から産生される。換言すれば、ＲＤＤＤは、その方向が常にＧＯＩ転写物に対して逆相補的であるように、アンチセンス鎖に統合される。したがって、パルボウイルスＤＩ粒子から産生されるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの機能的活性、詳細には、ＧＯＩ発現に対するそれらの負の効果を、減少または消失させることができる。
【0083】
[0102]ＲＤＤＤを運ぶベクターの主な利点は、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの負の効果を消失させることによって長期の安定した遺伝子発現を提供するそれらの能力である。ＧＯＩを標的とするアンチセンスおよびｄｓＲＮＡ分子は、ＧＯＩ転写物を直接調節し、ＧＯＩ ＲＮＡ分解によりそれらの発現を減少させることができる。加えて、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡは、免疫応答を誘導し、ＧＯＩ発現を減少／不安定化することで知られている。
【0084】
[0103]本願のベクターの重要な特徴は、ベクターは、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの発現を制御するために、内因性／外因性のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびリボザイムによって調節されるように設計することができ、それにより、所定のベクターのための特定の発現プロファイルを達成することができることである。したがって、これらのベクターは、免疫応答を防ぐためおよび／または長期導入遺伝子発現を維持するための遺伝子治療アプローチのために使用することができる。
【0085】
[0104]本願の別の態様は、組換えパルボウイルス産生収量を改善するための方法であって、ＲＮＡ不安定化／破壊ドメイン（ＲＤＤＤ）を組換えパルボウイルスに挿入するステップを含む方法に関する。組換えパルボウイルスは、パルボウイルスカプシドと；センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ウイルスゲノムとを含み、センス鎖は、５’から３’方向に：５’末端におけるパルボウイルス末端反復配列；目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列；および３’末端におけるパルボウイルス末端反復配列を含み、ＲＤＤＤは、ウイルスゲノムに挿入される。
【0086】
[0105]いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、ウイルスゲノムのアンチセンス鎖に位置する。いくつかの実施形態において、ＲＤＤＤは、逆の方向でＧＯＩのイントロンに位置する。
【実施例】
【0087】
[0106]実施例１:アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ消失のための偏在的に発現されるｍｉＲ－１６－ＴＳ
[0107]ｈｓａ－ｍｉＲ－１６配列を、ｍｉＲＮＡレジストリー（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ， ２００４）から得た。ｍｉＲ－１６標的配列を有するＲＤＤＤを合成し、肝臓特異的プロモーターＴＴＲの制御下においてＢドメイン欠失ＶＩＩＩ因子を有するＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）発現コンストラクトｐＡＡＶ－Ｆ８へクローン化した。プロモーターとＦＶＩＩＩ開始コドンとの間に挿入されたｍｉＲ－１６配列を有するＲＤＤＤ配列は、配列ＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧ（配列番号１）を含む。ＧＯＩ鎖における下線を引いた配列は、特定のｍｉＲＮＡに完全に一致するように設計される。ボトム鎖において、配列は、特定のｍｉＲＮＡ（この場合は、ｍｉＲ－１６）に対して完全に相補的である。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＰＧである。プロモーターとＧＯＩとの間の長い間隔を避けるために、１つのコピーｍｉＲＮＡだけが使用される。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＰＧをベースとするベクターを、一般的に報告される三重プラスミドトランスフェクション法によって産生した。ＤＩ組成をｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がインビボにおいてｄｓＲＮＡを発現するであろうことを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８およびｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＰＧによって産生されたベクターの注入後に、肝臓組織を採取し、試料からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＰＧ由来のｄｓＲＮＡの存在が、８０％から検出不能なレベルまで減少したことを確認した。
[0107]ｈｓａ－ｍｉＲ－１６配列を、ｍｉＲＮＡレジストリー（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ， ２００４）から得た。ｍｉＲ－１６標的配列を有するＲＤＤＤを合成し、肝臓特異的プロモーターＴＴＲの制御下においてＢドメイン欠失ＶＩＩＩ因子を有するＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）発現コンストラクトｐＡＡＶ－Ｆ８へクローン化した。プロモーターとＦＶＩＩＩ開始コドンとの間に挿入されたｍｉＲ－１６配列を有するＲＤＤＤ配列は、配列ＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧ（配列番号１）を含む。ＧＯＩ鎖における下線を引いた配列は、特定のｍｉＲＮＡに完全に一致するように設計される。ボトム鎖において、配列は、特定のｍｉＲＮＡ（この場合は、ｍｉＲ－１６）に対して完全に相補的である。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＰＧである。プロモーターとＧＯＩとの間の長い間隔を避けるために、１つのコピーｍｉＲＮＡだけが使用される。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＰＧをベースとするベクターを、一般的に報告される三重プラスミドトランスフェクション法によって産生した。ＤＩ組成をｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がインビボにおいてｄｓＲＮＡを発現するであろうことを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８およびｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＰＧによって産生されたベクターの注入後に、肝臓組織を採取し、試料からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＰＧ由来のｄｓＲＮＡの存在が、８０％から検出不能なレベルまで減少したことを確認した。
【0088】
[0108]実施例２:アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ消失のためのｍｉＲ－１６－ＴＳの複数コピー
[0109]４つのコピーｍｉＲ－１６標的配列を有するＲＤＤＤを合成し、肝臓特異的プロモーターＴＴＲの制御下においてＢドメイン欠失ＶＩＩＩ因子を有するＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）発現コンストラクトｐＡＡＶ－Ｆ８へクローン化した。ＧＯＩのプロモーターのアンチセンス鎖にはポリＡシグナルが存在しないため、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡに対する転写物は、プロモーターを超えて延び、ＩＴＲにおいて止まるであろうし、それは、ポリＡ部位の機能を有することが示される。ｍｉＲ－１６の４つのコピーを有するＲＤＤＤを、プロモーターと、以下の配列：
ｇｔａｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｃｔａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｔｃａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧａｇｃｔｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｃｇｔａ（配列番号２）
を含む５’ＩＴＲとの間に挿入した。ＧＯＩ鎖における下線を引いた配列は、特定のｍｉＲＮＡに完全に一致するように設計した。ボトム鎖において、これらの配列は、特定のｍｉＲＮＡ（この場合は、ｍｉＲ－１６）に対して完全に相補的であった。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＴＰであった。ＲＤＤＤを挿入するための別の理想的な位置は、プロモーターとエンハンサーとの間のヌクレオチドであり、その距離は、通常、プロモーターの活性に影響を及ぼさない。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＴＰをベースとするベクターを、三重プラスミドトランスフェクションによって産生した。ＤＩ組成をｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がインビボにおいてｄｓＲＮＡを発現するであろうことを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＴＰによって産生されたベクターの注入後に、肝臓組織を採取し、試料組織からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＴＰから産生されたベクター由来のｄｓＲＮＡの存在が、３回の繰り返し実験に基づいて、検出不能なレベルまで減少したことを確認した。
[0109]４つのコピーｍｉＲ－１６標的配列を有するＲＤＤＤを合成し、肝臓特異的プロモーターＴＴＲの制御下においてＢドメイン欠失ＶＩＩＩ因子を有するＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）発現コンストラクトｐＡＡＶ－Ｆ８へクローン化した。ＧＯＩのプロモーターのアンチセンス鎖にはポリＡシグナルが存在しないため、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡに対する転写物は、プロモーターを超えて延び、ＩＴＲにおいて止まるであろうし、それは、ポリＡ部位の機能を有することが示される。ｍｉＲ－１６の４つのコピーを有するＲＤＤＤを、プロモーターと、以下の配列：
ｇｔａｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｃｔａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｔｃａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧａｇｃｔｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｃｇｔａ（配列番号２）
を含む５’ＩＴＲとの間に挿入した。ＧＯＩ鎖における下線を引いた配列は、特定のｍｉＲＮＡに完全に一致するように設計した。ボトム鎖において、これらの配列は、特定のｍｉＲＮＡ（この場合は、ｍｉＲ－１６）に対して完全に相補的であった。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＴＰであった。ＲＤＤＤを挿入するための別の理想的な位置は、プロモーターとエンハンサーとの間のヌクレオチドであり、その距離は、通常、プロモーターの活性に影響を及ぼさない。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＴＰをベースとするベクターを、三重プラスミドトランスフェクションによって産生した。ＤＩ組成をｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がインビボにおいてｄｓＲＮＡを発現するであろうことを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＴＰによって産生されたベクターの注入後に、肝臓組織を採取し、試料組織からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－ＴＰから産生されたベクター由来のｄｓＲＮＡの存在が、３回の繰り返し実験に基づいて、検出不能なレベルまで減少したことを確認した。
【0089】
[0110]実施例３:肝臓におけるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ消失のためのｍｉＲ－１６－ＴＳおよびｍｉＲ－１２２
[0111]ＧＯＩのプロモーターのアンチセンス鎖にはポリＡシグナルが存在しないため、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡに対する転写物は、プロモーターを超えて延び、ＩＴＲにおいて止まるであろうし、それは、ポリＡ配列の機能を有することが示される。この研究において、ｍｉＲ－１６の２つのコピーとｍｉＲ－１２２（ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号３））の２つのコピーとを有するＲＤＤＤをプロモーターとエンハンサーとの間に挿入し、それは、以下の配列：
ｇｔａｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡｇｃｔａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｔｃａｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡａｇｃｔｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｃｇｔａ（配列番号４）
を含む。
[0111]ＧＯＩのプロモーターのアンチセンス鎖にはポリＡシグナルが存在しないため、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡに対する転写物は、プロモーターを超えて延び、ＩＴＲにおいて止まるであろうし、それは、ポリＡ配列の機能を有することが示される。この研究において、ｍｉＲ－１６の２つのコピーとｍｉＲ－１２２（ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号３））の２つのコピーとを有するＲＤＤＤをプロモーターとエンハンサーとの間に挿入し、それは、以下の配列：
ｇｔａｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡｇｃｔａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｔｃａｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡａｇｃｔｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｃｇｔａ（配列番号４）
を含む。
【0090】
[0112]ＧＯＩ鎖における下線を引いた配列は、特定のｍｉＲＮＡに完全に一致するように設計される。ボトム鎖において、これらの配列は、特定のｍｉＲＮＡ（この場合は、ｍｉＲ－１６およびｍｉＲ－１２２）に対して完全に相補的である。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＥＰであった。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＥＰをベースとするベクターを、三重プラスミドトランスフェクションによって産生した。ＤＩ組成をｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がインビボにおいてｄｓＲＮＡを発現するであろうことを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８およびｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＥＰによって産生されたベクターの注入後に、肝臓組織を採取し、試料からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ＡＡＶ－Ｆ８におけるｄｓＲＮＡおよびｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＥＰ由来のｄｓＲＮＡの存在が、７５％から検出不能なまで減少したことを確認した。
【0091】
[0113]実施例４：ＧＯＩのコード配列に埋め込まれた、肝臓におけるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ消失のためのｍｉＲ－１６－ＴＳおよびｍｉＲ１２２
[0114]この研究において、ＲＤＤＤは、以下の配列：
ｇｔａａｇｔｇｃｃｇｔｇｔｇｔｇｇｔｔｃｃｃｇｃｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｔａｃｇｇｇｔｔａｔｇｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡｇｃｔａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｔｃａｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡａｇｃｔｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｃｃｔｔｇｃｇｔｇｃｃｔｔｇａａｔｔａｃｔｇａｃａｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔｃｃａｃａｇ（配列番号５）
に反映されるような、イントロンに埋め込まれたｍｉＲ－１６の２つのコピーおよびｍｉＲ－１２２の２つのコピーを含む。合成イントロンは小文字で表されている。ＧＯＩ鎖における下線を引いた配列は、特定のｍｉＲＮＡに完全に一致するように設計される。ボトム鎖において、これらの配列は、特定のｍｉＲＮＡ（この場合は、ｍｉＲ－１６およびｍｉＲ－１２２）に対して完全に相補的である。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＮである。イントロンは、ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるＣＡＧ／Ｇ配列に挿入される。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＮをベースとするベクターを、三重プラスミドトランスフェクションによって産生した。ＤＩ組成をｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がｄｓＲＮＡを発現することを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８およびｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＮによって産生されたベクターの注入後に、３週間後に、肝臓組織を採取し、試料からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＮから産生されたベクター由来のｄｓＲＮＡの存在が検出不能であることを確認した。このコンストラクトにおいて発現されたＶＩＩＩ因子は、ａＰＴＴアッセイにおいて正常に機能した。
[0114]この研究において、ＲＤＤＤは、以下の配列：
ｇｔａａｇｔｇｃｃｇｔｇｔｇｔｇｇｔｔｃｃｃｇｃｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｔａｃｇｇｇｔｔａｔｇｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡｇｃｔａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｔｃａｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡａｇｃｔｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｃｃｔｔｇｃｇｔｇｃｃｔｔｇａａｔｔａｃｔｇａｃａｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔｃｃａｃａｇ（配列番号５）
に反映されるような、イントロンに埋め込まれたｍｉＲ－１６の２つのコピーおよびｍｉＲ－１２２の２つのコピーを含む。合成イントロンは小文字で表されている。ＧＯＩ鎖における下線を引いた配列は、特定のｍｉＲＮＡに完全に一致するように設計される。ボトム鎖において、これらの配列は、特定のｍｉＲＮＡ（この場合は、ｍｉＲ－１６およびｍｉＲ－１２２）に対して完全に相補的である。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＮである。イントロンは、ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるＣＡＧ／Ｇ配列に挿入される。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＮをベースとするベクターを、三重プラスミドトランスフェクションによって産生した。ＤＩ組成をｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がｄｓＲＮＡを発現することを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８およびｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＮによって産生されたベクターの注入後に、３週間後に、肝臓組織を採取し、試料からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＮから産生されたベクター由来のｄｓＲＮＡの存在が検出不能であることを確認した。このコンストラクトにおいて発現されたＶＩＩＩ因子は、ａＰＴＴアッセイにおいて正常に機能した。
【0092】
[0115]実施例５：追加のポリＡ配列を伴うコード配列に埋め込まれた、肝臓におけるアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ消失のためのｍｉＲ－１６－ＴＳおよびｍｉＲ１２２
[0116]埋め込まれたポリＡ配列の機能を実証するため、ＲＤＤＤは、以下の配列：
ｇｔａａｇｔｇｃｃｇｔｇｔｇｔｇｇｔｔｃｃｃｇｃｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｔａｃｇｇｇｔｔａｔｇｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡｇｃｔａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｔｃａｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡａｇｃｔｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｃｃｔｔｇｃｇｔｇｃｃｔｔｇａａｔｔａｃｔｇａＴＴＴＡＴＴｃａｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔｃｃａｃａｇ（配列番号６）
に反映されるような、イントロンに埋め込まれたｍｉＲ－１６の２つのコピーおよびｍｉＲ－１２２の２つのコピーを含む。合成イントロンは小文字で表されている。ポリＡ配列は、コード鎖において逆相補的な方向で提示される。ＧＯＩ鎖における下線を引いた配列は、特定のｍｉＲＮＡに完全に一致するように設計される。ボトム鎖において、これらの配列は、特定のｍｉＲＮＡ（この場合は、ｍｉＲ－１６およびｍｉＲ－１２２）に対して完全に相補的である。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＰである。イントロンは、ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるＣＡＧ／Ｇ配列に挿入される。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＰをベースとするベクターを、三重プラスミドトランスフェクションによって産生した。ＤＩ組成をｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がｄｓＲＮＡを発現するであろうことを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８およびｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＰによって産生されたベクターの注入後に、肝臓組織を採取し、試料からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＰから産生されたベクターにおけるｄｓＲＮＡの存在が７０％から検出不能なレベルに減少したことを確認した。このコンストラクトにおいて発現されたＶＩＩＩ因子は、ａＰＴＴアッセイにおいて正常に機能した。
[0116]埋め込まれたポリＡ配列の機能を実証するため、ＲＤＤＤは、以下の配列：
ｇｔａａｇｔｇｃｃｇｔｇｔｇｔｇｇｔｔｃｃｃｇｃｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｔａｃｇｇｇｔｔａｔｇｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡｇｃｔａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｔｃａｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡａｇｃｔｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｃｃｔｔｇｃｇｔｇｃｃｔｔｇａａｔｔａｃｔｇａＴＴＴＡＴＴｃａｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔｃｃａｃａｇ（配列番号６）
に反映されるような、イントロンに埋め込まれたｍｉＲ－１６の２つのコピーおよびｍｉＲ－１２２の２つのコピーを含む。合成イントロンは小文字で表されている。ポリＡ配列は、コード鎖において逆相補的な方向で提示される。ＧＯＩ鎖における下線を引いた配列は、特定のｍｉＲＮＡに完全に一致するように設計される。ボトム鎖において、これらの配列は、特定のｍｉＲＮＡ（この場合は、ｍｉＲ－１６およびｍｉＲ－１２２）に対して完全に相補的である。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＰである。イントロンは、ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるＣＡＧ／Ｇ配列に挿入される。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＰをベースとするベクターを、三重プラスミドトランスフェクションによって産生した。ＤＩ組成をｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がｄｓＲＮＡを発現するであろうことを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８およびｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＰによって産生されたベクターの注入後に、肝臓組織を採取し、試料からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＩＰから産生されたベクターにおけるｄｓＲＮＡの存在が７０％から検出不能なレベルに減少したことを確認した。このコンストラクトにおいて発現されたＶＩＩＩ因子は、ａＰＴＴアッセイにおいて正常に機能した。
【0093】
[0117]実施例６：アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ消失のためのｍｉＲ１６－ＴＳおよびｍｉＲ１２２に対する二重ＲＤＤＤ。ＧＯＩ（ＶＩＩＩ因子）遺伝子のアンチセンス鎖におけるポリＡ部位
[0118]この研究において、イントロンに埋め込まれたｍｉＲ－１６の２つのコピーおよびｍｉＲ－１２２の２つのコピーを伴う二重ＲＤＤＤは、以下の配列：
ｇｔａａｇｔｇｃｃｇｔｇｔｇｔｇｇｔｔｃｃｃｇｃｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｔａｃｇｇｇｔｔａｔｇｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡｇｃｔａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｔｃａｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡａｇｃｔｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｃｃｔｔｇｃｇｔｇｃｃｔｔｇａａｔｔａｃｔｇａｃａｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔｃｃａｃａｇ（配列番号７）
を含む。合成イントロンは小文字で表されている。ＧＯＩ鎖における下線を引いた配列は、特定のｍｉＲＮＡに完全に一致するように設計される。ボトム鎖において、これらの配列は、特定のｍｉＲＮＡ（この場合は、ｍｉＲ－１６およびｍｉＲ－１２２）に対して完全に相補的である。イントロンは、ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるＣＡＧ／Ｇ配列に挿入される。第２のＲＤＤＤは、ｇｔａｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｃｔａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧ（配列番号８）の配列を有し、これは、エンハンサーとプロモーターとの間に挿入される。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＤＲである。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＤＲをベースとするベクターを、三重プラスミドトランスフェクションによって産生した。ＤＩ組成を、ｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がインビボにおいてｄｓＲＮＡを発現するであろうことを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８およびｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＤＲによって産生されたベクターの注入後に、肝臓組織を採取し、試料からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＤＲ由来のｄｓＲＮＡの存在が検出不能であることを確認した。このコンストラクトにおいて発現されたＶＩＩＩ因子は、ａＰＴＴアッセイにおいて正常に機能した。
[0118]この研究において、イントロンに埋め込まれたｍｉＲ－１６の２つのコピーおよびｍｉＲ－１２２の２つのコピーを伴う二重ＲＤＤＤは、以下の配列：
ｇｔａａｇｔｇｃｃｇｔｇｔｇｔｇｇｔｔｃｃｃｇｃｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｔａｃｇｇｇｔｔａｔｇｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡｇｃｔａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｔｃａｇｃＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡａｇｃｔｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｃｃｔｔｇｃｇｔｇｃｃｔｔｇａａｔｔａｃｔｇａｃａｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔｃｃａｃａｇ（配列番号７）
を含む。合成イントロンは小文字で表されている。ＧＯＩ鎖における下線を引いた配列は、特定のｍｉＲＮＡに完全に一致するように設計される。ボトム鎖において、これらの配列は、特定のｍｉＲＮＡ（この場合は、ｍｉＲ－１６およびｍｉＲ－１２２）に対して完全に相補的である。イントロンは、ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるＣＡＧ／Ｇ配列に挿入される。第２のＲＤＤＤは、ｇｔａｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧｇｃｔａｇｃＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＧ（配列番号８）の配列を有し、これは、エンハンサーとプロモーターとの間に挿入される。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＤＲである。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＤＲをベースとするベクターを、三重プラスミドトランスフェクションによって産生した。ＤＩ組成を、ｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がインビボにおいてｄｓＲＮＡを発現するであろうことを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８およびｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＤＲによって産生されたベクターの注入後に、肝臓組織を採取し、試料からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ｍｉＲ－１６－１２２－ＤＲ由来のｄｓＲＮＡの存在が検出不能であることを確認した。このコンストラクトにおいて発現されたＶＩＩＩ因子は、ａＰＴＴアッセイにおいて正常に機能した。
【0094】
[0119]実施例７：プロモーターのアンチセンス鎖にポリＡ部位が存在しないアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ消失のためのリボザイム
[0120]ｓＬＴＳＶ（－）タイプ３ＨＨＲを有するＲＤＤＤを合成し、５’ＩＴＲとプロモーターとの間のｐＡＡＶ－Ｆ８にクローン化した。リボザイムｓＬＴＳＶ（－）タイプ３ＨＨＲは、哺乳動物発現系の不活性形態と比較して最大で６０倍まで遺伝子発現を減じることが示された。ｓＬＴＳＶ（－）タイプ３ＨＨＲ由来のカセットの配列は、ＧＯＩに対する相補鎖から読んだ場合、
５’－ＴＡＡＴＴＣＴＡＧＧＣＧＡＣＴＡＧＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＣＧＴＡＴＧＡＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡＡＣＧＣＣＧＴＣＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＧＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡ－３’（配列番号９）
である。ＧＯＩ鎖の相補鎖における下線を引いた配列は、下線を引かれていない配列で隣接されるリボザイムである。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ＲＺである。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ＲＺをベースとするベクターを、三重プラスミドトランスフェクションによって産生した。ＤＩ組成をｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がインビボにおいてｄｓＲＮＡを発現するであろうことを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８およびｐＡＡＶ－Ｆ８－ＲＺによって産生されたベクターの注入後に、肝臓組織を採取し、試料からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ＲＺ由来のｄｓＲＮＡの存在が、９０％から検出不能にまで減少したことを確認した。
[0120]ｓＬＴＳＶ（－）タイプ３ＨＨＲを有するＲＤＤＤを合成し、５’ＩＴＲとプロモーターとの間のｐＡＡＶ－Ｆ８にクローン化した。リボザイムｓＬＴＳＶ（－）タイプ３ＨＨＲは、哺乳動物発現系の不活性形態と比較して最大で６０倍まで遺伝子発現を減じることが示された。ｓＬＴＳＶ（－）タイプ３ＨＨＲ由来のカセットの配列は、ＧＯＩに対する相補鎖から読んだ場合、
５’－ＴＡＡＴＴＣＴＡＧＧＣＧＡＣＴＡＧＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＣＧＴＡＴＧＡＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡＡＣＧＣＣＧＴＣＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＧＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡ－３’（配列番号９）
である。ＧＯＩ鎖の相補鎖における下線を引いた配列は、下線を引かれていない配列で隣接されるリボザイムである。結果として得られるコンストラクトは、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ＲＺである。ｐＡＡＶ－Ｆ８－ＲＺをベースとするベクターを、三重プラスミドトランスフェクションによって産生した。ＤＩ組成をｐａｃＢｉｏによって配列決定し、分子がインビボにおいてｄｓＲＮＡを発現するであろうことを確認した。Ｃ５７Ｂ６マウスへのｐＡＡＶ－Ｆ８およびｐＡＡＶ－Ｆ８－ＲＺによって産生されたベクターの注入後に、肝臓組織を採取し、試料からＲＮＡを抽出した。定量ｒｔＰＣＲ分析により、ｐＡＡＶ－Ｆ８－ＲＺ由来のｄｓＲＮＡの存在が、９０％から検出不能にまで減少したことを確認した。
【0095】
[0121]実施例８：ｄｓＲＮＡを除去したベクターの性能
[0122]ｄｓＲＮＡが上記の実施例１～７におけるベクターにおいて制御されることを確認するため、ＭＤＡ５などのｄｓＲＮＡセンサーの発現動態を、コントロールベクターｐＡＡＶ－Ｆ８において分析した。ＨｅＬａ細胞へのコントロールベクターの投与後６日目および８日目に、ＭＤＡ５の上方調節が観察された（およそ２倍から３倍の増加）。しかしながら、上記の設計されたベクターの全てがＭＤＡ５の上方調節の兆候を示したわけではなかった。上記のベクターを、マウス１匹あたり１ｅ１１／ウイルス粒子の用量において、血友病Ａマウスに注入した。コントロールベクターＡＡＶ－ｆ８の発現は最も低かった。全ての他のベクターは、ＥＬＩＳＡおよびａＰＴＴアッセイによってＶＩＩＩ因子発現レベルを示し、それは、５０％から１０倍の範囲においてＶＩＩＩ因子の発現の向上を示した。
[0122]ｄｓＲＮＡが上記の実施例１～７におけるベクターにおいて制御されることを確認するため、ＭＤＡ５などのｄｓＲＮＡセンサーの発現動態を、コントロールベクターｐＡＡＶ－Ｆ８において分析した。ＨｅＬａ細胞へのコントロールベクターの投与後６日目および８日目に、ＭＤＡ５の上方調節が観察された（およそ２倍から３倍の増加）。しかしながら、上記の設計されたベクターの全てがＭＤＡ５の上方調節の兆候を示したわけではなかった。上記のベクターを、マウス１匹あたり１ｅ１１／ウイルス粒子の用量において、血友病Ａマウスに注入した。コントロールベクターＡＡＶ－ｆ８の発現は最も低かった。全ての他のベクターは、ＥＬＩＳＡおよびａＰＴＴアッセイによってＶＩＩＩ因子発現レベルを示し、それは、５０％から１０倍の範囲においてＶＩＩＩ因子の発現の向上を示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】